Analisa Protein
Analisa Protein
Analisa Protein
Protein
Sumber: From US Department of Agriculture, Agricultural Research Service (2009). USDA National Nutrient Database for Standard Reference.
Release 22. Nutrient Data Laboratory Home Page, http://www.ars.usda.gov/ba/bhnrc/ndl
Metode analisa Protein
1. Analisa Kualitatif
Biuret, Ninhidrin
2. Analisa Kuantitatif
Kjedahl, Lawry Method, Titrasi Formol
Metode Kjedahl
– Prinsip dasar:
– Mengukur kadar protein secara kasar melalui perhitungan
banyaknya kandungan N (nitrogen) yang ada pada produk
pangan
– Menghitung jumlah Nitrogen bebas pada bahan pangan
kemudian dikonversi menjadi kadar protein melalui perhitungan
Faktor Konversi (FK)
1. Destruksi
– Prinsip
– Protein dan berbagai komponen lain yang ada dalam bahan pangan didestruksi atau
dipecah dengan bantuan asam sulfat dan katalis untuk menghasilkan Nitrogen bebas
– Dengan penambahan potassium permanganat akan terbentuk reaksi oksidasi yang
sempurna
– Pada tahap ini semua total Nitrogen bebas akan tertangkap dan terkonversi
membentuk Amonium Sulfat
2. Destilasi
– Pada tahap ini terjadi perubahan amonium sulfat menjadi gas amonium yang
kemudian ditangkap oleh asam borat berlebih (4%), membentuk ion amonium
dan ion borat
3. Titrasi
– Ion amonium borat yang tidak stabil kemudian dititrasi dengan menggunakan
larutan asam hidroklorida (HCl) standar
Destruksi
Titrasi
Keunggulan dan Kelemahan
Keunggulan Kelemahan
– Dapat diaplikasikan pada semua – Mengukur semua total N (senyawa
jenis produk pangan lain yang memiliki N terukur sebagai
– Tidak mahal (metode terpisah, tidak protein)
automatis) – Membutuhkan waktu yang lama (2-
– Akurat untuk mengukur kadar 3 jam)
protein kasar – Menggunakan reagen yang korosif
Metode Biuret
– Prinsip dasar
– Mengukur banyaknya ikatan peptida yang berikatan dengan Cu yang didasarkan
pembentukan warna ungu (purple)
Metode Biuret
sampel
menggunakan BSA
– Intensitas warna (absorbansi) sebanding dengan (Bovine Serum
kandungan protein pada bahan makanan Albumin)
Prinsip Kerja
Sampel Padat Sampel Cair
– Diawali dengan penghancuran dan – Keruh dan jernih
penambahan air disaring – Sampel keruh harus disaring/
– Disentrifuse disentrifuse dulu untuk
– Endapan sebagai sampel menghasilkan sampel jernih (tanpa
endapan)
Persiapan Sampel
– Timbang ekstrak. Ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan air sampai
volume total 1 ml.
– Tambahkan 1 ml TCA (Tri Chloroacetic Acid) 10% agar protein terdenaturasi.
– Sentrifusa 3000 rpm, 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, supernatan
dibuang (dekantasi)
– Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur merata lalu sentrifus kembali untuk
menghilangkan residu TCA. Biarkan mengering pada suhu kamar.
– Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml, campur merata. sampel
– Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan yang tersisa
– 0.1-1.0 ml sampel (dipipet tepat) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diperlakukan
seperti
penetapan standar
Keunggulan dan Kelemahan
Keunggulan Kelemahan
– Lebih murah jika dibanding kjedahl – Absorbansi dapat dipengaruhi oleh
adanya pigmen
– Sangat spesifik terhadap protein
(karena bereaksi dengan ikatan – Tingginya konsentrasi garam
peptida) amonium dapat mempengaruhi reaksi
– Prinsip dasar
– Menggabungkan metode biuret (mereaksikan ion Cu dengan ikatan peptida) dengan
reagen Folin-Ciacalteu yang kemudian bereaksi dengan residu tyrosin dan tryptofan
yang terkandung dalam protein produk pangan membentuk warna biru
Lowry Method Inkubasi 10 menit
pada 50 oC
Dibaca pada
620 nm
Metode Lowry tidak umum digunkan dalam analisa protein pada produk pangan, tetapi digunkana pada
reaksi biokimia protein (protein yang telah dipurifikasi/ isolasi)
Keunggulan dan Kelemahan
Keunggulan Kelemahan
– Sangat sensitif (50-100 kali lebih – Variasi warna yang lebih beragam
dibanding biuret pada protein yang
sensitif dibanding biuret)
berbeda
– Tidak terpengaruh adanya – Intensitas warna tidak selalu
kekeruhan sampel sebanding dengan kadar protein
– Sangat spesifik – Reaksi dapat dipengaruhi oleh
sukrosa, lemak, monosakarida, buffer
– Sederhana dan cepat (1-1,5 jam)
fosfat, amonium sulfat, komponen
sulfihidril.
Bradford
– Prinsip dasar
– Perubahan warna yang terjadi pada Cromassine Brillian Blue yang
membentuk kompleks dengan protein dari warna kemerahan (reddish)
menjadi kebiruan (bluish) yang kemudian dibaca pada panjang
gelombang 465 – 595 nm
– Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi protein
pada produk pangan
– Biasanya digunakan untuk mengukur konsentrasi dalam jumlah kecil
dari proses purifikasi enzym.
Dye Binding
Keunggulan dan Kelemahan
Keunggulan Kelemahan
– Sangat cepat, reaksi dapat terjadi – Mudah terganggu oleh ionic dan
dalam 2 menit non-ionic detergent, ex SDS (sodium
– Reproducible deodecil sulfat)
– Sensitif – Harus menggunakan kuvet gelas,
– Tidak dipengaruhi oleh amonium karena reagen dapat bereaksi
sulfat, polifenol dan karbohidrat dengan kuvet non gelas
– Mengukur protein dan peptida – Variasi warna yang terbentuk lebar
dengan ukuran > 4000 Da
Referensi
– S. Suzanne Nielsen. 2010. Food Analysis, 4th edition. Part II, Compositional
Analysis of Food.
–
Thank You
Materi dapat diunduh di
adelyadesi.lecture.ub.ac.id