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WO2010098613A9 - Ｔｍ７ｓｆ３를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 및 항 ｔｍ７ｓｆ３ 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Ｔｍ７ｓｆ３를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 및 항 ｔｍ７ｓｆ３ 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2010098613A9
WO2010098613A9 PCT/KR2010/001222 KR2010001222W WO2010098613A9 WO 2010098613 A9 WO2010098613 A9 WO 2010098613A9 KR 2010001222 W KR2010001222 W KR 2010001222W WO 2010098613 A9 WO2010098613 A9 WO 2010098613A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
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tm7sf3
liver cancer
antibody
antigen
preventing
Prior art date
Application number
PCT/KR2010/001222
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English (en)
French (fr)
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WO2010098613A3 (ko
WO2010098613A2 (ko
Inventor
성영철
양세환
최소영
이지영
김세원
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Publication of WO2010098613A2 publication Critical patent/WO2010098613A2/ko
Publication of WO2010098613A3 publication Critical patent/WO2010098613A3/ko
Publication of WO2010098613A9 publication Critical patent/WO2010098613A9/ko

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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
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    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Definitions

  • the present invention relates to a liver cancer diagnostic composition containing TM7SF3 as an active ingredient, a liver cancer diagnostic kit containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient.
  • Liver cancer is the most common tumor in the world and more than 1 million people die from it every year. In Korea, the mortality rate is 32 males per 100,000 population and 10.6 females. The relative frequency of liver cancer among all cancers is 15.5%. It is second only to stomach cancer and 4.5% of women. In addition, as the age of the liver tends to increase.
  • liver cancer Risk factors for liver cancer include hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), cirrhosis, alcohol, smoking, oral contraceptives, aflatoxins (fungal toxins), and protein anabolic steroids.
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • cirrhosis alcohol
  • alcohol smoking
  • oral contraceptives hepatitis B and the incidence of liver cancer
  • aflatoxins fungal toxins
  • protein anabolic steroids hepatitis B and the incidence of liver cancer are intimately related.
  • 65-80% of liver cancer patients are carriers of hepatitis B virus, and hepatitis B carriers have a 100-fold higher risk of developing liver cancer.
  • the molecular mechanisms in liver cancer cells have not been elucidated yet.
  • liver cancer Since liver cancer has very few early symptoms, it is very difficult to suspect liver cancer early on. Therefore, symptoms such as liver failure, jaundice, ascites, loss of appetite, and indigestion caused by failure to maintain normal liver function are symptoms of late stage cancer or as cancer cells gradually proliferate. It is so fast that it usually dies within six months of being diagnosed. Therefore, the early diagnosis of liver cancer and the appropriate treatment method according to the clinical condition of the patient is important.
  • TM7SF3 transmembrane 7 superfamily member 3
  • CD133 which is known as a marker of human hematopoietic stem cells.
  • the gene sequence and amino acid sequence of TM7SF3 have been confirmed, but no antibody has been produced so far, and there is no study on the function of these proteins.
  • the present inventors have studied the function of the TM7SF3 protein and anti-TM7SF3 antibody, the TM7SF3 protein is hardly expressed in liver tissue of normal humans, but is highly expressed in liver cancer tissue of liver cancer patients, and the anti-TM7SF3 antibody is expressed in TM7SF3 cells. It was confirmed that only the liver cancer cells caused by TM7SF3 overexpression selectively induced by a specific binding to the foreign domain and specifically reacted with the liver cancer cell line, and completed the present invention.
  • the present invention is to provide a liver cancer diagnostic composition containing TM7SF3 as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a liver cancer diagnostic kit containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a method for detecting TM7SF3 in liver tissue through an antigen-antibody binding reaction using an antibody that specifically binds TM7SF3.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a TM7SF3 antigen expressing gene vaccine used in the present invention.
  • Fig. 2 shows the results of observing the antigen specificity of the anti-TM7SF3 polyclonal antibody of the present invention in the serum of mice to which the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine was administered using an enzyme immunoassay (ELISA).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FIG. 3 is a schematic diagram of pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4 ⁇ TM-IRES-EGFP, which is a vector expressing an antigen on a cell surface.
  • Fig. 4 shows the results of observing the antigen specificity of the anti-TM7SF3 polyclonal antibody of the present invention in the serum of mice to which the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine was administered using a cell-based FACS assay.
  • Figure 5 is a diagram showing the results observed by Western blotting of the human TM7SF3 full form protein recognition ability of the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) of the present invention.
  • Figure 6 shows the reactivity of the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) of the present invention with human liver cancer cell lines (PLC / PRF / 5 and SNU475), mouse liver cancer cell line (MIH-2), human non-hepatic cancer cell line (U-118MG) The figure which showed the result observed by FACS analysis.
  • Figure 7 is a diagram showing the results observed by Western blotting the expression of TM7SF3 protein in normal liver tissue, liver cancer patients liver tissue and liver normal tissue.
  • the present invention is to provide a liver cancer diagnostic composition containing TM7SF3 as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a liver cancer diagnostic kit containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for detecting TM7SF3 in liver tissue through an antigen-antibody binding reaction using an antibody that specifically binds to TM7SF3.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer containing an anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient.
  • TM7SF3 protein as an active ingredient in the liver cancer diagnostic composition of the present invention is hardly expressed in liver tissue of normal people, but is specifically expressed in liver cancer tissue of liver cancer patients. Therefore, the TM7SF3 protein of the present invention can be usefully used as a marker for diagnosing liver cancer.
  • the TM7SF3 may include all TM7SF3 present in mammals such as human (Homo sapiens), mouse (Mus musculus), rat (Rattus norvegicus), and in the present invention, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (accession number NP_057635 on NCBI database) Human TM7SF3 with) is preferred.
  • the TM7SF3 mRNA may include all of the TM7SF3 mRNA present in mammals such as humans, mice, and rats, and in the present invention, has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (accession number NM_016551 on the NCBI database, cDNA of TM7SF3 mRNA) Preferred is mRNA of human TM7SF3.
  • liver cancer diagnostic kit containing the anti-TM7SF3 antibody of the present invention as an active ingredient can be easily prepared by the production method commonly used in the art using the TM7SF3.
  • the liver cancer diagnostic kit may include an anti-TM7SF3 antibody, a secondary antibody conjugate conjugated with a label to be developed by reaction with a substrate, a color substrate solution to be color-reacted with the label, a wash solution, and an enzyme stopping solution. Can be.
  • the label of the secondary antibody conjugate is preferably a conventional coloring agent that performs a color reaction, horseradish peroxidase (HRP), basic alkaline phosphatase (colloid gold), colloidal gold (colloid gold), poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate ), Fluorescent materials such as rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), dyes and the like can be used.
  • HRP horseradish peroxidase
  • colloid gold basic alkaline phosphatase
  • colloidal gold colloidal gold
  • poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate
  • Fluorescent materials such as rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), dyes and the like can be used.
  • the chromogenic substrate solution is preferably used according to the label, TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid )], OPD (o-phenylenediamine) and the like can be used.
  • the color development substrate is more preferably provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1M NaOAc, pH 5.5).
  • the wash preferably comprises phosphate buffer, NaCl and Tween 20, more preferably a buffer consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20 (PBST).
  • PBST 0.05% Tween 20
  • the washing solution is reacted with the secondary antibody to the antigen-antibody conjugate, and then washed 3 to 6 times by adding an appropriate amount to the fixture.
  • sulfuric acid solution may be used as the reaction terminating solution.
  • the present invention can detect TM7SF3 in liver tissue through an antigen-antibody binding reaction using an antibody that specifically binds TM7SF3, thereby predicting the diagnosis or prognosis of liver cancer early.
  • the TM7SF3 is electrophoresed on SDS-PAGE, fractionated and transferred to the immobilized body, followed by immobilization of the antibody to specifically bind to the extracellular domain of the immobilized TM7SF3. The expression level is measured.
  • TM7SF3 expression level in liver cancer tissue is measured by measuring the expression level of TM7SF3 in liver cancer tissue, and comparing the measured expression level with the expression level of TM7SF3 in normal liver tissue, if TM7SF3 expression level in liver cancer tissue is higher than TM7SF3 expression level in normal liver tissue, In other words, it is diagnosed as having liver cancer or predicted to have the possibility of liver cancer.
  • a nitrocellulose membrane As the fixture for the antigen-antibody coupling reaction, a nitrocellulose membrane, a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) membrane, a 96 well plate synthesized with polyvinyl resin or polystyrene resin, glass slide glass, or the like may be used.
  • PVDF polyvinylidene difluoride membrane
  • the antigen-antibody binding reaction is conventional enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIIA), sandwich assay, Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, fluid Flow cytometry, fluorescence activated cell sorting (FACS), enzymatic substrate coloration, antigen-antibody aggregation, etc. may be used.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RAIA radioimmunoassay
  • sandwich assay Western blotting
  • immunoprecipitation immunohistochemical staining
  • fluid Flow cytometry fluid Flow cytometry
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • enzymatic substrate coloration antigen-antibody aggregation, etc.
  • the anti-TM7SF3 antibody as an active ingredient in the liver cancer diagnostic kit of the present invention and the pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer is characterized in that it specifically binds to the extracellular domain of TM7SF3 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the antibody may be a whole form of an antibody (hereinafter referred to as "antibody") or a functional fragment thereof.
  • the whole antibody may be in the form of a monomer or a multimer in which two or more whole antibodies are bound.
  • the functional fragment of the antibody is an antibody having the heavy and light chain variable regions of the whole antibody, which means to recognize the same antigen binding site (epitope) that the whole antibody recognizes.
  • Functional fragments of the antibody include, but are not limited to, single chain variable region fragments (scFv), (scFv) 2 , Fab, Fab 'and F (ab') 2 , and the like.
  • the single chain variable region (scFv) refers to an antibody fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked through a linker peptide to take the form of a single chain polypeptide.
  • the antibody can be modified by binding to various molecules such as enzymes, fluorescent materials, radioactive materials and proteins. Modified antibodies can be obtained by chemically modifying the antibody. Such modification methods are commonly used in the art.
  • the antibody is obtained as a chimeric antibody in which a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody are combined, or complementarity derived from a non-human antibody. It may be obtained as a humanized antibody in which a constant region is combined with a frame work region (FR) derived from a human antibody including a crystal site.
  • FR frame work region
  • the antibody may be a method known in the art, such as a protein or peptide vaccine, or a gene vaccine to immunize a mammal such as a mouse, sheep, rat, rabbit; Phage display method; Or it can be produced using a yeast display method, of which the method using a gene vaccine has a number of advantages over other methods. Genetic vaccines can reduce the effort and time required to purify antigenic proteins from bacteria, and can also overcome technical limitations in the purification process since the purification of antigenic proteins is omitted. In addition, in the case of immunization with a gene vaccine, since the antigenic protein is expressed in vivo, it has the same structure as the original three-dimensional structure of the protein, and the antibody produced thereby is more suitable for the purpose of cell separation. In particular, when TM7SF3, a membrane protein protein that is difficult to separate and purify proteins, is an antigen, a method of producing an antibody using a gene vaccine is more useful.
  • TM7SF3 a membrane protein protein that is difficult to separate and pur
  • Anti-TM7SF3 antibody of the present invention is produced as a polyclonal antibody and a monoclonal antibody using a gene vaccine method, the anti-TM7SF3 monoclonal antibody was named GX28 mAb.
  • mice vaccinated with the TM7SF3 antigen expressing gene vaccine of the present invention show high absorbance values on ELISA for cell lysates containing the TM7SF3 antigen, unlike the serum of mice not vaccinated with the TM7SF3 antigen expressing gene vaccine. This means that there is a polyclonal antibody specific for the TM7SF3 antigen in mouse serum.
  • serum obtained from mice vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine responded to Cos7 cells expressing the TM7SF3 antigen on the cell surface, whereas serum from mice vaccinated with the gene vaccine expressing the gankirin antigen protein expressed TM7SF3 antigen. It does not respond to expressing Cos7 cells.
  • the serum obtained from the mice vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine of the present invention contains a polyclonal antibody that specifically binds to TM7SF3.
  • the anti TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) according to the present invention recognizes the human TM7SF3 protein ( ⁇ 64 kD) and specifically reacts with liver cancer cell lines.
  • the anti-TM7SF3 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of TM7SF3, and specifically reacts with liver cancer cell lines to selectively induce apoptosis because only liver cancer cells caused by TM7SF3 overexpression are induced. It can be usefully used for the prevention or treatment of.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having an anticancer effect together with the anti TM7SF3 antibody.
  • known active ingredients having the anticancer effect are IL-15 (Interleukin-15), GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor), IL-12, IL-7, IL-2, calicheamicin, 4- [3,5-bis (trimethylsilyl) benzamido] benzoic acid, docetaxel, doxorubicin, cisplatin, fluorouracil, interferon, epirubicin, paclitaxel, iodine-131 (Iodine-131 or radioiodine) as radioisotope And the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as an antioxidant, buffer And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, with intravenous injection being particularly preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient.
  • the daily dosage of the composition is about 1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg, preferably about 0.1 mg / kg to 20 mg / kg, and more preferably, administered once to several times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of liver cancer.
  • the pGX10 vector (Korean Patent Publication No. 10-2003-47667) was cut with restriction enzymes Kpn I and Xba I, and then the synthesized tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd co nucleotide (SEQ ID NO: 4) was used as a ligase.
  • the recombinant vector pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd co was prepared by ligation.
  • Tpa tissue plasminogen activator
  • Tpa tissue plasminogen activator
  • GS linker is the base sequence of linker consisting of glycine and serine
  • ILZ Isoleucine Zipper
  • mCD40Lecd co murine CD40 Ligand extracellular domain
  • mCD40Lecd co is an extracellular domain of the murine CD40 ligand can play a role in increasing humoral antibody response in mice, and uses codon-optimized genes to enhance expression.
  • the amino acid sequence of human TM7SF3 (accession number NP_057635 on the NCBI database) is shown by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of human TM7SF3 mRNA (accession number NM_016551, cDNA of TM7SF3 mRNA on the NCBI database) is shown by SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the TM7SF3 antigen expressing gene vaccine used in the present invention is shown in FIG. 1.
  • mice 100 ⁇ g of the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine prepared in Example 1 was balb at 1 to 2 weeks intervals by hydrodynamic injection (Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999). / c mice were inoculated five times. Within 3 days before the last inoculation, blood was collected using microcapillary tubes in the ocular blood vessels of mice, and only serum after coagulation of blood was recovered to produce polyclonal antibodies that specifically bind to TM7SF3.
  • Example 2 after the last inoculation of the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine, spleens were isolated from the mice and the cells obtained by lysing erythrocytes were counted, followed by SP2 / O and 5: 1 as myeloma cells. I mixed it. Three washes with DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium) containing 10 mM HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid] buffer, followed by pre-warmed PEG 1 ml of (polyethylene glycol) was dropped within 1 minute to proceed cell fusion.
  • DMEM Disbecco's Modified Essential Medium
  • HAT medium Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine media
  • DMEM conditioned medium
  • Example 2 serum obtained from a mouse vaccinated with TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine
  • serum obtained from a mouse vaccinated with TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine was used.
  • Those with higher optical density (O.D) values than the positive control were selected and transferred to 24 wells.
  • the initial hybridoma clones were screened by dispensing 200 cells per 96 wells and incubating for 10 days to select a single colony. Only the positive cells were grown again and the 50 cells were divided and screened once more. Hybridoma cells were selected.
  • mice were injected with 5 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 hybridoma cells washed twice with serum-free DMEM. Checking at 3 to 5 days intervals when the abdominal cavity was filled (ascites), the ascites was drawn using an 18G injection needle. After leaving the ascites for 1 to 2 hours at room temperature, centrifuged at 3,500rpm for 30 minutes at 4 °C to remove the mass material including the yellow fat layer to separate only the supernatant. The separated supernatant was aliquoted and stored at -20 ° C.
  • the anti TM7SF3 monoclonal antibody contained in the plural supernatants was named GX28 mAb.
  • Example 2 20 ⁇ g of the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine prepared in Example 1 was added to 5 ⁇ 10 6 Cos7 cells (Korea Cell Line Bank) by electric stimulation to express the fusion protein for 36 to 48 hours, followed by three freezes. Cell lysates were obtained through freezing & thawing.
  • the serum obtained in Example 2 was used. Specifically, 50 ⁇ l of an anti-CD40L antibody (anti-CD40L Ab, where CD40L is the same as CD154 as CD40 ligand) is coated in a well of a plate by 50 ⁇ l, and the cell lysate is added thereto. After 50 ⁇ l of 50: 1 was added, the serum obtained in Example 2 was diluted 1: 100 as a test antibody.
  • an anti-CD40L antibody anti-CD40L Ab, where CD40L is the same as CD154 as CD40 ligand
  • anti-mouse immunoglobulin G (anti-mouse IgG Ab) bound with horseradish peroxidase (HRP), anti-mouse IgA Ab, anti-mouse immunity Dilute globulin M (anti-mouse IgM Ab) at 1: 3000, and add 50 ⁇ l of TMB (substrate, cat #: 50-76-00, KPL, USA) solution as a substrate for horseradish peroxidase. After the reaction was performed for 10 minutes in the light blocking conditions, the reaction was stopped by adding 50 ⁇ l of stop solution (2N H 2 SO 4 ), and the absorbance (optical density, OD) was measured and quantified. As a negative control group, serum of mice not vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine was used.
  • mice vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine were tested on ELISA for cell lysates containing the TM7SF3 antigen, unlike the negative control group (serum of mice not vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine). High absorbance values are shown. This means that there is a polyclonal antibody specific for the TM7SF3 antigen in mouse serum.
  • pCI-neo (Cat #: E1841, Promega, USA) vector containing a neomycin-resistance gene (neo) was treated with restriction enzymes Sal I and Not I, and then Klenow enzyme was used. The sticky ends were made in the form of smooth ends, which were in turn linked using ligase.
  • PCI-neo treated by the above method was digested with restriction enzyme Xho I, and the sticky terminal was made into smooth terminal form using Klenow enzyme, and then treated with Xba I restriction enzyme.
  • the schematic diagram of pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4 ⁇ TM-IRES-EGFP which is a vector which expresses the obtained antigen on the cell surface is shown in FIG.
  • TM7SF3 The gene encoding the extracellular domain of TM7SF3 (SEQ ID NO: 3) was treated with restriction enzymes of NotI and AscI and inserted into pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4 ⁇ TM-IRES-EGFP vector treated with the same restriction enzyme. After binding to ligase to prepare a TM7SF3 antigen cell surface expression vector.
  • the internal ribosome entry site is a base sequence that allows transcription of two genes but translation of the protein more than once. This allows for the simultaneous expression of several genes by one promoter.
  • Enhanced green fluorescence protein (EGFP) was used as a reporter protein, and neomycin-resistance gene, neo ) was used as a marker gene. remind neo To Host cells transformed with a recombinant expression vector comprising a resistance to aminoglycoside-based antibiotics, and can be more stably transformed cells by treatment with an antibiotic such as G418 in the medium.
  • tpa is a signal sequence of human tissue plasminogen activating factor and is located at the 5 'end of the gene encoding the antigen, thereby inducing the antigen to be expressed on the surface of the host cell.
  • the nucleotide encoding the transmembrane domain (CD4 transmembrane domain, CD4 ⁇ TM) of the CD4 together with the signal sequence is located at the 3 'end of the antigen-coding nucleotide, whereby the antigen is expressed on the surface of the host cell and separated from the cultured host cell.
  • Antibody detection can be performed by directly contacting a host cell with a biological sample that is believed to contain the antibody, without treatment of.
  • TM7SF3 antigen cell surface expression vector prepared in 1 was transfected into Cos7 cells (Korea Cell Line Bank) to obtain cells for FACS. Specifically, 5 ⁇ 10 6 Cos7 cells were placed in 300 ⁇ l cell culture medium (DMEM with 10% Bovine serum), 20 ⁇ g of the TM7SF3 antigen cell surface expression vector prepared above was mixed, followed by electroporation ( Electrophoresis) was transferred to a cuvette (Cat #: 165-2588, Bio-Rad, USA) to give an electrical stimulation at 240V to deliver the expression vector into Cos7 cells.
  • DMEM cell culture medium
  • Electrophoresis Electrophoresis
  • a green fluorescence protein (EGFP) expression vector without inserting the TM7SF3 antigen gene was transferred into Cos7 cells in the same manner as above.
  • the electrostimulated Cos7 cells were incubated for 36-48 hours in 37 °C, CO 2 incubator using a cell culture.
  • the cultured cells were harvested and washed with FACS buffer (0.5% FBS, 0.09% NaN 3 PBS), followed by serum obtained from Example 2 (serum obtained from mice vaccinated with TM7SF3 antigen expressing gene vaccine) and negative controls. Serum obtained from mice vaccinated with gene vaccines expressing gankyrin antigen protein was reacted by diluting 1: 100 in FACS buffer. Unbound antibodies were washed with FACS buffer, then combined with an anti-mouse Ig-APC secondary antibody to which the dye for FACS analysis was linked and finally washed, followed by FACS analysis.
  • FACS buffer 0.5% FBS, 0.09% NaN 3 PBS
  • serum obtained from Example 2 serum obtained from mice vaccinated with TM7SF3 antigen expressing gene vaccine
  • negative controls Serum obtained from mice vaccinated with gene vaccines expressing gankyrin antigen protein was reacted by diluting 1: 100 in FACS buffer. Unbound antibodies were washed with FACS buffer, then
  • serum obtained from mice vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine responded to Cos7 cells expressing the TM7SF3 antigen on the cell surface, whereas serum from the vaccinated mice expressing the gankyrin antigen protein was obtained. Serum did not respond to Cos7 cells expressing TM7SF3 antigen. In addition, all serum did not respond to Cos7 cells expressing only green fluorescent protein (EGFP) without expressing the antigen. From the above results, it can be seen that the serum obtained from the mice vaccinated with the TM7SF3 antigen-expressing gene vaccine of the present invention contains a polyclonal antibody that specifically binds to TM7SF3.
  • TM7SF3 protein recognition ability of the anti-TM7SF3 monoclonal antibody of the present invention in particular, the full form protein recognition ability rather than the extracellular domain of TM7SF3, the human TM7SF3 gene (Accession Nos. NM_016551, TM7SF3 mRNA in the NCBI database)
  • the following experiments were carried out by Western blotting using lysates of Cos7 cells transfected with cDNA).
  • Electrode transfer kit electrophore transfer kit
  • transfer buffer 2.5mM Tris, 6.9mM glycine, 20% methanol
  • the protein-electrophoretic membrane was completely transferred to a blocking solution (5% skim milk powder in PBS-T (1% Tween 20)) and shaken for 8 hours.
  • the primary antibody, anti-TM7SF3 monoclonal antibody was diluted to 1 / 1,000 in PBS-T (0.1% Tween 20). Shake incubation for 16 hours at 4 °C.
  • the anti TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) recognizes the human TM7SF3 protein ( ⁇ 64kD).
  • the anti TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) obtained in Example 3 was used by purification from a plurality of supernatants using an IgM Purification kit (IgM Purification kit, cat #: 44897, Pirece, USA). Cancer cell lines used in the experiment were glioma (U-373 MG, U-118 MG, LN-18, U-343 MG, C6Bu1) and liver cancer (HepG2, Hep3B, HuH-7, PLC / PRF / 5, SNU475, Hepa -1c1c7, MIH-2) cell line was used.
  • ⁇ g of the purified anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) was diluted in 100 ⁇ l FACS buffer and reacted with various cancer cell lines (using 2.5 ⁇ 10 5 cells).
  • Anti-mouse IgM-Biotin (cat #: 13-5890-81, eBioscience, USA) secondary antibody that specifically washes unbound antibody with FACS buffer and then specifically binds to IgM isotype antibody Bound and unbound antibodies were washed out with FACS buffer.
  • FACS analysis was performed after binding to the APC streptavidin (cat # 554067, BD Pharmingen, USA), which was chemically bound to biotin while the dye for FACS analysis was linked.
  • mouse IgM Isotype Control (clone #: 11E10; cat #: 14-4752-82, eBioscience, USA) was used as a negative control antibody.
  • the results of the reactivity between the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) and various cancer cell lines of the present invention are shown in Table 1, and the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) and human liver cancer cell lines (PLC / PRF / 5) of the present invention.
  • SNU475), mouse liver cancer cell line (MIH-2), human non-hepatic cancer cell line (U-118MG) was confirmed by FACS analysis results are shown in Figure 6 results.
  • the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) of the present invention is highly compatible with liver cancer cell lines, especially human liver cancer cell lines (PLC / PRF / 5 and SNU475) and mouse liver cancer cell line (MIH-2). While actively responding, they rarely reacted with human non-hepatic cancer cell lines.
  • the anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb) of the present invention specifically reacts with liver cancer cell lines.
  • TM7SF3 protein in human liver cancer tissues, Western blotting analysis was performed using proteins extracted from liver tissues of normal people, liver cancer tissues of liver cancer patients, and liver normal tissues.
  • Liver tissues of normal people, liver cancer tissues of liver cancer patients, and normal liver tissues were obtained from Gastroenterology, Catholic University of Korea.
  • 300 ⁇ l of protein lysis solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 1% Triton X, into about 50 mg of liver tissue from the sacrificed mice -100] was added and ground using a tissue mill (MagNa Lyser, Roche, USA). 300 ⁇ l of protein lysis solution was added to the decomposed liver tissues, incubated with liver tissues for 30 minutes on ice, and then centrifuged at 4 ° C.
  • Membrane with complete protein electrophoresis was placed in a blocking solution [5% skim milk powder in PBS-T (1% Tween 20)] and shaken for 8 hours. After washing the blocking solution with PBS-T (0.1% Tween 20) for 30 minutes, the primary antibody, anti-TM7SF3 monoclonal antibody (GX28 mAb), was diluted to 1 / 1,000 in PBS-T (0.1% Tween 20). Shake incubation for 16 hours at 4 °C.
  • the secondary antibody Anti-mouse Ig (H + L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat # 170-6516, Biorad, USA
  • the film was developed by applying a Western detection solution to the membrane and then sensitizing the film in a dark room.
  • TM7SF3 protein was hardly detected in liver tissue of normal persons, and was specifically expressed in liver cancer tissue of liver cancer patients.
  • a tablet was prepared by a direct tableting method.
  • the powder was prepared by mixing the above components, the powder was filled in a hard capsule according to the conventional method for preparing a capsule to prepare a capsule.
  • the amount of the above-mentioned ingredient was prepared per ampoule (2 ml).
  • Each component was added and dissolved in purified water according to the conventional method for preparing a liquid, and lemon flavor was added appropriately, followed by mixing the above components. Then, purified water was added thereto to adjust the total volume to 100 ml, and then filled in a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.
  • the TM7SF3 protein of the present invention is rarely expressed in liver tissue of normal humans, but is specifically expressed in liver cancer tissues of liver cancer patients, and thus can be usefully used as a marker for diagnosing liver cancer since it can predict the diagnosis or prognosis of liver cancer early.
  • the anti-TM7SF3 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of TM7SF3, and specifically reacts with liver cancer cell lines to selectively induce apoptosis because only liver cancer cells caused by TM7SF3 overexpression are prevented. It can be usefully used for treatment.
  • composition for diagnosis of hepatocellular carcinomas comprising
  • hepatocellular carcinomas comprising anti TM7SF3 antibody
  • caaatacttg agaaattacc ttttggttta caaatctatg atcaacttat tccattaaat 2040

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Abstract

본 발명은 TM7SF3를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TM7SF3 단백질은 정상인의 간 조직에서는 거의 발현되지 않으나, 간암 환자의 간암 조직에서는 특이적으로 높게 발현됨으로써, 간암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있어 간암 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항 TM7SF3 항체는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 간암 세포주와 특이적으로 반응하여 TM7SF3 과발현에 의해 야기되는 간암 세포만 선택적으로 세포사멸을 유도하므로, 간암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＴＭ７ＳＦ３를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 및 항 ＴＭ７ＳＦ３ 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 TM7SF3를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
간암은 세계적으로 가장 흔한 종양으로 매년 백만명 이상이 이 병으로 사망하고 우리나라에서도 그 사망률은 인구 10만명 당 남자 32명, 여자 10.6명으로, 모든 암 중에서 간암이 차지하는 상대적 빈도는 남자의 경우 15.5%로 위암에 이어 2위이고, 여자의 경우 4.5%를 차지한다. 또한 나이가 많을수록 간암의 발병이 증가하는 경향을 보인다.
간암의 위험 요인은 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 간경변, 알콜, 흡연, 경구 피임약, 아플라톡신(곰팡이에서 생기는 독소), 단백동화 스테로이드 등이 있다. 특히 B형 간염의 유병률과 간암 발생률은 밀접한 관계를 나타내는데, 간암 환자의 65~80%가 B형 간염 바이러스 보균자이며 B형 간염 바이러스 보균자의 간암 발생 위험도는 보통 사람에 비해 100배 이상 높다고 알려져 있다. 그러나 아직까지 간암 세포내의 분자 메커니즘은 명확히 규명되어 있지 않다.
간암은 초기 증상이 거의 없기 때문에 초기에 증상을 통해 간암을 의심한다는 것은 매우 어렵다. 따라서, 정상적인 간 기능을 유지하지 못함으로 인해 나타나는 간부전, 황달, 복수, 식욕감퇴, 소화불량 등의 증상은 간암 말기나 암세포가 점차 증식함에 따라 나타나는 증상으로, 간암이 확진되면 그 예후도 좋지 않고 진행 속도도 매우 빨라 진단을 받은 뒤 6개월 안에 사망하는 것이 보통이다. 그러므로 간암의 조기 진단 및 환자의 임상 상태에 따른 적절한 치료 방법이 중요하다.
따라서, 간암을 조기에 진단하기 위하여 간암 세포에서 특이적으로 고발현되거나 저발현되는 유전자의 DNA 마커 또는 단백질 마커를 이용하는 방법이 활발히 연구되고 있다.
한편, 세포 표면 단백질인 TM7SF3(transmembrane 7 superfamily member 3)은 인간 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)의 마커로 알려진 CD133을 발현하는 세포에서 높게 발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 TM7SF3의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 확인되었으나, 아직까지 이에 대한 항체가 제조된 바가 없고, 이들 단백질의 기능에 대한 연구도 전무한 상태이다.
본 발명자들은 TM7SF3 단백질의 기능과 항 TM7SF3 항체에 대해 연구하던 중, TM7SF3 단백질이 정상인의 간 조직에서는 거의 발현되지 않으나, 간암 환자의 간암 조직에서는 특이적으로 높게 발현되고, 항 TM7SF3 항체는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 간암 세포주와 특이적으로 반응하여 TM7SF3 과발현에 의해 야기되는 간암 세포만 선택적으로 세포사멸을 유도함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 TM7SF3를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간 조직에서 TM7SF3을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명에 사용되는 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신의 모식도이다.
도 2는 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성을 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 항원을 세포표면에 발현하는 벡터인 pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP의 모식도이다.
도 4는 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성을 세포기반의 FACS 분석법을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)의 인간 TM7SF3 전체 단백질(full form protein) 인식능을 웨스턴 블롯팅을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)와 인간 간암 세포주 (PLC/PRF/5와 SNU475), 마우스 간암 세포주(MIH-2), 인간 비간암 세포주(U-118MG)와의 반응성을 FACS 분석법으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 정상인의 간 조직, 간암 환자의 간암 조직 및 간 정상 조직에서 TM7SF3 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯팅을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 TM7SF3를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간조직에서 TM7SF3을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 간암 진단용 조성물에서 유효성분인 TM7SF3 단백질은 정상인의 간 조직에서는 거의 발현되지 않으나, 간암 환자의 간암 조직에서는 특이적으로 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 TM7SF3 단백질은 간암 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 TM7SF3은 인간(Homo sapiens), 마우스(Mus musculus), 랫트(Rattus norvegicus) 등의 포유류에 존재하는 TM7SF3을 모두 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NP_057635)을 갖는 인간 TM7SF3이 바람직하다.
상기 TM7SF3의 mRNA는 인간, 마우스, 랫트 등의 포유류에 존재하는 TM7SF3의 mRNA를 모두 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 2의 염기서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NM_016551, TM7SF3 mRNA의 cDNA)을 갖는 인간 TM7SF3의 mRNA가 바람직하다.
또한, 본 발명의 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트는, 상기 TM7SF3를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.
상기 간암 진단 키트는 항 TM7SF3 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.
상기 이차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간 조직에서 TM7SF3을 검출하여, 간암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 구체적으로는, TM7SF3을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 전이하여 고정시킨 후, 고정된 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, TM7SF3의 발현 수준을 측정한다. 즉, 간암 조직에서 TM7SF3의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 발현 수준을 정상 간 조직에서의 TM7SF3의 발현 수준과 비교하여, 간암 조직에서의 TM7SF3 발현 수준이 정상 간 조직에서의 TM7SF3 발현 수준보다 높으면, 간암을 갖는 것으로 진단하거나 간암의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.
상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 유효성분인 항 TM7SF3 항체는, 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 항체는 전체 형태의 항체(이하 "전항체"라고 함) 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.
상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 항체는 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 백신, 또는 유전자 백신으로 마우스, 양, 랫트, 토끼와 같은 포유동물을 면역화하는 방법; 파지 디스플레이 방법; 또는 효모 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있는데, 이 중 유전자 백신을 사용하는 방법이 다른 방법에 비해 여러 가지 이점이 있다. 유전자 백신을 이용하는 경우 박테리아에서 항원 단백질을 정제하는데 소요되는 많은 노력과 시간을 줄일 수 있고, 항원 단백질의 정제과정이 생략되므로 정제과정에서의 기술적인 제약도 극복할 수 있다. 또한, 유전자 백신에 의한 면역 접종의 경우 항원 단백질이 생체 내에서 발현되므로 단백질의 본래의 3차원적인 구조와 동일한 구조를 가지고, 이에 의해 생성된 항체는 세포분리와 같은 목적에 더 적합하다. 특히, 단백질 분리 및 정제가 어려운 세포막 표면 단백질(transmembrane protein)인 TM7SF3이 항원인 경우 유전자 백신을 이용하여 항체를 생산하는 방법이 보다 유용하다.
본 발명의 항 TM7SF3 항체는 유전자 백신 방법을 이용하여 다클론항체와 단일클론항체로 생산되며, 항 TM7SF3 단일클론항체를 GX28 mAb으로 명명하였다.
본 발명의 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스의 혈청은 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청과는 달리 TM7SF3 항원을 포함하는 세포용해물에 대해서 ELISA 상에서 높은 흡광도 값을 나타낸다. 이는 마우스 혈청 내에 TM7SF3 항원에 특이적인 다클론항체가 있음을 의미한다. 또한, TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3 항원을 세포표면에 발현하는 Cos7 세포에 반응하는 반면, 갠키린 항원 단백질을 발현하는 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3 항원을 발현하는 Cos7 세포에 반응하지 않는다. 또한, 항원을 발현하지 않고 녹색형광단백질(EGFP)만 발현하는 Cos7 세포에는 모든 혈청이 반응하지 않는다. 상기 결과로부터, 본 발명의 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하고 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)는 인간 TM7SF3 단백질(~64kD)을 인식하고, 간암 세포주와 특이적으로 반응한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 항 TM7SF3 항체는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 간암 세포주와 특이적으로 반응하여 TM7SF3 과발현에 의해 야기되는 간암 세포만 선택적으로 세포사멸을 유도하므로, 간암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 항 TM7SF3 항체와 함께 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분은 IL-15(Interleukin-15), GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), IL-12, IL-7, IL-2, 칼리키아마이신(calicheamicin), 4-[3,5-비스(트리메틸실릴)벤즈아미도]벤조산, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 플루오로우라실, 인터페론, 에피루비신, 파클리탁셀, 방사성 동위원소로서 요오드-131(Iodine-131 또는 radioiodine) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 정맥주사제가 특히 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 조성물의 일일 투여량은 약 1㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 간암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : TM7SF3 항원 발현 유전자 백신의 제작
pGX10 벡터(대한민국 공개특허공보 제 10-2003-47667호)를 제한효소 KpnI과 XbaI로 자른 후, 합성된 tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecdco 뉴클레오티드(서열번호 4)를 리가아제로 연결하여 재조합 벡터 pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecdco를 제작하였다. tpa(tissue plasminogen activator)는 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자의 신호서열로서 단백질 분비를 촉진하기 위해서 사용하였고, GS linker는 글리신, 세린으로 이루어진 링커의 염기 서열이며, ILZ(Isoleucine Zipper)는 강제적 삼량화 집행 영역(trimerizaion-enforcing domain)으로 융합 단백질을 삼량화하여 항체 반응을 증가시키고자 하였다. 또한, mCD40Lecdco(murine CD40 Ligand extracellular domain)는 뮤린 CD40 리간드의 세포외 도메인으로 마우스에서의 체액성 항체반응을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 발현 증진을 위해서 코돈 최적화된 유전자를 이용하고 있다. 상기 재조합 벡터의 MCS(multicloning site; 다중클로닝 부위)에 TM7SF3 유전자의 세포외 도메인에 해당하는 뉴클레오티드[서열번호 3, GenScript사 (Piscataway, NJ, USA)에 합성을 의뢰하여 얻음]를 NotI과 AscI으로 제한한 후 연결함으로써 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 수득하였다. 인간 TM7SF3의 아미노산 서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NP_057635)은 서열번호 1로 나타내었고, 인간 TM7SF3 mRNA의 염기서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NM_016551, TM7SF3 mRNA의 cDNA)은 서열번호 2로 나타내었다.
본 발명에 사용되는 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신의 모식도는 도 1에 나타내었다.
실시예 2 : 항 TM7SF3 다클론항체의 생산
상기 실시예 1에서 제조한 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신 100㎍을 액체역학 주사법(hydrodynamic injection; Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999)에 의해 1주 내지 2주 간격으로 Balb/c 마우스에게 5회 접종하였다. 마지막 접종 전 3일 이내에 마우스의 안구혈관에서 미세모세관 튜브(microcapillary tube)를 이용하여 혈액을 채취하고, 혈액의 응고 후 혈청만을 회수하여 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 생산하였다.
실시예 3 : 항 TM7SF3 단일클론항체의 생산
1. 하이브리도마 세포의 제작
상기 실시예 2에서 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 마지막으로 접종한 후 마우스로부터 비장을 분리하고 적혈구를 용해시켜 얻은 세포를 카운트(counting) 한 후 골수종 세포(myeloma cell)인 SP2/O와 5:1로 섞어주었다. 10mM HEPES[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid] 완충액을 함유한 DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium)으로 3번 세척한 후, 세포가 잘 퍼지도록 한 상태에서 미리 데운(pre-warmed) PEG(polyethylene glycol) 1㎖를 1분 이내에 떨어뜨려 세포융합을 진행하였다. 미리 데운 10mM HEPES 완충액을 함유한 DMEM 완충액 1㎖를 1분 이내에 떨어뜨린 후 10mM HEPES를 함유한 DMEM 10㎖를 동일한 방법으로 2번 떨어뜨렸다. 세포를 상층액과 분리한 후 HAT 배지(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine media)와 조건배지(conditioned media, SP2를 16시간 정도 배양했었던 DMEM)를 1:1로 섞어서 200㎕씩 96웰 플레이트에 분주하였다. 2~3일 간격으로 HAT 배지로 교체해 준 후 융합한 지 11일째부터 하이브리도마 클론 (hybridoma clone)의 융합상태(confluence)가 50% 이상일 때 스크리닝을 수행하였다. 양성대조군으로는 상기 실시예 2에서 얻은 혈청(TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청)을 사용하였다. 양성대조군보다 높은 흡광도 (Optical Density, O.D) 값을 보이는 것을 선택하여 24웰로 옮겨주었다. 초기 하이브리도마 클론은 96웰 당 200개의 세포를 분주하고 10일간 배양하여 단일 콜로니 (colony)가 형성된 것만 선택하여 스크리닝 하였고, 양성으로 나온 것은 다시 키워서 50개의 세포를 분주하여 한 번 더 스크리닝하여 최종 하이브리도마 세포를 선택하였다.
2. 하이브리도마 세포로부터 항 TM7SF3 단일클론항체의 생산
상기 1에서 선택한 최종 하이브리도마 세포로부터 항 TM7SF3 단일클론항체를 생산하기 위하여, 마우스 복강(abdominal cavity) 내에 프리스탄(pristane) 0.5㎖를 주사하였다. 프리스탄 투여 7일 후 마우스 복강 내에 무혈청(serum-free) DMEM으로 2번 세척한 하이브리도마 세포 5×106 ~ 1×107을 주사하였다. 3일 내지 5일 간격으로 확인하여 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 실온에서 1~2시간 방치한 후, 4℃에서 3,500rpm으로 30분 동안 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다. 복수 상층액에 포함되어 있는 항 TM7SF3 단일클론항체를 GX28 mAb로 명명하였다.
실험예 1 : TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스 혈청 내에서 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성 확인 : 효소면역측정법(ELISA)
TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여, 샌드위치 효소면역측정법 (Sandwich ELISA)을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신 20㎍을 5×106의 Cos7 세포(한국 세포주 은행)에 전기 자극의 방법으로 넣어서 융합 단백질을 36시간 내지 48시간 동안 발현시킨 다음, 3번의 동결융해(freezing & thawing)를 거쳐서 세포용해물(cell lysates)을 얻었다. 혈청은 상기 실시예 2에서 얻은 혈청을 사용하였다. 구체적으로는, 0.5㎍/㎖의 항-CD40L 항체(anti-CD40L Ab, 여기서 CD40L은 CD40 리간드를 의미하는 것으로서 CD154와 동일함)를 플레이트의 웰에 50㎕씩 코팅하고, 여기에 세포용해물을 50:1로 50㎕ 넣어준 후에, 시험용 항체로서 상기 실시예 2에서 얻은 혈청을 1:100으로 희석하여 넣어주었다. 그 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 항-마우스 면역글로불린 G (anti-mouse IgG Ab), 항-마우스 면역글로불린 A(anti-mouse IgA Ab), 항-마우스 면역글로불린 M(anti-mouse IgM Ab)을 1:3000으로 희석하여 넣어주고, 호스래디쉬 퍼옥시다제의 기질로서 TMB(substrate, cat #:50-76-00, KPL, USA) 용액 50㎕를 넣어준 후 10분간 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 다음 정지액(2N H2SO4) 50㎕를 넣어 반응을 정지시킨 후, 흡광도(optical density, O.D)를 측정하여 정량화 하였다. 음성대조군으로는 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청을 사용하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스의 혈청은 음성대조군(TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청)과는 달리 TM7SF3 항원을 포함하는 세포용해물에 대해서 ELISA 상에서 높은 흡광도 값을 나타내었다. 이는 마우스 혈청 내에 TM7SF3 항원에 특이적인 다클론항체가 있음을 의미한다.
실험예 2 : TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스 혈청 내에서 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성 확인 : 형광활성화 세포분류법(fluorescence-activated cell sorting, FACS)
TM7SF3 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 TM7SF3 다클론항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여, FACS를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. TM7SF3 항원 세포표면 발현 벡터의 제작
서열번호 5의 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP 뉴클레오티드를 합성하고, KpnI과 XbaI 제한효소를 이용하여 pGX10 벡터(대한민국 공개특허공보 제 10-2003-47667호)에 상기 뉴클레오티드를 삽입한 후, 리가아제로 연결하여 재조합 벡터 pGX10-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP를 제작하였다. 상기 벡터에 HindIII 제한효소를 처리하여 점착성 말단(cohesive end)을 만들고, Klenow 효소로 점착성 말단을 평활성 말단(blunt end) 형태로 만들었다. 이어서, XbaI 제한효소를 처리하여 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP를 포함하는 뉴클레오티드를 수득하였다.
또한, 네오마이신-저항성 유전자(neomycin-resistance gene; neo)를 포함하는 pCI-neo(Cat #: E1841, Promega, USA) 벡터를 제한효소 SalI과 NotI으로 처리한 후, Klenow 효소를 이용하여 점착성 말단을 평활성 말단 형태로 만들고, 이를 다시 리가아제를 이용하여 연결하였다. 상기의 방법으로 처리한 pCI-neo를 제한효소 XhoI으로 절단하고 Klenow 효소를 이용하여 점착성 말단을 평활성 말단 형태로 만든 후, 다시 XbaI 제한효소를 처리하였다.
상기 XbaI 제한효소를 처리한 pCI-neo 벡터에, XbaI 제한효소를 처리한 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP를 포함하는 뉴클레오티드를 도입하고, 리가아제를 처리하여 항원을 세포표면에 발현하는 벡터인 pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP를 수득하였다. 상기 수득된 항원을 세포표면에 발현하는 벡터인 pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP의 모식도는 도 3에 나타내었다.
TM7SF3의 세포외 도메인을 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 NotI과 AscI의 제한효소로 처리하고, 동일한 제한효소로 처리한 pCI-neo-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP 벡터에 삽입한 후 리가아제로 결합하여 TM7SF3 항원 세포표면 발현 벡터를 제작하였다.
TM7SF3 항원 세포표면 발현 벡터에서 내부 리보솜 부착 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES)는 두 개의 유전자에 대해 전사는 한번 일어나지만 단백질의 번역은 두 번 이상 일어날 수 있도록 하는 염기서열로, 두 유전자 사이에 삽입함으로써 하나의 프로모터에 의해 여러 유전자를 동시에 발현시키도록 한다. 녹색형광단백질(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)은 리포터 단백질로 사용되었고, 네오마이신 저항성 유전자(neomycine-resistance gene, neo)는 마커 유전자로 사용되었다. 상기 neo를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열 항생제에 대한 저항성을 가짐으로써, 배지 내에 G418과 같은 항생제를 처리하여 보다 안정적으로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. tpa는 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자의 신호서열로서 항원을 암호화하는 유전자의 5' 말단 쪽에 위치하여 항원이 숙주세포의 표면에서 발현할 수 있도록 유도하는 역할을 수행한다. 상기 신호서열과 함께 CD4의 막통과영역(CD4 transmembrane domain, CD4ΔTM)을 코딩하는 뉴클레오티드를 항원 코딩 뉴클레오티드의 3' 말단 쪽에 위치시킴으로써, 항원이 숙주세포의 표면에 발현되고, 배양된 숙주세포에 대한 별도의 처리 없이 숙주세포를 항체를 포함할 것으로 추정되는 생물학적 시료와 직접 접촉시켜 항체 검출을 수행할 수 있다.
2. TM7SF3 항원에 대한 다클론항체의 특이성
상기 1에서 제작한 TM7SF3 항원 세포표면 발현 벡터를 Cos7 세포(한국세포주 은행)에 형질감염시켜 FACS용 세포를 수득하였다. 구체적으로는, 5×106의 Cos7 세포를 300㎕의 세포배양액(10%의 Bovine serum을 가진 DMEM)에 넣고, 상기 1에서 제작한 TM7SF3 항원 세포표면 발현 벡터 20㎍을 섞은 후, 전기천공(Electroporation)용 큐벳(Cat #: 165-2588, Bio-Rad, USA)에 옮겨서 240V에서 전기자극을 주어 Cos7 세포 내로 발현 벡터를 전달하였다. 음성대조군으로는 TM7SF3 항원 유전자가 삽입되지 않은 녹색형광단백질(EGFP) 발현용 벡터를 위와 동일한 방법으로 Cos7 세포 내로 전달하여 사용하였다. 전기자극을 받은 Cos7 세포는 세포 배양액을 이용하여 37℃, CO2 배양기에서 36~48 시간 동안 배양하였다.
배양한 세포를 수거하여 FACS 완충액(0.5% FBS, 0.09% NaN3의 PBS)으로 세척한 후, 상기 실시예 2에서 얻은 혈청(TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청)과 음성대조군으로 갠키린(gankyrin) 항원 단백질을 발현하는 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청을 FACS 완충액에 1:100으로 희석하여 반응시켰다. 결합하지 않은 항체는 FACS 완충액으로 씻어낸 후, FACS 분석용 염료가 연결된 항-마우스(anti-mouse) Ig-APC 이차 항체와 결합시키고 마지막으로 세척한 후, FACS 분석을 수행하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3 항원을 세포표면에 발현하는 Cos7 세포에 반응하는 반면, 갠키린 항원 단백질을 발현하는 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3 항원을 발현하는 Cos7 세포에 반응하지 않았다. 또한, 항원을 발현하지 않고 녹색형광단백질(EGFP)만 발현하는 Cos7 세포에는 모든 혈청이 반응하지 않았다. 상기 결과로부터, 본 발명의 TM7SF3 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청은 TM7SF3에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하고 있음을 알 수 있다.
실험예 3 : 항 TM7SF3 단일클론항체의 TM7SF3 단백질 인식능 확인
본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체의 TM7SF3 단백질 인식능, 특히 TM7SF3의 세포외 도메인이 아닌 전체 단백질(full form protein) 인식능을 확인하기 위하여, 인간 TM7SF3 유전자(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NM_016551, TM7SF3 mRNA의 cDNA)가 형질감염된 Cos7 세포의 용해물(lysate)을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
인간 TM7SF3 유전자가 형질감염된 Cos7 세포의 용해물과, 음성대조군으로서 형질감염되지 않은 Cos7 세포의 용해물로부터 각각 정량한 단백질 5㎍을 전기영동을 통해 8% 아크릴아미드겔을 이용하여 분리하였다. 전기영동한 겔을 미리 적셔둔 다공성 패드(porous pad)와 3MM 페이퍼(Whatman laboratory Products, Maidstone, UK) 위에 올려놓고 그 위에 PVDF 막(PVDF Western Blottng Membrane, Roche)과 3MM 페이퍼(Whatman), 다공성 패드를 공기 방울이 생기지 않게 잘 덮고 전이 카세트 (transfer cassette)로 압착하였다. 이것을 전극 전이 키트(electrode transfer kit)에 넣고 전이완충액(2.5mM Tris, 6.9mM 글리신, 20% 메탄올)에 완전히 잠기게 한 후 전기이동하였다. 단백질이 완전하게 전기이동된 막을 차단용액(blocking solution) [PBS-T(1% Tween 20) 내 5% 탈지분유]에 넣고 8시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 차단용액을 30분 동안 세척한 후, 일차 항체인 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)를 PBS-T(0.1% Tween 20)에 1/1,000로 희석하여 넣고 4℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 10분 동안 3회에 걸쳐 헹구어준 후, 이차 항체(Anti-mouse Ig(H+L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat# 170-6516, Biorad, USA)를 1/3,000으로 희석하여 넣고 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 20분 동안 3회 헹구어 준 후, 막에 웨스턴 검출용액(western detection solution)을 도포한 후 암실에서 필름에 감광시켜 현상하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)는 인간 TM7SF3 단백질(~64kD)을 인식함을 확인하였다.
실험예 4 : 항 TM7SF3 단일클론항체와 다양한 암세포주와의 반응성 실험
본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체의 다양한 암세포주와의 반응성을 확인하기 위하여, FACS 분석 방법을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3에서 얻은 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)는 IgM 정제 키트 (IgM Purification kit, cat #:44897, Pirece, USA)를 이용하여 복수 상층액으로부터 정제하여 사용하였다. 실험에 사용된 암세포주는 신경교종(U-373 MG, U-118 MG, LN-18, U-343 MG, C6Bu1)과 간암(HepG2, Hep3B, HuH-7, PLC/PRF/5, SNU475, Hepa-1c1c7, MIH-2) 세포주를 사용하였다. 구체적으로는, 상기 정제한 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb) 1㎍을 100㎕의 FACS 완충액에 희석한 후, 다양한 암세포주들(2.5×105 cell 사용)과 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 씻어낸 후, IgM 이소타입 항체에 특이적으로 결합하는 항-마우스(anti-mouse) IgM-Biotin(cat #: 13-5890-81, eBioscience, USA) 이차 항체와 결합시키고, 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 씻어내었다. 마지막으로, FACS 분석용 염료가 연결됨과 동시에 비오틴에 화학적으로 결합하는 APC 스트렙타비딘(cat #554067, BD Pharmingen, USA)과 결합시키고, 마지막으로 세척한 후에 FACS 분석을 수행하였다. 이때 음성 대조 항체로는 마우스 IgM Isotype Control (clone #: 11E10; cat #: 14-4752-82, eBioscience, USA)을 사용하였다.
본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)와 다양한 암세포주와의 반응성 결과는 표 1에 나타내었으며, 본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)와 인간 간암 세포주(PLC/PRF/5와 SNU475), 마우스 간암 세포주(MIH-2), 인간 비간암 세포주(U-118MG)와의 반응성을 FACS 분석법으로 확인한 결과는 도 6에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2010001222-appb-T000001
※ 각 항체와의 반응성 항목의 실험 결과값은 음성 대조 항체에 비해 (1% 미만으로 설정) 양성 반응을 보이는, 즉 항체와 반응성을 보이는 세포를 형광 강도 (fluorescence intensity)를 기준으로 전체 세포에서 차지하는 %로 나타낸 것이다.
표 1 및 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)는 간암 세포주, 특히 인간 간암 세포주(PLC/PRF/5와 SNU475) 및 마우스 간암 세포주(MIH-2)와 매우 활발하게 반응하는 반면, 인간 비간암 세포주와는 거의 반응하지 않았다.
따라서, 본 발명의 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)는 간암 세포주와 특이적으로 반응함을 알 수 있다.
실험예 5 : 인간 간암 조직에서 TM7SF3 단백질의 발현 정도
인간 간암 조직에서 TM7SF3 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여, 정상인의 간 조직, 간암 환자의 간암 조직 및 간 정상 조직으로부터 추출된 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다.
정상인의 간 조직, 간암 환자의 간암 조직 및 간 정상 조직은 가톨릭의대 강남성모병원 소화기내과로부터 얻었다. 상기 간 조직들로부터 단백질을 추출하기 위하여, 희생된 마우스로부터 약 50㎎의 간 조직에 300㎕의 단백질 용해 용액[50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2M NaCl, 5mM CaCl2, 1% Triton X-100]을 첨가하고 조직분쇄기 (MagNa Lyser, Roche, USA)를 사용하여 마쇄하였다. 분해된 간 조직에 300㎕의 단백질 용해 용액을 첨가하여 간 조직과 함께 얼음에서 30분 동안 배양한 후, 15,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 담고 -70℃에서 1시간 이상 냉각시켰다. 이를 실온에서 충분히 녹인 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분 동안 원심분리하고, 분리된 상층액에 EDTA-free 프로테아제 저해제를 첨가한 후 -70℃에 보관하였다.
상기 인간 간 조직 추출 단백질 5㎍을 전기영동을 통해 8% 아크릴아미드겔을 이용하여 분리하였다. 전기영동한 겔을 미리 적셔둔 다공성 패드와 3MM 페이퍼 (Whatman laboratory Products, Maidstone, UK) 위에 올려놓고 그 위에 PVDF 막 (PVDF Western Blottng Membrane, Roche)과 3MM 페이퍼(Whatman), 다공성 패드를 공기 방울이 생기지 않게 잘 덮고 전이 카세트로 압착하였다. 이것을 전극 전이 키트에 넣고 전이완충액(2.5mM Tris, 6.9mM 글리신, 20% 메탄올)에 완전히 잠기게 한 후 전기이동하였다. 단백질이 완전하게 전기이동된 막을 차단용액[PBS-T(1% Tween 20) 내 5% 탈지분유]에 넣고 8시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 차단용액을 30분 동안 세척한 후, 일차 항체인 항 TM7SF3 단일클론항체(GX28 mAb)를 PBS-T(0.1% Tween 20)에 1/1,000로 희석하여 넣고 4℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 10분 동안 3회에 걸쳐 헹구어준 후, 이차 항체(Anti-mouse Ig(H+L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat# 170-6516, Biorad, USA)를 1/3,000으로 희석하여 넣고 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 20분 동안 3회 헹구어 준 후, 막에 웨스턴 검출용액을 도포한 후 암실에서 필름에 감광시켜 현상하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, TM7SF3 단백질은 정상인의 간 조직에서는 거의 검출되지 않았고, 간암 환자의 간암 조직에서는 특이적으로 높게 발현됨을 확인하였다.
하기에 본 발명의 약학 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 산제의 제조
항 TM7SF3 항체 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2 : 정제의 제조
항 TM7SF3 항체 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
제제예 3 : 캡슐제의 제조
항 TM7SF3 항체 0.1 g
옥수수전분 5 g
카복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4 : 주사제의 제조
항 TM7SF3 항체 0.02~0.2 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
안정화제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5 : 액제의 제조
항 TM7SF3 항체 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
본 발명의 TM7SF3 단백질은 정상인의 간 조직에서는 거의 발현되지 않으나, 간암 환자의 간암 조직에서는 특이적으로 높게 발현됨으로써, 간암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있어 간암 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항 TM7SF3 항체는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 간암 세포주와 특이적으로 반응하여 TM7SF3 과발현에 의해 야기되는 간암 세포만 선택적으로 세포사멸을 유도하므로, 간암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
<120> Composition for diagnosis of hepatocellular carcinomas comprising
TM7SF3, and diagnosis kit of hepatocellular carcinomas and
pharmaceutical composition for preventing or treating
hepatocellular carcinomas comprising anti TM7SF3 antibody
<130> P10-08088
<150> KR10-2009-0016773
<151> 2009-02-27
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 570
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Phe Leu Gln Leu Leu Val Val Ala Val Leu Ala Ser Glu His
1 5 10 15
Arg Val Ala Gly Ala Ala Glu Val Phe Gly Asn Ser Ser Glu Gly Leu
20 25 30
Ile Glu Phe Ser Val Gly Lys Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Asn Arg Pro
35 40 45
Phe Pro Glu Glu Ala Ile Leu His Asp Ile Ser Ser Asn Val Thr Phe
50 55 60
Leu Ile Phe Gln Ile His Ser Gln Tyr Gln Asn Thr Thr Val Ser Phe
65 70 75 80
Ser Pro Thr Leu Leu Ser Asn Ser Ser Glu Thr Gly Thr Ala Ser Gly
85 90 95
Leu Val Phe Ile Leu Arg Pro Glu Gln Ser Thr Cys Thr Trp Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Ser Gly Ile Gln Pro Val Gln Asn Met Ala Ile Leu Leu Ser
115 120 125
Tyr Ser Glu Arg Asp Pro Val Pro Gly Gly Cys Asn Leu Glu Phe Asp
130 135 140
Leu Asp Ile Asp Pro Asn Ile Tyr Leu Glu Tyr Asn Phe Phe Glu Thr
145 150 155 160
Thr Ile Lys Phe Ala Pro Ala Asn Leu Gly Tyr Ala Arg Gly Val Asp
165 170 175
Pro Pro Pro Cys Asp Ala Gly Thr Asp Gln Asp Ser Arg Trp Arg Leu
180 185 190
Gln Tyr Asp Val Tyr Gln Tyr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Leu Thr Glu
195 200 205
Glu Met Leu Leu Lys His Leu Gln Arg Met Val Ser Val Pro Gln Val
210 215 220
Lys Ala Ser Ala Leu Lys Val Val Thr Leu Thr Ala Asn Asp Lys Thr
225 230 235 240
Ser Val Ser Phe Ser Ser Leu Pro Gly Gln Gly Val Ile Tyr Asn Val
245 250 255
Ile Val Trp Asp Pro Phe Leu Asn Thr Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Ala
260 265 270
His Thr Tyr Ala Cys Ser Phe Glu Ala Gly Glu Gly Ser Cys Ala Ser
275 280 285
Leu Gly Arg Val Ser Ser Lys Val Phe Phe Thr Leu Phe Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Phe Phe Ile Cys Phe Phe Gly His Arg Phe Trp Lys Thr Glu Leu
305 310 315 320
Phe Phe Ile Gly Phe Ile Ile Met Gly Phe Phe Phe Tyr Ile Leu Ile
325 330 335
Thr Arg Leu Thr Pro Ile Lys Tyr Asp Val Asn Leu Ile Leu Thr Ala
340 345 350
Val Thr Gly Ser Val Gly Gly Met Phe Leu Val Ala Val Trp Trp Arg
355 360 365
Phe Gly Ile Leu Ser Ile Cys Met Leu Cys Val Gly Leu Val Leu Gly
370 375 380
Phe Leu Ile Ser Ser Val Thr Phe Phe Thr Pro Leu Gly Asn Leu Lys
385 390 395 400
Ile Phe His Asp Asp Gly Val Phe Trp Val Thr Phe Ser Cys Ile Ala
405 410 415
Ile Leu Ile Pro Val Val Phe Met Gly Cys Leu Arg Ile Leu Asn Ile
420 425 430
Leu Thr Cys Gly Val Ile Gly Ser Tyr Ser Val Val Leu Ala Ile Asp
435 440 445
Ser Tyr Trp Ser Thr Ser Leu Ser Tyr Ile Thr Leu Asn Val Leu Lys
450 455 460
Arg Ala Leu Asn Lys Asp Phe His Arg Ala Phe Thr Asn Val Pro Phe
465 470 475 480
Gln Thr Asn Asp Phe Ile Ile Leu Ala Val Trp Gly Met Leu Ala Val
485 490 495
Ser Gly Ile Thr Leu Gln Ile Arg Arg Glu Arg Gly Arg Pro Phe Phe
500 505 510
Pro Pro His Pro Tyr Lys Leu Trp Lys Gln Glu Arg Glu Arg Arg Val
515 520 525
Thr Asn Ile Leu Asp Pro Ser Tyr His Ile Pro Pro Leu Arg Glu Arg
530 535 540
Leu Tyr Gly Arg Leu Thr Gln Ile Lys Gly Leu Phe Gln Lys Glu Gln
545 550 555 560
Pro Ala Gly Glu Arg Thr Pro Leu Leu Leu
565 570
<210> 2
<211> 2527
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ccagccctgg cgtgggccca gcccggccca ggcagcaatg gggttcctgc agctgctggt 60
cgtagcggtg ctggcatccg aacaccgggt ggctggtgca gccgaggtct tcgggaattc 120
cagcgagggt cttattgaat tttctgtggg gaaatttaga tacttcgagc tcaataggcc 180
ctttccagag gaagctattt tgcatgatat ttcaagcaat gtgacttttc ttattttcca 240
aatacactca cagtatcaga atacaactgt ttccttttct ccgactctcc tttccaattc 300
ctcggaaaca ggcactgcca gtggactggt tttcatcctt agaccagagc agagtacatg 360
cacttggtac ttggggactt caggcataca gcctgtccag aatatggcta tcctactctc 420
ctactcagaa agagatcctg tccctggagg ctgtaatttg gagttcgatt tagatattga 480
tcccaacatt tacttggagt ataatttctt tgaaacgact atcaagtttg ccccagcaaa 540
cctaggctat gcgagaggcg tagatccccc accatgtgac gctgggacag accaggactc 600
caggtggagg ttgcagtatg atgtctatca gtattttctg cctgagaatg acctcactga 660
ggagatgttg ctgaagcatc tgcagaggat ggtcagtgtg ccccaggtga aggccagtgc 720
tctcaaggtg gttaccctaa cagctaatga taagacaagt gtttccttct cctccctccc 780
gggacaaggt gtcatataca atgtcattgt ttgggacccg tttctaaata catctgctgc 840
ctacattcct gctcacacat acgcttgcag ctttgaggca ggagagggta gttgtgcttc 900
cctaggaaga gtgtcttcca aagtgttctt cactcttttt gccctgcttg gtttcttcat 960
ttgtttcttt ggacacagat tctggaaaac agaattattc ttcataggct ttatcatcat 1020
gggattcttc ttttatatac tgattacaag actgacacct atcaagtatg atgtgaatct 1080
gattctgaca gctgtcactg gaagcgtcgg tggaatgttc ttggtagctg tgtggtggcg 1140
atttggaatc ctctcgatct gcatgctctg tgttggacta gtgctggggt tcctcatctc 1200
gtcagtgact ttctttactc cactgggaaa cctaaagatt tttcatgatg atggtgtatt 1260
ctgggtcact ttctcttgca tagctatcct cattccagta gttttcatgg gctgcctaag 1320
aatactgaac atactgactt gtggagtcat tggctcctat tcggtggttt tagccattga 1380
cagttactgg tccacaagcc tttcctacat cactttgaac gtactcaaga gagcgctcaa 1440
caaggatttc cacagagctt tcacaaatgt gccttttcaa actaatgact tcattatcct 1500
ggcagtatgg ggcatgctgg ctgtaagtgg aattacgtta cagattcgaa gagagagagg 1560
acgaccgttc ttccctcccc acccatacaa gttatggaag caagagagag agcgccgagt 1620
gacaaacatt ctggacccta gctaccacat tcctccattg agagagaggc tctatggccg 1680
attaacccag attaaagggc tcttccagaa ggagcagcca gctggagaga gaacgccttt 1740
gcttctgtag atgcccaggg gcttggtcag tgtgcctcag ctttggagtt catgcctgga 1800
gtggttcaac agtctctggt gcaagtctaa taagagatca ggcatatata tctgttcttt 1860
gcataatatt atggtgccct tattgatata tggtaagggt gtactagggg attaggatga 1920
ttgtaagaga atgagaaaga tgaccaaaag gttggtggta gggaggcttt ttcttatttc 1980
caaatacttg agaaattacc ttttggttta caaatctatg atcaacttat tccattaaat 2040
agatacatta aaaaaattaa aaactgcaaa aaaaaaaaaa aaactggtgt ttctttttat 2100
aaccccttga aacaagtctc tcacctgagc ctgtctaaac tttcggaggg agtttattat 2160
tgagtcttta tctgtgacag tatttggaga tttagggatt tgatacttag gcctttgaat 2220
tttagaatac aaaaagagaa gcaagccaga catggtggct cacacctgta atcccaatac 2280
tgggaagcca aggtgggagt atcgcttgag cccaggagtt tgagaccgac atgggcaaca 2340
tgacaagacc ccatctctac aaaaaaaatt aaaaaattag ccaggcatgg tggcacatgc 2400
ctactcccag ctcccaagga gactgagatg ggaggatccc tggagccctg aagattgagg 2460
ctacagtgag ccttgattgt gtcactgcac tccagcttgg gtgacagaga ccctgtctcg 2520
agaaatt 2527
<210> 3
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> extracellular domain gene of transmembrane 7 superfamily member
3(TM7SF3)
<400> 3
gcagaggtct ttggcaactc ttcggaggga ttaattgagt tctcagttgg gaagttccgg 60
tacttcgaac tgaaccgtcc tttcccagag gaagctatcc tgcacgatat cagctccaat 120
gtcacattcc ttatcttcca gattcactcc caataccaaa acacaactgt gtccttttca 180
cccacgctcc tttctaactc gagcgaaacg ggcacagctt caggactggt gtttatcttg 240
cgcccagagc agtctacatg cacttggtac ctgggaacaa gcggcattca gccagtgcag 300
aacatggcga tattgctgag ttattctgaa agagatcccg taccaggtgg ctgcaacttg 360
gaatttgacc tggacataga tcctaatatc tacctagagt ataacttttt tgagactacc 420
atcaaatttg ctcccgcgaa tctggggtac gcacggggag ttgatcctcc cccgtgtgac 480
gccggcacag accaagacag ccggtggcga ctgcagtatg acgtctacca gtattttctc 540
ccggaaaatg accttaccga ggaaatgtta ctcaaacatt tacagaggat ggtgagcgtg 600
ccacaggtta aagcatctgc cctgaaggtt gtgaccttga ccgctaatga caagaccagc 660
gtgtctttct ccagtctccc tggtcagggg gtgatctaca acgtcattgt atgggatccc 720
ttcctgaaca caagcgccgc ctatattcca gcacatacct atgcctgtag tttcgaggcg 780
ggcgaaggaa gttgcgcatc cctgggacgt gtgtcttcta aagggtccgg cagtgggagc 840
gggagtggga gtacccctct gggaaatcta aagatattcc atgatgacgg agtgggcagc 900
ggaagcggga gcggctcagg cagcctgaat gtcctaaaga gagcactgaa taaggacttc 960
caccgggcct tcaccaatgt c 981
<210> 4
<211> 901
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd nucleotide
<400> 4
ggtaccgcca ccatggatgc tatgaaacgg ggcctgtgct gcgtgctgct cctgtgcggc 60
gctgtgtttg tgagccctag cgctgcggcc gcacgatcga tgatatcgct agctaggcgc 120
gccggcagcg gcagcggcag cggcagcggc agccgatcga gaatgaagca gatcgaggac 180
aaaattgagg aaatcctgtc caagatttac cacatcgaga acgagatcgc ccggattaag 240
aaactcattg gcgagaggag acgcgccaag gtggaggagg aggtgaacct gcatgaggac 300
ttcgtgttca tcaagaagct gaagaggtgc aacaagggcg agggcagcct gagcctgctg 360
aactgcgagg agatgaggag gcagttcgag gacctggtga aggacatcac cctgaacaag 420
gaggagaaga aggagaacag cttcgagatg cagaggggcg acgaggaccc ccagatcgcc 480
gcccatgtgg tgagcgaggc caacagcaac gccgccagcg tgctgcagtg ggccaagaag 540
ggctactaca ccatgaagag caacctggtg atgctggaga acggcaagca gctgaccgtg 600
aagagggagg gcctgtacta cgtgtacacc caggtgacct tctgcagcaa cagggagccc 660
agcagccaga ggcccttcat cgtgggcctg tggctgaagc ccagcagcgg cagcgagagg 720
atcctgctga aggccgccaa cacccatagc agcagccagc tgtgcgagca gcagagcgtg 780
catctgggcg gcgtgttcga gctgcaggcc ggcgccagcg tgttcgtgaa cgtgaccgag 840
gccagccagg tgatccatag ggtgggcttc agcagcttcg gcctgctgaa gctgctctag 900
a 901
<210> 5
<211> 1721
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tpa-Myc-MCS-CD4deltaTM-IRES-EGFP nucleotide
<400> 5
ggtaccgcca ccatggatgc tatgaaacgg ggcctgtgct gcgtgctgct cctgtgcggc 60
gctgtgtttg tgagccctag cgctgagcag aaactcatct ctgaagagga tctggcggcc 120
gcacgatcga tgatatcgct agctaggcgc gccctgagtg aaggtgataa ggtcaagatg 180
gactccagga tccaggtttt atccagaggg gtgaaccaga cagtgttcct ggcttgcgtg 240
ctgggtggct ccttcggctt tctgggtttc cttgggctct gcatcctctg ctgtgtcagg 300
tgccggcacc aacagcgcca ggcagcacga atgtctcaga tcaagaggct cctcagtgag 360
aagaagacct gccagtgccc ccaccggatg cagaagagcc ataatctcat ctgagaattc 420
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 480
tgtgtttgtc tatatgtgat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 540
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 600
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 660
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 720
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 780
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tagtcaacaa 840
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga atctgatctg gggcctcggt 900
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaagct ctaggccccc cgaaccacgg 960
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggt gagcaagggc gaggagctgt 1020
tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 1080
gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 1140
gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 1200
tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 1260
tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 1320
cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 1380
tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 1440
acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1500
gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1560
tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1620
gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1680
ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaatctag a 1721

Claims (10)

  1. TM7SF3를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물.
  2. 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
  4. TM7SF3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간 조직에서 TM7SF3을 검출하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 TM7SF3은 정상 간 조직에서는 발현되지 않으나 간암 조직에서는 높게 발현되는 것을 특징으로 하는 TM7SF3을 검출하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 TM7SF3을 검출하는 방법.
  7. 항 TM7SF3 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 TM7SF3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 간암은 TM7SF3 과발현에 의해 야기되는 간암인 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 항체는 다클론항체 또는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2010/001222 2009-02-27 2010-02-26 Ｔｍ７ｓｆ３를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 및 항 ｔｍ７ｓｆ３ 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2010098613A2 (ko)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003004604A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 Genentech, Inc. Phage displayed pdz domain ligands
AU2002364968A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-02 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to hepatic specific genes and proteins
EP1506406B1 (en) * 2002-05-23 2009-03-11 Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre Diagnosis of hepatocellular carcinoma
EP1668155A2 (en) * 2003-09-24 2006-06-14 Oncotherapy Science, Inc. Methods for detecting, diagnosing and treating hepatocellular carcinomas (hcc)
ES2261049B1 (es) * 2004-12-16 2007-11-01 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Dioagnostico de carcinoma hepatocelular mediante la deteccion de formas oxidadas de apolipoproteina a1.
US20080254456A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Jung-Yaw Lin Gene marker for human hepatocellular carcinoma diagnosis

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