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WO2006132270A1 - 除草剤抵抗性遺伝子 - Google Patents

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Publication number
WO2006132270A1
WO2006132270A1 PCT/JP2006/311415 JP2006311415W WO2006132270A1 WO 2006132270 A1 WO2006132270 A1 WO 2006132270A1 JP 2006311415 W JP2006311415 W JP 2006311415W WO 2006132270 A1 WO2006132270 A1 WO 2006132270A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hppd
gene
herbicide
resistant
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/311415
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Fumihiko Sato
Hiromichi Minami
Original Assignee
Kyoto University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
Priority to JP2007520138A priority Critical patent/JPWO2006132270A1/ja
Publication of WO2006132270A1 publication Critical patent/WO2006132270A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to an herbicide-resistant enzyme, particularly an enzyme resistant to a herbicide targeting p-hydroxypyruvate dioxygenase.
  • HPPD p-Hydroxypyruvate dioxygenase
  • HPP p-hydroxyphenyl viruvate
  • molecular oxygen p-hydroxyphenyl viruvate
  • this enzyme is involved in the biosynthesis of blast quinone, ⁇ -tocopherol (vitamin E), etc. (Fig. 1).
  • this enzyme has recently been found to be a molecular target for several herbicides.
  • HPPD gene The full-length or partial sequence of a gene encoding HPPD of a plant (hereinafter also referred to as HPPD gene) is carrot, Arabidopsis thaliana, barley, corn, rice, , Ryegrass, oshinokedasa, akinoenokorogusa, ohishiba, sorghum (Non-Patent Document 1)
  • Herbicides that inhibit HPPD inhibit plastoquinone biosynthesis in plants, resulting in decreased carotenoids, chloroplast development arrest and whitening.
  • a decrease in plastoquinone content in plants is thought to affect the photosynthetic electron transport system and cause plant growth suppression symptoms.
  • Tocopherol another product of the plastoquinone biosynthetic system, acts as a free radical scavenger.
  • a decrease in tocopherol content in plants causes lipid peracids, which lead to necrotic symptoms.
  • a decrease in tocopherol content is thought to cause a decrease in the photosynthetic ability of plants!
  • HPPD inhibitors are thought to kill weeds by such various actions. Therefore, HPPD is extremely effective as a molecular target for powerful herbicides.
  • Herbicides that inhibit HPPD are triketone (cyclohexanedi) according to chemical structure. On), isoxazole, pyrazole, and bicyclooctanedione (BOD) systems.
  • pyrazole pyrazolate is known to have high herbicidal activity. Pyrazolate is hydrolyzed to form active detosyl virazolate (hereinafter referred to as DTP) as its herbicide (Fig. 2).
  • DTP active detosyl virazolate
  • Fig. 2 Bicyclooctanedione
  • BOD bicyclooctanedione
  • Patent Documents 1 and 2 Enzymes resistant to herbicides targeting HPPD have been reported (Patent Documents 1 and 2).
  • the degree of herbicide resistance of the HPPD disclosed in Patent Document 1 is 2 to 4.5 times as low as that of conventionally known HP PD.
  • the HPPD disclosed in Patent Document 2 is also considered to be only several times more resistant than the conventionally known HPPD, and the HPPD is a mutant enzyme in which a mutation is introduced into wild-type HPPD.
  • a method known in the art for creating an HPPD resistant plant is to increase the amount of enzyme and impart resistance by overexpressing HPPD in the plant body.
  • Met A method for producing a herbicide-resistant plant by using a wild-type enzyme derived from a plant whose enzyme itself has high herbicide resistance has been successful so far.
  • HPPD gene is useful as a tocopherol and plastoquinone biosynthetic gene, it is not only useful for the production of herbicide-resistant plants, but is also useful for Tocophere mouths such as plastoquinone. It is also useful as a gene for producing useful compounds.
  • Patent Document 1 Special Table 2004— No. 528821
  • Patent Document 2 Special Table 2001-522608
  • Non-patent document 1 Plant growth regulation, vol.27, No.2, pl46-155, 2002
  • An object of the present invention is to provide HPPD having extremely high herbicide resistance.
  • the present inventors have found that olene cultured cells are resistant to DTP (detosyl virazolate), which is the active body of pyrazolate, and olene force also has the ability to express HPPD gene. Released. The present inventors further expressed the HPPD gene in Escherichia coli and measured the activity thereof. As a result, it was revealed that the HPPD gene exhibits a resistance about 500 times higher than that of conventionally known HPPD. The HPPD also showed high resistance to a hydrolyzate of benzobicyclone.
  • DTP detosyl virazolate
  • the present invention relates to
  • a gene encoding a herbicide-resistant p-hydroxyphenylbiruvate dioxygenase enzyme which comprises a polynucleotide having the first to 1293th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase enzyme that is hybridized under stringent conditions with a polynucleotide having the first to 1293th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and resistant to herbicides A gene comprising a polynucleotide encoding.
  • the open reading frame (ORF) of the herbicide-resistant HPPD according to the present invention has a base number of 1 to 1290. Accordingly, the present invention provides a gene consisting of nucleotides 1-1290 of SEQ ID NO: 1.
  • the coding region containing 3 bases of the ORF and stop codon consists of nucleotides 1 to 1293. As long as the present invention includes a region corresponding to nucleotide numbers 1 to 1290 of SEQ ID NO: 1, any gene is included in the range.
  • the present invention relates to a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions with a polynucleotide having the 1st to 1293th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes herbicide-resistant HPPD.
  • a gene containing is also provided.
  • stringent hybridization conditions refer to conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5x SSC or equivalent stringency hybridization conditions.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence ability in which one or several bases or base pairs are deleted, substituted or added in the polynucleotide having the first to 1293th nucleotide strengths of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a gene comprising a polynucleotide encoding the herbicide-resistant HPPD is also provided.
  • “one or several bases or base pairs” means a number of bases that can be substituted, deleted, inserted, and Z or added by a known mutagenesis method such as site-directed mutagenesis. Or base pair.
  • the present invention also shows a homology of 70% or more at the nucleotide level with the polynucleotide having the first to 1293th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encodes herbicide-resistant HP PD. Also provided is a gene comprising the polynucleotide.
  • the nucleotide sequence homology is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, and still more preferably 92% or more, 95% or more, 98% or more. Sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson WR and DJ Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444-2448) or BLASTN search.
  • the present invention provides the following (c) or (d) p-hydroxyphenyl-birubinate dioxygenase enzyme:
  • P-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase that has the ability to align amino acids in which one or several amino acids are deleted, replaced or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and is resistant to herbicides enzyme.
  • mutant protein includes a protein having a mutation artificially introduced by a known mutant protein production method or the like, and a protein having a mutation in comparison with a naturally-occurring similar isolated SEQ ID NO: 2. Including.
  • the present invention comprises a protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a protein that acts as a herbicide-resistant HPPD and a protein that exhibits 72% or more homology at the amino acid level with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that acts as a herbicide-resistant HPPD. provide. Furthermore, the present invention provides a protein encoded by the HPPD gene of the present invention.
  • the term “one or several amino acids” has the same meaning as described above.
  • amino acid sequence homology is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, and still more preferably 95% or more, 98% or more. Sequence identity is determined by FASTA search (Pea rson WR and DJ Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444- 2448) and BL
  • the herbicide-resistant HPPD of the present invention includes herbicides for herbicides targeting HPPD, such as pyrazole pyrazolate (DTP which is the active body) and bicyclooctanedione benzobicyclon. Useful for imparting resistance to plants.
  • herbicides for herbicides targeting HPPD such as pyrazole pyrazolate (DTP which is the active body) and bicyclooctanedione benzobicyclon.
  • the herbicide-resistant HPPD provided by the present invention is detosyl virazolate.
  • the herbicide resistant HPPD provided by the present invention is derived from allene.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing the HPPD gene of the present invention, a transformed plant cell containing the recombinant vector, and a transformed plant containing the transformed plant cell.
  • Specific examples of the plant to be transformed include soybean, rice, rapeseed, potato, potato, tomato, tobacco, barley, wheat, corn and the like, preferably soybean and rice.
  • the present invention provides a method for producing an HPPD-inhibiting herbicide-resistant plant comprising the steps of transforming a plant cell with an HPPD gene, and regenerating the transformed plant cell to obtain a plant body. provide.
  • transformed plant includes all transformed plant bodies, plant organs, plant tissues and plant culture cells.
  • the present invention is also a method for controlling weeds in a field where a transformed plant is cultivated, and is effective for controlling target weeds without substantially changing the transformed product.
  • a method comprising applying to a field an amount of an HPPD-inhibiting herbicide.
  • the HPPD-inhibiting herbicide is pyrazolate and benzobicyclon.
  • HPPD gene of the present invention it is possible to confer resistance to a herbicide that inhibits HPPD. Since herbicides that inhibit HPPD are known as non-selective inhibitors, the HPPD gene of the present invention confers herbicide resistance to a wide range of crops.
  • the HPPD gene of the present invention may be useful for metabolic engineering of these useful compound biosynthesis systems.
  • the present invention is expected to reduce the weeding work.
  • the recombinant microorganism or recombinant plant containing the HPPD gene of the present invention can be useful in the production of useful vitamins such as tocopherol z plastoquinone.
  • FIG. 1 is a diagram showing HPPD-catalyzed reaction and inhibition of plastoquinone biosynthesis.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of an HPPD inhibitor.
  • a Pyrazolate is hydrolyzed to form active detosyl virazolate (DTP).
  • DTP active detosyl virazolate
  • b Triketone type HPPD inhibitor.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of DTP on the growth of cultured tobacco cells. DTP showed significant growth inhibition in tobacco.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of DTP on the growth of ollen cultured cells. In the wings, DTP had no inhibitory effect.
  • FIG. 5 is a diagram showing a partial comparison of HPPD sequences isolated from allenes and HPPD sequences isolated from other species. In the figure, triangles indicate iron binding residues. The active site is indicated by a frame.
  • FIG. 6 is a diagram showing a systematic line of HPPD.
  • FIG. 7 is a diagram showing SDS-PAGE of allene HPPD expressed in E. coli.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 2 control vector (pET-21d)
  • lane 3 HPPP D 0 arrow indicates predicted production of recombinant HPPD.
  • FIG. 8 is a diagram showing LC-MS analysis of a reaction product by recombinant HPPD.
  • FIG. 9 is a graph showing the inhibitory effect of pyrazolate and DTP on HPPD derived from carrot cultured cells. Not an inhibitor! The activity is 4.9 nmol homogentisic acid Z-min Zmg protein. ⁇ indicates pyrazolate, and ⁇ indicates DTP. This figure shows that the IC of DTP for carrot HPPD is 13 nM (Hiroshi Matsumoto et al., 200
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of DTP on allen HPPD.
  • the enzyme activity in the absence of inhibitor was 3.8 nmol Z min Zmg protein. From the inhibition curve, it can be seen that our HPPD IC is 6.75 ⁇ (about 500 times that of carrot).
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of benzobicyclone hydrolyzate on olene HPPD. From the inhibition curve, it can be seen that the IC of Aulen HPPD is 1.2 ⁇ .
  • herbicide-resistant HPPD is a herbicide that targets HPPD, for example, DTP's IC power against HPPD. Conventionally known! /, HPPD (Garcia,
  • HPPD that is 50 times or more, more preferably 100 times or more, and even more preferably 500 times or more.
  • IC is a herbicide that inhibits HPPD enzyme activity by 50%, for example,
  • the concentration of DTP It is the concentration of DTP. Therefore, even when a herbicide in a concentration substantially sufficient to kill plants such as weeds not containing HPPD of the present invention is applied, the plant having the HPP D of the present invention, preferably useful for agriculture. Crops do not die. Therefore, the herbicide-resistant HPPD of the present invention makes it possible to weed only weeds that do not kill useful crops.
  • the present invention provides a herbicide resistant HPPD gene.
  • the present inventors isolated the HP PD gene from cultured cells of Coptis japonica of the family Ranunculaceae and sequenced it (SEQ ID NO: 1).
  • the HPPD gene of the present invention is preferably a polynucleotide which is a polynucleotide comprising the bases 1 to 1293 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, so long as the part corresponding to this part is included.
  • the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be obtained from a cDNA library prepared by a conventionally known method.
  • the present invention also includes a gene encoding a protein functionally equivalent to the protein acting as the herbicide-resistant HPPD of SEQ ID NO: 2.
  • herbicide resistant HPPD The protein functionally equivalent to the protein acting as ⁇ has the same biological function as the protein of SEQ ID NO: 2, i.e., has HPPD enzyme activity and has the herbicide resistance defined above. ⁇ ⁇ that it is a protein to show.
  • the gene of the present invention includes, for example, a mutation encoding a protein having an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Bodies, derivatives, variants and homologs.
  • the number of bases mutated in comparison with the sequence of SEQ ID NO: 1 in the DNA constituting the HPPD gene of the present invention is within 30 amino acids, preferably within 20 amino acids, more preferably within 10 amino acids, at the amino acid level. More preferably, it causes mutation within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids, within 2 amino acids).
  • the method for obtaining the HPPD gene of the present invention is not particularly limited, and a conventionally known method is employed.
  • the gene may be excised from a genomic DNA or cDNA library with an appropriate restriction enzyme and purified. That is, the herbicide-resistant HPPD gene of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA. Methods for preparing genomic DNA and cDNA are well known to those skilled in the art.
  • the genomic DNA encoding the HPPD of the present invention for example, extracts genomic DNA from plant cells or tissue, and creates a genomic library (vectors include plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc.).
  • a probe prepared based on DNA encoding the protein of the present invention SEQ ID NO: 1
  • the library can be prepared by a method for screening (for example, colony hybridization or plaque hybridization).
  • the HPPD gene of the present invention can also be prepared by a method in which a primer specific to the sequence of SEQ ID NO: 1 is prepared and PCR is performed using this primer.
  • the cDNA encoding the HPPD of the present invention can be synthesized by, for example, synthesizing cDNA based on mRNA extracted from plant cells or tissue, and inserting it into a vector such as ⁇ ZAP to prepare a cDNA library. It can be prepared by a screening method (eg, colony hybridization or plaque hybridization), or by PCR.
  • the herbicide-resistant HPPD gene of the present invention can be used for mass production of useful vitamins such as tocopherol Z plastoquinone by enhancing the biosynthesis pathway of tocopherol Z plastoquinone.
  • the HPPD gene of the present invention is derived from ollen cultured cells. Therefore, it is possible to clone the full-length cDNA of the herbicide-resistant HPPD gene from plants other than olen using the HPPD gene derived from ollen.
  • a conventionally known method can be used and is not particularly limited.
  • whether or not the obtained gene codes for a protein having a function as a herbicide-resistant HPPD can be determined in a manner generally performed by those skilled in the art.
  • the protein power HPP and oxygen power encoded by the obtained gene have HPPD enzyme activity that catalyzes the formation of homogentisic acid can be confirmed by enzyme activity measurement methods well known to those skilled in the art. .
  • the HPPD enzyme activity is then measured in the presence of various concentrations of herbicide, such as DTP, and the concentration of herbicide (IC) that inhibits the enzyme activity by 50% is determined.
  • An evaluation of 50 can be performed as described in the examples.
  • the gene of the present invention can be isolated from many plant powers according to a conventional method.
  • the gene of the present invention can be obtained by chemical synthesis using a general method such as the phosphite triester method (H. Hunkapiller et al, Nature, vol. 310, p.10 5-111, 1984). You can also.
  • a base sequence having homology to the base sequence of the polynucleotide of the present invention is selected.
  • a base sequence homology search using an algorithm such as BLASTN can be suitably used.
  • an HPPD gene is obtained from a plant after the genome is made into a database
  • a conventional hybridization method using a conventionally known DNA library can also be used.
  • a genomic library or cDNA library is prepared using an appropriate cloning vector, and hybridization is performed using at least a part of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 as a probe. And a step of detecting a fragment that hybridizes to the probe.
  • the HPPD gene of the present invention is also useful as a probe.
  • the region used for the probe preferably contains a sequence specific to the HPPD gene.
  • the length of the polynucleotide used as the probe is preferably lOObp or more.
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions are as described above, 6M urea, 0.4% SDS, 0.5x SSC conditions, or a stringency hybridization equivalent thereto. Refers to a condition.
  • Higher stringency conditions, such as 6M urea, 0.4% SDS, O.lx SSC Genes can be isolated efficiently.
  • the isolated gene is considered to have high homology at the amino acid level with the amino acid sequence of the protein of the present invention (SEQ ID NO: 2).
  • high homology refers to sequence identity of at least 72% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more) at the amino acid level.
  • Sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson WR and DJ Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444- 2448) or BLASTP search.
  • a method for producing a transformed plant that expresses the gene of the present invention comprises the steps of inserting the HPPD gene of the present invention into an appropriate vector, introducing it into a plant cell, and transforming plant cells obtained thereby. Including playing.
  • the transformed cell of the present invention is a cell into which the HPPD gene or recombinant vector of the present invention has been introduced.
  • the gene or recombinant vector has been introduced means that the gene or recombinant vector is introduced into the host in an expressible manner by the action of the gene or recombinant vector, eg, a promoter, by a known genetic manipulation technique. .
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by directly introducing the HPPD gene of the present invention into a host, or by introducing a vector incorporating the gene into the host.
  • the host is not particularly limited, and examples include plants for producing herbicide-resistant plants, and microorganisms such as yeast and Escherichia coli for biosynthesis of useful vitamins. Although transformation may be transient, it is preferably one in which the HPPD gene is stably integrated.
  • the obtained gene When the obtained gene is introduced into a plant, it is used by being linked to a promoter capable of causing expression in the plant.
  • promoters include, for example, the 35S promoter of cauliflower mono-mosaic virus (CaMV35S promoter), the promoter of nopaline synthetase, the promoter of the small subunit of ribulose diphosphate canoleboxylase Z-oxygenase, and the like.
  • Various methods known to those skilled in the art may be used to produce the transformed cells of the present invention. Such methods include, for example, the polyethylene glycol method, electo-portion polarization. Method, method using agro-batterium, particle gun method and the like. Plant regeneration from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells (Toki et al., Plant Physiol. 100: 1503-1507 (1995)). reference). For example, as a method for producing a transformed plant, a gene is introduced into a protoplast using polyethylene glycol and the plant is regenerated (Datta, SK (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.
  • the present invention also includes a plant cell into which the gene of the present invention has been introduced, a plant containing the cell, progeny and clones of the plant, and propagation material derived therefrom.
  • the vector used for plant cell transformation is not particularly limited as long as the transgene can be expressed in the cell.
  • vectors having inducible promoters eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter
  • inducible promoters eg, ethylene-responsive PR5d promoter, water stress-inducible rd29
  • drug resistance genes include ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, and hygromycin resistance gene.
  • replication origins examples include replication origins derived from Ti or Ri plasmids.
  • DNA linked to a promoter can be directly introduced into plant cells using a microinjection method, an electopore position method, a polyethylene glycol method, a fusion method, or the like.
  • the DNA can also be incorporated into a plant vector for gene transfer into a plant and indirectly introduced into a plant cell via a virus or bacterium capable of plant infection.
  • cauliflower mosaic virus, diemi-virus, tobacco mosaic virus, brom mosaic virus, etc. can be used as powerful viruses, and as bacteria, Agrobacterium tumefaciens (hereinafter abbreviated as A.
  • Agrobacterium 'Rhizogenes' or the like can be used.
  • Examples of plasmids used for gene introduction into plants by the agrobacterium method using A. umefaciens include pBI101 and pBI121 (both from Clontech).
  • plant cells into which a vector is introduced include various forms of plant cells, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus.
  • the method for producing an HPPD-inhibiting herbicide-resistant plant comprising the steps of transforming a plant cell with an HPPD gene, and regenerating the transformed plant to obtain a plant body according to the present invention. According to this, a plant having high herbicide resistance can be obtained.
  • ollen and other various plants for example, poppy family (no, nabisiso, poppy), gramineous plant (rice, corn), solanaceous plant (tomato, potato), legumes, etc. It is also possible to mass-produce tocopherol Z plastoquinone from (such as soybean).
  • Protein of the present invention gene encoding the same, and use thereof
  • the protein of the present invention includes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a protein that acts as a herbicide-resistant HPPD enzyme, or a protein having amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2 and amino Includes proteins that show 72% or greater homology at the acid level and act as herbicide-resistant HPPD enzymes.
  • the protein of the present invention may be fused with a known tag such as HA or Flag for facilitating protein purification or detection at the end, or may be fused with a heterologous protein. Yes.
  • the protein of the present invention may be subjected to various modifications such as N-glycosylamine.
  • the protein according to the present invention may be obtained by recombinant production as described below, or may be isolated and purified from various sources including plant cells.
  • a general method for preparing recombinant HPPD is to insert the HPPD gene of the present invention into an appropriate expression vector, introduce the vector into an appropriate cell, culture the transformed cell, and express the expressed protein. Including purification.
  • the recombinant protein may be expressed as a fusion protein with another protein for the purpose of facilitating purification or the like.
  • Examples of fusion proteins include fusion proteins with maltose-binding proteins (vector pMAL series released by New England BioLabs, USA) and fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST) (vectors released by Amersham Pharmacia Biotech).
  • GST glutathione-S-transferase
  • pGEX series fusion proteins with histidine tags (Novagen pET series).
  • host cells include Escherichia coli, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells that are not particularly limited as long as they are suitable for the expression of recombinant proteins.
  • Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce the vector into the host cell. For example, for introduction into E. coli, introduction methods using calcium ions (Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, 53, 158-162 (1970), Hanahan, D. Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1983)).
  • the recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or its culture supernatant by methods known to those skilled in the art. When the recombinant protein is expressed as a fusion protein with a maltose binding protein, it can be easily recovered by affinity purification.
  • an antibody that binds to the protein can be prepared.
  • a polyclonal antibody contains purified protein of the present invention or a part thereof. It can be prepared by immunizing animals such as herons and collecting blood after a certain period of time. Monoclonal antibodies can be obtained by fusing antibody-producing cells and bone tumor cells from animals immunized with the above protein or a part thereof to isolate single clone cells (hypridoma) that produce the desired antibodies. It can be prepared by obtaining an antibody from the cells. The antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention.
  • the present invention includes an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • Fig. 3 is a graph showing the growth of tobacco cultured cells in the presence of DTP
  • Fig. 4 is a graph showing the growth of cultured olene cells in the presence of DTP.
  • the present inventors isolated full length cDNA encoding the allen cell force HPPD.
  • the present inventors provide the nucleotide sequence of HPPD cDNA derived from allene.
  • the nucleotide sequence (1293 bp) encodes a 430 amino acid residue protein with a molecular weight of 47.3 kDa and has a specific C-terminal region similar to HPPD from other species.
  • HPPD p-hydroxyphenol biruvic acid
  • the herbicide resistance of the HPPD of the present invention which is dramatically higher than the value for PPD, was about 500 times higher than the HPPD derived from a conventionally known plant (carrot).
  • the IC value for the hydrolyzate of the herbicide benzobicyclon was 1.2 ⁇ .
  • Oulen cultured cells (156-SMT) and tobacco sputum cells were used.
  • Ouren cells are 10
  • the cells were cultured in LS (Linsmaier-Skoog) liquid medium containing ⁇ M naphthalene acetic acid and 0.01 ⁇ 6-benzyladen.
  • Tobacco cells were cultured in LS liquid medium containing 10 ⁇ cocoons and 1 ⁇ ⁇ of strength rice.
  • Suspended cultured cells in a 100 ml Erlenmeyer flask, 20 ml of medium in a rotary shaker at 90 rpm, 25 ° C, ollen cells in the dark, tobacco cells in 3000 lux, 16-hour light conditions Maintained.
  • the herbicide DTP was added to the liquid medium as a methanol solution at various concentrations.
  • the growth of the cultured cells was measured as the total weight of the whole yarn and weave in one 100 ml Erlenmeyer flask after 3 weeks treatment with DTP.
  • p-Hydroxypyruvic acid was purchased from Aldrich. Homogentisic acid was purchased from Sigma. DTP was acquired from Sankyo Pharmaceutical. The benzobicyclone hydrolyzate was obtained from S.D.
  • the deduced protein sequence was aligned using Clustal W and Boxshade (www.ch.embnet.org/software/BOX form.html.). Clustal W was also used to calculate the phylogenetic tree.
  • PCR includes the following Oligonucleotides were used:
  • PCR was performed under the following conditions: first denaturation step, 2 minutes, 94 ° C; 15 seconds, 94 ° C denaturation, 30 seconds, 56 ° C annealing, 2 minutes, 68 ° C DNA 30 cycles consisting of elongation and the last 68 ° C for 5 minutes, KOD-plus DNA polymerase (Toyobo) was used for this.
  • the PCR fragment was subcloned into the pET21d vector (Novagen) cut with Ncol and EcoRI restriction enzymes.
  • the Allen HPPD cDNA fragment was placed under the control of the T7 polymerase promoter in pET21d. Both strands of the DNA insert were sequenced to confirm that mutations were introduced during PCR amplification.
  • Ollen HPPD expression plasmid (pET21d) was introduced into E. coli BL21 (DE3). These recombinant E. coli cells were cultured in 100 ml of LB medium containing 100 mM ampicillin at 30 ° C. and 120 rpm. IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalatatoside) is used as the OD force of E. coli.
  • the final concentration was 1 mM.
  • the cells were further cultured at 30 ° C for 8 hours.
  • Recombinant proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis containing 10% acrylamide. Protein samples were treated with 2XSDS-PAGE sample solution (0.125 M Tris-HC1, pH 6.8, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS). The unfolded gel Stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. The protein concentration was measured by the Bradford method using urchin serum albumin as a standard.
  • HPPD activity was measured by HPLC and LC-MS.
  • the 100 L standard enzyme reaction mixture consisted of: 100 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5, 50 mM ascorbic acid, 10 L (37.18 g desalted protein) enzyme preparation and 200 M P-Hydroxyphenyl viruvate (pH 7.7).
  • concentration of p-hydroxyphenol biruvic acid was set to various concentrations from 2 ⁇ to 200 ⁇ in the measurement of kinetic parameters.
  • the herbicide DTP was added to the solution as a solution of 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • reaction mixture was incubated for 5 minutes at 30 ° C.
  • the reaction was stopped by the addition of triclonal acetic acid (final concentration 2%).
  • the reaction products were quantified using reverse phase HPLC (equipped with Shimadzu LC-10A system).
  • TCA supernatant (50 ⁇ 1 or 20 ⁇ 1) was injected onto a C18 column and eluted at a flow rate of 0.8 mL / min.
  • the mobile phase was 10 mM acetic acid-methanol (85: 15 [Vol / Vol]).
  • the HPPD activity was based on measurement of the amount of homogentisic acid formed by HPLC and UV absorbance at 280 nm. Homogentisic acid was quantified by measuring the peak area. The peak area was converted into the amount of homogentisic acid using a calibration curve. The formation of the product homogentisic acid was confirmed by LC-MS (LC-MS-2010, Shimadzu Corp., negative mode, solvent 20 mM ammonium acetate pH 5.5, flow rate 0.5 ml / min).
  • HPPD inhibition experiment using benzobicyclone hydrolyzate was carried out in the same manner as the inhibition experiment using DTP, except for the following points.
  • inhibitor benzobicyclone hydrolyzate and enzyme solution 100 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5, 50 mM ascorbic acid, 10 ⁇ L (37.18 ⁇ g of desalted protein) enzyme preparation
  • concentrations of inhibitor benzobicyclone hydrolyzate and enzyme solution 100 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5, 50 mM ascorbic acid, 10 ⁇ L (37.18 ⁇ g of desalted protein) enzyme preparation
  • the substrate 200 M p-hydroxyfurrubic acid (pH 7.7) was added to the enzyme solution and the enzyme reaction was carried out for 10 minutes.
  • the formation of the product homogentisic acid was LC-MS ( LC-MS-2010, Shimadzu Corporation, negative mode, solvent was 20 mM ammonium acetate pH 5.5, flow rate was 0.5 ml / min).
  • a cDNA library was also prepared for the capacity of allen cells to produce large amounts of alkaloids, and 1014 ESTs were obtained.
  • a BLAST search (hppt: ⁇ www.ncbi.nlmgov / blast /) showed that these sequenced clones included HPPD clones! /.
  • the cDNA insert in this HPPD clone was approximately 1539 bp in length and had a poly (A) tile at its 3, end.
  • Several amino acid domains were highly conserved between the deduced amino acid sequence of the DNA insert of the Allen HPPD clone and the Arabidopsis sequence, and these two domain sequences showed 80% identity to each other.
  • allen HPPD was a partial cDNA encoding the C-terminal part of HPPD.
  • the isolated allen HPPD was 2183 bp long and contained an ORF encoding a 430-amino acid polypeptide (molecular weight 47.3 kDa)!
  • the Orlen HPPD ORF was sandwiched between a 208 bp 5 'untranslated region and a 3' untranslated region containing 194 bp poly (A).
  • the alignment of Aulen HPPD with other species of HPPD ( Figure 5) showed a high identity with HPPD of other plants, with the highest identity with Arabidopsis thaliana being 71.0%. The identity with humans (30.5%) and S. avermilitis (32.4%) was low.
  • HPPD Various species of HPPD, including olene, were highly conserved in the C-terminal region of the protein. Amino acid residues believed to be active sites of proteins from maize and Arabidopsis thaliana were also present in the Allen HPPD sequence! And, like HPPD from other plants, olene HPPD also has an N-terminal extension of the amino acid! /, But the extension in this olene was shorter than in other plants. Plant HPPD is thought to be significantly different from bacterial and mammalian HPPD at the N-terminus in that it has an extension of at least 30 amino acids. These residues may be targeting signals to the intracellular compartment, i.e. transport signals to the chloroplast.
  • the amino acid sequence suggests that the isolated cDNA encodes allen HPPD.
  • a recombinant protein was produced in E. coli.
  • the present inventors constructed an expression vector that produces recombinant protein in Escherichia coli.
  • the present inventors introduced an Ncol site into cDNA so as to match the start codon in the expression vector pET-21d for E. coli. This construct was then introduced into E. coli cells to induce the production of recombinant protein.
  • the crude E. coli enzyme extract was desalted with a PD-10 column, and the desalted solution was used for detection of HPPD activity. SDS / PAGE analysis clearly showed that transgenic expression was induced.
  • the molecular weight of the subunit was estimated to be approximately 51 kDa ( Figure 7).
  • E. coli carrying the pET-HPPD construct showed a dark brown color in both liquid and solid media, whereas E. coli carrying an empty pET_21d vector did not show such a dark brown color (data Not shown). Similar dark brown coloration is also observed by HPPD of other origins. Has been observed.
  • This dye is the product of the acid polymerization of homogentisic acid synthesized by recombinant HPPD. Clearly, the reaction mixture was subjected to HPLC analysis and the recombinant E. coli enzyme crude extract produced a compound that behaved exactly like the homogentisic acid standard! ( Figure 8). The control E. coli lysate containing the empty pET-21d vector did not produce this peak at the same position.
  • the inventors optimized the pH conditions for the HPPD reaction using p-hydroxyfurrubic acid as a substrate. Enzyme assembly at various pHs revealed that the optimal pH for the conversion of HPP to homogentisic acid was approximately 6.5. Time course studies have shown that homogentisic acid accumulation is linear for at least 10 minutes in the presence of 10 1 desalting enzyme (37.2 ⁇ g protein) and 200 ⁇ ⁇ -hydroxyphenol-birubinic acid. did. The optimum temperature was 30 ° C.
  • the substrate affinity of recombinant HPPD was measured by HPLC analysis using HPP as a substrate.
  • DTP is known to act as an HPPD inhibitor. Matsumoto et al. (2002) showed that DTP inhibited HPPD at an IC value of 13 nmol / L by HPPD assay using highly active extracts from carrot cultured cells ( Figure 9). .
  • benzobicyclone hydrolyzate In order to detect the effect of benzobicyclone hydrolyzate on recombinant olene HPPD, the present inventors added various concentrations of benzobicyclone hydrolyzate solution to the enzyme reaction solution, and then became a substrate p- Hydroxyphenylpyruvic acid was added. Enzyme activity was expressed as relative activity based on the peak area of homogentisic acid and the activity without inhibitor benzobicyclone hydrolyzate as 100%. Benzobicyclone hydrolyzate inhibited allen HPPD with an IC value of 1.2 ⁇ (Fig. 11).
  • HPPD of the present invention exhibits herbicide resistance and is very useful.
  • HP PD and HPPD gene of the present invention can be used for the production of plastoquinone Z tocopherol.

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Abstract

　本発明は、除草剤に対して高い抵抗性を有するｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼを提供することを目的とする。 　本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の遺伝子を提供する： （ａ）配列番号１で表される塩基配列の第１～１２９３塩基からなるポリヌクレオチドを含む、除草剤抵抗性ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、 （ｂ）配列番号１で表される塩基配列の第１～１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。

Description

明 細 書
除草剤抵抗性遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、除草剤抵抗性酵素、特に、 p—ヒドロキシピルビン酸ジォキシゲナーゼを 標的とする除草剤に抵抗性の酵素に関する。
背景技術
[0002] p—ヒドロキシピルビン酸ジォキシゲナーゼ（以下、 HPPDと称する）は、 p—ヒドロキ シフエ-ルビルビン酸 (以下、 HPPと称する)と分子酸素とからのホモゲンチジン酸 (2, 5-ジヒドロキシフエ-ル酢酸)の形成を触媒する。植物においては、この酵素は、ブラ ストキノン、 α—トコフエロール (ビタミン E)等の生合成に関与している（図 1)。さらに、 この酵素は最近、いくつかの除草剤の分子標的であることが判明した。
[0003] 植物の HPPDをコードする遺伝子（以下、 HPPD遺伝子と称することもある）の全長 あるいは部分配列は、ニンジン、シロイヌナズナ、ォォムギ、トウモロコシ、イネ、 -シ キジソ、アベナ、コムギ、ビロードキビ類、シンクリノィガ、ライグラス、ォ-ゥシノケダサ 、アキノエノコログサ、ォヒシバ、ソルガムにおいて明らかになつている（非特許文献 1
) ο
[0004] HPPDを阻害する除草剤は、植物におけるプラストキノンの生合成を阻害し、その 結果カロチノイドの減少、葉緑体の発達停止および白化が起こる。また、植物におけ るプラストキノン含量の低下は、光合成電子伝達系にも影響を及ぼし、植物の生育抑 制症状を引き起こすと考えられている。
[0005] プラストキノン生合成系のもう一つの産物であるトコフエロールは、フリーラジカルの 消去剤として作用する。したがって、植物におけるトコフエロール含量の低下は、脂質 過酸ィ匕を引き起こし、これはネクロシス症状を導く。また、トコフエロール含量の低下 は植物の光合成能力の低下を引き起こすと考えられて!/ヽる。
[0006] HPPD阻害剤はこのような様々な作用により、雑草を枯死させると考えられる。した がって、 HPPDは、強力な除草剤の分子標的としてきわめて有効である。
[0007] HPPDを阻害する除草剤は、化学構造にしたがって、トリケトン (シクロへキサンジ オン）系、イソキサゾール系、ピラゾール系およびビシクロオクタンジオン（BOD)系の 4系統に分類される。この中でも、ピラゾール系のピラゾレートは高い除草活性を有す ることが知られている。ピラゾレートは、加水分解されて、その除草剤としての活性本 体のデトシルビラゾレート（以下、 DTPと称する）となる（図 2)。また、ビシクロオクタン ジオン（BOD)系のベンゾビシクロンも、その加水分解物が活性本体である。
[0008] HPPDを標的とする除草剤に対して抵抗性の酵素が報告されている (特許文献 1 および 2)。特許文献 1に開示の HPPDは除草剤抵抗性の度合いは従来公知の HP PDと比較して 2— 4. 5倍ときわめて低い。特許文献 2に開示の HPPDも従来公知の HPPDと比較して数倍の抵抗性に過ぎないと考えられ、また、該 HPPDは野生型 H PPDに突然変異を導入した変異型酵素である。突然変異を導入しなくても高い除草 剤抵抗性を有する植物由来の HPPDは知られて 、な 、。
[0009] また、従来知られて!/、る HPPD抵抗性植物を作成する方法は、 、ずれも HPPDを 植物体内で過剰発現させることにより、酵素量を増加させて抵抗性を付与するという ものであった。酵素自体が高い除草剤抵抗性を有する植物由来の野生型の酵素を 用いることによる、除草剤抵抗性植物の作成方法は今まで成功して 、な 、。
[0010] さらに、 HPPD遺伝子は、トコフエロールおよびプラストキノン生合成系の遺伝子と しても有用であるため、除草剤抵抗性植物の作成に有用であるだけでなぐトコフエ口 ールゃプラストキノンのような有用化合物生産のための遺伝子としても有用である。 特許文献 1：特表 2004— 528821号公報
特許文献 2：特表 2001— 522608号公報
非特許文献 1 :植物の生長調節、 vol.27, No.2、 pl46- 155、 2002
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明は、きわめて高い除草剤抵抗性を有する HPPDを提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らはォゥレン培養細胞がピラゾレートの活性本体である DTP (デトシルビ ラゾレート）に対して抵抗性を有することを見いだし、ォゥレン力も HPPD遺伝子を単 離した。本発明者らはさらに、該 HPPD遺伝子を大腸菌で発現させ、その活性を測 定した結果、 DTPに対して、従来知られている HPPDの約 500倍高い抵抗性を示す ことを明らかにした。該 HPPDは、ベンゾビシクロンの加水分解物に対しても高い抵 抗性を示した。
[0013] すなわち本発明は、
以下の (a)または (b)の遺伝子を提供する：
(a)配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオチドを含 む、除草剤抵抗性 p -ヒドロキシフエ二ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素をコード する遺伝子、
(b)配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオチドとスト リンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、除草剤抵抗性 p—ヒドロキシフエ-ル ピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
[0014] 本発明による除草剤抵抗性 HPPDのオープンリーディングフレーム（ORF)は塩基 番号 1〜1290力らなる。したがって、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド 1〜1290 からなる遺伝子を提供する。なお、該 ORFと終止コドンの 3塩基を含むコード領域は 、ヌクレオチド 1〜1293からなる。本発明は、配列番号 1の塩基番号 1〜1290に相 当する領域を含む限り、いずれの遺伝子もその範囲に含む。
[0015] 本発明は、配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオ チドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、除草剤抵抗性 HPPDをコー ドするポリヌクレオチドを含む遺伝子も提供する。なお、本発明においてストリンジヱン トなハイブリダィゼーシヨン条件とは、 6M尿素、 0.4% SDS、 0.5x SSCの条件またはこ れと同等のストリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を指す。
[0016] また、本発明は、配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌ クレオチドにおいて 1もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加され た塩基配列力 なり、かつ除草剤抵抗性 HPPDをコードするポリヌクレオチドを含む 遺伝子も提供する。ここで、 「1もしくは数個の塩基または塩基対」とは、部位特異的 突然変異誘発法等の公知の変異導入法により置換、欠失、挿入、及び Zまたは付 加できる程度の数の塩基または塩基対を意味する。 [0017] 本発明はまた、配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌク レオチドとヌクレオチドレベルで 70%以上の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性 HP PDをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も提供する。ヌクレオチド配列の相同 性は好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、 85%以上、 90%以上、さらに好 ましくは、 92%以上、 95%以上、 98%以上である。配列の同一性は、 FASTA検索（ Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448) や BLASTN検索により決定することができる。
[0018] さらに本発明は、以下の（c)または（d)の p—ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシ ゲナーゼ酵素を提供する：
(c)配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なる除草剤抵抗性 p—ヒドロキシフヱニル ピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素、
(d)配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置 換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ除草剤抵抗性である P—ヒドロキシフ ェ-ルピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素。
[0019] 上記の「1もしくは数個のアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変 異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加できる程度の数のァ ミノ酸を意味する。また、変異タンパク質は、公知の変異タンパク質作製法等により人 為的に導入された変異を有するタンパク質、および、天然に存在する同様の単離さ れた配列番号 2と比較して変異を有するタンパク質を含む。
[0020] 本発明は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質、配列番号 2で表 されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された アミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性 HPPDとして作用するタンパク質、ならびに 、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで 72%以上 の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性 HPPDとして作用するタンパク質を提供する。 さらに本発明は、本発明の HPPD遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する 。ここで、「1もしくは数個のアミノ酸」なる語は上記の通りの意味である。アミノ酸配列 の相同性は好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、 85%以上、 90%以上、 さらに好ましくは、 95%以上、 98%以上である。配列の同一性は、 FASTA検索（Pea rson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444- 2448)や BL
ASTP検索により決定することができる。
[0021] 本発明の除草剤抵抗性 HPPDは、 HPPDを標的とする除草剤、例えば、ピラゾー ル系のピラゾレート（その活性本体である DTP)、およびビシクロオクタンジオン系の ベンゾビシクロン、に対する除草剤抵抗性を植物に付与するのに有用である。
[0022] 好ましくは本発明によって提供される除草剤抵抗性 HPPDは、デトシルビラゾレート
(DTP)の、該 HPPDに対する IC が 4. 05 μ Μ以上のもの、例えば 4. 05〜： L0. 03
50
μ Μのものである。
好ましくは本発明によって提供される除草剤抵抗性 HPPDはォゥレン由来である。
[0023] 本発明はまた、本発明の HPPD遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクター を含む形質転換植物細胞、および、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物を提 供する。
[0024] 形質転換される植物の具体例としては、ダイズ、イネ、ナタネ、ヮタ、ジャガイモ、トマ ト、タバコ、ォォムギ、コムギ、トウモロコシなどが挙げられ、好ましくはダイズ、イネであ る。
[0025] さらに本発明は、 HPPD遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質 転換した植物細胞を再分化させて植物体を得る工程を含む HPPD阻害除草剤抵抗 性植物の製造方法を提供する。
ここで、「形質転換植物」なる語は、形質転換された植物体、植物器官、植物組織 および植物培養細胞のすべてを含む。
[0026] 本発明はまた、形質転換植物を栽培する圃場における雑草の駆除方法であって、 該形質転 ^¾物を実質的に変化させることなぐかつ、標的とする雑草を駆除するの に有効量の HPPD阻害除草剤を圃場に施用することを含む方法を提供する。好まし くは該 HPPD阻害除草剤はピラゾレートおよびベンゾビシクロンである。
発明の効果
[0027] 本発明の HPPD遺伝子を用いて、 HPPDを阻害する除草剤に対して植物に抵抗 性を付与することが可能である。 HPPDを阻害する除草剤は非選択的阻害剤として 知られていることから、本発明の HPPD遺伝子は広範囲の作物に除草剤抵抗性を与 え得る。また、 HPPDはプラストキノンやトコフエロール生合成系の重要な酵素である ため、本発明の HPPD遺伝子はこれら有用化合物生合成系の代謝工学にも有用で ありうる。
[0028] また、本発明により、除草作業の軽減が期待される。さらに、本発明の HPPD遺伝 子を含む組み換え微生物あるいは、組み換え植物は、トコフエロール zプラストキノン 等の有用ビタミン類の生産において有用であり得る。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]図 1は、 HPPDに触媒される反応およびプラストキノン生合成の阻害を示す図 である。
[図 2]図 2は、 HPPD阻害剤の構造を示す図である。 a :ピラゾレートは加水分解され、 活性型のデトシルビラゾレート (DTP)となる。 b：トリケトン型の HPPD阻害剤。
[図 3]図 3は、タバコ培養細胞の生長に対する DTPの効果を示す図である。タバコに ぉ 、て DTPは顕著な生育阻害を示した。
[図 4]図 4は、ォゥレン培養細胞の生長に対する DTPの効果を示す図である。ォウレ ンには DTPは阻害作用を示さな力つた。
[図 5]図 5は、ォゥレンから単離された HPPDと他生物種から単離された HPPD配列 の部分比較を示す図である。図中、三角は、鉄結合残基を示す。また、活性部位を 枠で示す。
[図 6]図 6は、 HPPDの系統榭を示す図である。
[図 7]図 7は、大腸菌で発現させたォゥレン HPPDの SDS— PAGEを示す図である。 レーン 1 :分子量マーカー、レーン 2 :コントロールベクター（pET-21d)、レーン 3 :HPP D0矢印は予測された組換え HPPDの産生を示す。
[図 8]図 8は、組換え HPPDによる反応産物の LC— MS解析を示す図である。
[図 9]図 9は、ニンジン培養細胞由来の HPPDに対するピラゾレートならびに DTPの 阻害効果を示す図である。阻害剤のな!、ときの活性は 4.9nmolホモゲンチジン酸 Z分 Zmgタンパク質である。〇はピラゾレート、參は DTPを示す。この図からニンジンの H PPDに対する DTPの IC は 13nMであることがわかる（Hiroshi Matsumoto et al.， 200
50
2)o [図 10]図 10は、ォゥレン HPPDに対する DTPの効果を示す図である。阻害剤を含ま ない場合の酵素活性は 3.8nmolZ分 Zmgタンパク質であった。阻害曲線から、ォウレ ン HPPDの IC は 6.75 μ Μ (ニンジンの場合の約 500倍）であることがわかる。
50
[図 11]図 11は、ォゥレン HPPDに対するベンゾビシクロン加水分解物の効果を示す 図である。阻害曲線から、ォゥレン HPPDの IC は 1.2 μ Μであることがわかる。
50
発明を実施するための最良の形態
[0030] 本発明にお ヽて、除草剤抵抗性 HPPDとは、 HPPDを標的とする除草剤、例えば DTPの、 HPPDに対する IC 力 従来知られて!/、る-ンジン由来の HPPD (Garcia,
50
I et al.， Biochemical Journal (1997) vol.325, 761-769)に対する IC の 10倍以上、好
50
ましくは 50倍以上、より好ましくは 100倍以上、さらに好ましくは 500倍以上である H PPDを意味する。ここで、 IC とは、 HPPD酵素活性を 50%阻害する除草剤、例え
50
ば DTPの濃度である。したがって、本発明の HPPDを含まない雑草等の植物を枯死 させるのに実質的に十分な濃度の除草剤を施用した場合であっても、本発明の HPP Dを有する植物、好ましくは農業用有用な作物は、枯死しない。したがって本発明の 除草剤抵抗性 HPPDは、有用な作物を枯死させることなぐ雑草のみを除草すること を可能とするものである。
[0031] 以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の HPPD遣伝子
本発明は、除草剤抵抗性 HPPD遺伝子を提供する。
本発明者らは、キンポゥゲ科のセリバオウレン（Coptis japonica)の培養細胞から HP PD遺伝子を単離し、その配列決定を行った (配列番号 1)。
[0032] 本発明の HPPD遺伝子は好ましくは、配列番号 1に示す塩基配列の塩基第 1〜第 1293からなるポリヌクレオチドである力 この部分に相当する部分が含まれる限り、い ずれの遺伝子であってもよ 、。配列番号 1に示す塩基配列力 なるポリヌクレオチド は、ォゥレン培養細胞力 従来公知の方法によって調製した cDNAライブラリ一力 得 ることが出来る。
[0033] 本発明はまた、配列番号 2の除草剤抵抗性 HPPDとして作用するタンパク質と機能 的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ここで「除草剤抵抗性 HPPD として作用するタンパク質と機能的に同等タンパク質」とは、配列番号 2のタンパク質 と同等の生物学的機能を有する、即ち、 HPPD酵素活性を有し、かつ、先に定義し た除草剤抵抗性を示すタンパク質であることを ヽぅ。
[0034] 本発明の遺伝子には、例えば、配列番号 2のアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列力 なるタンパ ク質をコードする突然変異体、誘導体、バリアントおよびホモログが含まれる。
[0035] アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする遺伝子を調製するための方法は 当業者によく知られており、例えば、部位特異的突然変異誘発 (site-directed mutag enesis)法（Kramer, W. & Fritz,H.- J. Methods in Enzymology, 154: 350-367(1987)) が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変 異することは、 自然界においても生じ得る。このように本発明の HPPD (配列番号 2) をコードするアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付カロ したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、天然のものであっても、 配列番号 2の除草剤抵抗性 HPPDと同等の機能を有するタンパク質をコードする限 り、本発明の遺伝子に含まれる。また、塩基配列の変異によって、タンパク質中のアミ ノ酸が変化しな 、場合 (縮重変異)もある。このような縮重変異体も本発明の遺伝子 に含まれる。本発明の HPPD遺伝子を構成する DNAの、配列番号 1の配列と比較し て変異した塩基の数は、アミノ酸レベルにおいて、 30アミノ酸以内、好ましくは 20アミ ノ酸以内、さらに好ましくは 10アミノ酸以内、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内、 2アミノ酸以内）の変異をもたらすものである。
[0036] 本発明の HPPD遺伝子を獲得する方法は特に限定されるものではなぐ従来公知 の方法が採用される。例えば、該遺伝子は、ゲノム DNA、 cDNAライブラリーなどから 適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明の除草剤抵抗性 HPPD 遺伝子には、ゲノム DNA、 cDNA、および化学合成 DNAが含まれる。ゲノム DNAおよ び cDNAの調製方法は、当業者に周知である。本発明の HPPDをコードするゲノム D NAは、例えば、植物細胞または組織力もゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる）を作成 し、本発明のタンパク質をコードする DNA (配列番号 1)を基に調製したプローブを用 いて、該ライブラリーのスクリーニング（例えば、コロニーハイブリダィゼーシヨンあるい はプラークハイブリダィゼーシヨン)を行う方法により調製することが可能である。
[0037] また、本発明の HPPD遺伝子は、配列番号 1の配列に特異的なプライマーを作成 し、これを利用した PCRを行う方法によって調製することも可能である。また、本発明 の HPPDをコードする cDNAは、例えば、植物細胞または組織力も抽出した mRNAを 基に cDNAを合成し、これを λ ZAP等のベクターに挿入して cDNAライブラリーを作成 し、該ライブラリーのスクリーニング (例えば、コロニーハイブリダィゼーシヨンあるいは プラークハイブリダィゼーシヨン)を行う方法により、また、 PCR法により調製することが 可能である。
[0038] 本発明の除草剤抵抗性 HPPD遺伝子は、例えば、トコフエロール Zプラストキノン 生合成経路を増強することにより、トコフエロール Zプラストキノン等の有用ビタミン類 の大量生産に利用することが可能である。
[0039] 除苣剤抵杭件 HPPD コー する遣伝早の全長 cDNAの単離方法
本発明の HPPD遺伝子は、ォゥレン培養細胞由来である。したがってォゥレン由来 の該 HPPD遺伝子を用いて、ォゥレン以外の植物から除草剤抵抗性 HPPD遺伝子 の全長 cDNAをクローユングすることが可能である。この場合のクローユング方法とし ても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。こ こで、得られた遺伝子が除草剤抵抗性 HPPDとしての機能を有するタンパク質をコ ードするか否かは、当業者により一般的に行われているようにして判定できる。まず、 得られた遺伝子にコードされるタンパク質力 HPPと酸素力もホモゲンチジン酸の生 成を触媒する HPPD酵素活性を有するか否かは、当業者に周知の酵素活性測定方 法により確認することができる。次いで、種々の濃度の除草剤、例えば DTPの存在下 に HPPD酵素活性を測定し、その酵素活性を 50%阻害する除草剤の濃度 (IC )を
50 決定することにより判定できる。 HPPD酵素活性の測定、および、 DTPに対する IC
50 の評価は実施例に記載のように行うことが出来る。
[0040] 本発明の遺伝子は定法に従い、多くの植物力も単離することができる。また、本発 明の遺伝子は、ホスファイトトリエステル法 (H.Hunkapiller et al, Nature, vol.310, p.10 5-111、 1984)等の一般的な方法により、化学合成して得ることもできる。 [0041] 具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている植物力 HPPD 遺伝子を取得する場合、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に対して相同性のあ る塩基配列をデータベース中力 検索すればよい。例えば、 BLASTN等のアルゴリズ ムによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。
[0042] また、ゲノムがデータベース化されて 、な 、植物から HPPD遺伝子を取得する場合 、例えば、従来公知の DNAライブラリーを用いたノヽイブリダィゼーシヨン法を用いるこ ともできる。具体的には、適切なクローユングベクターを使用してゲノムライブラリ一又 は cDNAライブラリーを調製する工程と、配列番号 1のポリヌクレオチドの少なくとも一 部をプローブとして用いてハイブリダィゼーシヨンを行 、、該プローブにハイブリダィ ズする断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明の HPPD遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、 HPPD 遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポ リヌクレオチドの長さは、 lOObp以上が好ましい。
[0043] より具体的には、本発明の除草剤抵抗性 HPPD遺伝子を調製するために、当業者 によく知られた方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（Southern, E.M. Journal of Molecular Biology, 98, 503(1975))やポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術（Saiki, R. K. et al. Science, 230, 1350-1354(1985)、 Saiki, R. K. et al. Science, 239,487-491(1988 ))が挙げられる。即ち、本発明の HPPD遺伝子 (配列番号 1)もしくはその一部をプロ ーブとして、また該遺伝子に特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライ マーとして、植物細胞カも該遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離することが 可能である。このようにハイブリダィゼーシヨン技術や PCR技術により単離しうる、本発 明の除草剤抵抗性 HPPDと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もま た本発明に含まれる。
[0044] このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブ リダィゼーシヨン反応を行う。本発明にお 、てストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン 条件とは、上記のように、 6M尿素、 0.4% SDS、 0.5x SSCの条件またはこれと同等のス トリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を指す。よりストリンジエンシーの高 ヽ 条件、例えば、 6M尿素、 0.4% SDS、 O.lx SSCの条件を用いれば、より相同性の高い 遺伝子を効率的に単離することができる。こうして単離された遺伝子は、アミノ酸レべ ルにおいて、本発明のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2)と高い相同性を有する と考えられる。ここで、高い相同性とは、アミノ酸レベルで、少なくとも 72%以上、さら に好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上（例えば、 85%以上）の配列の同 一性を指す。配列の同一性は、 FASTA検索 (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444- 2448)や BLASTP検索により決定することができ る。
[0045] 形皙転椽細胞の作製方法
本発明の遺伝子を発現する形質転換植物を作製する方法は、本発明の HPPD遺 伝子を適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形 質転換植物細胞を再生させることを含む。
[0046] また、本発明の形質転換細胞は、本発明の HPPD遺伝子または組換えベクターが 導入された細胞である。ここで、「遺伝子または組換えベクターが導入された」とは、 公知の遺伝子操作技術により、遺伝子または組換えベクター力 例えばプロモータ 一の作用により、発現可能に宿主内に導入されることを意味する。
[0047] 本発明の形質転換細胞は、本発明の HPPD遺伝子を直接宿主に導入すること、あ るいは該遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上 記宿主は、特に限定されず、例えば、除草剤抵抗性植物の作成のためには植物、有 用ビタミン類生合成のためには酵母、大腸菌などの微生物などが挙げられる。なお、 形質転換は一過性でもよ 、が、好ましくは安定に HPPD遺伝子が組み込まれるもの である。
[0048] 得られた遺伝子は、植物に導入する場合は、植物にて発現を引き起こすことができ るプロモーターに連結して使用する。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラヮ 一モザイクウィルスの 35Sプロモーター（CaMV35Sプロモーター）、ノパリンシンセター ゼのプロモーター、リブロース 2リン酸カノレボキシラーゼ Zォキシゲナーゼの小サブュ ニットのプロモーター等が挙げられる。
[0049] 本発明の形質転換細胞を作製するには当業者に公知の種々の方法を用いればよ い。かかる方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクト口ポーレーシヨン 法、ァグロバタテリゥムを介する方法、パーティクルガン法などが挙げられる。形質転 換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法 で行うことが可能である（Toki et al.， Plant Physiol. 100:1503-1507(1995)参照）。例え ば、形質転換植物体を作出する方法としては、ポリエチレングリコールによりプロトプ ラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfe r To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66- 74)、電気パルスによりプロトプ ラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 10 0, 1503-1507)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再 生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957- 962.)およびァグロバタ テリゥムを介して植物材料に遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法 (Hiei et al. ( 1994) Plant J. 6: 271-282.)などを挙げることができる。
[0050] ー且、ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該 植物体力も有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植 物体やその子孫あるいはクローン力 得た繁殖材料 (例えば、種子、果実、切穂、塊 茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を用いて該植物体を量産することも可能であ る。本発明には、本発明の遺伝子が導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該 植物体の子孫およびクローン、並びにそれら由来の繁殖材料も含まれる。
[0051] 本発明において使用することができるベクターとしては、従来から微生物や植物な どの形質転換に使用されているベクターを挙げることができる。かかるベクターは、本 発明の遺伝子またはその断片の他に、遺伝子の発現を可能とする構成的または誘 導性プロモーター、形質転換体の選抜を容易にする薬剤抵抗性遺伝子、ァグロパク テリゥムのバイナリ ベクター系に使用される複製開始点などを含んで 、てもよ!/、。
[0052] より具体的には、大腸菌などの微生物へ導入される場合には、 pBluescript系のベタ ターや、 pETベクターなどを使用することができる。植物細胞の形質転換に用いられ るベクターとしては、該細胞内で導入遺伝子を発現させることが可能なものであれば 特に制限はない。例えば、植物細胞内での構成的遺伝子発現を導くプロモーター（ 例えば、カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター）を有するベクターや誘導性 プロモーター（例えば、エチレン応答性 PR5dプロモーター、水分ストレス誘導性 rd29 Aプロモーター等）を有するベクターを用いることも可能である。また、薬剤抵抗性遺 伝子としてはアンピシリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、ハイグロマイ シン抵抗性遺伝子などを挙げることができる。
[0053] 複製開始点としては、 Ti又は Riプラスミド由来の複製開始点などを挙げることができ る。プロモーターに連結された DNAは、マイクロインジェクション法、エレクト口ポレー シヨン法、ポリエチレングリコール法、融合法等を用いて、植物細胞に直接導入するこ とが可能である。また、該 DNAを、植物への遺伝子導入用プラスミドベクターに組込 み、植物感染能のあるウィルスや細菌を介して間接的に植物細胞に導入することもで きる。力かるウィルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ジエミ-ウィルス 、タバコモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が使用でき、また、細菌としては、 ァグロバタテリゥム.ッメファシエンス（以下、 A.ッメファシエンスと略す）、ァグロバクテ リウム'リゾジエネス等を使用することができる。 A.ッメファシエンスを用いるァグロバタ テリゥム法により、植物への遺伝子導入を行う場合のプラスミドとして、例えば pBI101、 pBI121(いずれも Clontech社)等が挙げられる。
[0054] 本発明にお 、てベクターが導入される植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例 えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
[0055] 本発明の、 HPPD遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換し た植物を再分化させて植物体を得る工程を含む HPPD阻害除草剤抵抗性植物の製 造方法によれば、高い除草剤抵抗性を有する植物を得ることが出来る。
[0056] さらに、本発明により、ォゥレンおよびその他種々の植物（例えば、ケシ科植物（ノ、 ナビシソゥ、ケシ）、イネ科植物 (イネ、トウモロコシ）、ナス科植物（トマト、ジャガイモ） 、マメ科植物 (ダイズ)など)から、トコフエロール Zプラストキノンを大量産生させること も可能である。
[0057] 本発明のタンパク質、それをコードする遣伝子およびその利用法
本発明のタンパク質には、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換も しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ除草剤抵抗性 HPPD酵素として作用す るタンパク質、または、配列番号 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質とァミノ 酸レベルで 72%以上の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性 HPPD酵素として作用 するタンパク質が含まれる。
[0058] また、本発明のタンパク質に、タンパク質の精製や検出等を容易にするための公知 の HAや Flag等のタグを末端に融合させてもょ 、し、異種タンパク質と融合させてもよ い。また、本発明のタンパク質は N-グリコシルイ匕などの各種修飾を受けていてもよい
[0059] 本発明によるタンパク質は下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、 植物細胞を含む様々な起源から単離、精製したものでもよ ヽ。
[0060] 組み換え HPPDを調製する一般的方法は、本発明の HPPD遺伝子を適当な発現 ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発 現させたタンパク質を精製することを含む。組み換えタンパク質は、精製を容易にす るなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。融合タ ンパク質としては、例えば、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質 (米国 New England BioLabs社発売のベクター pMALシリーズ）、グルタチオン- S-トランスフェラー ゼ (GST)との融合タンパク質（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクター pGEX シリーズ）、ヒスチジンタグとの融合タンパク質（Novagen社の pETシリーズ）などが挙げ られる。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制 限はなぐ大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。宿主細 胞へのべクタ一の導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例え ば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法 (Mandel, M. & Higa , A. Journal of Molecular Biology, 53, 158—162(1970)、 Hanahan, D. Journal of Molec ular Biology, 166, 557-580(1983))を用いることができる。宿主細胞内で発現させた 組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法 により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を、マルトース結合タ ンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、ァフィユティー精製によ り容易に回収することが出来る。
[0061] 得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができ る。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質またはその一部をゥ サギなどの動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取することにより調製することが 可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質またはその一部で免疫し た動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一 クローンの細胞 (ハイプリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製する ことができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利 用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれ る。
[0062] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
実施例
[0063] 本発明者らは、ォゥレン培養細胞力 タバコ培養細胞よりも DTPに対してより抵抗 性であることを見いだした。図 3は、タバコ培養細胞の DTPの存在下での生育、図 4 はォゥレン培養細胞の DTPの存在下での生育を表すグラフである。
[0064] かかる知見に基づき、本発明者らはォゥレン細胞力 HPPDをコードする全長 cDN Aを単離した。本発明者らはォゥレン由来の HPPDcDNAのヌクレオチド配列を提供 する。該ヌクレオチド配列 (1293bp)は分子量 47.3kDaの 430アミノ酸残基からなるタン ノ ク質をコードし、その他の種からの HPPDと類似の特異的 C末端領域を有する。
[0065] 大腸菌にお 、て発現させた組換え HPPD遺伝子は、 p—ヒドロキシフエ-ルビルビ ン酸 (HPP)をホモゲンチジン酸に変換した。これはこの遺伝子が機能的 HPPDをコ ードすることを示す。組換え HPPDの酵素学的な分析により、 DTP (除草剤ビラゾレ ートの活性本体である）に対する IC 値は 6.75 μ Μであり、 ΗΡΡについての Km値は 4
50
3 μ Μであることが示された。この IC 値は従来報告されて!、る種々の植物由来の Η
50
PPDについての値と比べて劇的に高ぐ本発明の HPPDの除草剤抵抗性は従来既 知の植物（ニンジン）由来の HPPDと比べて約 500倍高かった。また、除草剤べンゾ ビシクロンの加水分解物に対する IC 値は 1.2 μ Μであった。
50
[0066] 実験手順
植物材料
ォゥレン培養細胞 (156-SMT)およびタバコ ΝΠ細胞を使用した。ォゥレン細胞は、 10 μ Mのナフタレン酢酸および 0.01 μ Μの 6-ベンジルアデ-ンを含有する LS (Linsmai er- Skoog)液体培地で培養した。タバコ細胞は 10 μ Μの ΝΑΑおよび 1 μ Μの力イネ チンを含有する LS液体培地で培養した。懸濁培養細胞を 100 mlの三角フラスコ、 20 mlの培地中で回転振盪培養器、 90 rpm.にて 25°C、ォゥレン細胞は暗所、タバコ細胞 は 3000 lux, 16-時間明条件の条件に維持した。除草剤 DTPを様々な濃度でメタノー ル溶液として液体培地に添加した。培養細胞の生育は DTPによる 3週間の処理の後 に 1つの 100 ml三角フラスコ中の総糸且織新鮮重量として測定した。
[0067] 試薬
p -ヒドロキシピルビン酸は Aldrichから購入した。ホモゲンチジン酸は Sigmaから購 入した。 DTPは三共製薬より譲り受けた。ベンゾビシクロン加水分解物は、エス'ディ 一.エス.ノィォテックより入手した。
[0068] ォゥレンの cDNAライブラリーからの HPPDの全長 cDNAの単離
ォゥレン培養細胞力も cDNAライブラリーを調製し、配列決定した。 1014の ESTを配 列決定し、これらの配列を BLASTXサーチを利用してその機能を推定した (http；〃 ww w.ncbi.nih.gov/BLAST. (E. Dubouzet et. al》。 BLASTXサーチにより、本発明者らは HPPDをコードする ESTクローンを見 、だした。このクローンのさらなる配列情報を得 るために全長 cDNA配列を決定することとした。
[0069] ォゥレンから HPPDの全長 cDNAを単離するために 5'RACEを GeneRacerキット (Invit rogen)を用いて行った。遺伝子特異的リバースプライマー (5'CATGCGTAGCGACAC ATCGCGCGGGGT3')を先に見!、だした ESTのヌクレオチド配列に基づ!/、て設計した 。 PCR断片を単離し、 pGEM T easyベクター (Promega)にサブクローユングし、そのヌ クレオチド配列を決定した。
[0070] 推定タンパク質配列のアラインメント分析
推定タンパク質配列を Clustal Wと Boxshade(www.ch.embnet.org/software/BOX fo rm.html.)を用いてアラインメントした。 Clustal Wは系統樹の算出にも用いた。
[0071] ォゥレン HPPD遺伝子を含む発現ベクター pET21dの構築
全長ォゥレン HPPD cDNAの PCR増幅を用い、トランジットペプチドを含まない成熟 ォゥレン HPPD用大腸菌用発現ベクターを pET21d中に構築した。 PCRには以下の オリゴヌクレオチドを用いた：
フォワードプライマー、 5'TACTAACCATGGTTCCCAGCACAGCCTCCA3' (配列番 号 3) (これには ATG翻訳開始コドンを含む Ncol制限部位を含めた (下線)； リバースプライマー、 5 'TATGAATTCTC AAATGC AACTATGC AGC AAC A3 ' (配列番 号 4) (これは cDNAの 3'末端と相補的であり、 TGA停止コドンの 6bp後に、 EcoRI制 限部位を含めた (下線)。
[0072] PCRを以下の条件で行った:最初の変性工程、 2分、 94°C; 15秒、 94°Cの変性、 30 秒、 56°Cのアニーリング、 2分、 68°Cの DNA伸長からなるサイクルを 30サイクル、そし て最後の 68°C、 5分の伸長、これには KOD-plus DNAポリメラーゼ (東洋紡)を用いた。 PCR断片を Ncolおよび EcoRI制限酵素で切断した pET21dベクター (Novagen)にサブ クロー-ングした。ォゥレン HPPD cDNA断片を pET21d中 T7ポリメラーゼプロモータ 一の制御下においた。 DNAインサートの両鎖を配列決定し、 PCR増幅中に突然変異 が導入されて 、な 、ことを確認した。
[0073] 大腸菌における組換えォゥレン HPPDの発現
ォゥレン HPPD発現プラスミド (pET21d)を大腸菌 BL21 (DE3)に導入した。これら組 換え大腸菌細胞を 100 mMのアンピシリンを含む LB培地 100 ml中で 30°Cで 120rpmに て培養した。 IPTG (イソプロピル- β -D-チォガラタトシド）を大腸菌の OD 力 とな
600
つた時点で終濃度 1 mMとなるように添加した。細胞をさらに 8時間 30°Cで培養した。
[0074] 細胞を 14,000 rpm、 5分、 4°Cの遠心分離によって回収した。ペレットを 5mlの抽出バ ッファー (50 mM Tris- HCI、 10 %グリセロール、 5 mM 2-メルカプトエタノール)に再懸 濁し、 Handy Sonic(UR- ZOP, TOMY SEIKO co. LTD)で超音波処理した (出力設定 5 で 15秒 x6回)。粗抽出物を 14,000 rpmで 5分遠心分離し、細胞フリーの上清を得た。 沈降したタンパク質を 14,000 rpm、 5分の遠心分離で除いた。上清を PD- 10カラム (Am ersham Bioscineces)で脱塩し、 HPPD酵素活性の測定に用いた。
[0075] タンパク質の電気泳動分析
組換えタンパク質を 10%アクリルアミドを含む SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で 分離した。タンパク質サンプルを 2XSDS- PAGE試料液 (0.125 M Tris- HC1, pH6.8, 20 %グリセロール、 10% 2—メルカプトエタノール、 4% SDS)で処理した。展開したゲルを クーマシーブリリアントブルー R-250で染色した。タンパク質濃度を標準としてゥシ血 清アルブミンを用いるブラッドフォード法により測定した。
[0076] 組換えォゥレン HPPDの酵素活性アツセィ
HPPD活性を HPLCおよび LC-MSで測定した。 100 Lの標準酵素反応混合物は 以下からなるものであった： 100 mMリン酸カリウムバッファー、 pH 6.5、 50 mMァスコル ビン酸、 10 L (37.18 gの脱塩タンパク質)の酵素調製物および 200 Mの P-ヒドロ キシフエ-ルビルビン酸 (pH7.7)。ただし p-ヒドロキシフエ-ルビルビン酸濃度は動力 学パラメーターの測定にあたっては 2 μ Μ -200 μ Μの様々な濃度とした。
[0077] 除草剤 DTPを該溶液に 0.5%ジメチルスルホキシド (DMSO)の溶液として添カ卩した。
反応混合物を 5分、 30°Cでインキュベートした。反応をトリクロ口酢酸 (終濃度 2%)の添 加により停止させた。タンパク質が沈降した後、反応生成物を逆相 HPLC (島津製作 所 LC-10Aシステムを装備）を用いて定量した。
[0078] TCA上清（50 μ 1または 20 μ 1)を C18カラムに注入し、流速 0.8 mL/分で溶出した。移 動相は 10mM酢酸-メタノール (85: 15 [Vol/Vol])であった。 HPPD活性のアツセィは、 形成されたホモゲンチジン酸の量の HPLCおよび 280 nmの UV吸光度による測定に 基づくものとした。ホモゲンチジン酸の定量はピーク面積の測定により行った。検量 線を用いてピーク面積をホモゲンチジン酸量に変換した。生成物であるホモゲンチジ ン酸の形成は LC- MS(LC- MS-2010,島津製作所、ネガティブモード、溶媒は 20 mM 酢酸アンモ-ゥム pH 5.5、流速は 0.5ml/分)で確認した。
[0079] 粗酵素の動力学定数を基質濃度を変動させることによって判定した。データは Kale idaGraph (Synergy Software, Reading, PA)を用いて非線形最小二乗反復法によって ミカエリスメンテン式に適合させた。
[0080] ベンゾビシクロン加水分解物を用いた HPPD阻害実験
ベンゾビシクロン加水分解物を用いた HPPD阻害実験は、以下の点を除 、ては、 DTPを用いた上記阻害実験と同様にして行った。
様々な濃度の阻害剤ベンゾビシクロン加水分解物と、酵素溶液 (100 mMリン酸カリ ゥムバッファー、 pH 6.5、 50 mMァスコルビン酸、 10 ^ L (37.18 μ gの脱塩タンパク質 )の酵素調製物)を、 30°Cで 5分間インキュベーションし、阻害剤と酵素との反応を十 分に行った後、基質（200 Mの p-ヒドロキシフヱ-ルビルビン酸 (pH7.7》を酵素溶液 に添加し、酵素反応を 10分間行った。生成物であるホモゲンチジン酸の形成は LC- MS(LC-MS-2010,島津製作所、ネガティブモード、溶媒は 20 mM酢酸アンモ-ゥム pH 5.5、流速は 0.5ml/分)で確認した。
[0081] 結果
DTPによる培養細胞の生育阻害
DTPによるタバコ、ォゥレンの培養細胞に対する生育阻害を調べた。タバコ培養細 胞に対して DTPは顕著な生育阻害を示し、 3、 30、 100 Mの DTPは、細胞重量を それぞれ 50. 8、 23. 8、 5. 5%にまで減少させた（図 3)。一方、 DTPは、ォゥレン培 養細胞に対しては 100 Mまでの濃度において、ほとんど生育阻害を示さな力つた（ 図 4)。したがって、ォゥレン培養細胞は HPPDを標的とする除草剤である DTPに対 して抵抗性を有することが明ら力となった。このことはォゥレン培養細胞の HPPDが除 草剤抵抗性であることを示唆するものであった。
[0082] HPPD様クローンの配列分析
cDNAライブラリーを大量のアルカロイドを産生するォゥレン細胞力も調製し、その 10 14の ESTを得た。 BLASTサーチ (hppt：〃 www.ncbi.nlmgov/blast/)によりこれら配列 決定されたクローンの中には HPPDのクローンが含まれて!/、ることが示された。この H PPDクローン中の cDNAインサートは約 1539bpの長さであり、その 3，末端にポリ (A)テ ィルを有して 、た。 、くつかのアミノ酸ドメインはォゥレン HPPDクローンの DNAインサ ートの推定アミノ酸配列とシロイヌナズナ配列との間で高度に保存されており、これら 2つのドメイン配列は互いに 80%の同一性を示した。これらの結果から、本発明者らは 、ォゥレン HPPDのインサートは HPPDの C末端部分をコードする部分 cDNAであると 推測した。それが全長 cDNAであるかを調べるために、本発明者らは cDNA-特異的 プライマーとォゥレン培養細胞から単離したトータル RNAを用いた 5'RACEにより全長 cDNAを単離した。
[0083] 単離されたォゥレン HPPDは 2183bp長であり 430-アミノ酸ポリペプチド (分子量 47.3 kDa)をコードする ORFを含んで!/、た。ォゥレン HPPDの ORFは 208bpの 5'非翻訳領域 と 194bpのポリ (A)を含む 3'非翻訳領域に挟まれていた。 [0084] ォゥレン HPPDとその他の種の HPPDのアラインメント (図 5)により、他の植物の HP PDとの高い同一性が示され、シロイヌナズナとの同一性が最高であり 71.0 %であった 。ヒト（30.5%)および S. avermilitis (32.4%)との同一性は低かった。ォゥレンを含む様々 な種の HPPD配列はタンパク質の C-末端領域での保存性が高力つた。トウモロコシ とシロイヌナズナからのタンパク質の活性部位であると考えられているアミノ酸残基は ォゥレン HPPD配列にお!/ヽても存在して!/、た。そしてその他の植物由来の HPPDと 同様にォゥレン HPPDもまたアミノ酸の N-末端延長を有して!/、たが、このォゥレンに おける延長はその他の植物におけるものより短かった。植物の HPPDは少なくとも 30 アミノ酸の延長を有する点で細菌および哺乳類の HPPDと N-末端において顕著に 異なっていると考えられている。これら残基は細胞内区画への標的化シグナル、即ち 、葉緑体への輸送シグナルである可能性がある。
[0085] 系統樹によると、 HPPDの原核生物と真核生物の両方の形態は同じタンパク質ファ ミリ一のメンバーであることが示された。ォゥレン HPPD、シロイヌナズナ HPPDおよ び A. theophrastiの HPPDは同一クラスター内にある (図 6)。
[0086] 大腸菌における HPPDの全長 cDNAの発現
アミノ酸配列により、単離された cDNAはォゥレン HPPDをコードすることが示唆され た。このクローンの実体を確認するために、組換えタンパク質を大腸菌で産生した。 本発明者らは HPPDの活性を調べるために大腸菌にぉ ヽて組換えタンパク質を産 生する発現ベクターを構築した。本発明者らは成熟ポリペプチドを産生させるために 大腸菌用発現ベクター pET-21dにおける開始コドンに適合するように cDNAに Ncol 部位を導入した。このコンストラクトを次いで大腸菌細胞に導入し、組換えタンパク質 の産生を誘導した。大腸菌酵素粗抽出液を PD-10カラムで脱塩し、脱塩した溶液を HPPD活性の検出に用いた。 SDS/PAGE分析は明らかにトランスジエニックな発現が 誘導されたことを示した。サブユニットの分子量はおよそ 51 kDaであると評価された（ 図 7)。
[0087] pET-HPPDコンストラクトを担持する大腸菌は液体培地と固体培地の両方で暗褐色 を示したのに対し、空の pET_21dベクターを担持する大腸菌はそのような暗褐色を示 さなかった（データ示さず)。同様の暗褐色の着色は他の起源の HPPDによっても観 察されている。この色素は、組換え HPPDによって合成されたホモゲンチジン酸の酸 化的重合の産物である。反応混合物を HPLC分析にかけたところ明らかに、組換え大 腸菌酵素粗抽出液は、ホモゲンチジン酸標準と全く同じ挙動を示すィ匕合物を産生し て！、ることが示された (図 8)。空の pET-21dベクターを含むコントロールの大腸菌可溶 化液では同じ位置でこのピークを生じな力つた。
[0088] これらの結果により、単離したォゥレン HPPD cDNAが機能的な HPPDをコードし ていることが示された。 LC-MS分析により、ホモゲンチジン酸が組換え大腸菌酵素粗 抽出液によって P—ヒドロキシフヱ-ルビルビン酸力 産生されていることが確認され た。
[0089] 組換え HPPDの特徴付け
HPPD活性が確認されたので、本発明者らはさらに脱塩した組換え酵素を用いて HPPDの酵素的特性を特徴づけた。
まず、本発明者らは p—ヒドロキシフヱ-ルビルビン酸を基質として用いて HPPD反 応についての pH条件を至適化した。様々な pHでの酵素アツセィにより、ホモゲンチ ジン酸への HPPの変換反応の最適 pHはおよそ 6.5であることが判明した。タイムコー ス研究により、ホモゲンチジン酸の蓄積は 10 1の脱塩酵素 (37.2 μ gタンパク質)と 20 0 μ Μの ρ—ヒドロキシフエ-ルビルビン酸の存在下では少なくとも 10分間直線的であ ることが判明した。最適温度は 30°Cであった。
[0090] 次に、組換え HPPDの基質親和性を HPPを基質として HPLC分析により測定した。
基質濃度を変動させたところ、反応はミカエリスメンテン型の動力学にしたがうもので あった。動力学パラメーターである Kmは 43.2 μ Μであると評価され、これはその他の 植物からの HPPDにつ!/、て報告されて 、る値よりも高かった。
[0091] DTPによる HPPD活性の阻害
DTPは HPPD阻害剤として作用することが知られている。 Matsumoto et al. (2002) は、ニンジン培養細胞からの高度に活性な抽出物を用いた HPPDアツセィにより、 D TPが HPPDを IC 値 13 nmol/Lにて阻害することを示した（図 9)。
50
[0092] DTPの組換えォゥレン HPPDに対する効果を検出するために、本発明者らは様々 な濃度の DTPの 0.5%ジメチルスルホキシド (DMSO)溶液を酵素反応液に添カ卩した後 、該酵素を添加した。 DTPはニンジン細胞抽出物よりも高い濃度にて組換えォゥレン HPPDに対する阻害を示した。 DTPはォゥレン HPPDを IC 値 6.75 Mにて阻害し
50
た（図 10)。これは、ォゥレンの HPPDがニンジンの HPPDよりも除草剤ピラゾレート の活性本体 DTPに対する抵抗性が約 500倍高いことを示す。
[0093] ベンゾビシクロン加水分解物を用いた HPPD阻害実験
ベンゾビシクロン加水分解物の組換えォゥレン HPPDに対する効果を検出するた めに、本発明者らは様々な濃度のベンゾビシクロン加水分解物溶液を酵素反応液に 添加した後、基質となる p—ヒドロキシフヱニルピルビン酸を添加した。酵素活性は、 ホモゲンチジン酸のピークエリア面積を元に、阻害剤ベンゾビシクロン加水分解物な しのときの活性を 100%とした相対活性として表示した。ベンゾビシクロン加水分解物 はォゥレン HPPDを IC 値 1.2 μ Μにて阻害した（図 11)。
50
産業上の利用可能性
[0094] 本発明の HPPDは、除草剤抵抗性を示し、非常に有用なものである。本発明の HP PDおよび HPPD遺伝子は、プラストキノン Zトコフエロールの生産に利用することが できる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)または (b)の遺伝子：
(a)配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオチドを含 む、除草剤抵抗性 p -ヒドロキシフエ二ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素をコード する遺伝子、
(b)配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオチドとスト リンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、除草剤抵抗性 p ヒドロキシフエ-ル ピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
[2] 配列番号 1で表される塩基配列の第 1〜1293塩基力もなるポリヌクレオチドからな る除草剤抵抗性 P ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素をコードす る遺 子。
[3] デトシルビラゾレートの該 p ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素 に対する IC が 4. 05 μ Μ以上である、請求項 1または 2の遺伝子。
50
[4] ォゥレン由来である請求項 1から 3いずれかの遺伝子。
[5] 以下の（c)または（d)の ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素：
(c)配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なる除草剤抵抗性 p ヒドロキシフヱニル ピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素、
(d)配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置 換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ除草剤抵抗性である P ヒドロキシフ ェ-ルピルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素。
[6] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性 p ヒドロキシフヱ二ルビ ルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素。
[7] デトシルビラゾレートの該 p ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素 に対する IC が 4. 05 μ Μ以上である、請求項 5または 6の ρ ヒドロキシフエ-ルビ
50
ルビン酸ジォキシゲナーゼ酵素。
[8] ォゥレン由来である請求項 5から 7の!、ずれかの ρ -ヒドロキシフヱ-ルビルビン酸ジ ォキシゲナーゼ酵素。
[9] 請求項 1から 4の 、ずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
[10] 請求項 9の組換えベクターを含む形質転 ^¾物細胞。
[11] 請求項 10の形質転換植物細胞を含む形質転換植物。
[12] 請求項 1から 4の ヽずれかの遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該 形質転換した植物細胞を再分ィ匕させて植物体を得る工程を含む P—ヒドロキシフエ- ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ阻害除草剤抵抗性植物の製造方法。
[13] 請求項 11の形質転換植物を栽培する圃場における雑草の駆除方法であって、該 形質転換植物を実質的に変化させることなぐかつ、標的とする雑草を駆除するのに 有効量の P—ヒドロキシフエニルピルビン酸ジォキシゲナーゼ阻害除草剤を圃場に施 用することを含む方法。
[14] p—ヒドロキシフエ-ルビルビン酸ジォキシゲナーゼ阻害除草剤がピラゾレートであ る請求項 13の方法。
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