WO2005010053A1 - アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

例えば、式(1)で示されるアミノ化複合型糖鎖誘導体。(1)〔式中、R1は、-NH-(CO)-CH2X、-NH-(CO)-(CH2)b-CH2X、イソチオシアネート基、-NH-(CO)a-(CH2)b-CO2H、-NH-(CO)a-(CH2)b-CHOを示す。Xはハロゲン原子、aは0または1であり、bは1～4の整数を示す。R2およびR3は、水素原子、明細書中に示す式(2)～(5)で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、R2およびR3が共に水素原子または式(5)である場合、R2あるいはR3が水素原子であって残りのR2あるいはR3が式(5)である場合を除く｡〕

Description

明 細 書 アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法 技術分野

本発明は、 1一アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖誘導体 （以下、 ァミノ 化複合型糖鎖誘導体という） および糖鎖べプチドに関する。 背景技術

生体内に存在するペプチド （タンパク質） の多くは、 糖鎖を有している。 糖鎖 とは、 単糖と単糖がグリコシル結合という結合を介して鎖状に結合したもので図 1に示したように表されている。

ペプチド （タンパク質） と結合している糖鎖はそのアミノ酸との結合様式から 大きく 2種類に分類されている。 ァスパラギン （A s n ) の側鎖に結合したァス パラギン結合型 （N—結合型） とセリン （S e r )、 スレオニン （T h r ) の側 鎖水酸基に結合したムチン結合型 （O—結合型） である。 すべてのァスパラギン 結合型糖鎖は 5つの糖残基からなる基本骨格をもち、 結合する糖鎖の非還元末端 の糖残基の種類によって、 図 2に示すように高マンノース型、 複合型、 混成型の サブグループに分類される。

このような糖鎖は、 ペプチド （タンパク質） と結合しその分子の表面を覆うこ とでペプチド （タンパク質） の溶解性を調節したり、 プロテアーゼへの耐性を付 加し、 血中からの代謝を遅延させるだけでなくペプチド （タンパク質） の 3次元 構造を維持するために働く。

代表的な例として、 ヒ卜のエリスロポエチン （E P O) という糖鎖ペプチド (糖タンパク質） がある。 この糖鎖ペプチド （糖タンパク質） は、 複合型ァスパ ラギン結合型糖鎖を有しており、 赤血球系前駆細胞に作用しその増殖 ·分化を促 進することにより、 末梢血中の赤血球数を維持する機能を持った血球分化ホルモ ンである。 ペプチド （タンパク質） 上の糖鎖構造と生理活性の相関についていろ いろ研究され、 in vitroでは糖鎖が結合していない EPOでも生理活性を有する が、 in vivoでは糖鎖がないと生理活性がないということが判明した。

このような糖鎖ペプチド （糖タンパク質） だけでなくさまざまなペプチド （夕 ンパク質） を医薬品として用いる研究が展開されているが、 依然として解決すベ き問題点がある。 ペプチド （タンパク質） 製剤などが血中でタンパク質分解酵素 (ぺプチダ一ゼ） などにより簡単に分解し代謝されるために、 十分な血中濃度を 維持できないということである。

本発明の目的は、 十分な血中濃度を維持可能なアミノ化複合型糖鎖誘導体およ び糖鎖べプチドを提供することにある。 発明の開示

本発明は、 以下の発明に係る。

1. ァミノ化複合型糖鎖誘導体。

2. 式 （1) で示されるアミノ化複合型糖鎖誘導体 _t

〔式中、 R¹は、 一 NH— (CO) 一 CH₂X、 -NH- (CO) 一 (CH₂) _b — CH₂X、 イソチオシァネート基、 一 NH— (CO) _a- (CH₂) _b— C〇₂H、 -NH- (CO) _a— (CH₂) _b— CH〇を示す。 Xはハロゲン原子、 aは 0ま たは 1であり、 bは 1〜4の整数を示す。 R ²および R ³は、 水素原子、 式

(2) 〜 （5) で示される基であり、 同一でも異なっていてもよい。 ただし、 R ²および R³が共に水素原子または式 （5) である場合、 R²あるいは R³が水素 原子であって残りの R²あるいは R³が式 （5) である場合を除く。〕

3. R¹がー NH—ハロゲン化ァセチル基である上記に記載のアミノ化複合型 糖鎖誘導体。

4. 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とァミノ酸のチオール基が結合した糖鎖べ プチド。

5. 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基を結合させること を特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。 6. 上記アミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖べ プチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。

7. 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、 次いで上記アミノ化複合型糖鎖 誘導体を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。

8. 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、 次いで上記アミノ化複合型糖鎖 誘導体を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ぺプ チド。

本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体は、 複合型ァスパラギン結合型糖鎖の 1位 の炭素に結合している水酸基を、 — NH— (CO) — CH₂X、 一 NH— (C O) ― (CH₂) _b— CH₂X、 イソチオシァネート基、 一 NH— (CO) _a - (CH₂) _b— C〇₂H、 — NH— (CO) _a— (CH₂) _b— CHO (Xはハロゲ ン原子、 aは 0または 1であり、 bは 1〜4の整数を示す。） のいずれかの基で 置換した化合物である。

複合型ァスパラギン結合型糖鎖は、 例えば式 （6) に示される糖鎖を挙げるこ とができる。

(式中、 R⁴および R⁵は、 水素原子、 上記式 （2) 〜 （5) で示される基であ り、 同一でも異なっていてもよい。 ただし、 R⁴および R⁵が共に水素原子また は式 （5) である場合、 R⁴あるいは R⁵が水素原子であって残りの R⁴あるいは R⁵が式 （5) である場合を除く。）

この複合型ァスパラギン結合型糖鎖は、 例えば、 国際公開公報 WO 03/ 008431号公報に従って合成することができる。 また、 糖タンパク質から酵 素により糖鎖を切り出す方法や化学的に切断する方法を使用してもよい。 酵素と しては、 グリコぺプチダーゼ Aや N—ダリカナ一ゼを使用できる。 化学的切断法 としては、 ヒドラジン分解により糖鎖を製造することができる。

アミノ化複合型糖鎖誘導体は、 複合型ァスパラギン結合型糖鎖の 1位の炭素に 結合している水酸基を、 一 NH— (CO) — CH₂X、 —NH— (CO) 一 (C H₂) _b— CH₂X、 イソチオシァネート基、 一 NH— (CO) _a— (CH₂) _b— C0₂H、 一 NH— (CO) _a- (CH₂) _b— CH〇 （Xはハロゲン原子、 aは 0または 1であり、 bは 1〜4の整数を示す。） のいずれかの基で置換した化合 物であり、 例えば、 下記式 （1) で示すことができる。 ここでハロゲン原子とし ては、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素を例示することができる。

( 1)

(式中、 ¹〜!^³は上記に同じである。）

アミノ化複合型糖鎖誘導体は、 公知の方法で製造することができるが、 例えば、 アミノ化複合型糖鎖誘導体に— NH— (CO) 一 (CH₂) _b— CH₂X、 イソチ オシァネート基、 一 NH— (CO) _a- (CH₂) _b— C〇₂H、 — NH— (C 〇） _a- (CH₂) _b-CHO (Xはハロゲン原子、 aは 0または 1であり、 bは ：[〜4の整数を示す。） を持つ化合物を反応させればよい。 具体的には、 R¹が 一 NH—プロモアセチル基の場合、 溶媒中、 縮合剤存在下、 1一アミノー複合型 ァスパラギン結合型糖鎖とブロモ酢酸を反応させる。 溶媒としては、 1ーァミノ 一複合型ァスパラギン結合型糖鎖、 ブロモ酢酸等が溶解するものであれば良く、 例えば、 水、 DMF等を挙げることができる。 縮合剤としては、 例えば 1—メシ チレンスルホニル— 3 _二卜ロー 1, 2, 4—トリァゾール （MSNT)、 ジシク 口へキシルカルポジイミ ド （DCC)、 ジイソプロピルカルポジイミ ド （D I P CD I ) 等を挙げることができ、 1一アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖 1 モルに対して、 縮合剤を 1〜10モル使用するのが好ましい。 また、 1ーァミノ 一複合型ァスパラギン結合型糖鎖 1モルに対して、 ブロモ酢酸を 1〜1 0モル使 用するのが好ましい。 反応は、 通常 0〜80°C、 好ましくは、 10〜60°C、 更 に好ましくは、 1 5〜35°Cで行うのが良く、 通常 30分〜 5時間で行うのが良 レ^ 反応終了後は、 適宜、 公知の方法 〔例えば、 高速液体カラムクロマトグラフ ィー （HPLC)〕 で精製するのが良い。

本発明の 1ーァミノ一複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖べプチド は、 任意のアミノ酸をペプチド結合したペプチドに、 該ペプチドのチオール基を 介して 1一アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合させた糖鎖ペプチドで ある。

本発明においてペプチドとは、 同種または異種のアミノ酸が 2個またはそれ以 上で、 互いに一方のカルボキシ基と他方のァミノ基との間で脱水して酸アミド結 合、 すなわちペプチド結合 （一 CO— NH—） を形成してできる化合物を言う。 約 10個以下のアミノ酸からなる比較的小さいものをオリゴペプチド、 それより も大きいものをポリペプチドという。 また、 ポリペプチドにはタンパク質を含む。 ペプチドは、 固相合成法、 液相合成法、 細胞による合成、 天然に存在するもの を分離抽出する方法等により得ることできる。

本発明の 1一アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチド は、 アミノ化複合型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドとを反応させるこ とにより製造することができる。 反応は、 通常 0〜80°C、 好ましくは、 10〜 60°C、 更に好ましくは、 1 5〜35°Cで行うのが良く、 通常 30分〜 5時間で 行うのが良い。 反応終了後は、 適宜、 公知の方法 [例えば、 高速液体カラムクロ マトグラフィー （HPLC)] で精製するのが良い。 具体的には、 アミノ化複合 型糖鎖誘導体をチオール基を有するペプチドをリン酸緩衝液中、 室温で反応させ る。 反応終了後、 HPLCで精製することにより本発明の 1ーァミノ—複合型ァ スパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチドを得ることができる。

また、 上記の製造方法により、 予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有 する糖鎖ペプチドにアミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、 複数の糖あるいは糖 鎖を有する 1ーァミノ一複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖

を得ることができる。

さらに、 予め糖あるいは糖鎖が結合したチオール基を有する糖鎖ペプチドにァ ミノ化複合型糖鎖誘導体を反応させ、 予め有していた糖あるいは糖鎖を切断する ことにより、 1—アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖べプチ ドを得ることができる。 この時、 予め有していた糖あるいは糖鎖を切断するには、 例えば、 酵素を使用して切断することが好ましい。 また、 アミノ化複合型糖鎖誘 導体の導入前でもよいし、 導入後でもよいが、 切断と同時にアミノ化複合型糖鎖 誘導体をペプチドに導入することが好ましい。 切断する酵素としては、 ペプチド と糖あるいは糖鎖の還元末端を切断する酵素 （糖加水分解酵素） であれば良く、 例えば、 P N G a s e F等を使用することができる。 反応は、 通常 0〜8 0 、 好ましくは、 1 0 ~ 6 0で、 更に好ましくは、 1 5〜3 5 で行うのが良く、 通 常 3 0分〜 5時間で行うのが良い。 反応終了後は、 適宜、 公知の方法 [例えば、 高速液体カラムクロマトグラフィー （H P L C ) ] で精製するのが良い。

本発明の 1 一アミノー複合型ァスパラギン結合型糖鎖を結合した糖鎖ペプチド は、 天然に存在する複合型ァスパラギン結合型糖鎖ペプチドよりも、 糖加水分解 酵素に対する耐性に優れている （分解されにくい）。 この為、 血中での安定性が 向上し、 血中寿命が延びる。

本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドは、 ペプチドのァ ミノ酸配列、 糖鎖の結合位置あるいは糖鎖の構造や種類が均一である為、 この糖 鎖ペプチドが生理活性分子である場合 （例えば、 抗体）、 生理活性分子の生理活 性は均一である。

本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、 ぺ プチドのチオール基に選択的にアミノ化複合型糖鎖誘導体を任意の位置に選択的 に複合型ァスパラギン結合型糖鎖を導入することができる。

本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、 高 分子量 （例えば、 分子量 1万以上） の糖鎖ペプチドを製造することができる。 本発明のアミノ化複合型糖鎖誘導体を結合した糖鎖ペプチドの製造方法は、 糖 鎖ペプチドのフォールディングを崩すことなく任意の複合型ァスパラギン結合型 糖鎖を任意の位置に選択的に導入することができる。 図面の簡単な説明

図 1は糖鎖の構造の 1例を示す図である。

図 2はァスパラギン結合型糖鎖の分類を示す図である。

図 3は An t i— CD 20キメラ抗体 （Mu t a n t) と An t i— CD 20 キメラ抗体 （Mu t an t) 糖鎖修飾体の電気泳動を示す図である。 発明を実施するための最良の形態

以下に参考例及び実施例を挙げ、 本発明を具体的に説明するが、 何らこれに限 定されるものではない。

参考例 1 (ジシァロ糖鎖ァスパラギンの合成）

粗精製の SGP (シァリルグリコペプチド） 50 Omgとアジ化ナトリウム 1 Omg (31 9 mo 1 ) をトリス—塩酸 ·塩化カルシウム緩衝溶液 （T R I Z MA BASE 0. 05mo l Z l、 塩化カルシウム 0. 0 1mo l Z l、 pH = 7. 5) 2 5m lに溶解させた。 これにァクチナ一ゼ一 E (タンパク質分解酵 素、 科研製薬） 5 Omgをトリス—塩酸 ·塩化カルシウム緩衝溶液 5m】 に溶 かした溶液を加え、 37°Cで静置した。 1 1 5時間後、 この溶液を凍結乾燥した。 この残留物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで 2回精製し、 ジシァ口糖鎖ァ スパラギンを 252mg得た。

!H-NMR (30。C) 6 5. 1 3 (s， 1 H, M a n 4 -H- 1 ), 5. 0 7 (d， 1H， J二 9. 5Hz， G 1 c N A c 1 - H - 1 )， 4. 95 (s， 1 H, Ma n 4-H- 1), 4. 7 7 (s， 1 H, Ma n 3 -H- 1), 4. 6 1 (d， 1 H， J = 7. 6Hz, G 1 c NAc 2 -H- 1), 4. 60 (d， 2 H, J = 7. 6 Hz， G 1 c NAc 5, 5— H_ l)， 4. 44 (d， 2 H, J = 8. 0 H z , G a 1 6 , 6 -H- 1 ), 4. 2 5 (bd， 1 H, M a n 3 -H- 2), 4. 20 (b d d, 1H， Man 4 -H- 2), 4. 12 (b d， 1 H, Ma n 4 -H- 2), 2. 94 (d d， 1H， J = 4. 5 H z , 1 7. 2 H z , As n— 3 CH)， 2. 8

5 (dd, 1H， J = 7. 0 H z , 17. 2 H z , As n— /3 CH)， 2. 67， 2. 66 (dd， 2 H, J = 4. 6 H z , 1 2.4Hz, Ne uAc 7， 7— H— 3 _{e q}), 2. 07 (s， 3H， Ac), 2. 06 (s, 6 H， A c X 2), 2. 02 (s，

6 H, Ac X 2), 2. 01 (s, 3 H, Ac), 1. 71 (dd， 2 H, J = 1 2. 4Hz, 12.4Hz, N e u A c 7 , 7 -H- 3 _ax)

参考例 2 (Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口糖鎖ァ スパラギンの合成）

参考例 1で得られたジシァ口糖鎖ァスパラギン 8 Omg (0. 034mmo 1) を蒸留水 2. 7m 1とアセトン 4. lm 1混合溶液に溶解させ、 これに 9—フ ルォレニルメチル— N—スクシ二ミジルカーボネー卜 （Fmo c -OS n) 34. 7mg (0. 103mmo 1 ) と炭酸水素ナトリウム 1 1. 5mg (0. 137m mo 1 ) を加え、 室温で 2時間攪拌した。 TL Cで反応終了を確認後この溶液を 減圧濃縮し、 アセトンを除去した。 残渣をォクタデシルシリル基を結合したシリ 力ゲルを充填したカラム （ODSカラム） にかけ精製し、 目的の Fmo c - ァロ糖鎖ァスパラギン 6 0. Img 収率 6 8 %を得た。

—匪 R ( 3 0°C)

8. 0 1 (2H, d， J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 8 0 (2 H, d， J = 7 5H z , Fmo c ), 7. 6 0 (2 H, d d, J = 7. 5 H z , Fmo c ), 7. 5 3 ( 2 H, d d， J = 7. 5 H z , Fmo c), 5. 2 3 ( 1 H, s , M a n 4 - H i) , 5. 0 9 ( 1 H， d， J = 9. 4H z , G 1 c NA c 1 -H^, 5. 0 4

( 1 H, s , M a n 4 -Hj), 4. 8 6 ( 1 H， s， M a n 3 -Hj), 4. 7 0 〜4. 6 6 (m， G l c NA c 2— G 1 c NA c 5 , 5 -H,), 4. 5 4

( 2 H, d, J = 7. 9 H z , G a 1 6 , 6 -Hj), 4. 44 ( 1 H, d, Fm o c CH), 4. 3 4 ( 1 H， b d， M a n 3— H₂)， 4. 2 9 , ( 1 H, b d， M n 4 -H₂), 4. 2 0 ( 1 H, b d, M a n 4 -H₂), 2. 7 7 ( 2 H， d d, N e u A c 7 , 7 -H_{3 e q}), 2. 8 0 ( 1 H, b d d, A s n - ^ CH), 2. 6 2 ( 1 H， b d d, A s n - β CH), 2. 1 4 ( 1 8 H， s X 6 , —A c)， 1. 8 0 (2 H, d d, N e u A c 7 , 7—H_{3 ax})

参考例 3 (HOOC— A r g— G l u -G 1 u— G l n-Ty r -C y s - S e r一 Th r— Ty r—A r g— V a 1 一 NH₂の合成）

固相合成用カラムに HMPA— P E GAレジン 3 7 Omgを入れ、 CH₂C 1 ₂, DMFで十分に洗浄し反応に用いた。

Fmo c— Ar g (O t B u) 一 OH、 1—メシチレンスルホニル一 3—ニトロ - 1, 2, 4一トリァゾール （MS NT), N—メチルイミダゾールを CH₂C 1₂ に溶解させ 5分間撹拌した後、 樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で 3時 間攪拌した。 攪拌後、 樹脂をメチレンクロライド、 イソプロパノール、 DMFで 洗浄し乾燥させた。 その後、 20分間 20 %無水酢酸 DMF溶液を用いて固相上 の未反応の水酸基をァセチル化しキヤッビングした。 DM Fで樹脂を洗浄後、 2 0%ピぺリジン DMF溶液を用いて 20分撹袢することにより Fmo c基を脱 保護しレジン— A r g— NH₂を得た。 DMFで洗浄後、 乾燥させた。

この樹脂に、 グルタミン酸 （G l u)、 グルタミン酸 （G 1 u)、 グルタミン (G 1 n)、 チロシン （Ty r)、 システィン （Cy s)、 セリン （S e r)、 スレ ォニン （Th r)、 チロシン （Ty r)、 アルギニン （A r g)、 ノ リン （V a 1) を同様に縮合および Fmo c基の脱保護を行って、 レジン— Ar g— G l u -G 1 u -G 1 n-Ty r -Cy s -S e r -Th r -Ty r-Ar g-Va 1 一 NH₂を得た。

グルタミン酸 （G 1 u)、 グルタミン （G 1 n)、 チロシン （Ty r )、 システ イン （Cy s)、 セリン （S e r)、 スレオニン （Th r)、 アルギニン （A r g)、 パリン （Va l ) のアミノ酸はカルボキシル基を p f pエステル化した F mo c -AA-Op f p (AA =アミノ酸） を用い、 3, 4—ジヒドロ一 4ーォ キソ— 1, 2, 3_ベンゾトリアジン— 3— y 1 (D h b t ) によって縮合させた。 すべての縮合は D M F溶液中で行つた。

樹脂を洗浄後、 95%TFA水溶液を加え、 室温で 3時間攪拌してレジンを切 断した。 レジンをろ過して除き、 反応溶液を室温で減圧濃縮した後、 水に溶かし 凍結乾燥した。

参考例 4 (HOOC-S e r -S e r -As n (d i s i a l o o l i g o) - Cy s -L e u-L e u-A l a -NH₂の合成）

固相合成用カラムに HMPA— PEGAレジン 37 Omgを入れ、 CH₂C 1 ₂, DMFで十分に洗浄し反応に用いた。

Fmo c - S e r (O t B u) _OH、 1—メシチレンスルホニルー 3—ニトロ - 1, 2, 4-卜リアゾール （MS NT), N—メチルイミダゾールを CH₂C 1 ₂ に溶解させ 5分間撹拌した後、 樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で 3時 間攪拌した。 攪拌後、 樹脂をメチレンクロライド、 イソプロパノール、 DMFで 洗浄し乾燥させた。 その後、 20分間 20 %無水酢酸 DMF溶液を用いて固相上 の未反応の水酸基をァセチル化しキヤッビングした。 DM Fで樹脂を洗浄後、 2 0%ピぺリジンノ DMF溶液を用いて 20分撹拌することにより Fmo c基を脱 保護しレジン— S e r— NH₂を得た。 DMFで洗浄後、 乾燥させた。

次に、 Fmo c _S e r (O t B u) — OHを用い HOB t · Η₂〇と D I P CD Iによって縮合させた。

次に、 参考例 2の Fmo c—ジシァ口糖鎖ァスパラギンを DMS〇、 DMF 1 対 1の混合溶媒に溶かし、 HATUと D I PEAを用いて室温 24時間攪拌させ て縮合させた。 DMFで洗浄後 1 0 %無水酢酸 2—プロパノール： メタノール で 20分間攪拌しキヤッビングした。 樹脂を 2—プロパノール、 DMFで洗浄後、 20 %ピぺリジン ZDMFで 20分間攪拌し Fmo c基を脱保護し DM Fで樹脂 を洗浄した。

この樹脂に、 システィン （Cy s；)、 ロイシン （L e u)、 ロイシン （L e u)、 ァラニン （A 1 a) を同様に縮合および Fmo c基の脱保護を行って、 レジン一 S e r— S e r— As n (d i s i a 1 o o 1 i g o — Cy s— L e u— L e u-A 1 a— NH₂を得た。

システィン （Cy s)、 ロイシン （L e u)、 ァラニン （A l a) のアミノ酸は カルボキシル基を p f pエステル化した Fmo c _AA— Op f p (AA =アミ ノ酸） を用い、 3, 4—ジヒドロ一4—ォキソ一 1, 2, 3—ベンゾトリアジン一 3 -y 1 (Dh b t) によって縮合させた。 すべての縮合は DMF溶液中で行つ た。

樹脂を洗浄後、 95%TFA水溶液を加え、 室温で 3時間攪袢してレジンを切 断した。 レジンをろ過して除き、 反応溶液を室温で減圧濃縮した後、 水に溶かし 凍結乾燥した。 凍結乾燥品を pH l 1水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、 ベンジ ルエステルを加水分解した後、 酢酸で中和し、 HP LCで精製することで目的と する HOOC— S e r - S e r - A s n (d i s i a 1 o o 1 i g o) — Cy s — L e u— L e u— A l a— NH₂を得た。 （YMC— P a c k A— 3 1 4 S - 5 OD S 3 0 0 X 6. 0 mm 展開溶媒 ： 0. 1 % T F Α水溶液 B ： 0. 1 %TF A ァセトニトリル：水 = 9 0 : 1 0 グラジェント A 1 0 0 % 0. 6 0m l /m i n→B 1 0 0 % 0. 6 0m l /m i n 6 0分）

参考例 5 (ジシァロ糖鎖合成）

S GP ( l O Omg) を 5 0 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0に溶かし P N G a s e F (B i o L a b s I n c. 1 U) を加えた。 3 7度 2 4時間ィンキュベ —卜し、 TL C ( I P A ： 1 M NH₄OAc = 1 ： 1 ) で反応終了を確認後、 凍結乾燥した。 凍結乾燥品をゲルろ過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e x G 2 5, 1. 5 cmX 3 0 cm, 水， 流速 1. 0 m 1 /m i n) で精製しジ シァロ糖鎖を収量 74mg得た。

δ 5. 2 8 (b d, 1 Η, G 1 c Ν A c 1— Η— 1 a)， 5. 2 3 ( s , 1 H， Ma n 4 -H- 1 ), 5. 0 3 ( s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 1 ), 4. 8 6 ( s， 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 7 0 (m, 3 H, G 1 c NA c 2 , 5, 5 ' — H — 1 ), 4. 5 3 (d, 2 H, G a 1 6 , 6， — H— 1)， 4. 34 (b s , 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 2 8 (b d， 1 H, M a n 4 -H- 2), 4. 2 0 (b d, 1 H， Ma n 4 ' -H- 2), 2. 7 6 (b d d, 2 H, N e u A c 7 , 7 ' 一 H - 3 e q), 2. 1 7 (s , 3H， A c ), 2. 1 6 ( s , 6 H， A c X 2), 2. 1 3 (s , 6 H, A c X 3), 1. 8 0 (d d, 2 H, N e u A c 7 , 7 ' —H - 3 a x)

参考例 6 (ァミノ化）

参考例 5のジシァ口糖鎖 （10mg) を飽和炭酸水素アンモニゥム水溶液に溶 かし濃度 3 OmMに調製した。 室温で反応させ常に飽和している状態を維持した。 7日間反応させ TLC ( I P A： 1 M NH₄OAc = 1 ： 1) で反応がほぼ終 了した後、 反応溶液をそのまま凍結乾燥した。 炭酸水素アンモニゥムを除くため に、 凍結乾燥を 3回繰り返しクルードの状態でァミノ化したジシァ口糖鎖を収量 9mg得た。

:H-NMR (400MHz, D₂0)

δ 5. 22 (s , 1Η, Ma n 4-H- 1), 5. 03 (s， 1 H， Ma n 4 ' -H- 1 ), 4. 86 (s , 1 H, M a n 3 -H- 1 ), 4. 69 (m, 3H， G 1 c NA c 2 , 5, 5 ' — H— 1)， 4. 53 ( d , 2 H, G 1 6 , 6， — H— 1), 4. 34 (b s， 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 28 (b d， 1 H， Man 4 -H- 2), 4. 23 (b d, 1 H， G 1 c N A c 1 - H— 1 ) , 4. 20 (b d， 1 H, M a n 4 ' — H - 2), 2. 76 (bd d, 2 H, N e u A c 7 , 7 ' 一 H - 3 e q), 2. 17 (s , 3 H, Ac), 2. 16 (s , 6 H, Ac X 2), 2. 1 2 (s， 6H, Ac X 3), 1. 80 (dd, 2 H, N e u A c 7 , 7 ' 一 H— 3 a x )

実施例 1 (プロモアセチル化）

参考例 6のァミノ化したジシァ口糖鎖 （クル一ド 5mg) を水 I O O Lに 溶かし炭酸水素ナトリウム 2 mgを加えた。 そこに、 DMF (100 1 ) に溶 かしたブロモ酢酸 6. 2mgと DCC4. 6 m gを加え室温で反応させた。 1. 5 時間後、 TLC (I PA ·· 1M NH₄OAc = 2 ： 1) で反応終了を確認し、 炭酸水素ナトリウムで中和し、 ろ過後、 減圧濃縮した。 続いて、 ゲルろ過カラム クロマトグラフィー （S e p h a d e x G 25 , 1. 5 cmX 30 cm, 水， 流速 1. Om l Zm i n) で精製しプロモアセチル化したジシァ口糖鎖を収量 4 mg、 収率 77 %で得た。

^-NMR (400MH z , D₂0)

δ 5. 22 (s， 1 H, Man 4 -H- 1 ), 5. 16 (b d， 1 H, G l cN A c 1 -H- 1 ), 5. 03 (s, 1 H, M a n 4 ' 一 H— 1), 4. 86 (s , 1 H, M a n 3 -H- 1 ), 4. 70 (m, 3H, G 1 c NA c 2 , 5， 5 ' — H - 1)， 4. 53 (d， 2H, G a 1 6, 6， — H— 1)， 4. 34 (b s， 1 H， M a n 3 -H- 2), 4. 28 (b d, 1 H, Man 4 -H- 2), 4. 20 (b d， 1H， M a n 4 ' — H— 2), 2. 77 (b dd， 2 H, Ne uAc 7, 7 ' 一 H - 3 e q), 2. 1 7 (s , 3 H， A c), 2. 1 5 (s， 6 H, Ac X 2), 2. 2 (s , 6 H, Ac X 2), 2. 1 0 ( s , 3 H, Ac), 1. 8 0 (d d, 2 H_: N e u A c 7 , 7 ' — H— 3 a x)

実施例 2

実施例 1のブロモアセチル化したジシァ口糖鎖 2mgと参考例 3で合成した ぺプチド鎖 1. 8mg (A r g -G 1 u— G l u -G 1 n— Ty r— C y s _ S e r -Th r -Ty r -A r g-V a 1 ) を 1 0 0 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0、 1 7 0 ^ 1に溶かし、 室温でインキュベートした。 HP L Cで原料消失を確認し た後、 そのまま HP L C [カラム ： M i g h t y s i 1 — GP (5 ^m), φ 1 0 X 2 5 0mm、 グラジェント ： 0. 1 %トリフルォロ酢酸 Z水 1 0 0 %から 0. 1 %トリフルォロ酢酸 ァセ卜二トリルノ水 = 9 0 1 0 7 5 % ; 6 0m i n 1 i n e a r、 流速 2. 5m 1 ] で精製し、 ジシァ口糖鎖ペプチドを収量 2mg、 収率 64%で得た。

^-NMR (40 0MH z , D₂0)

6 7. 1 8 (4H， P h)， 6. 8 9 (4H， P h)， 5. 2 2 ( s , 1 H, M a n 4 -H- 1 ), 5. 1 4 (b d, 1 H, G 1 c N A c 1— H— 1 ), 5. 04 ( s， 1 H, Ma n 4 ' _H— 1)， 4. 8 6 ( s , 1 H， M a n 3 -H- 1 ), 4. 6 9

(^εΗ0义 一 Ι ΒΛ Ή 9 'Ρ) 0 Ί '(^εΗ 丄 ー ·ΐ ί丄 'HS 'Ρ) 82 Τ X ^SHっ 义 一 § J V -s SI J V ' 13 g -H- _t L ' Z o vn 9 N Ή 8 '^) Z S 'T - 26 "T '(つ V Ή S ' s ) o '2 '(Η£ - S J V '2 XHS'-n ΐ o Ή 9 'ω) 86 ·ΐ _

0 T '2 ' Xつ V Ή 9 ' s ) Ζ I 'Ζ '(S Xつ V Ή 9 ' s ) g T 'Z '(つ

V Ή 8 ' s ) 9 T '2 '(H £/ - u ΐ o 'H — 八 Ή £ '^) ο Τ 2 - £ Ζ 'Ζ '(^ΖΗΌ ^ - Π ι Ο Ή Ζ ΐ{つ Β 9) s g 2 '6 'Z ' HD ^ 01 - u I Ο Ή S) Ζ S "2 '(t) 38 -Η- , L ' つ Vn 9N Ή Ζ 'Ρ Ρ q) 9 L 'Ζ '(S XH£ — ュ 丄 'Η£/— つ Ή 9 ) 66 "2 -^ 1 -S ' (^z HO P - § J V Ή 2 qつ S 3) g z■£ 'O S 'S '(H» - § J V Ή I ) S I · '(Z -H- ' U B M Ή T 'P q) 05 · '(Η» - I ^ Λ ' z H 6S = f Ή T 'Ρ) ε S ' '(Η £/ - J q ' Z -H- u ¾H Ή S 'ui) 8 z ^ '{z -H- ε u ¾H Ή T ' s q) ε · '(Η» - j m H- § J

V ' S X H » - n I o 'H 'ui) 8 s ' ー ' '(Η » - J 3 S Ή » - u I O ' I -H- _t 9 '9 1 ^0 'H 'ui) ' 一 S S ' '(Η» - s A 〇 'H » _ J A丄 ' T 一 H— ' S ' S ' S つ VNつ 1 'H S ' ) S 9 ' ー

9C0ll0/l700Zdf/X3d CSOOTO/SOOZ OAV

81

9C0ll0/l700Zdf/X3d CSOOTO/SOOZ OAV 実施例 3 (1—プロモアセチルージシァ口糖鎖を用いたすり替え）

参考例 4で合成したジシァ口糖鎖べプチド 1 mgと実施例 1のプロモアセチル 化したジシァ口糖鎖 lmgを 10 OmMリン酸緩衝液 200 1に溶かし、 ァス パラギン結合型糖鎖をァスパラギンから切断する酵素である、 PNGa s e F (5U) を加え室温で反応させた。 生成物を HPLCで精製することにより目的 とするシスティンにジシァ口糖鎖が結合したジシァ口糖鎖べプチドを得た。

(YMC— P a c k A— 3 14 S - 5 OD S 300 X 6. 0 mm 展 開溶媒 ： 0. 1 %TFA水溶液 B : 0. 1 %TFA ァセトニトリル：水 =9 0 : 1 0 グラジェント A 1 00% 0. 60m l /m i n→B 1 00 0. 60m l / i n 60分）

差替え用紙 （規則 26,

差替え用紙 （規則 2 21

試験例 1 (糖加水分解酵素に対する耐性）

実施例 3で得られたジシァ口糖鎖べプチド 1 m gを 1 0 0 mMリン酸緩衝液 2 00 ιι \に溶かし、 ァスパラギン結合型糖鎖をァスパラギンから切断する酵素で ある、 PNGa s e F ( 5 U) を加え室温で反応させ、 ジシァ口糖鎖がぺプチ ドから切断される時間を測定した。 切断されるまでの時間は、 6時間であった。 参考例 4で得られたジシァ口糖鎖ペプチド 1 m gを 1 00 mMリン酸緩衝液 2 0 0 a \に溶かし、 ァスパラギン結合型糖鎖をァスパラギンから切断する酵素で ある、 PNGa s e F (5U) を加え室温で反応させ、 ジシァ口糖鎖がぺプチ ドから切断される時間を測定した。 切断されるまでの時間は、 30分であった。 この結果から明らかなように天然結合型糖鎖ペプチド （参考例 4) に比べて糖 加水分解酵素に対する耐性が高いことがわかる。 実施例 4

An t i -CD 20キメラ抗体 （Mu t a n t) (株式会社医学生物学研究所

差替え用紙 (規則 26) 製： ミューテーション技術により、 アミノ酸配列 297番目のァスパラギンをシ スティンに変換した抗体） 43. 9 gと実施例 1のプロモアセチル化したジシ ァロ糖鎖 l O O gを l O OmMリン酸緩衝液 300 1に溶かし、 室温でィ ンキュペートした。 反応終了後、 プロテイン Aカラムクロマトグラフィーと、 ゲ ルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することにより目的とするシスティンに ジシァ口糖鎖が結合した抗体を得た。 抗体は、 電気泳動 （10% SDS— PA GE (w i t h 2 -me r c ap t e t h an o l ) :分子量マ一力一は、 B I O— RAD社製 プレステインド S D S— PAGE スタンダード ブロード レンジ （カタログ No 161— 03 1 8)) および MAS Sにより確認した。 結 果を図 3に示す。 産業上の利用可能性

本発明によれば、 十分な血中濃度を維持可能な新規なアミノ化複合型糖鎖誘導 体および糖鎖べプチドを得ることができる。

Claims

請求の範囲

1. アミノ化複合型糖鎖誘導体。

2. 式 （1) で示される請求項 1記載のアミノ化複合型糖鎖誘導体。

〔式中、 R¹は、 -NH- (CO) -CH_?X, 一 NH— (CO) - (CHJ

CH X, イソチオシァネート基、 _NH— (CO) - (CHJ C〇 H、

-NH- (CO) _a- (CH₂) _b— CHOを示す。 Xはハロゲン原子、 aは 0ま たは 1であり、 bは 1〜4の整数を示す。 R ²および R ³は、 水素原子、 式

(2) 〜 （5) で示される基であり、 同一でも異なっていてもよい。 ただし、 R ²および R ³が共に水素原子または式 （5) である場合、 R ²あるいは R ³が水素 原子であって残りの R²あるいは R³が式 （5) である場合を除く。〕

(2)

3 . R ¹が— N H—ハロゲン化ァセチル基である請求の範囲第 2項記載のァミノ 化複合型糖鎖誘導体。

4 . ァミノ化複合型糖鎖誘導体とアミノ酸のチオール基が結合した糖鎖べプチド c

5 . ァミノ化複合型糖鎖誘導体とァミノ酸のチオール基を結合させることを特徴 とする糖鎖べプチドの製造方法。

6 . 糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする請求の範囲第 4項記載の糖鎖べ プチド。

7 . 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、 次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体 を結合することを特徴とする糖鎖ペプチドの製造方法。

8 . 糖鎖ペプチドの糖をアミノ酸から切断し、 次いでアミノ化複合型糖鎖誘導体 を結合して得られた糖鎖ペプチドが抗体であることを特徴とする糖鎖ペプチド。