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WO2013038981A1 - 膵疾患マーカーの検出方法 - Google Patents

膵疾患マーカーの検出方法 Download PDF

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WO2013038981A1
WO2013038981A1 PCT/JP2012/072712 JP2012072712W WO2013038981A1 WO 2013038981 A1 WO2013038981 A1 WO 2013038981A1 JP 2012072712 W JP2012072712 W JP 2012072712W WO 2013038981 A1 WO2013038981 A1 WO 2013038981A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pancreatic
pancreatic disease
marker
juice
concentration
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/072712
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博美 佐貫
奈緒 守屋
理惠 片岡
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to CN201280043445.7A priority Critical patent/CN103782175A/zh
Priority to EP12832566.9A priority patent/EP2757377A4/en
Publication of WO2013038981A1 publication Critical patent/WO2013038981A1/ja
Priority to US14/199,136 priority patent/US20140186863A1/en

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a pancreatic disease marker excreted from the pancreas safely and with high performance.
  • Pancreatic cancer has a 5-year survival rate of 5% or less, and is the worst prognosis cancer. The first reason is that there is no effective test method for screening for pancreatic cancer. Secondly, it is difficult to cause symptoms early in pancreatic cancer, and in many cases, it is discovered after pancreatic cancer has progressed. Therefore, it is expected that the prognosis of pancreatic cancer will be greatly improved if a treatable early pancreatic cancer can be detected by a minimally invasive and simple method that can be carried out even by normal screening.
  • Body fluid is an important biological sample for knowing the state of an organ.
  • Pancreatic juice is also an important biological sample for knowing the state of the pancreas, and is used for cytodiagnosis, bicarbonate measurement, bacterial testing, and the like.
  • the search for new markers for pancreatic-related diseases such as pancreatic cancer has been widely conducted.
  • CEA cancerembryonic antigen
  • serum tumor marker is a glycoprotein present on the surface of cancer cells and is known to be highly expressed in pancreatic cancer cells.
  • the concentration of the tumor marker molecule may be diluted with systemic blood, the detection sensitivity in pancreatic cancer was as low as about 50%.
  • pancreatic juice and bile secretion stimulants secretin and CCK
  • pancreatic juice discharged after 30 minutes and 45 minutes is collected from a sonde inserted into the duodenum under fluoroscopy (secretin test).
  • CEA in the pancreatic juice thus obtained is measured.
  • the CEA concentration is reported to be 2.3 to 25 ng / mL in healthy subjects and around 50 ng / mL in patients with pancreatic cancer.
  • the CEA concentrations may be high even in patients suffering from other than pancreatic diseases, and a high CEA concentration in duodenal juice collected after administration of a secretory stimulant did not necessarily indicate the presence of pancreatic cancer.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 in endoscopic pancreatography (ERCP), after inserting a catheter into the pancreatic duct, a pancreatic juice draining stimulant (secretin) is administered to remove the pure fluid from the pancreas.
  • ERCP endoscopic pancreatography
  • secretin a pancreatic juice draining stimulant
  • the measured CEA concentration is 0.1 to 10 ng / mL for healthy subjects (control) in Non-Patent Document 3 and 1 to 500 ng / mL for patients with pancreatic cancer, and 56 ⁇ 5 for healthy subjects (Control) in Non-Patent Document 4.
  • pancreatic cancer has been reported to be as high as 71.4% sensitivity and 93.3% specificity. That is, it has been shown that by using pure pancreatic juice collected by directly inserting a catheter into the pancreatic duct as a measurement sample, the same CEA inspection performance can be obtained even in another facility. This is probably because the pancreatic juice is collected by inserting the catheter directly into the pancreatic duct compared to the secretin test described above, so that it is not affected by bile and the like, and there is less variation in the sampling technique. It was.
  • this method requires a method of inserting a catheter into the pancreatic duct endoscopically, and requires a high level of skill for a doctor. Moreover, since there is a risk of developing a serious symptom of acute pancreatitis as an accidental onset of examination, it could be performed only for patients who were strongly suspected of having pancreatic disease.
  • An aspect of the present invention is to provide a detection method for detecting a pancreatic disease marker, which can reduce the risk of accidents and obtain a highly reliable result.
  • a method for detecting a pancreatic disease marker which comprises detecting a pancreatic disease marker in duodenal juice collected from a subject and containing naturally drained pancreatic juice.
  • the method for detecting a pancreatic disease marker according to (1) wherein the detection of the pancreatic disease marker measures the marker concentration and determines whether or not the concentration is a predetermined threshold value or more.
  • the pancreatic disease marker is CEA, The pancreatic disease is pancreatic cancer; The method for detecting a pancreatic disease marker according to (2), wherein the threshold value is a concentration in the range of 50 to 200 ng / mL.
  • a measurement kit for a marker of pancreatic disease in duodenal juice containing naturally drained pancreatic juice A kit for measuring a pancreatic disease marker, comprising a membrane on which a first antibody against the pancreatic disease marker is solid-phased.
  • a pancreatic juice drainage stimulating agent is obtained with high accuracy as in the case of measuring the CEA concentration in pure pancreatic juice directly collected from the pancreatic duct after administration of the pancreatic juice excretion stimulating agent.
  • a pancreatic disease marker such as CEA can be detected without using it and without inserting a catheter into the pancreatic duct. That is, there is no risk of accidents associated with the catheter insertion process into the pancreatic duct, and since it is simpler and less expensive than the conventional method, there is no suspicion of pancreatic disease by the method for detecting a pancreatic disease marker of the present invention.
  • the pancreatic juice test can be performed more safely on the patient. Therefore, it can be expected that the pancreatic cancer test is widely and generally spread by the method for detecting a marker for pancreatic disease of the present invention.
  • Example 1 it is the figure which showed the measurement result of the p-amylase density
  • emitted naturally according to the disease In Example 1, it is the figure which showed the CEA density
  • Example 1 it is the figure which showed the result of ROC (Receiver Operating Characteristic) analysis at the time of using the CEA density
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • pancreatic disease markers are various biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids, cells and the like contained in pancreatic juice, and are more effective in pancreatic diseases than non-affected individuals of pancreatic diseases.
  • the non-affected person of a pancreatic disease includes not only a healthy person but a diseased person other than a pancreatic disease.
  • pancreatic diseases include pancreatic cancer, IPMN (intraductal papillary mucinous tumor), MCN (mucinous cystic tumor), SCN (serous cystic tumor), NET (pancreatic endocrine tumor), chronic pancreatitis (CP), Examples include acute pancreatitis.
  • Pancreatic juice is a bodily fluid discharged from the pancreatic duct into the intestine of the duodenum.
  • duodenal juice intestinal fluid present in the intestinal tract of the duodenum
  • the naturally excreted pancreatic juice means pancreatic juice excreted from the pancreatic duct into the duodenal intestine without administration of a pancreatic juice excretion stimulator such as secretin.
  • pancreatic juice Since pancreatic juice is a digestive juice, it contains various digestive enzymes. These digestive enzymes exist in an inactive state in the pancreas, but are known to be activated after excretion into the duodenum. By activation of these various digestive enzymes, various biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids and cells contained in pancreatic juice are degraded and denatured after excretion into the duodenum. Therefore, when examining the target biomolecule in the pancreatic juice, it was considered that accurate measurement would not be possible if the pancreatic juice excreted into the duodenum was used as a measurement sample.
  • pancreatic disease markers in duodenal fluid including naturally excreted pancreatic juice
  • concentration of pancreatic disease markers in pure pancreatic juice collected directly from the pancreatic duct after stimulation with a pancreatic drainage stimulant It has been clarified by the present inventors that the presence or absence of pancreatic disease and the magnitude of the onset risk are reflected as well as the concentration. That is, the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice containing the naturally drained pancreatic juice is higher in those suffering from pancreatic disease than in those not suffering from pancreatic disease.
  • pancreatic disease marker in the duodenal juice collected from the subject by detecting the pancreatic disease marker in the duodenal juice collected from the subject and measuring its concentration, whether or not this subject suffers from the pancreatic disease and the risk of developing the pancreatic disease are determined by the conventional method.
  • the most accurate and reliable method can be examined with as high accuracy.
  • the method for detecting a marker for pancreatic disease according to an embodiment of the present invention is performed in a duodenal juice collected from a subject, It is characterized by measuring the concentration of a marker for pancreatic disease.
  • the method for detecting a marker for pancreatic disease of the present invention does not require stimulation with a pancreatic juice discharge stimulator, and thus can be carried out at a lower cost.
  • pancreatic juice after stimulation with a pancreatic juice discharge stimulant generally, pancreatic juice is collected 30 to 45 minutes after stimulation, but in the present invention, duodenal fluid collected in the intestinal tract of the duodenum is collected.
  • the catheter is not inserted into the pancreatic duct of the nipple, a body fluid as a measurement sample for detecting a pancreatic disease marker can be collected more non-invasively and easily. That is, the method for detecting a marker for pancreatic disease according to the present invention has no risk of accidental onset of tests such as acute pancreatitis, and therefore the pancreatic disease marker test that has so far only been performed only for patients with pancreatic disease from the risk Can be carried out more safely even for a subject whose presence or absence of onset of pancreatic disease is unknown.
  • the duodenal fluid used in the method for detecting a marker for pancreatic disease of the present invention is a fluid collected from the intestinal tract of the duodenum of a subject who has not been administered a pancreatic juice discharge stimulant.
  • the duodenal juice collected from anywhere in the intestinal tract of the duodenum may be used, the duodenal juice present in the second or third portion of the duodenum is preferable.
  • the first portion of the duodenum is directly connected from the pyloric part of the stomach, and there is a possibility of gastric juice contamination, and it is relatively difficult to fix the endoscope for collection and it may be difficult to collect Is for etc.
  • the method for collecting the duodenal juice is not particularly limited as long as it is a method capable of collecting the stored liquid in the intestinal tract of the duodenum.
  • duodenal fluid can be collected by suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • the endoscope is inserted from the oral cavity to the duodenum, and the duodenal fluid present in the second and third portions of the duodenum is aspirated and collected using a catheter inserted through the canal channel.
  • the duodenal juice collected in the intestinal tract of the duodenum is collected and the pancreatic disease marker in the obtained duodenal juice May be inspected.
  • the collected duodenal juice is preferably subjected to a pancreatic disease marker measurement test immediately after collection or within a few hours.
  • the duodenal fluid that has been stored for a predetermined period after the collection is treated with the concentration of the disease marker. You may use for a measurement test.
  • the collected duodenal juice may be stored refrigerated or frozen, may be stored at room temperature, may be lyophilized, and stored as a frozen powder.
  • disassembly of the digestive enzyme in duodenal juice can also be preserve
  • a proteolytic enzyme inhibitor for a proteolytic enzyme that degrades the pancreatic disease marker protein it is preferable to mix abundant serine protease inhibitors in pancreatic juice.
  • a proteolytic enzyme inhibitor or the like may be mixed after collecting duodenal juice from a living body, and the duodenal juice can also be collected in a container in which a proteolytic enzyme inhibitor or the like is previously placed.
  • the collected duodenal juice may be used as it is in a measurement test for a pancreatic disease marker, or may be used after separating and removing solids such as cells by centrifugation or the like.
  • a diluted solution obtained by diluting the collected duodenal juice with an appropriate buffer or the like, or a solution obtained by adding various additives to the duodenal fluid or a diluted solution thereof may be used for a measurement test of a pancreatic disease marker.
  • the additive include a surfactant, a proteolytic enzyme inhibitor, a nucleolytic enzyme inhibitor, a pH adjuster, and a pH indicator.
  • the pancreatic disease marker detected in the method for detecting a marker for pancreatic disease of the present invention is a biomolecule whose concentration in the pancreatic juice is significantly higher in patients suffering from pancreatic disease than in non-affected individuals of pancreatic disease. There is no particular limitation as long as it is sufficient.
  • the pancreatic disease marker is preferably a biomolecule that is not easily affected by digestive enzymes contained in duodenal juice, such as glycoproteins and enzymes.
  • pancreatic disease markers to be detected in the method for detecting a pancreatic disease marker of the present invention examples include glycoproteins CEA, CA19-9 (for example, see Non-Patent Document 3 etc.), MUC-1 (KL-6) (for example, JP, 2006-308576, etc.), enzyme MMP2 (Matrix Metalloproteinase-2) (see, for example, Pancreas, 2002, vol.24, No.54, p344-347), MMP7 (Matrix Metalloproteinase-7) Etc.
  • substances that become significantly higher in pancreatic juice in patients suffering from pancreatic diseases such as S100P are raised.
  • the pancreatic disease marker detected in the method for detecting a pancreatic disease marker of the present invention is particularly preferably CEA.
  • CEA concentration in duodenal juice containing spontaneously drained pancreatic juice as an index, it is possible to examine the presence or risk of developing pancreatic cancer, IPMN, MCN, chronic pancreatitis, acute pancreatitis, and the like.
  • a marker for pancreatic disease in duodenal juice is detected using an antigen-antibody reaction.
  • an antigen antibody formed by contacting an antibody against a pancreatic disease marker (an antigen when the pancreatic disease marker is an antibody) with duodenal juice, which is immobilized on a solid phase The complex is detected on the solid phase.
  • an antibody against a pancreatic disease marker an antigen when the pancreatic disease marker is an antibody
  • the immobilized antibody (or antigen) A pancreatic disease marker is bound and the formed complex is detected.
  • pancreatic disease in which biomolecules in duodenal juice are immobilized in advance on a solid phase, and an antibody against a pancreatic disease marker (an antigen when the pancreatic disease marker is an antibody) is contacted with the solid phase.
  • the complex formed is detected by binding to the marker.
  • Examples of the solid phase for immobilizing an antigen or antibody include, for example, polymer membranes such as nitrocellulose membranes, gels such as agarose gels and SDS-PAGE gels, inner surfaces of containers such as plastic tubes and microplates, latex beads, magnetic beads Etc.
  • Examples of a method for detecting an antigen-antibody complex formed on an antigen or antibody immobilized on a solid phase include, for example, immunochromatography, Western blotting, dot plotting, slot blotting, immunoelectrophoresis, immunization Examples include diffusion methods, ELISA methods, immunoaggregation methods using latex beads, immunoassay methods using magnetic beads, SPR, and the like.
  • Antigen or antibody immobilization methods and these methods can be performed by conventional methods except that duodenal fluid is used as a measurement target and an antibody against a pancreatic disease marker (an antigen when the pancreatic disease marker is an antibody) is used. it can. It can also be detected in the liquid phase using an antigen-antibody reaction. In the case of detecting in the liquid phase, the binding between the labeled antibody and the antigen can be measured by FCS, FRET, or the like. The presence of the antigen can also be measured by molecular weight measurement such as TOF-MS.
  • pancreatic disease markers are preferably detected by an immunochromatography method or an ELISA method because they are rapid and simple and easy to quantitatively detect, and are detected by an immunochromatography method. It is more preferable.
  • a composite formed by dropping duodenal juice onto a nitrocellulose membrane in which an antibody against a pancreatic disease marker is immobilized on the membrane surface in advance and binding the pancreatic disease marker in the duodenal fluid to the immobilized antibody. Detect the body.
  • a labeled antibody pre-labeled with a fluorescent substance, gold colloid, enzyme or the like as an antibody that binds to this complex, this complex can be detected as a band.
  • the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice is determined qualitatively by visually comparing the density of the band detected using the duodenal juice with a calibration color sample prepared using a known concentration of the pancreatic disease marker. Can be measured automatically. It can also be easily determined by optically measuring the density of the band and comparing it with the density of the band similarly detected using a known concentration of pancreatic disease marker. In addition, a calibration curve representing the relationship between band density and pancreatic disease marker concentration should be prepared in advance, and the band density detected using duodenal juice can be measured optically and converted from the calibration curve. Thus, the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice can also be determined.
  • the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice containing the naturally drained pancreatic juice tends to be higher in affected individuals who develop pancreatic disease than in non-affected individuals with pancreatic disease. For this reason, the possibility of suffering from pancreatic disease in the subject can be determined using the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice of the subject.
  • Establish a threshold value that separates affected and non-affected individuals in advance measures the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice of the subject, and determines whether this concentration is greater than or equal to the predetermined threshold . When this concentration is equal to or higher than a predetermined threshold, it can be determined that the subject is likely to have pancreatic disease.
  • the pancreatic disease can be detected by measuring the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal fluid containing the naturally drained pancreatic juice and comparing it with a predetermined threshold value.
  • the threshold value for separating the affected and unaffected individuals of pancreatic disease can be set experimentally in consideration of the type of pancreatic disease marker, the detection method of the pancreatic disease marker, and the like. For example, for duodenal juice collected from a population known not to suffer from pancreatic disease and duodenal fluid collected from a population known to suffer from this disease, It can be set as appropriate by measuring the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice naturally discharged by the detection method and comparing the measured values of both populations.
  • the threshold value for separating an affected person of pancreatic cancer from an unaffected person is preferably a concentration in the range of 50 to 200 ng / mL. More preferably, the concentration is in the range of 100 to 150 ng / mL.
  • pancreatic diseases without subjective symptoms can be picked up widely. Further, if the CEA concentration is high, there is a high possibility that the pancreatic cancer has progressed, and therefore it can be determined that a rapid close examination and the start of treatment are necessary.
  • pancreatic disease marker is CEA
  • an antibody in which duodenal juice is immobilized on a membrane on an nitrocellulose membrane in which an anti-CEA antibody is immobilized on the membrane surface in advance is an epitope site.
  • immunochromatography in which an anti-CEA antibody is immobilized on the membrane surface in advance is an epitope site.
  • a complex composed of the immobilized anti-CEA antibody, CEA and labeled anti-CEA antibody is formed on the surface of the nitrocellulose membrane.
  • the formed band is detected as a band by the label in the labeled anti-CEA antibody.
  • the CEA concentration on the immunochromatography can be quantified from the density of the band by visual comparison with the band concentration of a color sample in which a band obtained when a predetermined concentration of CEA is added. Further, the CEA concentration can be converted by optically measuring the density of the band and converting it from a predetermined calibration curve or the like.
  • the intensity of the band on the immunochromatography is compared to the color swatch described for the 50 ng / mL and 200 ng / mL CEA concentration bands, or the intensity between these two bands, or When it is higher than the band of 200 ng / mL, it is positive (the subject from whom the duodenal fluid used for the measurement was collected suffers from pancreatic diseases such as pancreatic cancer, IPMN, MCN, chronic pancreatitis, and acute pancreatitis, particularly pancreatic cancer. It is highly possible that
  • CEA concentration is relatively low in diseases where there are many benign such as IPMN and MCN, and it is assumed that CEA concentration is high in advanced pancreatic cancer and advanced chronic pancreatitis. For this reason, it can be expected to determine the degree of morbidity of a specific pancreatic disease other than pancreatic cancer by setting an appropriate threshold.
  • the CEA concentration in naturally discharged duodenal juice is measured by a rapid kit such as an immunochromatography method, so that a positive / negative judgment can be made quickly and easily in an endoscope room where duodenal juice is collected. (Determining whether the subject has a pancreatic disease) can be performed. Therefore, by using the pancreatic disease marker detection method of the present invention, a screening test for pancreatic cancer that is safe, high-performance, and rapid can be performed. It can be judged immediately after collecting the liquid, and by promptly motivating and making a reservation for the detailed examination, it is possible to start treatment of pancreatic cancer quickly.
  • pancreatic disease marker measuring kit of the present invention is a kit for measuring a pancreatic disease marker in duodenal juice containing naturally drained pancreatic juice.
  • the disease marker is an antibody
  • it preferably includes a solid phase on which an antigen) is immobilized in advance, for example, a membrane on which the first antibody against a pancreatic disease marker is immobilized.
  • An example of this membrane is an immunochromatographic test strip.
  • This measurement kit also preferably has a second antibody that labels a marker for pancreatic disease.
  • the measurement kit may further include a duodenal fluid storage container in which a proteolytic enzyme inhibitor is previously stored.
  • Example 1 Duodenal juice was collected from 73 patients suspected of having pancreatic disease and the CEA concentration was measured. Insert the endoscope into the second portion of the duodenum in a patient who fasted overnight, and use the catheter for pancreatography (Olympus, product name: PR-130Q) to complete the second and third portions of the duodenum. The duodenal juice collected in the wall was collected. Collection was performed by aspirating a syringe connected to the proximal side of the catheter outside the endoscope. An average of about 1 mL of duodenal juice could be collected in about 2 to 3 minutes. In the first portion of the duodenum, the endoscope fell out to the stomach side, and stable collection was not possible.
  • duodenal juice discharged naturally 47 out of 73 cases were further intravenously injected with secretin (manufactured by Cairocrine), and after 2 to 3 minutes, the second and third portion of the duodenal wall
  • secretin manufactured by Cairocrine
  • the duodenal juice accumulated shallowly was collected in the same manner.
  • secretin stimulation about 1.5 mL to about 2 mL of duodenal juice could be collected in about 2 to 3 minutes.
  • image diagnosis or pathological examination was further performed on each patient, and a final diagnosis was performed.
  • pancreatic cancer As a result of the final diagnosis, among 73 cases, there were 41 cases of pancreatic cancer, 17 cases of IPMN, 2 cases of MCN, 6 cases of SCN, 3 cases of NET, and 4 cases of chronic pancreatitis (CP).
  • CP chronic pancreatitis
  • duodenal juice collected from 47 patients who were able to collect both naturally-extracted duodenal fluid and secreted duodenal fluid (naturally-exposed duodenal fluid and secreted after secretin stimulation)
  • P-amylase concentration and CEA concentration in the duodenal juice were measured.
  • the p-amylase concentration was measured by an enzyme method (Gal-G2-CNP substrate method).
  • the CEA concentration was measured by ELISA using a commercially available kit (manufactured by IBL).
  • FIG. 1 shows the p-type in each duodenal juice for 47 patients who were able to collect both the duodenal juice drained naturally (before secretin stimulation) and the duodenal fluid drained after secretin stimulation (after secretin). The measurement result of amylase concentration is shown. It was found that even the duodenal juice before administration of secretin contained approximately the same level of p-amylase as the duodenal fluid after administration of secretin.
  • p-Amylase is derived from pancreatic juice, and pancreatic juice derived from the pancreas is naturally excreted and contained in the duodenal juice, and components derived from pancreatic juice can be detected from the duodenal juice that has been excreted naturally. confirmed.
  • FIG. 2 shows the CEA concentration in the duodenal juice excreted spontaneously
  • FIG. 3 shows the CEA concentration in the duodenal juice excreted after secretin stimulation.
  • the CEA concentration in the duodenal juice that was naturally excreted (no secretin administration) in this example was the same as that of pure pancreatic juice collected by cannulation in the nipple.
  • the CEA concentration was in the same concentration range. From these results, it was found that even when the CEA concentration in the duodenal juice discharged naturally was measured, the same pancreatic disease discrimination effect as that obtained when the CEA concentration of pure pancreatic juice was measured was obtained.
  • the CEA concentration in the duodenal juice of 73 cases spontaneously excreted (without administration of secretin) and the CEA concentration in the duodenal juice are shown in FIG.
  • the CEA concentration in duodenal juice was high in pancreatic cancer, and IPMN and chronic pancreatitis (CP) as treatment targets for pancreatic disease also showed high values.
  • CP chronic pancreatitis
  • NET malignant NET resulted in higher CEA concentration than benign NET data.
  • the SCN of the benign tumor that was the subject of follow-up was low, and the result was consistent with FIG.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic analysis was performed to examine whether the CEA concentration in the duodenal juice excreted spontaneously can be used as a marker for distinguishing pancreatic cancer from benign tumors (SCN in the present invention).
  • ROC analysis was performed using PASW statistics ver. 18 (manufactured by IBM). The analysis results are shown in FIG. As a result, the cut-off value (threshold value) for distinguishing pancreatic cancer from benign tumors was almost equivalent to the CEA concentration in pure pancreatic juice and the CEA concentration in duodenal juice collected after administration of secretin.
  • the sensitivity of detection of pancreatic cancer in this example was 71% sensitivity and 100% specificity, which was superior to the case where CEA concentration in pure pancreatic juice in the previous report was used as an index.
  • a cut-off value for distinguishing between pancreatic cancer and benign tumor was set within a range of 30 to 250 ng / mL, and sensitivity and specificity for each cut-off value were calculated. Table 3 shows the calculation results. As a result, when the cut-off value was set from 100 to 150 ng / mL, even when the specificity was 80% or more, the sensitivity was 70% or more, and a sensitivity having utility as a test was obtained. In addition, when the cut-off value is set, it becomes possible to detect pancreatic cancer from diseases such as MCN, and a test with higher specificity of pancreatic cancer can be expected. In addition to pancreatic cancer, NET can be expected to be benign or malignant.
  • the specificity is 50%, which is halved compared with the case where the cut-off value is set from 100 to 150 ng / mL, but the sensitivity is 93%, which is very sensitive to pancreatic cancer. Inspection can be performed.
  • Example 2 Using a commercially available CEA immunochromatography kit (product name: Lana Mammo Card CEA, manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.), CEA in the naturally excreted duodenal fluid sample used in Example 1 was detected. The CEA concentration was visually determined by comparing the color sample of the band attached to the kit with the intensity of the immunochromatographic band detected from each duodenal fluid specimen. As a result, there was a correlation between the band density of the duodenal fluid specimen when compared with 100 ng / mL and 400 ng / mL of the color sample and the measured value of CEA concentration by ELISA, and the CEA concentration in the duodenal juice was determined by immunochromatography. It was confirmed that it could be measured by the method.
  • a commercially available CEA immunochromatography kit product name: Lana Mammo Card CEA, manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.
  • Example 3 A protease inhibitor (product name: Complete, manufactured by Roche) is placed in advance in a syringe connected to the proximal side of the catheter outside the endoscope, and 47 patients out of Example 1 from Duodenal juice was aspirated.
  • the aspirated duodenal fluid was mixed with a protease inhibitor in a syringe, then transferred to a tube and stored frozen.
  • duodenal fluid collected via a catheter that did not previously contain a protease inhibitor in the syringe was similarly transferred to a tube and stored frozen.
  • the CEA concentration and S100P concentration of each duodenal juice after storage were measured.
  • the CEA concentration was measured in the same manner as in Example 1.
  • concentration was measured by ELISA method using the commercially available kit (made by Cyclex).
  • Tables 4 and 5 show the measurement results of CEA concentration and S100P concentration in duodenal juice by disease.
  • the CEA concentration the duodenal juice preserved with the addition of the protease inhibitor (in Table 4, “with inhibitor”) and the duodenal juice preserved without the addition of the protease inhibitor (inhibited in Table 4, “inhibition”). It was found that there was not much difference in concentration with no agent.
  • the S100P concentration is higher in the duodenal juice preserved with the addition of the protease inhibitor (in Table 5, “with inhibitor”) and in the duodenal juice preserved without the addition of the protease inhibitor (inhibited in Table 5, “inhibition”). Concentration was significantly higher than "no agent”).
  • the pancreatic disease marker detection method of the present invention is safe without risk of developing acute pancreatitis and measures CEA concentration in pure pancreatic juice directly collected from a catheter inserted into the pancreatic duct after stimulation of pancreatic juice drainage Since the pancreatic disease marker can be detected with the same accuracy as the case, it can be used in the field of analyzing pancreatic juice, particularly in the field of clinical examination and the like.

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Abstract

　膵疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法の提供する。抗原抗体反応を利用して固相に固定された抗原又は抗体を検出する測定方法により、被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法、前記膵疾患マーカーの濃度が、所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が膵疾患に罹患している可能性が高いと判断することを特徴とする前記記載の膵疾患マーカーの検出方法を提供する。

Description

膵疾患マーカーの検出方法
　本発明は、膵臓から排出された膵疾患マーカーを、安全かつ高性能に検出する方法に関する。
　本願は、２０１１年９月１３日に、日本に出願された特願２０１１－１９９６８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　膵癌は５年生存率が５％以下であり、癌の中でも最も予後の悪い癌である。その理由は、第一に、膵癌検診で有効な検査法がないことが挙げられる。第二には、膵癌では早期では症状がでにくく、多くの場合で膵癌が進行してから発見されることが挙げられる。そのため、通常の検診でも実施できる低侵襲かつ簡便な方法により、治療可能な早期膵癌が検出できるようになれば、膵癌の予後は大きく改善されると期待される。
　体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診、重炭酸塩測定、細菌検査等に用いられている。また、研究においても、膵癌等の膵臓関連疾患についての新たなマーカーの探索が広く行われている。
　血清腫瘍マーカーとして知られているＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞の表面に存在する糖タンパク質であり、膵癌細胞でも高発現していることが知られている。臨床検査においては、血清中のＣＥＡ濃度を測定することにより、癌の悪性度の把握や治療の効果の確認ができることが報告されている。しかしながら、血清中のＣＥＡの測定からは、癌の発生部位である臓器を特定できない。また、腫瘍マーカー分子の濃度が全身性の血液で薄まるためかもしれないが、膵癌での検出感度は５０％程度と低いものであった。
　一方で、膵癌細胞を含んだ状態で、膵臓から排出される膵液中のＣＥＡを測定する研究が報告されている。例えばローニィらによって、以下に説明する方法で、健常者と慢性膵炎患者と膵癌患者を見分けようという研究がなされている（非特許文献１参照）。この方法では、まず膵液と胆汁の分泌刺激剤（セクレチン及びＣＣＫ）を検査対象へ静注する。次に、この静注の後、３０分間、及び４５分間経過後に排出された膵液を、透視下で十二指腸に挿入したゾンデから採取する（セクレチンテスト）。最後に、こうして得られた膵液中のＣＥＡを測定する。この方法では、ＣＥＡ濃度は、健常者で２．３～２５ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で５０ｎｇ／ｍＬ付近と報告されている。しかしながら、この報告における膵癌の症例数がわずか数例と少なく、正確な値と判断することは難しかった。また、膵疾患以外に罹患した患者でもＣＥＡ濃度が高い場合があり、分泌刺激剤投与後に採取された十二指腸液中のＣＥＡ濃度が高いことが、かならずしも膵癌の存在を示すとはいえなかった。また、ファリーニらによっても、同様にセクレチンテストの方法で得た膵液中のＣＥＡが測定されており、健常者で５９～４５０ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で３２０～８００ｎｇ／ｍＬであった（非特許文献２参照）。つまり、同じセクレチンテストを行ったにもかかわらず、ローニィらによる結果とファリーニらによる結果では、ＣＥＡ濃度が１０倍近く相違しており、このセクレチンテストで得られた膵液の検査性能は、実施の形態によって大きくばらつくことが課題であった。
　これをうけて、非特許文献３及び４では、内視鏡的な膵管造影（ＥＲＣＰ）時に、膵管にカテーテルを挿入した後、膵液排出刺激剤（セクレチン）を投与して膵臓から排出される純粋な膵液を、１０分間又は１５分間採取し、得られた膵液中のＣＥＡの濃度を測定した結果が報告されている。測定されたＣＥＡ濃度は、非特許文献３では健常者（コントロール）が０．１～１０ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で１～５００ｎｇ／ｍＬであり、非特許文献４では健常者（コントロール）が５６±２７ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で１３８±５１ｎｇ／ｍＬであり、いずれもほぼ同程度であった。また、膵癌の検出性能も感度７１．４％、特異度９３．３％と高い値が報告されている。つまり、直接膵管にカテーテルを挿入して採取された純粋膵液を測定試料とすることにより、別施設であっても同様のＣＥＡの検査性能が出せることが示されている。これは、前述のセクレチンテストと比較して、直接膵管にカテーテルを挿入して膵液を採取していることから、胆汁等の影響を受けず、また採取手技のばらつきもうけることが少ないためと考えられた。しかしながら、この方法では、内視鏡的に膵管にカテーテルを挿入するという方法が必要であり、医師に高い技術が必要とされる。また、検査の偶発症として急性膵炎という重篤な症状を発症するリスクがあるため、膵疾患を強く疑われた患者にのみしか実施することができなかった。
ロルニィ（Rolny）、他２名、スカンディナヴィアン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（Scandinavian Journal of Gastroenterology）、１９７７年、第１２巻、第７５９～７６３ページ。 ファリーニ（Farini）、他１０名、ヘパトーガストロエンテロロジー（Hepato-Gastroenterology）、１９８０年、第２７巻、第２１３～２１６ページ。 パンクリース（Pancreas）、１９９４年、第９巻、第６号、第７４１～７４７ページ。 ヘパトーガストロエンテロロジー（Hepato-Gastroenterology）、１９９９年、第４６巻、第４６号、第３１～３７ページ。
　本発明の態様は、膵疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下の知見を見出し、本発明を完成させた。膵液排出刺激剤を投与することなく、十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定した場合、すなわち自然に十二指腸に排出された膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合でも、膵液排出刺激を行った後に膵管に挿入されたカテーテルから直接採取した純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等のＣＥＡの検査性能を得ることができる。
　本発明の態様を以下に示す。
（１）被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法。
（２）前記膵疾患マーカーの検出が、前記マーカー濃度を測定し、前記濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する前記（１）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（３）前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡである前記（１）又は（２）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（４）前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであり、
　前記膵疾患が膵癌であり、
　前記閾値が、５０～２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度である前記（２）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（５）前記十二指腸液が、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された状態で保存された十二指腸液である前記（１）から（４）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（６）前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法である前記（１）から（５）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（７）自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キットであって、
　前記膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする膵疾患マーカー測定キット。
（８）さらに、前記膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有する前記（７）に記載の膵疾患マーカー測定キット。
（９）前記膜がイムノクロマトグラフィー用テストストリップである前記（７）又は（８）に記載の膵疾患マーカー測定キット。
（１０）さらに、予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備える前記（７）から（９）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカー測定キット。
（１１）前記膵疾患マーカーがＣＥＡである前記（７）から（１０）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカー測定キット。
　本発明の一態様の膵疾患マーカーの検出方法は、膵液排出刺激剤を投与した後に直接膵管から採取された純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様に高い精度で、膵液排出刺激剤を使用せず、かつ膵管へのカテーテル挿入を要することなく、ＣＥＡ等の膵疾患マーカーを検出することができる。つまり、膵管へのカテーテル挿入処理に伴う偶発症のリスクがない上に、従来法と比較して簡便かつ低コストであるため、本発明の膵疾患マーカーの検出方法によって、膵疾患の疑いのない患者に対しても、より安全に膵液検査を実施することができる。したがって、本発明の膵疾患マーカーの検出方法により、膵癌の検査を広く一般的に普及させられることが期待できる。
実施例１において、自然排出された十二指腸液（セクレチン前）とセクレチン刺激後に排出された十二指腸液（セクレチン後）の各十二指腸液中のｐ－アミラーゼ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１において、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。 実施例１において、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。 実施例１において、自然排出された（セクレチン投与なし）十二指腸液中ＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。 実施例１において、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、膵癌と良性腫瘍（ＳＣＮ）とを識別するマーカーとして用いた場合のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析の結果を示した図である。
　本発明及び本願明細書において、膵疾患マーカーは、膵液中に含まれているタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子であって、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子である。なお、膵疾患の非罹患者は、健常者に限らず、膵疾患以外の疾患の罹患者をも含む。また、膵疾患としては、例えば、膵癌、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、ＭＣＮ（粘液性嚢胞腫瘍）、ＳＣＮ（漿液性嚢胞腫瘍）、ＮＥＴ（膵内分泌腫瘍）、慢性膵炎（ＣＰ）、急性膵炎等が挙げられる。
　膵液とは、膵管から十二指腸の腸管内に排出される体液である。十二指腸液（十二指腸の腸管内に存在する腸管液）には、膵液に加えて、同じく乳頭部より排出された胆汁や、十二指腸壁から排出される十二指腸分泌液、血液等も含まれている。また、本発明及び本願明細書において、自然に排出された膵液とは、セクレチン等の膵液排出刺激剤が投与されていない状態で、膵管から十二指腸の腸管内に排出された膵液を意味する。
　膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。これら種々の消化酵素の活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性されてしまう。そのため、膵液中の目的とする生体分子を検査する際に、十二指腸へ排出された膵液を測定試料とした場合には、正確な測定はできないと考えられていた。
　このため、従来は、膵液中の膵疾患マーカーを、臨床検査に要求される精度で検査するためには、十二指腸の腸管内に排出される前の純粋膵液を、膵臓の乳頭部へカテーテルを挿入し膵管から直接採取することが必要であると考えられていた（例えば、非特許文献３及び４参照）。また、測定試料として十二指腸液を用いる場合には、セクレチン等の膵液排出刺激剤を投与し、この刺激によって十分量の膵液を十二指腸へ排出させる必要があると考えられていた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
　これらの従来の知見にもかかわらず、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度が、膵液排出刺激剤による刺激後に膵管から直接採取された純粋膵液中の膵疾患マーカーの濃度と同様に、膵疾患への罹患の有無・発症リスクの大小を反映していることが、本発明者らによって明らかにされた。つまり、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、膵疾患の非罹患者に比べて、膵疾患の罹患者において高い。このため、被験者から採取された十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出し、その濃度を測定することによって、この被験者が膵疾患に罹患しているか否かや、膵疾患の発症リスクを、従来法のなかで最も精度・信頼性の高い方法（膵液排出刺激剤による刺激後に膵管から直接採取された純粋膵液を測定試料とする方法）と同程度に高い精度で調べることができる。
　すなわち、本発明の態様の膵疾患マーカーの検出方法（以下、本発明の膵疾患マーカーの検出法と称する）は、被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定することを特徴とする。本発明の膵疾患マーカーの検出方法では、膵液排出刺激剤による刺激が不要であるため、より低コストに実施することができる。また、膵液排出刺激剤による刺激後の膵液を採取する場合、一般的には刺激後３０～４５分経過後に膵液は採取されるが、本発明においては、十二指腸の腸管内に溜まっている十二指腸液が採取されるため、より短時間（例えば、数分～十数分間程度）で採取することができる。さらに、乳頭部の膵管へのカテーテル挿入を行わないため、より非侵襲的かつ簡便に、膵疾患マーカー検出のための測定試料とする体液を採取することができる。すなわち、本発明の膵疾患マーカーの検出方法は急性膵炎等の検査の偶発症発症のリスクがないため、そのリスクからこれまで明らかに膵疾患がある患者にのみしか実施できなかった膵疾患マーカー検査を、膵疾患の発症の有無が不明である被験者に対しても、より安全に実施することができる。
　本発明の膵疾患マーカーの検出方法において用いられる十二指腸液は、膵液排出刺激剤を投与されていない被験者の十二指腸の腸管内から採取された液である。十二指腸の腸管内のどこから採取された十二指腸液であってもよいが、十二指腸の第二ポーション又は第三ポーションに存在する十二指腸液であることが好ましい。十二指腸の第一ポーションは胃の幽門部から直接つながる部位であり、胃液の混入の可能性があること、また、採取のための内視鏡の固定が比較的難しく、採取が難しい場合があること等のためである。
　十二指腸液の採取方法は、十二指腸の腸管内の貯留液を採取可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えば、十二指腸液を内視鏡カテーテルに接続したシリンジや真空ポンプなどの吸引手段にて採取することができる。具体的には、内視鏡を口腔から十二指腸まで挿入し、かんしチャネルを挿通して挿入したカテーテルを用いて、十二指腸の第二・第三ポーションに存在する十二指腸液を吸引し採取する。例えば、いわゆる胃カメラとしての胃・十二指腸の内視鏡検査（上部内視鏡検査）のついでに、十二指腸の腸管内に貯留している十二指腸液を採取し、得られた十二指腸液中の膵疾患マーカーを検査してもよい。
　採取された十二指腸液に対して、採取後ただちに又は数時間以内に、膵疾患マーカーの測定試験が実施されることが好ましいが、採取後から所定期間保存した後の十二指腸液を、疾患マーカーの濃度測定試験に供してもよい。採取された十二指腸液は、冷蔵又は冷凍で保存してもよく、室温で保存してもよく、凍結乾燥処理を行い、凍結粉末として保存してもよい。また、十二指腸液中の消化酵素の分解を抑制するような物質を十二指腸液に混合した状態で保存することもできる。具体的には、膵疾患マーカータンパク質を分解するタンパク質分解酵素に対するタンパク質分解酵素阻害剤を混合することが好ましく、特に膵液中に豊富なセリンプロテアーゼ阻害剤を混合することが好ましい。タンパク質分解酵素阻害剤等は、生体から十二指腸液を採取した後に混合してもよく、タンパク質分解酵素阻害剤等を予め入れた容器に十二指腸液を採取することもできる。
　採取された十二指腸液は、そのまま膵疾患マーカーの測定試験に用いてもよく、遠心分離処理等により、細胞等の固形分を分離除去した後に用いてもよい。その他、採取された十二指腸液を適当なバッファー等で希釈した希釈液や、十二指腸液又はその希釈液に各種添加剤を添加したものを、膵疾患マーカーの測定試験に用いてもよい。添加剤としては、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。
　本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーは、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子であればよく、特に限定されるものではない。本発明においては、膵疾患マーカーは、糖タンパク質や酵素等の、十二指腸液中に含まれている消化酵素の影響を受け難い生体分子であることが好ましい。本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーとしては、糖タンパク質であるＣＥＡ、ＣＡ１９－９（例えば、非特許文献３等参照）、ＭＵＣ－１（ＫＬ－６）（例えば、特開２００６－３０８５７６号公報等参照）、酵素であるＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）（例えば、Pancreas, 2002, vol.24, No.54, p344-347参照。）、ＭＭＰ７（Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７）等が挙げられる。その他にもS100Pなど膵疾患に罹患している患者において膵液中で有意に高くなる物質が上げられる。
　本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーは、ＣＥＡであることが特に好ましい。自然排出された膵液を含む十二指腸液中のＣＥＡ濃度を指標とすることによって、膵癌、ＩＰＭＮ、ＭＣＮ、慢性膵炎、及び急性膵炎等の発症の有無や発症リスク等を調べることができる。
　本発明の膵疾患マーカーの検出方法においては、十二指腸液中の膵疾患マーカーを、抗原抗体反応を利用して検出する。抗原抗体反応を利用して検出する場合には、固相に固定されたすなわち、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を十二指腸液に接触させ、形成された抗原抗体複合体を、固相上で検出する。例えば、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を予め固相に固定させておき、この固相に十二指腸液を接触させて、固定化された抗体（若しくは抗原）と膵疾患マーカーを結合させ、形成された複合体を検出する。逆に、十二指腸液中の生体分子を予め固相に固定させておき、この固相に膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を接触させて固定化された膵疾患マーカーと結合させ、形成された複合体を検出する。
　抗原又は抗体を固定する固相としては、例えば、ニトロセルロース膜等の高分子膜、アガロースゲル、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル等のゲル、プラスチックチューブやマイクロプレート等の容器の内表面、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等が挙げられる。固相に固定された抗原又は抗体に対して形成された抗原抗体複合体を検出する方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法、ドットプロット法、スロットブロット法、免疫電気泳動法、免疫拡散法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックスビーズ等を用いた免疫凝集法や、磁気ビーズを用いた免疫測定法、SPR等が挙げられる。抗原又は抗体の固定化方法、及びこれらの方法は、測定対象として十二指腸液を用い、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を用いる以外は、常法により行うことができる。
　抗原抗体反応を用いて液相で検出することもできる。液相で検出する場合には、標識した抗体と抗原との結合を、FCS、FRET等で測定することもできる。
　また、抗原の存在をTOF-MS等の分子量測定で測定することもできる。
　本発明の実施形態においては、迅速かつ簡便であり、また、定量的な検出も容易であることから、イムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法により膵疾患マーカーを検出することが好ましく、イムノクロマトグラフィー法により検出することがより好ましい。例えば、予め膜表面上に膵疾患マーカーに対する抗体が固定化されたニトロセルロース膜に、十二指腸液を滴下し、この十二指腸液中の膵疾患マーカーを固定化された抗体と結合させ、形成された複合体を検出する。この複合体と結合する抗体として、蛍光物質、金コロイド、酵素等により予め標識した標識済抗体を用いることにより、この複合体をバンドとして検出することができる。
　十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを既知濃度の膵疾患マーカーを用いて作成された検量用の色見本と目視で比較することにより、定性的に測定することができる。また、バンドの濃さを光学的に測定し、既知濃度の膵疾患マーカーを用いて同様に検出されたバンドの濃さと比較することによっても、簡便に求めることができる。さらに、バンドの濃さと膵疾患マーカーの濃度との関係を表す検量線を予め作成しておき、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを光学的に測定し、検量線から換算することにより、十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を求めることもできる。
　自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、膵疾患を発症している罹患者のほうが、膵疾患の非罹患者よりも高い傾向にある。このため、被検者の十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を利用して、この被検者の膵疾患への罹患可能性を判断することができる。予め膵疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値を設定し、被検者の十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、この濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する。この濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が膵疾患に罹患している可能性が高いと判断することができる。このように、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、所定の閾値と比較することにより、膵疾患を検出することができる。
　膵疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値は、膵疾患マーカーの種類、膵疾患マーカーの検出方法等を考慮して、実験的に設定することができる。例えば、膵疾患に罹患していないことが分かっている集団から採取された十二指腸液と、この疾患に罹患していることが分かっている集団から採取された十二指腸液とに対して、本発明の検出方法を行って自然に排出された十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。
　例えば、ＣＥＡを膵疾患マーカーとする場合、膵癌の罹患者と非罹患者（良性腫瘍であるＳＣＮの罹患者）とを分ける閾値は、５０～２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度とすることが好ましく、１００～１５０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度とすることがより好ましい。閾値をこの範囲内に設定することにより、本発明の膵疾患マーカーの検出方法によって、被験者が膵癌に罹患しているか否かを、臨床上十分な感度及び特異度で識別することができる。特に、膵癌を確実に検出できるのみならず、膵癌のハイリスクとなるＩＰＭＮや、治療の対象となるＭＣＮ等も拾い上げることができ、自覚症状のない膵疾患を広く拾い上げることができる。また、ＣＥＡ濃度が高濃度であれば、進行した膵癌である可能性が高いため、迅速な精密検査と治療の開始が必要と判断することもできる。
　具体的には、膵疾患マーカーがＣＥＡの場合、予め膜表面上に抗ＣＥＡ抗体が固定化されたニトロセルロース膜（イムノクロマト）に、十二指腸液を、膜上に固定化された抗体とはエピトープ部位が異なる標識済抗ＣＥＡ抗体とともに滴下し、このニトロセルロース膜の膜表面上に、固定化された抗ＣＥＡ抗体とＣＥＡと標識済抗ＣＥＡ抗体とからなる複合体を形成させる。形成されたバンドは、この標識済抗ＣＥＡ抗体中の標識により、バンドとして検出される。イムノクロマト上のＣＥＡ濃度は、所定濃度のＣＥＡを添加した場合に得られるバンドが記載された色見本のバンド濃度と目視で比較し、バンドの濃さから定量することもできる。また、バンドの濃さを光学的に測定して、所定の検量線等から換算してＣＥＡ濃度を換算することもできる。例えば、イムノクロマト上のバンドの濃さを、５０ｎｇ／ｍＬと２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ濃度のバンドが記載された色見本と比較し、これらの２本のバンドの間の濃さであった場合、又は２００ｎｇ／ｍＬのバンドより濃かった場合に、陽性（測定に用いられた十二指腸液が採取された被験者が、膵癌、ＩＰＭＮ、ＭＣＮ、慢性膵炎、及び急性膵炎等の膵疾患、特に膵癌に罹患している可能性が高い）と判断することができる。
　また、ＩＰＭＮやＭＣＮ等の良性が多い場合の疾患ではＣＥＡ濃度は比較的低く、進行した膵癌や進行した慢性膵炎ではＣＥＡ濃度が高いことが想定される。このため、適当な閾値を設定することにより、膵癌以外の特定の膵疾患への罹患可能性の大小を判断することも期待できる。
　このように、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、イムノクロマトグラフィー法のような迅速キットによって測定することにより、十二指腸液の採取が行われる内視鏡室で迅速かつ簡便に陽性陰性の判断（被験者に膵疾患があるかどうかの判定）を行うことができる。したがって、本発明の膵疾患マーカーの検出方法を用いることにより、安全かつ高性能で迅速な膵癌のスクリーニング検査を行うことができるため、進行が早く、数ヶ月で死に至る膵癌の可能性を、十二指腸液の採取後速やかに判断でき、精密検査への動機づけや予約を迅速に行うことにより、迅速に膵癌の治療を開始することができる。
　十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出するための方法に使用する試薬・装置等をキット化することにより、本発明の膵疾患マーカーの検出方法をより簡便に実施することができる。本発明の他態様である、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キット（以下、本発明の膵疾患マーカー測定キットと称する）としては、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を予め固定させた固相、例えば、膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を含むことが好ましい。この膜としては、例えば、イムノクロマトグラフィー用テストストリップが挙げられる。この測定キットは、膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有することも好ましい。また、この測定キットは、さらに予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備えていてもよい。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　膵疾患を疑われる患者７３例から、十二指腸液を採取しＣＥＡ濃度を測定した。
　一晩絶食した患者に、内視鏡を十二指腸の第二ポーションまで挿入し、膵管造影用のカテーテル（オリンパス社製、製品名：ＰＲ－１３０Ｑ）を用いて、第二、第三ポーション全体の十二指腸壁に浅く溜まっている十二指腸液を採取した。採取は、カテーテルの内視鏡外の手元側に接続したシリンジを吸引することによって行った。２から３分間程度で平均１ｍＬ程度の十二指腸液が採取できた。十二指腸の第一ポーションでは、胃側に内視鏡が抜けてしまい、安定な採取をすることができなかった。
　自然に排出された十二指腸液を採取後に、７３例のうち４７例に対してさらにセクレチン（カイロクリン社製）を静注し、２から３分間後、第二、第三ポーション全体の十二指腸壁に浅く溜まっている十二指腸液を同様にして採取した。セクレチン刺激後には、２から３分間程度で約１．５ｍＬから約２ｍＬの十二指腸液が採取できた。
　その後、各患者に対してさらに画像診断又は病理検査を行い、最終診断を行った。最終診断の結果、７３例中膵癌４１例、ＩＰＭＮ１７例、ＭＣＮ２例、ＳＣＮ６例、ＮＥＴ３例、慢性膵炎（ＣＰ）４例であった。７３例のうち、自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった患者４７例の内訳は、膵癌２９例、ＩＰＭＮ７例、ＭＣＮ２例、ＳＣＮ３例、ＮＥＴ１例、慢性膵炎（ＣＰ）1例であった。
　自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった４７例の患者から採取された２種類の十二指腸液（自然排出された十二指腸液と、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液）中のｐ－アミラーゼ濃度及びＣＥＡ濃度を、それぞれ測定した。ｐ－アミラーゼ濃度は、酵素法（Ｇａｌ－Ｇ２－ＣＮＰ基質法）によって測定した。また、ＣＥＡ濃度は、市販のキット（ＩＢＬ社製）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。
　図１に、自然に排出された十二指腸液（セクレチン刺激前）とセクレチン刺激後に排出された十二指腸液（セクレチン後）の両方の採取が可能であった４７例の患者について各十二指腸液中のｐ－アミラーゼ濃度の測定結果を示す。セクレチン投与前の十二指腸液であっても、セクレチン投与後の十二指腸液とほぼ同程度のｐ－アミラーゼが含有されていることがわかった。ｐ－アミラーゼは膵液に由来するものであり、十二指腸液中には膵臓由来の膵液が自然に排出され含まれており、自然に排出された十二指腸液中からも、膵液由来の成分が検出できることが確認された。
　図２、図３、及び表１に、自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった４７例患者の十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した。図２は、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を示し、図３は、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を示した。この結果、疾患別の十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、自然排出（セクレチン投与無し）された十二指腸液と、セクレチン投与後に排出された十二指腸液とで、ほぼ同等であった。また、非特許文献４等の過去の報告と比較しても、本実施例における自然排出（セクレチン投与無し）された十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、乳頭部にカニュレーションして採取した純粋膵液のＣＥＡ濃度とも同様の濃度域であった。これらの結果から、自然に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定した場合であっても、純粋膵液のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様の膵疾患識別効果が得られることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　７３例の自然排出された（セクレチン投与なし）十二指腸液中ＣＥＡ濃度を十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、図4および表２に疾患別に示した。
　また、ほぼ図２と同様に十二指腸液のＣＥＡ濃度は膵癌で高く、膵疾患として治療対象となるＩＰＭＮや慢性膵炎（ＣＰ）も高値を示していた。ＮＥＴについては悪性のＮＥＴは良性のＮＥＴのデータよりもＣＥＡ濃度が高い結果となった。経過観察対象である良性腫瘍のＳＣＮは低値で図２と一致した結果であった。そこで、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度が、膵癌を良性腫瘍（本発明ではＳＣＮ）と識別するためのマーカーとして使用可能かどうかを調べるため、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を行った。ＲＯＣ解析は、ＰＡＳＷ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｖｅｒ．１８（ＩＢＭ製）を用いて作図した。解析結果を図５に示す。この結果、膵癌を良性腫瘍と区別するためのカットオフ値（閾値）は、純粋膵液中のＣＥＡ濃度やセクレチン投与後に採取された十二指腸液中のＣＥＡ濃度とほぼ同等であった。本実施例における膵癌の検出感度は感度７１％、特異度１００％であり、過去の報告にある純粋膵液中のＣＥＡ濃度を指標とした場合よりも勝るものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次いで、膵癌と良性腫瘍（本発明ではＳＣＮ）を区別するためのカットオフ値を、３０から２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内で設定し、カットオフ値ごとの感度及び特異度を算出した。算出結果を表３に示す。この結果、カットオフ値を１００から１５０ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、特異度が８０％以上であっても、感度が７０％以上であり、検査として利用価値のある感度が得られた。また、当該カットオフ値に設定した場合には、ＭＣＮ等の疾患から膵癌の検出を行うことも可能となり、より膵癌の特異度の高い検査が期待できる。また、膵癌だけでなくNETについても良悪性の判断ができることが期待できる。一方でカットオフ値を５０ｎｇ／ｍＬに設定すると、特異度は５０％であり、１００から１５０ｎｇ／ｍＬに設定した場合よりも半減するものの、感度が９３％であり、非常に高感度な膵癌の検査を実施することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２］
　市販のＣＥＡイムノクロマトキット（製品名：ラナマンモカードＣＥＡ、日本化薬社製）を用いて、実施例１で用いた自然排出された十二指腸液検体中のＣＥＡを検出した。ＣＥＡ濃度は、当該キット添付のバンドの色見本と、各十二指腸液検体から検出されたイムノクロマトのバンドの濃さを比較して、目視で判定した。
　この結果、色見本の１００ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬと比較した場合の十二指腸液検体のバンドの濃さと、ＥＬＩＳＡによるＣＥＡ濃度の測定値には相関が認められ、十二指腸液中のＣＥＡ濃度がイムノクロマトグラフィー法によっても測定可能であることが確認された。
［実施例３］
　カテーテルの内視鏡外の手元側に接続したシリンジ内に予めプロテアーゼ阻害剤（製品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）を入れておき、実施例１の患者のうち４７例から、このカテーテルを介して十二指腸液を吸引した。吸引された十二指腸液は、シリンジ内でプロテアーゼ阻害剤と混合された後に、チューブに移し変えて凍結保存された。対照として、シリンジ内にプロテアーゼ阻害剤が予め含まれていないカテーテルを介して採取された十二指腸液も同様に、チューブに移し変えて凍結保存された。
　保存後の各十二指腸液のＣＥＡ濃度及びＳ１００Ｐ濃度を測定した。ＣＥＡ濃度は、実施例１と同様にして測定した。また、Ｓ１００Ｐ濃度は、市販のキット（サイクレックス社製）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４及び５に、十二指腸液中のＣＥＡ濃度及びＳ１００Ｐ濃度の測定結果を、疾患別に示した。この結果、ＣＥＡ濃度については、プロテアーゼ阻害剤を添加して保存した十二指腸液（表４中、「阻害剤有り」）とプロテアーゼ阻害剤を添加せずに保存した十二指腸液（表４中、「阻害剤無し」）とでは、あまり濃度に違いがないことがわかった。一方でＳ１００Ｐ濃度は、プロテアーゼ阻害剤を添加して保存した十二指腸液（表５中、「阻害剤有り」）のほうが、プロテアーゼ阻害剤を添加せずに保存した十二指腸液（表５中、「阻害剤無し」）よりも有意に濃度が高かった。個々の症例を確認すると、阻害剤無しで測定不能だった検体が、測定可能となった例が複数あった。これらの結果から、Ｓ１００Ｐを膵疾患マーカーとした場合には、生体から採取された十二指腸液に予めプロテアーゼ阻害剤を混合することにより、Ｓ１００Ｐ濃度を測定する前に、この十二指腸液中のＳ１００Ｐの消化が抑制されるため、Ｓ１００Ｐの検出精度が向上することが確認された。
　本発明の膵疾患マーカーの検出方法は、急性膵炎発症のリスク等がなく安全である上に、膵液排出刺激を行った後に膵管に挿入されたカテーテルから直接採取した純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等の精度で膵疾患マーカーを検出することができるため、膵液を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。

Claims (11)

  1. 　被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法。
  2. 　前記膵疾患マーカーの検出が、前記マーカー濃度を測定し、前記濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定することを特徴とする請求項１に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
  3. 　前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
  4. 　前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであり、
    　前記膵疾患が膵癌であり、
    　前記閾値が、５０～２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度であることを特徴とする請求項２に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
  5. 　前記十二指腸液が、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された状態で保存された十二指腸液であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
  6. 　前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
  7. 　自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キットであって、
    　前記膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする膵疾患マーカー測定キット。
  8. 　さらに、前記膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有することを特徴とする請求項７に記載の膵疾患マーカー測定キット。
  9. 　前記膜が、イムノクロマトグラフィー用テストストリップであることを特徴とする請求項７又は８に記載の膵疾患マーカー測定キット。
  10. 　さらに、予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備えることを特徴とする請求項７～９のいずれか一項に記載の膵疾患マーカー測定キット。
  11. 　前記膵疾患マーカーがＣＥＡであることを特徴とする請求項７～１０のいずれか一項に記載の膵疾患マーカー測定キット。
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