Article 

Pullulan–Apple Fiber Biocomposite Films: Optical,   
Mechanical, Barrier, Antioxidant and Antibacterial Properties 
Ângelo Luís 1,2,*, Ana Ramos 3,4 and Fernanda Domingues 1,3 

1  Health Sciences Research Centre (CICS‐UBI), University of Beira Interior, Avenida Infante D. Henrique, 
6200‐506 Covilhã, Portugal; fdomingues@ubi.pt 
2  Pharmaco‐Toxicology Laboratory, UBIMedical, University of Beira Interior, Estrada Municipal 506,   

6200‐284 Covilhã, Portugal 
3  Chemistry Department, Sciences Faculty, University da Beira Interior, Rua Marquês d’Ávila e Bolama,   

6201‐001 Covilhã, Portugal; ammr@ubi.pt 
4  Fiber Materials and Environmental Technologies Research Unit (FibEnTech), University of Beira Interior, 

Rua Marquês d’Ávila e Bolama, 6201‐001 Covilhã, Portugal 
*  Correspondence: angelo.luis@ubi.pt 

Abstract:  More  than  150  million  tons  of  synthetic  plastics  are  produced  worldwide  from 
petrochemical‐based materials, many of these plastics being used to produce single‐use consumer 
products  like  food  packaging.  The  main  goal  of  this  work  was  to  research  the  production  and 
characterization of pullulan–apple fiber biocomposite films as a new food packaging material. The 
optical,  mechanical,  and  barrier  properties  of  the  developed  biocomposite  films  were  evaluated. 
Furthermore, the antioxidant and antibacterial activities of the biocomposite films were additionally 
studied. The results show that the Tensile Index and Elastic Modulus of the pullulan–apple fiber 
Citation: Luís, Â.; Ramos, A.;  films were significantly higher (p‐value < 0.05) when compared to the pullulan films. Regarding the 
Domingues, F. Pullulan–Apple Fiber  water vapor permeability, no significant differences (p‐value < 0.05) were observed in water vapor 
Biocomposite Films: Optical,    transmission rate (WVTR) when the apple fiber was incorporated into the biocomposite films. A 
Mechanical, Barrier, Antioxidant  significant increase (p‐value < 0.05) of water contact angle in both sides of the films was observed 
and Antibacterial Properties.    when the apple fiber was incorporated into pullulan, indicating an increase in the hydrophobicity 
Polymers 2021, 13, 870. 
of the developed biocomposite films. It is worth noting the hydrophobicity of the (rough) upper 
https://doi.org/10.3390/ 
side of the pullulan–apple fiber films, which present a water contact angle of 109.75°. It was possible 
polym13060870 
to  verify the  microbial  growth  inhibition  around  the  pullulan–apple  fiber  films  for  all the  tested 
bacteria. 
Academic Editor: Debora Puglia 

Received: 16 February 2021 
Keywords: pullulan; apple fiber; biocomposites; films; antioxidant activity; antibacterial properties 
Accepted: 8 March 2021   
Published: 11 March 2021 

Publisher’s Note: MDPI stays  1. Introduction 
neutral with regard to jurisdictional  Currently, more than 150 million tons of synthetic plastics are produced worldwide 
claims in published maps and 
from  petrochemical‐based materials,  such as  polyolefins and  polyesters. Many of these 
institutional affiliations. 
plastics are used to produce single‐use consumer products like food packaging [1]. This 
causes a serious environmental problem, as most of those plastics do not degrade when 
  disposed  of  in  the  environment  at  the  end  of  their  life  cycle,  being  recalcitrant  to 
environmental  attack  [1].  Several  studies  have  focused  on  finding  alternatives  for 
Copyright: © 2021 by the authors. 
conventional  petroleum‐derived  plastics  using  biopolymers  or  low‐cost  biomass  with 
Licensee MDPI, Basel, Switzerland. 
This article is an open access article 
comparable  properties  [2].  Biopolymers  from  agricultural  resources,  such  as  starch, 
distributed under the terms and 
cellulose,  proteins,  and  pectin  [3],  which  could  be  degraded  in  a  few  months,  can  be 
conditions of the Creative Commons  applied  to  the  sustainable  production  of  packaging  materials  since  they  are 
Attribution (CC BY) license  biodegradable, non‐toxic, and recyclable [4]. 
(http://creativecommons.org/licenses Contamination  of  processed  foods  by  foodborne  pathogens  is  an  important  safety 
/by/4.0/).  issue  for  consumers  and  food  processors.  To  address  this  question,  food‐compatible, 

 
Polymers 2021, 13, 870. https://doi.org/10.3390/polym13060870  www.mdpi.com/journal/polymers 
Polymers 2021, 13, 870  2  of  15 
 

plant‐derived  antimicrobials  could  reduce  surface  contamination  of  food  products  [5]. 
Antimicrobial edible films produced from plant‐derived foods could offer an additional 
level  of  protection  against  microbial  spoilage  of  food,  as  well  as  meet  the  increasing 
consumer  demands  for  safe  and  natural  foods  [6].  The  incorporation  of  natural 
antioxidants obtained from fruit and plant extracts to enhance the shelf‐life of foods has 
also become a widespread strategy [7]. 
Despite  not  being  an  exceptional  dietary  fiber  source,  apples  may  provide  several 
health  benefits  related  to  the  synergy  of  their  fiber  fractions  with  other  nutrients  [8]. 
Dietary fibers  found in apples  are  of  superior  quality than those obtained  from cereals 
since  they  present  higher  solubility  and  concentration  in  additional  health‐promoting 
bioactive compounds [8]. 
Several  studies  have  depicted  the  application  of  apple  by‐products  as  new  raw 
materials for the development of biodegradable materials such as edible films, which also 
have antioxidant activity due to the polyphenols present in apples [4]. However, in earlier 
studies  [4,8],  films  made  solely  by  apple  by‐products  showed  a  weak  film‐forming 
capacity, making their employment unfeasible in food packaging production [4,8]. Due to 
this, other biopolymers are required to be mixed with apple‐derived products to enhance 
their capability to form films [4]. 
Pullulan is a water‐soluble extracellular polysaccharide produced by Aureobasidium 
pullulans  in  cultures  of  sugar  and  starch  [9].  The  linear  polymer  mostly  consists  of 
maltotriose  units  connected  to  each  other  by  α‐(1,6)  glycosidic  bonds  [10].  This  single 
linkage  pattern  gives  pullulan  distinct  physical  properties  to  form  transparent,  strong, 
low‐permeability,  and water‐soluble films  [11].  Despite the  advantageous properties of 
pullulan, its use in food applications is frequently hindered due to its high cost. Therefore, 
pullulan is frequently blended with other biopolymers to reduce the cost, as well as to 
improve the material properties [11]. 
The  main  goal  of  this  work  was,  therefore,  to  research  the  production  and 
characterization  of  pullulan–apple  fiber  biocomposite  films  as  a  new  food  packaging 
material. The optical, mechanical, barrier, antioxidant, and antibacterial properties of the 
biocomposite films developed were further evaluated. 

2. Materials and Methods 
2.1. Reagents 
Pullulan (CAS Number: 9057‐02‐7), with a molar mass of 574.57 g/mol ((C23H42O16)n), 
was supplied by TCI Europe (Zwijndrecht, Belgium). Apple fiber, with a mean particle 
size  of  150  μm,  was  obtained  from  My  Protein  (a  THG  company)  (Voyager  House, 
Manchester;  UK).  Glycerol  (anhydrous)  (CAS  Number:  56‐81‐5)  was  purchased  from 
Merck (Darmstadt, Germany). 

2.2. Biocomposite Films Preparation 
Initially, 2 g of pullulan (2%, w/v) were mixed with 1 g of apple fiber (1%, w/v) at 
room temperature in 100 mL of distilled water. This mixture was stirred using a magnetic 
stirrer (Heidolph, Schwabach, Germany) (250 rpm) for 15 min. Then, 20% glycerol (w/w, 
relative  to  the  biopolymers)  was included as  a plasticizer  in  the  polymers  mixture and 
stirred  at  room  temperature  for  5  min,  and  at  50  °C  for  another  30  min.  Finally,  this 
mixture was homogenized for 5 min at 10,000 rpm using a disperser IKA T25 Digital Ultra‐
Turrax (Staufen, Germany). The biocomposite films were obtained by casting 16 mL of the 
polymer mixture in polystyrene Petri dishes (9 cm of diameter), which were subsequently 
dried for around 3 h at 60 °C in a forced‐air laboratory oven. Pullulan films not including 
apple  fiber  were  also  produced,  to  be  used  as  a  control.  Finally,  the  dried  films  were 
detached from the Petri dishes and kept under controlled relative humidity (RH) (50 ± 5%) 
and temperature (23 ± 2 °C) [1,2,4,12,13]. 
   

 
Polymers 2021, 13, 870  3  of  15 
 

2.3. Surface Morphology of the Films 
The  surface  morphology  of  the  biocomposite  films  was  observed  by  optical 
microscopy using a Nikon Labophot‐2 microscope (Nikon, Tokyo, Japan) equipped with 
a Leica MC190 HD camera and (Leica, Wetzlar, Germany) controlled by the LAS v4.13 
software (https://imillermicroscopes.com/pages/software‐download). 

2.4. Infrared Spectra 
A  Nicolet  iS10  smart  iTRBasic  Thermo  Fisher  Scientific  (Waltham,  MA,  USA)  was 
used  to  obtain  the  Fourier‐Transform  Infrared  Spectroscopy  (FTIR)  spectra  of  the 
biocomposite  films  between  600  and  4000  cm−1,  acquiring  120  scans  with  4  cm−1  of 
resolution [12]. 

2.5. Thermal Analysis 
A  calorimeter  Netzsch  DSC  204  (GWP,  Munich,  Germany)  was  used to  obtain  the 
Differential  Scanning  Calorimetry  (DSC)  thermograms  of  the  biocomposite  films, 
functioning with the following conditions: an inert atmosphere, a heating rate of 5 °C/min, 
and a temperature ranging from 25 to 500 °C. Before the study, samples of the films were 
maintained  at  105  °C  for  24  h  to  totally  evaporate  the  water,  also  being  obtained  the 
respective baselines [12]. 

2.6. Grammage, Thickness, Mechanical, and Optical Properties 
The biocomposite films’ grammage was determined by the quotient between their 
mass and area (g/m2), according to the ISO 536:1995. An Adamel Lhomargy Model MI 20 
micrometer (TMI, Veenendaal, Netherlands) was used to measure the thickness (μm) of 
the films, considering different random assessments, following the ISO 534:2011 [12,13]. 
The mechanical properties of the biocomposite films (Peak Elongation (%), Tensile 
Index  (N  m/g),  Tensile  Strength  (N/m),  and  Elastic  Modulus  (MPa))  were  determined 
using a Thwing‐Albert Instrument Co. (West Berlin, NJ, USA) tensile tester, adjusting the 
crosshead at 10 mm/min, and the initial grip at 50 mm, following the ISO 1924/1 [12,13]. 
The optical properties of the biocomposite films (color coordinates and transparency) 
were measured using a Color Touch 2 spectrophotometer (Technidyne, New Albany, MS, 
USA).  The  determinations  were  achieved  considering  several  arbitrary  positions  of  the 
films using the illuminant D65 (daylight with a UV component) and an observation angle 
of  10°.  Color  coordinates  L*,  a*,  and  b*  (lightness;  redness/±red‐green; 
yellowness/±yellow‐blue) were obtained [12,13]. 

2.7. Barrier Properties 
2.7.1. Oil Permeability 
Firstly, 5 mL of edible vegetal oil (obtained from sunflower seeds and composed of 
70% linoleic acid, 10% linolenic acid, and 10% oleic acid) (Vitaquell, Hamburg, Germany) 
were put into test tubes, which were then sealed with the biocomposite films. The tubes 
were turned upside down on the surface of a filter paper previously dried at 105 °C for 24 
h and weighed. The oil permeability (OP) (g mm/m2 day) was calculated with the weight 
difference of the filter paper, the thickness of the biocomposite films, the effective contact 
area, and the storage period (24 h) according to the following equation: 
∆
𝑂𝑃 ,  (1) 

where ΔW is the weight difference of the filter paper (g), e corresponds to the thickness of 
the film (mm), A is the contact area (m2), and T is the storage period (days) [14]. 
   

 
Polymers 2021, 13, 870  4  of  15 
 

2.7.2. Water Vapor Permeability 
The water vapor permeability (WVP) (g/Pa day m) and the water vapor transmission 
rate (WVTR) (g/m2 day) were evaluated following the ASTM E96‐00 standard procedure. 
For that, equilibrated test cups containing a desiccant (15 g of anhydrous CaCl2  (Sigma‐
Aldrich, MO, USA), previously dried at 105 °C) were sealed with the biocomposite films. 
Then, the cups were put in a container at 23 ± 2 °C and 50 ± 5% RH, the weight differences 
being checked every 2 h for 48 h. The slope of a linear regression of the weight increase 
versus time was used to determine the gradient [15]. The WVTR and WVP were calculated 
using Equations (2) and (3): 

𝑊𝑉𝑇𝑅 ,  (2) 

where ∆m is the weight change of the test cups (g), T is the test time (h), and A is the test 
area (m2). 

𝑊𝑉𝑃 𝑒,  (3) 

where p is the water vapor pressure at 23 °C (Pa), RH1 is the RH of the container (50%), 
RH2 is the RH inside the cups (0%), and e is the thickness (m) of the biocomposite films. 

2.8. Contact Angle and Surface Free Energy 
The  values  of  the  contact  angles  of  the  biocomposite  films  were  measured  by  the 
sessile  drop  method  using  an  OCAH  200  model  from  DataPhysics  Instruments 
(Filderstadt, Germany), which allowed for image acquisition and data analysis at the same 
time  [12,13].  The  surface  free  energy  (total,  dispersive,  and  polar  components)  of  the 
biocomposite films was calculated by determining the contact angles using three reference 
liquids (distilled water, diiodomethane, and ethylene glycol) [16]. The surface free energy 
components of these liquids were obtained directly from the software [17]. Contact angles 
were taken from six measurements for each liquid and each sample, considering random 
positions of the biocomposite films, the Owens‐Wendt approach being employed in the 
obtention of the surface free energies of the biocomposite films [18]. 

2.9. Antioxidant Activity 
2.9.1. DPPH Free Radical Scavenging Assay 
For  this  assay,  2.9  mL  of  a  DPPH  (2,2‐diphenyl‐1‐picrylhydrazyl)  (Sigma‐Aldrich, 
Missouri,  USA)  solution  (0.1  mM  in  methanol)  were  mixed  with  3  disks  of  the 
biocomposite  films  (6  mm  in  diameter).  Then,  the  absorbances  of  these  mixtures  were 
measured  every  30  min  for  5  h  at  517  nm  against  methanol  (Sigma‐Aldrich,  Missouri, 
USA) as a blank. The mixture of 2.9 mL of the DPPH solution with 100 μL of methanol 
was used as the control sample. The antioxidant activity of the biocomposite films was 
calculated using the following equation [13,19]: 

%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 100,  (4) 

where Acontrol is the absorbance of the control, and Asample is the absorbance of the samples 
(films). 

2.9.2. β‐Carotene Bleaching Test 
Firstly, 50 μL of a β‐carotene solution (20 mg/mL in chloroform (Sigma‐Aldrich, MO, 
USA)) were mixed with linoleic acid (40 μL), Tween 40 (400 μL), and chloroform (1 mL), 
the chloroform being evaporated under vacuum. Then, oxygenated distilled water (100 
mL) was added to the residue, forming an emulsion. Subsequently, 5 mL of the emulsion 
were  mixed  with  3  disks  of  the  biocomposite  films  (6  mm  in  diameter)  in  test  tubes. 
Finally, the tubes were placed in a 50 °C environment for 1 h. The absorbances of these 

 
Polymers 2021, 13, 870  5  of  15 
 

samples  were  measured  at  470  nm  against  a  blank  containing  an  emulsion  prepared 
without the β‐carotene. The mixture of 5 mL of the emulsion with 300 μL of methanol was 
used  as  the  control  sample.  The  antioxidant  activity  of  the  biocomposite  films  was 
calculated  as  the  percentage  of  inhibition  of  β‐carotene  oxidation  using  the  following 
equation [13,19]: 

%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 100,  (5) 

where  At=1h  is  the  absorbance  of  the  samples  (films)  or  the  control  at  the  final  time  of 
reaction, and At=0h is the absorbance of the control at the initial time of reaction. 

2.10. Antibacterial Properties 
The  antibacterial  activity  of  the  biocomposite  films  against  seven  foodborne 
pathogens  (Staphylococcus  aureus  ATCC  25923,  Listeria  monocytogenes  LMG  16779, 
Enterococcus  faecalis  ATCC  29212,  Bacillus  cereus  ATCC  11778,  Salmonella  Typhimurium 
ATCC 13311, Escherichia coli ATCC 25922, and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) was 
evaluated by solid assay. Stock cultures of the bacterial species were maintained at −80 °C 
with 20% (v/v) glycerol. All the bacterial species were cultivated in brain–heart infusion 
agar (BHI) for 24 h before the antibacterial tests [19]. For the solid assay, several microbial 
colonies  were  suspended  in  a  sterile  saline  solution  (NaCl  (Sigma‐Aldrich,  MO,  USA); 
0.85%;  w/v),  adjusting  the  suspension  of  the  inoculums  to  0.5  McFarland  (≈1.5  ×  108 
colony‐forming  units  (CFU)/mL).  Disks  of  the  biocomposite  films  (6  mm  in  diameter) 
were cut under asepsis. Then, the prepared disks were placed on the inoculated Müeller‐
Hinton agar (MHA) or BHI plates. Lastly, the plates were incubated for 18 h at 37 °C. After 
the  incubation  period,  they  were  visually  examined  for  inhibition  zones  and  their 
diameters  were  measured  with  a  pachymeter  [12,13].  Additionally,  the  plates  were 
observed  by  optical  microscopy,  as  described  above,  to  verify  the  microbial  growth 
inhibition  and  the  integrity  of  the  films  after  the  incubation  period.  The  results  were 
achieved by three independent assays. 

2.11. Biodegradability 
To evaluate the biodegradability of the biocomposite films, a soil burial degradation 
test  was  performed.  Small  strips  of  the  biocomposite  films  (2  ×  7  cm)  were  interred  in 
organic soil at a depth of 10 cm and maintained at 50 ± 5% RH and 23 ± 2 °C for 10 days. 
Afterwards, the strips were collected, cleaned with distilled water, and dried in an oven 
(50  °C)  for  24  h.  The  weight  loss  (WL)  was  determined  using  the  following  equation 
[15,20]: 

𝑊𝐿 % 100,  (6) 

where  W  corresponds  to  the  weight  of  the  samples  before  and  after  the  soil  burial 
degradation test. 

2.12. Statistical Analysis 
Overall, the results are shown as the mean ± standard deviation (SD). The IBM SPSS 
Statistics v25 software (https://www.ibm.com/analytics/spss‐statistics‐software) was used 
to  analyze  the  raw  values,  employing  the  Student’s  T‐test  (assuming  the  normal 
distribution of the continuous variables). Differences among means are considered to be 
significant if the p‐value is < 0.05 (a confidence level of 95%). 
   

 
Polymers 2021, 13, 870  6  of  15 
 

3. Results and Discussion 
3.1. Appearance and Surface Morphology of the Films 
The pullulan films appeared to be colorless, transparent, and homogenous (Figure 
1a),  presenting  a  smooth  surface  with  compact  structural  integrity  (Figure  1c).  On  the 
other hand, the pullulan–apple fiber films were yellowish, although transparent (Figure 
1b), with  the apple fiber uniformly  dispersed in  the  pullulan  matrix.  In  addition,  these 
films had a rough surface on the upper side of the film (Figure 1d). In both types of the 
developed  films,  there  were  no  pinholes  formation,  which  will  particularly  affect  their 
barrier properties. 

(a) Pullulan  (b) Pullulan and Apple Fiber 

   
(c) Pullulan  (d) Pullulan and Apple Fiber 

   
Figure  1.  Appearance  of  the  pullulan  film  (a),  pullulan  and  apple  fiber  film  (b),  and  surface  morphology  (optical 
microscopy, magnification: 400 ×) of the pullulan film (c), pullulan and apple fiber film (d). 

3.2. FTIR and DSC Assays 
Figure 2a shows the FTIR spectra of the apple fiber (maximum absorbance = 0.23), 
which present a similar profile to that of the biocomposite films (Figure 2b). Apples are 
particularly rich in pectin, a type of soluble fiber, also a polysaccharide‐like pullulan. 
The  FTIR  spectrum  of  the  pullulan  film  (Figure  2b)  shows  the  infrared  bands 
corresponding  to  CH  vibrations  at  2930  cm−1  and  the  stretching  vibrations  of  the  OH 
groups of the polymer at 3310 cm−1. Furthermore, the CO vibrations of the glycosidic and 
etheric bounds of the pullulan molecule were detected at 929 cm−1, 995 cm−1, 1078 cm−1, 
and 1148 cm−1 (maximum absorbance = 0.48) [12,21]. 
The  FTIR  spectrum  of  the  pullulan–apple  fiber  film  (Figure  2b)  showed  slight 
differences  in  the  zone  of  1800  to  1200  cm−1;  however,  a  considerable  decrease  in  the 
absorbance was noticed at 2930 cm−1, 1078 cm−1, and 995 cm−1, indicating that the apple 
fiber  was  successfully  incorporated  into  the  pullulan  matrix,  suggesting  its  interaction 

 
Polymers 2021, 13, 870  7  of  15 
 

with  the  pullulan  molecules  via  hydrogen  bonds,  which  also  corroborates  the  visual 
aspect of the biocomposite films and their surface morphology, as described above. 
The DSC results (Figure 3) revealed an increase in the glass transition temperature 
(Tg) of the films when the apple fiber was incorporated into pullulan, the value of Tg being 
154.5 °C [9]. This Tg increase suggests that the incorporation of apple fiber in the pullulan 
matrix changed the structure of the biocomposite films and, therefore, their mechanical 
properties [9]. To overcome this change in the mechanical properties, a higher percentage 
of  glycerol  (20%,  w/w),  used  as  a  plasticizer,  was  added  in  the  formulation  of  the 
biocomposite films, aiming to reduce the ratio of the crystalline to the amorphous region 
[22].  However,  in  previous  work,  we  developed  pullulan  films  incorporating  rockrose 
essential oil, and only 15% (w/w) of glycerol was used, taking into account the potential 
plasticizer effect of the essential oil [12]. 

 
Figure 2. FTIR results of the raw apple fiber (a) and the biocomposite films (b). 

   

 
Polymers 2021, 13, 870  8  of  15 
 

 
Figure 3. Differential Scanning Calorimetry (DSC) results of the biocomposite films. 

3.3. Grammage, Thickness, Mechanical, and Optical Properties 
The  grammage  and  thickness  of  the  biocomposite  films  increased  significantly  (p‐
value < 0.05) with the apple fiber incorporation into the pullulan (Table 1). This increase 
was particularly substantial for the thickness, which, in the pullulan films, was 35.59 μm, 
and in the films with apple fiber was 155.87 μm. This result is a consequence of the rough 
surface of the upper side of the biocomposite films. It was previously described that plant‐
based fibers may present a certain degree of inconsistency [23], which also explains the 
roughness observed in the pullulan–apple fiber films. 

Table 1. Grammage, thickness, mechanical, and optical properties of the biocomposite films. 

Properties 1  Pullulan  Pullulan and Apple Fiber  p‐Value 

Grammage (g/m2)  96.18 ± 4.63  131.52 ± 2.78  0.001 * 
Thickness (μm)  35.59 ± 6.54  155.87 ± 11.35  < 0.001 * 
Peak Elongation (%)  221.51 ± 39.07  2.81 ± 0.13  0.010 * 
Tensile Index (N m/g)  0.47 ± 0.06  4.18 ± 0.45  0.004 * 
Mechanical 
Tensile Strength (N/m)  42.05 ± 4.81  550.33 ± 57.37  0.004 * 
Elastic Modulus (MPa)  4.51 ± 0.70  286.39 ± 44.12  0.008 * 
L* (lightness)  28.77 ± 2.08  39.30 ± 0.20  0.012 * 
a* (redness)  −0.12 ± 0.01  0.39 ± 0.07  0.020 * 
Optical 
b* (yellowness)  −1.55 ± 0.14  5.93 ± 0.45  0.002 * 
Transparency (%)  94.13 ± 0.80  87.98 ± 0.24  0.003 * 
1 Results shown as mean ± SD; * Significant result (p‐value < 0.05). 

The mechanical properties of the biocomposite films must be carefully evaluated, as 
they  are  important  when  considering  the  potential  application  of  these  films  in  food 
packaging [24]. In the present study, the Peak Elongation, the Tensile Index, the Tensile 
Strength,  and  the  Elastic  Modulus  of  the  films  were  determined  (Table  1).  The  Peak 
Elongation of the pullulan–apple fiber films was similar to the one of the pullulan films 
incorporated with rockrose essential oil (2.34%) previously developed [12], despite being 
significantly lower (p‐value < 0.05) than the observed for the pullulan films (Table 1). The 
high value of Peak Elongation obtained for the pullulan films may be explained by the 
high  percentage  of  glycerol  used  as  a  plasticizer.  The  high  volumes  of  plasticizer 
decreased the  cohesive forces  amongst  polymer  chains, with the replacement of strong 
interactions  with  hydrogen  bonds.  Moreover,  the  hygroscopic  behavior  of  glycerol 
enhanced the water absorption, which is also a film plasticizer. Consequently, the films 

 
Polymers 2021, 13, 870  9  of  15 
 

became less rigid and more flexible [25]. It was also verified that the Tensile Index of the 
pullulan–apple fiber films was significantly higher (p‐value < 0.05) when compared to the 
pullulan films (Table 1), indicating that the Tensile Strength of the pullulan–apple fiber 
films  was  also  significantly  higher  (p‐value  <  0.05)  (Table  1).  Tensile  Strength  is  the 
evaluation  of  the  maximum  strength  of  a  film  to  withstand  applied  tensile  stress  [26]. 
Furthermore,  the  Elastic  Modulus  of  the  pullulan–apple  fiber  films  was  significantly 
higher (p‐value < 0.05) than that of the pullulan films (Table 1). 
Concerning the optical properties of the biocomposite films (Table 1), it was observed 
that when apple fiber was incorporated, there was a significant increase (p‐value < 0.05) 
in  color  coordinates  (L*,  a*,  and  b*),  which  is  consistent  with  their  yellowish  color. 
Moreover, a significant decrease (p‐value < 0.05) in the transparency was verified in the 
pullulan–apple fiber films (Table 1), as it was also possible to visually observe. 

3.4. Barrier Properties 
The  barrier  properties  of  the  biocomposite  films  were  evaluated  in  terms  of  their 
permeability to water vapor and oil (Table 2) since good barrier properties are a steady‐
state indicator of biodegradable packaging materials [27]. 
Regarding  the  water  vapor  permeability,  it  was  verified  that  no  significant 
differences  (p‐value  <  0.05)  were  observed  in  the  WVTR  when  the  apple  fiber  was 
incorporated  into  the  biocomposite  films  (Table  2).  However,  a  significant  increase  (p‐
value < 0.05) in the WVP was noticed (Table 2), which is related to the higher thickness of 
the pullulan–apple fiber films, as mentioned before. Previous works demonstrated that 
an increase in the thickness of films could result in an increase of WVP, since the resistance 
of the films to water vapor is decreased with the increase of the thickness. Therefore, a 
stagnant air layer is created, characterized by high partial pressure of water vapor on the 
inner film surface [14]. Similar results were observed for the OP of the biocomposite films 
developed (Table 2). It was assumed that glycerol, used as a plasticizer, increased the free 
volume between the pullulan molecules, which made oil permeate easily [14,27]. 

Table 2. Barrier properties of the biocomposite films. 

Permeability 1  Pullulan  Pullulan and Apple Fiber  p‐Value 

WVTR (g/m2 day)  55.50 ± 1.76  41.16 ± 7.06  0.065 
Water vapor 
WVP (g/Pa day m)  1.49 × 10‐6 ± 4.75 × 10−8  4.85 × 10‐6 ± 8.32 × 10−7  0.020 * 
Oil  OP (g mm/m2 day)  3.43 ± 0.08  124.21 ± 9.55  0.002 * 
1 Results shown as mean ± SD; * Significant result (p‐value < 0.05). 

3.5. Contact Angles and Surface Free Energy 
Surface  wettability,  which  is  frequently  described  by  the  water  contact  angle  [28], 
was  determined  in  the  biocomposite  films  using  a  sessile  drop  method.  Based  on  the 
Owens‐Wendt approach, the surface free energy parameters of the films were calculated 
by  the  mean  contact  angles  of  water,  diiodomethane,  and  ethylene  glycol  (Table  3).  A 
significant increase (p‐value < 0.05) of water contact angle in both sides of the films was 
verified  when  apple  fiber  was  incorporated  into  the  pullulan  (Table  3),  indicating  an 
increase in the hydrophobicity of the developed biocomposite films (water contact angle 
is higher than 90° [29]), which is an important finding since food products often present 
high amounts of water. It is worth noting the hydrophobicity of the (rough) upper side of 
the pullulan–apple fiber films, presenting a water contact angle of 109.75°. It is well known 
that the roughness of the surfaces is directly related to the increase of the water contact 
angle,  the  so‐called  “lotus  effect”  [30],  which  we  also  previously  explored  [15].  Other 
authors  reported  that  one  of  the  most  common  design  strategies  for  making  an  anti‐
wetting surface is to implement the surface roughness [31], which was clearly observed in 
the pullulan–apple fiber films now developed. While the intrinsic wettability of a material 

 
Polymers 2021, 13, 870  10  of  15 
 

depends  primarily  on  its  surface  free  energy,  the  role  of  surface  roughness  becomes 
critical when fabricating anti‐wetting surfaces [31]. 
It was observed that the total surface free energy (the sum of the polar and dispersive 
components of surface energy) of both types of films was not significantly different (p‐
value > 0.05) (Table 3) despite presenting significantly different (p‐value < 0.05) surface 
free energy components (polar and dispersive) (Table 3), which will affect their interfacial 
interactions with liquids and thereby would show different wettability [31]. 

Table 3. Contact angles and surface free energy of the biocomposite films. 
Pullulan  Pullulan and Apple Fiber 
Properties 1  Lower Side  Upper Side  p‐Value 
Lower Side a  Upper Side b 
(smooth) c  (rough) d 
< 0.001 ac* 
Water contact angle (°)  66.17 ± 1.79  64.99 ± 3.11    99.69 ± 2.11  109.75 ± 4.83 
< 0.001 bd* 
0.001 ac* 
Diiodomethane contact angle (°)  31.42 ± 1.32  37.05 ± 0.43  44.72 ± 1.87  41.82 ± 2.02 
0.049 bd* 
0.001 ac* 
Ethylene glycol contact angle (°)  59.06 ± 1.95  49.93 ± 0.78  44.72 ± 1.87  41.82 ± 2.02 
0.011 bd* 
0.361 ac 
Total surface free energy, ɤT (mN/m)  40.92 ± 2.04  43.10 ± 2.15  42.43 ± 1.39  41.33 ± 0.52 
0.288 bd 
0.001 ac* 
Polar component, ɤP (mN/m)  27.62 ± 1.37  31.25 ± 1.55  1.13 ± 0.33  2.95 ± 0.43 
< 0.001 bd* 
< 0.001 ac* 
Dispersive component, ɤD (mN/m)  13.28 ± 0.65  11.84 ± 0.58  41.29 ± 1.37  38.38 ± 0.29 
< 0.001 bd* 
1 Results shown as mean ± SD; superscript letters (a, b, c, d) identify the pairs of samples under 
statistical comparison; * Significant result (p‐value < 0.05). 

3.6. Antioxidant Activity 
The antioxidant capacity of the biocomposite films was examined by quantifying the 
constant  release  of  antioxidant  compounds  into  the  reaction  mixture,  evaluated  by  the 
DPPH free radical scavenging method, as shown in Figure 4. 

 
Figure 4. Antioxidant capacity of the biocomposite films measured by DPPH assay. 

The  obtained  results  indicated  that  the  DPPH  scavenging  capacity  was  clearly 
associated (R2 = 0.9642) with the time of reaction in the case of the pullulan–apple fiber 
films after the 2 h of reaction (before that, there was no antioxidant activity), while the 
pullulan films presented no capacity to scavenge the DPPH free radicals (Figure 4). These 
results  may  be  explained  by  the  presence  of  several  polyphenolic  compounds  in  apple 

 
Polymers 2021, 13, 870  11  of  15 
 

fiber  that  were  able  to  be  released  from  the  biocomposite  films  and  to  scavenge  free 
radicals, as described previously by other authors [8,32,33]. 
Moreover, the pullulan–apple fiber films were able to hinder the lipid peroxidation, 
assessed by a β‐carotene bleaching test (Table 4). The presence of antioxidants associated 
with apple  fiber,  like polyphenols,  may  be  responsible  for  this protective  effect against 
oxidation [8]. 
Overall, these findings evidence that not only can apple fiber be incorporated into 
pullulan films, reducing the quantity of pullulan needed to produce films, but also that 
when the apple fiber was added to the films, they acquired antioxidant properties, which 
could be beneficial to extending the shelf‐life of packaged foods. 

Table 4. Antioxidant activity (β‐carotene bleaching test) and weight loss (biodegradability) of the 
biocomposite films. 
Properties 1  Pullulan  Pullulan and Apple Fiber  p‐Value 
β‐carotene bleaching test  Inhibition (%)  0.00 ± 0.00  0.96 ± 0.06  0.001 * 
Biodegradability  Weight loss (%)  100.00 ± 0.00  100.00 ± 0.00  > 0.05 
1
 Results shown as mean ± SD; * Significant result (p‐value < 0.05). 

3.7. Antibacterial Properties 
The  antibacterial  activity  of  the  biocomposite  films  was  evaluated  by  solid  assay, 
with the inhibition zones diameters being measured (Table 5). It was observed that the 
pullulan–apple fiber films were able to cause bacterial cell retraction at the contact area 
with  a  clear  inhibition  zone  for  the  tested  Gram‐positive  and  Gram‐negative  bacteria, 
contrariwise to what was noted for the pullulan films. Once more, the functionalization 
of  the  biocomposite  films  was  achieved  by  the  incorporation  of  apple  fiber  into  the 
pullulan matrix, probably due to the bioactive compounds, like polyphenols, present in 
the apple fiber. Other authors developed polysaccharide‐based edible coatings enriched 
with apple fiber and concluded that its incorporation into the formulations had a marked 
effect in reducing psychrophilic and mesophilic counts [8]. 

Table 5. Antibacterial properties of the biocomposite films. 
Pullulan and Apple Fiber 
Diameters of Inhibition Zones 1  Pullulan  Lower Side  Upper Side  p‐Value 
(smooth)  (rough) 
Staphylococcus aureus ATCC 25923  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Listeria monocytogenes LMG 16779  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Enterococcus faecalis ATCC 29212  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Bacillus cereus ATCC 11778  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Salmonella typhimurium ATCC 13311  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Escherichia coli ATCC 25922  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853  0.00 ± 0.00 (‐)  6.00 ± 0.00 (+)  6.00 ± 0.00 (+)  < 0.001 * 
1 Results shown as mean ± SD; (‐) bacterial growth on the top of the films; (+) bacterial cell 
retraction at the contact area with a clear inhibition zone; * Significant result (p‐value < 0.05). 

The results of antibacterial activity were also confirmed by optical microscopy. By 
observing the images presented in Table 6, it was possible to verify the microbial growth 
inhibition around the pullulan–apple fiber films for all the tested bacteria. Furthermore, 
the antibacterial effect was similar on both sides of the biocomposite films. Additionally, 
the images showed that the pullulan–apple fiber films maintain their integrity over the 
incubation period, contrary to what was observed for the pullulan films that dissolved 
along  the  incubation  period.  The  obtained  results  suggest  the  relevance  of  the 
biocomposite films developed in this work for future applications in food packaging. 

 
Polymers 2021, 13, 870  12  of  15 
 

Table 6. Optical microscopy images of antibacterial activity (Magnification: 400×). 
Pullulan and Apple Fiber 
Pullulan 
Lower Side (smooth)  Upper Side (rough) 
Staphylococcus aureus ATCC 25923 

Colonies  Colonies  Colonies  Film 

Film 

     
Listeria monocytogenes LMG 16779 

Colonies  Colonies  Film 

Colonies 
Film 
     
Enterococcus faecalis ATCC 29212 

Colonies  Film  Colonies  Film 

Colonies 

     
Bacillus cereus ATCC 11778 

Colonies  Film  Colonies 

Colonies 

Film 
     
Salmonella Typhimurium ATCC 13311 

Colonies  Colonies  Film  Colonies  Film 

     
   

 
Polymers 2021, 13, 870  13  of  15 
 

Escherichia coli ATCC 25922 

Colonies  Colonies  Colonies 

Film  Film 
     
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 

Colonies  Film  Film 

Colonies 
Colonies 
     

3.8. Biodegradability 
A biodegradability test is a very valuable tool to help understand the environmental 
compatibility  of  developed  materials.  The  soil  biodegradability  of  food  packaging 
materials  was  already  stated.  Particularly,  the  food  packaging  films  produced  with 
renewable biopolymers exhibited appealing soil biodegradable behaviors [34]. 
The biodegradability test of the developed  biocomposite films  was examined by a 
soil burial degradation test over 10 days (Table 4). It was verified that both types of films 
were completely degraded after 10 days, showing a weight loss of 100%. The addition of 
the apple fiber to the pullulan did not alter the biodegradability of the biocomposite films, 
making them appropriate for being put back in the environment without causing adverse 
effects, as other authors have also reported [35]. 

4. Conclusions 
In this work, the incorporation of apple fiber in pullulan was shown to be a novel 
biopolymer  basis  to  produce  edible  and  bioactive  films.  The  biocomposite  films 
developed appeared to be resistant, flexible, and hydrophobic, together with their good 
visual aspect. Besides that, they were capable of scavenging free radicals, inhibiting lipid 
peroxidation, and inhibiting the growth of known foodborne pathogens. 
The  obtained  results  indicate  that  the  pullulan–apple  fiber  biocomposite  films 
developed in this work present a strong potential and are a promising material to develop 
new biodegradable alternatives to package foods, avoiding the use of traditional plastics. 

Author Contributions: Conceptualization, Â.L. and F.D.; methodology, Â.L. and A.R.; formal 
analysis, A.R. and F.D.; resources, Â.L., A.R. and F.D.; data curation, Â.L.; writing—original draft 
preparation, Â.L.; writing—review and editing, A.R. and F.D. All authors have contributed 
significantly to this version of the manuscript and have read and agreed to its publication. All 
authors have read and agreed to the published version of the manuscript. 
Funding: Ângelo Luís recognizes the contract of Scientific Employment (Microbiology) financed 
by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) under the scope of DL 57/2016. This work was 
partially supported by CICS‐UBI, which is financed by National Funds from FCT and by FEDER 
under the scope of PORTUGAL 2020 CENTRO 2020, within the project UIDB/00709/2020.   
Acknowledgments: Authors acknowledge Ana Paula Gomes (Laboratório de Microscopia 
Eletrónica, UBI) for her assistance in DSC. 
Institutional Review Board Statement: Not applicable. 

 
Polymers 2021, 13, 870  14  of  15 
 

Informed Consent Statement: Not applicable. 
Data Availability Statement: The data presented in this study are available on request from the 
corresponding author. 
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. 

References 
1.  Chiellini, E.; Cinelli, P.; Imam, S.H.; Mao, L. Composite films based on biorelated agro‐industrial waste and poly(vinyl alcohol). 
Preparation and mechanical properties characterization. Biomacromolecules, 2001, 2, 1029–1037. 
2.  Shin,  S.H.;  Kim,  S.J.;  Lee,  S.  H.;  Park,  K.M.;  Han,  J.  Apple  Peel  and  Carboxymethylcellulose‐Based  Nanocomposite  Films 
Containing Different Nanoclays. J. Food Sci., 2014, 79, E342–E353. 
3.  Gustafsson, J.; Landberg, M.; Bátori, V.; Åkesson, D.; Taherzadeh, M.J.; Zamani, A. Development of bio‐based films and 3D 
objects from apple pomace. Polymers, 2019, 11, 289. 
4.  Choi,  I.;  Chang,  Y.;  Shin,  S.H.;  Joo,  E.;  Song,  H.J.;  Eom,  H.;  Han,  J.  Development  of  biopolymer  composite  films  using  a 
microfluidization technique for carboxymethylcellulose and apple skin particles. Int. J. Mol. Sci., 2017, 18, 1278. 
5.  Ravishankar, S.; Zhu, L.; Olsen, C.W.; McHugh, T.H.; Friedman, M. Edible apple film wraps containing plant antimicrobials 
inactivate foodborne pathogens on meat and poultry products. J. Food Sci., 2009, 74, M440–M445. 
6.  Mild, R.M.; Joens, L.A.; Friedman, M.; Olsen, C.W.; McHugh, T.H.; Law, B.; Ravishankar, S. Antimicrobial edible apple films 
inactivate antibiotic resistant and susceptible Campylobacter jejuni strains on chicken breast. J. Food Sci., 2011, 76, M163–M168. 
7.  Du,  W.X.,  Avena‐Bustillos,  R.J.;  Woods,  R.;  Breksa,  A.P.;  McHugh,  T.H.;  Friedman,  M.;  Levin,  C.E.;  Mandrell,  R.  Sensory 
evaluation of baked chicken wrapped with antimicrobial apple and tomato edible films formulated with cinnamaldehyde and 
carvacrol. J. Agric. Food Chem., 2012, 60, 7799–7804. 
8.  Moreira, M.R.; Cassani, L.; Martín‐Belloso, O.; Soliva‐Fortuny, R. Effects of polysaccharide‐based edible coatings enriched with 
dietary fiber on quality attributes of fresh‐cut apples. J. Food Sci. Technol., 2015, 52, 7795–7805. 
9.  Hassannia‐Kolaee, M.; Khodaiyan, F.; Pourahmad, R.; Shahabi‐Ghahfarrokhi, I. Development of ecofriendly bionanocomposite: 
Whey protein isolate/pullulan films with nano‐SiO2. Int. J. Biol. Macromol., 2016, 86, 139–144. 
10.  Niu, B.; Shao, P.; Chen, H.; Sun, P. Structural and physiochemical characterization of novel hydrophobic packaging films based 
on pullulan derivatives for fruits preservation. Carbohydr. Polym., 2019, 208, 276–284. 
11.  Tong, Q.; Xiao, Q.; Lim, L.T. Effects of glycerol, sorbitol, xylitol and fructose plasticisers on mechanical and moisture barrier 
properties of pullulan‐alginate‐carboxymethylcellulose blend films. Int. J. Food Sci. Technol., 2013, 48, 870–878. 
12.  Luís, Â.; Ramos, A.; Domingues, F. Pullulan Films Containing Rockrose Essential Oil for Potential Food Packaging Applications. 
Antibiotics, 2020, 9, 681. 
13.  Luís,  Â.;  Gallardo,  E.;  Ramos,  A.;  Domingues,  F.  Design  and  characterization  of  bioactive  bilayer  films:  Release  kinetics  of 
isopropyl palmitate. Antibiotics, 2020, 9, 443. 
14.  Yan, Q.; Hou, H.; Guo, P.; Dong, H. Effects of extrusion and glycerol content on properties of oxidized and acetylated corn 
starch‐based films. Carbohydr. Polym., 2012, 87, 707–712. 
15.  Luís,  Â.;  Domingues,  F.;  Ramos,  A.  Production  of  Hydrophobic  Zein‐Based  Films  Bioinspired  by  The  Lotus  Leaf  Surface: 
Characterization and Bioactive Properties. Microorganisms, 2019, 7, 267. 
16.  Luís, Â.; Silva, F.; Sousa, S.; Duarte, A.P.; Domingues, F. Antistaphylococcal and biofilm inhibitory activities of gallic, caffeic, 
and chlorogenic acids. Biofouling, 2014, 30, 69–79. 
17.  Good, R.; van Oss, C. The modern theory of contact angles and the hydrogen bond components of surface energies, in Modern 
approaches to wettability applications, M. Schrader and G. Loeb, Eds. New York: Plenum Press, 1991, 1–27. 
18.  Silva, Â.; Duarte, A.; Sousa, S.; Ramos, A.; Domingues, F.C. Characterization and antimicrobial activity of cellulose derivatives 
films incorporated with a resveratrol inclusion complex. LWT–Food Sci. Technol., 2016, 73, 481–489. 
19.  Luís, Â.; Pereira, L.; Domingues, F.; Ramos, A. Development of a carboxymethyl xylan film containing licorice essential oil with 
antioxidant properties to inhibit the growth of foodborne pathogens. LWT‐Food Sci. Technol., 2019, 111, 218–225. 
20.  Kumar, D.; Kumar, P.; Pandey, J. Binary grafted chitosan film: Synthesis, characterization, antibacterial activity and prospects 
for food packaging. Int. J. Biol. Macromol., 2018, 115, 341–348. 
21.  Hezarkhani, M.; Yilmaz, E. Pullulan modification via poly(N‐vinylimidazole) grafting. Int. J. Biol. Macromol., 2019, 123, 149–156. 
22.  Ramos, Ó.L.; Fernandes, J.C.; Silva, S.I.; Pintado, M.E.; Malcata, F.X. Edible Films and Coatings from Whey Proteins: A Review 
on Formulation, and on Mechanical and Bioactive Properties. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2012, 52, 533–552. 
23.  Mahmud, S.; Hasan, K.M.F.; Jahid, M.A.; Mohiuddin, K.; Zhang, R.; Zhu, J. Comprehensive review on plant fiber‐reinforced 
polymeric biocomposites. J. Mater. Sci., 2021, 56, 7231–7264. 

 
Polymers 2021, 13, 870  15  of  15 
 

24.  Chu, Y.; Xu, T.; Gao, C.; Liu, X.; Zhang, N.; Feng, X.; Liu, X.; Shen, X.; Tang, X. Evaluations of physicochemical and biological 
properties of pullulan‐based films incorporated with cinnamon essential oil and Tween 80. Int. J. Biol. Macromol., 2019, 122, 388–
394. 
25.  Díaz, O.; Ferreiro, T.; Rodríguez‐Otero, J.L.; Cobos, Á. Characterization of chickpea (Cicer arietinum L.) flour films: Effects of pH 
and plasticizer concentration. Int. J. Mol. Sci., 2019, 20, 1246. 
26.  Liang, J.; Yan, H.; Zhang, J.; Dai, W.; Gao, X.; Zhou, Y.; Wan, X.; Puligundla, P. Preparation and characterization of antioxidant 
edible chitosan films incorporated with epigallocatechin gallate nanocapsules. Carbohydr. Polym., 2017, 171, 300–306. 
27.  Sun, H.; Shao, X.; Jiang, R.; Shen, Z.; Ma, Z. Mechanical and barrier properties of corn distarch phosphate‐zein bilayer films by 
thermocompression. Int. J. Biol. Macromol., 2018, 118, 2076–2081. 
28.  Chen, G.; Ali, F.; Dong, S.; Yin, Z.; Li, S.; Chen, Y. Preparation, characterization and functional evaluation of chitosan‐based 
films with zein coatings produced by cold plasma. Carbohydr. Polym., 2018, 202, 39–46. 
29.  Dong,  F.;  Padua, G.W.;  Wang,  Y.  Controlled  formation  of  hydrophobic  surfaces  by  self‐assembly  of  an  amphiphilic  natural 
protein from aqueous solutions. Soft Matter, 2013, 9, 5933–5941. 
30.  Wang, G.; Guo, Z.; Liu, W. Interfacial effects of superhydrophobic plant surfaces: A Review. J. Bionic Eng., 2014, 11, 325–345. 
31.  Song, K.; Lee, J.; Choi, S.O.; Kim, J. Interaction of surface energy components between solid and liquid on wettability, and its 
application to textile anti‐wetting finish. Polymers, 2019, 11, 498. 
32.  Reis, S.F.; Rai, D.K.; Abu‐Ghannam, N. Apple pomace as a potential ingredient for the development of new functional foods. 
Int. J. Food Sci. Technol., 2014, 49, 1743–1750. 
33.  Serra, A.T.; Matias, A.A.; Frade, R.F.M.; Duarte, R.O.; Feliciano, R.P.; Bronze, M.R.; Figueira, M.E.; Carvalho, A.; Duarte, C.M.M. 
Characterization of traditional and exotic apple varieties from Portugal. Part 2–Antioxidant and antiproliferative activities. J. 
Funct. Foods, 2010, 2, 46–53. 
34.  Yadav,  M.;  Liu,  Y.;  Chiu,  F.  Fabrication  of  Cellulose  Nanocrystal/Silver/Alginate  Bionanocomposite  Films  with  Enhanced 
Mechanical and Barrier Properties for Food Packaging Application. Nanomaterials, 2019, 9, 1523. 
35.  Nouraddini, M.; Esmaiili, M.; Mohtarami, F. Development and characterization of edible films based on eggplant flour and corn 
starch. Int. J. Biol. Macromol., 2018, 120, 1639–1645.