STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens
MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
TRANSFORMACIÓN ESTABLE Y EFICIENTE DE Phaseolus vulgaris
MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens
Elsa Espinosa-Huerta, Anareli Quintero-Jiménez1, K. Virginia Cabrera-Becerra, M. Alejandra Mora-Avilés*
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Unidad de Biotecnología de Plantas. Km. 6.5 Carretera Celaya-San Miguel de Allende, Apartado Postal 112, Celaya,
38110 Guanajuato, México (mora.alejandra@inifap.gob.mx).
ABSTRACT
RESUMEN
Common bean breeding requires novel techniques to
incorporate genes that may not be available in bean genetic
diversity. The objective of the present study was to analyze
the main variables involved in Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of common bean towards providing
an efficient system to introduce new agronomic traits. Bean
cultivars Flor de Mayo Anita and Pinto Saltillo were inoculated
with different A. tumefaciens strains, constructs and selection
was done using two selection agents (kanamycin or glufosinateammonium herbicide). Five-day old hypocotyls regenerated
organogenic buds (cell clusters) 5 d after inoculation. A
randomized complete blocks experimental design was used
and the experimental unit was a petri dish with at least 10
hypocotyls. Analysis of variance and Tukey test (p£0.05)
were performed on data. Transformation efficiency was 10-28 %
with small variations due to the genetic background of each
cultivar, the Agrobacterium strain and selection agent used.
Transformation efficiency was higher using kanamycin
(28.6 %) in relation to glufosinate-ammonium (10.2 %).
Similarly, Pinto Saltillo cultivar showed better regeneration
response (21-28 %) than that of Flor de Mayo Anita cultivar
(10-17 %) and this was consistent when selection agents
were compared within each cultivar. Molecular analysis
for detection and gene expression quantification by using
end point PCR and q-PCR showed evidence of presence
and activity at different expression levels through several
generations (T0 to T3). Transformed lines of common bean
with potential for fungal resistance and drought tolerance
were successfully obtained via Agrobacterium tumefaciens
with evidence of genetic stability.
El mejoramiento del frijol común requiere técnicas novedosas
para incorporar genes que puedan no estar disponibles en la
diversidad genética del frijol. El objetivo del presente estudio
fue analizar las principales variables involucradas en la transformación mediante Agrobacterium tumefaciens de frijol con
el propósito de proveer un sistema eficiente para introducir
nuevas características agronómicas. Los cultivares de frijol
Flor de Mayo Anita y Pinto Saltillo fueron inoculados con
diferentes cepas de A. tumefaciens y construcciones. La selección se realizó usando dos agentes, la kanamicina o el herbicida glufosinato de amonio. Hipocótilos de 5 d regeneraron
brotes organogénicos (grupos de células) 5 d después de la
inoculación. El diseño experimental fue bloques completos
al azar y la unidad experimental fue una placa de petri con
al menos 10 hipocótilos. Un análisis de varianza y la prueba
de Tukey (p£0.05) se efectuaron con los datos. La eficiencia
de transformación fue10-28 %, con variaciones pequeñas
debido a los antecedentes genéticos de cada cultivar, la cepa
de Agrobacterium y el agente de selección usado. La transformación fue más eficiente usando kanamicina (28.6 %)
en relación al glufosinato de amonio (10.2 %). Similarmente,
el cv. Pinto Saltillo mostró mejor respuesta de regeneración
(21-28 %) que Flor de Mayo Anita (10-17 %) y esto fue consistente al comparar los agentes de selección dentro de cada
cultivar. El análisis molecular para la detección y cuantificación de la expresión génica mediante PCR punto final y
q-PCR mostró evidencia de su presencia y actividad en los
diferentes niveles de expresión a través de varias generaciones
(T0 a T3). Líneas de frijol transformadas con potencial para
resistir hongos patógenos y tolerancia a sequía se obtuvieron
exitosamente mediante Agrobacterium tumefaciens, con evidencia de estabilidad genética.
* Author for correspondence v Autor responsable.
Received: August, 2012. Approved: April, 2013.
Palabras clave: grupos de brotes, tolerancia a la sequía, resistencia a los hongos, medio Gamborg, hipocótilos, organogénesis.
Published as ARTÍCULO in Agrociencia 47: 319-333. 2013.
319
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
Key words: bud clusters, drought stress tolerance, fungal
resistance, Gamborg medium, hypocotyls, organogenesis.
INTRODUCTION
C
ommon bean (Phaseolus vulgaris L.) is a
crop with vast genetic diversity that includes
germplasm with superior agronomic traits
such as resistance to adverse weather conditions, pest
and disease resistance, and high nutritional quality
(Cruz de Carvalho et al., 2000). However, some genes
that confer specific traits are either not present in
common bean germplasm or conventional breeding
may result time consuming. Most breeding programs
have made significant progress in the development
of disease resistant or drought tolerant cultivars;
nevertheless, there is need for the incorporation of
more efficient genes with low metabolic cost for the
plant.
A protocol that provides efficient cell
differentiation, shoot development, and whole
plant regeneration is an essential requirement for
genetic transformation in plants. Originally, only
three groups had produced stable and heritable
transformation of P. vulgaris (Russell et al., 1993;
Aragão et al., 1998) and P. acutifolius (Dillen et al.,
1997). However, there are successful transformation
events including the utilization of Agrobacterium
rhizogenes to generate transformed roots, research
oriented towards functional genomics (EstradaNavarrete et al., 2006), as well as transformation
via particle bombardment to develop bean cultivars
resistant to the bean golden yellow mosaic virus
through the insertion of a mutated rep gen (Faria et
al., 2006; Bonfim et al., 2007).
Direct organogenic regeneration of common bean
for two commercial cultivars with high regeneration
efficiency was reported by Delgado-Sánchez et al.
(2006) and Quintero-Jiménez et al. (2010a; 2010b).
Some factors need to be taken into consideration
for a consistent regeneration of transformed plants.
Several types of explants give differential response,
as cotyledons (McClean et al., 1991), protoplasts
(Leon et al., 1991), mature seed embryos (Aragão
et al., 1992), leaf disks and hypocotyls (Franklin et
al., 1993), meristems (Russell et al., 1993; Brasileiro
et al., 1996), apical shoots (Lewis and Bliss, 1994)
and embryonic axes (Kim and Minamikawa, 1996) .
Seed age, seed size and color as well as culture media
320
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
INTRODUCCIÓN
E
l frijol (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo con
gran diversidad genética que incluye germoplasma con características agronómicas superiores, como resistencia a condiciones climáticas
adversas, resistencia a plagas y enfermedades, y alta
calidad nutricional (Cruz de Carvalho et al., 2000).
Sin embargo, algunos genes que confieren características específicas no están presentes en el germoplasma del frijol o el mejoramiento convencional puede
tomar mucho tiempo. La mayoría de los programas
de mejoramiento han hecho avances significativos en
el desarrollo de cultivares resistentes a enfermedades
o tolerantes a sequías, pero es necesario incorporar
genes más eficientes de bajo costo metabólico para
la planta.
Un protocolo que proporcione una diferenciación
celular eficiente, desarrollo de brotes, y la regeneración de la planta completa es requisito esencial para
la transformación genética de las plantas. Originalmente, sólo tres grupos habían producido una transformación estable y heredable de P. vulgaris (Russell
et al., 1993; Aragão et al., 1998) y P. acutifolius (Dillen et al., 1997). Pero hay eventos de transformación
exitosos, incluyendo la utilización de Agrobacterium
rhizogenes para generar raíces transformadas, investigación orientada hacia la genómica funcional (Estrada-Navarrete et al., 2006), y la transformación vía
bombardeo de partículas para desarrollar cultivares
de frijol resistentes al virus amarillo del mosaico dorado del frijol a través de la inserción del gen mutante
rep (Faria et al., 2006; Bonfim et al., 2007).
La regeneración organogénica directa y altamente eficiente del frijol en dos cultivares comerciales
fue reportada por Delgado-Sánchez et al. (2006) y
Quintero-Jiménez et al. (2010a; 2010b). Algunos
factores se deben considerar para una regeneración
consistente de plantas transformadas. Varios tipos de
explantes dan diferentes respuestas, como cotiledones (McClean et al., 1991), protoplastos (León et al.,
1991), embriones maduros de semillas (Aragão et al.,
1992), discos de hojas e hipocótilos (Franklin et al.,
1993), meristemo (Russell et al., 1993; Brasileiro et
al., 1996), brotes apicales (Lewis y Bliss, 1994) y ejes
embrionarios (Kim y Minamikawa, 1996). La edad
de las semillas, tamaño y color, así como medios de
cultivo son aspectos a considerar. La transformación
vía bombardeo de partículas tuvo buenos resultados
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
are traits to consider. Transformation via particle
bombardment was reported with effective results
(Russell et al., 1993; Aragão et al., 1996; 1998; 2002;
Rech et al., 2008). Moreover, Agrobacterium strain
can be a qualitative determinant factor for success in
the development of common bean lines genetically
modified (McClean et al., 1991; Zambre et al., 1998;
2005).
The objective of the present study was to
analyze variables involved into a stable and efficient
Agrobacterium mediated transformation of common
bean by introducing two genes of agronomic
importance.
MATERIALS AND METHDOS
Plant material
Seeds of cv. Flor de Mayo Anita (FMA) (Reg. No. 1494-FRI032-220302/C) (Castellanos-Ramos et al., 2003) and Pinto
Saltillo (PS) (Reg. No. FRI-035-161181) (Sánchez-Valdez et al.,
2004) of common bean were used in transformation experiments.
Both primary transgenic plants T0 and self-pollinated progeny
plants (T1 and T3) were used for further experiments.
Constructs
Defensine (pdf1.2) and proton pump pyrophosphatase
(avp1) genes confer resistance to fungal pathogens (Raharjo et
al., 2008) and drought tolerance (Gaxiola et al., 2001; Park et
al., 2005). The pdf1.2 cDNA gene (0.439 kb) from Arabidopsis
thaliana (Penninckx et al., 1996) was inserted into the pKYLX80
binary vector (Schardl et al., 1987). The pdf1.2 gene was regulated
by a double cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter
and the small subunit polypeptide rubisco terminator from
pea (rbcS-E9). The neomycin phosphotransferase gene (nptII)
provides kanamycin resistance under control of the nopaline
synthase (nos) promoter and nos terminator from A. tumefaciens
(Figure 1A). The plasmid was inserted in Agrobacterium strain
GV2260 by heat shock transformation (Hoisington et al., 1994).
The avp1 open reading frame (2313 bp) from A. thaliana was
cloned into the XbaI site of a modified pRT103 plasmid (Gaxiola
et al., 2001). The avp1 gene was regulated by a double cauliflower
mosaic virus (CaMV) 35S promoter and A. tumefaciens nos
terminator. The phosphinothricin acetyl transferase gene (pat/
bar) from Streptomyces hygroscopicus which confers resistance to
glufosinate-ammonium herbicide, under control of nos promoter
and nos terminator, acted as selectable marker (Figure 1B). The
plasmid was inserted into A. tumefaciens strain GV3101.
(Russell et al., 1993; Aragão et al., 1996; 1998; 2002;
Rech et al., 2008). Además la cepa Agrobacterium
puede ser cualitativamente determinante para un
desarrollo satisfactorio de líneas de frijoles genéticamente modificados sea (McClean et al., 1991; Zambre et al., 1998; 2005).
El objetivo del presente estudio fue analizar las variables involucradas en una transformación de frijol
estable y eficiente mediante Agrobacterium introduciendo dos genes de importancia agronómica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Semillas de cv. Flor de Mayo Anita (FMA) (Reg. No. 1494FRI-032-220.302 / C) (Castellanos-Ramos et al., 2003) y Pinto
Saltillo (PS) (Reg. No. FRI-035-161181) (Sánchez-Valdez et al.,
2004) de frijol se usaron en experimentos de transformación.
Ambas plantas transgénicas primarias T0 y plantas de la progenie de auto-polinización (T1 y T3) se usaron para experimentos
adicionales.
Construcciones
Los genes defensina (pdf1.2) y de la bomba de protones pirofosfatasa (avp1) confieren resistencia a los patógenos fúngicos
(Raharjo et al., 2008) y tolerancia a la sequía (Gaxiola et al.,
2001; Park et al., 2005). El gen de pdf1.2 ADNc (0.439 kb)
de Arabidopsis thaliana (Penninckx et al., 1996) se insertó en el
vector binario pKYLX80 (Schardl et al., 1987). El gen pdf1.2
fue regulado por el doble promotor 35S del virus del mosaico
de coliflor (CaMV) y la subunidad pequeña polipéptida rubisco
terminador del chícharo (rbcS-E9). El gen de neomicina fosfotransferasa (nptII) proporcionó resistencia a la kanamicina bajo el
control del promotor de nopalin sintasa (nos), y el terminador nos
de A. tumefaciens (Figura 1A). El plásmido se insertó en la cepa
de Agrobacterium GV2260 mediante transformación por choque
térmico (Hoisington et al., 1994). El marco de lectura abierto del
gen avp1 (2313 pb) de A. thaliana se clonó en el sitio XbaI de
un plásmido modificado pRT103 (Gaxiola et al., 2001). El gen
avp1 estuvo regulado por el doble promotor del virus del mosaico
de la coliflor (CaMV) 35S y el terminador nos de A. tumefaciens.
El gen de fosfinotricin acetil transferasa (pat/bar) de Streptomyces
hygroscopicus, que proporciona resistencia al herbicida glufosinato de amonio, bajo el control del promotor nos y el terminador
nos, actuó como marcador de selección (Figura 1B). El plásmido
se insertó en la cepa A. tumefaciens GV3101.
ESPINOSA-HUERTA et al.
321
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
A
pdf1.2
CaMV35S(2)
LB
rbcS.E9
nos-p
nptII
nos-t
790 bp
439 bp
Cla1
EcoRI
PstI
RB
BamHI
B
HindI
CaMV35S(2)
LB
avp1
nos-t
2313 bp
SmaI
nos-p
bar
nos-t
782 bp
RB
SmaI
Figure 1. Schematic representation of restriction map of T-DNA. A) pRG522-avp1 containing vacuolar proton pump H+pyrophosphatase (H+-PPase) and selectable marker phosphinotricin acetyl transferase genes; B) pKYLX80-pdf1.2
containing Arabidopsis thaliana defensin and selectable marker type II neomycin phosphotransferase genes.
Figura 1. Representación esquemática del mapa de restricción del ADN-T. A) pRG522-avp1 que contiene los genes de la
bomba de protones vacuolar H+-pirofosfatasa (H+-PPasa) y marcador de selección fosfinotricin acetil transferasa;
B) pKYLX80-pdf1.2 que contiene genes defensina de Arabidopsis thaliana y marcador de selección neomicin fosfotransferasa tipo II.
Transformation procedure
Procedimiento de transformación
Seed germination, hypocotyls dissection and media
components were described by Quintero-Jiménez et al. (2010a).
GM liquid medium (Gamborg et al., 1968) amended with 2 %
sucrose, 100 mg L-1 myo-inositol, 1 mg L-1 pyridoxine, 10 mg
L-1 thiamine, were added to A. tumefaciens strain GV2260 or
GV3101 grown to an O.D.600=0.8 in a 5:1 (v/v) proportion.
Hypocotyls were incubated into this solution for 10 min in
soft motion. After this time, liquid was discarded and excess
eliminated with sterile paper towels. Explants were placed in cocultivation medium of induction and multiplication medium
(IMM) (Quintero-Jiménez et al., 2010a) added with 200 mM
acetosyringone. Explants were incubated in cocultivation
medium for 5 d at 25 °C 16 h light (45-70 mmol m-2 s-1) and
8 h dark.
Agrobacterium-elimination medium consisted of IMM added
with 300 mg L-1 timentin (GlaxoSmithKline®). Hypocotyls
remained into this medium for 10 d under the same growing
conditions. Explants were transferred into selection medium
wiht the same components as Agrobacterium-elimination
medium amended with 50 mg L-1 kanamycin or 0.2 mg L-1
glufosinate-ammonium.
La germinación de semillas, disección de los hipocótilos y
componentes de los medios fueron descritos por Quintero-Jiménez et al. (2010a). El medio líquido GM (Gamborg et al., 1968),
modificado con 2 % sacarosa, 100 mg L-1 de myo-inositol, 1 mg
L-1 piridoxina, 10 mg L-1 tiamina, se agregó a las cepas GV2260
o GV3101 de A. tumefaciens cultivadas a O.D.600 = 0.8 en proporción 5:1 (v/v). Los hipocótilos se incubaron 10 min en esta
solución con movimiento suave. Después, el líquido se desechó
y el exceso se eliminó con toallas de papel estériles. Los explantes
se colocaron en un medio de co-cultivo de inducción y multiplicación (IMM) (Quintero-Jiménez et al., 2010a) más 200 mM
de acetosiringona. Los explantes se incubaron 5 d en un medio
de co-cultivo a 25 °C, 16 h de luz (45-70 mmol m-2 s-1) y 8 h
oscuridad.
El medio de eliminación Agrobacterium contenía IMM más
300 mg L-1 timentina (GlaxoSmithKline®). Los hipocótilos permanecieron en este medio 10 d en las mismas condiciones de crecimiento. Los explantes se transfirieron a un medio de selección
con los mismos componentes del medio de eliminación Agrobacterium más 50 mg L-1 kanamicina o 0.2 mg L-1 glufosinato de
amonio.
322
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
Differentiated shoots that remained green in selection
medium were separated and grown individually in Magenta®
boxes with Elongation and Rooting Medium (ERM) (QuinteroJiménez et al., 2010a) amended with 50 mg L-1 kanamycin
or 0.2 mg L-1 glufosinate-ammonium herbicide and 300 mg
L-1 timentin to promote elongation and root formation.
Growth conditions were identical to the previous stage. In
vitro regenerated plantlets were transferred into pots filled with
Sunshine® Universal Mix (Sun Gro Horticulture Canada Ltd.)
and acclimatized. New plants were placed under greenhouses
at 25-28 °C and light intensity of 170-285 mmol m-2 s-1 until
maturity.
Los brotes diferenciados que permanecieron verdes en el medio de selección se separaron y se cultivaron individualmente en
cajas Magenta® en medio de elongación y enraizamiento (ERM)
(Quintero-Jiménez et al., 2010a), más 50 mg L-1 kanamicina ó
0.2 mg L-1 de glufosinato de amonio y 300 mg L-1 timentina
para promover alargamiento y formación de raíces. Las condiciones de cultivo fueron idénticas a la etapa anterior. Las plántulas
regeneradas in vitro se transfirieron a macetas llenas con mezcla
Sunshine® Universal Mix (Sun Gro Horticulture Canada Ltd.)
y aclimatadas. Las plantas nuevas se colocaron en invernaderos
a 25-28 °C e intensidad de la luz 170 a 285 mmol m-2 s-1 hasta
la madurez.
End point PCR analysis in pdf1.2 and avp1 transformed lines
DNA was isolated according to Murray and Thompson
(1980) using 100-200 mg of leaf tissue per sample. The final
concentration reactions consisted of template DNA (30 ng),
primers (0.2 mM), dNTP’s (0.25 mM), Taq DNA Polymerase
(1 U), magnesium chloride (2 mM), and Taq buffer (1X). PCR
analysis was done using primers to detect 35S promoter pdf1.2,
nptII or avp1 genes. Primers for detecting the 35S promoter were
sense 35S 5’-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’, antisense
35S 5’-GCA CCT ACA AAT GCC ATC A-3’, (Invitrogen, Life
Technologies). Amplification conditions consisted of 4 min 95 °C
for one cycle, 1 min 95 °C, 1 min 54 °C, 1 min 72 °C for 30
cycles and a final extension 7 min 72 °C. The pdf1.2 primers
consisted of sense pdf1.2 5’-CAT CAT GGC TAA GTT TGC
TTC C-3’, antisense pdf1.2 3’-CTC ATA GAG TGA CAG AGA
CT-5’; the nptII primers were sense nptII 5’-TCG GCT ATG
ACT GGG CAC AAC AGA-3’, antisense nptII 3’-AAG AAG
GCG ATA GAA GGC GAT GCG-5’. Amplification conditions
for both pdf1.2 and nptII primers were 3 min 94 °C for one cycle,
1 min 94 °C, 1 min 55 °C, and 2 min 72 °C for 35 cycles Finally,
the avp1 gene primers consisted of sense avp1 5’-ACT GGT
TAT GGT CTT GGT GGG T-3’; antisense avp1 5’-GGC AAC
ATC TTG CAC AGG GCT GT-3’. Amplification conditions
were 5 min a 95 °C for 1 cycle, 1 min 95 °C, 1 min 55 °C, 2 min
a 72 °C for 40 cycles and a final extension 7 min 72 °C. The
expected fragments sizes were 60 bp for pdf1.2, 700 bp for nptII
gene, 195 bp for 35S promoter and 630 bp for avp1. Amplified
fragments were separated into 2 % agarose gels and stained with
ethidium bromide.
Real time quantitative PCR analysis in T3 pdf1.2 transformed lines
Transgene detection analysis
Primers and probe were designed using the program
Primer Express version 2.0 (Applied Biosystems, Foster City,
Análisis por PCR punto final de líneas
transformadas con pdf1.2 y avp1
ADN se aisló de acuerdo con Murray y Thompson (1980),
usando 100-200 mg de tejido de hoja por muestra. La concentración final de las reacciones fue un molde de ADN (30 ng),
iniciadores (0.2 mM), dNTP’s (0.25 mM), Taq ADN polimerasa
(1 U), cloruro de magnesio (2 mM) y amortiguador Taq (1X).
El análisis PCR se hizo con iniciadores para detectar el promotor
35S y genes pdf1.2, nptII o avp1. Los iniciadores para detectar
el promotor 35S fueron sentido 35S 5’-GAT AGT GGG ATT
GTG CA-3’, antisentido 35S 5’-GCA CCT ACA AAT GCC
ATC A-3’, (Invitrogen, Life Technologies). Las condiciones de
amplificación fueron 5 min a 95 °C por un ciclo, 1 min a
95 °C, 1 min a 54 °C, 1 min a 72 °C por 30 ciclos y una extensión final de 7 min a 72 °C. Los iniciadores de pdf1.2 fueron
sentido pdf1.2 5’-CAT CAT GGC TAA GTT TGC TTC C-3’,
antisentido pdf1.2 3’-CTC ATA GAG TGA CAG AGA CT-5’;
los iniciadores de nptII fueron sentido nptII 5’-TCG GCT ATG
ACT GGG CAC AAC AGA-3 ‘, antisentido nptII 3’-AAG AAG
GCG ATA GAA GGC GAT GCG-5’. Las condiciones de amplificación para los iniciadores pdf1.2 y nptII fueron 3 min a
94 °C por un ciclo, 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C, y 2 min a 72 °C
por 35 ciclos. Por último, los iniciadores del gen avp1 fueron
sentido avp1 5’-ACT GGT TAT GGT CTT GGT GGG T-3’;
antisentido avp1 5’-GGC AAC ATC TTG CAC AGG GCT
GT-3’. Las condiciones de amplificación fueron 5 min a 95° C
por 1 ciclo, 1 min 95 °C, 1 min 55 °C, 2 min 72 °C por 40 ciclos
y una extensión final de 7 min a 72 °C. Los tamaños esperados
de los fragmentos fueron 60 pb para el gen pdf1.2, 700 pb para
el gen nptII, 195 pb para el promotor 35S y 630 pb para el gen
avp1. Los fragmentos amplificados fueron separados en geles de
agarosa al 2 % y teñidos con bromuro de etidio.
ESPINOSA-HUERTA et al.
323
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
CA) starting from the sequence of the pdf1.2 gene (NCBI,
NM_123809). Defensin gene specific primers and probe (Assays
by design, Applied Biosystems) to detect the pdf1.2 gene were
sense 5’-AGT TGT GCG AGA AGC CAA GT-3’, antisense 3’GCA TGC ATT ACT GTT TCC GCA AA-5’and the TaqMan®
probe 5’-CCC TGA CCA TGT CCC-3’ with a 6-FAM™ dye
label and minor groove binder (MGB) moiety on the 5’ end,
and non-fluorescent quencher (NFQ) dye on the 3’ end. The
internal control 18S ribosomal (4319413E, Applied Biosystem)
was tagged with the fluorofore VIC.
Gene expression analysis
Total cellular RNA was extracted from leaf tissue using Trizol®
(Reagent, Carisbald, CA, USA) following the manufacturer
instructions. RNA was quantified by fluorometry (TBS-380
Mini-Fluorometer) using the Ribo-Green kit (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, USA).
First-strand cDNA was synthesized using RT-PCR through
One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; Cat.
No.4309169). TaqMan® system was used for gene amplification.
The amplification conditions consisted of 48 °C 30 min (Reverse
Transcription), 95 °C 10 min (denaturalization), 45 cycles (PCR
amplification) at 95 °C, 15 sec and 60 °C, 1 min (ABI PRISM®
7000 Sequence Detection Systems, Applied Biosystems).
The relative expression ratio was calculated by normalizing
the target pdf1.2 gene Ct with reference housekeeping gene Ct
(18S) to obtain only the efficiency of the pdf1.2 gene (DCt= Ct
pdf1.2-Ct18Sr). Each DCt was compared to a calibrator within
replicates (DDCt = DCt (sample) - DCt (calibrator). The relative
expression was shown as 2-DDCt, unit of measurement of the
expression of the gene (Livak and Schmittgen, 2001).
Analysis of progeny of transgenic
plants in T3 pdf1.2 transformed lines
Forty to fifty seeds from selfed common bean transgenic lines
were analyzed for pdf1.2 fragment amplification by PCR. Plants
that amplified the pdf1.2 or avp1gene fragments were scored
and Chi-square analysis was performed to determine segregation
ratios and number of insertional events.
Análisis en tiempo real por PCR cuantitativa
en líneas transformadas T3 pdf1.2
Análisis de detección de transgenes
Los iniciadores y la sonda se diseñaron con el programa Primer Express versión 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
a partir de la secuencia del gen pdf1.2 (NCBI, NM_123809).
Los iniciadores y sonda específicos del gen defensina (Assays by
design, Applied Biosystems) para detectar el gen pdf1.2 fueron
sentido 5’-AGT TGT GCG AGA AGC CAA GT-3’, antisentido 3’-GCA TGC ATT ACT GTT TCC GCA AA-5’ y la sonda
TaqMan® 5’-CCC TGA CCA TGT CCC-3’ con una etiqueta de
marcado 6-FAM™ y el enlazante al surco menor (MGB) en el
extremo 5’, y el extintor no fluorescente (NFQ) en tinte en el extremo 3’. El control interno 18S ribosomal (4319413E, Applied
Biosystem) fue etiquetado con el fluoróforo VIC.
Análisis de la expresión de genes
El ARN celular total se extrajo del tejido de hojas utilizando Trizol® (reactivo, Carisbald, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó por fluorometría
(TBS-380 Mini-Fluorómetro) usando el kit Ribo-Green (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.).
El cADN de la primera cadena se sintetizó mediante RTPCR a través de One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; (Cat. No.4309169). El sistema TaqMan® se usó para la
amplificación de genes. Las condiciones de amplificación fueron:
48 °C por 30 min (transcripción inversa); 95 °C, 10 min (desnaturalización); 45 ciclos (amplificación por PCR) a 95 °C; 15 seg
a 60 °C; 1 min (ABI PRISM® 7000 Sequence Detection Systems,
Applied Biosystems).
La relación de expresión relativa se calculó normalizando el
Ct gen blanco pdf1.2 con el gen endógeno de referencia Ct (18S)
para obtener sólo la eficiencia del gen pdf1.2 (DCt = Ct pdf1.2Ct18Sr). Cada DCt se comparó con un calibrador dentro de las
repeticiones (DDCt = DCt (muestra) - DCt (calibrador). La expresión relativa se mostró como 2-DDCt, unidad de medida de
la expresión del gen (Livak y Schmittgen, 2001).
Experimental design
Análisis de la progenie de plantas transgénicas
en líneas T3 transformadas con pdf1.2
Pinto Saltillo and Flor de Mayo Anita hypocotyls were
inoculated with A. tumefaciens strain GV2260 containing
pdf1.2 and nptII gene or GV3101 containing avp1 and bar gene
in a randomized complete blocks experimental design. Three
transformation experiments were carried out and each experiment
consisted of three replicates. The experimental unit was one petri
De 40 a 50 semillas de líneas transgénicas de frijol autopolinizadas se analizaron para la amplificación de fragmentos pdf1.2
por PCR. Las plantas que amplificaron el pdf1.2 o fragmentos de
genes avp1 fueron registradas y se realizó el análisis de Ji-cuadrada para determinar las proporciones de segregación y el número
de eventos de inserción.
324
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
dish containing at least 10 hypocotyls. Transformation efficiency
was the response trait based on the interaction between cultivars,
Agrobacterium strains and selection agents. Data were analyzed
by ANOVA and Tukey test (p£0.05) using MINITAB 16
Statistical Software.
RESULTS AND DISCUSSION
Plant transformation
The efficiency for transformation of whole
plants depends upon the cells being competent for
regeneration (Dong and McHughen, 1991; Nagl et
al., 1997), which limited using this technology in
common bean. Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of P. vulgaris was developed based on
successful regeneration reports previously published
(Delgado-Sánchez et al., 2006; Quintero-Jiménez
et al., 2010a, 2010b). The structure derived from
germination and enlargement of the embryo
develops in hypocotyl structure (Figure 2a). The
complex tissue of organogenic shoots formed near
the suspensor cells indicates that the full germinative
and regenerative potential is translocated to that spot
facilitating and promoting the development of two
or three shoots, each of them with full capacity to
develop a whole plant (Figure 2b). However, not all
de novo shoots gave rise to whole plants; in most of
the cases only one shoot developed into a full single
plant concentrating the morphogenic potential in
only one shoot to become a plant (Figure 2c).
Once the organogenic shoots formed, they
remained attached to the hypocotyls until full
plant development (Figure 2d). In each fresh
medium transfer, a thin layer of the hypocotyl was
eliminated until the plant was independent. After
full stems and leaves formation and development,
roots differentiated at the stem base indicating that
the new plant is independent from the hypocotyl,
this phase took two-months for full elongation and
rooting (Figure 2e).
Plants that maintained a healthy condition were
transferred into greenhouse for further observation
(Figure 2f ). All T0 lines showed similar phenological
stages compared to non-transformed plants; they
flowered and set seeds at the same rate as control
plants (Figures 2g and 2h).
Different strains of A. tumefaciens for inoculation
and co-cultivation, as GV2260 and GV3101,
induced differential transformation efficiency. With
Diseño experimental
Los hipocótilos de Pinto Saltillo y Flor de Mayo Anita fueron inoculados con la cepa A. tumefaciens GV2260 que contiene
pdf1.2 y el gen nptII o GV3101 que contiene avp1 y el gen bar,
en un diseño experimental de bloques completos al azar. Se realizaron tres experimentos de transformación y cada experimento
tuvo tres réplicas. La unidad experimental fue una caja petri con
al menos 10 hipocotilos. La eficiencia de transformación fue la
variable de respuesta basada en la interacción entre cultivares,
cepas de Agrobacterium y agentes de selección. Los datos se analizaron con ANDEVA y la prueba de Tukey (p£0.05) usando
MINITAB 16 Statistical Software.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Transformación de plantas
La eficiencia de transformación de plantas enteras depende de si las células son competentes para
la regeneración (Dong y McHughen, 1991; Nagl et
al., 1997), lo cual limitó el uso de esta tecnología en
el frijol. La transformación de P. vulgaris a través de
A. tumefaciens se desarrolló con base en reportes de
regeneración exitosa (Delgado-Sánchez et al., 2006;
Quintero-Jiménez et al., 2010a, 2010b). La estructura derivada de la germinación y crecimiento del
embrión se desarrolla en la estructura de hipocótilo
(Figura 2a). El tejido complejo de brotes organogénicos formados cerca de las células del suspensor indica
que todo el potencial germinativo y regenerador es
trasladado a ese lugar, facilitando y promoviendo el
desarrollo de dos a tres brotes, cada uno de ellos con
plena capacidad para desarrollar una planta completa
(Figura 2b). Sin embargo, no todos los brotes de novo
dieron lugar a plantas enteras; en la mayoría de los
casos sólo un brote se desarrolló hasta convertirse en
una planta completa, es decir, en ese brote se concentró el potencial morfogénico hasta convertirse en una
planta (Figura 2c).
Una vez formados, los brotes organogénicos permanecieron unidos a los hipocótilos hasta el desarrollo total de la planta (Figura 2d). En cada traslado a
medio fresco se eliminó una capa delgada del hipocotilo hasta que la planta se hizo independiente. Después de formarse y desarrollarse los tallos y las hojas,
las raíces se diferenciaron en la base del tallo, indicando que la nueva planta es independiente del hipocótilo; esta fase requirió dos meses para una completa
elongación y enraizamiento (Figura 2e).
ESPINOSA-HUERTA et al.
325
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
A
B
C
D
E
F
G
H
Figure 2. Route of common bean Agrobacterium-mediated transformation. A) Hypocotyls used as main explant for
transformation. B) Hypocotyl with de novo shoots formed at the hypocotyl suspensor area 4 days after inoculation
(DAI). C) Differentiated shoots kanamycin resistant 20 DAI (RK). D) Plantlets RK remained on their original explant
until root formation. E) Plantlets 5-7 cm height with 1-2 trifoliate leaves and differentiated root system 60 days in
rooting medium. F) T0 common bean plant transferred to soil (20 cm height). G) T0 plant at 50 % flowering, 20 days
after transferring to greenhouse. H) Pods formation 18 days after 50 % flowering.
Figura 2. Ruta de la transformación del frijol por medio de Agrobacterium. A) Hipocotilos utilizados como explante principal
para la transformación. B) Hipocótilo con brotes de novo formados en el área del suspensor del hipocotilo 4 días después de la inoculación (DAI). C) Brotes diferenciados resistentes a kanamicina 20 DAI (RK ). D) Las plántulas RK
se mantuvieron en su explante original hasta la formación de raíces. E) Las plántulas 5-7 cm de altura con 1-2 hojas
trifoliadas y un sistema de raíces diferenciado 60 días en un medio de enraizamiento. F) Planta de frijol T0 trasladada
al suelo (20 cm de altura). G) Planta T0 a 50 % de su floración, 20 días después de su traslado a un invernadero. H)
Formación de vainas 18 días después de 50 % de la floración.
the use of the GV3101 strain some degree of necrosis
on the explants and inhibition of full regeneration
were observed (Table 1). The A. tumefaciens strain
effect was more severe for FMA than for PS reducing
326
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
Las plantas que mantuvieron una condición saludable fueron transferidas a invernadero para observación posterior (Figura 2f ). Todas las líneas T0 mostraron estados fenológicos similares en comparación con
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
Table 1. Effects of Agrobacterium tumefaciens strain and common bean cultivar on transformation efficiency.
Cuadro 1. Efectos de la cepa Agrobacterium tumefaciens y de la variedad de frijol en la eficiencia de transformación.
Cultivar
PS
FMA
A. tumefaciens
strain
Gene
GV2260
GV3101
GV2260
GV3101
PS control
pdf1.2+nptII
avp1 + bar
FMA control
pdf1.2+nptII
avp1 + bar
Number of
embryonic axes†
100
94.5
92.5
210
215
200
Hypocotyls with
organogenic
buds (%)¶
Hypocotyls
with shoots
95 (95.0)
80 (84.6)
76 (82.1)
183 (87.1)
196 (91.0)
152 (76.0)
95
76
58.5
179
49.5
33.5
Hypocotyls with resistant
Regeneration
plants (Transformation
efficiency (%)
§
efficiency)
27.0 (28.6) § aÞ
19.5 (21.1) b
36.5 (17.0) a
20.5 (10.25) b
80 (80.0)
171 (81.4)
Values are average of three transformation experiments at different time points; each experiment had three replicates. Each petri dish
with at least 10 hypocotyls was the experimental unit v Los valores son el promedio de tres experimentos de transformación en diferentes
momentos; cada experimento tuvo tres repeticiones. Cada caja petri con al menos 10 hipocótilos fue la unidad experimental.
¶
Number of embryos with bud clusters induced/number of embryos × 100 v Número de embriones con grupos de brotes inducidos/
número de embriones × 100.
§
Number of kanamycin resistant (nptII) or glufosinate-ammonium herbicide (bar) plants/Number of embryonic axes × 100 v Número
de plantas resistentes a la kanamicina (nptII) o al herbicida glufosinato de amonio (bar)/Número de ejes embrionarios × 100.
Þ
Different letters indicate a significant difference in observed inhibition between lines (Tukey; p£0.05); PS: Pinto Saltillo; FMA: Flor
de Mayo Anita v Letras diferentes indican una diferencia significativa en la inhibición observada entre líneas (Tukey; p£0.05); PS: Pinto
Saltillo; FMA: Flor de Mayo Anita.
†
the regeneration and transformation efficiency up to
30 % within PS and 80 % in FMA in relation to
control plants regeneration (Table 1).
Different transformation trials with A. tumefaciens
on FMA and PS showed direct organogenesis response
of hypocotyls. Average transformation efficiency
(number of resistant shoots to kanamycin / number
of explants X 100) for GV2260 (pdf1.2+nptII) was
17 and 28 % for FMA and PS. Transformation
efficiency (number of resistant shoots to glufosinateammonium herbicide / number of explants X 100)
using GV3101 (avp1+bar) was 10 and 21 % for FMA
and PS, respectively indicating a statistical difference
due to the Agrobacterium strain used (p=0.011)
(Table 1).
There was a significant difference (p=0.001)
in response for both cultivars to the overall
transformation process cutting down up to nearly
50 % in FMA compared to PS regardless the A.
tumefaciens strain used (Table 1). The transformation
efficiency close to 30 %, suggests that the system
herein utilized is comparable, and in some cases
superior, to other transformation systems (Aragão et
al., 1996, 2002; Kim and Minamikawa, 1996).
The use of kanamycin or glufosinate-ammonium
to detect a functional nptII or bar gene in the plant
las plantas no transformadas; florecieron y produjeron semillas al mismo ritmo que las plantas testigo
(Figuras 2g y 2h).
Cepas diferentes de A. tumefaciens para inoculación y co-cultivo, como GV2260 y GV3101, indujeron una eficiencia de transformación diferenciada.
Con el uso de la cepa GV3101 se observó cierto grado de necrosis en los explantes e inhibición de la regeneración completa (Cuadro 1). El efecto de la cepa
A. tumefaciens fue más severo para FMA que para PS,
reduciendo la regeneración y la eficiencia de transformación hasta 30 % en PS y 80 % en FMA respecto
a la regeneración de las plantas testigo (Cuadro 1).
Los diferentes ensayos de transformación con A.
tumefaciens en FMA y PS mostraron una respuesta
de organogénesis directa de hipocotilos. La eficiencia
media de la transformación (número de brotes resistentes a kanamicina / número de explantes X 100)
para el GV2260 (pdf1.2+nptII) fue 17 y 28 % para
FMA y PS. La eficiencia de transformación (número
de brotes resistentes a glufosinato de amonio / número de explantes X 100) usando GV3101 (avp1+bar)
fue 10 y 21 % para FMA y PS, lo que indica una diferencia estadística debido a la cepa de Agrobacterium
usada (P=0.011) (Cuadro 1).
ESPINOSA-HUERTA et al.
327
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
genome was efficient in maintaining the transformed
plants in a permanent stage of selection. However,
reduced transformation efficiency was reduced
(40 %) in both cultivars when using glufosinateammonium compared to kanamycin selection
(Table 2). Differences in transformation efficiency
between cultivars was confirmed using glufosinateammonium where FMA showed 3.9 % (p=0.001)
compared to PS (8.4 %) (p=0.037) (Table 2).
A two-way analysis of variance showed that there
were no significant interactions (p>0.05) between
cultivars, Agrobacterium strains and selection agents.
The difference in mean resistant plants, either
kanamycin or gluphosinate-ammonium on the
two cultivars, appear constant when either of the
Agrobacterium strains was used. This was confirmed
with a three-way interaction analysis (p>0.05) (Table 3).
Hubo diferencia significativa (p=0.001) en la respuesta de ambos cultivares en el proceso global de
transformación, bajando hasta casi 50 % en FMA
comparado con PS, independientemente de la cepa
de A. tumefaciens usada (Cuadro 1). La eficiencia de
transformación cercana a 30 % sugiere que el sistema
usado en este estudio es comparable y, en algunos casos, superior a otros sistemas de transformación (Aragão et al., 1996, 2002; Kim y Minamikawa, 1996).
El uso de kanamicina o glufosinato de amonio
para detectar los genes nptII o bar funcionales en el
genoma de la planta fue eficiente para mantener las
plantas transformadas en una etapa permanente de
selección. Sin embargo, la eficiencia de transformación fue menor (40 %) en ambos cultivares al usar
glufosinato de amonio, comparado con kanamicina (Cuadro 2). Las diferencias en la eficiencia de la
transformación entre los cultivares se confirmaron al
usar glufosinato de amonio, donde FMA tuvo 3.9 %
(p=0.001) comparado con PS (8.4 %) (p=0.037)
(Cuadro 2).
Un análisis de varianza de dos vías no mostró interacciones significativas (p>0.05) entre los cultivares,
Genomic analysis
A preliminary analysis of the T0 kanamycinresistant lines population to verify presence of
inserts was performed by end point PCR (Figure
Table 2. Agrobacterium-mediated transformation efficiency by using different selection agents for two common bean cultivars.
Tabla 2. Eficiencia de la transformación mediada por Agrobacterium usando diferentes agentes de selección para dos variedades
de frijol.
Cultivar
PS
FMA
Selection gene
Embryonic axes§
Hypocotyls w/ buds
Hypocotyls with
shoots
Number of resistant plants
(Average ± S.E.) Þ
Transformation efficiencyÞ
bar†
nptII¶
bar
nptII
250
185
180
400
194
152
136
304
110
117
100
67
21 (7.0 ± 1) Þ 8.4¤ a††
39 (19.5 ± 1.5) 21.1 c
7 (2.33 ± 0.66) 3.9 b
41 (20.5 ± 2.5) 10.3 c
†
bar: phosphinothricin acetyl transferase gene confers glufosinate-ammonium herbicide resistance v bar: gen fosfinotricin acetil
transferasa confiere resistencia al herbicida glufosinato de amonio.
¶
nptII: neomycin phosphotransferase gene confers resistance to kanamycin v nptII: gen neomicin fosfotransferasa confiere resistencia a
la kanamicina.
§
Values are average of three transformation experiments at different time points, each experiment had three replicates. Each petri dish
with at least 10 hypocotyls was the experimental unit v Los valores son la media de tres experimentos de transformación en diferentes
momentos; cada experimento tuvo tres repeticiones. Cada caja de petri con al menos 10 hipocótilos fue la unidad experimental.
Þ
Average of resistant plants among replications and its standard error v Promedio de plantas resistentes entre las repeticiones y su error
estándar.
¤
Number of resistant plants (Number of kanamycin or glufosinate-ammonium herbicide resistant plants/Number of embryonic axes x
100) v Número de plantas resistentes (Número de plantas resistentes a la kanamicina o al herbicida glufosinato-amonio / Número de
ejes embrionarios x 100)
††
Different letters indicate a significant difference in observed inhibition between lines (Tukey; p£0.05). PS: Pinto Saltillo; FMA: Flor
de Mayo Anita v Letras diferentes indican una diferencia significativa en la inhibición observada entre líneas (Tukey; p£0.05). PS: Pinto
Saltillo; FMA: Flor de Mayo Anita.
328
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
Table 3. Three-way interaction analysis of variance between cultivars, Agrobacterium strain and selection agents.
Cuadro 3. Análisis de varianza de tres vías de interacción entre los cultivares, la cepa Agrobacterium y los agentes de selección.
Source
Main effects
2-Way interactions
3-Way interactions
4-Way interactions
Residual error
Total
DF
4
6
4
1
20
35
Seq SS
197.153
12.903
3.640
0.102
58.202
272.000
Adj SS
Adj MS
F
P
75.0070
10.3111
3.6402
0.1023
58.2020
18.7518
1.7185
0.9100
0.1023
2.9101
6.44
0.59
0.31
0.04
0.002
0.734 NS
0.866 NS
0.853 NS
NS: non-significant interaction v NS: interacción no significativa.
3). These results were confirmed by q-PCR showing
amplification of the pdf1.2 gene in the lines that
amplified for all the three components mentioned
(Figure 4).
The transcriptional expression of the pdf1.2 gene
in nearly homozygous T3 population showed that
plants expressed different levels of pdf1.2 gene (0.610.9) which were correlated to levels of tolerance or
resistance to Colletotrichum lindemuthianum strains
448 or 1472 (data not shown) (Figure 5).
Segregation analysis
Segregation ratios and c2 analysis indicated that all
transgenic lines showed a 3:1 segregation, indicating
one construct insertion. The genomic analysis of
the plants showed preliminarily an integration of
the constructs on T0 plants and evidence of stable
integration in T3 populations (Data not shown).
CONCLUSIONS
The Agrobacterium-mediated transformation
protocol reported here is a viable alternative to
incorporate genes into common bean plants for their
use in breeding programs. Besides, it is a tool for
functional genomics in order to integrate valuable
genes or regulatory sequences that may provide added
value for agronomical performance, nutritional or
market value.
ACKNOWLEDGEMENTS
Authors would like to thank Dr. Miguel Gómez Lim from
CINVESTAV-Irapuato, México, and Dr. Roberto Gaxiola Ariza
cepas de Agrobacterium y agentes de selección. La
diferencia promedio en las plantas con resistencia,
ya sea a kanamicina o glufosinato de amonio en los
dos cultivares, fue constante al utilizar cualquiera de
las cepas de Agrobacterium. Esto se confirmó con un
análisis de interacción de tres vías (p>0.05) (Cuadro
3).
Análisis genómico
Se realizó un análisis preliminar de la población
T0 de líneas resistentes a kanamicina para verificar
la presencia de insertos por medio de PCR de punto final (Figura 3). Estos resultados fueron confirmados por q-PCR que muestra la amplificación del
gen pdf1.2 en las líneas que amplificaron para los tres
componentes mencionados (Figura 4).
La expresión transcripcional del gen pdf1.2 en la
población T3 casi homocigota, mostró que las plantas expresan diferentes niveles del gen pdf1.2 (0.61
a 0.9) que se correlacionaron con los niveles de tolerancia o resistencia a las cepas de Colletotrichum
lindemuthianum 448 o 1472 (datos no presentados)
(Figura 5).
Análisis de segregación
Las proporciones de segregación y el análisis c2
indicaron que todas las líneas transgénicas mostraron una segregación 3:1, indicando una inserción
del constructo. El análisis genómico de las plantas
mostró preliminarmente una integración de las construcciones en las plantas T0 y pruebas de integración
estable en las poblaciones de T3 (datos no presentados).
ESPINOSA-HUERTA et al.
329
AGROCIENCIA, 16 de mayo - 30 de junio, 2013
M
L2
L3
L4
L7
L9
C+
C-
M
A
190 bp
B
60 bp
C
700 bp
1kb C+ C-
ntp avp1 avp2 avp3 avp4 avp5 avp6 avp7 avp8 avp9 1kb
D
630 bp
Figure 3. End point PCR gene amplification: A, 35S; B, pdf1.2 and C, nptII. Lanes 1 to 10: T0 kanamycin resistant plants; C+
(A): pGEM-T plasmid with 35-S gene; C+ (B): pKYLX80 plasmid; C+ (C): pCAMBIA 2300 plasmid; C-: water; M:
molecular weight marker 1 Kb. D, avp1. Lane C+: plasmid pKYLX80, lane C-: amplification reaction without DNA,
lane ntp: non-transformed plant, lanes avp1 to avp9: plants derived from transformation experiments, lane 1 kb: 1 kb
ladder.
Figura 3. Amplificación de genes por PCR de punto final: A, 35S; B, pdf1.2 y C, nptII. Carriles 1 a 10: plantas T0 resistentes a
la kanamicina; C + (A): plásmido pGEM-T con el gen 35S; C + (B): plásmido pKYLX80; C+ (C): plásmido pCAMBIA
2300; C-: agua; M: marcador de peso molecular 1 Kb. D, avp1. Carril C+: plásmido pKYLX80, carril C-: reacción de
amplificación sin ADN, carril ntp: planta no transformada, carriles avp1 a avp9: plantas derivadas de experimentos de
transformación, carril 1 kb: marcador de 1 kb.
from Arizona State University for providing the gene constructs.
This study was financed in part by CONACYT-SAGARPA
(109621) and Consejo de Ciencia y Tecnología de Guanajuato
(118814).
330
VOLUMEN 47, NÚMERO 4
CONCLUSIONES
El protocolo de transformación a través de Agrobacterium en este estudio es una alternativa viable
STABLE AND EFFICIENT Agrobacterium tumefaciens MEDIATED TRANSFORMATION OF Phaseolus vulgaris
Delta Rn vs Cycle
1.0e+001
A
Delta Rn
1.0e+000
B
1.0e-001
C
1.0e-002
1.0e-003
1.0e-004
1 3 6 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
Cycle Number
0.91
para incorporar genes en plantas de frijol para usar
en programas de mejoramiento genético. Además, es
una herramienta para la genómica funcional con el
fin de integrar genes valiosos o secuencias reguladoras
que pueden aportar un valor agregado para el rendimiento agronómico, valor nutricional o mercado.
0.76
0.69
0.65
0.61
C-
L9(1472)
L9(448)
L7(1472)
0.00
L2(1472)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
L2(448)
Relative expression
(2pot-DDCt)
Figure 4. Amplification by q-PCR of T1 transgenic common bean plants. A: amplification of internal control ribosomal 18S; B:
amplification of pdf1.2 gene from transformed lines; C: non amplification from non-transformed lines.
Figura 4. Amplificación por q-PCR de plantas T1 transgénicas de frijol A: amplificación de control interno ribosomal 18S; B:
amplificación del gen pdf1.2 desde las líneas transformadas; C: sin amplificación desde líneas no transformadas.
Figure 5. Levels of transcriptional expression of pdf1.2 gene
in resistant T3 common bean transgenic plants
inoculated with Colletotrichum lindemuthianum
strain 448 or 1472.
Figura 5. Niveles de expresión transcripcional del gen
pdf1.2 en plantas transgénicas T3 resistentes
de frijol inoculadas con la cepa Colletotrichum
lindemuthianum 448 o 1472.
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