전자 저온 촬영

Electron cryotomography
이 도식은 전자 단층 촬영의 개념을 보여줍니다.샘플이 다른 각도로 기울어지면 TEM에서 영상화되어 2D 영상(위)의 "틸트 영상 시리즈"가 생성됩니다.그런 다음 이 틸트 영상 시리즈가 계산적으로 3D "토모그램"(하단)으로 재구성됩니다.

전자저온촬영(CryoET)은 샘플의 고해상도(~1~4nm) 3차원 뷰를 생성하는 데 사용되는 이미징 기술이며, 종종 생물학적 고분자 및 [1][2]세포에 국한되지 않는다.CryoET는 샘플이 기울어진 상태에서 영상을 촬영하는 투과형 전자저온현미경(CryoTEM)을 전문적으로 적용해 인체 CT 스캔과 유사한 3D 재구성이 가능하다.다른 전자 단층 촬영 기법과 달리 샘플은 극저온 조건(-150°C 미만)에서 촬영됩니다.세포 소재의 경우, 구조는 비결정("비활성") 얼음에 고정되며, 탈수 또는 화학적 고정 없이 영상을 촬영할 수 있으며, 그렇지 않으면 생물학적 구조를 [3][4]방해하거나 왜곡할 수 있습니다.

기법의 설명

전자 저온 촬영의 예.이미지는 온전한 Bdellovibrio 박테리오 포러스 세포의 단층촬영 재구성을 통해 중앙 슬라이스를 보여줍니다.스케일 바 200 nm.

전자현미경법(EM)에서는 샘플이 고진공 상태에서 촬영된다.이러한 진공상태는 세포와 같은 생물학적 샘플과 양립할 수 없다; 물은 끓어 없어지고, 압력의 차이는 세포를 폭발시킬 것이다.따라서 실온 전자파 기술에서는 샘플이 고정 및 탈수 방식으로 준비됩니다.그러나 생물학적 샘플을 안정화하는 또 다른 접근법은 그것들을 동결시키는 것이다(전자 극저온 현미경 검사).다른 전자 극저온 현미경 검사 기술과 마찬가지로 CryoET(일반적으로 작은 세포(예: 박테리아, 고고학 또는 바이러스)용 샘플은 표준 수성 매체에 준비되고 전자파 그리드에 적용된다.그리드는 물 분자가 결정 [3]격자로 재배열할 시간이 없을 정도로 매우 효율적인 저온(일반적으로 에탄)에 투입됩니다.그 결과 생기는 물의 상태를 "비터러스 얼음"이라고 부르며, 일반적으로 동결에 의해 파괴되는 지질막과 같은 고유의 세포 구조를 보존합니다.급랭 냉동 샘플은 액체 질소의 온도에서 저장 및 이미징되므로 물이 결정화될 정도로 따뜻해지지 않습니다.

샘플은 투과전자현미경(TEM)으로 촬영된다.다른 전자단층촬영기술과 마찬가지로 샘플은 전자빔에 대해 다른 각도(통상 -60°~+60°의 1~2도마다)로 기울어져 각 [5]각 각도로 화상을 취득한다.그런 다음 이 기울어진 영상 시리즈를 관심 [6]물체의 3차원 보기로 계산적으로 재구성할 수 있습니다.이것을 단층 촬영 재구성이라고 합니다.

적용들

투과전자현미경법(TEM)에서는 전자가 물질과 강하게 상호작용하기 때문에 분해능은 시료의 두께에 의해 제한된다.또한 시료를 기울일수록 시료의 두께가 커지며, 더 두꺼운 시료는 전자빔을 완전히 차단하여 이미지를 어둡게 하거나 완전히 검은색으로 만들 수 있습니다.따라서 CryoET의 경우 "대분자" 분해능(~4 nm)을 얻기 위해 샘플의 두께는 약 500 nm 미만이어야 합니다.이러한 이유로, 대부분의 ECT 연구는 정제된 고분자 복합체, 바이러스 또는 많은 종류의 박테리아와 [1]고세균과 같은 작은 세포에 초점을 맞추고 있다.

CryoET에는 저온 절삭 또는 FIB(Focused Ion Beam) 밀링 중 하나를 사용하여 더 큰 셀, 심지어 조직도 준비할 수 있습니다.동결절개에서는 동결된 세포 또는 조직의 블록을 저온 마이크로톰으로 [7]얇은 샘플로 분할한다.FIB-milling에서, 급랭 냉동 샘플은 샘플의 상단과 하단의 물질을 정밀하게 잘라내는 이온 빔(일반적으로 갈륨)에 노출되어 ECT 영상에 적합한 얇은 [8]층을 남깁니다.

전자와 물질의 강한 상호작용은 또한 이방성 분해 효과를 낳는다.이미징 중에 샘플이 기울어짐에 따라 전자빔은 더 높은 기울기 각도에서 비교적 큰 단면적과 상호작용합니다.실제로는 약 60-70°보다 큰 틸트 각도는 많은 정보를 제공하지 않으므로 사용되지 않습니다.이로 인해 최종 Tomogram(토모그램)에서 전자 [6]빔과 병렬로 분해능이 감소하는 정보의 "결측 쐐기"가 발생합니다.

1개 또는 복수의 Tomogram(토모그램)에 복수의 카피에 존재하는 구조의 경우, 서브ogram([9][10]서브토모그램) 평균화에 의해서, 보다 높은 분해능(1 nm 이하도)을 얻을 수 있습니다.단일 입자 분석과 유사하게 서브도 평균화는 동일한 물체의 이미지를 계산적으로 결합하여 신호 대 잡음 비를 증가시킵니다.

CryoET의 주요 장애물은 복잡한 세포 환경 내에서 관심 구조를 식별하는 것입니다.한 가지 솔루션은 상관된 극저온 형광 현미경 검사,[11] 심지어 초해상도 광 현미경 검사(예: Cryo-PALM)[12] 및 CryoET를 적용하는 것입니다.이러한 기술에서는 형광태그 부착 단백질을 포함한 시료를 급랭시켜 우선 특수 스테이지가 장착된 광현미경으로 촬영함으로써 시료를 아결정화 온도(-150°C 미만)로 유지한다.형광 신호의 위치가 식별되고 샘플이 CryoTEM으로 전송되며, CryoET에 의해 동일한 위치가 고해상도로 촬영됩니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ a b Gan, Lu; Jensen, Grant J. (2012-02-01). "Electron tomography of cells" (PDF). Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (1): 27–56. doi:10.1017/S0033583511000102. ISSN 1469-8994. PMID 22082691.
  2. ^ Dodonova, Svetlana O; Aderhold, Patrick; Kopp, Juergen; Ganeva, Iva; Röhling, Simone; Hagen, Wim J H; Sinning, Irmgard; Wieland, Felix; Briggs, John A G (2017-06-16). "9Å structure of the COPI coat reveals that the Arf1 GTPase occupies two contrasting molecular environments". eLife. 6. doi:10.7554/eLife.26691. ISSN 2050-084X. PMC 5482573. PMID 28621666.
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  5. ^ R. Hovden; D. A. Muller (2020). "Electron tomography for functional nanomaterials". MRS Bulletin. 45 (4): 298–304. arXiv:2006.01652. doi:10.1557/mrs.2020.87.
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  10. ^ Schur, Florian K. M.; Dick, Robert A.; Hagen, Wim J. H.; Vogt, Volker M.; Briggs, John A. G. (2015-10-15). "The Structure of Immature Virus-Like Rous Sarcoma Virus Gag Particles Reveals a Structural Role for the p10 Domain in Assembly". Journal of Virology. 89 (20): 10294–10302. doi:10.1128/JVI.01502-15. ISSN 1098-5514. PMC 4580193. PMID 26223638.
  11. ^ Zhang, Peijun (2013-10-01). "Correlative cryo-electron tomography and optical microscopy of cells". Current Opinion in Structural Biology. 23 (5): 763–770. doi:10.1016/j.sbi.2013.07.017. ISSN 1879-033X. PMC 3812453. PMID 23962486.
  12. ^ Chang, Yi-Wei; Chen, Songye; Tocheva, Elitza I.; Treuner-Lange, Anke; Löbach, Stephanie; Søgaard-Andersen, Lotte; Jensen, Grant J. (2014-07-01). "Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography". Nature Methods. 11 (7): 737–739. doi:10.1038/nmeth.2961. ISSN 1548-7105. PMC 4081473. PMID 24813625.

외부 링크