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WO2015190529A1 - タンパク質間相互作用の判定方法 - Google Patents

タンパク質間相互作用の判定方法 Download PDF

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WO2015190529A1
WO2015190529A1 PCT/JP2015/066760 JP2015066760W WO2015190529A1 WO 2015190529 A1 WO2015190529 A1 WO 2015190529A1 JP 2015066760 W JP2015066760 W JP 2015066760W WO 2015190529 A1 WO2015190529 A1 WO 2015190529A1
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WO
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protein
fusion protein
fluorescent
fusion
cell
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PCT/JP2015/066760
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English (en)
French (fr)
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拓 渡部
徹 庄司
峻 松澤
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株式会社医学生物学研究所
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining protein-protein interaction, and a vector and kit for use in the method.
  • the method for determining protein-protein interactions can be divided into two main groups.
  • the first is a method characterized by using a protein separated from a living cell.
  • surface plasmon resonance method protein mass spectrometry method
  • anisotropy measurement method anisotropy measurement
  • a method for determining protein-protein interactions using living cells has been developed.
  • Representative methods include a yeast two-hybrid system that detects the transcriptional activity of a reporter and variations thereof.
  • methods that utilize reconstitution of enzymes such as ⁇ -galactosidase and dihydrofolate reductase (DHFR) have been developed.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • FRET fluorescence resonance energy transfer method
  • Patent Document 1 a method for determining protein-protein interactions using intracellular localization was reported by Tobias Meyer et al.
  • a protein that specifically binds to a specific site in a cell is fused to one of the proteins for determining the interaction, and a fluorescent protein or the like is fused to the other of the proteins for determining the interaction. Then, these fusion proteins are expressed in the cell, and the protein-protein interaction is determined using a signal such as a fluorescent protein at a specific site in the cell as an index.
  • Patent Document 2 A method for determining protein-protein interaction has been reported (Patent Document 2).
  • this method requires the cells to be stimulated to induce the formation of aggregates at any point in time. It is necessary to remove the drugs that were present. Therefore, in this method, it is not possible to obtain time information when the protein-protein interaction occurs, and the protein-protein interaction that changes (occurs, disappears, regenerates, etc.) at any place in any period is There are problems such as being unable to judge.
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art, and its purpose is to determine the protein-protein interaction in the cell under the intracellular environment unique to the protein-protein interaction, And it is providing the method which can acquire the positional information and time information of protein-protein interaction.
  • the present inventors have the ability to multimerize the first protein in determining the interaction between the two proteins (first protein and second protein).
  • the use of a first fusion protein containing a protein and a fluorescent protein and a second fusion protein containing a second protein and a protein having multimerization ability was conceived (see FIGS. 1 and 2). More specifically, when these two fusion proteins are expressed in a cell, if the first protein and the second protein interact, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced.
  • a system was considered in which the fusion protein forms an aggregate independently, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • the interaction between the proteins was determined in response to the demonstration of the effectiveness of the system for detecting fluorescent bright spots generated by the formation of aggregates of the first fusion protein and the second fusion protein shown in FIGS.
  • We envisioned another detection system to do this see Figs. 3-6). That is, the first fusion protein and the second fusion protein are each divided and expressed in a cell or introduced into a cell, and protein-protein interaction is performed through reconstitution of each fusion protein in the cell. Conceived a detection system for judgment.
  • the third fusion protein containing the first protein and the protein having multimerization ability in the determination of the interaction between the first protein and the second protein, the third fusion protein containing the first protein and the protein having multimerization ability, In the case where the fourth fusion protein containing the protein and the protein having multimerization ability and the fifth fusion protein containing the protein having multimerization ability and the fifth fusion protein containing the fluorescent protein are expressed in the cell or introduced into the cell.
  • the proteins having multimerization ability associate to bind the third fusion protein and the fifth fusion protein, and the fourth fusion protein and the fifth fusion protein bind to each other.
  • proteins corresponding to the first and second fusion proteins shown are expressed in the cells.And if it is as such an assumption, like the system which detects the fluorescence luminescent point which arises by the aggregate formation of the 1st fusion protein and 2nd fusion protein which are shown to FIG. Interaction with other proteins induces multimer formation between proteins with multimerization ability, which causes the fusion protein to form an autonomous association, and the fluorescent protein contained in the fusion protein serves as a fluorescent luminescent spot. It can be expected to be detected also in a system for detecting a fluorescent bright spot generated by the association formation of the third fusion protein, the fourth fusion protein, and the fifth fusion protein shown in FIG.
  • the first labeled protein containing the affinity tag and the first protein the second labeled protein containing the affinity tag and the second protein, and the affinity tag
  • the sixth fusion protein which includes a protein having a multimerizing ability and a fluorescent protein, which is bound to a binding partner having a phenotype and expressed in a cell or introduced into a cell
  • the affinity tag and the By binding to the binding partner the first labeled protein binds to the sixth fusion protein to which the binding partner binds
  • the second labeled protein binds to the binding partner.
  • the first fusion protein and the second fusion protein shown in FIG. Each corresponding protein complex to the protein is assumed to be expressed within the cell.
  • a complex composed of a fluorescent protein, a protein having multimerization ability and a binding partner, an affinity tag and the first protein functions like the first fusion protein shown in FIG.
  • a complex composed of a protein and binding partner having multimerization ability, an affinity tag and a second protein functions like the second fusion protein shown in FIG.
  • the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • 8 fusion proteins, a second partial peptide that can be reconstituted by a fluorescent protein by binding to the first partial peptide, and a ninth fusion protein containing a protein having multimerization ability are expressed in cells.
  • the reconstitution causes the fluorescent protein to be expressed in the cell.
  • the first protein and the second protein interact, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced, whereby the fusion protein is independently associated.
  • a fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • the third partial peptide constituting the protein having multimerization ability and the tenth fusion protein containing the first protein and the third part constituting the protein having multimerization ability An eleventh fusion protein comprising a peptide and a second protein; a fourth partial peptide that can be reconstituted by a protein capable of multimerization by binding to a third partial peptide; and a twelfth comprising a fluorescent protein
  • a protein having multimerization ability is expressed in the cell by the reconstitution.
  • the first protein and the second protein interact, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced, whereby the fusion protein is independently associated.
  • a fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • the present inventors conceived the system shown in FIG. 7 as an embodiment for detecting an interaction between three or more proteins based on the system shown in FIG. That is, the thirteenth fusion protein containing the first protein and the protein having multimerization ability, the fourteenth fusion protein containing the second protein and the protein having multimerization ability, the third protein and the fluorescent protein If the first protein, the second protein, and the third protein interact when the fifteenth fusion protein is expressed in the cell or introduced into the cell, the system shown in FIG. Similarly, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced, whereby the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot. .
  • the detection system shown in FIG. 7 was actually constructed, and the fusion protein was expressed in the cell, resulting from the association of the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein, and the fifteenth fusion protein. It has been clarified that a system that detects a fluorescent bright spot generated by forming an association with a fluorescent bright spot can also determine any protein-protein interaction using the fluorescent bright spot detected in the cell as an index.
  • the detection system shown in FIG. 8 was actually constructed, and when the fusion protein was expressed in the cell, an aggregate was formed with the fluorescent bright spot generated by the association of the 16th fusion protein and the 17th fusion protein. It has been clarified that an interaction between proteins can be determined by using a fluorescent bright spot detected in the cell as an index even by a system for detecting the fluorescent bright spot generated by the above.
  • the present invention relates to a method for determining protein-protein interaction, and a vector and kit for use in the method. More specifically, the present invention provides the following inventions.
  • a method for determining an interaction between a first protein and a second protein comprising the following steps (1) to (3): (1) a first protein having a multimerizing ability; A step (2) of expressing or introducing into a cell a first fusion protein comprising a protein having a protein and a fluorescent protein and a second fusion protein comprising a second protein and a protein having multimerization ability
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the second fusion protein is a fusion protein further containing a fluorescent protein.
  • the fluorescent protein is a monomeric fluorescent protein.
  • ⁇ 4> A method for detecting an interaction between a first protein and a second protein, comprising the following steps (1) to (3): (1) the first protein and the multimerization ability; A third fusion protein comprising a protein having, a fourth fusion protein comprising a second protein and a protein having multimerization ability, and a fifth fusion protein comprising a protein having multimerization ability and a fluorescent protein, Step of expressing in cell or introducing into cell (2) Step of detecting fluorescent bright spot generated by association of third fusion protein, fourth fusion protein and fifth fusion protein in the cell (3) A step of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • the fluorescent protein is a monomeric fluorescent protein.
  • a DNA encoding a protein having a multimerization ability, a DNA encoding a fluorescent protein, and a cloning site, and the DNA encoding an arbitrary protein is inserted into the cloning site, whereby the multimerization is performed.
  • a vector capable of expressing a fusion protein comprising an active protein, the fluorescent protein and the arbitrary protein.
  • ⁇ 7> To be used in the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, including at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use: (A) The vector according to ⁇ 6> (b) A vector encoding the first fusion protein (c) A vector encoding the second fusion protein (d) Holding a vector encoding the first fusion protein (E) a transformed cell holding a vector encoding the second fusion protein (f) a transformation holding a vector encoding the first fusion protein and a vector encoding the second fusion protein Cells (g) First fusion protein (h) Second fusion protein.
  • a kit for use in the method according to ⁇ 4> or ⁇ 5> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use (a) A fusion protein comprising a DNA that encodes a protein having quantification ability and a cloning site, and a DNA that encodes an arbitrary protein inserted into the cloning site, and the protein having the quantification ability and the arbitrary protein (B) a vector encoding a third fusion protein (c) a vector encoding a fourth fusion protein (d) a vector encoding a fifth fusion protein (e) a fifth fusion Transformed cells carrying a protein-encoding vector (f) Third fusion protein (g) Fourth fusion protein h) the fifth fusion protein.
  • a method for detecting an interaction between a first protein and a second protein comprising the following steps (1) to (3): (1) comprising an affinity tag and the first protein A protein having a multimerizing ability, wherein a first labeled protein, a second labeled protein including an affinity tag and a second protein, and a binding partner having affinity for the affinity tag are bound. And a sixth fusion protein containing the fluorescent protein and expressing the cell in the cell or introducing the cell into the cell (2) In the cell, the first labeled protein, the second labeled protein, A step of detecting a fluorescent bright spot generated by association with the sixth fusion protein to which a binding partner is bound (3). Click protein and determining the interaction with the second protein.
  • a kit for use in the method according to ⁇ 9> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use (a) encoding an affinity tag A vector comprising a DNA and a cloning site, wherein a DNA encoding an arbitrary protein can be inserted into the cloning site to express a fusion protein containing the affinity tag; (b) a first labeled protein A vector encoding (c) a vector encoding the second labeled protein (d) a vector encoding the sixth fusion protein to which the binding partner is bound (e) a sixth to which the binding partner is bound A transformed cell carrying a vector encoding the fusion protein of (f) the first labeled protein (g Second labeled protein (h) a sixth fusion protein in which the binding partner is bound.
  • a method for detecting an interaction between a first protein and a second protein comprising the following steps (1) to (3): (1) a first part constituting a fluorescent protein Fluorescence by binding to the first partial peptide, the seventh fusion protein including the peptide and the first protein, the eighth fusion protein including the first partial peptide and the second protein constituting the fluorescent protein, and the first partial peptide
  • kits for use in the method according to ⁇ 11> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use: (a) a first partial peptide A vector capable of expressing a fusion protein containing the first partial peptide by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site; (C) a vector encoding the eighth fusion protein (d) a vector encoding the ninth fusion protein (e) a transformed cell carrying a vector encoding the ninth fusion protein ( f) Seventh fusion protein (g) Eighth fusion protein (h) Ninth fusion protein.
  • a method for detecting an interaction between a first protein and a second protein comprising the following steps (1) to (3): (1) constituting a protein having multimerization ability A tenth fusion protein comprising a third partial peptide and a first protein; an eleventh fusion protein comprising a third partial peptide and a second protein constituting a protein having multimerization ability; A step of expressing the fourth partial peptide that can be reconstituted by the protein having the ability to multimerize by binding to the partial peptide and the twelfth fusion protein containing the fluorescent protein into the cell or introducing it into the cell (2 ) Detects a fluorescent bright spot generated by the association of the tenth fusion protein, the eleventh fusion protein, and the twelfth fusion protein in the cell.
  • kits for use in the method according to ⁇ 13> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use: (a) a third partial peptide A vector capable of expressing a fusion protein containing the third partial peptide by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site.
  • a method for detecting an interaction between a first protein, a second protein, and a third protein comprising the following steps (1) to (3): (1) first protein And a thirteenth fusion protein comprising a protein having multimerization ability, a fourteenth fusion protein comprising a second protein and a protein having multimerization ability, and a fifteenth fusion protein comprising a third protein and a fluorescent protein (2) a step of detecting a fluorescent bright spot generated by association of the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein and the fifteenth fusion protein in the cell (3) A step of determining an interaction between the first protein, the second protein, and the third protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • kits for use in the method according to ⁇ 15> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use (a) having a multimerization ability
  • a vector comprising a DNA encoding a protein and a cloning site, and a fusion protein containing a protein having multimerization ability can be expressed by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site
  • b) A vector that includes a DNA encoding a fluorescent protein and a cloning site, and allows expression of a fusion protein containing the fluorescent protein by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site.
  • Vector encoding the fusion protein (d) encoding the 14th fusion protein That vector (e) a vector encoding the 15 fusion proteins of (f) 13th of fusion protein (g) 14 fusion protein (h) 15 fusion protein.
  • ⁇ 17> A method for determining an interaction between a first protein and a second protein, wherein the protein having the first multimerization ability is different from the protein having the second multimerization ability.
  • a method comprising the following steps (1) to (3): (1) a 16th fusion protein comprising a first protein, a first protein having multimerization ability, and a fluorescent protein; A step of expressing or introducing into the cell a seventeenth fusion protein comprising a protein having a multimerization ability of (2) association of the sixteenth fusion protein and the seventeenth fusion protein in the cell; (3) A step of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • kits for use in the method according to ⁇ 17> comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (f) and instructions for use: (a) a first multimerization A DNA encoding a protein having an ability, a DNA encoding a fluorescent protein, and a cloning site, and having a first multimerization ability by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site A vector capable of expressing a protein, a fusion protein comprising the fluorescent protein and the arbitrary protein (b) a DNA encoding a protein having a second multimerization ability, a DNA encoding the fluorescent protein, and a cloning site; And a DNA encoding an arbitrary protein is inserted into the cloning site, (C) a vector encoding the 16th fusion protein (d) encoding the 17th fusion protein Vector (e) 16th fusion protein (f) 17th fusion protein.
  • the present invention it is possible to determine protein-protein interaction in its own intracellular environment, and based on the result of the determination, it is possible to acquire position information and time information of protein-protein interaction. Become.
  • homomultimer formation can be determined efficiently in its own intracellular environment, and the position information and time information of homomultimer formation are also efficiently based on the determination result. It can be acquired.
  • a first fusion protein including a first protein (A in the figure), a protein having multimerization ability (C in the figure) and a fluorescent protein (D in the figure), and a second protein (in the figure) And B) and a second fusion protein containing a protein having a multimerization ability (C in the figure), or the first fusion protein in the cell when expressed into the cell or introduced into the cell,
  • a in the figure a protein having multimerization ability
  • B a second fusion protein
  • the interaction of a 1st protein and a 2nd protein can be determined by detecting the fluorescence luminescent point produced by the aggregate formation with a 2nd fusion protein.
  • a first fusion protein including a first protein (A in the figure), a protein having multimerization ability (C in the figure) and a fluorescent protein (D in the figure), and a second protein (in the figure) , B) and a second fusion protein containing a protein having multimerization ability (C in the figure) and further containing a fluorescent protein (D in the figure), or when introduced into the cell
  • determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting a fluorescent bright spot generated by forming an aggregate of the first fusion protein and the second fusion protein in the cell. It is a figure which shows that it can do.
  • the third fusion protein including the first protein (A in the figure) and the protein having multimerization ability (C in the figure), the second fusion protein (B in the figure) and having the multimerization ability
  • a fluorescent bright spot generated by the formation of an aggregate of the third fusion protein, the fourth fusion protein, and the fifth fusion protein in the cell when expressed or introduced into the cell.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram which shows the one aspect
  • the sixth fusion protein containing (D in the figure) is expressed in the cell or introduced into the cell, the first labeled protein and the second labeled protein in the cell
  • the interaction between the first protein and the second protein can be determined by detecting a fluorescent bright spot generated by forming an aggregate with the sixth fusion protein to which the binding partner is bound.
  • the seventh fusion protein containing the first protein (A in the figure) and the first partial peptide (d1 in the figure) constituting the fluorescent protein, the second protein (B in the figure) and the fluorescence
  • An eighth fusion protein containing a first partial peptide constituting the protein (in the figure, d1) and a second partial peptide that can be reconstituted by the fluorescent protein by binding to the first partial peptide (in the figure, d2) and the ninth fusion protein containing the protein having the ability to multimerize (C in the figure) are expressed in the cell or introduced into the cell, the seventh fusion protein And detecting the fluorescent bright spot generated by the formation of an association between the eighth fusion protein and the ninth fusion protein, the interaction between the first protein and the second protein can be determined.
  • the thirteenth fusion protein including the first protein (A in the figure) and the protein having multimerization ability (C in the figure), and the second protein (B in the figure) and having the multimerization ability
  • a 14th fusion protein containing a protein (C in the figure) and a 15th fusion protein containing a third protein (F in the figure) and a fluorescent protein (D in the figure) are expressed in cells.
  • a fluorescent bright spot generated by the association of the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein, and the fifteenth fusion protein in the cell.
  • the protein having the first multimerization ability is different from the protein having the second multimerization ability, and is a first protein (A in the figure), a protein having the first multimerization ability ( In the figure, C) and a 16th fusion protein containing fluorescent protein (D in the figure), a second protein (B in the figure) and a protein having a second multimerization ability (G in the figure).
  • a fusion protein according to the present invention obtained by fusing the PB1 domain of p62 protein as a protein having multimerization ability and mAG1 as a fluorescent protein to the FKBP12 mutant to be analyzed It was expressed whether it was expressed in the cell and the homodimer formation of the FKBP12 mutant according to the addition of the drug can be determined using the fluorescent bright spot as an index by adding the drug B / B homodimerizer to the cell. It is a microscope picture which shows a result.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m. It is a microscope picture which shows the result of having detected the fluorescence luminescent spot which shows the homodimer formation of the FKBP12 variant according to the chemical
  • the results of analyzing the cells before adding the drug, the cells 58 minutes after adding the drug, and the cells 66 minutes after adding the drug are shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • the homodimer formation of the FKBP12 mutant formed by adding the B / B homodimerizer to the cells that constitutively express the PB1-mAG1-FKBP12 mutant results from the addition of the B / B washout ligand.
  • cells before drug addition cells 90 minutes after addition of B / B homodimer, B / B homodimer was washed, and 90 minutes after addition of B / B washout ligand The results of analyzing the cells are shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • the homodimer formation of the FKBP12 mutant formed by adding the B / B homodimerizer to the cells that constitutively express the PB1-mAG1-FKBP12 mutant results from the addition of the B / B washout ligand.
  • A shows the elapsed time after adding B / B homodimerizer to the cells.
  • B shows the time which wash
  • C shows the elapsed time after adding B / B washout ligand to the cells after the washing.
  • a fusion protein (mAG1-PB1-p53 or p53-mAG1-PB1) according to the present invention which is obtained by fusing the PB1 domain of p62 protein as a protein having multimerization ability and mAG1 as a fluorescent protein to p53 to be analyzed.
  • Is expressed in cells and is a micrograph showing the result of analyzing whether or not p53 homomultimer formation can be determined using a fluorescent bright spot as an index.
  • “mAG1-PB1-p53” is a fluorescent signal derived from a protein obtained by fusing the N-terminal of p53 with a protein tag according to the present invention (a fusion protein including a protein having multimerization ability and a fluorescent protein).
  • the right panel shows the result of detecting nuclei by treating the same cells with Hoechst 33342.
  • P53-mAG1-PB1 shows the result of detecting a fluorescent signal derived from a protein in which the protein tag according to the present invention is fused to the C-terminal of p53, and the right panel shows the same cell as Hoechst 33342.
  • the result of detecting nuclei by processing with is shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a fusion protein (mAG1-p53 or p53-mAG1), in which only mAG1 is fused to the analysis target p53 as a fluorescent protein, is expressed in the cell, and p53 homomultimer formation is determined using the fluorescent bright spot as an indicator It is a microscope picture which shows the result of having analyzed whether it can do.
  • “mAG1-p53” shows the result of detecting a fluorescent signal derived from a protein in which a fluorescent protein is fused to the N-terminus of p53, and the right panel shows the same cell treated with Hoechst 33342. This shows the result of detecting the nucleus.
  • P53-mAG1 shows the result of detecting a fluorescent signal derived from a protein in which a fluorescent protein is fused to the C-terminal of p53.
  • the right panel shows that the same cell is treated with Hoechst 33342.
  • the result of detecting the nucleus is shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the N-terminus of the partial peptide of p53 to be analyzed (PB1-p53 (70)), and the PB1 domain and mAG1 of the p62 protein at the N-terminus of the MDM2 to be analyzed
  • “Nutlin-3 ( ⁇ )” indicates the result of observing the cells before adding Nutrin-3, which is an inhibitor of the protein-protein interaction.
  • Nutlin-3 (+), 30 min Shows the results of observing cells that had passed 30 minutes after adding Nutrin-3.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein (p53 (70) -mAG1-PB1) in which the PB1 domain of mAG1 and p62 protein is fused to the C-terminus of the partial peptide of p53 to be analyzed, and the N of NDM of MDM2 to be analyzed (PB1-MDM2) fused at the end of the cell is expressed in the cell, and the photomicrograph showing the result of analyzing whether the protein-protein interaction between p53 (70) and MDM2 can be determined using the fluorescent bright spot as an index It is.
  • Nutlin-3 ( ⁇ ) indicates the result of observing the cells before adding Nutrin-3, which is an inhibitor of the protein-protein interaction.
  • Nutlin-3 (+), 30 min Shows the results of observing cells that had passed 30 minutes after adding Nutrin-3.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein in which the PB1 domain of p62 protein and mAG1 are fused to the N-terminus of FKBP12 to be analyzed, and the PB1 domain of p62 protein at the C-terminus of the FRB domain of the mTOR protein to be analyzed
  • a fusion protein (mTOR (FRB domain) -PB1) was expressed in the cell, and the protein-protein interaction between FKBP12 and mTOR (FRB domain) was analyzed to determine whether the fluorescence bright spot could be used as an indicator. It is a microscope picture which shows a result.
  • Rapamycin ( ⁇ ) indicates the result of observing cells before adding rapamycin, which is an inducer of protein-protein interaction
  • Rapamycin (+), 30 min indicates that rapamycin is added. Then, the result of observing the cells after 30 minutes has been shown.
  • the scale bar in the figure indicates 100 ⁇ m.
  • a protein (p53 (70) -mAG1-PB1) obtained by fusing the PB1 domain of mAG1 and p62 protein to the N-terminal of the partial peptide of p53 to be analyzed, and MDM2 for analysis of the PB1 domain and mAG1 of p62 protein Of (PB1-mAG1-MDM2) fused to the N-terminus of E.
  • Nutlin-3 ( ⁇ ) indicates the result of observing the cells before adding Nutrin-3, which is an inhibitor of the protein-protein interaction.
  • Nutlin-3 (+), 30 min Shows the results of observing cells that had passed 30 minutes after adding Nutrin-3.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein obtained by fusing the PB1 domain and mAG1 of the p62 protein to the C terminus of the partial peptide of p53 to be analyzed (p53 (70) -PB1-mAG1), and the MDM2 to which the PB1 domain and mAG1 of the p62 protein are to be analyzed Of (PB1-mAG1-MDM2) fused to the N-terminus of E. coli and expressed in the cells, and analyzed whether the protein-protein interaction between p53 (70) and MDM2 can be determined using the fluorescent bright spot as an index FIG.
  • “Nutlin-3 ( ⁇ )” indicates the result of observing the cells before adding Nutrin-3, which is an inhibitor of the protein-protein interaction.
  • Nutlin-3 (+), 30 min Shows the results of observing cells that had passed 30 minutes after adding Nutrin-3.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein mTOR (FRB domain) -mAG1-PB1 in which the PB1 domain of mAG1 and p62 protein is fused to the C-terminal of the FRB domain of the mTOR protein to be analyzed, and the PB1 domain and mAG1 of the p62 protein are analyzed.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein (PB1-DG1-FKBP12 mutant, that is, PB1-DG1-FKBP12 (F36V)) obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein and DG1 as a fluorescent protein to the N-terminus of the FKBP12 mutant to be analyzed It was expressed whether it was expressed in the cell and the homodimer formation of the FKBP12 mutant according to the addition of the drug can be determined using the fluorescent bright spot as an index by adding the drug B / B homodimerizer to the cell. It is a microscope picture which shows a result.
  • a protein obtained by fusing the SAM domain of Tankyrase1 protein and mAG1 as a protein having multimerization ability to the N-terminus of the FKBP12 mutant to be analyzed (Tankylase-mAG1-FKBP12 mutant, Tankyase-mAG1-FKBP12 (F36V )) Expressed in cells, and by adding a drug B / B homodimerizer to the cells, it is possible to determine the homodimer formation of the FKBP12 mutant in response to the drug addition using the fluorescence bright spot as an index It is a microscope picture which shows the result of having analyzed.
  • the results of analyzing the cells before the addition of the drug and the cells 3 hours after the addition of the drug in order from the left are shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein having multimerization ability a protein obtained by fusing the SAM domain of Tankylase1 protein, the PB1 domain of PKCiota protein, the SAM domain of TEL protein or the SAM domain of DGKdelta protein to the N-terminus of p53 (Tankyase-mAG1-p53) , PKCi-mAG1-p53, TEL-mAG1-p53 or DGKd-mAG1-p53) are expressed in cells, and the results of analyzing whether or not p53 homomultimer formation can be determined using a fluorescent bright spot as an index are shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein (ERK2-mAG1-PB1) obtained by fusing the PB1 domain of mAG1 and the p62 protein to the C terminus of ERK2 is expressed in the cell, and EGF is added to the cell.
  • index indicates the result of observing the cells before adding EGF
  • EGF 50 ng / ml
  • 8 min indicates the cells that have passed 8 minutes after the addition of EGF. The observation result is shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a cell in which a protein (ERK2-PB1-mAG1) in which the PB1 domain and mAG1 of the p62 protein are fused to the C-terminus of ERK2 was constitutively expressed was observed 8 minutes after the addition of EGF.
  • 5 is a photomicrograph showing the result of analyzing whether or not formation of a homodimer of ERK2 according to the above can be determined using a fluorescent bright spot as an index.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein obtained by fusing the PB1 domain of p62 protein and mAG1 to the N-terminus of STAT3 (PB1-mAG1-STAT3) was expressed in the cell, and IL-6 was added to the cell, so that the addition was performed.
  • PB1-mAG1 a fusion protein containing the PB1 domain of p62 protein and mAG1
  • P53-PB1 indicates a protein obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to a part of C-terminal of the p53 protein
  • PB1-MDM2 indicates that the PB1 domain of the p62 protein is present at the N-terminal of MDM2.
  • a fused protein is indicated, and “PB1” indicates the PB1 domain of the p62 protein.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m, and the arrow indicates the detected fluorescent bright spot.
  • a protein obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the N-terminus or C-terminus of mTOR (FRB domain) (PB1-mTOR (FRB domain) or mTOR (FRB domain) -PB1), and the PB1 domain of the p62 protein as FKBP12 A protein (PB1-FKBP12 or FKBP12-PB1) fused to the N terminus or C terminus and the PB1 domain (mAG1-PB1) of the p62 protein fused with mAG1 to the N terminus are represented by the following (A) to (D ) Is a photomicrograph showing the result of analyzing whether or not the protein-protein interaction between FKBP12 and mTOR (FRB domain) can be determined using a fluorescent bright spot as an index.
  • rapamycin before adding rapamycin indicates the result of observing cells before adding rapamycin, which is an inducer of protein-protein interaction
  • rapamycin (500 nM), room temperature 60 min” indicates that rapamycin is added. The result of having observed the cell which passed for 60 minutes since then is shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • A PB1-mTOR (FRB domain), PB1-FKBP12 and mAG1-PB1
  • B PB1-mTOR (FRB domain), FKBP12-PB1 and mAG1-PB1
  • C mTOR (FRB domain) 1-PB1PB, PB1PB And mAG1-PB1
  • D mTOR (FRB domain) -PB1, FKBP12-PB1, and mAG1-PB1.
  • a protein obtained by fusing the FRB domain of the mTOR protein as an affinity tag to the N-terminus of CD80 to be analyzed (CD80-FRB), FKBP12 as a binding partner of the affinity tag, and PB1 of the p62 protein as a protein having multimerization ability
  • CD80-FRB A protein obtained by fusing the FRB domain of the mTOR protein as an affinity tag to the N-terminus of CD80 to be analyzed
  • FKBP12 as a binding partner of the affinity tag
  • PB1 of the p62 protein as a protein having multimerization ability
  • the upper panel shows the result of analyzing the above-mentioned CD80
  • the lower panel shows the result of analyzing using CD2 instead of CD80 as a negative control.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • the left panel shows the results
  • the right panel shows the results of analysis without expressing p65-PB1 as a negative control.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein obtained by fusing mAG1 to the N-terminus of CyclinD1 to be analyzed (mAG1-CyclinD1)
  • a protein obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the C-terminus of p21 to be analyzed (p21-PB1)
  • CDK4-PB1 fused with the C-terminal of CDK4 to be analyzed
  • the PB1 domain of the p62 protein the formation of a trimer consisting of CyclinD1, p21 and CDK4, It is a microscope picture which shows the result of having analyzed whether it can judge as a parameter
  • the left panel shows the results
  • the middle panel shows the results of analysis by expressing only PB1 instead of CDK4-PB1 as a negative control
  • the right panel shows CDK4 as a negative control.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • the left panel shows the results of analyzing the cells before the addition of histamine
  • the middle panel shows the results of analyzing the cells 60 seconds after the addition of histamine
  • the right panel shows the results of analyzing histamine.
  • the result of having analyzed the cell 300 seconds after adding is shown.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • a protein obtained by fusing mUkG1 as a fluorescent protein to the C terminus of calmodulin to be analyzed (Calmodulin-mUkG1) and a protein obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the C terminus of the M13 peptide to be analyzed (M13 peptide- Results of analyzing whether or not heterotetramer formation consisting of calmodulin and M13 peptide can be determined by adding histamine that induces the tetramer formation and using the fluorescence bright spot as an indicator in cells expressing PB1)
  • the left panel shows the results of analyzing the cells before addition of histamine
  • the right panel shows the results of analyzing the cells 60 seconds after the addition of histamine.
  • the scale bar in the figure indicates 20 ⁇ m.
  • DGKd-mAG1-MDM2 fused with the N-terminus of MDM2
  • the left panel shows the results of analyzing the cells before the addition of Nutrin-3
  • the right panel shows the results of analyzing the cells 60 minutes after the addition of Nutrin-3.
  • the scale bar in the figure indicates 10 ⁇ m (hereinafter, the notation in the figure is the same as in FIGS. 38 to 45).
  • TEL protein SAM domain as a protein having multimerization ability
  • TEL-mAG1-MDM2 a protein obtained by fusing mAG1 to the N-terminus of MDM2, p53 and It is a microscope picture which shows the result of having analyzed whether protein-protein interaction with MDM2 can be determined by using a fluorescence luminescent spot as a parameter
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of analyzing whether the protein-protein interaction between p53 and MDM2 can be determined using a fluorescent bright spot as an index in cells expressing Tankyase-mAG1-p53 and DGKd-mAG1-MDM2.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of analyzing whether or not the protein-protein interaction between p53 and MDM2 can be determined using a fluorescent bright spot as an index in cells expressing Tankyase-mAG1-p53 and TEL-mAG1-MDM2. .
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of analyzing whether or not the protein-protein interaction between p53 and MDM2 can be determined using a fluorescent bright spot as an index in cells expressing DGKd-mAG1-p53 and TEL-mAG1-MDM2. .
  • SAM domain of TEL protein as a protein having multimerization ability and a protein (TEL-mAG1-p53) obtained by fusing mAG1 to the N-terminus of p53, SAM domain of Tankyrase1 protein and mAG1 as proteins having multimerization ability was analyzed whether the protein-protein interaction between p53 and MDM2 can be determined using a fluorescent bright spot as an index in cells expressing a protein (Takyrase-mAG1-MDM2) fused with NDM of MDM2. It is a microscope picture which shows a result.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of analyzing whether or not the protein-protein interaction between p53 and MDM2 can be determined using a fluorescent bright spot as an index in cells expressing TEL-mAG1-p53 and DGKd-mAG1-MDM2. .
  • the first aspect of the method for determining protein-protein interactions of the present invention comprises: Expressing in a cell a first fusion protein comprising a first protein, a protein having multimerization ability and a fluorescent protein, and a second fusion protein comprising a second protein and a protein having multimerization ability, or Introducing into the cell (1); Detecting a fluorescent bright spot generated by the association of the first fusion protein and the second fusion protein in the cell (2); And a step (3) of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • the first fusion protein including the first protein, the protein having multimerization ability and the fluorescent protein, the second protein and having multimerization ability
  • a second fusion protein containing a protein is expressed in a cell or introduced into a cell, if the first protein and the second protein interact, a large amount of proteins having multimerization ability Body formation is induced, whereby the fusion protein forms an aggregate autonomously, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot (see FIGS. 1 and 2).
  • protein means a molecule in which two or more amino acids are bound by peptide bonds and a modified form thereof. Therefore, the concept includes not only full-length proteins but also so-called oligopeptides and polypeptides.
  • protein modifications include phosphorylation, glycosylation, palmitoylation, prenylation (eg, geranylgeranylation), methylation, acetylation, ubiquitination, SUMOylation, hydroxylation, and amidation.
  • first protein and the “second protein” a desired protein whose interaction is to be detected can be used. Further, the first protein and the second protein may be different or the same, but as shown in Examples 1 to 12 and Comparative Example 1 described later, according to the method of the present invention, Since formation and elimination (disappearance) of homomultimers can be determined efficiently, the method of the present invention is more useful when the first protein and the second protein are the same.
  • the “interaction between the first protein and the second protein” includes not only a direct interaction but also other molecules (protein, Indirect interactions such as formation of complexes via nucleic acids, sugars, lipids, low molecular weight compounds, etc.) are also included.
  • the “protein having multimerization ability” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a protein capable of forming a multimer, but from the viewpoint that a fluorescent bright spot can be detected more easily in the method of the present invention, a trimer.
  • a protein capable of forming the above multimer is preferable.
  • Examples of such a protein capable of multimerization include the PB1 domain of p62, the PB1 domain of TFG, the PB1 domain of PKCiota, the SAM domain of TEL, the SAM domain of DGKdelta, and the SAM domain of Tankyase-1.
  • the PB1 domain of p62 is more preferable from the viewpoint that a fluorescent bright spot can be detected more easily in the method of the present invention because a homo tetramer to octamer is formed.
  • the p62 PB1 domain, the TFG PB1 domain, the PKCiota PB1 domain, the TEL SAM domain, the DGKdelta SAM domain, and the Tankyrase-1 SAM domain are each typically an amino acid identified by SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequences of these “proteins capable of multimerization” can be mutated in nature (that is, non-artificially), and can be artificially introduced. As long as such a mutant also has the ability to multimerize and has the property of forming an aggregate (fluorescence bright spot) when the fused first and second proteins interact, the present invention Can be used.
  • the “fluorescent protein” may be any protein that can emit fluorescence. , MUkG), monomeric Kusisten-Orange2 (monomer wedge orange 2 and mKO2), monomeric Keima-Red (monomer Keima-Red, mKeima, mKeima-Red), monomeric Midoriishimide-Cimono-Chimoni-Chimoni-Chimoni-Chimoni-Chimoni 1, mMiCy), monomeric Kusecuring-Orange 1 (monomer wedge orange 1, mKO1), monomeri Cherry (monomer cherry, mCherry), FusionRed (Fusion Red), Dronpa-Green1 (Dronpa Green 1, DG1), Midoriishi-Cyan1 (Midoriishi-Cyan1, MiCy1), Kushira-Cyan1 (Kushira-Cyan1, Kwabi-Cyan1) ), Dimeric Azami-Green (
  • the fluorescent protein is a protein capable of forming a multimer
  • it is fused with the above-mentioned protein having multimerization ability.
  • monomer fluorescent proteins mAG1, mUkG, mKO2 MKeima, mMiCy, mKO1, mCherry, FusionRed, DG1, etc.
  • mAG1 and FusionRed are more preferred, and mAG1 is more preferred.
  • mAG1, mUkG, mKO2, mKeima, mMiCy, mKO1, MiCy1, KCy1, dAG (AB), KO1, dKeima, TGuv, mCherry, FusionRed, and DG1 are typically represented by SEQ ID NO: 14, respectively.
  • Genbank accession number: AB128821 a protein consisting of the amino acid sequence specified by Genbank accession number: AB128821, and a Genbank accession number: specified by AB128822 Protein consisting of amino acid sequence, protein consisting of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22, protein consisting of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24, Genbank accession number: protein consisting of amino acid sequence specified by AB128820, Genbank access Section number: protein consisting of amino acid sequence specified by AB209968, protein consisting of amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, GenBank accession number: protein consisting of amino acid sequence specified by AAV52164, SEQ ID NO: 40 A protein consisting of an amino acid sequence and a protein consisting of an amino acid sequence specified by GenBank Accession No. BAD72874.
  • amino acid sequences of these fluorescent proteins can be mutated in nature (ie, non-artificially). It is also possible to introduce mutations artificially. Such a mutant can also be used in the present invention as long as it can emit fluorescence.
  • chemiluminescent proteins such as luciferase can also be used instead of the aforementioned fluorescent proteins.
  • a fluorescent protein emits an electromagnetic wave (light) that is emitted when the electrons of the protein are excited by irradiation with electromagnetic waves and return to the ground state (photo luminescence).
  • a chemiluminescent protein emits electromagnetic waves (light) by excitation of electrons of a luminescent substrate by a chemical reaction catalyzed by the protein.
  • the chemiluminescent protein can also be used in the present invention.
  • a luciferase is mentioned, As a suitable example, Promega NanoLuc (trademark, Nluc) luciferase (made by Promega Corporation), Gaussia luciferase (Gaussia luciferase, Chem) Sci., 2013, Vol. 4, pages 4395-4400).
  • the fluorescent protein instead of the above-described fluorescent protein, the fluorescent protein emits electromagnetic waves (light) by the energy of chemical reaction. Commun., 2012, Vol. 3, page 1262) may also be used.
  • a protein that specifically binds to a fluorescent dye can be used instead of the fluorescent protein. This is because such a protein can be used as a fluorescent protein by expressing it in the cell and introducing the fluorescent dye into the cell.
  • a protein that specifically binds to such a fluorescent dye is HaloTag (manufactured by Promega Corporation).
  • the “first fusion protein” includes the first protein, the protein having multimerization ability, and the fluorescent protein, and does not inhibit the formation of an aggregate (fluorescent bright spot) with the second fusion protein.
  • the first protein, the protein having multimerization ability and the fluorescent protein are fused in order from the N-terminal side, the first protein, the fluorescent protein and the protein having multimerization ability may be used.
  • a protein having a multimerization ability, a first protein and a fluorescent protein, and a protein having a multimerization ability, a fluorescent protein and a second protein. 1 protein may be fused, fluorescent protein, first protein and protein having multimerization ability It may be those formed by fusion Te, fluorescent protein, or may be formed by fusion at a protein having a large amount Kano and first protein.
  • the “second fusion protein” includes a second protein and a protein having multimerization ability, and unless the formation of an association (fluorescence bright spot) with the first fusion protein is inhibited.
  • a protein having quantification ability may be fused to either the N-terminal or C-terminal of the second protein.
  • the second fusion protein is preferably a fusion protein further containing a fluorescent protein (see FIG. 2).
  • the fluorescent protein can be fused between the N-terminal and / or C-terminal of the fusion protein, or between the second protein and the protein having multimerization ability.
  • the fluorescent protein contained in the second fusion protein is as described above, and may be the same as or different from the fluorescent protein contained in the first fusion protein. From the viewpoint that it is possible to track changes in the intracellular localization of each of the first protein and the second protein according to the occurrence and cancellation of the interaction, the fluorescent protein contained in the first fusion protein and the second protein It is preferably different from the fluorescent protein contained in the fusion protein. Moreover, the expression level of each of the first protein and the second protein can also be measured by using different fluorescent proteins that are spectroscopic in this way. Furthermore, different fluorescent proteins are present at high concentrations inside the aggregate (fluorescent bright spot) and will be very close together, so FRET or fluorescence reabsorption can occur.
  • the protein-protein interaction can be determined by measuring the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescence bright spot as a result of FRET or fluorescence reabsorption without imaging or the like.
  • fluorescence reabsorption see “Fluorescence Imaging Revolution (27th) FRET to distinguish FRET from reabsorption”, Cell Engineering 25 (1), 67-69, 2006-01).
  • the fusion between each protein may be direct or indirect via a linker or a spacer protein. Also good. Moreover, as long as formation of an aggregate (fluorescence bright spot) is not inhibited, other functional proteins may be included.
  • the other functional protein is N-terminal, C-terminal or both sides of the fusion protein, or the first protein or the second protein, the protein having multimerization ability and the fluorescent protein, It can be fused directly or indirectly.
  • the function to give to the fusion protein concerning this invention it selects suitably.
  • functional proteins used for the purpose of facilitating purification of the fusion protein include Myc-tag (tag) protein, His-tag protein, hemagglutin (HA) -tag protein, FLAG-tag protein (registered trademark, Sigma- Aldrich), glutathione-S-transferase (GST) protein.
  • the “cell” according to the present invention is not particularly limited and may be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • animal cells HEK293 cells, U2OS cells, Hela cells, etc.
  • insect cells Sf9 cells, etc.
  • plant cells yeast, E. coli.
  • such cells may be cultured in vitro (for example, cells growing in or on the medium), and are present in the living body (for example, encoding the first fusion protein). Or a cell in a transgenic animal into which the DNA encoding the second fusion protein has been introduced).
  • the fusion protein etc. concerning this invention will be normally introduce
  • the expression of the fusion protein in the cell may be a transient expression or a constant expression depending on the purpose.
  • Expression of the fusion protein in the cell can be performed by introducing the vector according to the present invention described later into the cell.
  • Known methods for introducing vectors into cells include lipofection, electroporation, calcium phosphate, DEAE-dextran, viruses (such as adenovirus, lentivirus, adeno-associated virus), microinjection for animal cells.
  • viruses such as adenovirus, lentivirus, adeno-associated virus
  • microinjection for animal cells.
  • the method using the law is mentioned.
  • insect cells a method using baculovirus can be mentioned.
  • the Agrobacterium method, electroporation method, particle gun method and the like can be mentioned.
  • the lithium acetate method, electroporation method, and spheroplast method can be used.
  • heat shock methods for example, calcium chloride method, rubidium chloride method, electroporation methods and the like can be mentioned.
  • the fusion protein can be introduced into the cells by appropriately selecting a known method according to the type of cell by those skilled in the art.
  • Known methods for introducing a protein into cells include, for example, a method using a protein introduction reagent, an electroporation method, and a microinjection method.
  • the “fluorescent bright spot” detected in the present invention is one in which, as a result of the protein-protein interaction according to the present invention, high-density localization of the fluorescent protein contained in the aggregate occurs due to the formation of the aggregate such as a fusion protein.
  • the diameter is 0.2-5 ⁇ m (0.03-20 ⁇ m 2 ). It is an area.
  • Fluorescence bright spot detection can be performed by, for example, observation with a fluorescence microscope equipped with an excitation filter and an absorption filter corresponding to a fluorescent protein, and analysis with an imaging cytometer such as IN Cell Analyzer (manufactured by GE Healthcare). it can. Further, the fluorescent bright spot can be detected by processing the obtained image with an image analysis program (for example, an icy spot detection program described later). In addition, in the detection of such fluorescent luminescent spots, filters, detectors, various parameters, etc. are selected in accordance with the characteristics of the fluorescent luminescent spots to be detected (the wavelength and intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent luminescent spots) and the devices and programs used. Selection and setting can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the spot detection analysis program Icy. 5.4.2 J.-C.Olivo-Marin “Extraction of spots in biologics images using multiscale products”, Pattern recognition, vol. 35-9, 1989-1996 i. ”computed by the analysis program” that can be detected by the set value Spot Detector plug-in (conditions when all of Scale1, Scale2, and Scale3 are checked and the sensitivity is set to 100).
  • Per unit fluorescence intensity is the background (for example, the same fluorescence intensity value in a negative control cell) Even without 2.0 times or more, more preferably 2.5 times or more, even more preferably 5.0 times or more, especially if preferably 10 times or more, it can be determined that could be detected fluorescent bright spots.
  • the fluorescent bright spot if the fluorescent bright spot is detected in a cell, it can be determined that the first protein and the second protein interact, and the fluorescent bright spot must be detected. For example, it can be determined that the first protein and the second protein are not interacting with each other.
  • the method for determining the protein-protein interaction of the present invention is not limited to the above-described aspect.
  • the first fusion protein and the second fusion protein are each divided and expressed in a cell or introduced into a cell, and then the protein-protein interaction through reconstitution of each fusion protein in the cell.
  • the present invention can also take the following second to fifth embodiments.
  • a second aspect of the method for determining protein-protein interactions of the present invention comprises: A method for detecting an interaction between a first protein and a second protein, comprising the following steps (1) to (3): (1) having the first protein and multimerization ability A third fusion protein comprising a protein, a fourth fusion protein comprising a second protein and a protein having multimerization ability, and a fifth fusion protein comprising a protein having multimerization ability and a fluorescent protein, (2) a step of detecting a fluorescent bright spot generated by association of the third fusion protein, the fourth fusion protein, and the fifth fusion protein in the cell (2) 3) A step of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • the first protein and the third fusion protein containing the protein having multimerization ability, the second protein and the protein having multimerization ability are included.
  • the fourth fusion protein and the fifth fusion protein containing a multimerizing protein and a fluorescent protein are expressed in the cell or introduced into the cell, the proteins having the multimerizing ability associate with each other.
  • the third fusion protein and the fifth fusion protein bind to each other, and the fourth fusion protein and the fifth fusion protein bind to each other, which correspond to the first fusion protein and the second fusion protein, respectively. Protein expressed in the cells (see FIG. 3).
  • the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • the “third fusion protein” and the “fourth fusion protein” according to the present invention include the first protein and the protein having multimerization ability, and the second protein and the protein having multimerization ability, respectively. As long as the formation of aggregates (fluorescent bright spots) is not inhibited, the protein having multimerization ability may be fused to either the N-terminus or C-terminus of the first protein or the second protein. In the “third fusion protein” and the “fourth fusion protein”, the fusion between the proteins may be direct, or indirectly via a linker or a spacer protein. There may be.
  • the “third fusion protein” and the “fourth fusion protein” may each contain other functional proteins as long as they do not inhibit the formation of aggregates (fluorescent bright spots).
  • the other functional protein is either directly or both of the N-terminal and / or C-terminal of the fusion protein, or directly between the first protein or the second protein and the protein having multimerization ability. Can be fused either indirectly or indirectly.
  • the “fifth fusion protein” only needs to contain a protein having a multimerization ability and a fluorescent protein. May be fused to either the N-terminus or C-terminus of the fluorescent protein. Moreover, the fusion between each protein may be direct, or may be indirect via a linker or a spacer protein.
  • the “fifth fusion protein” may contain other functional proteins as long as the formation of aggregates (fluorescent bright spots) is not inhibited.
  • the other functional protein is fused directly or indirectly between the N-terminal and / or C-terminal of the fusion protein, or between the protein having multimerization ability and the fluorescent protein. Can do.
  • a third aspect of the method for determining protein-protein interaction of the present invention is a method comprising the following steps (1) to (3).
  • a first labeled protein comprising an affinity tag and a first protein
  • a second labeled protein comprising an affinity tag and a second protein
  • a binding partner having affinity for the affinity tag A step of expressing or introducing into the cell a sixth fusion protein containing a protein that binds and has multimerization ability and a fluorescent protein
  • First labeling in the cell A step of detecting a fluorescent bright spot generated by association of the protein, the second labeled protein, and the sixth fusion protein to which the binding partner is bound (3). Determining the interaction between the protein and the second protein.
  • the first labeled protein containing the affinity tag and the first protein, the second labeled protein containing the affinity tag and the second protein, When a binding partner having an affinity for the affinity tag is bound and a sixth fusion protein including a protein having multimerization ability and a fluorescent protein is expressed in the cell or introduced into the cell
  • the affinity tag and the binding partner bind to each other, thereby binding the first labeled protein to the sixth fusion protein to which the binding partner is bound, and the second labeled protein and 1 and 2 by binding to the sixth fusion protein to which the binding partner is bound.
  • Proteins, each corresponding to is to be expressed in the said cell the first and second fusion proteins shown (see FIG. 4).
  • the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • the “affinity tag” and “binding partner” according to the present invention are not particularly limited as long as they are compounds capable of binding in a cell and can bind to a protein, and are known to interact, for example.
  • a combination of proteins can be used.
  • the FRB domain of FTOR, FKBP12, and the like, which are shown in Examples below, are preferably used, and phytochrome B (PHYB) and phy-chrome bond that bind depending on light irradiation.
  • PEF cryptochrome 2
  • CRC1 cryptochrome-binding bHLH1
  • CIB1 cryptochrome-binding bHLH1
  • LOV and ePDZ cryptochrome-binding bHLH1
  • Dronpa145K-CAAX mNeptune, and the like
  • subunits constituting enzymes such as dihydrofolate reductase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -lactamase, firefly luciferase, and Gaussia luciferase can also be suitably used.
  • affinity tag and binding partner not only utilize such known protein-protein interaction, but also include, for example, biotin and avidin, lectin and sugar, protein A (or G ) And immunoglobin constant regions, antigens and antibodies can also be used.
  • the binding between the affinity tag and the binding partner may be spontaneous, such as an antigen-antibody reaction, or may be induced in response to a stimulus.
  • the stimulus for inducing such binding for example, low molecular weight compounds such as rapamycin that induces the binding between the FRB domain of the mTOR protein and FKBP12, light irradiation that induces the binding of PHYB and PIF, etc. Is mentioned.
  • the stimulus may be given to the cell during the step (1) or during the steps (1) and (2). Necessary.
  • first labeled protein and the “second labeled protein” according to the present invention may be any one in which the first protein and the second protein are each labeled with an affinity tag.
  • the affinity tag may be bound to any one of the N-terminal, C-terminal, and further the intermediate region of the first protein or the second protein as long as the formation of the fluorescent bright spot is not inhibited.
  • the “sixth fusion protein” according to the present invention only needs to include the protein having the multimerization ability and the fluorescent protein and to which the binding partner is bound. As long as the formation is not inhibited, the binding partner may be bound to any of the N-terminal, C-terminal and even the intermediate region of the sixth fusion protein.
  • the fusion between the proteins may be direct, or may be indirect via a linker or a spacer protein.
  • the “binding” of the affinity tag or binding partner to each protein is not particularly limited, and may be binding at the gene level or chemical binding.
  • the binding at the gene level is a so-called “fusion” as shown in the examples described above or below, and the DNA encoding the affinity tag or binding partner is exchanged with the first protein, the second protein or the sixth fusion. This is achieved by adding or inserting the reading frame together with DNA encoding the protein.
  • the chemical bond may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the “covalent bond” is not particularly limited.
  • an amide bond between an amino group and a carboxyl group For example, an amide bond between an amino group and a carboxyl group, an alkylamine bond between an amino group and an alkyl halide group, a disulfide bond between thiols, a thiol group and a maleimide group or an alkyl halide. And a thioester bond with the group.
  • the first labeled protein, the second labeled protein, and the sixth fusion protein all contain other functional proteins as long as they do not inhibit the formation of aggregates (fluorescent bright spots). Also good.
  • the other functional protein is directly connected between the N-terminal and / or C-terminal of each protein, or between the constituent proteins (for example, a protein capable of multimerization and a fluorescent protein). Or it can be indirectly fused.
  • a fourth aspect of the method for determining protein-protein interaction of the present invention is a method comprising the following steps (1) to (3).
  • a second partial peptide that can be reconstituted by a fluorescent protein by binding to the first partial peptide, and a ninth fusion protein containing a protein having multimerization ability, are expressed in the cell or introduced into the cell
  • the step of detecting the fluorescence bright spot generated by the association of the seventh fusion protein, the eighth fusion protein, and the ninth fusion protein in the cell (3) The detection of the fluorescence bright spot Determining the interaction between the first protein and the second protein.
  • the first partial peptide constituting the fluorescent protein and the seventh fusion protein containing the first protein, and the first partial peptide constituting the fluorescent protein and the eighth protein containing the second protein A fusion protein, a second partial peptide that can be reconstituted by a fluorescent protein by binding to the first partial peptide, and a ninth fusion protein containing a protein having multimerization ability were expressed in cells.
  • the reconstitution causes the fluorescent protein to be expressed in the cell.
  • the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • first partial peptide and the “second partial peptide” may be any one that can reconstitute a fluorescent protein by binding these peptides in a cell.
  • “reconstruction” refers to a state in which a plurality of partial peptides bind to each other so that the protein that they originally constituted can function (for example, fluorescent protein is fluorescent. It means that the protein can be released, and if it is a protein having multimerization ability, it returns to a state in which a multimer can be formed.
  • Such a reconfigurable partial peptide can be appropriately designed and prepared by those skilled in the art, for example, referring to the description of Cabantous S et al., Nature Biotechnology, 2005, 23, 102-107. can do.
  • the first partial peptide and the second partial peptide may be selected from three or more fragments.
  • the fragments not used as the first and second partial peptides are expressed in the cell or introduced into the cell during the step (1) or the steps (1) and (2). There is a need.
  • the first partial peptide and the second partial peptide may be fused to either the N-terminal or C-terminal of the first or second protein and the protein having multimerization ability.
  • the fusion between the proteins may be direct, and indirectly via a linker or a spacer protein. It may be natural.
  • any of the seventh fusion protein, the eighth fusion protein, and the ninth fusion protein may contain other functional proteins as long as they do not inhibit the formation of aggregates (fluorescent bright spots).
  • the other functional protein is N-terminal, C-terminal or both sides of each fusion protein, or between constituent proteins (for example, the first partial peptide and the first or second protein). Between the second partial peptide and the protein capable of multimerization) directly or indirectly.
  • limiting in particular as another functional protein According to the function to give to the fusion protein concerning this invention like the above-mentioned 1st and 2nd fusion protein, it selects suitably.
  • a fifth aspect of the method for determining protein-protein interaction of the present invention is a method comprising the following steps (1) to (3).
  • An eleventh fusion protein comprising: a fourth partial peptide that can be reconstituted by a protein having multimerization ability by binding to a third partial peptide; and a twelfth fusion protein comprising a fluorescent protein, (2) a step of detecting a fluorescent bright spot generated by association of the tenth fusion protein, the eleventh fusion protein, and the twelfth fusion protein in the cell (2) 3) A step of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • the 1st protein and the 2nd protein interact like the method of using the 1st fusion protein and the 2nd fusion protein mentioned above, between the proteins which have the recombination multimerization ability Multimer formation is induced, whereby the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot.
  • any peptide can be used as long as it can reconstitute a protein having multimerization ability by binding these peptides in the cell.
  • a person skilled in the art will know, as described above, Ohashi K, et al., Biotechniques. 2012, 52, No. 1, pages 45-50, and the like, such partial peptides can be appropriately designed and prepared.
  • the third partial peptide and the fourth partial peptide may be fused to either the N-terminal or C-terminal of the first or second protein and the protein having multimerization ability, respectively.
  • the fusion between the proteins may be direct, or indirectly via a linker or a spacer protein. It may be a natural one.
  • the tenth fusion protein, the eleventh fusion protein and the twelfth fusion protein may all contain other functional proteins as long as they do not inhibit the formation of aggregates (fluorescent bright spots).
  • the other functional protein is N-terminal, C-terminal or both sides of each fusion protein, or between constituent proteins (for example, the third partial peptide and the first or second protein). Between the fourth partial peptide and the fluorescent protein) directly or indirectly.
  • limiting in particular as another functional protein According to the function to give to the fusion protein concerning this invention like the above-mentioned 1st and 2nd fusion protein, it selects suitably.
  • the second to fifth aspects of the method for determining protein-protein interaction of the present invention have been described above.
  • the first fusion protein and the second fusion protein are each divided. Therefore, the molecular weight of the tag such as a protein fused to the first or second protein to be analyzed can be reduced. Therefore, in the determination of the protein-protein interaction and the like, the function of the protein to be analyzed, the change in localization, and the like are less likely to be inhibited.
  • the present invention can be applied in accordance with stimulation such as addition of a compound or light irradiation.
  • stimulation such as addition of a compound or light irradiation.
  • Method 6 for detecting protein-protein interaction When the analysis object is three or more proteins, the method including the following steps (1) to (3) is applied to the method for determining protein-protein interaction by applying the first aspect described above. As a sixth aspect, the present invention can also be provided.
  • a thirteenth fusion protein containing a first protein and a protein having multimerization ability, a fourteenth fusion protein containing a second protein and a protein having multimerization ability, a third protein and a fluorescent protein A step (2) of expressing a fifteenth fusion protein containing the protein in the cell or introducing the fifteenth fusion protein into the cell by the association of the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein and the fifteenth fusion protein in the cell; Step of detecting fluorescent spot (3) A step of determining an interaction between the first protein, the second protein and the third protein by detecting the fluorescent spot.
  • the 13th fusion protein containing the first protein and the protein having multimerization ability, the second protein and the protein having multimerization ability are included.
  • the fourteenth fusion protein and the fifteenth fusion protein including the third protein and the fluorescent protein are expressed in the cell or introduced into the cell, the first protein, the second protein, and the third protein
  • the formation of multimers between proteins having multimerization ability is induced, whereby the fusion protein autonomously forms an aggregate,
  • the contained fluorescent protein is detected as a fluorescent bright spot (see FIG. 7).
  • a desired protein whose interaction is desired to be detected can be used in the same manner as the first and second proteins described above. Further, the first protein, the second protein, and the third protein may be different, two of them may be the same, or all three may be the same.
  • the “interaction between the first protein, the second protein, and the third protein” includes not only a direct interaction but also other molecules (protein, nucleic acid, sugar, lipid) between proteins. Indirect interaction such as formation of a complex via a low molecular weight compound or the like) is also included.
  • the “13th fusion protein” may be any protein including the first protein and the protein having the multimerization ability, and the “14th fusion protein” may include the second protein and the multiple protein. What is necessary is just a protein containing the protein which has quantification ability. In these fusion proteins, as long as the formation of aggregates (fluorescent spots) is not inhibited, the protein having the multimerization ability may be fused to either the N-terminus or C-terminus of the first or second protein, Further, the fusion between the proteins may be direct, or indirect via a linker or a spacer protein.
  • the “fifteenth fusion protein” may be a protein containing a third protein and the fluorescent protein, and the fluorescent protein is a third protein as long as it does not inhibit the formation of an aggregate (fluorescent bright spot). It may be fused to either the N-terminus or C-terminus of the protein. Moreover, the fusion between proteins may be direct, or indirect via a linker or a spacer protein.
  • the present invention can also provide the following method as a seventh aspect for determining protein-protein interaction.
  • a method for determining an interaction between a first protein and a second protein, wherein the protein having the first multimerization ability is different from the protein having the second multimerization ability and A method comprising the following steps (1) to (3) (1) A 16th fusion protein comprising a first protein, a first protein having multimerization ability and a fluorescent protein, a second protein and a second protein Step (2) of expressing or introducing into a cell a 17th fusion protein containing a protein having quantification ability (2) Fluorescence generated by association of the 16th fusion protein and the 17th fusion protein in the cell Step of detecting a bright spot (3) A step of determining an interaction between the first protein and the second protein by detecting the fluorescent bright spot.
  • the “16th fusion protein” and the “17th fusion protein” according to the present invention are different in proteins having a multimerization ability (a protein having a first multimerization ability and a protein having a second multimerization ability). Except for this point, the above-mentioned first fusion protein and second fusion protein are the same proteins. The same applies to the first protein and the second protein, and these proteins may be different or the same. However, as shown in Examples described later, the protein-protein interaction of the present invention is demonstrated. The seventh aspect for determination is more useful when the first protein and the second protein are different.
  • this invention can also provide the method shown below using these methods.
  • the method of the present invention determines not only the occurrence of protein-protein interactions but also the disappearance of protein-protein interactions using the presence or absence of fluorescent bright spots as an index. can do. In addition, the occurrence of such protein-protein interactions can be followed over time. Furthermore, in the present invention, the protein-protein interaction can be determined in any region in the cell without being affected by the localization of the protein having multimerization ability or the fluorescent protein.
  • the present invention provides a method for determining the occurrence or disappearance of a protein-protein interaction, the time until the interaction occurs or disappears, or the duration of the interaction by detecting a fluorescent bright spot. be able to.
  • the present invention it is also possible to specify a region in a cell where the protein-protein interaction occurs. Further, according to the present invention, through the determination of “occurrence or disappearance of protein-protein interaction”, the occurrence and disappearance of signal transduction involving the protein-protein interaction, the time until the occurrence or disappearance of the signal transduction, and the The duration of signal transduction can be determined, and the region in the cell where the signal transduction occurs can also be identified. In addition, the interaction between the first protein and the second protein (or the interaction between the first protein, the second protein, and the third protein) occurs or disappears in response to a specific stimulus. Even so, it can be determined in the present invention.
  • the present invention detects the fluorescent bright spot according to the present invention, thereby generating or disappearing a protein-protein interaction in response to a specific stimulus, the time until the interaction occurs or disappears, or the interaction
  • a method for detecting the fluorescent bright spot can also be provided.
  • the “specific stimulus” may be a stimulus capable of directly or indirectly inducing or inhibiting a protein-protein interaction, and a stimulus by an endogenous factor generated in a cell (for example, intracellular calcium Increase or decrease of ion concentration, activation or inactivation of an enzyme), or external stimulation applied to a cell (for example, administration of a ligand (agonist or antagonist) to a receptor to a cell).
  • an endogenous factor generated in a cell for example, intracellular calcium Increase or decrease of ion concentration, activation or inactivation of an enzyme
  • external stimulation applied to a cell for example, administration of a ligand (agonist or antagonist) to a receptor to a cell.
  • the method of the present invention it is also possible to determine the generation or disappearance of a specific stimulus, the time until the occurrence or disappearance of the stimulus, or the duration of the stimulus by detecting the fluorescent bright spot.
  • the method of the present invention it is also possible to determine the increase or decrease in protein-protein interaction according to the degree of a specific stimulus (for example, the concentration when the specific stimulus is a drug).
  • a specific stimulus for example, the concentration when the specific stimulus is a drug
  • the 50% effective concentration (EC50) and 50% inhibitory concentration (IC50) of that drug on protein-protein interactions can be determined by the present invention.
  • the present invention is a method for screening a protein that interacts with a specific protein, wherein one of the first protein and the second protein is the specific protein, and the other is the test protein.
  • the method is a method for screening a protein that interacts with a specific protein, wherein two of the first to third proteins are selected from the proteins.
  • test protein is not particularly limited. From the viewpoint that a protein that interacts with a specific protein can be selected comprehensively and efficiently, a protein group encoded by a cDNA library can be preferably used.
  • the intensity of the protein-protein interaction can be quantitatively analyzed through the fluorescence intensity of the fluorescent bright spot. Therefore, according to the present invention, the amino acid residue in the first protein or the amino acid residue in the second protein (or the amino acid residue in the first to third proteins) involved in the protein-protein interaction is A method for identifying a protein in which a mutation is introduced into any of the first protein and the second protein (or a protein in which a mutation is introduced into any of the first to third proteins) When the intensity of the fluorescent luminescent spot is attenuated compared to the case of using a protein into which a mutation has not been introduced, a method for determining that the amino acid residue into which the mutation has been introduced is involved in the interaction Can be provided.
  • the “fluorescence intensity of a fluorescent luminescent spot” includes not only the fluorescent intensity of one fluorescent luminescent spot but also within a certain region (for example, in one cell, in one field of view in a fluorescence microscope observation, in one fluorescent image). The total fluorescence intensity of the existing fluorescent bright spots is also included.
  • a protein in which a mutation is introduced into the first protein can be performed by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • known techniques include site-directed mutagenesis.
  • the intensity of the protein-protein interaction can be grasped using the fluorescence intensity of the fluorescent bright spot as an index. Therefore, according to the present invention, in the presence of a test compound, the step of expressing or introducing the first fusion protein and the second fusion protein into the cell, Detecting a fluorescent bright spot generated by association of the first fusion protein and the second fusion protein in the cell; When the intensity of the fluorescent bright spot is higher than the intensity of the fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound, the test compound is selected as an inducer of the interaction, and the intensity of the fluorescent bright spot is When the intensity of the fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound is attenuated, the step of selecting the test compound as a substance that suppresses the interaction; Can be provided.
  • test compound used in the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • the state in the presence of the test compound is, for example, a state in which the test compound and the cell according to the present invention are in contact with each other by adding the test compound to the medium, or the test compound according to the present invention.
  • the state introduced into the cell is mentioned.
  • the screening method of the present invention is not limited to the above embodiment as long as the intensity of the fluorescent bright spot is used as an index. Therefore, the following mode can be taken as another mode.
  • the seventh fusion protein, the eighth fusion protein, and the ninth fusion protein in the cell or introducing them into the cell in the presence of the test compound; Detecting a fluorescent bright spot generated by the association of the seventh fusion protein, the eighth fusion protein, and the ninth fusion protein in the cell; When the intensity of the fluorescent bright spot is higher than the intensity of the fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound, the test compound is selected as an inducer of the interaction, and the intensity of the fluorescent bright spot is And a step of selecting the test compound as a substance that suppresses the interaction when the intensity is lower than the intensity of a fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound.
  • the test compound Expressing the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein, and the fifteenth fusion protein in the cell or introducing them into the cell in the presence of the test compound; Detecting a fluorescent bright spot generated by the association of the thirteenth fusion protein, the fourteenth fusion protein, and the fifteenth fusion protein in the cell; When the intensity of the fluorescent bright spot is higher than the intensity of the fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound, the test compound is selected as an inducer of the interaction, and the intensity of the fluorescent bright spot is And a step of selecting the test compound as a substance that suppresses the interaction when the intensity is lower than the intensity of a fluorescent bright spot generated in the absence of the test compound.
  • the present invention can provide a kit for use in the above method.
  • the kit of the present invention is a kit comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use.
  • A DNA that encodes a protein having multimerization ability, DNA that encodes a fluorescent protein, and a cloning site, and the DNA that encodes any protein is inserted into the cloning site.
  • B a vector encoding a first fusion protein
  • c a vector encoding a second fusion protein
  • d A) a transformed cell holding a vector encoding the first fusion protein;
  • e a transformed cell holding a vector encoding the second fusion protein; and
  • the first of the fusion protein h) a second fusion protein.
  • the vector according to the present invention may be any vector as long as it contains a control sequence necessary for expressing (transcription and translation) of the inserted DNA in the above-described cells.
  • control sequences include promoters, enhancers, silencers, terminators, poly A tails, and ribosome binding sequences (Shine-Dalgarno (SD) sequences).
  • the vector according to the present invention may contain a selection marker (such as a drug resistance gene) and a reporter gene (such as a luciferase gene, ⁇ -galactosidase gene, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene).
  • a selection marker such as a drug resistance gene
  • reporter gene such as a luciferase gene, ⁇ -galactosidase gene, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene.
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase
  • the protein encoded in the vector according to the present invention is each of the above-mentioned fusion proteins, etc. From the viewpoint of further improving the expression efficiency of such a protein, the codon is optimized in accordance with the cell type in which the protein is expressed.
  • DNA for example, DNA whose codons are humanized
  • the vector according to the present invention can be prepared by a person skilled in the art by appropriately using a known technique such as a DNA chemical synthesis method or a gene recombination technique, as shown in the Examples described later.
  • Examples of the “cloning site enabling insertion of DNA encoding any protein” described in (a) above include, for example, a multi-cloning site including one or a plurality of restriction enzyme recognition sites, a TA cloning site, and GATEWAY (registered). Trademark) cloning sites.
  • the fusion protein according to the present invention can be obtained by a person skilled in the art based on the nucleotide sequences of these fusion proteins, such as a cell-free protein synthesis system (for example, reticulocyte extract, wheat germ extract), E. coli, animal cells, insect cells, It can be synthesized and prepared by genetic techniques using plant cells and the like. Moreover, the fusion protein concerning this invention can be chemically synthesize
  • a buffer solution a stabilizer, a preservative, and a preservative may be added.
  • the transformed cell according to the present invention can be prepared by introducing the vector according to the present invention into the cell.
  • the preparation of the transformed cell according to the present invention may contain other components such as a medium, a stabilizer, a preservative, and an antiseptic necessary for storage and culture of the cell.
  • the “instruction for use” according to the present invention is an instruction for using the vector or the transformed cell in the method of the present invention.
  • the instructions include, for example, experimental methods and conditions of the method of the present invention, and information on the preparation of the present invention (for example, information such as a vector map showing the base sequence and cloning site of the vector, transformed cells, etc. Information on the origin, nature, and culture conditions of the cells).
  • kit of the present invention is not limited to the above-described embodiment, and may take the following aspects according to the embodiment for determining the protein-protein interaction described above.
  • Kit for use in second method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of (a) to (h) below and instructions for use (a) Multimerization
  • a fusion protein comprising the protein having the ability to multimerize and a fusion protein comprising the arbitrary protein by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site.
  • a vector that can be expressed (b) a vector that encodes a third fusion protein (c) a vector that encodes a fourth fusion protein (d) a vector that encodes a fifth fusion protein (e) a fifth fusion protein (F) the third fusion protein (g) the fourth fusion Protein (h) Fifth fusion protein.
  • Kit for use in third method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use (a) Affinity tag A vector capable of expressing a fusion protein containing the affinity tag by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site, and (b) a first label (C) a vector encoding the second labeled protein (d) a vector encoding the sixth fusion protein to which the binding partner is bound (e) the binding partner binding A transformed cell carrying a vector encoding the sixth fusion protein (f) Protein (g) a second labeled protein (h) a sixth fusion protein in which the binding partner is bound.
  • Affinity tag A vector capable of expressing a fusion protein containing the affinity tag by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site, and (b) a first label (C) a vector encoding the second labeled protein (d) a vector en
  • a kit for use in a fourth method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use: (a) First A vector capable of expressing a fusion protein containing the first partial peptide by inserting a DNA encoding any protein into the cloning site and inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site (b) (C) a vector encoding the seventh fusion protein (c) a vector encoding the eighth fusion protein (d) a vector encoding the ninth fusion protein (e) a trait carrying a vector encoding the ninth fusion protein Converted cells (f) Seventh fusion protein (g) Eighth fusion protein (h) Ninth fusion protein.
  • Kit for use in fifth method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use (a) Third A vector capable of expressing a fusion protein containing a third partial peptide by inserting a DNA encoding a partial peptide and a cloning site into which a DNA encoding an arbitrary protein is inserted.
  • Kit for use in sixth method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (h) and instructions for use: (a) Multimerization A vector capable of expressing a fusion protein containing a protein having a multimerization ability by inserting a DNA encoding a protein having an ability and a cloning site into which a DNA encoding an arbitrary protein is inserted.
  • a vector that includes a DNA encoding a fluorescent protein and a cloning site, and allows expression of a fusion protein containing the fluorescent protein by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the cloning site (c) A vector encoding the thirteenth fusion protein (d) the fourteenth fusion protein A vector encoding a protein (e) a vector encoding a fifteenth fusion protein (f) a thirteenth fusion protein (g) a fourteenth fusion protein (h) a fifteenth fusion protein.
  • a kit for use in the seventh method for determining protein-protein interaction comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (f) and instructions for use: (a) First A DNA encoding a protein having multimerization ability, a DNA encoding a fluorescent protein, and a cloning site, and a DNA encoding an arbitrary protein is inserted into the cloning site, whereby the first multimerization A vector capable of expressing a fusion protein comprising a protein having an ability, the fluorescent protein and the arbitrary protein (b) a DNA encoding a protein having a second multimerization ability, and a DNA encoding a fluorescent protein; A DNA encoding an arbitrary protein is inserted into the cloning site. (C) a vector encoding the sixteenth fusion protein (d) the seventeenth vector. (E) 16th fusion protein (f) 17th fusion protein
  • Example 1 In determining the interaction between two proteins (the first protein and the second protein), the present inventors have a first fusion protein comprising a first protein, a protein having multimerization ability, and a fluorescent protein; The use of a second fusion protein containing a second protein and a protein having multimerization ability was conceived (see FIG. 1). More specifically, when these two fusion proteins are expressed in a cell, if the first protein and the second protein interact, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced. Thus, the construction of a system in which the fusion protein autonomously forms an aggregate and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot was considered.
  • mAG1 monomer thistle green 1
  • an FKBP12 protein mutant known to form a homodimer by adding a drug was used. That is, in this verification, the first protein and the second protein are the same protein, and the first fusion protein and the second fusion protein are the same protein.
  • Expression vectors (pPB1-hmAG1-MLinker and phmAG1-PB1-MCLinker) encoding a protein tag (mAG1-PB1) formed by fusing mAG1 at the N-terminus were prepared.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 in which restriction enzyme sites are arranged at both ends of DNA consisting of a nucleotide sequence encoding PB1-mAG1 (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28).
  • the DNA consisting of was artificially synthesized.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 in which restriction enzyme sites are arranged at both ends of DNA consisting of a nucleotide sequence encoding mAG1-PB1 (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30). The DNA consisting of was artificially synthesized.
  • the synthetic DNA thus obtained was cleaved with NheI and AgeI, and inserted into phmAG1-MLinker (manufactured by Amalgaam Co., Ltd.) treated with the same restriction enzyme in combination, whereby pPB1-hmAG1-MCLinker and Each of phmAG1-PB1-MLinker was constructed.
  • pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant fused with PB1-mAG1 was prepared. That is, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 in which restriction enzyme sites are arranged at both ends of DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the FKBP12 variant (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32). The DNA consisting of was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into the pPB1-hmAG1-MLinker treated with the same combination of restriction enzymes, thereby constructing a pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant.
  • HEK293 cells were cultured in DMEM (high glucose, manufactured by SIGMA ALDRICH) supplemented with 10% FBS (manufactured by EQUITECH) and 1% penicillin streptomycin (manufactured by Lifetechnology).
  • DMEM high glucose, manufactured by SIGMA ALDRICH
  • FBS manufactured by EQUITECH
  • penicillin streptomycin manufactured by Lifetechnology
  • HEK293 cells cultured in this way were seeded on 8-well chamber slides (manufactured by Nunc), and cultured in a culture solution of 200 ⁇ L per well.
  • pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant 100 ng was diluted in 10 ⁇ L of OptiMEM (manufactured by Life Technologies), and 0.4 ⁇ L of turbofect transfection reagent (Turbofect, manufactured by Thermo Scientific) was added and stirred. Then, it was further mixed with 100 ⁇ L of the culture solution, added to HEK293 cells, and cultured for 20 hours.
  • OptiMEM manufactured by Life Technologies
  • HEK293 cells subjected to the gene introduction treatment were subjected to IX-71 inverted microscope (manufactured by Olympus, objective lens magnification: 20 times), U-MGGFPQ filter (manufactured by Olympus), and ORCA-ER digital camera (manufactured by Hamamatsu Photonics). ).
  • FKBP12 mutant homodimer formation was induced by adding 500 nM B / B homodimerizer (AP20187, B / B Homomerizer, manufactured by Takara Bio Inc.) to the medium. In addition, images were acquired over time after drug addition. The obtained results are shown in FIG.
  • a PB1 domain of the p62 protein is selected as the association-inducing protein, AG is selected as a fluorescent protein having multimerization ability, and a DNA encoding a humanized codon (hAG ) was used.
  • an expression vector (pPB1-FKBP12 mutant) encoding a fusion protein obtained by fusing the FKBP12 mutant to the C terminus of the PB1 domain of the p62 protein was prepared as follows. That is, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 in which restriction enzyme sites are arranged at both ends of DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the FKBP12 variant (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32). The DNA consisting of was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MCLinker (manufactured by Medical and Biological Laboratories) treated with the same restriction enzyme in combination, whereby the pPB1-FKBP12 mutant was obtained. It was constructed.
  • an expression vector (phAG-FKBP12 mutant) encoding a fusion protein formed by fusing the FKBP12 mutant with the C protein terminus of the AG protein was obtained in the same manner as described above using phAG-MCLinker (Medical and Biological Laboratories). Manufactured by inserting a synthetic DNA encoding the FKBP12 mutant.
  • Example 2 Next, it was verified whether or not reversible formation of a homodimer can be determined by the method of the present invention, that is, whether or not a fluorescent luminescent spot once formed disappears upon elimination of the homodimer.
  • the FKBP12 protein mutant homodimer induced and formed by the aforementioned B / B homodimerizer is resolved by the B / B washout ligand (B / B Washout Ligand, manufactured by Takara Bio Inc.). It has been known. Therefore, the verification was performed using the following materials and methods.
  • PB1-hmAG1-FKBP12 mutant was introduced into HEK293 cells to produce cells that constitutively express the fusion protein according to the present invention (PB1-hmAG1-FKBP12 mutant). That is, the day before the introduction of the expression vector, HEK293 cells were seeded in a 35 mm dish (manufactured by BD Falcon) and cultured in 1.5 mL of the culture medium.
  • pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant was diluted in 100 ⁇ L of OptiMEM (manufactured by Life Technologies), 10 ⁇ L of Polyfect (registered trademark) transfection reagent (manufactured by QIAGEN) was added, and the mixture was stirred. Next, the mixture was further mixed with 600 ⁇ L of the culture solution, added to HEK293 cells, and cultured for 20 hours. Then, G418 was added so that it might become a 500 microgram / mL density
  • the surviving cells were detached with a trypsin solution, diluted with a culture solution containing G418 (500 ⁇ g / ml) so as to be 0.5 cells / well, and then cultured in a 96-well plate. And the cell which formed the single colony was expanded and cultured.
  • the value of the fluorescence intensity when starting to confirm the generation of the fluorescent bright spot under the microscope observation was 1.9 times that value before the addition, It was clarified that if a value of at least twice the fluorescence intensity in a negative control (for example, a cell before the protein-protein interaction occurs) can be detected, a fluorescent bright spot indicating a protein-protein interaction has occurred.
  • the present invention it has also been clarified that reversible changes in protein-protein interactions can be determined using the occurrence and disappearance of detected fluorescent bright spots as an index.
  • the fluorescent bright spots gradually increase or decrease with the passage of time, it has been clarified that the protein-protein interaction can be quantitatively analyzed according to the present invention.
  • the fusion protein according to the present invention was introduced into a cell and a cell that constantly expresses the fusion protein could be produced, it was confirmed that the protein tag contained in the fusion protein does not exhibit cytotoxicity or the like. It was.
  • Example 3 It was verified by the following materials and methods whether homomultimer formation could also be determined according to the present invention. This verification was performed for the formation of homomultimers of the p53 protein (for the homomultimer formation, see Yoko Itana et al., J Biol Chem., 2009, 284, No. 8, pages 5158-5164. )
  • a BamHI recognition sequence, a stop codon and a NotI recognition sequence are present at the 5 ′ end and the 3 ′ end of a nucleotide sequence encoding p53 (NCBI RefSeq accession number: nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence described in NP_000537), respectively.
  • An added nucleotide sequence was designed.
  • DNA comprising the nucleotide sequence is artificially synthesized, cut with BamHI and NotI, and then inserted into phmAG1-PB1-MCLinker and phmAG1-MCLinker (manufactured by Amalgaam Co., Ltd.) treated with the same combination of restriction enzymes.
  • phmAG1-PB1-p53 and phmAG1-p53 were prepared.
  • the synthetic DNA obtained by removing the stop codon from the synthetic DNA encoding p53 was cleaved with BamHI and NotI, and then treated with the same combination of restriction enzymes, phmAG1-PB1-MNLinker and phmAG1-MNLinker (Amalgaam Limited Pp53-hmAG1-PB1 and pp53-hmAG1 were prepared.
  • U2OS cells were selected as cells into which the expression vector prepared above was introduced.
  • the cells were added with DMEM (high glucose, 10% FBS (EQUITECH) and 1% penicillin / streptomycin (Lifetechnology)). Cultivated by SIGMA ALDRICH). The day before the introduction of the expression vector, these cells were seeded on a 35 mm dish (manufactured by BD Falcon) and cultured in a 1.5 ml culture solution.
  • an expression vector (phmAG1-PB1-p53, phmAG1-p53, pp53-hmAG1-PB1 or pp53-hmAG1) is diluted with 100 ⁇ L of OptiMEM (manufactured by Life Technologies), and the Polyfect® transfection reagent (trademark) 10 ⁇ L of QIAGEN) was added and stirred. After further mixing with 600 ⁇ L of the culture solution, each expression vector mixed solution was added to the cultured cells, and further cultured for 20 hours.
  • OptiMEM manufactured by Life Technologies
  • Example 4 It was confirmed that the system shown in FIG. 1 is effective not only in the formation of the above-mentioned homomultimer but also in the determination of heteromultimer formation.
  • the target of detection in this verification is the interaction between the p53 protein and the MDM2 protein, and Nutlin-3 (nutrin-3), which is known as an inhibitor of the interaction, is also used in this verification experiment. (See Vassilev LT et al., Science, February 6, 2004, 303, 5659, pages 844-848). Furthermore, in this confirmation experiment, the PB1 domain of p62 protein was used as the protein having the above-mentioned multimerization ability, and the mAG1 protein was used as the fluorescent protein.
  • pPB1-p53 (70) ⁇ Preparation of pPB1-p53 (70)>
  • PB1-p53 (70) a partial peptide of p53 fused with the PB1 domain of the p62 protein at the N-terminus as a second fusion protein in cells
  • pPB1-p53 (70) is as follows. Vector was prepared.
  • pPB1-p53 In the preparation of pPB1-p53 (70), first, a part of p53 (region consisting of 1 to 70 amino acids of p53 protein (p53 (70)), region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34) is encoded. A nucleotide sequence was designed in which a BamHI recognition sequence was added to the 5 ′ end of the DNA, and a stop codon and NotI recognition sequence were added to the 3 ′ end of the DNA. Then, a DNA comprising the nucleotide sequence was artificially synthesized, cleaved with BamHI and NotI, and then inserted into pAsh-MCLinker treated with the same combination of restriction enzymes.
  • a pPB1-hmAG1-MDM2 vector is prepared as follows. did.
  • pPB1-MDM2 was cleaved with BamHI and NotI and then inserted into pPB1-hmAG1-MCLinker treated with the same restriction enzyme combination.
  • This is a plasmid vector for expressing the fused MDM2 protein (PB1-MDM2) as the second fusion protein.
  • PB1-MDM2 fused MDM2 protein
  • pp53 (70) -hmAG1-PB1 ⁇ Production of pp53 (70) -hmAG1-PB1>
  • pp53 A (70) -hmAG1-PB1 vector was prepared.
  • nucleotide sequences were designed in which a BamHI recognition sequence and a NotI recognition sequence were added to the 5 'end and 3' end of the DNA encoding the p53 (70), respectively.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence was artificially synthesized, cut with BamHI and NotI, and then inserted into phmAG1-PB1-MNLinker treated with the same combination of restriction enzymes.
  • HEK293 cells were cultured in a culture solution (DMEM high glucose (manufactured by SIGMA ALDRICH), 10% FBS (manufactured by EQUITECH), 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Lifetechnology)).
  • DMEM high glucose manufactured by SIGMA ALDRICH
  • FBS manufactured by EQUITECH
  • penicillin / streptomycin manufactured by Lifetechnology
  • HEK293 cells subjected to gene transfer treatment were observed using an IX-81 inverted microscope, U-MNIBA3 filter (Olympus), ORCA-Flash 4.0 digital camera (Hamamatsu Photonics).
  • Nutrin-3 was added to the culture to a final concentration of 40 ⁇ M. After the drug was added, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the cells were observed. Images before and after addition of Nutrin-3 are shown in FIGS. 15 and 16.
  • Example 4 it was confirmed that the protein tag according to the present invention functions even when fused to either the N-terminal or C-terminal of the protein to be analyzed.
  • Example 5 The effectiveness of the system shown in FIG. 1 in determining the protein-protein interaction was confirmed by the following method.
  • the target for detection in this verification is the FRB domain of the mTOR protein (hereinafter also referred to as “mTOR (FRB domain)”) and the FKBP12 protein, which interact in the presence of rapamycin. (See Chen J et al., Proc Natl Acad Sci USA, May 23, 1995, Vol. 92, No. 11, pages 4947-4951).
  • the PB1 domain of p62 protein was used as the protein having the above-mentioned multimerization ability
  • mAG1 protein was used as the fluorescent protein.
  • pPB1-hmAG1-FKBP12 a vector for expressing a protein (PB1-mAG1-FKBP12) in which the PB1 domain of the p62 protein and the mAG1 protein are fused to the N-terminus of the FKBP12 protein.
  • pPB1-FKBP12 A vector was prepared as follows.
  • pPB1-FKBP12 was cleaved with BamHI and NotI and then inserted into pPB1-hmAG1-MCLinker treated with the same combination of restriction enzymes to prepare pPB1-hmAG1-FKBP12.
  • pmTOR (FRB domain) -PB1 A vector (pmTOR (FRB domain) -PB1) for expressing a protein (mTOR (FRB domain) -PB1) in which the PB1 domain of the p62 protein is fused to the C-terminal of the FRB domain of the mTOR protein is as follows. It was prepared as follows. EcoRI and XhoI recognition sites are located at both ends of the nucleotide sequence encoding a part of the mTOR protein (region consisting of amino acids 2025 to 2114 of the mTOR protein, polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41). The arranged DNA was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same combination of restriction enzymes, thereby expressing an expression vector (pmTOR (FRBFRB)) that encodes mTOR (FRB domain) -PB1. domain) -PB1).
  • pmTOR FRBFRB
  • Example 4 it was confirmed that according to the present invention, not only homomultimer formation as shown in Examples 1 to 3 but also interactions between different proteins can be detected.
  • Example 6 The effectiveness of the system shown in FIG. 2 in determining the protein-protein interaction was confirmed by the following method.
  • the target of detection in this verification was the interaction between the p53 protein and the MDM2 protein, and Nutrin-3, which is known as an inhibitor of the interaction, was also used in this confirmation experiment.
  • the PB1 domain of p62 protein was used as the protein having the multimerization ability.
  • mAG1 protein was used as a fluorescent protein, and a fusion protein obtained by binding the fluorescent protein directly or indirectly to both p53 protein and MDM2 protein was used.
  • pPB1hmAG1-MNLinker A DNA (DNA consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 27) having NheI and AgeI recognition sites arranged at both ends of a DNA fragment encoding a protein fused with MAG at the C-terminus of the PB1p62 protein PB1 domain Artificially synthesized.
  • the DNA was cleaved with NheI and AgeI and inserted into pAsh-MNLinker excluding DNA encoding the PB1 domain of the PB1p62 protein to prepare a pPB1hmAG1-MNLinker plasmid vector.
  • pp53 (70) -PB1-hmAG1 ⁇ Production of pp53 (70) -PB1-hmAG1>
  • pp53 ( 70) -PB1-hmAG1 vector was prepared.
  • nucleotide sequences were designed in which a BamHI recognition sequence and a NotI recognition sequence were added to the 5 'end and 3' end of DNA encoding p53 (70), respectively. Then, a DNA comprising the nucleotide sequence was artificially synthesized, cut with BamHI and NotI, and then inserted into pPB1-hmAG1-MNLinker treated with the same combination of restriction enzymes.
  • HEK293 cells subjected to gene transfer treatment were observed by the same method as described in Example 4. That is, as an inhibitor of the protein-protein interaction between p53 and MDM2, Nutrin-3 was added to the culture solution to a final concentration of 40 ⁇ M. After the drug was added, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the cells were observed. Images before and after the addition of Nutrin-3 are shown in FIGS. 18 and 19.
  • Example 7 The effectiveness of the system shown in FIG. 2 in determining the protein-protein interaction was confirmed by the following method.
  • the target of detection in this verification was a protein-protein interaction between mTOR (FRB domain) and FKBP12 protein, and rapamycin that induces the interaction was also used in this system.
  • the PB1 domain of the p62 protein was used as the protein having the multimerization ability, and the mAG1 protein was used as the fluorescent protein.
  • pmTOR (FRB domain) -hmAG1-PB1 A vector (pmTOR (FRB domain) -hmAG1-PB1) for expressing a protein (mTOR (FRB domain) -mAG1-PB1) in which the CAG terminus of the FRB domain of the mTOR protein is fused with the PB1 domain of the mAG1 and p62 proteins ) was prepared as follows.
  • PmTOR (FRB domain) -PB1 was cleaved with BamHI and NotI, and the mTOR (FRB domain) fragment was purified. Then, the fragment was inserted into phmAG1-PB1-MNLinker treated with the same combination of restriction enzymes to prepare pmTOR (FRB domain) -hmAG1-PB1.
  • HEK293 cells subjected to gene transfer treatment were observed by the same method as described in Example 5. That is, rapamycin was added to the culture solution to a final concentration of 500 nM as an inducer of protein-protein interaction between mTOR (FRB domain) and FKBP12. After the drug was added, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the cells were observed. Images before and after the addition of each drug are shown in FIGS.
  • Example 8 The fluorescent protein in Example 1 was changed from mAG1 to DG1 or mCherry, and it was confirmed by the following method that the fluorescent protein used in the present invention was not limited to mAG1.
  • a vector (pPB1-hDG1-FKBP12 mutant) for expressing a protein (PB1-DG1-FKBP12 mutant) in which the PB1 domain of the p62 protein and the Dronpa-Green1 fluorescent protein are fused at the N-terminus of the FKBP12 mutant It was prepared as follows.
  • a DNA sequence encoding DG1 (protein consisting of the amino acid sequence described in GenBank accession number: BAD72874) and having a SpeI recognition sequence at the 5 'end and an AgeI recognition sequence at the 3' end was artificially synthesized. Subsequently, the obtained DNA is cleaved with these restriction enzymes, treated with the same restriction enzyme combination, and inserted into the pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant from which the hmAG1 portion has been removed, whereby the pPB1-hDG1-FKBP12 mutant is obtained.
  • DG1 protein consisting of the amino acid sequence described in GenBank accession number: BAD72874
  • a vector (pPB1-mCherry-FKBP12 mutant) for expressing a protein (PB1-mCherry-FKBP12 mutant) in which the PB1 domain of the p62 protein and the mCherry fluorescent protein are fused to the N-terminus of the FKBP12 mutant is shown below. Prepared as follows.
  • a SpeI recognition sequence and an AgeI recognition sequence are provided at the 5 ′ end and 3 ′ end of DNA encoding mCherry (a protein comprising the amino acid sequence described in GenBank accession number: AAV52164).
  • the nucleotide sequence added to each was designed.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence is artificially synthesized, cut with SpeI and AgeI, treated with the same restriction enzyme combination, and inserted into the pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant excluding the hmAG1 portion, A pPB1-mCherry-FKBP12 mutant was generated.
  • Example 9 In the present invention, it was confirmed that a protein other than the PB1 domain of the p62 protein can be used as a protein having multimerization ability. That is, in the method described in Example 1, using the SAM domain of Tankyrase1 protein instead of the PB1 domain, detection of homodimer formation of the FKBP12 protein mutant was performed using the following materials and methods. It was.
  • a vector (pTankylase-hmAG1-FKBP12 mutant) for expressing a protein (Takyrase-mAG1-FKBP12 mutant) in which the SAM domain of the Tankyase1 protein and mAG1 are fused to the N-terminus of the FKBP12 mutant is as follows. It was prepared as follows.
  • Takyrase-mAG1 a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 43
  • a DNA sequence having an AgeI recognition sequence was artificially synthesized and cleaved with NheI and AgeI.
  • the pTankyase-hmAG1-FKBP12 mutant vector was prepared by treating with the same restriction enzyme and inserting it into the pPB1-hmAG1-FKBP12 mutant excluding the PB1-hmAG1 portion.
  • HEK293 cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin streptomycin. And it seed
  • DMEM high glucose
  • FBS penicillin streptomycin
  • Example 10 Similarly to Example 9, in the present invention, it was confirmed that a protein other than the PB1 domain of the p62 protein can be used as a protein having multimerization ability. That is, in the method described in Example 3, using the SAM domain of Tankyrase1 protein, the PB1 domain of PKCiota protein, the SAM domain of TEL protein, or the SAM domain of DGKdelta protein instead of the PB1 domain, The body formation was detected by the following materials and methods.
  • a vector (pTankylase-hmAG1-p53) for expressing a protein (Takyrase-mAG1-p53) in which the SAM domain of mTa1 was fused to the N-terminus of p53 and mAG1 was prepared as follows.
  • Takyrase-mAG1 a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 43
  • NheI recognition sequence at the 5 ′ end and the 3 ′ end
  • a DNA sequence having an AgeI recognition sequence was artificially synthesized and cleaved with NheI and AgeI.
  • the pTankyase-hmAG1-p53 vector was prepared by treating with the same restriction enzyme and inserting it into phmAG1PB1-p53 excluding the hmAG1PB1 part.
  • a vector (pTakyrase-hmAG1-p53) for expressing a protein (PKCi-mAG1-p53) in which the PB1 domain of PKCiota protein and mAG1 were fused at the N-terminus of p53 was prepared as follows.
  • PKCi-mAG1 a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 45
  • mAG1 is fused to the C-terminus of the PB1 domain of the PKCiota protein, and the NheI recognition sequence at the 5 ′ end and the 3 ′ end.
  • a DNA sequence having an AgeI recognition sequence was artificially synthesized and cleaved with NheI and AgeI. Thereafter, the pPKCi-hmAG1-p53 vector was prepared by treating with the same restriction enzyme and inserting it into phmAG1PB1-p53 excluding the hmAG1-PB1 part.
  • a vector (pTEL-hmAG1-p53) for expressing a protein (TEL-mAG1-p53) in which the SAM domain of TEL protein and mAG1 were fused to the N-terminus of p53 was prepared as follows.
  • TEL-mAG1 a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 47
  • TEL-mAG1 a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 47
  • NheI recognition sequence a DNA sequence having an AgeI recognition sequence was artificially synthesized and cleaved with NheI and AgeI.
  • the pTEL-hmAG1-p53 vector was prepared by treating with the same restriction enzyme and inserting it into phmAG1-PB1-p53 excluding the hmAG1-PB1 part.
  • a vector (pDGKd-hmAG1-p53) for expressing a protein (DGKd-mAG1-p53) in which the SAM domain of DGKdelta protein and mAG1 were fused at the N-terminus of p53 was prepared as follows.
  • DGKd-mAG1 a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49
  • DGKd-mAG1 a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49
  • a DNA sequence having an AgeI recognition sequence was artificially synthesized and cleaved with NheI and AgeI.
  • the pDGKd-hmAG1-p53 vector was prepared by treating with the same restriction enzyme and inserting it into phmAG1PB1-p53 excluding the hmAG1-PB1 part.
  • HEK293 cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin streptomycin. Then, on the day before gene introduction, the cells were seeded on an 8-well chamber slide and cultured in a 200 ⁇ L culture medium per well. Next, a DNA solution in which 200 ng of plasmid was mixed with 10 ⁇ L of OptiMEM was prepared, and 0.8 ⁇ l of Fugene HD was added, followed by stirring. This was further mixed with 100 ⁇ l of the culture solution, added to HEK293 cells, and cultured for 48 hours.
  • DMEM high glucose
  • FBS penicillin streptomycin
  • Example 11 According to the present invention, it was confirmed by the method shown below that a homodimer formed depending on signal transduction can be detected.
  • a signal transduction pathway involving EGF, GPCR, etc. is activated, ERK2 located downstream thereof is phosphorylated and activated. With this activation, ERK2 is known to form a homodimer (Harvey CD et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 49, 19264-19269, Khoklatchev AV et al. Cell, 1998, Vol. 93, No. 4, pages 605-615). Therefore, the present invention attempted to detect the formation of the homodimer.
  • Vectors for expressing proteins (ERK2-mAG1-PB1 and ERK2-PB1-mAG1) fused with the PB1 domain of mAG1 and p62 protein at the C-terminus of ERK2 ) were prepared as follows.
  • a nucleotide sequence obtained by adding an XhoI recognition sequence and a NotI recognition sequence to the 5 ′ end and 3 ′ end of a nucleotide sequence encoding ERK2 (NCBI RefSeq accession number: protein consisting of the amino acid sequence described in NP_002736.3), respectively. Designed. Next, DNA comprising the nucleotide sequence was artificially synthesized and cleaved with XhoI and NotI. Further, phmAG1-PB1-MNLinker and pPB1-hmAG1-MNLinker were treated with the same combination of restriction enzymes.
  • vectors encoding ERK2-mAG1-PB1 and ERK2-PB1-mAG1 were prepared.
  • HEK293 cells were selected as cells into which the expression vector prepared above was introduced.
  • these cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS (manufactured by EQUITECH) and 1% penicillin / streptomycin. The day before the introduction of the expression vector, these cells were seeded in a 35 mm dish and cultured in 1.5 ml of a culture solution.
  • 1 ⁇ g of the expression vector (pERK2-hmAG1-PB1 or pERK2-PB1-hmAG1) was diluted with 100 ⁇ L of OptiMEM, and 10 ⁇ L of Polyfect (registered trademark) transfection reagent was added, followed by stirring.
  • each expression vector solution was added to the cultured cells.
  • the pERK2-hmAG1PB1-introduced cells were observed 20 hours after the introduction of the vector.
  • G418 was added to a concentration of 500 ⁇ g / mL, and further cultured for 1 week.
  • the surviving cells were detached with a trypsin solution, diluted with a culture solution containing G418 (500 ⁇ g / ml) so as to be 0.5 cells / well, and then cultured in a 96-well plate. And the cell which formed the single colony was expanded and cultured.
  • HEK293 cells subjected to the gene transfer treatment were cultured in a pH 7.4 buffer solution comprising Hanks balanced salt solution and 20 mM HEPES for 4 hours to obtain a serum starved state. Thereafter, observation was performed using an IX-71 inverted microscope (magnification of objective lens: 20 times), a U-MGGFPQ filter, and an ORCA-ER digital camera.
  • ERK2 homodimer formation was induced by adding EGF (epidermal growth factor, Sigma-Aldrich) to the same buffer to a final concentration of 50 ng / ml. Images before EGF addition and 8 minutes after addition are shown in FIGS.
  • ERK2 homodimer formation accompanying activation of the intracellular signal transduction pathway can be detected.
  • the activation associated with phosphorylation of ERK2 and thus the activation of a signal transduction pathway involving EGF and the like upstream thereof can be detected by the present invention through detection of fluorescent bright spots.
  • Example 12 it was confirmed by the method shown below that a homodimer formed depending on signal transduction can be detected. That is, when a signal transduction pathway involving IL-6 or the like is activated, STAT3 located downstream thereof is phosphorylated and activated. With this activation, STAT3 forms a homodimer, and it is known that extracellular signals are transmitted into the nucleus (Becker S et al., Nature, 1998, 394, 6689, 145-151 pages, see Johnston PA et al., Mol Interv., 2011, Vol. 11, No. 1, pages 18-26). Thus, the present invention attempted to detect STAT3 homodimer formation. In this confirmation experiment, the PB1 domain of the p62 protein was used as the protein having multimerization ability, and the mAG1 protein was used as the fluorescent protein.
  • a vector (pPB1-hmAG1-STAT3) for expressing a protein (PB1-mAG1-STAT3) in which the PB1 domain of p62 protein and mAG1 were fused to the N-terminus of STAT3 was prepared as follows.
  • An XhoI recognition sequence is added to the 5 ′ end of the nucleotide sequence encoding STAT3 (NCBI RefSeq accession number: NP_6444855.1 protein), and a stop codon and NotI are added to the 3 ′ end of the nucleotide sequence.
  • a nucleotide sequence with a recognition sequence added was designed. Then, DNA comprising the nucleotide sequence is artificially synthesized, cut with XhoI and NotI, and then treated with the same combination of restriction enzymes, and inserted into pPB1-hmAG1-MCLinker to produce pPB1-hmAG1-STAT3 did.
  • HEK293 cells were selected as cells into which the expression vector prepared above was introduced.
  • the cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin. The day before the introduction of the expression vector, these cells were seeded in a 35 mm dish and cultured in 1.5 ml of a culture solution.
  • 1 ⁇ g of the expression vector (pPB1-hmAG1-STAT3) was diluted with 100 ⁇ L of OptiMEM, and 10 ⁇ L of Polyfect (registered trademark) transfection reagent was added, followed by stirring. Further, after mixing with 600 ⁇ L of the culture solution, each expression vector mixed solution was added to the cultured cells.
  • G418 was added so that it might become a 500 microgram / mL density
  • the surviving cells were detached with a trypsin solution, diluted with a culture solution containing G418 (500 ⁇ g / ml) so as to be 0.5 cells / well, and then cultured in a 96-well plate. And the cell which formed the single colony was expanded and cultured.
  • the HEK293 cells constitutively expressing the PB1-mAG1-STAT3 were cultured in a pH 7.4 buffer solution consisting of Hank's balanced salt solution and 20 mM HEPES for 4 hours to achieve serum starvation. Thereafter, observation was performed using an IX-71 inverted microscope (magnification of objective lens: 20 times), a U-MGGFPQ filter, and an ORCA-ER digital camera. STAT3 homodimer formation was induced by adding human recombinant IL-6 (R & D Systems) to the same buffer so that the final concentration was 100 ng / ml. The images before and after addition of IL-6 are shown in FIG.
  • Example 13 As shown in Examples 1 to 12, it was revealed that the system shown in FIGS. 1 and 2 is effective in determining the protein-protein interaction. Next, the present inventor conceived a system shown in FIG. 3 as another embodiment of the system.
  • the third fusion protein including the first protein and the protein having multimerization ability the fourth fusion protein including the second protein and the protein having multimerization ability, the protein having multimerization ability, and fluorescence
  • the fifth fusion protein containing the protein is expressed in the cell or introduced into the cell
  • the proteins having the multimerization ability associate to form the third fusion protein and the fifth fusion protein.
  • the fourth fusion protein and the fifth fusion protein bind, and proteins corresponding to the first fusion protein and the second fusion protein shown in FIGS. 1 and 2 are expressed in the cells. is assumed.
  • Third and fourth fusion proteins according to the present invention that is, a fusion protein (p53-PB1) comprising the PB1 domain of p53 protein and p62 protein, and a fusion protein (PB1-MDM2) comprising the PB1 domain of MDM2 protein and p62 protein are expressed in cells by producing expression vectors encoding each fusion protein by the following method.
  • the obtained synthetic DNA was cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MNLinker (manufactured by Medical Biology Laboratory Co., Ltd.) treated with the same combination of restriction enzymes, whereby p53 (70) -PB1
  • An expression vector (pp53 (70) -PB1) was constructed.
  • An ash protein tag (PB1 domain of p62 protein) is inserted into the C terminus of the protein via a linker peptide by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the multi-cloning site of pAsh-MNLinker in a reading frame.
  • the fused protein can be expressed in the cell.
  • DNA having a restriction enzyme site on both ends of a nucleotide sequence encoding a part of MDM2 region consisting of amino acids 1 to 119 of MDM2 protein, region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36
  • DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA is cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MCLinker (manufactured by Medical and Biological Laboratories) treated with the same combination of restriction enzymes, thereby encoding PB1-MDM2.
  • An expression vector (pPB1-MDM2) was constructed.
  • An ash protein tag (PB1 domain of p62 protein) is inserted into the N-terminal of the protein via a linker peptide by inserting a DNA encoding an arbitrary protein into the multi-cloning site of pAsh-MLinker in accordance with the reading frame.
  • the fused protein can be expressed in the cell.
  • an expression vector was prepared by the method described below. That is, first, described in SEQ ID NO: 37 in which restriction enzyme sites are arranged at both ends of DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the PB1 domain of the p62 protein (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38). A DNA consisting of the nucleotide sequence was artificially synthesized.
  • phmAG1-PB1 prepared above was introduced into HeLaS3 cells to establish cells that constantly express the fifth fusion protein (mAG1-PB1) according to the present invention. That is, first, HeLaS3 cells were cultured in DMEM (low glucose, manufactured by SIGMA ALDRICH) supplemented with 10% FBS (manufactured by EQUITECH). On the day before gene transfer, HeLaS3 cells were seeded in a 35 mm dish (BD Falcon) and cultured in 1.5 mL of culture medium.
  • DMEM low glucose, manufactured by SIGMA ALDRICH
  • FBS manufactured by EQUITECH
  • OptiMEM manufactured by Life Technologies
  • 10 ⁇ L of Polyfect (registered trademark) transfection reagent manufactured by QIAGEN
  • the mixture was further mixed with 600 ⁇ L of the culture solution, added to HeLaS3 cells, and cultured for 20 hours.
  • G418 was added so that it might become a 500 microgram / mL density
  • the surviving cells were detached with a trypsin solution, diluted with a culture solution containing G418 (500 ⁇ g / ml) so as to be 0.5 cells / well, and then cultured in a 96-well plate. And the cell which formed the single colony was expanded and cultured.
  • pp53 (70) -PB1 and pPB1-MDM2 are expressed by the following method. Was introduced into the cells.
  • DMEM high glucose, manufactured by SIGMA ALDRICH
  • FBS EQUITECH
  • penicillin / streptomycin Lifetechnology
  • turbofect Tetrachlorofect, manufactured by Thermo Scientific
  • FIG. 29 shows the result of observation with the objective lens magnification set to 20 times as in Example 1.
  • FIG. 30 shows the result of observation with the objective lens magnification set to 40 times.
  • Example 14 Similarly to Example 13, the effectiveness of the system shown in FIG. 3 in determining the protein-protein interaction was confirmed by the method shown below.
  • the target of detection in this verification was a protein-protein interaction between mTOR (FRB domain) and FKBP12 protein, and rapamycin that induces the interaction was also used in this system.
  • the PB1 domain of the p62 protein was used as the protein having multimerization ability, and the mAG1 protein was used as the fluorescent protein.
  • ⁇ Production of pmTOR (FRB domain) -PB1> As a third fusion protein according to the present invention, a vector for expressing a protein (mTOR (FRB domain) -PB1) obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the C terminus of mTOR (FRB domain) 5 was prepared.
  • a vector (pPB1-mTOR) for expressing a protein (PB1-mTOR (FRB domain)) obtained by fusing the PB1 domain of p62 protein to the N-terminus of mTOR (FRB domain). (FRB domain)) was made as follows.
  • a vector (pFKBP12-PB1) for expressing a protein (FKBP12-PB1) obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the C-terminus of the FKBP12 protein is as follows: Produced.
  • DNA was prepared by artificially synthesizing EcoRI and XhoI recognition sites at both ends of a nucleotide sequence encoding FKBP12 protein (protein comprising the amino acid sequence described in NCBI RefSeq accession number: NP_4633460.1). Subsequently, the obtained synthetic DNA was cleaved with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzyme combination, thereby constructing an expression vector (pFKBP12-PB1) encoding FKBP12-PB1. .
  • a plasmid vector (pPB1-FKBP12) for expressing a protein (PB1-FKBP12) obtained by fusing the PB1 domain of the p62 protein to the N-terminus of the FKBP12 protein is shown in Example 5.
  • HEK293 cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin.
  • DMEM high glucose
  • penicillin / streptomycin 1% penicillin / streptomycin
  • the cells were seeded in a 96-well multi-well plate and cultured in a 140 ⁇ L culture medium per well.
  • a DNA solution prepared by mixing 133 ng of each plasmid vector with 10 ⁇ L of OptiMEM was diluted.
  • the mixture was stirred and further mixed with 90 ⁇ l of the culture solution. Then, the obtained mixed solution was added to the cultured cells and cultured for 20 hours.
  • the protein having the ability to multimerize and the fluorescent protein through self-association between the proteins having the ability to multimerize. It was revealed that the protein-protein interaction can also be determined by associating with. Furthermore, since a cell that constantly expresses the fifth fusion protein according to the present invention could be established, it was confirmed that the protein does not exhibit cytotoxicity.
  • the protein to be fused to the protein to be analyzed (first and second proteins) is a protein having multimerization ability.
  • proteins fused to the protein to be analyzed include fluorescent proteins in addition to proteins having multimerization ability. Therefore, the method shown in FIG. 3 requires a smaller molecular weight of the protein tag fused to the protein to be analyzed than the methods shown in FIGS. 1 and 2, so that the function of the protein to be analyzed is further inhibited. It becomes difficult.
  • Example 4 by preparing cells in which a fusion protein containing a fluorescent protein is constantly expressed in advance, the protein to be analyzed in these cells is prepared. Even if the fusion protein containing is transiently expressed, the influence of the variation in fluorescence signal between cells can be suppressed, and the protein-protein interaction can be determined more stably.
  • Example 15 As described above, it has become clear that the systems shown in FIGS. 1 to 3 are effective in determining protein-protein interactions. Next, the present inventor has conceived a system shown in FIG.
  • a first labeled protein containing an affinity tag and a first protein, a second labeled protein containing an affinity tag and a second protein, and a binding partner having an affinity for the affinity tag binds to each other when the sixth fusion protein containing a protein having a multimerizing ability and a fluorescent protein is expressed in the cell or introduced into the cell.
  • the first labeled protein binds to the sixth fusion protein to which the binding partner is bound
  • the second labeled protein binds to the sixth fusion protein to which the binding partner is bound.
  • the first fusion protein and the second fusion tongue shown in FIGS. 1 and 2 by binding with the protein Each corresponding protein is to be expressed within the cell to click cytoplasm.
  • the effectiveness of the system shown in FIG. 4 in the determination of protein-protein interaction was confirmed by the following materials and methods.
  • the target of detection is the formation of a homodimer of the transmembrane protein CD80.
  • a transmembrane protein CD2 which is known to exist as a monomer in the cell, was also used (for the protein-protein interaction of these proteins, James JR et al., Nat Methods., 2006, 3 Vol. 12, No. 100, pages 1001 to 1006).
  • pCD80-FRB ⁇ Preparation of pCD80-FRB>
  • mTOR FRB domain
  • CD80-FRB CD80 protein fused with this tag
  • DNA was prepared by artificially synthesizing BamHI and EcoRI recognition sequences at both ends of a nucleotide sequence encoding CD80 (NCBI RefSeq accession number: protein consisting of the amino acid sequence described in NP_005182.1).
  • the obtained synthetic DNA was cleaved with BamHI and EcoRI, and inserted into phmAG1-MNLinker treated with the same restriction enzyme combination to construct a pCD80-hmAG1 vector.
  • pCD2-FRB pCD2-FRB
  • CD2 protein CD2-FRB
  • mTOR FRB domain
  • DNA was prepared by artificially synthesizing BamHI and EcoRI recognition sequences on both ends of a nucleotide sequence encoding a CD2 protein (a protein consisting of the amino acid sequence described in Genbank Accession Number: AAA51946.1). Subsequently, the obtained synthetic DNA was cleaved with BamHI and EcoRI, and inserted into phmAG1-MNLinker treated with the same combination of restriction enzymes to construct pCD2-hmAG1.
  • FKBP12 was selected as a binding partner having affinity for the affinity tag
  • the PB1 domain of p62 was selected as a protein having multimerization ability
  • mAG1 was selected as a fluorescent protein.
  • a pPB1-hmAG1-FKBP12 vector was prepared as described in Example 5 so that PB1-hmAG1-FKBP12, which is a fusion of these proteins, was expressed in cells as a sixth fusion protein.
  • HEK293 cells were cultured in a culture solution (DMEM high glucose, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin). Next, the day before gene introduction, the cells were seeded in an 8-well chamber and cultured in 100 ⁇ L of culture medium per well. A DNA solution prepared by mixing 200 ng of each plasmid with 10 ⁇ L of OptiMEM was diluted. Next, after adding 0.8 ⁇ L of Fugene HD, the mixture was stirred and further mixed with 90 ⁇ l of the culture solution. Then, the obtained mixed solution was added to the cultured cells and cultured for 20 hours.
  • DMEM high glucose, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin a culture medium per well.
  • a DNA solution prepared by mixing 200 ng of each plasmid with 10 ⁇ L of OptiMEM was diluted. Next, after adding 0.8 ⁇ L of Fugene HD, the mixture was stirred and further mixed with 90 ⁇ l of the culture solution. Then, the obtained mixed solution was added to the cultured
  • the molecular weight of the protein tag fused to the protein to be analyzed can be small, so that the function of the protein to be analyzed is less likely to be inhibited.
  • the protein to be analyzed can be maintained in the cell in a state in which the low molecular weight tag is fused in this way, as described above, the fusion protein according to the present invention according to stimulation such as addition of rapamycin.
  • the protein-protein interaction can be set to a state that can be determined at an arbitrary timing.
  • the sixth fusion protein containing the fluorescent protein is constantly expressed in advance, it is possible to transiently express the fusion protein containing the protein to be analyzed in these cells.
  • the influence of the variation in fluorescence signal between cells is suppressed, and the protein-protein interaction can be determined more stably.
  • a transmembrane protein such as CD80 localizes to the cell membrane through an organelle such as the Golgi apparatus. Therefore, when the protein is fused with a tag and expressed, it becomes difficult to reach the cell membrane through the same organ. Therefore, in general, unlike the interaction with cytoplasmic proteins, the cell membrane It is said that it is difficult to detect that of a protein.
  • the tag to be fused is relatively small, so that the transmembrane protein can easily reach the cell membrane. Then, the transmembrane protein is expressed on the membrane in a state where the tag is fused, and the protein having multimerization ability and the fluorescent protein expressed in the cytoplasm are bound to the tag later, as shown in FIG. As is clear from the results, it is possible to easily detect protein-protein interactions in transmembrane proteins such as CD80.
  • Example 16 Next, the present inventor conceived the system shown in FIG. 7 as one embodiment for detecting an interaction between three or more proteins based on the system shown in FIG.
  • the thirteenth fusion protein containing the first protein and the protein having multimerization ability the fourteenth fusion protein containing the second protein and the protein having multimerization ability, the third protein and the fluorescent protein If the first protein, the second protein, and the third protein interact when the fifteenth fusion protein is expressed in the cell or introduced into the cell, the system shown in FIG. Similarly, multimer formation between proteins having multimerization ability is induced, whereby the fusion protein autonomously forms an aggregate, and the fluorescent protein contained in the fusion protein is detected as a fluorescent bright spot. .
  • the effectiveness of the system shown in FIG. 7 in the determination of protein-protein interaction was confirmed by the following materials and methods.
  • the target of detection is heterotrimer formation by p50, p60 and I ⁇ B ⁇ .
  • NF ⁇ B functions in the nucleus as a transcription factor responsible for regulating the expression of inflammatory cytokines, but is further retained in the cytoplasm by further interaction with I ⁇ B ⁇ , and its transcription function is known to be suppressed (Marc). D. Jacobs et al., Cell, December 11, 1998, 95, pages 749-758). Therefore, in this example, a protein having multimerization ability is fused to each of p50 and p65, and a fluorescent protein is fused to I ⁇ B ⁇ and expressed in the cell, thereby being formed by the interaction between p50 and p65. It was confirmed that a fluorescent luminescent spot was formed when I ⁇ B ⁇ fused with a fluorescent protein was further accumulated in the aggregate, and a trimeric complex could be detected.
  • PB1-p50 p50 protein in which the PB1 domain of p62 is fused to the N-terminus as a protein having multimerization ability in a cell as a thirteenth fusion protein, as shown below.
  • pPB1-p50 A vector was constructed.
  • DNA was prepared by artificially synthesizing EcoRI and XhoI recognition sequences at both ends of a nucleotide sequence encoding p50 (a protein comprising the amino acid sequence described in NCBI RefSeq accession number: NP_003989.2). Next, the obtained synthetic DNA was treated with EcoRI and XhoI, and inserted into pAsh-MCLinker treated with the same restriction enzymes to prepare pPB1-p50.
  • pp65-PB1 p65 protein (p65-PB1) in which the PB1 domain of p62 is fused to the C-terminal as a protein having multimerization ability as a 14th fusion protein in a cell, as shown below, pp65-PB1 A vector was constructed.
  • DNA in which BamHI and XhoI recognition sequences were respectively arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding p65 (protein comprising the amino acid sequence described in NCBI RefSeq accession number: NP_068810.3) was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and XhoI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzymes, thereby producing a pp65-PB1 vector.
  • phmKO2-I ⁇ B ⁇ ⁇ Production of phmKO2-I ⁇ B ⁇ >
  • I ⁇ B ⁇ protein mKO2-I ⁇ B ⁇
  • mKO2 was fused to the N-terminus as a fluorescent protein in the cell as a 15th fusion protein
  • a phmKO2-I ⁇ B ⁇ vector was constructed as shown below.
  • DNA in which BamHI and EcoRI recognition sequences were respectively arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding I ⁇ B ⁇ (protein comprising the amino acid sequence described in NCBI RefSeq accession number: NP — 065390.1) was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and EcoRI, and inserted into phmKO2-MCLinker (manufactured by Medical Biology Laboratories Co., Ltd.) treated with the same restriction enzyme to prepare a phmKO2-I ⁇ B ⁇ vector. .
  • HEK293 cells subjected to gene transfer treatment were observed using an IX-71 inverted microscope, a U-MGGFPQ filter, and an ORCA-Flash 4.0 digital camera. The obtained result is shown in FIG.
  • Example 17 Similarly to Example 16, the effectiveness of the system shown in FIG. 7 in the determination of protein-protein interaction was confirmed by the materials and methods shown below.
  • the detection target is heterotrimer formation by CDK4, CyclinD1 and p21.
  • p21 In the cell nucleus, p21 is known to recognize and interact with a complex composed of CDK4 and CyclinD1 (LaBaer J et al., Genes Dev., April 1, 1997, Vol. 11, 7). No. 847-862). It has also been clarified that formation of such a heterotrimer inhibits cell cycle progression (transition from G1 phase to S phase) promoted by a complex composed of CDK4 and CyclinD1.
  • pp21-PB1 p21 protein (p21-PB1), in which the PB1 domain of p62 is fused to the C-terminal as a protein having multimerization ability, as a thirteenth fusion protein, pp21-PB1 is expressed as follows. A vector was constructed.
  • DNA artificially synthesized with BamHI and NotI recognition sequences on both ends of a nucleotide sequence encoding p21 (NCBI RefSeq accession number: protein consisting of the amino acid sequence described in NP_510867.1) was synthesized. Next, the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and NotI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzymes, thereby producing a pp21-PB1 vector.
  • pCDK4-PB1 ⁇ Preparation of pCDK4-PB1>
  • CDK4-PB1 CDK4 protein
  • the pCDK4-PB1 vector is expressed as follows. Built.
  • DNA in which a recognition sequence of BamHI and NotI was arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding CDK4 (a protein comprising the amino acid sequence described in NCBI RefSeq accession number: NP — 000066.1) was artificially synthesized. Subsequently, the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and NotI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzymes, thereby producing a pCDK4-PB1 vector.
  • pCDK4 pCDK4 vector was constructed as shown below to express CDK4 protein (CDK4) not fused with other proteins.
  • a DNA in which a BamHI recognition sequence, a stop codon and a NotI recognition sequence were respectively arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding CDK4 was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and NotI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzymes, thereby preparing a pCDK4 vector.
  • phmAG1-CyclinD1 In order to express CyclinD1 protein (mAG1-CyclinD1) fused with mAG1 as a fluorescent protein at the N-terminal in the cell as a 15th fusion protein, a phmAG1-CyclinD1 vector was constructed as shown below.
  • Example 18 As in Examples 16 and 17, the effectiveness of the system shown in FIG. 7 in determining the protein-protein interaction was confirmed.
  • the target of detection in this confirmation experiment is tetramer formation by calmodulin and a partial sequence of myosin light chain kinase 2 (M13 peptide, M13 peptide). It is clear that the interaction between calmodulin and M13 peptide occurs in response to a transient increase in intracellular calcium ion concentration (second messenger) that occurs when a G protein-coupled receptor (GPCR) receives a ligand. (See Miyawaki A et al., Nature, August 28, 1997, 388, 6645, pages 882-887).
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • pM13 peptide-PB1 ⁇ Production of pM13 peptide-PB1>
  • M13 peptide-PB1 M13 peptide-PB1 in which the PB1 domain of p62 is fused to the C terminus as a protein having multimerization ability in the cell as a 13th and 14th fusion protein, as shown below, pM13 peptide -A PB1 vector was constructed.
  • DNA in which recognition sequences of BamHI and EcoRI were respectively arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding the M13 peptide was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and EcoRI, and inserted into pAsh-MNLinker treated with the same restriction enzymes, thereby producing a pM13 peptide-PB1 vector.
  • calmodulin-hmAG1 calumudulin-mAG1 fused with mAG1 as a fluorescent protein in the cell as a fifteenth fusion protein in a cell
  • calmodulin protein fused with mUkG1 as a fluorescent protein at the C terminus
  • the pCalumodullin-hmAG1 vector and the pCalumodulin-hmUkG1 vector were constructed as shown below.
  • DNA in which recognition sequences of BamHI and EcoRI were respectively arranged at both ends of a nucleotide sequence encoding calmodulin (nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 52) was artificially synthesized.
  • the obtained synthetic DNA was treated with BamHI and EcoRI, and inserted into phmAG1-MNLinker and phmUkG1-MNLinker (both manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.) treated with the same restriction enzymes.
  • the pCalumodulin-hmAG1 vector and the pCalumodulin-hmUkG1 vector were prepared.
  • the plasmid (1 ⁇ g + 1 ⁇ g) was diluted in OptiMEM, and 10 ⁇ l of Polyfect (registered trademark) transfection reagent was added and stirred. The mixture was further mixed with 600 ⁇ l of the culture solution, added to HeLaS3 cells, and cultured for 22 hours.
  • Hela S3 cells transfected with the above and cultured for 22 hours in a pH 7.4 buffer solution containing Hanks balanced salt solution and 20 mM HEPES were subjected to IX-71 inverted microscope, U-MGGFPQ filter, ORCA-ER digital camera. And observed. Thereafter, 100 ⁇ M histamine (Histamine, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and fluorescent images were taken over time. In addition, it has been clarified that histamine functions as a ligand of one kind of H1 receptor of GPCR which is also expressed in HeLaS3 cells. The obtained results are shown in FIGS.
  • Example 19 Based on the above results, the present inventors have conceived a system shown in FIG. 8 as a system for determining protein-protein interaction.
  • the target of detection in this verification was the interaction between the p53 protein and the MDM2 protein, and the inhibitor Nutrin-3 was also used in this verification. Furthermore, in this verification, as a protein having multimerization ability, the SAM domain of Tankyase1 protein, the PB1 domain of PKCiota protein, the SAM domain of TEL protein, and the SAM domain of DGKdelta protein were used in an appropriate combination. Moreover, mAG1 protein was used as a fluorescent protein. In the system shown in FIG. 8, the fluorescent protein is fused to only one protein that is the object of protein interaction analysis. In this example, the fusion was carried out with both proteins for verification.
  • plasmid vector for expressing various fusion proteins PTakyrase-hmAG1-p53, pPKCi-hmAG1-p53, pTEL-hmAG1-p53 and pDGKd-hmAG1-p53 prepared as described above were treated with restriction enzymes with NheI and AgeI, and nucleotide fragments Tankylase-hmAG1, PKCi- hmAG1, TEL-hmAG1 and DGKd-hmAG1 were prepared. Then, these were treated with the same restriction enzymes and inserted into pPB1-p53 (70) excluding the PB1 region to prepare the following plasmid vectors.
  • A pTankylase-hmAG1-p53 (70), (B) pPKCi-hmAG1-p53 (70), (C) pTEL-hmAG1-p53 (70), (D) pDGKd-hmAG1-p53 (70).
  • the following plasmid vector was also prepared by treating pPB1-MDM2 prepared in Example 4 with NheI and AgeI, removing the PB1 region, and then inserting each of the nucleotide fragments.
  • E pTankylase-hmAG1-MDM2
  • F pPKCi-hmAG1-MDM2
  • G pTEL-hmAG1-MDM2
  • H pDGKd-hmAG1-MDM2.
  • Plasmid vectors (a) to (h) prepared as described above were introduced into HEK293 cells by the method described below in the following combinations.
  • Combination 1 Plasmid vectors (b) and (h)
  • Combination 2 Plasmid vectors (b) and (g)
  • Combination 3 Plasmid vectors (a) and (f)
  • Combination 4 Plasmid vectors (a) and (h)
  • Combination 5 Plasmid vectors (a) and (g)
  • Combination 6 Plasmid vectors (d) and (f)
  • Combination 7 Plasmid vectors (d) and (g)
  • Combination 8 Plasmid vectors (c) and (e)
  • Combination 9 Plasmid vectors (c) and (h).
  • HEK293 cells were cultured in DMEM (high glucose) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin. Next, the day before gene introduction, the cells were seeded in a 96-well multiwell plate (manufactured by Greiner bio-one) and cultured in a culture solution of 100 ⁇ L per well. A DNA solution prepared by mixing 200 ng of each plasmid with 10 ⁇ L of OptiMEM was diluted. Next, after adding 0.8 ⁇ L of Fugene HD, the mixture was stirred and further mixed with 90 ⁇ l of the culture solution. Then, the obtained mixed solution was added to the cultured cells and cultured for 20 hours.
  • DMEM high glucose
  • FBS penicillin / streptomycin
  • protein-protein interaction can be determined in its own intracellular environment, and position information and time information of protein-protein interaction can be acquired.
  • the intensity of the protein-protein interaction correlates with the fluorescence intensity of the fluorescent bright spot. Therefore, identification of amino acid residues involved in the protein-protein interaction using the fluorescence intensity as an index, This method can also be used to screen for substances that modulate intermolecular interactions.
  • the determination method of protein-protein interaction of the present invention and the vector or kit to be used in these methods, elucidate various signal transduction in vivo, control of various biological reactions, etc., and thus the disease mechanism It is useful in the development of pharmaceuticals through elucidation of

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Abstract

　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程と、前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程とを含む方法。

Description

タンパク質間相互作用の判定方法
　本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法、並びに当該方法に用いられるためのベクター及びキットに関する。
　タンパク質間相互作用の判定方法は、主に２つのグループに分けることができる。一つ目は、生細胞から分離された状態のタンパク質を用いることを特徴とする方法である。例えば、表面プラズモン共鳴法、タンパク質質量分析法、異方性測定法（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）が挙げられる。しかしながら、これらの方法では、実際の細胞内環境と同様の環境で相互作用を判定することは困難である。
　そこで、二つ目の方法として、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の判定を行う方法も開発されている。代表的な方法としては、レポーターの転写活性を検出する酵母ツーハイブリッドシステムやその変法が挙げられる。その他、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の酵素の再構成を利用する方法も開発されている。
　しかしながら、これら方法には、タンパク質間相互作用が発生した位置（タンパク質間相互作用の位置情報）や、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間、該相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等（タンパク質間相互作用の時間情報）を判定することができないという問題がある。
　また、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の判定を行う方法として、蛍光タンパク質の再構成を利用する方法もあるが、一度再構成した蛍光タンパク質は解離しないため、タンパク質間相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等を判定することができないという問題がある。さらには、タンパク質間相互作用が発生してから、蛍光を発するまでに時間を要するため、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間等を判定することができないという問題もある。
　一方、生細胞内でタンパク質間相互作用の判定を行う方法として、分子間の距離に依存したエネルギー転移を検出する蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）が開発されている。この方法は、タンパク質間相互作用が発生した位置情報と時間情報が得られるという利点を有するものの、この方法に用いられるドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質との相互の位置関係が、タンパク質間相互作用の判定において重要であるため、これら蛍光タンパク質と検出の対象となるタンパク質とを繋ぐリンカー（スぺーサー）の最適化を検討する工程が煩雑であり、系の構築が困難であった。さらに、アクセプター蛍光タンパク質を励起してしまうｃｒｏｓｓ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎや、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光を検出するフィルター（吸収フィルター）セットにドナー蛍光タンパク質の蛍光が漏れ込むｂｌｅｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈが発生してしまうため、結果の解析が困難であった。また、２色の蛍光タンパク質（ドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質）を使用するため、検出対象となるタンパク質以外の情報を取得する目的で使用できる蛍光タンパク質が限定されるという問題もあった。
　近年、Ｔｏｂｉａｓ　Ｍｅｙｅｒらによって、細胞内局在化を利用したタンパク質間相互作用の判定方法が報告された（特許文献１）。この方法においては、相互作用を判定するタンパク質の一方に細胞内の特定の部位に特異的に結合するタンパク質を融合し、相互作用を判定するタンパク質の他方に蛍光タンパク質等を融合する。そして、これら融合タンパク質を細胞内で発現させ、細胞内の特定の部位における蛍光タンパク質等のシグナルを指標としてタンパク質間相互作用を判定する。
　また、Ｎｉｂｅｒｔらによって、相互作用を判定するタンパク質の一方にウィルス封入体を形成するタンパク質を融合した融合タンパク質を用い、相互作用を判定するタンパク質の他方がウィルス封入体に集積することを指標として、タンパク質間相互作用を判定する方法が報告されている（特許文献２）。
　しかしながら、これら細胞内局在化を利用したタンパク質間相互作用の判定方法は、相互作用を判定するタンパク質の一方を強制的（人工的）に細胞内の特定の部位に移行させて拘束するため、本来タンパク質間相互作用が生じる部位、すなわちタンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下での判定ができず、タンパク質間相互作用の位置情報が得られない等の問題点がある。また、天然の状態で、細胞内局在化される部位と同じ部位に局在するタンパク質同士の相互作用を判定することもできない。
　この問題点に対しては、Ｓａｒａ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｂｊｏｒｎらによって、タンパク質が本来機能する細胞内環境下にて相互作用させた上で、薬剤等の刺激を該細胞に与えることにより、相互作用するタンパク質からなる凝集体の形成を誘導し、該凝集体の形成をもって、タンパク質間相互作用を判定する方法（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ－ｔｒａｐ　ｍｅｔｈｏｄ）が報告されている（特許文献３）。
　しかしながら、この方法は任意の時点において凝集体の形成を誘導するための刺激を細胞に与える必要があり、刺激を与えた後に引き続き相互作用の有無を判定するためには、刺激を与えるために用いた薬剤等を除く必要がある。従って、かかる方法においては、タンパク質間相互作用が発生した時間情報を得ることができず、また、任意の期間に任意の場所にて変化（発生、消失、再発生等）するタンパク質間相互作用は判定できない等の問題点がある。
国際公開第２０００／０１７２２１号 国際公開第２００６／０９９４８６号 米国特許第７２８２３４７号明細書 国際公開第２０１３／０８４９５０号
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞内におけるタンパク質間相互作用を、タンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下において判定することができ、かつ、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することができる方法を提供することにある。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、２つのタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）の相互作用の判定において、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質との利用を構想した（図１及び２　参照）。より具体的には、これら２つの融合タンパク質を細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系を考えた。
　そして、実際にこの系を構築し、これら融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。また、この系によって、タンパク質間相互作用が発生した位置（タンパク質間相互作用の位置情報）や、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間及び該相互作用が消失するまでの時間等（タンパク質間相互作用の時間情報）も判定できることも明らかになった。さらに、この方法と、本発明者らが従前発明した、蛍光輝点を指標としてタンパク質間相互作用を判定する別の方法（特許文献４）とを比較した結果、本発明の方法は、特許文献４に記載の方法よりも、少なくとも第１のタンパク質及び第２のタンパク質が同一分子であり、その分子同士が２量体以上を形成する、ホモ多量体形成の判定効率の上では優れていることも明らかになった。
　また、図１及び２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系の有効性が実証されたことを受け、タンパク質間相互作用を判定するための別の検出系を構想した（図３～６　参照）。すなわち、前記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入し、当該細胞内における各融合タンパク質の再構成を介した、タンパク質間相互作用を判定するための検出系を構想した。
　より具体的には、図３に示す通り、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の相互作用の判定において、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することが想定される。そして、かかる想定通りであれば、図１及び２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることが、図３に示す第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系においても期待できる。
　また、図４に示す通り、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質複合体が該細胞内において発現することが想定される。すなわち、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び結合パートナーと、アフィニティタグ及び第１のタンパク質とからなる複合体が、図２に示す第１の融合タンパク質のように機能し、また、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び結合パートナーと、アフィニティタグ及び第２のタンパク質とからなる複合体が、図２に示す第２の融合タンパク質のように機能することが想定される。そして、これらタンパク質複合体の発現に伴い、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　さらに、図５に示す通り、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって蛍光タンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　さらにまた、図６に示す通り、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって多量化能を有するタンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　そこで、実際に図３に示す検出系も構築し、上記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。また、図４に示す検出系も構築し、上記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。
　さらに、本発明者らは、図１等に示した系に基づき、３以上のタンパク質間の相互作用を検出するための態様として、図７に示す系を構想した。すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　そこで、実際に図７に示す検出系も構築し、前記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。
　さらに、本発明者らは、上記結果に基づき、タンパク質間相互作用を判定するための系として、図８に示す系を構想した。すなわち、第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入し、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質である場合、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用し、さらに多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導されることにより、融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。
　そして、実際に図８に示す検出系も構築し、前記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。
　したがって、本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法、並びに当該方法に用いられるためのベクター及びキットに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）　第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜２＞　前記第２の融合タンパク質が、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜５＞　前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、＜４＞に記載の方法。
＜６＞　多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター。
＜７＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）＜６＞に記載のベクター
　（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
　（ｇ）第１の融合タンパク質
　（ｈ）第２の融合タンパク質。
＜８＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜４＞又は＜５＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第３の融合タンパク質
　（ｇ）第４の融合タンパク質
　（ｈ）第５の融合タンパク質。
＜９＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１０＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜９＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
　（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１の標識化タンパク質
　（ｇ）第２の標識化タンパク質
　（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
＜１１＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１２＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１１＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第７の融合タンパク質
　（ｇ）第８の融合タンパク質
　（ｈ）第９の融合タンパク質。
＜１３＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１４＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１３＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１０の融合タンパク質
　（ｇ）第１１の融合タンパク質
　（ｈ）第１２の融合タンパク質。
＜１５＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１６＞　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１５＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｆ）第１３の融合タンパク質
　（ｇ）第１４の融合タンパク質
　（ｈ）第１５の融合タンパク質。
＜１７＞　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）　第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１８＞　下記（ａ）～（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１７＞に記載の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１６の融合タンパク質
　（ｆ）第１７の融合タンパク質。
　本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において判定することができ、また当該判定の結果に基づき、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することが可能となる。特に、本発明によれば、ホモ多量体形成をその固有な細胞内環境下において効率良く判定することができ、また当該判定の結果に基づき、ホモ多量体形成の位置情報及び時間情報も効率良く取得することが可能となる。
本発明のタンパク質間相互作用の第１の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第１の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含み、さらに蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第２の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及びアフィニティタグ（図中、Ｅ１）を含む第１の標識化タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及びアフィニティタグ（図中、Ｅ１）を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナー（図中、Ｅ２）が結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１の標識化タンパク質と第２の標識化タンパク質と前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第４の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド（図中、ｄ１）を含む第７の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド（図中、ｄ１）を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド（図中、ｄ２）、及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第５の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド（図中、ｃ１）を含む第１０の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド（図中、ｃ１）を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド（図中、ｃ２）、及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第６の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質（図中、Ｆ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 本発明のタンパク質間相互作用の第７の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であって、第１のタンパク質（図中、Ａ）、第１の多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び第２の多量化能を有するタンパク質（図中、Ｇ）を含む第１７の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。 多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体に融合してなる、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから３８分後の細胞、薬剤を添加してから７６分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 国際公開第２０１３／０８４９５０号に記載の方法により、薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点を検出した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから５８分後の細胞、薬剤を添加してから６６分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加することにより形成されたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成が、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加することにより解消（消失）されることを、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加してから９０分後の細胞、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを洗浄し、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加してから９０分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加することにより形成されたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成が、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加することにより解消されることを、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示すグラフである。図中、Ａは、細胞にＢ／Ｂホモダイメリザーを添加してからの経過時間を示す。Ｂは、細胞に添加したＢ／Ｂホモダイメリザーを洗浄している時間を示す。Ｃは、該洗浄後、細胞にＢ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加してからの経過時間を示す。 多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１とを、解析対象であるｐ５３に融合してなる、本発明にかかる融合タンパク質（ｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３又はｐ５３－ｍＡＧ１－ＰＢ１）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３」はｐ５３のＮ末に本発明にかかるタンパク質タグ（多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む融合タンパク質）が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。また、「ｐ５３－ｍＡＧ１－ＰＢ１」はｐ５３のＣ末に本発明にかかるタンパク質タグが融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 蛍光タンパク質としてｍＡＧ１のみを解析対象であるｐ５３に融合してなる、融合タンパク質（ｍＡＧ１－ｐ５３又はｐ５３－ｍＡＧ１）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｍＡＧ１－ｐ５３」はｐ５３のＮ末に蛍光タンパク質が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。また、「ｐ５３－ｍＡＧ１」はｐ５３のＣ末に蛍光タンパク質が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｐ５３（７０））と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（－）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン－３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン－３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１－ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（－）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン－３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン－３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＦＫＢＰ１２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）とを細胞内に発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（－）」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（＋）、３０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは１００μｍを示す。 ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＮ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（－）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン－３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン－３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（－）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン－３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ－３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン－３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｍＡＧ１－ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＦＫＢＰ１２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２）とを細胞内に発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（－）」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（＋）、３０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは１００μｍを示す。 図２０に示した顕微鏡写真の一部を拡大した写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてＤＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体、すなわちＰＢ１－ＤＧ１－ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから１時間後の細胞、薬剤を添加してから２時間後の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＣｈｅｒｒｙとを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体、すなわちＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから１時間後の細胞、薬剤を添加してから２時間後の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインと、ｍＡＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。 多量化能を有するタンパク質として、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン又はＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインとを、ｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３、ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ｐ５３、ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ｐ５３又はＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ｐ５３）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを、ＥＲＫ２のＣ末に融合してなるタンパク質（ＥＲＫ２－ｍＡＧ１－ＰＢ１）を細胞内に発現させ、ＥＧＦを該細胞に添加することにより、該添加に応じたＥＲＫ２のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ＥＧＦ添加前」は、ＥＧＦを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、８ｍｉｎ」は、ＥＧＦを添加してから８分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を、ＥＲＫ２のＣ末に融合してなるタンパク質（ＥＲＫ２－ＰＢ１－ｍＡＧ１）を恒常的に発現させた細胞を、ＥＧＦを添加してから８分後に観察し、該添加に応じたＥＲＫ２のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を、ＳＴＡＴ３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３）を細胞内に発現させ、ＩＬ－６を該細胞に添加することにより、該添加に応じたＳＴＡＴ３のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｂｅｆｏｒｅ」は、ＩＬ－６を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ＩＬ６（１００ｎｇ／ｍｌ）、５０ｍｉｎ」は、ＩＬ－６を添加してから５０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を含む融合タンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１）を恒常的に発現させている細胞において、ｐ５３－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２、ＰＢ１－ＭＤＭ２及びＰＢ１、又は、ｐ５３－ＰＢ１及びＰＢ１を一過的に発現させ、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、「ｐ５３－ＰＢ１」は、ｐ５３タンパク質の一部のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合してなるタンパク質を示し、「ＰＢ１－ＭＤＭ２」は、ＭＤＭ２のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合してなるタンパク質を示し、「ＰＢ１」はｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示し、矢印は検出された蛍光輝点を示す。 ＰＢ１－ｍＡＧ１を恒常的に発現し、さらにｐ５３（７０）－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２を一過的に発現させている細胞において、ヌトリン３添加によるｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の解消を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側の写真がヌトリン３添加前の細胞を分析した結果を示し、右側の写真がヌトリン３添加後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは１０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）のＮ末又はＣ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）又はｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＦＫＢＰ１２のＮ末又はＣ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２又はＦＫＢＰ１２－ＰＢ１）と、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン（ｍＡＧ１－ＰＢ１）とを、下記（Ａ）～（Ｄ）の組み合わせにて、細胞において発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ラパマイシン添加前」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ラパマイシン（５００ｎＭ）、室温６０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから６０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。（Ａ）ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）、ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１－ＰＢ１（Ｂ）ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）、ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１及びｍＡＧ１－ＰＢ１（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１、ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１－ＰＢ１（Ｄ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１、ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１及びｍＡＧ１－ＰＢ１。 アフィニティタグとしてｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインを、解析対象であるＣＤ８０のＮ末に融合してなるタンパク質（ＣＤ８０－ＦＲＢ）と、アフィニティタグの結合パートナーとしてＦＫＢＰ１２、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及び蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２）とを発現させた細胞において、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２との結合を誘導するラパマイシンを添加した後、ＣＤ８０のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、上部のパネルは、前述のＣＤ８０を分析した結果を示し、下部のパネルは、陰性対照として、ＣＤ８０の代わりにＣＤ２を用いて分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５０のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｐ５０）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ６５のＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ６５－ＰＢ１）と、蛍光タンパク質としてｍＫＯ２をＩκＢαのＮ末に融合してなるタンパク質（ｍＫＯ２－ＩκＢα）とを発現させた細胞において、ｐ５０、ｐ６５及びＩκＢαからなる３量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、その結果を示し、右側のパネルは、陰性対照として、ｐ６５－ＰＢ１を発現させることなく分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｍＡＧ１を解析対象であるＣｙｃｌｉｎＤ１のＮ末に融合してなるタンパク質（ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ２１のＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ２１－ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＣＤＫ４のＣ末に融合してなるタンパク質（ＣＤＫ４－ＰＢ１）とを発現させた細胞において、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１及びＣＤＫ４からなる３量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、その結果を示し、真中のパネルは、陰性対照として、ＣＤＫ４－ＰＢ１の代わりにＰＢ１のみを発現させて分析した結果を示し、右側のパネルは、陰性対照として、ＣＤＫ４－ＰＢ１の代わりに他のタンパク質を融合させていないＣＤＫ４を発現させて分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 ｍＡＧ１を解析対象であるカルモジュリンのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭ１３ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１）とを発現させた細胞において、カルモジュリン及びＭ１３ペプチドからなるヘテロ４量体形成を、当該４量体形成を誘導するヒスタミンを添加し、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヒスタミン添加前の細胞を分析した結果を示し、真ん中のパネルは、ヒスタミンを添加してから６０秒後の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヒスタミンを添加してから３００秒後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 蛍光タンパク質としてｍＵｋＧ１を解析対象であるカルモジュリンのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＵｋＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭ１３ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１）とを発現させた細胞において、カルモジュリン及びＭ１３ペプチドからなるヘテロ４量体形成を、当該４量体形成を誘導するヒスタミンを添加し、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヒスタミン添加前の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヒスタミンを添加してから６０秒後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。 多量化能を有するタンパク質としてＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヌトリン－３添加前の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヌトリン－３を添加してから６０分後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは１０μｍを示す（以下、図中の表記に関しては、図３８～４５において同様である）。 ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ｐ５３と、多量化能を有するタンパク質としてＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３とＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３とＴＥＬ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 多量化能を有するタンパク質としてＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ｐ５３）と、ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 ＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ｐ５３とＴＥＬ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 多量化能を有するタンパク質としてＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。 ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ｐ５３とＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。また、下記各項目において説明する事項に関しては、当然のことながら特に断りがない限り、本発明全体を通し、他の項目等においても同様に解釈される。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法１＞
　本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第１の態様は、
　第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程（１）と、
　前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程（２）と、
　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程（３）と
を含む方法である。
　かかる方法によれば、後述の実施例１～１２において示す通り、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる（図１及び２　参照）。
　本発明において「タンパク質」とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。したがって、完全長のタンパク質のみならず、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドをも含む概念である。タンパク質の修飾としては、例えば、リン酸化、グリコシル化、パルミトイル化、プレニル化（例えば、ゲラニルゲラニル化）、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、アミド化が挙げられる。
　本発明にかかる「第１のタンパク質」及び「第２のタンパク質」としては、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは異なっていてもよく、同一であってもよいが、後述の実施例１～１２及び比較例１において示す通り、本発明の方法によれば、ホモ多量体の形成及び解消（消失）を効率良く判定できるため、本発明の方法は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが同一の場合に、より有用である。
　本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
　本発明にかかる「多量化能を有するタンパク質」は、多量体を形成できるタンパク質であればよく特に制限はないが、本発明の方法において蛍光輝点をより検出し易いという観点から、３量体以上の多量体を形成できるタンパク質であることが好ましい。このような多量化能を有するタンパク質としては、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ－１のＳＡＭドメインが挙げられ、これらの中においては、ホモ４～８量体を形成するため、本発明の方法において蛍光輝点をより検出し易いという観点から、ｐ６２のＰＢ１ドメインがより好ましい。
　なお、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ－１のＳＡＭドメインは、典型的には各々、配列番号：２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：６で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号：１２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　これら「多量化能を有するタンパク質」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得、また人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、多量化能を有し、融合させた第１のタンパク質及び第２のタンパク質が相互作用した場合に、会合体（蛍光輝点）を形成する性質を有する限り、本発明において用いることができる。
　本発明にかかる「蛍光タンパク質」は、蛍光を発することのできるタンパク質であればよく、例えば、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ａｚａｍｉ　Ｇｒｅｅｎ　１、ｍＡＧ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｕｍｉｋｉｎｏｋｏ－Ｇｒｅｅｎ（単量体ウミキノコ－グリーン、ｍＵｋＧ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ２（単量体クサビラオレンジ２、ｍＫＯ２）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ（単量体ケイマ－レッド、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ１（単量体ミドリイシ－シアン１、ｍＭｉＣｙ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ１（単量体クサビラオレンジ１、ｍＫＯ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｃｈｅｒｒｙ（単量体チェリー、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ（フュージョンレッド）、Ｄｒｏｎｐａ―Ｇｒｅｅｎ１（ドロンパ－グリーン１、ＤＧ１）、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ１（ミドリイシ－シアン１、ＭｉＣｙ１）、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｃｙａｎ１（クサビラ－シアン１、ＫＣｙ１）、ｄｉｍｅｒｉｃ　Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）（二量体アザミグリーン（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＢ））、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ１（クサビラオレンジ１、ＫＯ１）、ｄｉｍｅｒｉｃ　Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ（二量体ケイマ－レッド、ｄＫｅｉｍａ、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ）、ＴＧｕｖが挙げられるが、蛍光タンパク質が多量体を形成できるタンパク質である場合には、前述の多量化能を有するタンパク質と融合させた際に、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の相互作用の如何を問わずに、会合体（蛍光輝点）を形成し易くなるという観点から、単量体蛍光タンパク質（ｍＡＧ１、ｍＵｋＧ、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ、ｍＫＯ１、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ、ＤＧ１等）が好ましく、ｍＡＧ１、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄがより好ましく、ｍＡＧ１がさらに好ましい。
　なお、ｍＡＧ１、ｍＵｋＧ、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ、ｍＫＯ１、ＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１、ｄＡＧ（ＡＢ）、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ＴＧｕｖ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ及びＤＧ１は、典型的には各々、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６９で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＡＶ５２１６４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＢＡＤ７２８７４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　これら蛍光タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、蛍光を発することができる限り、本発明において用いることができる。
　また、本発明においては、前述の蛍光タンパク質の代わりに、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質も使用することができる。蛍光タンパク質は、電磁波照射によって当該タンパク質の電子が励起され、該電子が基底状態に戻る際に放出される電磁波（光）を発する（ｐｈｏｔｏ　ｌｕｍｉｎｅｓｓｅｎｃｅ）。一方、化学発光タンパク質は、当該タンパク質が触媒する化学反応によって、発光基質の電子が励起され、電磁波（光）を発する。このように、発光機構において、蛍光タンパク質と化学発光タンパク質とは原理的に類似しているため、本発明において、化学発光タンパク質も使用可能である。
　このような化学発光タンパク質として、特に制限はなく、例えば、ルシフェラーゼが挙げられ、その好適な例として、プロメガ　ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標、Ｎｌｕｃ）ルシフェラーゼ（プロメガ株式会社製）、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１３年、４巻、第４３９５～４４００ページ　参照）が挙げられる。
　また、本発明においては、上述の蛍光タンパク質の代わりに、化学反応のエネルギーによって、蛍光タンパク質が電磁波（光）を出す、蛍光タンパク質とルシフェラーゼとの融合タンパク質（ナノ－ランタン（Ｎａｎｏ－ｌａｎｔｅｒｎ）、Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１２年、３巻、１２６２ページ　参照）も使用し得る。
　さらに、蛍光タンパク質の代わりに、蛍光色素に特異的に結合するタンパク質を用いることができる。かかるタンパク質を細胞内に発現させておき、該蛍光色素を細胞に導入することにより、蛍光タンパク質として使用することができるからである。このような蛍光色素に特異的に結合するタンパク質の例として、ＨａｌｏＴａｇ（プロメガ株式会社製）が挙げられる。
　本発明にかかる「第１の融合タンパク質」においては、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含み、第２の融合タンパク質との会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、Ｎ末側から順に、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質にて融合されてなるものであってもよく、第１のタンパク質、蛍光タンパク質及び多量化能を有するタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、多量化能を有するタンパク質、第１のタンパク質及び蛍光タンパク質にて融合されてなるものであってもよく、多量化能を有するタンパク質、蛍光タンパク質及び第１のタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、蛍光タンパク質、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び第１のタンパク質にて融合されてなるものであってもよい。
　本発明にかかる「第２の融合タンパク質」においては、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含み、第１の融合タンパク質との会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、蛍光輝点がより検出し易くなるという観点から、第２の融合タンパク質は、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質であることが好ましい（図２　参照）。また、蛍光タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質の間に融合させることができる。第２の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質としては、上述の通りであり、第１の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質と同一のものであってもよく、異なるものであってもよいが、タンパク質間相互作用の発生及び解消等に応じた、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の各々の細胞内局在の変化を追跡できるという観点から、第１の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質と第２の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質とは異なるものであることが好ましい。また、このように分光可能な異なる蛍光タンパク質を用いることにより、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の各々の発現量も測定することもできる。さらに、異なる蛍光タンパク質は、会合体（蛍光輝点）内部にて高い濃度で存在し、非常に近接することになるため、ＦＲＥＴ又は蛍光再吸収が生じ得る。そして、このような場合、画像化等せずとも、ＦＲＥＴ又は蛍光再吸収の結果、蛍光輝点から放射される蛍光の強度を測定することにより、タンパク質間相互作用を判定することが可能となる（蛍光再吸収については、「蛍光イメージング革命（第２７回）ＦＲＥＴを再吸収と区別して理解するために」　細胞工学　２５（１），６７－６９，２００６－０１　参照）。
　「第１の融合タンパク質」及び「第２の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。また、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、第１のタンパク質若しくは第２のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質の精製を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ－タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ－タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）－タグタンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
　本発明にかかる「細胞」としては特に制限はなく、真核細胞であってもよく、原核細胞であってもよく、例えば、動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）、植物細胞、酵母、大腸菌が挙げられる。また、かかる細胞は、生体外で培養した状態（例えば、培地中又は培地上にて生育している細胞）であってもよく、生体内に存在する状態（例えば、第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡと第２の融合タンパク質をコードするＤＮＡとが導入されているトランスジェニック動物内の細胞）であってもよい。また、本発明にかかる融合タンパク質等は、通常同一の細胞に導入又は発現させることになるが、異なる細胞であってもよい。そして、このような場合、サイトカインと受容体との相互作用、受容体間の相互作用等の、異なる細胞間のタンパク質間相互作用も判定することが可能となる。
　融合タンパク質の前記細胞内における発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。融合タンパク質の細胞における発現は、後述の本発明にかかるベクターを前記細胞に導入することにより行うことができる。細胞にベクターを導入する公知の手法としては、動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）、マイクロインジェクション法を利用した方法が挙げられる。また、昆虫細胞に対しては、バキュロウィルスを利用した方法が挙げられる。さらに、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法が挙げられる。さらに、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。
　また、本発明において、融合タンパク質の前記細胞内への導入は、当業者であれば細胞の種類に合わせて適宜公知の手法を選択して行うことができる。タンパク質を細胞に導入する公知の手法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法が挙げられる。
　本発明において検出する「蛍光輝点」は、本発明にかかるタンパク質間相互作用の結果、融合タンパク質等の会合体形成によって会合体に含まれる蛍光タンパク質の高密度の局在化が生じるものであり、典型的には、拡散状態で存在している蛍光タンパク質の蛍光強度よりも高い蛍光強度を有する、顕微鏡による二次元観察では、大きさ直径０．２～５μｍ（０．０３～２０μｍ2）の領域である。
　「蛍光輝点の検出」は、例えば、蛍光タンパク質に対応した励起フィルター及び吸収フィルターを備えた蛍光顕微鏡による観察、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーターによる解析により行うことができる。また、得られた画像を画像解析プログラム（例えば、後述のｉｃｙスポット検出プログラム）により処理することによっても、蛍光輝点を検出することができる。なお、かかる蛍光輝点の検出において、検出する蛍光輝点の特性（蛍光輝点が発する蛍光の波長、強度等）、並びに用いる装置及びプログラム等に合わせて、フィルター、検出器、各種パラメーター等の選択、設定は、当業者であれば適宜行うことができる。
　例えば、後述の実施例２に示す通り、スポット検出解析プログムＩｃｙ．５．４．２（Ｊ．－Ｃ．Ｏｌｉｖｏ－Ｍａｒｉｎ「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｏｔｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｍａｇｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ」　Ｐａｔｔｅｒｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．３５－９，１９８９～１９９６ページ，２００２年、ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｏｍ　参照）における、設定値　Ｓｐｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒプラグイン（Ｓｃａｌｅ１，Ｓｃａｌｅ２，Ｓｃａｌｅ３　全てにチェックを入れ、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を全て１００に設定した際の条件）にて検出可能な「解析プログラムで算出された単位当たりの蛍光強度値」が、バックグランド（例えば、陰性対照となる細胞における同蛍光強度値）の少なくとも２．０倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらにより好ましくは５．０倍以上、特に好ましくは１０倍以上であれば、蛍光輝点を検出できたと判定できる。
　本発明の方法においては、細胞において前記蛍光輝点が検出されれば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していると判定することができ、前記蛍光輝点が検出されなければ、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していないと判定することができる。
　以上、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の１態様について説明したが、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法は上記態様に限定されるものではない。例えば、前記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入し、その後、当該細胞内における各融合タンパク質の再構成を介し、タンパク質間相互作用を判定することも、本発明によれば可能となる。より具体的には、以下に示す第２～５の態様も本発明はとり得る。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法２＞
　本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第２の態様は、
　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法である
（１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　かかる方法によれば、後述の実施例１３及び１４において示す通り、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現したこととなる（図３　参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
　本発明にかかる「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」は、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質、並びに第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を各々含むものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、第１のタンパク質又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　さらに、「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」は、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、各々他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、第１のタンパク質又は第２のタンパク質と、多量化能を有するタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
　本発明にかかる「第５の融合タンパク質」は、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含むものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、蛍光タンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　さらに、「第５の融合タンパク質」は、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法３＞
　本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第３の態様は、下記工程（１）～（３）を含む方法である。
（１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　かかる方法によれば、後述の実施例１５において示す通り、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図４　参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
　本発明にかかる「アフィニティタグ」及び「結合パートナー」は、細胞内において結合し得る関係にあり、またタンパク質に結合できる化合物であれば特に制限はなく、例えば、相互作用することが知られているタンパク質の組み合わせを用いることができる。このような組み合わせとして、後述の実施例において示すような、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＦＫＢＰ１２等が好適に用いられ、また、光照射依存的に結合する、フィトクロームＢ（ＰＨＹＢ）及びフィとクローム結合因子（ＰＩＦ）、クリプトクロム２（ＣＲＹ２）及びクリプトクロム結合ｂＨＬＨ１（ＣＩＢ１）、ＬＯＶ及びｅＰＤＺ、Ｄｒｏｎｐａ１４５Ｋ－ＣＡＡＸ及びｍＮｅｐｔｕｎｅ等も好適に用いることができる（光照射依存的に結合するタンパク質の組み合わせについては、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、２０１４年、１５巻、８号、５５１～５５８ページ　参照）。さらに、ジヒドロ葉酸還元酵素、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ等の酵素を構成するサブユニットも好適に用いることができる。また、本発明にかかる「アフィニティタグ」及び「結合パートナー」としては、このような公知のタンパク質間相互作用を利用することのみならず、例えば、ビオチン及びアビジン、レクチン及び糖、プロテインＡ（又はＧ）及びイムノグロビン定常領域、抗原及び抗体等も利用することができる。
　アフィニティタグと結合パートナーとの結合は、抗原抗体反応のような自発的に生じるものであってもよく、刺激に応じて誘導されて生じるものであってもよい。かかる結合を誘導する刺激としては特に制限はなく、例えば、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２との結合を誘導するラパマイシンのような低分子化合物、ＰＨＹＢとＰＩＦとの結合等を誘導するような光照射が挙げられる。また、かかる刺激によって結合が誘導されるアフィニティタグ及び結合パートナーを用いる場合には、前記工程（１）、又は、前記工程（１）及び（２）の間に、細胞に当該刺激を与えることが必要となる。
　本発明にかかる「第１の標識化タンパク質」及び「第２の標識化タンパク質」は、第１のタンパク質及び第２のタンパク質が各々アフィニティタグによって標識されているものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、アフィニティタグは、第１のタンパク質又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末、さらには中間部の領域のいずれに結合させてもよい。
　本発明にかかる「第６の融合タンパク質」は、前記多量化能を有するタンパク質及び前記蛍光タンパク質を含み、かつ前記結合パートナーが結合されているものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、結合パートナーは、第６の融合タンパク質のＮ末、Ｃ末、さらには中間部の領域のいずれに結合させてもよい。また、「第６の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　前記アフィニティタグ又は結合パートナーの各タンパク質への「結合」としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの結合であってもよく、また化学的な結合であってもよい。遺伝子レベルでの結合は、前述又は後述の実施例において示すような、所謂「融合」であり、アフィニティタグ又は結合パートナーをコードするＤＮＡを、第１のタンパク質、第２のタンパク質又は第６の融合タンパク質をコードするＤＮＡに、その読み枠を合わせて付加又は挿入することにより達成される。また、化学的な結合は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエステル結合が挙げられる。
　また、第１の標識化タンパク質、第２の標識化タンパク質及び第６の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質（例えば、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質）の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法４＞
　本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第４の態様は、下記工程（１）～（３）を含む方法である。
（１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　かかる方法によれば、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって蛍光タンパク質が該細胞内において発現することになり、ひいては、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図５　参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
　本発明にかかる「第１の部分ペプチド」及び「第２の部分ペプチド」としては、細胞内において、これらペプチドが結合することにより、蛍光タンパク質を再構成できるものであればよい。なお、本発明において「再構成」とは、このように複数の部分ペプチドが結合することにより、それらが元来構成していたタンパク質が機能し得る状態（例えば、蛍光タンパク質であれば、蛍光を発し得る状態、多量化能を有するタンパク質であれば、多量体を形成し得る状態）に戻ることを意味する。
　また、このような再構成し得る部分ペプチドは、当業者であれば、例えば、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ　Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５年、２３巻、１０２～１０７ページ等の記載を参酌しながら、適宜設計、調製することができる。
　なお、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ　Ｓら、Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．、２０１３年１０月、４；３：２８５４等に記載の通り、蛍光タンパク質を３つ以上に分割しても再構成し得ることが明らかになっている。したがって、第１の部分ペプチド及び第２の部分ペプチドは、このような３以上の断片の中から選択されるものでもあってよい。また、この場合、第１及び第２の部分ペプチドとして用いなかった断片は、前記工程（１）、又は、前記工程（１）及び（２）の間に、細胞内において発現又は細胞に導入する必要がある。
　また、第１の部分ペプチド及び第２の部分ペプチドは各々、第１又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。さらに、第７の融合タンパク質、第８の融合タンパク質及び第９の融合タンパク質のいずれにおいて、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　また、第７の融合タンパク質、第８の融合タンパク質及び第９の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質の間（例えば、第１の部分ペプチドと第１又は第２のタンパク質との間、第２の部分ペプチドと多量化能を有するタンパク質との間）に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法５＞
　本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第５の態様は、下記工程（１）～（３）を含む方法である。
（１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　かかる方法によれば、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって多量化能を有するタンパク質が該細胞内において発現することになり、ひいては、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図６　参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、再構成された多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
　本発明にかかる「第３の部分ペプチド」及び「第４の部分ペプチド」としては、細胞内において、これらペプチドが結合することにより、多量化能を有するタンパク質を再構成できるものであればよく、当業者であれば、上述の通り、Ｏｈａｓｈｉ　Ｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．、２０１２年、５２巻、１号、４５～５０ページ等の記載を参酌しながら、かかる部分ペプチドを適宜設計、調製し得る。
　また、第３の部分ペプチド及び第４の部分ペプチドは各々、第１又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、第１０の融合タンパク質、第１１の融合タンパク質及び第１２の融合タンパク質のいずれにおいて、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　さらに、第１０の融合タンパク質、第１１の融合タンパク質及び第１２の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質の間（例えば、第３の部分ペプチドと第１又は第２のタンパク質との間、第４の部分ペプチドと蛍光タンパク質との間）に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
　以上、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第２～５の態様について説明したが、これらの方法においては、上記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入することになるため、解析対象となる第１又は第２のタンパク質に融合するタンパク質等のタグの分子量が小さくて済むことになる。故に、タンパク質間相互作用の判定等において、解析対象となるタンパク質の機能、局在の変化等はより阻害されにくくなる。
　また、このように、分子量の小さいタグが融合した状態にて解析対象となるタンパク質を細胞内に維持することができるため、上述の通り、化合物の添加や光照射等の刺激に応じて本発明にかかる融合タンパク質が再構成される系を構築することにより、タンパク質間相互作用を任意のタイミングにて判定し得る状態に設定することができる。
　また、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うこともできる。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法６＞
　解析対象を３以上のタンパク質とする場合には、上述の第１の態様を応用することにより、下記工程（１）～（３）を含む方法を、タンパク質間相互作用を判定するための方法の第６の態様として、本発明は提供することもできる。
（１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　かかる方法によれば、後述の実施例１６～１８において示す通り、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる（図７　参照）。
　本発明にかかる「第３のタンパク質」としては、上述の第１及び第２のタンパク質同様に、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質とは異なっていてもよく、そのうち２つが同一であってもよく、３つ全てが同じであってもよい。
　本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、タンパク質間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
　本発明にかかる「第１３の融合タンパク質」は、第１のタンパク質及び前記多量化能を有するタンパク質を含むタンパク質であればよく、また「第１４の融合タンパク質」は、第２のタンパク質及び前記多量化能を有するタンパク質を含むタンパク質であればよい。これら融合タンパク質において、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、前記多量化能を有するタンパク質は、第１又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよく、また各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　本発明にかかる「第１５の融合タンパク質」は、第３のタンパク質及び前記蛍光タンパク質を含むタンパク質であればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、前記蛍光タンパク質は、第３のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。またタンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
　＜タンパク質間相互作用を検出するための方法７＞
　本発明は、タンパク質間相互作用を判定するための第７の態様として、以下の方法も提供し得る。
　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）～（３）を含む方法
（１）　第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）　前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
　本発明にかかる「第１６の融合タンパク質」及び「第１７の融合タンパク質」は、多量化能を有するタンパク質（第１の多量化能を有するタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質）が異なるという点を除いては、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質と各々同様のタンパク質である。なお、第１のタンパク質と第２のタンパク質についても同様であり、これらタンパク質は異なっていてもよく、同一であってもよいが、後述の実施例において示す通り、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための第７の態様は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが異なっていている場合に、より有用である。
　以上、タンパク質間相互作用を判定するための好適な実施態様について説明したが、本発明は、これらの方法を利用する、以下に示す方法も提供することができる。
　＜タンパク質間相互作用の時間情報等を得るための方法＞
　後述の実施例２及び１１～１３等において示す通り、本発明の方法は、蛍光輝点の存在又は非存在を指標として、タンパク質間相互作用の発生のみならず、タンパク質間相互作用の消失を判定することができる。また、かかるタンパク質間相互作用の発生等を経時的に追跡することもできる。さらに、多量化能を有するタンパク質や蛍光タンパク質の局在等に影響を受けることなく、本発明においては細胞内の任意の領域においてタンパク質間相互作用を判定することもできる。
　したがって、本発明は、蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を判定する方法を提供することができる。
　このような「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の判定に関して、本発明においては、タンパク質間相互作用が生じる細胞内の領域をも特定することもできる。また、本発明によれば、「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の判定を通して、当該タンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達の発生及び消失、該シグナル伝達の発生若しくは消失するまでの時間並びに該シグナル伝達の持続時間を判定することができ、さらに該シグナル伝達が生じている細胞内の領域をも特定することもできる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用（又は、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用）が特定の刺激に応答して発生又は消失するものであっても、本発明において判定することができる。したがって、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激に応答するタンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を判定するために、前記蛍光輝点を検出する方法も提供することができる。
　本発明にかかる「特定の刺激」とは、タンパク質間相互作用を直接的に又は間接的に誘導又は阻害できる刺激であればよく、また細胞内で生じる内在性因子による刺激（例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の増減、酵素の活性化又は不活性化）であってよく、細胞に与えられる外部からの刺激（例えば、受容体に対するリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）の細胞への投与）であってもよい。
　また、本発明の方法においては、蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激の発生若しくは消失、該刺激の発生若しくは消失するまでの時間、又は該刺激の持続時間を判定することもできる。
　さらに、本発明の方法においては、特定の刺激の程度（例えば、特定の刺激が薬剤である場合には、その濃度）に応じたタンパク質間相互作用の増減も判定することができる。したがって、特定の刺激が薬剤である場合には、タンパク質間相互作用に対する、その薬剤の５０％効果濃度（ＥＣ５０）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、本発明によって決定することができる。
　また、本発明の方法においては、同一の細胞において、多種類のタンパク質間相互作用、特定の刺激に各々依存的な多種類のタンパク質間相互作用、ひいてはこれらタンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達も判定することができる。
　＜特定のタンパク質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法＞
　本発明においては、任意のタンパク質間相互作用を判定することができる。したがって、本発明は、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方を該特定のタンパク質とし、他方を被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。また、３以上のタンパク質間の相互作用を対象とする場合には、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１～３のタンパク質のうちの２つのタンパク質を該特定のタンパク質とし、残りの一つを被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。
　本発明にかかる「被検タンパク質」としては特に制限はない。網羅的に効率良く特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択できるという観点から、ｃＤＮＡライブラリーがコードするタンパク質群を好適に用いることができる。
　＜タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定方法＞
　後述の実施例２等に示す通り、本発明において、蛍光輝点の蛍光強度を通してタンパク質間相互作用の強弱を定量的に分析することもできる。したがって、本発明によれば、タンパク質間相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基（又は、第１～３のタンパク質中のアミノ酸残基）を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質（又は、第１～３のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質）を用い、前記蛍光輝点の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する方法を提供することができる。
　本発明にかかる「蛍光輝点の蛍光強度」には、一蛍光輝点の蛍光強度のみならず、一定領域内（例えば、一細胞内、蛍光顕微鏡観察における一視野内、一蛍光画像内）に存在する蛍光輝点の総蛍光強度も含まれる。
　「第１のタンパク質等に変異が導入されたタンパク質」の調製は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して行うことができる。かかる公知の手法としては、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法が挙げられる。
　＜タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニング方法＞
　前述の通り、本発明の方法において、蛍光輝点の蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用の強弱を把握することができる。したがって、本発明によれば、被検化合物存在下で、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、
を含む方法を提供することができる。
　本発明のスクリーニング方法において使用する被検化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
　また、被検化合物存在下の状態とは、例えば、被検化合物の培地への添加等による被検化合物と本発明にかかる細胞とが接触している状態や、被検化合物が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
　なお、本発明のスクリーニング方法は、蛍光輝点の強度を指標とするものであればよく、上記実施態様に限定されるものではない。したがって、別の態様として、以下に示す態様もとり得る。
　被検化合物存在下で、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　被検化合物存在下で、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　被検化合物存在下で、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　被検化合物存在下で、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　被検化合物存在下で、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　被検化合物存在下で、第１６の融合タンパク質と、第１７の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
　前記細胞内において、第１６の融合タンパク質と、第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
　前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
　＜本発明の方法に用いられるためのキット＞
　本発明は、上記方法に用いられるためのキットを提供することができる。本発明のキットは、下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含むキットである。
　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
　（ｇ）第１の融合タンパク質
　（ｈ）第２の融合タンパク質。
　本発明にかかるベクターとしては、上述の細胞において、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよい。かかる制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）が挙げられる。さらに、本発明にかかるベクターにおいては、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等）を含んでいてもよい。また、このような本発明にかかるベクターの態様としては、例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
　本発明にかかるベクターにおいてコードされるタンパク質は、上述の各融合タンパク質等であるが、かかるタンパク質の発現効率をより向上させるという観点から、当該タンパク質を発現させる細胞の種に合わせて、コドンを最適化したＤＮＡ（例えば、コドンがヒト化されたＤＮＡ）が、本発明にかかるベクターには、挿入されていてもよい。
　また、本発明にかかるベクターは、後述の実施例において示す通り、当業者であれば、適宜、ＤＮＡ化学合成法、遺伝子組み換え技術等の公知の技術を利用することにより、調製することができる。
　前記（ａ）に記載の「任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
　本発明にかかる融合タンパク質は、当業者であれば、これら融合タンパク質のヌクレオチド配列に基づき、無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用い、遺伝学的手法により合成し、調製することができる。また、本発明にかかる融合タンパク質は、そのアミノ酸配列に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成し、調製することができる。
　本発明にかかるベクター又は融合タンパク質の標品においては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
　本発明にかかる形質転換細胞は、前述の通り、本発明にかかるベクターを細胞に導入することにより調製することができる。また、本発明にかかる形質転換細胞の標品には、当該細胞の保存、培養に必要な培地、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加又は付属してあってもよい。
　本発明にかかる「使用説明書」は、前記ベクターや形質転換細胞を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明の標品に関する情報（例えば、ベクターの塩基配列やクローニングサイト等が示されているベクターマップ等の情報、形質転換細胞の由来、性質、当該細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
　なお、本発明のキットは、上記実施態様に限定されるものではなく、上述のタンパク質間相互作用を判定するための実施態様に応じ、以下のような態様もとり得る。
　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第２の方法に用いられるためのキット
　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第３の融合タンパク質
　（ｇ）第４の融合タンパク質
　（ｈ）第５の融合タンパク質。
　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第３の方法に用いられるためのキット
　（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
　（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１の標識化タンパク質
　（ｇ）第２の標識化タンパク質
　（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第４の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第７の融合タンパク質
　（ｇ）第８の融合タンパク質
　（ｈ）第９の融合タンパク質。
　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第５の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
　（ｆ）第１０の融合タンパク質
　（ｇ）第１１の融合タンパク質
　（ｈ）第１２の融合タンパク質。
　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第６の方法に用いられるためのキット
　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｆ）第１３の融合タンパク質
　（ｇ）第１４の融合タンパク質
　（ｈ）第１５の融合タンパク質。
　下記（ａ）～（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第７の方法に用いられるためのキット
　（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
　（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
　（ｅ）第１６の融合タンパク質
　（ｆ）第１７の融合タンパク質。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）
　本発明者らは、２つのタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）の相互作用の判定において、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質との利用を構想した（図１　参照）。より具体的には、これら２つの融合タンパク質を細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。
　そして、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを選択し、蛍光タンパク質として単量体アザミグリーン１（ｍＡＧ１）を選択し、実際にこの系の有効性について検証した。さらに、蛍光輝点の検出のし易さを考慮し、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の双方にｍＡＧ１が含まれている態様にて、本検証を行った（図２　参照）。また、ｍＡＧ１の発現においては、当該蛍光タンパク質をコードし、コドンをヒト化したＤＮＡ（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－ｃｏｄｏｎ　ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ａｚａｍｉ　Ｇｒｅｅｎ　１、ｈｍＡＧ１）を用いた。
　また、この検証においては、薬剤（ＡＰ１９０３又はＡＰ２０１８７）添加によりホモ２量体を形成することが知られているＦＫＢＰ１２タンパク質変異体を用いた。すなわち、今回の検証においては、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は同一のタンパク質となり、また第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は同一のタンパク質となる。なお、ＡＰ１９０３等により制御されるＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成については、ＴＩＭ　ＣＬＡＣＫＳＯＮら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、９５巻、第１０４３７～１０４４２ページ参照のこと。以下に本検出系を構築するための材料及び方法を示す。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒの作製＞
　本検出系において、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質からなる融合タンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ１を融合してなるタンパク質タグ（ＰＢ１－ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＮ末にｍＡＧ１を融合してなるタンパク質タグ（ｍＡＧ１－ＰＢ１）とを各々コードする発現ベクター（ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ）を作製した。すなわち、ＰＢ１－ｍＡＧ１をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：２７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。また、ｍＡＧ１－ＰＢ１をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：２９に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、このようにして得られた合成ＤＮＡをＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒを各々構築した。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
　次に、前記の通り作製したｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒを用い、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１を融合したＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクターを作製した。すなわち、ＦＫＢＰ１２変異体をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した前記ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を構築した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　次に、前記の通り作製したｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体をＨＥＫ２９３細胞に導入し、該細胞において本発明にかかる融合タンパク質を発現させた。すなわち、先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、遺伝子導入の前日に、このようにして培養したＨＥＫ２９３細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり２００μＬの培養液にて培養を行った。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬにｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体１００ｎｇを希釈し、ターボフェクトトランスフェクション試薬（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．４μＬ添加した後、攪拌した。そして、それを更に培養液１００μＬと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ＩＸ－７１倒立顕微鏡（オリンパス社製、対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター（オリンパス社製）及びＯＲＣＡ－ＥＲデジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）を用いて観察した。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成は、５００ｎＭ　Ｂ／Ｂホモダイメリザー（ＡＰ２０１８７、Ｂ／Ｂ　Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ、タカラバイオ社製）を培地に添加して誘導した。また、薬剤添加後、継時的に画像を取得した。得られた結果を図９に示す。
　図９に示した結果から明らかな通り、薬剤添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された（図９　左側の画像参照）。その後、薬剤添加３８分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察されるようになり（図９　真ん中の画像参照）、さらに観察を続けると、７６分後には明瞭な蛍光輝点を示す多数の細胞を観察することができた（図９　右側の画像参照）。したがって、本検証結果により、図１又は２に示す、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質からなるタンパク質タグを利用した系を用いることにより、ホモ２量体形成の判定、ひいてはタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。さらに、図９に示す通り、本発明によれば、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、その固有な細胞内環境であるところの細胞質内にて判定できることも明らかになった。
　（比較例１）
　本発明者らは、タンパク質間相互作用を判定する別の系、すなわち第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する系を発明している（特許文献４　参照）。
　そこで、当該系を用い、前述のＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成を判定し、前述の実施例１に記載の結果と比較することで、本発明の有効性を評価することにした。以下に特許文献４に記載の検出系を構築するための材料及び方法を示す。
　＜ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２変異体及びｐｈＡＧ－ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
　特許文献４に記載の検出系において、前記会合誘導タンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを選択し、また多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡＧを選択し、コドンをヒト化したＡＧをコードするＤＮＡ（ｈＡＧ）を用いた。
　そして、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にＦＫＢＰ１２変異体を融合してなる融合タンパク質をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を以下の通りに作製した。すなわち、ＦＫＢＰ１２変異体をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２変異体を構築した。
　また、ＡＧタンパク質のＣ末にＦＫＢＰ１２変異体を融合してなる融合タンパク質をコードする発現ベクター（ｐｈＡＧ－ＦＫＢＰ１２変異体）を、前記同様の方法にて、ｐｈＡＧ－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）にＦＫＢＰ１２変異体をコードする合成ＤＮＡを挿入することにより構築した。
　また、このようにして構築した発現ベクターを各１００ｎｇずつ混合、計２００ｎｇ混合し、実施例１に記載の＜細胞培養と遺伝子導入＞及び＜細胞の観察＞と同様の方法にて、薬剤添加前後の細胞内における蛍光輝点を検出した。得られた結果を図１０に示す。
　図１０に示す通り、特許文献４に記載の方法によってもＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点を検出できることが確認された。しかしながら、当該方法においては、薬剤添加後６６分の時点であっても、僅かな細胞において蛍光輝点が形成されるに留まっていた。したがって、本発明の方法は、国際公開第２０１３／０８４９５０号に記載の方法よりも、少なくともホモ２量体形成判定の効率の上では優れていることが明らかになった。
　（実施例２）
　次に、本発明の方法により、ホモ２量体の可逆的な形成を判定できるかどうか、すなわち一度形成された蛍光輝点がホモ２量体の解消に応じて消失するかどうかを検証した。
　前述のＢ／Ｂホモダイメリザー（ＡＰ２０１８７）により誘導され、形成されるＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体は、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンド（Ｂ／Ｂ　Ｗａｓｈｏｕｔ　Ｌｉｇａｎｄ、タカラバイオ社製）によって解消されることが知られている。そこで、以下に示す材料及び方法にて、前記検証を行った。
　＜ＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞の作製＞
　前記ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体をＨＥＫ２９３細胞に導入し、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を恒常的に発現する細胞を作製した。すなわち、前記発現ベクター導入の前日に、ＨＥＫ２９３細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍＬの前記培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬにｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬを添加した後、攪拌した。次いで、更に培養液６００μＬと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、さらに１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記にて樹立した、ＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞を実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察した。また、定常状態にて蛍光輝点が無いことを確認した後、５００ｎＭ　Ｂ／Ｂホモダイメリザーを培養液に加え、１５０分間、継時的に細胞を撮影した。なお、この観察において、前記実施例１同様に、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点の発生が確認された。次に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを含む培養液を、通常培養に用いる培養液に置換することにより細胞を洗浄した。その後、５００ｎＭ　Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加し、１００分間、継時的に画像を取得した。得られた結果を図１１に示す。
　＜画像解析＞
　前記方法により継時的に撮影した画像を、ｉｃｙ画像解析プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）のスポット検出（ｓｐｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて解析した。また、各画像にて、操作時間（分）をＸ軸とし、蛍光輝点の領域を線で囲い、その囲みの中の蛍光強度を合計した数値をＹ軸とし、グラフに示した。なお、ｓｐｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｏｒによる解析は、各パラメーター（各処理経路）を以下のようにセッティングして行った。
プレプロセッシング（Ｐｒｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）：無し、
検出（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）：冗長ウェーブレット変換による検出（ＵＤＷＴＷａｖｅｌｅｔＤｅｔｅｃｔｏｒ）、暗背景よりも明るい輝点を検出する（Ｄｅｔｅｃｔ　ｂｒｉｇｈｔ　ｓｐｏｔ　ｏｖｅｒ　ｄａｒｋ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）、
測定可能なスケール（Ｓｃａｌｅ　ｅｎａｂｌｅｄ）：スケール　３、閾値　５０。
得られた結果を図１２に示す。
　図１１に示した結果から明らかな通り、実施例１に示した結果同様に、薬剤添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された（図１１　左側の画像参照）。その後、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加してから９０分後には複数の細胞にて明瞭な蛍光輝点が観察された（図１１　真ん中の画像参照）。
　そして、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加した結果、大部分の蛍光輝点は消失することが明らかになった（図１１　右側の画像参照）。また、図１２に示したグラフから、蛍光輝点は段階的に形成し、消失することが見て取れたことから、本発明によって、該蛍光輝点の発生、消失を指標として、各薬剤添加に応じたタンパク質間相互作用の継時的な変化を捉えることができることが明らかになった。さらに、図１１に示す通り、本発明によれば、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体の形成及び消失を、その固有な細胞内環境であるところの細胞質内にて判定できることも明らかになった。また、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加した直後で、顕微鏡観察下で蛍光輝点の発生を確認し始めた際の蛍光強度の値は、添加前のその値の１．９倍であったことから、陰性対照（例えば、タンパク質間相互作用が生じる前の細胞）における蛍光強度の少なくとも２倍の値が検出できれば、タンパク質間相互作用を示す蛍光輝点が発生したと判定できることが明らかになった。
　以上の通り、本発明によれば、検出される蛍光輝点の発生、消失を指標としてタンパク質間相互作用における可逆的な変化を判定することができることも明らかになった。また、時間経過に従い、段階的に蛍光輝点が増加又は減少していく事から、本発明によりタンパク質間相互作用を定量的に分析することもできることが明らかになった。さらに、本発明にかかる融合タンパク質を細胞に導入し、該融合タンパク質を恒常的に発現する細胞を作製できたことから、前記融合タンパク質に含まれるタンパク質タグは細胞毒性等を示さない事が確認された。
　（実施例３）
　本発明により、ホモ多量体形成も判定できるかどうかを以下に示す材料及び方法にて検証した。なお、この検証は、ｐ５３タンパク質のホモ多量体形成を対象として行った（当該ホモ多量体形成については、Ｙｏｋｏ　Ｉｔａｈａｎａら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．、２００９年、２８４巻、８号、５１５８～５１６４ページ　参照のこと）。
　＜ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３及びｐｈｍＡＧ１－ｐ５３の作製＞
　ｐ５３をコードするヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿０００５３７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の５’末端及び３’末端に、各々ＢａｍＨＩ認識配列及び終止コドンとＮｏｔＩ認識配列が付加してなるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３及びｐｈｍＡＧ１－ｐ５３を作製した。
　＜ｐｐ５３－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１及びｐｐ５３－ｈｍＡＧ１の作製＞
　ｐ５３タンパク質のＮ末にタンパク質タグを有する融合タンパク質をコードする前記発現ベクターの他、Ｃ末にタンパク質タグを有する融合タンパク質をコードする発現ベクターも、以下に示す方法にて作製した。
　すなわち、ｐ５３をコードする前記合成ＤＮＡから終止コドンを除いた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｐ５３－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１及びｐｐ５３－ｈｍＡＧ１を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＵ２ＯＳ細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬにて、発現ベクター（ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３、ｐｈｍＡＧ１－ｐ５３、ｐｐ５３－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１又はｐｐ５３－ｈｍＡＧ１）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター混合溶液を培養細胞に添加し、さらに２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記にて、各遺伝子導入を行った細胞を、ヘキスト３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈したハンクス平衡塩液（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（同仁化学社製）からなるｐＨ７．４緩衝液中にて観察した。得られた結果を、図１３及び１４に示す。なお、図１３及び１４に示した顕微鏡写真は、対物レンズの倍率を４０倍にして観察した結果である。
　図１３に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３融合タンパク質を発現する細胞及びｐ５３－ｍＡＧ１－ＰＢ１融合タンパク質を発現する細胞、すなわち本発明にかかる融合タンパク質を発現させた細胞にて、明瞭な蛍光輝点の形成が確認された。
　一方、図１４に示す通り、ｍＡＧ１－ｐ５３融合タンパク質を発現する細胞及びｐ５３－ｍＡＧ１融合タンパク質を発現する細胞においては、蛍光輝点は観察されず、蛍光シグナルは分散した状態にて観察された。
　したがって、本発明によれば、ホモ２量体形成のみならず、ホモ多量体形成も判定することが可能であることが明らかになった。さらに、図１３に示す通り、本発明によれば、核内及び細胞質内において生じるｐ５３のホモ多量体形成を、一様な蛍光輝点の形成を通して、細胞内で偏りなく判定できることも明らかになった。また、本発明にかかるタンパク質タグを、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も確認された。
　（実施例４）
　上述のホモ多量体形成のみならず、ヘテロ多量体形成の判定においても、図１に示す系は有効であることを確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているＮｕｔｌｉｎ－３（ヌトリン－３）も本確認実験において用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ　ＬＴ　ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４～８４８ページ　参照）。さらに、本確認実験において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐＰＢ１－ｐ５３（７０）の作製＞
　ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ＰＢ１－ｐ５３（７０））を、第２の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐＰＢ１－ｐ５３（７０）ベクターを調製した。
　ｐＰＢ１－ｐ５３（７０）の作製においては、先ずｐ５３の一部（ｐ５３タンパク質の１～７０アミノ酸からなる領域（ｐ５３（７０））、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩ認識配列が付加してあり、当該ＤＮＡの３’末端に終止コドン及びＮｏｔＩ認識配列が付加してあるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２の作製＞
　ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＮ末に融合させたＭＤＭ２（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２）を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２ベクターを調製した。
　ｐＰＢ１－ＭＤＭ２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した
　なお、ｐＰＢ１－ＭＤＭ２は、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたＭＤＭ２タンパク質（ＰＢ１－ＭＤＭ２）を、第２の融合タンパク質として発現させるためのプラスミドベクターであり、その調製方法等については後述の実施例１３を参照のこと。
　＜ｐｐ５３（７０）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１の作製＞
　ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＣ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１））を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐｐ５３（７０）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１ベクターを調製した。
　ｐｐ５３（７０）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１の作製においては、先ず前記ｐ５３（７０）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端にＢａｍＨＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列を各々付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、以下に示す方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＰＢ１－ｐ５３（７０）及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２。
　先ずＨＥＫ２９３細胞を培養液（ＤＭＥＭ　高グルコース（ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）、１％　ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製））にて培養した。同細胞を遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬに各ベクター１００ｎｇを混合したＤＮＡ溶液を希釈し、Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を０．８μｌ添加した後、攪拌した。さらに培養液１００μｌと混合した後、培養細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ＩＸ－８１倒立顕微鏡、Ｕ－ＭＮＩＢＡ３フィルター（オリンパス社製）、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ　４．０デジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）を用いて観察した。ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤として、ヌトリン－３を最終濃度４０μＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。ヌトリン－３の添加前と添加してから３０分後の画像を図１５及び１６に示す。
　図１５及び１６に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１－ｐ５３（７０）及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２を発現する細胞、並びにｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２を発現する細胞において、明確な蛍光輝点が観察された。さらに、これら蛍光輝点はヌトリン－３の添加によって解消され、蛍光シグナルが分散したことから明らかな通り、当該蛍光輝点は、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。
　したがって、本発明によれば、ホモ多量体形成のみならず、ヘテロ多量体形成も判定できることが確認された。実施例３においても実証した通り、本発明にかかるタンパク質タグを、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も、実施例４において確認された。
　（実施例５）
　タンパク質間相互作用の判定における、図１に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（以下「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）」とも称する）とＦＫＢＰ１２タンパク質とであり、これらタンパク質は、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の存在下において相互作用することが知られている（Ｃｈｅｎ　Ｊ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．、１９９５年５月２３日、９２巻１１号、４９４７～４９５１ページ　参照）。また、本確認実験においても、実施例５同様に、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２の作製＞
　ＦＫＢＰ１２タンパク質のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２）を構築するに際して、先ずｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２ベクターを以下のようにして作製した。
　ＦＫＢＰ１２タンパク質（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿４６３４６０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）認識サイトと終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭCＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２）を構築した。
　次に、ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２を作製した。
　＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１の作製＞
　ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合しているタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）を、以下の通りにして調製した。　ｍＴＯＲタンパク質の一部（ｍＴＯＲタンパク質の２０２５～２１１４位のアミノ酸からなる領域、配列番号：４１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識サイトを各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ｃ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例４に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ｃ）ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例４に記載の方法と同様の方法にて観察した。また、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用の誘導剤として、ラパマイシンを最終濃度５００ｎＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。各薬剤の添加前と添加してから３０分後の画像を図１７に示す。
　図１７に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１を発現する細胞において、ラパマイシンを添加する前は、蛍光輝点が観察されなかった。しかし、ラパマイシンを添加してから３０分後には、蛍光輝点が観察された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が形成されたことから、これらの蛍光輝点はＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。
　したがって、実施例４においても実証した通り、本発明によれば、実施例１～３において示したようなホモ多量体形成に限らず、異なるタンパク質間の相互作用も検出できることが確認された。
　（実施例６）
　タンパク質間相互作用の判定における、図２に示す系の有効性について以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているヌトリン－３も本確認実験において用いた。さらに、本確認実験において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用いた。また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用い、当該蛍光タンパク質を、ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質双方に直接又は間接的に結合させてなる融合タンパク質を用いた。
　＜ｐＰＢ１ｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒの作製＞
　ＰＢ１ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ融合させてなるタンパク質をコードするＤＮＡ断片の両端に、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの認識サイトを各々配したＤＮＡ（配列番号：２７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。当該ＤＮＡをＮｈｅＩ及びＡｇｅＩで切断し、ＰＢ１ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをコードするDNAを除いたｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１ｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒプラスミドベクターを調製した。
　＜ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１の作製＞
　ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＣ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｍＡＧ１）を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１ベクターを調製した。
　ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１の作製においては、先ずｐ５３（７０）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端に、ＢａｍＨＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列をそれぞれ付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例５に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｐ５３（７０）－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐ５３（７０）－ＰＢ１－ｍＡＧ１及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＭＤＭ２。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例４に記載の方法と同様の方法にて観察した。すなわち、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤として、ヌトリン－３を最終濃度４０μＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。ヌトリン－３の添加前と添加してから３０分後の画像を図１８及び１９に示す。
　図１８及び１９に示した結果から明らかな通り、いずれの細胞においても明確な蛍光輝点が観察された。さらに、これら蛍光輝点はヌトリン－３の添加によって解消され、蛍光シグナルが分散したことから明らかな通り、当該蛍光輝点は、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。また、ｐ５３（７０）に直接融合するタンパク質をｍＡＧ１としても（前記（Ａ）の場合）、ＰＢ１ドメインとしても（前記（Ｂ）の場合）、本発明の方法においては変わることなく、タンパク質間相互作用を判定できることも確認された。
　（実施例７）
　タンパク質間相互作用の判定における、図２に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質とのタンパク質間相互作用であり、また当該相互作用を誘導するラパマイシンも本系において用いた。また、本確認実験においても、実施例７同様に、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１の作製＞
　ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合しているタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｍＡＧ１－ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１）を、以下の通りにして調製した。
　ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断し、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）断片を精製した。次いで、当該断片を、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ｃ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例５に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例５に記載の方法と同様の方法にて観察した。すなわち、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用の誘導剤として、ラパマイシンを最終濃度５００ｎＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。各薬剤の添加前と添加してから３０分後の画像を図２０及び２１に示す。
　図２０及び２１に示した結果から明らかな通り、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２を発現する細胞において、ラパマイシンを添加する前は、蛍光輝点が観察されなかった。しかし、ラパマイシンを添加してから３０分後には、蛍光輝点が観察された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が形成されたことから、これらの蛍光輝点はＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。
　実施例１～３においても実証した通り、図２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系の有効性が、実施例６及び７においても確認された。特に、本発明によれば、実施例１～３において示したようなホモ多量体形成に限らず、異なるタンパク質間の相互作用も図２に示す系においても判定できることが確認された。
　（実施例８）
　実施例１における蛍光タンパク質をｍＡＧ１からＤＧ１又はｍＣｈｅｒｒｙに変更し、以下に示す方法にて、本発明において用いる蛍光タンパク質はｍＡＧ１に限定されないことを確認した。
　＜ｐＰＢ１－ｈＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
　ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びＤｒｏｎｐａ―Ｇｒｅｅｎ１蛍光タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１－ＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１－ｈＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。
　ＤＧ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＢＡＤ７２８７４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＳｐｅＩ認識配列と、３’末端にＡｇｅＩ認識配列とを有するＤＮＡ配列を人工合成した。次いで、得られたＤＮＡをこれら制限酵素にて切断し、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＰＢ１－ｈＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を作製した。
　＜ｐＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
　ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。
　ｐＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２の作製においては、先ずｍＣｈｅｒｒｙ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＡＶ５２１６４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端に、ＳｐｅＩ認識配及びとＡｇｅＩ認識配列に各々付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＳｐｅＩとＡｇｅＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　ＰＢ１－ｈＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体又はＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体を、細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例４に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ－８１倒立顕微鏡、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ　４．０デジタルカメラを用いて観察した。ＤＧ１及びｍＣｈｅｒｒｙの観察には、それぞれＵ－ＭＮＩＢＡ３フィルター（オリンパス社製）及びＵ－ＭＷＩＧ３フィルター（オリンパス社製）を用いた。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体の形成は、５００ｎＭ　Ｂ／Ｂホモダイメリザーを加えて誘導した。当該薬剤を添加してから室温で静置し、添加してから１、２及び３時間経過後に細胞を観察した。薬剤の添加前と添加してから１、２及び３時間後の画像を、図２２及び２３に示す。
　図２２及び２３に示した結果から明らかなように、ＰＢ１－ＤＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞及びＰＢ１－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞の双方において、薬剤添加依存的な蛍光輝点の増加が観察された。したがって、本発明に用いる蛍光タンパク質はｍＡＧ１に限られないことが確認された。
　（実施例９）
　本発明において、多量化能を有するタンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン以外のタンパク質も利用できることを確認した。すなわち、実施例１に記載の方法において、当該ＰＢ１ドメインの代わりに、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインを用いて、ＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成の検出を、以下に示す材料及び方法にて行った。
　＜ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
　ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。
　Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ＰＢ１－ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体ベクターを作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ＦＢＳ及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライドに播種した。１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ　１０μＬにプラスミドを２００ｎｇ混合したＤＮＡ溶液を調製し、Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を０．８μｌ添加した後、攪拌した。それを更に培養液１００μｌと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ－８１倒立顕微鏡及びＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ　４．０デジタルカメラを用いて観察した。観察には、Ｕ－ＭＮＩＢＡ３フィルターを用いた。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成は、５００ｎＭ　Ｂ／Ｂホモダイメリザーを培地に添加し、誘導した。また、薬剤添加後、室温にて静置し、３時間経過後に細胞を観察した。薬剤の添加前と添加３時間後とに得られた画像を図２４に示す。
　図２４に示した結果から明らかな通り、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞において、この変異体のホモ２量体形成を誘導する薬剤の添加に応じ、蛍光輝点の発生が観察された。したがって、本発明において、多量体を形成できるタンパク質であれば利用できることが確認された。
　（実施例１０）
　実施例９同様に、本発明において、多量化能を有するタンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン以外のタンパク質も利用できることを確認した。すなわち、実施例３に記載の方法において、当該ＰＢ１ドメインの代わりに、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン又はＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインを用いて、ｐ５３タンパク質のホモ多量体形成の検出を、以下に示す材料及び方法にて行った。
　＜ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３の作製＞
　ｐ５３のＮ末に、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。
　Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１－ｐ５３に挿入することにより、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３ベクターを作製した。
　＜ｐＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３の作製＞
　ｐ５３のＮ末に、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。
　ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１、配列番号：４５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１－ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１－ｐ５３に挿入することにより、ｐＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３ベクターを作製した。
　＜ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３の作製＞
　ｐ５３のＮ末に、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。
　ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＴＥＬ－ｍＡＧ１、配列番号：４７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１－ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ｐ５３に挿入することにより、ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３ベクターを作製した。
　＜ｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３の作製＞
　ｐ５３のＮ末に、ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。
　ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ－ｍＡＧ１、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１－ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１－ｐ５３に挿入することにより、ｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３ベクターを作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ＦＢＳ及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライドに播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ　１０μＬにプラスミドを２００ｎｇ混合したＤＮＡ溶液を調製し、Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤ　を０．８μｌ添加した後、攪拌した。それを更に培養液１００μｌと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、４８時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ－８１倒立顕微鏡、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ　４．０デジタルカメラを用いて観察した。観察には、Ｕ－ＭＮＩＢＡ３フィルターを用いた。得られた結果を図２５に示す。
　図２５に示した結果から明らかな通り、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｍＡＧ１－ｐ５３を発現する細胞、ＰＫＣｉ－ｍＡＧ１－ｐ５３を発現する細胞、ＴＥＬ－ｍＡＧ１－ｐ５３を発現する細胞及びＤＧＫｄ－ｍＡＧ１－ｐ５３を発現する細胞のいずれにおいても、ｐ５３のホモ多量体形成を示す、蛍光輝点の発生が観察された。したがって、本発明において、多量体を形成できるタンパク質であれば利用できることが確認された。
　（実施例１１）
　本発明によって、シグナル伝達依存的に形成されるホモ２量体を検出できることを、以下に示す方法にて確認した。ＥＧＦ、ＧＰＣＲ等が関与するシグナル伝達経路が活性化されると、その下流に位置するＥＲＫ２がリン酸化され、活性化される。そして当該活性化に伴い、ＥＲＫ２はホモ２量体を形成することが知られている（Ｈａｒｖｅｙ　ＣＤら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、２００８年、１０５巻、４９号、１９２６４～１９２６９ページ、Ｋｈｏｋｈｌａｔｃｈｅｖ　ＡＶら、Ｃｅｌｌ、１９９８年、９３巻、４号、６０５～６１５ページ　参照）。そこで、本発明によって当該ホモ２量体形成の検出を試みた。なお、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。また、前記ＥＲＫ２の活性化は、細胞質及び核内にて生じることも明らかになっている（Ｅｂｉｓｕｙａ　Ｍら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．、２００５年、１１８（Ｐｔ　１４）、２９９７～３００２ページ　参照）。
　＜ｐＥＲＫ２－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１及びｐＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１の作製＞
　ＥＲＫ２のＣ末に、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合しているタンパク質（ＥＲＫ２－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＥＲＫ２－ＰＢ１－ｍＡＧ１）を発現させるためのベクター（ｐＥＲＫ２－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１及びｐＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１）を、以下の通りにして調製した。
　ＥＲＫ２（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿００２７３６．３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、ＸｈｏＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列が各々付加してなるヌクレオチド配列を設計した。次いで、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＸｈｏＩとＮｏｔＩとで切断した。また、同じ制限酵素の組み合わせにて、ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒを処理した。そして、前記合成ＤＮＡの断片を、これらベクターに挿入することにより、ＥＲＫ２－ｍＡＧ１－ＰＢ１及びＥＲＫ２－ＰＢ１－ｍＡＧ１をコードするベクター（ｐＥＲＫ２－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１及びｐＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１）を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＨＥＫ２９３細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ　１００μＬにて、発現ベクター（ｐＥＲＫ２－ｈｍＡＧ１－ＰＢ１又はｐＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター溶液を培養細胞に添加した。ｐＥＲＫ２－ｈｍＡＧ１ＰＢ１導入細胞については、ベクターを導入してから２０時間後に観察を行った。ｐＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１導入細胞については、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中で４時間培養し、血清飢餓状態とした。その後、ＩＸ－７１倒立顕微鏡（対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ－ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。ＥＲＫ２のホモ２量体形成は、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌとなるように同緩衝液に添加して誘導した。ＥＧＦ添加前、及び、添加８分後の画像を、図２６及び２７に示す。
　図２６に示した結果から明らかな通り、ＥＧＦ添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された。その後、ＥＧＦ添加８分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察された。
　また図２７に示した結果から明らかな通り、ＥＲＫ２－ＰＢ１－ｈｍＡＧ１を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞の全体において、ＥＲＫ２のホモ２量体形成を示す蛍光輝点が検出された。
　したがって、本発明によれば、細胞内シグナル伝達経路の活性化に伴うＥＲＫ２のホモ２量体形成を検出できることが確認された。また、蛍光輝点の検出を通して、ＥＲＫ２のリン酸化に伴う活性化、ひいてはその上流であるＥＧＦ等が関与するシグナル伝達経路の活性化も、本発明によって検出できることが確認された。
　（実施例１２）
　本発明によって、シグナル伝達依存的に形成されるホモ２量体を検出できることを、以下に示す方法にて確認した。すなわち、ＩＬ－６等が関与するシグナル伝達経路が活性化されると、その下流に位置するＳＴＡＴ３がリン酸化され、活性化される。そして当該活性化に伴い、ＳＴＡＴ３はホモ２量体を形成し、細胞外のシグナルが核内に伝達されることが知られている（Ｂｅｃｋｅｒ　Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３９４巻、６６８９号、１４５～１５１ページ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ＰＡら、Ｍｏｌ　Ｉｎｔｅｒｖ．、２０１１年、１１巻、１号、１８～２６ページ　参照）。そこで、本発明によってＳＴＡＴ３のホモ２量体形成の検出を試みた。なお、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３の作製＞
　ＳＴＡＴ３のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を融合しているタンパク質（ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３）を、以下の通りにして調製した。
　ＳＴＡＴ３（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿６４４８０５．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を付加し、当該ヌクレオチド配列の３’末端に、終止コドン及びＮｏｔＩ認識配列が付加してなるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＸｈｏＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３を作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＨＥＫ２９３細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％　ＦＢＳ及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ　１００μＬにて、発現ベクター（ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター混合溶液を培養細胞に添加した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記ＰＢ１－ｍＡＧ１－ＳＴＡＴ３を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中で４時間培養し、血清飢餓状態とした。その後、ＩＸ－７１倒立顕微鏡（対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ－ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。ＳＴＡＴ３のホモ２量体形成は、ヒトリコンビナントＩＬ－６（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように同緩衝液に添加して誘導した。ＩＬ－６添加前、及び、添加５０分後の画像を、図２８に示す。
　図２８に示した結果から明らかな通り、ＩＬ－６添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された。その後、ＩＬ－６添加５０分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察された。
　したがって、本発明によれば、細胞内シグナル伝達経路の活性化に伴うＳＴＡＴ３のホモ２量体形成を検出できることが確認された。また、蛍光輝点の検出を通して、ＳＴＡＴ３のリン酸化に伴う活性化、ひいてはその上流であるＩＬ－６等が関与するシグナル伝達経路の活性化も、本発明によって検出できることが確認された。
　（実施例１３）
　実施例１～１２において示した通り、タンパク質間相互作用の判定において、図１及び２に示す系は有効であることが明らかになった。次に、本発明者は、かかる系の別態様として図３に示す系を構想した。
　すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することが想定される。そして、かかる想定通りであれば、図１及び２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることが、図３に示す系においても想定される。
　そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図３に示す系の有効性について検証した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているヌトリン－３（Ｎｕｔｌｉｎ－３）も本検証において用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ　ＬＴ　ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４～８４８ページ　参照）。さらに、本検証において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｈｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐｐ５３－ＰＢ１及びｐＰＢ１－ＭＤＭ２の作製＞
　本発明にかかる第３及び第４の融合タンパク質、すなわちｐ５３タンパク質及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを含む融合タンパク質（ｐ５３－ＰＢ１）と、ＭＤＭ２タンパク質及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを含む融合タンパク質（ＰＢ１－ＭＤＭ２）とを、細胞内において発現させるため、以下に示す方法にて各融合タンパク質をコードする発現ベクターを作製した。
　ｐ５３タンパク質の一部（ｐ５３タンパク質の１～７０位のアミノ酸からなる領域、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなる領域、以下「ｐ５３（７０）」とも称する）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素サイトを配したＤＮＡ（配列番号：３３に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐ５３（７０）－ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１）を構築した。なお、ｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒのマルチクローニングサイトに任意のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて挿入することにより、該タンパク質のＣ末にリンカーペプチドを介してＡｓｈタンパク質タグ（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）が融合されたタンパク質を細胞内において発現させることが可能となる。
　また、ＭＤＭ２の一部（ＭＤＭ２タンパク質の１～１１９位のアミノ酸からなる領域、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素サイトを配したＤＮＡ（配列番号：３５に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ＰＢ１－ＭＤＭ２をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１－ＭＤＭ２）を構築した。なお、ｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒのマルチクローニングサイトに任意のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて挿入することにより、該タンパク質のＮ末にリンカーペプチドを介してＡｓｈタンパク質タグ（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）が融合されたタンパク質を細胞内において発現させることが可能となる。
　＜ｐｈｍＡＧ１ＰＢ１の作製＞
　前記第５の融合タンパク質を細胞内において発現させるため、以下に示す方法にて発現ベクターを作製した。すなわち先ず、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインからなる融合タンパク質（ｍＡＧ１－ＰＢ１）をコードする発現ベクター（ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１）を構築した。
　＜ｍＡＧ１－ＰＢ１を恒常的に発現する細胞の作製＞
　次に、前記にて作製したｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１をＨｅＬａＳ３細胞に導入し、本発明にかかる第５の融合タンパク質（ｍＡＧ１－ＰＢ１）を恒常的に発現する細胞を樹立した。すなわち、先ず、ＨｅＬａＳ３細胞を、１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を添加したＤＭＥＭ（低グルコース、ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、遺伝子導入の前日に、ＨｅＬａＳ３細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍＬの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬに、ｐｈｍＡＧ１－ＰＢ１　１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２０時間培養した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　前記細胞にて、恒常的に発現させているｍＡＧ１－ＰＢ１に加え、ｐ５３（７０）－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２を発現させるために、以下に示す方法にてｐｐ５３（７０）－ＰＢ１及びｐＰＢ１－ＭＤＭ２を該細胞に導入した。
　すなわち先ず、前記にて樹立したｍＡＧ１－ＰＢ１を恒常的に発現する細胞を、１０％　ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社）及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり２００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬに、ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１及びｐＰＢ１－ＭＤＭ２を１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ターボフェクト（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．４μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液１００μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。
　また、陰性対照として、ｐｐ５３（７０）－ＰＢ１及びｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒを１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液、並びにｐＰＢ１－ＭＤＭ及びｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒを１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を各々、ｍＡＧ１－ＰＢ１を恒常的に発現する細胞に、前記同様の方法にて導入した。
　＜細胞の観察＞
　前記にて調製した、以下に示す３種の細胞を実施例１に記載の方法にて観察した
　ｍＡＧ１－ＰＢ１が恒常的に発現し、更にｐ５３（７０）－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２が発現している細胞、
　ｍＡＧ１－ＰＢ１が恒常的に発現し、更にｐ５３（７０）－ＰＢ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞（陰性対照）、
　ｍＡＧ１－ＰＢ１が恒常的に発現し、更にＰＢ１－ＭＤＭ及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞（陰性対照）。
得られた結果を図２９に示す。
　また、前記ｐ５３（７０）－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２が発現している細胞にヌトリン－３を最終濃度が２０μＭになるよう添加することにより、ｐ５３及びＭＤＭ２間相互作用を阻害する条件下においても当該細胞を観察した。得られた結果を図３０に示す。なお、図２９は実施例１同様に対物レンズの倍率を２０倍にして観察した結果を示しているが、図３０は対物レンズの倍率を４０倍にして観察した結果を示すものである。
　図２９に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１－ＰＢ１、ｐ５３（７０）－ＰＢ１及びＰＢ１－ＭＤＭ２が発現している細胞において、蛍光輝点が検出された（図２９の左側の画像　参照）。他方、ｍＡＧ１－ＰＢ１、ｐ５３（７０）－ＰＢ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞、並びに、ｍＡＧ１－ＰＢ１、ＰＢ１－ＭＤＭ２及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞においては、蛍光輝点が検出されなかった。
　さらに、図３０に示す通り、蛍光輝点が検出された前記細胞にヌトリン－３を添加し、その１５分後に観察したところ、蛍光輝点は消失していた。したがって、この蛍光輝点は、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用に依存して形成されたものであることが確認された。
　（実施例１４）
　実施例１３同様に、タンパク質間相互作用の判定における、図３に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質とのタンパク質間相互作用であり、また当該相互作用を誘導するラパマイシンも本系において用いた。さらに、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。
　＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１の作製＞
　本発明にかかる第３の融合タンパク質として、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１）を発現させるためのベクターを、実施例５に記載の通りに作製した。
　＜ｐＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）の作製＞
　本発明にかかる第３の融合タンパク質として、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ））を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ））を、以下の通りに作製した。
　ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）認識サイトと終止コドンとを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ））を構築した。
　＜ｐＦＫＢＰ１２－ＰＢ１の作製＞
　本発明にかかる第４の融合タンパク質として、ＦＫＢＰ１２タンパク質のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐＦＫＢＰ１２－ＰＢ１）を、以下の通りに作製した。
　ＦＫＢＰ１２タンパク質（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿４６３４６０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識サイトを各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐＦＫＢＰ１２－ＰＢ１）を構築した。
　＜ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２の作製＞
　本発明にかかる第４の融合タンパク質として、ＦＫＢＰ１２タンパク質のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＰＢ１－ＦＫＢＰ１２）を、実施例５に記載の通りに調製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
（Ａ）ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）、ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｂ）ＰＢ１－ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）、ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１、ＰＢ１－ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｄ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）－ＰＢ１、ＦＫＢＰ１２－ＰＢ１及びｍＡＧ１ＰＢ１
　上記（Ａ）～（Ｄ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を発現させるために、以下に示す方法にて各ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
　すなわち先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ＦＢＳ及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を９６ウェルマルチウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１４０μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ　１０μＬに、各プラスミドベクターを１３３ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記にて調製した細胞の培養液を除き、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液１００μＬを添加した。次いで、細胞をＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００を用いて観察した。また、各ウェルに、最終濃度５００ｎＭとなるようにラパマイシンを添加し、室温で１時間静置した後、細胞を観察した。得られた結果を図３１に示す。
　図３１に示した結果から明らかなように、ラパマイシン添加前は、いずれの細胞においても、蛍光輝点は検出されなかった。しかし、ラパマイシンを添加した結果、蛍光輝点が検出された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が検出されたことから、この蛍光輝点は、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２との相互作用に依存して形成されたものであることが確認された。また、本発明にかかるタンパク質タグ（多量化能を有するタンパク質又は蛍光タンパク質を含むタンパク質）を、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も、本実施例において確認された。
　以上、実施例４及び５において示した通り、本発明によれば、図３に示すように、多量化能を有するタンパク質どうしの自己会合を介し、細胞内において多量化能を有するタンパク質と蛍光タンパク質とを会合させることによっても、タンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。さらに、本発明にかかる第５の融合タンパク質を恒常的に発現する細胞を樹立できたことから、該タンパク質は細胞毒性等を示さない事が確認された。
　また、図３に示す方法において、解析対象となるタンパク質（第１及び第２のタンパク質）に融合させるタンパク質は、多量化能を有するタンパク質である。一方、図１及び２に示す方法においては、解析対象となるタンパク質に融合させるタンパク質には、多量化能を有するタンパク質に加え、蛍光タンパク質も含まれる。したがって、図３に示す方法は、図１及び２に示す方法と比較して、解析対象となるタンパク質に融合するタンパク質タグの分子量が小さくて済むため、解析対象となるタンパク質の機能はより阻害されにくくなる。
　さらに、図３に示す方法においては、実施例４に記載の通り、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うことができる。
　（実施例１５）
　以上の通り、タンパク質間相互作用の判定において、図１～３に示す系は有効であることが明らかになった。次に、本発明者は、かかる系の別態様として図４に示す系を構想した。
　すなわち、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、これらタンパク質の発現に伴い、図１及び２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図４に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、細胞膜貫通タンパク質　ＣＤ８０のホモ２量体形成である。また、その陰性対照として細胞内でモノマーとして存在することが知られている、細胞膜貫通タンパク質　ＣＤ２も用いた（これらタンパク質のタンパク質間相互作用に関しては、Ｊａｍｅｓ　ＪＲら、Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００６年、３巻、１２号、１００１～１００６ページ　参照）。
　＜ｐＣＤ８０－ＦＲＢの作製＞
　アフィニティタグとして前記ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）を選択し、このタグを融合させたＣＤ８０タンパク質（ＣＤ８０－ＦＲＢ）を、第１及び第２の標識化タンパク質として細胞内において発現させるべく、以下の通りにｐＣＤ８０－ＦＲＢベクターを調製した。
　先ず、ＣＤ８０（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセッション番号：ＮＰ＿００５１８２．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤ８０－ｈｍＡＧ１ベクターを構築した。
　次に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩの認識配列、並びに終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理し、ｈｍＡＧ１領域を除いたｐＣＤ８０－ｈｍＡＧ１に挿入することにより、ＣＤ８０－ＦＲＢをコードする発現ベクター（ｐＣＤ８０－ＦＲＢ）を構築した。
　＜ｐＣＤ２－ＦＲＢの作製＞
　前記同様に、アフィニティタグとしてｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）を融合させたＣＤ２タンパク質（ＣＤ２－ＦＲＢ）を、第１及び第２の標識化タンパク質として細胞内において発現させるべく、以下の通りにベクターを調製した。
　先ず、ＣＤ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ５１９４６．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤ２－ｈｍＡＧ１を構築した。
　次に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ　ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩの認識配列、並びに終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理し、ｈｍＡＧ１領域を除いたｐＣＤ２－ｈｍＡＧ１に挿入することにより、ＣＤ２－ＦＲＢをコードする発現ベクター（ｐＣＤ２－ＦＲＢ）を構築した。
　＜ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２の調製＞
　アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーとしてＦＫＢＰ１２を、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインを、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を選択した。そして、これらタンパク質が融合してなる、ＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２を、第６の融合タンパク質として細胞内において発現させるべく、実施例５に記載の通り、ｐＰＢ１－ｈｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２ベクターを調製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて、融合タンパク質を発現させるべく、以下に示す方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＣＤ８０－ＦＲＢ及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２
（Ｂ）ＣＤ２－ＦＲＢ及びＰＢ１－ｍＡＧ１－ＦＫＢＰ１２。
　すなわち先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、培養液（ＤＭＥＭ　高グルコース、１０％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン・ストレプトマイシン）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を８ウェルチャンバーに播種し、１ウェルあたり１００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ　１０μＬに、各プラスミドを２００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　観察前に、遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞の培養液を、５００ｎＭのラパマイシンを含有する観察緩衝液（ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなる、ｐＨ７．４の緩衝液）に置換した。当該薬剤を添加した緩衝液に置換した後、室温で３０分間静置した。そして、ＩＸ－７１倒立顕微鏡、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ－ＥＲデジタルカメラを用いて、細胞を観察した。得られた結果を、図３２に示す。
　図３２に示す通り、ＣＤ８０を検出対象として用いた場合には、細胞膜において蛍光輝点が観察された。一方、ＣＤ２を検出対象として用いた場合には、蛍光輝点が観察されなかった。したがって、図４に示した系の有効性が確認された。
　また、図４に示す本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法においては、図３に示す方法同様に、解析対象となるタンパク質に直接又は間接的に蛍光タンパク質を融合させることを要さない。そのため、図１及び２に示す方法と比較して、解析対象となるタンパク質に融合するタンパク質タグの分子量が小さくて済むため、解析対象となるタンパク質の機能はより阻害されにくくなる。
　また、このように、分子量の小さいタグが融合した状態にて解析対象となるタンパク質を細胞内に維持することができるため、上述の通り、ラパマイシン添加等の刺激に応じて本発明にかかる融合タンパク質が再構成される系を構築することにより、タンパク質間相互作用を任意のタイミングにて判定し得る状態に設定することができる。
　さらに、蛍光タンパク質を含む第６の融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うこともできる。
　また、ＣＤ８０等の細胞膜貫通タンパク質は、ゴルジ体等の細胞内小器官を通過して細胞膜へと局在する。そのため、当該タンパク質をタグと融合させて発現させた場合には、同器官を通過して細胞膜に到達することは困難となる、ゆえに、一般的に、細胞質タンパク質等における相互作用とは異なり、細胞膜タンパク質のそれを検出することは困難であると言われている。
　一方、本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法によれば、融合させるタグは比較的小さく済むので、細胞膜貫通タンパク質の細胞膜への到達が容易となる。そして、当該タグが融合した状態で細胞膜貫通タンパク質を膜上に発現させ、細胞質に発現させた多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を、あとからそのタグに結合させることによって、図２６に示した結果から明らかなように、ＣＤ８０等の細胞膜貫通タンパク質におけるタンパク質間相互作用をも容易に検出することが可能となる。
　さらに、この第３の判定方法を用いることにより、ＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ／ＢｉＦＣ等、タグの近接を利用する手法では検出できない、別々の細胞間におけるタンパク質間相互作用（例えば、ＰＤ１とＰＤＬ１とのタンパク質間相互作用）を判定することも可能となる。
　（実施例１６）
　次に、本発明者は、図１等に示した系に基づき、３以上のタンパク質間の相互作用を検出するための一態様として、図７に示す系を構想した。
　すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。
　そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、ｐ５０、ｐ６０及びＩκＢαによるヘテロ３量体形成である。
　なお、ｐ５０とｐ６５とはヘテロ２量体を形成し、ＮＦκＢを構成することが知られている。さらに、ＮＦκＢは炎症性サイトカインの発現調節を担う転写因子として核内で機能するが、ＩκＢαとさらに相互作用することによって細胞質に保持され、その転写機能は抑制されることが知られている（Ｍａｒｃ　Ｄ．Ｊａｃｏｂｓら、Ｃｅｌｌ、１９９８年１２月１１日、９５巻、７４９～７５８ページ　参照）。したがって、本実施例において、ｐ５０、ｐ６５各々に多量化能を有するタンパク質を融合し、ＩκＢαには蛍光タンパク質を融合させて、細胞内に発現させることで、ｐ５０とｐ６５との相互作用によって形成される会合体に、さらに蛍光タンパク質を融合したＩκＢαが集積する事で、蛍光輝点が形成され、３量体複合体を検出できることを確認した。
　＜ｐＰＢ１－ｐ５０の作製＞
　細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたｐ５０タンパク質（ＰＢ１－ｐ５０）を、第１３の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＰＢ１－ｐ５０ベクターを構築した。
　ｐ５０（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿００３９８９．２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１－ｐ５０を作製した。
　＜ｐｐ６５－ＰＢ１の作製＞
　細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたｐ６５タンパク質（ｐ６５－ＰＢ１）を、第１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｐ６５－ＰＢ１ベクターを構築した。
　ｐ６５（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿０６８８１０．３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６５－ＰＢ１ベクターを作製した。
　＜ｐｈｍＫＯ２－ＩκＢαの作製＞
　細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＫＯ２をＮ末に融合させたＩκＢαタンパク質（ｍＫＯ２－ＩκＢα）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｈｍＫＯ２－ＩκＢαベクターを構築した。
　ＩκＢα（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿０６５３９０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＫＯ２－ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐｈｍＫＯ２－ＩκＢαベクターを作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、実施例１２に示す方法と同様の方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＰＢ１－ｐ５０、ｐ６５－ＰＢ１及びｍＫＯ２－ＩκＢα
（Ｂ）ＰＢ１－ｐ５０及びｍＫＯ２－ＩκＢα（陰性対照）。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞は、ＩＸ－７１倒立顕微鏡、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０デジタルカメラを用いて観察した。得られた結果を図３３に示す。
　図３３に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１－ｐ５０、ｐ６５－ＰＢ１及びｍＫＯ２－ＩκＢαを細胞内にて発現させた場合に、蛍光輝点が検出された。一方、ＰＢ１－ｐ５０及びｍＫＯ２－ＩκＢαを細胞内にて発現させた場合には、蛍光輝点を検出することができなかった。したがって、図７に示す通り、ｐ５０とｐ６５が相互作用することにより、多量化能を有するタンパク質を利用して会合体が形成され、そこへ蛍光タンパク質を融合したＩκＢαがさらに集積することによって、蛍光輝点が生じることが確認された。すなわち、当該蛍光輝点の検出を介して、３種のタンパク質間の相互作用を判定できることが確認された。
　（実施例１７）
　実施例１６同様に、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、ＣＤＫ４、ＣｙｃｌｉｎＤ１及びｐ２１によるヘテロ３量体形成である。細胞の核内にて、ｐ２１は、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体を認識し、相互作用することが知られている（ＬａＢａｅｒ　Ｊら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．、１９９７年４月１日、１１巻７号８４７～８６２ページ　参照）。そして、かかるヘテロ３量体の形成により、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体によって促進される細胞周期の進行（Ｇ１期からＳ期への移行）が阻害されることも明らかになっている。
　＜ｐｐ２１－ＰＢ１の作製＞
　細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたｐ２１タンパク質（ｐ２１－ＰＢ１）を、第１３の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｐ２１－ＰＢ１ベクターを構築した。
　ｐ２１（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿５１０８６７．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ２１－ＰＢ１ベクターを作製した。
　＜ｐＣＤＫ４－ＰＢ１の作製＞
　細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたＣＤＫ４タンパク質（ＣＤＫ４－ＰＢ１）を第１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣＤＫ４－ＰＢ１ベクターを構築した。
　ＣＤＫ４（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿００００６６．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤＫ４－ＰＢ１ベクターを作製した。
　＜ｐＣＤＫ４の作製＞
　陰性対照として、他のタンパク質を融合させていないＣＤＫ４タンパク質（ＣＤＫ４）を発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣＤＫ４ベクターを構築した。
　ＣＤＫ４をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩの認識配列と、終止コドン及びＮｏｔＩの認識配列とを、各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤＫ４ベクターを作製した。
　＜ｐｈｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１＞
　細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１をＮ末に融合させたＣｙｃｌｉｎＤ１タンパク質（ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｈｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１ベクターを構築した。
　ＣｙｃｌｉｎＤ１（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　アクセション番号：ＮＰ＿４４４２８４．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩの認識配列と、終止コドン及びＮｏｔＩの認識配列とを、各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１ベクターを作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、実施例１４に示す方法と同様の方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１－ＰＢ１及びＣＤＫ４－ＰＢ１
（Ｂ）ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１－ＰＢ１及びＰＢ１（陰性対照）
（Ｃ）ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１－ＰＢ１及びＣＤＫ４（陰性対照）
　なお、（Ｂ）においては、ＰＢ１（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）を発現させるべく、ｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒを細胞に導入した。
　＜細胞の観察＞
　遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞は、実施例１４に示す方法と同様の方法にて観察した。得られた結果を図３４に示す。
　図３４に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１－ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１－ＰＢ１及びＣＤＫ４－ＰＢ１を発現する細胞では、蛍光輝点が検出された。一方、ＣＤＫ４を細胞内にて発現させなかった場合、多量化能を有するタンパク質を融合させずにＣＤＫ４を細胞内にて発現させた場合においては、蛍光輝点を検出することができなかった。したがって、図７に示す通り、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とが相互作用することにより、多量化能を有するタンパク質と蛍光タンパク質とを有する複合体が形成され、そこへ多量化能を有するタンパク質を融合したｐ２１が相互作用することで、蛍光輝点が生じることが確認された。すなわち、当該蛍光輝点の検出を介して、３種のタンパク質間の相互作用を判定できることが確認された。
　（実施例１８）
　実施例１６及び１７同様に、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）と、ミオシン軽鎖キナーゼ２（ｍｙｏｓｉｎ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２）の部分配列（Ｍ１３ペプチド、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ）とによる４量体形成である。カルモジュリンとＭ１３ペプチドとの相互作用は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がリガンドを受容した際に生じる細胞内カルシウムイオン濃度の一過的な上昇（セカンドメッセンジャー）に応答して発生することが明らかになっている（Ｍｉｙａｗａｋｉ　Ａ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年８月２８日、３８８巻、６６４５号、８８２～８８７ページ　参照）。また、カルモジュリンと、Ｍ１３ペプチド等のカルモジュリン結合ペプチドとの相互作用によって、これら各２分子からなる４量体が形成されることも明らかになっている（Ｙｅ　Ｑ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年１月２４日、４５巻、３号、７３８～７４５ページ　参照）。そこで、かかる４量体形成を、図７に示した系によって検出できることを、以下に示す材料及び方法にて確認した。さらに、蛍光輝点の検出を通じて、細胞内カルシウムイオン濃度の経時的な変化を検出することも確認した。
　＜ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１の作製＞
　細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたＭ１３ペプチド（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１）を、第１３及び１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１ベクターを構築した。
　Ｍ１３ペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５０に記載のヌクレオチド配列）の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ－ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１ベクターを作製した。
　＜ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＡＧ１及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＵｋＧ１の作製＞
　細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１をＣ末に融合させたカルモジュリンタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＡＧ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、または蛍光タンパク質としてｍＵｋＧ１をＣ末に融合させたカルモジュリンタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＵｋＧ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＡＧ１ベクター及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＵｋＧ１ベクターを構築した。
　カルモジュリンをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５２に記載のヌクレオチド配列）の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＵｋＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ（いずれも株式会社医学生物学研究所社製）各々に挿入する事により、ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＡＧ１ベクター及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｈｍＵｋＧ１ベクターを作製した。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、以下に示す方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨｅＬａＳ３細胞に導入した。
（Ａ）Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＡＧ１及びＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１
（Ｂ）Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＵｋＧ１及びＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１
　先ず、ＨｅＬａＳ３細胞を、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を含有するＤＭＥＭ（低グルコース）にて培養した。次いで、ＨｅＬａＳ３細胞を遺伝子導入の前日に３５ｍｍガラスベースディッシュ（旭硝子社製）に播種した。そして、遺伝子導入の際には、ＯｐｔｉＭＥＭにプラスミド（１μｇ＋１μｇ）を希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μｌ添加し、攪拌した。さらに培養液６００μｌと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２２時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記にて遺伝子導入し、２２時間培養したＨｅｌａＳ３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中にて、ＩＸ－７１倒立顕微鏡、Ｕ－ＭＧＦＰＨＱフィルター、ＯＲＣＡ－ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。その後、１００μＭ　ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、和光純薬工業社製）を添加し、継時的に蛍光画像を撮影した。なお、ヒスタミンは、ＨｅＬａＳ３細胞にも発現しているＧＰＣＲの１種　Ｈ１レセプターのリガンドとして機能することが明らかになっている。得られた結果を図３５及び３６に示す。
　図３５及び３６に示した結果から明らかなように、リガンド（ヒスタミン）添加前は、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＡＧ１及びＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｍＵｋＧ１は細胞内に拡散して存在していたが、リガンドを添加してから６０秒後には、蛍光輝点の発生が検出され、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰＢ１を含む会合体の形成が確認された。また、図３５に示す通り、その後も継続して観察した結果、リガンド添加に伴って一過的に上昇した細胞質カルシウムイオン濃度が、その後低下したことに伴い、リガンド添加３００秒後には蛍光輝点（会合体）は消失した。
　したがって、本発明によって、このようなヘテロ４量体形成も検出できることが確認された。さらに、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法を利用することにより、Ｈ１レセプターからのシグナル伝達により、一過的に上昇するカルシウムイオン濃度の実時間測定が可能であることも明らかになった。また、この実施例の結果から、ひいては、タンパク質間相互作用を発生させるセカンドメッセンジャー等の内在性因子、該セカンドメッセンジャー等が寄与するシグナル伝達、及び該シグナル伝達を惹起する細胞外リガンド等の外部からの刺激の検出並びにスクリーニングに適用できることも示された。
　（実施例１９）
　本発明者らは、上記結果に基づき、タンパク質間相互作用を判定するための系として、図８に示す系を構想した。
　すなわち、第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入し、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは異なるタンパク質であり、また第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質である場合、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用し、さらに多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導されることにより、融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。
　そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図８に示す系の有効性について確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤　ヌトリン－３も本検証において用いた。さらに、本検証において、多量化能を有するタンパク質として、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインを適宜組み合わせて用いた。また、蛍光タンパク質として、ｍＡＧ１タンパク質を用いた。なお、図８に示す系においては、タンパク質相互作用の解析対象である１のタンパク質のみに蛍光タンパク質を融合させているが、本実施例においては双方のタンパク質に融合して検証を行った。
　＜各種融合タンパク質を発現させるためのプラスミドベクターの調製＞
　上述の通りに調製した、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３、ｐＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３、ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３及びｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて制限酵素処理し、ヌクレオチド断片　Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１、ＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１、ＴＥＬ－ｈｍＡＧ１及びＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１を調製した。そして、これらを同制限酵素にて処理し、ＰＢ１領域を除いたｐＰＢ１－ｐ５３（７０）に、各々挿入することにより、以下のプラスミドベクターを調製した。
（ａ）ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３（７０）、
（ｂ）ｐＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３（７０）、
（ｃ）ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３（７０）、
（ｄ）ｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ｐ５３（７０）。
　また、実施例４において調製したｐＰＢ１－ＭＤＭ２を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理し、ＰＢ１領域を除いた後、前記ヌクレオチド断片を各々挿入することにより、以下のプラスミドベクターも調製した。（ｅ）ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２、
（ｆ）ｐＰＫＣｉ－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２、
（ｇ）ｐＴＥＬ－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２、
（ｈ）ｐＤＧＫｄ－ｈｍＡＧ１－ＭＤＭ２。
　＜細胞培養と遺伝子導入＞
　前述の通りにして調製したプラスミドベクター（ａ）～（ｈ）を、下記組み合わせにて、以下に示す方法により、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
組み合わせ１：プラスミドベクター（ｂ）及び（ｈ）、
組み合わせ２：プラスミドベクター（ｂ）及び（ｇ）、
組み合わせ３：プラスミドベクター（ａ）及び（ｆ）、
組み合わせ４：プラスミドベクター（ａ）及び（ｈ）、
組み合わせ５：プラスミドベクター（ａ）及び（ｇ）、
組み合わせ６：プラスミドベクター（ｄ）及び（ｆ）、
組み合わせ７：プラスミドベクター（ｄ）及び（ｇ）、
組み合わせ８：プラスミドベクター（ｃ）及び（ｅ）、
組み合わせ９：プラスミドベクター（ｃ）及び（ｈ）。
　ＨＥＫ２９３細胞を、１０％　ＦＢＳ及び１％　ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を９６ウェルマルチウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に播種し、１ウェルあたり１００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ　１０μＬに、各プラスミドを２００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。
　＜細胞の観察＞
　前記培養後に細胞の培養液を除き、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液１００μＬを添加した。そして、細胞をＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００を用いて観察を行なった。次に、各ウェルに、最終濃度４０μＭとなるようにヌトリン－３を添加した。室温で１時間静置したのち細胞を観察した。得られた結果を図３７～４５に示す。
　図３７～４５に示した結果から明らかなように、全ての組み合わせに置いて、ヌトリン－３を添加する前には、明確な蛍光輝点が観察された。一方、ヌトリン－３を添加して３０分後に再度観察した結果、当該蛍光輝点は解消され、蛍光シグナルは分散されていた。
　このように、図８に示す系でも、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用に依存して形成された蛍光輝点を検出することができ、当該系の有効性を示すことができた。
　以上説明したように、本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において判定することができ、またタンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することができる。また、本発明においては、タンパク質間相互作用の強弱と蛍光輝点の蛍光強度とが相関しているので、前記蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定や、タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニングにもこの方法を利用できる。
　したがって、本発明のタンパク質間相互作用の判定方法等、並びにこれらの方法に用いられるためのベクター又はキットは、生体内における様々なシグナル伝達や、様々な生体反応の制御等の解明、ひいては疾患メカニズムの解明を通した医薬品等の開発において有用である。
配列番号：１及び２
＜２２３＞　ｐ６２のＰＢ１ドメイン
配列番号：３及び４
＜２２３＞　ＴＦＧのＰＢ１ドメイン
配列番号：５及び６
＜２２３＞　ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン
配列番号：７及び８
＜２２３＞　ＴＥＬのＳＡＭドメイン
配列番号：９及び１０
＜２２３＞　ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン
配列番号：１１及び１２
＜２２３＞　Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－１のＳＡＭドメイン
配列番号：１３及び１４
＜２２３＞　コドンをヒト化した単量体アザミグリーン１（ｍＡＧ１）
配列番号：１５及び１６
＜２２３＞　単量体ウミキノコ－グリーン（ｍＵｋＧ）
配列番号：１７及び１８
＜２２３＞　単量体クサビラオレンジ２（ｍＫＯ２）
配列番号：１９及び２０
＜２２３＞　単量体ミドリイシ－シアン１（ｍＭｉＣｙ）
配列番号：２１及び２２
＜２２３＞　クサビラ－シアン１（ＫＣｙ１）
配列番号：２３及び２４
＜２２３＞　二量体アザミグリーン（ＡＢ）（ｄＡＧ（ＡＢ））
配列番号：２５及び２６
＜２２３＞　ＴＧｕｖ
配列番号：２７及び２８
＜２２３＞　ＰＢ１ｈｍＡＧ１
配列番号：２９及び３０
＜２２３＞　ｈｍＡＧ１ＰＢ１
配列番号：３１及び３２
＜２２３＞　ＦＫＢＰ１２変異体
配列番号：３３及び３４
＜２２３＞　ｐ５３
配列番号：３５及び３６
＜２２３＞　ＭＤＭ２
配列番号：３７及び３８
＜２２３＞　ＰＢ１
配列番号：３９及び４０
＜２２３＞　フュージョンレッド
配列番号：４２及び４３
＜２２３＞　Ｔａｎｋｙｒａｓｅ－ｈｍＡＧ１
配列番号：４４及び４５
＜２２３＞　ＰＫＣｉｏｔａ－ｈｍＡＧ１
配列番号：４６及び４７
＜２２３＞　ＴＥＬ－ｈｍＡＧ１
配列番号：４８及び４９
＜２２３＞　ＤＧＫｄｅｌｔ－ｈｍＡＧ１
配列番号：５０及び５１
＜２２３＞　Ｍ１３ペプチド
配列番号：５２及び５３
＜２２３＞　カルモジュリン

Claims (18)

  1. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）　第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  2. 　前記第２の融合タンパク質が、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  5. 　前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、請求項４に記載の方法。
  6. 　多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター。
  7. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）請求項６に記載のベクター
    　（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
    　（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
    　（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
    　（ｇ）第１の融合タンパク質
    　（ｈ）第２の融合タンパク質。
  8. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項４又は５に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
    　（ｆ）第３の融合タンパク質
    　（ｇ）第４の融合タンパク質
    　（ｈ）第５の融合タンパク質。
  9. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  10. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項９に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
    　（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
    　（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
    　（ｆ）第１の標識化タンパク質
    　（ｇ）第２の標識化タンパク質
    　（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
  11. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  12. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１１に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
    　（ｆ）第７の融合タンパク質
    　（ｇ）第８の融合タンパク質
    　（ｈ）第９の融合タンパク質。
  13. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  14. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１３に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
    　（ｆ）第１０の融合タンパク質
    　（ｇ）第１１の融合タンパク質
    　（ｈ）第１２の融合タンパク質。
  15. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）　第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  16. 　下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１５に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｆ）第１３の融合タンパク質
    　（ｇ）第１４の融合タンパク質
    　（ｈ）第１５の融合タンパク質。
  17. 　第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）～（３）を含む方法
    （１）　第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
    （２）　前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
    （３）　前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
  18. 　下記（ａ）～（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１７に記載の方法に用いられるためのキット
    　（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
    　（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
    　（ｅ）第１６の融合タンパク質
    　（ｆ）第１７の融合タンパク質。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018235787A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 株式会社医学生物学研究所 蛍光タンパク質を用いたタンパク質間相互作用の判定方法
JP2019515252A (ja) * 2016-03-15 2019-06-06 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114645065A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 华东理工大学 一种新型光-化学小分子双诱导基因表达系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004524019A (ja) * 2001-01-12 2004-08-12 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 内因性蛍光自己多量体化ｍｈｃ融合タンパク質およびその複合体
JP2006308568A (ja) * 2005-03-29 2006-11-09 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法
JP2008521447A (ja) * 2004-12-04 2008-06-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 蛍光タンパク質マイクロドメインを使用するタンパク質−タンパク質相互作用検出システム
JP2010094110A (ja) * 2008-10-20 2010-04-30 Tokyo Univ Of Agriculture サイクリンＡ−ｐ２７相互作用検出方法
JP2011211983A (ja) * 2010-03-31 2011-10-27 Osaka Prefecture Univ タンパク質分子対、タンパク質分子対をコードする遺伝子および遺伝子導入ベクターとタンパク質分子対を産生する細胞
WO2013084950A1 (ja) * 2011-12-05 2013-06-13 Ａｍａｌｇａａｍ有限会社 タンパク質間相互作用の検出方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
JP2002526756A (ja) 1998-09-24 2002-08-20 デューク ユニバーシティ 生細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用の測定方法
JP2001327296A (ja) * 2000-03-15 2001-11-27 Japan Science & Technology Corp 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法
AU2001270481A1 (en) 2000-07-04 2002-01-14 Bioimage A/S A method for extracting quantitative information relating to interactions between cellular components
WO2006017279A2 (en) * 2004-07-12 2006-02-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to identifying protein-protein interactions
WO2006099486A2 (en) 2005-03-15 2006-09-21 President And Fellows Of Harvard College Method and compounds for detecting protein-protein and protein-nucleic acid interactions
CN101821622B (zh) * 2007-08-17 2015-04-08 韩国科学技术院 分子相互作用的检测方法
WO2009049892A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Polypeptides comprising an annexin core domain, compositions, methods and use thereof
EP2078750B1 (en) * 2008-01-09 2016-09-28 Ludwig-Maximilians-Universität München A fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct visualization of protein interactions in living cells
WO2010066113A1 (zh) * 2008-12-11 2010-06-17 国立大学法人东京大学 拆分荧光蛋白的融合蛋白组合、其表达载体，稳定表达哺乳动物细胞系及筛选方法
US8877446B2 (en) * 2011-08-26 2014-11-04 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Method for detecting protein-protein interactions in cells

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004524019A (ja) * 2001-01-12 2004-08-12 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 内因性蛍光自己多量体化ｍｈｃ融合タンパク質およびその複合体
JP2008521447A (ja) * 2004-12-04 2008-06-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 蛍光タンパク質マイクロドメインを使用するタンパク質−タンパク質相互作用検出システム
JP2006308568A (ja) * 2005-03-29 2006-11-09 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法
JP2010094110A (ja) * 2008-10-20 2010-04-30 Tokyo Univ Of Agriculture サイクリンＡ−ｐ２７相互作用検出方法
JP2011211983A (ja) * 2010-03-31 2011-10-27 Osaka Prefecture Univ タンパク質分子対、タンパク質分子対をコードする遺伝子および遺伝子導入ベクターとタンパク質分子対を産生する細胞
WO2013084950A1 (ja) * 2011-12-05 2013-06-13 Ａｍａｌｇａａｍ有限会社 タンパク質間相互作用の検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNKO HASHIMOTO ET AL.: "Novel In Vitro Protein Fragment Complementation Assay Applicable to High-Throughput Screening in a 1536-Well Format", J BIOMOL SCREEN, vol. 14, no. 8, 2009, pages 970 - 979, XP055181781 *
See also references of EP3156484A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019515252A (ja) * 2016-03-15 2019-06-06 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法
US10451614B2 (en) 2016-03-15 2019-10-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of assessing protein interactions between cells
JP2020073911A (ja) * 2016-03-15 2020-05-14 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法
JP7097396B2 (ja) 2016-03-15 2022-07-07 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法
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