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WO2004026343A1 - 部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤 - Google Patents

部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤 Download PDF

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WO2004026343A1
WO2004026343A1 PCT/JP2003/011962 JP0311962W WO2004026343A1 WO 2004026343 A1 WO2004026343 A1 WO 2004026343A1 JP 0311962 W JP0311962 W JP 0311962W WO 2004026343 A1 WO2004026343 A1 WO 2004026343A1
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WO
WIPO (PCT)
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oligonucleotide
gene
collagen
promoter
therapeutic agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011962
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukio Ando
Masaaki Nakamura
Shunji Nagahara
Original Assignee
Sumitomo Phamaceuticals Co., Ltd.
Koken Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Phamaceuticals Co., Ltd., Koken Co., Ltd. filed Critical Sumitomo Phamaceuticals Co., Ltd.
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Priority to EP03797684A priority patent/EP1550463A4/en
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Priority to US10/527,597 priority patent/US20060258602A1/en
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the present invention relates to a new use of collagen, and more particularly, to a promoter for site-specific gene conversion of genomic genes, which contains collagen and oligonucleotides.
  • Gene therapy has great promise as a fundamental method for treating genetic diseases caused by mutations or deletions in genes.
  • a gene encoding a protein required for treatment is introduced into cells using a vinoresbetter, V-posome vector, plasmid DNA vector, or the like, and incorporated into the genomic gene of the cell.
  • Attempts have been made to express proteins by using these methods, but there are few cases where satisfactory therapeutic effects can be obtained. This is because 1) it is difficult to express a gene of large size that encodes the entire protein in winoressetter or plasmid DNA, and 2) the gene to be introduced is integrated into the genomic gene.
  • Retrovirus vectors integrate the gene to be introduced into unspecified positions in the genomic gene. 4) If a virus vector is used, a virus-derived protein is produced, and an immune response to this protein is induced to cause side effects.5) In addition, promoters are thought to be due to the high specificity of cells, which limits the number of cells that can express genes. Are (Li- Wen Lai et al., "Experimen” tal Nephrology "1999 seventh Certificates, p. 11-14).
  • FAP familial amyloidotic polyneuropathy
  • T.R transthyretin
  • apolipoprotein AI apolipoprotein AI
  • gelsolin as precursor proteins
  • amyloid is expressed in various organs and tissues.
  • FAP type in which atypical TTR composed of 127 amino acids and mutated to the 30th noline in TTR to methionine becomes amyloid, causing organ damage I (FAP
  • ATTR Va 1 3 OMet is used for polyneuritis with limb sensory disturbances and motor neuropathy, autonomic nervous disorders such as lightheadedness, sweating, decreased lacrimal secretion, gastrointestinal symptoms such as diarrhea and constipation, heart and kidney. It is hereditary amyloidosis with autosomal dominant inheritance, whose main symptom is damage to organs such as the eyes. It is a disease of poor prognosis that occurs in the 20s and 30s and results in death after about 10 years (Benson et al., “Trends in Neurosciences”, Vol. 12, 1989, ⁇ ⁇ 88- 92).
  • liver transplantation Since TTR, the causative protein of FAP, is mainly produced in monthly collections, liver transplantation has become a treatment for FAP. Because liver transplantation stops progression of FAP symptoms and improves some autonomic nervous symptoms, suppressing the production of atypical TTR in the liver may be an effective treatment for FAP. It was revealed. However, adapting liver transplantation to all patients is not possible for a variety of reasons. In addition, since the production of atypical TTR in the retina is not suppressed, there is a problem that eye lesions may progress even after liver transplantation. Therefore, as an alternative treatment, it is considered essential to establish a gene therapy that suppresses the production of atypical TTR in the liver and retina.
  • the Human Genome Project has made it possible to read the entire human gene sequence, and found that there are many single nucleotide variations among individuals, and this single nucleotide variation can lead to disease morbidity and drug susceptibility. It is becoming clear that this has a significant effect on Therefore, in order to put gene therapy to practical use, it is necessary to establish a technology that corrects specific single nucleotide mutations on genomic genes. '
  • RNA—DNA texture This method using a la-oligonucleotide is a method of mutating a genomic gene by introducing an oligonucleotide that forms a double strand with the region of the gene to be mutated into the cell and causing homologous recombination with the genomic gene. Oligonucleotides were introduced into lymphoblasts to mutate the gene for B-globin, a gene responsible for sickle cell anemia, a genetic disease. Since this report, it has been demonstrated that gene mutations targeting specific bases can be performed in various cells using oligonucleotides. Furthermore, in vivo, Kren et al.
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • the present invention provides a preparation that promotes localization in the nucleus by efficiently introducing an oligonucleotide into a cell, a preparation that promotes conversion of a base sequence of a target genomic gene, and a therapeutic agent for a genetic disease.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have been engaged in research on the onset, pathophysiology, and treatment method of patients with familial amyloid polyneuropathy (FAP) for many years, and a point mutation in the transthyretin (TTR) gene has changed the thirty-three palin of TTR to methionine.
  • FAP familial amyloid polyneuropathy
  • TTR transthyretin
  • AT TV a 13 OM et has intensively studied gene therapy for FAP and mutated into FAP and other various genetic diseases.
  • the present inventors have found a preparation which is also effective for site-specific gene conversion, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a site-specific gene conversion promoter comprising at least collagen and an oligonucleotide for gene conversion
  • the collagen is preferably water-soluble collagen, and the water-soluble collagen is preferably atelocollagen.
  • the oligonucleotide for gene conversion is an oligonucleotide consisting of at least 20 bases, and specifically, it is preferable that the oligonucleotide is an RNAZDNA chimeric oligonucleotide or a DNA oligonucleotide.
  • the oligonucleotide for gene conversion is an oligonucleotide having a base sequence that forms a Ptson 'Crick-type base pair including a mismatch base pair of 1 to 3 base pairs with the sense strand or antisense strand of the gene to be converted.
  • the oligonucleotide for gene conversion comprises a nucleotide sequence forming a Ptson 'Crick base pair including a deletion or insertion of 1 to 3 bases with a sense strand or antisense strand of the gene to be converted.
  • the mismatched pair is located at the center of the oligonucleotide, or the deletion or insertion of the base is preferably located at the center of the oligonucleotide.
  • the accelerator or therapeutic agent is preferably in the form of a solution, containing phosphate in the range of 0.01M to 0.1M, and sodium salt in the range of 0.07M to 0.14M. It is preferable to contain in the range,
  • the dosage form of the promoter or therapeutic agent is solid.
  • the oligonucleotide for gene conversion and collagen is a particulate aggregate, and the major axis of the particulate aggregate is 300 ⁇ . ! Preferably ⁇ 50 jum,
  • Solution form of the promoter or therapeutic agent is contained in an amount in the range of collagen from 0.01 to 1.0 wt 0/0, or collagen 0.01 to 0. It contains a range of 25 weight 0/0 Is preferred,
  • Collagen is dissolved in a solution containing 0.01M to 0.1M phosphate and 0.07M to 0.14M sodium salt, and added to the same concentration of phosphate and the same concentration.
  • a sodium salt-containing oligonucleotide solution for gene conversion site-specific gene conversion enhancement obtained by stirring at a temperature of! ⁇ 10 ° C Enhancer or gene therapy agent, ''
  • a method for arbitrarily converting a specific base on a genomic gene in the nucleus of a cell comprising contacting the cell with the gene conversion promoter, wherein the cell is a mammalian cell, yeast or Preferably a fungus,
  • a promoter for nuclear localization of an oligonucleotide comprising at least collagen and an oligonucleotide
  • the nuclear localization accelerator preferably contains phosphate in the range of 0.01M to 0.1M, and preferably contains sodium salt in the range of 0.07M to 0.14M.
  • the nucleotide and the collagen are a particulate aggregate, and the major axis of the particulate aggregate is 300 nm to 50 ⁇ m,
  • the nuclear localization promoter collagen 0. 01:. 1. It comprises in the range of 0 wt%, or 0.1 collagen 05-0 and child contained in an amount of 25 weight 0/0 Is preferred,
  • a method of contacting cells in the body and converting the genes of the cells is produced by administering a composition containing at least collagen and an oligonucleotide for gene conversion via P, nasal, pulmonary, intraportal, intramuscular, subcutaneous, subcutaneous, rising surface, organ, or transdermal.
  • FIG. 1 shows the structures of an RNAZ DNA chimeric oligonucleotide and a DNA oligonucleotide.
  • RNAZDNA chimeric oligonucleotide (a) RNAZDNA chimeric oligonucleotide, (b) 25mer DNA oligonucleotide, (c) 45mer DNA oligonucleotide, (d) 71 ⁇ 2er DNA oligonucleotide.
  • the thigh (lowercase) of the RNA / DNA chimeric oligonucleotide is 2, -0-methyl-RA, and the three bases (*) from both ends of the DNA oligonucleotide are phosphorothioate, preventing degradation.
  • Fig. 2 shows micrographs (a) and (b) showing the incorporation of atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide into HepG2 cells, and the results for HVJ-ribosome-encapsulated DNA oligonucleotide for comparison. It is a micrograph (c). The magnification is All are 100 times larger.
  • FIG. 3 is a microscopic photograph showing the '14 shape of atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of mass spectrometry of transthyretin in the serum of transgenic mice showing normal transthyretin production by atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide.
  • transthyretin extracted from serum of untreated transgenic mice B: transthyretin extracted from serum of transgenic mice to which atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide was administered
  • the first aspect of the present invention relates to a site-specific gene conversion promoter comprising at least collagen and an oligonucleotide for gene conversion.
  • “collagen” means any “collagen” usually used in the medical field, cosmetic field, industrial field and food field.
  • the collagen it is preferable to use K-soluble or solubilized collagen. 7 Soluble collagen is soluble in acidic or neutral water or salt solution, and soluble collagen is an enzyme-soluble collagen that is solubilized by an enzyme, It is preferable that there are an acid-soluble collagen and an alkali-soluble collagen that is soluble by an alkali, and both can pass through a membrane filter having a pore size of 1 micrometer.
  • the water solubility of collagen depends on the degree of cross-linking of collagen, and the higher the degree of cross-linking, the more insoluble the collagen.
  • the degree of cross-linking of collagen used in the present invention is preferably, for example, trimers or less, and more preferably Preferably it is a dimer or less.
  • the molecular weight of collagen is, for example, preferably from about 300,000 to about 900,000, and more preferably from about 300,000 to about 600,000.
  • Collagen can be used as extracted from any animal species, but is preferably extracted from vertebrates, more preferably extracted from mammals, birds and fish, more preferably mammals having a high denaturation temperature, Collagen extracted from birds is desirable. Any type of collagen Lagen may be used, but I-V type is preferred because of its abundance in the animal body.
  • type I collagen extracted from mammalian dermis by acid and more preferably, type I collagen extracted from calf dermis by acid, types I and III produced by genetic engineering Collagen and the like.
  • Collagen whose side chains have been modified, cross-linked collagen, or the like can be used as necessary.
  • collagen having a modified side chain include succininated or methylated collagen
  • cross-linked collagen include collagen treated with daltaraldehyde, hexamethylene diisoanatate, or a polyepoxy compound.
  • the collagen may be mixed with other biocompatible materials.
  • Biocompatible materials include, for example, gelatin, fibrin, anolevumin, hyaluronic acid, heparin, chondroitin sulfate, chitin, chitosan, alginic acid, pectin, agarose, hydroxyapatite, polypropylene, polyethylene, polydimethinolesiloxane, or glycolic acid.
  • a lactic acid or amino acid polymer or a copolymer thereof, or a mixture of two or more of these biocompatible materials is exemplified.
  • the “oligonucleotide for gene conversion” in the present invention is a single-stranded nucleotide having a length and a base sequence sufficient to convert a genomic gene.
  • the length of the oligonucleotide is preferably at least 20 bases, more preferably 25 to 100 bases, and still more preferably 30 to 75 bases.
  • the oligonucleotide is preferably an RNA / DNA chimeric oligonucleotide or a DNA oligonucleotide from the viewpoint of gene conversion efficiency, and more preferably a DNA oligonucleotide from the viewpoint of ease of synthesis and purification.
  • the oligonucleotide may have one or more nucleic acid analogs in the molecule to increase stability to nucleases in vivo or in cells.
  • Nucleic acid analogs are designed to inhibit the degradation of DNA or RA chains by enzymes. Analogs.
  • a phosphorothioate in which the oxygen atom of the phosphodiester binding site is substituted with one a methylphosphonate in which the methyl group is substituted, or a phospholipid amidate in which the amine group is substituted, or a phosphodiester in which the phosphoryl diester binding site is substituted
  • LNA Locked nucleic acid
  • the number of nucleic acid analogs contained in the oligonucleotide is represented by a phosphorothioate-type nucleic acid analog
  • the number of phosphorothioate bonds is preferably about 4 to 6. It is desirable that the phosphorothioate bond is introduced on both sides at least three bases away from the base to be mutated. When the base is approached to the base to be mutated, the conversion efficiency of the gene tends to decrease. More preferably, two or more bases are continuous at both terminal sites of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide may have a base moiety chemically modified.
  • the design of the oligonucleotide includes a sense sequence or an antisense strand of the gene to be converted, and a base sequence that forms a Ptson'-click-type base pair including a mismatch base pair of 1 to 3 base pairs almost at the center. It is preferable to use an oligonucleotide.
  • a base sequence of 20 bases or more of the genomic gene to be converted is selected, the base sequence of 1 to 3 bases located inside the sequence is replaced with a desired base sequence, and the remaining base sequence is replaced with Watson's base sequence.
  • the complementary sequence may be for the sense strand or the antisense strand of the genomic gene, but is more preferably for the sense strand.
  • the base pair contains a mismatch of 1-3 base pairs in the base pair.
  • the mismatch pair is more preferably located at the center of the oligonucleotide.
  • site-specific repair of a mutation of 1 to 3 bases in a genomic gene or conversely, site-specific introduction of a mutation of 1 to 3 bases in a genomic gene be able to.
  • the mutation may be continuous or discontinuous.
  • the design of the oligonucleotide for gene conversion comprises the step of forming a Watson-Crick base pair including a deletion or insertion of 1 to 3 bases with a sense strand or antisense strand of the gene to be converted. It is preferable that the oligonucleotide is a containing oligonucleotide.
  • a base sequence of 20 bases or more of the genomic gene to be converted is selected, and a base sequence of 1 to 3 bases located inside the sequence is deleted, or 1 to 3 bases are placed inside the sequence.
  • an oligonucleotide in which the base sequence is inserted and the remaining base sequence is designed to be a complementary sequence that forms a Ptson'Crick-type base pair (ie, a double strand).
  • the complementary sequence may be one for the sense strand of the genomic gene or one that blocks the antisense strand, but more preferably for the sense strand.
  • the base pair contains a loop of 1 to 3 bases. In order to increase the gene conversion efficiency, it is more preferable that the loop is located at the center of the oligonucleotide.
  • site-specific deletion of a mutation of 1 to 3 bases in a genomic gene or insertion of a site-specific mutation of 1 to 3 bases in a genomic gene can do.
  • the mutation may be continuous or discontinuous.
  • RNAZDNA chimeric oligonucleotide is performed by, for example, as shown in Fig. 1 (a), with the sense strand and the antisense strand with Watson. And an arbitrary intervening sequence portion that does not form a base pair can be selected as a continuous base sequence.
  • Methods for designing RNA / DNA chimeric oligonucleotides are disclosed, for example, in US 5,731,181, US 5,756,325.
  • a second aspect of the present invention provides at least collagen and an oligonucleate for gene conversion.
  • the present invention relates to an agent for treating a site-specific genetic disease, which comprises otide.
  • the collagen and the oligonucleotide for gene conversion contained in the therapeutic agent for genetic diseases of the present invention are the same as the collagen and the oligonucleotide for gene conversion contained in the gene conversion promoter.
  • the dosage forms of the site-specific gene conversion promoter and the therapeutic agent for genetic diseases of the present invention include solution, suspension, gel, film, and solid.
  • the drug When performing treatment targeting cells in the whole body, the drug is preferably in the form of a solution or suspension so that it can be administered intravascularly.
  • the possibility of unexpected side effects is minimized. Therefore, even when an oligonucleotide that does not perform gene conversion is used in normal cells, it is considered that it is not preferable to introduce the oligonucleotide into a cell that does not require gene conversion.
  • oligonucleotide in the preparation of the present invention causes a gene mutation
  • the mechanism by which the oligonucleotide in the preparation of the present invention causes a gene mutation is thought to be due to homologous recombination between the oligonucleotide and the gene or mismatch repair due to the formation of a hybrid between the oligonucleotide and the gene. Either is not clear. However, regardless of the mechanism, it is necessary for the oligonucleotide and the gene to form a hybrid at the portion targeted by the oligonucleotide.
  • genes form stable duplexes and interact with histones to concentrate in the nucleus at high density. Therefore, it is not expected that a foreign oligonucleotide will dissociate the double strand of the gene and form a hybrid with the target gene strand. Therefore, in order for the oligonucleotide in the preparation of the present invention to form a hybrid with the target gene chain to cause the target gene mutation, replication of the gene accompanying cell division during the period in which the oligonucleotide is present in the nucleus, or Gene transcription associated with protein production requires dissociation of the gene duplex.
  • the formulation of the present invention in the form of a solution, suspension, or gel is desirably isotonic with cells.
  • the preparation of the present invention contains a phosphate and a sodium salt, the phosphate is 0.1 to 0.1% and the phosphate is 0.0.
  • the preparation of the present invention is preferably manufactured so that the oligonucleotide for gene conversion and collagen are in a particulate aggregate.
  • the term “aggregate” refers to a complex in which a large number of positively charged collagen and negatively charged oligonucleotides are electrically attracted to each other in a molecule. means.
  • the formation of this aggregate is mainly composed of columnar collagen molecules with a major axis of about 300 nm and a diameter of about 1.5 nm, which associate mainly with the major axis of the molecule. Stretch in the direction. Therefore, the composite takes various shapes such as fibrous, fine fibrous, and particulate depending on the degree of elongation. be able to.
  • the aggregate in the present invention is preferably in the form of particles from the viewpoint of the efficiency of transfer of the oligonucleotide into cells, particularly into the nucleus.
  • the major axis of the particulate aggregate is preferably from 300 ⁇ to 50 ⁇ m, more preferably from 300 nm to 30 ⁇ .
  • the concentration and ratio of the collagen and oligonucleotide to be mixed, the salt concentration, the temperature, and the pH are adjusted.
  • the concentration of collagen in mixing is from 1.0 to 0.005 weight 0 / . It is more preferably 0.5 to 0.005% by weight, and still more preferably 0.05 to 0.005% by weight, but the concentration of oligonucleotides that form aggregates as the collagen concentration decreases also increases. descend.
  • fine collagen is previously dissolved in a solution containing 0.01M to 0.1M phosphate and 0.07M to 0.14M sodium salt.
  • Form fiber or collagen molecule aggregates and sometimes maintain collagen molecules in a monomolecular state, and add oligonucleotides to these to form collagen fibers, collagen molecule aggregates or collagen monomolecules. There is a way to do it.
  • the temperature during mixing is desirably 1 to 10 ° C, and more desirably 1 to 5 ° C, in order to obtain the above preferred long-diameter aggregate. is there.
  • the solution-form preparation of the present invention dissolves collagen in a solution containing 0.01M to 0.1M phosphate and a solution containing 0.07M to 0.14M sodium salt, and dissolves the same concentration of phosphate in the solution.
  • the mixture obtained by stirring at a temperature of 0 ° C usually has a collagen concentration of 50 ⁇ l.
  • g nom 1 L OmgZm 1
  • the concentration of oligonucleotide at the time of mixing is usually 20 ⁇ g Zm 1 to 1 mg / m 1.
  • the ratio of the number of collagen molecules forming an aggregate to the number of nucleotide monomers of the oligonucleotide is 1: 1-1: 200, preferably 1: 3-1: 150, More preferably, the ratio is 1: 3 to 1: 120.
  • the pH of the solution at the time of mixing is pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8.
  • a preparation in the form of a solution containing a particulate aggregate can be provided.
  • the concentration of collagen in the solution form in the formulation mainly when used in nuclear localization of gene conversion and oligonucleotides at Inbitoro, be contained in a range of 0.0 1 to 1.0 wt 0/0 Is preferred.
  • the concentration of collagen in the above-mentioned solution-form preparation is mainly in the range of 0.01 to 0.25% by weight when used for gene conversion in vivo, gene therapy or nuclear localization of oligonucleotides. It is preferred to contain.
  • solution-form preparation of the present invention contains EDTA at 0.1 to 1% by weight for stabilizing oligonucleotides, and 0.01 to 1% by weight of a surfactant for preventing adsorption to containers and administration devices. Can be contained.
  • Film and solid preparations are obtained by concentrating and drying the above solution preparations. That is, a film-form preparation can be prepared by casting the above solution-form preparation on a flat plate and drying it at a temperature of 40 ° C or lower. In addition, a powdery preparation can be prepared by centrifuging the solution preparation to precipitate an aggregate of oligonucleotide and collagen, and drying the precipitate at 40 ° C or lower. A method of preparing a rod-shaped preparation by compressing a sponge-like compound obtained by freeze-drying the powdery or solution-form preparation obtained in this manner, or adding a small amount of a powdery preparation and a sponge-like preparation. Water is added and kneaded to form a highly concentrated solution, which is extruded from a nozzle and dried at 40 ° C or less to prepare a rod-shaped preparation.
  • additives that are pharmaceutically acceptable such as albumin, gelatin, chondroitin sulfate, agarose, sorbitol, sucrose, etc. In the range of 10 to 80% by weight of the whole preparation.
  • the particle size of the powdered formulation can take various shapes depending on the excipient,
  • the major axis of the aggregate formed by the oligonucleotide and collagen is preferably 300 nm to 50 / im, more preferably 300 nm to 30 Aim.
  • the rod-shaped solid preparation preferably has a diameter of 0.lmm to 2.Omm, a length of 3mm to 2Omm, and a diameter of 0.3mm to 1.0mm so that it can be locally injected by injection.
  • a length of 3 mm to 10 mm is more desirable.
  • the amount of oligonucleotide contained in the solid preparation is usually a solid preparation 1 mg per 10 // ⁇ ⁇ 100 ⁇ ⁇ , collagen quantity is 990 / zg ⁇ 250 ⁇ g per usual solid preparation lmg.
  • a third aspect of the present invention relates to a method for optionally converting a specific base on a genomic gene in the nucleus of a cell. That is, in the conversion method of the present invention, by contacting the cell with the site-specific gene conversion promoter of the present invention, the oligonucleotide contained in the promoter is transferred and localized in the nucleus of the contacted cell. It is characterized by performing a desired base conversion.
  • the cells to be converted are not particularly limited as long as they are eukaryotic cells, and include yeast, fungi, plant cells and animal cells, and are preferably mammalian cells, yeast or fungi. .
  • Whether a specific base has been converted can be determined by contacting the gene conversion promoter of the present invention, collecting cells after a certain period of time, amplifying a gene region containing the specific base by a PCR method, or the like.
  • the gene therapy agent of the present invention can be used for treating various genetic diseases.
  • Diseases to be treated include the absence of normal proteins due to point mutations (including 1-3 nucleotide mutations), deletion mutations or insertion mutations (including 1-3 nucleotide mutations) in genes. Attributable diseases. Such diseases include familial polyamyloid neuropathy (FAP), Fupri's disease, Winoleson's disease, thalassemia, sickle cell disease, muscular dystrophy, cystic fibrosis, factor V Leiden abnormality, biotin-dependent multiple carboxylase deficiency, etc. Is mentioned.
  • TTR transthyretin
  • Type II FAP serine Diseases caused by
  • TTR is mainly produced in the liver
  • the gene therapy agent of the present invention can be administered targeting hepatocytes.
  • amyloid deposition due to atypical TTR also causes visual impairment accompanied by clouding of the vitreous body of the eye, and this disorder can be treated by administering the gene therapy agent of the present invention directly to the retina of the eye. it can.
  • the method of administration of the gene therapy agent of the present invention includes transdermal, subcutaneous, intranasal, nasal, pulmonary, intramuscular, intracerebral, tissue (S storage surface, ⁇ ), intravascular ( It can be administered intravenously, intraportally, or orally.
  • the dosage of the gene therapy agent of the present invention is the liquid volume in the case of a solution, the area in the case of a film-form preparation, the diameter and length of the rod-shaped preparation, and the powder preparation. In the case of (1), it can be easily adjusted by the volume or weight of the powder.
  • the optimal dose of the gene therapy agent of the present invention varies depending on the indication disease, administration site, administration method, type of dosage form, patient's gender, age, symptoms, etc., but the amount of oligonucleotide in the formulation is For example, 0.001 mg / kg to 4 Omg / kg, preferably 0.01 mg / kg to 3 Omg / kg.
  • the oligonucleotide in the gene therapy agent after the administration can efficiently convert the mutation in the genomic gene, that is, can repair the mutation.
  • normal TTRs are produced as a result of gene repair, atypical TTR levels are reduced, and amyloid formation is suppressed, thereby improving FAP symptoms.
  • a fourth aspect of the present invention provides an agent for promoting nuclear localization of an oligonucleotide, comprising at least collagen and the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide may be one designed so as to meet the conditions of the above-mentioned oligonucleotide for gene conversion, but any oligonucleotide having a normal length as an oligonucleotide may be used. It can be suitably used.
  • the present preparation can take various forms as in the case of the gene conversion promoter, but a solution form is preferred. The concentrations of the phosphate and sodium salt contained in the present solution in the form of a solution are the same as described above. In addition, other conditions (collagen concentration, The ratio of the number of molecules of one molecule to the number of oligonucleotide monomers, pH and temperature of the solution during mixing, etc.) are the same as described above.
  • the oligonucleotide contained in the preparation can be efficiently localized in the nucleus of the cell. Whether or not the oligonucleotide is localized in the nucleus of the cell can be confirmed by labeling the oligonucleotide with a fluorescent dye or the like and observing it with a fluorescence microscope or the like.
  • a site-specific conversion promoter for a TTR gene related to FAP and a site-specific conversion promoter for an a-galactosidase gene related to Fupurii disease used in the following Test Examples and Examples were prepared.
  • Oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 2 to 12.3.8 3 to 50 ⁇ and 10 ⁇ g / m 1 to 1 g / m 1 of equal amount of atelocollagen, 0.14 M salt After mixing at 2 ° C in a 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0) containing dani sodium, a solution preparation containing an aggregate of oligonucleotide and collagen (DNA collagen embedded in atelocollagen) was prepared. Prepared.
  • FAP type I FAP ATTR Val30Met
  • FAP ATTR Val30Met FAP ATTR Val30Met
  • FIGS. 1 (b) to (d) DNA oligonucleotides as shown in FIGS. 1 (b) to (d) were designed.
  • the oligonucleotides to be transferred were labeled at the 5 and 5 ends with FITC.
  • Fugene6 (Roche), ExGen 500 (MBI Fermentas), HVJ "-ribosome (provided by Osaka University graduate School of Medicine, Gene Therapy, Dr. Yasushi Kaneda) or the atelocollagen preparation prepared in Production Example 1 (FITC).
  • the optimization of the transfection method was studied using oligo nucleotides labeled with.
  • atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide 10 ⁇ 25 ⁇ 6 ⁇ ⁇ , 10 ⁇ 45mer, 10 ⁇ 74mer
  • 0.5% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide 50 M 25mer, 25 ⁇ 45mer, 10 ⁇ 74mer
  • 600 ⁇ 1 600 ⁇ 1 of culture solution
  • the nuclear localization rate of DNA oligonucleotides in HepG2 cells was determined by the expression of atelocollagen-embedded DNA in Fugene6, ExGen500, HVJ-ribosome and atelocollagen preparations, as shown in Figure 2 (a) and (b). It can be seen that the oligonucleotide was taken up by almost 50% of pG2 cells, and that the introduced DNA oligonucleotide was localized in the nucleus. All other methods showed weaker fluorescence and low nuclear localization.
  • the efficiency of gene repair was compared using 25-mer to 74-mer DNA oligonucleotides.It is known that 45-mer and 74-mer DNA oligonucleotides have a relatively high gene repair rate.
  • ⁇ terrorist collagen-embedded DNA oligonucleotide 74Mei- (SEQ ID NO: 4) was used was examined gene conversion rate in the He P G2 cells, the conditions 300 Mi and 600 Mi of the 3)
  • oligonucleotide concentration: 3.83 ⁇ oligonucleotide concentration: 3.83 ⁇
  • Concentration: 10 / X ⁇ the concentration of atelocollagen in the preparation was increased from 0.1% to 0.5%, and 600 ⁇ of atelocollagen-embedded D ⁇ oligonucleotide was added to 600 ⁇ l.
  • Gene conversion rate rose to 1 0% 1% by Rukoto be added to the cell cultures. Gene conversion rates using this drug may increase to a certain level in a dose-dependent manner.
  • the gene conversion rate was 0% when the atelocollagen concentration was 0.1% (DNA oligonucleotide concentration: 10 ⁇ ) for the DN-oligonucleotide 25mer (SEQ ID NO: 2) embedded in the mouth mouth collagen. At 0.5% (DN ⁇ oligonucleotide concentration: 50 ⁇ ⁇ ), about 0.5%, and at 45mer SEQ ID NO: 3), the atelocollagen concentration is 0.1% (DNA oligonucleotide concentration: ⁇ ⁇ ). 0%, 0.5% (DNA (Ligonucleotide concentration: 25 ⁇ M) was about 1%.
  • DNA oligonucleotide used in the present invention preferably has a chain length of 45 mer or more, more preferably 74 mer or more.
  • FIG. 3 shows the result of observation with a fluorescence microscope in the above 4). According to FIG. 3, no particles are observed with the DNA oligonucleotide alone, whereas with the 0.05% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide (SEQ ID NO: 5), aggregated particles are observed, and the average major diameter of the aggregated particles is observed.
  • SEQ ID NO: 5 atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide
  • atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide 1074mer, SEQ ID NO: 6
  • 1% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide 30 ⁇ 71 ⁇ 2er
  • the gene conversion rate was calculated as ATTR Val30Met copy number Z (ATTR Val30Met copy number + normal TTR gene copy number) x 100 (%).
  • the 74-mer DNA oligonucleotide embedded with 1% atelocollagen also had a higher gene conversion rate than the 74-mer DNA oligonucleotide embedded with 0.5% atelocollagen.
  • vitrectomy showed a higher gene conversion rate (about 1%).
  • mice harboring transthyretin (ATTR Val30Met) gene and homotransgenic mice harboring transthyretin gene of abnormal mouse Analysis of mechanism, Shuichiro Maeda et al., Research project for a specific disease, subsidized by the Health and Welfare Research Grant, "Research on amyloidosis,” FY2001 General Research Report, ⁇ 39- 41), the following preparations 1 to 3 were administered, and the gene conversion rate was examined.
  • Oligonucleotide 74 mer (SEQ ID NO: 5) in which the base for gene conversion is located at the center and the three bases at both ends are phosphorothioate oligonucleotides
  • Formulation 1 oligonucleotide 10 ⁇ M, atherocollagen 0.5%
  • IJ3 Oligonucleotide 10 ⁇ , Collagen 0.05%
  • the above preparation was directly administered (0.2 ml in total) to each of the hepatic lobes of one of the mouse livers.
  • the hepatic lobe to which the drug was administered and the hepatic lobe to which no drug was administered were collected and genes were extracted, and both liver lobes were analyzed for normality using the MASA method and real time PGR. The percentage of genes was measured.
  • transthyretin gene of mouse ATTR Val30Met was administered with the preparation, and serum containing anti-transthyretin antibody in serum.
  • the transthyretin extracted by immunoprecipitation was subjected to unicorn analysis using a mass-assisted 1 aser desorption ionization / time-of-flight mass spectrometry to determine whether normal transthyretin was produced. investigated.
  • a DNA oligonucleotide 51-mer YKS-384 (SEQ ID NO: 7), YKS-3 in which positions 1, 2, 3, 47, 49 and 50 in SEQ ID NO: 7 have been substituted with Locked nucleic acid (trade name) (LNA) 82, and YK S in which positions 1, 2, 3, 10, 11, 12, 14, 34, 35, 38, 47, 49 and 50 in SEQ ID NO: 7 have been substituted with Locked nucleic acid (trade name) (LNA) -3 8 3 types were synthesized.
  • the oligonucleotide is designed based on the human TTR gene. According to the method described in Production Example 1, a solution preparation (0.5% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide (10zM)) containing an aggregate of the three types of oligonucleotides and collagen was prepared.
  • 2xl0 5 HepG2 cells purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 2xl0 5 HepG2 cells purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 0.5% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide 51mer (10 ⁇ ) prepared in 1) was added to 600 ⁇ .
  • Each was transfection, and the cells were collected 6 days later.
  • a single solution of DN ⁇ oligonucleotide (YKS-384 (SEQ ID NO: 7) alone was prepared, and the solution was transfected in the same manner. DNA was extracted from the collected cells, and the mutant sequence was extracted.
  • the use of the atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide resulted in the conversion of the base encoding the 30th amino acid on the TTR gene in HepG2 cells when the DNA oligonucleotide was used alone.
  • the conversion of the base encoding another amino acid on the TTR gene that causes FAP was promoted by using atelocollagen-embedded DNA oligonucleotides. We considered what we could do.
  • FAP ATTR Ser 50 lie where the serine at position 50 of the transthyretin gene was mutated to isoleucine and 1
  • a DNA oligonucleotide 74mer (SEQ ID NOS: 8, 9; phosphorothioate oligonucleotides having three bases at both ends, with the bases for gene conversion arranged at the center) was synthesized based on the human TTR gene.
  • a solution preparation (0.5% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ )) containing an association of the two types of DNA oligonucleotides and collagen was prepared.
  • a DNA oligonucleotide (SEQ ID NO: 8) designed to convert the base encoding the 50th amino acid on the human transthyretin gene, and a base encoding the 114th amino acid on the human transthyretin gene I can do it
  • Each of the DNA oligonucleotides (SEQ ID NO: 9) designed as described above was prepared using atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide (atelocollagen concentration: 0.5%, DNA oligonucleotide concentration: 10 ⁇ M) and DNA oligonucleotide alone. Added to pG2 cells.
  • the base conversion rate was 0% for DNA oligonucleotides designed to convert the base encoding the 50th amino acid on the human transthyretin gene, 0% for DNA oligonucleotides alone, and DNA oligonucleotides embedded in atelocollagen.
  • DNA oligonucleotides designed to convert 1.61% of nucleotides and the base encoding the 114th amino acid on the human transthyretin gene 0% of DNA oligonucleotide alone and atelocollagen embedded DNA 0.58% for the oligonucleotide.
  • the DNA oligonucleotide embedded in the artificial mouth collagen of the present invention can promote base conversion by the DNA oligonucleotide even when the base mutation site is different. Furthermore, this indicates that the present invention can provide a therapeutic agent for different types of FAP.
  • the use of the atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide enabled the conversion of the base encoding the 30th amino acid on the TTR gene in HepG2 cells using DNA oligonucleotide alone. It became clear that it could be promoted compared to the case.
  • the conversion of bases on the TTR 'gene in human retinal cells can be achieved by using the DNA collagen-embedded DNA oligonucleotide. We considered what could be promoted.
  • DNA oligonucleotide (SEQ ID NO: 4) based on the human TTR gene
  • a solution preparation containing an association of DNA oligonucleotide and collagen (0.5%, 0.25% and 0.1% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotides (10%) were prepared.
  • the base conversion rate was 0% when the atelocollagen concentration was 0.1% and 5.91% when the atelocollagen concentration was 0.25%. At 5%, it was 2.08%. This result indicates that the atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide of the present invention can promote base conversion by DNA oligonucleotide in not only human liver cells but also human retinal cells.
  • a solution preparation containing the three types of oligonucleotides and collagen complex (0.1%, 0.25, 0.5% atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide) (10 ⁇ )) was prepared.
  • the embedded DNA oligonucleotide (10 ⁇ 74mer) was transfected in 600 ⁇ l (600 ⁇ of culture solution) at a time, and the cells were collected 7 days later. DNA was extracted from the collected cells, and the gene conversion rate was calculated using the MASA method and real time PCR.
  • DNA oligonucleotide that converts amino acid at position 125 (SEQ ID NO: 10) Atelocollagen concentration: base conversion rate
  • DNA oligonucleotide that converts amino acid at position 374 (SEQ ID NO: 11) Atelocollagen concentration: base conversion rate
  • atelocollagen-embedded DNA oligonucleotide of the present invention can promote base conversion by the DNA oligonucleotide even for a gene mutation associated with Fabry disease. This further indicates that the present invention can provide a therapeutic agent for Fabry disease.
  • the present invention provides a gene conversion promoter and a therapeutic agent for a gene disease, which convert a specific base pair present on a cell genomic gene in a site-specific manner.
  • the preparation of the present invention can be used to produce oligonucleotides with extremely high efficiency by using collagen, which is an in vivo organism, has low antigenicity, and has been confirmed to be highly safe when administered to a living body. Once introduced, it can be localized in the nucleus, and can efficiently promote the conversion of genomic genes.
  • the preparation of the present invention is also useful as an agent for promoting nuclear localization of an oligonucleotide. The use of these preparations enables gene therapy and the production of genetically modified animals and plants.

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Abstract

オリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に導入して核内での局在化を促進する製剤、目的とするゲノム遺伝子の塩基配列の変換を促進する製剤および遺伝子疾患治療剤を提供する。少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤、少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤、細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法であって、前記遺伝子変換促進剤を当該細胞に接触させることを含む方法、および少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤。

Description

部位特異的遺伝子変換促進剤およぴ遺伝子疾患治療剤
技術分野
本発明は、 コラーゲンの新しい用途に関するものであり、 詳しくは、 コラーゲ ンとオリゴヌクレオチドを含有する、 ゲノム遺伝子の部位特異的遺伝子変換促進 剤等に関する。
背景技術
遺伝子治療は、 遺伝子の変異または欠失により発症する遺伝子疾患を根本的に 治療する方法として大きな期待が寄せられている。 一般に、 遺伝子治療ではウイ ノレスベタター、 Vポソームベクターまたはプラスミド D NAベクター等を用いて 細胞に治療に必要なタンパク質をコードした遺伝子を導入し、 細胞のゲノム遺伝 子に組み込む手法、 あるいはゲノム遺伝子と共存させてタンパク質を発現させる 手法が試みられているが、 満足な治療効果が得られる例は少ない。 この原因は、 1 ) タンパク質全体をコ一ドする大きなサイズの遺伝子をウイノレスベタターある いはプラスミド D NAに組み込んで発現させるのは困難であること、 2) 導入す る遺伝子をゲノム遺伝子に組み込まないアデノウィルスべクターやプラスミド D N Aベクターを用いた場合には、 安定した長期間の発現が得られないこと、 3 ) レトロウィルスベクターは導入する遺伝子をゲノム遺伝子の不特定な位置に組み 込むため、 却って正常遺伝子の機能を喪失させる可能性があること、 4 ) ウィル スベクターを用いた場合、 ウィルスに由来するタンパク質が産生され、 このタン パク質に対する免疫反応が惹起されて副作用が生じること、 5 ) 更にプロモータ 一は細胞の特異性が高いため、 遺伝子を発現できる細胞が限られることによると 考えられている （Li- Wen Laiら、 「Experimen"tal Nephrology」 1999 第 7卷， p. 11-14 ) 。
一方、 遺伝子疾患では必要とされるタンパク質の遺伝子すべてが完全に欠失し ていることは稀で、 多くの場合には遺伝子上の僅力一塩基が誤っているために異 なるアミノ酸に置換されたり、 一塩基が欠失あるいは挿入されているためにフレ 一ムシフトが生じて正常なタンパク質が産生されないことが原因となっている。 例えば、 家族性アミロイドポリニューロパチー（Familial amyloidotic polyneur opathy: FAP) は、 遺伝子変異を起こしたトランスサイレチン（Transthyretin ： TT.R) 、 アポリポ蛋白 AI、 ゲルソリンを前駆蛋白とし、 種々の臓器'組織 にアミロイド沈着をきたす全身 "生アミロイド一シスの 1つである。 そのうち、 12 7個のアミノ酸から構成される TTRの 30番目のノ リンがメチォニンへ変異し た異型 TTRがアミロイドとなり臓器障害がおこる FAP t y p e I (FAP
ATTR Va 1 3 OMe t) は、 四肢の感覚障害や運動神経障害を伴う多発 神経炎、 立ちくらみ、 発汗、 涙液分泌低下などの自律神経障害、 下痢や便秘など の消化器症状、 心、 腎、 眼などの臓器障害などを主症状とする常染色体優性遺伝 を呈する遺伝性アミロイド一シスである。 本症は 20〜30代で発症し、 約 10年の経 過で死の転帰をとる予後不良の疾患である （Bensonら、 （"Trends in Neurosci en ces 」 1989第 12卷， ρ· 88 - 92 ) 。
FAPの原因蛋白である T T Rが主に月刊蔵で産生されることから、 F A Pの治 療として肝移植が行われるようになった。 肝移植により F APの症状の進行が停 止し、 一部の自律神経症状の改善を認めることから、 肝臓での異型 TTRの産生 を抑制することは、 FAPの有効な治療法であることが明らかになった。 しかし ながら、 肝移植をすベての患者に適応することは様々な理由から不可能である。 しかも，、 網膜での異型 TTRの産生は抑制されないため、 肝移植後も眼病変が進 行するとい.う問題点もある。 そこで、 これに代わる治療法として、 肝臓、 網膜で の異型 T T Rの産生を抑制する遺伝子治療の確立が不可欠であると考えられる。 他方、 ヒトゲノムプロジェクトによってヒトの全遺伝子配列が角军読されるよう になり、 個体間で多くの一塩基変異があることが見出され、 更にこの一塩基変異 が疾病の罹患率や薬剤の感受性に大きく影響することが明らかになりつつある。 従って遺伝子治療を実用化するには、 ゲノム遺伝子上の特定の一塩基変異を修正 する技術の確立が必要である。 '
1996年、 Kmiec らによって特定の塩基を変異する画期的な方法が発表された （
Kmiec ら、 「Science」 1996 第 273卷， p.1386-1389 )。 RNA— DNAキメ ラオリゴヌクレオチドを用いるこの方法は、 変異させたい遺伝子の領域と二重鎖 を形成するオリゴヌクレオチドを細胞内に導入してゲノム遺伝子と相同組換えを 生じさせることでゲノム遺伝子を変異させる方法であり、 リンパ芽球細胞にオリ ゴヌクレオチドを導入して遺伝子疾患である鎌状細胞貧血の原因遺伝子である B 一グロビンの遺伝子を変異させた。 この報告以降、 オリゴヌクレオチドを用いて 種々の細胞内で特定の塩基を標的とした遺伝子変異が行えることが実証された。 更に in vivo においては、 Krenらがラットの肝臓内で第 9因子の遺伝子を変異さ せて血友病を治療できる可能性を示した （Krenら、 「Nature Medicine」 1998 第 4卷， p. 285-290)のに続いて、 Cligler - Najjar症候群 （Krenら、 「Proceeding of National Academy of Sciences USAJ 1999 第 96卷， p. 10349-10354)、 Duch enne型筋ジストロフィ一の治療に使用できる可能性が示されるに至っている。 また、 最近 D NAオリゴマーでも R NA— D NAキメラオリゴヌクレオチドと 同様にゲノム遺伝子の特定の塩基を変異できることが、 細胞の抽出液中 （Gamper ら'、 「Nucleic Acids Research」 2000 第 28卷， p. 4332-4339) , 酵母 (Saccharom yces cerevisiae) (Michael ら、 「Nucleic Acids ResearchJ 2001 第 29卷, p. 4238 - 4250)で示され、 遺伝子治療への活用が期待されている。
しかしながら、 R NA— D NAキメラオリゴヌクレオチドを単独で用いて相同 組換えを行うこの方法は、 再現性がなく、 これら論文に報告されているような高 い効率で相同組換えを行うことができないことは当該領域の研究者の共通の認識 である。 実際、 Kmiec らの論文を最初に掲載した Science誌は、 彼らが発表した 論文の追跡調査を実施し、 論文の内容が再現されないことを確認したとの記事を 掲載した。 また、 その記事の中で最近の Kmiec らの研究によれば、 RNA— D N Aキメラオリゴヌクレオチドを単独で用いた場合の相同組換え効率は、 0. 0002% 〜0. 005%、 D N Aオリゴマーを単独で用いた場合の相同組換え効率は、 0. 016%〜 0. 02%程度であることを明らかにしている （Taubes、 「Science」 2002 第 298 卷， P. 2116- 2120)。 従って、 これらオリゴヌクレオチドを用いて効率的に相同組 換えを行う促進システムの開発が求められている。
一方、 オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子治療を臨床的に実用化する上で最も 大きな課題は、 生体内の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達方法である。 実際、 これまで行われたすべての研究では、 エレクト口ポレーシヨン、 ジーンガン、 リ ポソーム、 ポリカチオンなどの送達技術を用いたオリゴヌクレオチドの細胞内導 入方法は、 毒性や利便性などの問題があり臨床研究に供されたものはない。 特に 多くのリポソ一ム及ぴ力チオン性ポリマーは、 ォリゴマーと混合した状態で長期 間保存することが困難な上、 調製時の手技に導入効率が大きく依存することはこ の分野の研究者には良く知られた事実である。 従って、 オリゴヌクレオチドを安 定かつ効率的に細胞内に導入してゲノム遺伝子を変換できると共に、 安全で利便 性の高い送達システムの開発が求められている。
また、 ァンチセンスオリゴヌクレオチドの送達方法では、 標的となるメッセン ジャー R NAが主として細胞質に存在することから、 オリゴヌクレオチドを細胞 内の特定の部位に局在化することは求められなかった。 一方、 ゲノム遺伝子の変 換を行うには、 オリゴヌクレオチドを核内に導入、 局在化させて遺伝子変換の効 率を高める必要があり、 オリゴヌクレオチドを効率的に細胞の核内に局在化させ る送達システムの開発が望まれている。
発明の開示
本発明は、 オリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に導入して核内での局在ィ匕を 促進する製剤、 目的とするゲノム遺伝子の塩基配列の変換を促進する製剤および 遺伝子疾患治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、 家族性アミロイドポリニューロパチー （F A P) の患者の発症 、 病態および治療方法に関する研究に長年従事し、 トランスサイレチン (T T R ) 遺伝子の点変異により T T Rの 3 0番目のパリンがメチォニンに変異した F A Pタイプ I ( F A P . AT T V a 1 3 O M e t ) の遺伝子治療について鋭意 検討した結果、 下記要件を満たすことにより F A Pを初めとする様々な遺伝子疾 患の治療のみならず、 ィンビトロでの部位特異的遺伝子変換にも有効な製剤を見 出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明の要旨は、 以下のとおりである。
[ 1 ] 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる 部位特異的遺伝子変換促進剤、
[ 2 ] 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドを含んでなる 部位特異的遺伝子疾患治療剤、
前記コラーゲンは水溶性コラーゲンであることが好ましく、 前記水溶性コラー ゲンはァテロコラーゲンであることが好ましい、
前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが少なくとも 20塩基からなるオリゴ ヌクレオチドであることが好ましく、 具体的には RNAZDNAキメラオリゴヌ クレオチドまだは DN Aオリゴヌクレオチドであることが好ましい、
前記遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドは、 変換する遺伝子のセンス鎖または アンチセンス鎖と、 1〜3塩基対のミスマッチ対合を含んでヮトソン 'クリック 型塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること、 あるいは 、 前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドは、 変換する遺伝子のセンス鎖または アンチセンス鎖と、 1〜3塩基の欠失または挿入を含んでヮトソン'クリック型 塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい、 前記ミスマッチ対合は、 オリゴヌクレオチドの中央部に位置すること、 あるい は、 前記塩基の欠失または挿入は、 オリゴヌクレオチドの中央部に位置すること が好ましい、
前記促進剤または治療剤は、 その剤型が溶液状であることが好ましく、 リン酸 塩を 0. 01M〜0. 1Mの範囲で含有すること、 ナトリウム塩を 0. 07M〜 0. 14 Mの範囲で含有することが好ましい、
また、 前記促進剤または治療剤は、 剤型が固形状であることが好ましい、 遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドとコラーゲンは粒子状の会合体であり、 粒 子状の会合体の長径は 300 ηπ！〜 50 jumであることが好ましい、
溶液状の前記促進剤または治療剤は、 コラーゲンを 0. 01〜1. 0重量0 /0の 範囲で含有すること、 あるいはコラーゲンを 0. 01〜0. 25重量0 /0の範囲 含有することが好ましい、
[3] コラーゲンを、 0. 01M 〜0. 1Mのリン酸塩および 0. 07M〜0 . 14Mのナトリゥム塩を含有する溶液に溶解し、 これに同濃度のリン酸塩およ ぴ同濃度のナトリゥム塩を含有する遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド溶液を加 えて：!〜 10°Cの温度下で攪拌することにより得られる部位特異的遺伝子変換促 進剤または遺伝子治療剤、 '
[4] 細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法で あって、 前記遺伝子変換促進剤を当該細胞に接触させることを含む方法、 前記細胞は哺乳動物細胞、 酵母または真菌であることが好ましい、
[5] 少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオ チドの核内局在化促進剤、
前記核内局在化促進剤は、 リン酸塩を 0. 01M〜0. 1Mの範囲で含有する こと、 ナトリウム塩を 0. 07M〜0. 14 Mの範囲で含有することが好ましい 前記ォリゴヌクレオチドとコラ一ゲンが粒子状の会合体であり、 粒子状の会合 体の長径が 300 nm〜50 μ mであることが好ましい、
前記核内局在化促進剤は、 コラーゲンを 0. 01〜： 1. 0重量％の範囲で含有 すること、 あるいはコラーゲンを 0. 05〜0. 25重量0 /0の範囲で含有するこ とが好ましい、
[6] 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドを含む組成 物を経 P、 経鼻、 経肺、 門脈内、 筋肉内、 皮下、 騰表面、 臓器内または経皮投 与することにより生体内の細胞と接触させ、 当該細胞の遺伝子を変換する方法、
[7] 前記 [6] 記載の方法を用いて遺伝子疾患を治療する方法。
図面の簡単な説明
第 1図は、 RNAZDNAキメラオリゴヌクレオチドおよび DNAオリゴヌク レオチドの構造を示す。
(a) RNAZDNAキメラオリゴヌクレオチド、 (b) 25mer DNAオリゴヌタレ ォチド、 （c) 45mer DNAオリゴヌクレオチド、 （d) 7½er DNAオリゴヌタレ ォチド。 RNA/DNAキメラオリゴヌクレオチドの腿部分 (小文字) は 2， - 0 - メチル - R Aに、 DN Aオリゴヌクレオチドの両端から 3塩基 (*) はホスホロチ ォエートになっており、 分解を防いでいる。
第 2図は、 ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチドの HepG2細胞への 取り込みを示す顕微鏡写真 （a)および (b) と、 比較のため、 HV J—リボソーム 封入 DN Aオリゴヌクレオチドでの結果を示す顕微鏡写真 (c) である。 倍率は、 すべて 1 0 0倍である。
第 3図は、 ァテロコラーゲン包埋 D N Aオリゴヌクレオチドの '14状を示す顕微 鏡写真である。
(a) ： D NAオリゴヌクレオチドのみ
(b) ： 0. 05%ァテロコラーゲン包埋 D N Aオリゴヌクレオチド 74mer
第 4図は、 ァテロコラーゲン包埋 D NAオリゴヌクレオチドによる正常トラン スサイレチンの産生を示すトランスジエニックマウス血清中のトランスサイレチ ンの質量分析結果を示すグラフである。
A ：無処置トランスジエニックマウスの血清から抽出したトランスサイレチン B ：ァテロコラーゲン包埋 D NAオリゴヌクレオチドを投与したトランスジェニ ックマウスの血清から抽出したトランスサイレチン
発明を実施するための最良の形態
本発明の第一の態様は、 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌタレ ォチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤に関するものである。
本発明において 「コラーゲン」 とは、 通常、 医療分野、 化粧品分野、 工業分野 および食品分野で用いられているあらゆる 「コラーゲン」 を意味する。 コラーゲ ンは、 K溶性または可溶化コラーゲンを用いることが好ましい。 7溶性コラーゲ ンとは、 酸性または中性の水や塩溶液に可溶であり、 可溶ィ匕コラーゲンとは、 酵 素により可溶化される酵素可溶ィ匕コラーゲン、 酸により可溶ィヒされる酸可溶ィ匕コ ラーゲン、 アル力リにより可溶ィ匕されるアル力リ可溶化コラーゲンがあり、 いず れも孔サイズが 1マイクロメートルのメンプレンフィルターを通過できることが 好ましい。 コラーゲンの水溶性はコラーゲンの架橋度に依存し、 架橋度が高いほ ど不溶ィヒすることから、 本発明に使用するコラーゲンの架橋度は、 例えば、 3量 体以下であることが好ましく、 より好ましくは 2量体以下である。 コラーゲンの 分子量は例えば、 約 3 0万から約 9 0万が好ましく、 約 3 0万から約 6 0万がよ り好ましい。 コラーゲンはいかなる動物種から抽出されたものでも用いることが 出来るが、 好ましくは脊椎動物から抽出されたもの、 さらに好ましくは哺乳類、 鳥類、 魚類から抽出されたもの、 より好ましくは変性温度が高い哺乳類、 鳥類か ら抽出されたコラーゲンが望ましい。 コラーゲンのタイプもいかなるタイプのコ ラーゲンでも良いが、 動物体内の存在量から I〜V型が好ましレ、。 具体的には例 えば、 哺乳動物の真皮から酸抽出した I型コラーゲンが挙げられ、 より好ましく は例えば、 仔牛の真皮から酸抽出した I型コラーゲン、 遺伝子工学的に生産され る I型および III 型コラーゲンなどが挙げられる。 また、 安全性の面から抗原性 の高 、テ口ぺプチドを酵素的に除去したァテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的 に生産されるァテロコラーゲンが望ましい。 また、 必要に応じて側鎖を修飾した コラーゲン、 架橋したコラーゲン等を用いることができる。 側鎖を修飾したコラ 一ゲンとしては、 例えばサクシニノレ化またはメチル化したコラーゲン等が挙げら れ、 架橋したコラーゲンとしては、 例えばダルタルアルデヒド、 へキサメチレン ジィソアナ一トまたはポリエポキシ化合物等で処理したコラーゲン等を挙げるこ とができる （フレダランス ·ジャーナル 1989-12, 104-109 、 特公平 7- 59522号 公報）
なお、 前記コラーゲンには他の生体親和性材料を混合することもできる。 生体 親和性材料としては、 例えばゼラチン、 フイブリン、 ァノレブミン、 ヒアルロン酸 、 へパリン、 コンドロイチン硫酸、 キチン、 キトサン、 アルギン酸、 ぺクチン、 ァガロース、 ハイドロキシアパタイト、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリジ メチノレシロキサン、 またはグリコール酸、 乳酸もしくはアミノ酸の重合体もしく はこれらの共重合体、 またはこれらの生体親和性材料の 2種類以上の混合物等が 挙げられる。
本発明における 「遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド」 とは、 ゲノム遺伝子を 変換させるに足りる長さと塩基配列を有する一本鎖のヌクレオチドである。 前記 オリゴヌクレオチドの長さは、 少なくとも 2 0塩基が好ましく、 2 5〜1 0 0塩 基がより好ましく、 3 0〜 7 5塩基がさらに好ましい。
前記オリゴヌクレオチドは、 遺伝子変換の効率の観点から R NA/D NAキメ ラオリゴヌクレオチドまたは D N Aオリゴヌクレオチドが好ましく、 合成および 精製の容易さから D N Aオリゴヌクレオチドがより好ましい。
前記オリゴヌクレオチドは、 生体内または細胞内でのヌクレアーゼに耐する安 定性を高めるため、 分子内に 1個以上の核酸類似体を有しても良い。 核酸類似体 とは DNA鎖あるいは R A鎖の酵素による分解を阻害することを目的としてデザィ ンされた類似体である。 例えば、 リン酸ジエステル結合部位の酸素原子を一つィ ォゥに置換したホスホロチォエート、 メチル基に置換したメチルホスホネート、 もしくはアミン基に置換したホスホ口アミデート、 またはリン酸ジエステル結合 部位の二つの酸素原子をィォゥに置換したホスホロジチォエート、 もしくは一^つ のィォゥ原子とメチル基に置換したメチルホスホロチォエート、 または糖部分に 化学修飾を施した 2，-0-me1:hyl RNA、 2' -0-methoxyethyl RNA もしくは Locked n ucleic acid (商品名） （LNA) 等を挙げることができる （バイオクリニ力、 12, 166-170, 1997 、 Biohemistry, 41, 4503-4510, 2002) 。 核酸類似体がオリゴヌ クレオチドに含まれる数をホスホロチォエート型核酸類似体を代表として表すと 、 ホスホロチォエート結合の数は、 4〜 6個程度が好ましい。 ホスホロチォエー ト結合は変異させる塩基から少なくとも 3塩基以上離れた位置の両側に導入され ることが望ましく、 変異させる塩基に近づけると、 却って遺伝子の変換効率が低 下する傾向がある。 より好ましくはオリゴヌクレオチドの両末端部位に 2塩基以 上連続してあることが望ましい。 前記オリゴヌクレオチドは、 塩基部分に化学修 飾を施したものであってもよい。
前記オリゴヌクレオチドの設計は、 変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセ ンス鎖と、 1〜 3塩基対のミスマッチ対合をほぼ中央部に含んでヮトソン 'クリ ック型塩基対を形成する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとなるようにするこ とが好ましい。
すなわち、 変換対象のゲノム遺伝子の 2 0塩基以上の塩基配列を選択し、 当該 配列の内部に位置する 1〜 3塩基の塩基配列を所望する塩基配列に置換し、 その 余の塩基配列をワトソン 'クリック型塩基対 （即ち、 二本鎖） を形成する相補的 配列に設計したオリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。 相補的配列は、 ゲノム遺伝子のセンス鎖に対するものであってもアンチセンス鎖に対するもので あってもよいが、 センス鎖に対するものがより好ましい。 このようなオリゴヌク レオチドとゲノム遺伝子とがヮトソン 'クリック型塩基対を形成すると、 当該塩 基対合中に 1〜 3塩基対のミスマツチ対合を含むことになる。 遺伝子の変換効率 を高めるためには、 前記ミスマッチ対合はオリゴヌクレオチドの中央部に位置す ることがより好ましい。 このような遺伝子変換用オリゴヌクレオチドを用いると、 ゲノム遺伝子中の 1 〜 3塩基の変異を部位特異的に修復したり、 逆にゲノム遺伝子中に 1〜 3塩基の 変異を部位特異的に導入することができる。 前記変異が 2塩基または 3塩基の場 合、 当該変異は連続していてもよく、 不連続であってもよい。
また、 前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドの設計は、 変換する遺伝子のセ ンス鎖またはアンチセンス鎖と、 1〜3塩基の欠失または挿入を含んでワトソン •クリック型塩基対を形成する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとなるように することが好ましい。
すなわち、 変換対象のゲノム遺伝子の 2 0塩基以上の塩基配列を選択し、 当該 配列の内部に位置する 1〜 3塩基の塩基配列を欠失させるようにし、 または当該 配列の内部に 1〜 3塩基の塩基配列を揷入するようにし、 その余の塩基配列をヮ トソン 'クリック型塩基対 （即ち、 二本鎖） を形成する相補的配列に設計したォ リゴヌクレオチドを設計することが好ましい。 相補的配列は、 ゲノム遺伝子のセ ンス鎖に対するものであってもアンチセンス鎖に封するものであってもよいが、 センス鎖に対するものがより好ましい。 このようなオリゴヌクレオチドとゲノム 遺伝子とがワトソン ·タリック型塩基対を形成すると、 当該塩基対合中に 1〜 3 塩基のループを含むことになる。 遺伝子の変換効率を高めるためには、 前記ルー プはオリゴヌクレオチドの中央部に位置することがより好ましい。
このような遺伝子変換用オリゴヌクレオチドを用いると、 ゲノム遺伝子中の 1 〜 3塩基の変異を部位特異的に欠失したり、 逆にゲノム遺伝子中に 1〜 3塩基の 変異を部位特異的に挿入することができる。 前記変異が 2塩基または 3塩基の場 合、 当該変異は連続していてもよく、 不連続であってもよい。
• RNAZD NAキメラオリゴヌクレオチドの設計は、 前記条件に加え、 例えば 図 1 ( a ) に示すように、 センス鎖およびアンチセンス鎖それぞれとワトソン. クリック型塩基対を形成可能な 2種の塩基配列部分と、 塩基対を形成しない任意 の介在配列部分とが連続した塩基配列を選択することができる。 R NA/D NA キメラオリゴヌクレオチドの設計方法については、 例えば、 U S 5 , 7 3 1 , 1 8 1 , U S 5 , 7 5 6 , 3 2 5に開示されている。
本発明の第二の態様は、 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌタレ ォチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤に関するものである。
本発明の遺伝子疾患治療剤に含まれるコラーゲンおよび遺伝子変換用のォリゴ ヌクレオチドは、 前記遺伝子変換促進剤に含まれるコラーゲンおよび遺伝子変換 用のオリゴヌクレオチドと同様である。
本発明の部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤 （以下、 本発明 の製剤ともいう） の剤型は、 溶液状、 懸濁液状、 ゲル状、 フィルム状、 固形状
(棒状、 粉末状） 等のいずれでもよく、 用途によって選択される。 例えば本発明 の部位特異的遺伝子変換促進剤を用いて基材接着性細胞の遺伝子変換を行う場合 には、 溶液状態あるいは懸濁液状態の製剤を細胞の培養液に添加する方法の他、 細胞へのオリゴヌクレオチドの接触を高めるために、 基材表面にフィルム状ある いは粉末状の製剤を固定して用いられることが望ましい。 また、 浮遊細胞の遺伝 子変換を行う場合には、 溶液状態あるいは懸濁液状態の製剤を用いることが望ま しい。 剤形選択の重要性は、 本発明の遺伝子疾患治療剤を生体に投与して遺伝子 疾患の治療を行う場合更に大きくなる。 全身の細胞を標的とした治療を行う場合 、 製剤は血管内に投与できるよう溶液状、 懸濁液状が望ましいが、 一般に遺伝子 治療の分野では、 予期し得ない副作用の発現の可能性を極力低減するために、 例 え正常細胞では遺伝子変換を行わないオリゴヌクレオチドを用いた場合でも、 遺 伝子変換の必要がない細胞へのオリゴヌクレオチドの導入は好ましくないと考え られている。 限定された部位の細胞に対してのみ遺伝子変換を行レヽた 、場合には 、 局所的な製剤の濃度を高く維持し、 力 周囲への製剤の拡散を抑制できるゲル 状、 フイルム状、 固形状の製剤を用いることが望ましい。 また、 患者の細胞を in vitroで本発明の遺伝子疾患治療剤で処理して所望の遺伝子変換を行 ヽ、 遺伝子 変換された細胞を患者に移植する際に遺伝子疾患治療剤を除去する必要がある場 合には、 除去の容易さ力、らフィルム状あるいは固形状の剤形が望まし 、。
これらの剤型の製造方法は、 国際公開第 0 1 / 9 7 8 5 7号パンフレツト (発 明の名称：オリゴヌクレオチド導入製剤） に記載されており、 本発明においては いずれの製造方法を用いてもよい。
以下に、 溶液状、 懸濁液状、 ゲル状の本発明の製剤として、 好ましい態様につ いて説明する。 本発明の製剤中のオリゴヌクレオチドが遺伝子変異を生じさせる機構は、 オリ ゴヌクレオチドと遺伝子との相同組換え、 あるいはォリゴヌクレオチドと遺伝子 がハイプリッドを形成することによるミスマッチ修復によると考えられているが いずれかは定かではない。 但しいずれの機構にせよ、 オリゴヌクレオチドと遺伝 子がオリゴヌクレオチドが標的としている部分でハイプリッドを形成する必要が ある。 通常、 細胞が細胞分裂期になく、 かつタンパク質を産生していない場合、 遺伝子は安定な二重鎖を形成し、 かつヒストンと相互作用することで高密度に凝 集して核内に存在するため、 外来のオリゴヌクレオチドが遺伝子の二重鎖を解離 させて標的の遺伝子鎖とハイプリッドを形成することは期待できない。 従って、 本発明の製剤中のオリゴヌクレオチドが標的の遺伝子鎖とハイプリッドを形成し て目的の遺伝子変異を行うには、 オリゴヌクレオチドが核内に存在する期間中に 細胞分裂に伴う遺伝子の複製、 あるいはタンパク質産生に伴う遺伝子の転写のた め、 遺伝子の二重鎖が解離する必要がある。 一般に細胞が外的要因で傷害を受け た場合、 細胞のタンパク産生能及び細胞分裂能が著しく低下することが知られて いることから、 本発明の製剤は、 製剤が接触しオリゴヌクレオチドを導入する細 胞に傷害を与えないよう処方設計されることが望ましい。 即ち、 溶液状、 懸濁液 状、 ゲル状の本発明の製剤は細胞と等張であることが望ましい。 本発明の製剤に リン酸塩とナトリウム塩を含有する場合、 リン酸塩 0 . 1 ^1カ らリン酸塩0 . 0
1 M、 ナトリウム塩 0 . 1 4 Mの範囲内で含有することが望ましく、 リン酸塩 0 . 0 5 M、 ナトリウム塩 0. 0 7 Mからリン酸塩 0 . 0 1 M、 ナトリウム塩 0 .
1 4 Mの範囲で含有することがより好ましい。
さらに、 本発明の製剤は、 遺伝子変換効率を高めるためには遺伝子変換用のォ リゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体となるよう'に製造することが好 ましい。 ここで、 「会合体」 とは、 分子中に多数の正電荷を帯びたコラーゲンと 負電荷を帯びたォリゴヌクレオチドとが電気的に引き合つた複合体が他のコラー ゲンと会合したものを意味する。 この会合体の形成は、 長径約 3 0 0 n m、 直径 約 1 . 5 n mの円柱状のコラーゲン分子が主として分子の長軸方向と平行に会合 するものであり、 主として会合体は分子の長軸方向に伸張する。 したがって、 会 合体は、 伸張の程度により繊維状、 微繊維状および粒子状等の様々な形状をとる ことができる。 この中でも、 本発明における会合体はオリゴヌクレオチドの細胞 内、 特に核内への移行効率の点から粒子状であることが好ましい。
前記粒子状の会合体の長径は、 300ηιη〜50μ mが好ましく、 300 n m 〜30 μπιがより好ましい。
粒子状の会合体を形成させるためには、 混合するコラーゲンとオリゴヌクレオ チドの濃度と割合、 塩濃度、 温度、 pHなどを調整する。
塩が存在しない場合、 会合体の長径は混合時のコラーゲン濃度に依存するため 、 上記の好ましい長径の会合体を得るには、 混合時のコラーゲンの濃度が 1. 0 〜0. 005重量0/。、 より好ましくは 0. 5〜0. 005重量％、 更により好ま しくは 0. 05〜0. 005重量％であることが望ましいが、 コラーゲン濃度が 低下するに従って会合体を形成するオリゴヌクレオチド濃度も低下する。 より好 ましい会合体を高濃度に得る方法として、 予めコラーゲンを 0. 01M〜0. 1 Mリン酸塩および 0. 07M〜0. 14 Mナトリウム塩を含有する溶液に溶解し て微細なコラーゲン線維またはコラーゲン分子会合体を形成し、 また場合によつ てコラーゲン分子を単分子状態で維持し、 これにオリゴヌクレオチドを加えてコ ラーゲン線維、 コラーゲン分子会合体またはコラーゲン単分子と会合体を形成す る方法がある。 また、 コラーゲンの線維形成には温度が影響を与えるため、 上記 の好ましい長径の会合体を得るには、 混合時の温度は 1〜 10°Cが望ましく、 よ り好ましくは 1〜5°Cである。
従って、 本発明の溶液状の製剤は、 コラーゲンを、 0. 01M〜0. 1Mリン 酸塩おょぴ 0. 07M〜0. 14Mナトリゥム塩を含有する溶液に溶解し、 これ に同濃度のリン酸塩および同濃度のナトリゥム塩を含有する遺伝子変換用のオリ ゴヌクレオチド溶液を加えて 1〜： L 0 °Cの温度下で攪拌することにより得られる 混合時のコラーゲンの濃度は、 通常 50 μ gノ m 1〜： L OmgZm 1であり、 混合時のォリゴヌクレオチドの濃度は、 通常 20 μ g Zm 1〜 1 m g /m 1であ る。
会合体を形成したコラーゲン分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノ マー数との比は、 1 ： 1〜1 ： 200であり、 好ましくは 1 ： 3〜1 ： 150、 より好ましくは 1 ： 3 ~ 1 ： 1 2 0である。
混合時の溶液の p Hは、 p H 5〜9、 好ましくは p H 6〜8である。
このような条件下で本発明の製剤を製造することにより、 粒子状の会合体を含 む溶液状の製剤を提供することができる。
前記溶液状の製剤中のコラーゲンの濃度は、 主にィンビトロでの遺伝子変換や オリゴヌクレオチドの核内局在に使用する場合、 0. 0 1〜1 . 0重量0 /0の範囲 で含有することが好ましい。
前記溶液状の製剤中のコラーゲンの濃度は、 主にインビポでの遺伝子変換、 遺 伝子治療やオリゴヌクレオチドの核内局在に使用する場合、 0. 0 1〜0. 2 5 重量％の範囲で含有することが好ましい。
更に本発明の溶液状製剤は、 オリゴヌクレオチドの安定ィ匕のために EDTAを 0 0 1〜 1重量％、 容器及び投与器具への吸着防止のため界面活性剤を 0 . 0 1〜 1重量％含有することができる。
以下に、 フィルム状、 固形状 （棒状、 粉末状） の本発明の製剤として、 好まし い態様について説明する。
フィルム状、 固形状製剤は上記の溶液状製剤を濃縮、 乾燥して得られる。 即ち 上記の溶液状製剤を平面なプレート上にキャストして、 4 0 °C以下の温度で乾燥 させることによりフィルム状の製剤を調製できる。 また、 溶液状製剤を遠心して オリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を沈殿させ、 その沈殿物を 4 0 °C以下 で乾燥させることで粉末状の製剤を調製できる。 このようにして得られた粉末状 の製剤あるいは溶液状製剤を凍結乾燥して得られたスポンジ状化合物を圧縮して 棒状の製剤を調製する方法、 あるいは粉末状の製剤とスポンジ状製剤に少量の水 を加えて練合して高濃度の溶液とし、 ノズルから押し出して 4 0 °C以下で乾燥さ せて棒状の製剤を調製することができる。
フィルム状、 固形状製剤では、 溶液状製剤に含有された添加剤に加えて、 製剤 の形状を保つ目的で、 アルブミン、 ゼラチン、 コンドロイチン硫酸、 ァガロース 、 ソルビトール、 スクロース等の製剤上許容される添加剤を製剤全体の 1 0〜8 0重量％の範囲で含有できる。
粉末状製剤の粒子径は、 賦形剤により様々な形状を取り得るが、 含有されるォ リゴヌクレオチドとコラーゲンが形成する会合体の長径は、 300nm〜50/i mが好ましく、 300 nm〜30 Aimがより好ましい。
また、 棒状の固形状製剤は局所に注射的に投与できるように、 直径が 0. lm m〜2. Omm、 長さ 3mm〜2 Ommが望ましく、 直径が 0. 3 mm〜 1. 0 mm、 長さ 3 mm〜l Ommがより望ましい。
固形製剤に含有されるオリゴヌクレオチドの量は、 通常固形製剤 1 m gあたり 10// §〜100^ §、 コラーゲン量は、 通常固形製剤 lmgあたり 990/z g 〜250 μ gである。
本発明の第三の態様は、 細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任 意に変換する方法に関する。 すなわち、 本発明の変換方法は、 本発明の部位特異 的遺伝子変換促進剤を細胞に接触させることにより、 当該促進剤中に含まれるォ リゴヌクレオチドを接触した細胞の核内に移入、 局在させ、 所望の塩基の変換を 行うことを特徴とする。
変換対象の細胞は、 真核細胞であれば特に制限されるものではなく、 酵母、 真 菌、 植物細胞おょぴ動物細胞などが挙げられるが、 好ましくは哺乳動物細胞、 酵 母または真菌である。
特定の塩基が変換されたかどうかは、 本発明の遺伝子変換促進剤を接触させて 一定の期間後に細胞を回収し、 P C R法等により特定の塩基を含む遺伝子領域を 増幅して調べることができる。
本発明の遺伝子治療剤は、 種々の遺伝子疾患の治療に使用することができる。 治療対象の疾患としては、 遺伝子の点変異 （1〜 3塩基の変異を含む） 、 欠失変 異または挿入変異 （1〜 3塩基の変異を含む） により正常なタンパク質が発現さ れないことに起因する疾患があげられる。 そのような疾患としては家族性ポリア ミロイドニューロパチー （FAP) 、 フアプリ一病、 ウイノレソン病、 サラセミア 、 鎌形赤血球症、 筋ジストロフィー、 嚢胞性線維症、 第五因子ライデン異常症、 ビォチン依存性マルチプルカルボキシラーゼ欠損症等が挙げられる。
FAPの場合、 点変異により トランスサイレチン （TTR) の 30番目のパリ ンがメチォニンに変異した異型 TTRに起因する疾患 （I型FAP) や、 TTR の 84番目のイソロイシンがセリンに変異した異型 TTRに起因する疾患 （II型 FAP) などが代表例として挙げられる。 また、 FAPに関しては、 これまで 9 0種を越える様々な T T Rの点変異による F A Pが報告されており、 本遺伝子治 療剤は、 これらすベてのタイプの FAPに適用可能である。 TTRは、 主に肝臓 で産生されることから、 肝細胞を標的として本発明の遺伝子治療剤を投与するこ とができる。 また、 異型 TTRによるアミロイド沈着は眼の硝子体の白濁等を伴 う視力障害をも引き起し、 この障害は、 本発明の遺伝子治療剤を直接眼の網膜に 投与することにより治療することができる。
本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、 治療目的に応じて経皮、 皮下、 内、 経鼻、 経肺、 筋肉内、 脳内、 組織 （S蔵器表面、 β内） 、 血管内 （静脈内、 門脈内） または経口投与することができる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、 溶液状製剤の場合はその液量で、 フィルム 状剤型の場合はその面積で、 棒状製剤の場合はその径と長さで、 さらに粉末状製 剤の場合はその粉体体積もしくは重量で容易に調節することができる。
本発明の遺伝子治療剤の最適な投与量は、 適応疾患、 投与部位、 投与方法、 剤 型の種類、 患者の性別、 年齢、 症状などによって異なるが、 製剤中のオリゴヌク レオチドの量としては、 患者に対して例えば、 0. 00 lmg/k g〜4 Omg /k g、 好ましくは 0. 0 lmg/k g〜3 Omg/k gである。
投与後の遺伝子治療剤中のオリゴヌクレオチドは、 効率よくゲノム遺伝子中の 変異を変換する、 すなわち、 変異を修復することができる。 FAPの場合、 遺伝 子の修復の結果正常な TTRが産生され、 異型 TTR量は低下して、 アミロイド の形成を抑制することにより、 FAPの症状が改善される。
本発明の第四の態様は、 少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んで なるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤を提供する。 本製剤においては、 ォ リゴヌクレオチドは前記遺伝子変換用ォリゴヌクレオチドの条件に合致するよう に設計されたものを使用することができるが、 オリゴヌクレオチドとしての通常 の長さを有する任意のオリゴヌクレオチドも好適に使用することができる。 本製剤は、 前記遺伝子変換促進剤と同様に種々の剤型をとることができるが、 溶液状の剤型が好ましい。 溶液状の本製剤に含まれるリン酸塩およびナトリウム 塩の濃度は、 前記と同様である。 また、 その他の条件 （コラーゲンの濃度、 コラ 一ゲン分子数とォリゴヌクレオチドモノマー数との比、 混合時の溶液の p Hおよ び温度など） は、 前記と同様である。
本製剤を細胞に接触させることにより、 製剤中に含まれるオリゴヌクレオチド を細胞の核内に効率的に局在させることができる。 オリゴヌクレオチドが細胞の 核内に局在したかどうかは、 当該オリゴヌクレオチドを蛍光色素等で標識してお き、 蛍光顕微鏡等により観察することにより確認することができる。
実施例 ' . 以下、 実施例等により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によりなんら限定されるものではない。 実施例において、 コラーゲン濃度を示す %は、 重量％を意味する。
製造例 1
部位特異的遺伝子変換促進剤の調製
下記試験例および実施例で使用する F A Pに関連する T T Rの遺伝子の部位特 異的変換促進剤およびフアプリ一病に関連する a—ガラクトシダーゼの遺伝子の 部位特異的変換促進剤を調製した。 配列番号 2〜 1 2に記載の塩基配列を有する オリゴヌクレオチド 3. 8 3〜50 μΜと 10 μ g/m 1〜 1 g/m 1のァテロ コラーゲンとを等量、 0. 14 Mの塩ィ匕ナトリウムを含む 1 OmMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0) 中で 2 °Cで混合し、 オリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を 含む溶液製剤 （ァテロコラーゲン包埋 D N Aォリ'ゴヌクレオチド） を調製した。 実施例 1
HepG2細胞での遺伝子変換率
1 ) 遺伝子変換用のォリゴヌクレオチド
FAPで最も多くみられるのは、 TTRの 30番目のパリンがメチォニンへ変 異した FAP type I (FAP ATTR Val30Met)である。 そこで、 正常 TTR遺伝子を 有する HepG2細胞の正常 TTR遺伝子を ATTR Val30Met を発現するように変換す るため、 図 1 (b) 〜 （d) に示すような DN Aオリゴヌクレオチドを設計した 。 D N Aォリゴヌクレオチドの最適な長さを検討するために、 25mer (配列番号
： 2) 、 45mer (配列番号： 3) 、 74mer (配列番号： 4) の 3種類を合成した 。 また、 前記オリゴヌクレオチドは、 ヒト TTR遺伝子に基づいて設計されたも のであり、 マウスおょぴゥサギ TTR遺伝子に基づ V、て設計して合成した 74mer は、 それぞれ配列番号： 5および配列番号： 6に記載している。
2) トランスフエクシヨン方法
HepG2細胞への遺伝子導入効率を検討するために、 導入するオリゴヌクレオチ ドの 5，末端を F I TCで標識した。 Fugene6 (Roche製） 、 ExGen 500 (MBI Fe rmentas製） 、 HVJ "-リボソーム （大阪大学大学院医学系研究科、 遺伝子治療学、 金田安史博士より供与） または製造例 1で調製したァテロコラーゲン製剤 (F I T Cで標識したォリゴヌクレオチドを含有） を用いて、 トランスフエクション法 の最適化を検討した。
3) DNAオリゴヌクレオチドによる HepG2細胞における遺伝子変換率の検討 前日に 2xl05 の HepG2細胞 （大日本製薬より購入） を 12 well plate にまき、
0.1 %ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチド 74 mer (3. 8 3 μΜ) を 300 μΐ および 600 μΐずつトランスフエクシヨンし、 5日（300/xl 添加時） あるいは 6 日（600μ1 添加時） 後に細胞を回収した。 回収した細胞から DN Αを 抽出し、 変異配列に相当する塩基が 3'末端になるように設計した変異 DN A特異 的ォリゴヌクレオチドを用いて異常ァレル （ATTR Val30Met)のみ効率よく増幅す るよつに設定した MASA法 (mutant allele specific amplificationリ と real tim e PCR を用いて遺伝子変換率を算定した。
4) ァテロコラーゲンに包埋したオリゴヌクレオチドの性状の検討
8 μΐ のァテロコラーゲンとオリゴヌクレオチドとの会合体（製造例 1で調製 したもの） を、 一本鎖 DN Αを染色する 5倍希釈の一本鎖核酸染色蛍光試薬 Y0Y0 (モレキュラープローブ社） 2μ1 と混合し、 蛍光顕微鏡下で観察した。
5) D Ν Αオリゴヌクレオチドによる HepG2細胞における遺伝子変換の最適条件 の検討
前日に 2xl05 の HepG2細胞を 12 well plate にまき、 0.1 %ァテロコラーゲン 包埋 DN Aオリゴヌクレオチド （10μΜ 25πΐ6ΐ·， 10 μΜ 45mer, 10 μΜ 74mer) , または 0.5 %ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド （50 M 25mer, 2 5 μΜ 45mer， 10 μΜ 74mer)を 600 μ 1 (培養液 600 μ 1)ずつトランスフエクショ ンし、 5日後に細胞を回収した。 回収した細胞から DNAを抽出し、 MASA法と re al time PCR を用いて遺伝子変換率を算定した。
以上の実験結果に基づき、 遺伝子の変換効率の確認を行つた。
(A) オリゴヌクレオチドの細胞核内への局在率
HepG2細胞への DNAオリゴヌクレオチドの核内局在率は、 Fugene6、 ExGen 500、 HVJ -リボソームおよびァテロコラーゲン製剤の中で、 図 2 (a) 、 (b) に示 すようにァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドがほぼ 5 0%の pG2 細胞に取り込まれ、 更に導入された DN Aオリゴヌクレオチドが核に局在してい ることがわかる。 他の方法ではすべてこれよりも弱い蛍光を示し、 核への局在率 が低かった。
(B) DNAオリゴヌクレオチドによる HepG2細胞における遺伝子変換率 これまでの報告では、 DNAオリゴヌクレオチドを使った実験では、 最適な D
NAオリゴヌクレオチドの長さを調べるために、 25mer〜74mer の DNAオリゴ ヌクレオチドを使って遺伝子修復の効率を比較検討しており、 45mer、 74mer の DNAオリゴヌクレオチドが比較的遺伝子修復率が高いことが知られていること から、 ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド 74mei- (配列番号： 4) を用いて、 HePG2 細胞における遺伝子変換率を調べたところ、 前記 3) の条件下 では 300 μΐ及び 600 μΐ のァテロコラーゲン包埋 D Ν Αオリゴヌクレオチド（ ォリゴヌクレオチド濃度： 3.83 μ Μ) を添加した場合、 それぞれ 0.5%及ぴ 1 %弱 の遺伝子変換率であったのに対し、 前記 5 ) (オリゴヌクレオチド濃度： 10 /X Μ ) では製剤中のァテロコラーゲン濃度を 0.1 %から 0.5 %に上げ、 600 μΐ のァ テロコラ一ゲン包埋 D Ν Αォリゴヌクレオチドを 600 μ 1 の細胞培養液に添加す ることにより遺伝子変換率が 1 %から 1 0%に上昇した。 本製剤を用いた遺伝子 変換率は、 一定のレベルまで用量依存的に上昇することが考えられる。 尚、 遺伝 子変換率はァテ口コラーゲン包埋 DN Αォリゴヌクレオチド 25mer (配列番号： 2) ではァテロコラーゲン濃度が 0. 1 % (DN Aオリゴヌクレオチド濃度： 1 0 μΜ) のとき 0%、 0. 5% (DN Αオリゴヌクレオチド濃度： 50 μΜ) の とき約 0. 5 %、 45mer配列番号： 3 ) ではァテロコラ一ゲン濃度が 0. 1 % (DN Aオリゴヌクレオチド濃度： Ι Ο μΜ) のとき 0%、 0. 5% (DNAォ リゴヌクレオチド濃度： 2 5 μ M) のとき約 1 %であった。
これらの結果は、 本発明の用いる DNAオリゴヌクレオチドの鎖長は、 4 5 mer 以上が望ましく、 より望ましくは 74mer以上であることを示している。
(C) ァテロコラーゲンに包埋した D NAオリゴヌクレオチドの性状の検討 前記 4 ) の蛍光顕微鏡による観察の結果を図 3に示す。 図 3より DNAオリゴヌ クレオチド単独では全く粒子は観察されないのに対して、 0. 05%ァテロコラーゲ ン包埋 D N Aオリゴヌクレオチド （配列番号： 5 ) では、 会合体粒子が観察され 、 会合体粒子の平均長径は 1 8 . 7 3 μ mであった。
実施例 2
D NAオリゴヌクレオチドによる家兎の眼における遺伝子変換の検討
家兎の前眼房水を除去した後、 0. 5 %ァテロコラーゲン包埋 D NAオリゴヌク レオチド （10 74mer、 配列番号： 6 ) または 1 %ァテロコラーゲン包埋 D N Aオリゴヌクレオチド （30 μ Μ 7½er)を硝子体に直接注入 （左眼） 、 あるいは硝 子体切除後の硝子体に注入 （右眼） した。 1ヶ月後に眼を摘出し、 R NAを抽出 し、 逆転写酵素を用いて、 first strand cDNA を合成した。 この cDNAを铸型とし て、 MASA法と real time PGR を用いて、 正常 T T Rおよび ATTR Val30Met のコピ 一数を決めることで遺伝子変換率を算定した。
遺伝子変換率は、 ATTR Val30Met のコピー数 Z (ATTR Val30Met のコピー数 + 正常 T T R遺伝子のコピー数） X 100 (%)で算定した。 1%ァテロコラーゲンで包 埋した 74mer の D NAオリゴヌクレオチドの方が 0. 5%ァテロコラーゲンで包埋し た 74mer の D NAオリゴヌクレオチドょりも遺伝子変換率が高かった。 また、 硝 子体切除を施行した方がより高い遺伝子変換率 （約 1 %) を示した。
実施例 3
マウス肝臓における遺伝子変換の検討
正常おょぴ異常マウストランスサイレチン （ATTR Val30Met ) 遺伝子を有する ヘテロトランスジエニックマウスならびに異常マウストランスサイレチン遺伝子 を有するホモトランスジエニックマウス （変異導入マウスを用いた遺伝性アミ口 イド一シス発症機構の解析、 前田秀一郎ら、 厚生科学研究費補助金特定疾患対策 研究事業 「アミロイドーシスに関する研究」 平成 1 3年度総括研究報告書、 Ρ39- 41) に下記製剤 1〜3を投与し、 遺伝子変換率を調べた。
オリゴヌクレオチド：遺伝子変換を行う塩基を中央に配し、 両末端 3塩基をホス ホロチォエートオリゴヌクレオチドとした 7 4 mer (配列番号： 5 )
製剤：製剤 1 ：オリゴヌクレオチド 10 μ M，ァテロコラ一ゲン 0. 5%
2 ：オリゴヌクレオチド 10 μ Μ,ァテ口コラーゲン 0. 2%
製斉 IJ 3 ：オリゴヌクレオチド 10 μ Μ，ァテ口コラーゲン 0. 05%
投与方法：マウスの肝臓の一つの肝葉のニケ所に 0. 2mlずつ前記製剤を直接投与 (トータル 0. 4ml)した。
3週間飼育後、 製剤を投与した肝葉と、 製剤を投与していない肝葉を採取して 遺伝子を抽出し、 MASA法と real time PGRを用いて両肝葉について全トランスサ ィレチン遺伝子中の正常遺伝子の割合を測定した。
また、 3週間飼育後、 無処置のホモトランスジエニックマウス（マウスのトラ ンスサイレチン遺伝子 ATTR Val30Metのもの） および製剤を投与したホモトラン スジエニックマウスより血液を採取し、 血清に抗トランスサイレチン抗体をカロえ 免疫沈降をさせ抽出したトランスサイレチンを質量分析装置 (matrix-assisted 1 aser desorption ionization/ time-of -flight mass spectrometry) を用い一角早 析し、 正常トランスサイレチンが産生されているかどうかを検討した。
結果：製剤 3投与へテロトランスジエニックマウスの両肝葉での正常遺伝子の割 合は、 製剤を投与した肝葉で 6 0 . 7 %、 製剤を投与していない肝葉で 5 1 %で あった。 従って、 1 0 %の遺伝子修復効果が得られたと考えられる。 製剤 2投与 マウスは飼育中に死亡した （原因不明） 。 製剤 1投与マウスでも遺伝子修復効果 が得ら'れたが僅かであった。 製剤 3投与ホモトランスジエニックマウスの両肝葉 での遺伝子の正常ィ匕率は、 製剤を投与した肝葉で 8 . 7 %、 製剤を投与していな い肝葉で 0 %であった。 したがって、 約 9 %の遺伝子修復効果が得られた。 また 、 質量分析の結果、 未処置のトランスジエニックマウスでは ATTR V30Mの 13， 672 Daのピークを認めたが（図 4A)、 製剤 3を投与したトランスジエニックマウスで は 13, 672Daのピークに加えて、 Met が Val に修復することで分子量 32Daマイナス にシフトした I3， 640 Da (図 4B, | ) のピークを認めた。 これらの結果は、 ァテ 口コラーゲン包埋 D N Aォリゴヌクレオチドを肝臓に直接投与することで、 異常 トランスサイレチン遺伝子が修復され、 正常トランスサイレチンが産生されたこ とを示しており、 本発明のァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチドには 、 FAP の治療効果があるといえる。
実施例 4
HepG2 細胞での遺伝子変換率 (2)
1) 遺伝子変換促進剤の調製
DNAオリゴヌクレオチドとして 51mer の YKS— 3 84 (配列番号： 7) 、 配列番号 7において 1， 2， 3, 47， 49 および 50位を Locked nucleic acid (商品名） (LNA) に置換した YKS— 3 8 2、 ならびに配列番号 7において 1, 2, 3， 10, 11， 12 , 14， 34, 35, 38, 47， 49および 50位を Locked nucleic acid (商品名） （LNA) に置換 した YK S - 3 8 3の 3種類を合成した。 また、 前記オリゴヌクレオチドは、 ヒ ト TTR遺伝子に基づいて設計されたものである。 前記製造例 1に記載の方法に より、 前記 3種類のオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤 ( 0. 5 %ァテロコラーゲン包埋 D N Aォリゴヌクレオチド （ 1 0 z M) ) を調製 した。
2) HepG2細胞における遺伝子変換率の検討
前日に 2xl05 の HepG2細胞 （大日本製薬より購入） を 12 well plate にまき、 前記 1 ) で調製した 0. 5 %ァテロコラーゲン包埋 D N Aォリゴヌクレオチド 51 m er (1 0 μΜ) を 600 μΐ ずつトランスフエクシヨンし、 6 日後に細胞を回収し た。 対照として DN Αオリゴヌクレオチド （YKS— 3 84 (配列番号： 7) 単 独の溶液を調製し、 この溶液を用いて同様にトランスフエクシヨンした。 回収し た細胞から DN Aを抽出し、 変異配列に相当する塩基が 3'末端になるように設計 した変異 DNA特異的ォリゴヌクレオチドを用いて異常ァレル （ATTR Val30Met) のみ効率よく増幅するように設定した MASA法 (mutant allele specific amplifi cation) と! ~eal time PGR を用いて遺伝子変換率を算定した。
以上の実験結果に基づき、 遺伝子の変換率の確認を行ったところ、 ァテロコラ 一ゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド中の DNAオリゴヌクレオチドとして YK S - 3 84を用いた場合は 4 %、 6個の LNA を含む YK S - 3 8 2では 1 0 %、 1 3個の LNA を含む Y KS- 3 8 3では 2 3 %であった。 Y K S _ 3 84単独で は遺伝子変換が起こらなかつた。 . 実施例 5
DNAオリゴヌクレオチドによる HepG2細胞における TTR遺伝子上の 50番目及 ぴ 1 14番目のアミノ酸変換をコードした塩基の変換率の検討
実施例 1の検討により、 ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチドを用 いることで、 HepG2細胞における TTR遺伝子上の 30番目のアミノ酸をコードし た塩基の変換が、 DNAオリゴヌクレオチドを単独で用いた場合に比べて促進で きることが明らかになったことから、 FAP の原因となる TTR遺伝子上の他のアミ ノ酸をコードした塩基の変換が、 ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチ ドを用いることで促進できることを検討した。
1) 遺伝子変換促進剤の調製
DNAオリゴヌクレオチドとして、 トランスサイレチン遺伝子の 50番目のセ リンがイソロイシンに変異した FAP ATTR Ser 50 lie及ぴ 1 14番目のチロシン がシスティンに変異した FAP ATTR Tyr 114 Cysの遺伝子を正常化する効果を検討 するために、 ヒト TTR遺伝子に基づいて DNAオリゴヌクレオチド 74mer (配列 番号： 8、 9、 遺伝子変換を行う塩基を中央に配し、 両末端 3塩基をホスホロチ ォエートオリゴヌクレオチド） を合成した。 前記製造例 1に記載の方法により、 前記 2種類の DNAオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤 ( 0. 5%ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド （Ι Ο^Μ) ) を調製 した。
2) HepG2細胞における遺伝子変換率の検討
前曰に 105 の HepG2細胞を 12 well plate にまき、 1) で調製した 0.5 %ァ テロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド （ΙΟμΜ 74mer)と DNAオリゴヌ クレオチド （ΙΟμΜ 74mer)とを 600 μΐ (培養液 600 μ 1)ずつトランスフエクショ ンし、 5日後に細胞を回収した。 回収した細胞から DNAを抽出し、 MASA法と re al time PCR を用いて遺伝子変換率を算定した。
ヒ ト トランスサイレチン遺伝子上の 50番目のアミノ酸をコードした塩基を変 換できるように設計した DNAオリゴヌクレオチド （配列番号： 8 ) 、 ヒトトラン スサイレチン遺伝子上の 1 14番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるよ うに設計した DNAオリゴヌクレオチド （配列番号： 9 ) を各々、 ァテロコラーゲ ン包埋 DN Aオリゴヌクレオチド （ァテロコラーゲン濃度： 0. 5%、 DNAォ リゴヌクレオチド濃度： 10 μ M) 及び DNAォリゴヌクレオチド単独で pG2 細胞に添加した。 結果、 塩基の変換率は、 ヒトトランスサイレチン遺伝子上の 5 0番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計した D N Aォリゴヌ クレオチドでは、 DNAオリゴヌクレオチド単独で 0 %、 ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドで 1. 61%、 ヒ ト トランスサイレチン遺伝子上の 1 14番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計した DNAオリゴ ヌクレオチドでは、 DN Aオリゴヌクレオチド単独で 0%、 ァテロコラーゲン包 埋 DNAオリゴヌクレオチドで 0. 58%であった。 この結果は、 本発明のァテ 口コラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドは、 塩基変異部位が異なる場合でも DNAオリゴヌクレオチドによる塩基変換を促進できることを示している。 更に このことは、 本発明はタイプの異なる F A Pに対して治療薬を提供できることを 示している。
実施例 6
ヒト網膜上皮細胞における遺伝子変換率の検討
実施例 1の検討により、 ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチドを用 いることで、 HepG2細胞における TTR遺伝子上の 30番目のアミノ酸をコードし た塩基の変換が、 DNAォリゴヌクレオチドを単独で用いた場合に比べて促進で きることが明らかになった。 一方、 FAPでは異常な TTR は肝臓だけでなく網膜 でも産生されることから、 ヒ ト網膜細胞でも TTR'遺伝子上の塩基の変換が、 ァテ 口コラーゲン包埋 DN Aォリゴヌクレオチドを用いることで促進できることを検 討した。
1) 遺伝子変換促進剤の調製
ヒ ト TTR遺伝子に基づいた DN Aオリゴヌクレオチド （配列番号： 4) につい て、 前記製造例 1に記載の方法により、 D N Aオリゴヌクレオチドとコラ一ゲン の会合体を含む溶液製剤 (0. 5%、 0. 25%、 0. 1%ァテロコラーゲン包 埋 DN Aオリゴヌクレオチド （10 Μ) ) を調製した。
2) ヒ ト網膜上皮細胞における遺伝子変換率の検討 前日に 2xl05 cellのヒト網膜上皮細胞 （ARPE 19株） を 12 well plate に まき、 0.1 %、 0.25%、 0.5 %ァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチド (10 μ M 74mer)を 600 μ 1 (培養液 600 μ 1)ずつトランスフエクシヨンし、 5曰後 に細胞を回収した。 回収した細胞から DNAを抽出し、 MASA法と real time PCR を用いて遺伝子変換率を算定した。
ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチドをヒト網膜上皮細胞に添加し た場合、 塩基の変換率は、 ァテロコラーゲン濃度が 0. 1 %の時 0 %、 0. 25 %の時 5. 91%、 0. 5%の時 2. 08%であった。 この結果は、 本発明のァ テロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドは、 ヒト肝臓細胞だけでなくヒト 網膜細胞でも D N Aォリゴヌクレオチドによる塩基変換を促進できることを示し ている。
実施例 7
フアブリ一病に関連する遺伝子変異の変換率の検討
1) 遺伝子変換促進剤の調製
DNAオリゴヌクレオチドとしてフアプリ一病で見られる a—ガラクトシダー ゼ遺伝子の変異に基づいて 125番目または 374番目のアミノ酸を変換する D N Aオリゴヌクレオチド （配列番号： 10または 1 1、 遺伝子変換を行う塩基を 中央に配し、 両末端 3塩基をホスホロチォエートオリゴヌクレオチド） を合成し た。 前記実施例 6に記載の方法により、 前記 3種類のォリゴヌクレオチドとコラ 一ゲンの会合体を含む溶液製剤 （ 0. 1 %、 0. 25、 0. 5 %ァテロコラーゲ ン包埋 DN Aオリゴヌクレオチド （10 μΜ) ) を調製した。 -
2) フアブリ一病患者由来ヒ ト繊維芽細胞における遺伝子変換率の検討
製剤投与当ョに約 50%の細胞密度となるように前日に播種したフアブリ一病患 者由来のヒト繊維芽細胞を 12 well plate にまき、 0.1 %、 0.25%, 0.5 %ァテ 口コラーゲン包埋 D N Aォリゴヌクレオチド （10 μΜ 74mer)を 600 μ 1 (培養液 60 0 μΐ)ずつトランスフエクシヨンし、 7日後に細胞を回収した。 回収した細胞か ら DNAを抽出し、 MASA法と real time P C Rを用いて遺伝子変換率を算定した
3種類のァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドをヒト繊維芽細胞に 添加した場合、 塩基の変換率は次の通りであった。
125番目のァミノ酸を変換する D N Aォリゴヌクレオチド （配列番号： 10) ァテロコラーゲン濃度：塩基変換率
0. 1% : 0%、 0. 25% : 0%、 0. 5 %： 0. 95%
374番目のアミノ酸を変換する DN Aオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 1) ァテロコラーゲン濃度：塩基変換率
0. 1 %： 1. 3%、 0. 25% : 0%, 0. 5 %： 0 %
この結果は、 本発明のァテロコラーゲン包埋 DNAオリゴヌクレオチドは、 ファ ブリー病に関連する遺伝子変異に対しても DNAオリゴヌクレオチドによる塩基 変換を促進できることを示している。 更にこのことは、 本発明はフアブリ一病に 対してその治療薬を提供できることを示している。
MASA法を利用した real time PCR により算出した遺伝子変換率の妥当性評価
1) 実施例 1の 5) で 0. 5%ァテロコラーゲン包埋 DN Aオリゴヌクレオチド (ΙΟμΜ 74mer ) を添加した HepG2細胞から抽出した DNAを用いて、 TTR遺伝 子のェクソン 2 (変異部位のェクソン） を増幅し、 DH5 α細胞にトランスフォー ムした。 得られたコロニーからプラスミド DNAを精製し、 制限酵素 Nsi 1で切 断することにより、 正常 TTR遺伝子から ATTR Val30Met遺伝子への変換率を検討 した。 その結果、 60コ口-一のうち 50コロニーに遺伝子変換が認められ （8. 3 %) 、 MA S A法を利用した real time PCRの結果 （10%) とほぼ同じ結果 が得られた。
2) FAP ATTR Val30Met ホモ接合体患者から得られた DNAを正常者の DNAで 希釈して得られた 100%、 10。に 1 %ATTR Val30Met遺伝子をスタンダード として、 50%、 25%， 12. 5%, 6. 25%， 3. 125 %ATTR Val30Me t遺伝子について MAS A法を利用した real time PCRを行い、 理論値と測定 値の相関を検討した。 結果、 理論値と計算値は一次の相関を示し、 相関係数 0.
9956と良好な相関を認、めた。
3) real time PCRにおいて、 系中に残存した DNAオリゴヌクレオチドがテ ンプレートとして働いて P CR産物が生じ、 結果として遺伝子変換が生じたよう に計算される可能性を否定するため、 D NAオリゴヌクレオチド (配列番号： 4 ) をテンプレートとして real time P C Rを行なった。 結果、 D NAオリゴヌク レオチドをテンプレートとして使用した場合は、 当初から緩やかな上昇カーブが 見られ、 融角军曲線解析による P C R産物の Tm値がスタンダード遺伝子 (ATTR Va 130Met) と全く異なることから、 D NAオリゴヌクレオチドはテンプレートとし て働かないことが明らかになった。
以上の結果より、 MA S A法を利用した real time P C Rにより算出した遺伝 子変換率の妥当性が検証された。
産業上の利用可能性
本発明により、 細胞のゲノム遺伝子上に存在する特定の塩基対を部位特異的に 変換する遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤が提供される。 本発明の製剤 は、 生体内^科生でかつ低抗原性であり、 既に生体に投与した場合の高い安全性 が確認されているコラーゲンを用いることにより、 オリゴヌクレオチドが極めて 高い効率で細胞内に導入されて核に局在化でき、 ゲノム遺伝子の変換を効率的に 促進することができる。 本発明の製剤は、 オリゴヌクレオチドの核内局在ィヒ促進 剤としても有用である。 これらの製剤を使用することにより、 遺伝子治療、 遺伝 子変異動物および植物の作出が可能である。

Claims

請求の範囲
1 . 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる 部位特異的遺伝子変換促進剤。
2 . 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる 部位特異的遺伝子疾患治療剤。
3 . コラーゲンが水溶性コラーゲンである、 請求項 1または 2に記載の促進剤 または治療剤。
4 . τΚ溶性コラーゲンがァテロコラーゲンである、 請求項 3記載の促進剤また は治療剤。
5 . 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが少なくとも 2 0塩基からなるオリゴ ヌクレオチドである、 請求項 1〜 4いずれかに記載の促進剤または治療剤。
6 . 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが R NA/D NAキメラオリゴヌタレ ォチドまたは D N Αオリゴヌクレオチドである、 請求項 1〜 5いずれかに記載の 促進剤または治療剤。
7 . 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが、 変換する遺伝子のセンス鎖または アンチセンス鎖と、 1〜3塩基対のミスマッチ対合を含んでヮトソン'クリック 型塩基対を形成する塩基配列を有するォリゴヌクレオチドである、 請求項 5また は 6に記載の促進剤または治療剤。
8 . 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが、 変換する遺伝子のセンス鎖または アンチセンス鎖と、 1〜3塩基の欠失または挿入を含んでヮトソン 'クリック型 塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、 請求項 5または 6に記載の促進剤または治療剤。
9 . 前記ミスマッチ対合がオリゴヌクレオチドの中央部に位置する、 請求項 7 に記載の促進剤または治療剤。
1 0 . 前記塩基の欠失または揷入がオリゴヌクレオチドの中央部に位置する、 請求項 8記載の促進剤または治療剤。
1 1 . 剤型が溶液状である、 請求項 1〜 1 0いずれかに記載の促進剤または治
12. リン酸塩を 0. 01 M：〜 0. 1 Mの範囲で含有する請求項 1 1記載の促 進剤または治療剤。
13. ナトリウム塩を 0. 07M〜0. 14 Mの範囲で含有する請求項 11記 載の促進剤または治療剤。
14. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体であ る請求項 11〜 13いずれかに記載の促進剤または治療剤。
15. 粒子状の会合体の長径が 300n m〜 50 mである請求項 14記載の 促進剤または治療剤。
16. コラーゲンを 0. 01〜1. 0重量％の範囲で含有する請求項 1 1〜 1 5いずれかに記載の促進剤または治療剤。
17. コラーゲンを 0. 01〜0. 25重量0 /0の範囲で含有する請求項 1 1〜
15いずれかに記載の促進剤または治療剤。
18. コラーゲンを、 0. 01M 〜0. 1Mのリン酸塩および 0. 07M〜 0. 14 Mのナトリウム塩を含有する溶液に溶解し、 これに同濃度のリン酸塩お ょぴ同濃度のナトリゥム塩を含有する遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド溶液を 加えて 1〜 1 o°cの温度下で攪拌することにより得られる部位特異的遺伝子変換 促進剤または遺伝子治療剤。
19. 剤型が固形状であり、 遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドとコラーゲン が粒子状の会合体である請求項 1〜 10いずれかに記載の促進剤または治療剤。
20. 遺伝子変換用のォリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体であ る請求項 19に記載の促進剤または治療剤。
21. 粒子状の会合体の長径が 300 nm〜50/i mである請求項 20に記載 の促進剤または治療剤。
22. 細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法 であって、 請求項 1、 3〜21いずれかに記載の遺伝子変換促進剤を当該細胞に 接触させることを含む方法。
23. 前記の細胞が哺乳動物細胞である請求項 22に記載の方法。
24. 前記の細胞が酵母または真菌である請求項 22に記載の方法。
2 5 . 少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレ ォチドの核内局在化促進剤。
2 6 . リン酸塩を 0 . 0 1 M〜 0 . 1 Mの範囲で含有する請求項 2 5に記載の 核内局在化促進剤。
2 7 . ナトリウム塩を 0 . 0 7 M〜0 . 1 4 Mの範囲で含有する請求項 2 5ま たは 2 6に記載の核内局在化促進剤。
2 8 . 前記オリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体である請求項 2 5〜 2 7いずれかに記載の核内局在化促進剤。
2 9 . 粒子状の会合体の長径が 3 0 0 n m〜 5 0 μ mである請求項 2 8に記載 の核内局在化促進剤。
3 0 . コラーゲンを 0 . 0 1〜 1 . 0重量0 /0の範囲で含有する請求項 2 5〜 2
9いずれかに記載の核内局在化促進剤。
3 1 . コラーゲンを 0. 0 5〜 0 . 2 5重量％の範囲で含有する請求項 2 5〜
2 9いずれか記載の核内局在化促進剤。
3 2 . 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含む組成 物を経口、 経鼻、 経肺、 門脈内、 筋肉内、 皮下、 臓器表面、 臓器内または経皮投 与することにより生体内の細胞と接触させ、 当該細胞の遺伝子を変換する方法。
3 3 . 請求項 3 2記載の方法を用いて遺伝子疾患を治療する方法。
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