WO2013039112A1

WO2013039112A1 - 二次元培養細胞を三次元培養又は生体内と同様に活性化する方法及びその利用

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Publication number: WO2013039112A1
Application number: PCT/JP2012/073347
Authority: WO
Inventors: 俊博小名
Original assignee: 国立大学法人九州大学
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2013-03-21
Also published as: JPWO2013039112A1

Abstract

　抗がん剤の評価に際しては、従来法では比較的長い判定期間を必要とするという問題がある。実際には三次元培養することなく、非分裂条件下で三次元培養（又は生体内）と同等に活性化することができれば、少なくとも三次元培養のための期間は不要となり、迅速かつ簡便に対象物質を評価しうる。また、そのような三次元培養の模倣方法は、抗がん剤の評価のみならず、種々の刺激の生理活性の評価・判定への応用が期待できる。　基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；活性化した細胞へ刺激を供与する工程；及び刺激を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した刺激を評価する方法。

Description

二次元培養細胞を三次元培養又は生体内と同様に活性化する方法及びその利用

　本発明は、細胞を用いた評価方法（セルベースアッセイ）に関する。本発明は、医薬候補化合物等のハイスループットスクリーニングのために用いることができる。本発明は、患者の薬剤感受性試験に用いることができる。本発明は、創薬（特に抗がん剤）、機能性食品、又は機能性化粧品の研究開発のために有用である。本発明は、患者の投与薬剤の決定のために有用である。

　抗がん剤感受性試験や腫瘍の基礎研究、また腫瘍に限らず毒性を含む各種の生体反応の研究並びに試験などにおいて、ヒトの細胞を用いて評価を行うセルベースアッセイが良く用いられる。セルベースアッセイは、典型的には、ヒト細胞を培養器で単層培養し、評価対象物質を加えて一定時間経過後、生存細胞数をカウントすることにより行われる。このような方法は、低コストであり、簡便であることから頻繁に用いられるが、間質細胞等の細胞が取り除かれ、成体とは異なる特殊な環境下で行われ、かつ細胞は単層状に増殖しており、三次元構造を採ってはいない。

　単層培養に関しては、本来の組織特異的な遺伝子発現の消失、細胞周期、代謝、及び巨大分子の変換に関わる遺伝子発現の上昇、並びに成長や細胞接着に関わる遺伝子発現の抑制や細胞間のシグナル伝達の欠如などが報告されている（非特許文献1～6）。このため、単層培養を用いては、現実に生体内ではあり得ない検討がなされていることが多い（非特許文献7）。例えば、抗がん剤は、生体内の血液中濃度（生理的濃度）の10～100倍でないと効果が判定できない（非特許文献8及び9）。したがって、生体内では優れた抗がん作用を発揮しうる薬剤について低い評価しか得られず、臨床応用に結び付かないという問題が生じている（非特許文献10）。

　薬剤の評価にあたっては、生体内に近い微小環境を維持している系を用いることが望ましいが、系の維持の問題等がある。そこで、In vitroにおいて細胞を三次元培養し、生体内に近い構造を再構築した系が検討されつつある。

　三次元培養には、1）自発的細胞凝集である多細胞も含めたスフェロイド培養、2）細胞外基質成分包埋培養（特許文献1～3）、3）多孔質足場（スキャホールド）培養などがある（非特許文献11～14）。単純なスフェロイド培養では、微小環境の一部しか再現できないため、スフェロイドを細胞外基質成分で包埋する細胞外基質成分包埋培養も開発されている。細胞外基質成分としてはコラーゲンが良く用いられ、抗がん剤の場合では臨床結果との相関も高い（非特許文献15～18）。しかしながら、細胞を三次元培養し、試験に供するまでには通常、数日～14日もかかることから、三次元培養する限り、ハイスループット化する際にこの点が問題になることが指摘されている（非特許文献19及び20）。これに加え、標準的な三次元培養による抗がん剤感受性試験として、CD-DST（Collagen Gel Droplet Embedded Culture Drug Sensitivity Test）法が開発されているが、この方法でも、判定は薬剤を添加してから7日後～14日後に行われることが多い（前掲非特許文献10）。

　一方、装置による三次元培養細胞を用いた試験での判定及び予測は、主にイメージングの手法により行われている。装置としては、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、二光子（多光子）顕微鏡、核磁気共鳴（NMR）顕微鏡、光干渉断層法（OCT）、ポジトロン断層法（PET）などが用いられる（非特許文献21～25）。また、細胞外に排出される酸素濃度をモニターした走査電気化学顕微鏡を用いた方法、インピーダンスによる細胞直径の測定（非特許文献26）、マイクロキャビティーアレイ上でのインピーダンスのリアルタイム測定（非特許文献27）、が報告されている。

　しかしながら、すべての方法が、少なくとも7日間か、又はこの半分程度の判定期間を要し、判定までの間には、培地の定期的な交換等の手技が必要で、煩雑であり、自動化することも困難である（前掲非特許文献10）。このため、各種薬剤試験のハイスループットスクリーニング方法としては、広く用いられていない（前掲非特許文献10）。

　他方、本発明者らは、表面プラズモン共鳴装置を用いて、抗がん物質のスクリーニングや、ミトコンドリアの分極状態をモニタリングする方法を検討してきた（特許文献4～6）。

WO95/18216（特許第2879978号）特開2003-9853 特開2008-11797 特開2005-85089 WO2007/069692 特開2009-122016

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　抗がん剤の評価に際しては、従来法では比較的長い判定期間を必要とするという問題がある。実際には三次元培養することなく、非分裂条件下で三次元培養（又は生体内）と同等に活性化することができれば、少なくとも三次元培養のための期間は不要となり、迅速かつ簡便に対象物質を評価しうる。また、そのような三次元培養の模倣方法は、抗がん剤の評価のみならず、種々の刺激の生理活性の評価・判定への応用が期待できる。

　本発明は以下を提供する：
［1］　基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；
　活性化した細胞へ刺激を供与する工程；及び
　刺激を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程
を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した刺激を評価する方法。
［2］　細胞の変化を検出する工程が、細胞非分裂条件下で、表面プラズモン共鳴装置を用い、細胞及び／又はミトコンドリアの分極状態の変化、又は細胞及び／又はミトコンドリアの誘電率の変化に起因する表面プラズモン共鳴角の変化を測定することにより実施される、［1］に記載の方法。
［3］　細胞ががん細胞であり、刺激を供与する工程が、一又は二以上の抗がん剤を供与することにより行われる、抗がん剤の薬効を評価するための、［2］に記載の方法。
［4］　基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；
　活性化した細胞へ試験化合物を供与する工程；及び
　試験化合物を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程
を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した試験化合物を抗がん剤候補化合物として選択する、抗がん剤候補化合物のスクリーニングのための方法。
［5］　基板に維持した単層状の動物細胞の一部を、細胞外基質成分を含む組成物で覆うことにより、細胞の外来刺激に対する感受性を高める、方法。
［6］　基板に維持した単層状の動物細胞の一部を、細胞外基質成分を含む組成物で覆うことによる、三次元培養環境を模倣する方法。

　本発明の方法によれば、基板に維持した単層状の動物細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆うことにより、非分裂条件下で三次元培養（又は生体内）と同等に活性化することができる。

　上述の三次元培養を模倣した系を、細胞の変化を迅速に検出するための測定方法、例えばSPR装置によるミトコンドリアの分極状態の変化を検出する方法と組み合わせることにより、従来の試験法に比べて、下記のような利点がある：
(1)　従来法が10⁵～10⁶程度の細胞を必要とするのに対し、少量の細胞、例えば1000個程度の細胞で実施しうる。
(2)　物質投与後、1時間以内に判定しうる。
(3)　生理的濃度で実施しうる。

　本発明は、物質のスクリーニングを目的として実施できるのみならず、投薬前の効果予測を目的としても、有用であろう。

図1は、本発明の一態様の模式図である。図2は、CD-DST法による細胞生存率の測定結果を示したグラフである。図3は、高精度表面プラズモン共鳴装置（HP-SPR）を用い、本発明の三次元培養模倣法測定結果を示したグラフである。図4は、CD-DST法による細胞生存率とHP-SPRシグナルの変化率との相関を示したグラフである。図5は、高精度表面プラズモン共鳴装置（HP-SPR）を用い、本発明の三次元培養模倣法測定結果を、二次元培養状態と比較して示したグラフである。

　本発明の細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した刺激を評価する方法は、
（1）基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；
（2）活性化した細胞へ刺激を供与する工程；及び
（3）刺激を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程
を含む。

　（1）細胞を活性化する工程：
　本発明においては、基板上に動物細胞が維持される。

　本発明で「細胞」というときは、特に記載した場合を除き、生細胞を意味する。

　本発明には、目的に応じ、種々の細胞を用いることができる。用いることのできる細胞の例は、正常細胞、がん細胞、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＳ細胞に由来する分化細胞、間葉系幹細胞（脂肪幹細胞、血液幹細胞）、組織分化能を有する未分化細胞、多分化機能を保持する細胞などであってもよい。また、これらの培養細胞であってもよい。

　後述するように、細胞維持方法とSPR装置とを組み合わせた態様では、細胞はセンサー基板に接触していることは必要であるが、接着していることまでは要しない。したがって、この態様においても、細胞として、接着性のもののみならず、非接着性（浮遊性）のものも用いることができる。

　本発明において細胞の培養形態に関し「単層状」というときは、特に記載した場合を除き、細胞が、複層状又は三次元状でなくてもよいことを意味する。基板上に「単層状」に維持された細胞は、連なった層を形成していることを要さず、また、基板上でコンフルエントな状態であることも要さない。

　細胞は、通常のセルベースアッセイと同様、対数増殖期にあるものを用いることが好ましい場合がある。当業者であれば、前培養を行う等して、細胞を適切な状態とすることができる。

　本発明で「非分裂条件下で」というときは、特に記載した場合を除き、刺激を供与した後に刺激に応じて生じる細胞の変化が、細胞が分裂する際に生じうる元来の細胞の変化により検出不能とならないような条件下での実施を意味し、典型的には、細胞周期のうちで核分裂から細胞質分裂までの分裂期（M期）を避けた時期の実施を意味する。一般に動物細胞は、ある程度の大きさになると、成長を止めるか分裂をする。神経、骨格筋、赤血球などの細胞は、一度、成熟すると通常分裂しない。分裂から次の分裂までを細胞周期（cell cycle）と呼び、それを一回行うのにかかる時間を世代時間という。世代時間は、細胞の種類によって元来異なっており、また細胞の置かれる環境によっても異なる場合がある。当業者であれば、用いる細胞に応じた世代時間を考慮し、また後述する活性化の際の条件（例えば、細胞を覆う組成物の組成）を適切に設計することにより、非分裂条件を適宜定めることができる。

　細胞は、適切な密度となるように、例えば0.5～5×10⁶cells/mlとなるように、培地や緩衝液に細胞を懸濁される。そして懸濁液を基板へ播種され、必要であれば、基板ごと恒温・恒湿の培養装置内で、数分間～半日程度インキュベートすることにより、基板に接触したまま維持される。

　基板は、用いる細胞を維持できる表面を備えていれば、その材料や構造は限定されないが、測定装置によって、制約を受ける場合がある。場合により、例えば、ガラス基板、プラスチックス薄片、いわゆるカバースリップあるいはセルディスクと呼ばれるような培養プレートを用いることもできる。基板の表面は、平滑な平面とすることができるが、播種する細胞懸濁液の滴の拡がりを抑制するために、細胞培養上許容される素材で枠を設置することができ、また突起を設けたり、溝からなる画線を設けたりしておくこともできる。

　本発明においては、基板に維持された細胞は、細胞外基質を含む組成物で覆われる。組成物は、少なくとも細胞外基質成分と細胞培養上許容される一又はそれ以上の成分とを含む。組成物はまた、含有成分を水に溶解又は分散させたものであり、その形態は、溶液状又はゲル状であり得る。

　本発明において組成物は、細胞外基質成分を含む。本発明において「細胞外基質成分」というときは、特に記載した場合を除き、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、インテグリン、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸等のムコ多糖類を主成分とするタンパク質多糖類（プロテオグリカン）、ポリ-D-リジン、及びポリ-L-リジン等に代表される、生体組織内にある細胞の間を満たしている物質、又はそれと同様の働きを有する物質をいう。細胞外基質は、細胞間基質と表現されることもある。本発明には、細胞外基質成分として、複数の物質の混合物を用いてもよい。

　組成物による被覆は、溶解した細胞外基質を含む液を、基板に維持された細胞に供与し、そして、必要に応じゲル化させることにより行うことができる。細胞への組成物の供与の際、必要に応じ、細胞の周囲にある培地を除去してもよい。

　本発明の好ましい態様においては、細胞外基質を含む組成物の状態は、ゲルである。ゲルは、細胞外基質成分等を含有する液を調製し、ゲル化させることにより形成することができ、典型的には、ゲル化する条件の液を使用直前に調製し、細胞に供与した後、必要に応じゲル化が進行するための環境に置くか、又はそのまま置くことにより、ゲル化を進行させることができる。細胞培養に関連した培地等のゲル化のための手段は、当業者にはよく知られており、本発明にも適用可能である。

　本発明に用いられる細胞外基質成分の典型例は、コラーゲンである。細胞培養のためのコラーゲンを含むゲル（コラーゲンゲル）の調製方法は、当業者によく知られているが、本発明にも、従来法（例えば、前掲特許文献1～3）を応用することができる。

　コラーゲンゲルは、コラーゲン溶液から調製する。コラーゲン溶液は、従来の細胞包埋培養方法等で使用されている市販のコラーゲンを用いることができる。コラーゲンとして、酸可溶性タイプIコラーゲンを用いることができる。

　コラーゲン溶液には、コラーゲン以外にも、培養に必要な各種成分例えば、培地成分、栄養成分、抗生物質、カルシウム、リン酸カルシウムなどの無機塩類、脂質、糖質、蛋白質を添加してもよい。コラーゲン溶液は、用いる細胞の生理的条件と同一又は近似した環境pHを提供し得る緩衝液の組成を含んでいてもよい。例えば、がん細胞を用いる場合、コラーゲン溶液は、pH 6.2～7.6、好ましくはpH 6.8～7.4に保つことができる緩衝能を有することが好ましい。

　生理的条件に合わせて、コラーゲン溶液の塩濃度を調節することもできる。塩強度は、100～180mmolに設定しておくのが好ましく、140～160mmolがより好ましい。

　コラーゲン溶液のコラーゲン濃度や粘度は、当業者であれば適宜設定できる。従来の包埋法の場合と同様の濃度・粘度とすることもできるが、本発明においては、基板に維持された細胞の上にコラーゲン溶液を積層し、ゲルを形成させることができればよく、したがって、包埋法より、より低い濃度・粘度でも実施可能であろう。

　典型的には、コラーゲン濃度（細胞へ供与する際の終濃度）は、～2.0重量％とすることができる。これより濃度が高すぎると粘度が高く、扱いづらく、また細胞の活性に影響を与えるかもしれない。

　コラーゲン溶液は、基板に維持された細胞の一部を覆うように供与される。本発明でコラーゲン溶液又はコラーゲンゲルに関し、細胞の「一部分」を覆う、というときは、特に記載した場合を除き、細胞全体がコラーゲン溶液又はコラーゲンで覆われていないことを意味する。本発明においては、細胞は基板に維持されており、細胞の一部は基板に接触している。そのため細胞は、典型的には、基板に接触している部分以外が、コラーゲン溶液又はゲルで覆われることとなる。

　細胞に対して供与されるコラーゲンゲル溶液の量は、当業者であれば適宜設計できる。コラーゲン溶液に対する細胞の密度は、典型的には、10³～10⁶cells／mlとなるように、供与することができる。

　コラーゲン溶液の、基板に維持された細胞の上への供与は、コラーゲン溶液の容器から直接に滴状にたらしたり、スポイドなどの器具を用いたりして行うことができる。表面張力などの作用で、基板上でコラーゲン溶液が水滴状又はドーム状の滴となることがある。場合により、基板上には一定の範囲を囲む枠や画線が設けられており、その内側に細胞が維持されているので、コラーゲンゲル溶液も、その枠内・画線内に供与する。

　当業者にはよく知られた手段により適切な成分比で調製されたコラーゲン溶液からは、通常、時間の経過とともにゲル化する。

　従来、顕微鏡観察や画像解析に用いるコラーゲンゲルは、透明度の高いものが必要であったが、この発明の方法では、透明度の低いものでも使用できる。

　形成されたコラーゲンゲルは、評価のための測定が終了するまでは、ゲル状態を維持させておく必要がある。場合により、コラーゲンゲルが過度に乾燥しないように、培地等にゲルを含浸した状態に保っておいてもよい。

　細胞を培養するための培地、及び場合によりコラーゲン溶液に包含される培地としては、血清を含む血清培地、及び血清を含まない無血清培地のいずれかを、当業者であれば目的に応じ、適宜選択して使用することができる。

　用いることのできる血清の例として、FBS（牛胎児血清）、FCS（仔牛血清）、HS（馬血清）、又は非働化を行ったFBS等が好ましく挙げられるが、FBSがより好ましい。無血清培養液とは、通常の細胞培養に用いられる培養液が、その成分として血清を含むのに対し、血清を含有していないことに特徴があり、培養に必要な、血清以外の各種化学物質を組み合わせて構成される。

　無血清培養液を用いることは、細胞の分裂を効果的に抑制することができ、コラーゲンゲルの収縮を防止することができる点で、好ましい場合がある。無血清培養液を用いた場合の、具体的な配合成分とその割合は、必要に応じて設定すればよいが、目的とする動物細胞（例えば、がん細胞など）の増殖性が良好で、その他の細胞の増殖を抑制するような配合が好ましい。

　本発明の細胞維持方法（単層状＋細胞外基質成分を含む組成物）によると、驚くべきことに、細胞を短時間、かつ細胞非分裂条件下で三次元培養の状態（Yamada & Cukierman Cell 130:601, 2007）にすることができる。すなわち、細胞の一部分を細胞外基質を含む組成物で覆うことにより、三次元に増殖させるための期間を要さず、単層状であるにもかかわらず、細胞を三次元に維持されているか又は生体内にあるのと同様の状態にすることができる。本発明で「活性化」というときは、特に記載した場合を除き、このように細胞を、三次元に維持されているか又は生体内にあるのと同様の状態にするとの意味で用いている。

　本発明は、細胞全体ではなく、一部分のみを細胞外基質成分を含む組成物で覆い、さらに、細胞を分裂させずに、つまり培養せずに、評価に用いる。これらの点において、本発明に係る細胞を三次元培養（又は生体内）と同等に活性化する原理は、細胞又は細胞塊全体がコラーゲンゲルで包埋され、培養される細胞外基質成分包埋法とは本質的に異なる。

　（2）活性化した細胞へ刺激を供与する工程：
　本発明においては、上述の細胞維持方法で維持されている細胞へ、種々の刺激を与える。

　本発明で「刺激」というときは、特に記載した場合を除き、細胞へ評価対象となる物質を供与する以外に、細胞に対して物理的な刺激を与える場合も含む。物理的な刺激とは、例えば、高い温度や低い温度、圧力、磁場、電流などがある（Chew SY, Low WC. J Biomed Mater Res A. 2011 97(3):355-74. Scaffold-based approach to direct stem cell neural and cardiovascular differentiation: an analysis of physical and biochemical effects.参照）。

　（3）刺激を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程：
　本発明によって提供される細胞維持方法においては、単層状態のまま、三次元状態の活性を細胞に発揮させている。本発明の方法を利用して、あらゆる細胞の変化を測定できる。本発明で「細胞の変化」というときは、特に記載した場合を除き、少なくとも細胞及び／又はミトコンドリアの分極状態の変化、細胞及び／又はミトコンドリアの誘電率の変化が含まれ、それ以外に遺伝子、タンパク、シグナル分子を含む代謝物等の増加又は減少等の種々の変化が含まれうる。すなわち、OMICS全般について、蛍光、発光などの標識により検出・評価が可能な変化、及びラマン分光などの非標識による検出・評価が可能な変化について、本発明の方法は適用可能であろう。

　本発明により提供される細胞維持方法は、細胞の変化を検出するための種々の測定方法と組み合わせることができる。

　本発明においては、単層状態でなければ測定できない測定法と組み合わせることもできる。以下に本発明の実施態様の例を示す。

　［表面プラズモン共鳴（SPR）装置との組み合わせ]
　本発明においては、既存の表面プラズモン共鳴装置を用いることができる。例えば、前掲特許文献1及び特許文献2に開示された装置を用いてもよい。このための具体的な手順は、本明細書の実施例を参考にすることができる。

　SPRでは、三次元に増殖した細胞を評価しようとすると、大部分がセンサー基板から遠く、原理的に測定が不可能である。そのため、二次元的にセンサー基板に接触させたままのまま、細胞の活性を三次元培養と同等にするしかない。本発明の細胞維持方法は、この目的によく合致している。

　この態様においては、表面プラズモン共鳴センサーからのシグナルを経時的に記録した場合のグラフの傾き（時間当たりの表面プラズモン共鳴角変化量、すなわち変化率）を利用して、刺激（一又は複数）がミトコンドリアの分極状態の変化に与える影響を定量化する目的でも用いることができる。この場合、表面プラズモン共鳴角の変化が、実質的にミトコンドリアの分極状態の変化にのみに起因する時間帯であって、検出した表面プラズモン共鳴角の変化が一定である時間帯、すなわち表面プラズモン共鳴センサーからのシグナルを経時的に記録した場合のグラフの傾きがほぼ直線である時間帯を特定して、その時間帯におけるグラフの傾きを利用することができる。このような特定した時間帯の長さは、少なくとも1分間、好ましくは3分間以上、より好ましくは5分間以上、さらに好ましくは10分間以上である。より正確な定量を目的とする場合は、その時間帯における表面プラズモン共鳴角の変化率が、該時間帯を含みそれより10%以上長い時間帯における表面プラズモン共鳴角の変化率の±10％以内であるような時間帯の変化率を利用するとよい。

　具体的には、35～40分の5分間の場合にはそれより10%以上長い時間、すなわち5分30秒間以上（例えば、30～45分の10分間）、35～45分の10分間の場合にはそれより10%以上長い時間、すなわち11分間以上（例えば、30～50分の15分間）の時間帯における変化率を算出しても、その変化率が、35～40分の5分間又は35～45分の10分間の時間帯における変化率に対し、それぞれ±10%以内に収まっている場合、その35～40分の5分間又は35～45分の10分間が選択可能となる。このように、従来の方法よりも短時間(1時間以内)で、生細胞内のミトコンドリアの分極状態の変化を検出できることが本発明の1つの特徴であるが、例えばpH変化速度が遅い場合等、ミトコンドリアの分極状態の変化が遅く検出されると考えられる場合には、本明細書中の記載を参照して、当業者であれば、適宜検出の時間帯を決定することが出来るであろう（前掲特許文献6）。

　測定のために時間をかけ過ぎると、細胞が分裂することによるシグナルの変化がノイズとなることがある。したがって、細胞が分裂しないうちに、また細胞分裂を抑えた条件で実施するとよい。細胞分裂の抑制は、例えば、細胞外基質成分を含む組成物中に包含させる培地の成分を抑えること、具体的には、無血清培地とすること、等によることができる。

　[エバネッセント照明を用いた蛍光法（例えば田和圭子: 表面科学 28, 724-727 (2007)、Steyer JA, Almers W. Biophys J. 76(4):2262-71 (1999)）との組み合わせ]
　本発明は、蛍光試薬（例えば、JC-1等）を用いる方法とエバネッセント照明とを用いた測定方法と組み合わせた態様として実施することができる。この場合の典型的な手順は、下記のとおりである。

　供試細胞は、前培養後、シャーレから剥離し、細胞濃度を完全培地中1×10⁶ cells/mLに調製し、その細胞懸濁液100μLを基板上に滴下し、37℃、CO₂5%濃度下にて一晩培養する。コラーゲンドロップキットのA液（Collagen Cellmatrix Type CD）、B液（10倍濃縮 F-12培地）、及びC液（再構成用緩衝液）を8：1：1の割合で混合したものを30 μL、細胞上全体に滴下し、再度37℃、CO₂5％、湿度95%下にて適宜静置する（静置する時間のことを静置時間と呼ぶ）。その後、センサーチップを、マッチングオイル（屈折率1.518）を介してHP-SPRセンサーのプリズム上に設置し、5 mLのEMEM （Minimum Essential Medium Eagle）（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）で満たし、カスタムメイドのHP-SPRにより測定を開始する（Kosaihira and Ona 2008; Nishijima et al. 2010）。この際、CO₂ 5％、37±0.1℃下にて行うことができる。なお、静置時間は、細胞分裂しない程度の短い時間に相当し、このHP-SPRシグナルの安定なトレンドを示すことにより決定することができる。より具体的には、静置時間は、12時間以内、6時間以内、または約3時間とすることができる。測定開始2～3分後、SPRシグナルが安定していることを確かめ、JC-1 iodideを2.5μM含むEMEM（最終濃度0.1%のDMSOを含む）と交換後、 20分間置き測定を行う。蛍光強度観察は、観察倍率630倍で行うことができる。ハロゲンランプのSPR光源を励起フィルターにより485±20 nmを透過し、蛍光検出には515～565 nm透過のフィルターセット、ならびに575～640 nm透過のフィルターセットを用いることができる。測定開始10分後、EMEMを除き、抗がん剤を含む培地と交換し、測定を続ける。controlはDMSOを0.1%（v/v）を含む培地を用いる。

　[表面増強ラマン分光法（例えばUnited States Patent Application 20090118605、Downes, A.; Elfick, A. Sensors 10, 1871-1889 (2010)）]
　本発明の方法においては、ミトコンドリアの分極状態のモニタリングに関し、ラマン分光法と組み合わせて実施することができる。この場合の典型的な手順は、下記のとおりである。

　ガラス基板として、MATSUNAMI製MICRO COVER GLASS 18×18 mm（Thickness No.1 0.12-0.17 mm）を用いる。金蒸着はイオンコーターJFC-1100（JEOL製）を用いる。ガラス基板への蒸着は、カバーガラスをターゲットから2 cm離れた高さ7cmの位置に設置し、蒸着時間30分、電圧5.5 mA、電流値1.2 kVで行う。供試細胞は、前培養後、シャーレから剥離し、細胞濃度を完全培地中1×10⁶cells/mLに調製し、その細胞懸濁液100μLを基板上に滴下し、37℃、CO25%濃度下にて一晩培養する。表面増強ラマン測定は、Process Raman分光計Raman Analyzer PI-200（Process Instruments製）を用いる。測定範囲300-2400 cm^-1、励起波長785 nm、検出器CCD、積算回数1秒×5（5秒）にて測定を行い、測定方法はプローブ（Inphotonics製）を用いる。

　(4)小括：
　本発明は、長期の細胞培養をせず、細胞を単純にセンサー基板に接触及び、又は検出可能なほど検出器に対して十分近傍に配置させて、エンドポイントを迅速に予測する点で斬新な方法である。先進医療に取り入れられている、三次元培養による抗がん剤感受性試験であるCD-DST法においては薬剤添加してから7日後の生存率を指標に評価するが、同様の評価が、時間のかかる三次元培養をする必要なしに、わずか1時間以内で実施できる。

　本手法では、細胞を二次元的に基板に維持するのみで、細胞を三次元培養の状態（Yamada & Cukierman Cell 130:601, 2007）にしている。接着する細胞は、三次元培養や、三次元を構成している必要がなく、二次元培養したものでも構わない。このため非常に迅速であり、ハイスループット化に向いている。

　細胞をコラーゲンで覆い、細胞の活性を確認することにより、一定時間後にこれを達成する点で本手法は優れている。また、三次元培養で行う生理的濃度での測定では、これまでの二次元培養の百分の一程度まで薬剤濃度が低下する可能性があるが（Higashiyama et al. 2008）、これに対する応答も、これまでの方法では当然低下する。しかし、三次元培養で細胞が生理的濃度でも応答するということは、細胞の活性が高まるためと予測していたが、得られた結果はこれを支持するものであった。さらに、標準的な方法で必要な細胞数105と比較し、1000個程度の少数の細胞しか使用せず、HP-SPR測定することで、正確で十分な感受性試験を行える点でも非常に優れており、臨床応用にも向いている。本手法では、迅速に弱い光で測定するため、光退色の問題を回避できる長所がある。今後は、コンテンツの充実はもちろんであるが、臨床サンプルを用いた研究、並びに自動化装置の開発を行うことにより、将来効率的なテーラーメイド医薬品・医療への展開が期待される。本発明の方法を用いた具体的な評価系は、下記を含む。

　[抗がん剤の評価]
　本発明の方法は、抗がん剤の評価のために用いることができる。本発明においては細胞は三次元培養した場合と同様の状態に活性化されており、したがって、生理的濃度で評価することができる。また、患者由来の細胞を使用することで、感受性試験に応用することもできる。

　[抗がん剤のスクリーニング]
　アポトーシスの誘導により抗がん作用を示す抗がん剤においてミトコンドリアの脱分極が起こるなど、抗がん剤が、がん細胞に作用する過程においてミトコンドリアの分極状態に変化が起こることが知られている。また、その脱分極の程度から抗がん作用の評価が可能であることが見出されている（非特許文献1）。このため抗がん剤候補物質をがん細胞に投与した際のミトコンドリア分極状態のモニタリングから抗がん剤のスクリーニングが可能である。（Apoptosis 2005;10:687-705参照）また、例えばこのような抗がん剤候補物質の併用投与による相乗効果の判断も、ミトコンドリア分極状態のモニタリングによって可能となる。具体的には、抗がん剤候補化合物のスクリーニングのための方法は、次の工程を含む：基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；活性化した細胞へ試験化合物を供与する工程。そして、試験化合物を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した試験化合物を抗がん剤候補化合物として選択する。

　なお、本明細書では、スクリーニング方法に関し、上記のように抗がん剤候補物質のスクリーニング方法として実施される場合を例に説明することがあるが、特に記載した場合を除き、その説明は他の目的で候補物質を選択するためのスクリーニング方法にも当てはまる。

　[脂肪燃焼物質（抗肥満薬剤）のスクリーニング]
　過度の脂肪の蓄積は肥満という症状のみでなく、糖尿病、脳卒中、動脈硬化などの疾患を引き起こすことが明らかになっていることから、抗肥満薬剤としての脂肪燃焼物質の利用価値は非常に高い。また、脂肪燃焼は、褐色脂肪細胞や肝細胞により行なわれるが、脂肪燃焼時は肝細胞内においてミトコンドリアの分極・脱分極が起こることが明らかになっているため、褐色脂肪細胞のミトコンドリア分極状態モニタリングにより脂肪燃焼物質のスクリーニングが可能である。（Biophysical journal 2002;82(1):1673 part2およびFEBS Letters 1984;170(1):181-185参照）

　[がんの診断]
　がん化した細胞では、正常な細胞と比較し、ミトコンドリアの分極状態が顕著に異なることが知られていることから正常細胞とがん細胞の判別に応用可能である。（Cancer Research 2005;65(21):9861-9867参照）

　[RNAiの評価]
　RNAi(RNA interference; RNA干渉)は、細胞に導入された二本鎖RNAが、それと相補的な塩基配列を持つmRNAを分解する現象で、この現象を利用して人工的に二本鎖RNAを導入することにより、任意の遺伝子の発現を抑制することができる。RNAiのうち、特にミトコンドリアの脱分極に影響を与えると考えられるものについての効果の判断が、ミトコンドリア分極状態のモニタリングによって可能となる。そのようなRNAiとしては、例えば、細胞のアポトーシス、細胞の分裂活性、老化、肥満、肥満に関連した糖尿病、脳卒中、動脈硬化、褐色脂肪細胞、肝細胞等に関与するRNAiが挙げられるが、これらに限定されない。(RNAiに関して：Nature 2001;411:494-498参照)

　[環境モニタリング]
　環境ホルモンとして知られるビスフェノールAなどの内分泌かく乱物質ではその種類、濃度により特定の細胞に対し増殖やアポトーシスを誘導することが明らかになっており、上述の細胞増殖における細胞分裂やアポトーシスをミトコンドリアの分極状態のモニタリングより検出可能なことから環境中の内分泌かく乱物質の検出およびそれらの影響評価に利用可能である。（Archives of Toxicology 2000;74(2):99-105、およびJournal of Biological Chemistry 2005;280(7):6181-6196参照）

　[毒性評価]
　生細胞に対する毒性物質の投与はミトコンドリアの急激な脱分極を引き起こすことが一般的に知られており、蛍光試薬によるミトコンドリア分極状態のモニタリングにより各種物質の毒性評価を行なった例がある。本発明を用いて非標識下で簡便に毒性評価が可能である。（Hepatology 2000;31;1141-1152およびToxicological Sciences 2005;86(2):436-443参照）

　[細胞の分裂活性の評価]
　人工受精や動植物クローンにおける優良細胞の選抜においては分裂活性の高い細胞を選択することが重要であるが、ミトコンドリアの分極状態は細胞の分裂活性と密接に関連するため、本発明を用いて非標識下でミトコンドリアの分極状態をモニタリングすることで上記用途において優良な細胞を非侵襲的に選抜可能である。（Cancer Research 1998;58(13):2869-2875参照）

　[細胞の老化状態の評価」
　老化状態の細胞においては分裂活性が低く、ミトコンドリアの分極状態もこれと関連しているため、ミトコンドリアの分極状態モニタリングから細胞の老化状態のモニタリングが可能である。また、細胞を活性化させ、老化を抑制するような薬剤のスクリーニングに応用可能である。（Biological Signals and Receptors 2001;10:176-188参照）

　[その他]
　本発明の方法は、候補生細胞群の分裂活性、老化状態又は悪性（がん細胞であるか、正常細胞であるか）を評価し、スクリーニングするために用いることができる。また、iPSなどの幹細胞に関し、細胞の分化を検出することができる（特許文献6）。　

　また、本発明の方法は、種々の候補物質（例えば、ミトコンドリアの分極に関連した疾患又は状態を処置するための医薬候補化合物）を、スクリーニングするために用いることができる。すなわち、ミトコンドリアに関係する薬剤（候補物質）の薬効評価も期待される（Hock and Kralli 2009）。メタボリックシンドローム関連の高血圧、糖尿病、肥満の治療、予防のためのスクリーニングを中心に、心筋症、腎障害、不妊、難聴、動脈硬化の進展、脳卒中、アルツハイマー病、慢性疲労症候群、てんかん、心筋梗塞、脳梗塞、精子の泳動性、老化などへの展開が、生理的濃度で可能になる。このため、本研究から、斬新な着想に基づく新原理による、製薬、医療における新しい方法論の提案を行えると確信する。

　実施例1：三次元培養状態における、抗がん剤の細胞活性化に対する作用
　[細胞培養]
　供試細胞には、ヒト膵臓腺がん由来の細胞である、MIA PaCa-2（理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室RIKEN BRC through the National Bio-Resource Project of the MEXT, Japanから譲渡）及びPANC-1（九州大学　医学研究院　片野光男　教授から譲渡）を用い、37℃、CO₂5％、湿度91％下において、ペニシリン50 unit/mL－ストレプトマイシン50 μg混合試薬（Invitrogen、Calsbad、CA、USA）、牛胎児血清FBS10％（v/v）（Thermo Scientific、Waltham、MA、USA）を含む液体培地DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）にて培養した。対数増殖期にある細胞を用い実験を行った。

　[CD-DST法による細胞生存率の測定]
　前述の各種成分を含む液体培地DMEMを用いて、各がん細胞を3.5×10⁶個/mL懸濁液として調製し、コラーゲンドロップキット（Primaster（登録商標） KIT）（倉敷紡績、大阪）のA液（Collagen Cellmatrix Type CD）、B液（10倍濃縮 F-12培地）、及びC液（再構成用緩衝液）8：1：1（容量）に、調製した細胞懸濁液を1/10濃度になるように混合し、6穴マイクロプレートの各穴に30 μLを3滴ずつ落下、37℃、CO₂ 5％、湿度91％下にて1時間インキュベートした（Kobayashi et al. 2001）。その後、各種成分を含むDMEM培地を3mLずつ各穴に入れ24時間インキュベートし、各種濃度の抗がん剤ストック溶液を30 μLずつ添加、さらに24時間インキュベートした。その後、各穴の培地を4 mLのDMEMと交換、37℃、CO₂5％、湿度91％下にてプレートミキサーで10分間振とう後、同様の作業をもう一度繰り返した。さらに、各穴の培地を4 mLのPCM-2培地（Primaster（登録商標） KIT）（倉敷紡績、大阪）と交換し、2～3日毎に4 mLのPCM-2培地で液交換を行いながら、7日間培養を行った。各穴を0.1％コラゲナーゼ（コラゲナーゼL、新田ゼラチン、大阪）を含むDMEM培地3 mLと交換、37℃、CO₂5％、湿度91％下にてプレートミキサーで30分間振とうした。コラーゲンが取り除かれた細胞をトリパンブルー（和光純薬、大阪）で染色し、血球計算盤により細胞数を計測、コントロールの細胞生存数を100%として生細胞数を計算した。

　抗がん剤として、ドキソルビシン、又はパクリタキセル（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）を用いた。試験濃度が、それぞれ25及び50 nM、並びに1、2.5及び5 nMになるように、ストック溶液をそれぞれ100倍濃度で、ドキソルビシンに対しては超純水を、またパクリタキセルに対してはジメチルスルホキシド（DMSO）（ナカライテスク、京都）を溶媒として用い、調製した。

　[高精度表面プラズモン共鳴装置（HP-SPR）による表面プラズモン共鳴角のリアルタイムモニタリング]
　BK7スライドガラス上に45 nm金を蒸着したセンサーチップに、高さ約1.5 mm、外径9 mm、内径8 mmのポリプロピレンリングをコラーゲン（Type A-Ｉ）（新田ゼラチン、大阪）で接着した。この中にペニシリン－ストレプトマイシン、及びFBSフリーのDMEMに調製した細胞1×10⁶個/mLを100 μL滴下し、37℃、CO₂5％、湿度95%下にて一晩保持した後、培養液50 μLを取り除き、コラーゲンドロップキットのA液（Collagen Cellmatrix Type CD）、B液（10倍濃縮 F-12培地）、及びC液（再構成用緩衝液）を8：1：1の割合で混合したものを30 μL、細胞上全体に滴下し、再度37℃、CO₂5％、湿度95%下にて適宜静置した（図1）。

　その後、センサーチップを、マッチングオイル（屈折率1.518）を介してHP-SPRセンサーのプリズム上に設置し、5 mLのEMEM （Minimum Essential Medium Eagle）（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）で満たし、カスタムメイドのHP-SPRにより測定を開始した（Kosaihira and Ona 2008; Nishijima et al. 2010）。この際、CO₂ 5％、37±0.1℃下にて行った。なお、静置時間は、細胞分裂しない程度の短い時間に相当し、このHP-SPRシグナルの安定なトレンドを示すことにより決定した。測定開始2～3分後、SPRシグナルが安定していることを確かめ、ドキソルビシン、パクリタキセルいずれかを含む新しい5 mLのEMEM、もしくはコントロールとして5 mLのEMEMのみを交換した後、60分間測定し続けた。薬剤は、それぞれ1000倍濃度溶液ストックを用い、CD-DST法と同じ濃度になるように行った。

　薬剤が細胞に作用し始める時間帯である薬剤投入後25分以降で、安定した直線的なシグナル部分を5分間モニターし、各細胞におけるコントロールの変化率を差し引き、HP-SPR角度変化率として求めた（Nishijima et al. 2010）。

　[結果と考察]
　CD-DST法による細胞生存率の測定結果を図2に示す。MIA PaCa-2及びPANC-1における50％生存率を示す抗がん剤の濃度は、ドキソルビシンで25nM、パクリタキセルで2.5nM程度であった。本手法を用いることにより、臨床検査で用いられている濃度と同様の結果が得られることが確認できた（Yasuda et al. 1998）。このため、ドキソルビシンは、PANC-1よりもMIA PaCa-2で良く効いており、感受性の個人差も見られる。用いた二つのセルラインではともに、K-ras並びにp53に変異が認められる（Moore et al. 2001）。ただし、変異の箇所は異なっており、個人差を現わしている。

　HP-SPRによる測定結果を図3に示す。これまでの金基板上での測定では、コントロールはほぼ変化のないトレンドであった（Kosaihira and Ona 2008; Nishijima et al. 2010）。これとは異なり、細胞をコラーゲンで覆った場合には、コントロールでもミトコンドリア脱分極のトレンドが見られた。細胞をコラーゲンで覆った場合、細胞増殖の増加が認められ、代謝活性も上昇している（Kleinman et al. 1987）。しかしながらHP-SPRの測定においては、FBSを新たに添加しておらず、またEMEM培地を用いているため、成長因子、栄養ともに不足してきていると考えられる。この結果、コントロールでも経時的なミトコンドリアの脱分極が観察されたと考えられる。これに対し、抗がん剤を添加した場合には、コントロールよりも強い脱分極のトレンドを示しており、これまでと同様に薬効の評価が可能と考えられた。

　ここでドキソルビシンは、DNAへの挿入とともに、トポイソメラーゼ－IIを阻害し、DNA鎖を切断することにより働く（Sin and Moore 2005）。一方、パクリタキセルは、微小管の脱重合の阻害により、細胞分裂を停止させる（Sin and Moore 2005）。ともに、細胞膜を通過し、細胞内で作用する抗がん剤であるが、コラーゲンで覆っていない場合の実験結果とは異なり（Nishijima et al. 2010）、HP-SPRシグナルは細胞膜通過の影響をほとんど受けず、シグナリング　エコー法による結果と同様のトレンドを見せた（Nishijima et al. 2010）。このため、細胞をコラーゲンで覆った場合は抗がん剤の細胞膜の通過が容易になることが想像された（Ong et al. 2010）。

　CD-DST法による細胞生存率とHP-SPRシグナルの変化率との関係を図4に示す。図からも見て取れるように、セルラインや抗がん剤の種類に依存せず、有意義に高い相関が得られた（P<0.001）。

　抗がん剤の作用機構は、前述のように異なっている。また、同様に用いたセルラインは個人差を示すことから、得られた結果は、本発明により、抗がん剤の作用機序の違い、及び個人の遺伝子発現の違いに関わらず、薬効の評価を行えることを示している。

　実施例2：二次元培養状態と三次元培養状態における細胞活性の比較
　本実施例においては、本発明の三次元培養状態における細胞活性を、二次元培養状態の場合の細胞活性と比較することを目的として行った。

　抗がん剤として、実施例1において効果的に細胞を活性化させることが明らかになったドキソルビシン（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）を用いた。試験濃度が、25 nMになるように、ストック溶液を100倍濃度で、ドキソルビシンに対して超純水をを溶媒として用い、調製した。

　[高精度表面プラズモン共鳴装置（HP-SPR）による二次元培養状態細胞の表面プラズモン共鳴角のリアルタイムモニタリング]
　BK7スライドガラス上に45 nm金を蒸着したセンサーチップに、高さ約1.5 mm、外径9 mm、内径8 mmのポリプロピレンリングをコラーゲン（Type A-Ｉ）（新田ゼラチン、大阪）で接着した。この中にペニシリン－ストレプトマイシン、及びFBSフリーのDMEMに調製した細胞1×10⁶個/mLを100 μL滴下し、37℃、CO₂5％、湿度95%下にて20時間培養した。

　その後、センサーチップを、マッチングオイル（屈折率1.518）を介してHP-SPRセンサーのプリズム上に設置し、5 mLのEMEM （Minimum Essential Medium Eagle）（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MI、USA）で満たし、カスタムメイドのHP-SPRにより測定を開始した（Kosaihira and Ona 2008; Nishijima et al. 2010）。この際、CO₂ 5％、37±0.1℃下にて行った。

　なお、静置時間は、細胞分裂しない程度の短い時間に相当し、このHP-SPRシグナルの安定なトレンドを示すことにより決定した。測定開始2～3分後、SPRシグナルが安定していることを確かめ、ドキソルビシンを含む新しい5 mLのEMEM、もしくはコントロールとして5 mLのEMEMのみを交換した後、60分間測定し続けた。

　HP-SPRによる測定結果を図5に示す。二次元培養状態の細胞を用いた場合、コントロールと薬剤を投与したシグナルに差が認められず、細胞は活性化されていないことが確認できた。これに対して、本発明の手法を用いた三次元培養状態の細胞による試験では、細胞は活性化され、薬剤に対し感受性を示していることが判明した。このように、本手法を用いることより、細胞をin vitroで短時間の間に三次元培養状態に活性化させ、生体内に近い微小環境を形成でき、臨床応用に結び付く、薬剤感受性試験が可能になることを証明した。

Claims

　基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で又は活性化する工程；
　活性化した細胞へ刺激を供与する工程；及び
　刺激を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程
を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した刺激を評価する方法。
　細胞の変化を検出する工程が、細胞非分裂条件下で、表面プラズモン共鳴装置を用い、細胞及び／又はミトコンドリアの分極状態の変化、又は細胞及び／又はミトコンドリアの誘電率の変化に起因する表面プラズモン共鳴角の変化を測定することにより実施される、請求項1に記載の方法。
　細胞ががん細胞であり、刺激を供与する工程が、一又は二以上の抗がん剤を供与することにより行われる、抗がん剤の薬効を評価するための、請求項2に記載の方法。
　基板に維持した単層状の動物由来の細胞の一部分を、細胞外基質成分を含む組成物で覆い、細胞を非分裂条件下で活性化する工程；
　活性化した細胞へ試験化合物を供与する工程；及び
　試験化合物を供与した後に生じる、細胞の変化を検出する工程
を含み、細胞の変化の有無又は程度を指標に、細胞へ供与した試験化合物を抗がん剤候補化合物として選択する、抗がん剤候補化合物のスクリーニングのための方法。
　基板に維持した単層状の動物細胞の一部を、細胞外基質成分を含む組成物で覆うことにより、細胞の外来刺激に対する感受性を高める、方法。
　基板に維持した単層状の動物細胞の一部を、細胞外基質成分を含む組成物で覆うことによる、三次元培養環境を模倣する方法。