고정(이력)

Fixation (histology)

조직학, 병리학, 세포생물학 분야에서 고정은 자기분해나 부패로 인한 부패로부터 생물학적 조직을 보호하는 것이다.그것은 진행 중인 생화학 반응을 종료시키고 또한 처리된 조직의 기계적 강도나 안정성을 증가시킬 수 있다.조직 고정은 조직학적 단면을 준비하는 데 있어 중요한 단계이며, 광범위한 목적은 세포와 조직 구성 요소를 보존하고 얇고 얼룩진 단면을 준비할 수 있도록 하는 것이다.이것은 단백질과 핵산과 같은 고분자의 모양과 크기에 의해 결정되는 조직의 구조를 조사할 수 있게 해준다.

관류를 통해 고정되고 면역 조직 화학을 통해 염색되며 공초점 현미경을 사용하여 촬영됩니다.

목적들

보호 역할을 수행함에 있어, 고정제는 응고, 첨가 화합물 형성 또는 응고 및 첨가 과정의 조합에 의해 단백질을 변성시킨다.고분자에 화학적으로 첨가하는 화합물은 가교라고 알려진 두 개의 다른 고분자의 부분과 결합할 수 있다면 구조를 가장 효과적으로 안정화시킨다.조직의 고정은 몇 가지 이유로 이루어집니다.한 가지 이유는 사후 부패(자동 분해 및 부패)[1]를 방지하기 위해 조직을 죽이기 위함이다.고정은 검사를 위해 조직을 준비하는 과정에서 생물학적 물질(조직 또는 세포)을 가능한 한 자연 상태에 가깝게 보존합니다.이를 위해서는 보통 몇 가지 조건이 충족되어야 합니다.

첫째, 고정제는 일반적으로 내인성 생체 분자, 특히 단백질 분해 효소를 비활성화하는 작용을 하며, 그렇지 않으면 샘플을 소화하거나 손상시킨다.

둘째, 고정제는 일반적으로 외부 손상으로부터 샘플을 보호합니다.고정제는 조직 샘플에 존재하거나 고정 조직을 콜로니로 만들 수 있는 대부분의 일반적인 미생물(특히 박테리아)에 독성이 있습니다.또한, 많은 고정제는 화학적으로 고정 물질을 변화시켜 기회주의 미생물에 대한 입맛을 떨어뜨립니다(소화가 잘 되지 않거나 독성이 있습니다.

마지막으로, 고정제는 종종 분자 수준에서 세포나 조직을 변화시켜 기계적 강도나 안정성을 증가시킨다.이렇게 강도와 강성이 증가하면 샘플이 추가 분석을 위해 처리될 때 샘플의 형태(모양 및 구조)를 보존하는 데 도움이 됩니다.

아무리 주의 깊게 고정해도 샘플이 변경되어 세포 초미세 구조의 해석을 방해할 수 있는 아티팩트가 발생합니다.대표적인 예가 1970년대 그램 양성 박테리아에서 세포소기관으로 생각되었던 박테리아 메소좀이다. 그러나 나중에 전자 현미경을 위해 개발된 새로운 기술로 단순히 화학적 [2][3]고정의 인공물일 뿐이다.고정 및 기타 조직 처리 절차의 표준화는 어떤 절차가 어떤 종류의 아티팩트를 도입하는지 설정함으로써 아티팩트의 도입을 고려한다.각 조직 유형 및 처리 기술에 대해 어떤 유형의 아티팩트가 예상되는지 알고 있는 연구자는 아티팩트가 있는 섹션을 정확하게 해석하거나 관심 영역의 아티팩트를 최소화하는 기술을 선택할 수 있습니다.

고정 절차 선택

고정은 일반적으로 다단계 공정에서 현미경 검사 또는 기타 분석을 위한 생물학적 재료 샘플을 준비하는 첫 번째 단계입니다.따라서 고정제 및 고정 프로토콜의 선택은 계획된 추가 처리 단계와 최종 분석에 따라 달라질 수 있습니다.예를 들어 면역조직화학은 특정 단백질 표적에 결합하는 항체를 사용한다.장기간 고정하면 화학적으로 이러한 표적을 가리고 항체 결합을 방지할 수 있습니다.이러한 경우, 약 24시간 동안 차가운 포르말린을 사용하는 '퀵 픽스' 방법이 일반적으로 사용됩니다.메탄올(100%)은 신속한 고정에도 사용할 수 있으며, 그 시간은 생물학적 물질에 따라 다를 수 있습니다.예를 들어, MDA-MB 231 인간 유방암 세포는 차가운 메탄올(-20°C)로 3분 동안만 고정될 수 있다.효소 국재 연구의 경우, 조직을 가볍게 사전 고정하거나 효소 활성 생성물이 형성된 후에 사후 고정해야 합니다.

고정 및 프로세스 유형

고정 프로세스에는 일반적으로 수정해야 하는 샘플에 따라 세 가지 유형이 있습니다.

열 고정:열 고정은 단세포 유기체, 가장 일반적으로 박테리아와 고세균의 고정에 사용됩니다.유기체는 전형적으로 물이나 생리식염수와 혼합되어 샘플을 균등하게 퍼트리는 데 도움이 됩니다.일단 희석된 샘플은 현미경 슬라이드에 퍼집니다.이 희석된 박테리아 샘플은 슬라이드에 올려진 후 일반적으로 도말이라고 합니다.실온에서 미끄럼이 건조된 후 집게나 빨래집게로 슬라이드를 잡고 분젠 버너의 불꽃을 여러 번 통과시켜 생물을 열살해 슬라이드에 붙인다.마이크로 인사이너 장치도 사용할 수 있다.가열 후 샘플은 일반적으로 착색된 다음 현미경을 [4]사용하여 이미징됩니다.열 고정은 일반적으로 전체 형태를 보존하지만 내부 구조는 보존하지 않습니다.열은 단백질 분해 효소를 변성시켜 자가 분해를 방지합니다.열 고정은 캡슐(글리코칼릭스)을 수축 또는 파괴하고 [5]얼룩에서 볼 수 없으므로 캡슐 염색 방법에는 열 고정법을 사용할 수 없습니다.

몰입:침지법은 단일 세포에서 전체 유기체로 조직학적 샘플을 고정하기 위해 사용될 수 있다.조직 샘플은 정해진 시간 동안 고정제 용액에 담근다.고정용액은 조직 [6]부피보다 최소 10배 큰 부피를 가져야 합니다.정착이 성공하기 위해서는 정착제가 조직 전체에 확산되어야 하므로 정착제의 종류뿐만 아니라 조직의 크기와 밀도도 고려되어야 합니다.이것은 세포 응용에 일반적인 기술이지만 더 큰 조직에도 사용할 수 있습니다.더 큰 샘플을 사용하면 정착제가 더 깊은 [7]조직에 도달하기 위해 더 오래 담가야 합니다.

Perfusion Diagram.jpg

관류: 관류는 체액이 장기나 유기체의 혈관이나 자연적인 통로를 통과하는 것입니다.관류를 통한 조직 고정에서 고정제는 대개 좌심실에 삽입된 바늘을 통해 순환 시스템으로 펌프됩니다.이것은 초음파 유도 또는 [8]피험자의 흉강을 열어 수행할 수 있습니다.고정제는 일반적인 심장 출력과 일치하는 주입 용량으로 심장에 주입됩니다.선천적인 순환계를 사용하여, 고정제는 몸 전체에 분포하고, 고정될 때까지 조직은 죽지 않습니다.이 방법을 사용할 경우 고정제와 완충제의 부피를 고려하여 순환 시스템 어딘가에 배수 포트를 추가해야 합니다. 이 작업은 일반적으로 우심방에서 수행됩니다.그 고정제는 혈액을 모두 대체할 때까지 순환기 계통에 주입된다.관류를 사용하는 것은 형태학을 [9]보존할 수 있는 장점이 있지만, 단점은 대상자가 죽고 더 큰 유기체에 필요한 고정제의 양이 많아 잠재적으로 비용이 증가한다는 것이다.관련된 연구에 관심이 없는 조직을 공급하는 동맥을 잘라냄으로써 관류 고정을 수행하는 데 필요한 유체 부피를 줄일 수 있습니다.관류 고정은 설치류에서 뇌, 폐, 신장 조직을 촬영하는 데 흔히 사용되며 인간의 [7][10]부검 수행에도 사용됩니다.

화학적 고정

침지 및 관류 고정 프로세스에서 화학 고정제는 살아있는 조직에 가능한 한 가까운 상태(화학 및 구조 모두)의 구조를 보존하기 위해 사용됩니다.이것은 화학 고정제를 필요로 한다.

가교 정착제 – 알데히드

가교 고정제는 조직 내 단백질 사이에 공유 화학 결합을 생성함으로써 작용한다.이것은 수용성 단백질을 세포골격에 고정시키고 조직에 추가적인 강성을 부여합니다.배아 분화 파동 중의 수축과 같은 일시적 또는 미세한 세포골격 구조의 보존은 교차 연결 [11][12]고정제를 추가하기 전에 마이크로파를 사용한 전처리에 의해 가장 잘 달성된다.

조직학에서 가장 일반적으로 사용되는 고정제는 포름알데히드이다.보통 10% 중성버퍼 포르말린(NBF)으로 사용되며, pH 7은 인산염 완충액 중 포름알데히드가 약 3.7%~4.0%이며, 포름알데히드는 상온의 기체이므로 물에 녹는 포름알데히드 가스(~37% w/v)를 사용한다.포름알데히드는 단백질, 주로 염기성 아미노산 리신의 잔류물을 가교함으로써 조직을 고정시킨다.그것의 효과는 과도한 물에 의해 되돌릴 수 있고 포르말린 색소 침착을 방지한다.파라포름알데히드는 또한 일반적으로 사용되며 가열되면 포르말린으로 다시 분해되어 효과적인 고정제가 됩니다.파라포름알데히드의 다른 이점으로는 장기 저장과 양호한 조직 침투가 있습니다.그것은 면역 조직 화학 기술에 특히 좋다.포름알데히드 증기는 세포 도말의 고정제로도 사용될 수 있다.

또 다른 인기 있는 고정용 알데히드는 글루타르알데히드이다.포름알데히드와 유사하게 작용하여 단백질의 α-헬리스를 변형시킨다.그러나 글루타르알데히드는 포름알데히드보다 더 큰 분자이기 때문에 세포막에 더 느리게 침투한다.따라서 두꺼운 조직 시료에 글루타르알데히드를 고정하는 것이 어려워질 수 있으며, 이는 조직 시료의 크기를 줄임으로써 트러블 슈팅을 할 수 있다.글루타르알데히드 고정의 장점 중 하나는 길이가 길고 두 개의 알데히드 그룹이 더 먼 단백질 분자 쌍을 연결하고 연결할 수 있는 더 단단하거나 긴밀하게 연결된 고정 제품을 제공할 수 있다는 것입니다.이는 빠르고 돌이킬 수 없는 변화를 일으키고, 전자 현미경 검사에 적합하며, 4°C에서 잘 작동하며, 전반적인 세포질 및 핵 상세도가 가장 우수하다.그러나 면역조직화학염색에는 적합하지 않다.

일부 고정 프로토콜은 포름알데히드와 글루타르알데히드의 조합을 요구하여 각각의 강도가 서로 보완되도록 합니다.

이러한 가교 고정제, 특히 포름알데히드는 단백질의 2차 구조를 보존하는 경향이 있고 대부분의 3차 구조를 보존할 수도 있습니다.

침전성 정착제 – 알코올

침전(또는 변성) 고정제는 단백질 분자의 용해성을 감소시키고 종종 많은 단백질에게 3차 구조를 주는 소수성 상호작용을 방해함으로써 작용한다.단백질의 침전 및 집적은 알데히드 고정제와 일어나는 가교와는 매우 다른 과정이다.

가장 흔한 침전제는 에탄올과 메탄올이다.그것들은 얼린 부분과 얼룩을 고치는 데 흔히 사용된다.아세톤은 아세톤 메틸벤조산염 자일렌(AMEX) 기술에 사용될 때 동결 부분보다 더 나은 조직학적 보존을 생성하는 것으로 나타났다.

단백질 변성 메탄올, 에탄올 및 아세톤은 핵산을 연구하지 않는 한 블록 고정에 단독으로 사용되는 경우가 드물다.

아세트산은 변성제로, 데이비드슨의 [13]AFA와 같은 다른 침전 고정제와 함께 사용되기도 한다.알코올 자체는 고정 중에 조직의 상당한 수축과 경화를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 아세트산만 조직의 붓기와 관련이 있습니다. 두 가지를 결합하면 조직의 형태학이 더 잘 보존될 수 있습니다.

산화제

산화 고정제는 단백질과 다른 생체 분자의 곁사슬과 반응하여 조직 구조를 안정시키는 가교 형성을 가능하게 합니다.그러나 미세 세포 구조를 보존함에도 불구하고 광범위한 변성을 일으키며 주로 2차 고정제로 사용된다.

사산화 오스뮴은 전자현미경 시료를 준비할 때 2차 고정제로 많이 사용된다(조직의 두꺼운 부분을 매우 잘 투과하지 않기 때문에 빛현미경 검사에는 사용되지 않는다).

중크롬산칼륨, 크롬산칼륨, 과망간산칼륨은 모두 특정 조직학적 제제에 사용된다.

머큐리얼

B-5와 젠커 고정제와 같은 수은은은 염색의 밝기를 높이고 뛰어난 핵 디테일을 제공하는 알려지지 않은 메커니즘을 가지고 있다.수은은 빠르지만 침투가 잘 되지 않아 조직이 수축합니다.그들은 조혈조직과 망상내피조직의 고정에 가장 잘 적용된다.또한 수은이 함유되어 있으므로 폐기 시 주의해야 합니다.

피카레이트

피케이트는 히스톤과 염기성 단백질과 반응하여 아미노산과 결정성 피케이트를 형성하고 모든 단백질을 침전시키기 위해 조직을 잘 침투합니다.결합조직에 좋은 고정제이며 글리코겐을 잘 보존하고 지질 추출을 통해 생체 및 폴리펩타이드 호르몬 면역 유지에 있어 포름알데히드 효과가 뛰어나지만, 고정 후 시료를 철저히 세척하지 않으면 호염기구 손실을 일으킨다.

HOPE 고정제

헤페스-글루탐산 버퍼 매개 유기용매 보호효과(HOPE)는 포르말린 유사형태학, 면역조직화학 및 효소조직화학용 단백질 항원의 뛰어난 보존, RNA 및 DNA 수율 양호 및 가교단백질 부재 등을 제공한다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Carson FL, Hladik C (2009). Histotechnology: A Self-Instructional Text (3rd ed.). Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press. p. 2. ISBN 978-0-89189-581-7.
  2. ^ Ryter A (1988). "Contribution of new cryomethods to a better knowledge of bacterial anatomy". Annales de l'Institut Pasteur. Microbiology. 139 (1): 33–44. doi:10.1016/0769-2609(88)90095-6. PMID 3289587.
  3. ^ Friedrich CL, Moyles D, Beveridge TJ, Hancock RE (August 2000). "Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on gram-positive bacteria". Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (8): 2086–2092. doi:10.1128/AAC.44.8.2086-2092.2000. PMC 90018. PMID 10898680.
  4. ^ "How to Prepare & Heat Fix a Bacterial Smear for Staining". www.scienceprofonline.com. Retrieved 2021-12-11.
  5. ^ Aryal S (2015-09-24). "Capsule Staining- Principle, Reagents, Procedure and Result". Microbiology Info.com. Retrieved 2021-12-11.
  6. ^ "Fixation Protocols". medicine.yale.edu. Retrieved 2021-12-11.
  7. ^ a b Adickes ED, Folkerth RD, Sims KL (November 1997). "Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination". Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 121 (11): 1199–1206. PMID 9372749.
  8. ^ Zhou YQ, Davidson L, Henkelman RM, Nieman BJ, Foster FS, Yu LX, Chen XJ (March 2004). "Ultrasound-guided left-ventricular catheterization: a novel method of whole mouse perfusion for microimaging". Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3): 385–389. doi:10.1038/labinvest.3700038. PMID 14704721. S2CID 776193.
  9. ^ de Guzman AE, Wong MD, Gleave JA, Nieman BJ (November 2016). "Variations in post-perfusion immersion fixation and storage alter MRI measurements of mouse brain morphometry". NeuroImage. 142: 687–695. doi:10.1016/j.neuroimage.2016.06.028. hdl:1807/96891. PMID 27335314. S2CID 207199504.
  10. ^ McFadden WC, Walsh H, Richter F, Soudant C, Bryce CH, Hof PR, et al. (September 2019). "Perfusion fixation in brain banking: a systematic review". Acta Neuropathologica Communications. 7 (1): 146. doi:10.1186/s40478-019-0799-y. PMC 6728946. PMID 31488214.
  11. ^ Reipert S, Kotisch H, Wysoudil B, Wiche G (July 2008). "Rapid microwave fixation of cell monolayers preserves microtubule-associated cell structures". The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (7): 697–709. doi:10.1369/jhc.7A7370.2008. PMC 2430164. PMID 18413652.
  12. ^ Gordon NK, Gordon R (15 September 2016). Embryogenesis explained. Singapore: World Scientific Publishing. p. 527. doi:10.1142/8152. ISBN 9789814740692.
  13. ^ "데이비슨 AFAFixative이고 어떻게 조직학 및/또는 In-situ Hybridizations에 샘플 보존하는데 쓸".아리조나 대학과 수의학 과학 미생물학 웹 사이트(2월 22일 2013년 접속).그 2011-08-24에 원래에서 Archived.. 라이트너 DV(2016년)에서 2013-02-23 Retrieved."2장".새우 병리학과 진단 절차의 배양 penaeid 새우의 질병에 대한 지침서.배턴 루지, LA(미국):세계 양식업 협회입니다.

외부 링크

라이브러리 리소스 정보
고정(이력)