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WO2015099127A1 - Ｆｇｆｒゲートキーパー変異遺伝子およびそれを標的とする医薬 - Google Patents

Ｆｇｆｒゲートキーパー変異遺伝子およびそれを標的とする医薬 Download PDF

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WO2015099127A1
WO2015099127A1 PCT/JP2014/084521 JP2014084521W WO2015099127A1 WO 2015099127 A1 WO2015099127 A1 WO 2015099127A1 JP 2014084521 W JP2014084521 W JP 2014084521W WO 2015099127 A1 WO2015099127 A1 WO 2015099127A1
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WO
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alkyl
cancer
group
mutant polypeptide
amino
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/084521
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English (en)
French (fr)
Inventor
中西　義人
貫則 秋山
賢治 森上
Original Assignee
中外製薬株式会社
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Publication date
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Priority to JP2015555047A priority patent/JP6514645B2/ja
Priority to EP14873761.2A priority patent/EP3087986B1/en
Priority to DK14873761T priority patent/DK3087986T3/da
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    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general

Definitions

  • the present invention relates to a mutant polypeptide containing a novel gatekeeper mutation, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a cell containing the vector, an antibody that specifically binds to the polypeptide, and fragments thereof , Oligonucleotide primer or oligonucleotide probe that hybridizes to the polynucleotide, oligonucleotide that suppresses expression of the polypeptide, pharmaceutical composition comprising the antibody or the oligonucleotide, method for detecting the mutant polypeptide or the polynucleotide And a detection kit, a test method for the presence or absence of resistance to an FGFR inhibitor based on the presence or absence of the mutant polypeptide or the polynucleotide, a method for selecting a cancer patient to which an FGFR inhibitor is applied, and FGFR inhibitory activity
  • Compound youth A pharmaceutical composition for treating cancer, a compound having
  • cancer a disease that occurs in all organs and tissues, is refractory and deadly, and is extremely troublesome, but recent statistics also show that one in two lives a lifetime. Cancer is diagnosed at one time, and 1 in 4 males and 1 in 6 females die from cancer, a very serious disease.
  • Fibroblast growth factor receptor is a kinase belonging to the receptor tyrosine kinase family, and FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4 constitute the FGFR family.
  • the ligand is fibroblast growth factor (FGF), and 22 structurally similar proteins make up the family.
  • Non-patent Document 1 Signals transmitted through FGFR flow to the MAPK pathway and PI3K / AKT pathway. This signal transduction is involved in cell proliferation, angiogenesis, cell migration, invasion, metastasis, etc. It is reported that it is activated by overexpression, gene over-amplification, mutation, and translocation (Non-patent Document 1).
  • FGFR3 is known to be overexpressed in multiple myeloma gene translocation (Non-Patent Document 2), bladder cancer gene mutation (Non-Patent Document 3), ovarian cancer, non-small cell lung cancer, and hepatocellular carcinoma. ing.
  • Non-patent Documents 4 and 5 the relationship between FGFR and cancer has been suggested, and the development of compounds having an activity of inhibiting FGFR as anticancer agents has been attempted.
  • GK gatekeeper
  • the present inventors have found a novel gatekeeper mutation of the FGFR gene, and further confirmed that a specific FGFR inhibitor has an inhibitory activity on FGFR having the mutation equivalent to FGFR having no mutation. I found it. That is, the present invention provides a novel antitumor drug having high anticancer activity against cancers having FGFR that has acquired resistance by acquiring the mutation relative to other FGFR inhibitors. With the goal.
  • the present inventors have analyzed the crystal structure of FGFR and energetically studied mutant genes that can be various FGFR gatekeeper mutations.
  • a novel GK mutation for example, mutation V564F in SEQ ID NO: 1
  • a mutation similar to the GK mutation for example, mutation V562L in SEQ ID NO: 1
  • FGFR having the mutation is a known FGFR inhibitor such as AZD4547.
  • the present invention was completed by finding that the compound was resistant to the agent and sensitive to the compound A.
  • the present invention specifically relates to the following FGFR mutant polypeptide containing a novel gatekeeper mutation, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide, a vector containing the polynucleotide, and a cell containing the vector
  • the present invention relates to a method for selecting a patient to which the pharmaceutical composition is applied, the pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer in a patient expressing the mutant polypeptide, and the like.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a compound represented by the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient,
  • FGFR polypeptide in the partial amino acid sequence described in SEQ ID NO: 53 or 54, substitution of valine, which is the seventh amino acid from the N-terminal side, with phenylalanine and / or the fifth amino acid from the N-terminal side
  • a pharmaceutical composition for treating cancer characterized in that it is used to be administered to a patient that expresses an FGFR mutant polypeptide containing a substitution of valine for leucine or has a polynucleotide encoding the mutant polypeptide.
  • R1 to R4 each independently represent the following group;
  • R1 is hydrogen, hydroxy, halogen, cyano, nitro, C1-4 haloalkyl, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, C3-7 cycloalkyl, C6-10 aryl C1-4 alkyl, —OR5 , —NR6R7, — (CR8R9) nZ1, —C (O) NR12R13, —SR14, —SOR15, —SO2R16, —NR17SO2R18, COOH, substituted with one or more groups independently selected from the group P C6-10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q, —COR19, —COOR20, —OC ( O) R21, -NR22C (O) R23, -NR24C (S) R25,
  • R20 represents C1-4 alkyl, C3-7 cycloalkyl, C1-4 haloalkyl, C6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R21 represents C1-4 alkyl, C3-7 cycloalkyl, C1-4 haloalkyl, C6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R22 represents hydrogen, C1-4 alkyl or C1-4 haloalkyl
  • R23 represents hydrogen, C1-4 alkyl, C3-7 cycloalkyl, C1-4 haloalkyl, C6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R24 represents hydrogen, C1-4 alkyl or C1-4 haloalkyl
  • R25 represents C1-4 alkyl, C3-7 cycloalkyl, C1-4 haloalkyl, C1-4 haloalkyl, C
  • the pharmaceutical composition according to [1] comprising a compound represented by the following formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient: .
  • a pair of oligonucleotide primers or oligonucleotide probes for detecting or amplifying the polynucleotide comprising an oligonucleotide that specifically hybridizes to the polynucleotide encoding the mutant polypeptide according to [3].
  • oligonucleotide according to [9], wherein the oligonucleotide is an siRNA that cleaves an mRNA polynucleotide.
  • An FGFR mutation comprising a step of detecting the mutant polypeptide in a sample isolated from a subject using an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the mutant polypeptide according to [3] A method for detecting a polypeptide.
  • oligonucleotide primers or oligonucleotide probes for detecting or amplifying the polynucleotide including an oligonucleotide that specifically hybridizes to the polynucleotide encoding the mutant polypeptide according to [3]
  • a method for detecting a polynucleotide encoding an FGFR mutant polypeptide comprising a step of detecting a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample isolated from a subject.
  • [13] comprising a pair of oligonucleotide primers or oligonucleotide probes for detection or amplification of the polynucleotide, comprising an oligonucleotide that specifically hybridizes to the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of [3]
  • a kit for detecting a polynucleotide encoding an FGFR mutant polypeptide comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the mutant polypeptide according to [3].
  • the cancer is bladder cancer, brain tumor, head and neck squamous cell carcinoma, lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, skin melanoma, endometrial cancer, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, [15] The method according to [15], wherein the cancer is bile duct cancer, biliary tract cancer or liver cancer.
  • [17] A method for selecting a patient to which the pharmaceutical composition according to [1] or [2] is applied, comprising the following steps: (A) determining the presence or absence of the mutant polypeptide according to [3] in a sample isolated from a subject; (B) A step of selecting a subject in which the presence of the mutant polypeptide is confirmed as a patient to which the pharmaceutical composition is applied.
  • a method for selecting a patient to which the pharmaceutical composition of [1] or [2] is applied comprising the following steps: (A) determining a presence or absence of a polynucleotide encoding the mutant polypeptide according to [3] in a sample isolated from a subject; (B) A step of selecting a subject in which the presence of a polynucleotide encoding the mutant polypeptide is confirmed as a patient to which the pharmaceutical composition is applied.
  • the cancer is bladder cancer, brain tumor, head and neck squamous cell carcinoma, lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, skin melanoma, endometrial cancer, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, [18] The method according to [18], wherein the cancer is bile duct cancer, biliary tract cancer or liver cancer. [20] As defined in [1] or [2] for use in the treatment of cancer in a patient expressing the mutant polypeptide of [3] or having a polynucleotide encoding the mutant polypeptide A compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the cancer is bladder cancer, brain tumor, head and neck squamous cell carcinoma, lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, skin melanoma, endometrial cancer, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, [20]
  • the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [20] which is cholangiocarcinoma, biliary tract cancer or liver cancer.
  • the seventh amino acid sequence from the N-terminal side of the partial amino acid sequence described in SEQ ID NO: 53 or 54 in the FGFR polypeptide, which contains a compound represented by the following formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient A pharmaceutical composition for the treatment of cancer expressed by an FGFR mutant polypeptide comprising a substitution of valine with phenylalanine and / or a substitution of valine with leucine which is the fifth amino acid from the N-terminal side: .
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the function or expression of an FGFR mutant polypeptide comprising the substitution of the amino acid valine for leucine.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer for administration to a patient that expresses the mutant polypeptide according to [3] or has a polynucleotide encoding the mutant polypeptide [1] Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method for detecting resistance to an FGFR inhibitor selected from the group consisting of PD173074, AZD4547, BGJ398, and AZD2171 comprising the following steps: (A) a step of determining the presence or absence of the mutant polypeptide according to [3] or a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample isolated from a subject; (B) A step of determining that the subject in which the presence of the mutant polypeptide or the polynucleotide is confirmed has resistance to the FGFR inhibitor.
  • a method for predicting the response of a cancer patient to treatment with an FGFR inhibitor selected from the group consisting of PD173074, AZD4547, BGJ398, and AZD2171 comprising the following steps: (A) a step of determining the presence or absence of the mutant polypeptide according to [3] or a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample isolated from a patient; (B) A step of determining that a patient in which the presence of the mutant polypeptide or the polynucleotide is confirmed has low sensitivity to the FGFR inhibitor.
  • [29] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [7] or [8] for predicting the response of a cancer patient to treatment with an FGFR inhibitor selected from the group consisting of PD173074, AZD4547, BGJ398, and AZD2171 Use of the described oligonucleotide primers or oligonucleotide probes.
  • a kit for predicting the effect of an FGFR inhibitor in cancer treatment comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [7], or the oligonucleotide primer or oligonucleotide probe according to [8].
  • [31] The kit according to [30], wherein the FGFR inhibitor is selected from the group consisting of PD173074, AZD4547, BGJ398, and AZD2171.
  • FIG. 2 is a graph showing the effects of compounds A and C on tyrosine phosphorylation of FGFR in cells expressing wild type FGFR2, FGFR2 V564F mutant or FGFR2 V562L mutant.
  • 2 is a graph showing the inhibitory effect of compounds A, B and C on the growth of cells expressing wild type FGFR2, FGFR2 V564F mutant or FGFR2 V562L mutant.
  • 2 is a graph showing the inhibitory effect of compounds A, B, C, D and E on the growth of cells expressing TEL-fused wild type FGFR2 or TEL-fused FGFR2 V564F mutant.
  • 2 is a graph showing the inhibitory effect of compounds A and C on tumor growth in mice bearing tumor cells expressing TEL-fused wild-type FGFR2 or TEL-fused FGFR2 V564F mutants.
  • 2 is a graph showing the inhibitory effect of compound A or C on tumor phosphorylation in mice bearing tumor cells expressing TEL-fused wild-type FGFR2 or TEL-fused FGFR2RV564F mutants.
  • the present invention is an invention as exemplarily described in the above [1] to [31], and includes a novel FGFR mutant polypeptide containing a gatekeeper mutation, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide, Vector containing polynucleotide, cell containing the vector, antibody and fragment thereof specifically binding to the mutant polypeptide, oligonucleotide primer or oligonucleotide probe hybridizing to the polynucleotide, inhibiting expression of the mutant polypeptide Oligonucleotide, method for detecting the mutant polypeptide or polynucleotide, kit for detection, pharmaceutical composition for cancer treatment characterized by being used to be administered to a patient expressing the mutant polypeptide, the mutation Administering the pharmaceutical composition to a patient expressing the polypeptide A method for treating or preventing cancer, a method for selecting a patient to which the pharmaceutical composition is applied, a compound having FGFR inhibitory activity for use in the treatment or prevention of cancer in a patient expressing the mutant
  • FGFR in the present invention is a fibroblast growth factor receptor (FGFR), which is a kinase belonging to the receptor tyrosine kinase family, and includes the FGFR family by FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4. Means any FGFR belonging to (Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149).
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • the FGFR of the present invention means any FGFR, preferably FGFR of mammals (human, mouse, rat, guinea pig, rabbit, sheep, monkey, goat, donkey, cow, horse, pig, etc.) Further, human FGFR is more preferable, and human FGFR2, human FGFR1, and FGFR3 are particularly preferable, and many isoforms are known.
  • “Human FGFR2” in the present invention is a human FGFR2 wild-type polypeptide (GenBank Accession No.) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, or 44. .: NP_000132.3, NP_075259.4, NP_001138385.1, NP_001138386.1, NP_001138387.1, NP_001138388.1, NP_001138389.1, NP_001138390.1, NP_001138391.1, NP_001138391.1), or the wild type polypeptide In which one or more (preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5) amino acids are substituted, deleted or inserted.
  • “Human FGFR1” in the present invention is a human FGFR1 wild-type polypeptide (GenBank Accession No .: NP — 001167538.1 each consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21, 45, 46, 47, 48, 49, or 50). , NP_001167534.1, NP_001167535.1, NP_001167536.1, NP_001167537.1, NP_075594.1, NP_075598.2), or one or more (preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5) of the wild-type polypeptide ) Amino acid substitution, deletion or insertion.
  • human FGFR3 is a human FGFR3 wild-type polypeptide (GenBank Accession No .: NP_000133.1, NP_001156685.1, NP_075254.1, respectively) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, 51, or 52. ) Or a mutant polypeptide in which one or more (preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5) amino acids are substituted, deleted or inserted in the wild-type polypeptide.
  • the mutant polypeptide also includes a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of the wild-type polypeptide, preferably a polypeptide having 80% or more homology, more preferably 90% or more homology. More preferably, a polypeptide having a homology of 95% or more is included.
  • the “mutant polypeptide” refers to the substitution of valine, which is the seventh amino acid from the N-terminal side, with phenylalanine in the partial amino acid sequence described in SEQ ID NO: 53 or 54 in the FGFR polypeptide, and / or FGFR mutant polypeptide containing a substitution of valine, the fifth amino acid from the N-terminal side, with leucine, which is also referred to as a polypeptide containing the mutation of the present invention.
  • the mutant polypeptide of the present invention is an FGFR mutant polypeptide having at least one of the two types of mutations
  • the mutation is introduced into the amino acid sequence of the wild-type FGFR polypeptide consisting of the above-mentioned full-length amino acid sequence. It is not limited to FGFR mutant polypeptide consisting of the amino acid sequence that is, including those peptide fragments containing the mutation, and fusion polypeptides of those FGFR mutant polypeptides or peptide fragments and other peptides, Other than the position of the mutation, one or more (preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5) amino acids may be substituted, deleted, added or inserted.
  • TEL also known as ETV6, Cancer Research, 2001, 61: 8371-8374 and Blood, 2005, 105 (5): 2115-2123
  • polypeptide a wild-type polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33, or one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the wild-type polypeptide
  • BAIA2P2L1 polypeptide wild-type polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 or one or more amino acids in the wild-type polypeptide are substituted, deleted, added, or Inserted mutant polypeptide or peptide fragment thereof
  • TACC3 polypeptide SEQ ID NO: A wild-type polypeptide having the amino acid sequence described in No.
  • the mutant polypeptide of the present invention includes an FGFR mutant polypeptide selected from the following (1) to (20), or a peptide fragment of (1) to (20) containing the mutation, or (1 ) Means a fusion polypeptide of the FGFR mutant polypeptide of (20) to (20) or a peptide fragment thereof and another peptide: (1) an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutation V564F and / or V562L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above, (2) an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutant V565F and / or V563L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above, (3) FGFR2 mutant polypeptide containing at least mutation V565F and / or V563L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 37) of the above wild type FGFR2 polypeptide, or (4) amino
  • an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutant V475F and / or V473L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 39) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above
  • an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutant V449F and / or V447L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 40) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above
  • an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutation V448F and / or V446L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 41) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above
  • an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutation V447F and / or V445L in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 42) of the wild-type FGFR2 polypeptide described above
  • an FGFR2 mutant polypeptide comprising at least the mutation V476F and / or
  • the FGFR mutant polypeptide of the present invention includes an FGFR2 mutant polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 10, 29, or 30, and an FGFR1 mutation comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or 26. And a TEL-fused FGFR2 mutant polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 or 36, and a FGFR3 mutant polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 or 28.
  • the FGFR mutant polypeptide of the present invention has a biological activity comparable to or stronger than that of the wild-type FGFR polypeptide (eg, tyrosine phosphorylation activity, cell proliferation activity, angiogenesis activity of the FGFR intracellular domain, Cell migration activity, cell invasion activity, cell metastasis activity, preferably cell proliferation activity).
  • a biological activity comparable to or stronger than that of the wild-type FGFR polypeptide eg, tyrosine phosphorylation activity, cell proliferation activity, angiogenesis activity of the FGFR intracellular domain, Cell migration activity, cell invasion activity, cell metastasis activity, preferably cell proliferation activity.
  • the polynucleotide of the present invention includes any polynucleotide that encodes the above-mentioned FGFR mutant polypeptide of the present invention and can encode the FGFR mutant polypeptide of the present invention, and includes either genomic DNA or cDNA. Is also included. Genomic DNA includes exons and introns. The cDNA may include a nucleic acid sequence derived from a part of an intron sequence and encoding an amino acid sequence. In addition, the polynucleotide includes a degenerate polynucleotide composed of any codon as long as it is a codon encoding the same amino acid.
  • polynucleotide in the present invention includes a polynucleotide encoding a mutant polypeptide derived from a mammal, and a preferred embodiment includes a polynucleotide encoding a mutant polypeptide derived from a human.
  • the polynucleotide of the present invention may be obtained by any method.
  • complementary DNA cDNA prepared from mRNA
  • DNA prepared from genomic DNA DNA obtained by chemical synthesis
  • DNA obtained by PCR amplification using RNA or DNA as a template DNA obtained by PCR amplification using RNA or DNA as a template, and appropriate combinations of these methods All DNAs constructed in this way are also included.
  • the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention is a method of cloning cDNA from mRNA encoding the mutant polypeptide of the present invention according to a conventional method, a method of isolating and splicing genomic DNA, a method of chemical synthesis, etc. It can be obtained by.
  • the mutant polypeptide of the present invention can be cloned from any tissue or cell that expresses and produces the mutant polypeptide of the present invention according to a conventional method.
  • An mRNA encoding the peptide is prepared.
  • it can be performed by subjecting total RNA prepared by a method such as the guanidine thiocyanate method, the hot phenol method, or the AGPC method to affinity chromatography using oligo (dT) cellulose, poly U-sepharose, or the like.
  • a known method such as using reverse transcriptase (Mol. Cell. Biol., Vol. 2, p. 161, 1982; Mol. Cell. Biol., Vol. 3, p. .280, 1983; Gene, Vol. 25, p.263, 1983), etc., synthesize cDNA strand, convert cDNA to double-stranded cDNA, and incorporate this cDNA into plasmid vector, phage vector, cosmid vector, etc.
  • a cDNA library is prepared by transforming E. coli or transfecting E. coli after in vitro packaging.
  • the present invention also relates to a vector (recombinant vector) containing a polynucleotide encoding the above-described mutant polypeptide of the present invention.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in various prokaryotic and / or eukaryotic hosts, and includes plasmid vectors and phage vectors.
  • cloning vectors examples include pUC19, ⁇ gt10, ⁇ gt11, and the like.
  • a vector having a promoter capable of expressing the polynucleotide is preferable.
  • a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention can be conveniently linked by a conventional method to a recombination vector (plasmid DNA and bacteriophage DNA) available in the art. Can be prepared.
  • Examples of the recombination vector used include plasmids derived from E. coli (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19, etc.), plasmids derived from yeast (pSH19, pSH15, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, pC194, Etc.).
  • phages include bacteriophages such as ⁇ phage, and animal and insect viruses (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retroviruses, vaccinia viruses, nuclear polyhedrosis viruses, and lentiviruses.
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • pVL1393 animal and insect viruses
  • retroviruses such as retroviruses, vaccinia viruses, nuclear polyhedrosis viruses, and lentiviruses.
  • An expression vector is useful for the purpose of expressing a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention to produce the mutant polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and producing these polypeptides. Not.
  • Examples include pMAL C2, pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol.18, 1990, p.5322, etc.) or pME18S (experimental medicine separate volume "Gene Engineering Handbook", 1992 etc.).
  • the mutant polypeptide of the present invention can also be produced as a fusion protein with another protein.
  • the cDNA encoding the mutant polypeptide of the present invention is subcloned into, for example, the plasmid pGEX4T1 (Pharmacia), and E. coli DH5 ⁇ is transformed. Then, it can be prepared by culturing the transformant.
  • HA influenza agglutinin
  • immunoglobulin constant region ⁇ -galactosidase
  • MBP maltose binding protein
  • FLAG Hopp, T. P.
  • 6 ⁇ His consisting of 6 His (histidine) residues, 10 ⁇ His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag And a fusion with a known peptide such as a Protein C fragment, Stag, StrepTag, HaloTag or the like.
  • HA influenza agglutinin
  • HSV-GP fragment p18HIV fragment
  • T7-tag HSV-tag
  • E-tag E-tag
  • SV40T antigen fragment lck tag
  • ⁇ -tubulin fragment B-tag
  • a fusion with a known peptide such as a Protein C fragment, Stag, StrepTag, HaloTag or the like.
  • the vector of the present invention uses a bacterium, particularly Escherichia coli, as the host cell, the vector contains at least a promoter-operator region, a start codon, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable. Preferably it contains units.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention, and a stop codon.
  • the vector also comprises a signal peptide-encoding DNA, an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the gene encoding the protein of the present invention, splicing junction, polyadenylation site, selectable marker region or replication. Possible units may be included.
  • it may contain a marker gene (gene amplification gene, drug resistance gene, etc.) that makes it possible to select a host amplified and transformed.
  • a marker gene gene amplification gene, drug resistance gene, etc.
  • Examples include dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase gene, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, hygromycin-B-phosphotransferase gene, aspartate transcarbamylase gene, etc. be able to.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • thymidine kinase gene thymidine kinase gene
  • neomycin resistance gene glutamate synthase gene
  • glutamate synthase gene adenosine deaminase gene
  • ornithine decarboxylase gene hygromycin-B-phosphotransferase gene
  • aspartate transcarbamylase gene etc.
  • the promoter-operator region for expressing the mutant polypeptide of the present invention in bacteria can contain a promoter, an operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • examples include those containing Trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, tac promoter and the like.
  • Examples of the promoter for expressing the mutant polypeptide of the present invention in yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter.
  • the host is Bacillus, SL01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like can be mentioned.
  • SV40-derived promoters when the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell, SV40-derived promoters, retrovirus promoters, heat shock promoters, and the like can be mentioned.
  • SV40 is a retrovirus.
  • an enhancer is an effective method for expression.
  • a suitable start codon is exemplified by methionine codon (ATG).
  • methionine codon examples include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA).
  • As the terminator region a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
  • a replicable unit refers to a DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a DNA fragment prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included.
  • Suitable plasmids include plasmid pBR322 or an artificial modification thereof (DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme) in E.Ecoli, yeast 2 ⁇ plasmid or yeast chromosomal DNA in yeast,
  • Examples of mammalian cells include plasmid pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmid pSV2neo ATCC 37149, and the like.
  • polyadenylation site and splicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, respectively, can be used.
  • the expression vector of the present invention is prepared by linking at least the above-mentioned promoter, start codon, polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention, stop codon and terminator region continuously and circularly to appropriate replicable units. can do.
  • an appropriate DNA fragment for example, a linker, other restriction enzyme cleavage sites, etc.
  • a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase, if desired.
  • the present invention also relates to a recombinant cell transformed with the above-described vector of the present invention, and the recombinant cell of the present invention can be prepared by introducing the above-described expression vector into a host cell.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-described expression vector and can be transformed, and is a natural cell or artificially established usually used in the technical field of the present invention.
  • Examples include various cells such as recombinant cells (eg, bacteria (genus Escherichia, Bacillus), yeast (genus Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells or insect cells.
  • E. coli or animal cells such as E. coli (DH5 ⁇ , TB1, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.), rat-derived cells (PC12, PC12h, etc.) ), Hamster-derived cells (BHK, CHO, etc.), monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, diploid fibroblast-derived cells, myeloma cells, HepG2, etc. And the like.
  • E. coli DH5 ⁇ , TB1, HB101, etc.
  • mouse-derived cells COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.
  • rat-derived cells PC12, PC12h, etc.
  • Hamster-derived cells BHK, CHO, etc.
  • monkey-derived cells COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc
  • Introduction (transformation (transfection)) of an expression vector into a host cell can be performed according to a conventional method ([E. coli, Bacillus subtilis etc.): Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 69, p.2110, 1972; Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979; J. Mol.Biol., Vol.56, p.209, 1971; [In the case of Saccharomyces cerevisiae]: Proc Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978; J.
  • the mutant polypeptide of the present invention is produced by culturing a transformed recombinant cell (hereinafter used to include inclusion bodies) containing an expression vector prepared as described above in a nutrient medium according to a conventional method. can do.
  • the mutant polypeptide of the present invention can be produced by culturing recombinant cells as described above, particularly animal cells, and secreting them into the culture supernatant.
  • the obtained culture is filtered or centrifuged to obtain a culture filtrate (supernatant), and the mutation of the present invention is performed according to a conventional method generally used for purifying and isolating natural or synthetic proteins from the culture filtrate.
  • the polypeptide is purified and isolated.
  • Isolation and purification methods include, for example, methods using solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and other methods utilizing molecular weight differences, Methods using charges such as ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, methods using hydrophobic differences such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectricity Examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as point electrophoresis.
  • the mutant polypeptide of the present invention is present in the periplasm or cytoplasm of a cultured recombinant cell (such as Escherichia coli)
  • the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells.
  • a membrane containing the protein of the present invention by a method such as centrifugation or filtration after suspending in a suitable buffer solution, for example, disrupting cell walls and / or cell membranes such as cells by a method such as ultrasound, lysozyme and freeze-thawing. Get the fraction.
  • the membrane fraction is solubilized using a surfactant such as Triton-X100 to obtain a crude solution.
  • the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
  • the present invention also relates to any oligonucleotide that hybridizes to the polynucleotide (cDNA or genomic DNA) encoding the above-described mutant polypeptide of the present invention.
  • the oligonucleotide of the present invention has a base sequence complementary to an arbitrary partial base sequence of the cDNA or genomic DNA, and comprises a sense primer and an antisense primer in the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Any part or all of the base sequence of the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention can be amplified by PCR using the pair of oligonucleotide primers.
  • the oligonucleotide primer of the present invention includes an oligonucleotide having any base length complementary to the base sequence of the polynucleotide of the present invention, preferably at least 12 consecutive bases, preferably 12 to 50 bases, More preferred is an oligonucleotide having a sequence of 12 to 20 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention is also useful as a probe in DNA hybridization or RNA hybridization procedures.
  • Examples of the purpose of using the DNA as a probe include a continuous partial base sequence of 15 bases or more that hybridizes to the polynucleotide of the present invention, preferably a continuous partial base sequence of 50 bases or more, more preferably continuous.
  • the present invention also relates to an oligonucleotide that binds to an mRNA polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention and has an activity of inhibiting translation of the mRNA into a protein.
  • siRNA that binds to and cleaves mRNA polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention.
  • This oligonucleotide is an oligonucleotide that binds to and inhibits the expression of the mRNA encoding the mutant polypeptide of the present invention, and means, for example, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, or a siRNA (short interfering RNA). After binding to the mRNA, they inhibit translation of the mRNA into a protein.
  • Antisense oligonucleotide means an oligonucleotide that specifically hybridizes with genomic DNA and / or mRNA and inhibits the expression of the protein by inhibiting its transcription and / or translation.
  • Binding to the target polynucleotide may be due to general base pair complementarity or, for example, due to specific interactions in the main groove of the double helix in the case of binding to a DNA duplex But you can.
  • Antisense oligonucleotide target sites also include the 5 ′ end of the mRNA, eg, the 5 ′ untranslated sequence up to and including the AUG start codon or the 3 ′ untranslated sequence of the mRNA or the sequence of the coding region.
  • Examples of the purpose of use as an antisense oligonucleotide in the present invention include a continuous partial base sequence of 5 to 100 bases, preferably a continuous partial base sequence of 5 to 70 bases, more preferably a continuous 5 to 50 bases.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention has increased blood half-life (stability) when administered into a patient's body, increased permeability of intracellular membranes, or digestive organs when administered orally. It is possible to chemically modify a part of the oligonucleotide for the purpose of increasing the degradation resistance or increasing the absorption of the oligonucleotide. Examples of the chemical modification include chemical modifications such as phosphate bond, ribose, nucleobase, sugar moiety, 3 ′ and / or 5 ′ end in the oligonucleotide structure.
  • Phosphate bond modifications include one or more of these bonds, phosphodiester bonds (D-oligos), phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds (S-oligos), methylphosphonate bonds (MP-oligos), phosphoramidos. Mention may be made of any of the date bonds, non-phosphate bonds and methylphosphonothioate bonds or combinations thereof. Examples of the modification of ribose include a change to 2′-fluororibose or 2′-O-methylribose. Nucleobase modifications include changes to 5-propynyluracil or 2-aminoadenine.
  • Ribozyme means an oligonucleotide having catalytic activity to cleave mRNA. Ribozymes generally exhibit endonuclease, ligase or polymerase activity and include various types of trans-acting ribozymes, such as hammerhead and hairpin type ribozymes.
  • siRNA means a double-stranded oligonucleotide capable of performing RNA interference (eg, Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498 ).
  • siRNA cleaves mRNA in a sequence-specific manner, and as a result, translation of mRNA into protein is inhibited.
  • Examples of siRNA include double-stranded RNA having a length of 20 to 25 base pairs including a sequence complementary to a target polynucleotide sequence.
  • the siRNA of the present invention also includes oligonucleotides including chemically modified nucleotides and non-nucleotides.
  • the present invention also relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the above-described mutant polypeptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention is not limited in its origin, shape, function, etc., and any antibody may be used.
  • the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention may be any animal-derived antibody such as a human antibody, a mouse antibody, or a rat antibody. Alternatively, a recombinant antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody may be used.
  • Preferred antibodies of the present invention include chimeric antibodies, human antibodies or humanized antibodies.
  • the humanized antibody of the present invention can be prepared using methods known to those skilled in the art.
  • the variable region of an antibody is usually composed of three complementarity determining regions (CDRs) sandwiched between four frames (FR).
  • CDRs are regions that substantially determine the binding specificity of an antibody.
  • the amino acid sequence of CDR is rich in diversity.
  • the amino acid sequence constituting FR often shows high homology among antibodies having different binding specificities. Therefore, it is generally said that the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by CDR grafting.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is a non-human mammal, for example, a mouse antibody CDR grafted to the complementarity determining region of a human antibody, and its general gene Recombination techniques are also known (see European Patent Application Publication Nos. EP 125023 and WO 96/02576).
  • the CDR when the CDR is derived from a mouse antibody, a DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody is used for both CDR and FR.
  • the oligonucleotide is synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared so as to have a portion overlapping with the terminal region (see the method described in WO98 / 13388).
  • the obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication) No. WO 96/02576).
  • the framework region of the human antibody to be linked to the CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site.
  • the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted, deleted, added, and / or inserted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • partial nucleotide sequence mutations can be introduced into primers that anneal to the FR.
  • a nucleotide sequence mutation is introduced into the FR synthesized by such a primer.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody substituted with an amino acid by the above method (Sato, K. etal., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • a human antibody As a constant region of a humanized antibody, a human antibody is usually used.
  • the constant region of the human antibody used is not particularly limited.
  • the constant region of human IgG1, the constant region of human IgG2, the constant region of human IgG3, the constant region of human IgG4, human IgM, IgA , IgE, IgD constant regions, and the like can be used.
  • a human ⁇ chain constant region, a human ⁇ chain constant region, or the like can be used.
  • the constant region derived from a human antibody may have a naturally derived sequence, or a constant having a sequence in which one or more amino acids are modified (substitution, deletion, addition and / or insertion) in the naturally occurring sequence. It may be an area.
  • amino acids in the variable region eg, CDR, FR
  • constant region e.g., CDR, FR
  • the humanized antibody also includes a humanized antibody having such amino acid substitution.
  • the origin of CDR in the humanized antibody is not particularly limited and may be derived from any animal.
  • sequences of mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, camel antibody and the like can be used, but the CDR sequence of mouse antibody is preferable. Since humanized antibodies have reduced immunogenicity in the human body, they are useful when administered to humans for therapeutic purposes.
  • Chimeric antibodies are non-human mammals, for example, antibodies consisting of mouse antibody heavy and light chain variable regions and human antibody heavy and light chain constant regions. Chimeric antibodies can be produced using known methods.
  • the antibody gene can be cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, and introduced into a host (for example, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, “Published” in “the” United “Kingdom” by “MACMILLAN” PUBLISHERS “LTD,” 1990).
  • cDNA of the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired human antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the human antibody C region. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the chimeric antibody.
  • human antibodies can also be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to have a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • B cells expressing antibodies with antigen-binding activity can be isolated from human lymphocyte pools using Flow cytometry or cell arrays, etc., and the antibody genes of selected B cells can be analyzed to bind to the antigen.
  • DNA sequence of human antibody can be determined (Jin, A. et al., Nature Medicine (2009) 15, 1088-92, Scheid, JF et al., Nature (2009) 458, 636-640, Wrammert, J. et al., Nature (2008) 453, 667-672, Tiller, T. et al, Journal of Immunological Methods (2008) 329, 112-124). If the DNA sequence of an antibody that binds to an antigen is clarified, a suitable expression vector having the sequence can be prepared to obtain a human antibody.
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector having the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • the antibody of the present invention includes not only a bivalent antibody typified by IgG, but also a monovalent antibody or a multivalent antibody typified by IgM.
  • the antibodies of the present invention also include bispecific antibodies that can bind to different antigens.
  • the antibody of the present invention includes not only the full-length molecule of an antibody but also any antigen-binding fragment such as a low molecular weight antibody.
  • the antibody of the present invention includes a modified antibody to which a cytotoxic substance or the like is bound.
  • the sugar chain of the antibody of the antibody of the present invention may be modified.
  • the low molecular weight antibody (minibody) included in the antigen-binding fragment of the present invention is an antibody containing an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (whole antigen, such as whole IgG) is deleted, It does not specifically limit as long as it has the binding activity to a peptide.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it contains a part of the full-length antibody, but preferably contains an antigen binding site.
  • the antigen binding site is usually the CDR of the antibody, preferably the 6 CDRs of the antibody. Accordingly, preferred examples of the antigen binding site include six CDRs of an antibody and variable regions (heavy chain variable region and / or light chain variable region).
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably has a smaller molecular weight than the full-length antibody.
  • it may form a multimer such as a dimer, trimer or tetramer, and the molecular weight is larger than that of the full-length antibody. There is also.
  • antigen-binding fragment of the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • Specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), Diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2) And so on. Multimers of these antibodies (eg, dimer, trimer, tetramer, polymer) are also included in the low molecular weight antibody of the present invention.
  • An antigen-binding fragment can be obtained, for example, by treating an antibody with an enzyme to generate an antibody fragment.
  • enzymes that produce antibody fragments include, for example, papain, pepsin, and plasmin.
  • genes encoding these antibody fragments can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152). , 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A.
  • the digestive enzyme cleaves a specific position of the antibody fragment to give an antibody fragment having a specific structure as follows. If a genetic engineering technique is used for such an enzymatically obtained antibody fragment, any part of the antibody can be deleted.
  • the antibody fragments obtained when the above digestive enzymes are used are as follows. Papain digestion: F (ab) 2 or Fab Pepsin digestion: F (ab ') 2 or Fab' Plasmin digestion: Facb
  • the low molecular weight antibody in the present invention can include an antibody fragment lacking any region as long as it has binding activity to the mutant polypeptide of the present invention.
  • Diabody refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (Holliger Pet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP 404,097, WO93 / 11161 etc.).
  • Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains. Usually, in the polypeptide chain constituting the dimer, VL and VH are connected by a linker in the same chain. The linker in the diabody is generally so short that VL and VH cannot bind to each other. Specifically, the amino acid residues constituting the linker are, for example, about 5 residues. Therefore, VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single chain variable region fragment but form a dimer with another single chain variable region fragment. As a result, the diabody has two antigen binding sites.
  • the scFv antibody is an antibody in which a heavy chain variable region ([VH]) and a light chain variable region ([VL]) are combined with a linker or the like to form a single chain polypeptide (Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 (1988) 85, 5879-5883, Plickthun ⁇ The Pharmacology of Monoclonal Antibodies '' Vol. 113, Resenburg and Moore, Springer )).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv may be derived from any of the antibodies described herein.
  • any single chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • V regions of both strands can be linked by, for example, the PCR method as described above.
  • the DNA encoding the desired partial amino acid sequence is used as a template.
  • the DNAs encoding the V regions of the H chain and L chain are each amplified by PCR using a pair of primers having sequences corresponding to the sequences at both ends of the DNA to be amplified.
  • DNA encoding a peptide linker portion is prepared.
  • DNA encoding a peptide linker can also be synthesized using PCR.
  • a base sequence that can be linked to the amplification product of each V region synthesized separately is added to the 5 ′ side of the primer to be used.
  • PCR reaction is performed using each DNA of [H chain V region DNA]-[peptide linker DNA]-[L chain V region DNA] and assembly PCR primers.
  • the primer for assembly PCR consists of a combination of a primer that anneals to the 5 ′ side of [H chain V region DNA] and a primer that anneals to the 3 ′ side of [L chain V region DNA]. That is, the assembly PCR primer is a primer set that can amplify DNA encoding the full-length sequence of scFv to be synthesized. On the other hand, a base sequence that can be linked to each V region DNA is added to [peptide linker DNA]. As a result, these DNAs are ligated, and the full length of scFv is finally produced as an amplification product by the primers for assembly PCR.
  • an expression vector containing them and a recombinant cell transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Further, the scFv can be obtained by culturing the resulting recombinant cells and expressing the DNA encoding the scFv.
  • the order of the heavy chain variable region and the light chain variable region to be combined is not particularly limited, and may be arranged in any order, and examples thereof include the following arrangements.
  • Sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two VHs and two VLs are combined with a linker or the like to form a single chain (Hudson et al., J Immunol. Methods Methods 1999; 231: 177-189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by linking scFv with a linker.
  • VHs and two VLs are arranged in the order of VH, VL, VH, and VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]) starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above arrangement, and may be arranged in any order. For example, the following arrangements can also be mentioned.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or light chain variable region in the low molecular antibody may be substituted, deleted, added and / or inserted. Furthermore, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated, a part may be deleted or another polypeptide may be added as long as it has antigen binding activity.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • the linker that binds the variable region of the antibody is any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker, for example, a linker disclosed in Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 Can be used.
  • a preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, Particularly preferred is 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • Examples of the amino acid sequence of the peptide linker include the following sequences.
  • n which determines the length of the above peptide linker is usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • Synthetic compound linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene Glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), bis [2- (succinimideoxycarbonyloxy ) Ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy
  • the antibody of the present invention also includes an antibody in which one or more amino acid residues are added to the amino acid sequence of the antibody of the present invention. Also included are fusion proteins in which these antibodies are fused with other peptides or proteins.
  • a polynucleotide encoding an antibody of the present invention and a polynucleotide encoding another peptide or polypeptide are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host. Any technique known to those skilled in the art can be used.
  • Other peptides or polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, T. P.
  • polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention examples include GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose). Binding protein) and the like. Preparing a fusion polypeptide by fusing a commercially available polynucleotide encoding the peptide or polypeptide with a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and expressing the fusion polynucleotide prepared thereby. Can do.
  • the antibody of the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid and other high molecular weight substances, radioactive substances, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and toxins.
  • PEG polyethylene glycol
  • hyaluronic acid and other high molecular weight substances
  • radioactive substances such as radioactive substances, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and toxins.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • Bispecific antibodies refer to antibodies that have variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody that recognizes different epitopes of the mutant polypeptide molecule of the present invention, or one antigen binding site recognizes the mutant polypeptide of the present invention.
  • the other antigen-binding site may be a bispecific antibody that recognizes another substance.
  • bispecific antibodies can be produced by combining two types of antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody to be bound may be a 1 ⁇ 2 molecule each having an H chain and an L chain, or may be a 1 ⁇ 4 molecule consisting only of an H chain.
  • bispecific antibody-producing fused cells can be prepared by fusing hybridomas that produce different monoclonal antibodies.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc., depending on the antibody-producing cell, host or purification method described below. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to the antibody of the present invention, it is included in the present invention. For example, when the antibody of the present invention is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original antibody amino acid sequence. The antibody of the present invention also includes such an antibody.
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a modified sugar chain.
  • Methods for altering antibody sugar chains are known to those skilled in the art, for example, methods for improving ADCC activity by modifying antibody glycosylation, methods for regulating ADCC activity by the presence or absence of fucose in the antibody sugar chain, Methods for preparing antibodies having sugar chains that do not contain ⁇ -1,6 core fucose by producing antibodies in YB2 / 0 cells, methods for adding sugar chains having bisecting GlcNAc, etc. are known (WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, WO 02/79255, etc.).
  • the antibody of the present invention can be prepared by a known method using the mutant polypeptide of the present invention (derived from a mammal such as a human or a mouse) or a fragment peptide thereof as an immunogen. That is, a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen, and this is used to immunize a non-human mammal according to a normal immunization method.
  • An immune cell obtained from an immunized animal is fused with a known parent cell by an ordinary cell fusion method, a monoclonal antibody-producing cell (hybridoma) is selected by an ordinary screening method, and the cell is cultured to obtain a monoclonal antibody.
  • Antibodies can be made.
  • non-human mammals to be immunized examples include mice, rats, rabbits, sheep, monkeys, goats, donkeys, cows, horses, and pigs.
  • the antigen can be prepared using a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention according to a known method, for example, a method using a baculovirus (WO98 / 46777 etc.).
  • Hybridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • an antibody that binds to the mutant polypeptide of the present invention includes a monoclonal antibody that binds to the mutant polypeptide of the present invention.
  • the immunogen for producing a monoclonal antibody having binding activity for the mutant polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as an antibody having binding activity for the mutant polypeptide of the present invention can be produced.
  • the measurement of the binding activity of the antibody to the mutant polypeptide of the present invention can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • DNA immunization refers to immunization by administering a vector DNA constructed in such a manner that a gene encoding an antigen protein can be expressed in an immunized animal, and expressing the immunizing antigen in the body of the immunized animal. It is a method of giving a stimulus.
  • DNA immunization can be expected to have the following advantages. -Maintains the structure of membrane proteins and can provide immune stimulation-No need to purify immune antigens
  • a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention is administered to an immunized animal.
  • the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention can be synthesized by a known method such as PCR according to the method described above.
  • the obtained DNA (polynucleotide) is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector any vector as described above (for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1) can be used.
  • a method of administering the vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization can be performed by implanting gold particles adsorbed with an expression vector into cells with a gene gun. Performing boosting with the mutant polypeptide-expressing cells of the present invention after DNA immunization is a preferred method for obtaining monoclonal antibodies.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells can be used.
  • Mammalian myeloma cells are used as cells to be fused with the above immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient or TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • Normal cells die because they incorporate these pyrimidine analogs into the DNA, but cells deficient in these enzymes cannot survive these pyrimidine analogs and can survive in selective media.
  • a selectable marker called G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) with a neomycin resistance gene.
  • gentamicin analogs gentamicin analogs
  • immune cells and myeloma cells according to known methods such as the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. Ler G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) And cell fusion.
  • cell fusion can be carried out in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like can be used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added as desired in order to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be added to the culture medium.
  • a predetermined amount of immune cells and myeloma cells are mixed well in a culture solution, and a target PEG (hybridoma) is formed by mixing a PEG solution preheated to about 37 ° C.
  • a target PEG hybrida
  • PEG having an average molecular weight of about 1000 to 6000 can be usually added at a concentration of 30 to 60% (w / v).
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas are removed by sequentially adding the appropriate culture medium listed above, and then centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this manner can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can be selectively proliferated in the HAT culture solution.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • the target hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, by carrying out the usual limiting dilution method, screening and single cloning of the hybridoma producing the target antibody can be performed.
  • Screening and single cloning of the target antibody can be suitably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or the like, or a commercially available 96-well microtiter plate, and reacted with the culture supernatant of the hybridoma.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme is reacted. If the culture supernatant contains an antibody of interest that reacts with the sensitizing antigen, the secondary antibody binds to the carrier via this antibody.
  • By detecting the secondary antibody that finally binds to the carrier it can be determined whether the antibody of interest is present in the culture supernatant. It becomes possible to clone a hybridoma producing a desired antibody having the ability to bind to an antigen by a limiting dilution method or the like.
  • a target antibody can be obtained by sensitizing human lymphocytes with an antigen.
  • human lymphocytes are first sensitized with the mutant polypeptide of the present invention in vitro.
  • the immunized lymphocytes are then fused with an appropriate fusion partner.
  • the fusion partner for example, a myeloma cell derived from human and having a permanent division ability can be used (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • the antibody obtained by this method is a human antibody having binding activity to the mutant polypeptide of the present invention.
  • the base sequence and amino acid sequence encoding the antibody that binds to the mutant polypeptide of the present invention obtained by the above-described method and the like can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • a polynucleotide encoding an antibody is constructed based on the sequence of an antibody that recognizes the mutant polypeptide of the present invention, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun , A.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • pGEM-T for the purpose of subcloning and excision of cDNA
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the antibody of the present invention.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, etc.
  • promoters that can be expressed efficiently in E.
  • coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al. , (Science) (1988) (240), (1041-1043), or T7 promoter is essential.
  • lacZ promoter Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • araB promoter Better et al. , (Science) (1988) (240), (1041-1043
  • T7 promoter is essential.
  • examples of such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase BL21). are preferred).
  • the vector may also contain a signal sequence for antibody secretion.
  • a signal sequence for antibody secretion a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when the periplasm of E. coli is produced.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors for producing the antibody of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)), pEF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res. 1990, 18).
  • insect cell-derived expression vectors eg “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg pMH1, pMH2) Animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), and an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50.
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have the MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PSV2-dhfr ("Molecular Cloning 2nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))
  • MTX methotrexate
  • a method of transforming with a vector having SV40 replication origin (such as pcD) using COS cells having a gene expressing SV40 ⁇ ⁇ T antigen on the chromosome can be mentioned.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used in normal antibody purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. Examples of the column using protein A include Hyper D, POROS, Sepharose F (GE Amersham Biosciences), and the like.
  • the present invention also encompasses antibodies highly purified using these purification methods.
  • Measurement of the binding activity of the obtained antibody to the mutant polypeptide of the present invention can be carried out by methods known to those skilled in the art.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method can be used as a method for measuring the antigen-binding activity of an antibody.
  • an enzyme immunoassay a sample containing an antibody, for example, a culture supernatant of an antibody-producing cell or a purified antibody is added to a plate coated with an antigen.
  • “Cancer” in the present invention is generally used to represent a malignant neoplasm, which may be metastatic or non-metastatic.
  • carcinomas arising from epithelial tissues such as the digestive tract and skin include brain tumor, skin cancer, cervical head cancer, esophageal cancer, lung cancer, stomach cancer, duodenal cancer, breast cancer, prostate cancer, cervical cancer, Examples are endometrial cancer, pancreatic cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, bladder cancer, and ovarian cancer.
  • Non-limiting examples of sarcomas arising from non-epithelial tissues (stroma) such as muscle include osteosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, liposarcoma, and angiosarcoma. .
  • hematopoietic-derived blood cancers include malignant lymphomas, including Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma, acute (acute myelocytic leukemia), or chronic myelocytic leukemia (chronic myelocytic) leukemia), and leukemias including acute (acute lymphatic leukemia) or chronic ⁇ ⁇ ⁇ lymphatic leukemia, as well as multiple myeloma.
  • the cancer in the present invention includes any newly generated pathological tissue tumor (neoplasm).
  • the neoplasm results in the formation of a tumor, which is partly characterized by angiogenesis.
  • Neoplasm is benign such as hemangioma, glioma, teratoma, or malignant such as carcinoma, sarcoma, glioma, astrocytoma, neuroblastoma, retinoblastoma sell.
  • Preferred examples of the cancer in the present invention include bladder cancer, brain tumor, squamous cell carcinoma of the head and neck, lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, cutaneous melanoma, endometrial cancer, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, esophagus
  • Examples include cancer, stomach cancer, bile duct cancer, biliary tract cancer, and liver cancer.
  • cancer tissue means a tissue containing at least one cancer cell.
  • all cell types that contribute to the formation of tumor cells and tumor cells containing endothelial cells such as cancer tissue containing cancer cells and blood vessels.
  • a tumor refers to a tumor tissue nest (a foci of tumor tissue).
  • tumor is generally used to mean a benign or malignant neoplasm.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the above-described antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, or an oligonucleotide, or a compound of the present invention.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated using methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or in the form of suspension injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative Or in combination with binders and the like as appropriate, and can be formulated by mixing in unit dosage forms generally required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is set so as to obtain an appropriate volume within the indicated range.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solution for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • An appropriate solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.) can be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol can be used in combination as a solubilizing agent. It can also be formulated with buffers (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (eg, procaine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), and antioxidants.
  • buffers eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, procaine hydrochloride
  • stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidants antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • parenteral administration for example, an injection, nasal administration, pulmonary administration, or transdermal administration composition is administered.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose of the pharmaceutical composition containing the antigen-binding molecule can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per time. Alternatively, for example, a dose of 0.001 to 100000 mg per patient can be set, but the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can set an appropriate dose and administration method in consideration of these conditions.
  • amino acids included in the amino acid sequences described in the present invention may be modified after translation (for example, modification to pyroglutamic acid by pyroglutamylation of N-terminal glutamine is a modification well known to those skilled in the art). However, even if such an amino acid is post-translationally modified, it is naturally included in the amino acid sequence described in the present invention.
  • the present invention also relates to the aforementioned mutant polypeptide of the present invention and a method for detecting the polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample of a subject (including cancer patients and healthy persons).
  • the presence or absence of the mutant polypeptide of the present invention in the sample of the subject is, for example, a subject (a cancer patient, a person who may be suffering from cancer, a person who is at risk of suffering from cancer, a healthy person, but a human.
  • the above-mentioned mutant poly (polysaccharide) of the present invention is added to a sample (various body fluid (blood, serum, urine, saliva, ascites, pleural effusion, etc.) containing tumor tissue, normal tissue, cancer cells or normal cells) collected from It can be tested and determined by utilizing an antigen-antibody reaction by contacting an antibody that binds to a peptide or an antigen-binding fragment thereof. Detection of an antigen (that is, the mutant polypeptide of the present invention) by this antigen-antibody reaction can be performed using, for example, a conventional immunoassay.
  • the immunoassay in the present invention refers to a sample (tumor tissue, normal tissue, cancer cell or normal) based on the principle of reaction between an antigen (that is, the mutant polypeptide of the present invention) and an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the antigen.
  • the principles of various methods as described in, for example, enzyme immunoassay (3rd edition, edited by Koji Ishikawa et al., Published by Medical School, 1987) can be applied. That is, the various methods can be performed using one or more antibodies that bind to the target antigen for capturing (capturing, trapping) the target antigen in the sample to be detected.
  • Suitable principles include, for example, one-antibody solid phase method, two-antibody liquid phase method, two-antibody solid phase method, sandwich method, and one-pot method as described in JP-B-2-39747. Can be mentioned.
  • EMIT method Enzyme multiplied immunoassay technique
  • enzyme channeling assay Enzyme channeling immunoassay
  • enzyme activity modifying substance labeled immunoassay Enzyme modulator mediated enzyme immunoassay, EMMIA
  • enzyme inhibitor labeling Also included are an immunoassay, an immunoenzymometric assay, an enzyme enhanced immunoassay, a proximal linkage immunoassay, and the like. In the present invention, any principle of such an immunoassay can be appropriately selected and used depending on the purpose of the test.
  • sandwich method using a labeled antibody labeled with an enzyme or biotin or a bead and labeled with an enzyme such as peroxidase or biotin
  • an enzyme such as peroxidase or biotin
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the mutant polypeptide of the present invention used in the immunoassay of the present invention can provide a detectable signal either alone or by reacting with another substance. It may be labeled with.
  • labeling substance examples include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, and radioisotopes, and more specifically, peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase.
  • enzymes for example, horseradish peroxidase
  • chemiluminescent substances for example, biotin, avidin, and radioisotopes
  • peroxidase for example, horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • ⁇ -D-galactosidase examples include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, and radioisotopes, and more specifically, peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase.
  • Glucose oxidase glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescein isothiocyanate, phycobili Fluorescent materials such as proteins, rare earth metal chelates, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate, radioactive isotopes such as 3 H, 14 C, 125 I or 131 I, Otin, avidin, or chemiluminescent material.
  • the radioisotope and the fluorescent substance can provide a detectable signal alone.
  • the substrate in the case of an enzyme, at least a substrate is required, and various substrates are used depending on the method for measuring enzyme activity (colorimetric method, fluorescence method, bioluminescence method, chemiluminescence method, etc.).
  • colorimetric method, fluorescence method, bioluminescence method, chemiluminescence method, etc. for example, in the case of peroxidase, hydrogen peroxide is used as a substrate.
  • biotin at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted, but not limited thereto.
  • Various color-developing substances depending on the substrate are used as necessary.
  • the presence or absence of the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention in the sample of the subject is, for example, a subject (a cancer patient, a person who may have cancer, a person at risk of having cancer, or a healthy subject).
  • Humans but not limited to humans
  • mRNAs contained in samples tumor tissues, normal tissues, cancer cells or various body fluids containing normal cells (blood, serum, urine, saliva, ascites, pleural effusion, etc.)
  • the various oligonucleotides of the present invention described above are obtained using various gene analysis methods using cDNA, genomic DNA, etc.
  • Such gene analysis methods include, for example, Northern blotting, polymerase chain reaction (PCR), Southern blotting, LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement amplification), NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification), ICAN (Isothermal and Examples include chimeric primer-initiated amplification nucleic acids), LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) methods, TMA methods (Gen-Probe's TMA systems), microarrays, and next-generation sequencing methods.
  • hybridization of the oligonucleotide of the present invention to a polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention derived from the sample is used.
  • examples of such conditions include 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 x SSC, 37 ° C conditions, or hybridization conditions with stringency equivalent thereto.
  • conditions with higher stringency for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 x SSC, 42 ° C can also be applied.
  • the present invention also relates to a detection kit used for detecting the above-described mutant polypeptide of the present invention and a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in the samples of the above-described subjects (including cancer patients and healthy individuals).
  • the detection kit of the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the above-described mutant polypeptide of the present invention (including antibodies or antigen-binding fragments thereof labeled with the various labeling substances described above).
  • various detection reagents enzymes, substrates, etc.
  • experimental operation instructions can be included depending on the purpose of carrying out the various immunoassays described above.
  • the detection kit of the present invention hybridizes to mRNA derived from the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention described above, cDNA prepared using the mRNA as a template, genomic DNA, etc. Including various oligonucleotides of the present invention (a pair of oligonucleotide primers, oligonucleotide probes, etc.), and various reagents (enzymes, other oligonucleotides, nucleic acids, Reaction solution, etc.) and experimental operating instructions.
  • various oligonucleotides of the present invention a pair of oligonucleotide primers, oligonucleotide probes, etc.
  • various reagents enzymes, other oligonucleotides, nucleic acids, Reaction solution, etc.
  • the present invention also relates to the presence or absence of resistance to various FGFR inhibitors based on the presence or absence of the mutant polypeptide of the present invention or a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample isolated from a subject. It relates to a method of testing for predicting a subject's response to treatment or predicting the effect of an FGFR inhibitor in treating cancer.
  • the method of the present invention is from a subject (a cancer patient, a person who may be suffering from cancer, a person who is at risk of suffering from cancer, a healthy person, but is not limited to humans).
  • a subject a cancer patient, a person who may be suffering from cancer, a person who is at risk of suffering from cancer, a healthy person, but is not limited to humans.
  • the presence or absence of the mutant polypeptide of the present invention in the collected samples tumor tissue, normal tissue, cancer cells or various body fluids containing normal cells (blood, serum, urine, saliva, etc.)
  • FGFR Methods that test for predicting a subject's response to treatment with an inhibitor or predicting the effect of an FGFR inhibitor in treating cancer.
  • the method of the present invention further includes a sample collected from a subject (a cancer patient, a person who may have cancer, a person at risk of having cancer, or a healthy person, but not limited to a human).
  • a subject a cancer patient, a person who may have cancer, a person at risk of having cancer, or a healthy person, but not limited to a human.
  • the presence or absence of the polynucleotide encoding the mutated polypeptide of the present invention in various body fluids (tumor tissue, normal tissue, cancer cells or various body fluids (blood, serum, urine, saliva, etc.) containing normal cells) Based on the criteria of having resistance against various FGFR inhibitors when a polynucleotide encoding the mutant polypeptide is detected and tested using a detection method and detection kit for a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the present invention also provides an anticancer agent comprising a compound having an FGFR inhibitory activity (hereinafter referred to as “an anti-cancer agent”) based on the presence or absence of the mutant polypeptide of the present invention or a polynucleotide encoding the mutant polypeptide in a sample isolated from a subject. Relates to a method of selecting patients to which (as described) applies.
  • an anti-cancer agent comprising a compound having an FGFR inhibitory activity
  • a sample tumor tissue, normal tissue, cancer cell or normal
  • a subject a cancer patient or a person who may have cancer, not limited to a human
  • the presence or absence of the mutant polypeptide of the present invention in various body fluids including cells (blood, serum, urine, saliva, etc.) is tested and determined using the method for detecting the mutant polypeptide of the present invention and the detection kit described above. If the mutant polypeptide is detected, the subject is selected as a patient to which an anticancer agent containing a compound having an FGFR inhibitory activity (or a pharmaceutical composition for cancer treatment: as described below) is applied. The method of doing is mentioned.
  • the compound having the FGFR inhibitory activity is preferably a compound of the general formula (I).
  • the method of the present invention further includes a sample (tumor tissue, normal tissue, cancer cell or normal cell) collected from a subject (a cancer patient or a person who may be suffering from cancer; not limited to a human). Presence or absence of the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention in various body fluids (blood, serum, urine, saliva, etc.), the detection method and kit for detecting the polynucleotide encoding the mutant polypeptide of the present invention described above When a polynucleotide encoding the mutant polypeptide is detected, an anticancer agent containing a compound having FGFR inhibitory activity (as described below) is applied to the subject. The method of selecting as a patient is mentioned.
  • the compound having the FGFR inhibitory activity is preferably a compound of the general formula (I).
  • FGFR inhibitor or “compound having FGFR inhibitory activity” in the present invention is used interchangeably, and FGFR in the present invention described above, that is, a fibroblast which is a kinase belonging to the receptor tyrosine kinase family.
  • FGFR growth factor receptor
  • FGFR growth factor receptor
  • FGFR2 a growth factor receptor
  • FGFR2 cDNA sequence: SEQ ID NO: 3, 4 / GenBank Accession respectively
  • No . Compounds having the activity of inhibiting the activity of NM_000141.4 and NM_022970.3, respectively.
  • the FGFR inhibitor in the present invention includes any FGFR inhibitor as long as the compound has an activity of inhibiting the activity of FGFR.
  • the antibodies having the activity of inhibiting the activity of FGFR included as FGFR inhibitors in the present invention include antibodies identified by the following development codes (RG7444, FP-1039, AV370, PRO-001).
  • Examples of the low molecular weight compound having an activity of inhibiting the activity of FGFR included as an FGFR inhibitor in the present invention include (1) compounds disclosed in the following patent documents or non-patent documents (Cancer Research, 2012, 72: 2045-2056; J. Med. Chem., 2011, 54: 7066-7083; International Publication No.
  • WO2011 / 016528 (2) Compound identified by the following general name or development code: AZD-4547 (described later) Compound C in Table 1), BGJ-398 (Compound D in Table 1 described later), LY-2874455, cediranib (AZD2171; Compound E in Table 1 described later), PD173074 (Compound B in Table 1 described later), reorafenib , Ponatinib, orantinib, nintedanib, masitinib, lenvatinib, dovitinib (TKI258), brivanib, volasertib, golvatinib, ENMD-2076, E-3810, XL-999, XL-228, ARQ087, Tivozanib, motesanib, reorafenib, and (3)
  • the compounds shown below are included, but not limited thereto.
  • R 1 to R 4 each independently represents the following group;
  • R 1 is hydrogen, hydroxy, halogen, cyano, nitro, C 1-4 haloalkyl, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-7 cycloalkyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, —OR 5 , —NR 6 R 7 , — (CR 8 R 9 ) n Z 1 , —C (O) NR 12 R 13 , —SR 14 , —SOR 15 , —SO 2 R 16 , —NR 17 SO 2 R 18 , COOH, C 6-10 aryl optionally substituted with one or more groups independently selected from group P, one or more independently selected from group Q 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted by the group: —COR 19 , —COOR 20 , —OC (O) R 21 , —NR 22 C (O
  • R 20 represents C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R 21 represents C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R 22 represents hydrogen, C 1-4 alkyl or C 1-4 haloalkyl
  • R 23 represents hydrogen, C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl
  • R 24 represents hydrogen, C 1-4 alkyl or C 1-4 haloalkyl
  • R 25 represents C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl
  • Alkyl in the present specification is a monovalent group derived by removing an arbitrary hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon, does not contain a heteroatom or an unsaturated carbon-carbon bond in the skeleton, It has a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures containing hydrogen and carbon atoms. Alkyl groups include linear and branched structures. The alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 , hereinafter “C pq ” means p to q carbon atoms), C 1 Examples thereof include a -5 alkyl group, a C 1-4 alkyl group, and a C 1-3 alkyl group.
  • alkyl examples include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, pentyl group, isopentyl group, 2 , 3-dimethylpropyl group, 3,3-dimethylbutyl group, hexyl group and the like.
  • alkenyl is a monovalent hydrocarbon group having at least one double bond (two adjacent SP2 carbon atoms), and includes straight-chain or branched-chain ones. Depending on the arrangement of the double bonds and substituents (if any), the geometry of the double bonds can take the enthaneuve (E) or tsuzanmen (Z), or cis or trans configurations. Preferred examples of the alkenyl group include a C 2-6 alkenyl group.
  • alkenyl examples include vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (including cis and trans), 3-butenyl, and pentenyl groups. Hexenyl group and the like.
  • alkynyl is a monovalent hydrocarbon group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms), and includes straight-chain or branched-chain ones. Preferably, a C 2-6 alkynyl group is used.
  • alkynyl examples include ethynyl group, 1-propynyl group, propargyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group and the like.
  • Alkenyl or alkynyl can have one or more double bonds or triple bonds, respectively.
  • Cycloalkyl in the present specification means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclic ring, and a spiro ring.
  • Preferred examples of the cycloalkyl include a C 3-7 cycloalkyl group.
  • Specific examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group.
  • Cycloalkylalkyl in the present specification means a group in which any hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with the above-mentioned definition “cycloalkyl”.
  • Preferred examples of the cycloalkylalkyl include C 3-7 cycloalkyl C 1-3 alkyl, and specific examples include a cyclopropylmethyl group and a cyclopropylethyl group.
  • heteroatom means a nitrogen atom (N), an oxygen atom (O), or a sulfur atom (S).
  • Halogen in the present specification means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • haloalkyl is the same or different, preferably 1-9, more preferably 1-5, a group in which the “halogen atom” is bonded to the “alkyl”. Specifically, for example, chloromethyl group, dichloromethyl group, trichloromethyl group, fluoromethyl group, difluoromethyl group, perfluoroalkyl group (for example, trifluoromethyl group, —CF 2 CF 3 etc.), 2, 2, Examples include 2-trifluoroethyl group.
  • alkoxy means an oxy group to which the above-defined “alkyl” is bonded, and preferably includes a C 1-4 alkoxy group, a C 1-3 alkoxy group and the like. Specific examples of alkoxy include methoxy group, ethoxy group, 1-propoxy group, 2-propoxy group, n-butoxy group, i-butoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group and the like.
  • haloalkoxy is the same or different, preferably 1-9, more preferably 1-5, a group in which the “halogen atom” is bonded to the “alkoxy”. Specific examples include a chloromethoxy group, a trichloromethoxy group, a trifluoromethoxy group, and the like.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C 6-10 aryl and the like.
  • aryl include phenyl group, naphthyl group (for example, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group) and the like.
  • alicyclic ring means a monovalent non-aromatic hydrocarbon ring.
  • the alicyclic ring may have an unsaturated bond in the ring or may be a polycyclic group having two or more rings. Carbon atoms constituting the ring may be oxidized to form carbonyl.
  • the number of atoms constituting the alicyclic ring is preferably 3 to 10 (3 to 10-membered alicyclic ring).
  • Examples of the alicyclic ring include a cycloalkyl ring, a cycloalkenyl ring, and a cycloalkynyl ring.
  • heteroaryl means an aromatic monovalent heterocyclic group containing preferably 1 to 5 heteroatoms in the atoms constituting the ring. Heteroaryl may be partially saturated and may be monocyclic or fused (eg, bicyclic heteroaryl fused with a benzene ring or monoheteroaryl ring). The number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10 membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, Pyridyl group, pyrimidyl group, pyridazinyl group, pyrazinyl group, triazinyl group, benzofuranyl group, benzothienyl group, benzothiadiazolyl group, benzothiazolyl group, benzoxazolyl group, benzooxadiazolyl group, benzimidazolyl group, indolyl group, isoindolyl Group, azaindolyl group, indazolyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, cinnolinyl group, quinazolinyl group, quinoxalin
  • heterocyclyl means a non-aromatic monovalent heterocyclic group containing preferably 1 to 5 heteroatoms in the atoms constituting the ring.
  • the heterocyclyl may have a double or triple bond in the ring, the carbon atom may be oxidized to form a carbonyl, and may be a single ring or a condensed ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 3 to 10 (3 to 10 membered heterocyclyl).
  • heterocyclyl examples include oxetanyl group, dihydrofuryl group, tetrahydrofuryl group, dihydropyranyl group, tetrahydropyranyl group, tetrahydropyridyl group, morpholinyl group, thiomorpholinyl group, pyrrolidinyl group, piperidinyl group, piperazinyl group, Pyrazolidinyl group, imidazolinyl group, imidazolidinyl group, oxazolidinyl group, isoxazolidinyl group, thiazolidinyl group, isothiazolidinyl group, thiadiazolidinyl group, azetidinyl group, oxazolidone group, benzodioxanyl group, benzoxazolyl Group, dioxolanyl group, dioxanyl group and the like.
  • arylalkyl means a group in which any hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with the above-mentioned definition “aryl”.
  • Preferred examples of the arylalkyl include C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, C 6-10 aryl C 1-3 alkyl, and the like. Specific examples include a benzyl group, a phenethyl group, and a naphthylmethyl group.
  • heteroarylalkyl means a group in which any hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with the above-mentioned definition “heteroaryl”.
  • the heteroarylalkyl is preferably a 5- to 10-membered heteroaryl C 1-3 alkyl, and specifically includes, for example, a pyrrolylmethyl group, an imidazolylmethyl group, a thienylmethyl group, a pyridylmethyl group, a pyrimidylmethyl group, a quinolylmethyl group, and the like. Group, pyridylethyl group and the like.
  • Heterocyclylalkyl in the present specification means a group in which any hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with the above-mentioned definition “heterocyclyl”.
  • Preferred examples of the heterocyclylalkyl include 3- to 10-membered heterocyclyl C 1-3 alkyl. Specific examples include morpholinylmethyl group, morpholinylethyl group, thiomorpholinylmethyl group, pyrrolidinyl. Examples include a methyl group, piperidinylmethyl group, piperazinylmethyl group, piperazinylethyl group, oxetanylmethyl group and the like.
  • “Monohydroxyalkyl” in the present specification means a group in which any one hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with one hydroxyl group.
  • the monohydroxyalkyl is preferably C 1-6 monohydroxyalkyl, C 2-6 monohydroxyalkyl, and the like. Specifically, for example, hydroxymethyl group, 1-hydroxyethyl group, 2-hydroxyethyl group Etc. are included in this.
  • dihydroxyalkyl means a group in which any two hydrogen atoms in the above-mentioned definition “alkyl” are substituted with two hydroxyl groups.
  • dihydroxyalkyl include C 1-6 dihydroxyalkyl, C 2-6 dihydroxyalkyl, and the like. Specifically, for example, 1,2-dihydroxyethyl group, 1,2-dihydroxypropyl group, 1,3 This includes dihydroxypropyl groups and the like.
  • Trihydroxyalkyl in the present specification means a group in which any three hydrogen atoms in the above-mentioned definition “alkyl” are substituted with three hydroxyl groups.
  • Preferred examples of trihydroxyalkyl include C 1-6 trihydroxyalkyl and C 2-6 trihydroxyalkyl.
  • alkoxyalkyl means a group in which any hydrogen atom in the above-defined “alkyl” is substituted with “alkoxy” as defined above.
  • the alkoxyalkyl preferably includes C 1-3 alkoxy C 1-4 alkyl, C 1-3 alkoxy C 2-4 alkyl and the like, and specifically includes, for example, methoxyethyl and the like.
  • alkoxyalkoxyalkyl in the present specification means a group in which any hydrogen atom in the terminal alkyl in the above-mentioned definition “alkoxyalkyl” is substituted with “alkoxy” as defined above.
  • Preferred examples of the alkoxyalkoxyalkyl include C 1-3 alkoxy C 1-4 alkoxy C 1-4 alkyl, C 1-3 alkoxy C 2-4 alkoxy C 2-4 alkyl, and the like.
  • aminoalkyl means a group in which any hydrogen atom in the above-mentioned definition “alkyl” is substituted with an amino group.
  • Preferred examples of the aminoalkyl group include C 1-4 aminoalkyl and C 2-4 aminoalkyl.
  • alkylamino means an amino group in which one “alkyl” as defined above is bonded.
  • Preferred examples of alkylamino include C 1-4 alkylamino.
  • dialkylamino means an amino group in which two “alkyl” defined above are bonded, and the alkyl may be the same or different.
  • Preferred examples of the dialkylamino include di (C 1-4 alkyl) amino.
  • alkylaminoalkyl means a group in which any hydrogen atom in “alkyl” as defined above is substituted with “alkylamino” as defined above.
  • alkylamino alkyl preferably, C 1-4 alkylamino C 1-4 alkyl, such as C 1-4 alkylamino C 2-4 alkyl.
  • dialkylaminoalkyl means a group in which any hydrogen atom in “alkyl” as defined above is substituted with “dialkylamino” as defined above.
  • Preferred examples of the dialkylaminoalkyl include di (C 1-4 alkyl) amino C 1-4 alkyl, di (C 1-4 alkyl) amino C 2-4 alkyl and the like.
  • heterocyclylamino means an amino group in which one “heterocyclyl” defined above is bonded.
  • the heterocyclylamino is preferably a 3- to 10-membered heterocyclylamino.
  • cyanoalkyl in the present specification means a group in which any hydrogen atom in the above-defined “alkyl” is substituted with a cyano group.
  • Preferred examples of cyanoalkyl include cyano (C 1-3 alkyl).
  • alkylsulfonyl means a sulfonyl group to which the above-defined “alkyl” is bound (ie, alkyl-SO 2 —).
  • Preferred examples of the alkylsulfonyl include C 1-3 alkylsulfonyl, and specific examples thereof include methylsulfonyl, ethylsulfonyl, n-propylsulfonyl, i-propylsulfonyl and the like.
  • alkylsulfonylalkyl means a group in which any hydrogen atom in the above-defined “alkyl” is substituted with “alkylsulfonyl” as defined above.
  • alkylsulfonyl alkyl preferably, C 1-3 alkylsulfonyl C 1-4 alkyl, such as C 1-3 alkylsulfonyl C 2-4 alkyl.
  • the compounds represented by the formula (I) are preferably as follows.
  • R 1 is preferably hydrogen, hydroxy, halogen, cyano, nitro, C 1-4 haloalkyl, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-7 cycloalkyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, —OR 5 , —NR 6 R 7 , — (CR 8 R 9 ) n Z 1 , —C (O) NR 12 R 13 , —SR 14 , —SOR 15 , — SO 2 R 16 , —NR 17 SO 2 R 18 , COOH, C 6-10 aryl optionally substituted with one or more groups independently selected from the P group, independently selected from the Q group 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups, —COR 19 , —COOR 20 , —OC (O) R 21 , —NR 22 C (O) R 23 , —NR 24 C
  • R 1 is more preferably hydrogen, hydroxy, halogen, cyano, C 1-4 haloalkyl, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkynyl, C 3-7 cycloalkyl, C 6-10 aryl C 1- 4 alkyl, —OR 5 , —NR 6 R 7 , — (CR 8 R 9 ) n Z 1 , —C (O) NR 12 R 13 , —SR 14 , —SO 2 R 16 , —NR 17 SO 2 R 18 , COOH, C 6-10 aryl optionally substituted with one or more groups independently selected from group P, or substituted with one or more groups independently selected from group Q It may be 5 to 10 membered heteroaryl or 3 to 10 membered heterocyclyl.
  • 5- to 10-membered heteroaryl examples include imidazolyl, thienyl, pyridyl, pyridazinyl and pyrazolyl groups, and specific examples of the 3- to 10-membered heterocyclyl include morpholinyl and tetrahydropyridyl groups.
  • a piperidinyl group is particularly preferred.
  • R 2 is preferably hydrogen, hydroxy, halogen, cyano, nitro, C 1-4 haloalkyl, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-7 cycloalkyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, —OR 5 , —NR 6 R 7 , — (CR 8 R 9 ) n Z 1 , —C (O) NR 12 R 13 , —SR 14 , —SOR 15 , — SO 2 R 16 , —NR 17 SO 2 R 18 , COOH, C 6-10 aryl optionally substituted with one or more groups independently selected from the P group, independently selected from the Q group 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups, —COR 19 , —COOR 20 , —OC (O) R 21 , —NR 22 C (O) R 23 , —NR 24 C (
  • R 2 may be more preferably substituted with one or more groups independently selected from hydrogen, halogen, C 1-4 haloalkyl, C 1-6 alkyl, —OR 5 , P group.
  • the 5- to 10-membered heteroaryl here is particularly preferably a pyridyl group.
  • R 1 and said R 2 are preferably taken together with the atoms to which they are attached to form a 3-10 membered heterocyclyl or 5-10 membered heteroaryl.
  • the heterocyclyl or the heteroaryl may have a halogen atom as a substituent.
  • a dioxolanyl group and a dioxanyl group are particularly preferable.
  • R 3 is preferably hydrogen, C 1-5 alkyl, C 6-10 aryl C 1-6 alkyl or C 1-4 haloalkyl, more preferably hydrogen, C 1-4 alkyl, C 6- 10 aryl C 1-4 alkyl or C 1-3 perfluoroalkyl, particularly preferably C 1 alkyl.
  • R 4 is preferably hydrogen, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-4 haloalkyl, hydroxy, cyano, nitro, C 1-4 alkoxy, — (CH 2 ) n Z 1 , —NR 6 R 7.
  • R 4 is more preferably hydrogen, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 perfluoroalkyl, cyano, methanesulfonyl, hydroxyl, alkoxy or amino, and particularly preferably hydrogen or halogen.
  • the A ring is preferably a 5- to 10-membered heteroaryl ring or a C 6-10 aryl ring, and more preferably benzene, indole, azaindole, benzofuran, benzothiophene, benzothiazole, quinoline or pyrrole. Particularly preferred is indole or pyrrole.
  • R 5 is preferably C 1-5 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 3-7 cycloalkyl C 1-3 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl.
  • R 5 is more preferably C 1-5 alkyl, C 3-7 cycloalkyl C 1-3 alkyl, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 alkoxy C 1-4 alkyl, C 6-10 aryl, C 6-10 aryl C 1-3 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q, C 1-3 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl .
  • 3- to 10-membered heterocyclylalkyl specifically, piperazinylethyl group, oxetanylmethyl group, and morpholinylethyl group are particularly preferable, and as the 3- to 10-membered heterocyclyl, specifically, oxetanyl group, tetrahydro A pyranyl group is particularly preferred.
  • R 6 and R 7 may be the same or different and are each hydrogen, C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, C 1- 3 alkoxy C 2-4 alkyl, C 6-10 aryl C 1-3 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl C 1-3 alkyl, 5-10 membered heteroaryl C 1-3 alkyl, C 1-6 monohydroxyalkyl, C 1-6 dihydroxyalkyl, C 1-6 trihydroxyalkyl, 3-10 membered heterocyclyl, C 1-4 aminoalkyl, C 1-4 alkylamino C 1-4 alkyl, di (C 1-4 alkyl) amino C 1-4 alkyl, or cyano (C 1-3 alkyl).
  • each of R 6 and R 7 is independently hydrogen, C 1-3 alkoxy C 1-4 alkyl, 3 to 10-membered heterocyclyl C 1-3 alkyl, or 5 to 10-membered heteroaryl C 1. -3 alkyl, or C 1-6 dihydroxyalkyl.
  • the 3- to 10-membered heterocyclylalkyl is particularly preferably a morpholinylethyl group
  • the 5- to 10-membered heteroarylalkyl is particularly preferably a pyridylethyl group.
  • R 6 and R 7 can preferably be taken together with the nitrogen atom to which they are attached to form a 3-10 membered heterocyclyl or 5-10 membered heteroaryl.
  • N represents an integer of 1 to 3, preferably n is 1.
  • R 8 and R 9 may be the same or different, and each is hydrogen, C 1-4 alkyl or halogen, and more preferably hydrogen.
  • R 8 and R 9 can preferably be combined with the carbon atom to which they are attached to form an alicyclic ring.
  • Z 1 is preferably hydrogen, NR 10 R 11 , —OH, or 3 to 10 membered heterocyclyl or 5 to 10 member optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q Heteroaryl, more preferably NR 10 R 11 or —OH, or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from Group Q.
  • the 3- to 10-membered heterocyclyl here is particularly preferably a pyrrolidinyl group, a piperazinyl group, a piperidinyl group, or a morpholinyl group.
  • the R 10 and the R 11 may be the same or different, and C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 alkoxyC are preferable.
  • the R 10 and the R 11 can preferably be combined with the nitrogen atom to which they are attached to form a 3-10 membered heterocyclyl or 5-10 membered heteroaryl.
  • R 12 and R 13 may be the same or different and are each hydrogen, C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 Alkoxy C 1-4 alkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl, 3-10 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl C 1-3 alkyl, 5- 10-membered heteroaryl C 1-3 alkyl, cyano (C 1-3 alkyl), C 1-3 alkylsulfonyl C 1-4 alkyl, or 3- to 10-membered alicyclic ring, more preferably hydrogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 haloalkyl.
  • R 12 and R 13 may preferably be substituted with one or more groups independently selected from group Q together with the nitrogen atom to which they are bonded.
  • 10-membered heterocyclyl or 5- to 10-membered heteroaryl can be formed.
  • Particularly preferred is a 3- to 10-membered heterocyclylalkyl, specifically a piperazinyl group, a morpholinyl group, a pyrrolidinyl group or a piperidinyl group.
  • R 14 is preferably substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, group P.
  • Said R 15 is preferably substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, group P. Or an optionally substituted C 6-10 aryl, or a 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q.
  • Said R 16 is preferably substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, group P.
  • C 6-10 aryl, or 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q, more preferably C 1-4 alkyl.
  • R 17 is preferably hydrogen or C 1-4 alkyl, more preferably hydrogen.
  • R 18 is preferably substituted with one or more groups independently selected from C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, group P.
  • C 6-10 aryl, or 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with one or more groups independently selected from group Q, more preferably C 1-4 alkyl.
  • Said R 19 is preferably one or more groups independently selected from hydrogen, C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, or Q group 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl optionally substituted with hydrogen, more preferably hydrogen or one or more groups independently selected from group Q 5- to 10-membered heteroaryl or 3- to 10-membered heterocyclyl.
  • the 3- to 10-membered heterocyclyl here is more preferably a piperazinyl group, a morpholinyl group, a pyrrolidinyl group, or a piperidinyl group.
  • Said R 20 is preferably C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • R 21 is preferably C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • Said R 22 is preferably hydrogen, C 1-4 alkyl or C 1-4 haloalkyl.
  • Said R 23 is preferably hydrogen, C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • Said R 24 is preferably hydrogen, C 1-4 alkyl or C 1-4 haloalkyl.
  • R 25 is preferably C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • R 26 and R 27 may be the same or different and are each hydrogen, C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 Alkoxy C 1-4 alkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl, 3-10 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl C 1-3 alkyl, 5- 10-membered heteroaryl C 1-3 alkyl, cyano (C 1-3 alkyl), C 1-3 alkylsulfonyl C 1-4 alkyl, or a 3-10 membered alicyclic ring.
  • R 26 and R 27 can preferably be joined together with the nitrogen atom to which they are attached to form a 3-10 membered heterocyclyl or 5-10 membered heteroaryl.
  • R 28 and R 29 may be the same or different and are each hydrogen, C 1-4 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 Alkoxy C 1-4 alkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl, 3-10 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl C 1-4 alkyl, 3-10 membered heterocyclyl C 1-3 alkyl, 5- 10-membered heteroaryl C 1-3 alkyl, cyano (C 1-3 alkyl), C 1-3 alkylsulfonyl C 1-4 alkyl, or a 3-10 membered alicyclic ring.
  • R 28 and R 29 can preferably be joined together with the nitrogen atom to which they are attached to form a 3-10 membered heterocyclyl or 5-10 membered heteroaryl.
  • Said R 30 is preferably C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • R 31 is preferably C 1-4 alkyl, C 3-7 cycloalkyl, C 1-4 haloalkyl, C 6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl or 3-10 membered heterocyclyl.
  • Said R 32 is preferably C 1-4 alkyl or C 6-10 aryl.
  • the substituent included in the P group is preferably halogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 haloalkyl, —OH, C 1-3 alkoxy, C 1-3 haloalkoxy, 3 to 10-membered heterocyclylamino, —SO 2 R, —CN, —NO 2 , or 3 to 10 membered heterocyclyl, more preferably halogen, C 1-4 haloalkyl, C 1-3 alkoxy, C 1-3 haloalkoxy, or 3 to 10 Heterocyclyl.
  • the 3- to 10-membered heterocyclyl here is particularly preferably a morpholinyl group.
  • the substituent contained in the Q group is preferably halogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 haloalkyl, —OH, C 1-3 alkoxy, C 1-6 monohydroxyalkyl, C 1-6 dihydroxyalkyl. Or substituted with C 1-6 trihydroxyalkyl, 3-10 membered heterocyclylamino, —SO 2 R, —CN, —NO 2 , C 3-7 cycloalkyl, —COR 19 , or C 1-4 alkyl.
  • 3-10 membered heterocyclyl more preferably halogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 haloalkyl, —OH, C 1-3 alkoxy, C 1-6 monohydroxyalkyl, —SO 2 R 16 , C 3-7 cycloalkyl, -COR 19 or C 1-4 3 alkyl optionally substituted 1-10 membered heterocyclyl der, .
  • the 3- to 10-membered heterocyclyl here is more preferably a piperazinyl group, a piperidinyl group, or a morpholinyl group.
  • examples include compounds in which A in the above formula (I) is indole, R 3 is methyl, and R 4 is hydrogen, for example, compounds shown in Table 1.
  • the above compound can be produced, for example, according to the production method described in International Publication WO2011 / 016528.
  • the compound having the FGFR inhibitory activity in the present invention includes not only a free form but also a pharmaceutically acceptable salt.
  • salts include inorganic acid salts, organic acid salts, inorganic base salts, organic base salts, acidic or basic amino acid salts, and the like.
  • inorganic acid salts include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like
  • organic acid salts include, for example, acetate, succinate and fumarate.
  • Acid salts maleates, tartrate, citrate, lactate, malate, stearate, benzoate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, and the like.
  • a particularly preferred salt in the present invention is malate.
  • the inorganic base salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
  • organic base salts examples thereof include diethylamine salt, diethanolamine salt, meglumine salt, N, N-dibenzylethylenediamine salt and the like.
  • Preferred examples of the acidic amino acid salt include aspartate and glutamate, and preferred examples of the basic amino acid salt include arginine salt, lysine salt and ornithine salt.
  • the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention also includes hydrates. Furthermore, the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention may absorb a certain other solvent and become a solvate, and such a solvate is also included.
  • the compounds having FGFR inhibitory activity in the present invention also include all structurally occurring isomers (geometric isomers, optical isomers, stereoisomers, tautomers, etc.) and isomer mixtures.
  • the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention also includes any crystal polymorph.
  • the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention also includes its prodrug.
  • a prodrug is a derivative of a compound of the present invention that has a group that can be chemically or metabolically decomposed and is restored to the original compound after administration to a living body and exhibits its original medicinal properties. No complexes and salts.
  • the compounds having FGFR inhibitory activity in the present invention include those in which one or more atoms in the molecule are replaced with isotopes.
  • the isotope means atoms having the same atomic number (number of protons) but different mass numbers (sum of the number of protons and neutrons).
  • Examples of atoms to be substituted for isotopes contained in the compound of the present invention include hydrogen atoms, carbon atoms, nitrogen atoms, oxygen atoms, phosphorus atoms, sulfur atoms, fluorine atoms, chlorine atoms, and the like.
  • the body includes 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, and the like.
  • radioactive isotopes such as 3 H and 14 C that decay by emitting radiation are useful in the tissue distribution test of drugs or compounds.
  • Stable isotopes are safe to use because they do not decay, their abundance is almost unchanged, and they do not emit radiation.
  • the isotope substitute of the compound of the present invention can be converted according to a conventional method by replacing the reagent used in the synthesis with a reagent containing the corresponding isotope.
  • the “anticancer agent” or “pharmaceutical composition for cancer treatment” containing the FGFR inhibitor in the present invention is used interchangeably, and is composed of a compound having the above-mentioned FGFR inhibitory activity and a pharmaceutically acceptable carrier. Means a therapeutic composition.
  • the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention is prepared by a conventional method using tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, syrups, troches, inhalants, suppositories, injections, ointments. And ophthalmic ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, poultices, lotions and the like. Excipients, binders, lubricants, colorants, flavoring agents, and if necessary stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjusters, preservatives, Antioxidants and the like can be used. In general, ingredients that are used as raw materials for pharmaceutical preparations are blended to prepare a preparation by a conventional method.
  • the compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt and excipient thereof in order to produce an oral preparation, the compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt and excipient thereof, and optionally a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent.
  • a binder a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent.
  • these components include animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow, and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane and solid paraffin; ester oils such as octyldodecyl myristate and isopropyl myristate; cetostearyl alcohol and behenyl alcohol Higher alcohols; silicone resins; silicone oils; surfactants such as polyoxyethylene fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymers Water-soluble such as hydroxyethylcellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose Molecules; lower alcohols such as ethanol and isopropanol; polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, di
  • binder examples include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methylcellulose, ethylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polypropylene glycol, polyoxyethylene block polymer, meglumine and the like. It is done.
  • disintegrant examples include starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, carboxymethylcellulose / calcium and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like.
  • coloring agents those permitted to be added to pharmaceuticals are used.
  • flavoring agents cocoa powder, mint brain, fragrance powder, mint oil, dragon brain, cinnamon powder, and the like are used.
  • these tablets and granules may be coated with sugar coating and other coatings as necessary.
  • a liquid preparation such as a syrup or an injectable preparation
  • a compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof, a pH adjuster, a solubilizer, an isotonic agent, etc. are necessary. Add a solubilizing agent, stabilizer, etc. accordingly, and formulate it by a conventional method.
  • the method for producing the external preparation is not limited and can be produced by a conventional method. That is, as a base material used for formulation, various raw materials usually used for pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and the like can be used. Specific examples of base materials to be used include animal and vegetable oils, mineral oils, ester oils, waxes, higher alcohols, fatty acids, silicone oils, surfactants, phospholipids, alcohols, polyhydric alcohols, Examples include raw materials such as water-soluble polymers, clay minerals, and purified water. If necessary, pH adjusters, antioxidants, chelating agents, antiseptic / antifungal agents, coloring agents, fragrances, etc. may be added. However, the base material of the external preparation according to the present invention is not limited thereto.
  • the addition amount of the said base raw material is an amount used as the density
  • the anticancer agent for administering the compound having FGFR inhibitory activity in the present invention to a patient is not particularly limited, and may be administered orally or parenterally by a commonly used method.
  • a commonly used method for example, tablets, powders, granules, capsules, syrups, troches, inhalants, suppositories, injections, ointments, eye ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, poultices, lotions, etc. It can be formulated and administered as an agent.
  • the dose of the FGFR inhibitor contained in the anticancer agent or cancer therapeutic pharmaceutical composition in the present invention is appropriately determined according to the degree of symptoms, age, sex, body weight, type of administration / salt, specific type of disease, etc. You can choose.
  • the dose varies significantly depending on the type of disease, the degree of symptoms, the patient's age, gender difference, sensitivity to drugs, etc., but is usually about 0.03-1000 mg, preferably 0.1-500 mg per day as an adult. Preferably, 0.1-100 mg is administered in 1 to several times a day. In the case of an injection, it is usually about 1 ⁇ g / kg to 3000 ⁇ g / kg, preferably about 3 ⁇ g / kg to 1000 ⁇ g / kg.
  • the present invention is also characterized in that the compound having the FGFR inhibitory activity described above is used so as to be administered to a patient that expresses the mutant polypeptide of the present invention or has a polynucleotide encoding the mutant polypeptide. And a pharmaceutical composition for treating cancer containing the compound.
  • the present invention further provides treatment or prevention of cancer comprising administering an effective amount of the above-mentioned compound having FGFR inhibitory activity or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient that expresses the mutant polypeptide or has the polynucleotide.
  • the present invention relates to a compound having FGFR inhibitory activity or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the treatment or prevention of a patient expressing a peptide or having the polynucleotide.
  • the mutant polypeptide of the present invention as a biomarker before the patient is administered with the above-described anticancer agent containing the FGFR inhibitor, the patient expresses the mutant polypeptide, Or, it is tested whether or not it has a polynucleotide encoding the mutant polypeptide, and the FGFR inhibitor is included only when the mutant polypeptide is expressed or has the polynucleotide encoding the mutant polypeptide
  • the anticancer agent is used for administration to the patient. As a result, it is possible to prevent the occurrence of side effects in the treatment with the drug and to control the treatment mode so that the best treatment effect can be obtained, and personalized medicine (personalized medicine) becomes possible.
  • test of whether the patient expresses the mutant polypeptide of the present invention or has a polynucleotide encoding the mutant polypeptide can be performed using the method of the present invention described above.
  • the present invention also relates to a method for identifying a compound having FGFR inhibitory activity.
  • Specific examples of the method for identifying a compound having FGFR inhibitory activity of the present invention include a method comprising the following steps. (A) culturing cells expressing the above-described mutant polypeptide of the present invention in the presence and absence of the test compound, respectively, and determining the level of cell proliferation; (B) comparing the level of cell proliferation when the cells are cultured in the presence of the test compound with the level of cell proliferation when the cells are cultured in the absence of the test compound; and (c) When the level of cell proliferation when the cells are cultured in the presence of the test compound is lower than the level of cell proliferation when the cells are cultured in the absence of the test compound, the test compound is A step of determining that it has FGFR inhibitory activity.
  • the cells used in this method may be primary cultured cells, established cells or recombinant cells as long as they express the mutant polypeptide of the present invention.
  • Examples of the recombinant cell include a recombinant cell into which a vector containing a polynucleotide encoding the above-described mutant polypeptide of the present invention has been introduced.
  • the primary cultured cells include cells collected from cancer patients, and the established cells include cancer cell lines established from cancer cells collected from cancer patients.
  • the cancer in the present invention includes any cancer as described above.
  • the method for identifying a compound having FGFR inhibitory activity of the present invention further includes a method comprising the following steps.
  • A a step of administering a test compound to a non-human mammal transplanted with a cell expressing the above-described mutant polypeptide of the present invention and determining the level of proliferation of the cell;
  • B comparing the level of cell proliferation determined in step (a) with the level of cell proliferation of the cells determined in a non-human mammal transplanted with the cells not receiving the test compound And
  • the cells used in this method may be primary cultured cells, established cells, or recombinant cells as long as they express the mutant polypeptide of the present invention.
  • Examples of the recombinant cell include a recombinant cell into which a vector containing a polynucleotide encoding the above-described mutant polypeptide of the present invention has been introduced.
  • the primary cultured cells include cells collected from cancer patients, and the established cells include cancer cell lines established from cancer cells collected from cancer patients.
  • the cancer in the present invention includes any cancer as described above.
  • the level of cell proliferation is determined by a conventional method using, for example, a colorimetric method for measuring an enzyme activity for reducing a dye (MTT, XTT, MTS, WST, etc.) to a formazan dye (purple). Can be tested.
  • a colorimetric method for measuring an enzyme activity for reducing a dye MTT, XTT, MTS, WST, etc.
  • a formazan dye purple
  • the level of cell proliferation can also be determined by measuring the size or weight of a tumor formed as a result of cell proliferation.
  • the method for identifying a compound having FGFR inhibitory activity of the present invention also includes an embodiment using a reporter gene assay.
  • Reporter genes include genes encoding any commonly used fluorescent protein.
  • green fluorescent protein GFP derived from Aequorea coerulescens, luciferase derived from Renilla, RCFPs derived from reef coral (Reef Coral® Fluorescent Proteins), fruit fluorescent proteins, and modifications thereof.
  • the reporter gene assay in the present invention can be performed, for example, as follows. Transcription of the gene encoding the mutant polypeptide of the present invention and the gene encoding the reporter protein into the mRNA of the gene encoding the reporter protein depending on the transcription signal of the mutant polypeptide-encoding polynucleotide to mRNA A gene recombinant cell is produced by transforming a cell generally used in the production of a recombinant protein with an expression vector inserted so that the above occurs. A test compound is brought into contact with the obtained transformed cells. By indirectly measuring the level of the mutant polypeptide expressed depending on the action of the compound by measuring the amount of fluorescence emitted by the reporter protein expressed simultaneously with the expression of the mutant polypeptide. Analyze whether the compound affects the expression of the mutant polypeptide (eg, US Pat. No. 5,436,128 and US Pat. No. 5,401,629, etc.).
  • the identification of the compound using this assay can be performed manually, but the so-called high throughput screening (Tissue culture engineering, Vol. 23, No. 23) is performed automatically using a machine (robot). .13, p.521-524; U.S. Pat. No. 5,670,113) can be carried out more quickly and easily.
  • Example 1 Examination of FGFR2 V564F mutant and V562L mutant (1) Evaluation of phosphorylation inhibitory action by FGFR inhibitor Polynucleotide encoding FGFR2 V564F mutant (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 6) And a polynucleotide (SEQ ID NO: 7) encoding FGFR2 V562L mutant (SEQ ID NO: 10) from the ORF polynucleotide (SEQ ID NO: 5) of wild-type FGFR2 (SEQ ID NO: 8) using the PCR method. -Produced by Directed Mutagenesis method.
  • a polynucleotide encoding a wild-type FGFR2 ORF polynucleotide, FGFR2 V564F mutant, or FGFR2 V562L mutant was subcloned into a pCXND3 vector (Kakekenken) to prepare each polypeptide expression vector.
  • Each of the prepared vectors was introduced into human colon adenocarcinoma cell HCT 116 (ATCC) using transfection reagent FuGENE (registered trademark) HD (Promega), wild type FGFR2 polypeptide (SEQ ID NO: 8), FGFR2 V564F mutant polypeptide (SEQ ID NO: 9) and FGFR2 V562L mutant polypeptide (SEQ ID NO: 10) were each transiently expressed.
  • Compound A or compound C was allowed to act on each cell in the presence of 0.1% DMSO, and then cell lysate of each cell was collected using Cell lysis buffer (Cell Signaling Technology).
  • the cell growth inhibitory activity of each compound against the strain that stably expresses the FGFR2 V564F mutant polypeptide or the FGFR2 V562L mutant polypeptide is stable against the wild type FGFR2 polypeptide.
  • the cell growth inhibitory activity against the expressing strain it was confirmed that Compound B and Compound C were significantly attenuated while Compound A hardly changed.
  • Example 2 Examination on TEL fusion FGFR2 V564F mutant (1) Evaluation of in vitro cell growth inhibitory effect of FGFR inhibitor Polynucleotide encoding the dimerization domain of wild-type TEL (SEQ ID NO: 33) And a polynucleotide encoding the intracellular domain of wild-type FGFR2 (SEQ ID NO: 1) are fused by the Site-Directed Mutagenesis method using the PCR method, and a TEL-fused wild-type FGFR2 (SEQ ID NO: 34) is encoded. A nucleotide (SEQ ID NO: 11) was prepared.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 12) encoding a TEL-fused FGFR2 V564F mutant (SEQ ID NO: 35) was prepared by a site-directed mutation method using the PCR method using a polynucleotide encoding TEL-fused wild-type FGFR2 as a template. did. Polynucleotides encoding TEL-fused wild-type FGFR2 and TEL-fused FGFR2 V564F mutants were subcloned into the pCXND3 vector (Kaketsuken) to prepare each polypeptide expression vector.
  • TEL-fused wild-type FGFR2 or TEL-fused FGFR2 V564F mutant polypeptide expression vectors were introduced into IL-3-dependent mouse pro-B cells Ba / F3 by electroporation and used as a selection marker in the absence of IL-3.
  • G-418 was added and cultured to establish Ba / F3 strains that stably express TEL-fused wild-type FGFR2 polypeptide or TEL-fused FGFR2 V564F mutant polypeptide and can proliferate independently of IL-3. did.
  • each compound (compound A, B, C, or E) diluted 18-fold in increments of 4 with 50 ⁇ M as the maximum concentration, diluted 18-fold in increments of 4 with 10 ⁇ M as the maximum concentration
  • Each compound (compound D) or DMSO (used as a control) was added and cultured for 4 days. Cell proliferation after 4 days was measured by WST-8 (Dojindo Laboratories). The cell growth inhibitory activity of each compound for each cell is expressed as 450 nM absorbance value in the well where the cells were cultured with each concentration added, and 450 nM absorbance value when the cells were cultured with DMSO added as C. (1-T / C) x 100 (%).
  • the cell growth inhibitory activity of each compound against the strain that stably expresses the TEL-fused FGFR2 V564F mutant polypeptide is the cell against the strain that stably expresses the TEL-fused wild-type FGFR2 polypeptide.
  • the compounds B, C, D and E were significantly attenuated while the compound A hardly changed.
  • mutant FGFR polypeptide of the present invention exhibits resistance to known FGFR inhibitors such as AZD4547 and is sensitive to a specific compound
  • the mutant polypeptide can be used for cancer caused by various FGFR inhibitors.
  • it is possible to determine the appropriateness of application of various FGFR inhibitors for each individual patient, and to prevent the occurrence of side effects in treatment with conventional FGFR inhibitors. It is possible to control the treatment mode so that a therapeutic effect is obtained, and personalized medicine is possible.

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Abstract

本発明者らは、FGFRについて新規なゲートキーパー変異を同定することに成功した。さらに、該変異を有する変異FGFRは、AZD4547などの公知のFGFR阻害剤に対して耐性を示す一方、特定の化合物に対しては感受性を示すことを見出した。該変異を有する変異ポリペプチドを、FGFR阻害剤による癌治療におけるバイオマーカーとして利用することにより、従前のFGFR阻害剤による治療における副作用の発現を未然に防止し、且つ最善の治療効果が得られるよう治療態様をコントロールすることが可能であり、個別化医療が可能となる。

Description

ＦＧＦＲゲートキーパー変異遺伝子およびそれを標的とする医薬
　本発明は、新規なゲートキーパー変異を含む変異ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む細胞、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体およびその断片、該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ、該ポリペプチドの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、該抗体または該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの検出方法ならびに検出用キット、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの存否を基準とするFGFR阻害剤に対する耐性の有無についての試験方法、FGFR阻害剤が適用される癌患者を選択する方法、FGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩を該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者に投与されるように用いられることを特徴とする癌治療用医薬組成物、FGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩の有効量を該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者に投与することを含む癌の治療または予防方法、該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者に投与するための癌治療用医薬組成物の製造におけるFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩の使用、該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者の治療または予防における使用のためのFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩、ならびにFGFR阻害剤を同定する方法、等に関する。
　従来から、癌という疾患は、あらゆる臓器および組織で発生し、難治性かつ致死性の高い極めて厄介な疾患であることは言うまでもないが、最近の統計データにおいても、2人に１人が一生のうちに癌と診断され、また、男性では4人に1人が、女性では6人に1人が癌で死亡するという状況であり、極めて深刻な疾患である。
　線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）は、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属しているキナーゼで、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4によりFGFRファミリーを構成している。リガンドは線維芽細胞増殖因子（FGF）であり、22種の構造的に類似したタンパク質がファミリーを構成している。
　FGFRを介して伝達されるシグナルはMAPK経路やPI3K/AKT経路に流れ、このシグナル伝達は、癌においては、細胞増殖、血管新生、細胞遊走、浸潤、転移などに関わっていること、またFGFRは、過剰発現、遺伝子過増幅、変異、転座によって活性化することが報告されている(非特許文献１)。例えば、FGFR3は、多発性骨髄腫で遺伝子転座(非特許文献２)、膀胱癌で遺伝子変異(非特許文献３)、卵巣癌、非小細胞性肺癌、肝細胞癌で過剰発現が知られている。
　これらのことから、FGFRと癌との関連性が示唆されており、FGFRを阻害する活性を有する化合物の抗癌剤としての開発が試みられている(非特許文献４、非特許文献５)。
　現在、各種キナーゼに特異的な種々の分子標的薬が上市されているが、例えば、ゲフェニチブやエルロニチブなどの標的分子であるEGFRチロシンキナーゼにおいて、ある種のアミノ酸変異がその抵抗性獲得の要因となっている。このような変異をゲートキーパー（GK）変異といい、FGFR2においてもGK変異に関する報告がある（非特許文献６）。
Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149 Blood, 2003, 101: 4569-4575 Nature Genetics, 1999 Sep., 23(1): 18-20 Cancer Research, 2012, 72: 2045-2056 J. Med. Chem., 2011, 54: 7066-7083 Neoplasia (2013), 15(8), 975-988
　本発明者らは、FGFR遺伝子の新規なゲートキーパー変異を見出し、さらに、特定のFGFR阻害剤が、当該変異を有するFGFRに対して、変異を有さないFGFRと同等に阻害活性を有することを見出した。
　即ち、本発明は、他のFGFR阻害剤に対して、当該変異を獲得することにより耐性を獲得したFGFRを有する癌に対しても高い抗癌作用を有する、新たな抗腫瘍薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、FGFRの結晶構造解析を行い、様々のFGFRのゲートキーパー変異となりうる変異遺伝子について精力的に研究を行った。その結果、新規なGK変異（例えば、配列番号１における変異V564F）および当該GK変異に準ずる変異（例えば、配列番号１における変異V562L）を見出し、当該変異を有するFGFRはAZD4547などの公知のFGFR阻害剤に対して耐性を示す一方、化合物Aに対しては感受性であることを見出し、本願発明を完成した。
　即ち本発明は、具体的には、以下に記載される、新規なゲートキーパー変異を含むFGFR変異ポリペプチド、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む細胞、該変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体およびその断片、該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ、該変異ポリペプチドの発現を阻害するオリゴヌクレオチド、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの検出方法および検出用キット、該変異ポリペプチドを発現する患者に投与されるように用いられることを特徴とする癌治療用医薬組成物、該変異ポリペプチドを発現する患者に該医薬組成物を投与して癌を治療または予防する方法、ならびに該医薬組成物が適用される患者を選択する方法、該変異ポリペプチドを発現する患者における癌の治療において使用するための該医薬組成物等に関する。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
〔１〕下記式（I）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む癌治療用医薬組成物であって、
　FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドを発現するか、あるいは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者に投与されるように用いられることを特徴とする、癌治療用医薬組成物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に以下の基を示す；
　Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
　Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
　またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し、ここで該ヘテロシクリルまたは該ヘテロアリールは、ハロゲンで置換されていてもよく；
　Ｒ３はメチルを示し；
　Ｒ４は水素を示し；
　Ａはインドールであり；
　Ｒ５はＣ１－５アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリル、５～１０員ヘテロアリール、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキルを示し；
　Ｒ６およびＲ７は、同一でも異なってもよく、それぞれ、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキル、Ｃ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキルまたはシアノ（Ｃ１－３アルキル）を示すか、またはＲ６およびＲ７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し；
　ｎは１～３を示し；
　Ｒ８およびＲ９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキルまたはハロゲンを示すか、またはＲ８およびＲ９は、それらが結合している炭素原子と一緒になって脂環式環を形成してもよく；
　Ｚ１は、水素、ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＨ、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを示し；
　Ｒ１０およびＲ１１は、同一でも異なってもよく、それぞれＣ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）またはＣ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキルを示すか、またはＲ１０およびＲ１１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ１２およびＲ１３は同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、３～１０員脂環式環、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示すか、またはＲ１２およびＲ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ１４は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１６は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１７は、水素またはＣ１－４アルキルを示し；
　Ｒ１８は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１９は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２２は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
　Ｒ２３は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２４は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
　Ｒ２５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２６およびＲ２７は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２６およびＲ２７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ２８およびＲ２９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２８およびＲ２９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ３０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ３１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ３２は、Ｃ１－４アルキルまたはＣ６－１０アリールを示し；
<Ｐ群>
　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－３ハロアルコキシ、３～１０員ヘテロシクリルアミノ、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、および３～１０員ヘテロシクリル。
<Ｑ群>
　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリルアミン、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、Ｃ３－７シクロアルキル、－ＣＯＲ１９、およびＣ１－４アルキルで置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル。
〔２〕下記式で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、〔１〕記載の医薬組成物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
。
〔３〕FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチド。
〔４〕〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５〕〔４〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔６〕〔５〕記載のベクターを含む組み換え細胞。
〔７〕〔３〕記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
〔８〕〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
〔９〕〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチドに結合し、該mRNAポリヌクレオチドのタンパク質への翻訳を阻害する活性を有するオリゴヌクレオチド。
〔１０〕該オリゴヌクレオチドが、mRNAポリヌクレオチドを切断するsiRNAである、〔９〕記載のオリゴヌクレオチド。
〔１１〕〔３〕記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を用いて、被験者から単離された試料中において、該変異ポリペプチドを検出する工程を含む、FGFR変異ポリペプチドの検出方法。
〔１２〕〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いて、被験者から単離された試料中において、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する工程を含む、FGFR変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出方法。
〔１３〕〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを含む、FGFR変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出用キット。
〔１４〕〔３〕記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、FGFR変異ポリペプチドの検出用キット。
〔１５〕被験者から単離された試料中において、〔３〕記載の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定し、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドが検出された場合に、〔１〕または〔２〕記載の医薬組成物を当該被験者に投与して、癌を治療する方法。
〔１６〕該癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、〔１５〕記載の方法。
〔１７〕以下の工程を含む、〔１〕または〔２〕記載の医薬組成物が適用される患者を選択する方法：
（ａ）　被験者から単離された試料中において、〔３〕記載の変異ポリペプチドの存否を決定する工程；
（ｂ）　該変異ポリペプチドの存在が確認された被験者を該医薬組成物が適用される患者として選択する工程。
〔１８〕以下の工程を含む、〔１〕または〔２〕記載の医薬組成物が適用される患者を選択する方法：
（ａ）　被験者から単離された試料中において、〔３〕記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定する工程；
（ｂ）　該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在が確認された被験者を該医薬組成物が適用される患者として選択する工程。
〔１９〕該癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕〔３〕記載の変異ポリペプチドを発現するか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者における癌の治療において使用するための、〔１〕または〔２〕で定義される化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔２１〕前記癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、〔２０〕記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔２２〕下記式で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドの発現する癌の治療用医薬組成物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
。
〔２３〕FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドの機能を阻害するか発現を阻害する物質を有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
〔２４〕〔３〕記載の変異ポリペプチドを発現するか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者に投与するための癌治療または予防用の医薬組成物の製造における、前記〔１〕または〔２〕で定義される化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
〔２５〕以下の工程を含む、PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤に対する耐性を検出する方法：
（ａ）　被験者から単離された試料中において、〔３〕記載の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定する工程；
（ｂ）　該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの存在が確認された被験者を、該FGFR阻害剤に対する耐性を有すると判定する工程。
〔２５〕PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤に対する耐性の検出において使用するための、〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または〔８〕記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
〔２６〕PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤に対する耐性を検出するための、〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または〔８〕記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブの使用。
〔２７〕以下の工程を含む、PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤による治療に対する癌患者の応答を予測する方法：
（ａ）　患者から単離された試料中において、〔３〕記載の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定する工程；
（ｂ）　該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの存在が確認された患者を、該FGFR阻害剤に対する感受性が低いと判定する工程。
〔２８〕PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤による治療に対する癌患者の応答の予測において使用するための、〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または〔８〕記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
〔２９〕PD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択されるFGFR阻害剤による治療に対する癌患者の応答を予測するための、〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または〔８〕記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブの使用。
〔３０〕〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または〔８〕記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを含む、癌治療におけるFGFR阻害剤の効果を予測するためのキット。
〔３１〕前記FGFR阻害剤がPD173074、AZD4547、BGJ398、およびAZD2171からなる群より選択される、〔３０〕記載のキット。
　本発明により、他のFGFR阻害剤に対して耐性を獲得したFGFRを有する癌に対して高い抗癌作用を有する、新たな抗腫瘍薬を提供することが可能となる。
野生型FGFR2、FGFR2 V564F変異体またはFGFR2 V562L変異体を発現させた細胞におけるFGFRのチロシンリン酸化に対する、化合物AおよびCの影響を示す図である。 野生型FGFR2、FGFR2 V564F変異体またはFGFR2 V562L変異体を発現させた細胞の増殖に対する、化合物A、BおよびCによる阻害効果を示すグラフである。 TEL融合野生型FGFR2またはTEL融合FGFR2 V564F変異体を発現させた細胞の増殖に対する、化合物A、B、C、DおよびEによる阻害効果を示すグラフである。 TEL融合野生型FGFR2またはTEL融合FGFR2 V564F変異体を発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける腫瘍増殖に対する、化合物AおよびCによる抑制効果を示すグラフである。 TEL融合野生型FGFR2またはTEL融合FGFR2 V564F変異体を発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける腫瘍中リン酸化に対する、化合物AまたはCによる抑制効果を示すグラフである。
　本発明は、上述した〔１〕～〔３１〕に例示的に記載されるとおりの発明であって、新規なゲートキーパー変異を含むFGFR変異ポリペプチド、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む細胞、該変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体およびその断片、該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ、該変異ポリペプチドの発現を阻害するオリゴヌクレオチド、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの検出方法および検出用キット、該変異ポリペプチドを発現する患者に投与されるように用いられることを特徴とする癌治療用医薬組成物、該変異ポリペプチドを発現する患者に該医薬組成物を投与して癌を治療または予防する方法、該医薬組成物が適用される患者を選択する方法、該変異ポリペプチドを発現する患者の癌の治療または予防において使用するためのFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩、該変異ポリペプチドを発現する患者に投与するための癌治療または予防用の医薬組成物の製造におけるFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩の使用、FGFR阻害剤に対する耐性を検出する方法、ならびにFGFR阻害剤による治療に対する癌患者の応答を予測する方法、等を提供する。
　本発明における「FGFR」とは、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属しているキナーゼである線維芽細胞増殖因子受容体（fibroblast growth factor receptor; FGFR）であって、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4によりFGFRファミリーに属する任意のFGFRを意味する（Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149）。また、本発明のFGFRは、如何なる由来のFGFRを意味し、好ましくは、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、サル、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ、等）のFGFRであって、さらに好ましくはヒトのFGFRであり、特に好ましくはヒトFGFR2、ヒトFGFR1、FGFR3であり、それぞれ多くのアイソフォームが知られている。
　本発明における「ヒトFGFR2」は、配列番号１、２、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、もしくは４４に記載されるアミノ酸配列からなるヒトFGFR2の野生型ポリペプチド（GenBank Accession No.：それぞれNP_000132.3、NP_075259.4、NP_001138385.1、NP_001138386.1、NP_001138387.1、NP_001138388.1、NP_001138389.1、NP_001138390.1、NP_001138391.1、NP_075418.1）、または該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数（好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１乃至５個）のアミノ酸が置換、欠失若しくは挿入されている変異ポリペプチドである。
　本発明における「ヒトFGFR1」は、配列番号２１、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０に記載されるアミノ酸配列からなるヒトFGFR1の野生型ポリペプチド（GenBank Accession No.：それぞれNP_001167538.1、NP_001167534.1、NP_001167535.1、NP_001167536.1、NP_001167537.1、NP_075594.1、NP_075598.2）、または該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数（好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１乃至５個）のアミノ酸が置換、欠失若しくは挿入されている変異ポリペプチドである。
　本発明における「ヒトFGFR3」は、配列番号２２、５１、もしくは５２に記載されるアミノ酸配列からなるヒトFGFR3の野生型ポリペプチド（GenBank Accession No.：それぞれNP_000133.1、NP_001156685.1、NP_075254.1）、または該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数（好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１乃至５個）のアミノ酸が置換、欠失若しくは挿入されている変異ポリペプチドである。
　該変異ポリペプチドにはまた、該野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは80%以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは90%以上の相同性を有するポリペプチド、より好ましくは95%以上の相同性を有するポリペプチドが包含される。
　アミノ酸配列（または塩基配列）の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10）。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI （National Center for Biotechnology Information）の BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）のウェブサイトの情報を参照することができる。
　本発明における「変異ポリペプチド」は、FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドを意味し、本発明の変異を含むポリペプチドとも称される。
　ここで、本発明の変異ポリペプチドは、上記2種類の変異のうち少なくとも一方を有するFGFR変異ポリペプチドであれば、上述の全長アミノ酸配列からなる野生型FGFRポリペプチドのアミノ酸配列に当該変異が導入されているアミノ酸配列からなるFGFR変異ポリペプチドに限定されることはなく、当該変異を含むそれらのペプチド断片、およびそれらのFGFR変異ポリペプチドまたはペプチド断片と他のペプチドとの融合ポリペプチドも含み、当該変異の位置以外において１もしくは複数（好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１乃至５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されていてもよい。
　ここで、上記FGFR変異ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片との融合ポリペプチドを構成する「他のペプチド」として、例えばTEL（別名ETV6、Cancer Research, 2001, 61: 8371-8374およびBlood, 2005, 105(5): 2115-2123参照）ポリペプチド（配列番号３３に記載されるアミノ酸配列からなる野生型ポリペプチドもしくは該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されている変異ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片）、BAIA2P2L1ポリペプチド（配列番号３１に記載されるアミノ酸配列からなる野生型ポリペプチドもしくは該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されている変異ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片）、TACC3ポリペプチド（配列番号３２に記載されるアミノ酸配列からなる野生型ポリペプチドもしくは該野生型ポリペプチドにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されている変異ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片）などが挙げられるが、他にも数々のFGFR融合ポリペプチドが知られており（Cancer Discovery 2013;3:636-647参照）、これらの融合ポリペプチドに本発明の変異が導入されたFGFR融合ポリペプチドも本発明の変異ポリペプチドに含まれる。
　好ましくは、本発明の変異ポリペプチドとしては、以下の（1）～（20）より選択されるFGFR変異ポリペプチド、もしくはそれらの変異を含む（1）～（20）のペプチド断片、または（1）～（20）のFGFR変異ポリペプチドもしくはそれらのペプチド断片と他のペプチドとの融合ポリペプチドを意味する：
　（1）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）のうち少なくとも変異V564Fおよび/もしくはV562Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（2）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）のうち少なくとも変異V565Fおよび/もしくはV563Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（3）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３７）のうち少なくとも変異V565Fおよび/もしくはV563Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、もしくは
　（4）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３８）のうち少なくとも変異V452Fおよび/もしくはV450Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（5）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３９）のうち少なくとも変異V475Fおよび/もしくはV473Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（6）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４０）のうち少なくとも変異V449Fおよび/もしくはV447Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（7）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４１）のうち少なくとも変異V448Fおよび/もしくはV446Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（8）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４２）のうち少なくとも変異V447Fおよび/もしくはV445Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（9）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４３）のうち少なくとも変異V476Fおよび/もしくはV474Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（10）上述の野生型FGFR2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４４）のうち少なくとも変異V475Fおよび/もしくはV473Lを含むFGFR2変異ポリペプチド、
　（11）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２１）のうち少なくとも変異V559Fおよび/もしくはV557Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（12）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４５）のうち少なくとも変異V559Fおよび/もしくはV557Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（13）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４６）のうち少なくとも変異V551Fおよび/もしくはV549Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（14）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４７）のうち少なくとも変異V559Fおよび/もしくはV557Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（15）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４８）のうち少なくとも変異V472Fおよび/もしくはV470Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（16）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４９）のうち少なくとも変異V470Fおよび/もしくはV468Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（17）上述の野生型FGFR1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５０）のうち少なくとも変異V561Fおよび/もしくはV559Lを含むFGFR1変異ポリペプチド、
　（18）上述の野生型FGFR3ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２２）のうち少なくとも変異V555Fおよび/もしくはV553Lを含むFGFR3変異ポリペプチド、
　（19）上述の野生型FGFR3ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５１）のうち少なくとも変異V557Fおよび/もしくはV555Lを含むFGFR3変異ポリペプチド、もしくは
　（20）上述の野生型FGFR3ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５２）のうち少なくとも変異V443Fおよび/もしくはV441Lを含むFGFR3変異ポリペプチド。
　特に好ましくは、本発明のFGFR変異ポリペプチドとしては、配列番号９、１０、２９、または３０に示されるアミノ酸配列を含むFGFR2変異ポリペプチド、配列番号２５または２６に示されるアミノ酸配列を含むFGFR1変異ポリペプチド、および配列番号２７または２８に示されるアミノ酸配列を含むFGFR3変異ポリペプチド、ならびに配列番号３５または３６に示されるアミノ酸配列を含むTEL融合FGFR2変異ポリペプチドが挙げられる。
　好ましくは、本発明のFGFR変異ポリペプチドは、野生型FGFRポリペプチドと同程度またはそれより強い生物学的活性（例えば、FGFR細胞内ドメインのチロシンリン酸化活性、細胞増殖活性、血管新生活性、細胞遊走活性、細胞浸潤活性、細胞転移活性、好ましくは細胞増殖活性）を保持している。本発明のFGFR変異ポリペプチドがこのような生物学的活性を有することは、当業者に公知のアッセイ方法（例えば、下記実施例に記載の方法）によって決定することができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、前述の本発明のFGFR変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、本発明のFGFR変異ポリペプチドをコードし得るいかなるポリヌクレオチドをも包含し、ゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれをも包含する。ゲノミックDNAは、エキソンおよびイントロンを含む。またｃDNAは、イントロン配列の一部に由来する核酸配列であってアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
　また、該ポリヌクレオチドは、同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構成される縮重ポリヌクレオチドをも含む。
　また、本発明におけるポリヌクレオチドは、哺乳動物由来の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含し、好ましい態様としては、ヒト由来の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばmRNAから調製される相補DNA（cDNA）、ゲノムDNAから調製されるDNA、化学合成によって得られるDNA、RNAまたはDNAを鋳型としてPCR法で増幅させて得られるDNAおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNAをも全て包含する。
　本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、常法に従って本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAからcDNAをクローン化する方法、ゲノムDNAを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
　例えば、本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAからcDNAをクローン化する方法としては、まず、本発明の変異ポリペプチドを発現、産生する任意の組織あるいは細胞から常法に従って該本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAを調製する。例えばグアニジンチオシアネート法、熱フェノール法もしくはAGPC法等の方法を用いて調製した全RNAをオリゴ（dT）セルロースやポリＵ－セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
　次いで得られたmRNAを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法（Mol.Cell.Biol., Vol.2, p.161, 1982; Mol.Cell. Biol., Vol.3, p.280, 1983；　Gene, Vol.25, p.263, 1983）等によりcDNA鎖を合成し、cDNAの二本鎖cDNAへの変換し、このcDNAをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクター等に組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりcDNAライブラリーを作製する。
　本発明はまた、上述の本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター（組み換えベクター）に関する。
　本発明のベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される。
　クローニング用ベクターとしては例えば、pUC19、λgt10、λgt11等が例示される。なお、本発明の変異ポリペプチドを宿主細胞内で発現し得る細胞を単離する場合には、該ポリヌクレオチドを発現し得るプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
　本発明の組換えベクターとしては、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテリオファージDNA）に本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを常法により連結することによって調製することができる。
　用いられる組換え用ベクターとして、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19、等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC194、等）が例示される。
　また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルス、レンチウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例示される。
　本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ本発明の変異ポリペプチドを生産させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し、これらポリペプチドを生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
　例えば、pMAL C2 、pEF-BOS（NucleicAcid Research, Vol.18, 1990, p.5322、等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができる。
　また、本発明の変異ポリペプチドは他の別のタンパクとの融合蛋白として製造することもできる。例えば、GST（Glutathione S-transferase）との融合蛋白として調製する場合には、本発明の変異ポリペプチドをコードするcDNAを、例えば、プラスミドpGEX4T1（Pharmacia製）中にサブクローニングし、大腸菌DH5αを形質転換して該形質転換体を培養することにより調製することができる。
　あるいは、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等との融合体として調製することができる。さらには、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片、Stag、StrepTag、HaloTag等の公知のペプチドとの融合体として調製することができる。
　本発明のベクターは、宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、該ベクターは、少なくともプロモーター－オペレーター領域、開始コドン、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位を含んでいることが好ましい。
　宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドンを含んでいることが好ましい。
　また該ベクターは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のタンパクをコードする遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
　また、所望により、遺伝子増幅および形質転換された宿主を選抜することを可能とするマーカー遺伝子（遺伝子増幅遺伝子、薬剤耐性遺伝子、等）を含んでいてもよい。
　例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルテートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
　細菌中で本発明の変異ポリペプチドを発現させるためのプロモーター－オペレータ－領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、AAGGなど）を含むことができる。
　例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、例えばTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示される。
　酵母中で本発明の変異ポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられる。
　宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
　また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、SV40、レトロウイルスである。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
　好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
　複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミドpBR322、もしくはその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149等があげられる。
　エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
　本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。
　本発明はまた、上述した本発明のベクターで形質転換された組み換え細胞に関し、本発明の組み換え細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
　本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞などが例示される。
　好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、例えば、大腸菌（DH5α、TB1、HB101等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞（PC12,PC12h)、ハムスター由来細胞（BHK及びCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびHepG2等）などが例示される。
　発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は常法に従って行うことができる（［E.coli、Bacillus subtilis 等の場合］：　Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972；　Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979；　J. Mol.Biol., Vol.56, p.209, 1971；　［Saccharomyces cerevisiaeの場合］：　Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978；　J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）；　［動物細胞の場合］：　Virology, Vol.52, p.456, 1973；　［昆虫細胞の場合］：　Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）。
　本発明の変異ポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換組み換え細胞（以下、封入体を包含する意味で使用する。）を、常法に従って、栄養培地で培養することによって製造することができる。
　本発明の変異ポリペプチドは、上述のような組み換え細胞、特に動物細胞を培養し、培養上清中に分泌させることにより製造することができる。
　得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該本発明の変異ポリペプチドを精製、単離する。
　単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　一方、本発明の変異ポリペプチドが培養された組み換え細胞（大腸菌など）のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明のタンパクを含有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン－X100等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
　本発明はまた、上述の本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（cDNAやゲノミックDNA）にハイブリダイズする任意のオリゴヌクレオチドに関する。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、当該cDNAやゲノミックDNAの塩基配列の任意の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction; PCR）におけるセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる一対のオリゴヌクレオチドプライマーとして有用である。該一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRにより、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の一部または全部の塩基配列を増幅することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドプライマーとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な任意の塩基長のオリゴヌクレオチドが包含されるが、好ましくは、連続する少なくとも１２塩基、好ましくは１２～５０塩基、より好ましくは１２～２０塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡハイブリダーゼーションまたはＲＮＡハイブリダイゼーションの操作におけるプローブとしても有用である。当該ＤＮＡをプローブとして用いる目的においては、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする、連続した１５塩基以上の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５０塩基以上の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した１００塩基以上の部分塩基配列、より好ましくは連続した２００塩基以上の部分塩基配列、特に好ましくは連続した３００塩基以上の部分塩基配列が挙げられる。
　本発明はまた、本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチドに結合し、該mRNAのタンパク質への翻訳を阻害する活性を有するオリゴヌクレオチドに関する。特に好ましくは、本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチドに結合し、該mRNAを切断するsiRNAが挙げられる。
　このオリゴヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチドをコードするmRNAに結合しその発現を阻害するオリゴヌクレオチドであって、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはsiRNA（short interfering RNA）を意味する。これらは、該mRNAに結合した後、該mRNAのタンパク質への翻訳を阻害する。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ゲノムDNAおよび／またはmRNAと特異的にハイブリダイズし、その転写および／または翻訳を阻害することによりそのタンパク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを意味する。
　標的ポリヌクレオチド（mRNA等）への結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく、または、例えば、ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には、二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的部位としては、mRNAの５'末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５'非翻訳配列またはmRNAの３'非翻訳配列またはコーディング領域の配列もが挙げられる。
　本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いる目的においては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該オリゴヌクレオチドの一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3'及び／または5'末端等の化学修飾が挙げられる。
　リン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾としては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンなどへの変更が挙げられる。
　リボザイムとは、mRNAを切断する触媒活性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示し、種々のタイプのトランス作用性リボザイム、例えばハンマーヘッドおよびヘアピンタイプのリボザイムが包含される。
　siRNAとは、RNA干渉（RNA interference）を行うことができる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する（例えば、Bass,2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411,494-498）。
　siRNAは、配列特異的にmRNAを切断し、その結果mRNAのタンパク質への翻訳が阻害される。siRNAは、標的とするポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む２０～２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡが挙げられる。本発明のsiRNAには、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドが含まれるオリゴヌクレオチドも包含される。
　本発明はまた上述の本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
　本発明の抗体は、その由来、形状、機能などで限定されず、如何なる抗体でもよい。本発明の抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。本発明の抗体はヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。また、キメラ（chimeric）抗体やヒト化（humanized）抗体などの組換え抗体でもよい。本発明の好ましい抗体としては、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体を挙げることができる。
　本発明のヒト化抗体は当業者に既知の方法を用いて作製することができる。抗体の可変領域は、通常、４つのフレーム（FR）にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity determining region ; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体のCDRをヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576号公報参照）。
　具体的には、例えばCDRがマウス抗体由来である場合には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照）。得られたDNAを、ヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
　CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K.etal., CancerRes.（1993）53, 851-856）。
　ヒト化抗体の定常領域には、通常、ヒト抗体のものが使用される。
　使用されるヒト抗体の定常領域は特に限定されず、例えば重鎖定常領域の場合、ヒトIgG1の定常領域、ヒトIgG2の定常領域、ヒトIgG3の定常領域、ヒトIgG4の定常領域、ヒトIgM、IgA、IgE、IgDの定常領域などを用いることができる。又、軽鎖定常領域の場合、ヒトκ鎖定常領域、ヒトλ鎖定常領域などを使用することができる。さらに、ヒト抗体由来の定常領域は天然由来の配列を有するものでもよいし、天然由来の配列において１又は複数のアミノ酸が改変（置換、欠失、付加および／または挿入）された配列を有する定常領域でもよい。
　なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、CDR、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換、欠失、付加および／または挿入等してもよく、本発明のヒト化抗体には、そのようなアミノ酸置換等されたヒト化抗体も含まれる。
　ヒト化抗体におけるCDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能であるが、好ましくはマウス抗体のCDR配列である。
　ヒト化抗体はヒト体内における免疫原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。
　キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体である。キメラ抗体は、既知の方法を用いて作製することができる。例えば、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入することによって行うことが可能である（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望のヒト抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、ヒト抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、キメラ抗体を発現させることができる。
　また、ヒト抗体も当業者に公知の方法により取得することが可能である。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
　また、ヒトリンパ球プールから、抗原への結合活性をもつ抗体を発現するB細胞をFlow cytometryまたは細胞アレイなどを用いて単離し、選択されたB細胞の抗体遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体のDNA配列を決定することができる（Jin, A. et al., Nature Medicine (2009) 15, 1088-92, Scheid, J.F. et al., Nature（2009）458, 636-640，Wrammert, J. et al., Nature（2008）453, 667-672, Tiller, T. et al, Journal of Immunological Methods (2008) 329, 112-124）。抗原に結合する抗体のDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388などを参考にすることができる。
　さらに、ヒト抗体ファージライブラリーを用いて、パニング法によりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388などを参考にすることができる。
　本発明の抗体には、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。又、本発明の抗体には、異なる抗原に結合することができるBispecific抗体も含まれる。
　本発明の抗体には、抗体の全長分子に限らず、低分子化抗体等の任意の抗原結合断片が包含される。
　さらに、本発明の抗体には細胞傷害性物質などが結合した修飾抗体も含まれる。さらに、本発明の抗体は抗体の糖鎖が改変されていてもよい。
　本発明の抗原結合断片に包含される低分子化抗体(minibody)は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む抗体であり、本発明の変異ポリペプチドへの結合活性を有する限り特に限定されない。
　本発明において低分子化抗体は、全長抗体の一部分を含む限り特に限定されないが、抗原結合部位が含まれることが好ましい。抗原結合部位は通常、抗体のCDRであり、好ましくは抗体の６つのCDRである。従って、抗原結合部位の好ましい例としては、抗体の６つのCDRや、可変領域（重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域）を挙げることができる。
　本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
　本発明の抗原結合断片の他の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
　抗原結合断片は、例えば、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
　消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
　上述の消化酵素を用いた場合に得られる抗体断片は以下のとおりである。
　パパイン消化：F(ab)2またはFab
　ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
　プラスミン消化：Facb
　本発明における低分子化抗体は、本発明の変異ポリペプチドへの結合活性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含むことができる。
　ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
　scFv抗体は、重鎖可変領域（［VH］）及び軽鎖可変領域（［VL］）をリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
　両鎖のV領域は、例えば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
　抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
　抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列
　増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有する一対のプライマーを用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］－［ペプチドリンカーDNA］－［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
　アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
　結合される重鎖可変領域と軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
　sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
　また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
　低分子抗体中の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
　本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
　本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1～100アミノ酸、好ましくは3～50アミノ酸、更に好ましくは5～30アミノ酸、特に好ましくは12～18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１３）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：１４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：２０）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１６）)n
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するｎは、通常１～５、好ましくは１～３、より好ましくは１または２である。
　合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ－BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
　4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。
　また、本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片、Stag、StrepTag、HaloTag等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US5057313、US5156840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体は本発明の変異ポリペプチド分子の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が本発明の変異ポリペプチドを認識し、他方の抗原結合部位が他の物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。
　二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
　本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
　本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変する方法は当業者に公知であり、例えば、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良する方法、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節する方法、YB2/0細胞において抗体を産生せしめることによりα-1,6core　fucoseを含まない糖鎖を有する抗体を調製する方法、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を付加する方法、などが知られている（WO 99/54342、WO 00/61739、WO 02/31140、WO 02/79255など）。
　本発明の抗体は、本発明の変異ポリペプチド（ヒトやマウス等の哺乳動物に由来）またはその断片ペプチドを免疫原として、公知の方法によって作製することが出来る。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって非ヒト哺乳動物を免疫する。被免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を選別し、該細胞を培養することによって、モノクローナル抗体を作製することが可能である。
　免疫される非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタが挙げられる。抗原の調製は、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用い、公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（WO98/46777など）等に準じて行うことができる。
　ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行ってもよい。
　本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体の一態様として、本発明の変異ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の変異ポリペプチドに対する結合活性を有するモノクローナル抗体を作製するための免疫原としては、本発明の変異ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体を作製できる限り、特に限定されない。
　また、本発明の変異ポリペプチドに対する抗体の結合活性の測定は当業者に公知の方法により行うことができる。
　また、モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
－膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
－免疫抗原を精製する必要が無い
　DNA免疫によってモノクローナル抗体を得るには、まず、本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを免疫動物に投与する。本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述した方法に従って、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNA（ポリヌクレオチド）を適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、上述したような任意のベクター（例えば、pcDNA3.1などの市販の発現ベクター）を利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene gun）で細胞内に打ち込むことによってDNA免疫を行うことができる。DNA免疫後に、本発明の変異ポリペプチド発現細胞による追加免疫（boost）を行うことは、モノクローナル抗体を得る好ましい方法である。
　このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
　上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
　基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。
　細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。
　目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球を本発明の変異ポリペプチドで感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。この方法によって得られる抗体は、本発明の変異ポリペプチドへの結合活性を有するヒト抗体である。
　上述の方法等により取得された本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体をコードする塩基配列、アミノ酸配列は当業者に公知の方法により得ることが可能である。
　得られた本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体を作製することが可能である。具体的には、本発明の変異ポリペプチドを認識する抗体の配列を基に抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
　ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア製）、「QIAexpress system」（キアゲン製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌以外にも、例えば、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロゲン社製）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（ギブコBRL製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pSV2-dhfr（「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）など）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
　得られた抗体の本発明の変異ポリペプチドに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
　本発明における「癌」とは、一般に、悪性新生物を表すために用いられ、それは、転移性または非転移性であってよい。例えば、消化管や皮膚等の上皮組織から発生した癌腫の非限定な例として、脳腫瘍、皮膚癌、頸頭部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、および卵巣癌等が例示される。また、筋肉等の非上皮性組織（間質）から発生した肉腫の非限定な例として、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、および血管肉腫等が例示される。さらに、造血器由来の血液がんの非限定な例として、ホジキンリンパ腫（Hodgkin's lymphoma）および非ホジキンリンパ腫（non Hodgkin's lymphoma）を含む悪性リンパ腫、急性（acute myelocytic leukemia）または慢性骨髄性白血病（chronic myelocytic leukemia）、および急性（acute lymphatic leukemia）または慢性リンパ性白血病（chronic lymphatic leukemia）を含む白血病、ならびに多発性骨髄腫（multiple myeloma）が例示される。
　本発明における癌には、新たに生じたいかなる病的組織腫瘍（新生物）をも包含される。本発明においては、新生物は腫瘍の形成を生じ、それは部分的に血管形成を特徴とする。新生物は、例えば、血管腫、神経膠腫、奇形腫等の良性、あるいは、例えば、癌腫、肉腫、膠細胞腫、星状膠細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫等の悪性でありうる。
　本発明における癌の好適な例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌等が挙げられる。
　本発明における「癌組織」とは、少なくとも一つの癌細胞を含む組織を意味する。したがって、例えば癌組織が癌細胞と血管を含んでいるように、癌細胞および内皮細胞を含む腫瘤（tumor mass）の形成に寄与するすべての細胞型をいう。本発明において、腫瘤とは腫瘍組織巣（a foci of tumor tissue）をいう。「腫瘍」という用語は、一般に、良性新生物または悪性新生物を意味するために用いられる。
　本発明は上述した本発明の抗体若しくはその抗原結合断片、またはオリゴヌクレオチド、あるいは本発明の化合物を含む医薬組成物に関する。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤をいう。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法を用いて製剤化され得る。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用され得る。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化され得る。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定される。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施にしたがって処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適切な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80TM、HCO-50等）が併用され得る。
　油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填される。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物が投与される。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。抗原結合分子を含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量が設定され得るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
　なお、本発明に記載するアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明に記載するアミノ酸配列に含まれる。
　本発明はまた、被験者（癌患者および健常人を含む）の試料中における上述した本発明の変異ポリペプチドおよび該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法に関する。
　被験者の試料中における本発明の変異ポリペプチドの存否は、例えば、被験者（癌患者、癌に罹患している可能性のある者、癌に罹患するリスクを有す者、健常人。ただし、ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、腹水、胸水、等））に、上述した本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体またはその抗原結合断片を接触させることによる抗原抗体反応を利用することにより試験、決定することができる。
　この抗原抗体反応による抗原（即ち、本発明の変異ポリペプチド）の検出は、例えば、慣用されているイムノアッセイを用いて行うことができる。
　本発明におけるイムノアッセイとは、抗原（即ち、本発明の変異ポリペプチド）と該抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合断片との反応の原理に基づき、試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、腹水、胸水、等））中に含まれる本発明の変異ポリペプチドの検出を行う方法を意味し、この検出を可能とする方法であればどのようなイムノアッセイも包含される。
　本発明におけるイムノアッセイには、例えば、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような種々方法の原理を応用することができる。即ち、該種々方法においては、検出しようとする試料中の目的の抗原の捕捉（キャプチャーリング、トラッピング）のための該目的抗原に結合する１つ以上の抗体を用いて実施することができる。
　応用できる原理としては、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、及び特公平2-39747号公報に記載されているようなワンポット法を好適な例として挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用したアッセイとしては、EMIT法（Enzyme multiplied immunoassay technique）、エンザイムチャネリングアッセイ（Enzyme channeling immunoassay）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Enzyme modulator mediated enzyme immunoassay、EMMIA）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Enzyme inhibitor immunoassay）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Immunoenzymometric assay）、酵素活性増強イムノアッセイ（Enzyme enhanced immunoassay）及びプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Proximal linkage immunoassay）等も包含される。
　本発明においては、このようなイムノアッセイのいずれかの原理を、試験の目的に応じて適宜選択して用いることができる。
　また、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマルチウェルマイクロタイタープレート、酵素あるいはビオチンにより標識された標識抗体とを用いるサンドイッチ法、あるいはビーズと、ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンにより標識された標識抗体とを用いるワンポット法も包含される。
　上述のとおり、本発明におけるイムノアッセイにおいて用いられる本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体若しくはその抗原結合断片は、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質により標識されていてもよい。
　この標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ－ス－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ若しくは131Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。
　ここで、放射性同位体及び蛍光物質は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。
　一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらす。
　例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素を用いる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
　被験者の試料中における本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否は、例えば、被験者（癌患者、癌に罹患している可能性のある者、癌に罹患するリスクを有す者、健常人。ただし、ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、腹水、胸水、等））に含まれるmRNA、該mRNAを鋳型にして調製したcDNA、ゲノミックDNA等を利用した各種の遺伝子解析法を利用して、上述した本発明の各種のオリゴヌクレオチド（一対のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、等）を用いて常法に従って試験、決定することができる。当該遺伝子解析法には、例えば、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、サザーンブロッティング、LCR(Ligase chain reaction)、SDA(Strand displacement amplification)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、TMA法(Gen-Probe's TMA system)、マイクロアレー、次世代シークエンス法等が挙げられる。
　なお、これらのアッセイにおいては、該試料に由来する本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドへの本発明のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用するが、該ハイブリダイゼーションにおいて所望により適用されるストリンジェントな条件とは、例えば、6M 尿素、0.4% SDS、0.5 x SSC、37℃の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。目的により、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4% SDS、0.1 x SSCの条件、42℃も適用することができる。
　本発明はまた、上述した被験者（癌患者および健常人を含む）の試料中における上述した本発明の変異ポリペプチドおよび該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出に用いられる検出用キットに関する。
　本発明の検出用キットは、具体的には、上述した本発明の変異ポリペプチドに結合する抗体またはその抗原結合断片（上述した各種の標識物質で標識された抗体またはその抗原結合断片を含む）を含み、また、上述した各種のイムノアッセイの実施の目的に応じて各種の検出用試薬（酵素、基質、等）および実験操作指示書を含むことができる。
　本発明の検出用キットは、具体的には、上述した本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに由来するmRNA、該mRNAを鋳型にして調製したcDNA、ゲノミックDNA等にハイブリダイズする上述した本発明の各種オリゴヌクレオチド（一対のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、等）を含み、また、上述した各種の遺伝子解析の実施の目的に応じて各種の試薬（酵素、他のオリゴヌクレオチド、核酸、反応液、等）および実験操作指示書を含むことができる。
　本発明はまた、被験者から単離された試料中にける本発明の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を基準として、各種FGFR阻害剤に対する耐性の有無、FGFR阻害剤による治療に対する被験者の応答の予測、または癌治療におけるFGFR阻害剤の効果の予測について試験する方法に関する。
　本発明の方法としては、具体的には、被験者（癌患者、癌に罹患している可能性のある者、癌に罹患するリスクを有する者、健常人。ただし、ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、等））における本発明の変異ポリペプチドの存否を、上述した本発明の変異ポリペプチドを検出する方法および検出用キットを用いて試験、決定し、該変異ポリペプチドが検出された場合には各種FGFR阻害剤に対する耐性を有するという基準に基づき、各種FGFR阻害剤に対する耐性の有無、FGFR阻害剤による治療に対する被験者の応答の予測、または癌治療におけるFGFR阻害剤の効果の予測について試験する方法が挙げられる。
　本発明の方法としては、さらに、被験者（癌患者、癌に罹患している可能性のある者、癌に罹患するリスクを有する者、健常人。ただし、ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、等））における本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を、上述した本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出方法および検出用キットを用いて試験、決定し、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが検出された場合には各種FGFR阻害剤に対する耐性を有するという基準に基づき、各種FGFR阻害剤に対する耐性の有無、FGFR阻害剤による治療に対する被験者の応答の予測、または癌治療におけるFGFR阻害剤の効果の予測について試験する方法が挙げられる。
　本発明はまた、被験者から単離された試料中にける本発明の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を基準として、FGFR阻害活性を有する化合物を含有する抗癌剤（以下で説明するとおり）が適用される患者を選択する方法に関する。
　本発明の方法としては、具体的には、被験者（癌患者または癌に罹患している可能性のある者。ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、等））における本発明の変異ポリペプチドの存否を、上述した本発明の変異ポリペプチドを検出する方法および検出用キットを用いて試験、決定し、該変異ポリペプチドが検出された場合には、該被験者を、FGFR阻害活性を有する化合物を含有する抗癌剤（または癌治療用医薬組成物：以下で説明するとおり）が適用される患者として選択する方法が挙げられる。ここで、FGFR阻害活性を有する化合物としては、一般式（I）の化合物が好ましい。
　本発明の方法としては、さらに、被験者（癌患者または癌に罹患している可能性のある者。ヒトに限定されない。）から採取した試料（腫瘍組織、正常組織、癌細胞若しくは正常細胞を含む各種体液（血液、血清、尿、唾液、等））における本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を、上述した本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出方法および検出用キットを用いて試験、決定し、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが検出された場合には、該被験者を、FGFR阻害活性を有する化合物を含有する抗癌剤（以下で説明するとおり）が適用される患者として選択する方法が挙げられる。ここで、FGFR阻害活性を有する化合物としては、一般式（I）の化合物が好ましい。
　本発明における「FGFR阻害剤」または「FGFR阻害活性を有する化合物」は、それぞれ互換的に用いられ、上述した本発明におけるFGFR、即ち、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属しているキナーゼである線維芽細胞増殖因子受容体（fibroblast growth factor receptor; FGFR）であって、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4を含むFGFRファミリーに属する１つ以上の任意のFGFRの活性を阻害する活性を有する化合物を意味し、好ましくは、ヒトのFGFRの活性を阻害する活性を有する化合物を意味し、さらに好ましくは、配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるヒトFGFR2（cDNA配列：それぞれ配列番号３、４／　GenBank Accession No.：それぞれNM_000141.4、NM_022970.3）の活性を阻害する活性を有する化合物を意味する。
　本発明におけるFGFR阻害剤には、その化合物がFGFRの活性を阻害する活性を有する限り任意のFGFR阻害剤が包含される。
　具体的には、（１）FGFRのKinase活性の阻害、（２）FGFR、TACC3、およびBAIAP2L1の間における二量体の形成（ダイマー化）の阻害、（３）FGFRを介したシグナル伝達（MAPK経路、PI3K/AKT経路）の阻害（例えば、MEK阻害剤、RAF阻害剤、ERK阻害剤、PI3K阻害剤、mTOR阻害剤、AKT阻害剤、PDK阻害剤、S6K阻害剤、等）、（４）FGFRの発現量の阻害(例えば、siRNA、HSP90阻害剤、等)の作用機序を有する任意の化合物、抗体、核酸医薬（siRNA、アンチセンス核酸、リボザイム、等）が包含される。
　本発明におけるFGFR阻害剤として包含されるFGFRの活性を阻害する活性を有する抗体には、次の開発コードで識別される抗体が包含される（RG7444、FP-1039、AV370、PRO-001）。
　本発明におけるFGFR阻害剤として包含されるFGFRの活性を阻害する活性を有する低分子化合物には、例えば、（１）次の特許文献または非特許文献に開示されている化合物（Cancer Research, 2012, 72: 2045-2056；　J. Med. Chem., 2011, 54: 7066-7083；　国際公開WO2011/016528号）、（２）次の一般名称または開発コードで識別される化合物：　AZD-4547（後述の表１の化合物Ｃ）、BGJ-398（後述の表１の化合物Ｄ）、LY-2874455、cediranib（AZD2171；後述の表１の化合物Ｅ）、PD173074（後述の表１の化合物Ｂ）、regorafenib、ponatinib、orantinib、nintedanib、masitinib、lenvatinib、dovitinib（TKI258）、brivanib、volasertib、golvatinib、ENMD-2076、E-3810、XL-999、XL-228、ARQ087、Tivozanib、motesanib、regorafenib、および（３）例えば以下に示される化合物が包含されるが、この限りではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に以下の基を示す；
　Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
　Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
　またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し、ここで該ヘテロシクリルまたは該ヘテロアリールは、ハロゲンで置換されていてもよく；
　Ｒ３はメチルを示し；
　Ｒ４は水素を示し；
　Ａはインドールであり；
　Ｒ５はＣ１－５アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリル、５～１０員ヘテロアリール、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキルを示し；
　Ｒ６およびＲ７は、同一でも異なってもよく、それぞれ、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキル、Ｃ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキルまたはシアノ（Ｃ１－３アルキル）を示すか、またはＲ６およびＲ７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し；
　ｎは１～３を示し；
　Ｒ８およびＲ９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキルまたはハロゲンを示すか、またはＲ８およびＲ９は、それらが結合している炭素原子と一緒になって脂環式環を形成してもよく；
　Ｚ１は、水素、ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＨ、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを示し；
　Ｒ１０およびＲ１１は、同一でも異なってもよく、それぞれＣ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）またはＣ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキルを示すか、またはＲ１０およびＲ１１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ１２およびＲ１３は同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、３～１０員脂環式環、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示すか、またはＲ１２およびＲ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ１４は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１６は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１７は、水素またはＣ１－４アルキルを示し；
　Ｒ１８は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ１９は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２２は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
　Ｒ２３は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２４は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
　Ｒ２５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ２６およびＲ２７は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２６およびＲ２７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ２８およびＲ２９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２８およびＲ２９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
　Ｒ３０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ３１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
　Ｒ３２は、Ｃ１－４アルキルまたはＣ６－１０アリールを示し；
<Ｐ群>
　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－３ハロアルコキシ、３～１０員ヘテロシクリルアミノ、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、および３～１０員ヘテロシクリル。
<Ｑ群>
　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリルアミン、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、Ｃ３－７シクロアルキル、－ＣＯＲ１９、およびＣ１－４アルキルで置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本明細書における「アルキル」は、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキル基は直鎖状および分枝鎖状の構造を含む。アルキル基としては、好ましくは炭素原子数１～６（Ｃ１－６、以下「Ｃｐ－ｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する。）のアルキル基、Ｃ１－５アルキル基、Ｃ１－４アルキル基、Ｃ１－３アルキル基などが挙げられる。
　アルキルとしては、具体的には、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書における「アルケニル」は、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の炭化水素基であり、直鎖状または分枝鎖状のものを含む。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、あるいはシスまたはトランス配置をとることができる。アルケニル基として、好ましくは、Ｃ２－６アルケニル基などが挙げられる。
　アルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル基、アリル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基（シス、トランスを含む）、３－ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書における「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の炭化水素基であり、直鎖状または分枝鎖状のものを含む。好ましくはＣ２－６アルキニル基が挙げられる。
　アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル基、１－プロピニル基、プロパルギル基、３－ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが挙げられる。
　アルケニルまたはアルキニルには、それぞれ１個または２個以上の二重結合または三重結合を有することができる。
　本明細書における「シクロアルキル」は、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして、好ましくは、Ｃ３－７シクロアルキル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては具体的には、たとえば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。
　本明細書における「シクロアルキルアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義「シクロアルキル」で置換した基を意味する。シクロアルキルアルキルとして、好ましくは、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキルなどが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピルメチル基、シクロプロピルエチル基などが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロ原子」は、窒素原子（Ｎ）、酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）を意味する。
　本明細書における「ハロゲン」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
　本明細書における「ハロアルキル」は、同一又は異なる、好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個の前記「ハロゲン原子」が前記「アルキル」に結合した基を示す。
　具体的には、たとえば、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、ペルフルオロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基、－ＣＦ２ＣＦ３など）、２，２，２－トリフルオロエチル基などが挙げられる。
　本明細書における「アルコキシ」は、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基であることを意味し、好ましくはＣ１－４アルコキシ基、Ｃ１－３アルコキシ基などが挙げられる。アルコキシとして、具体的には、たとえば、メトキシ基、エトキシ基、１－プロポキシ基、２－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｉ－ブトキシ基、sec－ブトキシ基、tert－ブトキシ基などがあげられる。
　本明細書における「ハロアルコキシ」は、同一又は異なる、好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個の前記「ハロゲン原子」が前記「アルコキシ」に結合した基を示す。
　具体的には、たとえば、クロロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる
　本明細書における「アリール」は、１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－１０アリールなどが挙げられる。アリールとしては具体的には、たとえば、フェニル基、ナフチル基（たとえば、１－ナフチル基、２－ナフチル基）などが挙げられる。
　本明細書における「脂環式環」は、１価の非芳香族炭化水素環を意味する。脂環式環は、環中に不飽和結合を有してもよく、２個以上の環を有する多環性の基であってもよい。また環を構成する炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよい。脂環式環を構成する原子の数は、好ましくは３～１０である（３～１０員脂環式環）。脂環式環としては、例えば、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、シクロアルキニル環などが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロアリール」は、環を構成する原子中に好ましくは１～５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の１価の複素環基を意味する。ヘテロアリールは、部分的に飽和されていてもよく、単環でも縮合環（たとえば、ベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリール）でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０である（５～１０員ヘテロアリール）。
　ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ベンゾチアジアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾオキサジアゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、アザインドリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ベンゾジオキソリル基、インドリジニル基、イミダゾピリジル基などが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロシクリル」は、環を構成する原子中に好ましくは１～５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の１価の複素環基を意味する。ヘテロシクリルは、環中に二重、三重結合を有していてもよく、炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは３～１０である（３～１０員ヘテロシクリル）。
　ヘテロシクリルとしては具体的には、たとえば、オキセタニル基、ジヒドロフリル基、テトラヒドロフリル基、ジヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロピリジル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリニル基、イミダゾリジニル基、オキサゾリジニル基、イソオキサゾリジニル基、チアゾリジニル基、イソチアゾリジニル基、チアジアゾリジニル基、アゼチジニル基、オキサゾリドン基、ベンゾジオキサニル基、ベンゾオキサゾリル基、ジオキソラニル基、ジオキサニル基などが挙げられる。
　本明細書における「アリールアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義「アリール」で置換した基を意味する。アリールアルキルとしては、好ましくはＣ６－１０アリールＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキルなどが挙げられる。具体的には、たとえば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基などが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロアリールアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義「ヘテロアリール」で置換した基を意味する。ヘテロアリールアルキルとして、好ましくは、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキルなどが挙げられ、具体的には、たとえば、ピロリルメチル基、イミダゾリルメチル基、チエニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、キノリルメチル基、ピリジルエチル基などが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロシクリルアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義「ヘテロシクリル」で置換した基を意味する。ヘテロシクリルアルキルとして、好ましくは、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキルなどが挙げられ、具体的にはたとえば、モルホリニルメチル基、モルホリニルエチル基、チオモルホリニルメチル基、ピロリジニルメチル基、ピペリジニルメチル基、ピペラジニルメチル基、ピペラジニルエチル基、オキセタニルメチル基などが挙げられる。
　本明細書における「モノヒドロキシアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の１個の水素原子を１個の水酸基で置換した基を意味する。モノヒドロキシアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ2-６モノヒドロキシアルキルなどが挙げられ、具体的には、たとえば、ヒドロキシメチル基、１－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシエチル基などがこれに含まれる。
　本明細書における「ジヒドロキシアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の２個の水素原子を２個の水酸基で置換した基を意味する。ジヒドロキシアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキル、Ｃ２－６ジヒドロキシアルキルなどが挙げられ、具体的には、たとえば１，２－ジヒドロキシエチル基、１，２－ジヒドロキシプロピル基、１，３－ジヒドロキシプロピル基などがこれに含まれる。
　本明細書における「トリヒドロキシアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の３個の水素原子を３個の水酸基で置換した基を意味する。トリヒドロキシアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－６トリヒドロキシアルキル、Ｃ２－６トリヒドロキシアルキルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルコキシアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義の「アルコキシ」で置換した基を意味する。アルコキシアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ２－４アルキルなどが挙げられ、具体的には、例えば、メトキシエチルなどがこれに含まれる。
　本明細書における「アルコキシアルコキシアルキル」は、前記定義「アルコキシアルキル」中の末端のアルキル中の任意の水素原子を、前記定義の「アルコキシ」で置換した基を意味する。アルコキシアルコキシアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ２－４アルコキシＣ２－４アルキルなどが挙げられる。
　本明細書における「アミノアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を、アミノ基で置換した基を意味する。アミノアルキル基として、好ましくは、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ２－４アミノアルキルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルキルアミノ」は、前記定義の「アルキル」が１個結合したアミノ基であることを意味する。アルキルアミノとして、好ましくは、Ｃ１－４アルキルアミノなどが挙げられる。
　本明細書における「ジアルキルアミノ」は、前記定義の「アルキル」が２個結合したアミノ基であることを意味し、該アルキルは同一でも異なってもよい。ジアルキルアミノとして、好ましくは、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノなどが挙げられる。
　本明細書における「アルキルアミノアルキル」は、前記定義の「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義の「アルキルアミノ」で置換した基を意味する。アルキルアミノアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ２－４アルキルなどが挙げられる。
　本明細書における「ジアルキルアミノアルキル」は、前記定義の「アルキル」中の任意の水素原子を、前記定義の「ジアルキルアミノ」で置換した基を意味する。ジアルキルアミノアルキルとして、好ましくは、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ２－４アルキルなどが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロシクリルアミノ」は、前記定義の「ヘテロシクリル」が１個結合したアミノ基であることを意味する。ヘテロシクリルアミノとして、好ましくは、３～１０員ヘテロシクリルアミノなどが挙げられる。
　本明細書における「シアノアルキル」は、前記定義の「アルキル」中の任意の水素原子をシアノ基で置換した基を意味する。シアノアルキルとして、好ましくは、シアノ（Ｃ１－３アルキル）などが挙げられる。
　本明細書における「アルキルスルホニル」は、前記定義の「アルキル」が結合したスルホニル基（即ち、アルキル－ＳＯ２－）であることを意味する。アルキルスルホニルとして、好ましくは、Ｃ１－３アルキルスルホニルなどが挙げられ、具体的には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ－プロピルスルホニル、ｉ－プロピルスルホニルなどがこれに含まれる。
　本明細書における「アルキルスルホニルアルキル」は、前記定義「アルキル」中の任意の水素原子を前記定義の「アルキルスルホニル」で置換した基を意味する。アルキルスルホニルアルキルとして、好ましくは、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ２－４アルキルなどが挙げられる。
　前記式（Ｉ）で表される化合物として、好適には、以下のとおりである。
　前記Ｒ１は、好ましくは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３である。
　前記Ｒ１は、より好ましくは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう５～１０員ヘテロアリールとしては具体的にはイミダゾリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピラゾリル基が特に好ましく、３～１０員ヘテロシクリルとしては具体的にはモルホリニル基、テトラヒドロピリジル基、ピペリジニル基が特に好ましい。
　前記Ｒ２は、好ましくは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３である。
　前記Ｒ２は、より好ましくは、水素、ハロゲン、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ５、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールである。ここでいう５～１０員ヘテロアリールとしては具体的にはピリジル基が特に好ましい。
　前記Ｒ１および前記Ｒ２は、好ましくは、それらが結合している原子と一緒になって、３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。ここで、該ヘテロシクリルまたは該ヘテロアリールは、ハロゲン原子を置換基に有することができる。結合している原子と一緒になって形成する３～１０員ヘテロシクリルとしては具体的にはジオキソラニル基、ジオキサニル基が特に好ましい。
　前記Ｒ３は、好ましくは、水素、Ｃ１－５アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－６アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルであり、より好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキルまたはＣ１－３ペルフルオロアルキルであり、特に好ましくはＣ１アルキルである。
　前記Ｒ４は、好ましくは、水素、ハロゲン、Ｃ１－３アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４アルコキシ、－（ＣＨ２）ｎＺ１、－ＮＲ６Ｒ７、－ＯＲ５、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３である。
　前記Ｒ４は、より好ましくは、水素、ハロゲン、Ｃ１－３アルキル、Ｃ１－３ペルフルオロアルキル、シアノ、メタンスルホニル、ヒドロキシル、アルコキシまたはアミノであり、特に好ましくは、水素、またはハロゲンである。
　前記Ａ環としては、好ましくは、５～１０員ヘテロアリール環またはＣ６－１０アリール環であり、より好ましくは、ベンゼン、インドール、アザインドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾチアゾール、キノリンまたはピロールであり、特に好ましくはインドールまたはピロールである。
　前記Ｒ５は、好ましくは、Ｃ１－５アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリル、５～１０員ヘテロアリール、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキルである。
　前記Ｒ５は、より好ましくは、Ｃ１－５アルキル、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルアルキルとしては、具体的にはピペラジニルエチル基、オキセタニルメチル基、モルホリニルエチル基が特に好ましく、３～１０員ヘテロシクリルとしては具体的にはオキセタニル基、テトラヒドロピラニル基が特に好ましい。
　前記Ｒ６および前記Ｒ７は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれ、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ２－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキル、Ｃ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、またはシアノ（Ｃ１－３アルキル）である。
　前記Ｒ６および前記Ｒ７は、より好ましくは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、またはＣ１－６ジヒドロキシアルキルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルアルキルとしては具体的にはモルホリニルエチル基が特に好ましく、ここでいう５～１０員ヘテロアリールアルキルとしてはピリジルエチル基が特に好ましい。
　あるいは、前記Ｒ６および前記Ｒ７は、好ましくは、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。
　前記ｎは１～３の整数を示し、好ましくは、ｎは１である。
　前記Ｒ８および前記Ｒ９は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキルまたはハロゲンであり、より好ましくは、水素である。
　あるいは、前記Ｒ８および前記Ｒ９は、好ましくは、それらが結合している炭素原子と一緒になって脂環式環を形成することができる。
　前記Ｚ１は、好ましくは、水素、ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＨ、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールであり、より好ましくは、ＮＲ１０Ｒ１１または-ＯＨ、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルとしては、具体的にはピロリジニル基、ピペラジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基が特に好ましい。
　前記Ｒ１０および前記Ｒ１１は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれＣ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）またはＣ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキルであり、より好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルキニル、またはＣ１－３アルコキシＣ２－４アルキルである。
　あるいは、前記Ｒ１０および前記Ｒ１１は、好ましくは、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。
　前記Ｒ１２および前記Ｒ１３は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環であり、より好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキルである。
　あるいは、前記Ｒ１２および前記Ｒ１３は、好ましくは、それらが結合している窒素原子と一緒になってＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。特に好ましくは３～１０員ヘテロシクリルアルキルであり、具体的にはピペラジニル基、モルホリニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基がより好ましい。
　前記Ｒ１４は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキルである。
　前記Ｒ１５は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ１６は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくはＣ１－４アルキルである。
　前記Ｒ１７は、好ましくは、水素またはＣ１－４アルキルであり、より好ましくは水素である。
　前記Ｒ１８は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくは、Ｃ１－４アルキルである。
　前記Ｒ１９は、好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくは、水素、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルとしては、具体的にはピペラジニル基、モルホリニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基がより好ましい。
　前記Ｒ２０は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ２１は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ２２は、好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルである。
　前記Ｒ２３は、好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ２４は、好ましくは、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルである。
　前記Ｒ２５は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ２６および前記Ｒ２７は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環である。
　あるいは、前記Ｒ２６および前記Ｒ２７は、好ましくは、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。
　前記Ｒ２８および前記Ｒ２９は、好ましくは、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環である。
　あるいは、前記Ｒ２８および前記Ｒ２９は、好ましくは、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成することができる。
　前記Ｒ３０は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ３１は、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルである。
　前記Ｒ３２は、好ましくは、Ｃ１－４アルキルまたはＣ６－１０アリールである。
　前記Ｐ群に含まれる置換基として、好ましくは、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－３ハロアルコキシ、３～１０員ヘテロシクリルアミノ、－ＳＯ２Ｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、または３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくは、ハロゲン、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－３ハロアルコキシ、または３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルとしては、具体的にはモルホリニル基が特に好ましい。
　前記Ｑ群に含まれる置換基として、好ましくは、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリルアミノ、－ＳＯ２Ｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、Ｃ３－７シクロアルキル、－ＣＯＲ１９、またはＣ１－４アルキルで置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、より好ましくは、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、－ＳＯ２Ｒ１６、Ｃ３－７シクロアルキル、－ＣＯＲ１９、またはＣ１－４アルキルで置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルである。ここでいう３～１０員ヘテロシクリルとしては具体的にはピペラジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基がより好ましい。
　具体的には、例えば以下の化合物が挙げられる。
（１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピロリジン－１－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－ヒドロキシ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－ピロロ［３，２－ｃ］ピリジン－２－イル）－メタノン；
（５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピペラジン－１－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－モルホリン－４－イル－エトキシ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（テトラヒドロ－ピラン－４－イルオキシ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－クロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ブロモ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－ヨード－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１１）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；
（１２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ブロモ－５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－エチニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－クロロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－クロロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－クロロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－ブロモ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－フルオロ－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－メチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４，４－ジフルオロ－ピペリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３，３－ジフルオロ－ピペリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２８）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－５－カルボン酸（２，２，２－トリフルオロ－エチル）－アミド；
（２９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－トリフルオロメチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（６－トリフルオロメチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－クロロ－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－トリフルオロメチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－トリフルオロメチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（３６）　［５－アミノ－１－（６－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（３７）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－６－カルボン酸；
（３８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ヒドロキシメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（３９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－｛６－［２－（４－メチル－ピペラジン－１－イル）－エトキシ］－１Ｈ－インドール－２－イル｝－メタノン；
（４０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－メチル－オキセタン－３－イルメトキシ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－フルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－｛［ビス－（２－メトキシ－エチル）－アミノ］－メチル｝－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（４３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－｛６－［（メチル－プロパ－２－イニル－アミノ）－メチル］－１Ｈ－インドール－２－イル｝－メタノン；
（４４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３，３－ジフルオロ－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２，５－ジメチル－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３，３－ジフルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（（Ｓ）－３－メチル－モルホリン－４－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（４８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ブロモ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（４９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ヨード－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－ピロロ［３，２－ｂ］ピリジン－２－イル）－メタノン；
（５１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ブロモ－６－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ヨード－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－メチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－イソプロピル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（２－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（５６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ベンジル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（５７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（２－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（５８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（５９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（６０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－エチニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（６１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｆ］インドール－６－イル）－メタノン；
（６２）　［５－アミノ－１－（７－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（６３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４－トリフルオロメチル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（６４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ブトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（６５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－メチル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（６６）　Ｎ－｛２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－６－イル｝－メタンスルホンアミド；
（６７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（６－モルホリン－４－イル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（６８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ブチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（６９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－メトキシ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－メトキシ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－シクロプロピル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（７３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－メトキシ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７４）　５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－フェニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（７５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－メタンスルホニル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（７６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－イソプロピル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（７７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピリジン－２－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（７８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－シクロプロピル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（７９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピリダジン－３－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（８０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－イソプロポキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（８１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（２－メトキシ－エトキシ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－シクロプロピルメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（８３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（２，２－ジフルオロ－５Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｆ］インドール－６－イル）－メタノン；
（８４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－クロロ－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－フルオロ－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（６－モルホリン－４－イル－ピリダジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－クロロ－６－シクロプロピルメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（８８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２，４－ジフルオロ－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（８９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピリダジン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（９０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（３－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（９１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－イソプロピル－ピペリジン－４－イル）－６－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（９２）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル；
（９３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１，２，３，６－テトラヒドロ－ピリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（９４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ピペリジン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（９５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（（Ｒ）－３－フルオロ－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（９６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－フルオロ－５－ピペリジン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（９７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－フルオロ－５－（１－メチル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（９８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－イソプロピル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（９９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－フルオロ－５－（１－イソプロピル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１００）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピリジン－３－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１０１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（６－モルホリン－４－イル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ピリジン－３－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１０３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（６－ピペラジン－１－イル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（６－ヒドロキシ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－フルオロ－５－（４－メチル－ピペラジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－フルオロ－５－ピロリジン－１－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１０７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（１－メチル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－モルホリン－４－イル－フェニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１０９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３，４，５，６－テトラヒドロ－２Ｈ－［１，２'］ビピリジン－５'－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（６－ピペラジン－１－イル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（６－メトキシ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（（Ｓ）－３－メチル－モルホリン－４－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（（Ｒ）－３－フルオロ－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（２，５－ジメチル－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３－フルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３，３－ジフルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１１７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－｛６－［２－（４－メチル－ピペラジン－１－イル）－ピリジン－４－イル］－１Ｈ－インドール－２－イル｝－メタノン；
（１１８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ピリジン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１１９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４－フルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４，４－ジフルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２１）　［５－アミノ－１－（２－ジフルオロメチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－メチル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２２）　［５－アミノ－１－（２－ジフルオロメチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１２３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３，３－ジフルオロ－ピロリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－シクロペンチル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（１－シクロヘキシル－ピペリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１２６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（１２７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（１２８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－フェニル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（１２９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（３－クロロ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（１３０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（４－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（１３１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（３－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（１３２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－モルホリン－４－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１３３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（２－モルホリン－４－イル－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４－メチル－ピペラジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－モルホリン－４－イル－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（ピペラジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（２－メトキシ－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（２－ヒドロキシ－１－ヒドロキシメチル－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１３９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（２－ピリジン－４－イル－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１４０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－メトキシ－エチルアミノ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１４１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－モルホリン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－モルホリン－４－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－モルホリン－４－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－モルホリン－４－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（モルホリン－４－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１４６）　［５－アミノ－１－（２－イソプロピル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４７）　［５－アミノ－１－（２－プロピル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４８）　［５－アミノ－１－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１４９）　［５－アミノ－１－（２－トリフルオロメチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１５０）　［５－アミノ－１－（２－エチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１５１）　［５－アミノ－１－（２－ベンジル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１５２）　１－（４－｛２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－５－イルメチル｝－ピペラジン－１－イル）－エタノン；
（１５３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４－メタンスルホニル－ピペラジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１５４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ピペラジン－１－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１５５）　１－（４－｛２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－６－イルメチル｝－ピペラジン－１－イル）－エタノン；
（１５６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－メチル－ピペラジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１５７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（４－メチル－ピペラジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１５８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ピロリジン－１－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１５９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－２－イル）－メタノン；
（１６３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－フルオロ－６－モルホリン－４－イルメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６４）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－５－カルボン酸；
（１６５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，６－ジメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１６９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，６－ジメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－tert－ブチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－イソプロピル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ベンジルオキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－ベンジルオキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５，６－ジメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－tert－ブチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－フルオロ－４－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－フェノキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－メチルスルファニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１７９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－tert－ブチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－メチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－エチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－フルオロ－６－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－フルオロ－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－クロロ－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－クロロ－６－メトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－イソプロポキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ベンジルオキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－イソプロポキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１８９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（２，３－ジヒドロ－６Ｈ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｆ］インドール－７－イル）－メタノン；
（１９０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，６－ジ－tert－ブチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１９１）　２－［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボニル］－１Ｈ－インドール－４－カルボニトリル；
（１９２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－イミダゾール－１－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１９３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－トリフルオロメチルスルファニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１９４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－メチルスルファニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１９５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－メタンスルホニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（１９６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４，４－ジフルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１９７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－フルオロ－ピペリジン－１－イルメチル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１９８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（オキセタン－３－イルオキシ）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（１９９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ヒドロキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２００）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－メタンスルホニル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２０１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，５－ジブロモ－１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（２０２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，５－ジフェニル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（２０３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，５－ジ－ピリジン－３－イル－１Ｈ－ピロール－２－イル）－メタノン；
（２０４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－クロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２０５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－クロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２０６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－３－イル）－メタノン；
（２０７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（１Ｈ－インドール－６－イル）－メタノン；
（２０８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ブロモ－６－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２０９）　［５－アミノ－１－（２－エチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－ブロモ－６－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－トリフルオロメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノンｖ
（２１２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，６－ジクロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ブロモ－４－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－トリフルオロメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１５）　［５－アミノ－１－（２－エチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－トリフルオロメトキシ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１６）　［５－アミノ－１－（２－エチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５－トリフルオロメチル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（５，６－ジクロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１８）　［５－アミノ－１－（２－エチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－ブロモ－５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２１９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，５－ジクロロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２２０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２２１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－クロロ－ピリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（６－メチル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－フルオロ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－トリフルオロメチル－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－クロロ－２－メトキシ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（５－クロロ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－チオフェン－３－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２２８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（４－クロロ－ピリジン－３－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２２９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（６－チオフェン－２－イル－１Ｈ－インドール－２－イル）－メタノン；
（２３０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（３－フルオロ－ピリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［６－（２－トリフルオロメチル－ピリジン－４－イル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３，３－ジフルオロ－ピロリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（２，６－ジメチル－モルホリン－４－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（［１，４'］ビピペリジニル－１'－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－｛５－［４－（２，２，２－トリフルオロ－エチル）－ピペラジン－１－カルボニル］－１Ｈ－インドール－２－イル｝－メタノン；
（２３６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－｛５－［４－（２－ヒドロキシ－エチル）－ピペラジン－１－カルボニル］－１Ｈ－インドール－２－イル｝－メタノン；
（２３７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（３，３，４，４－テトラフルオロ－ピロリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（（Ｒ）－３－フルオロ－ピロリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２３９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［５－（（Ｓ）－３－フルオロ－ピロリジン－１－カルボニル）－１Ｈ－インドール－２－イル］－メタノン；
（２４０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（４－メトキシ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（３－メトキシ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４，５－ビス－（３－フルオロ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４，５－ビス－（４－メトキシ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（２，４－ジフルオロ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４５）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４－（４－トリフルオロメトキシ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４６）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－［４，５－ビス－（３－メトキシ－フェニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル］－メタノン；
（２４７）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ベンゾフラン－２－イル－メタノン；
（２４８）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル－メタノン；
（２４９）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ベンゾチアゾール－２－イル－メタノン；
（２５０）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（４－フルオロ－フェニル）－メタノン；
（２５１）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－（３－クロロ－フェニル）－メタノン；
（２５２）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン－３－イル－メタノン；
（２５３）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン－７－イル－メタノン；および
（２５４）　［５－アミノ－１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン－６－イル－メタノン。
　より具体的には、前記式（Ｉ）においてＡがインドールであり、Ｒ３がメチルであり、Ｒ４が水素である化合物が挙げられ、例えば、表１に記載される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　上記の化合物は、例えば、国際公開WO2011/016528号に記載される製造方法に従って製造することができる。
　また、上記の本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物には、フリー体に限らず、薬学的に許容される塩も包含される。
　このような「塩」としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
　無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などがあげられる。本発明における特に好ましい塩は、リンゴ酸塩である。
　無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。
　酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物にはまた、水和物も包含される。さらには、本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物には、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があり、そのような溶媒和物も包含される。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物にはまた、構造上生ずる全ての異性体（幾何異性体、光学異性体、立体異性体、互変異性体等）および異性体混合物も包含される。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物にはまた、任意の結晶多形が包含される。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物にはまた、そのプロドラッグが含まれる。プロドラッグとは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、生体に投与された後、元の化合物に復元して本来の薬効を示す本発明化合物の誘導体であり、共有結合によらない複合体及び塩を含む。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物には、その分子内の１つ以上の原子が同位体で置換されたものが含まれる。本発明において同位体とは、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子を意味する。本発明化合物に含まれる、同位体の置換対象となる原子の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それらの同位体には、２H、３H、１３C、１４C、１５N、１７O、１８O、３１P、３２P、３５S、１８F、３６Cl等が含まれる。特に、３Hや１４Cのような、放射線を発して崩壊する放射性同位体は、医薬品あるいは化合物の体内組織分布試験等の際に有用である。安定同位体は、崩壊を起こさず、存在量がほとんど変わらず、放射線も発しないため、安全に使用することができる。本発明の化合物の同位体置換体は、合成で用いている試薬を、対応する同位体を含む試薬に置き換えることにより、常法に従って変換することができる。
　また、本発明におけるFGFR阻害剤を含む「抗癌剤」または「癌治療用医薬組成物」は、互換的に用いられ、上述したFGFR阻害活性を有する化合物および薬学的に許容され得る担体とからなる癌の治療用の組成物を意味する。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等として製剤化することができる。製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。
　例えば、経口製剤を製造するには、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
　これらの成分としては例えば、大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体、精製水などがあげられる。
　賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが挙げられる。
　結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。
　着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。
　これらの錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。また、シロップ剤や注射用製剤等の液剤を製造する際には、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。
　外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造することができる。すなわち製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるが、本発明にかかる外用剤の基剤原料はこれらに限定されない。
　また、必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
　本発明におけるFGFR阻害活性を有する化合物を患者に投与するための抗癌剤（癌治療用医薬組成粒）は、その投与形態は特に限定されず、通常用いられる方法により経口投与でも非経口投与でもよい。例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤などの剤として製剤化し、投与することができる。
　本発明における抗癌剤または癌治療用医薬組成物に含有されるFGFR阻害剤の用量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選ぶことができる。
　該用量は、患者の、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差などにより著しく異なるが、通常成人として１日あたり、約0.03-1000mg、好ましくは0.1-500mg、さらに好ましくは0.1-100mgを１日１～数回に分けて投与する。注射剤の場合は、通常約１μg/kg～3000μg/kgであり、好ましくは約３μg/kg～1000μｇ/kgである。
　本発明はまた、上述のFGFR阻害活性を有する化合物が、本発明の変異ポリペプチドを発現するか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者に投与されるように用いられることを特徴とする、該化合物を含有する癌治療用医薬組成物に関する。
　本発明はさらに、上述のFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩の有効量を該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者に投与することを含む癌の治療または予防方法、該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者に投与するための癌治療用医薬組成物の製造におけるFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩の使用、該変異ポリペプチドを発現または該ポリヌクレオチドを有する患者の治療または予防における使用のためのFGFR阻害活性を有する化合物若しくはその薬学的に許容される塩、等に関する。
　具体的には、患者が上述したFGFR阻害剤を含む抗癌剤による投与を受ける前に、本発明の変異ポリペプチドをバイオマーカーとして利用することにより、該患者が当該変異ポリペプチドを発現しているか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するか否かを試験し、当該変異ポリペプチドを発現しているか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する場合のみ、該FGFR阻害剤を含む抗癌剤を該患者に投与するように用いられることを特徴とするものである。これにより、該薬剤による治療における副作用の発現を未然に防止し、且つ最善の治療効果が得られるよう治療態様をコントロールすることが可能であり、個別化医療（personalized medicine）が可能となる。
　なお、該患者が本発明の変異ポリペプチドを発現しているか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するか否かの試験は、上述した本発明の方法を用いて行うことができる。
　本発明はまた、FGFR阻害活性を有する化合物を同定する方法に関する。
　本発明のFGFR阻害活性を有する化合物を同定する方法は、具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
　（ａ）　被検化合物の存在下および非存在下で、上述した本発明の変異ポリペプチドを発現する細胞をそれぞれ培養し、細胞増殖のレベルを決定する工程；
　（ｂ）　被検化合物の存在下で該細胞を培養した場合の細胞増殖のレベルを、被検化合物の非存在下で該細胞を培養した場合の細胞増殖のレベルと比較する工程；および
　（ｃ）　被検化合物の存在下で該細胞を培養した場合の細胞増殖のレベルが、被検化合物の非存在下で該細胞を培養した場合の細胞増殖のレベルより低い場合は、該被検化合物がFGFR阻害活性を有すると判定する工程。
　この方法で用いられる細胞は、本発明の変異ポリペプチドを発現する細胞であれば初代培養細胞、株化された細胞または組み換え細胞のいずれであってもよい。該組み換え細胞には、上述した本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターが導入された組み換え細胞が挙げられる。
　また、該初代培養細胞は、癌患者から採取された細胞が挙げられ、該株化された細胞は、癌患者から採取された癌細胞から樹立された癌細胞株が挙げられる。
　また、本発明における癌には、上述したとおりの任意の癌が包含される。
　本発明のFGFR阻害活性を有する化合物を同定する方法は、さらに、以下の工程を含む方法が挙げられる。
（ａ）　上述した本発明の変異ポリペプチドを発現する細胞を移植された非ヒト哺乳動物に、被検化合物を投与し、該細胞の増殖のレベルを決定する工程；
（ｂ）　工程（ａ）で決定された細胞増殖のレベルを、該被検化合物の投与を受けていない該細胞を移植された非ヒト哺乳動物において決定された該細胞の細胞増殖のレベルと比較する工程；および
（ｃ）　工程（ａ）で決定された細胞増殖のレベルが、該被検化合物の投与を受けていない該細胞を移植された非ヒト哺乳動物において決定された該細胞の細胞増殖のレベルより低い場合は、該被検化合物がFGFR阻害活性を有すると判定する工程。
　この方法で用いられる細胞は、本発明の変異ポリペプチドを発現する細胞であれば初代培養細胞、株化された細胞または組み換え細胞のいずれであってもよい。該組み換え細胞には、上述した本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターが導入された組み換え細胞が挙げられる。
　また、該初代培養細胞は、癌患者から採取された細胞が挙げられ、該株化された細胞は、癌患者から採取された癌細胞から樹立された癌細胞株が挙げられる。
　また、本発明における癌には、上述したとおりの任意の癌が包含される。
　本発明の方法においては細胞増殖のレベルは、例えば、色素（MTT、XTT、MTS、WST、等）をホルマザン色素（紫色）へ還元する酵素活性を測定する比色定量法を用いて常法により試験することができる。
　また、該細胞増殖のレベルは、該細胞が癌細胞の場合には、細胞増殖の結果形成される腫瘍の大きさまたは重量を測定することによっても決定することができる。
　本発明のFGFR阻害活性を有する化合物を同定する方法はまた、レポータージーンアッセイ（reporter gene assay）を利用する態様が包含される。
　レポーター遺伝子としては、汎用されている任意の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が包含され、例えば、オワンクラゲ（Aequorea coerulescens）由来の緑色蛍光タンパク質GFP、ウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、造礁サンゴ由来のRCFPs（Reef Coral Fluorescent Proteins）、フルーツ蛍光タンパク質、およびそれらの改変体、等が挙げられる。
　本発明におけるレポータージーンアッセイは、例えば、次のように実施することができる。
　本発明の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとレポーター蛋白をコードする遺伝子を、該変異ポリペプチドコーディングポリヌクレオチドのmRNAへの転写のシグナルに依存して該レポータータンパクをコードする遺伝子のmRNAへの転写が起こるように挿入した発現ベクターで、遺伝子組換えタンパクの製造で一般的に使用される細胞を形質転換して遺伝子組換え細胞を作製する。得られた形質転換細胞に、被験化合物を接触させる。該化合物の作用に依存して発現される該変異ポリペプチドのレベルを、該変異ポリペプチドの発現と同時に発現される該レポータータンパクが発する蛍光の量を測定することにより間接的に測定することにより、該化合物が、該変異ポリペプチドの発現に影響を与えるか否かを分析する（例えば、米国特許第5,436,128号及び米国特許第5,401,629号、等）。
　また、本アッセイを用いた該化合物の同定は、マニュアル作業でも可能であるが、機械（ロボット）を用いて自動で行う所謂ハイスループットスクリーニング（High Throughput Screening）（組織培養工学, Vol.23, No.13, p.521-524；米国特許第5,670,113号）を用いることによりより迅速、簡便に行うことができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
　また、特に断りがない場合は、それぞれの試験工程は、公知の方法に従って実施可能である。
　また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
［実施例１］FGFR2 V564F変異体およびV562L変異体に対する検討
（１）FGFR阻害剤によるリン酸化抑性作用の評価
　FGFR2 V564F変異体（配列番号：９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：６）およびFGFR2 V562L変異体（配列番号：１０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：７）を、野生型FGFR2（配列番号：８）のORFポリヌクレオチド（配列番号：５）からPCR法を用いたSite-Directed Mutagenesis法により作製した。野生型FGFR2 ORFポリヌクレオチド、FGFR2 V564F変異体またはFGFR2 V562L変異体をコードするポリヌクレオチドを、pCXND3ベクター（化血研）にサブクローニングし、各ポリペプチド発現用ベクターを作製した。作製した各ベクターを、ヒト結腸腺癌細胞HCT 116（ATCC）に、トランスフェクション試薬FuGENE（登録商標） HD（Promega社）を用いて導入し、野生型FGFR2ポリペプチド（配列番号：８）、FGFR2 V564F変異ポリペプチド（配列番号：９）およびFGFR2 V562L変異ポリペプチド（配列番号：１０）をそれぞれ一過性に発現させた。それぞれの細胞に対して、DMSO 0.1%存在下にて化合物Aまたは化合物Cを作用させた後、Cell lysis buffer（Cell Signaling Technology社）を用いて各細胞の細胞溶解物を回収した。各細胞溶解物をPhospho-FGF Receptor (Tyr653/654) Antibody（Cell Signaling Technology社）またはFGFR-2 Antibody （Sigma社）を用いてウェスタンブロッティング法で解析したところ、図１に示すように、FGFR2 V564F変異ポリペプチドおよびFGFR2 V562L変異ポリペプチドに対する各化合物のリン酸化抑性効果は、野生型FGFR2ポリペプチドに対するリン酸化抑性効果に比べ、化合物Cでは大幅に減弱した一方、化合物Aではあまり減弱しないことが確認された。
（２）FGFR阻害剤によるin vitroでの細胞増殖抑制効果の評価
　実施例１（１）で作製した野生型FGFR2、FGFR2 V564F変異体またはV562L変異体の各ポリペプチド発現ベクターを、IL-3依存性マウスプロ B 細胞Ba/F3（理研）に電気穿孔法 によって導入し、IL-3非存在下で、セレクションマーカーであるG-418（Life technology社）、ならびにFGF1（Sigma社）およびheparin（Sigma社）を添加した条件下にて培養した後、野生型FGFR2ポリペプチド、FGFR2 V564F変異ポリペプチドまたはFGFR2 V562L変異ポリペプチドを安定的に発現しIL-3非依存的な増殖が可能なBa/F3株をそれぞれ樹立した。96ウェルプレートに蒔いた各株に対し、20 μMを最大濃度として4倍ずつ9段階希釈した各化合物（化合物A、BもしくはC）、またはDMSO（コントロールとして使用）を添加した状態で4日間培養した。4日間経過後の細胞増殖をWST-8（同仁化学研究所）により計測した。各細胞に対する各化合物の細胞増殖阻害活性は、各濃度の化合物を添加し細胞を培養したウェルの450nMの吸光度の値をT、DMSOを添加し細胞を培養した際の450nMの吸光度の値をCとした時の(1-T/C) x 100 (%)で算出し、IC50は最小二乗法によって算出した。その結果、図２および表２に示すように、FGFR2 V564F変異ポリペプチドまたはFGFR2 V562L変異ポリペプチドを安定的に発現する株に対する各化合物の細胞増殖阻害活性は、野生型FGFR2ポリペプチドを安定的に発現する株に対する細胞増殖阻害活性に比べ、化合物Bおよび化合物Cでは大幅に減弱した一方、化合物Aではほとんど変化しないことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実施例２］TEL融合FGFR2 V564F変異体に対する検討
（１）FGFR阻害剤によるin vitroでの細胞増殖抑制効果の評価
　野生型TEL（配列番号：３３）の二量体化ドメインをコードするポリヌクレオチドと野生型FGFR2（配列番号：１）の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドを、PCR法を用いたSite-Directed Mutagenesis法により融合させ、TEL融合野生型FGFR2（配列番号：３４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：１１）を作製した。TEL融合野生型FGFR2をコードするポリヌクレオチドを鋳型にTEL融合FGFR2 V564F変異体（配列番号：３５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：１２）を、PCR法を用いたSite-Directed Mutagenesis法により作製した。TEL融合野生型FGFR2およびTEL融合FGFR2 V564F変異体をコードするポリヌクレオチドを、pCXND3ベクター（化血研）にサブクローニングし、各ポリペプチド発現用ベクターを作製した。TEL融合野生型FGFR2もしくはTEL融合FGFR2 V564F変異体の各ポリペプチド発現ベクターをIL-3依存性マウスプロ B 細胞Ba/F3に電気穿孔法 によって導入し、IL-3非存在下にてセレクションマーカーであるG-418を添加して培養し、TEL融合野生型FGFR2ポリペプチドまたはTEL融合FGFR2 V564F変異ポリペプチドを安定的に発現しIL-3非依存的な増殖が可能なBa/F3株をそれぞれ樹立した。96ウェルプレートに蒔いた各株に対し、50 μMを最大濃度として4倍ずつ18段階希釈した各化合物（化合物A、B、C、もしくはE）、10 μMを最大濃度として4倍ずつ18段階希釈した各化合物（化合物D）、またはDMSO（コントロールとして使用）を添加した状態で4日間培養した。4日間経過後の細胞増殖をWST-8（同仁化学研究所）により計測した。各細胞に対する各化合物の細胞増殖阻害活性は、各濃度の化合物を添加し細胞を培養したウェルの450nMの吸光度の値をT、DMSOを添加し細胞を培養した際の450nMの吸光度の値をCとした時の(1-T/C) x 100 (%)で算出した。その結果、図３に示すように、TEL融合FGFR2 V564F変異ポリペプチドを安定的に発現する株に対する各化合物の細胞増殖阻害活性は、TEL融合野生型FGFR2ポリペプチドを安定的に発現する株に対する細胞増殖阻害活性に比べ、化合物B、C、DおよびEでは大幅に減弱した一方、化合物Aではほとんど変化しないことが確認された。
（２）FGFR阻害剤によるin vivoでの腫瘍増大抑制効果の評価
　実施例２（１）で樹立したTEL融合野生型FGFR2もしくはTEL融合FGFR2 V564F変異ポリペプチドを安定的に発現しIL-3非依存的な増殖が可能なBa/F3株をBALB/c ヌードマウス（日本チャールズ・リバー）の鼠頚部皮下に5.0～5.2 x 106個ずつ接種し、植付け9日後から、化合物Aまたは化合物Cを10% DMSO、10% Cremophor EL、15% PEG400、および15% HPCDを含む溶液に懸濁し、20 mL/kgの濃度で、経口で1日1回毎日マウスに投与したところ、図４に示すように、TEL融合FGFR2 V564F変異体ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける各化合物の腫瘍増殖抑制活性は、TEL融合野生型FGFR2ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける活性に比べ、化合物Cでは大幅に減弱した一方、化合物Aではほとんど変化しないことが確認された。
　また、試験終了後の腫瘍サンプルからCell lysis buffer（Cell Signaling Technology社）を用いて腫瘍溶解物を回収し、各腫瘍溶解物を、Phospho-FGF Receptor (Tyr653/654) Antibody（Cell Signaling Technology社）またはFGFR-2 Antibody （Sigma社）を用いてウェスタンブロッティング法で解析したところ、図５に示すように、TEL融合FGFR2 V564F変異体ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける各化合物の腫瘍中リン酸化抑性効果は、TEL融合野生型FGFR2ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を担持するマウスにおける活性に比べ、化合物Cでは大幅に減弱した一方、化合物Aではほとんど変化しないことが確認された。
　本発明の変異FGFRポリペプチドは、AZD4547などの公知のFGFR阻害剤に対して耐性を示す一方、特定の化合物に対しては感受性を示すことから、該変異ポリペプチドを、各種FGFR阻害剤による癌治療におけるバイオマーカーとして利用することにより、個々の患者ごとに各種FGFR阻害剤の適用の適否を決定することができ、従前のFGFR阻害剤による治療における副作用の発現を未然に防止し、且つ最善の治療効果が得られるよう治療態様をコントロールすることが可能であり、個別化医療が可能となる。

Claims (23)

  1. 　下記式（I）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む癌治療用医薬組成物であって、
    　FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドを発現するか、あるいは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者に投与されるように用いられることを特徴とする、癌治療用医薬組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に以下の基を示す；
    　Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
    　Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、－ＯＲ５、－ＮＲ６Ｒ７、－（ＣＲ８Ｒ９）ｎＺ１、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、－ＳＲ１４、－ＳＯＲ１５、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＮＲ１７ＳＯ２Ｒ１８、ＣＯＯＨ、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリル、－ＣＯＲ１９、－ＣＯＯＲ２０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ２１、－ＮＲ２２Ｃ（Ｏ）Ｒ２３、－ＮＲ２４Ｃ（Ｓ）Ｒ２５、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、－ＳＯ２ＮＲ２８Ｒ２９、－ＯＳＯ２Ｒ３０、－ＳＯ３Ｒ３１または－Ｓｉ（Ｒ３２）３を示し；
    　またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し、ここで該ヘテロシクリルまたは該ヘテロアリールは、ハロゲンで置換されていてもよく；
    　Ｒ３はメチルを示し；
    　Ｒ４は水素を示し；
    　Ａはインドールであり；
    　Ｒ５はＣ１－５アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ３－７シクロアルキルＣ１－３アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリル、５～１０員ヘテロアリール、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキルを示し；
    　Ｒ６およびＲ７は、同一でも異なってもよく、それぞれ、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリールＣ１－３アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキル、Ｃ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ１－４アミノアルキル、Ｃ１－４アルキルアミノＣ１－４アルキル、ジ（Ｃ１－４アルキル）アミノＣ１－４アルキルまたはシアノ（Ｃ１－３アルキル）を示すか、またはＲ６およびＲ７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成し；
    　ｎは１～３を示し；
    　Ｒ８およびＲ９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキルまたはハロゲンを示すか、またはＲ８およびＲ９は、それらが結合している炭素原子と一緒になって脂環式環を形成してもよく；
    　Ｚ１は、水素、ＮＲ１０Ｒ１１、-ＯＨ、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを示し；
    　Ｒ１０およびＲ１１は、同一でも異なってもよく、それぞれＣ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）またはＣ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキルを示すか、またはＲ１０およびＲ１１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
    　Ｒ１２およびＲ１３は同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、３～１０員脂環式環、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示すか、またはＲ１２およびＲ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｑ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
    　Ｒ１４は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ１５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ１６は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ１７は、水素またはＣ１－４アルキルを示し；
    　Ｒ１８は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｐ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよいＣ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ１９は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、またはＱ群から独立して選択される１または複数の基で置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールもしくは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ２０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ２１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ２２は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
    　Ｒ２３は、水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ２４は、水素、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－４ハロアルキルを示し；
    　Ｒ２５は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ２６およびＲ２７は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２６およびＲ２７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
    　Ｒ２８およびＲ２９は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ１－３アルコキシルＣ１－４アルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６－１０アリールＣ１－４アルキル、３～１０員ヘテロシクリルＣ１－３アルキル、５～１０員ヘテロアリールＣ１－３アルキル、シアノ（Ｃ１－３アルキル）、Ｃ１－３アルキルスルホニルＣ１－４アルキル、または３～１０員脂環式環を示すか、またはＲ２８およびＲ２９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって３～１０員ヘテロシクリルまたは５～１０員ヘテロアリールを形成してもよく；
    　Ｒ３０は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ３１は、Ｃ１－４アルキル、Ｃ３－７シクロアルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、Ｃ６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリールまたは３～１０員ヘテロシクリルを示し；
    　Ｒ３２は、Ｃ１－４アルキルまたはＣ６－１０アリールを示し；
    <Ｐ群>
    　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－３ハロアルコキシ、３～１０員ヘテロシクリルアミノ、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、および３～１０員ヘテロシクリル。
    <Ｑ群>
    　ハロゲン、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４ハロアルキル、－ＯＨ、Ｃ１－３アルコキシ、Ｃ１－６モノヒドロキシアルキル、Ｃ１－６ジヒドロキシアルキルまたはＣ１－６トリヒドロキシアルキル、３～１０員ヘテロシクリルアミン、－ＳＯ２Ｒ１６、－ＣＮ、－ＮＯ２、Ｃ３－７シクロアルキル、－ＣＯＲ１９、およびＣ１－４アルキルで置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル。
  2. 　下記式で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、請求項１記載の医薬組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    。
  3. 　FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチド。
  4. 　請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  5. 　請求項４記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  6. 　請求項５記載のベクターを含む組み換え細胞。
  7. 　請求項３記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
  8. 　請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
  9. 　請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチドに結合し、該mRNAポリヌクレオチドのタンパク質への翻訳を阻害する活性を有するオリゴヌクレオチド。
  10. 　該オリゴヌクレオチドが、mRNAポリヌクレオチドを切断するsiRNAである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 　請求項３記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を用いて、被験者から単離された試料中において、該変異ポリペプチドを検出する工程を含む、FGFR変異ポリペプチドの検出方法。
  12. 　請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いて、被験者から単離された試料中において、該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する工程を含む、FGFR変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出方法。
  13. 　請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、該ポリヌクレオチドの検出または増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを含む、FGFR変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出用キット。
  14. 　請求項３記載の変異ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、FGFR変異ポリペプチドの検出用キット。
  15. 　被験者から単離された試料中において、請求項３記載の変異ポリペプチドまたは該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定し、該変異ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドが検出された場合に、請求項１または２記載の医薬組成物を当該被験者に投与して、癌を治療する方法。
  16. 　該癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、請求項１５記載の方法。
  17. 　以下の工程を含む、請求項１または２記載の医薬組成物が適用される患者を選択する方法：
    （ａ）　被験者から単離された試料中において、請求項３記載の変異ポリペプチドの存否を決定する工程；
    （ｂ）　該変異ポリペプチドの存在が確認された被験者を該医薬組成物が適用される患者として選択する工程。
  18. 　以下の工程を含む、請求項１または２記載の医薬組成物が適用される患者を選択する方法：
    （ａ）　被験者から単離された試料中において、請求項３記載の変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存否を決定する工程；
    （ｂ）　該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在が確認された被験者を該医薬組成物が適用される患者として選択する工程。
  19. 　該癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、請求項１８記載の方法。
  20. 　請求項３記載の変異ポリペプチドを発現するか、または該変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する患者における癌の治療において使用するための、請求項１または２で定義される化合物またはその薬学的に許容される塩。
  21. 　前記癌が、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、皮膚黒色腫、子宮体癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、胆管癌、胆道癌または肝癌である、請求項２０記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
  22. 　下記式で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドの発現する癌の治療用医薬組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    。
  23. 　FGFRポリペプチドにおける、配列番号５３もしくは５４に記載される部分アミノ酸配列のうち、N末端側から７番目のアミノ酸であるバリンのフェニルアラニンへの置換、および/もしくはN末端側から５番目のアミノ酸であるバリンのロイシンへの置換を含むFGFR変異ポリペプチドの機能を阻害するか発現を阻害する物質を有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
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