트랜스펙션

Transfection

트랜스펙션은 진핵세포에 [1][2]의도적으로 노출되거나 정제된 핵산을 도입하는 과정이다.다른 용어들이 선호되기는 하지만, 그것은 또한 다른 방법들과 세포 유형을 언급할 수도 있다: "변환"은 전형적으로 식물 세포를 포함한 박테리아와 비동물 진핵 세포에서 비바이러스 DNA 전달을 묘사하기 위해 사용된다.동물 세포에서 트랜스펙션은 이러한 세포에서 암 상태로의 진행(암 발생)을 나타내기 위해 변환이 사용되기 때문에 선호되는 용어이다.진핵세포로의 [2][3]바이러스 매개 유전자 전달을 설명하기 위해 변환이 종종 사용된다.

트랜스펙션이라는 단어는 트랜스-와 감염의 합성어이다.유전물질(초코일 플라스미드 DNA 또는 siRNA 구조체 등)은 감염될 수 있다.동물 세포의 감염은 전형적으로 물질의 흡수를 가능하게 하기 위해 세포막에 일시적인 모공이나 "구멍"을 여는 것을 포함한다.트랜스펙션은 인산칼슘(즉 인산삼칼슘)을 사용하여 전기화, 세포 압착에 의해 또는 세포막과 융합하여 내부에 화물을 축적하는 리포좀을 생성하기 위해 카티온성 지질과 재료를 혼합함으로써 이루어질 수 있다.

감염은 표적 세포에 예기치 않은 형태와 이상을 초래할 수 있다.

용어.

그 용어의 의미는 [4]진화했다.전염의 원래 의미는 "변환에 의한 감염"이었다. 즉, 원핵생물 감염 바이러스 또는 박테리오파지에서 세포로 유전 물질인 DNA 또는 RNA를 도입하여 감염을 초래했다.박테리아 및 고고세포에 대한 연구를 위해 전염은 특별한 변형 사례로서의 본래의 의미를 유지한다.변형이라는 용어는 동물 세포 생물학에서 또 다른 의미를 가지고 있었기 때문에(배양이나 암세포의 전형적인 성질을 획득할 수 있는 유전적 변화), 동물 세포에 대해 트랜스펙션이라는 용어는 [citation needed]DNA의 도입에 의해 야기되는 세포 성질의 변화에 대한 현재의 의미를 획득했습니다.

방법들

진핵 세포에 외래 DNA를 도입하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 어떤 것들은 물리적인 처리에 의존합니다. 다른 것들은 운반체로 사용되는 화학 물질이나 생물학적 입자(바이러스)에 의존합니다.박테리아에서 포유류에 이르기까지 다양한 종류의 세포와 조직을 위해 개발된 유전자 전달의 많은 다른 방법들이 있다.일반적으로 방법은 물리적, 화학적, 생물학적 [5]세 가지 범주로 나눌 수 있습니다.

물리적인 방법에는 전기 주입, 미세 주입, 유전자 총, 임팩션, 정수압, 연속 주입, 초음파 처리가 포함됩니다.화학 물질에는 리포좀 벡터를 이용한 지질 매개 DNA 전달 과정인 리포텍션과 같은 방법이 포함된다.그것은 또한 고분자 유전자 캐리어(폴리플렉스)[6]의 사용을 포함할 수 있다.생물학적 감염은 전형적으로 바이러스에 의해 매개되며, 바이러스가 숙주 세포 안에 DNA를 주입하는 능력을 이용한다.분만을 목적으로 하는 유전자를 복제 결핍 바이러스 입자로 패키지화한다.지금까지 사용된 바이러스로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스,[citation needed] 단순 헤르페스 바이러스가 있다.

물리적인 방법

체외, 체내, 부착 세포 및 96개의 웰 일렉트로포레이션 애플리케이션을 위한 사각파 및 지수감쇠 파형이 있는 일렉트로포레이터.BTX Harvard Instrument, Holliston MA USA에서 제조.

물리적 방법은 개념적으로 가장 단순하며, 전달된 물질을 표적 세포의 핵으로 강제하기 위해 몇 가지 물리적 수단을 사용합니다.가장 널리 사용되는 물리적 방법은 짧은 전기 펄스가 세포막을 교란시켜 감염된 핵산이 [5]세포 안으로 들어갈 수 있게 하는 일렉트로포레이션이다.다른 물리적 방법에서는 세포막에 구멍을 뚫기 위해 다양한 방법을 사용합니다.초음파 탐지는 고강도 초음파(주로 주변 세포막과 상호작용하는 기체 기포의 캐비테이션에 기인한다)를 사용하며, 광학적 투과성은 고집중 레이저를 사용하여 약 1µm 직경의 [7]구멍을 형성한다.

몇몇 방법은 세포에 핵산의 강요로 도구, 즉:핵산의 미세한 바늘과 핵산 자성의 철에 부착된 현미 주사. 핵산 중금속 입자(보통으로 금을 가려 내다)고 세포에 높은 속도로 활기를 첨부합니다[5]biolistic 입자 배달,;[8]과 magnetofection을 사용한다.산화자석에 [8]의해 표적 세포에 주입됩니다.

유체역학적 분만은 생쥐와 랫드에 사용되는 방법으로, 비교적 많은 양의 핵산을 10초 이내에 혈액에 주입함으로써 간에 전달될 수 있다. 이 절차에 의해 거의 [9]모든 DNA가 간에서 발현된다.

화학적 방법

화학 기반 전염은 몇 가지 종류로 나눌 수 있습니다: 시클로덱스트린,[10] [11]폴리머, 리포좀 또는 나노 입자[12](화학 또는 바이러스 기능화 유무)이하를 참조해 주세요).

  • 가장 저렴한 방법 중 하나는 1973년 F[13]. L. Graham과 A. J. van der Eb에 의해 처음 발견된 인산칼슘을 사용한다(참조[14]).인산 이온을 포함한 헤페스 완충 식염수(HeBS)와 트랜스펙트 대상 DNA를 포함한 염화칼슘 용액을 조합한다.이 두 가지가 결합되면, 양전하를 띤 칼슘과 음전하를 띤 인산염의 미세한 침전이 형성되어 표면에 전달될 DNA와 결합하게 된다.그런 다음 침전물의 현탁액은 트랜스펙트 될 세포에 추가됩니다(일반적으로 단분자층에서 자라는 세포 배양).완전히 이해되지 않은 과정에 의해, 세포는 침전물의 일부를 차지하고, 그것으로 DNA를 얻는다.이 과정은 많은 종양유전자를 [15]식별하기 위해 선호되어 왔다.
  • 또 다른 방법은 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌아민(PEI)과 같은 양이온성 폴리머를 사용하는 것이다.음전하를 띤 DNA는 폴리카티온에 결합하고 복합체는 세포내구증(endocytosis)을 통해 세포에 흡수된다.
  • 지방검출(또는 리포좀 트랜스펙션)은 리포좀을 통해 유전물질을 세포에 주입하는 기술이다. 리포좀은 두 가지 모두 [16]인지질 이중층으로 만들어졌기 때문에 세포막과 쉽게 결합할 수 있는 소포이다.지질 탐지는 일반적으로 음전하를 띤(음이온성)[17] 유전 물질과 응집체를 형성하기 위해 양전하를 띤(카티온성) 지질(카티온성 리포좀 또는 혼합물)을 사용한다.이 트랜스펙션 기술은 폴리머, DEAE-덱스트란, 인산칼슘, 일렉트로포메이션 등을 이용한 다른 생화학 시술과 동일한 작업을 수행한다.지방검출의 효율은 가벼운 [18]열충격으로 트랜스펙트된 세포를 처리함으로써 향상될 수 있다.
  • 푸겐은 다양한 세포를 고효율 [19][20][21][22]저독성으로 직접 감염시킬 수 있는 널리 사용되는 일련의 비리포좀 트랜스펙션 시약이다.
  • 덴드리머(Dendrimer)는 다양한 구성 요소를 기반으로 수렴 또는 발산 방식으로 합성되는 고도로 분기된 분자의 한 종류입니다.이러한 덴드리머는 핵산을 결합시켜 덴드리플렉스를 형성하고 그 후에 세포를 [23][24]관통합니다.

바이러스 방법

DNA는 또한 바이러스를 매개체로 사용하여 세포에 도입될 수 있다.이러한 경우, 이 기술을 도입이라고 하며, 세포는 도입이라고 합니다.아데노바이러스 벡터는 다양한 인간 세포에 유전자를 전달할 수 있고 높은 전달 [2]속도를 가지고 있기 때문에 바이러스 감염 방법에 유용할 수 있다.렌티바이러스 벡터는 또한 현재 유사분열이 진행되지 않은 세포를 변환하는 능력 때문에 도움이 된다.

원형질 융합은 세포벽을 제거하기 위해 변형된 박테리아 세포를 리조자임으로 처리하는 기술이다.이어서 대상 유전자를 운반하는 원형플라스틱과 대상 수용체 세포를 융합하기 위해 융착제(예를 들어 센다이 바이러스, PEG, 일렉트로포레이션)를 사용한다.이 방법의 주요 단점은 박테리아 성분이 표적 세포에도 비특이적으로 도입된다는 것이다.

안정적이고 일시적인 감염

안정적이고 일시적인 트랜스펙션은 세포에 미치는 장기적인 영향이 다르다.안정적으로 트랜스펙션된 세포는 지속적으로 트랜스펙션된 DNA를 발현하여 딸 세포에 전달되는 반면, 트랜스펙션된 세포는 짧은 시간 동안 트랜스펙션된 DNA를 발현하고 딸 세포에 전달되지 않는다.

트랜스펙션의 일부 적용의 경우 트랜스펙션된 유전물질이 일시적으로만 발현되는 경우 충분하다.트랜스펙션 과정에서 도입된 DNA는 보통 핵 게놈에 통합되지 않기 때문에 외부 DNA는 유사분열을 통해 희석되거나 [5]분해된다.엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵항원 1(EBNA1) 또는 SV40 대형-T 항원을 발현하는 세포주는 복제의 바이러스 EBV(293E) 또는 SV40(293T) 기원을 포함하는 플라스미드의 에피좀 증폭을 허용하여 [25]희석 속도를 크게 감소시킨다.

만약 트랜스펙트된 유전자가 실제로 세포와 그 딸 세포의 게놈에 남아있기를 바란다면, 안정된 트랜스펙션이 일어나야 한다.이를 달성하기 위해, 마커 유전자가 공동 감염되어 세포에 특정 독소에 대한 저항성과 같은 선택 가능한 이점을 준다.일부 (극소수) 전염된 세포들은 우연히 외래 유전 물질을 그들의 게놈에 통합시킬 것이다.만약 그 독소가 세포 배양에 추가된다면, 다른 세포들은 죽는 반면, 표지자 유전자가 게놈에 통합된 소수의 세포들만 증식할 수 있을 것이다.이 선택스트레스(선택압)를 일정시간 가한 후 안정된 투과성을 가진 세포만이 남아 더욱 [26]배양할 수 있다.

안정적인 감염을 선택하기 위한 일반적인 에이전트는 다음과 같습니다.

RNA전달

RNA는 또한 세포에 전달되어 코드화된 단백질을 일시적으로 발현하거나 RNA 붕괴 동태학을 연구할 수 있다.RNA 전달은 종종 분열하지 않는 1차 세포에 사용된다.

또한 siRNA는 RNA 소음(즉, 표적 유전자의 RNA 및 단백질 손실)을 달성하기 위해 트랜스펙트 될 수 있다.이는 유전자 치료에서 잠재적 적용과 함께 관심 단백질(예: 엔도셀린-1[27])의 "녹다운"을 달성하기 위한 연구에서 주요 응용 분야가 되었다.소음 접근법의 한계는 세포에 대한 전달의 독성 및 다른 유전자/단백질 발현에 대한 잠재적 "표적 이탈" 영향이다.

RNA는 용해 후 세포에서 정제되거나 화학적으로 또는 DNA 템플릿을 전사하기 위해 RNA 중합효소를 사용하여 효소적으로 유리 뉴클레오티드에서 합성될 수 있다.DNA와 마찬가지로 RNA는 미세주입, 일렉트로포메이션 및 지질 매개 전달을 포함한 다양한 수단을 통해 세포에 전달될 수 있다.RNA가 단백질을 암호화하면 트랜스펙트된 세포는 RNA를 [28]암호화 단백질로 변환할 수 있다.RNA가 조절 RNA(예: miRNA)인 경우 RNA는 세포에 다른 변화(예: RNAi 매개 녹다운)를 일으킬 수 있습니다.

RNA 분자를 지질 나노 입자로 캡슐화하는 것은 인간 세포에 RNA [29][30]분자를 전달하는 데 있어 많은 중요한 기술적 장벽을 해결하면서 실행 가능한 RNA 백신을 생산하기 위한 돌파구였다.

약 25nt(뉴클레오티드)보다 짧은 RNA 분자는 긴 RNA 분자에 의해 유발되는 선천적인 면역 체계에 의한 탐지를 대부분 회피한다.신체의 대부분의 세포는 선천적인 면역체계의 단백질을 발현하고, 외인성 긴 RNA 분자에 노출되면, 이 단백질들은 염증을 일으키는 신호 전달을 시작합니다.이 염증은 노출된 세포와 인근 세포를 후속 노출에 과민하게 만든다.그 결과 비특이적인 영향이 거의 없는 짧은 RNA로 세포를 반복적으로 감염시킬 수 있지만, 선천적인 면역체계를 억제하거나 회피하는 조치가 취해지지 않는 한 소량의 긴 RNA로 세포를 반복적으로 감염시키면 세포사멸을 초래할 수 있다(아래의 "롱-RNA 트랜스펙션" 참조).

짧은 RNA 전달은 생물학적 연구에서 관심 있는 단백질의 발현을 무너뜨리거나(siRNA를 사용하여) miRNA의 활동을 발현 또는 차단하기 위해 일상적으로 사용된다(세포의 RNAi 기계와 독립적으로 작용하여 siRNA로 지칭되지 않음).짧은 RNA 분자를 코드하는 DNA 기반 벡터(바이러스, 플라스미드)도 사용할 수 있지만, 짧은 RNA 전달은 새로운 종류의 고분자 [31]약물로 짧은 RNA를 개발하게 한 특징인 세포의 DNA를 변형할 위험이 없다.

장기 RNA 감염은 살아있는 세포에 약 25nt보다 긴 RNA 분자를 의도적으로 도입하는 과정이다.외인성 장척 RNA 분자가 번역 블록, 세포 주기 정지 및 아포토시스 등 다양한 비특이적 효과를 일으킬 수 있는 세포에서 선천적 면역 응답을 유도하기 때문에 단기 RNA 전달과 장기 RNA 전달이 구별된다.

내인성 RNA 대 외인성 장기 RNA

선천적인 면역 체계는 병원균 관련 분자 패턴(PAMPs)을 감지하여 감염으로부터 보호하도록 진화했고, 집합적으로 "염증"으로 알려진 복잡한 일련의 반응을 유발합니다.많은 세포는 톨형 수용체 3,7,8(TLR3, TLR7, TLR8),[32][33][34][35] RNA 헬리케이스 RIG1(RARES3),[36] 단백질인산화효소 R(PKR, a.ka.EIF2ak2),[37][38] OLADIL 멤버를 포함한 외인성 RNA에 대한 특이 패턴 인식 수용체(PRR)를 발현한다.이 모든 단백질들은 특이적으로 외인성 RNA 분자와 결합하고 면역 반응을 일으킬 수 있다.PRR에 의해 인식되는 데 필요한 긴 RNA 분자의 특정 화학적, 구조적 또는 다른 특성은 강도 높은 연구에도 불구하고 대부분 알려지지 않았다.언제든지 전형적인 포유동물 세포는 수십만 mRNA와 다른 조절성 긴 RNA 분자를 포함할 수 있다.세포가 다량의 내인성 긴 RNA와 어떻게 외인성 긴 RNA를 구별하는지는 세포 생물학에서 중요한 미해결 질문이다.여러 보고에 따르면 긴 RNA 분자의 5' 말단 인산화 작용은 면역원성에 영향을 미칠 수 있으며, 특히 바이러스 감염 중에 생성될 수 있는 5'-삼인산 RNA는 5'-인산 RNA, 5'-일인산 RNA 또는 5''[39][40][41][42][43][44]인산이 없는 RNA보다 면역원성이 높다.단, 7-메틸구아노신 캡(진핵생물 mRNA에 존재하는 것)을 포함한 시험관내 전사(ivT) 긴 RNA는 5' [45]인산염이 없음에도 불구하고 높은 면역원성으로, 5'-인산화 이외의 특성이 RNA 분자의 면역원성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

진핵생물 mRNA는 N-메틸아데노신6, 5-메틸시티딘 및 2'-O-메틸화 뉴클레오티드와 같은 화학적으로 수식된 뉴클레오티드를 포함한다.비록 이러한 변형된 뉴클레오티드가 전형적인 mRNA [46][34]분자에 극소수만 존재하지만, 그것들은 바이러스 감염 동안에만 세포에 존재하는 것으로 생각되는 RNA의 일종인 이중 가닥 RNA와 유사한 2차 구조를 파괴함으로써 mRNA가 선천적인 면역 체계를 활성화하는 것을 막는데 도움을 줄 수 있다.긴 RNA의 면역원성은 선천적 면역과 적응적 면역 모두를 연구하는데 사용되어 왔다.

반복적인 장기 RNA 감염

간섭β, STAT2, EIF2의 세 가지 단백질만 억제한다.AK2는 긴 단백질 부호화 [45]RNA와의 빈번한 감염으로 인한 세포사망으로부터 인간 섬유아세포를 구하기에 충분하다.인터페론 시그널링을 억제하는 것은 보통 외인성 긴 RNA에 노출된 세포를 과민화하는 양의 피드백 루프를 방해한다.연구진은 최근 이 기술을 1차 인간 섬유아세포에서 [47]재프로그래밍 단백질을 발현시키기 위해 사용했다.

「 」를 참조해 주세요.

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