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WO2015099175A1 - ヒト抗ｉｌ－３３中和モノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト抗ｉｌ－３３中和モノクローナル抗体 Download PDF

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WO2015099175A1
WO2015099175A1 PCT/JP2014/084695 JP2014084695W WO2015099175A1 WO 2015099175 A1 WO2015099175 A1 WO 2015099175A1 JP 2014084695 W JP2014084695 W JP 2014084695W WO 2015099175 A1 WO2015099175 A1 WO 2015099175A1
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WO
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amino acid
antibody
residue
seq
acid sequence
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PCT/JP2014/084695
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰寛 藤野
吉川　勉
宏 越智
Original Assignee
田辺三菱製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody, an antibody competing with the antibody, a cytokine expression inhibitor containing these antibodies, and a pharmaceutical composition for treating, preventing or alleviating IL-33-related diseases. .
  • Interleukin-33 is a cytokine belonging to the interleukin-1 family that is thought to play a role in inflammatory conditions.
  • IL-33 is constitutively expressed in the nuclei of epithelial cells and vascular endothelial cells, and is released along with cell destruction by tissue damage caused by infection or physical / chemical stress, and functions as an alarmin.
  • IL-33 expression is increased by stimulation with lipopolysaccharide and secreted.
  • IL-33 released extracellularly can activate intracellular signals by binding to IL-33 receptors expressed on the cells.
  • the IL-33 receptor is expressed in various immune system cells and epithelial cells, and IL-33-induced intracellular signal transduction occurs in these cells.
  • IL-33 is a Th2 cytokine from Th2 cells, mast cells, eosinophils, basophils, NK (natural killer) T cells and group 2 natural lymphocytes among immune system cells expressing IL-33 receptor. It is thought to induce allergic inflammation (asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, etc.) by inducing the production of (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, etc.) (Non-patent document 1: Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p1203).
  • Non-patent Document 2 Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620. It has been suggested that an antagonist of IL-33 is effective for acute kidney injury (Non-patent Document 3: Ali Akcay et al., Journal of American Society Nephrology, 2011, Vol.22, p2057).
  • Non-patent Document 4 Yasushi33Matsuyama ⁇ ⁇ et al., Journal of Rheumatology, 2010, Vol. 37, p18; Non-Patent Document 5: David Pre ⁇ fontaine et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, Vol. 125, p752; , Clinical Rheumatology, 2011, Vol.
  • Non-Patent Document 7 A. L. Rankin et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p1526; , 2013, Vol. 39, ; p357;
  • Non-Patent Document 9 Liang-An Hu et al., Asian Pacific Journal of Cancer P revention, 2013, Vol. 14, p2563;
  • Non-Patent Document 10 Luca Pastorelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p8017).
  • IL-33 Since it is known that IL-33 is involved in various diseases, particularly inflammatory diseases, IL-33 agonists and antagonists have been developed (Patent Documents 1 to 4). Among them, an antibody against IL-33 has attracted attention because of its specificity and strength of action.
  • the antibodies that have been developed so far specify mouse antibodies that do not specify epitopes (Patent Document 1) or cleaved sites of IL-33 by caspase, and specify that the active form is uncleaved IL-33
  • Patent Document 2 an antibody having a region containing such a cleavage site (residue 155 to residue 198 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing) as an epitope and a commercially available goat polyclonal antibody have been known.
  • AnaptysBio reported on its website that it has successfully produced a therapeutic development candidate antibody ANB020 for IL-33 using its own somatic hypermutation technology (SHM-XEL) platform.
  • SHM-XEL somatic hypermutation technology
  • Non-patent literature 11 Hamza Suria, 'AnaptysBio announces development of novel anti-IL-33 therapeutic antibody', [on line], 2014, [retrieved on 11 January 2014], Retrieved from Internet: ⁇ URL: http: // www.anaptysbio.com/anti-il-33/>
  • Murphy et al. Obtained 20 types of human anti-IL-33 monoclonal antibodies using VelocImmune mice, which are mice into which variable regions of human antibodies have been introduced (Patent Document 5).
  • the epitope of the antibody is not disclosed, and the amino acid sequence of the framework region of 20 types of human anti-IL-33 monoclonal antibodies differs from the human germline amino acid sequence by 2 amino acid residues or more. Therefore, when these antibodies are administered to humans, an immune response to the antibodies is induced, and human anti-human immunoglobulin antibodies (HAHA) are induced to reduce the action effect and induce inflammation and other side effects.
  • HAHA human anti-human immunoglobulin antibodies
  • an anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having an antagonistic action of IL-33 is desired.
  • the action of an anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is closely related to the region of the epitope to which the antibody binds. Since IL-33 is released to the outside of the cell with cell destruction, it is highly likely to be cleaved by lysosomal proteolytic enzymes and the like. Many fragments with 33 activities can be generated.
  • a monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence of IL-33 is more effective than a monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a discontinuous amino acid sequence if the fragment contains an epitope consisting of the continuous amino acid sequence. Is also advantageous because it strongly binds to one continuous amino acid sequence of the fragment and inhibits the binding between the fragment and the IL-33 receptor. However, it has still been difficult to identify an epitope consisting of such a continuous amino acid sequence to generate an IL-33 monoclonal antibody having a desired antagonistic action.
  • the anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence of IL-33 desirably has low antigenicity when administered to humans or the like.
  • the antigenicity is low when administered to humans, and the framework region is preferably a human germline amino acid sequence or a combination thereof.
  • the SHM-XEL platform or the like is applied to human antibodies contained in a human antibody gene library, amino acid sequence mutations are introduced not only in the complementarity determining region but also in the framework region.
  • an epitope consisting of a continuous amino acid sequence present at positions 101-154 or 199-270, particularly at positions 111-130, 131-150, 231-250, or 251-270 The inventors have found that an epitope consisting of a continuous amino acid sequence is important from the viewpoint of the antagonistic action of an antibody that binds to the epitope, resulting in the present invention.
  • the present inventors have isolated a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody from a human antibody library, and further introduced a mutation only into its complementarity determining region, so that the complementarity determining region has high binding properties and good physical properties. Identified.
  • a human antibody that does not contain a mutation in the amino acid sequence of the germline framework region and that binds to human IL-33 and neutralizes its function could be obtained.
  • the present invention thus relates to the following inventions:
  • Epitopes consisting of consecutive amino acid sequences contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing are 111 to 130 and 131 to 150 in SEQ ID NO: 226 of the sequence listing.
  • Item 2 The antibody according to Item 1, wherein the antibody is an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 231 to 250 or 251 to 270.
  • An epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is P118, I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127. , Y129, N130, D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, D244, N245, H246, K266, L267, S268, and E269 Item 3.
  • the antibody according to Item 1 or 2 which is an epitope consisting of an amino acid sequence containing the amino acid.
  • Epitopes consisting of consecutive amino acid sequences contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing are 111 to 130 and 131 to 150 in SEQ ID NO: 226 of the sequence listing.
  • An epitope comprising a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is represented by positions 138 to 147 or 139 to 147 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing. 5.
  • An antibody according to any one of [7] A monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is expressed between IL-33 receptor and IL-33. 7.
  • a pharmaceutical composition for treating, preventing or alleviating an IL-33-related disease comprising the antibody according to any one of items 1 to 7.
  • a cytokine expression inhibitor comprising the antibody according to any one of items 1 to 7.
  • the inhibitor according to item 9 which suppresses the expression of TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6 or IL-13.
  • the inhibitor according to item 9 or 10 which suppresses the expression of IFN- ⁇ , IL-5, IL-6 or IL-13.
  • the monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the light chain is the residue 1 to residue 22 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of the framework region 2 of the light chain is the residue of SEQ ID NO: 317 of the sequence listing 36 to residue 50
  • the amino acid sequence of framework region 3 of the light chain is from residue 58 to residue 89 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 4 of the light chain is SEQ ID NO: of the sequence listing 401 of residue 3 to residue 12
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the heavy chain is residue 1 to residue 30 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing or residue 1 of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 2 of the heavy chain is the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing, or the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing
  • the heavy chain frame War The amino acid sequence of region 3 is the residue 67 to residue
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the light chain is the residue 1 to residue 22 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of the framework region 2 of the light chain is the residue of SEQ ID NO: 317 of the sequence listing 36 to residue 50
  • the amino acid sequence of framework region 3 of the light chain is from residue 58 to residue 89 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 4 of the light chain is SEQ ID NO: of the sequence listing 401, residue 3 to residue 12
  • the amino acid sequence of heavy chain framework region 1 is the residue 1 to residue 30 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of heavy chain framework region 2 Is the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of the heavy chain framework region 3 is the residue 67 to residue 98 of SEQ ID NO: 368 in the
  • Light chain complementarity determining region 1 (LCDR1), light chain complementarity determining region 2 (LCDR2), light chain complementarity determining region 3 (LCDR3), heavy chain complementarity determining region 1 (HCDR1)
  • LCDR2 light chain complementarity determining region 2
  • LCDR3 light chain complementarity determining region 3
  • HCDR1 The combination of the amino acid sequences of the heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) and the heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) is selected from the combinations represented by C1 to C30 in Table 1. Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody.
  • Light chain complementarity determining region 1 (LCDR1), light chain complementarity determining region 2 (LCDR2), light chain complementarity determining region 3 (LCDR3), heavy chain complementarity determining region 1 (HCDR1)
  • Item 18 is a combination of amino acid sequences of heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) and heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) selected from the combinations represented by C1 to C28 in Table 1.
  • LCDR1 Light chain complementarity determining region 1
  • LCDR2 light chain complementarity determining region 2
  • LCDR3 light chain complementarity determining region 3
  • HCDR1 heavy chain complementarity determining region 1
  • the combinations of the amino acid sequences of the heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) and the heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) are the combinations shown in Table 1, C1, C8, C15, C17 and C18.
  • Item 20 The human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to item 18 or 19, comprising the selected amino acid sequence.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 20, wherein the amino acid sequence of the framework region of the antibody is an amino acid sequence of a germline framework region or a combination thereof.
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the light chain is the residue 1 to residue 22 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 2 of the light chain is the residue of SEQ ID NO: 317 of the sequence listing 36 to residue 50
  • the amino acid sequence of framework region 3 of the light chain is from residue 58 to residue 89 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 4 of the light chain is SEQ ID NO: of the sequence listing 401 of residue 3 to residue 12
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the heavy chain is residue 1 to residue 30 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing or residue 1 of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing To residue 30, the amino acid sequence of framework region 2 of the heavy chain is the residue
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 21, which is residues 5 to 15 of SEQ ID NO: 407 in the sequence table. [23] The human anti-IL-33 according to any of items 18 to 22, wherein the combination of amino acid sequences of the light chain variable region and the heavy chain variable region is selected from the combinations represented by V1 to V30 in Table 2 Neutralizing monoclonal antibody. [24] The human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to item 23, wherein the combination of the amino acid sequences of the light chain variable region and the heavy chain variable region is selected from the combinations represented by V1 to V28 in Table 2.
  • IL-33 neutralizing monoclonal antibody [26] The human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 25, wherein the light chain is a ⁇ chain. [27] The human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 26, wherein the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is IgG.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 27, wherein the antigen is human IL-33 and monkey IL-33.
  • LCDR1 Light chain complementarity determining region 1
  • LCDR2 light chain complementarity determining region 2
  • LCDR3 light chain complementarity determining region 3
  • HCDR1 A combination of nucleic acid sequences encoding the respective amino acid sequences of the heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) and the heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) is selected from the combinations indicated by CN1 to CN30 in Table 3 30.
  • a vector comprising the nucleic acid molecule according to item 29 or 30.
  • a host cell comprising the vector according to item 31.
  • a cytokine expression inhibitor comprising the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 28.
  • the inhibitor according to item 34 which suppresses the expression of TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6 or IL-13.
  • the inhibitor according to item 34 or 35 which suppresses the expression of IFN- ⁇ , IL-5, IL-6 or IL-13.
  • a pharmaceutical composition comprising the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to any of items 18 to 28.
  • the pharmaceutical composition according to item 37 for prevention, treatment or alleviation of IL-33-related diseases.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic Erythromatodes, pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cirrhosis), pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute kidney injury, vasculitis 39.
  • the pharmaceutical composition according to item 38 selected from the group consisting of cancer and cancer.
  • An anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody whose binding to IL-33 competes with the antibody according to item 20 or 25.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic Erythromatodes, pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cirrhosis), pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute kidney injury, vasculitis 42.
  • the method of item 41 wherein the method is selected from the group consisting of cancer.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic Erythromatodes, pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cirrhosis), pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute kidney injury, vasculitis And use according to item 43, selected from the group consisting of and cancer.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic Erythromatodes, pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cirrhosis), pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute kidney injury, vasculitis 46.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic Erythromatodes, pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cir
  • a method for treating, preventing or alleviating a patient in need of cytokine expression suppression comprising administering to the subject the antibody according to any of items 1 to 7 and 18 to 28 ,Method.
  • the method of item 47, wherein the cytokine is TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6 or IL-13.
  • the use according to item 49, wherein the cytokine is TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6 or IL-13.
  • the monoclonal antibody that binds to the epitope of the present invention binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence, even when IL-33 is degraded and fragmented, it binds strongly to one continuous amino acid sequence, Neutralizing action is easily exhibited.
  • the monoclonal antibody of the present invention is difficult to induce human anti-human immunoglobulin antibody (HAHA) against the antibody framework region and / or complementarity determining region when administered to humans. If not inhibited by HAHA, the effect of neutralizing IL-33 in vivo persists. It is a safe antibody unless it causes inflammation caused by binding to HAHA. Since the monoclonal antibody of the present invention can bind to human IL-33 and neutralize its function, it can be used as a new diagnostic, preventive, therapeutic or alleviating drug for IL-33-related diseases.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating each domain and cleavage site of IL-33 protein.
  • FIG. 2 is a view showing the binding activity of each antibody to human IL-33 protein (residues 112 to 270) and partial peptide fragments (PEP11 to 26).
  • FIG. 3 shows a modeled three-dimensional structure of a complex of mature human IL-33 (residues 117 to 270) (described as “S117-T270” in the figure) and human ST2 (hST2). It is a figure.
  • FIG. 4 shows a part of the PEP12 epitope of human IL-33 (positions 117 to 130 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing) in the three-dimensional structure modeling of FIG.
  • FIG. 5 shows only the PEP14 epitope of human IL-33 and human ST2 in the three-dimensional structure modeling of FIG.
  • FIG. 6 shows only the PEP24 epitope of human IL-33 and human ST2 in the three-dimensional structure modeling of FIG.
  • FIG. 7 shows only the PEP26 epitope of human IL-33 and human ST2 in the three-dimensional structure modeling of FIG.
  • FIG. 8 shows the effects of the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody A25-3H04 on inflammation induced by intraperitoneal administration of human IL-33.
  • FIG. 9 shows the effects of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 and A26-1F02 on inflammation induced by intraperitoneal administration of human IL-33. It is a figure based on the mass, blood eosinophil count, blood basophil count, blood neutrophil count, serum IgA concentration, serum IgE concentration).
  • FIG. 9 shows the effects of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02 and A26-1F02 on inflammation induced by intraperitoneal administration of human IL-33. It is a figure based on the mass, blood eosinophil count, blood basophil count, blood neutrophil count, serum IgA concentration, serum IgE concentration).
  • FIG. 10 is a graph showing changes in plasma concentrations of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies (A23-1A05, A25-3H04, A26-1F02, A10-1C04, A25-2C02) in mice.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in monkey serum concentrations of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies (A10-1C04, A23-1A05).
  • an epitope refers to a part of an antigen recognized by an antibody.
  • an epitope relates to a sequence consisting of consecutive amino acids necessary for antibody recognition.
  • the phrase “monoclonal antibody” binds to an epitope means that a monoclonal antibody binds to an epitope peptide to form one complex.
  • the binding between the monoclonal antibody and the epitope depends on ionic bond, hydrogen bond, hydrophobic bond, van der Waals force, etc., but is not limited thereto.
  • Whether a monoclonal antibody binds to an epitope can be examined, for example, using a peptide array scan or KinExA described herein.
  • antibody in the present invention, the term “antibody” is used in the broadest sense, and includes a monoclonal antibody and a polyclonal antibody as long as a desired specific binding property is shown.
  • the antibody in the present invention may be an antibody derived from any animal such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • a monoclonal antibody refers to an antibody in an antibody population consisting of only a single clone (single molecular species) in the designed amino acid sequence.
  • Monoclonal antibodies shall include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, multispecific antibodies, and artificial antibodies, as well as functionally modified antibodies thereof, as well as conjugated antibodies thereof, and fragments thereof.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced using any known method such as a hybridoma method, a phage display method, and a genetic engineering method.
  • a chimeric antibody refers to an antibody in which the light chain, the heavy chain, or both are composed of a non-human-derived variable region and a human-derived constant region.
  • a humanized antibody refers to an antibody consisting of a variable region composed of a complementarity determining region of a non-human-derived antibody and a framework region derived from a human antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • human antibody refers to an antibody derived from a human both in the light chain and the heavy chain. Due to the difference in the constant region of the heavy chain, human antibodies include IgG having IgG heavy chain (including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4), IgM having ⁇ heavy chain, IgA having ⁇ heavy chain (Including IgA1 and IgA2), IgD having a heavy chain of ⁇ chain, or IgE having a heavy chain of ⁇ chain.
  • the light chain includes either a kappa chain or a lambda chain.
  • a multispecific antibody is an asymmetric antibody having two or more independent antigen recognition sites having two or more different antigen specificities, a bispecific antibody having two antigen specificities, and three antigen specificities. And the like.
  • One or more antigens recognized by the multispecific antibody of the present invention is an IL-33 molecule.
  • the artificial antibody is, for example, a protein scaffold and is an artificial antibody having a function similar to that of an antibody although it does not have an antibody structure.
  • the protein scaffold As the protein scaffold, the Kunitz domain of human serine protease inhibitor, the extracellular domain of human fibronectin, ankyrin, lipocalin, etc. can be used.
  • a protein scaffold that binds can be generated (Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol. 11 (2), pp40-48).
  • a function-modified antibody mainly regulates the cell killing function, complement activation function, blood half-life, etc. other than the antigen binding function of the antibody by modifying the amino acid and sugar chain of the Fc region of the antibody.
  • Antibody mainly regulates the cell killing function, complement activation function, blood half-life, etc. other than the antigen binding function of the antibody by modifying the amino acid and sugar chain of the Fc region of the antibody.
  • conjugate antibody refers to a functional molecule other than an antibody such as a non-peptidic polymer such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, a toxin, a low molecular weight compound, a cytokine, albumin, or an enzyme chemically or genetically engineered. Refers to an antibody bound to.
  • a non-peptidic polymer such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, a toxin, a low molecular weight compound, a cytokine, albumin, or an enzyme chemically or genetically engineered.
  • an antibody fragment is a protein containing a part of an antibody and capable of binding to an antigen.
  • antibody fragments include Fab fragments, Fv fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, or scFv.
  • these antibody fragments chemically or genetically link functional molecules other than antibodies such as non-peptidic polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive materials, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, albumin, and enzymes. You may do it.
  • IL-33 is a cytokine belonging to the IL-1 family, and human IL-33 consists of 270 amino acids as shown in SEQ ID NO: 226 in the Sequence Listing.
  • IL-33 has a chromatin-binding domain on the N-terminal side, an IL-1-like cytokine domain having a molecular weight of 18 kDa with 12 ⁇ -strands on the C-terminal side, and cathepsins at the 95th and 109th positions. It has a G cleavage site, an esterase cleavage site at position 99 and a caspase cleavage site at position 178 (FIG. 1).
  • IL-33 is cleaved by an enzyme such as lysosome-derived esterase, cathepsin G, or proteinase 3 in the process of necrosis in the cell, and mature IL-33 such as IL-33 (residue from residue 95) (Group 270) (IL-33 represented by the amino acid sequence from the 95th position to the 270th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is referred to as "IL-33 (residue 95 to residue 270)." ), IL-33 (residues 99 to 270), IL-33 (residues 109 to 270), IL-33 (residues 112 to 270), and the like, It is thought to function as a cytokine.
  • an enzyme such as lysosome-derived esterase, cathepsin G, or proteinase 3 in the process of necrosis in the cell
  • mature IL-33 such as
  • IL-33 is cleaved at position 178 by caspase activated during the process of apoptosis, and inactivated IL-33, such as IL-33 (from residue 179). Residue 270).
  • IL-33 when released extracellularly as a cytokine, binds to the IL-33 receptor and has a function of initiating intracellular signal transduction in cells that express the IL-33 receptor.
  • Signal transduction induced by IL-33 includes, but is not limited to, the NF- ⁇ B pathway and the MAPKKs pathway, and ultimately induces production of various cytokines, chemokines, and inflammatory mediators.
  • Examples of cytokines induced by IL-33 include TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, and particularly IFN.
  • - ⁇ , IL-5, IL-6, and IL-13 are induced.
  • chemokines induced by IL-33 include CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, and CCL24.
  • inflammatory mediators induced by IL-33 include PGD2 and LTB4.
  • IL-33-induced cytokines, chemokines, and inflammatory mediators are involved in immune system cell migration, cytokine production, and degranulation to cause inflammation.
  • IL-33 may refer to either full-length IL-33 or an active fragment thereof, as long as it acts by binding to the IL-33 receptor described below. It may be a mutant.
  • human IL-33 or IL-33 derived from other organisms may be used. Among these, human IL-33 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is preferable.
  • the IL-33 receptor to which IL-33 binds is composed of a heterodimer of ST2 and IL-1RAcP (IL-1 receptor accessorite protein).
  • IL-33 receptor a site that specifically recognizes and binds to IL-33 exists in the extracellular domain of ST2.
  • IL-33 receptors are expressed in various immune system cells (Th2 cells, mast cells, eosinophils, basophils, macrophages, dendritic cells, NK cells, NKT cells, group 2 natural lymphocytes (natural helper cells). , Nucleate, Ih2 (innate helper type 2) cells, etc.) and epithelial cells, but are not limited to these cells.
  • the IL-33-related disease means a disease caused by excessive release of IL-33 to the outside of the cell, and the IL-33-related disease can inhibit the function of IL-33. Can prevent, treat or alleviate.
  • IL-33 related diseases include asthma, atopic dermatitis, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), Crohn's disease, ulcerative colitis, arthritis, systemic lupus erythematosus , Pemphigus, pemphigoid, scleroderma, ankylosing spondylitis, liver fibrosis (including primary biliary cirrhosis), pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute kidney injury, vasculitis and Cancer is mentioned.
  • sinusitis including eosinophilic sinusitis
  • Crohn's disease ulcerative colitis
  • arthritis systemic lupus erythematosus
  • Pemphigus including primary biliary cirrhosis
  • pulmonary fibrosis including chronic obstructive pulmonary disease (COPD)
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the framework region refers to a portion other than the complementarity determining region in the variable region of an immunoglobulin molecule.
  • framework regions of immunoglobulin molecules are determined according to the Kabat numbering system (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
  • Germline means a group of germ cells, such as sperm and eggs, and unless otherwise stated, refers to the human germline. Unlike B lymphocytes that produce antibodies, germline immunoglobulin genes are not mutated. Therefore, when “the amino acid sequence of the germline framework region” is described, it means an amino acid sequence in which no mutation has occurred in the amino acid sequence of the immunoglobulin framework region, and "the amino acid sequence of the germline framework region” In the case of “combined amino acid sequences” means that the amino acid sequence of one or more framework regions of the four framework regions is the amino acid sequence of another germline framework region.
  • Human immunoglobulin light chain variable region genes are divided into V ⁇ and J ⁇ segments in the ⁇ chain, and V ⁇ and J ⁇ segments in the ⁇ chain, and framework regions 1 to 3 are divided into the V ⁇ and V ⁇ segments.
  • a framework region 4 exists in the J ⁇ segment and the J ⁇ segment.
  • the heavy chain variable region gene of human immunoglobulin is divided into a VH segment, a DH segment, and a JH segment.
  • Framework region 1 to frame region 3 exist in the VH segment, and framework region 4 exists in the JH segment.
  • Table 4 shows the germline amino acid sequences of the human immunoglobulin V ⁇ , V ⁇ , VH, J ⁇ , J ⁇ , and JH segments.
  • a human monoclonal antibody refers to a monoclonal antibody having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • the variable region of a human monoclonal antibody may be a recombinant with a part or all of the variable region of another human monoclonal antibody, and from the viewpoint of not affecting the binding property of the antibody in the recombinant. From the viewpoint that recombination may occur at the boundary between the work region and the complementarity-determining region, and the immunogenicity is not increased, each region of the framework region from framework region 1 to framework region 4 is another human monoclonal antibody. Recombination may occur with each of the framework regions 1 to 4 in the framework region 1.
  • the human monoclonal antibody may be a variant of the human monoclonal antibody, and in order to reduce the immunogenicity while maintaining or improving the binding to the antigen, the complementation of the human monoclonal antibody is determined.
  • a human monoclonal antibody comprising an amino acid sequence of a complementarity determining region having a mutation in the region and an amino acid sequence of a germline framework region having no mutation in the framework region is preferred.
  • Isolated by an isolated antibody means identified and separated and / or recovered from a component in its natural state. Impurities in the natural state are substances that can interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody and include enzymes, hormones and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes.
  • an antibody may be isolated by at least one purification step, and an antibody purified by at least one purification step can be referred to as an “isolated antibody”.
  • neutralization refers to an action capable of binding to a target of interest and inhibiting any function of the target. That is, “anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody” shall mean a monoclonal antibody whose binding to IL-33 results in inhibition of biological activity induced by the IL-33 polypeptide. Inhibition of biological activity of IL-33 includes, but is not limited to, inhibition of production of IL-33-induced cytokines such as IL-6. An indicator of the biological activity of IL-33 can be assessed by one or more of several in vitro or in vivo analyzes known in the art. The term “human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody” means a human monoclonal antibody that binds to IL-33 and inhibits any function of IL-33.
  • an “antagonist” means a general term for substances having a neutralizing action on a target of interest. That is, an “IL-33 antagonist” is a substance that can bind to IL-33 and inhibit any function of IL-33, and includes, for example, an anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody.
  • the complementarity determining region refers to a region that forms an antigen-binding site in the variable region of an immunoglobulin molecule, and is also referred to as a hypervariable region, and refers to a portion that has a particularly large change in amino acid sequence for each immunoglobulin molecule.
  • there are three complementarity determining regions (complementarity determining region 1, complementarity determining region 2 and complementarity determining region 3) in each of the light chain and the heavy chain.
  • complementarity determining regions of immunoglobulin molecules are determined according to the Kabat numbering system (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
  • “competing” with a monoclonal antibody means that there is a significant difference in IL-33 due to the presence of the monoclonal antibody as measured by the surface plasmon resonance (SPR) method described herein. It means that the bond with is lowered.
  • “competing anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody” refers to a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a multispecific antibody, an artificial antibody, a functionally modified antibody thereof, and a conjugate antibody thereof, and Those fragments shall be included.
  • the present invention relates to monoclonal antibodies that bind to an epitope of IL-33. Since a monoclonal antibody that binds to this epitope can neutralize the activity of human IL-33, the epitope corresponds to positions 101 to 154 or 199 to 270 of human IL-33 shown in SEQ ID NO: 226 in the Sequence Listing. It is preferably an amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 226 in the sequence listing, and positions 111 to 130 (PEP12), 131 to 150 (PEP14), 231 to 250 (PEP24), or 251 to 270 in SEQ ID NO: 226. The amino acid sequence contained in (PEP26) is more preferred. IL-33 is often cleaved when released outside the cell.
  • the folding may be disrupted by cleavage of IL-33, or the separated amino acid residues that constitute the epitope When the group disappears from the fragment, the affinity with the fragment may be significantly reduced. Therefore, the epitope to which the anti-IL-33 monoclonal antibody binds is preferably a continuous amino acid sequence.
  • preferred epitopes are preferably located not only on the surface of IL-33 protein but also in close proximity to the IL-33 receptor. Therefore, the present inventors performed three-dimensional structure modeling based on the crystal structure analysis data shown in Non-Patent Document 11 as described in the examples described later, and the atoms constituting the nearest IL-33 receptor and An amino acid containing an IL-33 atom (interfacial atom) having an interatomic distance of 5 km or less was identified.
  • P118 of PEP12 As amino acids containing an interfacial atom, P118 of PEP12 (the proline residue at position 118 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is expressed as “P118”, hereinafter the same), I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129, N130, P131 D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, PEP24 D244, N245, H246, P266 26 K266, L267, S268, E269 may be mentioned.
  • an epitope having an amino acid containing an interface atom is preferable.
  • the neutralizing action of a monoclonal antibody that specifically binds to a functional epitope is thought to depend on the number of interface atoms present in the functional epitope and the position of the interface atoms in the three-dimensional structure. Not intended to be bound.
  • an epitope comprising a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is represented by positions 111 to 130 (SEQ ID NO: 226 of the sequence listing).
  • PEP12 monoclonal antibody which is an epitope consisting of a continuous amino acid sequence from position 131 to position 150 (PEP14), position 231 to position 250 (PEP24) or position 251 to position 270 (PEP26).
  • a more preferred embodiment of the present invention includes a monoclonal antibody, wherein the epitope is an epitope consisting of a continuous amino acid sequence at positions 138 to 147 or positions 139 to 147 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing.
  • the present inventors examined the minimum amino acid sequence constituting the epitope using two types of monoclonal antibodies that bind to PEP14. As a result, the IL-33 epitope was determined as positions 138 to 147 of SEQ ID NO: 226. And a contiguous amino acid sequence from positions 139 to 147 was identified. Therefore, the present invention relates to an epitope comprising a continuous amino acid sequence at positions 138 to 147 and positions 139 to 147 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing.
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that binds to the epitope of the present invention is examined by a method generally practiced in the art such as ELISA method, immunoprecipitation method, surface plasmon resonance (SPR) method, KinExA method. be able to.
  • a method generally practiced in the art such as ELISA method, immunoprecipitation method, surface plasmon resonance (SPR) method, KinExA method.
  • the dissociation constant (Kd) can be measured by the method described in Examples of the present application using the KinExA method, but the dissociation constant for the epitope peptide is preferably low, for example, 10 ⁇ M or less, 1 ⁇ M or less, 100 nM or less, 10 nM. Hereinafter, it is preferably 1 nM or less, 100 pM or less, or 10 pM or less.
  • a pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing of the present invention.
  • a method for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of an IL-33 related disease comprising administering the monoclonal antibody of the present invention, and production of a medicament for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of an IL-33 related disease It relates to the use of the monoclonal antibodies of the invention.
  • IL-33 related diseases include, but are not limited to, asthma, atopic dermatitis, urticaria, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), allergic cerebrospinal spinal cord Inflammation, hypereosinophilic syndrome, polymyalgia rheumatica, rheumatic heart disease, multiple sclerosis, arthritis (eg, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, psoriatic arthritis, osteoarthritis, Reiter syndrome), Systemic lupus erythematosus (including discoid lupus), pemphigus, pemphigoid, psoriasis, ankylosing spondylitis, hepatitis (eg, autoimmune hepatitis, chronic active hepatitis, etc.), inflammatory bowel disease (eg, Ulcerative colitis, Crohn's disease, gluten-sensitive enteropathy etc.), Sjogren'
  • a cytokine, chemokine or inflammation comprising a monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing It exists also in the expression inhibitor of sex mediator.
  • Cytokines suppressed by the cytokine, chemokine or inflammatory mediator expression inhibitor of the present invention are cytokines induced by IL-33, such as TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-13 and the like.
  • chemokines that are suppressed by the inhibitor are chemokines induced by IL-33, and examples thereof include CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, and CCL24.
  • the inflammatory mediator suppressed by the inhibitor is an inflammatory mediator induced by IL-33, and examples thereof include PGD2, LTB4 and the like.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is an expression inhibitor of IFN- ⁇ , IL-5, IL-6 or IL-13, including an anti-IL-33 monoclonal antibody, more preferably an inhibitor of IL-6 production. .
  • an epitope to which an anti-IL-33 monoclonal antibody binds.
  • an epitope relates to a sequence consisting of 6 to 20 amino acids necessary for antibody recognition.
  • the amino acid sequence is a continuous amino acid sequence that does not include a discontinuous amino acid sequence, although it may constitute an additional epitope including amino acids surrounding the identified sequence or amino acids that are close in structure. It is preferable.
  • the number of amino acid residues in the continuous amino acid sequence constituting the epitope of the present invention is at least 5, preferably at least 6, more preferably at least 7, further preferably at least 8, and even more preferably at least 9. Furthermore, from the viewpoint of exhibiting sufficient antigenicity, it is at least 10, more preferably 15, and further preferably at least 20.
  • the sequence contained in the epitope becomes longer, there is a possibility that a plurality of parts recognized by the antibody are included. In such a case, there is a possibility that generation or screening of an antibody having a desired neutralizing action cannot be performed. Arise.
  • the length of the epitope sequence is preferably 30 or less, more preferably 20 or less, even more Preferably it is 15 or less.
  • the number of residues of the continuous amino acid sequence included in the epitope for example, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, It is the number of residues selected from one of 17, 17, 18, 19, and 20.
  • the epitope does not change its antigenicity, one or several amino acid mutations, that is, amino acid substitutions, deletions or insertions may be introduced.
  • the number of mutations to be introduced is preferably 5 or less, more preferably 3 or less, and most preferably 1.
  • the epitope may be modified, for example, a modification of a sugar chain or the like that the original protein had, or a terminal modification. In another embodiment, at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, relative to the sequence consisting of consecutive amino acids of the epitope specified in the present invention, unless the antigenicity is changed. It may even be an epitope consisting of an amino acid sequence having at least 98%, most preferably 99% sequence identity.
  • the epitope peptide may be added with a tag such as histidine or biotin when used as a bait, and may be combined with a carrier protein such as KLH when used as a vaccine.
  • Percent (%) sequence identity refers to any conservative substitutions that align sequences and introduce gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity. Defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues of a particular reference polypeptide sequence after not being considered part of the identity. Alignments for the purpose of measuring percent amino acid sequence identity are publicly available such as various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software This can be achieved by using simple computer software. One skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.
  • % amino acid sequence identity values are obtained by using the sequence comparison computer program BLAST in pairwise alignments.
  • the% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with a given amino acid sequence B is calculated as follows: 100 times the fraction X / Y where X is the number of amino acid residues with a score that is identical by the program alignment of A and B of the sequence alignment program BLAST, and Y is the total number of amino acid residues of B It is. It will be understood that if the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B is different from the% amino acid sequence identity of B to A. Unless otherwise indicated, all% amino acid sequence identity values herein are obtained using the BLAST computer program as set forth in the immediately preceding paragraph.
  • the epitope found by the present invention is a functional epitope to which a neutralizing antibody of IL-33 specifically binds. Therefore, by using the functional epitope of the present invention, for example, a novel antibody having an antagonistic action of IL-33 can be efficiently obtained. That is, a monoclonal antibody having an antagonistic action can be obtained by screening an antibody that binds to a functional epitope of the present invention against a group of monoclonal antibodies against full-length IL-33 or mature IL-33. . Accordingly, in a further aspect of the present invention, the present invention also relates to a method for screening an antibody having an antagonistic action using a functional epitope of IL-33.
  • IL-33 antagonistic action when enriching a clone of an antibody having an IL-33 antagonistic action from a naive antibody library by a phage display technique or the like, first, library selection is performed using a full-length or mature IL-33 protein as a bait, and IL- By enriching antibody clones that bind to various epitopes on the surface of 33 and then performing library selection using the functional epitope peptide found in the present invention as a bait, IL-specifically binds to the functional epitope. It is possible to efficiently screen antibodies having 33 antagonistic actions.
  • the present inventors examined IL-33 antagonist activity using a monoclonal antibody group in which the binding property to an epitope of 20 residues in length was specified using different antibody concentrations. Thereby, an epitope suitable for generating or screening an antibody having an antagonistic action was determined. According to the results, an epitope selected from the group consisting of positions 111 to 130 (PEP12), 131 to 150 (PEP14), 231 to 250 (PEP24) and 251 to 271 (PEP26) in SEQ ID NO: 226 in the Sequence Listing Since the increase in antagonistic action according to the antibody concentration was clearly observed, it was found that the antibody that binds to is a functional epitope suitable for generating or screening an antibody having antagonistic action.
  • At least one of the regions selected from the group consisting of positions 111 to 130, positions 131 to 150, positions 231 to 250, and positions 251 to 271 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing is provided. It relates to an epitope comprising a sequence of 6, preferably at least 10, more preferably at least 15 consecutive amino acids. In another aspect, the present invention relates to an epitope selected from the group consisting of position 111 to position 130, position 131 to position 150, position 231 to position 250, and position 251 to position 270 of SEQ ID NO: 226 in the Sequence Listing.
  • the epitope can be produced by using a peptide synthesis technique that is usually performed. Manufactured and purified epitopes can be used to immunize animals and produce antibodies against the epitopes. Further, in another method, the purified epitope can be used in a phage display method to generate or screen a monoclonal antibody that binds to the epitope. Epitopes can also be used as vaccines with adjuvants.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that binds to an epitope consisting of a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the Sequence Listing.
  • Monoclonal antibodies shall include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, multispecific antibodies, and artificial antibodies, as well as functionally modified antibodies thereof, as well as conjugated antibodies thereof, and fragments thereof.
  • the monoclonal antibody in the present invention may be an antibody derived from any animal such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced using any known method such as a hybridoma method, a phage display method, and a genetic engineering method.
  • hybridomas are prepared by fusing B cells collected from the spleen or lymph nodes of animals immunized with an immunogen, particularly rats or mice, and immortalized cells, such as myeloma cells, to obtain a desired binding property.
  • an immunogen particularly rats or mice
  • immortalized cells such as myeloma cells
  • a hybridoma that produces an antibody having the above can be screened and produced using the screened hybridoma.
  • a human antibody can be obtained by using a mouse into which a human antibody gene has been introduced.
  • the hybridoma is cultured according to a normal method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and the ascites is obtained.
  • the method of obtaining is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a technique for producing a monoclonal antibody a known technique may be used.
  • the monoclonal antibody can be generated by following the description of Chapter 2 of Current Protocols, Inc., Immunology, Wiley and Sons, Inc.
  • a phage selected from an arbitrary phage antibody library is screened using a target immunogen, and a phage having a desired binding property to the immunogen is selected.
  • an antibody corresponding sequence contained in the phage is isolated or sequenced, and an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding a monoclonal antibody is constructed based on the isolated sequence or the determined sequence information.
  • a monoclonal antibody can be produced by culturing a cell line transfected with such an expression vector.
  • CDR complementarity determining region
  • a chimeric antibody, a humanized antibody, a multispecific antibody, and an artificial antibody can be used for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans or adding another function.
  • These antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is obtained by ligating a DNA encoding a non-human antibody variable region with a DNA encoding a human antibody constant region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP 125023, WO 92 / 19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized antibody is obtained by linking a complementarity determining region (CDR) of a non-human-derived antibody and DNA encoding the other part of the human antibody region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. It is done.
  • CDR complementarity determining region
  • a multispecific antibody is an asymmetric antibody having two or more independent antigen recognition sites having two or more different antigen specificities.
  • Multispecific antibodies such as bispecific antibodies can be prepared by genetic engineering techniques using the antigen-binding regions of two or more monoclonal antibodies.
  • the genetic engineering technique has already been established in this field. For example, it differs depending on the technology of DVD-Ig (Wu et al., Nature Biotechnology 25 (11), 1290 (2007)) in which antigen-binding regions of two types of monoclonal antibodies are connected in series, or by modifying the Fc region of an antibody.
  • the desired bispecific antibody can be obtained using the ART-Ig technique (Kitazawa et al., Nature Medical 18 (10), 1570 (2012)) in which the heavy chains of two types of antibodies that bind to the antigen are combined.
  • the artificial antibody is, for example, a protein scaffold and is an artificial antibody having a function similar to that of an antibody although it does not have an antibody structure.
  • the protein scaffold As the protein scaffold, the Kunitz domain of human serine protease inhibitor, the extracellular domain of human fibronectin, ankyrin, lipocalin, etc. can be used.
  • a protein scaffold that binds can be generated (Patent Document 4, Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11 (2), pp40-48).
  • Such a function-modified antibody is prepared, for example, by the following method.
  • a monoclonal antibody is produced using a CHO cell in which the ⁇ 1,6-fucose transferase (FUT8) gene is disrupted as a host cell, an antibody with a reduced cell chain fucose content and an increased cell killing function can be obtained.
  • FUT8 ⁇ 1,6-fucose transferase
  • an antibody having a low cell killing function can be obtained (International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 2002/31140, International Publication No. 00/61739).
  • the complement activation function can be regulated by modifying amino acid residues in the Fc region (US Pat. No. 6,737,056, US Pat. No. 7,297,775, US Pat. No. 7,317,091).
  • FcRn which is one of the Fc receptors
  • the monoclonal antibody used in the present invention may be, for example, a non-peptide polymer such as polyethylene glycol (PEG), a conjugated antibody bound to various molecules such as radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Chemical modification methods have already been established in this field. Monoclonal antibodies in the present invention also include these conjugate antibodies (DJKing., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 TJ International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol 152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1996 Vol 93: 8681,).
  • antibody fragments include Fab fragments, Fv fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, or single chain Fv (scFv) in which Hv and L chain Fvs are linked by an appropriate linker. It is done.
  • these antibody fragments chemically or genetically link functional molecules other than antibodies such as non-peptidic polymers such as polyethylene glycol (PEG), radioactive materials, toxins, low molecular weight compounds, cytokines, albumin, and enzymes. You may do it.
  • PEG polyethylene glycol
  • in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells such as animal cells, plant cells, or fungal cells, and prokaryotic cells such as production systems using bacterial cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • animal cells to be used mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK, HeLa, Vero, and commonly used cells, insect cells, plant cells and the like may be used.
  • in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When animals are used, for example, there are production systems using mammals and insects.
  • mammals examples include goats, pigs, sheep, mice, and cattle (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • a silkworm can be used, for example.
  • plants for example, tobacco can be used.
  • a DNA encoding a monoclonal antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to Co-transformation may be performed, or DNA encoding H chain and L chain may be incorporated into a single expression vector to transform the host (see International Publication No. WO94 / 11523).
  • the obtained monoclonal antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of monoclonal antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, a monoclonal antibody can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited to these. Examples of columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. For example, as a column using a protein A column, HyperHD, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) and the like can be mentioned.
  • the monoclonal antibody that binds to an epitope comprising a continuous amino acid sequence contained in positions 101 to 154 or positions 199 to 270 of SEQ ID NO: 226 in the sequence listing of the present invention has low antigenicity when administered to humans Therefore, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody are preferable, and a human antibody is most preferable.
  • the amino acid sequence of the framework region is preferably the amino acid sequence of the human germline framework region or a combination thereof. Accordingly, the present invention provides a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody, wherein the amino acid sequence of the framework region of the antibody is the amino acid sequence of the germline framework region or a combination thereof.
  • the framework region of the variable region includes the amino acid sequence of the human germline framework region or a combination thereof, whereby the immunogenicity caused by these regions is increased. While having no or significantly less features, it can bind to IL-33 and interfere with its function. Therefore, when used as a pharmaceutical, the antibody is less likely to induce human anti-human immunoglobulin antibody (HAHA) and is therefore not eliminated in vivo, and as a result, has a long effect of neutralizing IL-33, It is a safe antibody unless it causes inflammation caused by binding to HAHA.
  • HAHA human anti-human immunoglobulin antibody
  • any amino acid sequence in the framework region of the light chain and heavy chain in the human germline can be used as long as the amino acid sequence is in the framework region of the human germline.
  • the DNA of the framework region of the heavy chain variable region and light chain variable region of human antibodies registered in databases such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi) The amino acid sequences encoded by the sequences and the amino acid sequences of the germline framework regions listed in Table 4 are used.
  • the light chain variable region may be a ⁇ chain variable region or a ⁇ chain variable region.
  • the framework region of the light chain and heavy chain in the human germline is preferably a frequently used framework region having a high appearance frequency in vivo.
  • human heavy chain framework regions include VH3-23 and VH3.
  • framework region 1, framework region 2, and framework region 3 such as ⁇ 30, VH4-39, and VH4-34, and framework region 4 such as JH4.
  • framework regions 1, such as V ⁇ 1-47, V ⁇ 2-14, V ⁇ 3-20, and V ⁇ 1-39, framework region 2, and framework region 3 are examples of human light chain framework regions that frequently appear in vivo.
  • Framework area 4 such as J ⁇ 2.
  • the heavy chain framework region can be used in any combination as long as it is a human heavy chain framework region.
  • framework region 1 and framework region 2 of VH3-23 and framework region 3 of VH3-30 can be selected and used as the heavy chain framework region.
  • framework region of the light chain can be used in any combination as long as it is a human light chain framework region.
  • the preferred amino acid sequence of the germline framework region in the present application is the amino acid sequence of the VH3-23, VH3-30, JH4, V ⁇ 1-47, and J ⁇ 2 framework regions.
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the light chain is represented by the residues 1 to 22 in SEQ ID NO: 317 of the sequence listing
  • the amino acid sequence of the framework region 2 of the light chain is represented by SEQ ID NO: 317 of the sequence listing.
  • Residue 36 to residue 50 the light chain framework region 3 amino acid sequence is SEQ ID NO: 317 of residue number 58 to residue 89 in the sequence listing
  • the light chain framework region 4 amino acid sequence is the sequence listing sequence Residue 3 to residue 12 of No.
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the heavy chain is residue 1 to residue 30 of SEQ ID No. 367 of the sequence listing or residue 1 of SEQ ID No. 368 of the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 2 of the heavy chain is the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing, or the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing
  • the heavy chain frame War The amino acid sequence of region 3 is the residue 67 to residue 98 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing, or the residue 67 to residue 98 of SEQ ID NO: 368 of the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 4 of the heavy chain is the sequence listing
  • the framework region which is residues 5 to 15 of SEQ ID NO: 407 is preferred, and the amino acid sequence of the framework region 1 of the light chain is represented by residues 1 to 22 of SEQ ID NO: 317 of the sequence listing.
  • the amino acid sequence of framework region 2 is SEQ ID NO: 317 from residue 36 to residue 50
  • the light chain framework region 3 amino acid sequence is SEQ ID NO: 317 of residue number 58 to residue 89
  • the amino acid sequence of framework region 4 of the light chain is from residue 3 to residue 12 of SEQ ID NO: 401 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 1 of the heavy chain is SEQ ID NO: in the sequence listing 67 residues 1 to 30
  • the heavy chain framework region 2 amino acid sequence is SEQ ID NO: 367 of SEQ ID NO: 367, residue 36 to residue 49
  • heavy chain framework region 3 amino acid sequence is Most preferred is a framework region wherein residues 67 to 98 of SEQ ID NO: 368 and the amino acid sequence of framework region 4 of the heavy chain is residues 5 to 15 of SEQ ID NO: 407 of the Sequence Listing.
  • Another aspect of the present invention includes light chain complementarity determining region 1 (LCDR1), light chain complementarity determining region 2 (LCDR2), light chain complementarity determining region 3 (LCDR3), and heavy chain complementarity.
  • the amino acid sequences of the determining region 1 (HCDR1), the heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2), and the heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) are amino acids of combinations of the complementarity determining regions shown in Table 1.
  • the sequence relates to an isolated human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody.
  • a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having a combination of C1 to C30 complementarity determining regions shown in Table 1 binds to IL-33 receptor and exhibits activity, particularly among IL-33.
  • Mature IL-33 exerting such as IL-33 (residue 95 to residue 270), IL-33 (residue 99 to residue 270), IL-33 (residue 109 to residue 270), IL- 33 (residue 112 to residue 270) and the like have binding and neutralizing activities.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having a combination of C1 to C30 complementarity determining regions shown in Table 1 has binding properties to IL-33 (residue 131 to residue 150). .
  • a preferred embodiment is a combination of complementarity determining regions improved in terms of binding properties and / or physical properties.
  • the upper limit of the dissociation rate constant (koff) for human IL-33 is about 3.5 ⁇ 10 ⁇ 5 / sec or less, more preferably about 2.0 ⁇ 10 ⁇ 5 / sec or less, Preferably it is about 1.5 ⁇ 10 ⁇ 5 / sec or less, and more preferably about 1.0 ⁇ 10 ⁇ 5 / sec or less, and the lower limit is not particularly limited, but for example 10 ⁇ 7 / sec or more, more
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is preferably 10 ⁇ 6 / sec or more, more preferably about 5 ⁇ 10 ⁇ 6 / sec or more.
  • human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies those having a low dissociation constant (Kd) for human IL-33 are more preferred, and the upper limit is, for example, 10 ⁇ 9 M or less, more preferably 10 ⁇ 10 M or less, and even more. Preferably, it is 10 ⁇ 12 M or less, and the lower limit is not particularly limited, and examples thereof include human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies that are 10 ⁇ 14 M or more, more preferably 10 ⁇ 13 or more.
  • Kd dissociation constant
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention inhibits IL-6 production from HUVEC upon stimulation with IL-33, and among them, those having a strong inhibitory effect are preferred.
  • a preferred embodiment of the present invention is that when stimulated with 100 ng / mL IL-33 by adding 1 ⁇ g / mL human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody as described in Example 10 described later.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody has a ratio (inhibition rate) of inhibiting IL-6 production from HUVEC of about 50% or more, more preferably about 70% or more, and even more preferably about 90% or more. Is mentioned.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention inhibits the production of IL-5, IL-6 and / or IL-13 from KU-812 cells upon stimulation with IL-33.
  • those having a strong inhibitory effect are preferable.
  • a preferred embodiment of the present invention is that when stimulated with 100 ng / mL IL-33 by adding 3 ⁇ g / mL human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody as described in Example 11 described later.
  • the ratio (inhibition rate) at which the production of IL-5, IL-6 and / or IL-13 from KU-812 cells is inhibited is about 30% or more, more preferably about 50% or more, and even more preferably about 70% or more human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention inhibits IFN- ⁇ production from human peripheral blood mononuclear cells upon IL-33 stimulation. Among them, those having a strong inhibitory effect are preferable. Specifically, a preferred embodiment of the present invention is that when stimulated with 10 ng / mL IL-33 by adding 10 ⁇ g / mL human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody as described in Example 12 described later.
  • the ratio (inhibition rate) at which IFN- ⁇ production from human peripheral blood mononuclear cells is inhibited is about 80% or more, more preferably about 90% or more, and even more preferably about 95% or more. 33 neutralizing monoclonal antibody.
  • human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention suppresses inflammation when human IL-33 is administered to mice. Among them, those having a strong anti-inflammatory effect are preferable. Specifically, as a preferred embodiment of the present invention, as described in Example 13 described later, human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody was intraperitoneally administered daily for 10 days at 10 mg / kg, thereby giving 0.4 ⁇ g / kg.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody has a ratio of about 30% or more, more preferably about 50% or more, and still more preferably about 80% or more.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention preferably has excellent antibody physical properties.
  • a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody that does not show bimodality in particle size distribution as evaluated by dynamic light scattering and has extremely low aggregation properties is preferable, and an interaction parameter (index of colloid stability) ( Those having a high kD) are preferred, for example, preferably ⁇ 12.4 mL / g or more, more preferably ⁇ 10 mL / g or more, and further preferably ⁇ 8.5 mL / g or more.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention is preferably an antibody having excellent thermodynamic stability.
  • the temperature (Tm) at which the folding of the immunoglobulin domain collapses is 65 ° C. or higher, preferably 68 ° C. or higher. More preferred is an antibody exhibiting thermodynamic stability that is 70 ° C. or higher, more preferably 73 ° C. or higher.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention preferably has excellent antibody stability.
  • the stability of the antibody can be measured by a general method such as a storage stability test or a forced oxidation test.
  • a storage stability test for example, as a preferred embodiment of the present invention, as described in Example 21 described later, the ratio of the monomer of the antibody molecule is preferably 90% or more, more preferably when stored at 40 ° C. for 4 weeks. Is 95% or more, and the binding activity to human IL-33 protein is preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
  • the binding activity to human IL-33 protein is 80% or more, more preferably 85% when forced oxidation is performed with 1% hydrogen peroxide solution at 37 ° C. for 24 hours. % Or more, more preferably 90% or more.
  • a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody selected from a combination of C1 to C28 complementarity determining regions in Table 1 is a more preferred antibody.
  • a further preferred embodiment of the present invention includes a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having a combination of amino acid sequences of specific complementarity determining regions (C1, C8, C15, C17 or C18 in Table 1). .
  • the amino acid sequence of the framework region in the variable region of the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody specified by the combination of the amino acid sequences of the complementarity determining regions is any framework region as long as antigen binding is ensured. It may be. From the viewpoint of reducing human immunogenicity, the amino acid sequence of the framework region is preferably the amino acid sequence of each amino acid sequence of the human germline framework region or a combination thereof. Amino acid sequence of the germline framework region.
  • a preferred amino acid sequence of the framework region in the present invention is that the amino acid sequence of the light chain framework region 1 is the residue 1 to residue 22 of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the light chain framework region 2 is SEQ ID NO: 317, residue 36 to residue 50, light chain framework region 3 amino acid sequence from SEQ ID NO: 317, residue 58 to residue 89, and light chain framework region 4
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 401 is from residue 3 to residue 12
  • the heavy chain framework region 1 amino acid sequence is from SEQ ID NO: 367 of residue number 1 to residue 30 or Residues 1 to 30 of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 2 of the heavy chain is from residues 36 to 49 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing, or SEQ ID NO: 3 of the sequence listing 8 residues 36 to 49
  • the amino acid sequence of framework region 3 of the heavy chain is the residues 67 to 98 of SEQ ID NO: 3
  • More preferred framework region amino acid sequences of the present invention are the light chain framework region 1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 317 in the sequence listing, residue 1 to residue 22, light chain framework region 2 amino acid sequence Is the residue 36 to residue 50 of SEQ ID NO: 317, the amino acid sequence of the light chain framework region 3 is residue 58 to residue 89 of SEQ ID NO: 317 of the sequence listing, and the light chain framework region
  • the amino acid sequence of 4 is from residue 3 to residue 12 of SEQ ID NO: 401 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of heavy chain framework region 1 is from residue 1 to residue 30 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 2 of the heavy chain is the residue 36 to residue 49 of SEQ ID NO: 367 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of framework region 3 of the heavy chain is the remainder of SEQ ID NO: 368 in the sequence listing 67 residues 98 to
  • the amino acid sequence of the heavy chain framework region 4 is the residue 15 residues 5 of SEQ ID
  • a preferred embodiment of the present invention is a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having a combination of variable regions from V1 to 28 in Table 2.
  • a more preferred embodiment of the present invention is a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody having a combination of amino acid sequences of specific complementarity determining regions (V1, V8, V15, V17 or V18 in Table 2).
  • Human immunoglobulin molecules have IgG (including IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4), each having a heavy chain of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, or ⁇ chain, depending on the constant region of the heavy chain , IgM, IgA (including IgA1 and IgA2), IgD or IgE are present, and the constant region of the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention includes all of them.
  • the light chain includes both ⁇ chain and ⁇ chain depending on the position on the chromosome, but includes both.
  • the ⁇ chain is preferable, but the ⁇ chain has an amino acid sequence different from that of the ⁇ chain, and the light chain of the ⁇ chain is as diverse as the ⁇ chain. Antibodies having these are also useful.
  • the light chain is preferably ⁇ chain
  • the heavy chain is preferably ⁇ chain IgG
  • the light chain is ⁇ chain. More preferably, the heavy chain is IgG1 which is a ⁇ 1 chain.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention preferably binds to monkey IL-33. More preferably, it binds to monkey IL-33 with an affinity comparable to ⁇ 33. Particularly preferably, in human anti-IL-33, the ratio of koff to monkey IL-33 is within about 20 times, more preferably within about 10 times, and even more preferably within about 5 times. Japanese monoclonal antibody.
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab fragment, Fv fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fab ′ fragment and scFv, and these antibody fragments include polyethylene glycol (PEG) and the like.
  • Functional molecules other than antibodies such as non-peptidic polymers, radioactive substances, toxins, low molecular compounds, cytokines, albumin, and enzymes may be bound.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention can produce a multispecific antibody such as a bispecific antibody by binding an antibody having another antigen binding specificity other than IL-33 to itself. It can.
  • Other antigens other than IL-33 include, but are not limited to, TNF- ⁇ , IL-6 receptor, CD3, CD20, ⁇ 4 integrin, BLys, Thymic Strom Lympoietin, IgE, IL-1, IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, IL-23, IL-25 and the like.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody and the antibody fragment of the present invention can be combined with other functional molecules to form a conjugated antibody, for example, a non-peptidic polymer such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a new function can be added by binding functional molecules such as radioactive substances, toxins, low-molecular compounds, albumin, cytokines, and enzymes.
  • a nucleic acid molecule encoding a protein portion of a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody whose framework region is a germline amino acid sequence, a vector containing the nucleic acid molecule, and a host cell containing the vector And a method for producing a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody by culturing the host cell.
  • the present invention also resides in a composition comprising the above human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody. Since IL-33 causes inflammation and the like, the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is expected to be used for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of IL-33-related diseases. Therefore, one aspect of the present invention resides in a pharmaceutical composition for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of an IL-33-related disease comprising a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody.
  • IL-33 since IL-33 induces cytokines, chemokines, inflammatory mediators, and the like, they also exist in cytokines, chemokines or inflammatory mediator expression inhibitors, including human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies .
  • Cytokines suppressed by the cytokine, chemokine or inflammatory mediator expression inhibitor of the present invention are cytokines induced by IL-33, such as TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-13 and the like.
  • chemokines that are suppressed by the inhibitor are chemokines induced by IL-33, and examples thereof include CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, and CCL24.
  • the inflammatory mediator suppressed by the inhibitor is an inflammatory mediator induced by IL-33, and examples thereof include PGD2, LTB4 and the like.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is an expression inhibitor of IFN- ⁇ , IL-5, IL-6 or IL-13 including a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody, more preferably suppression of IL-6 production. It is an agent.
  • the present invention resides in a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention. Also, a method for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of an IL-33 related disease comprising administering the monoclonal antibody of the present invention, and production of a medicament for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of an IL-33 related disease It relates to the use of the monoclonal antibodies of the invention.
  • IL-33 related diseases include, but are not limited to, asthma, atopic dermatitis, urticaria, hay fever, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), allergic cerebrospinal spinal cord Inflammation, hypereosinophilic syndrome, polymyalgia rheumatica, rheumatic heart disease, multiple sclerosis, arthritis (eg, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, psoriatic arthritis, osteoarthritis, Reiter syndrome), Systemic lupus erythematosus (including discoid lupus), pemphigus, pemphigoid, psoriasis, ankylosing spondylitis, hepatitis (eg, autoimmune hepatitis, chronic active hepatitis, etc.), inflammatory bowel disease (eg, Ulcerative colitis, Crohn's disease, gluten-sensitive enteropathy etc.), Sjogren'
  • the pharmaceutical composition comprising the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention comprises a pharmacologically acceptable carrier in addition to the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody which is an active ingredient and salts thereof, Diluents or excipients may be included. Furthermore, other active ingredients other than the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention, such as anti-inflammatory drugs and immunosuppressants, may be included.
  • Such a composition is provided as a parenteral administration or a dosage form suitable for oral administration, but parenteral administration is preferable from the viewpoint of use as an antibody drug.
  • parenteral administration examples include intravenous, intraarterial, subcutaneous, topical, intraperitoneal, intramuscular, nasal, ophthalmic, transdermal, transmucosal, intrameningeal, rectal, intramuscular, intracerebral, etc. Examples include, but are not limited to these.
  • the pharmaceutical composition can be appropriately formulated depending on its route of administration, and may be any injection, powder, infusion preparation, granule, tablet, suppository, etc., but in terms of parenteral administration, Injectables, infusion preparations, powders that are soluble at the time of use are preferred.
  • These preparations may contain various adjuvants used for pharmaceuticals, that is, additives such as carriers and other auxiliary agents, such as stabilizers, preservatives, soothing agents and emulsifiers.
  • Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies of the invention can be provided, for example, by continuous infusion at intervals of 1 to 7 times per day, 1 week, 1 month or 1 year, or by medication .
  • Dosing can be provided intravenously, subcutaneously, topically, orally, nasally, rectally, intramuscularly, intraventricularly, or by inhalation.
  • a preferred dose protocol is one that includes a maximum dose or dosing frequency that avoids significant undesirable side effects.
  • the overall weekly dose is generally at least about 0.05 ⁇ g / kg body weight, more usually at least about 0.2 ⁇ g / kg, most commonly at least about 0.5 ⁇ g / kg, typically at least about 1 ⁇ g / kg, more typically at least about 10 ⁇ g / kg, most typically at least about 100 ⁇ g / kg, preferably at least about 0.2 mg / kg, more preferably at least about 1.0 mg / kg, most preferably At least about 2.0 mg / kg, optimally at least about 10 mg / kg, more optimally at least about 25 mg / kg, and most optimally at least about 50 mg / kg.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention is useful, for example, in diagnostic assays for detecting the expression of IL-33 in specific cells, tissues or serum of patients with IL-33-related diseases.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody be a conjugated antibody labeled with a detectable moiety.
  • combinations of amino acid sequences of specific complementarity determining regions (C1, C8, C15, C17 or C18 of Table 1) or combinations of specific variable region amino acid sequences (V1, V8 of Table 2) , V15, V17, or V18), which relates to an anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody that competes with IL-33 for binding to an anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising the amino acid sequence of V15, V17, or V18).
  • Binding to IL-33 competes with a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising a combination of amino acid sequences of specific complementarity determining regions or a combination of specific variable region amino acid sequences as described above.
  • the anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is obtained by screening the anti-IL-33 antibody obtained by genetic engineering techniques such as phage display or the hybridoma method, for example, by the following surface plasmon resonance (SPR) method. it can.
  • a human IL-33 protein equivalent to 1300 to 1600 RU is immobilized by loading a biotinylated human IL-33 protein (4 ⁇ g / mL) as a ligand onto a sensor chip on which avidin is immobilized.
  • an optional anti-IL-33 antibody (15 ⁇ g / mL) is loaded as an analyte and allowed to bind to the human IL-33 protein immobilized on the sensor chip.
  • a state (saturated state) in which any anti-IL-33 antibody is bound to all molecules of the human IL-33 protein on the sensor chip is created, and the amount of binding in the saturated state (saturated state) The binding amount 1) is obtained.
  • any anti-IL-33 antibody (15 ⁇ g / mL) is loaded as an analyte and the amino acid sequence combination of specific complementarity determining regions or specific variable region amino acid sequence combinations of the present invention It is examined whether it binds in addition to human IL-33 protein saturated with a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody containing sequence.
  • any anti-IL-33 antibody comprising a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising a combination of amino acid sequences of specific complementarity determining regions of the present invention or a combination of specific variable region amino acid sequences
  • An antibody is judged to be “non-competing” if it can bind to the saturated human IL-33 protein while exhibiting the saturation binding amount 1 of any anti-IL-33 antibody calculated above.
  • any anti-IL-33 antibody comprises a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising a combination of amino acid sequences of specific complementarity determining regions of the present invention or a combination of specific variable region amino acid sequences.
  • any anti-IL-33 antibody comprises a combination of amino acid sequences of a specific complementarity determining region of the present invention or a combination of specific variable region amino acid sequences, and a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody Even if it can bind in an added form to human IL-33 protein saturated with, the antibody is judged to “compete” if the amount of added binding does not reach saturation binding amount 1 with a significant difference. .
  • the significant difference can be examined by a general test method (for example, Student's t test), and the significance level is 5% or 1% or less.
  • Binding to IL-33 competes with a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody containing a combination of amino acid sequences of the above-mentioned specific complementarity determining regions or a combination of specific variable region amino acid sequences.
  • the anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody may be an antibody derived from any animal such as mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, goat antibody, camel antibody, or a combination of these antibodies. A certain chimeric antibody or humanized antibody may be used.
  • Binding to IL-33 competes with a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody containing a combination of amino acid sequences of the above-mentioned specific complementarity determining regions or a combination of specific variable region amino acid sequences.
  • the anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is preferably a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody, and most preferably a human antibody.
  • Binding to IL-33 competes with a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising a combination of amino acid sequences of the specific complementarity determining regions described above or a specific variable region amino acid sequence combination.
  • Anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies include antibody fragments. Examples of antibody fragments include Fab fragments, Fv fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, or scFv, and antibody fragments to which PEG or the like is bound are preferred.
  • the method for producing the anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention will be described below.
  • a DNA sequence including a desired combination of complementarity determining region and framework region and including a DNA sequence encoding a light chain variable region and a heavy chain variable region is incorporated into an expression vector.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention can be produced by transforming this into a host cell and culturing the host cell (for example, BorrebaeckbaC. A. K. and Larrick J W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • the full length of the heavy chain and the full length of the light chain are encoded by linking DNA sequences encoding the light chain and heavy chain constant regions to the DNA sequences encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region, respectively.
  • a DNA sequence can be generated.
  • a DNA sequence encoding the full length of the heavy chain and the full length of the light chain of the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody preferable in the present invention is, for example, IgG1 having a ⁇ chain as the light chain and is represented in Table 5 below.
  • the heavy chain C-terminal lysine residue may be removed, and the heavy chain nucleic acid sequences shown in Table 5 (sequences in the sequence listing) 3 nucleotides “aag” constituting the 3 ′ end of numbers 254 to 277) may be removed from each heavy chain nucleic acid sequence. :
  • An in vitro production system can be used as a production system for antibody production.
  • in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells such as animal cells, plant cells or fungal cells, and production systems using prokaryotic cells such as bacterial cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • animal cells used include mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa, YB2 / 0, commonly used cells, insect cells, plant cells, and the like. However, 293 cells and CHO cells are preferable.
  • DNAs encoding the heavy chain or light chain of the antibody may be separately incorporated into an expression vector, and the host may be cotransformed, or the heavy chain And the DNA encoding the light chain may be incorporated into a single expression vector to transform the host (see WO94 / 11523).
  • Preferred examples of vectors that can be used in animal cells include, but are not limited to, pConPlus, pcDM8, pcDNA I / Amp, pcDNA3.1, and pREP4.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. Yes (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited to these. Examples of columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. For example, as a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) and the like.
  • a multispecific antibody such as a bispecific antibody can be prepared by binding an antibody having another antigen binding specificity other than IL-33 to the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody according to the present application.
  • Bispecific antibodies can be produced by known chemical methods (Nisonoff, A. et al., Archives of biochemistry and biophysics., 1961, Vol.90, p.460-462, Brennan, M.et al. , Science, 1985, Vol. 299, p.81-83). In these methods, two types of antibodies are first hydrolyzed by enzymes, then disulfide bonds of antibody heavy chains are cleaved with a reducing agent, followed by mixing and reoxidizing different types of antibodies to divalent reactivity. An antibody is obtained.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2-1556 A method for producing a multispecific antibody such as a bispecific antibody by genetic engineering is already established in this field. For example, it differs depending on the technology of DVD-Ig (Wu et al., Nature Biotechnology 25 (11), 1290 (2007)) in which antigen-binding regions of two types of monoclonal antibodies are connected in series, or by modifying the Fc region of an antibody.
  • the desired bispecific antibody can be obtained using the ART-Ig technique (Kitazawa et al., Nature Medical 18 (10), 1570 (2012)) in which the heavy chains of two types of antibodies that bind to the antigen are combined.
  • the function-modified antibody or conjugate antibody of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody is prepared by the following method.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present application is produced using a CHO cell in which the ⁇ 1,6-fucose transferase (FUT8) gene is disrupted as a host cell, the fucose content of the sugar chain decreases and cell killing occurs.
  • FUT8 ⁇ 1,6-fucose transferase
  • the complement activation function can be regulated by modifying amino acid residues in the Fc region (US Pat. No. 6,737,056, US Pat. No. 7,297,775, US Pat. No. 7,317,091). Furthermore, by using a variant of the Fc region that has increased binding to FcRn, which is one of the Fc receptors, it is possible to prolong the blood half-life (Shouhei Hashiguchi, Biochemistry, 2010, Vol. .82 (8), p710; Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685). These function-modified antibodies can be produced by genetic engineering.
  • the human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody of the present invention can be conjugated with other functional molecules to produce a conjugated antibody.
  • PEG when PEG is bound as a functional molecule to an antibody, PEG can be used with a molecular weight of 2,000 to 100,000 Da, more preferably 10,000 to 50,000 Da, and may be linear or branched. PEG can be bound to the N-terminal amino group of an amino acid of an antibody by using, for example, an NHS active group.
  • a radioactive substance is used as the functional molecule, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, 211 At, or the like is used. The radioactive substance can be directly bound to the antibody by the Kuguchi Lamin T method or the like.
  • bacterial toxins eg, diphtheria toxin
  • plant toxins eg, ricin
  • low molecular toxins eg, geldanamycin
  • maytansinoids calicheamicins, and the like
  • a low molecular weight compound e.g, fluorescent dyes such as daunomycin, doxorubicin, metrolexate, mitomycin, neocalcinostatin, vindesine, and FITC are exemplified.
  • luciferase eg, firefly luciferase and bacterial luciferase; US Pat. No.
  • malate dehydrogenase urease, peroxidase (eg, horseradish peroxidase (HRPO)), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase , Glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidase (eg, glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidase (eg, uricase and xanthine oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, and the like.
  • peroxidase eg, horseradish peroxidase (HRPO)
  • alkaline phosphatase eg, ⁇ -galactosidase
  • Glucoamylase Glucoamylase
  • lysozyme saccharide oxidase (eg, glucose oxidase, galactose oxida
  • Linkers used when chemically linking toxins, small compounds or enzymes include divalent radicals (eg, alkylene, arylene, heteroarylene), — (CR 2 ) n O (CR 2 ) n — (R is Linkers and alkoxy repeating units (eg, polyethyleneoxy, PEG, polymethyleneoxy, etc.) and alkylamino (eg, polyethyleneamino, Jeffamine TM), and diacid esters and amides (succinate, Succinamide, diglycolate, malonate, caproamide and the like).
  • divalent radicals eg, alkylene, arylene, heteroarylene
  • R is Linkers and alkoxy repeating units (eg, polyethyleneoxy, PEG, polymethyleneoxy, etc.) and alkylamino (eg, polyethyleneamino, Jeffamine TM), and diacid esters and amides (succinate, Succ
  • anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody that competes with IL-33 for binding to a human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody comprising the amino acid sequence of mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, goat
  • An antibody derived from any animal such as an antibody or a camel antibody may be used, or a chimeric antibody or a humanized antibody that is a combination of these antibodies may be used.
  • These anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies can be obtained by using any known technique such as a genetic engineering technique such as a hybridoma method or a phage display method, and particularly preferably obtained by a genetic engineering technique. can do.
  • a chimeric antibody is obtained by ligating a DNA encoding a non-human-derived antibody variable region with a DNA encoding a human antibody constant region, incorporating it into an expression vector, transforming it into a host cell, and producing it (European publication). No. 125023, International Publication 92/197559).
  • a humanized antibody can be obtained by ligating a complementarity-determining region of a non-human-derived antibody and a DNA encoding the human antibody region of other parts, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • Human antibodies are prepared, for example, using the procedures described in the examples provided below. Human antibodies include trioma technology, human B-cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983 Immunol Today 4: p72), and EBV hybridoma technology for generating human monoclonal antibodies (Cole et al., 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES ANDANDANCE CANCER R. Liss, Inc., p. 77) can also be used. Furthermore, a human antibody can also be produced by immunizing a transgenic mouse introduced with a human antibody gene with an antigen protein to produce a hybridoma. Examples of the transgenic mouse include HuMab (registered trademark) mouse (Medarex), KMTM mouse (Kirin Pharma), KM (FC ⁇ RIIb-KO) mouse, VelocImmune mouse (Regeneron) and the like.
  • combinations of amino acid sequences of specific complementarity determining regions of the present invention (C1, C8, C15, C17 or C18 of Table 1) or combinations of specific variable region amino acid sequences (V1 of Table 2) , V8, V15, V17 or V18), and human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies containing artificial amino acids that compete with IL-33 for binding.
  • the artificial antibody for example, the 10th unit (FNfn10) of human fibronectin type III domain can be used, and an artificial antibody that binds to a desired target by introducing mutation into the BC, DE, and / or FG loop of the unit. Can be obtained.
  • an artificial antibody in addition to the extracellular domain of fibronectin, peptides such as Kunitz domain of serine protease inhibitor, ankyrin, and lipocalin can be used.
  • These artificial antibodies can be produced by genetic engineering by introducing a vector containing a nucleic acid molecule encoding the peptide into Escherichia coli, yeast, or animal cells and purifying the culture supernatant from the cultured host cells. it can.
  • the specific protein as described above or a part of the amino acid sequence is not used, but a random sequence library in which amino acids are randomly combined is used to specifically detect the epitope of the present invention like an antibody. It is also possible to search for a low-molecular peptide molecule that binds (for example, Hipolito et al., Current Opinion in Chemical Biology, 2012 Vol 16: 196, Yamagishimaget al., Chemistry & Biology, 2011 Vol 18: 1562). Such a peptide can also be produced by a chemical synthesis method such as the fluorenylmethyloxy force carbonyl method or the t-butyloxy force sulfonyl method in addition to the genetic engineering method.
  • C1 to C30 in Table 1 which are combinations of amino acid sequences of complementarity determining regions of human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibodies described in this application
  • V1 to V30 in Table 2 which are combinations of amino acid sequences of variable regions
  • complementarity CN1 to CN30 in Table 5 which are combinations of nucleic acid sequences in the determination region
  • IGN1 to IGN30 in Table 5 which are combinations of nucleic acid sequences of antibodies correspond to the sequences of the same clones, respectively.
  • the amino acid sequence of the complementarity determining region of clone A10-1C04 is a combination of the amino acid sequences of the six complementarity determining regions of C1, and the amino acid sequence combination of this complementarity determining region is the six nucleic acid sequences of CN1
  • the amino acid sequences of the variable regions of the heavy chain and light chain of the clone are the two amino acid sequences of V1, and the amino acid sequences of the light chain of ⁇ chain and the heavy chain of ⁇ chain including the variable region of V1 are IGN1. Encoded by two nucleic acid sequences.
  • Example 1 Acquisition of anti-IL-33 antibody and identification of epitope peptide [Obtain antibody] Monoclonal antibodies were obtained by immunizing animals with human IL-33 protein and preparing hybridomas from the spleen cells of the immunized animals. In addition, animal antibody libraries prepared using RNA collected from spleen cells of immunized animals and antibodies that bind to human IL-33 protein from human naive antibody libraries were cloned by phage display technology. In this way, 8 types (antibodies A to H) of anti-IL-33 monoclonal antibodies were obtained.
  • a peptide array scan was conducted to examine the binding between a partial peptide (20 residues in length) of human IL-33 and each antibody.
  • a total of 16 types of amino acid residues were shifted in the range from the N-terminal to the valine at position 101 (V101) to the threonine at position 270 (T270) while shifting the start position every 10 amino acids.
  • a 20 amino acid long peptide (PEP11 to PEP26) was synthesized. Table 7 shows the sequences and positional relationships of these peptides.
  • Each peptide in which the N-terminus was biotinylated was immobilized as a ligand on a neutrovidin sensor chip of a Surface Plasmon Resonance (SPR) device (Bio-Rad, ProteOn XPR36).
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • an Abitag sequence was added to the N-terminus of mature human IL-33 (residues 112 to 270), and a protein (hIL-33) specifically biotinylated by biotin ligase reaction was used as an SPR sensor. Immobilized as a ligand on the chip.
  • test antibody human IL-33 receptor white matter (recombinant human ST2 Fc chimera) (Enzo Life Science, ALX-201-367-C050) or buffer (0.05) is used as an analyte on the sensor chip on which the ligand is immobilized.
  • % Tween20 / PBS antibody concentration: 10 ⁇ g / ml; flow rate: 100 ⁇ l / min
  • antibody amount bound to the ligand on the sensor chip after washing is shown as the RU value. It was. The results are shown in FIG.
  • a commercially available anti-human IL-33 polyclonal antibody (R & D Systems, AF3625) bound to most of the 16 types of human IL-33 peptides used in the study.
  • the human IL-33 receptor (ST2) bound to the human IL-33 protein, but hardly bound to the human IL-33 peptides (PEP11 to PEP26), and any part of IL-33 was associated with ST2. It was not known in this study whether it was important for binding. In addition, binding to a ligand was not observed with buffer alone or mouse IgG (R & D® Systems, MAB002). When the binding to hIL-33 (residue 112 to residue 270) was compared between the antibodies used, antibody G, Antibody H, antibody D, antibody E, antibody B, antibody A, antibody C, and antibody F were in this order.
  • Example 2 Evaluation of IL-33 neutralizing activity of anti-IL-33 monoclonal antibody-1 IL-33 neutralizing activity of antibody A, antibody B, antibody E, and antibody F was measured using as an index the inhibitory effect on the binding between immobilized human ST2 and human IL-33.
  • Recombinant human ST2 Fc chimera (Enzo Life Science, ALX-201-367-C050) diluted with phosphate buffered saline (PBS) (1 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L / ml) in a 96-well microplate (Nunc TM, # 442404) The wells were dispensed and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the plate was washed once with PBS containing 1% BSA (PBS-B), and the same solution (250 ⁇ L / well) was added, followed by blocking at room temperature for 2 hours. Thereafter, a mixed solution (50 ⁇ L / well) of a test antibody (final concentration 10 ⁇ g / mL) diluted with PBS-B and a recombinant human IL-33 protein (ATGen, ILC0701) (final concentration 1 ⁇ g / mL) was added to room temperature. And incubated for 2 hours.
  • a test antibody final concentration 10 ⁇ g / mL
  • ATGen a recombinant human IL-33 protein
  • the microplate was washed 5 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS-T) and then diluted with PBS-B goat anti-human IL-33 antibody (R & D Systems: AF3625, final concentration 1 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L / Well) and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the microplate 5 times with PBS-T, HRP-labeled rabbit anti-goat IgG antibody (Invitrogen: 61-1620, 50 ⁇ L / well) diluted 2000-fold with PBS-B was added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • PBS-T PBS-B goat anti-human IL-33 antibody
  • the microplate was washed 5 times with PBS-T, SureBlue TM TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL: 52-00-01, 50 ⁇ L / well) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 20 minutes. The reaction was stopped with TMB Stop Solution (KPL: 50-85-05, 50 ⁇ L / well), and the difference in absorbance at wavelengths of 450 nm and 620 nm was measured using a plate reader (SPECTRA MAX 190, Molecular Devices).
  • the inhibitory effect of the antibody on the binding between ST2 and IL-33 is human IL-1 ⁇ (PeproTech, 200-01B) (final concentration 1 ⁇ g / mL) instead of human IL-33.
  • the percentage of inhibition with respect to the sample to which human IL-33 (final concentration 1 ⁇ g / mL) was added alone was determined.
  • antibody A epitopope is PEP12
  • antibody B epitopope is PEP12
  • antibody E epipe is PEP16-17
  • antibody F epipe is PEP24
  • Example 3 Evaluation of IL-33 neutralizing activity of anti-IL-33 monoclonal antibody-2 Measurement of IL-33 neutralizing activity of test antibodies (antibodies A to H) using as an index the inhibitory effect on human IL-33-induced IL-6 production using normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (LONZA, CLC2517A) Carried out. HUVEC was seeded on a 96-well microplate (IWAKI, MT4940-010) (6 ⁇ 10 3 /0.1 mL / well), and it was confirmed that the cells were confluent.
  • IWAKI 96-well microplate
  • ECM-2 medium (LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176)
  • anti-IL-33 antibody final concentration 10 ⁇ g / mL
  • recombinant human IL-33 ATGen, ILC0701, final concentration 100 ng / mL
  • Added 0.2 mL / well
  • the concentration of IL-6 in the medium was measured using a commercially available ELISA kit (Thermo Scientific, EH2IL6).
  • the cell viability at the time of medium collection was measured using a cell count kit (Dojindo, 345-06463), and it was confirmed that the IL-6 production inhibitory effect was not caused by a decrease in the number of viable cells.
  • the IL-33 neutralizing activity (HUVEC IL-6 production inhibition rate) of the test antibody the inhibition rate (%) for IL-6 production by recombinant human IL-33 alone treatment was calculated.
  • antibody A (epitope is PEP12) inhibits 51%
  • antibody B (epitope is PEP12) inhibits 48%
  • antibody C (epitope is PEP14) inhibits 33%
  • antibody D (epitope is PEP14) inhibits 38%
  • Antibody E (epitope is PEP16-17) is 0% inhibition
  • antibody F (epitope is PEP24) is 38% inhibition
  • antibody G epipitope is PEP26) is 48% inhibition
  • antibody H (epitope is PEP26) is 56% inhibition
  • all antibodies except antibody E showed an inhibition rate of 30% or more (Table 9).
  • an antibody that binds to an epitope selected from the group consisting of positions 111 to 130, 131 to 150, 231 to 250, and 251 to 270 of SEQ ID NO: 1 has an antibody concentration of 3, 10 And 30 ⁇ g / mL, the increase in neutralizing activity was large (for example, 23, 42, and 61% inhibition with antibody D, respectively), and it was found that the epitope is suitable for producing an antibody having an antagonistic action. .
  • Patent Document 2 (WO2008 / 132709) describes three types of epitopes: epitope 1 (positions 155 to 198), epitope 2 (positions 165 to 188), and epitope 3 (positions 175 to 178). It was revealed that this epitope overlaps with the epitope peptide (positions 151 to 180) of antibody E, which was confirmed to have no neutralizing activity of IL-33. From these results, the antibody against the epitope of Patent Document 2 cannot sufficiently inhibit the binding between IL-33 and the receptor ST2, and has no neutralizing activity of IL-33, or even if it is very present. It was considered low.
  • the binding to hIL-33, such as antibody D, antibody G, and antibody H tends to be weaker than that of antibody E, clones that showed clear neutralizing activity of IL-33 Due to its existence, this possibility is considered to be low.
  • the epitope described in Patent Document 2 is an epitope that does not relate to the binding to IL-33 and the neutralizing activity of IL-33.
  • the four epitopes we found this time are considered to be functional epitopes that are associated with binding to IL-33 and neutralizing activity of IL-33.
  • Antibodies that bind to a functional epitope are likely to have a high antagonistic effect on IL-33, while antibodies that bind to a non-functional epitope may have a low or no antagonistic effect on IL-33.
  • Example 4 Mapping of Epitope Peptide to Human IL-33 Conformation
  • the above four epitope peptides are further interfacial atoms (in the shortest range of 5 km from the atoms constituting ST2) which are epitopes preferable for the production of antibodies having an antagonistic action.
  • an epitope peptide was mapped on the three-dimensional structure of the human IL-33 / human ST2 complex.
  • amino acids containing interfacial atoms P118 of PEP12, I119, T120, Y122, L123, R124, S125, L126, S127, Y129, N130, PEP14 of D131, Q132, S133, T135, A137, L138, E139, S142, Y143, E144, I145, Y146, E148, D149, L150, PEP24 D244, N245, H246, PEP26 K266, L267, S268, E269.
  • an epitope having an amino acid containing an interface atom is considered preferable.
  • Example 5 Obtaining a human anti-IL-33 antibody (parent clone) Using a human scFv phage display library (BioInvent, n-CoDeR) (Soderlind et al., Nature biotechnology, 2000 Vol.18 (8), p852).
  • Binds to mature IL-33 inhibits the binding of IL-33 and ST2, and IL-33-dependent IL of normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) described below
  • scFv parental clones
  • the base sequences of these antibodies were determined, and the amino acid sequences of the light chain and heavy chain variable regions were determined.
  • the combinations of amino acid sequences of the light chain and heavy chain variable regions of A00-0070 and A00-0036 were V29 and V30 in Table 2, respectively.
  • Example 6 Determination of amino acid substitution to improve complementarity-determining regions Improvement of affinity and physical properties of two types of parent clones to IL-33 (reduction of cohesion and improvement of solubility due to reduction of surface hydrophobicity) Therefore, the complementarity determining region was improved by Fab ribosome display and Fab phage display. The complementarity-determining region is improved in two stages. In the first stage, one amino acid substitution aiming at improving affinity to IL-33 and improving physical properties is determined, and in the second stage, a plurality of these one amino acid substitutions are determined. The combination was determined (Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012 Vol. 428 (3), p395).
  • a Fab ribosome display vector was constructed using the light chain and heavy chain variable regions of two types of parent clones. All amino acid residues constituting the six complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, HCDR3) of the antibody are obtained by a multi-step PCR reaction using site-directed mutagenesis PCR and overlap extension PCR. A comprehensive library of single amino acid substitution mutants was constructed in which each group was made into 20 natural amino acids.
  • Fab ribosome display method (Fujino et al., Biochem. Biophys.) Using the reconstructed cell-free translation system PURE system (Genefrontier, PUREfrex) (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 2001 Vol.
  • the change rate (concentration ratio) of the presence frequency of all 1 amino acid substitution mutants in the library before enrichment and in the library after enrichment is calculated, and using the magnitude of the enrichment ratio by library enrichment as an index, human IL-33 protein
  • One amino acid substitution that was considered useful to improve the affinity for was determined.
  • the position for introducing the amino acid substitution was determined in the custom library constructed in the second stage.
  • Amino acid substitutions that are considered to be useful for reducing surface hydrophobicity while maintaining the ability to bind to human IL-33 protein at these sites, and enrichment ratios in mutation analysis using a comprehensive 1 amino acid substitution mutant library was determined in consideration of the data.
  • Example 7 Creation of a human anti-IL-33 antibody with an improved complementarity determining region A custom for full-scale complementarity determining region improvement by combining a plurality of the above useful amino acid substitutions for the purpose of improving affinity and improving physical properties
  • the library was designed. Construction of Fab ribosome display and Fab phage display vectors, multi-step PCR reaction using site-directed mutation PCR and overlap extension PCR using Fab ribosome display vector as template, and site by Kunkel method using Fab phage display vector as template Customization for improvement of complementarity-determining regions in which complementarity-determining regions are randomized based on the above design by carrying out specific mutagenesis (Fellouse et al., J. Mol. Biol. 2007 Vol.
  • Mature human IL-33 (residue 112 to residue 270) and mature cynomolgus IL-33 (residue 112 to residue 269 of SEQ ID NO: 227 in the sequence listing) have a 6His tag-Avi tag added to the N-terminal side
  • the resulting vector was inserted into pET30a (-) to construct an expression vector, and a recombinant protein was prepared.
  • coli BL21 (DE3) strain carrying the expression vector is pre-cultured with 5 mL of LB medium, then 1 mL of the preculture is inoculated into 50 mL expression medium (Merck, Overnight Express; kanamycin added), and about 18 hours at 30 ° C./200 rpm. Expression culture was performed. The collected cells were washed, lysed with BagBuster (Novagen), and the supernatant was collected.
  • the 6His tag-Avi tag-cynomolgus monkey IL33 (residues 112 to 269) contained in the supernatant was purified using Ni-NTA Agarose (QIAGEN), and a commercially available biotin ligase (Avidity, BirA) was used. Thus, biotin modification was introduced specifically for the Avi tag portion.
  • E. coli library secreting and expressing Fab was constructed using the library after concentration, and the dissociation rate constant (koff) was measured by surface plasmon resonance (SPR) using the culture supernatant of several hundred clones of E. coli (Bio -Rad, ProteOn XPR36).
  • the human IL-33 protein (4 ⁇ g / mL) biotinylated and the cynomolgus monkey IL-33 protein (4 ⁇ g / mL) were loaded onto a sensor chip (Bio-Rad, NLC sensor chip) as ligands, and humans corresponding to 1300 to 1600 RU IL-33 protein and cynomolgus IL-33 protein corresponding to 1100 to 1500 RU were immobilized.
  • the culture supernatant of Escherichia coli was loaded as an analyte, and sensorgrams were obtained for a binding phase of 1 minute and a dissociation phase of 10 to 30 minutes.
  • Sensor spot interspot correction and blank correction were performed using an SPR data analysis program (Bio-Rad, “ProteOn® Manager” v3.1.0), and koff was determined by Langmuir off-rate analysis.
  • clones having improved affinity for human IL-33 protein and binding to cynomolgus IL-33 protein are advanced to higher evaluation after Example 8. It was determined as 28 clones (V1 to V28 in Table 2). As shown in Table 10, these clones (Fab) showed higher affinity (lower Koff value) for human and cynomolgus monkey IL-33 protein than the parental clone (Fab). There were no amino acid substitutions in the framework regions in the variable regions of these clones. Even if it is the same single amino acid substitution in the complementarity determining region, the effect of improving the affinity changes between the single amino acid substitution mutant and the multiple amino acid substitution mutant.
  • Example 8 Preparation of IgG antibody Seven clones of the obtained human anti-IL-33 antibody (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070, A00-) [0036] Next, an expression vector for mammalian cells expressing IgG was constructed by inserting DNAs encoding the amino acid sequences of the light and heavy chains downstream of the CMV promoter. The DNA sequence of the light chain of each clone uses SEQ ID NOS: 228, 232, 239, 241, 242, 230, and 253 of the sequence listing, respectively, and the DNA sequence of the heavy chain is SEQ ID NO: 254, 261, 262 of the sequence listing, respectively.
  • the expression vector was introduced into FreeStyle 293-F cells (Life Technologies) using the gene introduction reagent NeoFection 293-1 (Astec). The culture supernatant was obtained after culturing for 5 days after gene introduction.
  • a stable expression strain by CHO cells was established by a GS system (Lonza) using pConPlus vector and CHO K1SV cells. The CHO cell stable expression strain was cultured from 0.3 ⁇ 10 6 cells / mL using WAVE Bioreactor SYSTEM 20/50 EHT (GE Healthcare), and a culture solution containing secreted IgG was collected.
  • IgG was purified from the culture supernatant by affinity chromatography using Protein A resin (GE Healthcare, HiTrap MabSelect SuRe). IgG bound to Protein A resin was eluted with an elution buffer having a pH of 3.2, neutralized promptly to make the pH near neutral, and then dialyzed with PBS (pH 7.2).
  • IgG after purification of Protein A column was purified by CHT (ceramic hydroxylate Type I resin) (BIORAD). IgG bound to CHT was eluted with a gradient of NaCl concentration, and the desired fraction was collected and dialyzed against PBS (pH 7.2).
  • the antibody obtained by this purification method was designated as “neutral purified antibody”.
  • a purification method in which a washing operation for 6 minutes with 6 column volume of 100 mM sodium carbonate buffer (pH 11.0) was added before the elution step from the protein A resin in the above purification method was also carried out.
  • the antibody obtained by this purification method was designated as “alkali purified antibody”.
  • Table 11 shows the recovery rate of the alkali-purified antibody in each step.
  • the purified alkali-purified antibody after purification was centrifuged and concentrated with VIVASPIN Turbo15 30000 MWCO (Sartoeius).
  • Example 9 Affinity to IL-33 protein
  • the affinity of a test antibody (IgG) meaning that the molecular form is IgG, hereinafter the same) to human IL-33 protein is kinetic excision assay (KinExA) was determined by measuring the dissociation constant (Kd) in PBS (Sapidyne, KinExA3200).
  • the concentration of human IL-33 protein (ATGen, ILC0701) is a wide range for test antibodies at a fixed concentration (final concentration of several tens to several hundreds of pM) (the upper limit of the final concentration ranges from several nM to several tens of nM).
  • a mixed sample titrated to a 2048-fold concentration range in a 2-fold dilution series was prepared and incubated at room temperature until the antigen-antibody reaction reached equilibrium. After reaching equilibrium, the presence of free anti-IL-33 antibody was measured using KinExA3200.
  • KinExA data analysis program (Sapidyne, KinExA Pro Software v3.5.3), a plot of the abundance (vertical axis) and antigen concentration (horizontal axis) of anti-IL-33 antibody not bound to human IL-33 protein Kd was calculated by fitting to a theoretical formula.
  • the affinity of the alkaline purified antibody for human IL-33 protein (residue 112-residue 270) (ATGen, ILC0701) or full-length human IL-33 protein was measured with KinExA (Table 12).
  • the recombinant protein used as the ligand was prepared as follows.
  • the full-length human IL-33 protein was constructed by inserting an expression vector having NusA tag-6His tag-TEV Protease cleavage sequence added to the N-terminal side into pET30a (+) to prepare a recombinant protein.
  • NusTag and HisTag were cleaved by adding 100 ⁇ L of Turbo TEV protease (Nacalai Tesque) and 4.5 ⁇ L of 1M DTT to 1750 ⁇ L of the concentrate and incubating at 4 ° C. After removing the tag, it was applied to a Ni Sepharose Excel column (GE Healthcare) to remove NusTag and Turbo TEV protease (Histag fusion) contained in the sample, and the flow-through fraction was collected. DTT was added to the flow-through fraction to a final concentration of 3.3 mM, and used as a full-length human IL-33 protein for measurement with KinExA.
  • Example 10 Evaluation of neutralizing activity of human IL-33 in vitro using HUVEC
  • the neutralizing activity of human IL-33 in vitro of the test antibody (IgG) was determined by the IL-33 dependent IL- of HUVEC. 6 production was evaluated as an index.
  • a commercially available polyclonal anti-IL-33 antibody R & D Systems, AF3625 was used as a positive control.
  • HUVEC (LONZA, CLC2517A) is suspended in EGM-2 medium (LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176), seeded in a 96-well microplate (IWAKI) (6 ⁇ 10 3 / well), and the cells are confluent. It was confirmed.
  • the IL-33 neutralizing activity of the test antibody was calculated as the inhibition rate (%) for IL-6 production by treatment with IL-33 alone.
  • A10-1C04 is 67% inhibition
  • A23-1A05 is 74% inhibition
  • A25-2C02 is 96% inhibition
  • A25-3H04 is 97% inhibition
  • A26-1F02 is 96% inhibition.
  • the parent clone A00-0070 had a 4% inhibition and A00-0036 had a very weak neutralization activity of -2%.
  • A00-0070 showed 42% inhibition and A00-0036 showed 38% inhibition, indicating moderate neutralizing activity.
  • a commercially available polyclonal antibody (R & D Systems, AF3625) showed 30% inhibition and moderate neutralizing activity when added at a final concentration of 1 ⁇ g / mL.
  • HUVEC was purified with alkaline purified test antibody (final concentration 0.1-10 ⁇ g / mL (approximately 0.67-67 nM)) and recombinant human IL-33 (ATGen, ILC0701) (final concentration 100 ng / mL (approximately 5 nM)).
  • the neutralizing activity of the antibody was calculated as the inhibitory effect (IC 50 value) on IL-6 production by treatment with IL-33 alone.
  • HUVEC was subjected to alkaline purified test antibody (final concentration 0.1 to 3 ⁇ g / mL) and recombinant cynomolgus monkey IL-33 (using the method prepared in Example 7 without biotinylation) (final concentration 100 ng / ml). mL) was added, and the neutralizing activity of the antibody was calculated as the inhibitory effect (IC 50 value) on IL-6 production by treatment with IL-33 alone.
  • IC 50 of A10-1C04 is 0.43 ⁇ g / mL, A10-1C04 was confirmed to neutralize the same intensity the human IL-33 and cynomolgus IL-33.
  • Example 11 Evaluation of neutralization activity of human IL-33 in vitro using KU-812 cells
  • the neutralization activity of human IL-33 in vitro of the test antibody (IgG) was determined as the IL of KU-812 cells.
  • -33 dependent IL-5, IL-6, IL-13 production was evaluated as an index.
  • a commercially available polyclonal anti-IL-33 antibody R & D Systems, AF3625 was used as a positive control.
  • a human basophil cell line, KU-812 cells (ECACC, EC90071807) was seeded in a 96-well microplate (Falcon) (1 ⁇ 10 4 / well).
  • a mixed solution of the test antibody (final concentration 3 ⁇ g / mL (about 20 nM)) and recombinant human IL-33 (ATGen, ILC0701) (final concentration 100 ng / mL (about 5 nM)) was added, and the mixture was added at 37 ° C., 24 ° C. Incubated for hours.
  • Concentrations of IL-5, IL-6, and IL-13 in RPMI-1640 medium containing 10% FBS were compared with Human IL-5 Flex set, Human IL-6 Flex set, and Human IL of BDTM Cytometric Bead Array (BD Biosciences). Measurements were made using a -13 Flex set.
  • the cell viability at the time of medium collection was measured using a cell count kit (Dojindo, 345-06463). It was confirmed that it was not caused.
  • A26-1F02 inhibited IL-5, IL-6, and IL-13 production by 70%, 82%, and 72%, respectively, in this evaluation system. Also showed stronger neutralizing activity than commercially available polyclonal antibodies (47%, 51% and 41% inhibition, respectively).
  • an alkaline purified test antibody (final concentration of 100 to 0.01 ⁇ g / mL (about 667 to 0.067 nM)) and recombinant human IL-33 (ATGen, ILC0701) (final concentration of 3 ng / mL (about 0.15 nM)), human IL-3 (PeproTech, 200-03, final concentration of 10 ng / mL (approximately 0.67 nM), human complement C5a (Sigma-Aldrich, C5788) (final concentration of 1 nM) was added. And incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • the concentrations of IL-5 and IL-13 in RPMI-1640 medium containing 10% FBS were measured, and the cell viability when the medium was collected using a cell count kit In this evaluation system, alkaline purified test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A25) were confirmed to have no inhibitory effect on IL-5 and IL-13 production. 2C02, A25-3H04, A26-1F02) showed an inhibitory effect of 50% or more at a final concentration of 1 [mu] g / mL to IL-5 and IL-13 production.
  • Example 12 Evaluation of human IL-33 neutralization activity in vitro using human peripheral blood mononuclear cells
  • the human IL-33 neutralization activity in vitro of the test antibody (IgG) IL-33-dependent IFN- ⁇ production of nuclei (PBMC) was evaluated as an index.
  • a commercially available polyclonal anti-IL-33 antibody R & D Systems, AF3625 was used as a positive control.
  • PBMCs were prepared, seeded in 96-well microplates (2 ⁇ 10 5 / well), and recombinant human IL-12 (Wako Pure Chemical Industries) (final concentration 10 ng / mL) was added.
  • the inhibition rate when an alkaline purified antibody was allowed to act at a final concentration of 10 ⁇ g / mL was 96.9% inhibition with A10-1C04, 97.5% inhibition with A23-1A05, and 98.3% with A25-2C02. The inhibition was 75%, A25-3H04 was 97.9% inhibition, and A26-1F02 was 98.25% inhibition.
  • Example 13 Evaluation of effects on inflammation induced by intraperitoneal administration of human IL-33 Various inflammatory changes were induced by intraperitoneal administration of human IL-33 to mice. That is, an increase in blood IgE, IgA, IL-5, an increase in neutrophils, eosinophils, basophils, an increase in spleen cells (an increase in spleen weight), and pathological changes in various mucosal organs occurred. . Using these changes as indices, the anti-inflammatory action of the test antibody (IgG) in vivo was evaluated.
  • IgG test antibody
  • human control IgG MP ⁇ Biomedicals, 55908
  • mpk the average spleen weight
  • the spleen weight of the group in which A26-1F02, which is a neutral purified antibody, was intraperitoneally administered at 10 mg / kg was 66 ⁇ 3 mg on average.
  • the alkali-purified antibody was evaluated by subcutaneous administration (sc, one shot) only once on the day before human IL-33 protein administration (Day-1). Seven days after the start of administration (Day 7), the spleen weight of the group administered with PBS instead of human IL-33 protein was 70 mg on average, whereas the human control IgG was administered subcutaneously in addition to IL-33 protein administration The spleen weight of the group (10 mg / kg) averaged 152 mg. In contrast, as shown in FIG. 8, the spleen weights of the groups administered with A25-3H04 subcutaneously (1, 3, 5, 10 mg / kg) in addition to IL-33 protein administration were 143, 106, 109, and 78 mg, respectively.
  • A25-3H04 inhibited the increase in spleen weight due to inflammation in a concentration-dependent manner. Similar to these anti-inflammatory effects on spleen weight, serum IgA concentration, serum IgE concentration, blood neutrophil count, basophil count, eosinophil count, serum IL increased by human IL-33 administration It was confirmed that the -5 concentration was also suppressed by A25-3H04 (FIG. 8). From the above results, it was confirmed that A25-3H04 has an inhibitory action on the in vivo inflammatory reaction induced by IL-33. Further, when the blood concentration of A25-3H04 in the mouse 7 days after the start of administration (Day 7) was measured, 0.6, 3.7, 6.5, It was 20.3 ⁇ g / ml.
  • the in vivo anti-inflammatory effect of other test antibodies was also evaluated subcutaneously (10 mg / kg) using the same protocol.
  • the spleen weight of the group subcutaneously administered with human control IgG was 181 mg on average, whereas each of the purified alkaline antibodies (A10-1C04, A23- 1A05, A25-2C02, and A26-1F02) were spleen weights of 82 mg, 92 mg, 100 mg, and 77 mg, respectively, and the increase in spleen weight due to inflammation was suppressed.
  • Example 14 Evaluation of effects on lung injury induced by intra-tracheal administration of human IL-33
  • Human IL-33 protein was intratracheally administered to mice, and then bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected.
  • BALF bronchoalveolar lavage fluid
  • the total number of cells, the number of eosinophils and the number of neutrophils in BALF are increased, and tracheal epithelial mucus growth is also observed. It also produces cytokines such as IL-4, 5, 6, 13 in BALF.
  • a test antibody IgG
  • Example 15 Evaluation of effects on airway hypersensitivity induced by intranasal administration of human IL-33
  • the IL-33 protein is administered intranasally to mice, airway hypersensitivity to inhaled methacholine subsequently occurs.
  • the test antibody IgG
  • Example 16 Evaluation of the effect on IL-33 using human IL-33 knock-in mice
  • airway inflammation was induced, and from this mouse Recovery of BALF increases the total number of cells in BALF. It is known that airway inflammation caused by mite antigen or papain is caused by the release of IL-33 from airway epithelial cells by the protease activity of mite antigen or papain (Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581).
  • Test antibody (IgG) was administered intraperitoneally, subcutaneously or intravenously to this evaluation system to evaluate the effect of the test antibody on airway inflammation due to protease and the effect of the test antibody on IL-33 induced in vivo. can do.
  • Example 17 Evaluation of effect on inflammation in LPS intraperitoneally administered sepsis model LPS is induced intraperitoneally in human IL-33 knock-in mice, although sepsis is induced (Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences). of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581), test antibody (IgG) is administered intraperitoneally, subcutaneously or intravenously before LPS administration, and the effect of the test antibody on subsequent mortality is evaluated. be able to.
  • inflammatory cytokines such as IL-6 and TNF- ⁇ are detected in blood at high concentrations within several hours after LPS administration. By measuring these concentrations, the anti-inflammatory action of the test antibody should be evaluated. Can do.
  • Example 18 Evaluation of in vivo effect on cancer using tumor-bearing mice
  • mouse cancer cell lines and human cancer cell lines were orthotopic, subcutaneous or Human IL-33 is administered intravenously.
  • the test antibody IgG
  • the cancer cell line is transferred, the number of cancer cells in the primary cancer site or metastasis organ is evaluated by volume or cell number. The effect of the test antibody on cancer can be evaluated.
  • Example 19 Evaluation of colloidal stability of antibody
  • the colloidal stability of the test antibody (IgG) was evaluated by the presence or absence of aggregates by dynamic light scattering.
  • Each alkali-purified antibody was concentrated to around 50 mg / mL with VIVASPIN or VIVASPIN TURBO (sartorius, 10,000 to 50,000 MWCO). Centrifugation was performed at 4 ° C., and the number of rotations and time were appropriately changed.
  • Measure the dynamic light scattering Nikkiso, Nanotrac UPA UT-151 using 200 to 250 ⁇ L of the sample antibody solution while diluting the test antibody solution, and obtain data from around 1 mg / mL to 50 mg / mL in the concentration range. did.
  • the particle size distribution of the antibody protein was calculated from the accumulated data for 200 seconds, and the presence or absence of aggregates was evaluated.
  • the test antibody (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) has a degree of shift of the peak near 10 nm in the particle size distribution toward the higher particle size side as the antibody concentration increases. There was no peak having a particle diameter of several tens of nanometers or more, which is considered to be derived from an irreversible aggregate that is very slight and does not depend on the antibody concentration. The above results confirmed good colloidal stability of the test antibody.
  • the interaction parameter (k D ) was calculated.
  • the interaction parameter representing the concentration dependency of the diffusion coefficient (inversely proportional to the particle diameter) is an important index that is also used for the formulation design of high-concentration protein preparations such as antibodies. If the value of the interaction parameter is higher than ⁇ 12.4 mL / g, it is reported that it is a repulsive interaction and excellent in colloidal stability and low in self-association (Saito et al.,). Pharm.Res., 2013.Vol.30 p1263).
  • D is the diffusion coefficient (cm 2 / sec)
  • K B is the Boltzmann constant (J / K)
  • T is the thermodynamic temperature (K)
  • [pi is pi
  • eta is the diluent viscosity P (poise)
  • D is the particle diameter (nm).
  • D is the diffusion coefficient obtained by the Stokes-Einstein equation
  • D 0 is the diffusion coefficient at infinite dilution
  • c is the concentration (g / mL) of the test antibody at the time of measurement.
  • the interaction parameter (k D ) which is the slope of the fitting straight line, was calculated.
  • the parameter was also higher than ⁇ 12.4 mL / g, and the colloidal stability was excellent.
  • thermodynamic stability of antibody The thermodynamic stability of a test antibody (IgG) was evaluated at a temperature (Tm) at which the folding of the immunoglobulin domain collapses.
  • Tm a temperature at which the folding of the immunoglobulin domain collapses.
  • Protein Thermal Shift Dye (Life Technologies) was added to a test antibody solution of several tens of ⁇ g / mL according to the attached document, and fluorescence intensity was measured by increasing the temperature at about 1 ° C./min with real-time PCR 7500 Fast (Life Technologies). Tm was determined by analyzing the obtained data with Protein Thermal Shift (Life Technologies). In addition, when several Tm was recognized, it was set as Tm1 and Tm2 from the one where temperature is low.
  • Tm2 77.6 ° C.
  • Tm2 80.3.degree. C.
  • Tm2 76.4.degree. C.
  • Tm2 77.5 ° C.
  • Tm2 80.4 ° C
  • Tm2 76.4 ° C
  • All antibodies had a Tm of 65 ° C. or higher, indicating good thermodynamic stability.
  • Example 21 Evaluation of storage stability of antibody
  • each alkaline purified antibody was citrated with a citrate buffer (50 mM citrate, 150 mM NaCl) at a concentration of about 10 mg / mL. (PH 6.3)) and stored at 40 ° C. for 4 weeks.
  • a citrate buffer 50 mM citrate, 150 mM NaCl
  • mCE-SDS microchip capillary SDS electrophoresis
  • a column connected with two TSKgel G3000SWXL (Tosoh) was mounted on an HPLC apparatus (Beckman System Gold, 126olsolvent manager, 166 detector, 508 autosampler) and subjected to gel filtration analysis. Separation was performed at a flow rate of 0.5 mL / min using a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 6.7) containing 0.1 M sodium sulfate as a mobile phase solvent, and detection was performed at UV 215 nm. .
  • An antibody stock solution of about 10 mg / mL was diluted 100-fold to obtain an analytical sample, and 50 ⁇ L thereof was injected.
  • the monomer purity obtained by gel filtration analysis is shown in Table 13.
  • All test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) retain a monomer purity of 90% or higher after storage at 40 ° C. for 4 weeks, and are well stored Showed stability.
  • Capillary SDS electrophoresis was performed using Lab Chip GX II (PerkinElmer). Reduction was carried out under denaturing conditions according to the manufacturer's standard protocol using a reagent kit HT-Protein-Express Reagent- (PerkinElmer) dedicated to the apparatus. As a sample for analysis, 2 ⁇ L of an antibody storage solution of about 10 mg / mL was added. The reagent used for electrophoresis was added to the dedicated chip HT
  • rate 2 PerkinElmer
  • any test antibody (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) was 90 ° C. after storage at 40 ° C. for 4 weeks. % Monomer purity was maintained, and good storage stability was exhibited.
  • particle size measurement was performed.
  • a dynamic light scattering method (Nikkiso Co., Ltd.) was used for an analytical sample obtained by diluting the antibody stock solution 10 times with a citrate buffer (50 mM citrate, 150 mM mM NaCl (pH 6.3)) (final concentration: about 1 mg / mL).
  • ⁇ Nanotrac UPA UT-151 was used for particle size measurement. The integration time was measured at 200 seconds.
  • test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02, A00-0070, A00-0036) was detected after storage at 40 ° C. for 4 weeks, and storage An antibody with excellent stability could be obtained.
  • antigen-binding activity was measured using a surface plasmon resonance apparatus Biacore T200 (GE Healthcare).
  • Human IL-33 protein (ATGen, ILC0701) was immobilized on Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) using an amine coupling kit (GE Healthcare) (an immobilized amount of about 3000 to 6000 RU).
  • the antibody stock solution is diluted 10-fold with citrate buffer (50 mM citrate, 150 mM NaCl (pH 6.3)), and the total protein concentration in the solution is measured using a microspectrophotometer Astragene II (Astranet). (Protein concentration: about 1 mg / mL).
  • the antibody solution whose total protein concentration was measured was diluted 1000 times with HBS-EP buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% (v / v) Surfactant P20 (pH 7.4)), and the analyte. It was set as the solution. The measurement was performed at 25 ° C. Various analyte solutions were added for 36 seconds to obtain bonded phase sensorgrams. The flow rates were 5 ⁇ L / min and 100 ⁇ L / min, and the sensorgrams obtained at the two flow rates were subjected to antigen analysis using Calibration Free Concentration Analysis using a data analysis program (GE Healthcare, Biacore T200 Evaluation Software v1.0). The concentration of the antibody having binding activity was determined.
  • Example 22 Evaluation of stability by forced oxidation of antibody The influence of the antigen binding activity by the oxidation of the test antibody (IgG) was examined.
  • Hydrogen peroxide water (final concentration 1%) was added to various alkali-purified antibodies having a final concentration of about 1 mg / mL and oxidized at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, an 80 mM methionine solution was added to terminate the oxidation. Next, the test antibody solution was replaced with PBS using a desalting column Zebaspin (Thermo Scientific). The antigen binding activity of the test antibody subjected to the oxidation treatment was examined using a surface plasmon resonance apparatus Biacore T200 (GE Healthcare) in the same manner as in Example 21.
  • any of the test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) has an antigen binding activity of 80% or more in forced oxidation by treatment with 1% hydrogen peroxide solution. The stability of holding was shown.
  • Example 23 Evaluation of aggregate formation by physical stress (stirring)
  • the test antibody (IgG) was diluted to 0.2 mg / mL with PBS and stirred in a batch cell attached to an Aggregates Sizer (Shimadzu Corporation). To add physical stress. The stirring bar was moved up and down (190 times / min) for 30 minutes at room temperature, and then the aggregate concentration from 40 nm to 20 ⁇ m was measured with an Aggregates Sizer.
  • the aggregate concentration produced by stirring was 17.2 ⁇ g / mL for A10-1C04, 16.4 ⁇ g / mL for A23-1A05, 13.3 ⁇ g / mL for A25-2C02, and A25-3H04. Is 23.4 ⁇ g / mL, A26-1F02 is 17.0 ⁇ g / mL, and the aggregate formation induced by physical stress is 15% or less for any of the antibodies. It was stable.
  • Example 24 Evaluation of changes in antibody blood concentration in mice Male C57BL6 mice (8 to 10 weeks old) (Charles River, Japan) were intravenously administered (3 mg / kg) with a test antibody (IgG) fluorescently labeled. Thereafter, the concentration of the test antibody was measured by detecting fluorescence in plasma. As shown in FIG. 10, when an alkali-purified antibody was used, any of the test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) had an elimination half-life of 100 hours or more. There was good blood stability.
  • Example 25 Evaluation of changes in monkey blood concentration Male cynomolgus monkeys (2 to 3 years old) (Hamley) were intravenously administered with a test antibody (IgG) (1 mg / kg) and then Human Therapeutic IgG1 EIA Kit (Cayman Chemical, 500910). ) was used to measure the concentration of the test antibody in the serum. Alkali purified antibody A10-1C04 was administered to 2 cynomolgus monkeys (No. 201, 202), and alkali purified anti-A23-1A05 was administered to 1 cynomolgus monkey (No. 301). As shown in FIG. 11, the elimination half-life of A10-1C04 is 16.56 days (No. 201) and 11.40 days (No.
  • Example 26 Immunogenicity evaluation of antibody An in vitro T cell assay was performed to evaluate the immunogenicity of the test antibody (IgG) (Lonza).
  • IgG test antibody
  • the number of donors is 50, and 50 ⁇ g / mL of various alkaline purified antibodies are added to human peripheral blood-derived dendritic cells collected from donors and taken up into dendritic cells.
  • human peripheral blood-derived CD4 positive T cells collected from the same donor were isolated. Thereafter, both, ie, dendritic cells into which the test antibody was incorporated, were co-cultured with CD4 positive T cells, and the reaction (proliferation) of CD4 positive T cells was measured.
  • the immunogenicity risk when the antibody was administered to humans was evaluated by comparing with the reaction of CD4 positive T cells obtained in the same manner with a buffer (PBS) not containing the test antibody.
  • PBS buffer
  • none of the test antibodies (A10-1C04, A25-2C02, A25-3H04, A26-1F02) showed any difference in T cell responses from the negative control.
  • Example 27 Evaluation of human tissue cross-reactivity Evaluation of the cross-reactivity of the test antibody (IgG) to human tissues (frozen sections of 35 tissues satisfying the guidelines of 1 donor, FDA and EMA) by immunohistochemical staining (Covance Laboratories Ltd.).
  • tissues include adrenal gland, bladder, blood cells, bone marrow, mammary gland, cerebellum, cerebral cortex, colon, endothelial cells (blood vessels), eyeball, oviduct, gastrointestinal tract (including smooth muscle), heart, kidney (glomerular, tubule) ), Liver, lung, lymph node, ovary, pancreas, parathyroid, parotid, peripheral nerve, pituitary, placenta, prostate, skin, spinal cord, spleen, striated muscle, testis, thymus, thyroid, tonsils, urine Includes tubes, uterus (cervical, intima).
  • any of the test antibodies (A10-1C04, A23-1A05, A26-1F02, A25-2C02) was used for vascular endothelial cells (IL-33 expression widely known) Strong staining was confirmed in the positive control).
  • vascular endothelial cells (IL-33 expression widely known) Strong staining was confirmed in the positive control).
  • cross-reactivity to the cytoplasm or nucleus was confirmed in various tissues such as epithelium, stromal cells, nerve tissue, muscle tissue, and blood cells, but no cross-reactivity to the cell membrane was observed in any tissue. It was.
  • Example 28 Refinement of epitope region of A10-1C04 and A25-3H04 Anti-IL-33 monoclonal antibodies A10-1C04 and A25-3H04 bound to the PEP14 epitope described in Example 1 above.
  • Two types of epitopes (LEDESYEIYV (SEQ ID NO: 426 in the Sequence Listing)) were obtained from a short continuous amino acid sequence contained in PEP14 consisting of 20 amino acid residues.
  • EDESYEIYV SEQ ID NO: 427 of the Sequence Listing).
  • Peptide LEDESYEIYV corresponds to residues 138 to 147 of human IL-33 shown in SEQ ID NO: 226 in the sequence listing
  • peptide EDESYEIYV corresponds to residues 139 to 147 of human IL-33 shown in SEQ ID NO: 226 of the sequence listing. It corresponds to.
  • These peptides were synthesized, and the affinity with the alkaline purified antibody was calculated as K d by the KinExA experiment similar to Example 9 (Table 14).
  • the antibody having a neutralizing action in the present invention can be used as a pharmaceutical composition for diagnosis, treatment, prevention or alleviation of IL-33-related diseases.

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Abstract

　ＩＬ－３３に対しアンタゴニスト作用を有する抗体、特にフレームワーク領域のアミノ酸配列が生殖系列のアミノ酸配列またはその組合せのアミノ酸配列である、単離したヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体またはその抗体のフラグメントを提供することを目的とする。複数の抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体について、エピトープを同定し、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を取得し、さらにその相補性決定領域に変異を導入することにより、ＩＬ－３３に結合性の高い相補性決定領域を特定した。特定した相補性決定領域を用いることにより、フレームワーク領域のアミノ酸配列が生殖系列のアミノ酸配列またはその組合せのアミノ酸配列である、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を取得した。

Description

ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体
　本願の発明は、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体及び当該抗体に競合する抗体、並びにこれらの抗体を含むサイトカイン発現抑制剤、及びＩＬ－３３関連疾患の治療、予防または軽減用医薬組成物に関する。
　インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）は、炎症性状態において役割を果たすと考えられているインターロイキン－１ファミリーに属するサイトカインである。ＩＬ－３３は、上皮細胞や血管内皮細胞の核内で恒常的に発現しており、感染や物理的・化学的ストレスによる組織傷害によって細胞破壊と共に放出され、アラーミンとして機能する。また、ＩＬ－３３の発現はリポ多糖等の刺激によって上昇し、分泌される機構もあると考えられている。細胞外に放出されたＩＬ－３３は、細胞上に発現するＩＬ－３３受容体に結合することによって、細胞内シグナルを活性化することができる。ＩＬ－３３受容体は、様々な免疫系細胞や上皮細胞などで発現しており、これらの細胞において、ＩＬ－３３誘導性の細胞内シグナル伝達が生じる。
　ＩＬ－３３は、ＩＬ－３３受容体を発現する免疫系細胞の内、Ｔｈ２細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、ＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）Ｔ細胞やグループ２自然リンパ球からのＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３等）の産生を誘導することによって、アレルギー性炎症（喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショックなど）を誘導すると考えられている（非特許文献１：Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p1203）。また、ＩＬ－３３受容体を発現する免疫系細胞のうちマスト細胞やマクロファージでは、ＩＬ－３３刺激によりＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）－αの産生が誘導され、これが自己抗体誘導関節炎（関節リウマチのモデル）の発症に関与していることが示唆されている（非特許文献２：Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620）。ＩＬ－３３のアンタゴニストが急性腎障害に有効であることが示唆されている（非特許文献３：Ali Akcay et al., Journal of American Society Nephrology, 2011, Vol.22, p2057） 。ヒトにおいては、ＩＬ－３３の発現上昇が、種々の炎症性疾患（関節リウマチ、喘息、全身性硬化症、肝線維症、肺線維症等の線維症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎等）で認められており、ＩＬ－３３が様々な疾患の発症・維持に関与していると考えられている（非特許文献４：Yasushi Matsuyama et al., Journal of Rheumatology, 2010, Vol. 37, p18；非特許文献５：David Pre´fontaine et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, Vol. 125, p752；非特許文献６：Koichi Yanaba et al., Clinical Rheumatology, 2011, Vol. 30, p825；非特許文献７：A. L. Rankin et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p1526；非特許文献８：Tamar Mchedlidze et al., Immunity, 2013, Vol. 39, p357；非特許文献９：Liang-An Hu et al., Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, Vol. 14, p2563；非特許文献１０：Luca Pastorelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p8017）。
　このように様々な疾患、特に炎症性疾患におけるＩＬ－３３の関与が知られていることから、ＩＬ－３３のアゴニストやアンタゴニストの開発が行われてきている（特許文献１から４）。なかでも、その特異性や作用強度の点からＩＬ－３３に対する抗体が注目されてきている。しかしながら、これまで開発されてきた抗体は、エピトープの特定がないマウス抗体（特許文献１）、またはカスパーゼによるＩＬ－３３の切断部位を特定し、活性型が非切断ＩＬ－３３であることを特定したことに基づき、かかる切断部位を含む領域（配列表の配列番号２２６の残基１５５から残基１９８）をエピトープとした抗体（特許文献２）や市販のヤギポリクローナル抗体が知られていた。２０１４年１月１０日にＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ社が同社のホームページにて独自の体細胞超変異技術（ＳＨＭ―ＸＥＬ）プラットフォームを用いてＩＬ－３３に対する治療用開発候補抗体ＡＮＢ０２０の作製に成功したことを報告した（非特許文献１１：Hamza Suria, ’AnaptysBio announces development of novel anti-IL-33 therapeutic antibody’, [on line], 2014, [retrieved on 11 January 2014], Retrieved from Internet:<URL: http://www.anaptysbio.com/anti-il-33/>） 。また、Ｍｕｒｐｈｙらはヒト抗体の可変領域遺伝子を導入したマウスであるＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウスを用いて２０種類のヒト抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体を取得した（特許文献５）。しかしながら、該抗体のエピトープは開示されておらず、また２０種類のヒト抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列は２アミノ酸残基以上でヒト生殖系列のアミノ酸配列と異なっている。したがって、これらの抗体をヒトに投与した場合に、当該抗体に対する免疫反応が惹起され、ヒト抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＨＡＨＡ）の誘導により、作用効果の低減、炎症やその他の副作用の誘発という問題点がある。
国際公開第２００５／０７９８４４号 国際公開第２００８／１３２７０９号 国際公開第２０１１／０３１６００号 国際公開第２００８／１４４６１０号 国際公開第２０１４／１６４９５９号
Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p120 Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620 Ali Akcay et al., Journal of American Society Nephrology, 2011, Vol.22, p2057 Yasushi Matsuyama et al., Journal of Rheumatology, 2010, Vol. 37, p18 David Pre´fontaine et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, Vol. 125, p752 Koichi Yanaba et al., Clinical Rheumatology, 2011, Vol. 30, p825 A. L. Rankin et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p1526 Tamar Mchedlidze et al., Immunity, 2013, Vol. 39, p357 Liang-An Hu et al., Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2013, Vol. 14, p2563 Luca Pastorelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p8017 Hamza Suria, ’AnaptysBio announces development of novel anti―IL―33 therapeutic antibody‘, [on line], 2014, [retrieved on 11 January 2014], Retrieved from Internet:<URL: http://www.anaptysbio.com/anti―il―33/>
　近年、ＩＬ－３３と疾患との関係が明らかになってきており、ＩＬ－３３のアンタゴニスト作用を有する抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が望まれている。抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の作用は、その抗体が結合するエピトープの領域と密接に関わっている。ＩＬ－３３は細胞破壊とともに細胞外へ放出されるため、リソゾーム由来のタンパク質分解酵素等により切断される可能性が高く、いわゆる成熟型ＩＬ－３３、さらに成熟型ＩＬ－３３から派生する、ＩＬ－３３の活性を有する多くの断片が生じ得る。ＩＬ－３３の連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体は、断片が該連続するアミノ酸配列からなるエピトープを含んでいる場合には、不連続なアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体よりも、該断片の１つの連続するアミノ酸配列に強く結合して該断片とＩＬ－３３受容体との結合を阻害等することから有利である。しかしながら、所望のアンタゴニスト作用を有するＩＬ－３３モノクローナル抗体を生成するための、このような連続するアミノ酸配列からなるエピトープを特定することは依然として困難であった。
　ＩＬ－３３の連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合する抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体としては、ヒト等に投与した場合に抗原性が低いことが望ましい。ヒト抗体であれば、ヒトに投与した場合に抗原性が低く、さらにフレームワーク領域がヒト生殖系列のアミノ酸配列またはその組合せのアミノ酸配列であることが望ましい。しかしながら、ヒト抗体遺伝子ライブラリ中に含まれるヒト抗体にＳＨＭ－ＸＥＬプラットフォーム等を適用した場合には、相補性決定領域に限らずフレームワーク領域にもアミノ酸配列の変異が入ってしまう。また、ヒト抗体遺伝子を導入したマウスをヒトＩＬ－３３タンパク質で免疫してヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を取得する場合にも、該抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体のフレームワーク領域にアミノ酸配列の変異が生じることを防止できない。したがって、フレームワーク領域のアミノ酸配列がヒト生殖系列のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、ＩＬ－３３に対する単離したヒトモノクローナル抗体の取得は依然として困難であった。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、従来の好ましいエピトープであると考えられていた１５５～１９８位に存在するエピトープに強く結合する抗体が、ほとんどアンタゴニスト作用を有さない一方で、１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に存在する連続するアミノ酸配列からなるエピトープ、特に１１１～１３０位、１３１～１５０位、２３１～２５０位、又は２５１～２７０位に存在する連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、該エピトープに対し結合する抗体のアンタゴニスト作用の観点で重要であることを見出し、本発明に至った。
　さらに本発明者らは、ヒト抗体ライブラリからヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を単離し、さらにその相補性決定領域にのみ変異を導入することにより結合性が高く、物性のよい相補性決定領域を特定した。これにより、生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列に変異を含まないヒト抗体であって、ヒトＩＬ－３３に結合し、その機能を中和するヒト抗体を取得できた。そこで本発明は以下の発明に関する：
［１］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
［２］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位又は２５１位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、項目１に記載の抗体。
［３］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、Ｐ１１８、Ｉ１１９、Ｔ１２０、Ｙ１２２、Ｌ１２３、Ｒ１２４、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｓ１２７、Ｙ１２９、Ｎ１３０、Ｄ１３１、Ｑ１３２、Ｓ１３３、Ｔ１３５、Ａ１３７、Ｌ１３８、Ｅ１３９、Ｓ１４２、Ｙ１４３、Ｅ１４４、Ｉ１４５、Ｙ１４６、Ｅ１４８、Ｄ１４９、Ｌ１５０、Ｄ２４４、Ｎ２４５、Ｈ２４６、Ｋ２６６、Ｌ２６７、Ｓ２６８及びＥ２６９から選ばれるアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるエピトープである、項目１又は２に記載の抗体。
［４］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位又は２５１位～２７０位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、項目１～３のいずれかに記載の抗体。
［５］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１３８位～１４７位または１３９位～１４７位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、項目１～４のいずれかに記載の抗体。
［６］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、ＩＬ－３３のアンタゴニストである、項目１～５のいずれかに記載の抗体。
［７］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、ＩＬ－３３受容体と、ＩＬ－３３との結合を阻害する、項目１～６のいずれかに記載の抗体。
［８］項目１～７のいずれかに記載の抗体を含む、ＩＬ－３３関連疾患の治療、予防、又は軽減用の医薬組成物。
［９］項目１～７のいずれかに記載の抗体を含む、サイトカイン発現抑制剤。
［１０］ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、項目９に記載の抑制剤。
［１１］ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、項目９又は１０に記載の抑制剤。
［１２］
１）項目１～５のいずれかに記載のエピトープ、
２）該エピトープの連続するアミノ酸からなる配列に対し、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるエピトープ、及び
３）該エピトープの連続するアミノ酸からなる配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるエピトープ
からなる群から選ばれるエピトープ。
［１３］項目１２に記載のエピトープを用いて生成又はスクリーニングされた抗体。
［１４］配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、項目１～７のいずれかに記載の抗体。
［１５］フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、項目１４に記載の抗体。
［１６］軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、項目１５に記載の抗体。
［１７］軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、項目１５または１６に記載の抗体。
［１８］軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表１のＣ１からＣ３０で示される組み合わせより選択される、単離したヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ［１９］軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが、表１のＣ１からＣ２８で示される組み合わせから選択される、項目１８に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２０］軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが、表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７及びＣ１８で示される組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含む、項目１８または１９に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２１］抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、項目１８～２０のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２２］軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、項目１８～２１のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２３］軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１からＶ３０で示される組み合わせから選択される、項目１８～２２のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ［２４］軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１からＶ２８で示される組み合わせから選択される、項目２３に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２５］軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７及びＶ１８で示される組み合わせから選択される、項目２３または２４に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２６］軽鎖がλ鎖である、項目１８～２５のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２７］ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体がＩｇＧである、項目１８～２６のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２８］抗原がヒトＩＬ－３３及びサルＩＬ－３３である、項目１８～２７のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［２９］項目１８～２８のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の蛋白質部分をコードする核酸分子。
［３０］軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列の組み合わせが表３のＣＮ１からＣＮ３０で示される組み合わせより選択される、項目２９に記載の核酸分子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 ［３１］項目２９または３０に記載の核酸分子を含むベクター。
［３２］項目３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
［３３］項目１８～２８のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の製造方法であって、項目３２に記載の宿主細胞を培養して製造する方法。
［３４］項目１８～２８のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、サイトカイン発現抑制剤。
［３５］ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、項目３４に記載の抑制剤。
［３６］ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、項目３４または３５に記載の抑制剤。
［３７］項目１８から２８のいずれかに記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
［３８］ＩＬ－３３関連疾患の予防、治療または軽減用の項目３７に記載の医薬組成物。
［３９］ＩＬ－３３関連疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌からなる群から選択される、項目３８に記載の医薬組成物。
［４０］ＩＬ－３３との結合が、項目２０または２５に記載の抗体と競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
［４１］ＩＬ－３３関連疾患を患う患者を治療、予防、又は軽減するための方法であって、項目１～７及び１８～２８のいずれかに記載の抗体を対象に投与することを含む、方法。
［４２］ＩＬ－３３関連疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
［４３］ＩＬ－３３関連疾患を治療、予防、又は軽減するための医薬の製造のための、項目１～７及び１８～２８のいずれかに記載の抗体の使用。
［４４］ＩＬ－３３関連疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌からなる群から選択される、項目４３に記載の使用。
［４５］ＩＬ－３３関連疾患を治療、予防、又は軽減するための、項目１～７及び１８～２８のいずれかに記載の抗体の使用。
［４６］ＩＬ－３３関連疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌からなる群から選択される、項目４５に記載の使用。
［４７］サイトカイン発現抑制を必要とする患者を治療、予防、又は軽減するための方法であって、項目１～７及び１８～２８のいずれかに記載の抗体を該対象に投与することを含む、方法。
［４８］前記サイトカインが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３である、項目４７に記載の方法。
［４９］サイトカイン発現を抑制剤の製造のための、項目１～７及び１８～２８のいずれかに記載の抗体の使用。
［５０］前記サイトカインが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３である、項目４９に記載の使用。
　本発明のエピトープに結合するモノクローナル抗体は、連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合することから、ＩＬ－３３が分解され断片化された場合でも、1つの連続するアミノ酸配列に強く結合することにより、中和作用が発揮されやすい。
　本発明のモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合に抗体のフレームワーク領域及び/または相補性決定領域に対するヒト抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＨＡＨＡ）を誘導しにくい。ＨＡＨＡにより阻害されなければ、生体内でＩＬ－３３を中和する効果が持続する。またＨＡＨＡと結合することに起因する炎症を惹起しなければ安全な抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ－３３に結合し、その機能を中和することができることから、ＩＬ－３３関連疾患に対する新たな診断、予防、治療または軽減薬として利用できる。
図１は、ＩＬ－３３タンパク質の各ドメイン及び切断部位を説明する図である。 図２は、ヒトＩＬ－３３タンパク質（残基１１２から残基２７０）及び各部分ペプチド断片（ＰＥＰ１１～２６）に対する各抗体の結合活性を示す図である。 図３は、成熟型ヒトＩＬ－３３(残基１１７から残基２７０)（図中では「S117-T270」と記載する）とヒトＳＴ２（ｈＳＴ２）の複合体との立体構造をモデリングして示した図である。 図４は、図３の立体構造モデリングにおいて、ヒトＩＬ－３３のＰＥＰ１２エピトープの一部(配列表の配列番号２２６の１１７位～１３０位)（図中では「S117-N130」と記載し、以下同様に記載する）とヒトＳＴ２のみを表示した図である。 図５は、図３の立体構造モデリングにおいて、ヒトＩＬ－３３のＰＥＰ１４エピトープとヒトＳＴ２のみを表示した図である。 図６は、図３の立体構造モデリングにおいて、ヒトＩＬ－３３のＰＥＰ２４エピトープとヒトＳＴ２のみを表示した図である。 図７は、図３の立体構造モデリングにおいて、ヒトＩＬ－３３のＰＥＰ２６エピトープとヒトＳＴ２のみを表示した図である。 図８は、ヒトＩＬ－３３の腹腔内投与によって誘導される炎症に対するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体Ａ２５－３Ｈ０４の作用を炎症関連指標（脾臓質量、血清中ＩＬ－５濃度、血中好酸球数、血中好塩基球数、血中好中球数、血清中ＩｇＡ濃度、血清中ＩｇＥ濃度）に基づき示した図である。 図９は、ヒトＩＬ－３３の腹腔内投与によって誘導される炎症に対するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２及びＡ２６－１Ｆ０２の作用を炎症関連指標（脾臓質量、血中好酸球数、血中好塩基球数、血中好中球数、血清中ＩｇＡ濃度、血清中ＩｇＥ濃度）に基づき示した図である。 図１０は、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体（Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２、Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２５－２Ｃ０２）のマウス血漿中濃度推移を表示した図である。 図１１は、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５）のサル血清中濃度推移を表示した図である。
　本発明の理解を容易にするため、以下に本発明に用いられる用語を説明する。
［エピトープ］
　本発明において、エピトープとは、抗体が認識する抗原の一部分のことをいう。本発明においてエピトープは、抗体の認識に必要となる連続するアミノ酸からなる配列に関している。
［結合する］
　本発明において、モノク口一ナル抗体がエピトープに「結合する」とは、モノクローナル抗体が、エピトープであるペプチドに結びついて１つの複合体を形成することを意味する。モノクローナル抗体とエピトープの結合はイオン結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力などによるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体がエピトープに結合するかは、例えば本明細書に記載されたペプチドアレイスキャンやＫｉｎＥｘＡを用いて調べることができる。
［抗体］
　本発明において「抗体」という語は、最も広い意味で使用するものとし、所望の特異的結合性が示される限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体が含まれるものとする。本発明における抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよい。
［モノクローナル抗体］
　本発明の抗体のうちモノクローナル抗体は、設計上のアミノ酸配列において単一クローン(単一分子種)のみからなる抗体集団の抗体のことをいう。モノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マルチスペシフィック抗体、及び人工抗体、並びにそれらの機能改変抗体、並びにそれらのコンジュゲート抗体、並びにそれらのフラグメントが含まれるものとする。本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法、及び遺伝子工学的手法など、任意の公知の手法を用いて生成することができる。
［キメラ抗体］
　キメラ抗体とは、軽鎖、重鎖、またはその両方が、非ヒト由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域から構成される抗体をいう。
［ヒト化抗体］
　ヒト化抗体は、非ヒト由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域とからなる可変領域並びにヒト抗体由来の定常領域からなる抗体をいう。
［ヒト抗体］
　ヒト抗体とは、軽鎖、重鎖ともにヒト由来の抗体をいう。ヒト抗体は、重鎖の定常領域の違いにより、γ鎖の重鎖を有するＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、μ鎖の重鎖を有するＩｇＭ、α鎖の重鎖を有するＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む）、δ鎖の重鎖を有するＩｇＤ、またはε鎖の重鎖を有するＩｇＥを含む。また原則として軽鎖は、κ鎖とλ鎖のどちらか一方を含む。
［マルチスペシフィック抗体］
　マルチスペシフィック抗体とは、２つ以上の異なる抗原特異性を有する２つ以上の独立した抗原認識部位を持ち合わせた非対称の抗体であり、２つの抗原特異性を有するバイスペシフィック抗体、３つの抗原特異性を有するトリスペシフィック抗体などが挙げられる。本発明のマルチスペシフィック抗体が認識する1つ以上の抗原はＩＬ－３３分子である。
［人工抗体］
人工抗体とは、例えばタンパク質スキャフォールドであり、抗体の構造を有しないものの、抗体と同様の機能を有する人工抗体である。タンパク質スキャフォールドとしてはヒトのセリンプロテアーゼ阻害剤のKunitzドメインやヒトのファイブロネクチンの細胞外ドメイン、アンキリン、リポカリンなどが利用され、スキャフォールド上の標的結合部位の配列を改変すれば本発明のエピトープに結合するタンパク質スキャフォールドを生成することができる（Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48）。
［機能改変抗体］
　本願において機能改変抗体とは、主に抗体のＦｃ領域のアミノ酸や糖鎖を改変することにより、抗体の有する抗原結合機能以外の細胞殺傷機能、補体活性化機能や血中半減期等を調節した抗体をいう。
［コンジュゲート抗体］
　本願においてコンジュゲート抗体とは、抗体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、アルブミン、酵素などの抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合した抗体をいう。
［フラグメント］
　本願において抗体のフラグメントとは、抗体の一部分を含む蛋白質であり、抗原に結合できるものをいう。抗体のフラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはｓｃＦｖが挙げられる。
　さらにこれらの抗体のフラグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、アルブミン、酵素などの抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合していてもよい。
［ＩＬ－３３］
　ＩＬ－３３はＩＬ－１ファミリーに属するサイトカインであり、ヒトＩＬ－３３は配列表の配列番号２２６に示すように２７０アミノ酸からなる。ＩＬ－３３は、Ｎ末端側にクロマチン結合ドメインを有し、Ｃ末端側に１２個のβストランドを持つ分子量１８ｋＤａのＩＬ－１様サイトカインドメインを有しており、さらに９５位及び１０９位にカテプシンＧ切断部位、９９位にエスタラーゼ切断部位及び１７８位にカスパーゼ切断部位を有している（図１）。ＩＬ－３３は、細胞がネクローシスを起こす過程で、リソゾーム等に由来するエスタラーゼ、カテプシンＧ、またはプロテイナーゼ３などの酵素により切断されて、成熟型ＩＬ－３３、例えばＩＬ－３３（残基９５から残基２７０）（配列表の配列番号２２６のＮ末から９５位から２７０位のアミノ酸配列で表されるＩＬ－３３を「ＩＬ－３３（残基９５から残基２７０）」と表記する。以下同様に表記する）、ＩＬ－３３（残基９９から２７０）、ＩＬ－３３（残基１０９から残基２７０）、ＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０位）などを含むさまざまな断片となり、サイトカインとして機能すると考えられている。一方で、細胞死がアポトーシスである場合、アポトーシスの過程で活性化されるカスパーゼにより、ＩＬ－３３は、１７８位で切断されて、不活性型ＩＬ－３３、例えばＩＬ－３３（残基１７９から残基２７０）になると考えられている。
　ＩＬ－３３は、サイトカインとして細胞外に放出されると、ＩＬ－３３受容体と結合し、当該ＩＬ－３３受容体を発現する細胞において、細胞内シグナル伝達を開始させるという機能を有する。ＩＬ－３３により誘導されるシグナル伝達には、非限定的に、ＮＦ－κＢ経路と、ＭＡＰＫＫｓ経路とがあり、最終的に各種のサイトカインやケモカイン、炎症性メディエータの産生を惹起する。ＩＬ－３３により誘導されるサイトカインの例として、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３などが挙げられ、特にＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６、及びＩＬ－１３が誘導される。ＩＬ－３３により誘導されるケモカインの例としてＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２４などが挙げられる。ＩＬ－３３により誘導される炎症性メディエータの例としてＰＧＤ２、ＬＴＢ４などが挙げられる。ＩＬ－３３により誘導されるサイトカインやケモカイン、炎症性メディエータは、免疫系細胞の遊走、サイトカイン産生、脱顆粒に関与し炎症を惹起する。本発明では、ＩＬ－３３は、後述するＩＬ－３３受容体に結合して作用するものであれば、全長ＩＬ－３３またはその活性型断片のいずれかを指してもよいし、それらの誘導体若しくは変異体であってもよい。また、ヒトＩＬ－３３でも他の生物由来のＩＬ－３３でもよい。中でも配列表の配列番号２２６のアミノ酸配列で表されるヒトＩＬ－３３が好ましい。
　ＩＬ－３３が結合するＩＬ－３３受容体は、ＳＴ２とＩＬ－１ＲＡｃＰ（ＩＬ－ｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とのヘテロ二量体から構成される。ＩＬ－３３受容体において、ＩＬ－３３を特異的に認識して結合する部位は、ＳＴ２の細胞外ドメインに存在する。ＩＬ－３３の受容体は、様々な免疫系細胞（Ｔｈ２細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、グループ２自然リンパ球（ナチュラルヘルパー細胞）、ｎｕｏｃｙｔｅ、Ｉｈ２（ｉｎｎａｔｅ　ｈｅｌｐｅｒ　ｔｙｐｅ　２）細胞など）や上皮細胞などで発現しているが、これらの細胞に限定されない。
［ＩＬ－３３関連疾患］
　本願においてＩＬ－３３関連疾患とは、ＩＬ－３３が過剰に細胞外に放出されるために惹起される疾患を意味し、ＩＬ－３３関連疾患はＩＬ－３３の機能を阻害することができる薬剤により予防、治療または軽減することができる。ＩＬ－３３関連疾患としては、例えば喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌が挙げられる。
［フレームワーク領域］
　フレームワーク領域とは免疫グロブリン分子の可変領域のうち、相補性決定領域以外の部分をいう。フレームワーク領域には軽鎖、重鎖それぞれに４つのフレームワーク領域（フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３及びフレームワーク領域４）がある。本願では、免疫グロブリン分子のフレームワーク領域はカバット（Kabat）の番号付けシステム（Kabatら, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA）に従って決定される。
［生殖系列］
　生殖系列とは精子や卵子などの一群の生殖細胞を意味し、特別に言及がない限り、ヒトの生殖系列のことをいう。抗体を産生するＢリンパ球と異なり、生殖細胞の免疫グロブリンの遺伝子は変異が生じていない。したがって、「生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列」と記載した場合は、免疫グロブリンのフレームワーク領域のアミノ酸配列に変異が生じていないアミノ酸配列を意味し、「生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列の組合せのアミノ酸配列」と記載した場合には、４つのフレームワーク領域の１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、別の生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列であることを意味する。ヒト免疫グロブリンの軽鎖可変領域の遺伝子はκ鎖でＶκセグメントとＪκセグメント、及びλ鎖でＶλセグメントとＪλセグメントに分かれており、ＶκセグメントとＶλセグメントにフレームワーク領域１からフレーム領域３が、ＪκセグメントとＪλセグメントにフレームワーク領域４が存在する。ヒト免疫グロブリンの重鎖可変領域の遺伝子はＶＨセグメント、ＤＨセグメント、ＪＨセグメントに分かれており、ＶＨセグメントにフレームワーク領域１からフレーム領域３が、ＪＨセグメントにフレームワーク領域４が存在する。ヒト免疫グロブリンのＶκ、Ｖλ、ＶＨ、Ｊκ、Ｊλ、ＪＨの各セグメントの生殖系列のアミノ酸配列を表４に表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［ヒトモノクローナル抗体］
　ヒトモノクローナル抗体は、ヒトの生殖系列の免疫グロブリンの配列に由来する可変領域及び定常領域を有するモノクローナル抗体をいう。本願においてヒトモノクローナル抗体の可変領域は、他のヒトモノクローナル抗体の可変領域の一部又は全部との組換え体でもよく、該組換え体においては抗体の結合性に影響を与えない観点から、フレームワーク領域と相補性決定領域との境界で組換えが生じてよく、免疫原性を高めない観点から、フレームワーク領域１からフレームワーク領域４のフレームワーク領域の各領域が、他のヒトモノクローナル抗体のフレームワーク領域１からフレームワーク領域４のフレームワーク領域の各領域と組換えが生じてもよい。さらに、本発明においてヒトモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体の変異体であってもよく、抗原への結合性を維持又は改善しつつ、免疫原性を低下させるために、ヒトモノクローナル抗体の相補性決定領域に変異がある相補性決定領域のアミノ酸配列と、フレームワーク領域に変異がない生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列とを含む、ヒトモノクローナル抗体が好ましい。
［単離した］
　単離した抗体の「単離した」とは、同定され、かつ、分離された、及び／または、自然状態での成分から回収された、という意味である。自然状態での不純物は、その抗体の診断的または治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン及びその他の蛋白質性のまたは非蛋白質性の溶質が挙げられる。一般的に、抗体を単離するには、少なくとも１つの精製工程によって精製すればよく、少なくとも１つの精製工程により精製された抗体を「単離した抗体」ということができる。
［中和］
　本願において「中和」とは目的の標的に結合し、かつ、その標的のいずれかの機能を阻害することができる作用のことをいう。すなわち、「抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体」は、そのＩＬ－３３に対する結合が、ＩＬ－３３ポリペプチドによって誘導される生物活性の阻害をもたらすモノクローナル抗体を意味するものとする。ＩＬ－３３の生物学的活性の阻害は、ＩＬ－６などのＩＬ－３３誘導性サイトカインの産生の阻害を含むが、これに限定されない。ＩＬ－３３の生物学的活性の指標は、当分野において知られたいくつかのｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ分析の１つまたはそれ以上によって評価することができる。なお、「ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体」と記載した場合は、ＩＬ－３３に結合しＩＬ－３３のいずれかの機能を阻害する、ヒトモノクローナル抗体を意味する。
［アンタゴニスト］
　本願において「アンタゴニスト」とは目的の標的に対し中和作用を有する物質の総称を意味する。すなわち、「ＩＬ－３３のアンタゴニスト」は、ＩＬ－３３に結合して、ＩＬ－３３のいずれかの機能を阻害することができる物質であり、例えば抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が含まれる。
［相補性決定領域］
　相補性決定領域とは免疫グロブリン分子の可変領域のうち、抗原結合部位を形成する領域をいい、超可変領域とも呼ばれ、免疫グロブリン分子ごとに特にアミノ酸配列の変化が大きい部分をいう。相補性決定領域には軽鎖、重鎖それぞれに３つの相補性決定領域（相補性決定領域１、相補性決定領域２及び相補性決定領域３）がある。本願では、免疫グロブリン分子の相補性決定領域はカバット（Kabat）の番号付けシステム（Kabatら, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA）に従って決定される。
［競合する］
　本発明において、モノク口一ナル抗体と「競合する」とは、本明細書に記載された表面プラズモン共鳴(SPR)法によって測定した場合に、該モノクローナル抗体の存在により、有意差をもってＩＬ－３３との結合が低下することをいう。
　本発明において「競合する抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マルチスペシフィック抗体、及び人工抗体、並びにそれらの機能改変抗体、並びにそれらのコンジュゲート抗体、並びにそれらのフラグメントを含むものとする。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はその実施の形態のみに限定されない。
本発明はＩＬ－３３のエピトープに結合するモノクローナル抗体に関する。このエピトープに結合するモノクローナル抗体がヒトＩＬ－３３の活性を中和しうることから、該エピトープは配列表の配列番号２２６に示されるヒトＩＬ－３３の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれるアミノ酸配列であることが好ましく、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位（ＰＥＰ１２）、１３１位～１５０位（ＰＥＰ１４）、２３１位～２５０位（ＰＥＰ２４）又は２５１位～２７０位（ＰＥＰ２６）に含まれるアミノ酸配列であることがより好ましい。ＩＬ－３３は細胞外へ放出される際に切断されることが多い。ＩＬ－３３の一次配列上で離れているアミノ酸残基が、タンパク質のフォールディング等に基づきエピトープを形成する場合、ＩＬ－３３の切断により、フォールディングが崩れたり、該エピトープを構成する離れているアミノ酸残基が断片上から消失することにより、該断片との親和性が著しく減少することがある。従って、抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体の結合するエピトープは連続するアミノ酸配列であることが好ましい。
　エピトープに結合するモノクローナル抗体が中和作用を発揮するためには、例えばＩＬ－３３のＩＬ－３３受容体への結合を妨げることが必要である。したがって、本発明において、好ましいエピトープは、単にＩＬ－３３タンパク質の表面上に位置しているのみならず、ＩＬ－３３受容体に近接して存在することが好ましい。そこで、本発明者等は、後述の実施例に記すように非特許文献１１で示された結晶構造解析のデータに基づき立体構造モデリングを行い、最も近接するＩＬ－３３受容体を構成する原子との間の原子間距離が５Å以内のＩＬ－３３の原子（界面原子）を含むアミノ酸を特定した。界面原子を含むアミノ酸としては、ＰＥＰ１２のＰ１１８（配列表の配列番号２２６の１１８位のプロリン残基を「Ｐ１１８」と表記する。以後同様に表記する）、Ｉ１１９、Ｔ１２０、Ｙ１２２、Ｌ１２３、Ｒ１２４、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｓ１２７、Ｙ１２９、Ｎ１３０、ＰＥＰ１４のＤ１３１、Ｑ１３２、Ｓ１３３、Ｔ１３５、Ａ１３７、Ｌ１３８、Ｅ１３９、Ｓ１４２、Ｙ１４３、Ｅ１４４、Ｉ１４５、Ｙ１４６、Ｅ１４８、Ｄ１４９、Ｌ１５０、ＰＥＰ２４のＤ２４４、Ｎ２４５、Ｈ２４６、ＰＥＰ２６のＫ２６６、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｅ２６９が挙げられる。ＩＬ－３３を中和することができるモノクローナル抗体が特異的に結合する機能的なエピトープとしては、界面原子を含むアミノ酸を有するエピトープが好ましい。機能的なエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の中和作用は、機能的なエピトープ中に存在する界面原子の数や、界面原子の立体構造における位置などに依存すると考えられるが、かかる理論に束縛されることを意図しない。
本発明の好ましい態様として、配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位（ＰＥＰ１２）、１３１位～１５０位（ＰＥＰ１４）、２３１位～２５０位（ＰＥＰ２４）又は２５１位～２７０位（ＰＥＰ２６）の連続するアミノ酸配列からなるエピトープであるモノクローナル抗体が挙げられる。本発明のより好ましい態様として、該エピトープが配列表の配列番号２２６の１３８位～１４７位または１３９位～１４７位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープであるモノクローナル抗体が挙げられる。
　本発明者らは、ＰＥＰ１４と結合する2種類のモノクローナル抗体を用いてエピトープを構成する最小限のアミノ酸配列を調べたところ、ＩＬ－３３のエピトープとして、配列表の配列番号２２６の１３８～１４７位及び１３９～１４７位の連続するアミノ酸配列を特定した。従って、本発明は、配列表の配列番号２２６の１３８～１４７位及び１３９～１４７位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープに関する。
モノクローナル抗体が本発明のエピトープに結合するモノクローナル抗体であるかは、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴(SPR)法、ＫｉｎＥｘＡ法などの当該技術の分野で一般的に実施される方法により調べることができる。例えば、ＳＰＲ法を利用した本願実施例に記載のペプチドアレイスキャン法では、本発明のエピトープペプチドを用いて試験した場合、モノクローナル抗体のエピトープへの結合をＲＵ値の有意な増加として測定することができる。また、ＫｉｎＥｘＡ法を利用た本願実施例に記載の方法では解離定数（Ｋｄ）を測定することができるが、エピトープペプチドに対する解離定数は低い方が好ましく、例えば１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、１０ｐＭ以下であることが好ましい。
　本発明の別の態様では、本発明の、配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体を含む医薬組成物に存する。また、本発明のモノクローナル抗体を投与することを含むＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減方法、並びに、ＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減用医薬の製造のための本発明のモノクローナル抗体の使用に関する。
　ＩＬ－３３関連疾患の例として、非限定的に、喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、アレルギー性脳脊髄炎、好酸球増多症候群、リウマチ性多発筋痛、リウマチ性心疾患、多発性硬化症、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、ライター症候群等）、全身性エリトマトーデス（円板状狼蒼を含む）、天疱瘡、類天疱瘡、乾癬、強直性脊椎炎、肝炎（例えば、自己免疫性肝炎、慢性活動性肝炎等）、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン感受性腸疾患等）、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性炎症性眼疾患、自己免疫性新生児血小板減少症、自己免疫性好中球減少、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、アドレナリン作動薬耐性、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ　ｇｒｅａｔａ）、抗リン脂質症候群、副腎の自己免疫疾患（例えば、自己免疫性アジソン病等）、セリアックスプルー－皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、寒冷凝集素病、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症（ｎｅｐｈｒｏｐｈａｔｈｙ）等）、グレーブス病、甲状腺機能亢進症（すなわち、橋本甲状腺炎）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、混合結合組織病、１型または免疫介在性糖尿病、悪性貧血、多発性軟骨炎（ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｄｒｉｔｉｓ）、多腺症候群、スティッフマン症候群、白斑、サルコイドーシス、多腺性内分泌障害、他の内分泌腺不全、動脈硬化症、肝線維症（例えば、原発性胆汁性肝硬変等）、肺線維症（例えば、突発性肺線維症等）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群、レイノー現象等を含む）、尿細管間質性腎炎、デンスデポジット病、急性腎障害、心筋炎、心筋症、神経炎（例えば、ギラン・バレー症候群等）、結節性多発性動脈炎、心臓切開症候群（ｃａｒｄｉｏｔｏｍｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、ＩｇＡ神経障害、扁平苔癬、メニエール病、ポスト心筋梗塞（ｐｏｓｔ－ＭＩ）、ブドウ膜炎、ブドウ膜炎眼炎（Ｕｖｅｉｔｉｓ　Ｏｐｔｈａｌｍｉａ）、血管炎、原発性無ガンマグロブリン血症、癌（例えば、脳腫瘍、喉頭癌、口唇口腔癌、下咽頭癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、肺癌、胃癌、副腎皮質癌、胆管癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ユーイング腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫等）、免疫系による排除に抵抗を示す感染（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ））、強毒性インフルエンザ感染症に伴う致死的サイトカインストーム、並びに、敗血症が挙げられ、好ましくは、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌などが挙げられる。
　本発明のさらに別の態様では、配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体を含む、サイトカイン、ケモカインまたは炎症性メディエータの発現抑制剤にも存する。
　本発明のサイトカイン、ケモカインまたは炎症性メディエータ発現抑制剤により抑制されるサイトカインはＩＬ－３３により誘導されるサイトカインであり、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３等が挙げられる。また、当該抑制剤により抑制されるケモカインはＩＬ－３３により誘導されるケモカインであり、例えば、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２４等が挙げられる。当該抑制剤により抑制される炎症性メディエータはＩＬ－３３により誘導される炎症性メディエータであり、例えば、ＰＧＤ２、ＬＴＢ４等が挙げられる。本発明の特に好ましい態様は、抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体を含むＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６またはＩＬ－１３の発現抑制剤であり、より好ましくはＩＬ－６の産生抑制剤である。
本発明のさらに別の態様では、抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体が結合するエピトープに関する。本発明においてエピトープは、抗体の認識に必要となる６～２０のアミノ酸からなる配列に関している。別の態様では、特定された配列の周囲のアミノ酸又は立体構造上近傍のアミノ酸を含んで、さらなるエピトープを構成していてもよいが、不連続なアミノ酸配列を含まない、連続するアミノ酸配列であることが好ましい。
　したがって、本発明のエピトープを構成する連続するアミノ酸配列のアミノ酸残基数は、少なくとも５、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、さらに好ましくは少なくとも８、さらにより好ましくは少なくとも９である。さらに、より十分な抗原性を発揮する観点から、少なくとも１０、より好ましくは１５、さらに好ましくは少なくとも２０である。一方で、エピトープに含まれる配列が長くなると、抗体により認識される部分が複数含まれる可能性が生じ、そのような場合、所望の中和作用を有する抗体の生成又はスクリーニングができなくなる可能性が生じる。したがって、本発明のエピトープに結合する抗体が、所望の中和作用を発揮することを担保する観点から、エピトープ配列の長さは、３０以下であることが好ましく、より好ましくは２０以下、さらにより好ましくは１５以下であることが好ましい。エピトープに含まれる連続するアミノ酸配列の残基数としては、例えば５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、及び２０個のうちの１つから選択される残基数である。
　エピトープは、その抗原性を変化させない限りにおいて、１又は数個のアミノ酸変異、すなわちアミノ酸置換、欠失または挿入が導入されていてもよい。導入される変異の数は、好ましくは５以下、より好ましくは３以下、最も好ましくは１である。さらに、エピトープには、修飾、例えば元のタンパク質が有していた糖鎖などの修飾や末端修飾等が加えられていてもよい。また、別の態様では、その抗原性を変化させない限りにおいて、本発明で特定されたエピトープの連続するアミノ酸からなる配列に対し、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％、より一層好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるエピトープであってもよい。エピトープペプチドは例えばベイトとして使用する場合ヒスチジンやビオチンなどのタグが付加されてもよく、ワクチンとして使用される場合はＫＬＨなどのキャリアタンパク質と結合してもよい。
ここで同定した参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ペアワイズアラインメントにおいて、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用することによって得られる。
アミノ酸配列比較にＢＬＡＳＴが用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの％アミノ酸配列同一性は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴのＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用いて得られる。
　本発明により見出されたエピトープは、ＩＬ－３３の中和抗体が特異的に結合する機能的なエピトープである。したがって、本発明の機能的なエピトープを利用することで、例えば新規のＩＬ－３３のアンタゴニスト作用を有する抗体を効率的に取得することができる。すなわち、全長ＩＬ－３３又は成熟型ＩＬ－３３に対するモノクローナル抗体群に対し、本発明の機能的なエピトープに結合する抗体をスクリーニングすることで、アンタゴニスト作用を有するモノクローナル抗体を取得することが可能になる。したがって、本発明のさらなる態様では、本発明は、ＩＬ－３３の機能的なエピトープを用いたアンタゴニスト作用を有する抗体のスクリーニング方法にも関する。より具体的に、ファージディスプレイ技術等でナイーブ抗体ライブラリからＩＬ－３３アンタゴニスト作用を有する抗体のクローンを濃縮する場合、まず、全長又は成熟型ＩＬ－３３タンパク質をベイトとして、ライブラリ選択を行い、ＩＬ－３３表面上の様々なエピトープに結合する抗体クローンを濃縮し、次に本発明で見出した機能的なエピトープペプチドをベイトとしてライブラリ選択を行うことで、機能的なエピトープに特異的に結合するＩＬ－３３のアンタゴニスト作用を有する抗体を効率的にスクリーニングすることが可能となる。
　本実施例において、本発明者らは、２０残基長のエピトープへの結合性が特定されたモノクローナル抗体群について、抗体濃度を変えて使用して、ＩＬ－３３アンタゴニスト活性を調べた。これにより、アンタゴニスト作用を有する抗体を生成又はスクリーニングするのに適したエピトープを決定した。その結果によると、配列表の配列番号２２６の１１１～１３０位（ＰＥＰ１２）、１３１～１５０位（ＰＥＰ１４）、２３１～２５０位（ＰＥＰ２４）及び２５１～２７１位（ＰＥＰ２６）からなる群から選ばれるエピトープに結合する抗体が、抗体濃度に応じたアンタゴニスト作用の増加が明確に認められたことから、アンタゴニスト作用を有する抗体を生成又はスクリーニングする上で適した機能的なエピトープであることが分かった。したがって、本発明の１の態様では、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位及び２５１～２７１位からなる群から選ばれる領域のうちの少なくとも６、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５の連続するアミノ酸からなる配列を含むエピトープに関する。別の態様では、本発明は、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位、及び２５１位～２７０位からなる群から選ばれるエピトープに関する。
　エピトープは、通常行われるペプチド合成技術を用いることにより製造可能である。製造され、精製されたエピトープは動物の免疫や、該エピトープに対する抗体を産生するために用いることができる。さらに、別の方法では、精製されたエピトープをファージディスプレイ法において用いることにより、当該エピトープに結合するモノクローナル抗体を生成又はスクリーニングすることもできる。また、エピトープをアジュバントと共にワクチンとして用いることもできる。
本発明は、配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体に関する。モノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マルチスペシフィック抗体、及び人工抗体、並びにそれらの機能改変抗体、並びにそれらのコンジュゲート抗体、並びにそれらのフラグメントが含まれるものとする。本発明におけるモノクローナル抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよい。本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法、及び遺伝子工学的手法など、任意の公知の手法を用いて生成することができる。
　ハイブリドーマ法では、免疫原を用いて免疫した動物、特にラットまたはマウスの脾臓またはリンパ節から採取したＢ細胞と、不死化細胞、例えばミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作成し、所望の結合性を有する抗体を生成するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングされたハイブリドーマを用いて生成することができる。また、ヒトの抗体遺伝子を導入したマウスを使用することによりヒト抗体を取得することができる。ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。モノクローナル抗体を作製する技術は、公知の技術を用いればよく、例えばCurrent Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc.のChapter 2の記載に従うことで生成することができる。
　ファージディスプレイ法では、任意のファージ抗体ライブラリより選別したファージを、目的の免疫原を用いてスクリーニングを行い、免疫原に対する所望の結合性を有するファージを選択する。次に、ファージ内に含まれる抗体対応配列を単離又は配列決定し、単離された配列又は決定された配列情報に基づき、モノクローナル抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを構築する。そしてかかる発現ベクターをトランスフェクションされた細胞株を培養することにより、モノクローナル抗体を産生させることができる。ファージ抗体ライブラリとして、ヒト抗体ライブラリを用いることにより、所望の結合性を有するヒト抗体を生成することができる。
　遺伝子工学的手法では、抗体をコードする遺伝子配列において、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する配列、又はその他の配列に変異を導入して、かかる配列を発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に形質転換し組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させたり、別の機能を付加すること等を目的として、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、マルチスペシフィック抗体、人工抗体も使用することができるし、これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体は、非ヒト抗体可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（EP 125023、WO 92/19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、非ヒト由来抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、その他の部分のヒト抗体領域をコードするＤＮＡを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
　マルチスペシフィック抗体とは、２つ以上の異なる抗原特異性を有する２つ以上の独立した抗原認識部位を持ち合わせた非対称の抗体である。バイスペシフィック抗体などのマルチスペシフィック抗体は2種類以上のモノクローナル抗体の抗原結合領域を利用して、遺伝子工学的な手法により作製することができる。該遺伝子工学的な手法はこの分野において既に確立されている。例えば、2種類のモノクローナル抗体の抗原結合領域を直列に連結したＤＶＤ－Ｉｇ（Wuら、Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)）の技術や、抗体のＦｃ領域を改変することにより、異なった抗原に結合する2種類の抗体の重鎖が組み合わされるＡＲＴ－Ｉｇの技術(Kitazawaら、Nature Medicine 18(10), 1570(2012))を利用すれば所望のバイスペシフィック抗体が取得できる。
　人工抗体とは、例えばタンパク質スキャフォールドであり、抗体の構造を有しないものの、抗体と同様の機能を有する人工抗体である。タンパク質スキャフォールドとしてはヒトのセリンプロテアーゼ阻害剤のKunitzドメインやヒトのファイブロネクチンの細胞外ドメイン、アンキリン、リポカリンなどが利用され、スキャフォールド上の標的結合部位の配列を改変すれば本発明のエピトープに結合するタンパク質スキャフォールドを生成することができる（特許文献4、Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48）。
　本発明のモノクローナル抗体のＦｃ領域等のアミノ酸配列や糖鎖を改変することにより、抗体の有する抗原結合機能以外の細胞殺傷機能、補体活性化機能や血中半減期等を調節することができる（Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685）。このような機能改変抗体は、例えば以下のような方法で調製される。モノクローナル抗体を、宿主細胞としてα１，６―フコース転移酵素（ＦＵＴ８）遺伝子を破壊したＣＨＯ細胞を用いて製造すると、糖鎖のフコース含量が低下して細胞殺傷機能が高まった抗体が得られ、ＦＵＴ８遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を宿主細胞として製造すると、細胞殺傷機能が低い抗体が得られる（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）。また、Ｆｃ領域のアミノ酸残基を改変することで補体活性化機能を調節することができる（米国特許第６７３７０５６号、米国特許第７２９７７７５号、米国特許第７３１７０９１号）。さらに、Ｆｃ受容体の１つであるＦｃＲｎへの結合を高めたＦｃ領域の変異体を使用することにより、血中半減期の延長を図ることができる（橋口周平ら、生化学、２０１０、Vol.82(8), p710）。これらの機能改変抗体は、遺伝子工学的に製造することができる。
　本発明に使用するモノクローナル抗体は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、化学的修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明におけるモノクローナル抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681, )。
　本発明では、上記のような全抗体とは別に、エピトープ結合性を有し、アンタゴニスト活性を発揮する限り、モノクローナル抗体のフラグメントやその修飾物であってよい。例えば、抗体のフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
さらにこれらの抗体のフラグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、アルブミン、酵素などの抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合していてもよい。
　モノクローナル抗体製造のための産生系は、in vitro又はin vivoの産生系のいずれかを利用することができる。in vitroの産生系としては、真核細胞、例えば動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を使用する産生系や原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌細胞を使用する産生系が挙げられる。使用される動物細胞としては、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏといった一般に使用される細胞、昆虫細胞、植物細胞などが用いられてもよい。in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、例えば哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。哺乳類動物としては、例えばヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にてモノクローナル抗体を産生する場合、モノクローナル抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際公開第ＷＯ９４/１１５２３号参照）。
　得られたモノクローナル抗体は、均一になるまで精製することができる。モノクローナル抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、モノクローナル抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
　本発明の、配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合の抗原性が低いことから、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。さらに、ヒト抗体の中でも、フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列であることが好ましい。そこで本発明は、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体であって、該抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に関する。
　このヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、可変領域のフレームワーク領域が、ヒト生殖系列フレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列を含むことにより、これらの領域に起因する免疫原性が全くないか、または顕著に少ないという特徴を有する一方で、ＩＬ－３３に結合し、その機能を妨げることができる。したがって、該抗体は医薬として用いられた場合に、ヒト抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＨＡＨＡ）を誘導しにくく、それにより生体内で排除されず、その結果、ＩＬ－３３を中和する効果が長く、またＨＡＨＡと結合することに起因する炎症を惹起しなければ安全な抗体である。
　ヒトの生殖系列における軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ＮＣＢＩなどのデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi)に登録されているヒト抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域のＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列や、表４に記載の生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列が用いられる。軽鎖可変領域は、λ鎖の可変領域であってもよいし、κ鎖の可変領域であってもよい。ヒト生殖系列における軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域としては、生体内での出現頻度が高い、多用されるフレームワーク領域が好ましく、このようなヒト重鎖フレームワーク領域として、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４などのフレームワーク領域１、フレームワーク領域２及びフレームワーク領域３が挙げられ、ＪＨ４などのフレームワーク領域４が挙げられる。また、生体内での出現頻度の高いヒト軽鎖フレームワーク領域としてＶλ１－４７、Ｖλ２－１４、Ｖκ３－２０、Ｖκ１－３９などのフレームワーク領域１、フレームワーク領域２及びフレームワーク領域３が挙げられ、Ｊλ２などのフレームワーク領域４が挙げられる。重鎖フレームワーク領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域であれば任意に組み合わせて使用することができ、例えばＶＨ３-２３のフレームワーク領域１及びフレームワーク領域２と、ＶＨ３－３０のフレームワーク領域３を選択して重鎖フレームワーク領域として用いることができる。また、軽鎖のフレームワーク領域も同様に、ヒト軽鎖フレームワーク領域であれば、任意に組み合わせて使用することができる。
　本願において好ましい生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＪＨ４、Ｖλ１－４７、Ｊλ２のフレームワーク領域のアミノ酸配列である。具体的には、軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５であるフレームワーク領域が好ましく、軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５であるフレームワーク領域が最も好ましい。
　本発明の別の態様としては、軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列が、表１に示される相補性決定領域の組み合わせのアミノ酸配列である、単離したヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に関する。
　より好ましい態様では、表1に示すＣ１からＣ３０の相補性決定領域の組み合わせを有するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３の中でも特に、ＩＬ－３３受容体に結合し、活性を発揮する成熟型ＩＬ－３３、例えばＩＬ－３３（残基９５から残基２７０）、ＩＬ－３３（残基９９から残基２７０）、ＩＬ－３３（残基１０９から残基２７０）、ＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）などに対して結合性及び中和活性を有する。さらに好ましくは、表1に示すＣ１からＣ３０の相補性決定領域の組み合わせを有するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３（残基１３１から残基１５０）に対して結合性を有する。
　本発明においては、結合性及び/または物性の点で改良された相補性決定領域の組み合わせであることが好ましい態様である。特に好ましくは、ヒトＩＬ－３３に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）の上限値が、約３．５×１０-5/ｓｅｃ以下であり、より好ましくは約２．０×１０-5／ｓｅｃ以下、さらに好ましくは約１．５×１０-5／ｓｅｃ以下、さらにより好ましくは約１．０×１０-5／ｓｅｃ以下であり、下限値は、特に限定されないが、例えば１０-7／ｓｅｃ以上、より好ましくは１０-6／ｓｅｃ以上、さらに好ましくは約５×１０-6／ｓｅｃ以上であるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が挙げられる。
　ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の中でも、ヒトＩＬ－３３に対する解離定数（Ｋｄ）が低いものがさらに好ましく、上限値として例えば１０-9Ｍ以下、より好ましくは１０-10Ｍ以下、さらにより好ましくは１０-12Ｍ以下であり、下限値としては特に限定されないが、例えば１０-14Ｍ以上、より好ましくは１０-13以上であるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が挙げられる。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３刺激時のＨＵＶＥＣからのＩＬ－６の産生を阻害し、中でも、その阻害効果が強いものが好ましい。具体的に本発明の好ましい態様としては、後述する実施例１０で記載するように、１μｇ／ｍＬのヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の添加により、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３で刺激した時のＨＵＶＥＣからのＩＬ－６の産生が阻害される割合（阻害率）が約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらにより好ましくは約９０％以上のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が挙げられる。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３刺激時のＫＵ－８１２細胞からのＩＬ－５、ＩＬ－６及び／またはＩＬ－１３の産生を阻害する。中でも、その阻害効果が強いものが好ましい。具体的に本発明の好ましい態様としては、後述する実施例１１で記載するように、３μｇ／ｍＬのヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の添加により、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３で刺激した時のＫＵ－８１２細胞からのＩＬ－５、ＩＬ－６及び／またはＩＬ－１３の産生が阻害される割合（阻害率）が約３０％以上、より好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体である。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３刺激時のヒト末梢血単核球からのＩＦＮ－γの産生を阻害する。中でも、その阻害効果が強いものが好ましい。具体的に本発明の好ましい態様としては、後述する実施例１２で記載するように、１０μｇ／ｍＬのヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の添加により、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３で刺激した時のヒト末梢血単核球からのＩＦＮ－γの産生が阻害される割合（阻害率）が約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体である。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、マウスにヒトＩＬ－３３を投与した時の炎症を抑制する。中でも、抗炎症効果が強いものが好ましい。具体的に本発明の好ましい態様としては、後述する実施例１３で記載するように、１０ｍｇ／ｋｇでヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を７日間連日腹腔内投与することにより、０．４μｇ／個体のヒトＩＬ－３３の７日間連続投与による脾臓重量、血清中のＩｇＡ濃度、ＩｇＥ濃度、好中球数、好塩基球数、好酸球数及び／または血清中のＩＬ－５濃度の増加が抑制される割合が約３０％以上、より好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約８０％以上のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が挙げられる。
　さらに、本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、抗体の物性がすぐれていることが好ましい。中でも、動的光散乱による評価で粒子径分布の形状が二峰性を示さない、凝集性が著しく低いヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が好ましく、コロイド安定性の指標である相互作用パラメータ（ｋＤ）が高いものが好ましく、例えば-１２．４ｍＬ／ｇ以上であることが好ましく、より好ましくは－１０ｍＬ／ｇ以上であり、さらに好ましくは－８．５ｍＬ／ｇ以上である。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は熱力学安定性にすぐれた抗体であることが好ましく、例えば免疫グロブリンドメインのフォールディングが崩壊する温度（Ｔｍ）が６５℃以上、好ましくは６８℃以上、より好ましくは７０℃以上、さらにより好ましくは７３℃以上である熱力学的安定性を示す抗体が好ましい。
　さらに、本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、抗体の安定性がすぐれていることが好ましい。抗体の安定性は、保存安定性試験や強制酸化試験などの一般的な手法により測定することができる。保存安定性試験として、例えば本発明の好ましい態様としては、後述する実施例２１で記載するように、４０℃で４週間保存した場合に抗体分子のモノマーの割合が９０％以上が好ましく、より好ましくは９５％以上であり、またヒトＩＬ－３３蛋白質への結合活性が９５％以上が好ましく、より好ましくは９９％以上である。
　また本願実施例２２で記載するように１％の過酸化水素水で３７℃、２４時間の条件で強制酸化した場合に、ヒトＩＬ－３３蛋白質への結合活性が８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上保持することが好ましい。
　上記を勘案すると、本発明においては、表１のＣ１からＣ２８の相補性決定領域の組み合わせから選択されるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、より好ましい抗体である。また、本発明のさらに好ましい態様としては、特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ（表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７またはＣ１８）を有するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が挙げられる。
　上記の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせにより特定されるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗原結合性が担保される限りにおいて任意のフレームワーク領域であってもよい。ヒトに対する免疫原性を低下させる観点では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列フレームワーク領域の各アミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列であることが好ましいが、より好ましくは、ヒト生体において多用される生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列である。
　本発明で好ましいフレームワーク領域のアミノ酸配列は、軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である。本発明でより好ましいフレームワーク領域のアミノ酸配列は、軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である。
　したがって、本発明において好ましい重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組み合わせは、例えば表２に表される。
　本発明の好ましい態様は、表２のＶ１から２８の可変領域の組み合わせを有するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体である。
　本発明のより好ましい態様は、特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ（表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７またはＶ１８）を有するヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体である。
　ヒト免疫グロブリン分子には、重鎖の定常領域の違いにより、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、またはε鎖の重鎖を有する、それぞれＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤまたはＩｇＥが存在するが、本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の定常領域としては、その全てを包含する。また、軽鎖は、その染色体上の位置に応じて、κ鎖とλ鎖が存在するが、その両方を含むものとする。抗体医薬を製造する場合、凝集性の観点から、κ鎖が好ましいものの、λ鎖はκ鎖と異なったアミノ酸配列を有し、しかもκ鎖と同様に多様である点でλ鎖の軽鎖を有する抗体も有用である。本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、血中安定性の観点から、軽鎖がλ鎖であり、重鎖がγ鎖のＩｇＧであることが好ましく、軽鎖がλ鎖であり、重鎖がγ１鎖であるＩｇＧ１であることがより好ましい。
　ＩＬ－３３のアミノ酸配列は動物種によって異なるため、配列表の配列番号２２６で示されるヒトＩＬ－３３と配列表の配列番号２２７で示されるサルＩＬ－３３でもアミノ酸配列に違いがある。一般に、抗体医薬の薬理試験や安全性試験では、サルが実験材料として用いられるため、本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、サルＩＬ－３３にも結合することが好ましく、ヒトＩＬ―３３と同程度の親和性でサルＩＬ－３３に結合することがより好ましい。特に好ましくは、サルＩＬ－３３に対するkoffのヒトＩＬ－３３に対するkoffの割合が約２０倍以内であり、より好ましくは約１０倍以内、さらに好ましくは約５倍以内であるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体である。
　本発明の抗体のフラグメントとしては、例示的にＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びｓｃＦｖが挙げられ、さらにこれらの抗体のフラグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、アルブミン、酵素などの抗体以外の機能分子を結合していてもよい。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、それ自体にＩＬ－３３以外の別の抗原結合特異性を有する抗体を結合することにより、バイスペシフィック抗体などのマルチスペシフィック抗体を作製することができる。ＩＬ－３３以外の別の抗原としては、非限定的にＴＮＦ―α、ＩＬ―６受容体、ＣＤ３、ＣＤ２０、α４インテグリン、ＢＬｙｓ、Ｔｈｙｍｉｃ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＩｇＥ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５等が挙げられる。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体及びその抗体のフラグメントにおいては、そのＦｃ領域等を改変することにより、細胞殺傷機能や補体活性化機能、血中半減期等の機能を調節した機能改変抗体を取得することができる（設楽研也、藥學雜誌、2009、Vol.129(1), p3；石井明子ら、日本薬理學雜誌、2010、Vol.136(5), p280；橋口周平ら、生化学、2010、Vol.82(8), p710 Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685）。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体及びその抗体のフラグメントは、他の機能分子を結合して、コンジュゲート抗体とすることができ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、アルブミン、サイトカイン、酵素などの機能分子を結合して新たな機能を付加することができる。
　本発明の別の態様として、フレームワーク領域が生殖系列のアミノ酸配列であるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の蛋白質部分をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、及び、該宿主細胞を培養することによるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の製造方法が挙げられる。
　本発明のさらに別の態様では、上記ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、組成物にも存する。ＩＬ－３３は、炎症等を惹起することから、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減の用途が期待される。したがって、本発明の一態様では、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、ＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減用の医薬組成物に存する。さらに別の態様では、ＩＬ－３３が、サイトカイン、ケモカイン、炎症性メディエータなどを誘導することから、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、サイトカイン、ケモカインまたは炎症性メディエータ発現抑制剤にも存する。
　本発明のサイトカイン、ケモカインまたは炎症性メディエータ発現抑制剤により抑制されるサイトカインはＩＬ－３３により誘導されるサイトカインであり、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３等が挙げられる。また、当該抑制剤により抑制されるケモカインはＩＬ－３３により誘導されるケモカインであり、例えば、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２４等が挙げられる。当該抑制剤により抑制される炎症性メディエータはＩＬ－３３により誘導される炎症性メディエータであり、例えば、ＰＧＤ２、ＬＴＢ４等が挙げられる。本発明の特に好ましい態様は、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含むＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６またはＩＬ－１３の発現抑制剤であり、より好ましくはＩＬ－６の産生抑制剤である。
　本発明の別の態様では、本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物に存する。また、本発明のモノクローナル抗体を投与することを含むＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減方法、並びに、ＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減用医薬の製造のための本発明のモノクローナル抗体の使用に関する。
　ＩＬ－３３関連疾患の例として、非限定的に、喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、アレルギー性脳脊髄炎、好酸球増多症候群、リウマチ性多発筋痛、リウマチ性心疾患、多発性硬化症、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、ライター症候群等）、全身性エリトマトーデス（円板状狼蒼を含む）、天疱瘡、類天疱瘡、乾癬、強直性脊椎炎、肝炎（例えば、自己免疫性肝炎、慢性活動性肝炎等）、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン感受性腸疾患等）、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性炎症性眼疾患、自己免疫性新生児血小板減少症、自己免疫性好中球減少、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、アドレナリン作動薬耐性、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ　ｇｒｅａｔａ）、抗リン脂質症候群、副腎の自己免疫疾患（例えば、自己免疫性アジソン病等）、セリアックスプルー－皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、寒冷凝集素病、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症（ｎｅｐｈｒｏｐｈａｔｈｙ）等）、グレーブス病、甲状腺機能亢進症（すなわち、橋本甲状腺炎）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、混合結合組織病、１型または免疫介在性糖尿病、悪性貧血、多発性軟骨炎（ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｄｒｉｔｉｓ）、多腺症候群、スティッフマン症候群、白斑、サルコイドーシス、多腺性内分泌障害、他の内分泌腺不全、動脈硬化症、肝線維症（例えば、原発性胆汁性肝硬変等）、肺線維症（例えば、突発性肺線維症等）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群、レイノー現象等を含む）、尿細管間質性腎炎、デンスデポジット病、急性腎障害、心筋炎、心筋症、神経炎（例えば、ギラン・バレー症候群等）、結節性多発性動脈炎、心臓切開症候群（ｃａｒｄｉｏｔｏｍｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、ＩｇＡ神経障害、扁平苔癬、メニエール病、ポスト心筋梗塞（ｐｏｓｔ－ＭＩ）、ブドウ膜炎、ブドウ膜炎眼炎（Ｕｖｅｉｔｉｓ　Ｏｐｔｈａｌｍｉａ）、血管炎、原発性無ガンマグロブリン血症、癌（例えば、脳腫瘍、喉頭癌、口唇口腔癌、下咽頭癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、肺癌、胃癌、副腎皮質癌、胆管癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ユーイング腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫等）、免疫系による排除に抵抗を示す感染（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ））、強毒性インフルエンザ感染症に伴う致死的サイトカインストーム、並びに、敗血症が挙げられ、好ましくは、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌などが挙げられる。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む医薬組成物は、活性成分であるヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体、及び、その塩の他に、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤を含んでいてもよい。さらに本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体以外の他の活性成分、例えば抗炎症性薬剤や免疫抑制剤等を含んでもよい。このような組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供されるが、抗体医薬として使用される観点から非経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内、経鼻、点眼、経皮、経粘膜、髄膜内、経直腸、筋肉内、脳内投与等が挙げられるがこれらに限られるものではない。
　医薬組成物は、その投与経路に応じて適宜剤形することができ、例えば注射剤、粉末剤、輸液製剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよいが、非経口投与する観点では、注射剤、輸液製剤、用時溶解性の粉末剤等が好ましい。また、これらの製剤は医薬用に用いられる種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、例えば、１日、１週間、１月間に１回もしくは１年間に１から７回の間隔での持続注入によってか、または投薬によって提供され得る。投薬は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、経直腸、筋肉内、脳室内に、または、吸入によって提供され得る。好ましい用量プロトコルは、重大な望まれない副作用を避ける最大用量または投薬頻度を含むものである。全体の週用量は、一般的に少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、最も一般的には少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、代表的には少なくとも約１μｇ／ｋｇ、より代表的には少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、最も代表的には少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、最適には少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、より最適には少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ、そして最も最適には少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇである。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ－３３関連疾患患者の特定の細胞、組織または血清中におけるＩＬ－３３の発現を検出するための、診断アッセイに有用である。診断用途では典型的には、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体が検出可能な部分で標識されたコンジュゲート抗体であることが好ましい。
　本発明の別の態様としては、特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ（表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７もしくはＣ１８）または特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせ（表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７もしくはＶ１８）のアミノ酸配列を含む抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に対し、ＩＬ－３３との結合が競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に関する。
　上記のような、特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせまたは特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に対し、ＩＬ－３３との結合が競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ファージディスプレイなどの遺伝子工学的な手法やハイブリドーマ法等により取得した抗ＩＬ－３３抗体を、例えば以下の表面プラズモン共鳴(SPR)法によりスクリーニングすることにより取得できる。
　アビジンが固定されたセンサーチップにビオチン化したヒトＩＬ－３３蛋白質（４μｇ／ｍＬ）をリガンドとしてロードすることで、１３００から１６００ＲＵ相当のヒトＩＬ－３３蛋白質を固定する。次に任意の抗ＩＬ－３３抗体（１５μｇ／ｍＬ）をアナライトとしてロードし、センサーチップ上に固定されたヒトＩＬ－３３蛋白質に結合させる。これを複数回繰り返すことで、センサーチップ上のヒトＩＬ－３３蛋白質の全ての分子に任意の抗ＩＬ－３３抗体が結合している状態（飽和状態）を作り、飽和状態での結合量（飽和結合量１）を求める。
　同様の実験を本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせまたは特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体でも実施し、飽和状態での結合量（飽和結合量２）を求める。
　続いて、センサーチップ上のヒトＩＬ－３３蛋白質を本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせまたは特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体で飽和させた後、任意の抗ＩＬ－３３抗体（１５μｇ／ｍＬ）をアナライトとしてロードし、本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせまたは特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体で飽和されたヒトＩＬ－３３蛋白質に追加される形で結合するかどうかを調べる。
　任意の抗ＩＬ－３３抗体が、本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体で飽和されたヒトＩＬ－３３蛋白質に追加される形で、上記で算出した任意の抗ＩＬ－３３抗体の飽和結合量１を示しながら結合できる場合は、その抗体は「競合しない」と判断される。一方、任意の抗ＩＬ－３３抗体が、本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体で飽和されたヒトＩＬ－３３蛋白質に追加される形で結合できない場合は、その抗体は「競合する」と判断される。また任意の抗ＩＬ－３３抗体が、本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体で飽和されたヒトＩＬ－３３蛋白質に追加される形で結合できる場合でも、追加される結合量が有意差をもって飽和結合量１に達しない場合は、その抗体は「競合する」と判断される。有意差は一般的な検定方法（例えば、スチューデントのt検定）で調べることができ、有意水準は５％または１％以下とする。
　上記の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に対し、ＩＬ－３３との結合が競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよいし、これらの抗体の組み合わせであるキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。
　上記の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に対し、ＩＬ－３３との結合が競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であることが好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
　上記の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ、または、特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせのアミノ酸配列を含む、ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に対しＩＬ－３３との結合が競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体としては、抗体のフラグメントがある。抗体のフラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはｓｃＦｖが挙げられるが、ＰＥＧなどが結合した抗体のフラグメントが好ましい。
　以下に、本発明の抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体等の製造方法について説明する。遺伝子工学的手法を用いれば、所望の相補性決定領域の組み合わせ及びフレームワーク領域の組み合わせを含み、かつ、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に形質転換して、該宿主細胞を培養することにより本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を製造することができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。また、軽鎖及び重鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列に連結することにより、重鎖の全長及び軽鎖の全長をコードするＤＮＡ配列を作製することができる。本発明において好ましいヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナ抗体の重鎖全長及び軽鎖全長をコードするＤＮＡ配列は、例えば軽鎖としてλ鎖を有するＩｇＧ１であり、以下の表５に表される。但し、遺伝子工学的手法により動物細胞を用いて該抗体を製造する場合、重鎖のＣ末端のリジン残基が除かれる場合があり、表5に示される重鎖の核酸配列（配列表の配列番号２５４～２７７）の３‘末端を構成する３ヌクレオチド「aag」は各重鎖核酸配列から除かれていてもよい。：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　抗体製造のための産生系は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系を利用することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞、例えば動物細胞、植物細胞または真菌細胞を使用する産生系や原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌細胞を使用する産生系等が挙げられる。使用される動物細胞としては、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＮＳ０、Ｎａｍａｌｗａ、ＹＢ２／０といった一般に使用される細胞、昆虫細胞、植物細胞などが用いられてもよいが、２９３細胞やＣＨＯ細胞が好ましい。
　上述のようにｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいは重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際公開９４／１１５２３号参照）。動物細胞で使用されうるベクターとしては、例えばｐＣｏｎＰｌｕｓ、ｐｃＤＭ８、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲＥＰ４などが好ましいが、これらに限定されるものではない。
　得られた抗体は、均一になるまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等が挙げられる。例えばプロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ， ＰＯＲＯＳ， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ． Ｆ．（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
　本願に係るヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体に、ＩＬ－３３以外の別の抗原結合特異性を有する抗体を結合することにより、バイスペシフィック抗体などのマルチスペシフィック抗体を作製することができる。バイスペシフィック抗体の製造法は、既に公知である化学的方法（Nisonoff,A. et al., Archives of biochemistry and biophysics., 1961, Vol.90, p.460-462, Brennan, M.et al., Science, 1985, Vol. 299, p.81-83）が良く知られている。これらの方法は、まず２種類の抗体を酵素によりそれぞれ加水分解した後、抗体の重鎖のジスルフィド結合を還元剤で切断し、続いて異種の抗体を混合し再酸化することで二価反応性抗体を得るものである。最近では、グルタルアルデヒドやカルボジイミドなどの架橋剤を用いた調製方法も開示されている（特開平２－１５５６号公報）。遺伝子工学的にバイスペシフィック抗体などのマルチスペシフィック抗体を作製する方法もこの分野において既に確立されて方法である。例えば、2種類のモノクローナル抗体の抗原結合領域を直列に連結したＤＶＤ－Ｉｇ（Wuら、Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)）の技術や、抗体のＦｃ領域を改変することにより、異なった抗原に結合する2種類の抗体の重鎖が組み合わされるＡＲＴ－Ｉｇの技術(Kitazawaら、Nature Medicine 18(10), 1570(2012))を利用すれば所望のバイスペシフィック抗体が取得できる。
　ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の機能改変抗体やコンジュゲート抗体は、以下のような方法で調製される。例えば、本願ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を、宿主細胞としてα１，６―フコース転移酵素（ＦＵＴ８）遺伝子を破壊したＣＨＯ細胞を用いて製造すると、糖鎖のフコース含量が低下して細胞殺傷機能が高まった抗体が得られ、ＦＵＴ８遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を宿主細胞として製造すると、細胞殺傷機能が低い抗体が得られる（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）。また、Ｆｃ領域のアミノ酸残基を改変することで補体活性化機能を調節することができる（米国特許第６７３７０５６号、米国特許第７２９７７７５号、米国特許第７３１７０９１号）。さらに、Ｆｃ受容体の１つであるＦｃＲｎへの結合を高めたＦｃ領域の変異体を使用することにより、血中半減期の延長を図ることができる（橋口周平ら、生化学、2010、Vol.82(8), p710；Strohl, Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol.20, p685）。これらの機能改変抗体は、遺伝子工学的に製造することができる。
　本発明のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は他の機能分子を結合してコンジュゲート抗体を作製することができる。例えば、抗体に機能分子としてＰＥＧを結合する場合、ＰＥＧは非限定的に分子量２０００から１０００００Ｄａ、より好ましくは１００００から５００００Ｄａのものが使用でき、直鎖型でもよく、ブランチ型のものでもよい。ＰＥＧは、例えばＮＨＳ活性基を用いることにより、抗体のアミノ酸のＮ末端アミノ基等に結合することができる。機能分子として放射性物質を用いる場合、131Ｉ、125Ｉ、90Ｙ、64Ｃｕ、99Ｔｃ、77Ｌｕまたは211Ａｔなどが用いられる。放射性物質は、ク口ラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。機能分子として毒素を用いる場合、細菌毒素（例えば、ジフテリア毒素）、植物毒素（例えば、リシン）、低分子毒素（例えば、ゲルダナマイシン）、メイタンシノイド、及びカリケアマイシン等が用いられる。機能分子として低分子化合物を用いる場合、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトロレキサート、マイトマイシン、ネオカルチノスタチン、ビンデシン及びＦＩＴＣ等の蛍光色素等が挙げられる。機能分子として、酵素を用いる場合、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が用いられる。毒素、低分子化合物または酵素を化学的に結合する時に使用するリンカーとしては、二価ラジカル（例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン）、－（ＣＲ2）nＯ（ＣＲ2）n－（Ｒは任意の置換基）で表されるリンカーやアルコキシの反復単位（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ等）及びアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ）、並びに、二酸エステル及びアミド（スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等が挙げられる）が挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681)。
　本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ（表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７もしくはＣ１８）または特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせ（表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７もしくはＶ１８）のアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体と、ＩＬ－３３との結合に競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよいし、これらの抗体の組み合わせであるキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。これらの抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法などの遺伝子工学的手法など、任意の公知の手法を用いて取得することができるが、特に好ましくは遺伝子工学的手法により取得することができる。
　キメラ抗体は非ヒト由来の抗体可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に形質転換し産生させることにより得られる（欧州公開第１２５０２３号、国際公開９２／１９７５９号参照）。
　ヒト化抗体は非ヒト由来抗体の相補性決定領域と、その他の部分のヒト抗体領域をコードするＤＮＡを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
　ヒト抗体は、例えば、以下に提供される実施例に記載の手順を使用して調製される。またヒト抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ-細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983 Immunol Today 4: p72)及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., p. 77)等を使用し、調製することもできる。さらに、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニックマウスに抗原蛋白質を免疫し、ハイブリドーマを作製することにより、ヒト抗体を生成することもできる。トランスジェニックマウスとしては、ＨｕＭａｂ（登録商標）マウス(Medarex)、ＫＭＴＭマウス (Kirin Pharma)、ＫＭ(ＦＣγＲＩＩｂ-ＫＯ)マウス、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（Regeneron）等が挙げられる。
　本発明の別の態様として、本発明の特定の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせ（表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７もしくはＣ１８）または特定の可変領域アミノ酸配列の組み合わせ（表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７もしくはＶ１８）のアミノ酸配列を含むヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体と、ＩＬ－３３との結合が競合する人工抗体が挙げられる。人工抗体としては、例えばヒトファイブロネクチンタイプＩＩＩドメインの１０番目のユニット（ＦＮｆｎ１０）が利用でき、該ユニットのＢＣ、ＤＥ、及び／またはＦＧループに変異をいれることにより所望の標的に結合する人工抗体が取得できる。人工抗体としては、ファイブロネクチンの細胞外ドメイン以外に、セリンプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインやアンキリン、リポカリンなどのペプチドが利用できる。これらの人工抗体は該ペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを大腸菌や酵母または動物細胞等に導入し、該宿主細胞を培養した培養上清から精製することにより、遺伝子工学的に製造することができる。
　人工抗体としては、上記のような特定の蛋白質、またはその一部のアミノ酸配列を利用するのではなく、アミノ酸をランダムに組み合わせたランダム配列ライブラリから、抗体のように本発明のエピトープに特異的に結合する低分子ペプチド分子として探索することもできる（例えば、Hipolito et al., Current Opinion in Chemical Biology, 2012 Vol 16: 196, Yamagishi et al., Chemistry & Biology, 2011 Vol 18: 1562）。このようなペプチドは、遺伝子工学的な方法以外に、フルオレニルメチルオキシ力ルボニル法、tーブチルオキシ力ルボニル法などの化学合成法によって製造することもできる。
［抗体の配列の組み合わせ］
　本願に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせである表１のＣ１からＣ３０、可変領域のアミノ酸配列の組み合わせである表２のＶ１からＶ３０、相補性決定領域の核酸配列の組み合わせである表５のＣＮ１からＣＮ３０、及び、抗体の核酸配列の組み合わせである表５のＩＧＮ１からＩＧＮ３０はそれぞれ同一のクローンの配列に相当し、対応関係を下記表６に表す。例えば、クローンＡ１０－１Ｃ０４の相補性決定領域のアミノ酸配列はＣ１の６個の相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせであり、この相補性決定領域のアミノ酸配列の組み合わせはＣＮ１の６個の核酸配列によりコードされうる。また、該クローンの重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列はＶ１の２個のアミノ酸配列であり、Ｖ１の可変領域を含むλ鎖の軽鎖及びγ鎖の重鎖のアミノ酸配列はＩＧＮ１の２個の核酸配列によりコードされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、特に言及しない限り、本発明は以下に限定されるものではない。
実施例１：抗ＩＬ－３３抗体の取得とエピトープペプチドの同定
［抗体の取得］
　ヒトＩＬ－３３蛋白質を動物に免疫し、免疫動物の脾細胞からハイブリドーマを作製することでモノクローナル抗体を取得した。また免疫動物の脾細胞から回収したＲＮＡを用いて作製した動物の抗体ライブラリや、ヒトナイーブ抗体ライブラリからヒトＩＬ－３３蛋白質に結合する抗体をファージディスプレイ技術によりクローニングした。このようにして８種類（抗体Ａ～Ｈ）の抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体を取得した。
［ペプチドアレイスキャン］
　取得したＩＬ－３３抗体のエピトープを同定するために、ヒトＩＬ－３３の部分ペプチド（２０残基長）と、各抗体との結合性を調べるペプチドアレイスキャンを実施した。主な成熟型ヒトＩＬ－３３分子をカバーするように、Ｎ末から１０１位のバリン（Ｖ１０１）から２７０位のスレオニン（Ｔ２７０）までの範囲で１０アミノ酸ごとに開始位置をずらしながら計１６種類の２０アミノ酸長ペプチド（ＰＥＰ１１からＰＥＰ２６）を合成した。これらのペプチドの配列と位置関係を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　Ｎ末端をビオチン化した各ペプチドをＳｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）装置（Bio-Rad, ProteOn XPR36）のニュートロアビジンセンサーチップ上にリガンドとして固定化した。また陽性対照として成熟型ヒトＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）のＮ末にアビタグ配列を付加し、ビオチンリガーゼ反応によりアビタグ配列特異的にビオチン化した蛋白質（ｈＩＬ－３３）をＳＰＲセンサーチップ上にリガンドとして固定化した。リガンドを固定化したセンサーチップに、アナライトとして、被験抗体、ヒトＩＬ－３３受容体白質（組換えヒトＳＴ２　Ｆｃキメラ）（Enzo Life Science, ALX-201-367-C050）またはバッファー（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）のみを流して（抗体濃度：１０μｇ／ｍｌ；流速：１００μｌ／ｍｉｎ）結合させ、洗浄後にセンサーチップ上のリガンドに結合しているアナライト量（抗体量）をＲＵ値として示した。結果を図２に示した。
　ヒトＩＬ－３３蛋白質のＮ末端側にエピトープをもつ抗体から順に、抗体Ａと抗体ＢがＰＥＰ１２に結合した。抗体Ｃと抗体ＤがＰＥＰ１４に結合した。抗体ＥがＰＥＰ１６とＰＥＰ１７の両方に結合した。 抗体ＦはＰＥＰ２４に結合した。抗体Ｇと抗体ＨはＰＥＰ２６に結合した。市販の抗ヒトＩＬ－３３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ３６２５）は検討に使用した１６種類のヒトＩＬ－３３ペプチドの大部分に結合した。一方、ヒトＩＬ－３３受容体（ＳＴ２）はヒトＩＬ－３３蛋白質には結合したが、ヒトＩＬ－３３ペプチド（ＰＥＰ１１～ＰＥＰ２６）にはほとんど結合せず、ＩＬ－３３のどの部分がＳＴ２との結合に重要かは本試験では分からなかった。また、バッファーのみやマウスＩｇＧ（R&D Systems, MAB002）ではリガンドへの結合は認められなかった。ｈＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）への結合性を、使用した抗体間で比較したところ、ｈＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）への結合が強いものから、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｂ、抗体Ａ、抗体Ｃ、抗体Ｆの順となった。
実施例２：抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体のＩＬ－３３中和活性の評価－１ 
　固相化ヒトＳＴ２とヒトＩＬ－３３の結合に対する阻害作用を指標として抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｅ、抗体ＦのＩＬ－３３中和活性の測定を実施した。９６ウェルマイクロプレート（NuncTM、#442404）に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した組換えヒトＳＴ２　Ｆｃキメラ（Enzo Life Science, ALX-201-367-C050）（１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を分注して４℃で一晩静置した。翌日、上記プレートを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｂ）で１回洗浄後、同溶液（２５０μＬ／ウェル）を添加して室温で２時間ブロッキングした。その後、ＰＢＳ－Ｂで希釈した被験抗体（終濃度１０μｇ／ｍＬ）および組換えヒトＩＬ－３３蛋白質（ATGen、ILC0701）（終濃度１μｇ／ｍＬ）の混合溶液（５０μＬ／ウェル）を添加して室温で２時間インキュベートした。マイクロプレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で５回洗浄した後、ＰＢＳ－Ｂで希釈したヤギ抗ヒトＩＬ－３３抗体（R&D Systems：AF3625、終濃度１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を添加して室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄後、ＰＢＳ－Ｂで２０００倍希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Invitrogen：61-1620、５０μＬ／ウェル）を添加して室温で1時間インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳ－Ｔで5回洗浄後、SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL：52-00-01、５０μＬ／ウェル）を添加して室温で２０分間反応させた。TMB Stop Solution（KPL：50-85-05、５０μＬ／ウェル）で反応を停止させ、プレートリーダー（SPECTRA MAX 190、Molecular Devices）を用いて、波長４５０ｎｍおよび６２０ｎｍの吸光度の差を測定した。ＳＴ２とＩＬ－３３の結合に対する抗体による阻害作用（ＩＬ－３３／ＳＴ２結合系競合阻害率）はヒトＩＬ－３３の代わりにヒトＩＬ－１β（PeproTech，200-01B）（終濃度１μｇ／ｍＬ）を添加したサンプルをバックグラウンドとし、ヒトＩＬ－３３（終濃度１μｇ／ｍＬ）を単独で添加したサンプルに対する阻害率（％）を求めた。その結果、抗体Ａ（エピトープはＰＥＰ１２）が６６％阻害、抗体Ｂ（エピトープはＰＥＰ１２）が５５％阻害、抗体Ｅ（エピトープはＰＥＰ１６－１７）が０％阻害、抗体Ｆ（エピトープはＰＥＰ２４）が３９％阻害となり、検討した４種類の抗体のうち、抗体Ｅを除く全ての抗体（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｆ）が終濃度１０μｇ／ｍＬで３０％以上の阻害率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例３：抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体のＩＬ－３３中和活性の評価－２
　正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（LONZA, CLC2517A）を用いたヒトＩＬ－３３誘発ＩＬ－６産生に対する阻害作用を指標として被験抗体（抗体Ａ～Ｈ）のＩＬ－３３中和活性の測定を実施した。ＨＵＶＥＣを９６ウェルマイクロプレート（IWAKI、MT4940-010）に播種し（６×１０3／０．１ｍＬ／ウェル）、細胞がコンフルエントになっていることを確認した。培地（ＥＧＭ－２培地（LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176））に抗ＩＬ－３３抗体（終濃度１０μｇ／ｍＬ）および組換えヒトＩＬ－３３（ATGen、ILC0701、終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を添加し（０．２ｍＬ／ウェル）、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に培地中のＩＬ－６濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Thermo Scientific、EH2IL6)）を用いて測定した。また細胞カウントキット（Dojindo、345-06463)を用いて培地採取時の細胞の生存率を測定し、ＩＬ－６産生抑制作用が生存細胞数の低下に起因しないことを確認した。被験抗体のＩＬ－３３中和活性（ＨＵＶＥＣ系ＩＬ－６産生阻害率）として、組換えヒトＩＬ－３３単独処理によるＩＬ－６産生に対する阻害率（％）を算出した。その結果、抗体Ａ（エピトープはＰＥＰ１２）が５１％阻害、抗体Ｂ（エピトープはＰＥＰ１２）が４８％阻害、抗体Ｃ（エピトープはＰＥＰ１４）が３３％阻害、抗体Ｄ（エピトープはＰＥＰ１４）が３８％阻害、抗体Ｅ（エピトープはＰＥＰ１６－１７）が０％阻害、抗体Ｆ（エピトープはＰＥＰ２４）が３８％阻害、抗体Ｇ（エピトープはＰＥＰ２６）が４８％阻害、抗体Ｈ（エピトープはＰＥＰ２６）が５６％阻害となり、８種類の抗体のうち、抗体Ｅを除く全ての抗体が３０％以上の阻害率を示した（表９）。これらの抗体のうち配列番号１の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位及び２５１～２７０位からなる群から選ばれるエピトープに結合する抗体は、抗体濃度を３、１０及び３０μｇ／ｍＬとした場合の中和活性の増加が大きく（例えば、抗体Ｄではそれぞれ２３、４２、６１％阻害）、アンタゴニスト作用を有する抗体を生成する上で適したエピトープであることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　抗体Ｅは、ｈＩＬ－３３に結合するにもかかわらず（図２）、機能的中和能を示さなかった（表８、表９）。特許文献２（ＷＯ２００８／１３２７０９）には、エピトープ１（１５５～１９８位）、エピトープ２（１６５～１８８位）、エピトープ３（１７５～１７８位）の３種類のエピトープが記載されているが、これらのエピトープは今回ＩＬ－３３の中和活性が無いことが確認された抗体Ｅのエピトープペプチド（１５１～１８０位）と重複することが明らかとなった。これらの結果から特許文献２のエピトープに対する抗体は、ＩＬ－３３と受容体であるＳＴ２との結合を十分に阻害できず、ＩＬ－３３の中和活性が無いか、仮にあったとしても非常に低いと考えられた。
　抗体ＥがＩＬ－３３の中和活性を示さなかった理由として、理論的にはエピトープの優劣以外に、親和性不足の可能性が存在する。しかし、抗体Ｄ、抗体Ｇ、抗体Ｈといった、抗体ＥよりもｈＩＬ－３３への結合が抗体Ｅよりも弱い傾向にあるにも関わらず、明確なＩＬ－３３の中和活性を示したクローンの存在により、この可能性は低いと考えられる。これらのことからサイトカインであるＩＬ－３３を中和することを目的とした場合、特許文献２に記載のエピトープはＩＬ－３３への結合とＩＬ－３３の中和活性が関連しないエピトープであるのに対し、今回我々が見出した４つのエピトープ（ＰＥＰ１２、ＰＥＰ１４、ＰＥＰ２４、ＰＥＰ２６）は、ＩＬ－３３への結合とＩＬ－３３の中和活性が関連する機能的なエピトープであると考えられる。機能的なエピトープに結合する抗体は、ＩＬ－３３に対するアンタゴニスト作用が高い一方で、非機能的なエピトープに結合する抗体は、ＩＬ－３３に対するアンタゴニスト作用が低いか、又は全くないと考えられる。
実施例４：エピトープペプチドのヒトＩＬ－３３立体構造へのマッピング
　上記の４つのエピトープペプチドについてさらに、アンタゴニスト作用を有する抗体の生成に好ましいエピトープである界面原子（ＳＴ２を構成する原子から最短５Å圏内のＩＬ－３３の原子）を特定するために、ヒトＩＬ－３３・ヒトＳＴ２複合体の立体構造の上にエピトープペプチドをマッピングした。ヒトＩＬ－３３・ヒトＳＴ２複合体のＸ線結晶構造（Research Collaboratory for Structual Bioinformatics:　PDB ID 4KC3）ではＩＬ－３３蛋白質の一部の構造が欠如していたため、今回同定した全てのエピトープペプチドの位置を示すことができなかった。そこで、上記Ｘ線結晶構造（4KC3）を鋳型としてホモロジーモデルを作製し（図３、Accelrys社Discovery Studio 3.5を使用）、今回中和活性が認められた抗体のエピトープペプチド（ＰＥＰ１２、ＰＥＰ１４、ＰＥＰ２４、ＰＥＰ２６）をマッピングした（図４～７）。図４～７ではヒトＩＬ－３３やエピトープペプチドは濃い灰色、それらと結合するＳＴ２は薄い灰色で示した。ＩＬ－３３蛋白質表面上の受容体との接触面の位置を明示するために、界面原子を大き目の球で強調して表示した。その結果、これらのエピトープペプチド（ＰＥＰ１２、ＰＥＰ１４、ＰＥＰ２４、ＰＥＰ２６）はそれぞれ界面原子を含むアミノ酸を有することがわかった。界面原子を含むアミノ酸としては、ＰＥＰ１２のＰ１１８、Ｉ１１９、Ｔ１２０、Ｙ１２２、Ｌ１２３、Ｒ１２４、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｓ１２７、Ｙ１２９、Ｎ１３０、ＰＥＰ１４のＤ１３１、Ｑ１３２、Ｓ１３３、Ｔ１３５、Ａ１３７、Ｌ１３８、Ｅ１３９、Ｓ１４２、Ｙ１４３、Ｅ１４４、Ｉ１４５、Ｙ１４６、Ｅ１４８、Ｄ１４９、Ｌ１５０、ＰＥＰ２４のＤ２４４、Ｎ２４５、Ｈ２４６、ＰＥＰ２６のＫ２６６、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｅ２６９が挙げられる。アンタゴニスト作用を有する抗体が特異的に結合するエピトープとしては界面原子を含むアミノ酸を有するエピトープが好ましいと考えられる。
実施例５：ヒト抗ＩＬ－３３抗体（親クローン）の取得
　ヒトｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリ（BioInvent, n-CoDeR)(Soderlind et al., Nature biotechnology, 2000 Vol.18(8), p852)を用いて、成熟型ＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）に結合し、ＩＬ－３３とＳＴ２の結合を阻害し、かつ後述する正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＩＬ－３３依存的ＩＬ－６産生を指標としてＩＬ－３３の活性を阻害する、２種類の親クローン（ｓｃＦｖ）（分子形がｓｃＦｖであることを意味する、以下同様に表記する）を取得した（クローン名：Ａ００－００７０、Ａ００－００３６）。これらの抗体の塩基配列を決定し、軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。Ａ００－００７０及びＡ００－００３６の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列の組み合わせは、それぞれ表２のＶ２９及びＶ３０であった。
実施例６：相補性決定領域を改良するためのアミノ酸置換の決定
　２種類の親クローンのＩＬ－３３への親和性向上と物性改善（表面疎水性の低減による凝集性の低減及び溶解度の向上）を目的として、Ｆａｂリボゾームディスプレイ及びＦａｂファージディスプレイによる相補性決定領域の改良を行なった。相補性決定領域の改良は２段階にて実施し、第一段階でＩＬ－３３への親和性向上と物性改善を狙える１アミノ酸置換を決定し、第二段階でこれらの１アミノ酸置換の複数の組合せを決定した(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012 Vol. 428(3), p395)。
　２種類の親クローンの軽鎖及び重鎖可変領域を用いてＦａｂリボゾームディスプレイベクターを構築した。これを鋳型としたｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ＰＣＲ及びｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲによる多段階のＰＣＲ反応により、抗体の６つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を構成する全てのアミノ酸残基を１つずつ全２０種類の天然アミノ酸にした、包括的１アミノ酸置換変異体ライブラリを構築した。再構築型無細胞翻訳系ＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍ（Genefrontier, PUREfrex）(Shimizu et al., Nature Biotechnology, , 2001Vol. 19(8), p751）を用いたＦａｂリボゾームディスプレイ法(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012 Vol. 428(3), p395）により、組換ヒトＩＬ－３３蛋白質（ATGen、ILC0701）をベイトとして包括的１アミノ酸置換変異体ライブラリの濃縮を数ラウンド繰り返した。濃縮前（構築直後）のライブラリ及び濃縮後のライブラリに含まれる各クローン（Ｆａｂ）（分子形がＦａｂであることを意味する、以下同様に表記する）の軽鎖及び重鎖可変領域の塩基配列を次世代シーケンサ（Roche, 454）を用いて決定した。濃縮前後の各ライブラリから数千リードの配列データを取得して、相補性決定領域における全ての１アミノ酸置換変異体の存在頻度を算出した。次に濃縮前のライブラリと濃縮後のライブラリにおける全ての１アミノ酸置換変異体の存在頻度の変化倍率（濃縮比）を算出し、ライブラリ濃縮による濃縮比の大きさを指標として、ヒトＩＬ－３３蛋白質に対する親和性を向上させるために有用と考えられる１アミノ酸置換を決定した。さらにこれらの１アミノ酸置換の総数とアミノ酸配列上での分布状態を考慮し、第二段階で構築するカスタムライブラリでアミノ酸置換を導入する位置を決定した。
　親クローンＡ００－００７０では、ＬＣＤＲ１（配列表の配列番号２）の１２番目のアスパラギン、ＬＣＤＲ２（配列表の配列番号１１）の４番目のグルタミン、ＬＣＤＲ３（配列表の配列番号２３）の２番目のセリン、３番目のチロシン、６番目のセリン、ＨＣＤＲ１（配列表の配列番号４３）の１番目のアスパラギン酸、５番目のアスパラギン、ＨＣＤＲ２（配列表の配列番号６４）の４番目のセリン、５番目のセリン、７番目のセリン、９番目のイソロイシンにアミノ酸置換を導入することを決定した。親クローンＡ００－００３６では、ＬＣＤＲ１（配列表の配列番号６）の９番目のアスパラギン、１３番目のアスパラギン、ＬＣＤＲ２（配列表の配列番号２０）の６番目のアルギニン、７番目のロイシン、ＬＣＤＲ３（配列表の配列番号４０）の１番目のアラニン、９番目のアラニン、１０番目のバリン、ＨＣＤＲ１（配列表の配列番号４７）の１番目のアスパラギン、ＨＣＤＲ２（配列表の配列番号６４）の４番目のセリン、５番目のセリン、６番目のセリン、７番目のセリン、８番目のチロシン、９番目のイソロイシン、１０番目のチロシン、１１番目のチロシン、１３番目のアスパラギン酸、１６番目のリジン、ＨＣＤＲ３（配列表の配列番号７８）の２番目のグリシン、５番目のヒスチジン、６番目のアスパラギン酸にアミノ酸置換を導入することを決定した。
物性改善のために蛋白質構造解析プログラム（Accelrys, Discovery Studio）を使用して２種類の親クローンのホモロジーモデルを作成し、相補性決定領域において表面疎水性が高い領域を予測した。次にこのような領域の表面疎水性を低下させるために、親クローンＡ００－００７０では、ＬＣＤＲ３（配列表の配列番号２３）の３番目のチロシン、ＨＣＤＲ２（配列表の配列番号６４）の７番目のセリン、９番目のイソロイシンに、また親クローンＡ００－００３６では、ＬＣＤＲ２（配列表の配列番号２０）の６番目のアルギニン、７番目のロイシン、ＨＣＤＲ２（配列表の配列番号６４）の７番目のセリン、８番目のチロシン、９番目のイソロイシンにアミノ酸置換を導入することを決定した。これらの部位においてヒトＩＬ－３３蛋白質との結合能を維持しつつ表面疎水性の低減を図るために有用と考えられるアミノ酸置換を、包括的１アミノ酸置換変異体ライブラリを用いた変異分析における濃縮比のデータを考慮して決定した。
実施例７：相補性決定領域を改良したヒト抗ＩＬ－３３抗体の創製
　親和性向上と物性改善を目的とした上記の有用アミノ酸置換を複数組合せることにより本格的な相補性決定領域改良用カスタムライブラリを設計した。Ｆａｂリボゾームディスプレイ及びＦａｂファージディスプレイのベクターを構築し、Ｆａｂリボゾームディスプレイベクターを鋳型としたｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ＰＣＲ及びｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲによる多段階のＰＣＲ反応、及びＦａｂファージディスプレイベクターを鋳型としたクンケル法による部位特異的変異導入法（Fellouse et al., J. Mol. Biol. 2007 Vol. 373, p924）を実施することで、相補性決定領域を上記の設計に基づきランダム化した相補性決定領域改良用カスタムライブラリを構築した。ヒトＩＬ－３３蛋白質及びカニクイザルＩＬ－３３蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ：　ＥＨＨ５７４０４、配列表の配列番号２２７の残基１１２のＳｅｒから残基２６９のＧｌｕ）をベイトとして、Ｆａｂリボゾームディスプレイ及びＦａｂファージディスプレイによるライブラリ濃縮を数ラウンド繰り返した。後半のラウンドではＩＬ－３３蛋白質への結合の前にＯｃｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GE Healthcare）あるいはＰｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GE Healthcare）といった疎水カラム担体を用いたネガティブ選択を実施することで、ＩＬ－３３蛋白質へ親和性が高く、かつ表面疎水性が低いＦａｂを濃縮した。
　ベイトとして使用した組換え蛋白質は以下のように調製した。成熟型ヒトＩＬ－３３（残基１１２から残基２７０）および成熟型カニクイザルＩＬ－３３（配列表の配列番号２２７の残基１１２から残基２６９）はＮ末端側に６Ｈｉｓタグ－Ａｖｉタグを付加したものをｐＥＴ３０ａ（－)に挿入することで発現ベクターを構築し、組換え蛋白質を調製した。発現ベクターを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をＬＢ培地５ｍＬで前培養後、前培養液１ｍＬを５０ｍＬ発現培地(Merck, Overnight Express;カナマイシン添加）に植菌し、３０℃／２００ｒｐｍで約１８時間発現培養した。回収した菌体を洗浄後ＢａｇＢｕｓｔｅｒ（Novagen）で溶菌し上清を回収した。上清中に含まれる６Ｈｉｓタグ－Ａｖｉタグ－カニクイザル　ＩＬ３３（残基１１２から残基２６９）はＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、市販されているビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ、ＢｉｒＡ）を用いてＡｖｉタグ部分特異的にビオチン修飾を導入した。
　濃縮後のライブラリを用いてＦａｂを分泌発現する大腸菌ライブラリを構築し、数百クローンの大腸菌の培養上清を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定を実施した（Bio-Rad, ProteOn XPR36）。センサーチップ（Bio-Rad, NLC sensor chip）にビオチン化した前記ヒトＩＬ－３３蛋白質（４μｇ／ｍＬ）及び前記カニクイザルＩＬ－３３蛋白質（４μｇ／ｍＬ）をリガンドとしてロードし、１３００から１６００ＲＵ相当のヒトＩＬ－３３蛋白質及び１１００から１５００ＲＵ相当のカニクイザルＩＬ－３３蛋白質を固定した。次に大腸菌の培養上清をアナライトとしてロードし、結合相１分、解離相１０から３０分のセンサーグラムを取得した。ＳＰＲデータ解析プログラム（Bio-Rad, ProteOn Manager v3.1.0）を用いてセンサーグラムのインタースポット補正及びブランク補正を実施し、Ｌａｎｇｍｕｉｒのｏｆｆ－ｒａｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓによりｋｏｆｆを求めた。
　相補性決定領域を改良したクローン（Ｆａｂ）の中からヒトＩＬ－３３蛋白質に対する親和性が向上し、かつカニクイザルＩＬ－３３蛋白質に対する結合性を有するクローンを、実施例８以後の高次評価に進める２８クローンとして決定した（表２のＶ１からＶ２８）。表１０に示すように、これらのクローン（Ｆａｂ）は親クローン（Ｆａｂ）と比べてヒト及びカニクイザルＩＬ－３３蛋白質に対する高い親和性（低いＫｏｆｆ値）を示した。これらのクローンの可変領域中のフレームワーク領域におけるアミノ酸置換はなかった。相補性決定領域中の同一の１アミノ酸置換であってもその親和性向上効果は１アミノ酸置換変異体の場合と複数アミノ酸置換変異体の場合で変化するため、第一段階での包括的１アミノ酸置換変異体ライブラリからの濃縮比が小さいにもかかわらず高次評価用２８クローンの配列中の頻度が高いアミノ酸置換や、逆に第一段階での濃縮比が大きいにもかかわらず高次評価用２８クローンの配列中の頻度が低いアミノ酸置換が存在した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例８：ＩｇＧ抗体の調製
取得したヒト抗ＩＬ－３３抗体の７クローン（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２、Ａ００－００７０、Ａ００－００３６）ついて、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＣＭＶプロモータの下流に挿入することにより、ＩｇＧを発現する哺乳細胞用発現ベクターを構築した。各クローンの軽鎖のＤＮＡ配列はそれぞれ、配列表の配列番号２２８、２３２、２３９、２４１、２４２、２３０及び２５３を用い、重鎖のＤＮＡ配列はそれぞれ、配列表の配列番号２５４、２６１、２６２、２６４、２６５、２７６及び２７７を用いた。遺伝子導入試薬　ＮｅｏＦｅｃｔｉｏｎ－２９３－１　（Astec）を使用して、上記発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３-Ｆ　細胞（Life Technologies）に導入した。遺伝子導入後５日間培養した後に培養上清を取得した。ＣＨＯ細胞による安定発現株はｐＣｏｎＰｌｕｓベクターとＣＨＯ　Ｋ１ＳＶ細胞を用いたＧＳシステム（Lonza）にて樹立した。　ＣＨＯ細胞安定発現株はＷＡＶＥ　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　ＳＹＳＴＥＭ　２０／５０　ＥＨＴ（GE Healthcare社）を用いて０．３×１０6　ｃｅｌｌｓ／ｍＬから培養を開始し、分泌されたＩｇＧを含む培養液を回収した。ＡＫＴＡ　ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１００（GE Healthcare）を使用し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ樹脂（GE Healthcare 、HiTrap MabSelect SuRe）を用いたアフィニティークロマトグラフィにより培養上清からＩｇＧを精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ樹脂に結合したＩｇＧをｐＨ３．２の溶出ｂｕｆｆｅｒで溶出し、すみやかに中和することでｐＨを中性付近にした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析した。精製純度を高める目的でＰｒｏｔｅｉｎ　Ａカラム精製後のＩｇＧをＣＨＴ（ｃｅｒａｍｉｃ　ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴｙｐｅＩ樹脂）（BIORAD）にて精製した。ＣＨＴに結合したＩｇＧをＮａＣｌ濃度のグラジエントで溶出し、目的のフラクションを回収後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析した。本精製法にて得た抗体を「中性精製抗体」とした。
　上記精製法のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ樹脂からの溶出工程の前に６　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｖｏｌｕｍｅの１００ｍＭ炭酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１１．０）による６分間の洗浄操作を加えた精製法も実施した。本精製法にて得た抗体を「アルカリ精製抗体」とした。アルカリ精製抗体の各工程における回収率を表１１に示した。精製後のアルカリ精製抗体はＶＩＶＡＳＰＩＮ　Ｔｕｒｂｏ１５　３００００ＭＷＣＯ（Sartoeius）にて遠心濃縮した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
実施例９：ＩＬ－３３蛋白質に対する親和性
　被験抗体（ＩｇＧ）（分子形がＩｇＧであることを意味する、以下同様に表記する）のヒトＩＬ－３３蛋白質に対する親和性はｋｉｎｅｔｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ(ＫｉｎＥｘＡ)によりＰＢＳ中での解離定数（Ｋｄ）を測定することで決定した（Sapidyne, KinExA3200）。一定濃度（終濃度で数十ｐＭから数百ｐＭ）の被験抗体に対しヒトＩＬ－３３蛋白質（ATGen, ILC0701）の濃度を広範囲（終濃度の上限を数ｎＭから数十ｎＭとし１２段階の２倍希釈系列で２０４８倍の濃度範囲）にタイトレートした混合サンプルを調製し、抗原抗体反応が平衡に達するまで室温でインキュベートした。平衡到達後にＫｉｎＥｘＡ３２００を用いてフリーの抗ＩＬ－３３抗体の存在率を測定した。ＫｉｎＥｘＡデータ解析プログラム（Sapidyne, KinExA Pro Software v3.5.3）を用いて、ヒトＩＬ－３３蛋白質に結合していない抗ＩＬ－３３抗体の存在率（縦軸）と抗原濃度（横軸）のプロットを理論式にフィッティングすることでＫｄを算出した。抗ＩＬ－３３抗体キャプチャー用ビーズは５０ｍｇのＡｚｌａｃｔｏｎｅ　ｂｅａｄｓ　（Sapidyne）を１ｍＬのコート溶液（１０μｇ／ｍＬ　ヒトＩＬ－３３蛋白質（ATGen, ILC0701）、５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．６）で懸濁し、室温で１時間インキュベートすることで調製した。検出用抗体はａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆ（ａｂ）’２－ＤｙＬｉｇｈｔ６４９（Jackson, 309-495-006）を使用した。表１２に示すように、中性精製抗体を用いた場合、相補性決定領域を改良した抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）のヒトＩＬ－３３蛋白質に対しする親和性は最も弱いＡ２３－１Ａ０５でＫｄ＝２３１ｐＭ、最も強いＡ２５－２Ｃ０２でＫｄ＝７２０ｆＭであった。
　同様にしてアルカリ精製抗体のヒトＩＬ－３３蛋白質（残基１１２－残基２７０）（ATGen, ILC0701）または全長ヒトＩＬ－３３蛋白質に対する親和性をＫｉｎＥｘＡで測定した（表１２）。ヒトＩＬ－３３蛋白質（残基１１２－残基２７０）に対する親和性は、Ａ１０－１Ｃ０４でＫｄ＝１００．３ｐＭ、Ａ２３－１Ａ０５でＫｄ＝１９５．３ｐＭ、Ａ２５－２Ｃ０２でＫｄ＝７００ｆＭ、Ａ２５－３Ｈ０４でＫｄ＝７．７ｐＭ、Ａ２６－１Ｆ０２でＫｄ＝５．３ｐＭであった。全長ヒトＩＬ－３３蛋白質に対する親和性は、Ａ１０－１Ｃ０４でＫｄ＝１７９．８ｐＭ、Ａ２６－１Ｆ０２でＫｄ＝１０．４ｐＭであった。
　リガンドとして使用した組換え蛋白質は以下のように調製した。全長ヒトＩＬ－３３蛋白質は、Ｎ末端側にＮｕｓＡタグ－６Ｈｉｓタグ－ＴＥＶ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ切断配列を付加したものをｐＥＴ３０ａ（＋）に挿入することで発現ベクターを構築し、組換え蛋白質を調製した。発現ベクターを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）株を前培養後、５０ｍＬのＬＢ培地にＯＤ＝０．５の密度で植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。４時間後に培養温度を１３℃に変更して３０分振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加して引き続き１３℃で７２時間振とう培養することで、全長ＩＬ－３３発現大腸菌を得た。全長ＩＬ－３３発現大腸菌をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Novagen）にて溶菌後、遠心分離を行い上清画分を得た。回収後の上清をＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ　Ｃｒｕｄｅカラム（GE Healthcare）によるＩＭＡＣ精製及びＣａｐｔｏＱ　Ｉｍｐｒｅｓｓカラム（GE Healthcare）による陰イオン交換精製に供し、蛋白純度を高めた。陰イオン交換後のサンプルをＶＩＶＡＳＰＩＮ６（5,000MWCO）による限外ろ過により遠心濃縮した。濃縮液１７５０μＬに対して、Turbo TEV protease（ナカライテスク）を１００μＬ、及び１Ｍ　ＤＴＴを４．５μＬ添加し４℃にてインキュベートすることによりＮｕｓＴａｇ及びＨｉｓＴａｇを切断した。タグ切断後サンプル中に含まれるＮｕｓＴａｇ及びＴｕｒｂｏ　ＴＥＶ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＨｉｓＴａｇ融合）を除去する為にＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｅｘｃｅｌカラム（GE Healthcare）に供し、その素通り画分を回収した。素通り画分に終濃度３．３ｍＭとなるようにＤＴＴを添加し、全長ヒトＩＬ－３３蛋白質としてＫｉｎＥｘＡでの測定に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例１０：ＨＵＶＥＣを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性をＨＵＶＥＣのＩＬ－３３依存的ＩＬ－６産生を指標として評価した。陽性対照として市販ポリクローナル抗ＩＬ－３３抗体（R&D Systems, AF3625）を使用した。ＨＵＶＥＣ（LONZA, CLC2517A）をＥＧＭ－２培地（LONZA, CLCC-3156, CLCC-4176）に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（IWAKI）に播種し（６ｘ１０3／ウェル）、細胞がコンフルエントになっていることを確認した。培地に抗ＩＬ－３３抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ（約６．７ｎＭ））及び組換えヒトＩＬ－３３（ATGen, ILC0701）（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（約５ｎＭ））の混合溶液を添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を採取して、培養上清中のＩＬ－６濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Thermo Scientific, EH2IL6）を用いて測定した。また、細胞カウントキット（Dojindo, 345-06463）を用いて培地採取時の細胞の生存率を測定し、ＩＬ－６産生の抑制作用が生存細胞数の低下に起因しないことを確認した。被験抗体のＩＬ－３３中和活性はＩＬ－３３単独処理によるＩＬ－６産生に対する阻害率（％）として算出した。中性精製抗体を用いた場合、Ａ１０－１Ｃ０４が６７％阻害、Ａ２３－１Ａ０５が７４％阻害、Ａ２５－２Ｃ０２が９６％阻害、Ａ２５－３Ｈ０４が９７％阻害、Ａ２６－１Ｆ０２が９６％阻害と強い中和活性を示したのに対し、親クローンであるＡ００－００７０が４％阻害、Ａ００－００３６が－２％と非常に弱い中和活性にとどまった。１０μｇ／ｍＬに濃度を上げることで、Ａ００－００７０が４２％阻害、Ａ００－００３６が３８％阻害と中程度の中和活性を示した。一方、市販ポリクローナル抗体（R&D Systems, AF3625）は終濃度１μｇ／ｍＬで添加した場合で３０％阻害と中程度の中和活性を示した。
　同様にＨＵＶＥＣにアルカリ精製被験抗体（終濃度０．１～１０μｇ／ｍＬ（約０．６７～６７ｎＭ））及び組換えヒトＩＬ－３３（ATGen, ILC0701）（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（約５ｎＭ））の混合溶液を添加し、抗体の中和活性をＩＬ－３３単独処理によるＩＬ－６産生に対する阻害効果（ＩＣ50値）で算出した。Ａ１０－１Ｃ０４がＩＣ50＝０.３５μｇ／ｍＬ、Ａ２３－１Ａ０５がＩＣ50＝０.２７μｇ／ｍＬ、Ａ２５－２Ｃ０２がＩＣ50＝０.１９μｇ／ｍＬ、Ａ２５－３Ｈ０４がＩＣ50＝０.２１μｇ／ｍＬ、Ａ２６－１Ｆ０２がＩＣ50＝０.２３μｇ／ｍＬであった。
　また、ＨＵＶＥＣにアルカリ精製被験抗体（終濃度０．１～３μｇ／ｍＬ）及び組換えカニクイザルＩＬ－３３（実施例７記載の方法で調製したものをビオチン化せずに使用）（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）の混合溶液を添加し、抗体の中和活性をＩＬ－３３単独処理によるＩＬ－６産生に対する阻害効果（ＩＣ50値）で算出した。Ａ１０－１Ｃ０４のＩＣ50は０.４３μｇ／ｍＬであり、Ａ１０－１Ｃ０４はヒトＩＬ－３３とカニクイザルＩＬ－３３を同様の強さで中和すること確認した。
実施例１１：ＫＵ－８１２細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性をＫＵ－８１２細胞のＩＬ－３３依存的なＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３の産生を指標として評価した。陽性対照として市販ポリクローナル抗ＩＬ－３３抗体（R&D Systems, AF3625）を使用した。ヒト好塩基球細胞株、ＫＵ－８１２細胞（ECACC, EC90071807）を９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した（１ｘ１０4／ウェル）。続いて、被験抗体（終濃度３μｇ／ｍＬ（約２０ｎＭ））と組換えヒトＩＬ－３３（ＡＴＧｅｎ、ＩＬＣ０７０１）（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（約５ｎＭ））の混合溶液を添加し、３７℃、２４時間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中のＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３の濃度をＢＤＴＭ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｂｅａｄ　Ａｒｒａｙ　（BD Biosciences）のＨｕｍａｎ　ＩＬ－５　Ｆｌｅｘ　ｓｅｔ、　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－６　Ｆｌｅｘ　ｓｅｔ及びＨｕｍａｎ　ＩＬ－１３　Ｆｌｅｘ　ｓｅｔを用いて測定した。また、細胞カウントキット（Dojindo, 345-06463）を用いて培地採取時の細胞の生存率を測定し、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３の産生の抑制作用が生存細胞数の低下に起因しないことを確認した。中性精製抗体を用いた場合、この評価系においてＡ２６－１Ｆ０２はＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３の産生をそれぞれ７０％、８２％、７２％阻害し、いずれのサイトカイン産生に対しても市販ポリクローナル抗体（それぞれ、４７%、５１%、４１%阻害）よりも強い中和活性を示した。
　同様にＫＵ－８１２細胞にアルカリ精製被験抗体（終濃度１００～０.０１μｇ／ｍＬ（約６６７～０.０６７ｎＭ））と組換えヒトＩＬ－３３（ATGen, ILC0701）（終濃度３ｎｇ／ｍＬ（約０.１５ｎＭ））、ヒトＩＬ－３（PeproTech, 200-03, 終濃度１０ｎｇ／ｍＬ（約０.６７ｎＭ）、ヒト補体Ｃ５ａ（Sigma-Aldrich, C5788）（終濃度１ｎＭ）の混合溶液を添加し、３７℃、２４時間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中のＩＬ－５、ＩＬ－１３の濃度を測定した。また、細胞カウントキットを用いて培地採取時の細胞の生存率を測定し、ＩＬ－５、ＩＬ－１３の産生の抑制作用が生存細胞数の低下に起因しないことを確認した。この評価系においてアルカリ精製被験抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）は、ＩＬ－５及びＩＬ－１３産生に対し終濃度１μｇ／ｍＬで５０％以上の阻害効果を示した。
実施例１２：ヒト末梢血単核球を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＩＬ－３３の中和活性をヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＩＬ－３３依存的なＩＦＮ－γ産生を指標として評価した。陽性対照として市販ポリクローナル抗ＩＬ－３３抗体（R&D Systems, AF3625）を使用した。ＰＢＭＣを調製し、９６ウェルマイクロプレートに播種し（２ｘ１０5／ウェル）、組換えヒトＩＬ－１２(和光純薬工業)（終濃度 １０ｎｇ／ｍＬ) を加えた。被験抗体と組換えヒトＩＬ－３３蛋白質(１０ｎｇ／ｍＬ)の混合物を添加し、３７℃、４８時間インキュベートした。その後、培養上清を採取して、培地中のＩＦＮ－γ産生量をＡｌｆａＬＩＳＡ　ＴＭ　ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｋｉｔ（PerkinElmer）を用いて測定し、ＩＬ－３３の中和活性を評価した。この評価系において、アルカリ精製抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬで作用させた場合の阻害率は、Ａ１０－１Ｃ０４で９６.９％阻害、Ａ２３－１Ａ０５で９７.５％阻害、Ａ２５－２Ｃ０２で９８.７５％阻害、Ａ２５－３Ｈ０４で９７.９％阻害、Ａ２６－１Ｆ０２で９８.２５％阻害であった。
実施例１３：ヒトＩＬ－３３の腹腔内投与によって誘導される炎症に対する作用の評価
　ヒトＩＬ－３３をマウスに腹腔内投与することによって、様々な炎症性変化が誘導された。すなわち、血中のＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩＬ－５の増加、好中球、好酸球、好塩基球の増加、脾細胞の増加（脾臓重量の増加）、及び各種粘膜臓器の病理変化が生じた。これらの変化を指標にして、被験抗体（ＩｇＧ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの抗炎症作用を評価した。
　雄性Ｃ５７ＢＬ６（６～８週齢）（日本チャールス・リバー)に対して、ヒトＩＬ－３３蛋白質(R&D Systems, 3625-IL-010）を０．４μｇ／個体、７日間（Ｄａｙ０－Ｄａｙ６）腹腔内投与を行った。さらに、被験抗体（ＩｇＧ）を７日間（Ｄａｙ０－Ｄａｙ６）腹腔内投与した。投与開始から７日後（Ｄａｙ７）、ヒトＩＬ－３３蛋白質の代わりにＰＢＳ(図中では「vehicle」と表記している)を投与した群の脾臓重量が平均７６±４ｍｇであったのに対し、ＩＬ－３３蛋白質投与群の脾臓重量が平均９０±７ｍｇであった。また、ＩＬ－３３蛋白質投与に加えてヒトcontrol IgG（MP Biomedicals, 55908）を１０ｍｇ／ｋｇ（図中では「ｍｐｋ」と表記している）で腹腔内投与した群の脾臓重量が平均９３±４ｍｇであったのに対し、ＩＬ－３３蛋白質投与に加えて中性精製抗体であるＡ２６－１Ｆ０２を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した群の脾臓重量が平均６６±３ｍｇであった。
　次にアルカリ精製抗体を、ヒトＩＬ－３３蛋白質投与前日（Ｄａｙ－１）に１回だけ皮下投与(sc, one shot)して評価した。投与開始から７日後（Ｄａｙ７）、ヒトＩＬ－３３蛋白質の代わりにＰＢＳを投与した群の脾臓重量が平均７０ｍｇであったのに対し、ＩＬ－３３蛋白質投与に加えて前記ヒトcontrol IgGを皮下投与（１０ｍｇ／ｋｇ）した群の脾臓重量が平均１５２ｍｇであった。これに対し、図８に示すように、ＩＬ－３３蛋白質投与に加えてＡ２５－３Ｈ０４を皮下投与（１、３、５、１０ｍｇ／ｋｇ）した群の脾臓重量がそれぞれ１４３、１０６、１０９、７８ｍｇであり、Ａ２５－３Ｈ０４は炎症による脾臓重量の増加を濃度依存的に抑制した。これら脾臓重量に対する抗炎症作用と同様に、ヒトＩＬ－３３投与により増加する血清中ＩｇＡ濃度、血清中ＩｇＥ濃度、血中の好中球数、好塩基球数、好酸球数、血清中ＩＬ－５濃度もＡ２５－３Ｈ０４により抑制されることが確認された（図８）。以上の結果から、ＩＬ－３３で誘導されるｉｎ　ｖｉｖｏの炎症反応に対してＡ２５－３Ｈ０４が抑制作用を示すことが確認された。また、投与開始から７日後（Ｄａｙ７）におけるＡ２５－３Ｈ０４のマウス血中濃度を測定したところ、１、３、５、１０ｍｇ／ｋｇ投与それぞれに対して０．６、３．７、６．５、２０．３μｇ／ｍｌであった。
　その他の被験抗体（ＩｇＧ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの抗炎症作用も皮下投与（１０ｍｇ／ｋｇ）で同様のプロトコルにて評価した。その結果、図９に示すように、ヒトcontrol IgGを皮下投与した群の脾臓重量が平均１８１ｍｇであったのに対し、ＩＬ－３３蛋白質投与に加えて各アルカリ精製抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２６－１Ｆ０２）を皮下投与した群の脾臓重量がそれぞれ８２ｍｇ、９２ｍｇ、１００ｍｇ、７７ｍｇであり、炎症による脾臓重量の増加を抑制していた。これら脾臓重量に対する抗炎症作用と同様に、ヒトＩＬ－３３蛋白質投与により増加する血清中ＩｇＡ濃度、血清中ＩｇＥ濃度、血中の好中球数、好塩基球数、好酸球数もアルカリ精製抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２６－１Ｆ０２）が抑制することを確認した（図９）。以上の結果から、ＩＬ－３３で誘導されるｉｎ　ｖｉｖｏの炎症反応に対してＡ２５－３Ｈ０４と同様に、その他の被験抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２６－１Ｆ０２）も抗炎症作用を示すことが確認された。
実施例１４：ヒトＩＬ－３３気管内投与によって誘導される肺障害に対する作用の評価
　マウスに対して、ヒトＩＬ－３３蛋白質を気管内投与し、その後に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取すると、ＢＡＬＦ中総細胞数や好酸球数、好中球数が増加し、気管上皮粘液増生も見られる。また、ＢＡＬＦ中のＩＬ－４、５、６、１３といったサイトカインも産生する。この系に、被験抗体（ＩｇＧ）を腹腔内、皮下もしくは静脈内投与することによってその肺障害に対する被験抗体の作用を評価することができる。
実施例１５：ヒトＩＬ－３３鼻内投与によって誘導される気道過敏に対する作用の評価
　ＩＬ－３３蛋白質をマウスに鼻内投与すると、その後に吸入メタコリンに対する気道過敏が生じる。この評価系に、被験抗体（ＩｇＧ）を腹腔内、皮下もしくは静脈内投与することによって気道過敏に対する被験抗体の作用を評価することができる。
実施例１６：ヒトＩＬ－３３ノックインマウスを用いたＩＬ－３３に対する作用の評価
　ヒトＩＬ－３３ノックインマウスに、ダニ抗原またはｐａｐａｉｎを点鼻または気管内投与すると、気道炎症が誘発され、このマウスからＢＡＬＦを回収するとＢＡＬＦ中の総細胞数が増加する。ダニ抗原またはｐａｐａｉｎによる気道炎症は、ダニ抗原またはｐａｐａｉｎのプロテアーゼ活性により気道上皮細胞からＩＬ－３３が放出されることが引き起こされることが知られている(Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581)。この評価系に、被験抗体（ＩｇＧ）を腹腔内、皮下もしくは静脈内投与することによって、プロテアーゼによる気道炎症に対する被験抗体の作用、及びｉｎ　ｖｉｖｏで誘導されたＩＬ－３３に対する被験抗体の作用を評価することができる。
実施例１７：ＬＰＳ腹腔内投与敗血症モデルにおける炎症に対する作用の評価
　ヒトＩＬ－３３ノックインマウスにＬＰＳを腹腔内投与することにより敗血症が誘発されるが(Oboki et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, vol. 107, p18581)、ＬＰＳ投与前に被験抗体（ＩｇＧ）を腹腔内、皮下もしくは静脈内投与しておき、その後の死亡率に対する被験抗体の作用を評価することができる。また、ＬＰＳ投与数時間以内にＩＬ－６やＴＮＦ－αといった炎症性サイトカインが血中に高濃度で検出されるが、これらの濃度を測定することにより、被験抗体の抗炎症作用を評価することができる。
実施例１８：担癌マウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏにおける癌に対する作用の評価
　マウスに対して、マウス癌細胞株やヒト癌細胞株を各癌細胞株に応じて適切な細胞数で同所、皮下または静脈内に移入してヒトＩＬ－３３を投与する。このマウスに被験抗体（ＩｇＧ）を腹腔内、皮下もしくは静脈内投与し、癌細胞株を移入後に、原発巣の癌部位や転移巣である臓器における癌細胞数を体積や細胞数にて評価すると、被験抗体の癌に対する作用を評価することができる。
実施例１９：抗体のコロイド安定性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）のコロイド安定性を動的光散乱による凝集物の有無で評価した。各アルカリ精製抗体をＶＩＶＡＳＰＩＮまたはＶＩＶＡＳＰＩＮ　ＴＵＲＢＯ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００００から５００００　ＭＷＣＯ）にて５０ｍｇ／ｍＬ付近まで濃縮した。遠心は４℃にて行い、回転数、時間に関してはそれぞれ適宜変更した。被験抗体溶液を順次希釈しながら２００から２５０μＬのサンプルを用いて動的光散乱（日機装, Nanotrac UPA UT-151）を測定し、濃度範囲にして１ｍｇ／ｍＬ付近から５０ｍｇ／ｍＬ付近におけるデータを取得した。抗体蛋白質の粒子径の分布を２００秒間の積算データから算出し、凝集物の有無を評価した。被験抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）は粒子径分布における１０ｎｍ付近のピークが抗体濃度の増加に伴って高粒子径側へのシフトする度合が非常に軽微であり、また抗体濃度に依存しない不可逆的な凝集物に由来すると考えられる粒子径数十ｎｍ以上のピークは存在しなかった。以上の結果により被験抗体の良好なコロイド安定性を確認した。
　コロイド安定性を定量的に評価するため、相互作用パラメータ（ｋD)の算出を行った。拡散係数(粒子径と反比例)の濃度依存性を表す相互作用パラメータは、抗体などの蛋白質高濃度製剤の処方設計にも利用される重要な指標である。相互作用パラメータの値は－１２．４ ｍＬ／ｇより高い値であれば斥力的な相互作用でコロイド安定性に優れ、自己会合性が低いものであると報告されている(Saito et al., Pharm.Res., 2013.Vol.30 p1263)。ＰＢＳ (ｐＨ ７．２)に溶解した被検抗体溶液を限外ろ過膜で数１０ｍｇ／ｍＬになるように濃縮し、同溶媒で順次２倍希釈したサンプルの粒子径測定を動的光散乱測定装置(Ｎａｎｏｔｒａｃ ＵＰＡ ＵＴ１５１　日機装)を用いて行った。得られた粒子径から拡散係数を以下のＳｔｏｋｅｓ-Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
 上式中、Ｄは拡散係数(ｃｍ2/ｓｅｃ)、ＫBはボルツマン定数（Ｊ/Ｋ）、Ｔは熱力学温度（Ｋ）、πは円周率、ηは希釈液粘度P(poise)、ｄは粒子径（ｎｍ）である。拡散係数の濃度依存性をプロットし、以下の計算式でフィッティングすることで相互作用パラメータを求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
 ＤはＳｔｏｋｅｓ-Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式で得られた拡散係数で、Ｄ0は無限希釈時の拡散係数、ｃは測定時の被験抗体の濃度（ｇ／ｍＬ）である。この式からフィッティング直線の傾きである相互作用パラメータ（ｋD）を算出した。その結果Ａ１０－１Ｃ０４がｋD＝－８．１ｍＬ／ｇ（解析範囲は０．４１－６３．７ｍｇ／ｍＬ）、Ａ２３－１Ａ０５がｋD ＝－５．６ｍＬ／ｇ（解析範囲は０．４０－６１．８ｍｇ／ｍＬ）、Ａ２５－２Ｃ０２がｋD ＝－６．２ｍＬ／ｇ（解析範囲は０．４３－６６．３ｍｇ／ｍＬ）、Ａ２５－３Ｈ０４がｋD ＝－７．５ｍＬ／ｇ（解析範囲は０．３４－５６．５ｍｇ／ｍＬ）、Ａ２６－１Ｆ０２がｋD ＝－６．７ｍＬ／ｇ（解析範囲は０．３５－６２．７ｍｇ／ｍＬ）であり、いずれの抗体の相互作用パラメータも－１２．４ｍＬ／ｇよりも高く、コロイド安定性に優れていた。
実施例２０：抗体の熱力学的安定性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）の熱力学的安定性を免疫グロブリンドメインのフォールディングが崩壊する温度（Ｔｍ）で評価した。数１０μｇ／ｍＬの被験抗体溶液にＰｒｏｔｅｉｎ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添付文書に従って添加し、リアルタイムＰＣＲ　７５００　Ｆａｓｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で約１℃／ｍｉｎで温度を上昇させながら蛍光強度を測定した。得られたデータをＰｒｏｔｅｉｎ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解析することでＴｍを決定した。なお、複数のＴｍが認められた場合、温度が低い方からＴｍ１、Ｔｍ２とした。その結果、中性精製抗体を用いた場合、Ａ１０－１Ｃ０４がＴｍ=７３．９℃、Ａ２３－１Ａ０５がＴｍ１=６９.３℃、Ｔｍ２=７７．６℃、Ａ２５－２Ｃ０２がＴｍ１=６９．３℃、Ｔｍ２=８０．３℃、Ａ２５－３Ｈ０４がＴｍ１=７０．０℃、Ｔｍ２=７６．４℃、Ａ２６－１Ｆ０２がＴｍ=７４．５℃であった。またアルカリ精製抗体を用いた場合、Ａ１０－１Ｃ０４がＴｍ=７３．７℃、Ａ２３－１Ａ０５がＴｍ１=６９．５℃、Ｔｍ２=７７．５℃、Ａ２５－２Ｃ０２がＴｍ１=６９．５℃、Ｔｍ２=８０．４℃、Ａ２５－３Ｈ０４がＴｍ１=７０．１℃、Ｔｍ２=７６．４℃、Ａ２６－１Ｆ０２がＴｍ=７４．４℃であった。いずれの抗体のＴｍも６５℃以上であり、良好な熱力学的安定性を示した。
実施例２１：抗体の保存安定性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）の保存安定性を評価するため、各アルカリ精製抗体を約１０ ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸バッファー(５０ ｍＭ クエン酸、 １５０ ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ６．３)）に溶解して、４０℃で４週間保存した。保存後の抗体モノマー純度評価のため、ゲル濾過分析（ＳＥＣ）及びマイクロチップキャピラリーＳＤＳ電気泳動（ｍＣＥ－ＳＤＳ）によるモノマー純度の測定、並びに表面プラズモン共鳴を用いた抗原結合活性測定を実施した。
　ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ(東ソー)を２連結したカラムをＨＰＬＣ装置(Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ, １２６ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ, １６６ ｄｅｔｅｃｔｏｒ, ５０８ ａｕｔｏ ｓａｍｐｌｅｒ)に装着し、ゲルろ過分析を行った。移動相溶媒として０．１ Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．７）を用いて、０．５ ｍＬ／ｍｉｎの流量で分離し、検出はＵＶ ２１５ ｎｍで行った。約１０ ｍｇ／ｍＬの抗体保存溶液を100倍に希釈して分析用サンプルとし、その５０μＬをインジェクトした。ゲル濾過分析で得られたモノマー純度を表１３に示した。いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も４０℃４週間保存後において、９０％以上のモノマー純度を保持しており、良好な保存安定性を示した。
　Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ＧＸ ＩＩ (ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)を用いてキャピラリーＳＤＳ電気泳動を行った。同装置専用の試薬キットＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ (ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)を用いて、メーカーの標準プロトコルに沿って変性条件下で還元を実施した。分析用サンプルとして約１０ｍｇ／ｍＬの抗体保存溶液を２μＬ添加した。泳動に使用する試薬を上述のキットより専用のチップＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｂ Ｃｈｉｐ, ｖｅｒｓｉｏｎ ２ (ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)に添加し、抗体分析用の内臓プロトコルＨＴ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ２００で測定を行った。表１３に示すように、変性・還元条件においても、いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も４０℃４週間保存後において、９０％以上のモノマー純度を保持しており、良好な保存安定性を示した。
　保存後の抗体濃度に依存しない不可逆的な凝集体形成の有無を調べるため、粒子径測定を実施した。抗体保存溶液をクエン酸バッファー(５０ ｍＭ クエン酸、 １５０ ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ６．３）)で10倍希釈(終濃度：約1 mg/mL)した分析用サンプルについて、動的光散乱法（日機装, Nanotrac UPA UT-151）により粒子径測定を行った。積算時間は２００秒で測定した。いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２、Ａ００－００７０、Ａ００－００３６）も４０℃４週間保存後において凝集体は検出されず、保存安定性に優れた抗体を取得することが出来た。
　保存後の抗原結合能の有無を調べるため、表面プラズモン共鳴装置Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（GE Healthcare）を用いた抗原結合活性測定を行った。アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてヒトＩＬ－３３蛋白質（ATGen, ILC0701）をＳｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５（GE Healthcare）に固定化した（固定化量約３０００から６０００ＲＵ）。次に、抗体保存溶液をクエン酸バッファー(５０ｍＭ クエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ６．３）)で１０倍希釈し、微量分光光度計Ａｓｔｒａｇｅｎｅ　ＩＩ（Ａｓｔｒａｎｅｔ）を用いて溶液中の総蛋白質濃度を測定した(蛋白質濃度：約１ｍｇ／ｍＬ)。総蛋白質濃度を測定した抗体溶液をＨＢＳ－ＥＰバッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０（ｐＨ７．４））を用いて１０００倍希釈し、アナライト溶液とした。測定は２５℃にて行った。各種アナライト溶液を３６秒間添加し、結合相のセンサーグラムを得た。流速は５μＬ／ｍｉｎ、１００　μＬ／ｍｉｎにて行い、２種類の流速で得られたセンサーグラムについてデータ解析プログラム（GE Healthcare, Biacore T200 Evaluation Software v1.0）を用いたＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　Ｆｒｅｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓにより、抗原結合活性を有する抗体の濃度を求めた。対照として、４℃で4週間保存した各種被験抗体の抗原結合活性を同様に測定し、４０℃4週間保存した被検抗体の抗原結合活性の割合を算出した。表１３に示すように、いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も４０℃４週間保存後において、９０％以上の抗原結合活性を保持しており、良好な保存安定性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 実施例２２：抗体の強制酸化による安定性の評価
　被検抗体（ＩｇＧ）の酸化による抗原結合活性の影響を調べた。終濃度約１ｍｇ/ｍＬの各種アルカリ精製抗体に過酸化水素水（終濃度１％）を添加し、３７℃にて２４時間酸化させた。その後、８０　ｍＭ　メチオニン溶液を添加し酸化を終了させた。次に、被験抗体溶液を脱塩カラムＺｅｂａｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＢＳに置換した。酸化処理を施した被検抗体の抗原結合活性を前記実施例２１と同様に表面プラズモン共鳴装置Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（GE Healthcare）を用いて調べた。酸化未処理の各種被験抗体の抗原結合活性に対する酸化処理後の抗原結合活性の割合を算出したところ、Ａ１０－１Ｃ０４が８３％、Ａ２３－１Ａ０５が９５％、Ａ２５－２Ｃ０２が１００．５％、Ａ２５－３Ｈ０４が９８．７％、Ａ２６－１Ｆ０２が８９．５％の結合活性を保持していた．これらの結果より、いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も１％過酸化水素水処理による強制酸化において８０％以上の抗原結合活性を保持する安定性を示した。
実施例２３：物理的ストレス（撹拌）による凝集体形成の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）をPBSで0.2mg/mLに希釈し、Aggregates Sizer（島津製作所）に装着した回分セル（Batch cell）中で撹拌することで物理的ストレスを加えた。室温で撹拌子を30分間上下運動（190回/分）させた後、Aggregates Sizer で40nmから20μmの凝集体濃度を測定した。アルカリ精製抗体を用いた場合、撹拌により生じた凝集体濃度は、Ａ１０－１Ｃ０４が１７．２μｇ/mL、Ａ２３－１Ａ０５が１６．４μｇ/mL、Ａ２５－２Ｃ０２が１３．３μｇ/mL、Ａ２５－３Ｈ０４が２３．４μｇ/mL、Ａ２６－１Ｆ０２が１７．０μｇ/mLであり、いずれの抗体も物理的ストレスで誘導される凝集体形成が１５％以下であり、いずれの被検抗体も物理的ストレスに対して安定であった。
実施例２４：抗体のマウス血中濃度推移の評価
　雄性Ｃ５７ＢＬ６マウス（８～１０週齢）（日本チャールス・リバー)に蛍光標識した被験抗体（ＩｇＧ）をマウスに静脈内投与（３ｍｇ／ｋｇ）した後、血漿中の蛍光を検出することにより、被験抗体の濃度を測定した。図１０に示すように、アルカリ精製抗体を用いた場合、いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も消失半減期が１００時間以上であり、良好な血中安定性を示した。
実施例２５：サル血中濃度推移の評価
　雄性カニクイザル（２～３歳）（ハムリー）に被験抗体（ＩｇＧ）を静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）した後、Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ＩｇＧ１　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、５００９１０）を用いて、血清中の被検抗体の濃度を測定した。アルカリ精製抗体Ａ１０－１Ｃ０４を２匹のカニクイザル（Ｎｏ.２０１、２０２）に投与し、アルカリ精製抗Ａ２３－１Ａ０５を１匹のカニクイザル（Ｎｏ.３０１）に投与した。図１１に示すように、Ａ１０－１Ｃ０４の消失半減期は１６.５６日（Ｎｏ.２０１）及び１１.４０日（Ｎｏ.２０２）であり、クリアランス値は３.５９８ｍＬ／ｄａｙ／ｋｇ（Ｎｏ.２０１）及び５.４５１ｍＬ／ｄａｙ／ｋｇ（Ｎｏ.２０２）であった。またＡ２３－１Ａ０５の消失半減期は１０.８７日であり、クリアランス値は１０.０７ｍＬ／ｄａｙ／ｋｇであった。いずれの被検抗体もカニクイザルにおいて良好な血中安定性を示した。
実施例２６：抗体の免疫原性評価
　被験抗体（ＩｇＧ）の免疫原性を評価するためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔ細胞アッセイを行った（Ｌｏｎｚａ）。標的となる人口集団の代表を示すため、提供者数は５０名とし、提供者から採取したヒト末梢血由来の樹状細胞に５０μｇ／ｍＬの各種アルカリ精製抗体を添加し、樹状細胞に取り込ませた。一方、同一の提供者から採取したヒト末梢血由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。その後に両者、すなわち被験抗体を取り込ませた樹状細胞をＣＤ４陽性Ｔ細胞とともに共培養し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応（増殖）を測定した。陰性対照として、被験抗体を含まないバッファー（ＰＢＳ）で同様に実施して得られるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応と比較することにより、抗体をヒトに投与した際の免疫原性リスクを評価した。その結果、いずれの被験抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２５－２Ｃ０２、Ａ２５－３Ｈ０４、Ａ２６－１Ｆ０２）も陰性対照との間にＴ細胞の反応について差は認められなかった。
実施例２７：ヒト組織交差反応性の評価
　被験抗体（ＩｇＧ）の、ヒト組織（1ドナー、FDAおよびEMAのガイドラインを満たす３５組織の凍結切片）への交差反応性を免疫組織化学染色法により評価した（Covance Laboratories Ltd.)。35組織には副腎、膀胱、血液細胞、骨髄、乳腺、小脳、大脳皮質、結腸、内皮細胞（血管）、眼球、卵管、胃腸管（平滑筋含む）、心臓、腎臓（糸球体、尿細管）、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、上皮小体、耳下腺、末梢神経、下垂体、胎盤、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、横紋筋、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃、尿管、子宮（頚部、内膜）が含まれる。その結果、アルカリ精製抗体を用いた場合、いずれの被検抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２６－１Ｆ０２、Ａ２５－２Ｃ０２）とも、ＩＬ－３３の発現が広く知られている血管内皮細胞（陽性対照）において強い染色性が確認された。また、上皮・間質細胞・神経組織・筋組織・血球等の様々な組織において、細胞質あるいは核への交差性が確認されたが、いずれの組織においても細胞膜への交差反応性はみられなかった。ICH S6(R1)ガイドラインおよびその他の論文（Toxicologic Pathology 2010, 38(7):1138-1166）によれば、in vivoで抗体が到達する可能性の低い細胞質や核への交差反応性は毒性学的意義が低いと考えられている。従って、いずれの被験抗体（Ａ１０－１Ｃ０４、Ａ２３－１Ａ０５、Ａ２６－１Ｆ０２、Ａ２５－２Ｃ０２）も毒性懸念は見出されなかった。
実施例２８：Ａ１０－１Ｃ０４およびＡ２５－３Ｈ０４のエピトープ領域の絞り込み
　抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体Ａ１０－１Ｃ０４およびＡ２５－３Ｈ０４は前記実施例１に記載したＰＥＰ１４エピトープに結合した。２０アミノ酸残基からなるＰＥＰ１４に含まれる、より短い連続するアミノ酸配列について、このようなアミノ酸配列を提示するファージディスプレイライブラリを用いた実験により、２種類のエピトープ（ＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶ（配列表の配列番号４２６）及びＥＤＥＳＹＥＩＹＶ（配列表の配列番号４２７））を見出した。ペプチドＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶは配列表の配列番号２２６に示すヒトＩＬ－３３の残基１３８から残基１４７に相当し、ペプチドＥＤＥＳＹＥＩＹＶは配列表の配列番号２２６に示すヒトＩＬ－３３の残基１３９から残基１４７に相当する。これらのペプチドを合成し、実施例９と同様のKinExA実験によりアルカリ精製抗体との親和性をＫdとして算出した（表１４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　本発明における中和作用を有する抗体は、ＩＬ－３３関連疾患の診断、治療、予防または軽減用の医薬組成物として用いることができる。

Claims (40)

  1. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
  2. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位又は２５１位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、請求項１に記載の抗体。
  3. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、Ｐ１１８、Ｉ１１９、Ｔ１２０、Ｙ１２２、Ｌ１２３、Ｒ１２４、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｓ１２７、Ｙ１２９、Ｎ１３０、Ｄ１３１、Ｑ１３２、Ｓ１３３、Ｔ１３５、Ａ１３７、Ｌ１３８、Ｅ１３９、Ｓ１４２、Ｙ１４３、Ｅ１４４、Ｉ１４５、Ｙ１４６、Ｅ１４８、Ｄ１４９、Ｌ１５０、Ｄ２４４、Ｎ２４５、Ｈ２４６、Ｋ２６６、Ｌ２６７、Ｓ２６８及びＥ２６９から選ばれるアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるエピトープである、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１１１位～１３０位、１３１位～１５０位、２３１位～２５０位又は２５１位～２７０位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープが、配列表の配列番号２２６の１３８位～１４７位または１３９位～１４７位の連続するアミノ酸配列からなるエピトープである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、ＩＬ－３３のアンタゴニストである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、ＩＬ－３３受容体と、ＩＬ－３３との結合を阻害する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＩＬ－３３関連疾患の治療、予防、又は軽減用の医薬組成物。
  9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体を含む、サイトカイン発現抑制剤。
  10. 　ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、請求項９に記載の抑制剤。
  11. 　ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、請求項９又は１０に記載の抑制剤。
  12. 　１）請求項１～５のいずれか一項に記載のエピトープ、
    　２）該エピトープの連続するアミノ酸からなる配列に対し、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるエピトープ、及び
    　３）該エピトープの連続するアミノ酸からなる配列に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるエピトープ
    からなる群から選ばれるエピトープ。
  13. 　請求項１２に記載のエピトープを用いて生成又はスクリーニングされた抗体。
  14. 　配列表の配列番号２２６の１０１位～１５４位又は１９９位～２７０位に含まれる連続するアミノ酸配列からなるエピトープに結合するモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  15. 　 フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、請求項１４に記載の抗体。
  16. 　軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、請求項１５に記載の抗体。
  17. 　軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、請求項１５または１６に記載の抗体。
  18. 　軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表１のＣ１からＣ３０で示される組み合わせより選択される、単離したヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  19. 　軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが、表１のＣ１からＣ２８で示される組み合わせから選択される、請求項１８に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  20. 　軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが、表１のＣ１、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１７及びＣ１８で示される組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  21. 　抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、生殖系列のフレームワーク領域のアミノ酸配列またはその組み合わせのアミノ酸配列である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  22. 　軽鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３１７の残基１から残基２２、軽鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基３６から残基５０、軽鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３１７の残基５８から残基８９、及び、軽鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０１の残基３から残基１２であり、かつ、重鎖のフレームワーク領域１のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基１から残基３０または配列表の配列番号３６８の残基１から残基３０、重鎖のフレームワーク領域２のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基３６から残基４９または配列表の配列番号３６８の残基３６から残基４９、重鎖のフレームワーク領域３のアミノ酸配列が配列表の配列番号３６７の残基６７から残基９８または配列表の配列番号３６８の残基６７から残基９８、及び、重鎖のフレームワーク領域４のアミノ酸配列が配列表の配列番号４０７の残基５から残基１５である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  23. 　軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１からＶ３０で示される組み合わせから選択される、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  24. 　軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１からＶ２８で示される組み合わせから選択される、請求項２３に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  25. 　軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列の組み合わせが表２のＶ１、Ｖ８、Ｖ１５、Ｖ１７及びＶ１８で示される組み合わせから選択される、請求項２３または２４に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  26. 　軽鎖がλ鎖である、請求項１８～２５のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  27. 　ヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体がＩｇＧである、請求項１８～２６のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  28. 　抗原がヒトＩＬ－３３及びサルＩＬ－３３である、請求項１８～２７のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
  29. 　請求項１８～２８のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の蛋白質部分をコードする核酸分子。
  30. 　軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のそれぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列の組み合わせが表３のＣＮ１からＣＮ３０で示される組み合わせより選択される、請求項２９に記載の核酸分子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  31. 　請求項２９または３０に記載の核酸分子を含むベクター。
  32. 　請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  33. 　請求項１８～２８のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体の製造方法であって、請求項３２に記載の宿主細胞を培養して製造する方法。
  34. 　請求項１８～２８のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、サイトカイン発現抑制剤。
  35. 　ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、請求項３４に記載の抑制剤。
  36. 　ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、ＩＬ－６又はＩＬ－１３の発現を抑制する、請求項３４または３５に記載の抑制剤。
  37. 　請求項１８から２８のいずれか一項に記載のヒト抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
  38. 　ＩＬ－３３関連疾患の予防、治療または軽減用の請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 　ＩＬ－３３関連疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、全身性エリトマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、強直性脊椎炎、肝線維症（原発性胆汁性肝硬変を含む）、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性腎障害、血管炎及び癌からなる群から選択される、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 　ＩＬ－３３との結合が、請求項２０または２５に記載の抗体と競合する、抗ＩＬ－３３中和モノクローナル抗体。
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