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WO2024150525A1 - 抗ネコｐｄ－１抗体 - Google Patents

抗ネコｐｄ－１抗体 Download PDF

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WO2024150525A1
WO2024150525A1 PCT/JP2023/041176 JP2023041176W WO2024150525A1 WO 2024150525 A1 WO2024150525 A1 WO 2024150525A1 JP 2023041176 W JP2023041176 W JP 2023041176W WO 2024150525 A1 WO2024150525 A1 WO 2024150525A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
feline
antibody
amino acid
acid sequence
fpd1
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/041176
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
拓也 水野
翔真 西堀
Original Assignee
国立大学法人山口大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to feline PD-1 (Programmed Cell Death 1), comprising specific heavy chain complementarity determining regions (CDRs) 1-3 and specific light chain CDRs 1-3 (hereinafter sometimes referred to as "the anti-feline PD1 antibody”); a polynucleotide that encodes the anti-feline PD1 antibody (hereinafter sometimes referred to as “the anti-feline PD1 antibody coding polynucleotide”); a vector that comprises the anti-feline PD1 antibody coding polynucleotide operably linked downstream of a promoter (hereinafter sometimes referred to as "the anti-feline PD1 antibody expression vector”); host cells into which a D1 antibody expression vector has been introduced (hereinafter, sometimes referred to as "the subject host cells”); a binding inhibitor between feline PD-1 and feline PD-L1 (hereinafter, sometimes referred to as "the subject inhibitor”), which contains the subject anti-feline
  • PD-1 is a receptor that exists on the surface of T cells. It has the function of suppressing the activation of T cells, and has been shown to have functions such as suppressing immune responses against oneself. Such immune response is suppressed when PD-L1, a ligand of PD-1, binds to PD-1. Meanwhile, cancer cells express PD-L1, and the expressed PD-L1 binds to PD-1, thereby suppressing T cell activation and acquiring the ability to escape immune responses. Therefore, inhibiting the binding between PD-1 and PD-L1 is thought to be effective in treating cancer.
  • Patent Document 1 a cancer treatment agent that contains an anti-PD-L1 antibody as an active ingredient and has the effect of suppressing the proliferation of cancer cells in vivo
  • Patent Document 2 an anti-cancer agent that contains an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody that restores the reactivity of iNKT cells in which allergies have been induced by administration of an iNKT cell ligand
  • Patent Document 1 anti-PD-1 antibodies are being developed as treatments for melanoma, non-small cell lung cancer, and renal cell cancer.
  • Patent Document 3 anti-canine PD-1 antibodies and anti-canine PD-L1 antibodies that inhibit the binding of PD-1 to PD-L1 in dogs.
  • Patent Document 3 On the other hand, in cats, there are few researchers conducting research on cats, and research on PD-1 and PD-L1 has not progressed, so there have been no reports of anti-feline PD-1 antibodies or anti-feline PD-L1 antibodies.
  • the objective of the present invention is to provide an antibody or the like that specifically binds to feline PD-1 and has the effect of inhibiting the binding between feline PD-1 and feline PD-L1.
  • the present inventors have been working diligently to solve the above problems. In the process, they first confirmed that the anti-canine PD-1 antibodies (i.e., "3B7-D9" and “4F12-E6” in Patent Document 3) previously produced by the present inventors could not detect recombinant feline PD-1 protein. Therefore, in order to produce a mouse monoclonal antibody against feline PD-1, they first produced a mouse cell line expressing feline PD-1 (feline PD-1-expressing cell line), immunized the mouse, and then produced cells (hybridomas) in which B cells (lymph node monocytic cells) and myelomas (P3U1 cells) were fused.
  • B cells lymph node monocytic cells
  • P3U1 cells myelomas
  • an antibody that specifically binds to feline PD-1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, a heavy chain complementarity determining region (CDR) 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • the antibody comprising a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • [2] The antibody described in [1] above, comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • [3] The antibody described in [1] or [2] above, comprising a heavy chain consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and a light chain consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • [5] A vector comprising a promoter and the polynucleotide according to [4] above operably linked downstream of the promoter.
  • [6] A host cell into which the vector described in [5] above has been introduced.
  • [8] A method for inhibiting binding between feline PD-1 and feline PD-L1, comprising the step of administering to a cat the antibody according to any one of [1] to [3] above.
  • inventions of the present invention include the use of the anti-feline PD1 antibody for use in immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats, and the use of the anti-feline PD1 antibody for the manufacture of a preparation for immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats.
  • an antibody that specifically binds to feline PD-1 and has the effect of inhibiting the binding between feline PD-1 and feline PD-L1 can release the inhibition of T cell activation caused by the binding between fPD1 and fPDL1 in cats and activate T cells, and is therefore useful for immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats.
  • the figure shows the results of flow cytometry analysis of an NIH3T3 cell line (hereinafter sometimes referred to as "NIH3T3/fPD1”) (hereinafter sometimes referred to as “fPD1” in the figure) stably expressing feline (Felis silvestris catus) PD-1 (hereinafter sometimes referred to as “fPD1”) or an NIH3T3 cell line (hereinafter sometimes referred to as "NIH3T3”) (hereinafter sometimes referred to as "mock” in the figure) in the presence of four types of anti-fPD1 mouse monoclonal antibodies (1A1 [Figure 1A], 1A11 [Figure 1B], 1D3 [Figure 1C], and 1H11 [ Figure 1D]), incubated in the presence of anti-mouse IgG-PE.
  • NIH3T3/fPD1 stably expressing feline (Felis silvestris catus) PD-1
  • NIH3T3 NIH3T3
  • FIG. 2A shows the results of Western blotting using anti-human IgG for the fusion protein (hereinafter, sometimes referred to as "fPDL1”) of the extracellular domain of feline PD-L1 (hereinafter, sometimes referred to as "fPDL1”) and the human IgG2 Fc domain (hereinafter, sometimes referred to as "hIg").
  • fPDL1 anti-human IgG for the fusion protein
  • fPDL1 extracellular domain of feline PD-L1
  • hIg human IgG2 Fc domain
  • FIG. 2B shows the results of flow cytometry analysis after incubating NIH3T3/fPD1 ("fPD1" in the figure) or NIH3T3 ("mock” in the figure) in the presence of fPDL1-hIg and in the presence of anti-human IgG-PE.
  • PE on the horizontal axis indicates the PE-derived fluorescence intensity in anti-human IgG-PE, and the vertical axis indicates the cell count.
  • NIH3T3/fPD1 was incubated 1) in the presence of four types of anti-fPD1 mouse monoclonal antibodies (1A1 [FIG. 3A], 1A11 [FIG. 3B], 1D3 [FIG. 3C], and 1H11 [FIG.
  • FIG. 4B 1A1-3 [FIG. 4C], 1D3-1 [FIG. 4D], 1D3-2 [FIG. 4E], and 1D3-3 [FIG. 4F]) (arrowhead in the figure), 2) in the presence of fPDL1-hIg (arrow in the figure), or 3) in the presence of the six types of anti-fPD1 mouse monoclonal antibodies and fPDL1-hIg (open arrow in the figure), and then incubated in the presence of anti-human IgG-PE, and the results of flow cytometry analysis were then obtained.
  • the horizontal axis "PE” indicates the fluorescence intensity derived from PE in anti-human IgG-PE, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • FIG. 5A shows the results of detecting NIH3T3/fPD1 by Western blotting using anti-FLAG antibody (left) and "1A1-2" (right).
  • FIG. 5B shows the results of incubating NIH3T3/fPD1 ("fPD1" in the figure) or NIH3T3 ("mock” in the figure) in the presence of "1A1-2", respectively, and incubating in the presence of anti-mouse IgG-PE, followed by flow cytometry analysis.
  • FIG. 5B shows the results of incubating NIH3T3/fPD1 ("fPD1" in the figure) or NIH3T3 ("mock” in the figure) in the presence of "1A1-2", respectively, and incubating in the presence of anti-mouse IgG-PE, followed by flow cytometry analysis.
  • FIGS. 5C shows the results of incubating a feline lymphoma cell line (FT-1) (hereinafter sometimes referred to as "FT-1/k-fPD1") or FT-1 in which the fPD1 gene has been knocked out in the presence of "1A1-2", respectively, and incubating in the presence of anti-mouse IgG-PE, followed by flow cytometry analysis.
  • FT-1 feline lymphoma cell line
  • FT-1 in which the fPD1 gene has been knocked out in the presence of "1A1-2”, respectively
  • FIGS. 5B and 5C "PE” on the horizontal axis indicates the fluorescence intensity derived from PE in anti-mouse IgG-PE, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • This figure shows the results of flow cytometry analysis after incubating NIH3T3/fPD1 1) in the absence of "1A1-2” and in the presence of hIg ((1) in the figure), 2) in the presence or absence of "1A1-2” and in the presence of fPDL1-hIg ((2) in the figure), or 3) in the presence of "1A1-2” ((3) in the figure), each in the presence of anti-human IgG-PE.
  • PE on the horizontal axis indicates the PE-derived fluorescence intensity in anti-human IgG-PE, and the vertical axis indicates the cell number.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells from three healthy cats (Cat 1, Cat 2, and Cat 3) were cultured in the presence of concanavalin A (ConA) and an isotype control (fake antibody) or "1A1-2," and the concentration of feline IFN- ⁇ (interferon- ⁇ , hereafter sometimes referred to as "fIFN ⁇ ") in the culture medium was measured.
  • ConA concanavalin A
  • Fake antibody isotype control
  • fIFN ⁇ feline IFN- ⁇
  • 8A shows the results of flow cytometry analysis after incubating NIH3T3/fPD1 ("fPD1" in the figure) or NIH3T3 ("mock” in the figure) in the presence of "ch-1A1-2” (i.e., a chimeric antibody consisting of the heavy chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1, and the light chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1), and incubating in the presence of anti-feline IgG-PE.
  • ch-1A1-2 i.e., a chimeric antibody consisting of the heavy chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1, and the light chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1
  • PE on the horizontal axis indicates the fluorescence intensity derived from PE in anti-feline IgG-PE, and the vertical axis indicates the cell count.
  • FIG. 8B shows the results of flow cytometry analysis after incubating NIH3T3/fPD1 1) in the absence of "ch-1A1-2” and in the presence of hIg ((1) in the figure), or 2) in the presence or absence of "ch-1A1-2” and in the presence of fPDL1-hIg ((2) in the figure), respectively, in the presence of anti-human IgG-PE.
  • the horizontal axis "PE” indicates the fluorescence intensity derived from PE in anti-human IgG-PE, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • 8C shows the results of measuring the concentration of fIFN ⁇ in the culture medium after culturing PBMCs derived from four healthy cats (cat 1, cat 2, cat 3, and cat 4) in the presence of ConA and isotype control (fake antibody) or "ch-1A1-2".
  • the present anti-feline PD1 antibody is an antibody that specifically binds to feline PD-1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (i.e., an antibody that recognizes and binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 by a highly specific antigen-antibody recognition mechanism), and comprises a heavy (H) chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an H chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an H chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light (L) chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an L chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and an L chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (i.e., the present anti-feline PD1 antibody), and has an effect of inhibiting the binding
  • the above-mentioned H chain CDR1 to 3 are usually contained in the H chain variable region, and the above-mentioned L chain CDR1 to 3 are usually contained in the L chain variable region.
  • Cat refers to any of the following small mammals: domestic cat (Felis silvestris catus), wild cats, and feral cats (domestic cats that have reverted to being wild), all of which are classified in the order Felidae (Carnivora), suborder Felidae, subfamily Felinae, and genus Felis. "Cat” does not include animals of the Felidae family other than cats (e.g. lions, tigers, leopards, etc.).
  • the origin, type, class, form, etc. of the present anti-feline PD1 antibody are not particularly limited, and examples of the present anti-feline PD1 antibody include antibodies derived from mice, rats, cats, etc.; polyclonal antibodies, oligoclonal antibodies (a mixture of several to several tens of antibodies), monoclonal antibodies; chimeric antibodies in which a partial region (e.g., a constant region) of an antibody is replaced with a region derived from a different species (e.g., a cat), F(ab') 2 antibody fragments obtained by digesting a monoclonal antibody with pepsin, Fab' antibody fragments obtained by reducing F(ab') 2 antibody fragments, Fab and other antibody fragments obtained by digesting a monoclonal antibody with papain, and recombinant antibodies such as scFv in which an antibody heavy (H) chain variable region and an antibody light (H) chain variable region are linked by an amino acid bridge; etc.
  • the present anti-feline PD1 antibody is preferably isolated.
  • isolated means that the antibody is present in a state different from the state in which it is naturally present, for example, by artificially removing the antibody from the environment in which it naturally exists or by expressing the antibody in an environment different from the environment in which the antibody naturally exists.
  • isolated antibody does not include an antibody derived from an individual and contained in the body of the individual or in tissues or body fluids (blood, plasma, serum, etc.) derived from the body without being subjected to external manipulation (artificial manipulation).
  • the present anti-feline PD1 antibody is preferably an antibody produced by artificial manipulation (for example, the above-mentioned recombinant antibody).
  • Such "antibodies derived from cells produced by artificial manipulation or antibodies produced from such cells” does not include antibodies that have not been subjected to artificial manipulation, for example, antibodies produced from naturally occurring B cells.
  • framework regions are typically linked to the amino (N) termini and carboxyl (C) termini of each of the H chain CDR1-3 and L chain CDR1-3.
  • H chain FRs include H chain FR1 linked to the N terminus of H chain CDR1, H chain FR2 linked to the C terminus of H chain CDR1 (the N terminus of H chain CDR2), H chain FR3 linked to the C terminus of H chain CDR2 (the N terminus of H chain CDR3), and H chain FR4 linked to the C terminus of H chain CDR3.
  • examples of the L chain FR include L chain FR1 linked to the N-terminus of L chain CDR1, L chain FR2 linked to the C-terminus of L chain CDR1 (N-terminus of L chain CDR2), L chain FR3 linked to the C-terminus of L chain CDR2 (N-terminus of L chain CDR3), and L chain FR4 linked to the C-terminus of L chain CDR3.
  • the above-mentioned H chain FR1 can be, for example, a polypeptide consisting of the 1st to 30th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • the H chain FR2 may be, for example, a polypeptide consisting of the 36th to 49th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • the H chain FR3 may be, for example, a polypeptide consisting of the 67th to 98th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • the above-mentioned H chain FR4 can be, for example, a polypeptide consisting of the 114th to 124th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • L-chain FR1 can be, for example, a polypeptide consisting of the 1st to 23rd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • L-chain FR2 can be, for example, a polypeptide consisting of the 35th to 49th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • L-chain FR3 can be, for example, a polypeptide consisting of the 57th to 88th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • L-chain FR4 can be, for example, a polypeptide consisting of the 98th to 109th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of said polypeptide.
  • the heavy chain CDR1 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions H31-35 in the Kabat numbering (see Kabat, E.A. et al., (1991) NIH Publication No. 91-3242, sequences of proteins of immunological interest).
  • the heavy chain CDR2 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions H50-52, H52A, and H53-65 in the Kabat numbering.
  • the heavy chain CDR3 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions H95-100, H100A-G, H101, and H102 in the Kabat numbering.
  • the light chain CDR1 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions L24-34 in the Kabat numbering.
  • the L chain CDR2 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions L50 to L56 in the Kabat numbering.
  • the L chain CDR3 in the present anti-feline PD1 antibody is usually located at positions L89 to L97 in the Kabat numbering.
  • the present anti-feline PD1 antibody preferably comprises an H-chain variable region having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and an L-chain variable region having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, and more preferably comprises an H-chain having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, and an L-chain having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
  • the present anti-feline PD1 antibody can be obtained by culturing cells (i.e., the present host cells) produced by genetically introducing the present anti-feline PD1 antibody expression vector into host cells in a culture medium appropriate for the host cells, and recovering the present anti-feline PD1 antibody produced in the culture medium.
  • transgenic animals such as mice, cows, goats, sheep, chickens, and pigs can be produced that incorporate part or all of the anti-feline PD1 antibody expression vector of the present invention, and the anti-feline PD1 antibody of the present invention can be mass-produced from the blood, milk, etc. of such transgenic animals.
  • a non-human animal e.g., mouse, rat
  • a non-human animal e.g., mouse, rat
  • a cell line non-human animal cell line expressing feline PD-1
  • the hybridoma that produces the anti-feline PD-1 antibody can be obtained by 1) screening the hybridomas by an ELISA method using a plate on which feline PD-1 is immobilized, and/or 2) screening the hybridomas that are positive for the non-human animal cell line expressing feline PD-1 by flow cytometry.
  • the polynucleotide encoding the constant region in the anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide contained in the genomic DNA of the hybridoma can be replaced with a polynucleotide encoding a constant region derived from a different species (e.g., a cat) using the CRISPR/Cas9 system according to the method described in the literature "Sci Adv. 2019 Aug 28; 5(8): eaaw1822.” and the literature “Vet Comp Oncol. 2020 Dec; 18(4): 739-752.” to produce a hybridoma that produces a chimeric antibody derived from a species having different variable and constant regions.
  • the anti-feline PD1 antibody can be purified from the culture supernatant of the hybridoma using known antibody purification techniques.
  • polynucleotide encoding the present anti-feline PD1 antibody may be a polynucleotide that encodes the present anti-feline PD1 antibody (i.e., the present anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide), and the nucleotides constituting the present anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide may be DNA or RNA having a natural structure, or may be nucleotides having a structure in which DNA or RNA having a natural structure has been chemically modified (also referred to as "modified nucleic acid").
  • a modified nucleic acid is used to impart resistance to degradation by RNase.
  • the modified nucleic acid is preferably a nucleotide in which the base moiety is modified, for example, a pyrimidine nucleotide substituted at the 5th position, or a pseudouridine which may be substituted at the 1st position, and specific examples of the modified nucleic acid include 5-methylcytidine, 5-methoxyuridine, 5-methyluridine, pseudouridine, and 1-alkylpseudouridine.
  • the 1-alkylpseudouridine may be 1-(C1-C6 alkyl)pseudouridine, and is preferably 1-methylpseudouridine or 1-ethylpseudouridine.
  • the polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention can be easily prepared by standard methods based on the amino acid sequence of the anti-feline PD1 antibody of the present invention.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence can be obtained based on the amino acid sequence listed in the sequence listing, and the polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention can be prepared using standard molecular biological and/or chemical procedures.
  • the polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention may contain a nucleotide sequence in which the codons are optimized for expression in a specific host cell.
  • Such an optimized nucleotide sequence can be obtained by applying known algorithms and software to the amino acid sequence of interest.
  • the polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention may be a single-stranded (sense strand) polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention, or a double-stranded polynucleotide consisting of the sense strand and an antisense strand of its complementary sequence, and the form of the polynucleotide is selected to be appropriate for the method of introducing the polynucleotide into cells.
  • the polynucleotide in a single-stranded form, and in the case of plasmid DNA, the polynucleotide may be in a double-stranded form.
  • the polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention preferably includes a polynucleotide encoding an H-chain variable region having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a polynucleotide encoding an L-chain variable region having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, and more preferably includes a polynucleotide encoding an H-chain having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, and a polynucleotide encoding an L-chain having an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
  • 80% or more identity means identity of 80% or more (at least 80%), preferably 85% or more, more preferably 88% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, especially more preferably 98% or more, and most preferably 100% identity.
  • identity means the degree of polypeptide or polynucleotide sequence similarity, as determined by matching a query sequence with another sequence, preferably of the same type (nucleic acid or protein sequence).
  • Preferred computer program methods for calculating and determining "identity” include GCG BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402; Devereux et al., Nucleic Acids Res. 1984, 12:387), and BLASTN 2.0 (Gish W., http:// blast. wustl.
  • an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:X means, in other words, “an amino acid sequence in which 0, 1 or several amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and/or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:X (amino acid sequence of SEQ ID NO:X) and which has the same function as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:X (amino acid sequence of SEQ ID NO:X).
  • an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and/or added means an amino acid sequence in which, for example, 1 to 30 amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and/or added, preferably 1 to 20 amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and/or added, preferably 1 to 15 amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and/or added, preferably 1 to 10 amino acid residue
  • the present anti-feline PD1 antibody expression vector is not particularly limited as long as it contains a promoter and the present anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide operably linked downstream of the promoter and is capable of transcribing the mRNA encoded by the present anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide (i.e., the present anti-feline PD1 antibody expression vector).
  • the anti-feline PD1 antibody expression vector of the present invention can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include non-viral vectors (e.g., episomal vectors, artificial chromosome vectors, and plasmid vectors) and viral vectors.
  • the vector may be either circular or linear.
  • the promoter in the present anti-feline PD1 antibody expression vector is not particularly limited as long as it is a region to which RNA polymerase (preferably RNA polymerase and general transcription factor) binds and initiates transcription of the mRNA encoded by the present polynucleotide located downstream thereof, and examples thereof include the SR ⁇ promoter, SV40 early promoter, viral LTR (Long Terminal Repeat), CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, EF1 ⁇ promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, etc.
  • RNA polymerase preferably RNA polymerase and general transcription factor
  • the anti-feline PD1 antibody expression vector may contain an enhancer, a polyA addition signal, a marker gene, a replication origin, a gene encoding a polypeptide that binds to the replication origin and controls replication, etc., as desired.
  • a marker gene refers to a gene that allows the selection or selection of cells by introducing the marker gene into cells.
  • Specific examples of the marker gene include drug resistance genes, fluorescent protein genes, luminescent enzyme genes, and chromogenic enzyme genes. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Specific examples of the drug resistance genes include neomycin resistance genes, tetracycline resistance genes, kanamycin resistance genes, zeocin resistance genes, and hygromycin resistance genes.
  • fluorescent protein genes include blue fluorescent protein (BFP), green fluorescent protein (GFP) genes, yellow fluorescent protein (YFP) genes, and red fluorescent protein (RFP) genes.
  • BFP blue fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • luminescent enzyme genes include luciferase genes.
  • chromogenic enzyme gene include the ⁇ -galactosidase gene, the ⁇ -glucuronidase gene, and the alkaline phosphatase gene.
  • the host cell of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell (i.e., the present host cell) into which the present anti-feline PD1 antibody expression vector is introduced and in which the present anti-feline PD1 antibody is expressed.
  • the host cells survive and are maintained in a liquid or in a moist (wet) state in a liquid (e.g., a culture plate or dish, a tube for cell storage or cell sorting).
  • a liquid e.g., a culture plate or dish, a tube for cell storage or cell sorting.
  • Such liquids include liquids in which the host cells survive and are maintained.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used, and examples of the medium include culture medium (e.g., culture medium containing or not containing serum), saline, phosphate buffered saline, Tris buffered saline, HEPES buffered saline, etc.
  • examples of the liquid include saline, Ringer's solution (lactate Ringer's solution, acetate Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution, etc.), and 5% glucose aqueous solution.
  • the serum may be, for example, 0.1 to 30 (v/v)% serum.
  • examples of the culture medium include culture media for animal cell culture (DMEM, EMEM, IMDM, RPMI1640, ⁇ MEM, F-12, F-10, M-199, AIM-V, etc.).
  • examples of the serum-free culture medium include commercially available B27 supplement (minus insulin) (Life Technologies), N2 supplement (Life Technologies), and B27 supplement (Life Technologies).
  • examples of the culture medium for animal cell culture include the above-mentioned culture medium supplemented with an appropriate amount (for example, 1 to 30%) of a serum substitute such as Serum Replacement (manufactured by Invitrogen) or Knockout Serum Replacement (manufactured by Invitrogen).
  • the host cell of the present invention can be prepared by genetically introducing the anti-feline PD1 antibody expression vector into the host cell.
  • the method of genetically introducing the anti-feline PD1 antibody expression vector into the host cell may be any method suitable for the anti-feline PD1 antibody expression vector and the host cell.
  • a non-viral vector when used as the anti-feline PD1 antibody expression vector, a method using liposomes or microparticles containing cationic lipids or the like, as described in WO 96/10038, WO 97/18185, WO 97/25329, WO 97/30170, and WO 97/31934 (herein incorporated by reference), may be used; see Jin et al, EMBO Mol Med. 2016 Jul; 8(7): 702-711.
  • the method of gene transfer of the anti-feline PD1 antibody expression vector of the present invention into host cells can be exemplified by a method of infecting immune cells with the virus using a culture supernatant containing the recombinant virus (i.e., a viral particle containing a viral vector plasmid [which may be DNA or RNA] in which a foreign gene [in the present application, a polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention] has been incorporated by removing a gene related to pathogenicity from the viral genome) or a concentrated recombinant virus.
  • a culture supernatant containing the recombinant virus i.e., a viral particle containing a viral vector plasmid [which may be DNA or RNA] in which a foreign gene [in the present application, a polynucleotide encoding the anti-feline PD1 antibody of the present invention] has been incorporated by removing a gene
  • the host cell may be any cell into which the anti-feline PD1 antibody-encoding polynucleotide is transcribed and into which the anti-feline PD1 antibody is expressed, and examples of such cells include yeast, mammalian (e.g., human, mouse, rat, dog, cat, etc.) cells, insect (e.g., Spodoptera frugiperda, Trichoplusiani, etc.) cells, and plant (e.g., tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rapeseed, alfalfa, rice, wheat, barley, etc.) cells.
  • yeast mammalian cells
  • insect e.g., Spodoptera frugiperda, Trichoplusiani, etc.
  • plant e.g., tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rapeseed, alfalfa, rice, wheat, barley, etc.
  • the present binding inhibitor between feline PD-1 and feline PD-L1 of the present invention is an agent (i.e., the present inhibitor) containing the present anti-feline PD-1 antibody, which is specified for the use "to inhibit the binding between feline PD-1 and feline PD-L1.”
  • the "binding between feline PD-1 and feline PD-L1" to be inhibited may be in cultured feline cells or in the living cat.
  • the subject inhibitor may be used as a cat food or drink or a cat medicine (formulation) by itself, consisting of the subject anti-feline PD1 antibody, which is the active ingredient, or may be used in the form of a composition (feline food or drink composition or feline medicinal composition) by further mixing with additives.
  • Additives for the inhibitor of the present invention include physiologically acceptable typical carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, isotonicity agents, coating agents, solubilizers, lubricants, glidants, dissolution aids, lubricants, flavorings, sweeteners, solvents, gelling agents, nutrients, etc.
  • Specific examples of such additives include water, saline, animal fats and oils, vegetable oils, lactose, starch, gelatin, crystalline cellulose, gum, talc, magnesium stearate, hydroxypropyl cellulose, polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, and glycerin.
  • the subject inhibitor may contain, in addition to the subject anti-feline PD1 antibody, which is the active ingredient, a component that inhibits the binding between feline PD-1 and feline PD-L1.
  • a component that inhibits the binding between feline PD-1 and feline PD-L1 e.g., a compound, a protein [e.g., an antibody], DNA, RNA).
  • the present inhibitor inhibits the binding of feline PD-1 and feline PD-L1, removes the inhibition of T cell activation in cats, and activates T cells in cats, making it advantageously applicable to formulations for immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats.
  • immunotherapy e.g., cancer immunotherapy
  • the present inhibition method for inhibiting the binding between feline PD-1 and feline PD-L1 is not particularly limited, so long as it comprises a step of administering the present anti-feline PD1 antibody to a cat and inhibits the binding between PD-1 and PD-L1 in the living body of a cat (i.e., the present inhibition method).
  • Cats that can be administered with the present anti-feline PD1 antibody may be any cat that requires inhibition of the binding between feline PD-1 and feline PD-L1, specifically cats that require the activation of T cells to be activated by removing the inhibition of T cell activation caused by the binding between PD1 and PDL1, and more specifically cats that require immunotherapy (e.g. cancer immunotherapy) (e.g. cats with cancer, cats at risk of developing cancer, etc.).
  • immunotherapy e.g. cancer immunotherapy
  • the administration form of the anti-feline PD1 antibody in this case can be oral administration in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrup, etc., or parenteral administration in the form of topical skin preparation, transdermal preparation, transmucosal preparation, nasal preparation, enteral preparation, injection, suppository, inhalant, patch, etc.
  • the dosage of the present anti-feline PD1 antibody is determined appropriately depending on the cat's age, weight, sex, symptoms, drug sensitivity, etc., and is, for example, in the range of 1 ⁇ g to 100 mg/kg (body weight)/day.
  • the present anti-feline PD1 antibody is administered once or multiple times (for example, 2 to 4 times) per day, and the dosage may be adjusted depending on the improvement of the cat's symptoms.
  • the present inhibitory method inhibits the binding between feline PD-1 and feline PD-L1 by administering the present anti-feline PD1 antibody to a cat, thereby releasing the inhibition of T cell activation in the cat and activating the T cells in the cat, and therefore can be advantageously applied to immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats.
  • immunotherapy e.g., cancer immunotherapy
  • the present inhibition kit is a kit (i.e., the present inhibition kit) containing the present anti-feline PD1 antibody or a labeled product thereof, or the present anti-feline PD1 antibody expression vector, specified for the use "to inhibit the binding between feline PD-1 and feline PD-L1", and such a kit usually contains the items generally contained in this type of kit, such as a carrier, a pH buffer, a stabilizer, an instruction manual, and instructions for inhibiting the binding between feline PD-1 and feline PD-L1.
  • the "binding between feline PD-1 and feline PD-L1" to be inhibited may be in cultured feline cells or in the living cat.
  • Examples of the labeling substance in the label of the anti-feline PD1 antibody of the present invention include enzymes such as peroxidase (e.g., horseradish peroxidase [HRP]), alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apo-glucose oxidase, urease, luciferase, and acetylcholinesterase; fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelates, dansyl chloride, and tetramethylrhodamine isothiocyanate; green fluorescent protein (GFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (Red Fluorescence Protein), and the like.
  • fluorescent protein examples include fluorescent protein such as radioisotope (RFP), luciferase, and the like; radioisotopes such as 3 H, 14 C, 125 I, and 131 I, biotin, avidin, and chemiluminescent substances.
  • fluorescent protein such as radioisotope (RFP), luciferase, and the like
  • radioisotopes such as 3 H, 14 C, 125 I, and 131 I, biotin, avidin, and chemiluminescent substances.
  • the primers used in PCR in the following examples are shown in Table 1.
  • the NIH3T3 cell line which is a mouse fibroblast cell line used in the following examples, was cultured and maintained in a DMEM culture medium containing 10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, and 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol (hereinafter simply referred to as "DMEM culture medium") under conditions of 5% CO 2 and 37° C.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, and 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol
  • PCR was performed under the conditions of pre-denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 98 ° C for 10 seconds, annealing reaction at 58 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C for 60 seconds for 35 cycles, and then a final extension reaction was performed at 68 ° C for 10 minutes.
  • the following PCR was also performed under the above conditions.
  • PCR product i.e., cDNA of fPD1
  • cDNA of fPD1 was gel-purified, cleaved with BamHI and EcoRI, and then inserted between two restriction enzyme sites (BamHI and EcoRI) in the pMXs-IP vector to prepare pMX-IP-fPD1.
  • PCR was performed using forward primer 2 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15) and reverse primer 2 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16) and BigDye (registered trademark) Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (manufactured by Perkin-Elmer) according to the protocol attached to the product, and the amplified PCR product was confirmed to be a nucleotide sequence (feline PD-1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12) encoding fPD1 (feline PD-1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) using an ABI Prism (registered trademark) 377 automated DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • fPD1-expressing retroviral vector expressing a protein (FLAG-fused fPD1) in which two FLAG tags (2xFLAG) are fused to the C-terminus of fPD1
  • pMX-IP-fPD1 was used as a template, and PCR was performed using forward primer 1, reverse primer 3 (a single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 [i.e., a nucleotide sequence encoding a polypeptide containing a FLAG tag at the C-terminus of fPD1]), and KOD-Plus-Neo according to the protocol attached to the product to obtain a primary PCR product.
  • PCR was performed using the primary PCR product as a template, forward primer 1, reverse primer 4 (a single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 [i.e., a nucleotide sequence encoding a 2xFLAG tag]), and KOD-Plus-Neo according to the protocol attached to the product to obtain a secondary PCR product.
  • forward primer 1 a single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 [i.e., a nucleotide sequence encoding a 2xFLAG tag]
  • KOD-Plus-Neo according to the protocol attached to the product to obtain a secondary PCR product.
  • the obtained secondary PCR product was introduced into the restriction enzyme site SmaI of the pbluescript SK(-) vector, and then further cleaved with EcoRI and NotI, and then inserted between the two restriction enzyme sites (EcoRI and NotI) of the pMXs-IP vector to prepare pMX-IP-fPD1-FL (i.e., an fPD1-expressing retroviral vector).
  • fPD1-expressing mouse cell line 3.5 ⁇ 10 5 NIH3T3 cell lines were seeded in a 6-well dish, and one day later, pMX-IP-fPD1-FL was transfected into the NIH3T3 cell line using PEI Max (Polysciences) according to the protocol attached to the product, and incubated for 48 hours. Then, the cells were cultured in the presence of 10 ⁇ g/ml puromycin (Sigma-Aldrich) to prepare NIH3T3/fPD1 (i.e., an NIH3T3 cell line stably expressing fPD1).
  • fPD1 in the above NIH3T3/fPD1 was confirmed by immunofluorescence using anti-FLAG M2 antibody (1:1000 dilution, Sigma-Aldrich) as the primary antibody and IgG-Alexa (registered trademark) 647-labeled anti-mouse (Jackson Immunoresearch) as the secondary antibody.
  • mice with NIH3T3/fPD1 and subsequent screening of NIH3T3/fPD1 positive hybridomas 500 ⁇ L of DMEM culture solution containing 1 ⁇ 10 7 NIH3T3/fPD1 was emulsified with an equal amount of Titer Max (registered trademark) Gold (manufactured by CytRx) and administered intradermally to the hind footpad of a 5-week-old Balb/c mouse (manufactured by SLC). A total of four administrations were performed every other week, and 10 days after the last administration, popliteal lymph node cells were isolated and fused with P3U1 cells.
  • Titer Max registered trademark
  • SLC 5-week-old Balb/c mouse
  • lymph node monocytic cells (1 ⁇ 10 8 cells) were mixed with P3U1 cells (2 ⁇ 10 7 cells) and washed twice with serum-free RPMI1640 culture solution. Then, following the instructions of the ClonaCell-HY Hybridoma Kit (Veritas), the cells were fused and seeded (100 ⁇ L/well) into four 96-well tissue culture plates. After colonies were obtained, NIH3T3 cell-positive hybridomas expressing fPD1 were screened by ELISA and flow cytometry, and 288 types of NIH3T3/fPD1-positive hybridomas were obtained.
  • hybridomas producing anti-fPD1 mouse monoclonal antibodies were screened by ELISA, and as a result, four types of hybridomas (hybridoma 1A1, hybridoma 1A11, hybridoma 1D3, and hybridoma 1H11) were obtained (in this specification, the anti-fPD1 mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1A1 may be referred to as "1A1", the anti-fPD1 mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1A11 may be referred to as "1A11", the anti-fPD1 mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1D3 may be referred to as "1D3”, and the anti-fPD1 mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1H11 may be referred to as "1H11").
  • hybridomas producing anti-fPD1 antibodies were screened by ELISA, and as a result, four types of hybridomas (hybridoma 1A1, hybridoma 1A11,
  • 2 x 10 5 NIH3T3/fPD1 or NIH3T3 were incubated in the presence of 10 ⁇ g/mL of each of the above four types of mouse monoclonal antibodies, and then incubated in the presence of anti-mouse IgG-PE (manufactured by Southern Biotech), and the fluorescence intensity derived from PE was detected using a flow cytometer (CytoFLEX [manufactured by Beckman Coulter]), and the obtained results were analyzed using FlowJo software (manufactured by Treestar).
  • fPDL1 expression retroviral vector In order to amplify the cDNA of fPDL1 (the nucleotide sequence of NCBI Reference Sequence: XM_006939039.3), PCR was performed using the cDNA of the feline lymphoblast cell line FL-4 as a template, forward primer 3 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19), reverse primer 5 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20), and KOD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the protocol attached to the product.
  • forward primer 3 single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19
  • reverse primer 5 single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20
  • KOD-Plus-Neo manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the amplified PCR product i.e., the cDNA of fPDL1
  • the amplified PCR product was gel-purified, cleaved with EcoRI and XhoI, and then inserted between the two restriction enzyme sites (EcoRI and XhoI) in the pMXs-IP vector to prepare pMX-IP-fPDL1-K.
  • PCR was performed using forward primer 2 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15) and reverse primer 2 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16) and BigDye (registered trademark) Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (manufactured by Perkin-Elmer) in accordance with the protocol attached to the product, and then the amplified PCR product was confirmed to be a nucleotide sequence (feline PD-L1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12) encoding fPDL1 (feline PD-L1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) using an ABI Prism (registered trademark) 377 automated DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • fPDL1-hIg Expression Vector In order to amplify a polynucleotide encoding the extracellular region of fPDL1, pMx-IP-fPDL1 was used as a template, and PCR was performed using forward primer 3 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19) and reverse primer 6 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22) and KOD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the protocol attached to the product to obtain a primary PCR product.
  • forward primer 3 single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19
  • reverse primer 6 single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22
  • KOD-Plus-Neo manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • PCR was performed using the primary PCR product as a template, forward primer 3, reverse primer 4 (single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 [i.e., a nucleotide sequence encoding a 2xFLAG tag]), and KOD-Plus-Neo according to the protocol attached to the product to obtain a secondary PCR product.
  • the obtained secondary PCR product was inserted into a pANT vector to prepare pANT-fPD1-FL.
  • PCR was performed using pANT-fPD1-FL as a template, forward primer 4, reverse primer 7 primer (nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23), and KOD-Plus-Neo according to the protocol attached to the product to obtain a tertiary PCR product (i.e., a polynucleotide encoding the extracellular domain of fPDL1).
  • pFUSE-hIgG2-Fc2 Exvivogen
  • hIg human IgG2 Fc domain [hereinafter sometimes referred to as "hIg”] expression vector
  • 2 x 10 5 NIH3T3/fPD1 or NIH3T3 were incubated in the presence of fPDL1-hIg at various concentrations (0 ⁇ g/mL, 0.16 ⁇ g/mL, 0.63 ⁇ g/mL, 2.5 ⁇ g/mL, or 10 ⁇ g/mL), and then incubated in the presence of anti-human IgG-PE (Southern Biotech).
  • the fluorescence intensity derived from PE was detected using a flow cytometer (CytoFLEX [Beckman Coulter]), and the results obtained were analyzed using FlowJo software (Treestar).
  • hybridomas three types of hybridomas (hybridoma 1A1-1, hybridoma 1A1-2, and hybridoma 1A1-3) were isolated from hybridoma 1A1, and three types of hybridomas (hybridoma 1D3-1, hybridoma 1D3-2, and hybridoma 1D3-3) were isolated from hybridoma 1D3.
  • the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1A1-1 may be referred to as "1A1-1," the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1A1-2 as “1A1-2,” the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1A1-3 as "1A1-3,” the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1D3-1 as "1D3-1,” the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1D3-2 as "1D3-2,” and the mouse monoclonal antibody produced by hybridoma 1D3-3 as "1D3-3”).
  • the hybridoma 1A1-2 is stored at the Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University, a national university corporation, and can be sold under certain conditions.
  • fPD1 gene was knocked out of a feline lymphoma cell line (FT-1) using the CRISPR/Cas9 system described in the literature "Vet Comp Oncol. 2020 Dec;18(4):739-752.” to generate FT-1/ko-fPD1. Then, flow cytometry analysis was performed on FT-1/ko-fPD1 or FT-1 using 10 ⁇ g/mL of "1A1-2" according to the method described in Example 2 above. As a result, it was shown that "1A1-2" specifically binds to fPD1 in FT-1 ( Figure 5C).
  • NIH3T3/fPD1 was 1) incubated in the absence of "1A1-2” and in the presence of hIg, 2) incubated in the presence of "1A1-2" at various concentrations (0 ⁇ g/mL, 0.16 ⁇ g/mL, 0.63 ⁇ g/mL, 2.5 ⁇ g/mL, 10 ⁇ g/mL, or 40 ⁇ g/mL) and fPDL1-hIg, or 3) incubated in the presence of 40 ⁇ g/mL of "1A1-2", and then incubated in the presence of anti-human IgG-PE, and then flow cytometry analysis was performed according to the method described in "3-5" above.
  • the antibody heavy chain CDR1 is located at positions H31-35 in the Kabat numbering
  • the antibody heavy chain CDR2 is located at positions H50-52, H52A, and H53-65 in the Kabat numbering
  • the antibody heavy chain CDR3 is located at positions H95-100, H100A-G, H101, and H102 in the Kabat numbering
  • the antibody light chain CDR1 is located at positions L24-34 in the Kabat numbering
  • the antibody light chain CDR2 is located at positions L50-56 in the Kabat numbering
  • the antibody light chain CDR3 is located at positions L89-97 in the Kabat numbering.
  • hybridoma ch-1A1-2 was prepared that produces a chimeric antibody consisting of the heavy chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1, and the light chain variable region of "1A1-2” and the constant region of feline IgG1 (in this specification, the mouse monoclonal chimeric antibody produced by hybridoma ch-1A1-2 may be referred to as "ch-1A1-2").
  • the amino acid sequences of the heavy and light chains of "ch-1A1-2” are shown in Table 4.
  • the hybridoma ch-1A1-2 is kept at the Joint School of Veterinary Medicine, Yamaguchi University, a national university corporation, and can be sold under certain conditions.
  • NIH3T3/fPD1 was 1) incubated in the absence of "ch-1A1-2” and in the presence of hIg, or 2) incubated in the presence of various concentrations (0 ⁇ g/mL, 0.16 ⁇ g/mL, 0.63 ⁇ g/mL, 2.5 ⁇ g/mL, 10 ⁇ g/mL, or 40 ⁇ g/mL) of "ch-1A1-2” and fPDL1-hIg, and each was incubated in the presence of anti-human IgG-PE, and then flow cytometry analysis was performed according to the method described in "3-5" above.
  • PBMCs were isolated from four healthy cats (cat 1, cat 2, cat 3, and cat 4) according to a standard method, and then the PBMCs were seeded in a 96-well round-bottom plate at 2 x 10 5 cells per well, and 10 ⁇ g/mL ConA was added, and at the same time, a pseudo antibody (feline IgG, Jackson Immunoresearch) or "ch-1A1-2" was added. After 72 hours of culture, the culture supernatant was collected, and fIFN ⁇ in the culture supernatant was measured by Feline IFN-gamma DuoSet ELISA (R&D).
  • the present invention is useful for immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) in cats.
  • immunotherapy e.g., cancer immunotherapy

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Abstract

本発明は、ネコＰＤ－１に特異的に結合し、かつ、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する作用を有する抗体等を提供することを課題とする。　特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３と、特定の軽鎖ＣＤＲ１～３とを含む、ネコのＰＤ－１に特異的に結合する抗体を得る。

Description

抗ネコＰＤ－１抗体
　本発明は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３及び特定の軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ネコのＰＤ－１（Programmed cell death 1）に特異的に結合する抗体（以下、「本件抗ネコＰＤ１抗体」ということがある）；本件抗ネコＰＤ１抗体をコードするポリヌクレオチド（以下、「本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチド」ということがある）；プロモーターの下流に作動可能に連結されている本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター」ということがある）；本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターが導入されている宿主細胞（以下、「本件宿主細胞」ということがある）；本件抗ネコＰＤ１抗体を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤（以下、「本件阻害剤」ということがある）；本件抗ネコＰＤ１抗体をネコに投与する工程を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する方法（以下、「本件阻害方法」ということがある）；本件抗ネコＰＤ１抗体若しくはその標識物、又は本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害用キット（以下、「本件阻害用キット」ということがある）；等に関する。
　ヒトにおいては、近年、免疫抑制性分子である免疫チェックポイント分子を標的とした抗体医薬が注目されており、多くの臨床試験が実施されている。特にＰＤ－１（Programmed cell death 1）及びＰＤ－Ｌ１（programmed cell death 1 ligand-1）を標的としたヒトのがんを対象とした臨床試験では優れた成績をおさめており、次世代のがん治療として着目されている。
　ＰＤ－１はＴ細胞の表面に存在する受容体である。Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を有しており、自己に対する免疫反応を抑制するなどの機能が明らかにされている。かかる免疫反応の抑制は、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することによって行われる。一方、がん細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、発現したＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することによってＴ細胞の活性化を抑制し、免疫反応から逃れる能力を獲得している。したがって、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を阻害することが、がんの治療に有効であると考えられる。
　これまでに、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を有効成分として含み、インビボにおいてがん細胞の増殖を抑制する作用を有するがん治療剤（特許文献１）や、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアレルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗がん剤（特許文献２）が提案されている。また、メラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞がんの治療剤として抗ＰＤ－１抗体の開発が進められている（非特許文献１）。
　一方、ペットの長寿化に伴い、近年、件数が急増しているのがペットのがんである。人間同様、ペットのがん治療も進歩を遂げ、外科療法、放射線治療、化学療法（抗がん剤）の３大がん療法が積極的に行われている。
　ペットの中ではイヌやネコの飼育率が高く、２０２０年にペットフード協会が実施した全国イヌネコ飼育実態調査によると、日本国内においてイヌは約８５０万頭、ネコは約９６０万頭飼われている。イヌやネコの飼育数の増加に伴い、イヌやネコにおいてがんの発生件数も増加しているが、上記３大がん療法では治療に限界があり、新たな治療法が求められていた。その方法として、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１等の免疫チェックポイント分子を標的とした治療が期待されるが、抗ヒトＰＤ－１抗体や抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体は、イヌやネコに対しては作用しないという問題があった。
　最近、本発明者らは、イヌにおいて、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する抗イヌＰＤ－１抗体や抗イヌＰＤ－Ｌ１抗体を見いだしている（特許文献３）。一方、ネコにおいては、ネコを対象とした研究を実施する研究者が少ないこともあって、ＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１についての研究が進んでいないこともあり、抗ネコＰＤ－１抗体や抗ネコＰＤ－Ｌ１抗体の報告例はこれまで１例もなかった。
特開２０１４－６５７４８号公報 特開２０１０－８３８６３号公報 国際公開第２０１６／００６２４１号パンフレット
Suzanne L. et al., The New England Journal of Medicine Vol.366, No. 26:2443-2454, 2012
　本発明の課題は、ネコＰＤ－１に特異的に結合し、かつ、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する作用を有する抗体等を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、まず、以前本発明者らが作製した抗イヌＰＤ－１抗体（すなわち、特許文献３における「３Ｂ７－Ｄ９」及び「４Ｆ１２－Ｅ６」）では、ネコＰＤ－１の組換えタンパク質を検出できないことを確認した。そこで、ネコＰＤ－１に対するマウスモノクローナル抗体を作製するために、まず、ネコＰＤ－１を発現するマウス細胞株（ネコＰＤ－１発現細胞株）を作製し、マウスへ免疫感作した後、Ｂ細胞（リンパ節単球細胞）とミエローマ（Ｐ３Ｕ１細胞）とが融合した細胞（ハイブリドーマ）を作製し、ネコＰＤ－１発現細胞株陽性のハイブリドーマをスクリーニングした結果、２８８のクローンを得た。この２８８のクローンについて、ネコＰＤ－１発現細胞株におけるネコＰＤ－１に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした結果、４クローンを得た。また、この４クローンについて、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１－ｈＩｇとの結合を阻害する作用を有するものをスクリーニングした結果、２クローンを得た。さらに、この２クローンについて、シングルセルクローニングした結果、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有する抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして１クローンを得た。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるネコＰＤ－１に特異的に結合する抗体であって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含む、前記抗体。
〔２〕配列番号７に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む、上記〔１〕に記載の抗体。
〔３〕配列番号９に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗体。
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔５〕プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている上記〔４〕に記載のポリヌクレオチドとを含むベクター。
〔６〕上記〔５〕に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
〔７〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗体を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤。
〔８〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗体をネコに投与する工程を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する方法。
〔９〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗体、若しくはその標識物、又は請求項５に記載のベクターを含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害用キット。
　本発明の実施の他の態様として、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）における使用のための本件抗ネコＰＤ１抗体や、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）用製剤を製造するための、本件抗ネコＰＤ１抗体の使用を挙げることができる。
　本発明によると、ネコＰＤ－１に特異的に結合し、かつ、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する作用を有する抗体は、ネコにおいてｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化することができるため、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）に有用である。
ネコ（Felis silvestris catus）ＰＤ－１（以下、「ｆＰＤ１」ということがある）を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１」ということがある）（図中の「ｆＰＤ１」）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞株（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３」ということがある）（図中の「ｍｏｃｋ」）を、それぞれ４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１［図１Ａ］、１Ａ１１［図１Ｂ］、１Ｄ３［図１Ｃ］、及び１Ｈ１１［図１Ｄ］）の存在下でインキュベートし、抗マウスＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗マウスＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。横軸矢印の方向が、蛍光輝度がより高いことを示す（以下同じ）。 図２Ａは、ネコＰＤ－Ｌ１（以下、「ｆＰＤＬ１」ということがある）の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域との融合タンパク質（以下、「ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ」ということがある）、及びヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域（以下、「ｈＩｇ」ということがある）を、抗ヒトＩｇＧを用いたウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。図２Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１（図中の「ｆＰＤ１」）又はＮＩＨ３Ｔ３（図中の「ｍｏｃｋ」）を、それぞれｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。 ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１［図３Ａ］、１Ａ１１［図３Ｂ］、１Ｄ３［図３Ｃ］、及び１Ｈ１１［図３Ｄ］）の存在下でインキュベートし（図中の矢頭）、２）ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の矢印）、又は、３）上記４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体及びｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の白抜き矢印）、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。 ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）６種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１－１［図４Ａ］、１Ａ１－２［図４Ｂ］、１Ａ１－３［図４Ｃ］、１Ｄ３－１［図４Ｄ］、１Ｄ３－２［図４Ｅ］、及び１Ｄ３－３［図４Ｆ］）の存在下でインキュベートし（図中の矢頭）、２）ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の矢印）、又は、３）上記６種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体及びｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の白抜き矢印）、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。 図５Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、抗ＦＬＡＧ抗体（左図）及び「１Ａ１－２」（右図）を用いたウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。図５Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１（図中の「ｆＰＤ１」）又はＮＩＨ３Ｔ３（図中の「ｍｏｃｋ」）を、それぞれ「１Ａ１－２」の存在下でインキュベートし、抗マウスＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。図５Ｃは、ｆＰＤ１遺伝子をノックアウトしたネコリンパ腫細胞株（ＦＴ-１）（以下、「ＦＴ-１／ｋо－ｆＰＤ１」ということがある）又はＦＴ-１を、それぞれ「１Ａ１－２」の存在下でインキュベートし、抗マウスＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。図５Ｂ及び５Ｃにおいて、横軸の「ＰＥ」は、抗マウスＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。 ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）「１Ａ１－２」の非存在下でかつｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の（１））、２）「１Ａ１－２」の存在下又は非存在下でかつ、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の（２））、あるいは、３）「１Ａ１－２」の存在下でインキュベートし（図中の（３））、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。 ３匹の健常ネコ（ネコ１、ネコ２、及びネコ３）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）と、ｉｓｏｔｙｐｅコントロール（偽抗体）又は「１Ａ１－２」の存在下で培養し、培養液中のネコＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ、以下、「ｆＩＦＮγ」ということがある）の濃度を測定した結果を示す図である。偽抗体と「１Ａ１－２」との間で、Paired t testにより統計学的な有意差（ｐ＝０．０３０９１５９６）が認められた。 図８Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１（図中の「ｆＰＤ１」）又はＮＩＨ３Ｔ３（図中の「ｍｏｃｋ」）を、それぞれ「ｃｈ－１Ａ１－２」（すなわち、「１Ａ１－２」の重鎖可変領域及びネコＩｇＧ１の定常領域と、「１Ａ１－２」の軽鎖可変領域及びネコＩｇＧ１の定常領域とからなるキメラ抗体）の存在下でインキュベートし、抗ネコＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ネコＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。図８Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）「ｃｈ－１Ａ１－２」の非存在下でかつｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の（１））、あるいは、２）「ｃｈ－１Ａ１－２」の存在下又は非存在下でかつ、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図中の（２））、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図である。横軸の「ＰＥ」は、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥにおけるＰＥ由来の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。図８Ｃは、４匹の健常ネコ（ネコ１、ネコ２、ネコ３、及びネコ４）由来のＰＢＭＣを、ＣｏｎＡと、ｉｓｏｔｙｐｅコントロール（偽抗体）又は「ｃｈ－１Ａ１－２」の存在下で培養し、培養液中のｆＩＦＮγの濃度を測定した結果を示す図である。
＜１．本件抗ネコＰＤ１抗体＞
　本発明の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列からなるネコＰＤ－１に特異的に結合する抗体（すなわち、抗原－抗体間の特異性の高い認識機構によって、配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し結合する抗体）であって、配列番号１のアミノ酸配列からなる重（Ｈ）鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３と、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＬ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＬ鎖ＣＤＲ３とを含む、前記抗体（すなわち、本件抗ネコＰＤ１抗体）であり、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する作用を有する。かかる作用により、ネコＰＤ１とネコＰＤＬ１との結合によるネコＴ細胞の活性化抑制を解除し、ネコＴ細胞を活性化することができる。上記Ｈ鎖ＣＤＲ１～３は、通常、Ｈ鎖可変領域中に含まれ、上記Ｌ鎖ＣＤＲ１～３は、通常、Ｌ鎖可変領域中に含まれる。
　本明細書において、「ネコ」とは、ネコ目（食肉目）－ネコ亜目－ネコ科－ネコ亜科－ネコ属に分類される小型哺乳類であるイエネコ（Felis silvestris catus）、ヤマネコ（野生ネコ）、及び野ネコ（イエネコが再野生化したもの）のいずれかを意味し、ネコ以外のネコ科動物（例えば、ライオン、トラ、ヒョウ等）は、「ネコ」には含まれない。
　本件抗ネコＰＤ１抗体の由来、種類、クラス、形態等は特に制限されず、例えば本件抗ネコＰＤ１抗体には、マウス、ラット、ネコ等由来の抗体；ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）、モノクローナル抗体；抗体の一部領域（例えば、定常領域）を異なる生物種（例えば、ネコ）由来の領域に置換したキメラ抗体、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）２抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントを還元して得られるＦａｂ′抗体フラグメント、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ等の抗体フラグメント、抗体重（Ｈ）鎖可変領域と抗体軽（Ｈ）鎖可変領域とを、アミノ酸架橋によって連結させたｓｃＦｖ等の組換え抗体；などが含まれる。本件抗ネコＰＤ１抗体としては、モノクローナル抗体が好ましく、ネコ由来の定常領域を含むモノクローナル抗体がより好ましい。
　本件抗ネコＰＤ１抗体は、分離されているものが好ましい。ここで「分離されている」とは、人為的操作によって、抗体を、本来存在する環境から取り出したり、抗体が本来存在する環境とは別の環境下で発現させる等して、抗体が本来存在している状態とは異なった状態で存在していることを意味する。すなわち、「分離されている抗体」には、ある個体由来の抗体であって、かつ外的操作（人為的操作）が施されずに、当該個体の体内中又は体内由来の組織若しくは体液（血液、血漿、血清等）中に含まれる状態の抗体は含まれない。また、本件抗ネコＰＤ１抗体は、人為的操作によって作製した抗体（例えば、上記組換え抗体）が好ましい。かかる「人為的操作によって作製した細胞由来の抗体や当該細胞から産生される抗体」には、人為的操作の施されていない抗体、例えば、天然に存在するＢ細胞から産生される抗体は含まれない。
　本件抗ネコＰＤ１抗体は、通常、Ｈ鎖ＣＤＲ１～３及びＬ鎖ＣＤＲ１～３のそれぞれのアミノ（Ｎ）末端及びカルボキシル（Ｃ）末端には、フレームワーク領域（ＦＲ）が連結されている。かかるＦＲのうちＨ鎖ＦＲとしては、Ｈ鎖ＣＤＲ１のＮ末端に連結されているＨ鎖ＦＲ１や、Ｈ鎖ＣＤＲ１のＣ末端（Ｈ鎖ＣＤＲ２のＮ末端）に連結されているＨ鎖ＦＲ２や、Ｈ鎖ＣＤＲ２のＣ末端（Ｈ鎖ＣＤＲ３のＮ末端）に連結されているＨ鎖ＦＲ３や、Ｈ鎖ＣＤＲ３のＣ末端に連結されているＨ鎖ＦＲ４を挙げることができる。また、上記ＦＲのうちＬ鎖ＦＲとしては、Ｌ鎖ＣＤＲ１のＮ末端に連結されているＬ鎖ＦＲ１や、Ｌ鎖ＣＤＲ１のＣ末端（Ｌ鎖ＣＤＲ２のＮ末端）に連結されているＬ鎖ＦＲ２や、Ｌ鎖ＣＤＲ２のＣ末端（Ｌ鎖ＣＤＲ３のＮ末端）に連結されているＬ鎖ＦＲ３や、Ｌ鎖ＣＤＲ３のＣ末端に連結されているＬ鎖ＦＲ４を挙げることができる。
　上記Ｈ鎖ＦＲ１としては、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の１～３０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｈ鎖ＦＲ２としては、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の３６～４９番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｈ鎖ＦＲ３としては、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の６７～９８番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｈ鎖ＦＲ４としては、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の１１４～１２４番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｌ鎖ＦＲ１としては、例えば、配列番号８のアミノ酸配列の１～２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｌ鎖ＦＲ２としては、例えば、配列番号８のアミノ酸配列の３５～４９番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｌ鎖ＦＲ３としては、例えば、配列番号８のアミノ酸配列の５７～８８番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　また、上記Ｌ鎖ＦＲ４としては、例えば、配列番号８のアミノ酸配列の９８～１０９番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ１は、通常、kabatによる番号付け（文献「kabat, E.A. et al., (1991) NIH Publication No. 91-3242, sequences of proteins of immunological interest」参照）でＨ３１～３５の位置に存在する。また、本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ２は、通常、kabatによる番号付けでＨ５０～５２、Ｈ５２Ａ、及びＨ５３～６５の位置に存在する。また、本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ３は、通常、kabatによる番号付けでＨ９５～１００、Ｈ１００Ａ～Ｇ、Ｈ１０１、及びＨ１０２の位置に存在する。また、本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ１は、通常、kabatによる番号付けでＬ２４～３４の位置に存在する。また、本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ２は、通常、kabatによる番号付けでＬ５０～５６の位置に存在する。また、本件抗ネコＰＤ１抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ３は、通常、kabatによる番号付けでＬ８９～９７の位置に存在する。
　本件抗ネコＰＤ１抗体としては、配列番号７のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを含むものが好ましく、配列番号９のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖とを含むものがより好ましい。
　本件抗ネコＰＤ１抗体は、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入することにより作製した細胞（すなわち、本件宿主細胞）を、宿主細胞に応じた培養液中で培養し、培養液中に産生された本件抗ネコＰＤ１抗体を回収することにより得ることができる。
　また、トランスジェニック動物作製技術を用いて、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターの一部又は全部が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ等のトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから本件抗ネコＰＤ１抗体を大量に産生することもできる。
　さらに、配列番号１１のアミノ酸配列からなるネコＰＤ－１を発現する非ヒト動物（例えば、マウス、ラット）細胞株（ネコＰＤ－１発現非ヒト動物細胞株）を、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット）に免疫し、細胞融合技術を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを調製し、抗ネコＰＤ－１抗体を産生するハイブリドーマを、１）ネコＰＤ－１を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法でスクリーニングすること、及び／又は、２）ネコＰＤ－１発現非ヒト動物細胞株が陽性のハイブリドーマを、フローサイトメトリーでスクリーニングすることにより、本件抗ネコＰＤ１抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。また、ハイブリドーマのゲノムＤＮＡに含まれる本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドにおける定常領域をコードするポリヌクレオチドを、文献「Sci Adv. 2019 Aug 28;5(8):eaaw1822.」や文献「Vet Comp Oncol . 2020 Dec;18(4):739-752.」に記載の方法に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、異なる生物種（例えば、ネコ）由来の定常領域をコードするポリヌクレオチドに置換し、可変領域と定常領域が異なる生物種由来のキメラ抗体を産生するハイブリドーマを作製することもできる。ハイブリドーマの培養上清から、公知の抗体精製技術を用いて、本件抗ネコＰＤ１抗体を精製することができる。
＜２．本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチド＞
　本発明のポリヌクレオチドとしては、本件抗ネコＰＤ１抗体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチド）であればよく、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然の構造を有するＤＮＡやＲＮＡであってもよく、天然の構造を有するＤＮＡやＲＮＡが化学的に修飾された構造を有するヌクレオチド（「修飾核酸」ともいう）であってもよい。例えば、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドがｍＲＮＡの形態の場合、ＲＮａｓｅによる分解に耐性を付与するため、修飾核酸が用いられる。修飾核酸は、ヌクレオチドにおける塩基部分が修飾されたものが好ましく、例えば、５位が置換したピリミジンヌクレオチド、１位が置換していてもよいシュードウリジンであるとよく、具体的には、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、シュードウリジン、１－アルキルシュードウリジンを例示することができる。また、１－アルキルシュードウリジンとしては、１－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）シュードウリジンであってよく、好ましくは１－メチルシュードウリジン又は１－エチルシュードウリジンである。
　本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドは、本件抗ネコＰＤ１抗体のアミノ酸配列を基に常法により容易に作製することができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表に記載のアミノ酸配列に基づき取得することができ、標準的な分子生物学的及び／又は化学的手順を用いて本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドを作製することができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞での発現のためにコドンが最適化されたヌクレオチド配列を含むものであってもよい。この様に最適化されたヌクレオチド配列は、目的のアミノ酸配列を公知のアルゴリズム、ソフトウェアを適用することにより、入手することができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドは、本件抗ネコＰＤ１抗体をコードする１本鎖（センス鎖）のポリヌクレオチドであっても、かかるセンス鎖と、その相補配列のアンチセンス鎖からなる２本鎖のポリヌクレオチドであってもよく、その形態はポリヌクレオチドの細胞への導入方法に適切な形態が選択される。例えば、ｍＲＮＡやレンチウイルスベクターの場合、一本鎖の形態であり、プラスミドＤＮＡの場合、２本鎖の形態をとりうる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドとしては、配列番号７のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドと、配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドとを含むものが好ましく、配列番号９のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖をコードするポリヌクレオチドと、配列番号１０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含むものがより好ましい。
　本明細書において、「８０％以上の同一性」とは、同一性が８０％以上（少なくとも８０％）であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を意味する。
　本明細書において、用語「同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ　ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９－３４０２；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７）、並びにＢＬＡＳＴＮ　２．０（Ｇｉｓｈ　Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６－２００２）、並びにＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１９８８，８５：２４４４－２４４８）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ　ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Ｗｉｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎ，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４：５５７－５６７；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３－４５３）が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列（配列番号Ｘのアミノ酸配列）と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、換言すると、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列（配列番号Ｘのアミノ酸配列）において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列（配列番号Ｘのアミノ酸配列）と同等の機能を有するアミノ酸配列」である。ここで、「１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～３０個の範囲内、好ましくは１～２０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内、さらに好ましくは１～１０個の範囲内、さらに好ましくは１～５個の範囲内、さらに好ましくは１～３個の範囲内、さらに好ましくは１～２個の範囲内の数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。これらアミノ酸残基の変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。
＜３．本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター＞
　本発明のベクターとしては、プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドとを含み、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドがコードするｍＲＮＡを転写できるベクター（すなわち、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター）であれば特に制限されない。
　本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターは、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非ウイルスベクター（例えば、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター）やウイルスベクターを挙げることができる。また、ベクターは、環状のものであっても線状のものであってもよい。
　本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターにおけるプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する本件ポリヌクレオチドがコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域であれば特に制限されず、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ウイルスのＬＴＲ（Long Terminal Repeat）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等を挙げることができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するポリペプチドをコードする遺伝子等を含有していてもよい。かかるマーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に遺伝子導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。上記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等を挙げることができる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。上記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。上記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等を挙げることができる。上記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。上記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等を挙げることができる。
＜４．本件宿主細胞＞
　本発明の宿主細胞としては、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターが導入され、本件抗ネコＰＤ１抗体が発現する細胞（すなわち、本件宿主細胞）であれば特に制限されない。本件宿主細胞は、通常、容器（例えば、培養プレート又はディッシュ、細胞保存用又は細胞分取用チューブ）内の液体中又は液体で湿った（濡れた）状態で生存・維持する。かかる液体としては、本件宿主細胞が生存・維持できるものであれば特に制限されず、例えば、培養液（例えば、血清含有若しくは不含の培養液）、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液等の液体を挙げることができる。上記血清としては、例えば、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を挙げることができる。また、上記培養液としては、例えば、動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等）を挙げることができる。また、上記血清不含の培養液（無血清培養液）としては、例えば、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液を挙げることができる。
　本件宿主細胞は、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを、宿主細胞へ遺伝子導入することにより作製することができる。本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入する方法としては、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター及び宿主細胞に適した方法であればよく、例えば、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターとして非ウイルスベクターを用いる場合、例えば、国際公開第９６／１００３８号パンフレット、国際公開第９７／１８１８５号パンフレット、国際公開第９７／２５３２９号パンフレット、国際公開第９７／３０１７０号パンフレット、及び国際公開第９７／３１９３４号パンフレット（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているとおり、リポソーム又は陽イオン脂質等を含む微粒子などを使用する方法；文献「Jin et al, EMBO Mol Med. 2016 Jul; 8(7): 702-711.」等に記載されているscaffold/matrix attachment region element発現のエピソーマルベクターを導入する方法；文献「Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 22;8:131-140.」に記載されたPiggyBac法などのトランスポゾン系の導入方法に採用されるウイルス粒子を放射線照射して中身を壊した外殻などを用いる方法；本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター（具体的には、線状の本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクター）を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＺｎフィンガーヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術により、目的細胞のゲノムへ導入する方法（例えば、米国特許第8,956,828号公報）；などを挙げることができる。
　また、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターとしてウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を用いる場合、本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入する方法としては、組換えウイルス（すなわち、ウイルスゲノムから病原性に関する遺伝子を除去し、外来遺伝子［本願の場合、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチド］を組み込んだウイルスベクタープラスミド［ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい］を包含するウイルス粒子）を含む培養上清や、濃縮した組換えウイルスを用いて免疫細胞へウイルス感染させる方法を挙げることができる。
　宿主細胞としては、本件抗ネコＰＤ１抗体コーディングポリヌクレオチドが転写されて本件抗ネコＰＤ１抗体が発現する細胞であればよく、例えば、酵母、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ等）細胞、昆虫（例えば、spodoptera frugiperda、Trichoplusiani等）細胞、植物（例えば、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等）細胞などを挙げることができる。
＜５．本件結合阻害剤＞
　本発明のネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤は、「ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害するため」という用途に特定された、本件抗ネコＰＤ１抗体を含有する剤（すなわち、本件阻害剤）である。阻害する「ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合」は、ネコ培養細胞内であってもよいし、ネコ生体内であってもよい。
　本件阻害剤は、有効成分である本件抗ネコＰＤ１抗体を、単独でネコ用飲食品又はネコ用医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（ネコ用飲食品組成物又はネコ用医薬組成物）として使用してもよい。
　本件阻害剤の添加剤としては、生理的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
　本件阻害剤としては、有効成分である本件抗ネコＰＤ１抗体以外に、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する成分を含むものであってもよいが、本件抗ネコＰＤ１抗体単独でも優れた阻害効果を発揮するため、本件抗ネコＰＤ１抗体以外に、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する成分（例えば、化合物、タンパク質［例えば、抗体］、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含まないものが好ましい。
　本件阻害剤は、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害し、ネコにおけるＴ細胞の活性化抑制を解除し、ネコにおけるＴ細胞を活性化する作用を有するため、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）用製剤に有利に適用することができる。
＜６．本件阻害方法＞
　本発明のネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する方法としては、本件抗ネコＰＤ１抗体をネコに投与する工程を含み、ネコ生体内のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する方法（すなわち、本件阻害方法）であれば特に制限されない。
　本件抗ネコＰＤ１抗体の投与対象のネコとしては、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する必要があるネコであればよく、具体的には、ＰＤ１とＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化する必要があるネコを挙げることができ、より具体的には、免疫療法（例えば、がん免疫療法）を必要とするネコ（例えば、がんに罹患したネコ、がんに罹患するおそれがあるネコ等）を挙げることができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体の投与形態としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤等の剤型で投与する経口投与や、皮膚外用剤、経皮剤、経粘膜剤、経鼻剤、経腸剤、注射剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等の剤型で投与する非経口投与を挙げることができる。
　本件抗ネコＰＤ１抗体の投与量は、ネコの年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定され、例えば、１μｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。また、本件抗ネコＰＤ１抗体は、一日あたり単回又は複数回（例えば、２～４回）に分けて投与されるが、ネコの症状の改善の状況に応じて投与量を調節してよい。
　本件阻害方法は、本件抗ネコＰＤ１抗体をネコに投与することによって、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害し、ネコにおけるＴ細胞の活性化抑制を解除し、ネコにおけるＴ細胞を活性化することができるため、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）に有利に適用することができる。
＜７．本件阻害用キット＞
　本発明のネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害用キットは、「ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害するため」という用途に特定された、本件抗ネコＰＤ１抗体若しくはその標識物、又は本件抗ネコＰＤ１抗体発現ベクターを含むキット（すなわち、本件阻害用キット）であり、かかるキットには、一般にこの種のキットに含まれるもの、例えば、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、取扱説明書、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害するための説明書等が通常含まれる。阻害する「ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合」は、ネコ培養細胞内であってもよいし、ネコ生体内であってもよい。
　上記本件抗ネコＰＤ１抗体の標識物における標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase［ＨＲＰ］）、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ－ス－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ＰＣＲで使用したプライマーを表１に示す。また、以下の実施例で用いたマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び５５μＭの２－メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培養液（以下、単に「ＤＭＥＭ培養液」という）中で、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で培養・維持した。
１．抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
１－１　ＰＣＲ
　ｆＰＤ１のｃＤＮＡ（NCBI Reference Sequence:NM_001145510.1のヌクレオチド配列）を増幅するために、ネコリンパ腫由来細胞株ＫＯ－１のｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワードプライマー１（配列番号１３のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）及びリバースプライマー１（配列番号１４のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）とを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行った。ＰＣＲは、プレ変性を９４℃で２分間行い、その後９８℃で１０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング反応、６８℃で６０秒の伸長反応を３５サイクルの条件下で行い、さらに最終伸長反応を、６８℃で１０分間行った。なお、以下のＰＣＲについても、上記条件で行った。
１－２　シークエンシング
　ＰＣＲ産物（すなわち、ｆＰＤ１のｃＤＮＡ）をゲル精製し、BamHI及びEcoRIで切断後、ｐＭＸｓ－ＩＰベクターにおける２つの制限酵素サイト（BamHI及びEcoRI）の間に挿入し、ｐＭＸ－ＩＰ－ｆＰＤ１を作製した。かかるコンストラクトベクターを基に、フォワードプライマー２（配列番号１５のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）及びリバースプライマー２（配列番号１６のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）と、BigDye（登録商標）Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer社製)を用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行った後、ABI Prism（登録商標）３７７自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems社製)によって、増幅したＰＣＲ産物が、ｆＰＤ１（配列番号１１のアミノ酸配列からなるネコＰＤ－１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２のヌクレオチド配列からなるネコＰＤ－１遺伝子）であることを確認した。
１－３　ｆＰＤ１発現レトロウイルスベクターの作製
　ｆＰＤ１のＣ末端に２つのＦＬＡＧタグ（２×ＦＬＡＧ）が融合したタンパク質（ＦＬＡＧ融合ｆＰＤ１）が発現するレトロウイルスベクターを構築するために、まず、ｐＭＸ－ＩＰ－ｆＰＤ１をテンプレートとし、フォワードプライマー１と、リバースプライマー３（配列番号１７のヌクレオチド配列［すなわち、ｆＰＤ１のＣ末端にＦＬＡＧタグを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列］からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏとを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行い、１次ＰＣＲ産物を得た。次に、一次ＰＣＲ産物をテンプレートとし、フォワードプライマー１と、リバースプライマー４（配列番号１８のヌクレオチド配列［すなわち、２×ＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列］からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏとを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行い、２次ＰＣＲ産物を得た。得られた２次ＰＣＲ産物を、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）ベクターの制限酵素サイトSmaIに導入後、さらにEcoRI及びNotIで切断後、ｐＭＸｓ－ＩＰベクターにおける２つの制限酵素サイト（EcoRI及びNotI）の間に挿入し、ｐＭＸ－ＩＰ－ｆＰＤ１－ＦＬ（すなわち、ｆＰＤ１発現レトロウイルスベクター）を作製した。
１－４　ｆＰＤ１発現マウス細胞株の作製
　３．５×１０5個のＮＩＨ３Ｔ３細胞株を６ウェルディッシュに播種し、１日後、ｐＭＸ－ＩＰ－ｆＰＤ１－ＦＬを、ＰＥＩ　Ｍａｘ(Polysciences社製)を用いて、製品添付のプロトコールに従って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株へトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。その後、１０μｇ／ｍｌのプロマイシン（Sigma-Aldrich社製）の存在下で培養し、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１（すなわち、ｆＰＤ１を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株）を作製した。
　上記ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１において、ｆＰＤ１が安定発現していることは、一次抗体として、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（1:1000希釈、Sigma-Aldrich社製）、二次抗体としてＩｇＧ－Ａｌｅｘａ（登録商標）６４７－標識抗マウス(Jackson Immunoresearch社製)を用いた免疫蛍光法によって確認した。
１－５　ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１のマウスへの免疫と、その後のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１陽性ハイブリドーマのスクリーニング
　ｆＰＤ１に対するマウスモノクローナル抗体を作製するために、１×１０7個のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を含むＤＭＥＭ培養液５００μＬを、等量のTiter Max（登録商標）Gold（CytRx社製）で乳化し、５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（SLC社製）の後足蹠に皮内投与した。１週おきに全４回投与し、最後の投与から１０日後に、膝窩のリンパ節細胞を単離し、Ｐ３Ｕ１細胞と融合させた。すなわち、リンパ節単球細胞（１×１０8個）とＰ３Ｕ１細胞（２×１０7個）と混合し、無血清のＲＰＭＩ１６４０培養液で２回洗浄した。その後、ClonaCell-HY　Hybridoma　Kit（Veritas社製）の説明書に従って細胞融合後、細胞を４つの９６ウェル組織培養プレートに播種（１００μＬ／ウェル）した。コロニーが得られた後、ｆＰＤ１を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞陽性ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ法やフローサイトメトリーでスクリーニングした結果、２８８種類のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１陽性ハイブリドーマが得られた。
１－６　抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング
　上記２８８種類のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１陽性ハイブリドーマの中から、抗ｆＰＤ１抗体を産生するハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした結果、４種類のハイブリドーマ（ハイブリドーマ１Ａ１、ハイブリドーマ１Ａ１１、ハイブリドーマ１Ｄ３、及びハイブリドーマ１Ｈ１１）が得られた（本明細書において、ハイブリドーマ１Ａ１によって産生された抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を「１Ａ１」、ハイブリドーマ１Ａ１１によって産生された抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を「１Ａ１１」、ハイブリドーマ１Ｄ３によって産生された抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を「１Ｄ３」、ハイブリドーマ１Ｈ１１によって産生された抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を「１Ｈ１１」ということがある）。
２．抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体が、ｆＰＤ１に結合することの確認
　上記４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１、１Ａ１１、１Ｄ３、及び１Ｈ１１）が、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１におけるｆＰＤ１に結合することを確認するために、文献「Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71(12):1561-1568, 2009」に記載の方法に従ってフローサイトメトリー解析を行った。具体的には、２×１０5個のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１又はＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ１０μｇ／ｍＬの上記４種類のマウスモノクローナル抗体の存在下でインキュベートし、抗マウスＩｇＧ－ＰＥ（Southern biotech社製)の存在下でインキュベートした後、フローサイトメーター（CytoFLEX［Beckman Coulter社製］)を用いてＰＥ由来の蛍光輝度を検出し、得られた結果を、FlowJo software (Treestar社製)によって解析した。
　その結果、いずれの抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を用いた場合でも、蛍光標識二次抗体（抗マウスＩｇＧ－ＰＥ）由来の蛍光強度が増加していた（図１）。
　この結果は、上記４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１、１Ａ１１、１Ｄ３、及び１Ｈ１１）が、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１におけるｆＰＤ１に結合することを示している。
３．抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１）が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害することの確認
３－１　ｆＰＤＬ１発現レトロウイルスベクターの構築
　ｆＰＤＬ１のｃＤＮＡ（NCBI Reference Sequence：XM_006939039.3のヌクレオチド配列）を増幅するために、ネコリンパ芽球細胞株ＦＬ－４のｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワードプライマー３（配列番号１９のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）及びリバースプライマー５（配列番号２０のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）とを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行った。増幅したＰＣＲ産物（すなわち、ｆＰＤＬ１のｃＤＮＡ）をゲル精製し、EcoRI及びXhoIで切断後、ｐＭＸｓ－ＩＰベクターにおける２つの制限酵素サイト（EcoRI及びXhoI）の間に挿入し、ｐＭＸ－ＩＰ－ｆＰＤＬ１－Ｋを作製した。かかるコンストラクトベクターを基に、フォワードプライマー２（配列番号１５のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）及びリバースプライマー２（配列番号１６のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）と、BigDye（登録商標）Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer社製)を用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行った後、ABI Prism（登録商標）３７７自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems社製)によって、増幅したＰＣＲ産物が、ｆＰＤＬ１（配列番号１１のアミノ酸配列からなるネコＰＤ－Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２のヌクレオチド配列からなるネコＰＤ－Ｌ１遺伝子）であることを確認した。
３－２　ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ発現ベクターの作製
　ｆＰＤＬ１の細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを増幅するために、ｐＭｘ－ＩＰ－ｆＰＤＬ１をテンプレートとし、フォワードプライマー３（配列番号１９のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）及びリバースプライマー６（配列番号２２のヌクレオチド配列からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社製）とを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行い、１次ＰＣＲ産物を得た。次に、一次ＰＣＲ産物をテンプレートとし、フォワードプライマー３と、リバースプライマー４（配列番号１８のヌクレオチド配列［すなわち、２×ＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列］からなる１本鎖ＤＮＡ）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏとを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行い、２次ＰＣＲ産物を得た。得られた２次ＰＣＲ産物を、ｐＡＮＴベクターに挿入し、ｐＡＮＴ－ｆＰＤ１－ＦＬを作製した。次に、ｐＡＮＴ－ｆＰＤ１－ＦＬをテンプレートとし、フォワードプライマー４と、リバースプライマー７プライマー（配列番号２３のヌクレオチド配列）と、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏとを用いたＰＣＲを、製品添付のプロトコールに従って行い、３次ＰＣＲ産物（すなわち、ｆＰＤＬ１の細胞外領域をコードするポリヌクレオチド）を得た。得られた３次ＰＣＲ産物を、BglIIで切断し、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ２－Ｆｃ２（Invivogen社製)（すなわち、ヒトＩｇＧ２　Ｆｃ領域［以下、「ｈＩｇ」ということがある］発現ベクター）における２つの制限酵素サイト（EcoRV及びBgIII）の間に挿入し、ｐＦＵＳＥ－ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ（すなわち、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ発現ベクター）を作製した。
３－３　ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの作製と精製
　ｐＦＵＳＥ－ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ又はｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ２－Ｆｃ２と、Expi293 Expression System Kit（Thermo Fisher Scientific社製）とを用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株の培養液中にｆＰＤＬ１－ｈＩｇ又はｈＩｇを発現させ、培養上清を回収した後、rProtein A agarose（GE healthcare社製）を用いた精製と、透析による脱塩処理により、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ及びｈＩｇを精製した。ｆＰＤＬ１－ｈＩｇ及びｈＩｇが精製されたことは、抗ヒトＩｇＧを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを定法に従って行い、確認した（図２Ａ）。
３－４　ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１－ｈＩｇとの結合試験
　後述する「抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体によるｆＰＤ１とｆＰＤＬ１－ｈＩｇとの阻害試験」の予備試験として、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇとＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１におけるｆＰＤ１とが結合することを確認するために、文献「Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71(12):1561-1568, 2009」に記載の方法に従ってフローサイトメトリー解析を行った。具体的には、２×１０5個のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１又はＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ各種濃度（０μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ）のｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Southern biotech社製)の存在下でインキュベートした後、フローサイトメーター（CytoFLEX［Beckman Coulter社製］)を用いてＰＥ由来の蛍光輝度を検出し、得られた結果を、FlowJo software (Treestar社製)によって解析した。
　その結果、ＮＩＨ３Ｔ３を、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートしても抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ由来の蛍光強度に変化は認められなかったのに対して、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートすると、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの濃度依存的に抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ由来の蛍光強度が増加することが示された（図２Ｂ）。
　この結果は、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇが、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１におけるｆＰＤ１に特異的に結合することを示している。
３－５　抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体によるｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合阻害試験
　抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害するかどうかを解析するために、文献「Mizuno et al., J Vet Med Sci, 71(12):1561-1568, 2009」に記載の方法に従ってフローサイトメトリー解析を行った。具体的には、２×１０5個のＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）１０μｇ／ｍＬの４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１、１Ａ１１、１Ｄ３、及び１Ｈ１１）の存在下でインキュベートし（図３における矢頭）、２）１０μｇ／ｍＬのｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし（図３における矢印）、又は、３）上記４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養上清と、１０μｇ／ｍＬのｆＰＤＬ１－ｈＩｇとの存在下でインキュベートし（図３における白抜き矢印）、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Southern biotech社製)の存在下でインキュベートした後、フローサイトメーター（CytoFLEX［Beckman Coulter社製］)を用いてＰＥ由来の蛍光輝度を検出し、得られた結果を、FlowJo software (Treestar社製)によって解析した。
　その結果、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１をｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートすることにより増加した、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ由来の蛍光強度（図３における矢印）は、２種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１及び１Ｄ３）とともにインキュベートすることにより減少したのに対して（図３Ａ及びＣにおける白抜き矢印）、２種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１１及び１Ｈ１１）については、かかる減少は認められなかった（図３Ｂ及びＤにおける白抜き矢印）。
　この結果は、４種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１、１Ａ１１、１Ｄ３、及び１Ｈ１１）のうち、１Ａ１及び１Ｄ３が、ｆＰＤ１と、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇにおけるｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有することを示している。
４．抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１－２）が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害することの確認
　実施例３の結果を踏まえ、２種類のハイブリドーマ（ハイブリドーマ１Ａ１及びハイブリドーマ１Ｄ３）について、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有する抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体を産生するより純度の高いハイブリドーマを単離するために、定法に従ってシングルセルクローニングした結果、ハイブリドーマ１Ａ１から３種類のハイブリドーマ（ハイブリドーマ１Ａ１－１、ハイブリドーマ１Ａ１－２、及びハイブリドーマ１Ａ１－３）を単離し、ハイブリドーマ１Ｄ３から３種類のハイブリドーマ（ハイブリドーマ１Ｄ３－１、ハイブリドーマ１Ｄ３－２、及びハイブリドーマ１Ｄ３－３）を単離した（本明細書において、ハイブリドーマ１Ａ１－１によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ａ１－１」、ハイブリドーマ１Ａ１－２によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ａ１－２」、ハイブリドーマ１Ａ１－３によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ａ１－３」、ハイブリドーマ１Ｄ３－１によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ｄ３－１」、ハイブリドーマ１Ｄ３－２によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ｄ３－２」、ハイブリドーマ１Ｄ３－３によって産生されたマウスモノクローナル抗体を「１Ｄ３－３」ということがある）。
　これら６種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１－１、１Ａ１－２、１Ａ１－３、１Ｄ３－１、１Ｄ３－２、及び１Ｄ３－３）が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有するかどうかを調べるために、上記「３－５」に記載の方法に従ってフローサイトメトリー解析を行った。
　その結果、５種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１－１、１Ａ１－３、１Ｄ３－１、１Ｄ３－２、及び１Ｄ３－３）については、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有するものではなかったのに対して（図４Ａ及びＣ～Ｆ）、１種類の抗ｆＰＤ１マウスモノクローナル抗体（１Ａ１－２）は、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有するものであることが確認された（図４Ｂ）。なお、ハイブリドーマ１Ａ１－２は、国立大学法人山口大学共同獣医学部に保管されており、一定の条件下で分譲可能である。
５．「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１に特異的に結合することの確認
　ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、SIGMA社製）及び「１Ａ１－２」を用いたウェスタンブロッティングを定法に従って行った。
　その結果、抗ＦＬＡＧ抗体で検出されるバンドと同じサイズのバンドが、「１Ａ１－２」でも検出された（図５Ａ）。
　また、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１又はＮＩＨ３Ｔ３について、それぞれ各種濃度（０μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ）の「１Ａ１－２」を用いたフローサイトメトリー解析を、上記実施例２に記載の方法に従って行った。
　その結果、「１Ａ１－２」は、濃度依存的に、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１に特異的に結合することが示された（図５Ｂ）。
　さらに、ネコリンパ腫細胞株（ＦＴ-１）を、文献「Vet Comp Oncol . 2020 Dec;18(4):739-752.」に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ｆＰＤ１遺伝子をノックアウトすることにより、ＦＴ-１／ｋо－ｆＰＤ１を作製した後、ＦＴ-１／ｋо－ｆＰＤ１又はＦＴ-１について、１０μｇ／ｍＬの「１Ａ１－２」を用いたフローサイトメトリー解析を、上記実施例２に記載の方法に従って行った。
　その結果、「１Ａ１－２」は、ＦＴ-１におけるｆＰＤ１に特異的に結合することが示された（図５Ｃ）。
６．「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害することの確認
　さらに、「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害するかどうかを解析するために、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）「１Ａ１－２」の非存在下でかつｈＩｇの存在下でインキュベートし、２）各種濃度（０μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、又は４０μｇ／ｍＬ）の「１Ａ１－２」と、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし、あるいは、３）４０μｇ／ｍＬの「１Ａ１－２」の存在下でインキュベートし、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を、上記「３－５」に記載の方法に従って行った。
　その結果、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を（ｈＩｇではなく）ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートすることにより増加した、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ由来の蛍光強度は、「１Ａ１－２」をともにインキュベートすることにより、「１Ａ１－２」の濃度依存的に減少することが示された（図６）。
　この結果は、「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１と、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇにおけるｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有することを示している。
７．「１Ａ１－２」が、ＩＦＮγ産生増強作用があることの確認
　「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有することから、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化する作用を有するかどうかを解析した。具体的には、３匹の健常ネコ（ネコ１、ネコ２、及びネコ３）よりＰＢＭＣを定法に従って分離した後、ＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート中にウェル当たり２×１０５個となるように播種し、１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを添加すると同時に、偽抗体(マウスＩｇＧ１、Biolegend社製)又は「１Ａ１－２」を添加した。７２時間培養後に培養上清を回収し、培養上清中のｆＩＦＮγをFeline IFN-gamma DuoSet ELISA（R&D社製）により測定した。
　その結果、ＰＢＭＣを「１Ａ１－２」の存在下で培養すると、偽抗体の存在下で培養した場合と比べ、培養液中に産生されるｆＩＦＮγの濃度が有意に増加した（図７）。
　この結果は、「１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化した結果、ｆＩＦＮγ産生量が増加したことを示している。
８．「１Ａ１－２」の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の同定
　ハイブリドーマ１Ａ１－２を基に、定法に従って同定した「１Ａ１－２」の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表２に示す。
　また、抗体Ｈ鎖ＣＤＲ１は、kabatによる番号付けでＨ３１～３５の位置に存在し、抗体Ｈ鎖ＣＤＲ２は、kabatによる番号付けで、Ｈ５０～５２、Ｈ５２Ａ、及びＨ５３～６５の位置に存在し、抗体Ｈ鎖ＣＤＲ３は、kabatによる番号付けで、Ｈ９５～１００、Ｈ１００Ａ～Ｇ、Ｈ１０１、及びＨ１０２の位置に存在することが知られている。また、抗体Ｌ鎖ＣＤＲ１は、kabatによる番号付けでＬ２４～３４の位置に存在し、抗体Ｌ鎖ＣＤＲ２は、kabatによる番号付けでＬ５０～５６の位置に存在し、抗体Ｌ鎖ＣＤＲ３は、kabatによる番号付けでＬ８９～９７の位置に存在することが知られている。かかる点を考慮して、「１Ａ１－２」の重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を表３に示す。なお、これらＣＤＲは、表２中の四角で囲ったアミノ酸配列に相当する。
９．「１Ａ１－２」の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、ネコＩｇＧ１の定常領域とからなるキメラ抗体の作製
　ハイブリドーマ１Ａ１－２のゲノムＤＮＡに含まれる、「１Ａ１－２」における定常領域をコードするポリヌクレオチドを、文献「Sci Adv. 2019 Aug 28;5(8):eaaw1822.」に記載の方法に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ネコ由来の定常領域をコードするポリヌクレオチドに置換し、「１Ａ１－２」の重鎖可変領域及びネコＩｇＧ１の定常領域と、「１Ａ１－２」の軽鎖可変領域及びネコＩｇＧ１の定常領域とからなるキメラ抗体を産生するハイブリドーマｃｈ－１Ａ１－２を作製した（本明細書において、ハイブリドーマｃｈ－１Ａ１－２によって産生されたマウスモノクローナルキメラ抗体を「ｃｈ－１Ａ１－２」ということがある）。「ｃｈ－１Ａ１－２」の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表４に示す。なお、ハイブリドーマｃｈ－１Ａ１－２は、国立大学法人山口大学共同獣医学部に保管されており、一定の条件下で分譲可能である。
　表中、下線部は定常領域を示す。
１０．「ｃｈ－１Ａ１－２」が、１）ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１におけるｆＰＤ１に特異的に結合すること、２）ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害すること、及び、３）ＩＦＮγ産生増強作用があることの確認
　ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１（図中の「ｆＰＤ１」）又はＮＩＨ３Ｔ３（図中の「ｍｏｃｋ」）について、それぞれ各種濃度（０μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ）の「ｃｈ－１Ａ１－２」を用いたフローサイトメトリー解析を、抗マウスＩｇＧ－ＰＥを抗ネコＩｇＧ－ＰＥ（Santacruz biotechnology社製）に代え、上記実施例２に記載の方法に従って行った。
　その結果、「ｃｈ－１Ａ１－２」は、濃度依存的に、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１に特異的に結合することが示された（図８Ａ）。
　次に、「ｃｈ－１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合を阻害するかどうかを解析するために、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を、１）「ｃｈ－１Ａ１－２」の非存在下でかつｈＩｇの存在下でインキュベートし、あるいは、２）各種濃度（０μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、又は４０μｇ／ｍＬ）の「ｃｈ－１Ａ１－２」と、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートし、それぞれ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥの存在下でインキュベートした後、フローサイトメトリー解析を、上記「３－５」に記載の方法に従って行った。
　その結果、ＮＩＨ３Ｔ３／ｆＰＤ１を（ｈＩｇではなく）ｆＰＤＬ１－ｈＩｇの存在下でインキュベートすることにより増加した、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ由来の蛍光強度は、「ｃｈ－１Ａ１－２」をともにインキュベートすることにより、「ｃｈ－１Ａ１－２」の濃度依存的に減少することが示された（図６）。
　この結果は、「ｃｈ－１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１と、ｆＰＤＬ１－ｈＩｇにおけるｆＰＤＬ１との結合を阻害する作用を有することを示している。
　次に、「ｃｈ－１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化する作用を有するかどうかを解析するために、４匹の健常ネコ（ネコ１、ネコ２、ネコ３、及びネコ４）よりＰＢＭＣを定法に従って分離した後、ＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート中にウェル当たり２×１０５個となるように播種し、１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを添加すると同時に、偽抗体(ネコＩｇＧ、Jackson Immunoresearch社製)又は「ｃｈ－１Ａ１－２」を添加した。７２時間培養後に培養上清を回収し、培養上清中のｆＩＦＮγをFeline IFN-gamma DuoSet ELISA（R&D社製）により測定した。
　その結果、ＰＢＭＣを「ｃｈ－１Ａ１－２」の存在下で培養すると、偽抗体の存在下で培養した場合と比べ、培養液中に産生されるｆＩＦＮγの濃度が増加した（図８Ｃ）。
　この結果は、「ｃｈ－１Ａ１－２」が、ｆＰＤ１とｆＰＤＬ１との結合によるＴ細胞の活性化抑制を解除し、Ｔ細胞を活性化した結果、ｆＩＦＮγ産生量が増加したことを示している。
　本発明は、ネコにおける免疫療法（例えば、がん免疫療法）に資するものである。

Claims (9)

  1. 　配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるネコＰＤ－１に特異的に結合する抗体であって、
    配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
    配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含む、前記抗体。
  2. 　配列番号７に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 　配列番号９に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  5. 　プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている請求項４に記載のポリヌクレオチドとを含むベクター。
  6. 　請求項５に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
  7. 　請求項１～３のいずれかに記載の抗体を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤。
  8. 　請求項１～３のいずれかに記載の抗体をネコに投与する工程を含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する方法。
  9. 　請求項１～３のいずれかに記載の抗体、若しくはその標識物、又は請求項５に記載のベクターを含む、ネコＰＤ－１とネコＰＤ－Ｌ１との結合阻害用キット。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020103885A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Anti-pd-1 antibodies and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020103885A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Anti-pd-1 antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI, ERI ET AL.: "Expression analysis of programmed death ligand 1 (PD-L1) in feline tumor tissues", PROGRAMS OF THE 165TH MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE, Dl1A-04, 6 September 2022 (2022-09-06) *
NISHIBORI, SHOUMA ET AL.: "Examination of cross-reactivity of anti-human PD-L1 monoclonal antibodies against feline PD-L1", PROGRAMS OF THE 165TH MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE, HS1A-15, 6 September 2022 (2022-09-06) *

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