확장된 유전자 코드
Expanded genetic code
확장유전자코드는 하나 이상의 특정 코돈이 22개의 일반적인 자연부호화 단백질원성아미노산 [1]중 하나가 아닌 아미노산을 부호화하기 위해 재할당된 인공변형 유전자코드이다.
유전자 코드를 확장하기 위한 주요 전제 조건은 다음과 같습니다.
- 코드화할 비표준 아미노산,
- 사용하지 않는 코돈은 채택할 코돈,
- 이 코돈을 인식하는 tRNA와
- tRNA와 비표준 아미노산만을 인식하는 tRNA 합성효소.
유전자 코드를 확장하는 것은 유용한 목적을 위해 생물 시스템을 설계하는 것을 목표로 하는 응용 생물학 분야인 합성 생물학 연구 분야이다.유전자 코드 확장은 과학이 이용할 수 있는 유용한 도구의 레퍼토리를 풍부하게 한다.
2019년 5월, 연구자들은 박테리아 게놈의 64개 코돈의 자연수를 61코돈으로 줄임으로써 새로운 합성(인공 가능한) 형태의 생존 생명체의 창조를 보고했다. (세린 코드 6개 중 2개 코돈과 3개 코돈 중 1개 코돈 제거)그 중 59개는 20개의 아미노산을 [2][3]암호화하는 데 사용되었다.
서론
주목할 점은 모든 유기체의 유전자 코드가 기본적으로 동일하기 때문에 모든 생명체가 동일한 '유전자 언어'[4]를 사용한다는 것이다.일반적으로 새로운 기능성 부자연 아미노산이 살아있는 세포의 단백질에 도입되면 유전언어의 보편성이 깨져 이상적으로는 [5]대체생명체로 이어진다.단백질은 RNA 메시지를 일련의 아미노산으로 해독하는 번역계 분자 덕분에 생산된다.메신저 RNA(mRNA)에 포함된 유전정보를 단백질로 변환하는 것은 리보솜에 의해 촉매된다.전달 RNA(tRNA)는 mRNA를 암호화된 폴리펩타이드로 디코딩하기 위한 키로 사용됩니다.tRNA는 mRNA에서 특정 3개의 뉴클레오티드 코돈을 그것의 루프 중 하나에 안티코돈이라고 불리는 상보적 배열과 함께 인식한다.각 3뉴클레오티드 코돈은 20개의 자연발생 아미노산 [6]중 하나로 변환된다.코돈에는 적어도 하나의 tRNA가 있으며, 때로는 동일한 아미노산에 대한 여러 코돈 코드가 있습니다.많은 tRNA가 여러 코돈과 호환됩니다.아미노아실 tRNA 합성효소라고 불리는 효소는 아미노산을 적절한 tRNA에 [7]공유 결합시킨다.대부분의 세포는 각 아미노산(20개 이상의 합성효소)에 대해 서로 다른 합성효소를 가지고 있다.한편, 아미노아실 tRNA 합성효소가 20개 미만인 세균도 있어 아미노산 아미노산을 아미노전달효소(Aminotransferase)[8]에 의해 구조적으로 관련된 아미노산을 수식함으로써 '결손' 아미노산을 도입한다.유전자 코드의 확장에 이용되는 특징 중 하나는 아미노아실 tRNA 합성효소가 항코돈을 인식하지 못하는 경우가 많지만 항코돈이 변이되면 해당 아미노산의 부호화가 새로운 코돈으로 바뀌는 것을 의미한다.mRNA 코돈이 tRNA의 상보적 항코돈과 일치하면 mRNA 내의 정보가 특정 아미노산으로 변환되어 성장 중인 폴리펩타이드 사슬에 부가된 아미노산이 첨가된다.리보솜에서 방출될 때, 폴리펩타이드 사슬은 기능하는 [7]단백질로 접힙니다.
새로운 아미노산을 유전자 코드에 포함시키기 위해서는 몇 가지 변화가 필요하다.첫째, 신규 아미노산의 성공적인 번역을 위해 신규 아미노산이 할당된 코돈은 20개의 천연 아미노산 중 하나를 코드화할 수 없다.보통 넌센스 코돈(정지 코돈) 또는 4베이스 코돈이 사용됩니다.[6]둘째, 새로운 쌍의 tRNA와 아미노아실 tRNA 합성효소가 필요하며, 이들은 직교 세트라고 불린다.직교 세트는 리보솜 및 번역 장치의 다른 구성 요소와 기능적으로 호환성이 있는 상태에서 내생 tRNA 및 합성효소 세트와 교잡해서는 안 됩니다.합성효소의 활성 부위는 신규 아미노산만을 받아들이도록 수정된다.가장 자주 tRNA에 원하는 아미노산을 충전하는 돌연변이 합성효소 라이브러리가 스크리닝된다.또한 합성효소는 직교 tRNA만을 [6]인식하도록 수정된다.tRNA 합성효소 쌍은 종종 다른 박테리아나 진핵 [9]세포에서 조작된다.
이 연구 영역에서, 20개의 암호화된 단백질 생성 아미노산은 표준 아미노산 또는 대체적으로 천연 또는 표준 아미노산으로 언급되는 반면, 첨가된 아미노산은 비표준 아미노산 또는 부자연 아미노산(uAAs; 자연 비단백질 생성 아미노산과 같은 논문에 사용되지 않는 용어)이라고 불립니다.포스포세린) 또는 비산화 아미노산.
비표준 아미노산
이 시스템의 첫 번째 요소는 특정 종의 유기체의 유전자 코드에 첨가되는 아미노산이다.
71개 이상의 다른 NSAA가 다른 종류의 대장균, 효모 또는 포유류 [10]세포에 첨가되었다.기술적 세부사항(NSAA의 더 쉬운 화학적 합성, 더 적은 혼화 및 아미노아실-tRNA 합성효소의 더 쉬운 진화)으로 인해, NSAA는 일반적으로 표준 아미노산보다 크고 대부분 페닐알라닌 코어를 가지고 있지만 매우 다양한 치환기를 가지고 있다.이는 형광 리포터(예: 단실알라닌)[11]로서 라벨링(그림 참조) 또는 진핵세포 번역 후 변형(예: 포스포세린, 포스포트로신)[10][12]으로 대장균에서 번역 단백질을 생성하는 것과 같은 새로운 기능의 많은 레퍼토리를 가능하게 한다.
설립 연구는 Rolf Furtner에 의해 보고되었으며, Rolf Furtner는 단독으로 효모 tRNA/PhePheRS 쌍을 사용하여 E.[13]coli에 p-요오드페닐알라닌을 포함시켰다.
단백질에 포함된 부자연 아미노산은 특정 X선 결정학 연구를 용이하게 하기 위해 무거운 원자를 포함하는 아미노산, 새로운 입체/패킹 및 전자 특성을 가진 아미노산, 시험관내 또는 생체내 단백질-단백질 상호작용을 프로브하는데 사용될 수 있는 광교차 아미노산, 케토, 아세틸렌, 아지드화 및 붕소를 포함한다.생체외 또는 생체내 단백질에 많은 수의 생물물리학적 프로브, 태그 및 새로운 화학작용기를 선택적으로 도입하기 위해 사용할 수 있는 섭취함유 아미노산, 전자전달 탐침을 위한 레독스 활성아미노산, 생물학적 과정을 광레귤레이션하기 위한 광이성 아미노산, 금속결합촉매 및 금속 이온 감지용 아미노산, 단백질 구조와 역학을 프로브하기 위한 형광 또는 적외선 활성 측쇄를 포함하는 아미노산, 골격 구조 및 수소 결합 상호작용 프로브로서의 α-히드록시산 및 D-아미노산, 포스트 t 프로브로서의 황산 아미노산 및 인산화 아미노산의 마이메틱스몸값의 [14][15][16]수정
비표준 아미노산의 가용성은 유기체가 배지에서 아미노산을 수입하거나 생합성해야 한다.첫 번째 예에서는 먼저 광학적으로 순수한 [17]L자 형태로 화학적으로 합성된다.그런 다음 세포의 [10]배지에 첨가된다.복합물의 라이브러리는 보통 새로운 아미노산의 통합에 사용하기 위해 테스트되지만, 예를 들어 다양한 운송 시스템이 근극성 측쇄를 가진 부자연스러운 아미노산을 처리할 수 있는 것은 항상 필요한 것은 아닙니다.두 번째 경우, 생합성 경로는 예를 들어 염기성 탄소원으로부터 새로운 아미노산(p-아미노페닐알라닌)을 생합성하여 유전자 [16][18][19]코드에 포함하는 대장균주를 엔지니어링할 필요가 있다.또 다른 예로는 천연 대사물인 포스포세린의 생산으로 포스포세린의 [12]생산량을 증가시키기 위해 경로 플럭스의 변경이 필요했다.
코돈 할당
이 시스템의 또 다른 요소는 새로운 아미노산에 할당하는 코돈이다.
유전자 코드 확장의 큰 문제는 자유로운 코돈이 없다는 것이다.유전자 코드는 원시 진화의 다양한 단계의 명백한 징후를 보여주는 무작위적이지 않은 레이아웃을 가지고 있지만, 그 이후 제 자리에 동결되어 거의 보편적으로 [20]보존되고 있다.그럼에도 불구하고, 어떤 코돈들은 다른 코돈들보다 더 희귀하다.실제로 대장균(및 모든 유기체)에서 코돈 사용은 동일하지 않지만 몇 가지 희귀한 코돈(표 참조)을 나타내며, 가장 희귀한 코돈은 호박정지 코돈(UAG)이다.
| 코돈 | 아미노산 | 풍족도(%) |
|---|---|---|
| UUU | Pe(F) | 1.9 |
| UUC | Pe(F) | 1.8 |
| UUA | Leu(L) | 1.0 |
| UUG | 레우(L) | 1.1 |
| CUU | 레우(L) | 1.0 |
| CUC | 레우(L) | 0.9 |
| CUA | 레우(L) | 0.3 |
| 특정 회원 정보 | 레우(L) | 5.2 |
| AUU | 아이 소류신(나는) | 2.7 |
| 탄산 암모늄-우라닐 | 아이 소류신(나는) | 2.7 |
| AUA | 아이 소류신(나는) | 0.4 |
| 8월 | 충족(M) | 2.6 |
| GUU | 발(V) | 2.0 |
| GUC | 발(V) | 1.4 |
| GUA | 발(V) | 1.2 |
| GUG | 발(V) | 2.4 |
| UCU | 서버(S) | 1.1 |
| UCC | 서버(S) | 1.0 |
| UCA | 서버(S) | 0.7 |
| UCG | 서버(S) | 0.8 |
| CCU | 프로(P) | 0.7 |
| CCC | 프로(P) | 0.4 |
| CCA | 프로(P) | 0.8 |
| CCG | 프로(P) | 2.4 |
| ACU | Thr(T) | 1.2 |
| ACC | Thr(T) | 2.4 |
| ACA | Thr(T) | 0.1 |
| ACG | Thr(T) | 1.3 |
| GCU | Ala(A) | 1.8 |
| GCC | Ala(A) | 2.3 |
| GCA | Ala(A) | 0.1 |
| GCG | Ala(A) | 3.2 |
| UAU | Tyr(Y) | 1.6 |
| UAC | Tyr(Y) | 1.4 |
| UAA | 이제 그만 | 0.2 |
| UAG | 이제 그만 | 0.03 |
| CAU | 그의 (H) | 1.2 |
| CAC | 그의 (H) | 1.1 |
| CAA | GLN(Q) | 1.3 |
| CAG | GLN(Q) | 2.9 |
| AAU | ASN(N) | 1.6 |
| AAC | ASN(N) | 2.6 |
| AAG | Lys(K) | 3.8 |
| 아 | Lys(K) | 1.2 |
| GAU | ASP(D) | 3.3 |
| GAC | ASP(D) | 2.3 |
| GAA | Glu(E) | 4.4 |
| 입을 다물다 | Glu(E) | 1.9 |
| UGU | Cys(C) | 0.4 |
| UGC | Cys(C) | 0.6 |
| UGA | 이제 그만 | 0.1 |
| UGG | Trp(W) | 1.4 |
| CGU | Arg(R) | 2.4 |
| CGC | Arg(R) | 2.2 |
| CGA | Arg(R) | 0.3 |
| CGG | Arg(R) | 0.5 |
| AGU | 서버(S) | 0.7 |
| AGC | 서버(S) | 1.5 |
| AGA | 서버(S) | 0.2 |
| AGG | 서버(S) | 0.2 |
| GGU | 글리(G) | 2.8 |
| GGC | 글리(G) | 3.0 |
| GGC | 글리(G) | 0.7 |
| GGA | 글리(G) | 0.9 |
황색 코돈 억제
코돈 재할당 가능성은 1990년 노먼리 외 연구진이 UAG("황색")에서 [22]읽은 대장균의 생존 가능한 돌연변이 변종이 코돈을 막았을 때 실현했다.이는 이 코돈의 희귀성과 릴리스 팩터1만으로 황색 코돈이 변환을 종료하기 때문에 가능했습니다.이후 슐츠 연구실에서는 호박 [23]코돈의 기본값인 STOP 대신 고균인 Methanococcus jannaschii의 [6]tRNATyr/tyrosyl-tRNA 합성효소(TyrRS)를 사용해 티로신을 도입했다.이것은 서로를 인식하지 못하는 내생성 박테리아 합성효소와 직교성 고생합성효소의 차이 때문에 가능했다.이어서 이 그룹은 비표준 아미노산 O-메틸티로신을 [6]이용하기 위해 직교 tRNA/신타아제 쌍을 발전시켰다.그 뒤를 이어 더 큰 나프틸알라닌과[24] 광가교 벤조일페닐알라닌이 [25]나타나 시스템의 잠재적 효용성을 입증했다.
호박 코돈은 대장균에서 가장 적게 사용되는 코돈이지만, 그것을 탈취하는 것은 상당한 체력 저하를 초래한다.실제로 한 연구에서는 판독치의[26] 영향을 크게 받는 펩타이드가 최소 83개 이상 있었으며, 라벨 표시는 불완전했다.그 결과, 유전자에서 모든 호박 코돈을 제거하는 것을 포함하여, 건강 비용을 줄이기 위해 여러 변종이 만들어졌다.대부분의 대장균 K-12 균주(바이러스).대장균(분자생물학) 균주 혈통에는 314개의 UAG 저지 코돈이 있습니다.그 결과, 이것들을 대체하기 위해 엄청난 양의 작업이 투입되었습니다.교수 그룹에 의해 개척된 하나의 접근법.Harvard의 George Church는 CAGE에서 MAGE로 불렸습니다.이것은 모든 UAG 코돈을 제거하기 위한 다중 변환과 후속 변형 재조합에 의존했습니다.후자는 첫 번째 논문에서 [27]중단점을 제시했지만 극복되었습니다.그 결과 대장균 균주 C321이 나왔다.모든 UAG 코돈과 [28]RF1이 결여되어 있다.이것은 아미노산 비페닐알라닌을 구조적으로 요구하기 위해 몇 가지 핵심 효소를 진화시킴으로써 아미노산 비페닐알라닌에 "중독"되도록 하는 실험을 할 수 있게 했고, 따라서 확장된 유전자 코드를 긍정적인 선택 하에 [29]놓았습니다.
희귀 감지 코돈 재할당
황색 코돈 외에 희귀 감지 코돈도 사용 대상으로 검토되고 있습니다.AGG 코돈은 아르기닌을 코드하지만 균주는 6-N-알록시카르보닐-리신을 코드하도록 성공적으로 [30]수정되었습니다.또 다른 후보로는 AUA 코돈이 있는데, 이는 각각의 tRNA가 메티오닌을 코드하는 AUG와 분화해야 한다는 점에서 특이하다(원래는 이소류신, 따라서 그 위치).이를 위해 AUA tRNA는 특별한 염기인 리시딘을 가지고 있다.합성효소(TILS)의 삭제는 Mycoplasma mobile(리시딘 없음)으로 네이티브 tRNA를 대체한 덕분에 가능했다., 유전 코드 확장에 사용될 허용하는 것이 변형 AUA의 모든 인스턴스를 잃도록 강요하는 것을 향한 건강은 첫 발자국이다.[31일]
4개의 베이스(쿼드러플렛) 코돈
![[icon]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/Wiki_letter_w_cropped.svg/40px-Wiki_letter_w_cropped.svg.png){kind=small} | 이 섹션은 확장해야 합니다.추가하시면 됩니다. (2015년 2월) |
트리플렛 코돈이 자연에서 유전 코드의 기초인 반면, 프로그래밍된 +1 프레임 시프트는 [32]아미노산을 부호화하기 위해 4뉴클레오티드 배열(쿼드러플렛 코돈)을 사용할 수 있는 자연스러운 과정이다.유전자 코드 공학의 최근 발전은 또한 4중항 코돈이 실험 [33][34][35]조건 하에서 비표준 아미노산을 부호화하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.이를 통해 Huisgen 시클로디션에 [36]의해 서로 가교하는 두 개의 부자연 아미노산인 p-아지도페닐알라닌(pAzF)과 N6-[(2-propynyloxy) 카르보닐]라이신(CAK)을 동시에 사용할 수 있었다.야생형 비기록 균주의 4배 복호화는 매우 [36]비효율적이다.이는 3원복합체 또는 기타 번역 컴포넌트와 엔지니어링된 tRNA 간의 상호작용이 세포 내인성 번역 [37]요소만큼 바람직하지 않고 강력하지 않다는 사실에서 비롯됩니다.이 문제는 특히 4중 코돈을 비기록 [38]변형으로 디코딩할 수 있는 tRNA를 엔지니어링하고 발전시킴으로써 해결할 수 있습니다.이 방법으로 최대 4개의 서로 다른 직교 tRNA/tRNA 합성효소 쌍을 생성할 수 있다.[39] 4중 코돈 해독 접근법은 HIV-1 [40]백신 구축에도 적용되고 있다.
tRNA/합성효소쌍
또 다른 중요한 요소는 tRNA/synthetase 쌍입니다.
합성효소 및 tRNA의 직교 세트는 다른 새로운 아미노산으로 tRNA를 충전하기 위해 유도 진화를 통해 변이되고 스크리닝될 수 있다.쌍을 포함하는 플라스미드에 대한 돌연변이는 오류 발생 가능성이 높은 PCR 또는 합성효소의 활성 부위에 대한 퇴행성 프라이머를 통해 도입될 수 있다.선택은 2단계 과정의 여러 라운드를 수반하며, 여기서 플라스미드는 이른 호박 코돈과 함께 클로람페니콜 아세틸전달효소를 발현하는 세포로 이행된다.독성 클로람페니콜과 비천연 아미노산의 존재 하에서, 살아남은 세포는 표준 아미노산 또는 비천연 아미노산과 직교 tRNA 아미노아실화를 사용하여 호박 코돈을 덮어쓸 것이다.전자를 제거하기 위해 플라즈미드는 조기호박코돈을 가진 바나제 유전자(독성)를 가진 세포에 삽입되지만 비천연아미노산은 없는 세포에 삽입되어 비천연아미노산을 [6]특이하게 인식하지 않는 직교합성효소를 모두 제거한다.tRNA를 다른 코돈으로 재코딩할 뿐만 아니라 4베이스 코돈을 인식하도록 변환하여 추가 무료 코딩 [41]옵션을 사용할 수 있습니다.그 결과 비천연아미노산은 단백질 구조와 기능을 탐색하거나 실용적 목적을 위해 신규 또는 강화된 단백질을 생성하기 위해 다양한 물리화학적, 생물학적 특성을 도입한다.
모형 유기체의 직교 집합
합성효소가 내인성 tRNA를 잘못 아미노아실화하거나 tRNA가 내인성 합성효소에 의해 잘못 아미노아실화 될 수 있기 때문에 한 유기체에 작용하는 직교 합성효소와 tRNA 쌍은 다른 유기체에 작용하지 않을 수 있다.그 결과, 지금까지 작성된 세트는 유기체마다 다릅니다.
 | 이 섹션에서는 사용되는 코돈과 새로운 AA에 대한 정보가 누락되어 있습니다.tRNA 포맷에 대해 검토해 주십시오.은 에 될 수 . (2019년 3월) |
| 짝 | 원천 | 대장균 | 효모균 | 포유동물 | 주 및 참고 자료 |
|---|---|---|---|---|---|
| tRNA-TyRS | 메탄코커스잔나스키이 | 네. | 아니요. | 아니요. | |
| tRNA-리스LysRS | 호리코시이 | 네. | 아니요. | 아니요. | [42] |
| tRNA-GluGluRS | 호리코시이 | 네. | 아니요. | 아니요. | [43] |
| tRNA-LeuRSLeu | tRNA: 돌연변이 할로박테륨 스파. RS: 메타노박테륨 서모자토영양증 | 네. | 아니요. | 아니요. | [44] |
| tRNAAmber-PylRS | 메타노사르치나바케리와 메타노사르치나메이제 | 네. | 네. | 네. | [45] |
| tRNA-3-요오드티로실-RS | 변종 메타노칼도코쿠스 잔나스키이 aaRS | 네. | 아니요. | 아니요. | [46] |
| tRNA-TyRS | 대장균 | 아니요. | 네. | 아니요. | 2003년 [47]보고, 2014년[48] LeuRS에서 언급 |
| tRNAiMet-GlnRS | tRNA: 인간 대장균 | 아니요. | 네. | 아니요. | 오렌지 [49]코돈으로 전환. |
| tRNA-TyRS | tRNA: 대장균 세레비시아에 | 네. | 네. | 아니요. | 오렌지 [49]코돈으로 전환. |
| tRNALeu/Amber-LeuRS | 대장균 | 아니요. | 네. | 네. | 2004년에 보고되었으며 2-아미노옥탄산, o-메틸 티로신 및 o-니트로벤질 시스테인에 [48]대해 돌연변이되었다.4,5-디메톡시-2-니트로벤질세린 [50][51]효모에서 진화하여 4,5-디메톡시-2-니트로벤질-시스테인으로 [52][53]쥐 및 포유동물 세포를 대상으로 테스트. |
| tRNA-TyRS | 스테아로더모필루스균 | 아니요. | 아니요. | 네. | [9] |
| tRNATrp-TrpRS | 서브틸리스균, RS수정 | 아니요. | 아니요. | 네. | 새로운 AA는 5-OH Trp입니다.[54] |
2017년에 부자연스러운 아미노산을 가진 단백질을 생산할 수 있는 확장된 유전자 코드를 가진 쥐가 보고되었다.[55]
직교 리보솜
직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(aaRS)와 유사하게 직교 리보솜은 자연 리보솜과 병렬로 작동하도록 설계되었다.직교 리보솜은 자연 리보솜과 다른 mRNA 전달물을 이상적으로 사용하며, 궁극적으로 별도의 tRNA 풀에도 그려야 한다.이것은 현재 앰버 코돈 억제와 같은 기술에서 여전히 발생하는 체력 상실의 일부를 완화시킬 것이다.또한 직교 리보솜은 4중 코돈의 인식과 같은 특정 작업에 대해 돌연변이 및 최적화될 수 있다.이러한 최적화는 불가능하거나 천연 리보솜에 매우 불리합니다.
o-리보솜
2005년에 천연 mRNA를 인식하지 않고 대신 별도의 직교 mRNA 풀(o-mRNA)[56]을 번역한 리보솜 세 세트가 발표되었다.이는 리보솜의 16S rRNA, 이른바 Anti-Shine-Darlgarno-Sequence에서 mRNA의 인식 시퀀스, 샤인-달가르노 시퀀스 및 해당 인식 시퀀스를 변경함으로써 달성되었다.이렇게 하면 보통 어느 시퀀스가 변환되면 손실되는 기본 쌍이 사용 가능한 상태로 유지됩니다.그러나 16S rRNA의 돌연변이는 기존의 Anti-Shine-Darlgarno 염기쌍화 뉴클레오티드에 제한되지 않았다.
리보-X
2007년 Jason W. Chin 그룹은 직교 리보솜을 제시했는데, 이는 앰버 코돈 [57]억제에 최적화되었다.16S rRNA는 자연 리보솜보다 방출 계수 RF1과 덜 강하게 결합하도록 변이되었다.이 리보솜은 자연 단백질의 억제된 정지 코돈에 의해 야기된 세포 적합성 저하 문제를 제거하지 못했다.그러나 향상된 특이성을 통해 정확하게 합성된 표적 단백질의 수율을 크게 높였다(호박 코돈 1개가 억제되고 2개의 호박 코돈에 대해 <1%에서 >20%로 형성된다).
리보큐
2010년 Jason W. Chin 그룹은 직교 리보솜의 더욱 최적화된 버전을 제시했다.Ribo-Q는 tRNA를 인식하도록 최적화된 16S rRNA로, tRNA는 자연 트리플렛 코돈 [36]대신 쿼드러플렛 코돈을 인식하기 위한 4중항코돈을 가지고 있다.이 방법에서는 가능한 코돈의 수가 64개에서 256개로 증가합니다.다양한 정지 코돈을 설명하더라도, 200개 이상의 다른 아미노산이 잠재적으로 이러한 방식으로 암호화될 수 있습니다.
리보솜 스테이플링
위에서 설명한 직교 리보솜은 모두 16S rRNA의 최적화에 초점을 맞추고 있습니다.지금까지, 최적화된 16S rRNA는 직교 리보솜을 형성하기 위해 자연 대형 서브셋과 결합되었다.대형 리보솜 서브유닛의 주요 RNA 성분인 23S rRNA도 최적화되어야 한다면 직교 리보솜과 천연 리보솜의 조합에 크로스톡이 없음을 보장해야 했다(그림X B 참조).최적화된 23S rRNA가 최적화된 16S rRNA를 가진 리보솜으로만 형성되도록 두 개의 rRNA를 하나의 [58]전사체로 결합했다.23S rRNA의 배열을 16S rRNA 배열의 루프 영역에 삽입함으로써 두 서브유닛은 여전히 기능 접힘을 채택한다.2개의 rRNA는 연결되어 있어 일정한 근접성을 유지하므로 다른 유리 부유 리보솜 서브유닛이 아닌 서로 결합하는 것이 바람직하다.
공학적 펩티딜전달효소센터
2014년에는 23S rRNA의 펩티딜전달효소 중심을 변경함으로써 tRNA의 [59]직교 풀에 끌어당기는 리보솜을 생성할 수 있는 것으로 나타났다.tRNA의 3' 끝은 CCA로 보편적으로 보존된다.tRNA를 리보솜에 결합하기 위해 2개의 구아닌 23S rRNA를 가진 2개의 세포질 염기쌍.이 상호 작용은 번역의 충실성을 위해 필요합니다.그러나 결합뉴클레오티드가 염기쌍이 되도록 공변환함으로써 번역 충실도를 유지할 수 있다.tRNA의 3' 말단은 CCA에서 CGA로, 리보솜 A-사이트와 P-사이트의 2개의 시티딘 뉴클레오티드는 구아니딘으로 변이된다.이것은 자연적으로 발생하는 tRNA를 기질로 받아들이지 않는 리보솜과 천연 리보솜에 의해 기질로 사용될 수 없는 tRNA로 이어진다.
이러한 tRNA를 효과적으로 사용하려면 특정 직교 aaRS에 의해 아미노아실화되어야 한다.가장 자연적으로 발생하는 aaRS는 대응하는 tRNA의 [60][61]3' 말단을 인식한다. 이 3' 변이 tRNA에 대한 aaRS는 아직 이용할 수 없다.지금까지 이 시스템은 직교 tRNA의 아미노아실화가 소위 "플렉시자임"을 사용하여 달성된 시험관 번역 환경에서만 작동하는 것으로 나타났다.플렉시임은 tRNA-아미노-아크릴화 [62]활성을 가진 리보자임이다.
적용들
확장된 유전자 코드와 함께, 부자연스러운 아미노산은 유전적으로 관심 있는 단백질의 선택된 부위로 향할 수 있습니다.이 과정의 고효율과 충실도는 일반적으로 시스테인의 티올기 및 [63]리신의 아미노기와 같은 동일한 유형의 모든 아미노산을 대상으로 하는 번역 후 단백질을 수정하는 것에 비해 수정의 배치를 더 잘 제어할 수 있게 한다.또한 확장된 유전자 코드를 통해 체내 수정을 할 수 있다.연구실에서 합성된 화학물질을 단백질로 사이트 특이적으로 유도할 수 있는 능력은 다음과 같은 매우 어려운 여러 유형의 연구를 가능하게 한다.
- 프로빙 단백질 구조 및 기능:티로신 대신 O-메틸티로신이나 단실알라닌 등 크기가 약간 다른 아미노산을 사용하고, 선택된 단백질 부위에 유전자 코드화된 리포터 부분(색변화 및/또는 스핀활성)을 삽입함으로써 단백질의 구조 및 기능에 대한 화학정보를 측정할 수 있다.
- 단백질 구조 및 기능에서 번역 후 수정의 역할을 탐색하는 방법:포스포세린과 같은 번역 후 변형을 모방한 아미노산을 사용함으로써 생물학적으로 활성 단백질을 얻을 수 있으며 아미노산 혼입의 부위 특이성은 단백질 인산화 작용의 [64][65][66][67]위치, 밀도 및 분포에 대한 정보로 이어질 수 있다.
- 단백질 활성 식별 및 조절:포토매지된 아미노산을 사용함으로써, 단백질 기능은 유기체를 조명함으로써 켜지거나 꺼질 수 있다.
- 단백질의 작용 모드 변경:DNA의 특정 염기서열을 결합하는 단백질의 유전자부터 시작해 결합 부위에 화학 활성 아미노산을 삽입함으로써 DNA를 결합하는 대신 절단하는 단백질로 변환할 수 있다.
- 면역원성 향상 및 자가내성 극복:전략적으로 선택된 티로신을 p-니트로페닐알라닌으로 치환함으로써 내성적인 자가단백질을 [68]면역원성화 할 수 있다.
- 선택된 세포 구성요소의 선택적 파괴: 확장된 유전자 코드를 사용하여, 부자연스럽고 파괴적인 화학적 부분('화학적 탄두'라고도 함)이 특정 세포 [69]구성요소를 대상으로 하는 단백질에 통합될 수 있습니다.
- 더 나은 단백질 생산: 호박 코돈에 3-아이오도티로신을 코드한 비진화 대장균 균주에 대한 T7 박테리오파지의 진화, 그 프로테옴에[70] 요오드티로신의 존재로 인해 야생형보다 집단 적합성을 초래했다.
- 세균 내 [71]단백질 국재성과 단백질-단백질 상호작용을 조사한다.
미래.
유전자 코드의 확대는 아직 초기 단계에 있다.현재 방법론에서는 한 번에 하나의 비표준 아미노산만 사용하지만 이상적으로는 여러 아미노산을 사용할 수 있다.사실, 제이슨 친 그룹은 최근 4개의 부자연스러운 아미노산을 동시에 [72]함유할 수 있는 유전적으로 기록된 E.coli 변종 기록을 깼다.또한 단백질 수율 [73]및 충실도를 개선하기 위해 직교 리보솜과 부자연스러운 tRNA/RS 쌍을 조합할 수 있는 소프트웨어가 개발되어 왔다.
복호화된 합성 게놈
여러 개의 부자연 아미노산의 부호화를 달성하는 한 가지 방법은 다시 작성된 [74]게놈을 합성하는 것이다.2010년 4,000만 달러를 들여 미코플라스마라는 유기체가 [75]합성 게놈에 의해 제어되지만 기록되지 않는 유전체에 의해 제어되는 것이 건설되었다.최초의 유전자 기록 유기체는 George Church와 Farren Isaacs의 연구실 간의 협업에 의해 만들어졌으며, 야생 유형 E.coli MG1655가 모든 알려진 정지 코돈(UAG)으로 대체되었고 방출 인자 1이 외부 유전자와의 상호작용을 제거하기 위해 녹아웃되었다.us는 코돈을 막고 부자연스러운 단백질 [76]합성을 개선한다.2019년에는 천연 [3][2]64가 아닌 61개의 코돈으로 구성된 4메가베이스 기록 게놈으로 대장균 Syn61이 생성됐다.희귀 코돈의 사용을 제거하는 것 외에도, 많은 tRNA가 여러[74] 코돈을 인식하므로 시스템의 특수성을 높일 필요가 있다.
확장된 유전자 알파벳
또 다른 접근법은 핵염기 수를 확장하여 코딩 용량을 증가시키는 것이다.
부자연 염기쌍(UBP)은 실험실에서 생성되고 자연에서는 발생하지 않는 DNA의 설계 서브유닛(또는 핵염기)이다.UBP 시연은 히라오 이치로(s ichiro一郞) 일본 리켄(RIKEN) 연구소에 의해 체외에서 이뤄졌다.2002년에 그들은 2-아미노-8-(2-티에닐) 푸린(s)과 피리딘-2-온(y) 사이에 비표준 아미노산의 [77]단백질로의 부위 특이적 결합을 위해 시험관내 전사 및 번역 기능을 하는 부자연스러운 염기쌍을 개발했다.2006년에는 복제 및 [78]전사를 위한 세 번째 염기쌍으로 7-(2-티에닐)이미다조[4,5-b]피리딘(Ds)과 피롤-2-카르발알데히드(Pa)를 생성했다.그 후 PCR [79][80]증폭에서 Ds와 4-[3-(6-아미노헥사나미도)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(Px)을 고충실성 쌍으로 발견했다.2013년, 그들은 Ds-Px 쌍을 시험관내 선택(SELEX)에 의한 DNA 압타머 생성에 적용하고 유전자 알파벳 확장이 표적 [81]단백질에 대한 DNA 압타머 친화력을 유의하게 증가시킨다는 것을 입증했다.
2012년, 캘리포니아 샌디에고에 있는 스크립스 연구소의 화학 생물학자인 플로이드 롬스버그가 이끄는 미국 과학자 그룹은 그의 팀이 부자연스러운 [82]염기쌍을 설계했다고 발표했다.두 개의 새로운 인공 뉴클레오티드 또는 부자연스러운 염기쌍(UBP)은 "d5SICS"와 "dNaM"으로 명명되었다. 보다 엄밀히 말하면, 소수성 핵산가스를 가진 이러한 인공 뉴클레오티드는 [83][84](d5SICS–dNaM) 복합체 또는 DNA에서 염기쌍을 형성하는 두 개의 융합 방향족 고리를 특징으로 한다.2014년 스크립스 연구소의 같은 팀은 자연 T-A와 C-G 염기쌍을 포함하는 플라스미드로 알려진 원형 DNA를 UBP 롬스버그의 연구소가 설계한 가장 뛰어난 성능의 UBP Romesberg의 실험실과 합성하여 부자연스러운 복제를 성공적으로 수행한 일반적인 박테리아 대장균의 세포에 삽입했다고 보고했습니다.기본 쌍을 여러 [85]세대에 걸쳐 만듭니다.이것은 살아있는 유기체가 확장된 유전자 코드를 따라 다음 [83][86]세대에 전달되는 최초의 알려진 사례이다.이는 부분적으로 d5SICSTP와 dNaMTP의 트리포스페이트를 대장균에 [83]효율적으로 수입하는 뉴클레오티드 삼인산 트랜스포터를 발현하는 지지 조류 유전자를 추가함으로써 달성되었다.그런 다음 자연 세균 복제 경로는 d5SICS–dNaM을 포함하는 플라스미드를 정확하게 복제하기 위해 이들을 사용한다.
살아있는 미생물에 세 번째 염기쌍을 성공적으로 결합하는 것은 DNA에 의해 암호화될 수 있는 아미노산의 수를 크게 확장하여, 살아있는 유기체가 새로운 단백질을 [85]생산할 수 있는 가능성을 확장하는 목표를 향한 중요한 돌파구이다.DNA의 인공 문자열은 아직 아무 의미도 없지만, 과학자들은 그것들이 산업적 또는 [87]의약적으로 사용될 수 있는 새로운 단백질을 생산하도록 설계될 수 있다고 추측한다.
2014년 5월, 연구진은 박테리아 DNA에 2개의 새로운 인공 뉴클레오티드를 성공적으로 도입했으며, 배양 배지에 개별 인공 뉴클레오티드를 포함시킴으로써 박테리아를 24번 통과할 수 있었다고 발표했다.; 그들은 mRNA나 인공 [83][88][89][90]뉴클레오티드를 사용할 수 있는 단백질을 생성하지 않았다.
관련 방법
알로프로틴 생산을 위한 SPI(선택압착) 방법
비표준 아미노산을 가진 단백질을 생산한 많은 연구들이 있었지만, 그것들은 유전자 코드를 바꾸지는 않는다.알로프로틴이라고 불리는 이러한 단백질은 유사한 코드화된 아미노산이 없는 상태에서 부자연스러운 아미노산으로 세포를 배양하여 만들어지는데, 예를 들어 메티오닌(Met)[91]을 위한 L-2-아미노헥산(Ahx)이 단백질로 통합될 수 있도록 한다.
이러한 연구는 표적 tRNA에 천연 기질과 유사한 부자연 아미노산(즉, 아날로그)을 추가하기 위해 아미노아실 tRNA 합성효소의 자연 혼합 활성에 의존한다. 예를 들어, 메티오닐-tRNA 합성효소의 이소류신을 [92]메티오닌으로 오인한다.예를 들어 단백질 결정학에서 셀레노메티오닌을 메티오닌-보조성 균주의 배지에 첨가하면 메티오닌(viz)에 비해 셀레노메티오닌을 함유하는 단백질을 얻을 수 있다.다파장 이상분산([93]이유)또 다른 예는 크로스라벨 단백질에 [94]류신 및 메티오닌 대신 포토류신과 포토메티오닌을 첨가하는 것이다.마찬가지로 일부 텔루 내성 균류는 시스테인과 메티오닌 [95]대신 텔루로시스테인과 텔루로메티오닌을 단백질에 포함할 수 있다.유전자 코드를 확장하는 목적은 아미노산을 대체하는 것이 아니라 하나 이상의 아미노산을 추가하는 것이기 때문에 더 급진적이다.한편 프로테옴 전체의 치환은 글로벌 아미노산 치환에 의해 가장 효율적으로 이루어진다.예를 들어, 천연 아미노산을 불소화 아날로그로 전지구적으로 치환하는 것이 대장균과[96] B. 서브틸리스에서 [97]시도되었다.2015년 Budisa와 Söll은 [98]대장균에서 20899 UGG 코돈에 반응하여 티에노피롤-알라닌에 의한 완전한 트립토판 치환을 보고했다.또한 단백질 접힘 및 안정성과 같은 많은 생물학적 현상은 단백질 [99]배열의 많은 위치에서 상승 효과를 기반으로 한다.
이러한 맥락에서 SPI법은 자연 아미노산을 부자연스러운 [100]것으로 치환함으로써 직접 재조합 단백질 변이체 또는 알로프로틴을 생성한다.표적 단백질 [101]발현 중에 아미노산 보조 영양 발현 호스트에 아미노산 유사체를 보충한다.이 접근법은 억제 기반[102] 방법의 함정을 방지하고 효율성, 재현성 및 극히 단순한 실험 [103]설정 측면에서 이 접근법보다 우수합니다.수많은 연구는 다양한 이성질 유사체로 표준 아미노산을 대체함으로써 최소한의 구조적 섭동이 발생했지만 열역학,[104][105] 접힘, 응집[106] 스펙트럼[107][108] 특성 [109]및 효소 활성의 극적인 변화가 어떻게 발생했는지를 보여주었다.
시험관내 합성
위에서 설명한 유전자 코드 확장은 생체 내이다.다른 대안은 체외 번역 실험을 코드화하는 것이다.이것은 모든 tRNA의 고갈과 화학적으로 아미노아실화된 [110]특정 아미노아실화-tRNA의 선택적 재도입을 필요로 한다.
화학 합성
화학적으로 펩타이드를 생성하는 몇 가지 기술이 있는데, 일반적으로 고체상 보호 화학에 의한 것이다.이것은 모든 (보호된) 아미노산이 초기 배열에 첨가될 수 있다는 것을 의미합니다.
2017년 11월, 스크립스 연구소의 팀은 6개의 다른 핵산을 사용하여 반합성 대장균 게놈을 구성했다고 보고했다.두 개의 추가 '문자'가 세 번째 부자연스러운 기본 쌍을 형성합니다.그 결과 생성된 유기체는 "비자연 아미노산"[111][112]을 사용하여 단백질을 번식시키고 합성할 수 있었다.사용되는 부자연스러운 베이스쌍은 dNaM-dTPT3입니다.[112]이 부자연스러운 염기쌍은 이전에 [113][114]증명된 바 있지만, 이것은 부자연스러운 염기쌍을 사용한 단백질의 전사 및 번역에 대한 첫 보고이다.
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