CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos: a) Retención. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido. b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria y la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. La repetición sucesiva de las operaciones elementales de retención y desplazamiento a lo largo del sistema cromatográfico da lugar a la separación de la mezcla original. El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la móvil, recibe el nombre de elución. La cromatografía puede emplearse para conocer el número de componentes de una mezcla y su identificación, por comparación con patrones (cromatografía analítica). También se aplica a la separación de mezclas de compuestos, tanto a pequeña como a gran escala, y como método de purificación (cromatografía preparativa). Existen diversos tipos de cromatografía que se clasifican atendiendo a distintos conceptos. Dependiendo de: la naturaleza de la fase estacionaria (sólida o líquida) y de la fase móvil (líquida o gaseosa) se habla de cromatografía sólido-líquido, líquido-gas o sólido-gas. En función del tipo de interacciones que se establezcan entre los componentes la cromatografía se divide en cromatografía de adsorción, de partición o de intercambio icónico. Finalmente, dependiendo del tipo de soporte tenemos la cromatografía en columna y la cromatografía en capa fina. En esta práctica se utilizará la cromatografía en capa fina (CCF) que se encuadra dentro de la cromatografía de adsorción sólido-líquido. Este tipo de cromatografía (adsorción sólido-líquido) se caracteriza por emplear una fase estacionaria sólida (adsorbente) de carácter polar, y una fase móvil líquida (eluyente). La limitación de esta técnica radica en la dificultad de separación de mezclas de compuestos que presentan una polaridad muy similar. Fase estacionaria La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso finamente granulado. La superficie específica, que es al suma de las superficies externa e interna, contiene centros activos polares aptos para la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil,. La superficie interna del material poroso es mucho mayor que la externa. Por tanto, al disminuir el tamaño de las 1 partículas, el número de centros activos por unida de volumen es mayor y, en consecuencia, la capacidad de adsorción se incrementa. La capacidad de retención de un adsorbente también varía en función de su grado de activación, que depende del contenido en agua. La activación requiere eliminar de su superficie el agua adsorbida, operación que se lleva a cabo por secado prolongado a vacío y a alta temperatura. Desde un punto de vista práctico no es conveniente emplear fases estacionarias muy activadas, ya que se pueden producir adsorciones irreversibles o reacciones catalíticas. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias que se van a separar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición, isomerización o hidrólisis. Los adsorbentes más comunes son la alúmina (Al2O3) y el gel de sílice (SiO2), la gel de sílice presenta carácter ácido, mientras que la alúmina puede adquirirse con carácter neutro, ácido o básico. Fase móvil Está constituida por un disolvente en el que los componentes deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil. Generalmente se utiliza un disolvente único o dos miscibles de diferente polaridad. No es aconsejable utilizar disolventes altamente volátiles, debido a que la composición de la fase móvil es difícil de controlar. Retención La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar y las moléculas de la fase móvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria. Así pues, las moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y, a medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por moléculas polares presentes en la fase móvil. La retención y la selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las constantes de los diferentes equilibrios que están en función de: a) Polaridad del compuesto, determinada por el número y la naturaleza de los grupos funcionales presentes. Los solutos más polares quedarán más retenidos, puesto que se adsorben más firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras que los no polares eluirán con mayor facilidad. b) Naturaleza del adsorbente c) Naturaleza del disolvente. En algunos casos, se pueden presentar interacciones secundarias entre algunos de los compuestos a separar y ciertos disolventes. Así, por ejemplo, los compuestos que forman enlaces 2 de hidrógeno con el disolvente disminuyen notablemente su retención con respecto a lo que cabría esperar considerando únicamente la fuerza eluyente del disolvente. Cromatografía analítica en capa fina. La cromatografía en capa fina (CCF) es una técnica analítica sensible, rápida y barata muy utilizada en química orgánica. Con esta técnica es posible detectar hasta 10-9 g de material. La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada, formando una capa fina de espesor uniforme (0,1-0,2 mm), sobre una placa de vidrio, plástico o aluminio. Este cromatofolio, que puede ser del tamaño de un porta-objetos para microscopios, se coloca inclinado en el interior de una cubeta que contiene una pequeña cantidad de disolvente, de tal modo que la parte del extremo del cromatofolio en la que se ha aplicado la muestra quede sumergida, pero no la muestra. El disolvente asciende por la placa por efecto de capilaridad, arrastrando de forma diferente a cada uno de los componentes de la mezcla presente en la muestra. La relación entre las distancias recorridas por un compuesto dado y por el disolvente, desde el origen del cromatograma, se conoce como Rf (abreviatura de rate factor), y tiene un valor constante para cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas (adsorbente, disolvente, tamaño de la cubeta, temperatura, etc). Debido a que es prácticamente imposible reproducir exactamente dichas condiciones experimentales, la comparación de una muestra con otra se debe realizar eluyendo ambas en la misma placa. Para calcular el Rf se aplica la siguiente fórmula: Rf = Distancia recorrida por la sustancia/distancia recorrida por el disolvente (Figura 5.2). La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si ésta es excesivamente grande (diámetro mayor de 4 mm) se obtendrá un valor erróneo de Rf. Cuanto más polar es un compuesto, más retenido queda en el adsorbente y menor será su Rf. Por el contrario, los pocos polares se desplazan a mayor distancia del origen. La polaridad del disolvente también influye en el valor de Rf. Así, para un mismo compuesto, un incremento en la polaridad del disolvente aumentará su desplazamiento en la placa y, por tanto, su Rf. Figura 5.1 Figura 5.2 3 La CCF se utiliza: a) para determinar el número de componentes de una mezcla; b) para identificar sustancias por comparación; c) para controlar el avance de una reacción; d) para determinar la eficacia de una purificación; e) para determinar las condiciones más apropiadas para realizar una separación de componentes de una mezcla por cromatografía en columna; f) para controlar una cromatografía en columna. La elección del disolvente dependerá, lógicamente, de la naturaleza del compuesto o de los compuestos que se van a separar. Una regla general para la elección del disolvente es la comparación de la polaridad del mismo y de la sustancia que se desea separar. En la mayoría de los casos, es trabajo del químico encontrar, a base de pruebas, el disolvente o la mezcla adecuada de disolventes que permita la separación de los componentes de la mezcla a analizar. Se recomienda elegir un disolvente en el que los componentes de la mezcla presenten un Rf en torno a 0,3-0,5. Cuando un compuesto eluye a un Rf inferior a 0,2 o superior a 0,7 puede ocurrir que lo que parece un compuesto único sea en realidad una mezcla de varios. En estos casos se debe cambiar a otro disolvente más o menos polar, respectivamente. Para compuestos poco polares, que se desplazan del origen con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano. En el caso de compuestos de polaridad media, se aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en distintas proporciones. Los productos más polares, que quedan muy retenidos en al adsorbente, requieren un disolvente más polar como el metanol o mezclas cloruro de metileno/metano en distintas proporciones. Para realizar un análisis con CCF se debe aplicar una pequeña cantidad de la muestra sobre el cromatofolio antes de proceder al desarrollo o elución. Antes de aplicar la muestra se traza con lápiz una línea (línea base) a aproximadamente 1 cm de un extremo de la placa. Sobre esa línea base se marcan con el lápiz los puntos donde se quieren aplicar las muestras. Las muestras se aplican mediante un tubo capilar o micropipeta en la posición apropiada. Para preparar el tubo capilar, se toma un tubo de vidrio sujetándolo por los extremos. A continuación se calienta con el mechero Bunsen aplicando la llama en la mitad del tubo mientras se gira. Se mantiene en la llama hasta que el tubo se ablande y la llama tome un color amarillo, se retira de la llama e inmediatamente se estira unos 12 cm. El tubo se deja enfriar y se corta por el punto medio con una lima. La punta del tubo capilar se sumerge en la disolución de la muestra, observándose cómo la disolución entra en el tubo capilar. A continuación se realiza la aplicación de la muestra, que consiste en colocar suavemente la punta del tubo capilar sobre uno de los puntos de la placa marcados con lápiz. La muestra presente en el tubo capilar se descarga apareciendo una mancha. y dejando que el disolvente se evapore. 4 El desarrollo se lleva acabo en cubetas. En el interior de la cubeta debe colocarse un papel de filtro, empapado de disolvente, que cubra las paredes interiores de la misma, para conseguir que la atmósfera esté saturada de vapor de disolvente. El fondo de la cubeta se cubre de disolvente hasta una altura de 0,5 cm y después de un período de tiempo apropiado, para que se alcance el equilibrio, se introduce la placa apoyada sobre la pared de la cubeta sumergiendo el extremo de la línea base pero sin que el líquido la alcance. Se observará como el líquido asciende por capilaridad a través del adsorbente. Durante el desarrollo no debe moverse la cubeta. Cuando el frente del disolvente esté a aproximadamente 1 cm del extremo superior de la placa, ésta se saca de la cubeta y se marca el frente con el lápiz. A no ser que el material analizado tenga color es necesario realizar un revelado de la placa. Para realizar esta operación se pueden aplicar vapores de yodo sobre la placa, se puede pulverizar la placa con reactivos (por ejemplo una disolución de H2SO4 en etanol al 5% seguido de calentamiento), se puede aplicar una lámpara ultravioleta, etc. 5