Avaliação da atividade antagônica in vitro de isolados de Trichoderma sp. para biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum

Comunicado 177 Técnico ISSN 9192-0099 Agosto, 2008 Brasília, DF Avaliação da Atividade Antagônica in vitro de Isolados de Trichoderma sp para Biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum Oliveira, T.A.S1 Carvalho, D.D.C1 Mello, S.C.M2* O controle biológico de patógenos de plantas possui uma série de vantagens em relação aos pesticidas convencionais. Enquanto os fungicidas apresentam somente um efeito temporário e usualmente necessitam aplicações repetidas durante o período de crescimento da cultura, os agentes de controle biológico são capazes de se estabelecer, colonizar e de se reproduzirem no ecossistema (ÁVILA et al., 2005), além de constituírem uma alternativa para diminuir o potencial de inóculo do solo sem trazer danos ao meio ambiente (MELLO et al., 2007). Fungos antagônicos do gênero Trichoderma (Pers.), são aqueles que produzem enzimas capazes de degradar diversos materiais e lisar parede de células de fungos. Atuam, também, por meio da produção de antibióticos voláteis e não-voláteis (MELO, 1996). Os fungos pertencentes a esse gênero são naturais do solo, e podem viver saprofiticamente ou parasitando outros fungos (MELO, 1998). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary é um fungo de solo que tem extensa distribuição nos climas temperados e subtropicais, causando 1 Eng. Agr., M.Sc., Departamento de Fitopatologia, Universidade de Brasília, 70919-900, Brasília DF. 2 Eng. Agr., Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, 70770-900, Brasília DF. *e-mail: smello@cenargen.embrapa.br murcha e morte em distintas espécies de 334) e o isolado C-03-02 de S. plantas, incluindo o feijoeiro (CANDOM et Sclerotiorum. al., 2000). O sucesso no uso de Trichoderma como agente de biocontrole Avaliação in vitro do antagonismo de tem sido documentado em diversos Trichoderma spp. em cultura pareada. países, sobretudo para patógenos de solo, como Rhizoctonia solani (HADAR et A verificação do antagonismo dos al., 1979), Sclerotium rolfsii (ELAD et al., isolados de Trichoderma contra o 1980; AVILA et al., 2005), Pyhtium patógeno S. sclerotiorum foi realizada aphanidermatum (PATRÍCIO et al., 2001), utilizando-se a metodologia adaptada de Sclerotinia sclerotiorum (SINGH, 1991; cultura pareada descrita por Dennis e AVILA et al., 2005) e Colletotrichum Webster (1971), com a diferença de truncatum (BANKOLE E ADEBANJO, proporcionar previamente o 1996). estabelecimento do patógeno Tendo em vista a necessidade de se (crescimento sobre 1/3 da placa de Petri). desenvolver método eficaz de controle Para isso, discos de cultura (5 mm) dessa doença, este trabalho objetivou contendo micélio de S. sclerotiorum, com testar o efeito in vitro de 10 isolados de seis dias de cultivo, foram repicados dois fungos do gênero Trichoderma contra S. dias antes da introdução do agente sclerotiorum e estudar interações in vitro biocontrolador. Os discos de Trichoderma entre o patógeno e o agente de e do patógeno foram colocados, em lados biocontrole por microscopia de luz. opostos, em cada placa contendo meio Batata-dextrose-ágar (BDA) solidificado e MATERIAL E MÉTODOS os experimentos conduzidos em triplicata. As placas foram mantidas em Isolados de Trichoderma sp. e Sclerotina BOD a 25oC com fotoperíodo de 12 horas sclerotiorum (ÁVILA et al., 2005). Após sete dias de cultivo dos dois fungos na mesma placa, Os isolados de Trichoderma spp. e S. procederam-se as avaliações, que sclerotiorum utilizados neste trabalho consistiram na medição do crescimento pertencem à Coleção de Fungos para radial das colônias de S. sclerotiorum. Os Controle Biológico de Fitopatógenos da valores médios de crescimento micelial Embrapa Recursos Genéticos e obtidos foram, então, utilizados para Biotecnologia. Para os experimentos, análise estatística, empregando-se o teste foram utilizados os seguintes isolados de de Scott e Knott (1974) a 5 % de Trichoderma spp. (CEN 304, CEN 308, probabilidade. Adicionalmente, foi CEN 311, CEN 315, CEN 316, CEN 320, realizada a classificação do antagonismo, CEN 329, CEN 330, CEN 332 e CEN de acordo com escala descrita por Bell et médio do patógeno a um valor (4,96 cm) al. (1982). significativamente inferior aos demais tratamentos (Tabela 1). Verificação do hiperparasitismo de De acordo com a classificação de Bell et Trichoderma sp. sobre S. sclerotiorum. al. (1982), dos 10 isolados avaliados, somente CEN 316 apresentou nota 1, Para obtenção de zonas de confronto dos ocupando em média, 83% da superfície dois fungos, o isolado de Trichoderma do meio e colonizando o patógeno, sendo CEN 316 foi cultivado juntamente com o classificado como altamente antagônico a patógeno em cultura pareada, durante 10 S. sclerotiorum, aos 10 dias de cultivo dias (CARPENTER et al., 2005). Após simultâneo dos fungos (Tabela 1). Por esse período, com 83% da placa de Petri outro lado, os demais isolados, colonizada pelo antagonista, discos de classificados com as notas 3 e 4, micélio provenientes da região de mostraram-se menos eficazes quanto a confronto dos dois fungos, foram capacidade antagonista in vitro. removidos para lâminas microscópicas e Resultados similares foram obtidos por observados em microscópio de luz Leica Mello et al. (2007), em que vários Microstar IV. Este experimento foi isolados de Trichoderma pertencentes a conduzido em triplicata e as imagens essa coleção, ao serem testados pelo capturadas com câmera digital Sony método de cultivo pareado, foram cyber shot 6.2. capazes de inibir o crescimento de Sclerotium rolfsii, colonizando totalmente RESULTADOS E DISCUSSÃO o patógeno. A redução de crescimento de S. sclerotiorum pode ser atribuída à Avaliação in vitro do antagonismo de competição por espaço e por nutrientes Trichoderma spp. em cultura pareada. presentes no meio de cultura, como também pela liberação de substâncias Dentre os isolados de Trichoderma tóxicas. Este efeito também foi relatado testados, CEN 316, CEN 334 e CEN 311 por Ávila et al. (2005), ao avaliar o foram os que apresentaram maior antagonismo de outros isolados de atividade antagonista aos sete dias de Trichoderma contra S. rolfsii e S. cultivo pareado, reduzindo o crescimento sclerotiorum. Tabela 1 – Crescimento de Sclerotinia sclerotiorum ao 7º dia de cultivo pareado com isolados de Trichoderma spp. e classificação dos isolados quanto ao antagonismo, segundo escala de Bell et al. (1982)*, ao 10º dia de cultivo pareado. Isolado de Crescimento das colônias de S. Trichoderma sp. quanto ao Trichoderma sp. sclerotiorum (cm) ao 7º dia** antagonismo ao 10º dia* CEN 316 4,9 a 1 CEN 334 4,9 a 4 CEN 311 4,9 a 3 CEN 308 5,0 a 3 CEN 330 5,7 b 4 CEN 329 5,7 b 4 CEN 315 5,7 b 3 CEN 320 6,4 c 4 CEN 332 6,4 c 4 CEN 304 6,5 c 3 Coeficiente de variação 6,67% *Classe 1: Trichoderma cresce sobre o patógeno e ocupa toda a superfície do meio; Classe 2: Trichoderma cresce sobre pelo menos 2/3 da superfície do meio; Classe 3: Trichoderma ocupam aproximadamente metade da superfície do meio; Classe 4: Trichoderma cresce sobre 1/3 da superfície do meio; Classe 5: Trichoderma não cresce e o patógeno ocupa toda a superfície da placa. **Valores seguidos pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Scott e Knott (1974) a 5 % de probabilidade. Verificação do hiperparasitismo de Trichoderma spp. sobre S. sclerotiorum. Interações entre o antagonista e o ocorreram em todas as repetições do patógeno foram confirmadas (Figura 1A). tratamento. Estes resultados estão de As figuras 1B e 1C mostram hifas de acordo com Inbar et al. (1996) e Ávila et Trichoderma crescendo em torno das al. (2005), que verificaram, através de hifas de S. sclerotiorum forma microscopia eletrônica de varredura verificadas. Além disso, foi observado o (MEV) e de luz, interações semelhantes crescimento do antagonista por toda entre hifas de T. harzianum e S. extensão das hifas do patógeno (Figura sclerotiorum em condições in vitro de 1D). Interações entre os dois fungos cultivo simultâneo. Fig. 1 – Estudos de microscopia de luz da interação entre Trichoderma sp. (isolado CEN 316) e Sclerotinia sclerotiorum: A) Interações entre antagonista e patógeno; B) Hifa de Trichoderma sp. crescendo e se enrolando em uma hifa de S. slerotiorum; C) Setas mostrando uma hifa de S. sclerotiorum colonizada pelo antagonista; D) Hifa de S. sclerotiorum com 30 µm de diâmetro colonizada pelo antagonista, em maior aumento. (Bars = 32; 19; 20 e 30 µm para as figuras 1A, 1B, 1C e 1D, respectivamente). Agressividade elevada e capacidade de colonização do isolado CEN 316 de Trichoderma sp. sobre S. sclerotiorum foi verificada aos 10 dias de cultivo. Logo, estudos posteriores deverão ser realizados para averiguar o efeito antagônico deste isolado em condições de campo e de casa-de-vegetação. REFERÊNCIAS ÁVILA, Z. R.; CARVALHO, S. S.; BRAÚNA, L. M.; GOMES, D. M. P. A.; MELLO, S. C. M. Seleção de isolados de Trichoderma spp. antagônicos a Sclerotium rolfsii e Sclerotinia sclerotiorum. Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005. 30 p. (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Boletim de pesquisa e desenvolvimento, 117). BANKOLE, S. A.; ADEBANJO, A. Biocontrol of brown blotch of cowpea caused by Colletotrichum truncatum with Trichoderma viride. Crop Protection, Oxford, v.15, p. 633-636, 1996. BELL, D. K.; WELLS, H. D.; MARKHAM, C. R. 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