Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2009116893A1 - Способ получения эндотелиальных клеток (варианты) - Google Patents

Способ получения эндотелиальных клеток (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2009116893A1
WO2009116893A1 PCT/RU2008/000795 RU2008000795W WO2009116893A1 WO 2009116893 A1 WO2009116893 A1 WO 2009116893A1 RU 2008000795 W RU2008000795 W RU 2008000795W WO 2009116893 A1 WO2009116893 A1 WO 2009116893A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
endothelial cells
differentiation
medium
escs
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000795
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Львови КИСЕЛЕВ
Мария Андреевна ЛАГАРЬКОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Лaбopaтopия Клеточных Технологий"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Лaбopaтopия Клеточных Технологий" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Лaбopaтopия Клеточных Технологий"
Priority to EA201000378A priority Critical patent/EA022736B1/ru
Priority to EP08873385.2A priority patent/EP2277993B1/en
Publication of WO2009116893A1 publication Critical patent/WO2009116893A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the invention relates to biotechnology, in particular to the production of endothelial cells from human embryonic stem cells (ESCs) and their use.
  • Human embryonic stem cells (a designation accepted in the world of hESCs) should be considered as a valuable source for regenerative medicine because of their ability to differentiate into all types of cells.
  • the resulting endothelial cell differentiation can be widely used in medical practice and in the study of differentiation mechanisms. Endothelial cells not only line the walls of the blood vessel, but are also able to migrate in the blood stream to various places. Thus, they could be used not only for the regeneration of vessels through their integration or secretion of growth factors, but also serve as a vehicle for the therapeutic gene or drug delivery.
  • the potential clinical use of differentiated ip vitro cells requires confirmation that the desired cellular phenotype will be maintained without returning to a pluripotent state.
  • Differentiation of ESCs along a certain pathway is accompanied by a change in the pattern of gene expression, from genes characteristic of the pluripotent state, to tissue-specific genes.
  • the change in the expression pattern is due to the attenuation of the expression of key transcription factors involved in maintaining pluripotency, and the expression of tissue-specific transcription factors.
  • the epigenetic mechanisms of regulation of gene expression that repress genes necessary for pluripotent state, and activate tissue-specific. Since ESCs are an in vitro analogue of epiblast cells artificially maintained in an undifferentiated state, when changing culturing conditions, ESCs spontaneously differentiate into different types of cells.
  • ESCs For human ESCs, the ability to differentiate into many types of cells has been shown: neurons and glia, endothelium, keratinocytes, trophoblasts, cardiomyocytes, osteoblasts, blood cells, hepatocytes, insulin-producing cells and some others.
  • cardiomyocytes differentiated from human ESCs express transcription factors Nkx 2.5, GATA4, as well as specific markers of cardiomyocytes - troponin 1 and alpha-myosin heavy chain.
  • Nkx 2.5, GATA4 transcription factors that are expressed on a cell.
  • GATA4 transcription factors that are expressed on a cell.
  • ESCs identical in basic morphological characteristics and expression of major genes, may differ in epigenetic status in the regulatory regions of some genes. These factors can lead to the fact that ESC cell lines will have preferential ways of differentiation. That is, for example, ESCs will easily differentiate into neurons and bad in cardiomyocytes. Perhaps it is precisely the difference in the epigenetic status of mouse and human ESCs that can explain such a different differentiation potential.
  • vascular tissue forms from the mesoderm. Soon after gastrulation, the mesoderm forms as a separate layer between the ecto- and endoderm. It is assumed that endothelial and hematopoietic cells originate from a common mesodermal precursor - hemangioblast (5). Precursor cells potentially capable of forming hematopoietic and endothelial cells were identified on the model of mouse ESCs (6,7,8) and only later in vivo when studying gastrulation of a mouse embryo (9). There are three main technical approaches for studying the differentiation of ESCs into endothelial cells and hematopoietic cells.
  • the first is the differentiation of ESCs into endothelial or hematopoietic cells through the ET stage (10-15).
  • the second is co-cultivation of ESCs with stromal cells (16, 17).
  • the third is the differentiation of ESCs in two-dimensional conditions (18, 8).
  • ET contains cells originating from different germ layers, and therefore the proportion of cells of the required type is small.
  • the percentage of endothelial cells in embryoid bodies is about 2%.
  • this approach has several more limitations. For example, it is difficult to observe cells under a microscope, to analyze the differentiation of single cells, it is difficult to separate cells from cell aggregates in ET.
  • ET is a crude model analogue of a developing embryo in which various cells are present, including those necessary for the researcher.
  • ETs formed from the available human ESC lines.
  • the hESL and hESOS lines were taken. These lines, isolated in the laboratory earlier, showed morphology characteristic of this type of cells, expressed the corresponding markers, and had a normal karyotype (19).
  • ESCs formed ETs with a characteristic morphology for this type of structure.
  • immunohistochemical analysis of embryoid bodies after 10-12 days cultivations were found in a small amount (not more than 1-5%) of endotheliocyte-like cells expressing CD31 (fig. 1).
  • Fig.l Immunohistochemical analysis Yumkm cryosection ET 12 days of cultivation.
  • A-ET line ESM01 staining with antibodies to CDZ 1 (red);
  • B-ET line ESMOS staining with antibodies to CD31 (red); kernels are painted with DAPI (blue).
  • Secondary antibodies goat apt-mouse Alekha Fluor 546.
  • Fig.2 Formation of vascular-like structures and monolayer during differentiation of human ESCs (8 days). A is a bright field.
  • Fig. 3 Assessment of the viability of CD3 1 positive cells after immunological separation. A - 5th day of differentiation; B - 7th day of differentiation. Living cells (green), dead (orange). Photograph obtained using a fluorescence microscope.
  • Fig.4 Differentiation of human ESCs into endothelial cells in a two-dimensional system: A — undifferentiated ESC colonies on the MEF feeder; B - differentiated derivatives, 3 day cultivation; B - differentiated derivatives, 5th day of cultivation; G - vascular-like structures, day 7 of cultivation
  • FIG. 5 A - CD31 endothelial cells obtained from ESCs, 24 hours after selection (Photograph in a bright field).
  • B Immunohistochemical analysis of ESCs after immunomagnetic separation. Expression CD3 1 (red); kernels are painted DAPI (blue). Secondary antibodies Alex Fluor 546.
  • B - Matrigel test (Matrigel Assau), showing the endothelial nature of cells isolated by immunomagnetic separation
  • Fig. 6 RT-PCR analysis of the VE-cadherip, GATA-2, Flkl, GAPDH, GATA-3, ⁇ N ⁇ S, CD31 genes in undifferentiated ESMOZ (U) line ESCs, endothelial cells from ESMOZ line obtained using immunomagnetic separation (E ) and in endothelial cells from the umbilical vein (H) of a person.
  • U undifferentiated ESMOZ
  • E immunomagnetic separation
  • H umbilical vein
  • Fig.7 The results of bisulfite sequencing of the promoter region of the GATA-2 gene from 43 to -187 nucleotides relative to the start of transcription.
  • A human ESCs
  • B endothelium derived from human ESCs
  • C HUVEC.
  • Fig.8 The results of bisulfite sequencing of the promoter region of the GAT A-3 gene from 228 to -115 nucleotides relative to the start of transcription (A) from human ESCs, (B) endothelium obtained from human ESCs, (C) HUVEC.
  • Fig.9 The results of bisulfite sequencing of the promoter region of the eNOS gene from 13 to -297 nucleotides relative to the start of transcription (A) from human ESCs, (B) endothelium obtained from human ESCs, (C) HUVEC.
  • Fig. 10 Change in the density of blood vessels 30 days after the introduction of endothelial cells 10 a - before administration, 10 b - 30 days after administration.
  • Fig. 11. (a) Matrigel removed from experimental animals after 8 days, not containing endothelial cells, (b) Matrigel removed from experimental animals after 8 days, containing endothelial cells.
  • Table.l Comparison of different media for the differentiation of human ESCs into the endothelium. The comparison was carried out after 8 days of cultivation based on immunohistochemical analysis
  • growth factors were identified that ensure the efficient differentiation of human ESCs into endothelial cells.
  • growth proteinaceous factors include stem sell fastor SCF (proizvoditelShemisop), human vascular endothelial growth factor VEGF (proizvoditelShemisop) bope morrhogepis rroteip BMP4, basis fibroblast growth fastor bFGF (proizvoditelShemisop), tumor growth fastor TGFbeta.
  • SCF stem sell fastor SCF
  • VEGF human vascular endothelial growth factor
  • BMP4 bope morrhogepis rroteip
  • basis fibroblast growth fastor bFGF proizvoditelShemisop
  • TGFbeta tumor growth fastor TGFbeta.
  • the quantitative ratios of these growth factors depend on the composition of the medium, the presence or absence of components of uncertain origin in the medium, and may also vary depending on the ESC lines used. The number of growth factors can
  • CD31 positive cells are presented not only as a part of vascular-like structures, but also as a monolayer (fig.2). According to research the balance between vascular cells and the monolayer depends on the concentration of VEGF.
  • CD31 marker To select the endothelium obtained from ESCs in a two-dimensional system, we used the CD31 marker, but other endothelial markers, such as CD34, vWF factor, or others, can be used.
  • Isolated cells were plated on collagen-coated plates in an endothelial differentiation medium. Cells were sown in high density (at least 50,000 cells per lcm or more), as plating at a lower density negatively affected cell viability.
  • the ratio of the components of the medium can be optimized for each cell line individually for maximum efficiency.
  • a medium for culturing cells other synthetic media of a fully known and characterized composition can be used.
  • the claimed methods allow to obtain a high yield of cells at the end of the differentiation process having immunological markers of the endothelium, most of which is able to participate in the formation of a tubular network. Even more, differentiation was reproduced using a serum substitute instead of characterized fetal bovine serum (FBS), which is significantly better than existing differentiation methods.
  • FBS fetal bovine serum
  • the use of a synthetic medium containing no components of animal origin makes the method reproducible and independent of the composition of the serum. However, even in this case, approximately half of the cells were represented by an unknown cell type or a small population of undifferentiated cells. It is important to note that even a small percentage of undifferentiated cells or cells that differentiate into different types can contaminate the cell culture. These third-party populations can have a major impact on the safe and functional effectiveness of the culture for therapeutic use or further study. Thus, selection of a specific cell population is important.
  • CDZ 1 was recognized as the best immunological marker of endothelial cells, and at the same time, its expression was detected very early on day 6 of hESC differentiation, which allowed its use in the method of immunomagnetic sorting.
  • other markers e.g., CD34, vWF factor
  • other selection methods e.g., FACS
  • Example 1 Cultivation of human ESCs.
  • Human ESC lines were cultured in a medium containing 80% KnockOut DMEM, 20% KO of a serum substitute, glutamine 1 mM, 1% essential amino acids, 50 penicillin U / ml, 50 ⁇ g / ml streptomycin (manufactured by Ivvitrogep), 0.1 mM ⁇ - mercaptoethanol (Sigma), and 4 ⁇ g / ml bFGF (Chemisop) on mitomycin C (Yumkg / ml, Sigma) inhibited mouse embryonic fibroblasts (MIF) at a density of 10 4 cells / cm 2 in culture dishes coated with 0.1% gelatin (Mersk).
  • MIF mouse embryonic fibroblasts
  • Fibroblasts were prepared from 12-day-old mouse Fl embryos (C57BL / bJxCBA / Ca). HESC colonies were passaged every 5-6 days by culturing with type IV collagenase (200U / ml, Ivitrogep) and mechanical dissection. Plates with undifferentiated hESC colonies grown for 8 days were treated with collagenase IV for 10 minutes, washed twice with growth medium, and the colonies were collected mechanically with a feeder using a micropipette tip. Pluripotent cell lines, isolated and grown on a feeder, showed typical ESC cell morphology, expressed immunological markers characteristic of undifferentiated cells, and maintained a normal karyotype. We did not observe even a small percentage of CD3 positive cells in undifferentiated colonies.
  • Example 2 Differentiation of human ESCs into endothelial cells. Differentiation medium.
  • a synthetic medium of the following composition base 85% liquid DMEM / F12 (Hyclone or an analogue of another company), 15% liquid KO serum substitute (Ipvitrogep or an analogue of another company) with the addition of 1% essential amino acids, 2 mM L-glutamine, 50 units / ml penicillin, 50 mg / ml streptomycin, 50 ng / ml SCF, Jung / ml BMP4, 50 ng / ml VEGF, activin Jung / ml, 20 ng / ml bFGF, 2HG / ML TGFbeta.
  • TGF beta is introduced on day 4 of differentiation.
  • Concentrations and combinations of growth factors may differ from those indicated by 50-100% depending on the cell line and individual cultivation conditions.
  • DMEM / FI2 liquid medium was mixed with a liquid serum substitute, antibiotics, and glutamine and stored for further use at + 4 ° C. All other components (growth factors, etc.) were added to the medium immediately before addition to the cells. The complete medium was not stored. Methodology for differentiation.
  • hESC colonies grown for 8 days were treated with collagenase IV for 10 minutes, washed twice with growth medium, and the colonies were manually collected with a micropipette tip, cut into 300-500 cell fragments.
  • ESC colonies for differentiation were transferred to 35 mm Petri dishes coated with collagen IV (70 ug / ml) in the medium of the above composition (fig.4B). At 4 days of differentiation, Wednesday was added
  • Example 3 Differentiation of human ESCs into endothelial cells. Differs from example 1 in the use of a medium based on a mixture of liquid DMEM / F12 (Hyclone) and fetal bovine serum (Nuslope chemotherapy).
  • Differentiation medium For differentiation, we used a medium of the following composition: a base of 85% liquid DMEM / F12 (Hyclone or an analog of another company) and 15% fetal bovine serum (Hyclone, characterized or an analog of another company), 2 mM L-glutamine, 1% essential amino acids, 50 units / ml penicillin, 50 mg / ml streptomycin, (all from Ipvitrogep or an analog of another company), 20 ng / ml SCF (Chemisop or an analog of another company), 10 to 50 ng / ml VEGF (Chemisop or an analog of another company), 5 ng / ml bFGF (Chemisop or an analog of another company) Growth factors may vary as described in example 1. The medium is prepared as described in example 1.
  • Cells also acquired morphology of differentiated derivatives on days 3-6. On days 6–10, colonies contained clusters of vascular-like structures.
  • Example 4 The separation of endothelial cells.
  • CD31 + cell selection cells on the 5-7th day of differentiation were separated by treatment with collagenase IV (Ipvitrogen or an analogue of another company) at 37 ° C for 10 minutes and washed off with phosphate buffered saline (Phosphate buffered saline PBS) containing 0.5 % bovine serum albumin (BSA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the obtained cells were incubated for 3 minutes with mouse antibodies against human CD31 in a portion of 10 ⁇ g per 10 6 cells and then with goat anti-mouse IgG sewn onto magnetic balls (Miltepui Biotes or an analogue of another company) for 15 min at 8 ° C.
  • CD31 positive the cells were isolated by passing through a filter and an MS column attached to a Mipi-MACS seraratiopit magnetic block (Miltepui BIOS or an analog of another company) to obtain a magnetically retained fraction of purified CD31 + cells. After elution of CD31, positive cells were placed on collagen-coated IV plates with a seeding density of 50,000 cells per cm 2 and the cells were grown in endothelium-supporting medium (Fig. 5 A).
  • the purity of the selected population was determined by immunocytochemical analysis. To find out whether the CD31 + cells eluted from the column are endothelial cells or their precursors, some of the cells were subjected to a functional test for the cells to belong to the endothelium matrix test. The expression of genes characteristic of the endothelium was analyzed by the method of semi-quantitative RT-PCR (reverse transcription PCR). Immunoditochemical analysis.
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindolol
  • the test was carried out as described in (21). Matrigel was added to 24 wells of the plate. 0.5-2x10 4 cells were placed in wells in 0.5 ml of growth medium and incubated at 37 ° C and 5% CO2. Cell morphology was analyzed in phase contrast using an inverted light microscope. As can be seen from Figure 5B, the cells form a cellular vascular-like network characteristic of the endothelium. Reverse Transcription PCR (OT-PCR " ).
  • RNA was isolated from undifferentiated hESCs, CD31 selected endothelial cells and HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) using RNeasu Mipi Kit (Qiagep).
  • the reverse transcription reaction was performed using RNA (1-2 ⁇ g), random six-nucleotide primers (Protega), RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and reagents (Protega) according to the manufacturer's recommendations.
  • the coding DNA was dissolved in a final volume of 25 ml.
  • a certain amount of cDNA (l-5 ml) was subjected to PCR amplification using Taq DNA polymerase and reagents (Fermeptas).
  • RNA samples were able to result in equal amplification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as an internal standard.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Transcription factors play an important role during embryonic development in the direction of differentiation and maintenance of the phenotype. Especially the endothelium-specific transcription factors GATA-2 and 3, which are almost completely turned off in undifferentiated hESCs, although their expression in the pure endothelial cell population obtained from hESCs was comparable to their expression in HUVECs.
  • the eNOSA gene was not expressed by undifferentiated hESCs, but after differentiation into the endothelium, its expression was found in a pure population of endothelial cells at the same level as in HUVCs.
  • Genomic bisvlfit sequeshing Genomic DNAs were isolated from undifferentiated hESCs, CD31 selected hESCs-derived endothelial cells and HUVEC. Genomic DNA was subjected to sodium bisulfite treatment using CpGepom TM Fast DNA Modificatiop Kit, Chemisop. Aliquots of DNA modified with sodium bisulfite (25-50 ng) were used for PCR at 45 amplification cycles.
  • PCR primers at the sites of interest were selected for sodium bisulfite modified matrix (Table 4).
  • Final PCR products were cloned using the pGEM-T Esasu kit (Al 360, Protega), and plasmid clones (10 for each plot) were sequenced using an automated ABI Prism 377 Sequepser DNA (Arpliéd BIOSystems).
  • CpG located in the region from 228-115 nucleotides were highly methylated in undifferentiated cells (up to 90%), but in cells obtained from hESC endothelium and in HUVECs methylation of the designated area was reduced to 15 -20% (fig. 8).
  • the GATA-3 gene was weakly expressed in undifferentiated hESCs, although the hypomethylated promoter significantly increased its expression.
  • Chhap (22) in endothelial cells the most significant epigenic modifications occur in the region of the eNOS promoter closest to the site of transcription initiation.
  • This region of the eNOSA gene between 13 and -237 nucleotides was chosen for analysis of bisulfite sequencing, which showed that the region was hypermethylated in undifferentiated hESCs at approximately the same level as the regulatory regions of GAT A-2 and GAT A-3 genes from 70 to 90
  • % for each CpG position After hESCs of differentiation into endethelial origin, methylation of this region decreased to 20% in functional endothelial cells selected from hESCs and did not exceed 10% in HUVECs (fig. 9).
  • the resulting endothelial cells could be frozen and stored. At the same time, the cells retained viability and their properties.
  • the freezing medium had the following composition: 90% fetal bovine serum (inactivated at 56 ° C for 45 minutes) (Ipvitrogen or an analogue of another company), 10% DMSO (ICN Biomedisals, Ips. Or an analogue of another company).
  • Cryovials were thawed in a water bath at 37 ° C, sterilized with 95% ethanol. The contents of the vial were transferred to a 15 ml tube and 9 ml of culture medium was gradually added. It was centrifuged for 5 minutes at 10 ° C, the supernatant was removed, the precipitate was suspended in 1 ml of medium and transferred to a culture dish or vial of medium. Cells were evenly distributed over the surface and placed in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 Methods, methods, application of the obtained endothelial cells (endotheleocytes).
  • endothelial cells can be used to form the vasculature (collaterals) nev through neoangiogenesis by introducing 10 4 , 10 5 , 10 6 or more cells into a vein or artery of mammals, including humans (Fig. 10 )
  • the obtained cells can be used for vascularization of the implant by encapsulating them in a biocompatible material, such as gelatin, chitosan, collagen, matrigel, and others or their combinations, providing the formation of a three-dimensional structure, which in addition to endothelial cells can include cells such as fibroblasts, cardiomyocytes , hepatocytes, keratinocytes, neurons, multipotent bone marrow cells, glial cells, chondrocytes, osteocytes and other cell types or combinations of cell types and implantation (introduction) into organisms m of mammals, including humans.
  • a biocompatible material such as gelatin, chitosan, collagen, matrigel, and others or their combinations
  • Vascularization of the implant can be carried out either by attracting the endothelial cells of the body, or by vascularization of the implanted cells contained in a three-dimensional structure to provide the implant (inserted tissue or cell composition) with blood supply (Fig.l 1).
  • the resulting endothelial cells can be used to make a tubular structure coated with endotheliocytes by applying them to a two-dimensional substrate of collagen, mtarigel, chitosan, fibronectins and / or other biocompatible materials in combination with other types of cells or without them, which can be used as a tube during operations on vessels to restore impaired or insufficient circulation, by replacing a part, fragment or complete vessel or its stenting.
  • Endothelial cells obtained by a standardized method from a standard renewable cell culture can be used to test the toxicity of chemical or biological substances, or can be used to determine the effectiveness of substances to stimulate the growth (proliferation) of endothelial cells by determining the proliferation or death of endothelial cells using known methods.
  • Endothelial cells can be used for diagnostic or therapeutic purposes for the treatment of genetic diseases or for the delivery of toxin genes or toxins themselves to the sites of active angiogenesis (vascular growth) to block the latter (for example, in the case of vascular growth in the tumor) in order to stop the blood supply to the organ or tissue and its subsequent death by genetic modification, by constructs containing reporter genes, for example, a green fluorescent protein or the like, or by genetic constructs, containing toxin genes, or genetic constructs containing genes for restoring broken genes and introducing modified endothelial cells into mammals, in particular humans.
  • Endothelial cells modified by genetic constructs encoding growth factors can be vectors for stimulating the growth of a particular tissue, cell, group of cells.
  • our two-dimensional system of differentiation allowed us to produce endothelial cells with high efficiency, to select a pure population of functional endothelial cells that acquired the same epigenetic status of key transcription factors and homeostasis of gene maintenance as their analogues, differentiating in the ipvivo embryo.
  • the obtained endothelial cells can be widely used in medical practice.
  • the selected hESC-derived endothelial cells expressed endothelial-specific genes, formed vascular-like structures and were morphologically indistinguishable from primary endothelial cells.
  • CD3 1 selected endothelial cells differentiated from hESCs were able to be cultured ip vitro up to at least 4 passages.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и их применению. Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека предусматривает дифференцировку ЭСК человека на подложке и в синтетической среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки на основе смеси DMEM/FI2 с КО заменителем сыворотки с факторами роста VEGF SCF, BMP4, bFGF, ТGFbеtа в эффективных количествах, причем ТGFbеtа добавляют на 3-6 день дифференцировки. Также может быть использована среда для дифференцировки на основе смеси DMEM/FI2 с фетальной бычей сывороткой с факторами роста VEGF, SCF, bFGF. Сепарацию проводят на 3-9 день методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для эндотелиальных клеток, после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной среде при плотности посева не менее 50000 клеток на 1см2.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ). Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и их применению. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (обозначение, принятое в мире hЕSСs) нужно рассматривать, как ценный источник для регенеративной медицины из-за их способности дифференцироваться во все типы клеток. Полученные в результате дифференцировки эндотелиальные клетки могут найти широкое применение в медицинской практике и в изучении механизмов дифференцировки. Эндотелиальные клетки не только выстилают стенки кровеносного сосуда, но и также способны мигрировать в потоке крови к различным местам. Таким образом, они могли использоваться не только для регенерации судов с помощью их интеграции или секреции ростовых факторов, но и служить транспортным средством для терапевтического гена или доставки препарата. Однако, потенциальное клиническое применение дифференцированных iп vitrо клеток требует подтверждения, что желательный клеточный фенотип будет поддержан без возвращения к плюрипотентному состоянию.
Предшествующий уровень техники На стадии развития бластоцисты происходит формирование внутренней клеточной массы бластоцисты (BKM), из которой и получают линии ЭСК. Способность hЕSСs дифференцироваться в некоторые специфические типы клеток в настоящее время интенсивно изучается. Общая цель таких исследований обычно состоит в том, чтобы получать, специализированные функциональные клетки. Однако дальнейшая возможность применения этих клеток для лечения человека может быть реализована только при условии обеспечения устойчивой клеточной специализации. Таким образом, нужно рассматривать не только морфологические, иммунологические, или функциональные свойства клетки, но также и генетические и эпигенетические.
Дифференцировка ЭСК по определенному пути сопровождается изменением паттерна экспрессии генов, от генов, характерных для плюрипотентного состояния, к тканеспецифическим генам. Изменение паттерна экспрессии осуществляется за счет затухания экспрессии ключевых транскрипционных факторов, участвующих в поддержании плюрипотентности, и экспрессией тканеспецифических транскрипционных факторов. Параллельно работают эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, которые репрессируют гены, необходимые для плюрипотентного состояния, и активируют тканеспецифические. Так как ЭСК - это iп vitrо аналог клеток эпибласта искусственно поддерживаемых в недифференцированном состоянии, при изменении условий культивирования ЭСК спонтанно дифференцируются в различные типы клеток. In vitrо спонтанная дифференцировка ЭСК человека наблюдается как при длительном культивировании прикрепленных колоний, так и в процессе роста эмбриоидных телец (ЭТ) в суспензии. В отличие от ЭСК мыши, не все линии ЭСК человека легко образуют эмбриоидные тельца, и ни одна линия ЭСК не образует эмбриоидные тельца из одиночных клеток.
Для ЭСК человека была показана способность к дифференцировке во многие типы клеток: нейроны и глия, эндотелий, кератиноциты, трофобласты, кардиомиоциты, остеобласты, клетки крови, гепатоциты, инсулин-продуцирующие клетки и некоторые другие.
Производные энтодермы получить оказалось труднее всего. В недавно опубликованных сообщениях о дифференцировке ЭСК человека в инсулин- секретирующие клетки (1) и гепатоциты (2), было показано, что по белковым и генетическим маркерам они совпадают с зрелыми инсулин-секретирующими клетками или гепатоцитами. Однако, факторы, определяющие дифференцировку в энтодерму, плохо охарактеризованы, и почти отсутствуют маркеры ранней энтодермальной дифференцировки. В отличие от ЭСК мыши, которые легко дифференцируются в кардиомиоциты в отсутствии lеukеmiа inhibitory factor LIF, спонтанная дифференцировка ЭСК человека наблюдается у разных линий ЭСК в разном проценте случаев - от .спонтанно сокращающихся участков в 70% ЭТ до полного отсутствия спонтанной дифференцировки (3). Показано, что кардиомиоциты, дифференцированные из ЭСК человека, экспрессируют транскрипционные факторы Nkх 2.5, GATA4, а так же специфические маркеры кардиомиоцитов - тропонин 1 и тяжелую цепь альфа- миозина. Недавно опубликована работа по дифференцировке кардиомиоцитов в бессывороточной среде, минуя стадию эмбриоидных телец (4). При длительном культивировании, ЭСК могут подвергаться искусственной случайной селекции. Кроме того, как оказалось, ЭСК, идентичные по основным морфологическим характеристикам и экспрессии основных генов, могут отличаться эпигенетическим статусом в регуляторных областях некоторых генов. Эти факторы могут приводить к тому, что клеточные линии ЭСК будут иметь преимущественные пути дифференцировки. То есть, например, ЭСК будут легко дифференцироваться в нейроны и плохо в кардиомиоциты. Возможно, именно разница в эпигенетическом статусе ЭСК мыши и человека может объяснить столь различный потенциал дифференцировки.
При нормальном развитии эмбриона сосудистая ткань формируется из мезодермы. Вскоре после гаструляции мезодерма формируется как отдельный слой между экто- и эндодермой. Предполагается, что эндотелиальные и гематопоэтические клетки происходят от общего мезодермального предшественника - гемангиобласта (5). Клетки-предшественники, потенциально способные образовывать гематопоэтические и эндотелиальные клетки, были идентифицированы на модели мышиных ЭСК (6,7,8) и лишь позже iп vivо при изучении гаструляции мышиного эмбриона (9). Существует три основных технических подхода для изучения дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия и гематопоэтические клетки. Первый - дифференцировка ЭСК в эндотелиальные или гематопоэтические клетки через стадию ЭТ (10-15). Второй - совместное культивирование ЭСК со стромальными клетками (16, 17). Третий - дифференцировка ЭСК в двумерных условиях (18, 8).
Дифференцировка ЭСК через образование ЭТ — это всегда спонтанная, ненаправленная дифференцировка. Как уже упоминалось, ЭТ содержит клетки, происходящие из разных зародышевых листков, и поэтому доля клеток требуемого типа мала. Процент клеток эндотелия в эмбриоидных тельцах составляет около 2%. Кроме того, этот подход обладает еще несколькими ограничениями. Например, трудно наблюдать клетки в микроскоп, проводить анализ дифференцировки единичных клеток, трудно разделять клетки из агрегатов клеток в ЭТ. Однако, на сегодняшний день в большом количестве публикаций используется именно этот подход. Это обусловлено, в частности, тем, что направленная дифференцировка клеток требует специального подбора условий, а ЭТ — грубый модельный аналог развивающегося эмбриона, в котором присутствуют различные клетки, в том числе и необходимые исследователю.
Нами было проверено, есть ли эндотелиальные клетки в ЭТ, образованных из линий ЭСК человека, имеющихся в распоряжении. Для анализа были взяты линии hЕSМОl и hЕSМОЗ. Эти линии, выделенные в лаборатории ранее, проявляли характерную для данного типа клеток морфологию, экспрессировали соответствующие маркеры и имели нормальный кариотип (19). При переводе в суспензионную культуру ЭСК формировали ЭТ с характерной морфологией для данного типа структур. При иммуногистохимическом анализе эмбриоидных телец после 10-12 дней культивирования были обнаружены в небольшом количестве (не более 1-5%) эндотелиоцитоподобные клетки, экспрессирующие CD31 (fig. 1).
Дифференцировка ЭСК человека в клетки эндотелия в двумерных условиях (минуя стадию образования ЭТ) использовалась только одной группой исследователей (20). Известный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога. Способ предусматривает дифференцировку ЭСК человека в присутствии человеческого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) на подложке из коллагена IV. Селекция эндотелиальных клеток осуществлялась по размеру клеток с помощью фильтрации через фильтр с диаметром пор 40 мкм. Из работы не ясно, какую долю составляли клетки эндотелия после селекции. Однако, полагая, что эндотелиальные клетки связаны с гематопоэтическими клетками и происходят от общего предшественника гемангиобласта механический выбор, не мог обеспечить желательную чистоту клеток. Скорее всего, данный метод селекции не стоит использовать, если необходимо получить чистую популяцию клеток эндотелия. Краткое описание фигур.
Fig.l Иммуногистохимический анализ Юмкм криосреза ЭТ 12 дней культивирования. А- ЭТ линии ESM01, окраска антителами к СDЗ 1 (красный); Б- ЭТ линии ЕSМОЗ, окраска антителами к CD31 (красный); ядра покрашены DAPI (синий). Вторичные антитела gоаt апti-mоusе Аlеха Fluоr 546. Fig.2 Формирование сосудистоподобных структур и монослоя при дифференцировке ЭСК человека (8 дней). А — светлое поле. Б — иммуногистохимическое окрашивание антителами к СDЗ 1.
Fig.З Оценка жизнеспособности СDЗ 1 положительных клеток после проведения иммумагнитной сепарации. А - 5ый день дифференцировки; Б - 7oй день дифференцировки. Живые клетки (зеленый), мертвые (оранжевый). Фотография получена с помощью флуоресцентного микроскопа.
Fig.4 Дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки в двумерной системе: А - недифференцированные колонии ЭСК на фидере МЭФ; Б - дифференцированные производные, 3 день культивирования; В - дифференцированные производные, 5 день культивирования; Г - сосудистоподобные структуры, 7 день культивирования
Fig.5 А - CD31 клетки эндотелия, полученные из ЭСК, через 24 часа после селекции (Фотография в светлом поле). Б - Иммуногистохимический анализ ЭСК после проведения иммуномагнитной сепарации. Экспрессия СDЗ 1 (красный); ядра окрашены DAPI (синий). Вторичные антитела Аlеха Fluоr 546. В - Тест на матригеле (Маtrigеl Аssау), показывающий эндотелиальную природу выделенных с помощью иммуномагнитной сепарации клеток
Fig.6 ОТ-ПЦР анализ генов VЕ-саdhеriп, GATA-2, Flkl, GAPDH, GATA-3, еNОS, CD31 в недифференцированных ЭСК линии ЕSМОЗ (U), клетках эндотелия из ЭСК линии ЕSМОЗ, полученных с помощью иммуномагнитной сепарации (E) и в клетках эндотелия из пупочной вены (H) человека.
Fig.7 Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена GATA-2 с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции. (А) ЭСК человека, (Б) эндотелий полученный из ЭСК человека, (В) HUVEC.
Fig.8 Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена GAT A-3 с 228 по -115 нуклеотид относительно старта транскрипции (А) из ЭСК человека, (Б) эндотелий полученный из ЭСК человека, (В) HUVEC. Fig.9 Результаты бисульфитного секвенирования промоторной области гена еNОS с 13 по -297 нуклеотид относительно старта транскрипции (А) из ЭСК человека, (Б) эндотелий полученный из ЭСК человека, (В) HUVEC.
Fig. 10 Изменение плотности кровеносных сосудов через 30 дней после введения клеток эндотелия 10 а- до введения, 10 б -через 30 дней после введения. Fig. 11. (а) матригель, удаленный из экспериментальных животных через 8 дней, несодержащий клеток эндотелия, (б) матригель, удаленный из экспериментальных животных через 8 дней, содержащий клетки эндотелия.
Раскрытие изобретения
Нами была поставлена задача разработать эффективный и воспроизводимый метод дифференцировки hЕSСs в чистую популяцию функциональных эндотелиальных клеток, в которой изменения паттерна генной регуляции соответствуют зрелым эндотелиальным клеткам. В отличие от дифференцировки через стадию ЭТ, прямая дифференцировка ЭСК проста для наблюдения за клетками и манипуляций с ними, однако требует предварительных исследований по определению условий дифференцировки. Кроме того, контролируемая дифференцировка, во-первых, должна приводить преимущественно к желаемому клеточному фенотипу. Во-вторых, должна существовать возможность селекции нужных популяций клеток, причем сам процесс селекции не должен существенным образом влиять на жизнеспособность клеток и их дифференцировку. Следующей поставленной перед нами задачей явилась разработка метода сепарации предшественников эндотелия и эндотелиальных клеток из дифференцированных ЭСК человека.
Отсутствие в литературе данных по дифференцировке ЭСК человека в двумерной системе без формирования ЭТ в эндотелиальные клетки потребовало определение условий и сред для дифференцировки. Было испробовано более 15 способов культивирования с различными сочетаниями сред, сывороток и ростовых факторов. Для этого колонии ЭСК перемещали в чашки Петри с ростовыми средами различного состава (таб л.1) .
Табл.l. Сравнение различных сред для дифференцировки ЭСК человека в эндотелий. Сравнение проводилось через 8 дней культивирования на основании иммуногистохимического анализа
Figure imgf000008_0001
В процессе дифференцировки были обнаружены отдельные клетки, экспрессирующие ранний маркер эндотелия CD31 и маркер позднего, дифференцированного эндотелия - фактор Вон Виллибрандта (vWF).
После применения различных композиций сред в различных комбинациях с факторами роста были выявлены ростовые факторы, обеспечивающие эффективную дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки. К таким ростовым факторам белковой природы относятся stеm сеll fасtоr SCF (производительСhеmiсоп), человеческий фактор роста эндотелия сосудов VEGF (производительСhеmiсоп), bопе mоrрhоgепiс рrоtеiп BMP4, bаsiс fibrоblаst grоwth fасtоr bFGF (производительСhеmiсоп), tumоr grоwth fасtоr ТGFbеtа . Количественные соотношения данных ростовых факторов зависит от состава среды, наличия или отсутствия в среде компонентов неопределенного происхождения, а так же могут варьировать в зависимости от используемых линий ЭСК. Количество ростовых факторов может быть подобрано экспериментальным путем.
В течение дифференцировки в среде, содержащей компоненты необходимые для направленной дифференцировки ЭСК человека в эндотелиальные клетки, мы могли наблюдать изменения и в морфологии клеток и специфической экспрессии маркеров эндотелия. Сначала на 4 день после индукции дифференцирования были обнаружены СDЗ 1 эндотелиальные маркеры. Появление сосудистоподобных структур совпало с экспрессией vWF. На день 6-7 почти 60 % клеток экспрессировали CD31 молекулу и к концу процедуры дифференцирования (12-ый день), приблизительно 50 % клеток экспрессировали CD105 антиген (табл. 2). При этом стоит заметить, что экспрессия CD 133 молекулы была высока в недифференцированных hЕSСs и понижалась в течение дифференцировки в эндотелиальных предшественниках. Довольно высокий процент дифференцировки в эндотелиальные клетки позволял нам проводить тест на формирования сосудов без селекции клеток.
Таблица 2
Figure imgf000009_0001
CD31 положительные клетки представлены не только в составе сосудистоподобных структур, но и в виде монослоя (fig.2). По данным исследований баланс между сосудистоподобными клетками и монослоем зависит от концентрации VEGF.
Для сепарации дифференцированных из ЭСК человека эндотелиальных клеток нами был выбран метод иммунологической селекции с использованием поверхностных или внутренних маркеров, специфических для клеток эндотелия. Например, в данном случае использовался метод иммуномагнитной сепарации MACS (mаgпеtiс асtivаtеd сеll sоrtiпg) эффективная технология магнитного сортинга, основанная на разделении клеток по поверхностным антигенам (см. www.miltепуibiоtес . сот) . Подобный метод позволяет быстро и эффективно (с чистотой 98% и более) провести селекцию нужной популяции клеток по поверхностным маркерам. Однако, может быть использован и другой метод, например флуоресцентно-активированный клеточный сортинг (FACS) или любые другие, позволяющие разделить клетки в зависимости от поверхностных или внутренних маркеров.
Для селекции эндотелия полученного из ЭСК в двумерной системе мы воспользовались маркером CD31, но могут быть использованы и другие маркеры эндотелия, как CD34, фактор vWF или другие.
Селекцию на CD31 проводили на 5-7 день дифференцировки. Замечено, что жизнеспособность клеток, отобранных на 5 день была выше, чем отобранных в день 7 после начала дифференцировки (fig.З). Этот факт можно объяснить тем, что на 7 день дифференцировки клетки эндотелия уже формируют структуры, которые достаточно трудно разрушить ферментативной обработкой, а увеличение времени обработки и/или разрушение уже сформировавшихся межклеточных контактов ведет к существенному снижению жизнеспособности. Следовательно, проведение селекции на
5 день дифференцировки в наших условиях можно считать оптимальным. При использовании для селекции других маркеров селекцию можно проводить на 3-9 дни дифференцировки.
Выделенные клетки высевали на чашки, покрытые коллагеном, в среду для эндотелиальной дифференцировки. Клетки высевали в высокой плотности (не менее 50000 клеток на lсм и более), так как посев в более низкой плотности негативно влиял на жизнеспособность клеток.
Нами предложено 2 варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека. Сущность первого варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека заключается в следующем:
1. Проведение дифференцировки ЭСК человека на подложке и в синтетической среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с VEGF, SCF , BMP4 , bFGF, ТGFbеtа. Использование в качестве основы синтетической среды смеси жидкой DMEM/FI2 с жидким КО заменителем сыворотки в количестве (oб.%): жидкая DMEM/FI2- 75-95%, жидкая КО заменитель сыворотки - 5-25 %. Причем ТGFbеtа вносят в синтетическую среду на 3-6- ый день дифференцировки. 2.Пpoвeдeниe иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для клеток эндотелия на 3-9 дни дифференцировки.
3. Культивирование эндотелиальных клеток при плотности посева не менее 50000клeтoк на lсм2
Сущность второго варианта способа получения эндотелиальных клеток из ЭСК человека заключается в следующем:
1. Проведение дифференцировки ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с VEGF, SCF , bFGF. Использование в качестве основы среды смеси жидкой DMEM/FI2 и фетальной бычьей сыворотки в количестве (oб.%):жидкaя DMEM/FI2- 75-95%, жидкая фетальная бычья сыворотка - 5-25%.
2. Проведение иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для клеток эндотелия на 3-9 дни диференциоровки.
3. Культивирование эндотелиальных клеток при плотности посева не менее 50000клeтoк на lсм2 В наших способах были опробованы линии клеток hЕSМОl, hЕSМОЗ HESM02,
04, Hl, HUES7,8,9,, при этом полученные результаты были близкими, что подтверждает возможность его применения для дифференцировки любых ЭСК человека.
Соотношение компонентов среды может оптимизироваться для каждой клеточной линии в отдельности для достижения максимальной эффективности. В качестве среды для культивирования клеток могут быть использованы и другие синтетические среды полностью известного и охарактеризованного состава.
Заявленные способы позволяют получить высокий выход клеток в конце процедуры дифференцировки, имеющих иммунологические маркеры эндотелия, большинство из которых способно участвовать в формировании трубчатой сети. Даже больше, дифференцировка была воспроизведена с использованием заменителя сыворотки вместо характеризованной фетальной бычьей сыворотки (FBS), что значительно лучше существующих методов дифференцировки. Использование синтетической среды не содержащей компонентов животного происхождения делает метод воспроизводимым и независимым от состава сыворотки. Однако, даже в этом случае приблизительно половина клеток была представлена неизвестным типом клеток или незначительной популяцией недифференцированных клеток. Важно отметить, что даже маленький процент недифференцированных клеток или клеток, которые дифференцировались в различные типы, может загрязнить клеточную культуру. Эти сторонние популяции могут иметь большое воздействие на безопасную и функциональную эффективность культуры для терапевтического применения или дальнейшего изучения. Таким образом, селекция специфической популяции клеток важна.
СDЗ 1 признан лучшим иммунологическим маркером эндотелиальных клеток, и в то же самое время его экспрессия была обнаружена очень рано на день 6 hЕSСs дифференцировки, что позволило его использовать в методе иммуномагнитного сортинга. Однако, использование других маркеров (например, CD34, фактор vWF) и других методов селекции (например, FACS) тоже давало хорошие результаты. Варианты осуществления изобретения Возможность осуществления способа подтверждается следующими примерами его реализации, которые показывают лишь частные случаи его выполнения.
Пример 1. Культивирование ЭСК человека.
Линии ЭСК человека культивировали в среде, содержащей 80% KnockOut DMEM, 20% КО заменителя сыворотки, глутамин 1 мМ, 1% заменимые аминокислоты, 50 пенициллина ЕД/мл, 50 мкг/мл стрептомицина (производитель Iпvitrоgеп), 0,1 мМ β- меркаптоэтанола (Sigmа), и 4 мкг/мл bFGF (Сhеmiсоп) на ингибированных митомицином С (Юмкг/мл, Sigmа) мышиных эмбриональных фибробластах (МИФ) при плотности 104клeтoк/cм2 в культуральных чашках, покрытых 0,1 % -ным желатином (Меrсk). Фибробласты приготавливали из 12- дневных мышиных эмбрионов Fl (C57BL/бJxCBA/Ca).hESC колонии пассировали каждые 5-6 дней культивирования обработкой коллагеназы типом IV (200U/ml, Iпvitrоgеп) и механической диссекцией. Чашки с недифференцированными колониями hЕSС, выращенными в течение 8 дней обрабатывали коллагеназой IV в течение 10 минут, смывали дважды ростовой средой, и собрали колонии с фидера механически, наконечником микропипетки вручную. Плюропотентные линии клеток, изолированные и выращенные на фидере, показывали типичную ЭСК морфологию клетки, экспрессировали иммунологические маркеры характерные для недифференцированных клеток и поддерживали нормальный кариотип. Мы не наблюдали даже маленький процент СDЗ 1 положительных клеток в недифференцированных колониях.
Пpимep2. Дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки. Среда для дифференцировки.
Для дифференцировки использовали синтетическую среду следующего состава: основа 85% жидкой DMEM/F12(Hyclone или аналог другой фирмы), 15 % жидкого КО заменитель сыворотки (Iпvitrоgеп или аналог другой фирмы) с добавлением 1% заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина , 50 мг/мл стрептомицина, 50 нг/мл SCF, Юнг/мл BMP4, 50 нг/мл VEGF, активина Юнг/мл, 20 нг/мл bFGF, 2HГ/MЛ ТGFbеtа . TGF bеtа вносят на 4 день дифференцировки.
Концентрации и сочетания ростовых факторов могут отличаться от указанных на 50- 100% в зависимости от клеточной линии и индивидуальных условий культивирования.
Способ приготовления среды
Жидкую среду DMEM/FI2 смешивалась с жидким заменителем сыворотки, антибиотиками и глутамином и для дальнейшего использования хранилась при +4° С.Все остальные компоненты (ростовые факторы и пр.) добавлялись в среду непосредственно перед добавлением к клеткам. Полная среда не хранилась. Методика проведения дифференцировки.
Чашки с недифференцированными колониями hЕSС, выращенными в течение 8 дней (fig.4A) обрабатывали коллагеназой IV в течение 10 минут, смывали дважды ростовой средой и колонии собрали вручную наконечником микропипетки, разрезая на фрагменты размером 300-500 клеток. Колонии ЭСК для проведения дифференцировки были перемещены в 35 мм чашки Петри покрытые коллагеном IV (70 ug/ml) в среде, указанного выше состава (fig.4Б). На 4дeнь дифференцировки в среду добавляли
2нг/мл ТGFbеtа 1. На следующий после добавления день клетки приобретали морфологию дифференцированных производных (fig. 4В). На 6-10 день культивирования колонии содержали кластеры сосудистоподобных структур (fig. 4Г).
ПримерЗ. Дифференцировка ЭСК человека в эндотелиальные клетки. Отличается от примера 1 использованием среды на основе смеси жидких DMEM/F12(Hyclone) и фетальной бычьей сыворотки (Нусlопе сhаrасtеrizеd).
Среда для дифференцировки. Для дифференцировки использовали среду следующего состава: основа 85% жидкой DMEM/F12(Hyclone или аналог другой фирмы) и 15 % фетальной бычьей сыворотки (Hyclone,characterized или аналог другой фирмы), 2 мМ L-глутамина, 1% заменимые аминокислоты, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, (все от Iпvitrоgеп или аналог другой фирмы), 20 нг/мл SCF (Сhеmiсоп или аналог другой фирмы), от 10 до 50 нг/мл VEGF (Сhеmiсоп или аналог другой фирмы), 5 нг/мл ЪFGF (Сhеmiсоп или аналог другой фирмы) Ростовые факторы могут варьировать как указано в примере 1.Среду готовят как описано в примере 1.
Клетки также на 3-6 день приобретали морфологию дифференцированных производных. На 6-10 день культивирования колонии содержали кластеры сосудистоподобных структур.
Пример 4. Сепарация эндотелиальных клеток.
Для CD31 + клеточной селекции клетки на 5-7 день дифференцировки были отделены обработкой коллагеназы IV (Iпvitrоgеп или аналог другой фирмы) при 37° С в течение 10 минут и смыты дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (рhоsрhаtе buffеrd saline PBS), содержащим 0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA). Полученные клетки инкубировали в течение ЗОминут с антителами мыши против CD31 человека в порции 10 мкг на 10 6 клеток и затем с IgG козы против мыши, пришитыми к магнитным шарикам (Мiltепуi Вiоtес или аналог другой фирмы) в течение 15 мин при 8 С. CD31 положительные клетки были изолированы, проходя через фильтр и колонку MS прикрепленную к магнитному блоку Мiпi-МАСS sераrаtiоп uпit (Мiltепуi Вiоtесh или аналог другой фирмы), чтобы получить сохраненную магнитом фракцию очищенных CD31 + клеток. После элюции CD31 положительные клетки были помещены на покрытые коллагеном IV плашки с плотностью посева 50000клeтoк на lсм2 и клетки были выращены в эндотелий - поддерживающей среде (рис. 5 А).
Промышленная применимость
Чистоту выделенной популяции определяли по иммуноцитохимическому анализу. Чтобы узнать, являются ли CD31+ клетки, элюированные с колонки, клетками эндотелия или их предшественниками, часть клеток подвергали функциональному тесту на принадлежность клеток к эндотелию- тесту на матригеле. Анализ экспрессии генов характерных для эндотелия проводили методом полуколичественного ОТ-ПЦР (Обратной транскрипции ПЦР). Иммунодитохимический анализ.
Клетки фиксировали 100%-oм ледяным метанолом в течение 5 минут или 4 % парафармальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре. Слайды были промыты в трех PBS5 ОД % Tween20 и инкубировались со вторичными антителами: Аlеха Fluоr 546-conjugated IgG козы против мыши, Аlеха Fluоr 488-conjugated IgG козы против мыши в разведении 1:800. Первичные используемые антитела были античеловеческим CD31, античеловеческим vWF, античеловеческий CD 105 , античеловеческий CD34, античеловеческий CD 133, античеловеческий FIk- 1, античеловеческий CD 14, античеловеческий CD45. Клетки были также окрашены 4,6- диaмидинo-2-фeнилoндoлoм (DAPI). После этого иммуномеченные клетки или фрагменты были исследованы с помощью флюоресценцентного микроскопа. Чтобы избегать артефактов в обнаружении, мы использовали антитела с различной спецификой от используемых для селекции клеток. Чистота популяции клеток была больше чем 90 % (рис. 5 Б). Испытание на способность образовывать сосудистоподобные структуры.
Испытание было проведено как описано в (21). Матригель добавлялся в 24 лунки планшета. 0,5-2x104 клеток были помещены в лунки в 0,5 мл ростовой среды и инкубировались при 37C и 5 % CO2. Морфология клеток анализировалась в фазовом контрасте на инвертированном световом микроскопе. Как видно из рисунка 5В, клетки формируют характерную для эндотелия ячеистую сосудоподобную сеть. Обратной транскрипции ПЦР (OT-ПЦP").
Тотальная РНК была изолирована от недифференцированных hЕSСs, CD31 селектированых эндотелиальных клеток и HUVECs ( эндотелиальные клетки вены человеческой пуповины) использованием RNеаsу Мiпi Кit (Qiаgеп). Обратная реакция транскрипции была выполнена, используя РНК (1-2 мкг), случайные шестинуклеотидные праймеры (Рrоmеgа), RеvеrtАid M-MuLV обратную транскриптазу и реактивы (Рrоmеgа) согласно рекомендациям изготовителя. Кодирующая ДНК была растворена в конечном объеме 25 мл. Определенное количество кДНК (l-5мл) было подвергнуто ПЦР амплификации, используя Таq ДНК полимеразу и реактивы (Fеrmепtаs). Все образцы РНК были способны привести к равной амплификации глицepaльдeгид-3-фocфaтдeгидpoгeнaзы (GAPDH) как внутренний стандарт. Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР указанны в Таблице 3. Продукты амплификации были сепарированы в 1,5 % агарозном геле. Таблица 3
Figure imgf000016_0001
Факторы транскрипции играют важную роль в течение эмбрионального развития в направлении дифференцировки и поддержании фенотипа. Особенно эндотелий- специфичные факторы транскрипции GATA-2 и 3 ,кoтopыe почти полностью выключены в недифференцированных hЕSСs, хотя их экспрессия в полученной из hЕSСs чистой популяции эндотелиальных клеток была сопоставима с их экспрессией в HUVECs . Ген еNОSа не экспрессировался недифференцированными hЕSСs, но после дифференцировки в эндотелий его экспрессия была обнаружена в чистой популяции эндотелиальных клеток на том же самом уровне как в HUVCs . Таким образом, Анализ экспрессии генов характерных для эндотелия методом полуколичественного ОТ-ПЦР показал, что уровень экспрессии этих генов в клетках эндотелия из ЭСК сравним с экспрессией в HUVEC (fϊg.6) Геномное бисvльфитное секвешгоование. Были выделены геномные ДНК от недифференцировынных hЕSСs, CD31 отобранных hЕSСs-полученных эндотелиальных клеток и HUVEC. Геномная ДНК была подвергнута обработке натрием бисульфитом используя СрGепоmе™ Fаst DNA Моdifiсаtiоп Кit, Сhеmiсоп. Аликвоты ДНК, модифицированной бисульфитом нaтpия(25-50 нг), были использованы для ПЦР при 45 циклах амплификации. Праймеры для ПЦР в интересущих участках были подобраны для натрия бисульфит модифицированной матрицы (Таблица 4). Конечные ПЦР продукты были клонированы с помощью набора рGЕМ-Т Еаsу (Al 360, Рrоmеgа), и клоны плазмиды (10 для каждого участка) были секвенированы использованием автоматизированной ABI Рrism 377 ДНК Sеquепсеr (Аррliеd Вiоsуstеms).
Таблица Ns 4
Figure imgf000017_0001
Чтобы подтвердить, что эндотелиальные клетки дифференцированные из hЕSСs имеют правильное проявление эпигенетического статуса, мы сравнили профили метилирования регулирующих участков GATA-2,-3, и генов еNОСа в hЕSСs, эндотелиальных клеток дифференцированных из hЕSСs и HUVECs. Мы исследовали уровень метилирования каждого CpG в области соответствующей селективному промотору гена GAT A-2 (с 43 по -187 нуклеотид относительно старта транскрипции, определяемого как +1) с помощью бисульфитного секвенирования. В недифференцированных hЕSСs эта область была высоко метилирована почти до 80 % метилирования (fig. 7). Уровни метилирования селективного промотора в HUVEC и эндотелиальных клетках дифференцированных из hЕSСs были низкими и варьировали от 20 % в эндотелиальных клетках дифференцированных из hЕSСs до 10 % в HUVECs.
CpG расположенные в области от 228-115 нуклеотидов были высоко метилированы в недифференцированных клетках (до 90 %), но в полученных из hЕSС клетках эндотелия и в HUVECs метилирование обозначенной области понижалось до 15 -20 % (fig. 8). Таким образом, несмотря на гиперметилирование проксимального промотора ген GATA-3 был слабо экспрессирован в недифференцированных hЕSСs, хотя гипометилированный промотор значительно увеличил его экспрессию. Согласно данным Сhап (22) в эндотелиальных клетках самые существенные эпигенитические модификации происходят в области промотора еNОSа самой близкой к сайту начала транскрипции. Эта область гена еNОSа между 13 и-237 нуклеотидами была выбрана для анализа бисульфитного секвенирования , который показал, что область была гиперметилирована в недифференцированных hЕSСs приблизительно на том же самом уровне как регулирующие области GAT A-2 и GAT A-3 генов от 70 до 90
% по каждому CpG положению . После hЕSСs дифференцировки в эндетелиальные происхождения метилирование этой области уменьшилось до 20 % в функциональных эндотелиальных клетках, отобранных из hЕSСs и не превышал 10 % в HUVECs (fig.9).
Бисульфитное секвенирование позволило выявить, что область селективного промотора GAT A-2, гиперметилирована в hЕSСs и гипометилирована в hЕSСs- полученных эндотелиальных клетках. Таким образом, мы показали, что статус метелирования GATA-2 селективного промотора оказывает влияние на экспрессию этого фактора транскрипции.
Принятие во внимание корреляции экспрессии GATA-2 и его промотора метилирования в hЕSСs-полученных эндотелиальных клетках мы могли признать важную роль селективного промотора GATA-2 в эндотелий- дифференцировке. Несмотря на гиперметилирование GATA-3 проксимального промотора, GATA-3 ген был слабо экспрессирован в недифференцированных hЕSСs. Однако, мы не могли исключить, что в недифференцированных hЕSСs GATA-3 ген запущен альтернативным промотором
Проанализировав все полученные данные, мы можем заключить, что iп vitrо внешние сигналы вызывают сложную комбинацию молекулярных механизмов, заканчивающихся индукцией определенных факторов транскрипции экспрессии. Даже больше, полагая, что ДНК деметилирование является, заключительным шагом эпигенетических событий, ведущих к активации гена, эта индукция постоянна и необратима. Несомненно, стволовые клетки имеют большой потенциал, однако этот потенциал должен управляться iп vitrо иначе нежелательные последствия могут иметь место после неконтролируемой в естественных условиях дифференцировки. Согласно нашим данным GATA-2 и еNОS промоторы подвергаются гипометилированию в ходе hЕSСs дифференцировки в эндотелий. Следовательно, мы можем заключить, что эндотелий- специфичная экспрессия еNОSа регулируется через двойной негативный эпигенетический контроль. В недифференцированных hЕSСs не только промотор еNОSа, но также и промотор его регулирующего фактора транскрипции GAT A-2 был блокирован метилированием.
Наши исследования демонстрируют существенные различия в метилировании областей промоторов трех генов от hЕSСs к из hЕSСs-по лученным эндотелиальным клеткам. Однако, мы наблюдали некоторые различия между областями промоторов метилирования трех генов, изученных в из hЕSСs- полученных эндотелиальных клетках и HUVEC. В полученных из hЕSСs эндотелиальных клетках области промоторов изученных генов были немного больше метилированы, чем соответствующие области в HUVEC, хотя это не кончалось подавлением транскрипции. Возможно, это отражает, что происходящие из hЕSСs эндотелиальные клетки не были эндотелиальными клетками вены пуповины, а скорее представляли смесь специализированных подтипов эндотелиальных клеток (например, капиллярные, аортальные эндотелиальные клетки, легочные эндотелиальные клетки), где уровень метилирования является переменным.
Полученные эндотелиальные клетки могли быть подвергнуты заморозке и хранению. При этом клетки сохраняли жизнеспособность и свои свойства.
Криоконсервацию и оттаивание эндотелиальных клеток осуществляли следующим образом.
Среда для заморозки имела следующий состав: 90% фетальная бычья сыворотка (инактивированная при 560C в течение 45 минут) (Iпvitrоgеп или аналог другой фирмы), 10% DMSO (ICN Вiоmеdiсаls, Iпс. или аналог другой фирмы).
С культивируемых клеток удаляли среду, промывали дважды PBS, добавляли трипсин/ЭДТА 2 мл на 100мм чашку или 75 см2 флакон. Инкубировали при 370C 5 минут, нейтрализовали трипсин/ЭДТА 5 мл культуральной среды и пипетировали, чтобы получить одноклеточную суспензию. Полученную суспензию переносили в 25 мл пробирку и центрифугировали 5 минут при 1200rpm. Осадок суспендировали в lмл среды для заморозки, затем переносили в криовиалу и сразу помещали на 24 часа на -700C. На следующий день криовиалы переносили в жидкий азот для продолжительного хранения. В одной криовиале замораживали 1,5-Змлн клеток. Криовиалы оттаивали на водяной бане при 370C, стерилизовали 95% этанолом. Содержимое виалы переносили в 15мл пробирку и постепенно добавляли 9 мл культуральной среды. Центрифугировали 5 минут при ЮООrрm, надосадочную жидкость удаляли, осадок суспендировали в lмл среды и переносили в культуральную чашку или флакон со средой. Клетки равномерно распределяли по поверхности и помещали в инкубатор при 370C и 5%CO2 Методы, способы, применение полученных клеток эндотелия (эндотелеоциты).
1. Полученные, описанным выше способом, клетки эндотелия могут быть применены для формирования сосудистой сети (коллатералей) dе поvо за счет неоангиогенеза путем введения 104, 105, 106 или большего количества клеток в вену или артерию млекопитающих, включая человека (Fig. 10 )
2. Полученные клетки могут быть применены для васкуляризации имплантанта путем заключения их в биосовместимый материал, такой как желатин, хитозан, коллаген, матригель и другие либо их комбинации, обеспечивающие формирование трехмерной структуры, в которую кроме клеток эндотелия могут входить такие клетки как фибробласты, кардиомиоциты, гепатоциты, кератиноциты, нейроны, мультипотентные клетки костного мозга, глиальные клетки, хондроциты, остеоциты и другие клеточные типы или сочетания типов клеток и имплантирования (введения) в организм млекопитающих, включая человека. Васкуляризации имплантанта может осуществляться либо за счет привлечение эндотелиальных клеток организма, либо за счет васкуляризации имплантированными клетками, содержащимися в трехмерной структуре для обеспечения импланта (введенной тканевой или клеточной композиции) кровоснабжением (Fig.l 1).
3. Полученные клетки эндотелия могут использованы для изготовления трубчатой структуры покрытой эндотелиоцитами путем нанесения их на двумерную подложку из коллагена, мтаригеля, хитозана, фибронектинов и/ или других биосовместимых материалов в сочетании с другими типами клеток или без них, которая может быть использована в качестве трубки при операциях на сосудах для восстановления нарушенного или недостаточного кровообращения, путем замены части, фрагментиа или полного сосуда или его стентирования.
4. Полученные стандартизованным методом из стандартной возобновляемой клеточной культуры клетки эндотелия могут быть использованы для тестирования токсичности химических или биологических субстанций, или могут быть использованы для определения эффективности веществ стимулировать рост (пролиферацию) клеток эндотелия путем определения пролиферации или гибели клеток эндотелия с помощью известных методов.
5. Клетки эндотелия могут быть использованы для диагностических или терапевтических целей для лечения генетических заболеваний или для доставки генов токсинов либо сами токсины в места активного ангиогенеза (роста сосудов) для блокирования последнего (например, в случае роста сосудов в опухоли) с целью прекращения кровоснабжения органа или ткани и ее последующей гибелью путем их генетической модификации, конструкциями, содержащими гены репортеры, например, зеленый флуоресцентный белок или аналогичные, или генетическими конструкциями, содержащими гены токсинов, или генетическими конструкциями, содержащими гены для восстановления работы нарушенных генов и введения модифицированных клеток эндотелия в организм млекопитающих, в частности человека. Эндотелиальные клетки, модифицированные генетическими конструкциями , кодирующими ростовые факторы, могут быть векторами для стимуляции роста определенной ткани, клеток, группы клеток.
6. Сочетания перечисленных выше методов использования.
Таким образом, наша двумерная система дифференцировки позволила нам производить эндотелиальные клетки с высокой эффективностью, выбирать чистую популяцию функциональных эндотелиальных клеток, которые приобретали тот же самый эпигенетический статус ключевых факторов транскрипции и гомеостаза поддержания генов как их аналоги, дифференцирующиеся в эмбрионе iп vivо. Полученные эндотелиальные клетки могут найти широкое применение в медицинской практике Отобранные hЕSС-полученные эндотелиальные клетки экспрессировали эндотелий- специфические гены, формировали сосудоподобные структуры и были морфологически неотличимы от первичных эндотелиальных клеток. СDЗ 1 отобранные эндотелиальные клетки дифференцированные из hЕSСs были способны культивироваться iп vitrо по крайней мере до 4 пассажей. Используя наш способ дифференцировки, мы наблюдали CD31 и VЕ-саdhеriп экспрессию на 6 день. Несомненно, это могло произойти из-за различий между линиями клеток, хотя условия культивирования (то есть среда культивирования, факторы роста, обработка) имеют большое воздействие на свойства дифференцировки. Интересно то, что мы обнаружили VE саdhеriп экспрессию на 6 день hЕSСs дифференцировки, в то время как в естественных условиях его экспрессия наблюдалась только в 8-ую неделю беременности. Таким образом, маркер дифференцированных эндотелиальных клеток VЕ-саdhеriп был обнаружен очень рано iп vitrо. Список литературы. l.Ваhаrvапd, H., Jаfаrу, H., Маssumi, M., Аshtiапi, S.К. Gепеrаtiоп оf iпsuliп-sесrеtiпg сеlls frоm humап еmbrуопiс stеm сеlls. Dеv Grоwth Diffеr. 2006, 48: 323-332.
2. Нау, D. С, Zhао, D., Rоss, А., Мапdаlаm, R., Lеbkоwski, J., Сui, W. Dirесt Diffеrепtiаtiоп оf Humап Бmbrуопiс Stеm Сеlls tо Нераtосуtе-likе Сеlls Ехhibitiпg Fuпсtiопаl Асtivitiеs. Сlопiпg Stеm Сеlls. 2007, 9: 51-62
3. Непg, B.C., Наidеr, Н.Кh., Sim, E.K., Сао, Т., Ng, S.С. Strаtеgiеs fоr dirесtiпg thе diffеrепtiаtiоп оf stеm сеlls iпtо thе саrdiоmуоgепiс liпеаgе iп vitrо. Саrdiоvаsс Rеs. 2004, 62: 34-42.
4. Xu, С, He5 J.Q., Каmр, T.J., Роliсе, S., Нао, X., О'Sullivап, С, Саrрепtеr, M.K., Lеbkоwski, J., GoId JD. Humап еmbrуопiс stеm сеll-dеrivеd саrdiоmуосуtеs сап bе mаiпtаiпеd iп dеfiпеd mеdiшп withоut sегаm. Stеm Сеlls Dеv. 2006, 15: 931-941.
5. Lасаud, G., Кеllеr, G., Коuskоff, V. Тrасkiпg mеsоdеrm fоrmаtiоп апd sресifiсаtiоп tо thе hеmапgiоblаst iп vitrо.Тrепds Саrdiоvаsс Меd. 2004, 14, 314-317.
6. Сhоi, К., Кеппеdу, M., Каzаrоv. А., Рараdimitriоu, J.C., Кеllеr, G. А соmmоп рrесursоr fоr hеmаtороiеtiс апd епdоthеliаl сеlls. Dеvеlорmепt. 1998, 125, 725-732.
7. Сhuпg, Y.S., Zhапg, W.J., Аrепtsоп, E., Кiпgslеу, P.D., Раlis, J., Сhоi, К. Liпеаgе апаlуsis оf thе hеmапgiоblаst аs dеfiпеd bу FLKl апd SCL ехрrеssiоп. Dеvеlорmепt. 2002, 129, 5511-5520.
8. Nishikаwа, S.I., Nishikаwа, S., Нirаshimа, M., Маtsuуоshi, N., Коdаmа, H. Рrоgrеssivе liпеаgе апаlуsis bу сеll sоrtiпg апd сulturе idепtifiеs FLKl+VE-cadheriп+ сеlls аt а divеrgiпg роiпt оf епdоthеliаl апd hеmороiеtiс liпеаgеs. Dеvеlорmепt. 1998, 125, 1747- 1757.
9. Нubеr, T.L., Коuskоff, V.5 Fеhliпg, HJ., Раlis, J., Кеllеr, G. Наеmапgiоblаst соmmitmепt is iпitiаtеd iп thе рrimitivе strеаk оf thе mоusе еmbrуо. Nаturе. 2004, 432, 625-630. 10. Сеrdап, С, Rоulеаu, А., Вhаtiа, M., VEGF-A165 аugmепts еrуthrороiеtiс dеvеlорmепt frоm humап еmbrуопiс stеm сеlls. Вlооd. 2004, 103, 2504-12.
11. Сhаdwiсk, К., Wапg, L., Li, L., Мепепdеz, Р., Мurdосh, В., Rоulеаu, А., Вhаtiа, M. Суtоkiпеs апd BMP-4 рrоmоtе hеmаtороiеtiс diffеrепtiаtiоп оf humап еmbrуопiс stеm сеlls.
Вlооd. 2003, 102, 906-915 12. Lеvепbеrg, S., Gоlub, J.S., Аmit, M., Itsкоvitz-Еldоr, J., Lапgеr, R. Епdоthеliаl сеlls dеrivеd frоm humап еmbrуопiс stеm сеlls. Рrос Nаtl Асаd Sсi U S A. 2002, 99: 4391-4396.
13. Ng, E.S., Dаvis, R.P., Аzzоlа, L., Stапlеу, E.G., Еlеfапtу, А.G. Fоrсеd аggrеgаtiоп оf dеfmеd пumbеrs оf humап еmbrуопiс stеm сеlls iпtо еmbrуоid bоdiеs fоstеrs rоbust, rерrоduсiblе hеmаtороiеtiс diffеrепtiаtiоп. Вlооd. 2005, 106, 1601-1603.
14. Zаmbidis, E.T., Реаult, В., Раrк, T.S., Вuпz, F., Сiviп, CL, Hеmаtороiеtiс diffеrепtiаtiоп оf humап еmbrуопiс stеm сеlls рrоgrеssеs thгоugh sеquепtiаl hеmаtоепdоthеliаl, рrimitivе, апd dеfiпitivе stаgеs rеsеmbliпg humап уоlк sас dеvеlорmепt. Вlооd. 2005, 106, 860-870.
15. Zhап, X., Drаvid, G., Ye, Z., Наmmопd, H., Shаmblоtt, M., Gеаrhаrt, J., Сhепg, L. Fuпсtiопаl апtigеп-рrеsепtiпg lеuсосуtеs dеrivеd frоm humап еmbrуопiс stеm сеlls iп vitrо.Lапсеt. 2004, 364, 163-171
16. Каufmап, D. S., Напsоп, E.T., Lеwis, R.L., Аuеrbасh, R., Тhоmsоп, J. А. Hеmаtороiеtiс соlопу-fоrmiпg сеlls dеrivеd frоm humап еmbrуопiс stеm сеlls. Рrос Nаtl Асаd Sсi U S A. 2001, 98, 10716-10721. 17. Vоdуапik, M. А., Воrk, J. А., Тhоmsоп, J. А., Slukviп, LI. Humап еmbrуопiс stеm сеll- dеrivеd CD34+ сеlls: еffiсiепt рrоduсtiоп iп thе сосulturе with OP9 stгоmаl сеlls апd апаlуsis оf lуmрhоhеmаtороiеtiс роtепtiаl. Вlооd. 2005, 105, 617-626.
18. Нirаshimа, M., Каtаоkа, H., Nishikаwа, S., Маtsuуоshi, N., Nishikаwа, S. Маturаtiоп оf еmbrуопiс stеm сеlls iпtо епdоthеliаl сеlls iп ап iп vitrо mоdеl оf vаsсulоgепеsis. Вlооd. 1999, 93, 1253-1263.
19. Lаgаrkоvа, M.A., Vоlсhkоv, P. Y., Lуаkishеvа, A.V., Рhilопепkо, E.S., Кisеlеv, S.L. Divеrsе ерigепеtiс рrоfilе оf поvеl humап еmbrуопiс stеm сеll liпеs. CeIl Сусlе. 2006, 5: 416-420.
20. Gеrесht-Nir, S., Ziskiпd, А., Соhеп, S., Itskоvitz-Еldоr, J. Humап еmbrуопiс stеm сеlls аs ап iп vitrо mоdеl fоr humап vаsсulаr dеvеlорmепt апd thе iпduсtiоп оf vаsсulаr diffеrепtiаtiоп. Lаb Iпvеst. 2003, 83: 1811-1820.
21. Воmраis, H. еt аl. Humап епdоthеliаl сеlls dеrivеd frоm сirсulаtiпg рrоgепitоrs disрlау sресifiс fuпсtiопаl рrореrtiеs соmраrеd with mаturе vеssеl wаll епdоthеliаl сеlls. Вlооd 103, 2577-2584 (2004) 22. Сhап, Y., Fish, J.E., D'Аbrео, С. Thе сеll-sресifiс ехрrеssiоп оf епdоthеliаl пitriс-охidе sупthаsе: а rоlе fоr DNA mеthуlаtiоп. J Вiоl Сhеm. 2004, 279: 35087-35100.

Claims

ФОРМУЛА
1. Способ получения эндотелиалъных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, предусматривающий дифференцировку ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с человеческим фактором роста эндотелия сосудов VEGF и сепарацию полученных эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что используют синтетическую среду для дифференцировки на основе смеси DMEM/FI2 с КО заменителем сыворотки при соотношении : жидкая DMEM/FI2 - 75-95%, жидкий КО заменитель сыворотки — 5-25%, при этом синтетическая среда дополнительно содержит факторы роста SCF , BMP4 , bFGF, ТGFbеtа в эффективных количествах, причем ТGFbеtа добавляют на 3-6 день дифференцировки, а сепарацию проводят на 3- 9 день методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для клеток эндотелия, после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной синтетической среде при плотности посева не менее 50000 клеток на lсм2.
2. Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, предусматривающий дифференцировку ЭСК человека на подложке и в среде, которые обеспечивают направленную прямую дифференцировку ЭСК человека в эндотелиальные клетки, с человеческим фактором роста эндотелия сосудов VEGF и сепарацию полученных эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что используют среду для дифференцировки на основе смеси DMEM/FI2 с фетальной бычьей сывороткой при соотношении : жидкая DMEM/FI2- 75-95%, жидкая фетальная бычья сыворотка - 5-25%, при этом среда дополнительно содержит факторы роста SCF и bFGF в эффективных количествах, а сепарацию проводят на 3-9 день методом иммунологической селекции с использованием маркеров, специфических для эндотелиальных клеток , после чего полученные эндотелиальные клетки культивируют в указанной среде при плотности посева не менее 50000 клеток на lсм2.
PCT/RU2008/000795 2008-03-19 2008-12-24 Способ получения эндотелиальных клеток (варианты) WO2009116893A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201000378A EA022736B1 (ru) 2008-03-19 2008-12-24 Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)
EP08873385.2A EP2277993B1 (en) 2008-03-19 2008-12-24 Method for producing endothelial cells (variants)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008110210 2008-03-19
RU2008110210/13A RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2008-03-19 Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009116893A1 true WO2009116893A1 (ru) 2009-09-24

Family

ID=41025901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000795 WO2009116893A1 (ru) 2008-03-19 2008-12-24 Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP2277993B1 (ru)
EA (1) EA022736B1 (ru)
RU (1) RU2359030C1 (ru)
WO (1) WO2009116893A1 (ru)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
CA3114827C (en) 2007-07-31 2023-09-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine
KR101731474B1 (ko) 2008-02-21 2017-05-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
MX2011000125A (es) 2008-06-30 2011-02-25 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre pluripotentes.
BRPI0921996A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Métodos e composições para cultura e ligação de células em substratos planos.
CN102741395B (zh) 2009-12-23 2016-03-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
EP2539437B1 (en) 2010-02-25 2017-08-02 The Johns Hopkins University SMOOTH MUSCLE-LIKE CELLS (SMLCs) DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS
US9969981B2 (en) 2010-03-01 2018-05-15 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
EP2611909B1 (en) 2010-08-31 2018-01-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
AU2011296382B2 (en) * 2010-08-31 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN105143446B (zh) 2011-12-22 2020-11-03 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞
RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
AU2013225946B2 (en) * 2012-02-29 2018-07-12 The Johns Hopkins University Method for guiding the derivation of endothelial cells from human pluripotent stem cells employing two-dimensional, feeder-free differentiation
CN108034633B (zh) 2012-06-08 2022-08-02 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
BR112015015701A2 (pt) 2012-12-31 2017-07-11 Janssen Biotech Inc diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células pancreáticas endócrinas com o uso de reguladores hb9
EP2938722B1 (en) 2012-12-31 2021-12-08 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
EP2938724B1 (en) 2012-12-31 2020-10-28 Janssen Biotech, Inc. Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
RU2691062C2 (ru) * 2013-01-15 2019-06-10 Корнелл Юниверсити Перепрограммирование эндотелия человека в гемопоэтических предшественников множественных линий дифференцировки с использованием определенных факторов
US8859286B2 (en) * 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
US9506037B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 The Johns Hopkins University Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix
US9994825B2 (en) 2013-03-15 2018-06-12 The Johns Hopkins University Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
WO2020030954A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Integrative Medicine Clinic, Sia Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191744A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for differentiating primate embryonic stem cell into vascular cell

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0213815A (pt) * 2001-11-02 2004-10-19 Wisconsin Alumni Res Found Células endoteliais derivadas de células tronco embriÈnicas de primatas
RU2217196C2 (ru) * 2002-02-28 2003-11-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Способ индукции дифференцировки клеток
JP2007536936A (ja) * 2004-05-14 2007-12-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 幹細胞集団および使用方法
ES2502841T3 (es) * 2005-09-28 2014-10-06 Ipd-Therapeutics B.V. Métodos y medios para la proliferación de células madres y generación y expansión posterior de células progenitoras, así como producción de células efectoras como terapéuticos clínicos

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191744A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for differentiating primate embryonic stem cell into vascular cell

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAHARVAND, H.; JAFARY, H.; MASSUMI, M.; ASHTIANI, S.K.: "Generation of insulin-secreting cells from human embryonic stem cells", DEV GROWTH DIFFER., vol. 48, 2006, pages 323 - 332
BOMPAIS, H. ET AL.: "Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells", BLOOD, vol. 103, 2004, pages 2577 - 2584
CERDAN, C.; ROULEAU, A.; BHATIA, M.: "EGF-A165 augments erythropoietic development from human embryonic stem cells", BLOOD, vol. 103, 2004, pages 2504 - 12
CHADWICK, K; WANG, L.; LI, L.; MENENDEZ, P.; MURDOCH, B.; ROULEAU, A.; BHATIA, M.: "Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells", BLOOD, vol. 102, 2003, pages 906 - 915
CHAN, Y.; FISH, J.E.; D'ABREO, C.: "The cell-specific expression of endothelial nitric-oxide synthase: a role for DNA methylation", J BIOL CHEM., vol. 279, 2004, pages 35087 - 35100
CHOI, K.; KENNEDY, M.; KAZAROV. A.; PAPADIMITRIOU, J.C.; KELLER, G.: "A common precursor for hematopoietic and endothelial cells", DEVELOPMENT, vol. 125, 1998, pages 725 - 732
CHUNG, Y.S.; ZHANG, W.J.; ARENTSON, E.; KINGSLEY, P.D.; PALIS, J.; CHOI, K.: "Lineage analysis of the hemangioblast as defined by FLK1 and SCL expression.", DEVELOPMENT, vol. 129, 2002, pages 5511 - 5520
DATABASE PUBMED MEDLINE [online] GERECHT-NIR S. ET AL.: "Human embryonic stem cells as an in vitro model for human vascular development and the induction of vascular differentiation.", XP001203785, Database accession no. 14691299 *
GERECHT-NIR, S.; ZISKIND, A.; COHEN, S.; ITSKOVITZ-ELDOR: "J. Human embryonic stem cells as an in vitro model for human vascular development and the induction of vascular differentiation", LAB INVEST., vol. 83, 2003, pages 1811 - 1820
HAY, D.C.; ZHAO, D.; ROSS, A.; MANDALAM, R.; LEBKOWSKI, J.; CUI, W.: "Direct Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-like Cells Exhibiting Functional Activities", CLONING STEM CELLS, vol. 9, 2007, pages 51 - 62
HENG, B.C.; HAIDER; H.KH.; SIM, E.K.; CAO, T.; NG, S.C.: "Strategies for directing the differentiation of stem cells into the cardiomyogenic lineage in vitro", CARDIOVASC RES., vol. 62, 2004, pages 34 - 42
HIRASHIMA, M.; KATAOKA, H.; NISHIKAWA, S.; MATSUYOSHI, N.; NISHIKAWA, S.: "Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis", BLOOD, vol. 93, 1999, pages 1253 - 1263
HUBER, T.L.; KOUSKOFF, V.; FEHLING, H.J; PALIS, J.; KELLER, G: "Haemangioblast commitment is initiated in the primitive streak of the mouse embryo", NATURE, vol. 432, 2004, pages 625 - 630
KAUFMAN, D.S.; HANSON, E.T.; LEWIS, R.L.; AUERBACH, R.; THOMSON, J.A.: "Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 98, 2001, pages 10716 - 10721
LAB INVEST, vol. 83, no. 12, December 2003 (2003-12-01), pages 1811 - 20 *
LACAUD, G.; KELLER, G; KOUSKOFF, V.: "Tracking mesoderm formation and specification to the hemangioblast in vitro", TRENDS CARDIOVASC MED., vol. 14, 2004, pages 314 - 317
LAGARKOVA, M.A.; VOLCHKOV, P.Y.; LYAKISHEVA, A.V.; PHILONENKO, E.S.; KISELEV, S.L.: "Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines", CELL CYCLE., vol. 5, 2006, pages 416 - 420
LEVENBERG, S.; GOLUB, J.S.; AMIT, M.; ITSKOVITZ-ELDOR, J.; LANGER, R.: "Endothelial cells derived from human embryonic stem cells", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 99, 2002, pages 4391 - 4396
NG, E.S.; DAVIS, R.P.; AZZOLA, L.; STANLEY, E.G.: "Elefanty, A.G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation", BLOOD, vol. 106, 2005, pages 1601 - 1603
NISHIKAWA, S.I.; NISHIKAWA, S.; HIRASHIMA, M.; MATSUYOSHI, N.; KODAMA, H: "Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK+VE- cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages", DEVELOPMENT, vol. 125, 1998, pages 1747 - 1757
See also references of EP2277993A4 *
VODYANIK, M.A.; BORK, J.A.; THOMSON, J.A.; SLUKVIN, I.I: "Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential", BLOOD, vol. 105, 2005, pages 617 - 626
XU, C.; HE, J.Q.; KAMP, T.J.; POLICE, S.; HAO, X.; O'SULLIVAN, C.; CARPENTER, M.K.; LEBKOWSKI, J.; GOLD JD.: "Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes can be maintained in defined medium without serum", STEM CELLS DEV., vol. 15, 2006, pages 931 - 941
ZAMBIDIS, E.T.; PEAULT, B.; PARK, T.S.; BUNZ, F.; CIVIN, C.I.: "Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development", BLOOD, vol. 106, 2005, pages 860 - 870
ZHAN, X.; DRAVID, G.; YE, Z.; HAMMOND, H.; SHAMBLOTT, M.; GEARHART, J.; CHENG, L.: "Functional antigen-presenting leucocytes derived from human embryonic stem cells in vitro", LANCET, vol. 364, 2004, pages 163 - 171

Also Published As

Publication number Publication date
RU2359030C1 (ru) 2009-06-20
EP2277993A1 (en) 2011-01-26
EA022736B1 (ru) 2016-02-29
EP2277993B1 (en) 2015-09-02
EP2277993A4 (en) 2011-11-09
EA201000378A1 (ru) 2011-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009116893A1 (ru) Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)
JP5067949B2 (ja) 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法
EP2318520B1 (en) Compositions for mesoderm derived isl1+ multipotent cells (imps), epicardial progenitor cells (epcs) and multipotent cxcr4+cd56+ cells (c56cs) and methods of use
US8507275B2 (en) Method of inducing differentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
JP2020162608A (ja) 心外膜細胞を形成するための方法及び組成物
KR102368751B1 (ko) 모양체 주연부 간세포의 제조 방법
US20230174929A1 (en) Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity
KR101812817B1 (ko) 무관계 표현형이 고갈된 분화된 다능성 줄기 세포 자손
KR20080056181A (ko) 전구세포주의 유도 방법
JP2005522213A (ja) 脈管形成性の始原細胞をインビトロで同定し、単離し、または分化させるための新規な方法
WO2000017326A1 (en) Non-hematopoietic cells, including cardiomyocytes and skeletal muscle cells, derived from hematopoietic stem cells and methods of making and using them
EP3699275A1 (en) Organ organoid and method for producing same
WO2012133942A1 (ja) 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞
KR100677054B1 (ko) 제대혈로부터 다분화능 전구세포를 분리하여 배양하는 방법 및 이의 분화 유도방법
WO2021201175A1 (ja) 下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法
Srivastava et al. Dexamethasone facilitates erythropoiesis in murine embryonic stem cells differentiating into hematopoietic cells in vitro
Fang et al. Stem cells and combinatorial science
Jahan Multi-stage endothelial differentiation and expansion of human pluripotent stem cells
Aghami et al. ESC cardiac differentiation and applications
Hierlihy Identification and characterization of stem cell-like SP cells in the post-natal myocardium.
Chronowska PANCREATIC DIFFERENTIATION OF SAX 17 KNOCK-IN MOUSE EMBRYONIC STEM CELLSIN VITRO
Vunjak-Novakovic et al. Vascular Progenitor Cells Isolated from Human Embryonic Stem Cells
UA95733C2 (ru) Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08873385

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201000378

Country of ref document: EA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008873385

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: a201007592

Country of ref document: UA