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WO2007102200A1 - 抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 - Google Patents

抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 Download PDF

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WO2007102200A1
WO2007102200A1 PCT/JP2006/304370 JP2006304370W WO2007102200A1 WO 2007102200 A1 WO2007102200 A1 WO 2007102200A1 JP 2006304370 W JP2006304370 W JP 2006304370W WO 2007102200 A1 WO2007102200 A1 WO 2007102200A1
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WO
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seq
monoclonal antibody
antibody
chain
cells
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PCT/JP2006/304370
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English (en)
French (fr)
Inventor
Susumu Uchiyama
Kiichi Fukui
Original Assignee
Osaka University
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Publication date
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CD20 monoclonal antibody.
  • CD20 is expressed on the surface of human B lymphocytes and is a sugar-free protein that is expressed on many malignant tumor B cells in addition to normal B cells in peripheral blood, spleen, tonsils and bone marrow. Yes.
  • the epitope to which the CD20 monoclonal antibody binds has been reported to have a very diverse biological response, and many monoclonal antibodies that recognize CD20 have been reported.
  • rituximab is a chimeric mouse Z human monoclonal antibody (C2B8) derived from mouse antibody 2B8 obtained by immunizing an SB cell line which is a human B cell (see Patent Documents 1 and 2), It has been put into practical use as a therapeutic agent for low-grade non-Hodgkin lymphoma (NHL) under the registered trademark Rituxan. Furthermore, Rituxan has been shown to be effective against many immune diseases involving B cells, such as malignant tumors such as chronic lymphocytic leukemia (CLL), autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia purpura. Pathogenic autoantibodies such as disease (ITP) are reported to be effective against autoimmune diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and multiple sclerosis (MS). (See Non-Patent Documents 1 to 4).
  • chimeric molecules with heterologous animals are not generally preferred as therapeutic agents because of their antigenicity, but anti-CD20 antibodies, including rituximab, have the property of targeting and removing all B cells including normal cells. It was thought that there was no sex. However, a few percent have been reported to induce neutralizing antibodies during the treatment period, the possibility increases further depending on the dose and period of administration, and From cell lymphoma , RA, IT, and MS have expanded the problem of antigenicity, and recently there has been a demand for humanized or human antibodies having sequences closer to humans! .
  • the chimeric antibody has a problem that the half-life in blood is relatively short, and the beta half-life ( ⁇ 1/2) of the mouse Z human chimeric antibody including rituximab is only 3 to 4 days.
  • the response rate of clinical trials for low-grade NHL has been reported to be less than 50% (see Non-Patent Document 7).
  • the dissociation constant (Kd value) of rituximab for the CD20 antigen is 5.2 nM, and there is a problem that the dose is increased in NHL treatment where the binding affinity is too high (see Non-Patent Document 8).
  • Patent Document 1 International Publication No. 94Z11026 Pamphlet
  • Patent Document 2 U.S. Patent No. 5736137
  • Non-patent document 2 Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 205-11
  • Non-patent document 3 Zaja F et al, Heamatologica 2002; 87: 189-95
  • Non-Patent Document 4 Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116: 465-7
  • Non-Patent Document 5 Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
  • Non-Patent Document 6 Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
  • Non-Patent Document 7 IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998
  • Non-Patent Document 8 Mitchell ER et al., Blood 1994; 82: 435-445
  • the main object of the present invention is to provide an anti-CD20 monoclonal antibody exhibiting a biological activity more suitable as a pharmaceutical.
  • the present inventors have produced a monoclonal antibody having a high binding affinity for a human CD20 molecule in a natural state to obtain an anti-CD20 monoclonal antibody having an excellent function.
  • Researched earnestly.
  • SB cells and Raji cells which are B cell lines with a high density of CD20 antigen as an immunogen, and non-human animal cells that express CD20 in a large amount on the cell membrane by genetic recombination should be used in combination.
  • High affinity The inventors have found that monoclonal antibodies that exhibit excellent biological activity can be obtained, and have completed the present invention.
  • Human CD20 antigen which is derived from a human B cell line expressing human CD20 antigen and a cell line derived from a non-human animal that is transformed with human CD20 DNA and is different from the immunized animal.
  • An anti-CD20 monoclonal antibody having growth inhibitory activity against cells having
  • a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody obtained by fusing the mouse-derived monoclonal antibody variable region amino acid sequence of (5) above with a human immunoglobulin constant region amino acid sequence,
  • the L chain variable region amino acid sequence and the H chain variable region amino acid sequence are SEQ ID NO: 4 and 12, SEQ ID NO: 5 and 13, SEQ ID NO: 6 and 14, SEQ ID NO: 7 and 15, or SEQ ID NO: 8 and 16, respectively.
  • ABP-105466 produced by the human anti-CD20 monoclonal antibody according to (7) above,
  • SEQ ID NO: 18 L chain and SEQ ID NO: 24 H chain, SEQ ID NO: 18 L chain and SEQ ID NO: 22 H chain, SEQ ID NO: 19 L chain and SEQ ID NO: 22 H chain or SEQ ID NO: 19 L A human anti-anti-CD20 monoclonal antibody according to (14) above, which combines a chain and the H chain of SEQ ID NO: 23;
  • a therapeutic agent for a B cell-related disease comprising the anti-CD20 monoclonal antibody described in (6), (7), (10), (14) or (16) as an active ingredient.
  • the monoclonal antibody of the present invention exhibits a strong binding affinity for the extracellular epitope of CD20 antigen and has biological activities such as cell growth inhibitory activity and is suitable as a pharmaceutical. Furthermore, a therapeutic agent for a disease associated with B cells can be provided by chimerizing or humanizing the monoclonal antibody.
  • FIG. 1 is a restriction map showing the structure of recombinant antibody expression vector pNOW-Ab
  • FIG. 2 is a restriction map showing the structure of a protein expression vector pNOW.
  • FIG. 3a is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3b is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3c is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3d is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 4a is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4b is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4c is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4d is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 5a is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 5b is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 5c is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 5d is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 6a is a graph showing the results of a CDC test.
  • FIG. 6b is a graph showing the results of the CDC test.
  • FIG. 6c is a graph showing the results of the CDC test.
  • FIG. 6d is a graph showing the results of a CDC test.
  • FIG. 7a is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7b is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7c is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7d is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 8a is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 8b is a graph showing the results of apoptosis experiments using humanized antibodies.
  • FIG. 8c is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 8d is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 9a is a graph showing the ratio of early apoptosis with a humanized antibody
  • FIG. 9b is a graph showing the ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • FIG. 9c is a graph showing the ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • FIG. 9d is a graph showing a ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • PAbgh Ushi growth hormone gene poly A addition signal
  • DHFR mouse dihydrofolate reductase cDNA
  • PAsv Simian virus 40 poly A with signal
  • PBR322ori Origin of replication in E. coli
  • Amp Selectable marker in E. coli (ampicillin resistance)
  • Neo r Selectable marker in mammalian cells (G418 resistance)
  • VL Antibody light chain variable region cDNA
  • Vh Antibody light chain variable region cDNA
  • antibody includes not only the whole antibody but also a fragment exhibiting a binding affinity for an antigen equivalent to the whole antibody, for example, a fragment containing the variable region of the whole whole antibody (eg, Fab, F (ab ′), etc.).
  • the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody having high affinity for human CD20 antigen and exhibiting excellent biological activity, and includes mouse-derived monoclonal antibodies, chimerized antibodies, and humanized antibodies. .
  • the first preferred embodiment has a growth inhibitory activity against cells having human CD20 antigen, and the dissociation constant (Kd value) for Raji cells (floating cells) is a matrix derived from rituximab. It is a monoclonal antibody having a high affinity for human CD20 antigen of 1B2 or less, preferably 1.70 to 3.39 nM of 2B8 which is a mouse antibody.
  • the method for measuring the dissociation constant is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring floating cells, but in this specification, the dissociation constant is determined by the method described in the following examples.
  • the growth inhibitory activity against cells having human CD20 antigen is greater than 2B8.
  • the growth inhibitory activity is preferably a growth inhibitory activity against in vitro culture of cells having human CD20 antigen in the absence of peripheral blood mononuclear cells, and more preferably, the growth inhibitory activity is due to apoptosis induction.
  • the above growth inhibitory activity can be measured, for example, by the method described in Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS. Avian D. 2002 Jan-Mar; 46 (l): 10-6.
  • the L chain variable region amino acid sequence and the H chain variable region amino acid sequence are SEQ ID NO: 1 and 9, SEQ ID NO: 2 and 10 respectively.
  • monoclonal antibodies derived from mice having SEQ ID NOs: 3 and 11 and those obtained by chimerizing or humanizing these antibodies can be mentioned.
  • Chimerization is carried out according to a known method as described in, for example, Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3: 439-444 and the variable region amino acid sequence of a mouse-derived monoclonal antibody. It can be carried out by fusing human immunoglobulin constant region amino acid sequences.
  • the amino acid sequences of the L chain variable regions and the amino acid sequences of the H chain variable regions of a plurality of mouse monoclonal antibodies may be arbitrarily combined.
  • the mouse-derived monoclonal antibody variable region amino acids of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 The mouse-derived monoclonal antibody variable region of SEQ ID NOs: 9 to 11 having a chimerized sequence and a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody comprising a combination of the H chain having a chimerized amino acid sequence, the mouse-derived monoclonal antibody of any of SEQ ID NOs:
  • the humanized anti-CD20 monoclonal antibody is a combination of the light chain of the amino acid sequence of the variable region CDR and the human chain of SEQ ID NOS: 9 to 11, and the human chain of any mouse monoclonal variable region CDR sequence. It is done.
  • the antibody of the second aspect of the present invention is a monoclonal antibody obtained by chimerizing or humanizing a mouse-derived monoclonal antibody having a dissociation constant (Kd value) of Raji cells of 1B8 of 2B8 or less.
  • Kd value dissociation constant
  • Antibodies with high affinity for human CD20 antigen especially human IgGl or IgG3, or antibodies with human Fc sequences modified from them (including mouse-derived monoclonal antibodies that are chimeric or humanized) It is well known that binding to the above CD20 induces effector cell activity via Fc ⁇ RIII (CD 16) on NK cells, causing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). It has been.
  • antibodies having high affinity for human CD20 antigen particularly antibodies having human HcG or IgM, or modified human Fc sequences (including those obtained by chimerizing or humanizing mouse-derived monoclonal antibodies) It is also well known that when it binds to CD20 on the cell surface, it induces complement activation and causes complement-dependent cytotoxicity (CDC)! /
  • the antibody of the second aspect of the present invention is expected to show ADCC or CDC with low or no growth inhibitory activity.
  • the L chain variable region amino acid sequence and the H chain variable region amino acid sequence are SEQ ID NO: 4 and 12, SEQ ID NO: 5 and 13, SEQ ID NO: 6 and 14, SEQ ID NO: 7 and 15, or those having SEQ ID NOs: 8 and 16.
  • Chimerization or humanization can be performed in the same manner as in the antibody of the first aspect.
  • the amino acid sequences of the L chain variable regions and the amino acid sequences of the H chain variable regions of a plurality of mouse monoclonal antibodies are arbitrarily combined. May be.
  • an L chain obtained by chimerizing the mouse monoclonal antibody variable region amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 8 and an H chain obtained by chimerizing the mouse derived monoclonal antibody variable region amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 16 The Combined chimeric anti-CD20 monoclonal antibody, SEQ ID NOs: 4-8 !, any mouse-derived monoclonal antibody variable region L chain with amino acid sequence of CDR and SEQ ID NOs: 12-16, derived from any mouse Monoclonal antibody variable region Humanized anti-CD20 monoclonal antibody combining a humanized H chain with a CDR sequence.
  • the antibody of the preferred third aspect of the present invention is not limited to a specific dissociation constant for 2B8, including a humanized monoclonal antibody that is also effective against cells for which rituximab has no effect. It is a humanized antibody.
  • Examples of these antibodies include the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 24, the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 22, the L chain of SEQ ID NO: 19 and the H chain of SEQ ID NO: 22 or And a humanized CD20 monoclonal antibody comprising a combination of the L chain of SEQ ID NO: 19 and the H chain of SEQ ID NO: 23.
  • the mouse-derived monoclonal antibody of the present invention or the mouse-derived monoclonal antibody that can be used for the production of the antibody of the present invention has, for example, a mouse hybridoma clone obtained by screening by the following method, having the desired properties. This can be obtained by selecting clones that produce monoclonal antibodies.
  • sensitizing antigen for example, SB cells or Raji cells, which are cells expressing CD20, and, for example, CD20 DNA that is commercially available by genetic recombination (or an equivalent effect) CHO cells (CHOZCD20) that have been transformed with CD20 expression on the cell surface after being transformed with such fragments.
  • the initial immunization, booster immunization, and final immunization are expressed as the sensitizing antigen at least once.
  • Immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye, and at least one immunization is the same as that of an immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination as a sensitizing antigen.
  • One of the immunizations using a cell line derived from an animal belonging to the eye and the final immunization should be the other.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody is prepared according to a known method: (1) immunization of an immunized animal, (2) preparation of lymphocytes from the immunized animal, (3) preparation of parental cells, (4) lymphocytes and Cell fusion of parent cells, (5) screening and clawing (See, for example, Ailsa M. Campbell (Author), Toshiaki Osawa (translation) Biochemical Monoclonal Antibody, Tokyo Chemical Dojin, 1989).
  • a method for producing a monoclonal antibody using a high-pridoma using the obtained clone is a normal method for producing a monoclonal antibody, except that the hybridoma produced by the method of producing the hybridoma of the present invention is used. Same as above. In the case of mass production, methods such as cell culture and mouse ascites can be mentioned. In the case of producing a chimeric or humanized antibody, a gene encoding a chimerized or humanized antibody is prepared, incorporated into an expression vector, and the expression vector is expressed in appropriate cells. Can be produced.
  • the L chain and H chain variable region genes are chimerized with human immunoglobulin L chain and H chain ( ⁇ ) constant region genes and incorporated into a high expression vector for CHO cells.
  • Vector systems for producing recombinant antibodies may be commercially available, but based on the mammalian cell high expression vector pNOW (Patent No. 3582965), both L-chain and H-chain multicloning sites ( The one constructed in the high expression vector pNOW-ab for dimers having MCS) can be used.
  • a restriction map showing the composition of each vector is shown in Figs.
  • the expression vector incorporating the chimeric antibody gene is transferred to CHO cells, and clones are selected with high productivity.
  • An antibody is produced by the usual method of its clonal power.
  • the antibody of the first aspect of the present invention has a relatively high binding affinity compared to rituximab and has a growth inhibitory activity, preferably an activity induced by apoptosis. It can be used as an active ingredient in therapeutic agents for B cell malignancies and immune diseases involving B cells.
  • the antibodies of the second and third aspects of the present invention are considered to exhibit antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) against cells having human CD20 antigen. Therefore, it can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for B cell malignant tumors and immune diseases involving B cells. Therefore, the present invention also provides a therapeutic agent for a B cell-related disease containing these chimerized or humanized antibodies as active ingredients.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that does not require cross-linking with a secondary antibody to induce apoptosis, and an antibody that does not require it.
  • An antibody that can induce apoptosis alone is a secondary antibody. Since it is not necessary, it is convenient for pharmaceutical use.
  • two or more of the antibodies of the present invention may be used in combination.
  • B cell-related diseases include, but are not limited to, non-Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia, rheumatoid arthritis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia Examples include purpura, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody symptoms, Siedalen syndrome, Crohn's disease, scleroderma, and multiple sclerosis.
  • the therapeutic agent can be produced according to a known pharmaceutical technique, and other dosage components can be determined with reference to a known Rituxan without particular limitations.
  • SB cells and Raji cells which are B cell lines expressing CD20! /, Were cultured in vitro.
  • DNA encoding all molecules of CD20 obtained from Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850, specific primer hCD20- Cloning using S-GK-Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaa attc (SEQ ID NO: 25) and hCD20- E- Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc (SEQ ID NO: 26) and incorporating it into pNOW (Fig.
  • SB cells or Raji cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • CD20ZCHO cells were cultured using CHO-S-SFM II medium (GIBCO, Cat. No. 12052-098) supplemented with 800 / z gZml of G418. These cultures were centrifuged at lOOrpm for 5 minutes, then Dulbecco's PBS (-) was added to the cells, suspended, and centrifuged again. This washing operation was repeated once more, and a suspension prepared by adding physiological saline to the cells ( Cell number: 1 to 3 ⁇ 10 7 Zml) was used for immunization.
  • All of the immunogen preparations were intraperitoneally administered to 7-11 week old Balb / c female mice. Either the same cells of SB cells or CD20ZCHO cells were repeatedly administered 2 to 3 times at various days intervals, and then different cells (CD20ZCHO cells or Raji cells) were administered for the final immunization. The number of cells administered was 1 to 3 ⁇ 10 7 cells per mouse.
  • Table 1 shows the immunogen combinations used.
  • spleen cells were prepared from two mice and Oi.VT and LA Immunb erg, 1980, in: Selected Methods in Cellular Immunology, eds.B. isnell and SM Sni igi (Freeman and Co. San. According to Francisco, CA) p.351, fusion reaction with mouse myeloma (NS-1) was performed in the presence of PEG-1500.
  • Cell ELISA was performed using 96 well plates to which CD20ZCHO cells or CHO cells (parent strain) were attached, and wells producing antibodies that specifically react with CD20 were selected. Furthermore, a 96-well plate to which the same CD20ZCHO cells were attached was used to perform a competitive reaction with rituximab (C2B8), and an antibody (well) that reacts in a similar manner to the C2B8 epitope was selected.
  • C2B8 rituximab
  • Table 1 shows the results of screening.
  • CD20ZCHO cells or CHO cells (parent strain) attached to Poly-L-Lysine-coated 96-well plates (Asahi Techno Glass, Cat. No. ll-023-018) were used for Cell ELISA.
  • Each well was filled with 150 1 blocking solution (0.2% gelatin, 0.5% BSA in PBS) and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour. After washing the plate 5 times with 150 mM—NaCl, 0.05% —Tween20 aqueous solution, add 100 1 sample (diluted culture supernatant) to each well and perform the primary reaction at 37 ° C for 1 hour. I did it.
  • a mixed solution of a sample (diluted culture supernatant) and a chimeric antibody (10 to 40 ngZml) was prepared.
  • the absorbance of m was measured.
  • the limiting dilution method was used.
  • the cells were plated on a 96-well plate and cultured, and cell ELISA was performed on the culture supernatant of one colony well to select a clone producing a specific antibody.
  • Specific antibody-producing clones were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS, and when the cell density reached around 5 ⁇ 10 5 Zml, the medium was changed to serum-free medium ASF-104N (Ajinomoto) and cultured. After 2 to 4 days, the culture solution was centrifuged to collect the culture supernatant, and purified using a protein G column. The eluted monoclonal antibody solution was dialyzed against 150 mM NaCl. The solution was sterilized by filtration with a 0.2 m filter to obtain a test antibody (anti-human CD20 mouse monoclonal antibody).
  • Number of selected wells — A Responds to CD 20 / CHO cells.
  • Number of selected wells B Among the selected number of wells A, the monoclonal antibodies produced by the 8 representative clones that produced antibodies that exhibited a competitive anti-K against the control antibody.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NOs: 1 to 8) and the amino acid sequence of the H chain V region (SEQ ID NOs: 9 to 16) are as follows.
  • H chain V region sequence of lkl422 (SEQ ID NO: 9) MDYWGQGTSVTVSL
  • the base sequence of the variable region of the monoclonal antibody gene was determined, and the antibody binding affinity and the biological property test were performed as follows for the monoclonals produced by them. .
  • the number of cells was measured using a Burker-Turk hemocytometer (catalog No. 03-303-1, Kuruma Sales Co., Ltd.).
  • the culture medium of confluent cells 3 to 4 days after the passage was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature and 3000 rpm using a multi-centrifuge cooling centrifuge LX-120 (TOMY), and the supernatant was removed to collect the cells.
  • the number of rotations and time used here are the conditions under which the number of cells does not change even after repeated centrifugation and supernatant removal.
  • Na HPO Wako, Cat. No. 197-02865, Lot ASF2635
  • KCl Wako, Cat.
  • the washed cells were suspended in 1% BSA (Wako Cat No. 013-07492 Lot PKH3483) —PBS solution, and the cell density was adjusted to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • test antibody or positive control antibody As the primary antibody, test antibody or positive control antibody (2B8) 15, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200 ng (l. 5 to 5 1) each 1.5 ml tube (BM equipment, BM phosphor) Dispense into Glock tubes Cat. No. BM-15) and prepare 4 tubes without antibody at the same time. Three samples were prepared for each test antibody.
  • 1% BSA Wang Cat No.013-07492 Lot PKH3483
  • centrifuge in a micro high-speed cooling centrifuge MX-100 (T0MY) at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature collect the cells, and then suspend in 200 1 PBS to remove unreacted primary antibody remaining on the cell surface.
  • the operation of centrifuging at 3000 rpm for 3 minutes and removing the supernatant was performed twice.
  • the cells thus obtained were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates (Sumitomo Bakelite ELISA PLATE Cat. No. 8496F).
  • the amount of fluorescence of the secondary antibody was measured under the detection conditions of Fluorescense mode, 600 V ⁇ 526 SP / g reen (532 nm), Focus: bottom surface + 3 mm using Typhoon9210 image Nafisa ( ⁇ Amersnam Bioscience).
  • PBS solution 100 / z 1 added with 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng of FITC-labeled secondary antibody was used as a control for preparing a calibration curve.
  • a calibration curve is created by measuring the amount of fluorescence at each concentration of FITC-labeled secondary antibody used as a control, and the amount (mole number or weight) of secondary antibody bound to the cell is determined. It was. Assuming that each primary antibody and FITC-labeled secondary antibody reacted at a ratio of 1: 2, the amount of bound primary antibody was calculated. The amount of free primary antibody was also determined by subtracting the amount of binding from the amount of added antibody. When the antibody concentration was converted to molar concentration, the molecular weight of the monoclonal antibody was set to 150,000.
  • Flow cytometry (Annexin V / PI staining) was used to measure the apoptosis-inducing ability of the test antibody. Positive control (2B8) and negative control [Anti-CD3 monoclonal antibody (BD PharMingen)] were used. The test was performed using MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat. No. 4700, Lot. 20).
  • Raji cells are centrifuged and suspended in fresh medium RPMI1640 (Sigma, Cat. No. R8758, Lot. 44K2416) containing 10% FBS (non-immobilized) (ICN, Cat. No. 2916754, Lot. 8005C).
  • Nigoshi were placed lml each Ueru of 12 ⁇ E Le plates at a density of 5xl0 5 cells ZML.
  • each antibody was added to a final concentration of 2 gZml or 4 gZml (3 wells x 2 species concentration x 2 time points, total 12 wells).
  • Fig. 3a to Fig. 3d show the measurement results of the monoclonal antibody produced by 6 representative clones and the positive control (2B8) and negative control (Anti-CD3).
  • 2B8 the ability to induce apoptosis of 2B8 is considered to be high.
  • Clone lkl791 obtained from cell fusion of 1K17 series (immunized with CD20ZCHO and Raji cells) and cell fusion power of 1K14 series (immunized with SB cells and CD20Z CHO)
  • the monoclonal antibody produced by the obtained clone lkl422 was highly induced to induce apoptosis.
  • a suspension of 5 ⁇ 10 4 cells / ml of Raji cells was prepared in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS, and cultured in 100 1Z wells in 96 well plates. After 24 hours, each antibody solution was added to 50 1Z wells so that the antibody concentration was 1 gZml, and the culture was continued. 72 hours after the addition of the antibody, a cell-coloring dye Cell Counting Kit-8 (Dojindo Cat. No. 343-07623, Lot. SG076) was further cultured for 4 hours after being incubated with 101 Zwell, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • Table 2 shows the measurement results of the absorbance of the monoclonal antibody, positive control (2B8), and negative control of the above 6 clones, and Table 3 shows their characteristics.
  • ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the effector cells were activated through the Fc site of the anti-CD20 chimeric antibody and the ability to lyse the lymphoma cell line was measured.
  • each of the cells were washed with 10% FCS containing RPMI1640, a force Rusein by reaction for 15 minutes in 37 ° C after incorporated into live cells, the number of cells 4 X 10 5 cells Zml It was adjusted. Forced lucein can be used to stain only living cells because the cell membrane is maintained normally and is maintained only in the cells.
  • anti-CD20 chimeric antibody rituximab C2B 8
  • 6 kinds of chimeric antibodies (lk0924, lkl402, lkl422, lkl712, lkl736, lkl791) at 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml with RPMI1640 containing 10% FCS , Adjusted to 0.8 g / ml. Effector cells were collected from a healthy person, immediately after collecting the centrifuged lymphocyte fraction was layered onto Ficoll, 5 X 10 6 cells / ml, 1 X 10 6 cells / ml, 0. 2 X 10 6 cells / adjusted to ml.
  • Concentrated cells 25 ⁇ 1, anti-CD20 chimeric antibody solution 25 1 (final concentrations of 5 ⁇ g / m 1 ⁇ gZml, 0.2 ⁇ g / ml, respectively) 50 1 (E: T ratios 25: 1, 5: 1, 1: 1 respectively), mix 100 1 in a 96-well plate and react for 4 hours in an incubator at 37 ° C and 5% CO concentration I let you.
  • E T ratios 25: 1, 5: 1, 1: 1 respectively
  • the lysed cells break the cell membrane and force lucein comes out of the cell.
  • Use quencher to eliminate the fluorescence of force lucein released in the reaction solution, and then measure the amount of fluorescence using a fluorescence analyzer. did.
  • Dissolution rate [%] ((natural dissolution) (sample)) / ⁇ (natural dissolution) (maximum dissolution)) X I 0 0
  • Figures 4a to 4d show the relationship between antibody concentration and cytotoxic activity in each cell when the ratio of the number of effector cells such as NK cells to the number of target cells (E: T ratio) is 25: 1.
  • E: T ratio the ratio of the number of effector cells such as NK cells to the number of target cells
  • FIGS. 5a to 5d show the relationship between E: T ratio and cytotoxic activity in each cell when the antibody concentration is 5 gZml.
  • the cytotoxic activity is shown by adding antibody to any cell under the condition of E: T ratio of 25: 1. That is, the antibody is involved in cell injury.
  • W Cell lines other than iL2—NS already showed activity similar to 1 ⁇ g / mU 5 ⁇ g / ml at 0.2 ⁇ gZml antibody concentration (saturated at 0.2 ⁇ gZml) and active Has reached its maximum value and is flat, suggesting that it acts with less antibody than is required for complement-dependent cytotoxic activity.
  • each cell was washed with 10% FCS-containing RPMI 1640 and the number of cells was adjusted to 2 to 3 ⁇ 10 6 Zml.
  • C2B8 rituximab
  • an anti-CD20 chimeric antibody rituximab
  • 6 types of chimeric antibodies lk0924, lkl402, lkl422, lkl712, lkl736, lkl791 in RPMI1640 containing 10% FCS at 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml , Adjusted to 0.8 gZml.
  • Concentrated cells 55 ⁇ 1, anti-CD20 chimeric antibody solution 25 1 (each final concentration is 5 ⁇ g / m 1 ⁇ g / 0.2 ⁇ g / ml), pooled serum collected from 5 healthy individuals Alternatively, the inactivated 20 1, a total of 100 1, were mixed by a vortex mixer and reacted in an incubator at 37 ° C. and 5% CO concentration for 2 hours. Background calculation sun
  • Pulls were prepared by replacing 25 ⁇ 1 of the antibody solution with 25 ⁇ 1 of RPMI1640 medium containing 10% FCS.
  • dead cells were stained with ⁇ (Providium iodide) solution and analyzed by FACS (Becton Dickinson). The numbers are taken from the population of dead cells as they are, and the values of samples with knock ground and inactivated serum are subtracted.
  • FIGS. 6a to 6d The relationship between antibody concentration and cytotoxic activity in each cell is shown in FIGS. 6a to 6d.
  • Raji, WiL2—NS, SU—DHL4 all six antibodies Indicates activity.
  • lkl791 shows particularly high activity compared to other antibodies when compared at a concentration of 5 / z gZml, which can confirm concentration dependence.
  • RC-K8 for which rituximab is not effective, showed a significant difference for each antibody.
  • Rituximab, lkl402 and lkl712 have little or no activity.
  • lkl791 shows very high activity, and at a concentration of 5 / z gZml, it shows about 50% damage activity.
  • Lk0924 force 25 0/0 approximately, shows a lkl422, lkl736 force 10 0/0 of about cytotoxicity, Ru.
  • Raji cells derived from human B cell line are cultured in a 10% FCS supplemented medium deactivated to RPMI1640 in a CO incubator at 37 ° C and 5% CO concentration, and maintained by passage twice a week.
  • Cell culture medium 3-4 days after passage (approximately lxlO 6 Zml) is centrifuged at room temperature at lOOOrpm for 5 minutes, and the cells are collected, suspended in PBS (—), and centrifuged at lOOOrpm for 5 minutes. Washing was performed by removing the supernatant twice.
  • Anti-CD20 antibody (positive control antibody: mouse antibody 2B8, chimeric antibody and humanized antibody C2B8) was mixed with Raji cells and reacted at room temperature for 1 hour to carry out the primary antibody reaction.
  • the final concentration of each of the anti-CD20 antibodies is 1.33, 2.67, 4.00, 5.33, 6.67, 8.00, 9.33, 10.67, 12.00, 13.
  • Thirteen points of 33, 14.67, and 16.00 nM were used, and the number of cells was 5xl0, 6 % 1% BSA-PBS solution was used as a reaction solution and dispensed to a volume of 100 1.
  • Three samples were prepared for the same test antibody, and four tubes were prepared with no antibody added as a background calculation sample.
  • GOAT Anti Mouse IgG H & D-FITC was used as the FITC-labeled secondary antibody
  • GOAT F ab ′ 2F Fragment Anti Human IgG (Fcy) -FI TC was used as the chimeric antibody and humanized antibody.
  • the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature, the unreacted FITC-labeled secondary antibody was removed, the cells were collected, suspended in 200 1 PBS, centrifuged again, and washed.
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates.
  • the fluorescence of the secondary antibody was measured using a Typhoon9210 image analyzer (Amersham Bioscience).
  • the cell culture solution on the 3rd to 4th day after passage (about lxlO 6 Zml) was centrifuged at room temperature at lOOOrpm for 5 minutes to collect the cells.
  • Anti-CD20 antibody positive control antibody: mouse antibody 2B8, chimeric antibody and humanized antibody C2B8; negative control: Anti-CD3 monoclonal antibody
  • cells suspended in fresh culture medium are mixed for 1.5 hours at 37 ° C. Reacted in a 5% CO incubator.
  • the final concentration of each of the anti-CD20 antibodies is 0.2, 1, 5 / z gZml, cell density lxlO 6 cells Zm 1, and culture medium is used as a reaction solution to a volume of 250 1. 1. Reaction in a 5ml tube I went. Three samples were prepared for the same test antibody.
  • the mixture was centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature to remove unreacted antibodies and collect the cells.
  • nti mouse IgG and Fc y Fragment were used, and Gome Anti human Ig and vcy Fragment specific were used for the Kimefu body and the human antibody.
  • the mixture was centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature, the unreacted secondary antibody was removed, and the cells were collected. Suspended with 250 1 PBS, washed again by centrifugation
  • MEBCYTO apoptosis kit- Annexin V-FITC, ⁇ - (MBL, Cat. No. 4700, Lot. 21) was used as a detection reagent. After suspending 85 ⁇ 1 of Binding buffer, add Annexin V-FITC 5 ⁇ 1 and propidium iodide (PI) 5 1 (final concentration 0.5 mg / ml) and mix well. The reaction was allowed to proceed for 15 minutes at temperature.
  • a DNA whose codon was optimized for CHO cells based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17 to 24 was designed and synthesized by a conventional method.
  • the humanized 1K1791 expression construct was introduced into CHO DG44cd B cells using a transfection reagent. 1 ⁇ 10 6 CHO DG44cdB cells into which each gene was introduced were suspended in 100 ml of selective medium and spread on 5 96-well plates (200 1Z well). The cells were cultured at 37 ° C for 3-4 weeks in the presence of 5% carbon dioxide.
  • Transfusion reagent Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427
  • Selection medium IS CHO-CD w / Hydrolysate / 4 mM GlutaMAX / 0.8 mg / ml G418
  • Clones with high antibody production were transferred to a 24-well plate, cultured for about 5 days, and the supernatant was taken and antibody production was measured by sandwich ELISA.
  • Two clones selected for each of the 16 constructs were cultured in T75 flasks containing 30 ml of selective medium.
  • An antibody-producing cell line (genetically modified CHO-DG44 cells) containing Hydrolysate CHO—CD / with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No. 91119) was supplemented with 4 mM GlutaMax (Invitrogen, Cat 35050—061) and 200 ⁇ g / ml G418 (Sigma, Cat. No. A1720—5G). Culture in a medium incubator at 37 ° C and CO concentration of 5%.
  • the cell culture medium was centrifuged at room temperature and 3500 rpm for 5 minutes, and the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 ⁇ syringe filter. Equilibrated with 50 mM Tris—HC1, pH 7.0
  • the culture supernatant was added to a Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01) column, and then washed with 50 mM Tris—HC1, pH 7.0. Elution was performed with 0.1 M citrate, pH 4.0, and 400 ⁇ l was collected and neutralized with 10 ⁇ l of 40 ⁇ 1 1M Tris—HC1, pH 9.0. Dialysis was carried out against 100 volumes of PBS using a M. W. 3500 dialysis cup (Bio-Tech Cat. No. 2 12932) for 2.5 hours twice and then for 15 to 18 hours.
  • the antibody-producing strains used were CHO cells hzl791-! V10, hzl791-ffi34, hzl791-sf43 and hzl791-ss32, which under the Budapest Treaty from March 1, 2006, Japan 1-chome Tsukuba 1-chome, Ibaraki Prefecture 1 Central 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, FERM ABP-10543, FERM ABP-1054 4, FERM ABP-10545 and FERM ABP— Deposited with a receipt number of 10546.
  • amino acid sequences (SEQ ID NOs: 17 to 24) of the H chain V region and L chain V region of the human baboon anti-CD20 monoclonal antibody obtained from these cell lines are as follows (the mouse corresponding to the underlined portion): Different from antibodies).
  • H chain V region sequence (SEQ ID NO: 24) WMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RT NYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
  • sdr 1791 STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLEIK
  • FIGS. 7a to 7d the results of apoptosis experiments using 8 types of mouse antibodies are shown in FIGS. 7a to 7d. 4 types In all cells, 8 types of mouse antibodies and the known CD20 antibodies 2B8 and 2H7 could be divided into 2 types (with some exceptions).
  • anti-CD20 antibody alone showed sufficient apoptosis-inducing ability, but the apoptosis-inducing ability of group A and anti-CD20 antibody alone, which is almost the same even under cross-linking conditions with secondary antibodies, is not sufficiently shown.
  • Is Group B which increases significantly under cross-link conditions.
  • the antibodies included in Group A have the same affinity as 2B8, and the antibodies included in Group B include those having higher affinity than 2B8.
  • Group A which does not require the presence of a secondary antibody to induce apoptosis and can induce apoptosis alone, is more convenient as a medicine.
  • an anti-CD20 monoclonal antibody having a high binding affinity for a natural human CD20 molecule and exhibiting a biological activity suitable as a pharmaceutical can be provided.
  • SEQ ID NO: 17 L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
  • SEQ ID NO: 18 L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
  • SEQ ID NO: 19 L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
  • SEQ ID NO: 20 L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
  • SEQ ID NO: 21 H chain V region sequence or humanized antibody abb 1791
  • SEQ ID NO: 22 H chain V region sequence or humanized antibody fra 1791
  • SEQ ID NO: 23 H chain V region sequence or humanized antibody sdr 1791
  • SEQ ID NO: 24 H chain V region sequence or humanized antibody Ven 1791 SEQ ID NO: 25: primer SEQ ID NO: 26: primer

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Abstract

　ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するモノクローナル抗体、及びこれをキメラ化又はヒト化したモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、医薬として好適な生物学的活性を示す。

Description

抗 CD20モノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、抗 CD20モノクローナル抗体に関する。
背景技術
[0002] CD20はヒト Bリンパ細胞表面に発現して 、る糖鎖不含タンパク質で、末梢血、脾臓 、扁桃、骨髄中の正常 B細胞に加えて、多くの悪性腫瘍 B細胞に発現している。 CD2 0のモノクローナル抗体が結合するェピトープは多様性が非常に高ぐ多様な生物学 的応答が報告され、また、 CD20を認識するモノクローナル抗体が多数報告されてい る。とりわけ、リツキシマブ (rituximab)は、ヒト B細胞である SB細胞株を免疫して得ら れるマウス抗体 2B8から由来するキメラマウス Zヒトモノクローナル抗体（C2B8)であ り（特許文献 1および 2参照）、登録商標リツキサン (Rituxan)の名称で低悪性度非ホ ジキンリンパ腫 (NHL)の治療薬として実用化されている。さらにその後、リツキサン は B細胞が関与する多くの免疫疾患に対して有効であること、例えば、慢性リンパ性 白血病 (CLL)などの悪性腫瘍、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫 斑病 (ITP)などの病原性自己抗体が関与して 、る自己免疫疾患、慢性関節リウマチ (RA)や多発性硬化症 (MS)のような炎症性疾患に対して有効であることが報告され ている (非特許文献 1〜4参照)。
リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞障害 (CDC)によりリンパ系 B細 胞系を溶解することが報告されており（非特許文献 5参照）、抗体依存性細胞障害 (A DCC)のアツセィでは活性を示し、トリチウム化チミジン導入アツセィでは抗増殖効果 と、アポトーシス誘発が報告されている（非特許文献 6参照)。
一方、異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれ ないが、リツキシマブを含め、抗 CD20抗体は正常細胞を含む全ての B細胞を標的し 除去する性質を有するため抗原性はないと考えられた。しかし、数パーセントではあ るが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されていること、投与する量や期 間によつてはさらにその可能性が高まることや、治療対象疾患が B細胞リンパ腫から 、 RA、 IT、 MSに拡大していくなかで抗原性の問題がクローズアップされ、最近、より ヒトに近 、配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体が要望されるようになって!/、る。 さらに、キメラ抗体は、血中半減期が比較的短い問題を有し、リツキシマブを含めマ ウス Zヒトのキメラ抗体のベータ半減期 ( β 1/2)は 3〜4日に過ぎず、リツキシマブの 低悪性度 NHLに対する臨床試験の奏効率は 50%弱であったことが報告されている (非特許文献 7参照)。また、リツキシマブの CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）は 5. 2nMであり、結合親和性があまり高くなぐ NHL治療において投与量が多くなる 問題もある (非特許文献 8参照)。
特許文献 1：国際公開第 94Z11026号パンフレット
特許文献 2 :米国特許第 5736137号明細書
非特許文献 l : Coiffier B et al.， Blood 1998; 92: 1297-32
非特許文献 2 : Edward JC et al.， Rheumatology (Oxford) 2001 ; 40:205-11 非特許文献 3 : Zaja F et al , Heamatologica 2002; 87: 189-95
非特許文献 4 : Perrotta S et al. , Br J Haematol 2002; 116:465-7
非特許文献 5 : Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
非特許文献 6 : Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
非特許文献 7 : IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998 非特許文献 8 : Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上記のような事情に鑑み、本発明は、医薬としてさらに適した生物学的活性を示す 抗 CD20モノクローナル抗体を提供することを主な目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者らは、上記目的を達成するため、自然の状態のヒト CD20分子に対する結 合親和性の高 ヽモノクローナル抗体を作製し、優れた機能を有する抗 CD20モノクロ ーナル抗体を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、免疫原として CD20抗原が高 密度とされる B細胞株である SB細胞や Raji細胞と、遺伝子組換により細胞膜上に CD 20を多量に発現させた非ヒト動物細胞を組み合わせて用いることにより、高親和性の モノクローナル抗体であって、優れた生物学活性を示すものが得られることを見出し 、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換さ れた非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20 抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する抗 CD20モノクローナル抗体、
(2)ヒト CD20抗原を有する細胞の in vitro培養に対して末梢血単核細胞非存在下 で増殖阻害活性を有する上記（1)記載の抗 CD20モノクローナル抗体、
(3)増殖阻害活性がアポトーシス誘導である上記（2)記載のモノクローナル抗体、
(4) Raji細胞 (浮遊細胞）に対する解離定数 (Kd値）が 2B8の 1Z2以下である上記 (1)記載の抗 CD20モノクローナル抗体、
(5) L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 1 及び 9、配列番号 2及び 10、又は配列番号 3及び 11であるマウス由来の上記 (4)記 載の抗 CD20モノクローナル抗体、
(6)上記（5)記載のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列とヒトイム ノグロブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体、
(7)上記（5)記載のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸配列と ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗体、
(8)配列番号 1、 2又は 3のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列を キメラ化した L鎖と配列番号 9、 10又は 11のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせた上記（6)記載のキメラ抗 CD20モノク ローナル抗体、
(9)配列番号 1、 2又は 3のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸 配列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 9、 10又は 11のマウス由来モノクローナル抗体可変 領域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせた上記（7)記載のヒト化抗 CD20モノク ローナル抗体、
(10) Raji細胞 (浮遊細胞）に対する解離定数 (Kd値）が 2B8の 1Z8以下である請 求項 1記載のマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒトイ匕した抗 CD20モノ クローナル抗体、
(11) L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 4 及び 12、配列番号 5及び 13、配列番号 6及び 14、配列番号 7及び 15、又は、配列 番号 8及び 16である上記（10)記載の抗 CD20モノクローナル抗体、
( 12)配列番号 4〜8の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸 配列をキメラ化した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクローナル 抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせた上記（10)記載のキメ ラ抗 CD20モノクローナル抗体、
( 13)配列番号 4〜8の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRの アミノ酸配列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクロ一 ナル抗体可変領域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせた上記（10)記載のヒト 化抗 CD20モノクローナル抗体、
(14) CHO細胞 hzl791- 1V10 (FERM ABP— 10543)、 hzl791- ff34 (FERM A BP— 10544)、 hzl791-sf43 (FERM ABP— 10545)または hzl791-ss32 (FERM
ABP— 10546)が産生する上記（7)記載のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(15)配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖、配列番号 18の L鎖と配列番号 22の H鎖、配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖または配列番号 19の L鎖と配列番号 23の H鎖を組み合わせた上記（14)項記載のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(16)アポトーシスの誘導に 2次抗体を必要としな 、上記（3)、 (6)又は（7)記載の 抗 CD20モノクローナル抗体、
及び
(17)上記（6)、（7)、（10)、（14)又は（16)記載の抗 CD20モノクローナル抗体を 有効成分としてなる B細胞関連疾患治療剤を提供するものである。
発明の効果
本発明のモノクローナル抗体は、 CD20抗原の細胞外ェピトープに対して強い結 合親和性を示し、かつ細胞増殖阻害活性等の生物学的活性を有し、医薬として好適 である。さらにそのモノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化することにより B細胞が関 与する疾患の治療剤が提供できる。 図面の簡単な説明
[図 1]組換抗体発現用ベクター pNOW-Abの構造を示す制限地図である
[図 2]タンパク発現用ベクター pNOWの構造を示す制限地図である。
[図 3a]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 3b]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 3c]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 3d]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 4a]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4b]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4c]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4d]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5a]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5b]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5c]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5d]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 6a]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6b]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6c]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6d]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 7a]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7b]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7c]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7d]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8a]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8b]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8c]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8d]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 9a]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである ( [図 9b]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
[図 9c]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
[図 9d]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
符号の説明
[0008] Pcmv:サイトメガロウィルスプロモーター
PAbgh:ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付加シグナル
Psvd:ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター
DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA
PAsv:シミアンウィルス 40ポリ A付カ卩シグナル
PBR322ori:大腸菌中での複製起点
Amp： 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor: 哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）
INrbg:ゥサギ 13グロビンイントロン
SP1:抗体軽鎖シグナルペプチド
VL:抗体軽鎖可変領域 cDNA
C κ 抗体 κ軽鎖定常領域 cDNA
SPh:抗体軽鎖シグナルペプチド
Vh:抗体軽鎖可変領域 cDNA
C γ 1:抗体 γ 1重鎖定常領域 cDNA
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本明細書において、「抗体」には、抗体全体のみならず、抗体全体と同等の、抗原 に対する結合親和性を示すフラグメント、例えば、元の抗体全体の可変領域を含む フラグメント (例、 Fab、 F(ab')など)も包含する。
2
本発明のモノクレーナル抗体は、ヒト CD20抗原に対し高い親和性を有し、かつ、 優れた生物学的活性を示すモノクローナル抗体であり、マウス由来のモノクローナル 抗体、そのキメラ化、ヒト化抗体を包含する。
その好ましい第 1の態様は、ヒト CD20抗原を有する細胞に対して増殖阻害活性を 有し、 Raji細胞 (浮遊細胞）に対する解離定数 (Kd値）が、リツキシマブの由来するマ ウス抗体である 2B8の 1Z2以下の、好ましくは 1. 70〜3. 39nMの、ヒト CD20抗原 に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体である。
解離定数 (Kd値)の測定方法は、浮遊細胞に対して測定できる方法であれば特に 限定するものではないが、本明細書においては、後の実施例に記載する方法による 解離定数とする。
[0010] ヒト CD20抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性は 2B8よりも大き 、ことが好ま しい。増殖阻害活性は、好ましくは、末梢血単核細胞非存在下でのヒト CD20抗原を 有する細胞の in vitro培養に対する増殖阻害活性であり、さらに好ましくは、増殖阻害 活性はアポトーシス誘導によるものである。
上記の増殖阻害活性の測定は、例えば、 Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS.Avian D is. 2002 Jan- Mar;46(l):10- 6に記載の方法により測定できる。
[0011] 本発明の第 1の態様のモノクローナル抗体の具体的な例としては、 L鎖可変領域ァ ミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 1及び 9、配列番号 2及 び 10、又は、配列番号 3及び 11であるマウスを由来とするモノクローナル抗体と、そ れらの抗体をキメラ化又はヒト化したものが挙げられる。
キメラ化は、例えば、 Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-44 4に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領 域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行う ことができる。
ヒト化は、例えば、上記 Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439- 444や、 Eduardo A.Padlan, Molecular Immunology, Vol. 28—4/5, pp489— 498, 1991； Eduardo A.Padlan et.al, The FASEB Journal,vol.9, ppl33- 139;および Tai te Wu, El vin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol.29- 9, ppl 141- 1146, 1992に記載されるよ うな公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域 CDRアミノ酸配 列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いて行うことができる。
キメラ化又はヒト化を行う場合には、複数のマウスモノクローナル抗体の L鎖可変領 域のアミノ酸配列と、 H鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例 えば、配列番号 1〜3のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸 配列をキメラ化した L鎖と配列番号 9〜 11のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体、 配列番号 1〜3のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのァミノ 酸配列をヒトイヒした L鎖と配列番号 9〜 11の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗 体可変領域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせたヒト化抗 CD20モノクローナル 抗体が挙げられる。
本発明の好ま 、第 2の態様の抗体は、 Raji細胞の浮遊細胞に対する解離定数 (K d値）が 2B8の 1Z8以下であるマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒトイ匕 したモノクローナル抗体である。
ヒト CD20抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒト IgGl又は IgG3、又は それらを改変したヒト Fc配列を有する抗体 (マウス由来モノクローナル抗体をキメラィ匕 又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上の CD20に結合した場合、 NK細胞上の F c γ RIII (CD 16)を介したエフェクター細胞の活性ィ匕を誘発し、抗体依存性細胞性細 胞傷害 (ADCC)を起こすことがよく知られている。また、ヒト CD20抗原に対し高い親 和性を有する抗体で、特にヒ HgG又は IgM、又はそれらを改変したヒト Fc配列を有 する抗体 (マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細 胞表面上の CD20に結合した場合、補体の活性化を誘発し、補体依存性細胞傷害（ CDC)を起こすこともよく知られて！/、る。
力べして、本発明の第 2の態様の抗体は、増殖阻害活性が低いか又は認められず、 ADCC又は CDCを示すことが期待できる。
第 2の態様の抗体の具体的な例としては、 L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領 域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 4及び 12、配列番号 5及び 13、配列番号 6及び 14、配列番号 7及び 15、又は、配列番号 8及び 16であるものが挙げられる。
キメラ化又はヒト化は、第 1の態様の抗体と同様に行うことができ、その場合、複数の マウスモノクローナル抗体の L鎖可変領域のアミノ酸配列と、 H鎖可変領域のアミノ酸 配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号 4〜8のいずれかのマウス由来 モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化した L鎖と配列番号 12〜16のい ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を 組み合わせたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体、配列番号 4〜8の!、ずれかのマウ ス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸配列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDR配列をヒト化し た H鎖を組み合わせたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体が挙げられる。
[0013] 本発明の好ましい第 3の態様の抗体は、リツキシマブが効果を示さない細胞に対し ても有効なヒト化したモノクローナル抗体を包含する、 2B8に対する特定の解離定数 に限定されな 、一群のヒト化抗体である。
これらの抗体の例としては、配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖、配列番号 18 の L鎖と配列番号 22の H鎖、配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖または配列番 号 19の L鎖と配列番号 23の H鎖を組み合わせたヒト化 CD20モノクローナル抗体が 挙げられる。
[0014] 本発明のマウス由来モノクローナル抗体又は本発明の抗体の作製に使用できるマ ウス由来モノクローナル抗体は、例えば、つぎのような方法によるスクリーニングで得 られたノヽイブリドーマのクローンから目的の性質を有するモノクローナル抗体を産生 するクローンを選択すること〖こより得ることができる。
感作抗原 (免疫原）として、例えば、 CD20を発現している細胞である SB細胞又は R aji細胞と、例えば、遺伝子組換えにより商業的に入手可能な CD20の DNA (又は、 同等の効果を有するそのフラグメント等)で形質転換して細胞表面上に CD20を発現 させた CHO細胞 (CHOZCD20)を用いる。そして、初回免疫、追加免疫、及び、最 終免疫を行う際に、初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原と して、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を 用いる免疫、及び、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞 膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞 株を用いる免疫の 、ずれか一方であり、最終免疫が他方であるようにする。
この他の条件は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの作製法と 同様でよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に従って 、（1)被免疫動物の免疫、（2)免疫された動物からのリンパ球の調製、（3)親細胞の 調製、（4)リンパ球と親細胞の細胞融合、（5)スクリーニング及びクローユングによつ て作製される（例えば、 Ailsa M. Campbell (著)、大沢利昭（訳） 生化学実験法 モノ クローナル抗体、東京化学同人、 1989年参照)。
得られたクローンを用いてハイプリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方 法は、本発明のノ、イブリドーマ作製法で作製されたハイブリドーマを用いることの他 は、通常の、モノクローナル抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、 細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などが挙げられる。また、キメ ラ化又はヒト化抗体を作製する場合には、キメラ化又はヒト化抗体をコードする遺伝子 を作製し、それを発現ベクターに組み込み、発現ベクターを適当な細胞で発現させ ること〖こより作製することができる。
[0015] 例えば、 L鎖および H鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリン L鎖および H鎖（ κ )定常域遺伝子とでキメラ化し、 CHO細胞用高発現ベクターに組み込む。組換抗 体生産用のベクターシステムは市販されているものでよいが、哺乳動物細胞高発現 ベクター pNOW (特許第 3582965号公報）を基に、 L鎖、 H鎖両方のマルチクロー- ングサイト（MCS)を有するダイマー用高発現ベクター pNOW-abに構築したものを使 用できる。各ベクターの構成を示す制限地図を図 1および図 2に示す。キメラ抗体遺 伝子が組み込まれた発現ベクターを CHO細胞にトランスフエタトし、それぞれ生産性 の高 、クローンを選別する。そのクローン力も通常の方法で抗体を作製する。
[0016] 本発明の第 1の態様の抗体は、結合親和性がリツキシマブに比べて相対的に高く かつ増殖阻害活性、好ましくはアポトーシス誘導による活性が高いので、キメラ化又 はヒト化した抗体は B細胞悪性腫瘍及び B細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤 の有効成分として使用できる。また、本発明の第 2、第 3の態様の抗体は、ヒト CD20 抗原を有する細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害 (ADCC)又は補体依存性 細胞傷害 (CDC)を示すと考えられるので、 B細胞悪性腫瘍及び B細胞が関与する 免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、これ らキメラ化又はヒト化した抗体を有効成分とする B細胞関連疾患に対する治療剤も提 供する。
また、本発明の抗体には、アポトーシス誘導に 2次抗体によるクロスリンクが必要な 抗体と必要としな 、抗体があり、単体でアポトーシス誘導が可能な抗体は 2次抗体を 必要としないので、医薬用に好都合である。
さらに、本発明においては、本発明の抗体を 2種以上併用してもよい。
B細胞関連疾患としては、以下に限定するものではないが、例えば、非ホジキンリン パ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、関節リウマチ、自己免疫溶血性貧 血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候 群、シエーダレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症などが挙げられる。 該治療剤は、公知の製剤技術に従って製造でき、他の配合成分は特に限定するも のではなぐ公知のリツキサンを参考にして、投与量等も決定することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
[0017] (1)マウス感作用免疫原の準備
CD20を発現して!/、る B細胞株である SB細胞と Raji細胞を in vitroで培養した。 ま 7こ、另I途、 Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Ta ft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から入手した CD20の全分子をコードする DNAを、特異的なプライマー hCD20- S- GK- Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaa attc (配列番号 25)、及び hCD20- E- Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc (配列番号 2 6)を用いてクローユングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターである pNOW (図 1)に組み込み、構築されたベクターを CHO細胞にトランスフエタトした。 FACS分析 により、細胞表面に CD20分子を高発現している組換 CHO細胞（CD20ZCHO細 胞）を榭立した。ここにおいて、 FITC標識抗 CD20モノクローナル抗体で染色した際 に、 SB細胞に比べて蛍光強度が 5倍以上のものを高発現しているものとした。
[0018] (2)免疫原の調製
SB細胞または Raji細胞は 10%FCS添加 RPMI 1640培地を用 Vヽて培養を行つた。 CD20ZCHO細胞は、 G418を 800 /z gZml添カ卩した CHO— S— SFM II培地（G IBCO、 Cat. No. 12052- 098)を用いて培養を行った。これらの培養液を l lOOrpmで 、 5分遠心分離した後、細胞に Dulbecco's PBS (-)を加えて懸濁させ再度遠心分離し た。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（ 細胞数： l〜3 X 107Zml)を免疫に用いた。
[0019] (3)免疫
7〜11週令の Balb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した 。 SB細胞又は CD20ZCHO細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔 で 2〜3回繰り返して投与した後、最終免疫には異なった細胞 (CD20ZCHO細胞 又は Raji細胞）を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス 1匹当たり 1〜3 X 107 個であった。
使用した免疫原の組み合わせを表 1に示す。
[0020] (4)細胞融合
最終免疫の 3日後、 2匹のマウスから脾臓細胞を調製し、 Oi.V.T. and L.A. Herzenb erg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. isnell and S.M. Sni igi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351に従って、マウスミエローマ（NS— 1) との融合反応を PEG— 1500の存在下で行なった。
[0021] (5) 1次、 2次スクリーニング
CD20ZCHO細胞または CHO細胞 (親株）を付着させた 96ゥエルプレートを用い て Cell ELISAを行い、 CD20に特異的に反応する抗体を産生しているゥエルを選択 した。さらに、同じ CD20ZCHO細胞を付着させた 96ゥエルプレートを用い、リツキ シマブ (C2B8)との競合反応を行って、 C2B8のェピトープと類似したところに反応 する抗体 (ゥエル)を選択した。
表 1にスクリ一ユング結果を示す。
[0022] (6) Cell ELISA
Poly- L- Lysineコート 96ゥエルプレート（旭テクノグラス、 Cat.No.ll- 023- 018)に付 着させた CD20ZCHO細胞または CHO細胞 (親株）を Cell ELISAに用いた。その各 ゥエルにブロッキング液（0. 2%—ゼラチン、 0. 5%BSAの PBS溶液）を 150 1入 れて 37°Cで 1時間静置した。 150mM—NaCl、 0. 05%—Tween20水溶液を用い てプレートを 5回洗浄した後、サンプル (培養上清の希釈液）を各ゥエルに 100 1入 れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マ ウス IgG (H + L)ゥサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315- 035- 003)、または HRP標 識抗マウス IgG (Fc y )ゥサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315- 035- 008)〕を各ゥェ ルに 100 /z l入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった。 1次、 2次の反応液の調製に は、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液 (OPD)を各ゥエルに 100 1 入れ 30分後に 4N— H SOを 50 1カ卩えて反応を停止し、 492nmの吸光度を測定
2 4
した。
[0023] (7) Cell ELISAでの競合反応
サンプル (培養上清の希釈液)とキメラ抗体（ 10〜40ngZml)の混合溶液を調製し た。
上記の Cell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ゥエル に 100 /z l入れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔H RP標識抗ヒト IgG (H+L)ゥサギ抗体 (Jackson Lab. Code No. 309- 035- 082)〕を各 ゥエルに lOOul入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、発色液 (OPD)を 各ゥエルに 100 1入れ 30分後に 4N—H SOを 50 1カ卩えて反応を停止し、 492η
2 4
mの吸光度を測定した。
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、 1次反応で添加したサンプル中の抗 体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
[0024] (8)クローニング
限界希釈法で行った。細胞を 96ゥエルプレートに撒いて培養後、 1コロニーのゥェ ルの培養上清について Cell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
[0025] (9)精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを 10%FCS添加 RPMI1640培地で培養し、細胞密度が 5 X 105Zml前後になった時点で無血清培地 ASF— 104N (味の素）に培地を交換 して培養を行った。その 2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと 、プロテイン Gカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を 150 mM— NaClに対して透析した。 0. 2 mのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗 体 (抗ヒト CD20マウスモノクローナル抗体）とした。
[0026] [表 1]
Figure imgf000015_0001
選択ゥエル数— A： CD 20/CHO細胞に反応し. CHO細胞には反応しない钪体を産生したゥ工ル
選択ゥエル数一 B：選択ゥエル数一 Aのうち、 対照抗体 との競合反 Kが認められる抗体を産生したゥエル 代表的な 8クローンの産生するモノクローナル抗体にっレ、て、 L鎖 V領域のアミノ酸 配列（配列番号 1〜8)及び H鎖 V領域のアミノ酸配列 (配列番号 9〜16)は以下のと おりである。
1K0924の H鎖 V領域配列（配列番号 11)
Figure imgf000015_0002
GQGTTLTVSS
1K1228の H鎖 V領域配列（配列番号 16)
Figure imgf000015_0003
GQGTSVTVSS
lkl422の H鎖 V領域配列（配列番号 9) MDYWGQGTSVTVSL
lkl791の H鎖 V領域配列（配列番号 10)
Figure imgf000016_0001
AMDYWGQGTSVTVSS
lkl712の H鎖 V領域配列（配列番号 12)
Figure imgf000016_0002
DYWGQGTTLTVSS
lkl402の H鎖 V領域配列（配列番号 13)
Figure imgf000016_0003
MDYWGQGTSVTVSS
lkl736の H鎖 V領域配列（配列番号 14)
Figure imgf000016_0004
LDYWGQGTSVTVSS
lkl782の H鎖 V領域配列（配列番号 15)
Figure imgf000016_0005
GTTVTVSS
1K0924の L鎖 V領域配列（配列番号 3)
1K1228の L鎖 V領域配列（配列番号 8) lkl422の L鎖 V領域配列（配列番号 1)
Figure imgf000017_0001
lkl791の L鎖 V領域配列（配列番号 2)
Figure imgf000017_0002
lkl712の L鎖 V領域配列（配列番号 4)
Figure imgf000017_0003
lkl402の L鎖 V領域配列（配列番号 5)
Figure imgf000017_0004
lkl736の L鎖 V領域配列（配列番号 6)
Figure imgf000017_0005
lkl782の L鎖 V領域配列（配列番号 7)
DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQN SRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK
実施例 2
得られたクローンの一部に関し、モノクローナル抗体遺伝子の可変領域について塩 基配列の決定を行うとともに、それらが産生するモノクローナルについて抗体結合親 和性の測定及び生物学的特性試験を以下のとおり行った。
(1)結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現して!/ヽるヒト B細胞株由来の浮遊細胞 Raji及び、 CD20抗原を発現して!/、な!/、細胞としてヒト T細胞株由来の浮遊細胞 Jurkatを用いた 。共に RPMI1640 (ナカライ、 Cat.No.30264- 85、 Lot L4K2844)に 10%ゥシ胎仔血 清 FCS(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04- 001- 1Aゝ Lot 815242、補体成分を非働化す るためあらかじめ 56°C30分加温したもの）を添カ卩した培地で 37°CCO濃度 5%の C
2
Oインキュベーター（SANYO MCO-175M)で培養、週 2回の継代により維持した。
2
細胞数の測定は、 Burker-Turk血球計算盤 (ヱルマ販売 (株) Cat.No.03-303-1)を用 いて行った。
継代後 3〜4日目のコンフルェントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機 LX— 120 (TOMY)で室温、 3000rpmで 3分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用 いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条 件である。細胞の表面に残った培地及び FCSを除くため（洗浄）、回収した細胞を Dul becco's Phosphate Buffered Saline (-)〔Caゝ Mgフリー、 PBS (-)、（NaCl:Wako、 Cat.N 0.191—01665、 Na HPO： Wako、 Cat.No.197—02865、 Lot ASF2635、 KCl:Wako、 Cat.
2 4
No.163— 0334T、 Lot CEQ7122、 KH PO： Wako、 Cat.No.169—0425、 Lot ELG7616) ]
2 4
で懸濁後、 3000rpmで 3分間遠心して上清を除く操作を 2回行った。洗浄を終えた 細胞を 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)— PBS溶液で懸濁し、細 胞密度を 5xl06個/ mlに調整した。
1次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体（2B8) 15、 30、 50、 75、 100 、 125、 150、 200ng (l. 5〜5 1)を各々、 1. 5mlチューブ（ビーェム機器、 BMリン グロックチューブ Cat.No.BM-15)に分注し、同時に抗体を入れないチューブも 4本用 意した。また、各々の試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。そこに、 1%BSA( Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)— PBS溶液で懸濁液を 100 1 (細胞数 5x 105個）ずつ加えて混和し、室温で 1時間振とう反応させた。
反応後、微量高速冷却遠心機 MX— 100 (T0MY)で室温、 3000rpm3分間遠心 分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため 200 1 の PBSで懸濁し、 3000rpmで 3分間遠心し上清を除く操作を 2回行った。
次に、細胞と結合した 1次抗体に対して過剰量（500ng)の FITC標識抗マウス IgG (H&L) 2次饥体 LGOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated, affinity pu rifled Secondary antibody, Chemiconゝ Cat.No.AP124Fゝ Lot 24021014〕および 1%B SA-PBS^¾100 μ 1 (500ng/100 μ 1) ' 遮光、室温のもと 1時間 振とう反応させて細胞に結合した 1次抗体を検出した。反応後、 3000rpmで 3分間 遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の FITC標識抗マウス IgG (H& L)抗体を除くため、 200 1の PBSで懸濁し、 3000rpmで 3分間遠心し上清を除く操 作を 2回行った。
こうして得た細胞を 100 μ 1PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレート（住友ベークライト ELISA PLATE Cat.No.8496F)へ移した。 2次抗体の蛍光量を Typhoon9210イメージ ナフィサ ~~ (Amersnam Bioscience) 用 ヽて、 Fluorescense mode, 600V ^ 526SP/g reen(532nm)、 Focus :底面 + 3mmの検出条件で測定した。この際、 FITC標識 2次抗 体を 0、 12. 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150ng添加した PBS溶液 100 /z 1を検量線 作成用のコントロールとして用いた。
[0030] 検出後、画像を画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数 値化を行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、 PBS溶液、お よび細胞に非特異的に結合した FITC標識 2次抗体に由来するバックグラウンド値と して、細胞と FITC標識 2次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その 4点の 平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合した FIT C標識 2次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度の FITC標 識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合して 、る 2次 抗体の量 (モル数または重量)を求めた。各 1次抗体と FITC標識 2次抗体が 1： 2の 割合で反応していると仮定し、結合している 1次抗体量を算出した。また遊離の 1次 抗体量は添加量力も結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する 際、モノクローナル抗体の分子量を 150000とした。
[0031] 添加する 1次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達する ことを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数 (Kd値)を算出するため、 スキャッチヤード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生 物学研究のための新培養細胞実験法;羊土社、実験医学別冊バイオマニュアル UP シリーズ改訂第 2版、 212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて 3点の値の平均値を用いた。
代表的な 8クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール抗体（2B8) の測定結果を後の表 3に示す。 [0032] (2)生物学的特性試験
(a)アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining)を用いて試験抗体のアポトーシス誘導 能を測定した。陽性コントロール（2B8)、陰性コントロール [Anti-CD3モノクローナル 抗体 (BD PharMingen社)]を用いた。試験は MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No. 4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、 10%FBS (非動化済）（ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含 む新鮮な培地 RPMI1640(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、 12ゥェ ルプレートの各ゥエルに 5xl05細胞 Zmlの密度で lmlを入れた。各抗体あたり 12ゥ エルを用い、各抗体を終濃度 2 gZml又は 4 gZmlになるよう添加した（3ゥエル X 2種濃度 X 2時点、計 12ゥエル)。培養開始 1日後及び 2日後に、 2xl05個程度分 の細胞を含む培養液を回収し、遠心後 PBSで 1回洗浄した。次に 85 μ 1 Binding buf ferをカ卩ぇ懸濁した。さらに、 Annexin V- FITC10 μ 1と ΡΙ5 μ 1をカ卩えてよく混和した後 、遮光、室温で 15分間反応させた。フローサイトメトリー (FACS Calibur, Becton Dicki nson)を用いて測定し、 CellQuest (Becton Dickinson)で解析を行った。
代表的な 6クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール（2B8)、陰性 コントロール (Anti- CD3)の測定結果を図 3a〜図 3dに示した。一般に 2B8のアポトー シスの誘導能は高いとされる力 1K17シリーズ（CD20ZCHOと Raji細胞で免疫）の 細胞融合から得られたクローン lkl791、および 1K14シリーズ（SB細胞と CD20Z CHOで免疫）の細胞融合力も得られたクローン lkl422の産生するモノクローナル 抗体は 2B8との比較にぉ 、て高 、アポトーシス誘導がみられた。
[0033] (b)細胞増殖阻害試験
5 X 104個/ mlの Raji細胞懸濁液を 10%FCS添加 RPMI1640培地で調製して 96 ゥエルプレートに 100 1Zゥエルずつ入れて培養した。 24時間後、抗体濃度が 1 gZmlになるように各抗体溶液を 50 1Zゥエル添加して培養を継続した。抗体添加 72時間後に発色色素 Cell Counting Kit- 8(同仁化学 Cat.No.343- 07623, Lot. SG0 76)を 10 1Zゥェルカ卩ぇ、さらに 4時間培養した後で波長 492nmにおける吸光度を 測定した。 上記 6クローンのモノクローナル抗体と陽性コントロール（2B8)、および陰性コント口 一ルの吸光度の測定結果を表 2に、また、それらの特性を表 3に示す。
細胞増殖阻害試験
[表 2]
Figure imgf000021_0001
[0035] モノクローナル抗体の特性
[表 3]
Figure imgf000021_0002
[0036] (c)抗体依存性細胞性細胞傷害 (ADCC)
この実験では抗 CD20キメラ抗体の Fc部位を介してエフェクター細胞が活性ィ匕し、 それに伴ってリンパ腫細胞系を溶解する能力につ 、て測定を行った。
ヒト B細胞由来の Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4、 RC—K8の 4種類の細胞を非 働化処理した 10%FCS添加 RPMI1640に培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては、各々の細胞を 10%FCS含 RPMI1640で洗浄し、 37°C中で 15 分間の反応により力ルセインを生細胞に取り込ませた後、細胞数を 4 X 105個 Zmlに 調整した。力ルセインは細胞膜が正常に保たれて 、る細胞にのみ維持されるので生 細胞のみを染色することができる。また抗 CD20キメラ抗体であるリツキシマブ (C2B 8)と 6種類のキメラ抗体（lk0924、 lkl402、 lkl422、 lkl712、 lkl736、 lkl7 91)を 10%FCS含 RPMI1640で 20 μ g/ml、 4 μ g/ml、 0. 8 g/mlに調整し た。エフェクター細胞は健常者より採血し、直ちに Ficollに重層して遠心しリンパ球画 分を採取した後、 5 X 106個/ ml、 1 X 106個/ ml、 0. 2 X 106個/ mlに調整した。 濃度調整をした細胞 25 μ 1、各抗 CD20キメラ抗体溶液 25 1 (それぞれ終濃度が 5 μ g/m 1 μ gZml、 0. 2 μ g/ml)、各抗体濃度にお!、てエフェクター細胞 50 1 (それぞれ E :T比が 25 : 1、 5 : 1、 1 : 1)、計 100 1を 96穴プレート内で混合し、 3 7°C、 CO濃度 5%のインキュベーター内で 4時間反応させた。また、自然な細胞の
2
溶解を算出するために抗体溶液およびエフェクター細胞を 10%FCS含 RPMI1640 で置き換えたサンプル、抗体に依存しな 、エフェクター細胞のみの活性を算出する サンプルとして抗体溶液を 10%FCS含 RPMI1640で置き換えたサンプル、最大溶 解を算出するサンプルとして抗体溶液を 20%TritonX— 100で置き換えたサンプル を用意した。
反応後、溶解した細胞は細胞膜が壊れて力ルセインが細胞外に出るため、 Quench erを用いて反応溶液中に遊離した力ルセインの蛍光を消失させた後、蛍光アナライ ザ一により蛍光量を測定した。
検出後、画像解析ソフト (Amersham Bioscience)を使用し、数値化を行った後、以 下の式を用いて各サンプルの溶解率を算出した。
[数 1]
溶解率 〔％〕 = ( (自然溶解） （サンプル）） / { (自然溶解） （最大溶解）） X I 0 0
NK細胞などのエフェクター細胞数とターゲットとなる細胞数の割合（E :T比）が 25： 1のときの各細胞における抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図 4a〜図 4dに示す。ま た、抗体濃度が 5 gZmlのときの各細胞における E :T比と細胞傷害活性の関係図 5a〜図 5dに示す。
図 4a〜図 4dに示すごとぐ E :T比が 25 : 1の条件ではどの細胞でも抗体を加えるこ とにより細胞傷害活性を示している。つまり抗体が細胞傷害に関与している。また、 W iL2— NS以外の細胞株では 0. 2 μ gZmlの抗体濃度で既に 1 μ g/mU 5 μ g/ml と同程度の活性を示し (0. 2 μ gZmlで飽和して ヽる）、活性は最大値まで達してフ ラットとなっており、補体依存性細胞傷害活性に必要とされる抗体量よりも少ない抗 体量で作用することを示唆して ヽる。
図 5a〜図 5dに示すごとぐ抗体濃度が 5 gZmlのときの細胞傷害活性の E :T比 による影響を見ると、細胞傷害活性が E :T比濃度に依存して上昇しているのがわか る。このことからエフェクター細胞が作用して細胞傷害が起こっていると判断される。
(d)補体依存性細胞傷害 (CDC)
この実験では抗 CD20キメラ抗体が補体を含む血清の存在下でリンパ腫細胞系を 溶解する能力につ!、て測定を行った。
ヒト B細胞由来の Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4、 RC—K8の 4種類の細胞を非 働化処理した 10%FCS添加 RPMI1640に培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては各々の細胞を 10%FCS含 RPMI1640で洗浄し細胞数を 2〜3 X 106個 Zmlに調整した。また、抗 CD20キメラ抗体である C2B8 (リツキシマブ）と 6種 類のキメラ抗体（lk0924、 lkl402、 lkl422、 lkl712、 lkl736、 lkl791)を 10 %FCS含 RPMI1640で 20 μ g/ml, 4 μ g/ml, 0. 8 gZmlに調整した。
濃度調整をした細胞 55 μ 1、各抗 CD20キメラ抗体溶液 25 1 (それぞれ終濃度が 5 μ g/m 1 μ g/ 0. 2 μ g/ml)、 5人の健常者より採取したプール血清又は それを非働化したもの 20 1、計 100 1をボルテックスミキサーにより混合し、 37°C、 CO濃度 5%のインキュベーター内で 2時間反応させた。バックグラウンドの算出サン
2
プルとしては抗体溶液 25 μ 1を 10%FCS含 RPMI1640培地 25 μ 1に置き換えたも のを用意した。
反応後、 ΡΙ (ヨウ化プロビジゥム）溶液で死細胞を染色し、 FACS (Becton Dickinson )により解析を行った。数値は死細胞のポピュレーションをそのまま採用し、ノックグラ ゥンド及び非働化血清を加えたサンプルの値を差し引 ヽてある。
各細胞においての抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図 6a〜図 6dに示す。
図 6a〜図 6dに示すごとぐ Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4では 6種類全ての抗体 が活性を示している。また、濃度依存性も確認できる力 5 /z gZmlの濃度で比較す ると lkl791は他の抗体に itベて特に高!/、活'性を示し、つ ヽで、 lkl736、 lkl422 、 lkl712力高!/、活'性を示して!/ヽる。この濃度で ίま Raji、 WiL2— NSにお!/、て lkl79 1は他の抗体のおよそ 2倍近 、細胞傷害を誘導して!/、ることが確認できる。しかしな がら、他の抗体もリツキシマブと同程度、もしくはそれ以上の活性を示している。
一方、リツキシマブが効かないとされる RC—K8では、抗体ごとの差異が顕著に現 れた。リツキシマブ、 lkl402および lkl712ではほとんどもしくは全く活性がない。 それに対し、 lkl791は非常に高い活性を示し、 5 /z gZmlの濃度では約 50%の傷 害活' 14を示して ヽる。これに続き、 lk0924力 250/0程度、 lkl422、 lkl736力 100/0 程度の傷害活性を示して 、る。
以上から、今回試験対象とした 6種類のキメラ抗体はリツキシマブと同程度あるいは より強 、CDC活性を有して 、ることが確認された。
実施例 3
(1)結合親和性測定
ヒト B細胞株由来の Raji細胞を、 RPMI1640に非働化処理した 10%FCS添加培地 で 37°C、 CO濃度 5%の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代により維持し
2 2
た。
継代後 3〜4日目（約 lxlO6個 Zml)の細胞培養液を室温、 lOOOrpmで 5分間遠 心分離し、細胞を回収後、 PBS (—）で懸濁、 lOOOrpmで 5分間遠心分離を行い、 上清を除く操作を 2回行うことで洗浄した。
抗 CD20抗体（陽性コントロール抗体:マウス抗体 2B8、キメラ抗体及びヒト化抗体 C2B8)と Raji細胞を混和し、室温で 1時間反応することで 1次抗体反応を行った。ここ で、抗 CD20抗体の各々の終濃度は 1. 33、 2. 67、 4. 00、 5. 33、 6. 67、 8. 00、 9. 33、 10. 67、 12. 00、 13. 33、 14. 67、 16. 00nMの 12点とし、細胞数 5xl06 個、 1%BSA— PBS溶液を反応溶液とし液量 100 1になるよう 1. 5mlチューブに分 注した。同一試験抗体あたり 3点のサンプルを準備し、バックグラウンド算出サンプル として抗体を加えな 、チューブも 4本用意した。
反応後、室温、 3000rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の 1次抗体を除き、細胞 を回収した。
[0040] 細胞と結合した 1次抗体に対して過剰量となるよう 1%BSA— PBS溶液で 5ugZml に調製した FITC標識二次抗体を 100 1づっ添加し、懸濁後、遮光、室温のもと 1 時間反応させた。
ここで FITC標識 2次抗体はマウス抗体では GOAT Anti Mouse IgG (H&D-FITCを キメラ抗体及びヒト化抗体では GOAT F(ab') 2F ragment Anti Human IgG (Fc y )- FI TCを用いた。
反応後、室温、 3000rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の FITC標識 2次抗体を 除き、細胞を回収し、 200 1の PBSで懸濁し再度遠心し洗浄を行った。
この細胞を 100 μ 1PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレートへ移した。 2次抗体の蛍 光量を Typhoon9210イメージアナライザー（Amersham Bioscience)を用いて測定し た。
検出後、画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数値化を 行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。同一試験抗体の平均値を求め、バック グラウンド算出サンプル (細胞と FITC標識 2次抗体のみを反応させたもの）の値を各 試験抗体の値力 差し引くことで、プレート、 PBS溶液および細胞に非特異的に結合 した FITC標識 2次抗体に由来するバックグラウンド値を除いた。同時に 100 1当り、 0、 12. 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150ngの FITC標識 2次抗体単独の蛍光量を 測定することで検量線を作成し、細胞に結合している 2次抗体のモル数を求めた。各 1次抗体と FITC標識 2次抗体が 1： 5の割合で反応して 、ると仮定し、結合して 、る 1 次抗体量を算出した。遊離の 1次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。 これらの値を用いて、スキャッチヤード解析を行い、解離定数 Kd値を得た。
結果を以下の表 4に示す。
[0041] (2)アポトーシス誘導試験
ヒト B細胞株由来細胞に対する抗 CD20抗体によるアポトーシス誘導を単独で見る 条件 (クロスリンク無)及びさらに抗 CD20抗体の Fc領域を認識する 2次抗体を添カロ することによるアポトーシス誘導を見る条件 (クロスリンク有)の 2条件で反応し、 Annexi n V-FITC apoptosis kitを用いて初期アポトーシスの検出を行った。 ヒト B細胞株由来の Raji、 WIL2— NS、 SU— DHL4、 RCK8の 4種類の細胞を、 R PMI1640に非働化処理した 10%FCS添加培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代により維持した。
2
継代後 3〜4日目（約 lxlO6個 Zml)の細胞培養液を室温、 lOOOrpmで 5分間遠 心分離し、細胞を回収した。
抗 CD20抗体（陽性コントロール抗体:マウス抗体 2B8、キメラ抗体及びヒト化抗体 C2B8；陰性コントロール: Anti— CD3モノクローナル抗体）と新鮮な培養培地で懸 濁した細胞を混和し、 1. 5時間 37°C、 5%COインキュベータ内で反応した。ここで、
2
抗 CD20抗体各々の終濃度は 0. 2、 1、 5 /z gZmlの 3点、細胞密度 lxlO6細胞 Zm 1、培養培地を反応溶液として液量 250 1になるよう 1. 5mlチューブ内で反応を行つ た。同一試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。
反応後、室温、 1200rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の抗体を除き、細胞を回 収した。
クロスリンク無の条件では新鮮な培養培地、クロスリンク有条件では抗 CD20抗体の 5倍量の Fc領域を認識する 2次抗体を 250 1づっ添カ卩し、混和後、さらに 3時間、 3 7°C、 5%COインキュベータ内で反応した。ここで 2次抗体はマウス抗体では Goat A
2
nti mouse IgG, Fc y Fragmentを、キメフ饥'体及びヒトイ匕抗体では Goat Anti human Ig , vc y Fragment specificを用 ヽた。
反応後、室温、 1200rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の 2次抗体を除き、細胞 を回収した。 250 1の PBSで懸濁し再度遠心し洗浄を行った
検出試薬として MEBCYTO apoptosis kit- AnnexinV- FITC ,ΡΙ- (MBL, Cat.No.470 0, Lot. 21)を使用した。 85 μ 1の Binding bufferをカ卩え懸濁した後、 Annexin V- FITC 5 μ 1と propidium iodide (PI)5 1 (終濃度 0. 5mg/ml)をカ卩えてよく混和し、遮光、室 温で 15分間反応させた。
フローサイトメトリー（EPICS ALTRA： BECKMAN COULTER)を用いて total count2 0, 000の細胞を測定し、解析（Expo32: BECKMAN COULTER)を行った。
結果を図 7a〜図 9dに示す。
(3)ヒト化抗体産生株の調製 (a) DNA合成
配列番号 17〜 24のアミノ酸配列を元にしてコドンを CHO細胞に最適化した DNA を、定法によりデザインし、合成した。
(b)コンストラクトの作成
pNOWを発現ベクターとして 16種類のヒト化 1K1791発現コンストラクトを構築した。 ヒト化 1K1791発現コンストラクトを作製した。
pNOW— aal791kgl、 pNOW— afl791kgl、 pNOW— asl791kgl、 pNOW— avl791kgl、 pN OW— fal791kgl、 pNOW— ffl791kgl、 pNOW— fsl791kgl、 pNOW— !V1791kgl、 pNOW— s al791kgl、 pNOW— sfl791kgl、 pNOW— ssl791kgl、 pNOW— svl791kgl、 pNOW— val7 91kgl、 pNOW— vH791kgl、 pNOW— vsl791kgl、 pNOW— wl791kgl
(c)トランスフエクシヨンと薬剤による選択
トランスフエクシヨン試薬を用いてヒト化 1K1791発現コンストラクトを CHO DG44cd B細胞に導入した。それぞれの遺伝子を導入した CHO DG44cdB細胞 1 X 106個を 100mlの選択培地に懸濁し、 96ゥエルプレート 5枚に撒いた（200 1Zゥエル）。 5 %炭酸ガス存在下に 37°C、 3〜4週間培養した。
トランスフエクシヨン試薬： Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427 選択培地： IS CHO- CD w/Hydrolysate/4mM GlutaMAX/0.8 mg/ml G418
(d)高発現細胞株の選択
1)コロニーが出現しているゥエルの上清をとり、ドット 'プロット'アツセィ（Dot Blot as say)で抗体産生量を測定した。
2)抗体産生量の多いクローンを 24ゥエルプレートに移し、約 5日間培養後、上清を とり、サンドイッチ ELISAで抗体産生量を測定した。
3)発現量が多 、クローンを 2つ選択し、 T75フラスコに移した。
(e)小規模培養
16種類のコンストラクトそれぞれに対して選択した 2種のクローンを 30mlの選択培 地を含む T75フラスコ中で培養を行った。
(4)ヒト化抗体産生株の培養及び精製
抗体産生細胞株（遺伝子組み換え CHO— DG44細胞）を、 Hydrolysateを含む IS CHO— CD/with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No.91119)に、 4mM GlutaMax( Invitrogen, Cat 35050—061)、 200 μ g/mlG418 (Sigma,Cat.No.A1720— 5G)を添カロし た培地で 37°C、 CO濃度 5%の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代〖こより
2 2
維持した。
継代後約 2週間経過した細胞培養液を室温、 3500rpmで 5分間遠心分離し、培養 上清を回収し、 0. 45 μ ηι syringe filterで濾過した。 50mM Tris— HC1、 pH7. 0で 平衡化した
Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17- 0402- 01)カラムに、培養上清を 添加後、 50mM Tris— HC1、 pH7. 0で洗浄した。 0. 1Mクェン酸、 pH4. 0で溶出 し、 400 μ 1づっ採取し、その 10/1量にあたる 40 μ 1 1M Tris— HC1、 pH9. 0で 中和した。 100倍量の PBSに対して、 M. W. 3500透析カップ（Bio- Tech Cat. No.2 12932)を用いて 2. 5時間を 2回後、 15〜18時間 1回の透析を行った。
使用した抗体生産株は、 CHO細胞 hzl791-!V10、 hzl791-ffi34、 hzl791-sf43および hzl791- ss32であり、これらは、ブタペスト条約の下、平成 18年（2006年） 3月 1日より 、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術研究所 、特許生物寄託センターに、各々、 FERM ABP— 10543、 FERM ABP— 1054 4、FERM ABP— 10545および FERM ABP— 10546の受領番号で寄託してあ る。
これらの細胞株から得られたヒトイヒ抗 CD20モノクローナル抗体の H鎖 V領域およ び L鎖 V領域のアミノ酸配列 (配列番号 17〜 24)は以下のとおりである（アンダーライ ン部分が対応するマウス抗体と異なる)。
ヒト化 lkl791の配列
L鎖 V領域配列 (配列番号 20)
Ven 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLELK
H鎖 V領域配列 (配列番号 24) WMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RT NYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 17)
abb 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLl
Y FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGT KLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 21)
WMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFVFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR R TNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 19)
sdr 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 23)
WMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR R TNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 18)
fra 1791： STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLl
Y FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGT KLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 22)
MG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAY LQISSLKAEDMATYFCTR RTN YYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
この実験では、 AbbL、 FraL、 SdrL、 VenLの 4種類 X AbbH、 FraH、 SdrH、 VenHの 4種類を組み合わせた合計 16種類の配列組合わせ力も各 2クローンづっについて 実験を行った。以上の結果より、 Kd値を基に表 5に示すように 4グループに分類でき る。それぞれのグループより 1種類を選抜し以降の実験で使用した。
コントロール： c2B8
グループ I : Kd = 20 nM<
グループ II： Kd = 10- 20 nM
グループ III： Kd = 8-10 nM
グループ IV： Kd = < 8 nM
ヒト化抗体結合解離定数
[表 4]
m mm^ mm [ oo]
Figure imgf000031_0001
οε
.Cl70C/900Zdf/X3d OOHO動 OAV グループ Ηζ1791 clone Kd (nM)
I (20 nM<) ss 23.09
Π (10-20 ηΜ) sa 14.66
sf 12.70
sv 12.58
as 11.68
aa 10.82
vs 10.35
va 10.30
fa 10.09
ΙΠ (8-10 ηΜ) av 9.94
fs 8.71
幵 8.15
IV«8nM) vf 7.78
af 7.76
fv 7.21
vv 7.07
:πン卜 π—ル c2B8 5.35±1.13 さらに、マウス抗体 8種類でのアポトーシス実験結果を図 7a〜図 7dに示す。 4種類 全ての細胞においてマウス抗体 8種類および既知の CD20抗体 2B8、 2H7について 2つのタイプに分けることができた (但し一部例外を除く）。
グループ A:m0924 , ml422 , ml791 , m2B8
グループ B:ml228 , ml402 , ml712 , ml736 , ml782 , m2H7
(但し、 m0924は SU— DHL4細胞ではグループ Bに含まれる）
すなわち、抗 CD20抗体単独で十分なアポトーシス誘導能が示され、 2次抗体によ るクロスリンク条件下でもほぼ同程度であるグループ Aと抗 CD20抗体単独でのアポ トーシス誘導能は十分に示されないがクロスリンク条件下で大きく増加するグループ Bである。またグループ Aに含まれる抗体は親和性が 2B8と同程度であり、グループ Bに含まれる抗体は 2B8より高い親和性であるものが含まれる。アポトーシス誘導に 2 次抗体の存在を必要とせず、単体でアポトーシス誘導が可能なグループ Aの方が医 薬としては都合よいといえる。
細胞別にみるとアポトーシスの割合が RAJI、 WIL2-NS, RCK8では高いもので も 30〜40%であるのに対し、 SU— DHL4では高いもので 80%以上を示す結果とな つた o [0049] ヒトイ匕抗体 4種類での結果を図 8a〜図 9dに示す。
マウス抗体同様、 4種類全ての細胞においてヒトイ匕 1791抗体 4種類について 2つの タイプに分けることができた。
グループ A:1V10 , H34
グループ B : sf43 , ss32 , c2B8
C2B8と同等の親和性を示すグループ Aの !V10、ffi34抗体はクロスリンク無しで C2B 8と同程度のアポトーシス活性をもち、クロスリンク条件下で明らかに活性が増加する 。グループ Bの sf、 ss抗体はグループ Aの抗体より、解離定数が大きく親和性は弱い 力 これらの抗体単独で C2B8よりやや高 、アポトーシス活性を示した。
抗 CD20抗体による B細胞に対するアポトーシス誘導能について、単独で十分なァ ポトーシス誘導能を示す場合、クロスリンク条件下でもその割合はほぼ同等であるが 、抗体の種類、未飽和条件などで抗 CD20抗体単独では十分なアポトーシス誘導能 が示されない場合、クロスリンク条件下でアポトーシス活性は増加すると考えられる。 なお、図 9a〜図 9dは、実験日の noAbでの早期アポトーシス（％)を 1とするグラフで ある。
産業上の利用可能性
[0050] 本発明によれば、自然の状態のヒト CD20分子に対する結合親和性の高い、医薬 として好適な生物学的活性を示す抗 CD20モノクローナル抗体を提供することができ る。
配列表フリ -テキスト
[0051] SEQ ID NO: 17: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 18: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 19: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 20: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 21: H chain V region sequence or humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 22: H chain V region sequence or humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 23: H chain V region sequence or humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 24: H chain V region sequence or humanized antibody Ven 1791 SEQ ID NO: 25: primer SEQ ID NO: 26: primer

Claims

請求の範囲
[I] ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換された 非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20抗原 を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する抗 CD20モノクローナル抗体。
[2] ヒト CD20抗原を有する細胞の in vitro培養に対して末梢血単核細胞非存在下で増 殖阻害活性を有する請求項 1記載の抗 CD20モノクローナル抗体。
[3] 増殖阻害活性がアポトーシス誘導である請求項 2記載のモノクローナル抗体。
[4] Raji細胞 (浮遊細胞）に対する解離定数 (Kd値）が 2B8の 1Z2以下である請求項 1 記載の抗 CD20モノクローナル抗体。
[5] L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 1及び
9、配列番号 2及び 10、又は配列番号 3及び 11であるマウス由来の請求項 4記載の 抗 CD20モノクローナル抗体。
[6] 請求項 5記載のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグ ロブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体。
[7] 請求項 5記載のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸配列とヒト ィムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗体。
[8] 配列番号 1、 2又は 3のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメ ラ化した L鎖と配列番号 9、 10又は 11のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミ ノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせた請求項 6記載のキメラ抗 CD20モノクロ ーナノレ抗体。
[9] 配列番号 1、 2又は 3のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸配 列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 9、 10又は 11のマウス由来モノクローナル抗体可変領 域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせた請求項 7記載のヒト化抗 CD20モノクロ ーナノレ抗体。
[10] Raji細胞 (浮遊細胞）に対する解離定数 (Kd値）が 2B8の 1Z8以下である請求項 1 記載のマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒトイ匕した抗 CD20モノクロ一 ナル抗体。
[II] L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 4及び 12、配列番号 5及び 13、配列番号 6及び 14、配列番号 7及び 15、又は、配列番号 8 及び 16である請求項 10記載の抗 CD20モノクローナル抗体。
[12] 配列番号 4〜8のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列 をキメラ化した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗体 可変領域アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせた請求項 10記載のキメラ抗 C
D20モノクローナル抗体。
[13] 配列番号 4〜8のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのァミノ 酸配列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクローナル 抗体可変領域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせた請求項 10記載のヒト化抗 C
D20モノクローナル抗体。
[14] CHO細胞 hzl791- 1V10 (FERM ABP— 10543)、 hzl791-ffi34 (FERM ABP—
10544)、 hzl791-sf43 (FERM ABP— 10545)または hzl791-ss32 (FERM ABP 10546)が産生する請求項 7記載のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[15] 配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖、配列番号 18の L鎖と配列番号 22の H鎖
、配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖または配列番号 19の L鎖と配列番号 23の
H鎖を組み合わせた請求項 14項記載のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[16] アポトーシスの誘導に 2次抗体を必要としない請求項 3、 6又は 7記載の抗 CD20モ ノクローナル抗体。
[17] 請求項 6、 7、 10、 14又は 16記載の抗 CD20モノクローナル抗体を有効成分として なる B細胞関連疾患治療剤。
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