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WO2014013330A2 - Proceso para la producción de 2,3-butanodiol mediante cepas mejoradas de raoultella planticola - Google Patents

Proceso para la producción de 2,3-butanodiol mediante cepas mejoradas de raoultella planticola Download PDF

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WO2014013330A2
WO2014013330A2 PCT/IB2013/001592 IB2013001592W WO2014013330A2 WO 2014013330 A2 WO2014013330 A2 WO 2014013330A2 IB 2013001592 W IB2013001592 W IB 2013001592W WO 2014013330 A2 WO2014013330 A2 WO 2014013330A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
butanediol
glycerol
planticola
strains
strain
Prior art date
Application number
PCT/IB2013/001592
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English (en)
French (fr)
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WO2014013330A3 (es
Inventor
Antonia Maria ROJAS MARTINEZ
Silvia SEGARRA MANZANO
Alejandro MONTESINOS PAES
Marta Tortajada Serra
Daniel Ramon Vidal
Victoria Eugenia SANTOS MAZORRA
Miguel LADERO GALAN
Felix Garcia-Ochoa Soria
Vanessa RIPOLL MORALES
Original Assignee
Biopolis. S.L.
Universidad Complutense De Madrid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biopolis. S.L., Universidad Complutense De Madrid filed Critical Biopolis. S.L.
Priority to CA2879331A priority Critical patent/CA2879331A1/en
Priority to BR112015001094A priority patent/BR112015001094A2/pt
Priority to EP13819213.3A priority patent/EP2876155B1/en
Priority to US14/415,343 priority patent/US9783832B2/en
Publication of WO2014013330A2 publication Critical patent/WO2014013330A2/es
Publication of WO2014013330A3 publication Critical patent/WO2014013330A3/es

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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to new mutant strains obtained by random mutagenesis from the bacterial species Raoultella planticola CECT843 with industrial production capacity of 2,3-butanediol from glycerol.
  • the present invention preferably relates to the Rauoltella planticola strains called IA1 and IIIA3, and deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with deposit number CECT8158 (corresponding to the named strain, IA1) and CECT8159 (corresponding to the denominated strain, IIIA3).
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the present invention also relates to a process for obtaining 2,3-butanediol from glycerol by a biotechnological process using the new strains of the invention.
  • 2,3-Butanediol is an organic compound, specifically an alcohol, whose molecular formula is C 4 H 10 O 2 .
  • D - (-) -, L - (+) - and meso- and it is also known as 2,3-butylene glycol, dimethylene glycol, dimethylethylene glycol, and its name according to IUPAC It is butane-2,3-diol. Its molecular weight is 90, 121 (g mol "1 ), and it is found in cocoa butter and in the roots of the Ruta graveolens plant.
  • 2,3-butanediol and some of its derivatives are used in the production of plastics and solvents. Due to its high octane index, 2,3-butanediol is useful as an octane enhancer in fuels. Given his bass melting point (-60 ° C), it is also used as an antifreeze. As an analysis reagent, 2,3-butanediol is used for the resolution of carbonyl compounds in gas chromatography.
  • 2,3-butanediol One of the main applications of 2,3-butanediol is its conversion into 1, 3- butadiene, which is used for the production of synthetic rubber.
  • the product of the dehydrogenation of 2,3-butanediol, diacetyl is a flavoring and bacteriostatic agent highly valued in the food industry.
  • the dehydration of 2,3-butanediol yields methyl ethyl ketone (MEC), which is an additive with high heat of combustion used in fuels. MEC is also used as solvent for resins and lacquers.
  • MEC methyl ethyl ketone
  • PUMAs polyurethane-melamides
  • 2,3-butanediol esterification products are used in cosmetics and in the pharmaceutical industry.
  • potential applications of 2,3-butanediol are also considered to be the production of wetting agents, elastane, fumigants, plasticizers (such as polyvinyl chloride, cellulose nitrate and polyacrylates), perfumes, printing inks, softeners and vectors of drugs
  • Various microorganisms are capable of accumulating 2,3-butanediol, such as strains of the bacterial species Aeromonas hydrophila, Aerobacter indologenes, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacilus polymyxa, Bacillus subtilis, Brevibacillus brevis S1, Coryneumbacterrobacterro Enterobacterrobacterium Enterobacterium Enterobacterium Enterobacterium Enterobacterium bacteria , Klebsiela pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella terr ⁇ gena, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp.
  • lactis var. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Pseudomonas chlororaphis, Raoultella terr ⁇ gena, Serratia marcescens, Streptococcus faecalis, some rhizobacteria and Clamydomonas perigranulata seaweed, although not all do so in significant amounts.
  • Some yeasts are also capable of synthesizing 2,3-butanediol, but with very low productivity, so the only microorganisms of industrial importance for the production of this compound are bacteria. It is also known that the synthesis of 2,3-butanediol seems to play a very important physiological role for microorganisms by preventing acidification, regulating the NADH / NAD + ratio and storing carbon and energy for growth.
  • the genes responsible for the transformation of 2,3-butanediol from A. aerogenes and K. terrigena have been cloned and characterized.
  • budA C consisting of three genes that encode the three key enzymes: ⁇ -acetolactate synthetase, a-acetolactate decarboxylase and acetoin reductase (2,3-butanediol dehydrogenase).
  • the bacteria so far identified as more efficient among the producers of 2,3-butanediol are B. polymyxa, K. oxytoca and K. pneumoniae and mainly use sugars as a substrate.
  • strain K. pneumoniae DSM 2026 which is a very good glycerol fermenter.
  • strain K. pneumoniae G31 is better under fermentation conditions in which the pH value is not controlled.
  • K. pneumoniae G31 produced 2,3-butanediol with a yield of 0.36 g / g (Petrov & Petrova, 2009) 6 and in tests with forced fluctuations of pH the result was 0.39 g / g, in both cases, from glycerol (Petrov & Petrova, 2010) 7 .
  • the species K. pneumoniae is listed as a group 2 biological agent, which means that it is a pathogen that can cause disease in man and can pose a danger. for workers (Directive 2000/54 / EC of the European Parliament and of the Council of 18-9-2000), so the strains of this species are not suitable for use in industrial biotechnology.
  • US 5,254,467 refers to a process for the transformation by means of microorganisms of glycerol in 1, 3-propanediol. Said process comprises the fermentation of said microorganisms in a medium containing 5-20% by weight of glycerol under standard anaerobic fermentation conditions, subsequently recovering the 1,3-propanediol produced, and as a secondary product, 2,3-butanediol.
  • the strain Klebsiella planticola IAM 33 is mentioned.
  • the yield of 2,3-butanediol in this fermentation process is very low, so its use at industrial level is not feasible.
  • JP 2010226959 mentions the use of other microorganisms capable of generating ethanol from glycerol, specifically Raoultella ornithinolytica and R. planticola, although the obtaining of 2,3-butanediol is not mentioned.
  • the object of the invention is to improve the production of 1,3-propanediol from glycerol using certain strains of bacteria belonging to the genera Caloramator, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus, Listeria and Salmonella using an enzyme-catalyzed reaction in which the first step is the conversion of glycerol into 3- hydroxypropionaldehyde and water, and the second step is the reduction of 3- hydroxypropionaldehyde to 1,3-propanediol.
  • the production of 2,3-butanediol is not mentioned.
  • the object of the invention of US 2008/0274522 A1 is a method for the production of 2-butanone by fermentation by a microorganism.
  • the method uses the enzyme acetolactate synthetase and a reduction in temperature during the fermentation process, which results in a higher tolerance of the butanone host. It does not mention the production of 2,3-butanediol.
  • Patent application WO 2007/130518 A2 refers to the production of 2-butanol by means of the industrial fermentation of a recombinant microorganism.
  • the transgenic host contains at least one recombinant DNA molecule that It contains a gene that encodes a polypeptide capable of catalyzing a substrate and converting: i) pyruvate to alpha-acetolactate; ii) acetoin alpha-acetolactate; and iii) acetoin to 3-amino-2-butanol. It does not mention the production of 2,3-butanediol.
  • EP 1892300 A1 provides a method for the production of 1, 3- propanediol starting from crude glycerol, obtained as a byproduct in the production of biodiesel, and using Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum and Klebsiella pneumoniae as fermenting microorganisms. It does not mention the production of 2,3-butanediol. All other significant examples of 2,3-butanediol production refer to the use of sugars (eg glucose) as a substrate.
  • sugars eg glucose
  • the technical problem of the present invention relates to the provision of new strains of the R. planticola species, with an industrial production capacity of 2,3-butanediol from glycerol.
  • said technical problem has resulted in the provision of two new strains of R. planticola referred to herein as IA1 and IIIA3 and deposited on 06/12/12 with access number: CECT8158 (corresponds to IA1) and CECT8159, ( corresponds to IIIA3) in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, c / Professor Agust ⁇ n Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, Spain, according to the provisions of the Budapest Treaty.
  • Said strains have a production capacity of 2,3-butanediol superior to strains of the same species, whereby the present invention also contemplates a method with industrial viability for the biotechnological transformation of glycerol to 2,3-butanediol using said new strains or its mutants OBJECT OF THE INVENTION
  • the present invention relates to new strains of the R. planticola species, obtained by random mutagenesis from the CECT843 strain of R. planticola. Specifically, the present invention relates to the CECT8158 and CECT8159 strains of R. planticola that have a 2,3-butanediol producing capacity superior to the wild species and other strains of the same species, as well as the provision of a method with viability industrial for the biotechnological transformation of glycerol to 2,3-butanediol using any of these new strains or their mutants.
  • An object of the present invention is also a method of obtaining strains of the R. planticola species, in particular those deposited as CECT8158 and CECT8159 obtained through randomly induced mutagenesis of the wild strain CECT843 and subsequent forced selection of plate mutants of bromate / bromide with improvements in the production capacity of 2,3-butanediol.
  • the object of the present invention is also a process for obtaining 2,3 butanediol, which comprises the following steps: a) An aerobic fermentation of the R. planticola microorganism strains CECT8158 or CECT8159 capable of converting glycerol into 2,3-butanediol, into a medium comprising an aqueous solution with a glycerol content of at least 3% by weight, preferably 6% by weight under conditions suitable for producing 2,3-butanediol; and b) A process for the separation of 2,3-butanediol produced from the reaction medium.
  • the present invention also aims at the provision of a method for producing 2,3-butanediol in a fermentative process from glycerol, and can be used for the purpose of the present invention as a carbon source, both pure glycerol and glycerol industrial (crude), from the biofuels industry as a byproduct of biodiesel production processes.
  • FIGURES Figure 1A Growth of the R. planticola strain CECT843 in increasing concentrations of glycerol. The average results of four replicas are illustrated.
  • Figure 1 B Growth of strain K. oxytoca m5a1 in increasing concentrations of glycerol. The average results of four replicas are illustrated.
  • Figure 2A Growth of the R. planticola strain CECT843 in increasing concentrations of 2,3-butanediol. The average results of four replicas are illustrated.
  • Figure 2B Growth of strain K. oxytoca m5a1 in increasing concentrations of 2,3-butanediol. The average results of four replicates are illustrated.
  • Figure 3 Scheme of the random mutagenesis procedure for obtaining and selecting the R. planticola CECT8158 and CECT8159 strains.
  • the present invention relates to new strains of the R. planticola species, obtained by random mutagenesis from the CECT843 strain of R. planticola. Specifically, the present invention relates to the CECT8158 and CECT8159 strains of R. planticola that have a 2,3-butanediol producing capacity superior to the wild species and other strains of the same species, as well as the provision of a method with industrial viability for the biotechnological transformation of glycerol to 2,3-butanediol using any of said new strains or their mutants, comprising the following stages: a) an aerobic fermentation of the R.
  • planticola strain CECT8158 or CECT8159 strain capable of converting glycerol in 2,3-butanediol, in a medium comprising an aqueous solution with a glycerol content of at least 3% by weight, preferably 6% by weight, under conditions suitable for producing 2,3-butanediol; and b) a process of separating 2,3-butanediol produced from the reaction medium.
  • the efficiency of the transformation in the production process of 2,3 butanediol depends fundamentally on the selection of strains microbials with high producing capacity of 2.3 butanediol, as well as high growth capacity and viability in a culture medium with high concentrations of glycerol and 2.3 butanediol.
  • a collection of 2,3-butanediol producing strains from glycerol was established, using the following collection strains: Raoultella terr ⁇ gena CECT 4519, Pantoea agglomerans CECT 4842, Paenibacillus polymyxa CECT 155-T, Paenibacillus polymyxa CECT 153, Paenibacillus polymyxa DSM 356, Paenibacillus polymyxa ATCC 12321, Paenibacillus xylamilyticus CECT 5839-T, CECT 4536 Bacillus licheniformis, Bacillus licheniformis DSM8785, Bacillus licheniformis TUL, Bacillus subtilis TUL322, Bacillus amyloliquefaciens TUL, R.
  • biological sludge samples were obtained from a water purifier of a biodiesel production plant. 45 mL of medium and 500 ⁇ of sludge were added in 50 mL capacity tubes. Two different culture media with 15 g / L of glycerol were used as carbon source: medium A (MA) and medium B (MB) richer in nutrients than the first.
  • MA medium A
  • MB medium B
  • the MA composition per liter, is as follows: 30 g of glycerol, 0.75 g of KCI, 1.38 g of NH 2 PC and 2 H 2 0, 5.35 g of (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.28 g of Na 2 S0 4 , 0.26 of MgSCy7H 2 0.04 g of citric acid, 2 g of yeast extract, 0.3 mL of microelement solution (per liter: 34.2 g of ZnCI 2 , 2.7 g of FeCI 3 -6H 2 0, 10 g of MNCI 2 -4H 2 0, 0.85 g of CuCl 2 -2H 2 0, 0.3 g of H 3 B0 3, 8.23 g COCl 2 -6H 2 0).
  • the MB medium has the following composition, per liter: 15-30 g of glycerol instead of glucose, 5.0 g of yeast extract, 5.0 of tryptone, 7.0 g of KH 2 P0 4 , 7.0 g of KH 2 P0 4 , 1 .0 g of (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.25 g of MgS0 4 -7H 2 0, 0.12 g of NaMoCy7H 2 0, 0.021 g of CaCI 2 -2H 2 0, 0.029 g of CoCI 2 -6H 2 0, 0.039 g of Fe (NH 2 ) 2 S0 4 -6H 2 0.02 mg of nicotinic acid, 0.172 mg of Na 2 Se0 3 , 0.02 mg of NiCI 2 , and 10 mL of microelement solution (per liter: 0.5 g of Na 2 EDTA, 0.5 g of MNCI 2 -4H 2 0, 0.1 g of H 3 B0 3, 1 0.0 mg of CuCl 2
  • the qualitative methods to detect and identify the 2,3-butanediol producers used are those described in the literature for the identification of 2,3-butanediol (Desnuelle & Naudet, 1945) 3 and acetoin (Benjaminson et al. 1963 1 ; Speckman & Collins, 1982 8 ) once modified and adapted to the specific conditions of the present invention.
  • the microorganisms used in the screening indicated above were grown for 16-18 hours in the glycerol culture media (MA and MB media), at 30 ° C, with stirring at 150 rpm.
  • the method followed for the identification of acetoin in the medium is based on the fact that acetoin is oxidized by ⁇ -naphthol in the presence of air in basic medium.
  • creatine and the ⁇ -naphthol alkaline solution are added to solutions with acetoin or diacetyl, a bright red complex of indefinite chemical composition is formed that is measurable in the spectrophotometer.
  • 120 ⁇ of 0.5% creatine solution, 300 iL of 5% ⁇ -naphthol in ethanol, and 200 ⁇ of 40% KOH solution are added. In 96-well plates, the flow of the processed samples is increased.
  • the method followed for the detection of 2,3-butanediol was based on the oxidation of 2,3-butanediol to acetaldehyde and the formation of a blue complex with phenylhydrazine and sodium nitroprusside measurable in the spectrophotometer.
  • To identify the 2,3-butanediol produced 4 mL of distilled water and 1 mL of 0.1 M H 5 I0 6 were added to 1 mL of supernatant and the mixture was incubated 30 minutes at room temperature. The reaction was neutralized with 2 drops (2 x 20 ⁇ ) of ethylene glycol.
  • colorimetric assays were carried out to select the producing colonies of 2,3-butanediol and acetoin following the methods described above. A total of 850 isolates were analyzed and with which a positive result was obtained in the colorimetric tests (a total of 40 strains) a larger scale culture was made to check the production of 2,3-butanediol.
  • the genomic DNA of the best producing strain was obtained and identified at the genus and species level by sequencing the 16S zone of the MbosomaL repeating unit.
  • Universal primers 616V, illustrated in SEQ were used for the PCR reaction. ID. NO. 1 and 630R illustrated in SEQ. ID. NO. 2.
  • the PCR reaction mixture was: 200 ng of genomic DNA, 5pL of 10X buffer, 1.5 mM MgCl 2 . 1 U of Taq polymerase (Dinazyn e), 200 ⁇ of dNTPs, 1 ⁇ of primers.
  • the reaction conditions were: 1 cycle of 5 min at 94 ° C; 35 cycles from 20 s to 94 ° C, 30 s to 56 ° C, from 1 min to 72 ° C; and 1 cycle of 10 min at 72 ° C.
  • the best producing strain was identified as a strain belonging to the bacterial species R. planticola and specifically with the wild strain CECT 843.
  • the sequence of the 16S rDNA obtained with the primer 616V is illustrated in SEQ. ID. NO. 3. This strain is classified in the Spanish (CECT) and German (DSMZ) type crop collections as risk type 1, that is, not causing diseases to laboratory workers and animals.
  • a fermentation test was carried out to compare the 2,3-butanediol producing capacity of the selected wild strain, R. planticola CECT843 with other microorganisms described and already known for their 2,3-butanediol producing capacity.
  • the microorganisms used in this comparative test were the following: B. licheniformis D5M8785, Klebsiella oxytoca m5A1, P. polymyxa D5 356, P. polymyxa ATCC12321 and R. planticola IAM1 133 cited in US5254467
  • the medium was used, the medium called MB with glycerol at 60 g / L.
  • the tests were carried out in 250 mL flasks with 50 mL of medium and incubation at 30 ° C, and 100 rpm.
  • the growth of the cultures was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of the substrate and the metabolites produced was quantified by liquid chromatography in a Waters 1525/2695 device with differential refractive index detector and Rezex ROA Organic Acid column, with H 2 S0 4 at 2.5 mM and flow of 0.5 mL / min . Quantification was performed by comparison with standard product curves.
  • the R. planticola IAM133 strain consumes only 16% of the total glycerol, and generates only 2.9 g / L of 2.3BD compared to 23.2 g / L produced by R. planticola CECT843. For this reason, the R. planticola CECT 843 strain is far superior in production and yield to the R. planticola IAM1 133 strain.
  • the strain was chosen Klebsiella oxytoca m5a1 as a control strain to compare, being the second best producer of 2,3-butanediol under the conditions previously examined.
  • this strain is one of the most studied and used in fermentations with glycerol to produce 1,3-propanediol and 2,3-butanediol.
  • glycerol concentrations were tested: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 and 80 g / L.
  • the 2,3-butanediol concentrations tested were: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 and 80 g / L.
  • glucose was used as carbon source at 15 g / L as growth control.
  • the tests were carried out by incubating in a Multiskan Ascent incubator (Thermo Electron Corporation) at 30 ° C. Culture growth was monitored by measuring absorbance or optical density (OD600) for 24 hours.
  • Figure 1 shows the results of glycerol growth and Figure 2 of the OD600 achieved with 2,3-butanediol.
  • the R. planticola strain CECT843 selected as the best producer is also more tolerant of both compounds than the control strain K. oxytoca m5a1.
  • the R. planticola CECT843 strain maintains the same level of growth up to concentrations of 60 g / L of glycerol, while the growth of K. oxytoca begins to be inhibited from 40 g / L.
  • the growth of K. oxytoca is reduced to 50% with 15 g / L of the compound, while in the R. planticola CECT843 strain this effect does not occur until concentrations of 35 g / L of 2,3-butanediol.
  • FIG. 3 A schematic of the procedure is presented in Figure 3.
  • mutagenesis with EMS about 2x10 8 cells / mL of a culture obtained exponentially in a culture medium with 30 g / L glycerol (MB medium) were used.
  • the cells were washed with 0.1 M phosphate buffer pH 7.0, and resuspended in the same volume of the buffer.
  • the cell suspension was distributed in 1 mL aliquots in eppendorf tubes.
  • Different amounts of EMS (0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 [iL per mL of culture) were added and incubated for 1 hour at 30 ° C.
  • the tubes were centrifuged and two washings were done with phosphate buffer.
  • the mutagen was neutralized with two washes with sodium thiosulfate, and the contents of each tube were resuspended in 5 ml of culture medium with 30 g / L of glycerol. The whole was incubated at 30 ° C for 16-18 hours for recovery. Counts were made in LB medium to determine the percentage of death. The dose chosen for mutagenesis was 10pL / mL to provide 95% death.
  • bromide / bromate 100 mM NaBr, and 100 mM NaBr0 3 , 12 g / L glucose, 4 g / L peptone, 1.2 g meat extract, 2 g / L of NaCI, and 16 g / L of agar
  • Colonies that were obtained from Br7Br0 3 " plates were tested in multiwell plates in fermentation medium with glycerol 30 g / L (Nakashimada ef al., 1998J, supplemented with phenol red at a concentration of 0.008%.
  • [BD] max is the maximum concentration of 2,3-butanediol reached;
  • [Glycerol] cons is the concentration of glycerol consumed;
  • ⁇ indicates the transformation yield, grams of 2,3-BD produced relative to grams of glycerol consumed;
  • [Acetoin] max is the maximum concentration of acetoin produced, measured in g / L; and
  • [EtOH] max is the maximum concentration of ethanol produced measured in g / L.
  • IIIC9 11.7 37.4 0.31 0.7 0.2
  • the 7 strains A7, H7, IA1, IA12, IIC12, IIIA1 and IIIA3 were selected, according to criteria of higher concentration of 2,3-BD and higher yield than the wild strain.
  • the mutants IA1, IA12, IIC12, IIIA1 and IIIA3 were obtained by mutagenesis with EMS.
  • the H7 mutant resulted in spontaneous mutagenesis of the wild strain sown in plates with NaBr / NaBr0 3,100 mM. Mutant A7 was produced by exposure to UV radiation.
  • IIIA1 37.1 ⁇ 60.9 ⁇ 0.46 ⁇ 1.9 ⁇ 0.2 0.9 ⁇ 0.4
  • IIIA3 30.5 ⁇ 57.6 ⁇ 0.50 ⁇ 2.4 ⁇ 1.5 0.8 ⁇ 0.0
  • Figure 4 shows how the concentration of 2,3-butanediol reached for strain IA1 and strain IIIA3, both obtained by random mutagenesis induced with EMS, and subsequent selection on bromate / bromide plates according to the present invention They are superior to the rest of the strains tested.
  • mutants IA1 and IIIA3 generated concentrations of 2,3-butanediol at around 30 g / L and yields around 50%.
  • the remaining strains tested produced about 30% more 2,3-butanediol than the wild strain.
  • mutant strains of R. planticola CECT843 obtained by random mutagenesis induced with EMS and subsequent selection in bromate / bromide plates have industrial capacity for the production of 2,3-butanediol from glycerol.
  • mutant strains IA1 (CECT8158) and IIIA3 (CECT8 59) show a greater industrial viability for the purposes of the present invention.
  • Table 6 shows the results obtained in each of the experiments presented in Table 5.
  • T to reaction between 28 and 37 ° C, preferably 33 ° C.
  • cobalt salts such as CoCI 2 : between 0.012 and
  • Presence of glycerol in the culture medium between 10 and 90 g / L, preferably 60 g / L. pH between 7.5 and 5.5, preferably 6.8 and uncontrolled during fermentation.
  • glycerol In addition to glycerol, other carbon sources, such as yeast extract rich in vitamins and amino acids, can be added in the culture medium in amounts between 0.5-8 and preferably 5 g / L.
  • the culture medium may also contain other sources of nitrogen, whether inorganic, for example, ammonium sulfate, or complex organic, such as yeast extract, peptone, tryptone, corn steep liquor, urea or glutamate.
  • inorganic for example, ammonium sulfate, or complex organic, such as yeast extract, peptone, tryptone, corn steep liquor, urea or glutamate.
  • reaction time it is estimated between 12 and 48 hours, preferably 30 hours.
  • the concentration of dissolved oxygen in the medium with respect to the saturation concentration is estimated around 0% -20%, preferably 5%.
  • the fermentation process of the present invention can be carried out discontinuously, in batch fed or batch mode, either with free or immobilized cells, in bioreactors of Applikon, Braun Biotech or similar characteristics, 1 to 5 liters, and higher scales, in which it is determined as an appropriate agitation for the purposes of the present invention, between 200 and 700, preferably 500 rpm.
  • 2,3-butanediol product obtained in the fermentation As previously mentioned, 2,3-butanediol formed in the fermentation process using the new strains of R. planticoia strains CECT8158 and CECT8159 of the present invention, is separated from the culture supernatant by commonly used procedures . In the separation of 2,3-butanediol from the culture broth, the separation of the biomass and other solids from the fermentation broth can be carried out by filtration or centrifugation.
  • Solvents such as ethyl acetate, tributyl phosphate, diethyl ether, n-butanol, dodecanol and oleyl alcohol can be used in the liquid-liquid extraction.
  • water must be removed by evaporation and by microfiltration and reverse osmosis.
  • PEG / dextran systems can be used for two-phase aqueous extraction.
  • 2,3-BD can react with formaldehyde to produce a methyl acetal under acid catalysis.
  • the 2,3-butanediol methyl acetal is collected as an oil in the upper phase and for recovery it is reacted with methanol to form 2,3-BD and methyl.
  • Methyl or dimethoxymethane is in turn hydrolyzed to methanol and formaldehyde.
  • Pervaporation or distillation with vacuum membranes manages to concentrate large amounts of the compound with the use of microporous polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the MC medium is composed of 1 liter: 2 g of NH CI, 6 g of KH 2 P0 4i 12 g of Na 2 HP0 4 , 1 g of NaCI, 246 mg of MgSCy7H 2 0, 14.7 g of CaCI 2 -2H 2 0 14.7 g / L.
  • Type of culture medium the tests were carried out on two synthetic media medium A and C.
  • Yeast extract concentration the range studied was 0.5 to 1.5 g / L
  • the experiments were carried out in batch mode, in 50 mL bottles with 0 mL of the corresponding culture medium.
  • the initial glycerol concentration was 30 g / L.
  • Stirring was set in all experiments at 175 rpm.
  • the initial pH of the medium was 7 and evolved freely during the course of fermentation, decreasing to values close to 5.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of substrate and metabolites produced was quantified by high performance liquid chromatography in an Agilent Technologies 1 100 series with Array Diode detector (measured at 276 nm) and a Refractive index detector.
  • the column used was Rezex ROA Organic Acid.
  • the mobile phase used was a dilute solution of sulfuric acid (concentration of 0.005 N acid), whose flow was set at 0.5 mL / min.
  • the quantification of the compounds was performed by comparison with standard curves of the products.
  • Optimized conditions were used for the wild strain CECT843 and the modified MC synthetic medium, whose initial concentration of pure glycerol was 60 g / L.
  • the fermentation conditions were set at: temperature 28 ° C; stirring 175 rpm.
  • the initial pH of the medium was 7 and evolved freely during the course of fermentation, decreasing to values close to 5.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of substrate and metabolites produced was quantified by high performance liquid chromatography in an Agilent Technologies 1 100 series with Array Diode detector (measured at 276 nm) and a Refractive index detector.
  • the column used was Rezex ROA Organic Acid.
  • the mobile phase used was a dilute solution of sulfuric acid (concentration of 0.005 N acid), whose flow was maintained 0.5 mL / min.
  • the quantification of the compounds was performed by comparison with standard curves of the products.
  • Optimized conditions were used for the wild strain and the modified MC synthetic medium, whose initial concentration of pure glycerol was 60 g / L.
  • the fermentation conditions were set at: temperature 28 ° C; stirring 175 rpm.
  • the initial pH of the medium was 7 and evolved freely during the course of fermentation, decreasing to values close to 5.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of substrate and metabolites produced was quantified by high performance liquid chromatography in an Agilent Technologies 1 100 series with Array Diode detector (measured at 276 nm) and a Refractive index detector.
  • the column used is Rezex ROA Organic Acid.
  • the mobile phase used is a dilute solution of sulfuric acid (concentration of 0.005 N acid), whose flow is 0.5 mL / min.
  • the quantification of the compounds was performed by comparison with standard curves of the products.
  • a batch mode test was carried out in a 1 liter volume Applikon fermenter with the wild strain CECT 843.
  • the conditions described as optimal for MB medium with glycerol were used at an initial concentration of 60 g / L.
  • the fermentation conditions were set at 33 ° C, 500 rpm and 5% dissolved oxygen.
  • the initial pH of the medium was 6.8, and it was not controlled during the experiment, so that the pH dropped freely.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of the substrate and the metabolites produced was quantified by liquid chromatography in a Waters 1525/2695 device with differential refractive index detector and Rezex ROA Organic Acid column, with H 2 S0 4 at 2.5 mM and flow of 0.5 mL / min . Quantification was performed by comparison with standard product curves.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of the substrate and the metabolites produced was quantified by liquid chromatography in a Waters 1525/2695 device with differential refractive index detector and Rezex ROA Organic Acid column, with H 2 S0 4 at 2.5 mM and flow of 0.5 mL / min . Quantification was performed by comparison with standard product curves.
  • a batch mode test was carried out on a 1-liter volume Fermentation Applikon fermentor with the mutant strain IIIA3.
  • the conditions described as optimal for the wild strain CECT843 and the MB medium with glycerol at an initial concentration of 60 g / L were used.
  • the fermentation conditions were set at 33 ° C, 500 rpm and 5% dissolved oxygen.
  • the initial pH of the medium was 6.8, and it was not controlled during the experiment, so that the pH dropped freely.
  • the growth of the culture was determined by absorbance measurements at 600 nm in spectrophotometer.
  • the concentration of the substrate and the metabolites produced was quantified by liquid chromatography in a Waters 1525/2695 device with differential refractive index detector and Rezex ROA Organic Acid column, with H 2 S0 4 a 2.5 mM and flow of 0.5 mL / min. Quantification was performed by comparison with standard product curves.

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Abstract

Proceso para la producción de 2,3-BUTANODIOL mediante cepas mejoradas de Raoultella planticola, se refiere a nuevas cepas mutantes obtenidas por mutagénesis al azar a partir de la especie bacteriana Raoultella planticola CECT843 con capacidad productora industrial de 2,3-butanodiol a partir de glicerol. La presente invención se refiere preferentemente a las cepas de Rauoltella planticola denominadas IA1 y IIIA3, y depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con n° de depósito CECT8158 (correspondiente a la cepa denominada, IA1 ) y CECT8159 (correspondiente a la cepa denominada, IIIA3). La presente invención refiere igualmente a un proceso de obtención de 2,3-butanodiol a partir de glicerol mediante un proceso biotecnológico utilizando las nuevas cepas de la invención.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3-BUTANODIOL MEDIANTE CEPAS MEJORADAS DE Raoultella planticola
DESCRIPCIÓN
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas cepas mutantes obtenidas por mutagénesis al azar a partir de la especie bacteriana Raoultella planticola CECT843 con capacidad productora industrial de 2,3-butanodiol a partir de glicerol. La presente invención se refiere preferentemente a las cepas de Rauoltella planticola denominadas IA1 y IIIA3, y depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con n° de depósito CECT8158 (correspondiente a la cepa denominada, IA1) y CECT8159 (correspondiente a la cepa denominada, IIIA3). La presente invención se refiere igualmente a un proceso de obtención de 2,3-butanodiol a partir de glicerol mediante un proceso biotecnológico utilizando las nuevas cepas de la invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El aprovechamiento de los subproductos para producir biocombustibles, energía y compuestos químicos básicos es cada vez más necesario en la situación actual de escasez de petróleo. Muchos compuestos que tradicionalmente han sido producidos a partir del petróleo pueden sintetizarse hoy día de forma biotecnológica empleando recursos renovables. Este es el caso de la producción biológica del 2,3-butanodiol. El 2,3-butanodiol es un compuesto orgánico, concretamente un alcohol, cuya fórmula molecular es C4H10O2. Existen tres formas isoméricas del mismo: D-(-)-, L-(+)- y meso- y se conoce también como 2,3-butilen-glicol, dimetilen-glicol, dimetiletilen-glicol, y su denominación según la IUPAC es butano-2,3-diol. Su peso molecular es 90, 121 (g mol"1), y se encuentra en la manteca de cacao y en las raíces de la planta Ruta graveolens.
El interés en este compuesto ha aumentado considerablemente en los últimos años por la gran cantidad de aplicaciones industriales que tiene, principalmente en la industria química y energética. Tanto el 2,3-butanodiol como algunos de sus derivados se emplean en la producción de plásticos y disolventes. Por su alto índice de octano el 2,3-butanodiol es útil como potenciador del octanaje en combustibles. Dado su bajo punto de fusión (-60°C), se emplea también como anticongelante. Como reactivo de análisis, el 2,3-butanodiol se utiliza para la resolución de compuestos carbonílicos en cromatografía de gases.
Una de las aplicaciones principales del 2,3-butanodiol es su conversión en 1 ,3- butadieno, que se utiliza para la producción de goma sintética. Por otro lado, el producto de la deshidrogenación del 2,3-butanodiol, el diacetilo, es un agente saborizante y bacteriostático muy valorado en la industria alimentaria. La deshidratación del 2,3-butanodiol rinde metil etil cetona (MEC), que es un aditivo con alto calor de combustión empleado en carburantes. La MEC se utiliza también como disolvente de resinas y lacas. De la esterificación de 2,3-butanodiol con ácido mélico se obtienen las poliuretano-melamidas (PUMAs), con utilidad en aplicaciones cardiovasculares. Otros productos de esterificación de 2,3-butanodiol se emplean en cosmética y en la industria farmacéutica. Finalmente, se consideran también aplicaciones potenciales del 2,3-butanodiol la producción de agentes humectantes, elastano, fumigantes, plastificantes (como por ejemplo, cloruro de polivinilo, nitrato de celulosa y poliacrilatos), perfumes, tintas de impresión, suavizantes y vectores de fármacos.
Diversos microorganismos son capaces de acumular 2,3-butanodiol, como por ejemplo cepas de las especies bacterianas Aeromonas hydrophila, Aerobacter indologenes, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacilus polymyxa, Bacillus subtilis, Brevibacillus brevis S1 , Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiela pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella terrígena, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Pseudomonas chlororaphis, Raoultella terrígena, Serratia marcescens, Streptococcus faecalis, algunas rizobacterias y el alga marina Clamydomonas perigranulata, aunque no todos lo hacen en cantidades significativas. También algunas levaduras son capaces de sintetizar 2,3-butanodiol, pero con muy baja productividad, por lo que los únicos microorganismos de importancia industrial para la producción de este compuesto son las bacterias. Se conoce además que la síntesis de 2,3-butanodiol parece jugar un papel fisiológico muy importante para los microorganismos al prevenir la acidificación, regular la proporción NADH/NAD+ y almacenar carbón y energía para el crecimiento. Los genes responsables de la transformación de 2,3-butanodiol de A. aerogenes y K. terrigena han sido clonados y caracterizados. Son un operón, denominado budA C constituido por tres genes que codifican las tres enzimas clave: α-acetolactato sintetasa, a- acetolactato decarboxilasa y acetoina reductasa (2,3-butanodiol deshidrogenasa).
Las bacterias hasta ahora identificadas como más eficientes entre los productores de 2,3-butanodiol son B. polymyxa, K. oxytoca y K. pneumoniae y utilizan principalmente azúcares como sustrato.
Por otra parte, es bien sabido que en la producción de compuestos químicos de base la solución ideal es la bioconversion de subproductos industriales (como glicerol, suero lácteo o residuos agrícolas) o el aprovechamiento del exceso de biomasa (como hidrolizado de maderas). En particular, y dado que en la producción de biodiesel se generan aproximadamente 100 Kg de glicerol crudo por tonelada de producto, y teniendo en cuenta el incremento de la producción de biodiesel, resulta interesante buscar alternativas para la utilización posterior de este subproducto. Por esta razón, el glicerol es conocido como uno de los sustratos potencialmente más interesantes para la producción de 2,3-butanodiol. En los procesos fermentativos de transformación de glicerol a otros productos distintos a 2,3-butanodiol, como el 1 ,3-propanodiol, destaca la participación de varias cepas pertenecientes a la especie de K. pneumoniae, por ejemplo, la cepa K. pneumoniae DSM 2026, que es muy buena fermentadora de glicerol. Por su parte, la cepa K. pneumoniae G31 es mejor en condiciones de fermentación en las que el valor de pH no se controla.
Estas especies también son capaces de producir 2,3-butanodiol a partir de glicerol. En procesos fermentativos de alimentación discontinua, K. pneumoniae G31 produjo 2,3- butanodiol con un rendimiento de 0.36 g/g (Petrov & Petrova, 2009)6 y en ensayos con fluctuaciones forzadas de pH el resultado fue de 0.39 g/g, en ambos casos, a partir de glicerol (Petrov & Petrova, 2010)7. Sin embargo, la especie K. pneumoniae está catalogada como agente biológico de grupo 2, lo que quiere decir que es un agente patógeno que puede causar enfermedades en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores (Directiva 2000/54/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 18-9-2000), por lo que las cepas de esta especie no son adecuadas para su empleo en biotecnología industrial.
Respecto a los documentos de patente, el documento US 5,254,467 se refiere a un proceso para la transformación por medio de microorganismos del glicerol en 1 ,3- propanodiol. Dicho proceso comprende la fermentación de dichos microorganismos en un medio que contiene 5-20% en peso de glicerol en condiciones estándar de fermentación anaeróbica, recuperando posteriormente el 1 ,3-propanodiol producido, y como producto secundario, 2,3-butanodiol. Como posible microorganismo útil para estos fines se menciona la cepa Klebsiella planticola IAM 33. No obstante, el rendimiento de obtención de 2,3-butanodiol en este proceso fermentativo es muy bajo, por lo que no resulta factible su utilización a nivel industrial.
El documento JP 2010226959 menciona la utilización de otros microorganismos con capacidad para generar etanol a partir de glicerol, concretamente Raoultella ornithinolytica y R. planticola, si bien no se menciona la obtención de 2,3-butanodiol.
En el documento US2007/0148749 A1 el objeto de la invención es mejorar la producción de 1 ,3-propanodiol a partir de glicerol utilizando ciertas cepas de bacterias que pertenecen a los géneros Caloramator, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus, Listeria y Salmonella utilizando una reacción catalizada por enzimas en la que el primer paso es la conversión del glicerol en 3- hidroxipropionaldehído y agua, y el segundo paso es la reducción del 3- hidroxipropionaldehído a 1 ,3-propanodiol. No se menciona la producción de 2,3- butanodiol.
El objeto de la invención del documento US 2008/0274522 A1 es un método para la producción de 2-butanona mediante fermentación por un microorganismo. El método utiliza la enzima acetolactato sintetasa y una reducción de la temperatura durante el proceso de fermentación, lo que da como resultado una mayor tolerancia del huésped a la butanona. No menciona la producción de 2,3-butanodiol.
La solicitud de patente WO 2007/130518 A2 se refiere a la producción de 2-butanol por medio de la fermentación industrial de un microorganismo recombinante. El huésped transgénico contiene al menos una molécula recombinante de DNA que contiene un gen que codifica un polipéptido con capacidad para catalizar un substrato y llevar a cabo la conversión de: i) piruvato a alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a acetoína; y iii) acetoína a 3 -amino-2-butanol. No menciona la producción de 2,3- butanodiol. El documento EP 1892300 A1 proporciona un método para la producción de 1 ,3- propanodiol partiendo de glicerol crudo, obtenido como subproducto en la producción de biodiesel, y utilizando como microorganismos fermentadores Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum y Klebsiella pneumoniae. No menciona la producción de 2,3- butanodiol. Todos los demás ejemplos significativos de producción de 2,3-butanodiol se refieren al uso de azúcares (e.g. glucosa) como sustrato.
Por tanto, el problema técnico de la presente invención se refiere a la provisión de nuevas cepas de la especie R. planticola, con capacidad de producción a nivel industrial de 2,3-butanodiol a partir de glicerol. Preferentemente dicho problema técnico se haya resulto con la provisión de dos nuevas cepas de R. planticola denominadas en la presente descripción como IA1 y IIIA3 y depositadas el 12/06/12 con número de acceso: CECT8158 (corresponde a IA1 ) y CECT8159, (corresponde a IIIA3) en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Pare Cientific Universitat de Valencia, c/Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna - Valencia, España, según las disposiciones del Tratado de Budapest. Dichas cepas presentan una capacidad productora de 2,3-butanodiol superior a cepas de la misma especie, por lo que la presente invención contempla también un método con viabilidad industrial para la transformación biotecnológica de glicerol a 2,3-butanodiol utilizando dichas nuevas cepas o sus mutantes. OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevas cepas de la especie R. planticola, obtenidas por mutagénesis al azar a partir de la cepa CECT843 de R. planticola. En concreto, la presente invención se refiere a las cepas CECT8158 y CECT8159 de R. planticola que presentan una capacidad productora de 2,3-butanodiol superior a la especie silvestre y otras cepas de la misma especie, así como la provisión de un método con viabilidad industrial para la transformación biotecnológica del glicerol a 2,3-butanodiol utilizando cualquiera de dichas nuevas cepas o sus mutantes.
Es también un objeto de la presente invención un procedimiento de obtención de cepas de la especie R. planticola, en particular aquellas depositadas como CECT8158 y CECT8159 obtenidas a través de mutagénesis inducida al azar de la cepa silvestre CECT843 y posterior selección forzada de mutantes en placas de bromato/bromuro con mejoras en la capacidad de producción de 2,3-butanodiol.
También es objeto de la presente invención un proceso para la obtención de 2,3 butanodiol, que comprende las siguientes etapas: a) Una fermentación aeróbica del microorganismo R. planticola cepas CECT8158 o CECT8159 capaz de convertir glicerol en 2,3-butanodiol, en un medio que comprende una solución acuosa con un contenido en glicerol de al menos el 3% en peso, preferiblemente el 6% en peso en condiciones adecuadas para producir 2,3- butanodiol; y b) Un proceso para la separación del 2,3-butanodiol producido del medio de reacción.
Asimismo es objeto de la presente invención la definición de los parámetros óptimos de reacción en la fermentación para la producción de 2,3 butanodiol utilizando las nuevas cepas R. planticola de la presente invención en un sistema de fermentación en discontinuo. Es también un objeto de la presente invención un nuevo procedimiento biotecnológico de obtención de 2,3-butanodiol que alcanza un rendimiento de conversión óptimo del 40-50% en peso, (g 2,3-butanodiol/g glicerol consumido), preferiblemente de un 30% más con respecto al rendimiento obtenido por la cepa silvestre.
Finalmente, la presente invención tiene también como objeto la provisión de un método para producir 2,3-butanodiol en un proceso fermentativo a partir de glicerol, pudiendo ser utilizado a los efectos de la presente invención como fuente de carbono, tanto glicerol puro como glicerol industrial (crudo), proveniente de la industria de los biocombustibles como subproducto de los procesos de obtención de biodiesel.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Crecimiento de la cepa R. planticola CECT843 en concentraciones crecientes de glicerol. Se ilustran los resultados promedio de cuatro réplicas.
Figura 1 B: Crecimiento de la cepa K. oxytoca m5a1 en concentraciones crecientes de glicerol. Se ilustran los resultados promedio de cuatro réplicas. Figura 2A: Crecimiento de la cepa R. planticola CECT843 en concentraciones crecientes de 2,3-butanodiol. Se ilustran los resultados promedio de cuatro réplicas.
Figura 2B: Crecimiento de la cepa K. oxytoca m5a1 en concentraciones crecientes de 2,3-butanodiol. Se ¡lustran los resultados promedio de cuatro réplicas.
Figura 3: Esquema del procedimiento de mutagénesis al azar para la obtención y selección de las cepas R. planticola CECT8158 y CECT8159.
Figura 4. Producción de 2,3- butanodiol de distintas cepas de la especie R. planticola.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevas cepas de la especie R. planticola, obtenidas por mutagénesis al azar a partir de la cepa CECT843 de R. planticola. En concreto, la presente invención se refiere a las cepas CECT8158 y CECT8159 de R. planticola que presentan una capacidad productora de 2,3-butanodiol superior a la especie silvestre y otras cepas de la misma especie, así como la provisión de un método con viabilidad industrial para la transformación biotecnológica del glicerol a 2,3-butanodiol utilizando cualquiera de dichas nuevas cepas o sus mutantes, que comprende las siguientes etapas: a) una fermentación aeróbica del microorganismo R. planticola cepa CECT8158 o cepa CECT8159 capaz de convertir el glicerol en 2,3-butanodiol, en un medio que comprende una solución acuosa con un contenido en glicerol de al menos el 3% en peso, preferiblemente el 6% en peso, en condiciones adecuadas para producir 2,3- butanodiol; y b) un proceso de separación del 2,3-butanodiol producido del medio de reacción.
A los efectos de la presente invención, la eficiencia de la transformación en el proceso de producción de 2,3 butanodiol depende fundamentalmente de la selección de cepas microbianas con elevada capacidad productora de 2,3 butanodiol, así como con alta capacidad de crecimiento y viabilidad en un medio de cultivo con concentraciones elevadas de glicerol y 2,3 butanodiol.
I. Selección de R. planticola cepa CECT 843 a) Identificación y aislamiento de microorganismos productores de 2,3- butanodiol.
Se estableció una colección de cepas productoras de 2,3-butanodiol a partir de glicerol, empleando las siguientes cepas de colección: Raoultella terrígena CECT 4519, Pantoea agglomerans CECT 4842, Paenibacillus polymyxa CECT 155-T, Paenibacillus polymyxa CECT 153, Paenibacillus polymyxa DSM 356, Paenibacillus polymyxa ATCC 12321 , Paenibacillus xylamilyticus CECT 5839-T, Bacillus licheniformis CECT 4536, Bacillus licheniformis DSM8785, Bacillus licheniformis TUL, Bacillus subtilis TUL322, Bacillus amyloliquefaciens TUL, R. planticola CECT 843, R. planticola IAM 1 133 (NCIMB 8153), Escherichia blattae ATCC 33430, Klebsiella oxytoca m5a1 , Klebsiella oxytoca NRRL-B199, Bacillus aquimaris BPCOIN34, Bacillus flexus BPCOIN20, Bacillus megaterium BPCOIN39, Bacillus marínus BPCOIN33, Bacillus murimartini BPCOIN2, Bacillus murimartini BPCOIN7, Bacillus pumilus BPCOIN1 , Bacillus pumilus BPCOIN21 , Bacillus silvestris BPCOIN24, Bacillus silvestris BPCOIN22, Bacillus thuríngiensis BPCOIN23, Bacillus thuringiensis BPCOIN61 , Bacillus weihenstephanensis BPCOIN32, Enterococcus faecalis BP162, Enterococcus faecalis Lom1 , Enterococcus faecium Nal , Lactobacillus plantarum BPE20, Lactobacillus plantarum BPE31 , Lactobacillus plantarum BC79, Lactobacillus plantarum BC78, Lactobacillus rhamnosus BP2, Lactobacillus rhamnosus BP173, Lactobacillus safranciensis M610, Lactobacillus sanfranciensis M611 , Lactobacillus sanfranciensis M615, Lactobacillus sanfranciensis M619, Lactobacillus zeae OR5, Pediococcus pentosaceus Prd1.
Para la obtención de los aislados, se obtuvieron muestras de fango biológico de una depuradora de agua de una planta productora de biodiesel. Se añadieron 45 mL de medio y 500 μί de fango en tubos de 50 mL de capacidad. Se emplearon 2 medios de cultivo diferentes con 15 g/L de glicerol como fuente de carbono: medio A (MA) y medio B (MB) más rico en nutrientes que el primero. La composición del MA, por litro, es la siguiente: 30 g de glicerol, 0.75 g de KCI, 1 .38 g de NH2PCy2 H20, 5.35 g de (NH4)2S04, 0.28 g de Na2S04, 0.26 de MgSCy7H20, 0.42 g de ácido cítrico, 2 g de extracto de levadura, 0.3 mL de solución de microelementos (por litro: 34.2 g de ZnCI2, 2.7 g de FeCI3-6H20, 10 g de MnCI2-4H20, 0.85 g de CuCI2-2H20, 0.3 g de H3B03, 23.8 g de CoCI2-6H20). El medio MB tiene la siguiente composición, por litro: 15 -30 g de glicerol en lugar de glucosa, 5.0 g de extracto de levadura, 5.0 de triptona, 7.0 g de KH2P04, 7.0 g de KH2P04, 1 .0 g de (NH4)2S04, 0.25 g de MgS04-7H20, 0.12 g de NaMoCy7H20, 0.021 g de CaCI2-2H20, 0.029 g de CoCI2-6H20, 0.039 g de Fe(NH2)2S04-6H20, 2.0 mg de ácido nicotínico, 0.172 mg de Na2Se03, 0.02 mg de NiCI2, y 10 mL de solución de microelementos (por litro: 0.5 g de Na2EDTA, 0.5 g de MnCI2-4H20, 0.1 g de H3B03, 1 .0 mg de CuCI2-2H20).
Se utilizaron 2 temperaturas diferentes para la incubación: 30 y 37 °C, y los cultivos se incubaron con y sin agitación. Después de 48 horas se pasaron a medio sólido empleando los medios de cultivo MA y MB solidificados con 2% de agar. Las colonias aisladas se inocularon en placas multipocillo para su escrutinio masivo con el mismo medio de cultivo del que provenían.
Los métodos cualitativos para detectar e identificar los productores de 2,3-butanodiol utilizados son los descritos en la literatura para la identificación de 2,3-butanodiol (Desnuelle & Naudet, 1945)3 y acetoína (Benjaminson et al. 19631 ; Speckman & Collins, 19828) una vez modificados y adaptados a las condiciones concretas de la presente invención. Los microorganismos empleados en el escrutinio indicados con anterioridad se cultivaron durante 16-18 horas en los medios de cultivo con glicerol (medios MA y MB), a 30 °C, con agitación a 150 rpm.
El método seguido para la identificación de acetoína en el medio se basa en el hecho de que la acetoína es oxidada por α-naftol en presencia de aire en medio básico. Cuando la creatina y la solución alcalina de α-naftol se añaden a disoluciones con acetoína o diacetilo se forma un complejo rojo brillante de composición química indefinida que es medible en el espectrofotómetro. Para identificar la acetoína producida a 1 mL de sobrenadante o de cultivo sin tratar se añaden 120 μί de solución de creatina al 0.5%, 300 iL de α-naftol al 5% en etanol, y 200 μί de solución de KOH al 40%. En placas de 96 pocilios se incrementa el flujo de las muestras procesadas. Para ello se empleó 100 μί de cultivo o sobrenadante, 12 μί de creatina 0.5%, 30 μΙ_ de solución de oc-naftol 5% en etanol, y 20 pL de KOH al 40%. Se deben mezclar bien todos los componentes, mediante agitación en vortex o pipeteo. El color rojo aparece en torno a los 5-10 minutos y desaparece aproximadamente 30 minutos después.
El método seguido para la detección de 2,3-butanodiol se basó en la oxidación de 2,3- butanodiol a acetaldehído y la formación de un complejo de color azul con fenilhidrazina y nitroprusiato sódico mesurable en el espectrofotometro. Para identificar el 2,3-butanodiol producido, a 1 mL de sobrenadante se añadieron 4 mL de agua destilada y 1 mL de H5I06 0.1 M y la mezcla se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 2 gotas (2 x 20 μί) de etilenglicol. Se añadió 1 .5 mL de una solución saturada de piperazina (30%) y 0.5 mL de nitroprusiato sódico al 4%. El resultado fue la aparición de un color azul intenso fugaz ante la presencia de 2,3-butanodiol. En placas de multipocillo se emplearon 150 μί de sobrenadante ó 30iL de sobrenadante con 120 pL de agua; se añadieron 32 pL de H5I06 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 20 D L de etilenglicol, 48 pL de la solución de piperazina y 16 pL de la solución de nitroprusiato sódico.
Tras incubación de los microorganismos seleccionados durante 16-18 horas se llevaron a cabo los ensayos colorimétricos para seleccionar las colonias productoras de 2,3-butanediol y acetoína siguiendo los métodos descritos con anterioridad. Se analizaron un total de 850 aislados y con los que se obtuvo un resultado positivo en las pruebas colorimétricas (un total de 40 cepas) se hizo un cultivo a mayor escala para comprobar la producción de 2,3-butanodiol.
Se obtuvo el ADN genómico de la cepa mejor productora y se identificó a nivel de género y especie por secuenciación de la zona 16S de la unidad de repetición MbosomaL Para la reacción de PCR se emplearon los cebadores universales 616V, ilustrado en SEQ. ID. NO. 1 y 630R ilustrado en SEQ. ID. NO. 2. La mezcla de reacción de PCR fue: 200 ng de ADN genómico, 5pL de tampón 10X, 1 .5 mM de MgCI2. 1 U de Taq polimerasa (Dinazyn e), 200 μΜ de dNTPs, 1 μΜ de cebadores. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo de 5 min a 94 °C; 35 ciclos de 20 s a 94°C, 30 s a 56 °C, de 1 min a 72 °C; y 1 ciclo de 10 min a 72 °C.
Comparando con las bases de datos (BlastN) se identificó la cepa mejor productora como una cepa perteneciente a la especie bacteriana R. planticola y concretamente con la cepa silvestre CECT 843. La secuencia del ADNr 16S obtenida con el cebador 616V se ilustra en la SEQ. ID. NO. 3. Esta cepa se clasifica en las colecciones de cultivos tipo española (CECT) y alemana (DSMZ) como de tipo de riesgo 1 , es decir, no causante de enfermedades a trabajadores de laboratorio y animales.
b) Comparación de actividad en la producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol de la cepa silvestre R. planticola CECT 843 frente a otros microorganismos
Se llevó a cabo un ensayo de fermentación para comparar la capacidad productora de 2,3-butanodiol de la cepa silvestre seleccionada, R. planticola CECT843 con otros microorganismos descritos y ya conocidos por su capacidad productora de 2,3- butanodiol. Los microorganismos utilizados en este ensayo comparativo fueron los siguientes: B. licheniformis D5M8785, Klebsiella oxytoca m5A1 , P. polymyxa D5 356, P. polymyxa ATCC12321 y R. planticola IAM1 133 citada en la patente US5254467
Se empleó uno de los medios utilizado en el escrutinio, el medio denominado MB con glicerol a 60 g/ L. Los ensayos se llevaron a cabo en matraces de 250 mL con 50 mL de medio e incubación a 30 °C, y 100 rpm.
El crecimiento de los cultivos se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotómetro. La concentración del sustrato y de los metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida en un equipo Waters 1525/2695 con detector de índice de refracción diferencial y columna Rezex ROA Organic Acid, con H2S04 a 2.5 mM y flujo de 0.5 mL/min. La cuantificación se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 , en la cual, se muestra el porcentaje de glicerol consumido; [BD]max es la máxima concentración de 2,3-butanodiol alcanzada; η indica en porcentaje el rendimiento de la transformación, en gramos de 2,3-BD producidos respecto a gramos de glicerol consumidos; [Acetoina]max es la máxima concentración en g/L de acetoina producida; [PD]max es la concentración máxima de 1 ,3-propanodiol; OD se refiere a la máxima densidad óptica a 600 nm medida en el cultivo; n.d.: no detectado. Tabla 1. Comparativa de cepas productoras de 2,3-butanodiol.
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En esta tabla se observa que los mejores productores de 2,3-BD son R. planticola silvestre y K. oxytoca m5al Ambos consumen la práctica totalidad del sustrato de partida, pero R. planticola CECT843 tiene un rendimiento superior, dando lugar a 23.3 g/L de 2,3-BD.
Cabe destacar la gran diferencia observada entre las dos cepas de R. planticola. La cepa R. planticola IAM133 consume solamente un 16% del total del glicerol, y genera tan sólo un 2.9 g/L de 2,3BD frente a 23.2 g/L producidos por R. planticola CECT843. Por esta razón, la cepa R. planticola CECT 843 es muy superior en producción y en rendimiento a la cepa R. planticola IAM1 133.
c) Caracterización de la tolerancia a glicerol y 2,3-butanodiol.
Adicionalmente a la selección de una especie con alta capacidad para transformar el glicerol a 2,3-butanodiol, debe también tenerse en cuenta la capacidad del microorganismo para no verse afectado en su crecimiento y viabilidad por las altas concentraciones de glicerol añadidas al medio para el proceso de transformación, así como las elevadas concentraciones de producto de transformación, 2,3-butanodiol, generadas durante el proceso.
Por ello, con el fin de determinar la tolerancia de la cepa seleccionada al sustrato y al producto obtenido tras la fermentación, se llevaron a cabo ensayos de crecimiento en concentraciones crecientes de ambos compuestos en el medio de cultivo denominado medio A. Se escogió la cepa Klebsiella oxytoca m5a1 como cepa control para comparar, por ser la segunda mejor productora de 2,3-butanodiol en las condiciones escrutadas previamente. Además esta cepa es una de las más estudiadas y empleadas en fermentaciones con glicerol para producir 1 ,3-propanodiol y 2,3- butanodiol.
Se ensayaron las siguientes concentraciones de glicerol: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 y 80 g/L. Las concentraciones de 2,3-butanodiol ensayadas fueron: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 y 80 g/L. En ambos casos, como control de crecimiento se empleó glucosa como fuente de carbono a 15 g/L. Los ensayos se llevaron a cabo incubando en un equipo de incubación Multiskan Ascent (Thermo Electron Corporation) a 30 °C. El crecimiento del cultivo se monitorizó mediante la medida de absorbancia o densidad óptica (OD600) durante 24 horas.
En la Figura 1 se muestran los resultados del crecimiento con glicerol y en la Figura 2 de la OD600 alcanzada con 2,3-butanodiol. La cepa R. planticola CECT843 seleccionada como mejor productora es además más tolerante a ambos compuestos que la cepa control K. oxytoca m5a1. La cepa R. planticola CECT843 mantiene el mismo nivel de crecimiento hasta concentraciones de 60 g/L de glicerol, mientras que el crecimiento de K. oxytoca comienza a inhibirse a partir de 40 g/L. Respecto a la presencia de 2,3-butanodiol, el crecimiento de K. oxytoca se ve reducido al 50% con 15 g/L del compuesto, mientras que en la cepa R. planticola CECT843 este efecto no se da hasta concentraciones de 35 g/L de 2,3-butanodiol.
Por lo tanto, la selección de la cepa silvestre de R. planticola también resulta acertada en términos de viabilidad industrial debido a su elevada tolerancia al glicerol y 2,3- butanodiol.
d) Obtención de R. planticola cepas CECT8158 y CECT8 59 a partir de la cepa silvestre Para la obtención de cepas sobreproductoras de 2,3-butanodiol a partir de la cepa silvestre CECT843 seleccionada previamente se siguió una estrategia de mutagénesis inducida al azar tanto con un mutágeno químico (etil metano sulfonato, EMS) como por exposición a radiación UV, seguida de crecimiento en placas de bromato/bromuro. Este procedimiento permite seleccionar aquellos mutantes con una menor secreción de ácidos. Puesto que la producción de ácidos orgánicos compite con la ruta de producción de 2,3-BD, una producción menor de ácidos debe dar lugar a un aumento en la producción de 2,3-BD.
En la Figura 3 se presenta un esquema del procedimiento. Para la mutagénesis con EMS se emplearon en torno a 2x108 células/mL de un cultivo obtenidas en fase exponencial en un medio de cultivo con 30 g/L de glicerol (medio MB). Las células se lavaron con tampón fosfato 0.1 M pH 7.0, y se resuspendieron en el mismo volumen del tampón. La suspensión de células se repartió en alícuotas de 1 mL en tubos eppendorf. Se añadieron distintas cantidades de EMS (0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 [iL por mL de cultivo) y se incubaron durante 1 hora a 30°C. Se centrifugaron los tubos y se hicieron dos lavados con tampón fosfato. Se neutralizó el mutágeno con dos lavados con tíosulfato sódico, y se resuspendió el contenido de cada tubo en 5 mi de medio de cultivo con 30 g/L de glicerol. El conjunto se incubó a 30 °C durante 16-18 horas para su recuperación. Se hicieron conteos en medio LB para determinar el porcentaje de muerte. La dosis elegida para la mutagénesis fue 10pL/mL al proporcionar un 95% de muerte.
Posteriormente se sembraron en placas de selección con bromuro/bromato (100 mM de NaBr, y 100 mM de NaBr03, 12 g/L de glucosa, 4 g/L de peptona, 1 .2 g de extracto de carne, 2 g/L de NaCI, y 16 g/L de agar) y se incubaron 2-3 días hasta la aparición de colonias. Para determinar la concentración de bromuro/bromato óptima que permitía obtener colonias aisladas se probaron distintas proporciones de las sales y distintos valores de pH: Br7Br03 " 160/40 mM, 130/32.5 mM, 100 mM/25 mM y 100/100 mM, pH 7.0, 6.5 y 6.0. La combinación de 100/100 mM de ambas sales y pH 6.0 fue determinante para la selección de cepas alteradas en el metabolismo de ácidos (método protón-suicida, Cueto & Méndez, 1990).
Para la mutagénesis por exposición a radiación UV, se sembró directamente 1 mL de suspensión de células lavadas en tampón fosfato (2x108), provenientes de un cultivo en fase de crecimiento exponencial, en placas conteniendo Br7Br03 " 100 mM pH 6.0. Como control se sembraron diluciones seriadas de los cultivos en placas de medio LB para analizar el seguimiento del efecto de la radiación sobre la viabilidad celular. Las placas se sometieron a distintos tiempos de exposición de luz UV: 0, 15, 30, 45 y 60 segundos. Se incubaron en oscuridad hasta la aparición de colonias. Se seleccionó el tiempo de exposición 45 segundos como el tiempo de radiación más adecuado al proporcionar un 95% de porcentaje de muerte.
Las colonias que se obtuvieron de las placas de Br7Br03 " se ensayaron en placas multipocillo en medio de fermentación con glicerol 30 g/L (Nakashimada ef al., 1998J, suplementado con rojo fenol a una concentración de 0.008%. Por debajo de pH 6.4 este colorante vira al amarillo, lo que permitió descartar los mutantes que disminuían el pH por debajo de esta cifra y seleccionando así los que producen menos ácido. Se llevaron a cabo los ensayos colorimétricos descritos previamente para la detección de acetoína y 2,3-butanodiol. De esta manera se analizaron 650 mutantes, de los que se hizo una primera selección de aquellos que producían menos ácido en los ensayos en placa multipocillo, y que daban positivo en las pruebas colorimétricas de detección de 2,3-BD y acetoína, resultando un total de 24 cepas.
Estas 24 cepas se ensayaron en un micro-reactor en las condiciones óptimas de crecimiento y producción determinadas para la cepa silvestre CECT 843. Se analizó el consumo de glicerol y la concentración de 2,3-butanodiol producido durante el ensayo. Se midió el crecimiento mediante absorbancia en espectrofotómetro a 600 nm. En la tabla 2 se muestran los resultados de los ensayos comparando los distintos mutantes seleccionados, con la cepa silvestre. Se muestra la máxima concentración de 2,3-BD, acetoínay etanol en g/L; el glicerol consumido en g/L, y el rendimiento como g 2,3- butanodiol/g glicerol consumido.
Los cultivos se realizaron en medio MB, con 60 g/L de glicerol, con pH inicial de 6.8. Sí se controló la temperatura (33°C) y la oxigenación, marcando como punto de referencia 5% DO (oxígeno disuelto). Se tomaron muestras periódicamente para analizar el contenido del sobrenadante y el crecimiento bacteriano. El máximo de 2,3- butanodiol se alcanzó en torno a las 30 horas. Tabla 2. Comparativa de cepas mutantes con la cepa silvestre. [BD]max es la máxima concentración de 2,3-butanodiol alcanzada; [Glicerol]cons es la concentración de glicerol consumida; η indica el rendimiento de la transformación, gramos de 2,3-BD producidos respecto a gramos de glicerol consumidos; [Acetoína]max es la máxima concentración de acetoína producida, medida en g/L; y [EtOH]max es la máxima concentración de etanol producida medida en g/L.
[BD]max [Glicerol]co η g/g [Acetoín [EtOH]max
CECT843 20.4 ±2.1 47.2 ±2.9 0.43 ± 1.5 ±0.4 0.4 ±0.2 843Silvestr 0.02
A1 18.0 ±8.7 38.9 ± 11.9 0.45 ± 0.9 ± 0.8 ±0.5
A2 9.4 ±2.2 22.5 ±5.7 0.42 ± 1.6 ± 0.4 ±0.1
A3 17.8 ±2.9 35.3 ±6.3 0.51 ± 0.9 ±0.4 0.5 ±0.0
A7 27.8 ± 40.6 ±2.7 0.67 ± 2.0 ± 1.6 0.3 ±0.4
C3 12.2 ± 27.4 ±4.1 0.45 ± 0.9 ±0.2 0.5 ±0.1
E1 4.2 ±2.2 14.1 ±6.2 0.29 ± 1.5 ±0.4 0.2 ±0.0
E12 3.9 ± 1.0 15.9 ± 1.8 0.24 ± 1.3 ±0.4 0.3 ±0.1
F6 11.1 ± 29.8 ±2.8 0.38 ± 0.8 ±0.2 0.2 ±0.0
F11 9.8 ± 1.1 28.2 ±2.8 0.35 ± 0.7 ±0.2 0.3 ±0.1
H7 21.3 ± 42.5 ±9.9 0.51 ± 1.3 ±0.6 1.0 ±0.5
H10 19.4 ± 40.6 ±0.1 0.48 ± 1.1 ±0.2 0.4 ±0.0
IA1 20.7 ± 45.1 ±2.5 0.46 ± 1.2 ±0.0 0.6 ±0.0
IA11 2.3 ± 0.2 13.7 ± 1.0 0.17± 1.3 ± 0.1 0.2 ±0.0
IA12 20.4 ± 1.6 44.1 ±0.3 0.46 ± 1.4 ± 0.8 0.4 ±0.0
IB12 10.9 ±3.6 30.2 ± 5.6 0.37 ± 1.3 ± 1.1 0.4 ±0.0
IH1 17.0 ±5.8 45.1 ±4.1 0.37 ± 1.9 ±0.9 0.3 ± 0.0
IIA12 19.4 ±8.3 41.3 ±4.1 0.46 ± 1.0 ±0.4 0.5 ±0.0
IIB2 11.9 ± 1.1 37.2 ±2.7 0.32 ± 0.5 0.7 ±0.0 0.3 ±0.0
IIB12 19.2 ±0.9 45.3 ±0.7 0.42 ± 1.9± 1.0 0.5 ±0.0
IC12 21.4 ±6.4 45.5 ± 3.8 0.47 ± 2.2 ± 1.2 0.3 ±0.0
IIIA1 21.3 45.1 0.51 1.4 0.5 IIIA3 21.8 44.3 0.49 2.1 0.3
IIIA5 12.0 28.0 0.43 0.8 0.4
IIIC9 11.7 37.4 0.31 0.7 0.2
Tras esta segunda evaluación se seleccionaron las 7 cepas A7, H7, IA1 , IA12, IIC12, IIIA1 y IIIA3, atendiendo a criterios de mayor concentración de 2,3-BD y mayor rendimiento que la cepa silvestre. Los mutantes IA1 , IA12, IIC12, IIIA1 y IIIA3 se obtuvieron por mutagénesis con EMS. El muíante H7 resultó de la mutagénesis espontánea de la cepa silvestre sembrada en placas con NaBr/NaBr03 100 mM. El muíante A7 se produjo por exposición a radiación UV.
e) Selección de Raoultella planticola cepas IA1 (CECT8158) y III A3 (CECT8159) como cepas mejores productoras de 2,3-butanodiol
Se llevaron a cabo nuevamente los ensayos descritos anteriormente para comparar la capacidad productora de 2,3-butanodiol de los 7 mutantes seleccionados en la etapa anterior en el equipo de microfermentación tomando como control la cepa silvestre CECT 843 en las mismas condiciones explicadas en el apartado anterior. Los cultivos se realizaron en medio MB, con 60 g/L de glicerol.
Las conclusiones generales a los resultados del ensayo realizado se ilustran en la Tabla 4. Se observa una menor producción de acetoína y de biomasa en los mutantes frente a la cepa silvestre, lo que explicaría el mayor rendimiento de conversión en 2,3- butanodiol en las cepas mutadas. Los resultados del ensayo realizado se recogen en la siguiente tabla:
Tabla 4. Ensayos comparativos de R. planticola silvestre y mutantes.
[BD]max [Glicer η (g/g) [Acetoina]ma [EtOH]max
CECT843 23.3 ± 64.7 ± 0.36 ± 6.7 ± 0.2 0.6 + 0.3
1.4 0.0 0.02
IA1 30.8 ± 62.5 ± 0.49 ± 5.0 ± 1.0 0.5 ± 0.0
3.9 0.9 0.07 A7 27.4 ± 60.5 ± 0.45 ± 3.4 ± 1.4 0.2 ± 0.1
5.2 7.3 0.06
H7 25.3 ± 55.2 ± 0.45 ± 3.6 ± 1.7 0.4 + 0.0
7.8 7.3 0.01
IA12 29.4 ± 63.2 ± 0.47 ± 5.0 ± 0.7 0.3 ± 0.0
0.8 0.7 0.00
IIC12 25.1 ± 56.0 ± 0.45 ± 2.0 ± 1.0 0.7 ± 0.4
2.7 7.1 0.10
IIIA1 37.1 ± 60.9 ± 0.46 ± 1.9 ± 0.2 0.9 ± 0.4
3.3 0.9 0.07
IIIA3 30.5 ± 57.6 ± 0.50 ± 2.4 ± 1.5 0.8 ± 0.0
0.4 5.5 0.00
Adicionalmente, en la Figura 4 se muestra como la concentración de 2,3-butanodiol alcanzada para la cepa IA1 y la cepa IIIA3, obtenidas ambas por mutagénesis al azar inducida con EMS, y posterior selección en placas de bromato/bromuro según la presente invención son superiores al resto de las cepas probadas.
En concreto, los mutantes IA1 y IIIA3 generaron concentraciones de 2,3-butanodiol en torno a 30 g/L y rendimientos entorno al 50%. El resto de cepas ensayadas produjeron alrededor de 30% más 2,3-butanodiol que la cepa silvestre.
En conclusión, cepas mutantes de R. planticola CECT843 obtenidas por mutagénesis al azar inducida con EMS y posterior selección en placas de bromato/bromuro tienen capacidad industrial para la producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol. Preferentemente, las cepas mutantes IA1 (CECT8158) y IIIA3 (CECT8 59) muestran tener una mayor viabilidad industrial a los efectos de la presente invención.
II. Selección de condiciones óptimas del proceso de fermentación para la producción de 2,3-butanodiol
Para identificar las condiciones óptimas de la transformación de glicerol en 2,3- butanodiol utilizando las cepas de R. planticola de la presente invención se realizó un análisis de la influencia de las variables temperatura (T), concentración inicial de glicerol ([Gly)] y concentración inicial de cobalto ([Co2+]), el consumo de la fuente de carbono (glicerol) y el crecimiento de la biomasa en el proceso de transformación a 2,3-butanodiol. Para ello se empleó un diseño factorial de experimentos.
Se definieron como funciones a maximizar como objetivo del diseño factorial el rendimiento real (Yi), calculado como muestra la ecuación [1], el consumo de glicerol (Y2), definido en la ecuación [2] y la densidad óptica, dado que es proporcional a la cantidad de biomasa (Y3).
_ [2,3 - BD ]
[Gfy [1 ]
[Gly ] [Gly ]
[Gly ] [2]
[Gly ] Los ensayos se llevaron a cabo en un micro-reactor, en el medio de cultivo de fermentación denominado medio MB (Nakashimada et al., 1998), con los cambios en la concentración de glicerol (concentración de glicerol 60, 75 y 90 g/L) y sal de cobalto requeridos (0.012, 0.024 y 0.036 g/L de CoCI2) y en las condiciones que se indican en la Tabla 5. La cantidad de oxígeno disuelto se fijó al 5%. Se utilizaron 3 mL como volumen de cultivo.
Tabla 5. Diseño de experimentos
Factor A B C D A B C
Experimento T (°C) % 02 [Glicerol] [C0CI2] T (°C) [Glicerol] [Cocy
g/L g/L g/L g/L
E1 28 5 75 0.035 1 2 3
E2 30 5 60 0.012 2 1 1
E3 33 5 90 0.024 3 3 2
E4 28 5 90 0.012 1 3 1
E5 30 5 75 0.024 2 2 2
E6 33 5 60 0.036 3 1 3
E7 28 5 60 0.024 1 1 2
E8 30 5 90 0.036 2 3 3 E9 33 5 75 0.012 3 2 1
En la Tabla 6 se recogen los resultados obtenidos en cada uno de los experimentos planteados en la Tabla 5. Mediante análisis estadístico de la variabilidad asociada a cada factor, se determinó que la concentración de glicerol, la temperatura y la concentración de sales de cobalto tenían influencia significativa en las funciones objetivo.
Tabla 6. Resultados experimentales
Figure imgf000022_0001
Los niveles óptimos para cada factor se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7. Niveles óptimos de cada factor.
Variable Yi Y2 Y3
T(°C) 33 33 30
[ ] Gli (g/L) 60 60 75
[ ] Co (g/L 0.036 0.036 0.024 Del análisis de resultados obtenidos en este apartado también se concluyó que las condiciones viables y óptimas de la reacción de fermentación del procedimiento de obtención de 2,3-butanodiol son las siguientes:
Ta de reacción: entre 28 y 37°C, preferiblemente, 33°C. - Presencia de sales de cobalto, como por ejemplo CoCI2: entre 0.012 y
0.050 g/L, preferiblemente 0.036 g/L.
Presencia de glicerol en el medio de cultivo: entre 10 y 90 g/L, preferiblemente 60 g/L. pH entre 7.5 y 5.5, preferiblemente 6.8 y sin controlar durante la fermentación.
Además de glicerol, en el medio de cultivo pueden adicionarse otras fuentes de carbono, como por ejemplo extracto de levadura rico en vitaminas y aminoácidos, en cantidades entre 0.5-8 y, preferiblemente 5 g/L.
El medio de cultivo podrá contener asimismo otras fuentes de nitrógeno ya sean inorgánicas como por ejemplo, sulfato de amonio, u orgánicas complejas, tales como extracto de levadura, peptona, triptona, corn steep liquor, urea o glutamato.
En cuanto al tiempo de reacción éste se estima entre 12 y 48 horas, preferiblemente, 30 horas.
La concentración de oxígeno disuelto en el medio con respecto a la concentración de saturación se estima entorno a 0%-20%, preferiblemente 5%.
El proceso de fermentación de la presente invención se puede llevar a cabo de forma discontinua, en discontinuo alimentado {fed-batch) o en modo discontinuo, tanto con con células libres como inmovilizadas, en bioreactores de Applikon, Braun Biotech o de características similares, de 1 a 5 litros, y escalas superiores, en los cuales se determina como una agitación apropiada a los efectos de la presente invención, entre 200 y 700, preferiblemente 500 rpm.
III. Separación del producto 2,3-butanodiol obtenido en la fermentación Tal y como se ha comentado con anterioridad, el 2,3-butanodiol formado en el proceso de fermentación utilizando las nuevas cepas de R. planticoia cepas CECT8158 y CECT8159 de la presente invención, se separa a partir del sobrenadante del cultivo por procedimientos habitualmente utilizados. En la separación del 2,3-butanodiol del caldo de cultivo, la separación de la biomasa y otros sólidos del caldo de fermentación se puede llevar a cabo mediante filtración o centrifugación. Para la purificación posterior del 2,3-butanodiol se pueden emplear diversas técnicas tales como extracción con vapor (steam stripping), extracción con vapor en contracorriente, extracción con disolventes, extracción reactiva, extracción repulsiva, osmosis inversa y pervaporación (Xiu & Zeng, 2008).
En la extracción líquido-líquido se pueden emplear disolventes tales como etil acetato, tributilfosfato, dietil éter, n-butanol, dodecanol y oleil alcohol. Como paso previo, se ha de eliminar el agua mediante evaporación y mediante microfiltración y osmosis inversa. Para la extracción acuosa en dos fases se pueden emplear sistemas PEG/dextrano.
La extracción repulsiva o precipitación por cristalización requiere eliminar previamente el agua del caldo de reacción. Se ha conseguido la extracción de 2,3-BD empleando KCI o K2C03
En la extracción reactiva, el 2,3-BD puede reaccionar con formaldehído para producir un metil acetal bajo catálisis ácida. El metil acetal de 2,3-butanodiol se recoge como un aceite en la fase superior y para su recuperación se hace reaccionar con metanol para formar 2,3-BD y metilal. El metilal o dimetoximetano se hidroliza a su vez a metanol y formaldehido.
La pervaporación o destilación con membranas a vacío consigue concentrar grandes cantidades del compuesto con el empleo de membranas microporosas de politetrafluoroetileno (PTFE).
EJEMPLO 1
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticoia silvestre: selección de las condiciones óptimas de operación con un medio de cultivo simple Se determinaron las condiciones de operación óptimas con un medio de cultivo simple (medio C, MC) conveniente para trabajar en escalas superiores de fermentación para la producción de 2,3-butanodiol empleando la cepa silvestre CECT843 de R. planticola a partir de glicerol puro como fuente de carbono. El medio MC está compuesto por litro: 2 g de NH CI, 6 g de KH2P04i 12 g de Na2HP04, 1 g de NaCI, 246 mg de MgSCy7H20, 14.7 g de CaCI2-2H20 14.7 g/L.
Se realizó un diseño de experimentos que contempló los siguientes factores:
Temperatura: el intervalo estudiado fue 26 a 35° C.
Tipo de medio de cultivo: los ensayos se realizaron en dos medios sintéticos medio A y C.
Concentración de extracto de levadura: el intervalo estudiado fue 0.5 a 1.5 g/L
Adición de ácido cítrico y/o acético: se observó la influencia de la adición de uno u otro ácido orgánico en concentración 0.42 g/L o bien la mezcla de ambos (en concentración 0.21 g/L), comparando con el resultado obtenido en un experimento control.
Los experimentos se llevaron a cabo en modo batch, en botellas de 50 mL con 0 mL del medio de cultivo correspondiente. La concentración inicial de glicerol fue 30 g/L. La agitación se fijó en todos los experimentos en 175 rpm. El pH inicial del medio fue 7 y evolucionó libremente durante el transcurso de la fermentación, disminuyendo hasta valores cercanos a 5.
Del análisis de los resultados obtenidos en el diseño experimental, se determinó que las condiciones que optimizan la producción de 2,3-butanodiol para cada factor en el medio de cultivo ensayado son las siguientes: - Temperatura 28° C
Medio C
Concentración de extracto de levadura: 1.5 g/L
Adición de 0.42 g/L de ácido cítrico.
Los resultados obtenidos para las condiciones óptimas se muestran en la Tabla 8, en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]con; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es el rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max.
Tabla 8. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa R. planticola CECT843 con glicerol puro.
Figure imgf000026_0001
El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotómetro. La concentración de sustrato y metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución en un equipo Agilent Technologies serie 1 100 con detector de Diodo de Array (medida realizada a 276 nm) y un detector de índice de Refracción. La columna empleada fue la Rezex ROA Organic Acid. La fase móvil empleada fue una disolución diluida de ácido sulfúrico (concentración del ácido 0.005 N), cuyo flujo se fijó a 0.5 mL/min. La cuantificación de los compuestos se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
EJEMPLO 2
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticola CECT8158 (mutante IA1 ) en medio MC.
Para evaluar la capacidad productora de 2,3-butanodiol en medio sintético MC de la cepa mutante R. planticola CECT8158, se llevó a cabo un experimento en modo batch a nivel de incubadora orbital, en botellas de 50 mL con 10 mL de medio de cultivo.
Se emplearon las condiciones optimizadas para la cepa silvestre CECT843 y el medio sintético MC modificado, cuya concentración inicial de glicerol puro fue 60 g/L. Las condiciones de fermentación se fijaron en: temperatura 28° C; agitación 175 rpm. El pH inicial del medio fue 7 y evolucionó libremente durante el transcurso de la fermentación, disminuyendo hasta valores cercanos a 5.
Los resultados se muestran en la Tabla 9, en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]con; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es el rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max.
Tabla 9. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa R. planticola mutante IA1 en medio MC.
Figure imgf000027_0001
El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotometro. La concentración de sustrato y metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución en un equipo Agilent Technologies serie 1 100 con detector de Diodo de Array (medida realizada a 276 nm) y un detector de índice de Refracción. La columna empleada fue Rezex ROA Organic Acid. La fase móvil empleada fue una disolución diluida de ácido sulfúrico (concentración del ácido 0.005 N), cuyo flujo se mantuvo 0.5 mL/min. La cuantificación de los compuestos se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos. EJEMPLO 3
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticola CECT8159 (IIIA3) en medio MC
Para evaluar la capacidad productora de 2,3-butanodiol en medio sintético de la cepa mutante R. planticola IIIA3, se llevó a cabo un experimento en modo batch en botellas de 50 mL con 10 mL de medio de cultivo.
Se emplearon las condiciones optimizadas para la cepa silvestre y el medio sintético MC modificado, cuya concentración inicial de glicerol puro fue 60 g/L. Las condiciones de fermentación se fijaron en: temperatura 28° C; agitación 175 rpm. El pH inicial del medio fue 7 y evolucionó libremente durante el transcurso de la fermentación, disminuyendo hasta valores cercanos a 5.
Los resultados se muestran en la Tabla 10, en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]con; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max.
Tabla 10. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa R. planticola CECT8159 medio MC
Figure imgf000028_0001
El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotómetro. La concentración de sustrato y metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución en un equipo Agilent Technologies serie 1 100 con detector de Diodo de Array (medida realizada a 276 nm) y un detector de índice de Refracción. La columna empleada es Rezex ROA Organic Acid. La fase móvil empleada es una disolución diluida de ácido sulfúrico (concentración del ácido 0.005 N), cuyo flujo es 0.5 mL/min. La cuantificacíón de los compuestos se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
EJEMPLO 4
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticola cepa silvestre CECT 843 en biorreactor a escala de 1 litro.
Se llevó a cabo un ensayo en modo batch en un termentador Applikon de 1 litro de volumen de fermentación con la cepa silvestre CECT 843. Se emplearon las condiciones descritas como óptimas para el medio MB con glicerol a una concentración inicial de 60 g/L. Las condiciones de fermentación se fijaron a 33°C, 500 rpm y 5% de oxígeno disuelto. El pH inicial del medio fue de 6.8, y no se controló durante el experimento, de manera que el pH bajase libremente.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 1 , en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]COn; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es el rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max. Tabla 11. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa silvestre CECT 843 en termentador de 1 L.
Figure imgf000029_0001
El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotometro. La concentración del sustrato y de los metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía liquida en un equipo Waters 1525/2695 con detector de índice de refracción diferencial y columna Rezex ROA Organic Acid, con H2S04 a 2.5 mM y flujo de 0.5 mL/min. La cuantificación se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
EJEMPLO 5
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticola cepa CECT8158 (mutante IA1 ) en biorreactor a escala de 1 litro. Se llevó a cabo un ensayo en modo batch en un fermentador Applikon de 1 litro de volumen de fermentación con la cepa mutante IA1. Se emplearon las condiciones descritas como óptimas para la cepa silvestre y el medio MB con glicerol a una concentración inicial de 60 g/L. Las condiciones de fermentación se fijaron a 33°C, 500 rpm y 5% de oxígeno disuelto. El pH inicial del medio fue de 6.8, y no se controló durante el experimento, de manera que el pH bajase libremente.
Los resultados se muestran en la Tabla 12, en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]con; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es el rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max. Tabla 12. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa IA1 en fermentador de 1 L.
[BD]max [GlicerolJcon η (g/g) [Acetoina]max [EtOH]max
33.6 61.8 0.54 4.3 0.5 El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotómetro. La concentración del sustrato y de los metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida en un equipo Waters 1525/2695 con detector de índice de refracción diferencial y columna Rezex ROA Organic Acid, con H2S04 a 2.5 mM y flujo de 0.5 mL/min. La cuantificación se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
EJEMPLO 6
Producción de 2,3-butanodiol a partir de glicerol con R. planticola cepa CECT8159 (imitante IIIA3) en biorreactor a escala de 1 litro.
Se llevó a cabo un ensayo en modo batch en un fermentador Applikon de 1 litro de volumen de fermentación con la cepa muíante IIIA3. Se emplearon las condiciones descritas como óptimas para la cepa silvestre CECT843 y el medio MB con glicerol a una concentración inicial de 60 g/L. Las condiciones de fermentación se fijaron a 33°C, 500 rpm y 5% de oxígeno disuelto. El pH inicial del medio fue de 6.8, y no se controló durante el experimento, de manera que el pH bajase libremente.
Los resultados se muestran en la Tabla 13, en la cual, se ilustran los valores obtenidos para el glicerol consumido en g/L, [glicerol]∞n; concentración de 2,3-butanodiol producida, [BD]max; máxima concentración de acetoina producida [acetoina]max; η es el rendimiento en g/g; máxima concentración de etanol producido, [EtOH]max.
Tabla 12. Producción de 2,3-butanodiol por la cepa IIIA3 en fermentador de 1 L.
Figure imgf000030_0001
El crecimiento del cultivo se determinó mediante medidas de absorbancia a 600 nm en espectrofotómetro. La concentración del sustrato y de los metabolitos producidos se cuantificó mediante cromatografía líquida en un equipo Waters 1525/2695 con detector de índice de refracción diferencial y columna Rezex ROA Organic Acid, con H2S04 a 2.5 mM y flujo de 0.5 mL/min. La cuantificación se realizó mediante comparación con curvas patrón de los productos.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepas mutantes de la especie Raoultella planticola con capacidad productora de 2,3-butanodiol a partir de glicerol obtenidas por mutagénesis inducida al azar de la cepa de Raoultella planticola CECT843 y posterior selección en placas de bromato/bromuro de mutantes con mejoras en la capacidad de producción de 2,3-butanodiol.
2. Cepas mutantes de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionadas del grupo que consiste en las cepas de R. planticola, con número de acceso: CECT8158 y CECT8159, depositadas en la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT), en fechal 2/06/2012.
3. Método con viabilidad industrial para la transformación biotecnológica de glicerol a 2,3-butanodiol que comprende las siguientes etapas:
a) fermentación aeróbica de las cepas según las reivindicaciones anteriores en un medio que comprende una solución acuosa de glicerol en condiciones adecuadas para producir 2,3-butanodiol; y
b) separación del 2,3-butanodiol producido del medio de reacción.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la solución acuosa de glicerol contiene al menos un 3% en peso de glicerol.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la solución acuosa de glicerol contiene al menos un 6% en peso de glicerol.
6. Método de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque la temperatura de reacción de la etapa de fermentación a), es de 28°C - 37°C.
7. Método de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque el tiempo de reacción de la etapa de fermentación a), es de 12 a 48 horas.
8. Método de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el pH de reacción de la etapa de fermentación a), es de 7.5 a 5.5.
9. Método de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque la separación del 2,3-butanodiol en la etapa b) se lleva a cabo por filtración o centrifugación y posterior extracción.
10. Método de obtención de cepas mutantes de la especie R. planticola según reivindicadas en la reivindicación 1 , que comprende mutagénesis inducida al azar de la cepa de R. planticola CECT843 y posterior selección en placas de bromato/bromuro de mutantes con mejoras en la capacidad de producción de 2,3-butanodiol.
1 1. Método de acuerdo con la reivindicación 10 caracterizado porque la etapa de mutagénesis inducida al azar se realiza mediante un mutágeno químico o radiación UV.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la etapa de mutagénesis al azar con mutágeno químico se realiza a través de la incubación de la cepa R. planticola CECT 843 en un medio de cultivo con 30 g/L de glicerol y 10μΙ_ΛηΙ_ de etil metano sulfonato, (EMS) durante 1 hora a 30°C.
13. Método de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la posterior selección de cepas mutantes se realiza a través de la siembra e incubación de las colonias resultantes de la etapa de mutagénesis en placas de selección con 100mM NaBr y 100mM de NaBr03 durante 2 a 3 días a pH 6.
14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque en la selección de cepas mutantes se descartan las colonias que disminuyen el pH del medio por debajo de 6.4.
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