WO2015085990A1 - Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum bereit, welches die Schritte a) Rhizobiaceae-vermitteltes Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit einer genetischen Komponente, und b) Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum aus einer transformierten Zelle umfasst, wobei von Schritt (a) bis Schritt (b) kein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, erfolgt.

Description

SELEKTIONSMARKER-FREIES RHIZOBIA CEAE-VERMI TTEL TE S VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER TRANSGENEN PFLANZE DER GATTUNG TRITICUM

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie und umfasst ein

verbessertes Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum mittels Bakterienzellen aus der Familie Rhizobiaceae, insbesondere der Gattung

Agrobacterium, sowie transgene Pflanzen oder Teile davon, welche mit dem verbesserten Verfahren hergestellt wurden.

Hintergrund der Erfindung

Erzeugnisse der Pflanzen der Gattung Triticum wie beispielsweise Weizen (Triticum aestivum) sind eines der bedeutsamsten Rohstoffe und spielen als Grundnahrungsmittel in großen Teilen der Welt eine entscheidende Rolle. Dennoch fiel in den letzten fünfzig Jahren der durch konventionelle Züchtung erreichte Fortschritt beispielsweise im Weizen im

Hinblick auf verschiedenste Merkmale wie z.B. Ertrag deutlich gegenüber demjenigen in anderen Kulturarten wie Mais, Zuckerrübe oder Raps deutlich zurück. Die Entwicklung von transgenen Pflanzen der Gattung Triticum stellt eine Möglichkeit dar, diesen verfehlten Fortschritt zumindest in Teilen wieder wettzumachen. Jedoch gilt die Herstellung trangener Pflanzen der Gattung Triticum über eine Rhizobiacea (z.B. Agrobacterium tumefaciens)- vermittelte Transformation von jeher als extrem schwierig. In der Regel erreicht man hierbei z.B. bei Weizen lediglich Effizienzen von 1 % - 3% transgene Linien pro isoliertem

Ausgangsexplantat. In Einzelfällen werden in der Literatur Transformationsprotokolle mit Effizienzen bis zu 10% beschrieben (Hensel et al., 2009; Shrawat und Lörz, 2006), allerdings sind diese häufig in der Praxis nicht realisierbar. Bekannte Protokolle umfassen fast ausschließlich die Verwendung von Markergenen zur Selektion (Selektionsmarker) in einer Cotransformation. Dabei ist der Selektionsmarker üblicherweise gekoppelt mit dem zu transformierenden gene of interest (goi). Als Markergen wird in der Regel entweder ein Antibiotikaresistenzgen oder ein Herbizidresistenzgen eingesetzt, welche transformierten Zellen unter bestimmten in-vitro Bedingungen einen Überlebensvorteil während der

Regenerationsphase verschaffen. Somit bieten Markergene einen Weg zur Unterscheidung der transgenen von den nicht-transgenen Pflanzen. Letztendlich ermöglicht die Anwendung der Selektion mit Markergenen eine effizientere Transformation, bzw. macht eine

Transformation überhaupt erst möglich.

Da der Selektionsmarker nur während der in ^'iro-Phase in der transgenen Pflanze benötigt wird, erfüllt er in der Pflanze später keine Funktion mehr und ist somit dann überflüssig. Da die Anzahl an zur Verfügung stehenden Selektionsmarkern jedoch begrenzt ist, erschwert das Vorhandensein des nicht mehr benötigten Selektionsmarkers eine nachträgliche Supertransformation der bereits transgenen Pflanze mit einem zweiten goi. Ein Stacking von mehreren Genen mittels sequentieller Transformation ist somit nur begrenzt möglich und ist limitiert durch die Anzahl an unterschiedlichen Selektionsmarkern, die für die jeweilige Pflanzenart zur Verfügung steht.

Weiterhin steht die Verwendung von insbesondere Antibiotikaresistenzgenen als

Selektionsmarker in transgenen Pflanzen in der Öffentlichkeit in der Kritik, so dass grundsätzlich in der regulatorischen Zulassung und in der Kommerzialisierung nur transgene Pflanzen ohne Selektionsmarker akzeptabel sind. Die Entfernung des

Selektionsmarkers ist jedoch mit einem erheblichen Arbeits-, Kosten- und Zeitaufwand verbunden.

Technisch stehen dem Fachmann heute verschiedene Verfahren und Hilfsmittel zur Entfernung eines Selektionsmarkers aus dem Genom einer transgenen Linie zur

Verfügung. Zum einen kann man hochspezifische Nukleasen (z.B. Zinkfinger-Nukleasen) nutzen. Solche Nukleasen müssen dafür durch Kreuzung mit einer Nuklease

exprimierenden Linie in das Genom der transgenen Pflanze, die den zu entfernenden Selektionsmarker enthält, eingebracht werden. Nach erfolgreicher Eliminierung des Selektionsmarkers ist weiterhin eine Entfernung der Nuklease aus dem Genom der transgenen Pflanze erforderlich, was mittels meiotischer Segregation erfolgt. Dadurch sind für die Identifizierung von Selektionsmarker-freien Pflanzen mindestens zwei weitere Generationen notwendig. Als eine Variante dieser Methode kann die Verwendung von spezifischen Rekombinasen (z.B. Cre-Rekombinase) angesehen werden, die jedoch immer zu einem Verbleib der Rekombinationssites in der transgenen Pflanze führen. Aus regulatorischer Sicht ist dies problematisch, da es sich auch hierbei um nicht benötigte, also überflüssige Sequenzmotive innerhalb der transgenen Pflanze handelt.

Zum anderen können die Pflanzen mit zwei T-DNAs transformiert werden, wobei die eine T- DNA das goi und die andere T-DNA den Selektionsmarker trägt. In etwa 30% bis 50% der erstellten, transgenen Pflanzen kommt es dann zur Integration der beiden T-DNAs in eine Zelle, jedoch an unterschiedlichen Orten des Genoms. Dadurch ist mittels Meiose eine Segregation des Selektionsmarkers und des goi in der folgenden Generation möglich. Eine Identifizierung von Selektionsmarker-freien Pflanzen ist jedoch erst in der ersten

Filialgeneration der Ausgangstransformanten möglich. Die Trennung von Selektionsmarker und goi durch Segregation ist jedoch aufgrund der häufigen Cointegration der beiden, transformierten T-DNAs in nahe beieinanderliegenden genomischen Regionen sehr ineffizient, so dass eine große Anzahl an Ausgangstransformanten erstellt werden muss, um eine ausreichende Anzahl an transgenen, Selektionsmarker-freien Linien identifizieren zu können.

Die Herstellung von transgenen Pflanzen ohne die Anwendung eines Selektionsschrittes während des Transformationsprozesses galt lange als unmöglich (Potrykus et al., 1998; Erikson et al., 2005; Joersbo et al., 2001 ). In ihrem Reviewartikel im Jahr 2006 beschreiben Shrawat und Lörz diverse Möglichkeiten um Selektionsmarker-freie Getreidepflanzen zu produzieren, jedoch basieren alle Methoden auf der Anwendung einer der oben

beschriebenen Strategien, also entweder die Durchführung von Co-Transformationen (gene of interest und Selektionsmarker befinden sich auf zwei getrennten T-DNAs) mit

anschließender Segregation des Selektionsmarkers und des goi über die Meiose, oder die nachträgliche Entfernung des Selektionsmarkers über spezifische Rekombinasen. Eine Anwendung einer Selektionsmarker-freien Transformation ist nicht beschrieben.

In einem kürzlich erschienen Review-Artikel von Tuteja et al. (2012) sind ebenfalls zahlreiche Methoden für die Erstellung von Markergen-freien Pflanzen aufgeführt. Jedoch werden auch in diesem Artikel nur noch einmal die bereits bei Shrawat und Lörz (2006) aufgeführten Möglichkeiten der Co-Transformation bzw. der nachträglichen

Selektionsmarker Entfernung dargestellt. Eine Transformation ohne Selektionsmarker in Pflanzen der Gattung Triticum mittels Rhizobiaceae-Bakterien wie Agrobacterium

tumefaciens ist nicht erwähnt. Eine Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium ohne die Präsenz und Anwendung eines Selektionsmarkers ist für einige andere

Pflanzenarten beschrieben, u.a. Kartoffel (De Vetten et al., 2003, Ahmad et al., 2008), Tabak (Li et al., 2009), Orange (Ballester et al., 2010) und Luzerne (Ferradini et al., 2011 ).

Heute sind folgende unerwünschte Phänomene bekannt, welche beim Verzicht auf eine Selektion mit einem Markergen auftreten können:

Das transformierte Explantat durchläuft gewöhnlich mehrere Selektionsschritte in der Kallusphase. Während dieser Selektionsphase findet durch die Präsenz eines Antibiotikums oder eines Herbizides eine Anreicherung von transgenen Zellen im Kallus statt, die das korrespondierende Resistenzgen tragen, also transgen sind. Nicht-transgene Zellen werden in ihrem Wachstum gehemmt und sterben ab, was die Wahrscheinlichkeit deutlich erhöht, dass sich vor Allem transgene Sprosse aus dem selektierten Kallus regenerieren. So zeigen Faize et al. (2010), dass während des Transformationsprozesses von Aprikose der Anteil an transgenem Gewebe in Aprikosensprossen durch mehrfaches Subkultivieren auf selektivem Medium erhöht werden kann und somit ein chimärer Charakter der Sprosse durch Anwendung der Selektion reduziert bzw. eliminiert werden kann. Fehlen also die Selektionsschritte, besteht offensichtlich die Gefahr, dass die nicht-transgenen Sprosse solchen aus transgenen Zellen während der Regeneration überlegen sind. Man geht davon aus, dass die transformierten Zellen durch die

einen

Vitalitätsnachteil im Vergleich mit nicht transformierten Zellen aufweisen. Somit erhöht sich bei einer Selektionsmarker-freien Transformation die Wahrscheinlichkeit, dass überwiegend nicht transgene Sprosse regenerieren. Folglich sinkt die Transformationseffizienz im

Vergleich zu einer Transformation mit Selektion deutlich ab. Dies ist sehr gut bei der Selektionsmarker-freien Kartoffeltransformation untersucht worden, bei der Effizienzen von 1 - 4% beschrieben sind (De Vetten et al., 2003), während bei der Transformation mit Selektionsmarker Effizienzen von ~ 30 % erhalten werden können (Chang and Chan, 1991 ).

Ferner beobachtet man regelmäßig, dass sich bei Abwesenheit einer Markergen-basierten Selektion auch solche Sprosse regenerieren, die sowohl aus transgenem als auch aus nicht transgenem Gewebe bestehen (chimäre Sprosse). Dabei können unterschiedliche Formen des Chimären Charakters vorhanden sein. Sollte eine periklinale Chimäre vorhanden sein, so kann es vorkommen, dass die für die Ausbildung der Gameten notwendige L2- Zellschicht in den Meristemen der Pflanzen nicht transgen ist. Somit werden in dieser Pflanze nur nicht-transgene Gameten gebildet und das in die Pflanze eingebrachte

Transgen wird nicht an die nächste Generation weitergegeben. Bei generativ zu

vermehrenden Pflanzen sind solche chimär transgenen Pflanzen dann verloren. Bei sektoralchimären Pflanzen sind einige Bereiche der Pflanzen transgen, andere Bereiche sind nicht transgen. In dem nicht-transgenen Bereichen/Teilen der Pflanze werden nur nicht-transgene Gameten gebildet. Der Anteil an nicht-transgenen Gameten ist dadurch deutlich erhöht, so dass in der nachfolgenden Generation ein erhöhter Anteil an nicht transgenen Nachkommen nachgewiesen werden kann. Die Aufspaltungsverhältnisse in der Filialgeneration entsprechen dann nicht den Mendelschen Regeln. Durch die Anwendung von Markergen-basierter Selektion wird die Ausbildung chimärer Sprosse üblicherweise unterdrückt oder der Anteil an transgenem Gewebe in einer Sektorialchimäre ist durch den angewendeten Selektionsdruck so hoch, dass keine oder nur sehr geringe negativen Effekte des Chimären Charakters der regenerierten transgene Pflanze, insbesondere eine nicht der Mendelschen Regeln entsprechenden Vererbung, auftritt.

Für monokotyledone Nutzpflanzen sind aus dem Stand der Technik nur wenige

anwendbare Verfahren zur Transformation und Herstellung von Markergen-freien Pflanzen bekannt. Insbesondere für Weizen ist einzig von Liu et al. 2011 eine erfolgreiche

Selektionsmarker-freie Herstellung von transgenen Weizenpflanzen beschrieben. Jedoch ist die erzielte Ausbeute mit nur 0,28% extrem niedrig, weshalb das beschriebene

Verfahren für eine routinemäßige Anwendung ungeeignet ist. Außerdem verwenden die Autoren für die Transformation den Mikroprojektil-Beschuss und nicht Rhizobiaceae- Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens.

WO 2008/028121 beschreibt die Erstellung von Selektionsmarker-freien Maispflanzen, welche ohne die Anwendung einer Selektion generiert werden können. Die Autoren schlagen zwar vor, die offenbarte Methode auch auf andere Poaceae wie Weizen anzuwenden, jedoch beschränken sich die dargestellten Beispiele ausschließlich auf die Erzeugung von transgenen Maispflanzen. Zudem führen die Autoren zwar an, dass die erzeugten Maispflanzen vorzugsweise nicht chimär sein sollen, jedoch werden keine experimentellen Angaben zur Vererbung des Transgens an die nächste Generation gemacht, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass dennoch ein Großteil der erzeugten, transgenen Maislinien chimär ist. In EP 2 274 973 wird ebenfalls die Erzeugung von transgenen monokotyledonen Pflanzen, insbesondere Mais- und Reispflanzen, mittels /Agrobacter/um-vermittelter Transformation beschrieben, bei der kein Selektionsschritt angewendet wird. Für Mais wird klar gezeigt, dass eine nicht unerhebliche Zahl an

Chimären Pflanzen entsteht, welche aufwendig identifiziert und aussortiert werden müssen. Der Anteil an Chimären Ausgangstransformanten lag bei > 50% der erhaltenen, transgenen Sprosse. Nur weniger als 20% der generierten transgenen Pflanzen waren überhaupt nicht chimär (uniform). Damit ist die Zahl von Transformanten mit chimärem Charakter erwartungsgemäß um ein vielfaches höher als bei der Transformation mit entsprechenden Selektionsschritten. So wird z.B. bei Coussens et al. (2012) gezeigt, dass bei der

Generierung von transgenen Maispflanzen unter Verwendung des Selektionsmarkers bar ein Anteil von nur ca. 5 % der erstellten Pflanzen chimär ist, bzw. 95 % der erstellten Pflanzen nicht chimär sind, und somit das Transgen gemäß der Mendelschen Regeln an die nächste Generation weitergeben. Weiterhin beschreiben die Autoren in EP 2 274 973 die Transformation von Reis ohne Anwendung eines Selektionsmarkers, jedoch werden keine Analysen durchgeführt, die zeigen wie hoch der Anteil an Chimären Pflanzen in der Population der generierten, Selektionsmarker-freien Pflanzen ist. In diesem

Zusammenhang ist es interessant, dass bei der Transformation von Reis unter Anwendung eines Selektionsdruckes bereits Chimäre Pflanzen auftreten (Hiei et al., 1994). Somit kann auch hier erwartet werden, dass der Anteil an Chimären Pflanzen im Reis bei der

Selektionsmarker-freien Transformation deutlich erhöht ist. Die Autoren von EP 2 274 973 schlagen das offenbarte Herstellungsverfahren auch für die Erzeugung von transgenem Weizen vor, jedoch finden sich keine experimentellen Daten hierzu, welche Effizienzen und chimäre Tendenzen für Weizen zu erwarten sind. Auch wenn Weizen ebenso wie Mais und Reis zu den monokotyledonen Pflanzen gehört, ist es dem Fachmann bekannt, dass Zellen dieser Kulturpflanzenart im Prozess der Transformation und Regeneration ein deutlich unterschiedliches Verhalten aufweisen können, weshalb bezweifelt werden muss, dass Ergebnisse aus der Transformation anderer monokotyledoner Pflanzen ohne Weiteres auf Weizenpflanzen übertragen werden können. So zeigt beispielsweise Hensel et al. 2009 auch in einem Vergleich der Transformation von Gerste, Mais, Triticale und Weizen solche Unterscheide auf.

EP 2 460 402 A1 offenbart ein besonders effizientes Verfahren zur Transformation von Weizenzellen mittels Agrobacterium tumefaciens, das bei der Regeneration Ausbeuten von 70% und mehr transgene Linien pro isoliertem Ausgangsexplantat ermöglichen soll. Das hierbei angewendete Transformationsprotokoll beinhaltet aber immer die Verwendung der Selektionsmarker Hygromycinphosphotransferase (hpt) oder Phosphinotricin- acetyltransferase (PAT/bar). Zwar führen die Autoren an, dass eine Selektion für die Generierung von transgenen Weizenpflanzen nicht unbedingt notwendig ist, es fehlen jedoch auch hier entsprechende experimentelle Nachweise.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Rhizobiaceae-vermitteltes Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum bereitzustellen, welches ohne eine Markergen-basierten Selektion auskommt und vorstehend beschriebene unerwünschte Effekte minimiert oder nur im geringem Ausmaß aufzeigt. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum, welches aus sowohl aus ökonomischer wie auch aus regulatorischer Sicht bisherigen Verfahren überlegen ist.

Die Aufgaben sind erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum umfassend die Schritte (a) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit einer genetischen

Komponente durch Cokultivieren von Zellen eines Explantats der Pflanze der Gattung Triticum mit mindestens einer Bakterienzelle aus der Familie Rhizobiaceae, die die genetische Komponente umfasst, und (b) Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum aus mindestens einer transformierten Zelle aus (a), wobei von Schritt (a) bis Schritt (b) kein Selektieren einer transformierten Zelle aus (a) basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, erfolgt.

Bevorzugt ist eine Bakterienzelle aus der Familie Rhizobiaceae eine Bakterienzelle der Gattung Agrobacterium und besonders bevorzugt eine Bakterienzelle der Art

Agrobacterium tumefaciens (Broothaerts et al., 2005). Vorzugsweise umfasst die

Bakterienzelle die genetische Komponente auf einem Vektor, insbesondere auf einem binären Vektor, einem superbinären Vektor oder einem Vektor eines kointegrativen

Vektorsystems.

Vorzugsweise ist die genetische Komponente ein Nukleinsäuremolekül, insbesondere eine DNA-Molekül oder eine rekombinante DNA, und umfasst mindestens das gene of interest. Weiterhin kann die genetische Komponente eine regulatorische Sequenz, ein Intron, eine Erkennungssequenz für ein RNA-Molekül, ein DNA-Molekül oder ein Protein oder eine 5'- oder 3'-UTR (untranslated region) aufweisen.

In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Transformieren in Schritt (a) unter Bedingungen durchgeführt werden, welche eine erfolgreiche Infektion von mindestens einer Zelle eines Explantats der Pflanze der Gattung Triticum mit einer Bakterienzelle aus der Familie Rhizobiaceae erlaubt. Solche Transformationsbedingungen sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (Cheng et al., 1997). Vorzugsweise ist das in Schritt (a) eingesetzte Explantat ein embryonales Gewebe, insbesondere Radicula, Embryoachse, Scutellum oder Keim, oder ein Teil davon und stellt einen Teil eines unreifen Embryos oder reifen Samens dar (EP 0 672 752 B1 ). Es sind aber auch andere geeignete Gewebe bekannt, die erfolgreich für eine Transformation von Pflanzen der Gattung Triticum wie Weizen verwendet werden können (Shrawat und Lörz (2006)). Weiterhin meint das Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum aus mindestens einer transformierten Zelle aus (a) in Schritt (b) auch das Regenerieren einer Pflanze aus einer transformierten Zelle, welche aus mindestens einer transformierten Zelle aus (a) durch Zellteilung hervorgegangen ist, beispielsweise im Zuge der Bildung eines Kallus, welcher sich zu somatischen Embryonen umformt, um dann zur Sproßregeneration zu führen. Diverse Techniken zur Regeneration einer Pflanze der Gattung Triticum sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Eine Regeneration kann z.B. aus unreifen Embryonen erfolgen (Vasil et al., 1993). Eine weitere Möglichkeit der Regeneration ergibt sich aus Antheren oder aus Mikrosporen (Bsp.: Maluszynski et al., 2003).Außerdem wurden Weizenpflanzen auch schon aus Blütengewebe (Amoah et al., 2001) sowie aus Kallus von reifen Embryonen regeneriert (Wang et al., 2009)

Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt von Schritt (a) bis Schritt (b) kein Selektieren einer transformierten Zelle aus (a) basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon. Hierbei kann eine transformierte Zelle aus (a) ebenso eine transformierte Zelle, welche aus mindestens einer transformierten Zelle aus (a) durch Zellteilung hervorgegangen ist, bedeuten. Bevorzugt ist kein Selektieren basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder einen Teil davon, kein Selektieren basierend auf einer Herbizid- oder Antibiotikaresistenz.

Eine Herbizidresistenz kann beispielsweise durch die Expression der Phosphinotricin- Acetyltransferase aus Streptomyces hygroscopicus oder Streptomyces viridochromogenes, die eine Resistenz gegenüber dem Herbizid Phosphinotricin bzw. Bialaphos vermittelt, erreicht werden (De Block et al., 1987). Eine weitere Herbizidresistenz, die Resistenz gegenüber dem Wirkstoff Glyphosat, kann durch die Überexpression der 5- Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat-Synthase erzielt werden. Üblicherweise wird hierzu ein Enzym verwendet, welches insensitiv gegenüber Glyphosat ist (Comai et al., 1983).

Außerdem kann eine Resistenz gegenüber den Herbizidklassen der Sulfonylharnstoffe, Sulfonylaminocarbonyltriazolinone, Imidazolinone, Triazolopyrimidine und

Pyrimidinyl(thio)benzoate durch Expression einer mutagenisierten Form des Enzyms Acetolactat-Synthase (ALS) erzielt werden. Unterschiedliche Mutationen führen dabei zu einer Resistenz gegenüber den unterschiedlichen Herbiziden. Eine Übersicht über üblicherweise verwendete Herbizidresistenzen ist bei Tuteja et al (2012), Kraus (2010) oder Shrawat and Lörz (2006) zu finden. Antibiotikaresistenzen können durch Expression von bakteriellen Genen erzielt werden, die das eingesetzte Antibiotikum durch Übertragung einer Phosphat- oder Acetylgruppe inaktivieren. Beispiele hierfür sind die Neomycinphosphotransferase (npt), die eine

Resistenz gegenüber Antibiotika der Aminoglycosid-Klasse (z.B. Kanamycin, Paromomycin, Geneticin) vermitteln. Als weitere häufig verwendete Antibiotikaresistenz wird

beispielsweise die Hygromycinphosphotransferase verwendet, die eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin B vermittelt. Eine Übersicht über

Antibiotikaresistenzen, die in der Pflanzentransformation eingesetzt werden ist bei Tuteja et al (2012), Kraus (2010) oder Shrawat and Lörz (2006) zu finden.

Neben Antibiotika und Herbizidresistenzen können aber auch andere Selektionsmarker verwendet werden, die eine Differenzierung zwischen transgenen und nicht transgenen Zellen ermöglichen. Beispiele hierfür sind z.B. die Anregung der Produktion von

Anthocyanen oder anderen Pflanzenfarbstoffen durch die Expression bestimmter

Transkriptionsfaktoren (Kortstee et a., 2011 ), der Expression von Fluoreszenzproteinen (Mußmann et al., 2011 ) oder der Expression von auxotrophen Markern, wie der

Phosphomannoseisomerase (PMI), deren Expression ein Wachstum transgener Zellen auf Mannose als einziger Kohlenhydratquelle ermöglicht, wohingegen nicht-transgene Zellen diese Kohlenstoffquelle nicht nutzen können (Reed et al., 2001).

Dem Fachmann ist bewusst, dass aufgrund des fehlenden Selektionsdrucks auf die transformierten wie auch die nicht transformierten Zellen von Schritt (a) bis Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens neben transgenen Pflanzen auch nicht transgene oder chimäre Pflanzen im Schritt (b) regenerieren können. Die geringe Ausbeute an

verwertbaren transgenen Pflanzen (nicht chimär) stand lange einem ökonomisch sinnvollen Einsatz eines Markergen-freien Verfahrens zur Herstellung einer transgenen Pflanze entgegen. In der Regel war die Herstellung einer transgenen Pflanze mit Selektion, basierend auf einem Markergen und der anschließenden nachträglichen Entfernung des Selektionsmarkers, auch wenn diese mit immensen Arbeits-, Kosten- und Zeitaufwand verbunden war, weiterhin das Verfahren der Wahl, um transgene, Selektionsmarker-freie Pflanzen zu erstellen. Zur Steigerung der Effizienz der Erstellung von transgenen, monokotylen Pflanzen sind sich die Fachleute einig, dass dies ausschließlich dadurch geschehen kann, dass bereits zum Zeitpunkt des Cokultivierens der Zellen des Explantats mit dem Agrobacterium die Infektionsrate signifikant gesteigert werden muss. Dies sollte dann zu einer erhöhten Transformationsrate führen, d.h. das Vorhandensein von mehr transformierten Zellen im Explantat, aus denen dann auch mehr transgene Pflanzen regenerieren sollten. Diverse Ansätze für eine deratige gesteigerte Transformationseffizienz sind aus dem Stand der Technik bekannt (US 201 1/0030101 A1 ). Sie wurden auch in Verfahren zur Markergen-freien Herstellung von Mais und Reis erfolgreich eingesetzt. Dennoch bleiben auch heute noch die Markergen-freien Verfahren zur Herstellung von transgenen Mais- und Reispflanzen im Hinblick auf Transformationseffzienz hinter den Verfahren mit Markergen-basierter Selektion zurück, sodass die Herstellung von

transgenen Mais- und Reispflanzen immer noch vor Allem unter Verwendung von

Markergen-basierter Selektion stattfindet. In nicht unwesentlichem Maße ist dies auch auf die weiterhin bestehende Problematik der erhöhten Generation von Chimären Pflanzen bei Verzicht auf einen Selektionsmarker und deren anschließend notweniger Identifizierung und Aussortierung zurückzuführen. Gewöhnlich ist der Anteil an Chimären Pflanzen bei Verzicht auf die Markergen-basierter Selektion deutlich höher im Vergleich zu dem Anteil, welcher bei Verwendung eines Markergens erzielt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren beschriebt erstmals die Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum unter Verwendung einer Rhizobiaceae-vermittelten

Transformation, wobei kein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die während der Transformation eingeführten genetische Komponente oder eines Teiles davon, erfolgt. Entgegen den Erwartungen zeigte das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine überraschend hohe Transformationseffizienz auf, welche deutlich höher war, als aus dem Stand der Technik bekannte

Transformationseffizienzen von bekannten Markergen-freien Herstellungsverfahren transgener Pflanzen der Gattung Triticum ohne Verwendung von Bakterien der Familie Rhizobiaceae wie Agrobacterium tumefaciens. Das Verfahren weist bevorzugt eine

Transformationseffizienz von mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, besonders bevorzugt von mindestens 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% oder ganz besonders bevorzugt von mindestens 21 %, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% oder mehr als 40% auf.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die

Transformationseffizienz vergleichbar mit der Transformationseffizienz eines

entsprechenden Vergleichsverfahrens, das sich darin unterscheidet, dass ein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, also basierend auf mindestens einem Selektionsmarker erfolgt. Weiterhin kann die Transformationseffizienz des

erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens 95%, mindestens 90%, mindestens 85%, mindestens 80%, mindestens 75%, mindestens 70%, mindestens 65%, mindestens 60%, mindestens 55%, mindestens 50%, mindestens 45%, mindestens 40%, mindestens 35%, mindestens 30% oder mindestens 25% der Transformationseffizienz eines äquivalenten Verfahrens aufweisen, in welchem ein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, also basierend auf mindestens einem Selektionsmarker erfolgt. Aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes, der mit der nachträglichen Entfernung des Selektionsmarkers aus stabilen, transgenen Pflanzen verbunden ist, wird ein Fachmann auch dann das

erfindungsgemäße Verfahren noch vorteilhaft und dem Stand der Technik überlegen ansehen, wenn eine solche Transformationseffizienz im erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden. Ferner sollten solch hohe Transformationseffizienzen den Fachmann überraschen, da er aus den Erfahrungen mit Verfahren zur Markergen -freien Herstellung von beispielsweise transgenen Mais- und Reispflanzen eine deutlich niedrigere

Transformationseffzienz erwartet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein oben beschriebenes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Transformationseffizienz durch eine Behandlung zur Steigerung der Transformationseffizienz erhöht ist. Die Behandlung zur Steigerung der Transformationseffizienz kann eine Transformationseffizienz von mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, bevorzugt mindestens 1 1 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% oder besonders bevorzugt mindestens 21 %, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% oder mehr als 40% bewirken. Verschiedene Behandlungen zur Steigerung der

Transformationseffizienz in Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze,

insbesondere einer transgenen monokotyledonen Pflanze, sind im Stand der Technik beschrieben. Die Behandlung zur Steigerung der Transformationseffizienz kann mindestens eine Behandlung umfassen, die ausgewählt ist aus

i. physikalisches und/oder chemisches Schädigen des Gewebes oder eines Teils

davon während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren (EP 2 460 402), ii. Zentrifugation vor dem Cokultivieren, während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren (Hiei et al., 2006, WO 2002/012520),

iii. Zugabe von Silbernitrat und/oder Kupfersulfat in das Medium zum Cokultivieren

(Zhao et al., 2002; Ishida et al., 2003; WO 2005/017152), iv. thermale Behandlung des Explantats vor dem Cokultivieren oder während des Cokultivierens (WO 1998/054961 ),

v. Druckbehandlung vor dem Cokultivieren oder während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren (WO 2005/017169),

vi. Beimpfen mit Agrobacterium in Anwesenheit eines Puders (WO 2007/069643) und vii. Zugabe von Cystein in das Medium zum Cokultivieren (Frame et al., 2002).

Darüberhinaus sind weitere Behandlungen zur Steigerung der Transformationseffizienz aus dem Stand der Technik bekannt, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Zudem kann eine Behandlung zur Steigerung der

Transformationseffizienz auch eine Kombination bekannter Behandlungen zur Steigerung der Transformationseffizienz darstellen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein oben beschriebenes Verfahren entweder dadurch gekennzeichnet, dass das Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum in Schritt (b) nicht-chimäre, transgene Pflanzen mit einer Häufigkeit von mindestens 15%, mindestens 16%, mindestens 17%, mindestens 18%, mindestens 19%, mindestens 20%, mindestens 22% mindestens 24%, mindestens 26% mindestens 28%, mindestens 30%, mindestens 32%, mindestens 34%, mindestens 36%, mindestens 38% oder mindestens 40%, bevorzugt von mindestens 45%, mindestens 50% mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65% oder mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 75% mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90 hervorbringt, oder dadurch gekennzeichnet, dass das Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum in Schritt (b) vorzugsweise weniger als 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 28%, 26%, 24%, 22%, 20%, 18% 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 1 1 %, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% oder 5% chimäre, transgene Pflanzen hervorbringt.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Anteil an nicht-chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum aus Schritt (b) vergleichbar mit dem Anteil an nicht-chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum, welche regeneriert werden in einem entsprechenden Vergleichsverfahren, das sich darin unterscheidet, dass ein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer

Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, also basierend auf mindestens einem Selektionsmarker erfolgt. Dies ist ebenso überraschend, da ein Fachmann aus den Erfahrungen mit Verfahren zur Markergen-freien Herstellung von beispielsweise transgenen Maispflanzen einen deutlich niedrigeren Anteil an nicht- chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum erwartet. Aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes für die Erstellung von Selektionsmarker-freien Pflanzen der Gattung Triticum mit oben beschriebenem nachträglichen Entfernen des Selektionsmarkergens wird ein Fachmann auch dann das erfindungsgemäße Verfahren noch als vorteilhaft und dem Stand der Technik überlegen ansehen, wenn der Anteil an nicht-chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum aus Schritt (b) niedriger ist als im Vergleichsverfahren. Dabei kann der Anteil um maximal einem Faktor 10, um maximal einem Faktor 9, um maximal einem Faktor 8, um maximal einem Faktor 7, um maximal einem Faktor 6, um maximal einem Faktor 5, um maximal einem Faktor 4,5, um maximal einem Faktor 4, um maximal einem Faktor 3,5, um maximal einem Faktor 3, um maximal einem Faktor 2,5 oder um maximal einem Faktor 2 niedriger sein.

Wie oben beschrieben können chimäre transgene Pflanzen entstehen, wenn ein sich regenerierender Spross aus mehreren Ursprungszellen gebildet hat, wobei ein Teil dieser Zellen transgen, ein andere nicht transgen war. Es können dabei beispielsweise

Sektoralchimäre oder Periklinalchimäre entstehen. Durch den Anteil an nicht transgenem Gewebe in den Chimären Pflanzen, können diese z.B. durch die quantitative PCR

identifiziert werden (Faize et al., 2010).

Eine weitere Nachweismethode für chimäre transgene Pflanzen stellt die Analyse der ersten Nachkommenschaft einer Ausgangstransformante dar. Die in die

Ausgangstransformante eingebrachte genetische Komponente oder ein Teil davon kann gemäß den Mendelschen Regeln an die nächste Generation weitergegeben werden. Bei der Integration einer Kopie der genetischen Komponente oder eines Teils davon in das Genom der Pflanzenzelle wird dieses auf nur einem Chromosom des diploiden Genoms integriert. In einer nicht-chimären Pflanze wird dann in der Meiose die genetische

Komponente oder ein Teil davon dann in 50% der gebildeten Gameten zu finden sein. In Chimären transgenen Pflanzen werden aber auch aus dem nicht transgenen Teilen der Pflanze Gameten gebildet. In diesen Geweben werden nur Gameten gebildet, die genetische Komponente oder ein Teil davon nicht enthalten. Auf die gesamte Pflanze gesehen, erhöht sich somit in Chimären transgenen Pflanzen der Anteil an nicht transgenen Gameten auf > 50 %. In den Selbstungsnachkommen der Chimären

Ausgangstransformanten erhöht sich somit auch der Anteil an nicht transgenen

Nachkommen auf einen Wert > 25 %, was damit größer ist, als dies gemäß der

Mendelschen Regeln erwartet werden würde. Ein Beispiel für die nicht den Mendelschen Regeln folgende Segregation in der ersten Filialgeneration einer chimär transgenen

Pflanzen ist bei Coussens et al. (2012) zu sehen. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen

Verfahrens ist der Anteil an Chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum aus Schritt (b) vergleichbar mit dem Anteil an Chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum, welche regeneriert werden in einem entsprechenden Vergleichsverfahren, das sich darin unterscheidet, dass ein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer

Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, also basierend auf mindestens einem Selektionsmarker erfolgt. Dies ist ebenso überraschend, da ein Fachmann aus den Erfahrungen mit Verfahren zur Markergen-freien Herstellung von beispielsweise transgenen Maispflanzen einen deutlich höheren Anteil an Chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum erwartet. Aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes für die Erstellung von Selektionsmarker-freien Pflanzen der Gattung Triticum mit oben beschriebenem nachträglichen Entfernen des Selektionsmarkergens wird ein Fachmann auch dann das erfindungsgemäße Verfahren noch als vorteilhaft und dem Stand der Technik überlegen ansehen, wenn der Anteil an Chimären, transgenen Pflanzen der Gattung Triticum aus Schritt (b) höher ist als im Vergleichsverfahren. Dabei kann der Anteil um maximal einem Faktor 10, um maximal einem Faktor 8, um maximal einem Faktor 6, um maximal einem Faktor 5, um maximal einem Faktor 4, um maximal einem Faktor 3,5, um maximal einem Faktor 3, um maximal einem Faktor 2,5, um maximal einem Faktor 2, um maximal einem Faktor 1 ,8, um maximal einem Faktor 1 ,6, um maximal einem Faktor 1 ,4, um maximal einem Faktor 1 ,2 oder um maximal einem Faktor 1 ,1 höher sein.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es nach Schritt (b) einen weiteren Schritt (c) Selektieren der regenerierten transgenen Pflanze aus Schritt (b) umfasst. Vorzugsweise erfolgt das

Selektieren basierend auf der molekularen Struktur der genetischen Komponente oder eines Teils davon oder basierend auf der Eigenschaft, insbesondere einer phänotypischen Eigenschaft, welche durch die genetische Komponente direkt oder indirekt vermittelt wird (z.B. Herbizidresistenz, Pathogenresistenz, Wuchshöhe, Ertrag, Blattstruktur). Molekulare Struktur der genetischen Komponente oder eines Teils davon meint insbesondere die sequenzielle Abfolge der Nukleotide der genetischen Komponente oder eines Teils davon. Der Schritt (c) dient dem Nachweis der erfolgreichen Transformation der genetischen Komponente oder eines Teils davon in die Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum, d.h. auch den Transfer der genetischen Komponente oder eines Teils davon in das Genom der Pflanzen. Dafür stehen dem Fachmann zahlreiche unterschiedliche Methoden der

Molekularbiologie aus dem Stand der Technik zu Verfügung. So ist der Nachweis der in die Zelle eingebrachten genetischen Komponente beispielsweise über Polymerase Chain Reaction' (Mullis, 1988), über Hybridisierung einer detektierbaren, einzelsträngigen

Nukleinsäure, die komplementär zur eingebrachten genetischen Komponente ist, mit der genomischen DNA der transgenen Pflanze, z.B. im sogenannter Southern Blot (Southern, 1975) oder über Sequenzierung des Genoms der transgenen Pflanze (Kovalic et al., 2012) möglich. Weiterhin kann die molekulare Struktur der genetischen Komponente oder eines Teils davon auch die molekulare Struktur einer abgeleiteten Komponente, welche sich beispielsweise durch Transkription, Prozessierung und/oder Translation aus der

genetischen Komponente ergibt, bedeuten. So ist der Nachweis des Transkripts oder des kodierten Peptids / Polypeptids / Proteins der eingebrachten genetischen Komponente oder eines Teils davon in der transgenen Pflanze ebenso als Beleg für die erfolgreiche

Transformation der genetischen Komponente oder eines Teils davon, also für das

Selektieren geeignet. Beispiele für dem Fachmann bekannte Methoden, die zum Zwecke des Nachweises des Transkripts eingesetzt werden können sind: Das Umschreiben einer aus der genetischen Komponente oder einem Teil davon gebildeten RNA in cDNA und anschließende Polymerase Chain Reaction (RT-PCR; Sambrook et al., 2001), die

Hybridisierung einer detektierbaren, einzelsträngigen Nukleinsäure, die komplementär zur eingebrachtengenetischen Komponente ist, mit der RNA der transgenen Pflanze (Northern Blot, Sambrook et al., 2001) oder das Umschreiben einer aus der genetischen Komponente oder einem Teil davon gebildeten RNA in cDNA und anschließender Sequenzierung des gesamten Pools an erhaltener cDNA. Das kodierte Peptid / Polypeptid / Protein kann beispielsweise mittels Immunodetektion über unterschiedliche Methoden wie Western Blot oder ELISA identifiziert werden. Ferner kann zum Selektieren eine phänotypischen

Eigenschaft, welche durch die genetische Komponente direkt oder indirekt vermittelt wird, nachgewiesen werden. Ein solcher phänotypischer Nachweis kann auch den Nachweis einer geänderten chemischen Zusammensetzung der Pflanzenzelle einschließen. Diese geänderte chemische Zusammensetzung kann dann mittels bekannter Methoden der chemischen Analyse nachgewiesen werden.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen

Verfahrens wird die mindestens eine Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit der vollständigen genetischen Komponente in Schritt (a) transformiert, insbesondere stabil transformiert. Vollständig bedeutet vorzugsweise, dass die mindestens eine Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit der genetischen Komponente transformiert wird, wobei die genetische Komponente keine Trunkationen (beispielsweise vom 5'- oder 3'-Ende her) erfahren hat, welche die beabsichtigte Funktionalität der genetischen Komponente in der Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum beeinträchtigen, und besonders bevorzugt, dass die mindestens eine Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit sämtliche Nukleotiden der genetischen Komponente transformiert wurde.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen

Verfahrens zeigt nach der Transformation in Schritt (a) die genetische Komponente eine Expressionshöhe in der Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum, welche die beabsichtigte Funktionalität der genetischen Komponente ermöglicht. Vorzugsweise ist das

erfindungsgemäße Verfahren dadruch charakterisiert, dass 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% der transformierte Zellen aus Schritt (a) eine detektierbare Expressionshöhe aufweisen, bevorzugt eine Expressionshöhe aufweisen, welche die beabsichtigte Funktionalität der genetischen Komponente

ermöglicht, oder dass 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% der regenerierten transgenen Pflanze der Gattung Triticum aus Schritt (b) Zellen umfassen, die eine detektierbare Expressionshöhe aufweisen, bevorzugt eine

Expressionshöhe aufweisen, welche die beabsichtigte Funktionalität der genetischen Komponente ermöglicht.

Oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum lassen sich dahingehend vorteilhaft einsetzen, da aus den trangenen Pflanzen Selektionsmarker-freie transgene Linien von hoher Qualität entwickelt werden können. Um transgene Linien vergleichbarer Qualität zu erstellen bestünde zur Zeit nur die Möglichkeit mittels Co-Transformation und anschließender Segregation, Selektionsmarker-freie

Pflanzen zu erstellen. Vergleicht man den Aufwand, der betrieben werden muss, um eine Selektionsmarker-freie transgene Linie über den Co-Transformationsansatz zu generieren mit dem Aufwand bei einem Verfahren der vorliegenden Erfindung, so sind die Kosten für die Entwicklung einer homozygoten, Selektionsmarker-freien transgenen Linie ca. 50 mal so hoch. Figur 1 zeigt eine Schätzung der Kosten für die Generierung von 100 TO transgenen Linien bei einem Cotransformationsansatz sowie bei der Selektionsmarker freien Transformation. Die generierten Ausgangstransformanten werden weiter analysiert in den nächsten Generationen, mit dem Ziel homozygote, Selektionsmarker-freie

Saatgutpools zu erhalten. Während die Ausbeute an .Single copy', Selektionsmarker-freien Linien beim Co-Transformationsansatz bedingt durch die nur 30 - 50 % Co- Transformationsrate und die Erfordernis, dass sowohl das gene of interest als auch der Selektionsmarker als .Single copy'-Event vorliegen müssen, um eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit der Segregation der beiden Transgene zu bekommen, bei nur 2 homozygoten Saatgutpools liegt, kann ausgehend von 100 Ausgangstransformanten bei der erfindungsgemäßen Selektionsmarker-freien Transformation mit 30 homozygoten Saatgutpools gerechnet werden.

Die vorliegende Erfindung erfasst weiterhin eine transgene Pflanze der Gattung Triticum, welche mit einem der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, sowie ein Nachkomme, ein Teil oder ein Samen davon, wobei der Nachkomme, der Teil oder der Samen die genetische Komponente, welche in Schritt (a) des erfindungsgemäßen

Verfahrens übertragen wurde, als Transgen aufweist. Ein Teil kann dabei eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ bedeuten.

Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:

Ein„gene of interest" kann jede Art von DNA oder RNA-Molekül, welches beispielsweise ein Protein kodiert, sein oder ein Nukleinsäuremolekül.

Eine„Pflanze der Gattung Triticum" meint beispielsweise eine Pflanze der Spezies Triticum aestivum, eine Pflanze der Spezies Triticum durum oder eine Pflanze der Spezies Triticum spelta.

Eine„regulatorische Sequenz" ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, welche die Expression eines gene of interest kontrolliert. Beispiele sind Promotoren, Operatoren, Enhancer-Elemente, Attenuatoren, cis-Elemente etc.

Der Begriff„Selektionsmarker" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gleichbedeutend mit Selektionsmarkergen oder Markergen verwendet. Beispiele für nutzbare Selektionsmarker sind oben beschrieben.

„Transformationseffizienz" kann das Verhältnis der Zahl von Explantate mit positiv- transgenen Sprossen zu der Zahl von Ausgangsexplantaten meinen. Die

Transformationseffizienz wird vorzugsweise als Prozentsatz angegeben.

Der Begriff„vergleichbar" bedeutet im Zusammenhang mit zwei oder mehr

gegenübergestellten nummerischen Angaben, dass die Angaben um höchstens +/- 5% voneinander abweichen. Ausgestaltungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen

beschrieben:

Figur 1 : Kosten-Gegenüberstellung für die Generierung von 100 T0-Pflanzen mittels Cotransformation (links) und mittels einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und weitere Identifizierung von homozygoten, Selektionsmarker freien Saatgutpools.

Figur 2: Blick auf das Scutellum eines mit tDT transformierten Weizenembryos 5 Tagen nach Infektion mit A. tumefaciens (links: bei Fluoreszenzlicht; rechts: bei Tageslicht); Pfeile zeigen fluoreszierende Regionen im Ausgangsexplantat, welche exemplarisch Hinweis auf durch die Agrobakterien geben.

Figur 3: Binärvektor pLH70SubiintrontDT (tDT ist tandem Dimer Tomato, ein rot

fluoreszierendes Protein)

Figur 4: Southern Blot von ausgewählten, Selektionsmarker-freien transgenen Linen des Transformationsversuches WA1. 20 pg der genomischen DNA der jeweiligen Linie wurden vollständig mit dem Enzym Hindlll verdaut, in einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmenbran geblottet und anschließend mit einem DIG markierten PCR Produkt (tDT- rev/tDT-for) hybridisiert.

Figur 5: Expressionsanalyse des eingebrachten tDT-Gens mittels qRT-PCR in

ausgewählten, transgenen Weizenpflanzen.

Figur 6: Bestimmung des Zygotiestatus mittels qPCR auf das eingebrachte Transgen tDT sowie auf den eingebrachten nos-Terminator (siehe Figur 3).

Selektionsmarker-freie Transformation von Weizenpflanzen der Sorte Taifun:

Weizenpflanzen der Sorte Taifun wurden im Gewächshaus angezogen. Die

Anzuchtbedingungen waren 18 °C am Tag und 16 °C in der Nacht, wobei die Tageslänge 16 h betrug. Als Beleuchtungsquelle wurden Natriumlampen verwendet (Master SON-T Agro 400W). Die Embryonengröße in den sich entwicklenden Ähren wurde regelmäßig überprüft und Ähren, die Körner mit Embryonen enthielten, die ca. 1 ,5 - 2,5 mm Größe hatten, wurden geerntet und bis zur weiteren Verwendung in Wasser stehend bei 4 °C im Dunkeln gelagert. Als Vorbereitung auf die Isolierung der unreifen Weizenembryonen wurden die Körner aus den Weizenähren isoliert und anschließend oberflächensterilisiert. Dazu wurden die Körner zunächst 45 Sekunden in 70 % Ethanol inkubiert und anschließend 10 Minuten in 1 % Natriumhypochloridlösung inkubiert. Nach der Sterilisation wurden die Körner durch mehrmaliges Waschen in sterilem Wasser von noch anhaftendem Natriumhypochlorid befreit. Die sterilisierten Körner wurden dann bis zur weiteren Verwendung bei 4°C im Dunkeln gelagert.

Die Anzucht von Agrobacterium tumefaciens zur Transformation erfolgte ausgehend von einer Glycerinkultur des A. tumefaciens Stammes AGL1 , welcher das zu transformierende Genkonstrukt im Binärvektor pLH70SubiintrontDT (Figur 3) trägt. Nach Ausstrich auf selektivem LB-Medium (mit 100 mg/L Rifampicin, 100 mg/L Carbenicillin, 50 mg/L

Spectinomycin, 25 mg/L Streptinomycin) wurde mit einer Einzelkolonie eine 2 ml

Flüssigkultur in MG/L-Medium (Wu et al., 2009) mit 100 mg/L Rifampicin, 100 mg/L

Carbenicillin, 50 mg/L Spectinomycin, 25 mg/L Streptinomycin angeimpft und über Nacht bei 28 °C und 200 rpm angezogen. 250 μΙ der Flüssigkultur wurden am nächsten Tag für das Animpfen von 50 ml frischem MG/L Medium (100 mg/L Rifampicin, 100 mg/L

Carbenicillin, 50 mg/L Spectinomycin, 25 mg/L Streptinomycin) verwendet und die Kultur über Nacht bei 28 °C und 200 rpm angezogen. Ein Aliquot der Über-Nacht-Kultur wurde anschließend abzentrifugiert (5 Minuten bei 4 °C und 3500 x g), der Überstand verworfen und das Bakterienpellet im gleichen Volumen Inf liquid medium (Tabelle 1) mit 100 μΜ Acetosyringon resuspendiert. Die so hergestellte Agrobakteriensuspension konnte für die Infektion der unreifen Embryonen verwendet werden.

Aus den sterilisierten Weizenkörnern wurden die unreifen Embryonen isoliert und im Inf liquid medium (Tabelle 1) gesammelt. Anschließend wurden die Embryonen einmal mit frischem Inf liquid medium gewaschen und dann durch Zentrifugation bei 15.000 rpm für 10 Minuten vorbehandelt. Zur Infektion mit den Agrobakterien wurde die vorbereitete

Agrobakteriensuspension auf die Embryonen gegeben und die Embryonen wurden für 30 Sekunden in der Agrobakteriensuspension geschwenkt. Im Anschluß daran wurden die Embryonen für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur in der Agrobakteriensuspension inkubiert. Die unreifen Embryonen wurden dann auf Co-Cul Medium (Tabelle 1 ) gegeben und zwar mit der Scutellum-Seite nach oben. Die so behandelten Explantate wurden für zwei Tage bei 23 °C im Dunkeln inkubiert. Figur 2 zeigt das Scutellum eines transformierten Weizenembryos nach mehreren Tagen nach Infektion mit A. tumefaciens. Die

Weizenembryonen wurden mit einem Reportergenkonstrukt transformiert, welches zur Bildung eines rot-fluoreszierenden Proteins in den transformierten Zellen führt. Das linke Bild zeigt das Scutellum bei Tageslicht, das rechte das Scutellum bei Fluoreszenzlicht. Es ist deutlich zu erkennen, dass ein Großteil der Zellen des Scutellums das Transgen expremieren und somit erfolgreich durch A. tumefaciens infiziert wurde.

Nach zwei Tagen Co-Kultur der unreifen Weizenembryonen mit den Agrobakterien wurde die Embryoachse mittels eines scharfen Skalpells von jedem Embryo entfernt und die verbleibenden Scutella wurden auf ein resting medium (Tabelle 1) gesetzt,. Die Platten mit den Scutella wurden im Anschluss 5 Tage bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde der sich entwickelnde Kallus noch einmal bei 25 °C im Dunkeln auf dem resting medium (Tabelle 1) für 21 Tage subkultiviert.

Der induzierte Kallus wurde im Ganzen auf LSZ medium (Tabelle 1) umgesetzt und für 14 Tage ins Licht gestellt. Sich bildende, grüne Sprosse wurden vom Kallus getrennt und auf LSF medium (Tabelle 1) zur Bewurzelung umgesetzt. Dabei wurden die Sprosse, soweit dies bereits möglich war, voneinander getrennt um Einzelsprosse zu erhalten. Sprosse die aus einem Ursprungsexplantat stammten (Scutellum) wurden dabei zusammengehalten. Nach ausreichendem Längenwachstum der Sprosse konnten von diesen Blattproben für DNA Extraktionen und anschließender PCR Analysen abgenommen werden.

Tabelle V. Zusammensetzung der einsetztbaren Medien

Inf liquid medium Co-Cul medium resting medium

1/10 x MS anorganische 1/10 x MS anorganische 1x MS anorganische

Salze Salze Salze

1X MS Vitamine 1X MS Vitamine 1X MS Vitamine

10 g/L Glucose 10 g/L Glucose 40 g/L Maltose

0,5 g/L MES 0,5 g/L MES 0,5 g/L Glutamin

100 μΜ Acetosyringon 0,1 g/L Caseinhydrolysat

5 μΜ Silbernitrat 0,75 g/L MgCL2 x 7H20

5 μΜ Kupfersulfat 1 ,95 g/L MES

8 g/L Agarose 100 mg/L Ascorbinsäure

150 mg/L Timentin

2,2 mg/L Picloram

0,5 mg/L 2,4-D

2 g/L Gelrite

8 g/L Agar 3 g/L Gelrite

Ergebnisse:

Drei unabhängige Transformationsexperimente in Triticum aestivum wurden wie oben beschrieben ohne die Verwendung eines Selektionsmarkers durchgeführt. In allen drei Experimenten konnten transgene Pflanzen ohne den Einsatz von Selektionsmarkern erhalten werden (siehe Tabelle 2). Überraschend war die hohe Anzahl an Explantaten, die zu transgenen Sprossen führten. Im Experiment WA1 konnten von 151 infizierten

Embryonen 89 Embryonen zur Regeneration von Sprossen angeregt werden. Die regenerierten Sprosse wurden für die PCR Analyse zunächst zu insgesamt 341

Sprosspools zusammengefasst. Dazu wurden, je nach Anzahl der regenerierten Sprosse pro Ausgangsexplantat, jeweils 2 - 3 Sprosse eines Explantates für den Zweck der DNA Extraktion in einem Probengefäß zusammengefasst. Sollten mehr als drei Sprosse pro Ausgangsexplantat regeneriert sein, so wurden mehrere Sprosspools von einem

Ausgangsexplantat angelegt. Es wurden jedoch niemals Blattproben von Sprossen mehrerer Ausgangsexplantate zusammengefasst. Von den analysierten Sprosspools war eine erstaunlich hohe Anzahl positiv (78 oder ~ 23%). Aus den 341 Sprosspools der 89 Explantate konnten von 42 Explantaten 78 transgene Sprosspools identifiziert werden. Die den 78 Sprosspools zu Grunde liegenden 1 1 1 Sprosse wurden dann einzeln beprobt und erneut auf Anwesenheit des Transgens untersucht.

Zum Nachweis des Transgens in den regenerierten Sprossen wurde die aus den

Sprosspools oder aus den Einzelsprossen isolierte DNA mittels PCR auf Anwesenheit der rekombinanten DNA untersucht. Dazu wurden die Primer tDT-1 (SEQ ID NO: 1 ) und tDT-2 (SEQ ID NO: 2) verwendet. DNA's, bei denen ein 287 bp Fragment amplifiziert werden konnte, zeigten die Präsenz der eingebrachten, rekombinanten DNA und wurden als Transgen betrachtet. Zur Bestimmung der Anzahl der eingebrachten Kopien des Transgens in das Weizengenom wurde eine quantitative PCR mit den Primern nosTxxxfOl (SEQ ID NO: 3) und nosTxxxr03 (SEQ ID NO: 4) sowie der Sonde nosTxxxMGB (SEQ ID NO: 5) durchgeführt. Die quantitative PCR bestätigte die zuvor erhaltenen Ergebnisse mit der klassischen PCR.

Bei Experiment WA1 konnte in insgesamt 82 Sprossen das Transgen nachgewiesen werden. Die 82 Sprosse stammten von 37 Explantaten/Embryonen, die zu Beginn mit A. tumefaciens infiziert wurden. Demnach konnte im Experiment WA1 trotz des Weglassens der Markergen-basierten Selektion eine Transformationseffizienz von ~25 % erreicht werden. Diese Effizienz berechnet sich aus den 37 Explantaten mit positiven Sprossen, von ursprunglich 151 eingesetzten Explantaten.

In den Experimenten WA2 und WA3 wurden direkt alle Einzelsprosse, die aus den

Explantaten regenerierten mittels PCR untersucht, da in Experiment WA1 eine

überraschend hohe Ausbeute an transgenen Sprossen erhalten wurde, und damit die Anwendung der Pool-PCR-Strategie überflüssig war. Bei direkter Analyse der regenerierten Sprosse konnten in 56% (WA2) bzw. 75% (WA3) der regenerierbaren Explantate transgene Einzelsprosse identifiziert werden.

Berechnet man die Effizienz der Transformation auf Basis der Anzahl der eingesetzten Ausgangsexplantate, so ergeben sich Transformationseffizienzen von 27% für das

Experiment WA2 und 40% für das Experiment WA3.

Eine Mittelung über alle drei Transformationsversuche bei Triticum aestivum ohne die Anwendung einer Markergen-basierten Selektion ergibt, dass durchschnittlich 55% der regenerierbaren Explantate transgene Einzelsprosse hervorbrachten und eine mittlere Transformationseffizienz von etwa 30% erreicht wurde.

Parallel wurden die Kontroll-Experimente WA1 K, WA2K und WA3K durchgeführt, in denen der Selektionsmarker Hygromycinphosphotransferase (hpt) zusammen mit dem gene of interest in das Genom der Weizensorte Taifun integriert wurde. Die Transformationen wurden wie in EP 2 460 402 beschrieben durchgeführt, d.h. während der Kallus und

Regenerationsphase wurde dem Medium Hygromycin in Konzentrationen von 15 mg/L bzw. 30 mg/L zugesetzt.

Bei WAK1 konnte dabei eine Transformationseffizienz von 37% erreicht werden (75

Explantate mit positiven Sprossen von 204 Ausgangsexplantaten). Im Versuch WAK2 betrug die Transformationseffizienz 24% (37 Explantate mit positiven Sprossen von 153 Ausgangsexplantaten) und bei WAK3 27% (47 Explantate mit positiven Sprossen von 175 Ausgangsexplantaten). Im Mittel konnte somit in diesen Transformationsexperimenten eine Effizienz von 30% (0 WAK) erreicht werden.

Somit entspricht die gefundene Transformationseffizienz ohne Anwendung von Selektion der Effizienz, die üblicherweise in Weizentransformationsexperimenten mit Markergen- basierter Selektion erreicht wird, teilweise scheinen die Effizienzen sogar höher zu sein.

Tabelle 2: Ergebnisse von drei Transformationsversuchen ohne die Anwendung einer Markergen- basierten Selektion in Triticum aestivum (Sorte Taifun); WAKx bezeichnet die Kontrollexperimente mit Markergen-basierter Selektion, WAx bezeichnet Experimente ohne Markergen-basierter Selektion

Der Nachweis der Transgenität der erstellten, Selektionsmarker-freien transgenen Linien wurde wie oben beschrieben über qPCR erbracht. Gleichzeitig erlaubte diese Analyse eine Abschätzung des Anteils an .Single copy'-Linien, die für die weitere Verwendung zu kommerziellen Zwecke von besonderem Interesse sind. Auch hier zeigte sich, dass sich die Ergebnisse zwischen Transformationen mit und ohne Verwendung eines Selektionsmarkers nicht unterscheiden.

So konnten im Experiment WA2 zwölf unabhängige .Single copy'-Linien über den qPCR- Ansatz identifiziert werden. Da insgesamt 27 unabhängige transgene Events generiert wurden, entspricht dies einer Rate von 44% .Single copy'-Events. Im Experiment WA3 wurden ebenfalls 12 unabhängige .Single copy'-Events generiert, was bei insgesamt 42 generierten unabhängigen Events einer Rate von 29% entspricht.

Um die Transgenität der erstellten Linien weiter zu verifizieren, wurden von

ausgewähltenTo-Pflanzen des Experiments WA1 ein Southern Blot durchgeführt. Dem Fachmann ist bekannt, dass es beim Transfer der T-DNA vom Agrobakterium in das pflanzliche Genom häufig nur zum Transfer von verkürzten T-DNA Fragmenten kommt. Diese sind an der LB (left border)-Seite deletiert. Daher werden T-DNAs zur Verwendung in einer Transformation mit Markergen häufig so konzipiert, dass der für die Selektion verwendete Selektionsmarker an der LB-Seite der T-DNA positioniert wird. Somit können dann nur Events mit vollständiger T-DNA, also auch vollständig übertragenem Markergen, selektiert werden. Da bei Markergen-freier Transformation nur das gene of interest als T- DNA vorhanden ist, könnte somit das gene of interest unfreiwillig beim Transfer verkürzt werden, was gewöhnlich zur fehlerhaften Expression des übertragenen gene of interest im pflanzlichen Genom führt.

Zur Überprüfung der Vollständigkeit der übertragenen T-DNA wurden

Hybridisierungsversuche durchgeführt. Dabei wurde das eingebrachte tDT-Gen als

Hybridisierungssonde verwendet. Die genomische DNA wurde mit Hindlll verdaut, so dass eine vollständig integrierte T-DNA ein Hybridisierungsfragment von größer 3,0 kb ergab. Wie in Figur 4 zu sehen, konnte in allen getesteten, PCR-positiven Linien ein

Hybridisierungsfragment gefunden werden. Genomische DNA der Negativkontrolle (Taifun) hybridisierte nicht mit der Sonde. Da sämtliche erhaltenen Hybridisierungsfragmente eine Größe > 3,0 kb aufweisen, ist damit nachgewiesen, dass in allen dargestellten Linien die T- DNA vollständig integriert ist. Dies zeigt, dass die Qualität des Transgens nach Transfer vergleichbar ist mit derjenigen unter Verwendung einer Transformation mit LB-seitigem Markergen. Dies war so für einen Fachmann nicht zu erwarten.

Weiterhin wurden die transgene Linien, hergestellt mit dem Markergen-freien

Transformationsverfahren, hinsichtlich der Expressionshöhe des integrierten Transgens genauer untersucht. Bei Verwendung von T-DNA mit Selektionsmarker ist es für die erfolgreiche Selektion von transgenen Linien notwendig, dass das Gen des

Selektionsmarkers exprimiert wird, und es somit zur Bildung des funktionalen Proteins kommt. T-DNA-Integrationen in genomischen Regionen, die kein Ablesen des

eingebrachten Genkonstruktes ermöglichen, können somit nicht als transgene Linie identifiziert werden. Bei Verwendung der Selektionsmarker-freien Transformation werden Events, die in Regionen des Genoms integriert sind, die kein Ablesen des Transgens ermöglichen, mittels molekularbiologischer Verfahren wie PCR ebenfalls als transgene Linie identifiziert. Somit besteht die Gefahr, dass ein erhöhter Anteil an transgenen Linien produziert wird, die keinerlei Expression des eingebrachten Transgens aufweisen.

Daher wurde die Expressionshöhe des eingebrachten Transgens aus zufällig ausgewählten Linien des Transformationsexperiments WA1 mittels qRT-PCR bestimmt (Figur 5). In lediglich 3 der analysierten 13 transgenen Linien konnte keine Expression des Transgens festgestellt werden. Alle anderen Linien zeigen eine deutliche Expression des Transgens, wenn sich auch die Expressionshöhe zwischen den einzelnen Linien deutlich unterscheidet. Dies ist aber auch in transgenen Linien der Fall, die unter Verwendung eines

Selektionsmarkers transformiert wurden. Somit gibt es auch keine Unterschiede in der Qualität des Transgens zwischen transgenen Linien, die mit Hilfe eines Selektionsmarkers erstellt wurden und solche ohne einen Selektionsmarker.

Zum Nachweis der Bildung von chimär transgenen Pflanzen wurde untersucht, ob das eingebrachte Transgen an die nächste Generation gemäß den Mendelschen Regeln weitergegeben wird. Dazu wurde das Saatgut von 6 transgenen Linien ausgelegt (jeweils 30 Körner/Linie) und die Anwesenheit des Transgens sowie dessen Zygotiestatus wurden mittels qPCR auf das eingebrachte Transgen tDT sowie auf den eingebrachten nos- Terminator bestimmt. Exemplarisch ist das Ergebnis einer Analyse einer

Nachkommenschaft in Figur 6 dargestellt. Es ist eindeutig ein klassische 1 :2:1- Vererbungsmuster für einen monogenen Erbgang zu beobachten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Nachkommenschaftsanalyse ist in Tabelle 3 wiedergegeben.

Fünf der sechs analysierten Nachkommenschaften zeigen eine Vererbung gemäß den Mendelschen Regeln (entspricht 83%). Somit kann davon ausgegangen werden, dass der größte Teil der erstellten transgenen Ausgangstransformanten homogen in Bezug auf das Transgen war. Der nicht Mendelsche Erbgang bei der transgenen Linie WA1-T-014 kann zum einen auf eine nicht homogene, also chimar transgene Pflanze zurückzuführen sein, zum anderen kann aber auch die Integration des Transgens in ein wichtiges Gen der Pflanze erfolgt sein. Dadurch kommt es zu partiell letalen Pflanzen/Embryonen, was auch die schlechte Keimfähigkeit dieser Nachkommenschaft (nur 20 von 30 Körnern keimten) erklären würde.

Tabelle 3: Ergebnisse einer Nachkommenschaftsanalyse zum Nachweis von chimär transgenen Weizenpflanzen

transgene Linie azygot hemizygot homozygot total Spaltungsverhältnis Chi²

WA1-T-006 8 16 3 27 1 :2:1 0,25

WA1-T-008 8 14 7 29 1 :2:1 0,95

WA1-T-009 4 16 9 29 1 :2:1 0,36

WA1-T-014 11 6 3 20 ? 0,01

WA1-T-024 8 13 9 30 1 :2:1 0,74

WA1-T-028 9 17 4 30 1 :2:1 0,33

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US 201 1/0030101 A1 (Japan Tobacco Inc. et al.) "Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant"

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum umfassend die Schritte

(a) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze der Gattung Triticum mit einer genetischen Komponente durch Cokultivieren von Zellen eines Explantats der Pflanze der Gattung Triticum mit mindestens einer Bakterienzelle aus der Familie Rhizobiaceae, die die genetische Komponente umfasst, und

(b) Regenerieren einer transgenen Pflanze der Gattung Triticum aus mindestens einer transformierten Zelle aus (a),

wobei von Schritt (a) bis Schritt (b) kein Selektieren einer transformierten Zelle aus (a) basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze der Gattung Triticum eine Pflanze der Spezies Triticum aestivum, Triticum durum oder Triticum spelta ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Explantat ein embryonales Gewebe, insbesondere Radicula, Embryoachse, Scutellum oder Keim, oder ein Teil davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das embryonale Gewebe Teil eines unreifen Embryos oder reifen Samen ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass kein Selektieren basierend auf einer Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teils davon, kein Selektieren basierend auf einer Herbizid- oder

Antibiotikaresistenz ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren eine Transformationseffizienz von mindestens 5% aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren eine Transformationseffizienz aufweist, welche vergleichbar ist mit der

Transformationseffizienz eines entsprechenden Vergleichsverfahrens, das sich darin unterscheidet, dass ein Selektieren einer transformierten Zelle basierend auf einer

Eigenschaft, vermittelt durch die genetische Komponente oder eines Teiles davon, erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformationseffizienz durch eine Behandlung zur Steigerung der

Transformationseffizienz erhöht ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung zur

Steigerung der Transformationseffizienz eine Transformationseffizienz von mindestens 5% bewirkt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung zur Steigerung der Transformationseffizienz mindestens eine Behandlung umfasst, die ausgewählt ist aus

i. physikalisches und/oder chemisches Schädigen des Gewebes oder eines Teils davon während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren,

ii. Zentrifugation vor dem Cokultivieren, während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren,

iii. Zugabe von Silbernitrat und/oder Kupfersulfat in das Medium zum Cokultivieren, iv. thermale Behandlung des Explantats vor dem Cokultivieren oder während des

Cokultivierens,

v. Druckbehandlung vor dem Cokultivieren oder während des Cokultivierens oder nach dem Cokultivieren,

vi. Beimpfen mit Agrobacterium in Anwesenheit eines Puders und

vii. Zugabe von Cystein in das Medium zum Cokultivieren.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) nicht- chimäre, transgene Pflanzen mit einer Häufigkeit von mindestens 15% hervorbringt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen weiteren Schritt umfasst

(c) Selektieren der regenerierten transgenen Pflanze aus Schritt (b).

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektieren in Schritt (c) basierend auf der molekularen Struktur der genetischen Komponente oder eines Teils davon oder basierend auf der Eigenschaft, insbesondere einer phänotypischen Eigenschaft, welche durch die genetische Komponente direkt oder indirekt vermittelt wird, erfolgt.

14. Transgene Pflanze der Gattung Triticum, welche mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurden, sowie ein Nachkomme, ein Teil oder ein Samen davon.