WO2014169494A1

WO2014169494A1 - 特异性识别egfr突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用

Info

Publication number: WO2014169494A1
Application number: PCT/CN2013/074626
Authority: WO
Inventors: 吴正东; 黄文俊
Original assignee: 武汉纽斯特生物技术有限公司
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2014-10-23
Also published as: CN103626871A

Abstract

本发明公开了特异性识别EGFR突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用，属于生物科学和药物载体领域。利用本发明的方法制备出的三种单克隆抗体分别可以特异性识别十种EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L突变蛋白。这十种单克隆抗体可以用于检测动物或者人体组织中的EGFR蛋白是否含有G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、 L861Q、A839T、N826S、G863D或者V769L突变，能为临床上的多种癌症的诊断和治疗提供依据。

Description

特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用技术领域

本发明属于生物科学和药物载体领域，特别涉及特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其作为诊断和治疗试剂的应用。背景技术

EGFR蛋白 (Epidermal Growth Factor Receptor , 表皮生长因子受体，也称为 ErbB-1或者 HERl)是细胞表面的表皮生长因子受体家族的跨膜受体成员。 EGFR与细胞外的表皮生长因子（EGF ) 结合，从而将细胞外的信号传导到细胞内。 EGFR蛋白的突变在多种人类癌症，例如肺癌、肛门癌、直肠癌、乳腺癌中都存在 ( Paez JG et al . , Science, 304 (5676)： 1497-500 (2004) ) 。这些突变导致 EGFR蛋白的持续激活，进而促进细胞的增殖转化和癌细胞生长。常见的 EGFR突变蛋白有 G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D和 V769L。

针对 EGFR突变蛋白的抑制剂药物已经上市，包括易瑞沙™ ( Iressa™, 化学名 Genf itinib )、特罗凯™ ( Tarceva™,化学名 Erlotinib )等（Mayumi Onol and Michihiko Kuwano, Clin. Cancer Res. 12： 7242 (2006) ) 。这些抑制剂药物特异性针对突变的 EGFR蛋白，因此在使用之前，需要用一种能够特异性结合突变的 EGFR蛋白但是不结合野生型 EGFR蛋白的抗体来检测该病人是否带有 EGFR突变（Pal l i s AG et al .， J. Cancer. 105 (1) : 1-8. (2011) )。这种抗体可以被用来快速检测少量的取自病人的样品，用于诊断癌症。能够特异性结合 EGFR突变蛋白的抗体也是治疗癌症所迫切需要的。发明内容

本发明的目的是为解决上述问题而提供了分别特异性地识别 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D和 V769L突变体蛋白的六种单克隆抗体、制备方法及其应用。利用本发明的方法制备出的单克隆抗体能够分别特异性地识别 G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D和 V769L突变体蛋白，而不识别野生型 EGFR蛋白。

在一些操作实例中，所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由一条重链和一条轻链组成；重链和轻链的 CDR1、 CDR2以及 CDR3的氨基酸序列分别是由中国典型培养物保藏中心 ( CCTCC ) 保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302 , CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的 CDR1、 CDR2以及 CDR3的氨基酸序列决定。在进一步的操作实例中，所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由分别包含所述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链的可变区域的氨基酸序列的一条重链和一条轻链组成。在更进一步的操作实例中，抗体或者抗原结合部位包含上述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。

本发明的单克隆抗体可以是一种人源化的或者嵌合型的抗体。在某些操作实例中，这种单克隆抗体是 IgG。

在一方面，本发明包括保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC ) 保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302 , CCTCC C201320 , CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞。

本发明包括一种含有所述单克隆抗体或者抗原结合部位的药物或者可用于药物的载体。本发明还包括一种含有本发明中提到的单克隆抗体或者其抗原结合部位诊断试剂盒。

在一些应用实例中，本发明能够提供一种癌症诊断的方法（例如，肺癌，非小细胞肺癌，直肠癌，结肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，胶质瘤，脑癌），其主要步骤包括：用本发明所述的单克隆抗体接触来自于检测目标的生物学样本；检测抗体或者其部分与样本是否结合；如果抗体与样本存在结合则表明被检测对象是癌症，或者存在发展成癌症的风险。

在另外的应用实例中，本发明提供一种治疗肿瘤病人的方法，包括：检测 G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D 或者 V769L突变形式的 EGFR蛋白是否存在于来自于病人的样本中；如果其中一个突变存在，则使用一种 EGFR抑制剂（例如 Genf it inib和 Erlotinib ) 进行治疗。本发明还提供一种治疗癌症病人（例如，直肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌）的方法。该治疗方法包括给予病人一种组成成分中含有本发明的单克隆抗体或者其抗原结合部分的药物。本发明进一步提供一种使用本发明所述单克隆抗体或者其抗原结合部位作为药剂治疗黑色素癌，直肠癌，甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血组织癌。

本发明包括一种纯化的核酸分子，其组成为能够编码本发明中的特异性结合突变 EGFR蛋白的的单克隆抗体的重链或者轻链或者抗原结合部分的核酸序列。进一步本发明包括含有该核酸序列的载体；该载体优化为含有包括可以联系到该核酸分子的表达调控序列。在一种应用实例中，本发明提供一种含有该核酸分子的宿主细胞。在另一个应用实例中，本发明提供一种能够产生所述的单克隆抗体或者抗原结合部位的细胞株。本发明还包括一种生产特异性结合突变型而不结合野生型 EGFR蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位的方法。其步骤包括：在适当的条件下培养宿主细胞或者本发明中提到的细胞株；纯化所述的抗体。

本发明基于单克隆抗体特异性结合突变型的 EGFR蛋白的发现。我们发现这些抗体能够非常好地优先结合突变的 EGFR蛋白（例如带有 G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L 突变的 EGFR蛋白）。这些抗体能够有效地诊断或者治疗癌症等疾病。这些抗体特别能够有效地检测生物样品中微量的 EGFR蛋白。

EGFR

本专利所描述的 EGFR是指表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 的基因或者蛋白（Hunter T and Cooper JA, Annu Rev Biochem. 54:897-930 (1985))。该基因或者蛋白也被称为 ErbB-1或者 HER1。野生型的 EGFR蛋白序列包括 SEQ ID N0:7，野生型 EGFR蛋白的编码 mRNA序列包括 SEQ ID NO: 8。

EGFR是细胞表面的表皮生长因子受体家族的跨膜受体成员，是一种受体酪氨酸激酶。 EGFR与细胞外的表皮生长因子（EGF) 结合，发生二聚化并激活自身的激酶活性，磷酸化细胞内的一系列下游蛋白，从而将细胞外的信号传导到细胞内。

EGFR蛋白的突变型式包括一个或者多个氨基酸的插入、删除、替换等。本专利所描述的 EGFR G719A突变指的是第 719位的甘氨酸（G) 被丙氨酸 (A) 替换的突变； EGFR G719C指的是第 719位的甘氨酸（G) 被半胱氨酸 (C)替换的突变； EGFR G719S指的是第 719位的甘氨酸（G)被丝氨酸（S) 替换的突变； EGFR D761Y指的是第 761位的天冬氨酸（D) 被酪氨酸（Y) 替换的突变； EGFR L858R指的是第 858位的亮氨酸（L) 被精氨酸（R) 替换的突变； EGFR L861Q指的是第 861位的亮氨酸（L) 被谷氨酰胺（Q) 替换的突变； EGFR A839T指的是第 839位的丙氨酸（A) 被苏氨酸（T) 替换的突变； EGFR N826S指的是第 826位的天冬酰胺（N) 被丝氨酸（S) 替换的突变； EGFR G863D指的是第 863位的甘氨酸（G) 被天冬氨酸（D) 替换的突变； EGFR V769L指的是第 769位的缬氨酸（V) 被谷亮氨酸（L) 替换的突变。

抗体与抗原结合部位

本发明包括特异性结合突变型 EGFR蛋白但是不结合野生型 EGFR蛋白的单克隆抗体。 "抗体" 或者 "免疫球蛋白 Ig" 指的是由重链（H, 大约 50-70 kDa) 和轻链（L, 大约 25 kDa) 通过二硫键链接成的四聚体。轻链可以是 λ 轻链或者 κ 轻链。重链可以分为 μ、 δ、 γ、 α、 ε，不同重链和轻链的组合共同决定抗体的类型分别是 IgM、 IgD、 IgG、 IgA或者 IgE

(Fundamental Immunology Ch. 7， Paul, W.， ed.， 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989) ) 。

每条重链（有时称为 H链，或者 HC) 都含有一个重链可变区（也叫 v_H) 和一个重链恒定区（也叫 C_H) 。重链恒定区由三个结构与组成，分别为 C_H1、 C_H2和 C_H3。每条轻链（有时也成为 L链，或者 LC) 也有一个轻链可变区（也叫 V ) 和轻链恒定区（CL) 。轻链恒定区只含有一个结构与 CL，在轻链和重链内部，可变区和恒定区通过一个大约 12 个氨基酸左右的" J" 形状的结构链接起来。在重链内部还有一个 3个氨基酸左右的" D"形区域。重链可变区和轻链可变区可以进一步被分为超可变区，也叫互补决定区 (CDR) 以及穿插中间的略微保守的框架区域（FR) 。这些区域以此从 N 端往 C端排列为 FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。每个结构区域的氨基酸序列排序是根据 Kabat (Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991) ) 禾口 Chothia & Lesk (Chothia & Lesk， J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)； Chothia et al.， Nature 342:878-883 (1989) )的研究结果分类的。

本发明的内容之一是特异性结合突变型 EGFR蛋白的的单克隆抗体的抗原结合部位。 "抗原结合部位" 是指抗体上使其具有特异性识别并结合抗原（例如 EGFR蛋白上一段含有特定突变的多肽片段）的功能的一段抗体片段。目前认为，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的部分片段来实现。抗体的 "抗原结合部位" 的特征在于包含：（1) 一个 Fab片段，一个包含 VL、 V_H、 CL、 C_h1结构域的单价片段；（2) —个 F(ab' )₂片段，一个含有通过铰链区的的二硫键连接起来的 Fab片段的二价片段；（3)—个包含 V_H和 C_H1结构域的 Fd片段；（4) 抗体单臂包含一个 VL、 V_h结构域的 Fv片段；（5) —个由 V_H结构域组成的 dAb片段（Ward et al.， (1989) Nature 341:544-546) ； (6) 一个独立的互补决定区（CDR) 。更进一步地，尽管 F_v片段的两个结构域 V_H和 ^是由不同的独立基因编码的，但是可以用基因重组的方式通过合成一个链接区域将它们连接起来，形成由单链蛋白内部的 V_H和 VL配对成单价分子，也称为单链 F_v (scF_v) (Bird et al. Science 242:423-426 (1988) and Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) ) 。这种单链抗体也包括在 "抗原结合部位" 的范围内。抗体的一部分，比如 Fab和 F(ab' )₂片段，可以从全长的抗体通过常规的技术，比如木瓜酶（papain) 或者胃蛋白酶（Pepsin)酶消化的方法获得。它们也可以通过下面描述的标准的 DNA重组技术获得。

抗 EGFR抗体及其抗原结合部位

本发明的抗体可以用来自于人类 EGFR突变蛋白的抗原免疫非人类的动物（例如，小鼠、兔子、大鼠或者仓鼠）来制备。这些抗体也可以通过噬菌体展示技术或者其它的已知的抗体制备技术获得。抗原可以是纯化的多聚多肽或者多肽，也可以是在细胞内表达的多聚多肽或者多肽。

特定疾病相关的突变的 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L。

本发明中特异性结合 EGFR G719A突变蛋白的抗体可以通过多肽

ETEFKKIKVLASGAFGTV (SEQ ID NO： 1)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201301, 名称为杂交瘤细胞株 M116。

本发明中特异性结合 EGFR G719C突变蛋白的抗体可以通过多肽

ETEFKKIKVLCSGAFGTV (SEQ ID NO： 2)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C2012127, 名称为杂交瘤细胞株 M32_8。

本发明中特异性结合 EGFR 719S突变蛋白的抗体可以通过多肽

ETEFKKIKVLSSGAFGTV (SEQ ID NO： 3)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C2012118, 名称为杂交瘤细胞株 M20_18。本发明中特异性结合 EGFR D761Y突变蛋白的抗体可以通过多肽

EATSPKANKEILYEAYVM (SEQ ID NO： 4)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201303 , 名称为杂交瘤细胞株 M121ft l。

本发明中特异性结合 EGFR L858R突变蛋白的抗体可以通过多肽

KTPQHVKITDFGRAKLLG (SEQ ID NO： 5)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C2012125 , 名称为杂交瘤细胞株 M85_ 13。

本发明中特异性结合 EGFR L861Q突变蛋白的抗体可以通过多肽

ITDFGLAKQLGAEEKE (SEQ ID NO： 6)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201315 , 名称为杂交瘤细胞株 M80_14。

本发明中特异性结合 EGFR A839T突变蛋白的抗体可以通过多肽

DRRLVHRDLTARNVLVKTP (SEQ ID NO： 7)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201302 , 名称为杂交瘤细胞株 M1 18ft7。

本发明中特异性结合 EGFR N826S突变蛋白的抗体可以通过多肽

IAKGMSYLEDRRLVHR (SEQ ID NO： 8)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201320 , 名称为杂交瘤细胞株 M1 17_ 10。

本发明中特异性结合 EGFR G863D突变蛋白的抗体可以通过多肽

ITDFGLAKLLDAEEKE (SEQ ID NO： 9)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201304 , 名称为杂交瘤细胞株 M120。

本发明中特异性结合 EGFR V769L突变蛋白的抗体可以通过多肽

EAYVMASLDNPHV (SEQ ID NO： 10)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC C201316, 名称为杂交瘤细胞株 M122ftl。

本发明进一步包含一种单克隆抗体或者其抗原结合部位，它们包括由保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。在一些操作实例中，本发明中的单克隆抗体或许只包含由保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303, CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链氨基酸序列或者轻链氨基酸序列。

在某些操作实例中，本发明的抗 EGFR抗体或者抗原结合部位包含一条或者多条由保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链或者 CDR的氨基酸序列。在某些操作实例中，抗体或者抗原结合部位包括由保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303, CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链的所有 CDR1、 CDR2以及 CDR3的氨基酸序列。

在某些操作实例中，本发明的抗 EGFR抗体或者抗原结合部位包含由保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链可变区的氨基酸序列。在特定的操作实例中，抗体或者抗原结合部位同时包含由保藏号为 C CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303, CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链可变区的氨基酸序列。

EGFR的结合特异性

本发明的抗体或者抗原结合部位能够分别特异性地结合突变型的 EGFR G719A, EGFR G719C, EGFR G719S , EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D以及 EGFR V769L蛋白，但是不结合野生型的 EGFR蛋白（完全不结合或者在某种程度上不结合）。换言之，该抗体或者抗原结合部位能够区分突变型和野生型的人类 EGFR蛋白。该结合的特异性可以用已知的常用检测手段进行确认，例如免疫印迹实验

(Western b lot ) ，酶联免疫吸附实验（ELISA ) ，流式细胞分选，免疫共沉淀，免疫荧光，免疫组织化学染色，表面离子共振（例如 BIAC0RE™) 或者放射免疫实验等方法。

在一些操作实例中，该抗体能够特异性地优先结合突变型的 EGFR蛋白，对于突变型 EGFR蛋白的结合能力至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对野生型 EGFR蛋白的结合能力。在某些操作实例中，本发明中的抗体或者抗原结合部位特异性结合突变型 EGFR蛋白的解离平衡常数 K_D至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，至少 500倍，或者至少 1000倍强于对野生型 EGFR蛋白的结合的解离平衡常数（K_D ) 。解离平衡常数（K_D ) 可以通过表面离子共振或者流式细胞计数测得。

本发明的抗体或者抗原结合部位或许只能结合一种 EGFR突变蛋白而不能结合其他的 EGFR突变蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR 719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L的一种）。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR G719A 蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR G719A蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y、 EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T, EGFR N826S , EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR G719A蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR G719C蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719S、 EGFR D761Y、 EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T, EGFR N826S , EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR G719C蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR G719S蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR D761Y、 EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T, EGFR N826S , EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR G719S蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR D761Y蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T, EGFR N826S , EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR D761Y蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S , EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR L861Q蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y、 EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR L861Q蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y、 EGFR L858R、 EGFR A839T、 EGFR N826S、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR A839T蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y、 EGFR L858R、 EGFR L861Q, EGFR N826S , EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR A839T蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S , EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR N826S , EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR N826S蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T, EGFR G863D以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR N826S蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S , EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T、 EGFR G863D 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR G863D蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T , EGFR N826S以及 EGFR V769L ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR G863D蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S , EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T、 EGFR N826S 以及 EGFR V769L ) 的结合能力。

在一些操作实例中，该抗体或许只能结合 EGFR V769L蛋白而不结合其他突变型的 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S、 EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR A839T , EGFR N826S以及 EGFR G863D ) 。举例来说，该抗体特异性地结合 EGFR V769L蛋白的能力或许至少 10倍，至少 20倍，至少 50倍，至少 100倍，至少 250倍，或者至少 500倍强于其对其它任何一种突变 EGFR蛋白（例如 EGFR G719A、 EGFR G719C、 EGFR G719S , EGFR D761Y, EGFR L858R, EGFR L861Q , EGFR A839T、 EGFR N826S 以及 EGFR G863D ) 的结合能力。

在一些操作实例中，本发明中的抗体或者抗原结合部位能够特异性结合含有 SEQ ID N0 : 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9或者 10的 EGFR多肽。在一些操作实例中，本发明的抗体或者抗原结合部位特异性结合保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304 或者 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的抗原表位或者与其重合的抗原表位。

生产抗体的重组方法

本发明包括编码能够特异性结合人类突变型的 EGFR蛋白但是不能结合野生型 EGFR蛋白的单克隆抗体及其抗原结合部位的核酸序列。人类突变的 EGFR蛋白包括： G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D以及 V769L。在一些操作实例当中，该核酸分子只编码单克隆抗体或者抗原结合部位的重链或者轻链。在另外一些操作实例当中，该核酸分子同时编码单克隆抗体及其抗原结合部位的重链和轻链。在一些操作实例中，该核酸分子编码保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303、 CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链、轻链、重链可变区或者轻链可变区。核算可以是纯化的核酸分子。

编码本发明抗体的核酸分子可以从任何能够产生该抗体的来源中获得。例如，核酸可以从保藏号为 CCTCC C201301、 CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303, CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞中获得。分离纯化编码抗体的核酸的方法是一种已知的常见的技术。具体方法可以参见书籍： [美] J.莎姆布鲁克 D. W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，第三版， 2002年。

在一些操作实例中，编码本发明中的单克隆抗体的重链的核酸序列可以是由编码本发明抗体的 V_H结构域的核酸序列与一条编码任意其它来源抗体的重链恒定区的组成的同框编码序列。类似地，一条编码本发明的抗 EGFR蛋白的轻链的核酸分子也可以是由编码本发明抗体的 V结构域的核酸序列与一条编码任意其它来源的抗体的轻链恒定区的组成的同框编码序列。

在进一步的操作实例中，编码重链可变区（V_H)和 /或者轻链可变区（VL) 的核酸分子被转化为全长的抗体编码基因。在一些操作实例中，编码 V_H或者 VL结构域的核酸序列被分别通过插入到已经含有重链恒定区（C_H) 或者轻链恒定区（CL) 的表达载体中去的方法构建为一个全长抗体基因。这样构建的全长抗体基因的 C_H的片段与 CL的片段在载体内部相连接，并且 /或者编码 V_H的片段与编码 VL的片段在载体内部相连接。在另外的操作实例中，编码 v_H以及 /或者 V结构域的核酸序列分别通过核酸重组技术被连接到一个编码 c_H的片段和 /或者编码 C 的片段上面。编码人类免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的基因是已知的。具体参见著作 Kabat et al . ,

Sequences of Prote i ns of Immunol ogi cal Interest, 5th ed.， NIH Pub l . No. 91-3242, 1991。编码全长重链和 /或者轻链的核酸分子可以在被引入和纯化 EGFR抗体的细胞株中表达。

可以使用核酸分子实现重组表达大量的 EGFR抗体。也可以用核酸分子来生产嵌合抗体，双特异性结合抗体，单链抗体，免疫粘附剂，双头抗体，突变抗体以及抗体衍生物。如果该核酸分子来自于非人类、非转基因动物，该核酸分子也可能被用来实现抗体的人源化。

本发明还包括插入有编码抗体重链、轻链或者同时编码本发明的 EGFR 抗体或者其抗原结合部位的核酸分子。该载体可能适合于在原核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达本发明中的抗体或者其抗原结合部位。

常见的哺乳动物细胞包括很多永生细胞系都可以用来作为表达宿主。这些细胞系包括但不限于：中国仓鼠卵巢细胞（CH0 ) ， NS0细胞， SP2细胞， HEK293T细胞， 293 Free styl e ( Inv i trogen公司）， NIH3T3细胞， HeLa细胞，幼仓鼠肾细胞（BHK ) ，非洲绿猴肾细胞，人类肝癌细胞（如 HepG2 )，以及 A549细胞。其它可以用于表达的细胞有昆虫细胞，包括 sf9 和 sf2 1细胞。植物宿主细胞包括：烟草，拟南芥，浮萍，玉米，小麦，番茄，水稻来源的细胞。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和放线菌。酵母宿主包括裂殖酵母，酿酒酵母，毕赤酵母。

利用不同的细胞系在不同的培养条件下，或者利用转基因动物表达的抗体能够有不同的糖基化模式。但是不论其糖基化模式是怎样的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列编码的抗体都是本发明的内容。

嵌合与人源化抗体这里所说的嵌合抗体，其特征在于有来自于两种或者更多种不同的抗体的结构域组成的抗体。例如，嵌合抗体的可变区结构域可能是来自于保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302 , CCTCC C201320 , CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，但是其恒定区可能是来自于人类抗体。这种嵌合抗体在作为人类的治疗药物时具有较少的免疫原性。

在一些操作实例中，本发明抗体的人源化抗体是一种将本发明中的来源于老鼠的抗体的 CDR结构域插入到人类受体抗体中去。因此，嵌合抗体的 FR和恒定区域来自于人类。这种含有人类 FR区域的人源化 EGFR抗体在人类身上比只是恒定区来自于人类的嵌合抗体具有更小的免疫原性。在一些操作实例中，人源化抗体的 CDR序列可以是来自于保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。抗体人源化的方法是一种已知的成熟技术。

修饰与标签抗体

本发明还包括以上所描述的抗 EGFR单克隆抗体或其抗原结合部位被至少一种额外分子或集团修饰而成的抗体。该修饰可以是用于纯化或者检测该抗体的，以及 /或者增强其治疗效果。例如，抗体或者抗原结合部位可以连接到一种检测试剂、标签、细胞毒性试剂、药物分子以及 /或者蛋白或多肽，以便接到该抗体或者其抗原结合部位与其它一种分子（例如亲和素核心区域，或者多聚组氨酸标签）的结合。常见的检测标签包括但不限于：放射性同位素（例如 ¹²⁵I， ^mI， ³⁵S or ¾) ，荧光复合物（例如荧光素，二氯三嗪氨荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明， 5-二甲氨基 -1-萘磺酰氯苯，荧光素 PE , 稀土发光物，伞形酮，丹磺酰氯），以及酶（例如辣根过氧化物酶， 0-半乳糖苷酶， β_半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙酰胆碱酯酶）。在进一步的操作实例中，本发明所述抗体或者其部分可以被标记生物素，或者已经证明可以被另一个报告分子（例如亮氨酸拉链配对区域，二抗结合位点，金属集合结构域，表位标签）识别的多肽表位。在更进一步的操作实例中，任意一种抗体或者其部分可以利用聚乙烯醇（PEG) ，甲基或乙基或者糖基经行修饰。

抗 EGFR抗体或者其抗原结合部位的诊断用途

本发明的一个方面是使用所述的抗 EGFR抗体或者其抗原结合部位作为一种癌症诊断试剂。癌症指的是任意一种恶性肿瘤，包括任何阶段和级别的癌症。可能用本发明的单克隆抗体诊断的癌症具体例子包括但是不限于：肺癌，非小细胞肺癌，直肠癌，结肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，胶质瘤，脑癌。

诊断包括检测癌症的发展程度，确认癌症的存在，或者癌症的分型或分类。在一些操作实例中，本发明可以提供一种诊断目标中癌症的方法，其步骤包括：用本发明所述的抗 EGFR单克隆抗体接触来自于检测目标的生物学样本；检测抗体或者其部分与样本是否结合；如果抗体与样本存在结合则表明被检测主体是癌症，或者存在发展成癌症的风险。检测的样本可以是血液，血清，淋巴，组织（例如穿刺或者甲醛和石蜡固定的包被切片）。

抗体结合到样本上与否可以用常见的的已知技术检测，包括但是不限于： ELISA, RIA, 流式细胞，免疫细胞化学，免疫组织化学，免疫荧光，免疫印迹，或者免疫共沉淀。抗 EGFR抗体或者其部分也可以用一种可以检测的标记物直接标记。如果抗体没有被标记，则可以使用一种能够结合 EGFR抗体并能够被检测到的二抗或者其它分子。根据已有的常识，特定的二抗能够特异性地结合特定的种类和亚型的一抗。例如，如果抗 EGFR抗体是一种小鼠 IgG，则二抗必须是一种标记的抗小鼠 IgG的抗体。其它能够结合抗体的分子包括但是不限于 Protein A和 Protein G。他们都有多种商业化的形式。例如来自 Pierce公司的 Protein A和 Protein G。适合用来标记抗体或者二抗的分子包括但是不限于：酶，辅基，荧光材料，发光材料，磁性材料以及放射性材料（见上文描述）。在一些操作实例中，本发明的抗体或者其部分可以提供在一种包含检测抗体结合试剂的试剂盒中。

抗 EGFR抗体或者其部分还可以用来检查癌症病人的发展进程，然后决定采取哪一种治疗治疗方案。例如在治疗方案的伴随检测中。医务人员可能根据 EGFR突变的检测结果来决定对特定病人最优的治疗方案。治疗方案可以是手术，放射性治疗，药物治疗（包括化学治疗与靶向治疗），或者以上多种治疗方式的结合。举例来说，本发明包括一种治疗癌症病人的方法，其特征在于包括：检查来自病人的生物样本是否带有 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L 突变；如果存在某种突变则对病人给予 EGFR抑制剂治疗。 EGFR抑制剂可能是一种反义 RNA( anti sense RNA)，小干涉 RNA( s iRNA)，微小 RNA( miRNA ) 药物，抗 EGFR单克隆抗体药物。在给予病人抗 EGFR物的靶向治疗之前检测是否存在 EGFR突变对于治疗十分有意义。

抗 EGFR抗体及其抗原结合部位的治疗应用

本发明同样提供一种抗体及其抗原结合部位作为治疗性药物的应用包括用本发明的抗体或者其部分作为治疗人类的应用，以及使用抗体或者其部分作为制造用于治疗人类癌症药物的应用。这些人类癌症包括直肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。详细的癌症种类亦可参阅上文的描述。

在一些操作实例中，医务人员给予能够对特定疾病达到有效剂量的本发明的抗体或者部分，一般是一种嵌合的或者人源化的抗体或者部分，从而实现减缓或者治疗该疾病，防止癌症转移或者进一步发展。抗体的给药方式可以是例如：注射或者浸注。抗体或者部分的剂量可以由医务人员决定，大致范围为 0. 1到 100毫克 /公斤体重，更优地为 0. 5到 50毫克 /公斤体重，更优地为 1到 20毫克 /公斤体重，更优地为 1到 10毫克 /公斤体重。治疗的效果可以通过监测例如肿瘤体积缩小的程度来说明。本发明的治疗性药物的成分除了所述的单克隆抗体或者其部分以外，可能包括一种可接受的药剂载体。可接受的药剂载体其特征在于，可以是一种溶剂，分散剂，包被剂，抗菌剂和抗真菌剂，渗透平衡剂和吸附延缓剂，其特征是具有生理兼容性。在很多情况下，优先的载体包括渗透平衡剂，例如糖类，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化钠组分。其它可以接受的药剂材料包括湿润剂或者少量的辅剂，例如湿润剂，乳化剂，保护剂或缓冲液，它们能够增加抗体的保质期或者效果。

在一些操作实例中，本发明的抗 EGFR抗体或者其部分被与其它一种和 /或者多种治疗药物，诊断药物，或者预防剂混合在一起。治疗药物包括但不限于具有不同细微特异性差异的结合不同靶标的抗 EGFR抗体，以及 EGFR抑制剂，例如抑制剂可以是西妥昔单抗（cetuxmab ) ，帕尼单抗

(panitumumab ) ， Necitumumab, Nimotuzumab , 吉非替尼 ( gef itinib ) ，厄洛替尼 (erlotinib) ，拉帕替尼 ( lapatinib )，凡德他尼 (Vandetanib )， PF299804, R05083945, ABT-806 , AP-26113 , Afatinib (BIBW2992) , Canertinib (CI-1033)， Neratinib (HKI- 272)， CP-724714, TAK- 285， AST-1306 , ARRY334543 , Lapatinib, Arry-380, Dacomitinib (PF - 299804)， WHI-P154, Desmethyl Erlotinib (CP-473420) , Desmethyl Erlotinib

( OSI-420 ) ， AZD8931 , AEE788 (NVP- AEE788)， Pel itinib (EKB- 569)， CUDC-101 , WZ804, WZ4002 , WZ3146 , XL647, PD-153035 , PD-174265, PD 158780, BMS-599626 (AC480)， Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU-1361 , Hypericin, BIBX-1382 , DAPH, Erbstatin Analog, JNJ 28871063 , R0 106-9920， GW2974, GW 583340， PD-153035, PD-158780 , PD-168393 , Tyrphostin AG - 183， Tyrphostin AG - 99， Tyrphostin AG-825 , Tyrphostin B42 (AG - 490 ) ， Tyrphostin AG_494， Tyrphostin AG-555, Tyrphostin AG - 527， Tyrphostin AG - 528， Tyrphostin AG - 835， Tyrphostin AG - 1478， Tyrphostin RG- 14620， Daphnetin, BPIQ ， BPIQ- I， BPIQ- II， CL- 387， 785， EGFR Inhibitor (K00598a) ， LFM-A12 , Pel itinib, PKC-412 , PP3 ( 5334-30-5 ) ， SU 5402 , HDS 029， WHI-P 154 , TAK 165 , Vatalanib o 本发明的药剂组成可能含有一种 "治疗有效剂量"或者 "预防有效量" 的本发明的抗体或者抗原结合部位。 "治疗有效剂量" 是指在一定的疗程和剂量下，要达到有治疗效果的有效药物量。抗体及其抗原结合部分的治疗有效剂量可能根据多种因素，例如疾病进程，年龄，性别，体重，以及抗体或者抗体部分能够在个体内所引起的反应能力而有所不同。治疗有效剂量也包含了该抗体或者抗原结合部位的有利作用强于任何毒性或者不利作用的意思。 "预防有效量" 是指在一定的疗程和剂量下，要达到有预防效果的有效药物量。通常由于预防药物都是在疾病发生之前或者疾病早期使用，因此预防有效量可能会小于治疗有效量。

除非特别声明，这里所用的所有的技术或者科学属于都与一般熟知本发明领域的人员的常识相一致。可效仿的方法和材料在下面将进行详细描述，尽管与这里描述的相似或者同样的方法和材料也可以用来检验本发明。所有的参考文献都详细列出。尽管引用了大量的文献，但是这些引用并不表明承认任何文献是该领域的常识。本专利描述过程中使用的"包含" "包括" 应当被理解为表明包含所述的完整对象或者群体对象，而不是排除任何其他的对象或者群体对象。材料、方法和实例仅是为了说明本发明的技术方案，并非限制。

以下实例是为了描述本发明的方法与材料。对描述的条件或参数适当的修改或者同等替换通常符合本领域技术人员的明显常识，因此依然属于本发明的精神和范围。附图说明

图 1显示保藏号为 CCTCC C201301的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719A蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的图 2显示保藏号为 CCTCC C2012127的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719C蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR G719C蛋白；

图 3显示保藏号为 CCTCC C20121 18的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719S蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR G719S蛋白；

图 4显示保藏号为 CCTCC C201303的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR D761Y蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR D761Y蛋白；

图 5显示保藏号为 CCTCC C2012125的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR L858R蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR L858R蛋白；

图 6显示保藏号为 CCTCC C201315的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR L861Q蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR L861Q蛋白;

图 7显示保藏号为 CCTCC C201302的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR A839T蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR A839T蛋白；

图 8显示保藏号为 CCTCC C201320的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR N826S蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR N826S蛋白；

图 9显示保藏号为 CCTCC C201304的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G863D蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR G863D蛋白；

图 10显示保藏号为 CCTCC C201316的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR V769L蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫印染实验图谱。泳道 1含有大肠杆菌表达的野生型 EGFR蛋白。泳道 2含有大肠杆菌表达的突变型 EGFR V769L蛋白；

图 1 1显示保藏号为 CCTCC C201301的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719A蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR G719A 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR G719A蛋白的细胞（下面）中出现；

图 12显示保藏号为 CCTCC C2012127的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719C蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR G719C 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR G719C蛋白的细胞（下面）中出现；

图 13显示保藏号为 CCTCC C20121 18的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G719S蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR G719S 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR G719S蛋白的细胞（下面）中出现；

图 14显示保藏号为 CCTCC C201303的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR D761Y蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR D761Y 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR D761Y蛋白的细胞（下面）中出现；

图 15显示保藏号为 CCTCC C2012125的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR L858R蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR L858R 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR L858R蛋白的细胞（下面）中出现；

图 16显示保藏号为 CCTCC C201315的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR L861Q蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR L861Q 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR L861Q蛋白的细胞（下面）中出现；

图 17显示保藏号为 CCTCC C201302的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR A839T蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR A839T 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR A839T蛋白的细胞（下面）中出现；

图 18显示保藏号为 CCTCC C201320的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR N826S蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR N826S 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR N826S蛋白的细胞（下面）中出现；

图 19显示保藏号为 CCTCC C201304的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR G863D蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR G863D 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR G863D蛋白的细胞（下面）中出现；图 20显示保藏号为 CCTCC C201316的细胞株产生的抗体特异性结合 EGFR V769L蛋白，却不能结合野生型的 EGFR蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP )信号分别指示野生型 EGFR (上面）和突变型 EGFR V769L 蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与 EGFR蛋白的结合，并且只在表达 EGFR V769L蛋白的细胞（下面）中出现。具体实施方式

实施例 1

特异性结合 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的生产

含有 EGFR突变蛋白氨基酸序列的多肽通过合成获得。详细的多肽序列在下表中列出，相对野生型蛋白的突变氨基酸加下划线标示：

表 1 突变的 EGFR多肽

每条合成的多肽都被偶联到琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白（keyhole limpet hemocyanin, KLH ) 上，用来免疫小鼠，并利用弗氏佐剂混合增强免疫效果。将用以上多肽免疫的抗 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R 和 L861Q小鼠的脾脏细胞分别与小鼠骨髓瘤 SP2/0细胞通过聚乙烯醇（PEG ) 介导融合。用 ELISA实验筛选阳性克隆。阳性克隆细胞注射到相同品系的小鼠腹腔，产生腹水。从腹水中纯化抗体。

通过用含有突变的 EGFR蛋白的多肽免疫小鼠产生的杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC, 湖北省武汉市武汉大学， 430072 ) . 杂交瘤细胞的名称和保藏编号在下表中列出。

表 2 抗 EGFR杂交瘤细胞株以及保藏编号

实施例 2

免疫印迹实验分析单克隆抗体特异性结合大肠杆菌和动物细胞表达的突变蛋白

在大肠杆菌中中表达 EGFR蛋白时，将编码 EGFR野生型以及 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L突变型蛋白的 cDNA序列克隆到带有 6个组氨酸标签的细菌表达载体 pET28a上。构建好的质粒转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)菌株中，并将转化的细菌涂布到含有卡那霉素的 LB培养基平板上，在 37 °C培养。从平板上挑选单克隆菌落，放入含有 500毫升含有卡那霉素的 LB培养基的锥形瓶中。将锥形瓶放在 37 °C的摇床中培养到 0D600接近 1. 0。然后往锥形瓶中加入 0. 2 mM的 IPTG在 37 °C诱导培养 3个小时。离心收集培养的细菌，然后加入裂解液（20 mM Tris， lOO mM NaCl , 1 % Triton™ X- 100，以及蛋白酶抑制剂）。裂解的细菌液在 12000g的速度下离心 30分钟，收集上清。将上清加入到一个镍柱上，按照镍柱生产商的说明纯化得到纯的 EGFR蛋白。然后将 0. 1 μ_§每种纯化的 EGFR蛋白分别与等体积的 2 X SDS上样缓冲液混合，并在 95 °C加热 10分钟。

在用哺乳动物细胞表达时，将编码 EGR野生型以及 EGFR G719A、G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L突变型蛋白的 cDNA序列克隆到哺乳动物表达载体 pCNDA3. 0中，并且与一个编码绿色荧光蛋白（GFP ) 的序列融合形成一个开放阅读框。构建好的质粒转化到 DH5a大肠杆菌中，以扩增并抽提质粒。在转染前一天，将 HEK293T细胞以 30%的密度铺到 24孔细胞培养板中，放在 37 °C的 5% ( 0₂培养箱中培养。然后将含有 0. 5 μ_§表达每种 EGFR蛋白的质粒用标准的磷酸钙转染的方法转染到 HEK293T细胞中。转染的细胞继续培养 24小时。然后将转染的细胞收集，每孔细胞加入 20 μΐ的细胞裂解液，在冰上放置 10分钟。然后将细胞在 12000转的速度下离心 10分钟，收集上清。分别取 10 μΐ每种细胞裂解液的上清，与等体积的 2 X SDS上样缓冲液混合，并在 95 °C加热 10 分钟。

将 10 μΐ每种准备好的 EGFR蛋白样品加入到 10% 的 SDS-PAGE蛋白胶上。在 90伏电压下电泳 90分钟。然后将胶上分离的蛋白转移到 PVDF膜上。用 5%的脱脂牛奶封闭 PVDF膜。然后将转印有 EGFR蛋白的 PVDF膜放到含有实施例 1中纯化的抗体的 TBS缓冲液中在 4 °C孵育 16小时。然后去掉抗体，用含有 0. 1%吐温 ®-20的 TBS缓冲液漂洗三次 PVDF膜，每次漂洗 5分钟。然后将膜放入含有 HRP-标记的抗小鼠的二抗中孵育 30分钟。去掉二抗，再次用含有 0. 1%吐温 ®-20的 TBS缓冲液漂洗三次 PVDF膜，每次漂洗 5分钟。然后将膜放入到含有 ECL底物的溶液中浸润，并在暗室中用胶片感光。洗片，显影，定影。

图 1，图 2，图 3，图 4，图 5，图 6，图 7，图 8，图 9和图 10显示，在免疫印迹实验中，实施例 1 中生产的抗 EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L单克隆抗体能够分别特异性地结合 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L突变蛋白，但是并不结合野生型的 EGFR蛋白，并且不论该蛋白是在大肠杆菌中表达的，还是在哺乳动物细胞中表达的。实施例 3

免疫荧光实验分析这些单克隆抗体特异性结合哺乳动物细胞内表达的 EGFR蛋白

能够表达带有 GFP标签的野生型以及 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L突变型 EGFR蛋白的 pCDNA3. 0质粒按照实施例 2的方法构建。在转染前，将无菌处理的载玻片放到 24孔细胞培养板中，并将 HEK293T细胞以 30%的密度铺到这些孔内，放在 37 °C的 5% C0₂培养箱中培养。然后将含有 0. 5 μ_β表达每种 EGFR 蛋白的质粒用标准的磷酸钙转染的方法转染到 HEK293T细胞中。转染的细胞继续培养 36小时。然后将细胞用 3. 7%的多聚甲醛固定 10分钟。以及含有 1% Triton™ X-100的 PBS缓冲液处理细胞 10分钟，以增加其通透性。然后用含有 5%谈牛血清的的 PBS封闭处理 10分钟。然后将这些处理的细胞分别放在含有实施例 1生产的抗 EGFR单克隆抗体的缓冲液中在 4 °C孵育 16小时。然后去掉抗体，将细胞用 PBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗 5 分钟。然后加入标记有荧光发光物的抗小鼠的二抗中孵育 30分钟。同时在二抗溶液中加入 DAPI染料以染色细胞核。去掉二抗，再次用 PBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗 5分钟。然后将附着有细胞的载玻片取出来，固定到载玻片上并且用指甲油封闭。在荧光显微镜下观察细胞并拍照。

图 1 1，图 12，图 13，图 14，图 15，图 16，图 17，图 18，图 19和图 20显示，在免疫荧光实验中，实施例 1 中生产的抗 EGFR G719A、 G719C、

G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L单克隆抗体能够分别特异性地结合在哺乳动物细胞中表达的抗 EGFR G719A、

G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L 突变蛋白，但是并不结合野生型的 EGFR蛋白。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

权利要求书

1.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，不能识别 EGFR野生型蛋白的单克隆抗体，或者抗原结合蛋白，该单克隆抗体特异性识别的 EGFR突变蛋白包括：第 719位的甘氨酸（Glycine, G)突变为丙氨酸（Alanine, A) 的突变蛋白（EGFR G719A) ；第 719位的甘氨酸（G) 突变为半胱氨酸（C)的突变蛋白（EGFR G719C);第 719位的甘氨酸（Glycine, G) 突变为丝氨酸（Serine, S) 的突变蛋白（EGFR G719S) ；第 761位的天冬氨酸（Asparatic Acid, D) 突变为酪氨酸（Tyrosine, Y) 的突变蛋白（EGFRD761Y);第 858位的亮氨酸（Leucine, L)突变为精氨酸（Arginine, R) 的突变蛋白（EGFRL858R) ；第 861位的亮氨酸（Leucine, L) 突变为谷氨酰胺（Glutamine, Q) 的突变蛋白（EGFRL861Q) ；第 839位的丙氨酸（Alanine, A)突变为苏氨酸（Threonine, T)的突变蛋白（EGFR A839T)；第 826位的天冬酰胺（Asparagine, N) 突变为丝氨酸（Serine, S) 的突变蛋白（EGFR N826S) ；第 863位的甘氨酸（Glycine, G) 突变为天冬氨酸（Asparatic Acid, D) 的突变蛋白（EGFRG863D) ；第 769位的缬氨酸 (Valine, V) 突变为谷亮氨酸 (Leucine, L) 的突变蛋白 (EGFR V769L) 。

2.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID NO: 1的 EGFR 蛋白。

3.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:2的 EGFR 蛋白。

4.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:3的 EGFR 蛋白。

5.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:4的 EGFR 蛋白。

6.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:5的 EGFR 蛋白。

7.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:6的 EGFR 蛋白。

8.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:7的 EGFR 蛋白。

9.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:8的 EGFR 蛋白。

10.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID N0:9的 EGFR 蛋白。

11.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列 SEQ ID NO: 10的 EGFR 蛋白。

12.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，由一条重链和一条轻链组成；重链和轻链的 CDR1、 CDR2以及 CDR3的氨基酸序列分别是由中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏号为 CCTCC C20130K CCTCC C2012127, CCTCC C2012118, CCTCC C201303, CCTCC C2012125, CCTCC C201315, CCTCC C201302, CCTCC C201320、 CCTCC C201304以及 CCTCC C201316的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的 CDR1、 CDR2以及 CDR3的氨基酸序列决定。

13.根据权利要求 12所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，所述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体重链和轻链的组成分别包含重链和轻链的可变区域。

14.根据权利要求 12所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，包含有所述的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列。

15.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，包括抗原结合部位，是一种人源化或者嵌合型抗体。

16.根据权利要求 2至 13及 15任一项所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体是一种 IgG。

17.根据权利要求 1所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC ) 的保藏号为 CCTCC C20130 K CCTCC C2012127 , CCTCC C20121 18、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125 , CCTCC C201315 , CCTCC C201302、 CCTCC C201320、 CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316的十株杂交瘤细胞。

18.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，该单克隆抗体或者抗原结合部位的药物，以及可以药用的载体。

19.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种诊断 EGFR突变的诊断试剂盒，其组成含有权利要求 1至 14所述的任意一种单克隆抗体或者抗原结合部位。

20.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种诊断肿瘤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

( 1 ) 用权利要求 1至 14所述的任意一种单克隆抗体或者抗原结合部位接触需要检测的生物样本；

( 2 )检测单克隆抗体或者抗原结合部位是否与样本发生结合，而结合指示样本存在癌症或者发展成癌症的风险。

21.根据权利要求 20所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述诊断方法中，常见的癌症类型包括：肺癌，非小细胞肺癌，直肠癌，结肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，胶质瘤，脑癌。

22.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种治疗癌症病人的方法，其特征在于：

(1) 检测来自于病人的生物学样品中是否含有 EGFR G719A、 G719C、 G719S、 D761Y、 L858R、 L861Q、 A839T、 N826S、 G863D或者 V769L突变;

(2) 如果存在上述突变，对该病人给予 EGFR蛋白抑制剂的治疗。

23.根据权利要求 22所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗方法中， EGFR蛋白抑制剂包括：反义 RNA

(antisense RNA) ，小干涉 RNA (siRNA) ，微小 RNA (mi RNA) 药物，抗 EGFR单克隆抗体药物。 EGFR抑制剂可以是西妥昔单抗（cetuxmab) ，帕尼单抗 (panitumumab)， Necitumumab, Nimotuzumab,吉非替尼 (gef itinib)，厄洛替尼 (erlotinib) ，拉帕替尼 (lapatinib)，凡德他尼 (Vandetanib)， PF299804, R05083945, ABT-806, AP-26113, Afatinib (BIBW2992) , Canertinib (CI— 1033)， Neratinib (HKI— 272)， CP— 724714， TAK— 285， AST-1306, ARRY334543, Lapatinib, Arry-380, Dacomitinib (PF - 299804)， WHI-P154, Desmethyl Erlotinib (CP-473420) , Desmethyl Erlotinib (OSI-420) ， AZD8931, AEE788 (NVP- AEE788)， Pelitinib (EKB- 569)， CUDC-101, WZ804, WZ4002, WZ3146, XL647, PD-153035, PD-174265, PD 158780, BMS-599626 (AC480)， Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU- 1361， Hypericin, BIBX-1382, DAPH, Erbstatin Analog, JNJ 28871063, R0 106-9920， GW2974, GW 583340， PD-153035, PD-158780, PD-168393, Tyrphostin AG - 183， Tyrphostin AG - 99， Tyrphostin AG-825, Tyrphostin B42 (AG - 490) ， Tyrphostin AG - 494， Tyrphostin AG - 555， Tyrphostin AG - 527， Tyrphostin AG - 528， Tyrphostin AG - 835， Tyrphostin AG - 1478， Tyrphostin RG— 14620， Daphnetin, BPIQ ， BPIQ- I， BPIQ- II， CL- 387， 785， EGFR Inhibitor (K00598a) ， LFM-A12 , Pel itinib, PKC-412 , PP3 ( 5334-30-5 ) ， SU 5402 , HDS 029, WHI-P 154, TAK 165, Vatalanibo

24.根据权利要求 22所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗癌症病人的方法，给予病人含有权利要求 11 的组成成分的药物。

25.根据权利要求 22或 24所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗癌症病人的方法中，常见的癌症类型包括：直肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。

26.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求 1至 15的单克隆抗体或者抗原结合部位用于癌症治疗药物的生产过程，常见的癌症种类包括：黑色素癌，直肠癌，甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血组织癌。

27.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种纯化的核酸分子，包含能够编码权利要求 1至 15所述单克隆抗体的重链或者其一个抗原结合部位，或者能够编码轻链或者其一个抗原结合部位，或者能够同时编码二者的核酸序列。

28.根据权利要求 27所述的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种载体分子，含有可以联系到该核酸分子的表达调控序列。

29.根据权利要求 27的特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种宿主细胞，含有该核酸分子。

30.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，包含权利要求 1至 14的一种细胞株，其含有所述的单克隆抗体或者其抗原结合部位。

31.特异性识别 EGFR突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种生产单克隆抗体或者其抗原结合部位的方法，所生产的抗体或者抗原结合部位特异性结合人类突变的 EGFR蛋白，而不结合人类野生型的 EGFR蛋白，其步骤包括：

(1) 根据权利要求 29，在适当的条件下培养该宿主细胞，或者根据权利要求 30，在释放的条件下培养该细胞株；

(2) 提纯所述的抗体部分。