Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2004072302A1 - 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 - Google Patents

発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004072302A1
WO2004072302A1 PCT/JP2004/001588 JP2004001588W WO2004072302A1 WO 2004072302 A1 WO2004072302 A1 WO 2004072302A1 JP 2004001588 W JP2004001588 W JP 2004001588W WO 2004072302 A1 WO2004072302 A1 WO 2004072302A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
self
oligonucleotide
probe
assembly
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001588
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitsugu Usui
Toshihiko Fujikawa
Original Assignee
Eisai Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai Co., Ltd. filed Critical Eisai Co., Ltd.
Priority to CA2515734A priority Critical patent/CA2515734C/en
Priority to KR1020057012669A priority patent/KR101050510B1/ko
Priority to CN200480003402.1A priority patent/CN1745180B/zh
Priority to US10/543,683 priority patent/US20060035235A1/en
Priority to JP2005505011A priority patent/JP4351210B2/ja
Priority to EP04710967A priority patent/EP1593746B1/en
Priority to AU2004212083A priority patent/AU2004212083B2/en
Publication of WO2004072302A1 publication Critical patent/WO2004072302A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Definitions

  • the present invention relates to a clear signal amplification method for detecting an expressed gene, and more particularly, to the detection sensitivity using a self-assembly reaction by an oligonucleotide.
  • the detection of expressed genes using a DNA chip involves the use of primers having only poly dT or random primers, and incorporating nucleic acids labeled with fluorescent substances such as Cy3 and Cy5 by reverse transcription reaction.
  • the labeled cDNA is used as a probe.
  • it is common to synthesize antisense RNA using a linear amplification method for a small amount of sample for example, Yoshihide Hayashizaki, “DNA Microarray Practical Manual,” Yodosha, January 1, 2000 Day, see p. 80—90.).
  • the second-strand cDNA is synthesized using three types of enzymes, RNase H, DNA polymerase I, and DNA ligase, and finally the RNA polymerase is synthesized.
  • HCP HeneyComb Probe
  • HCP Be alternation link self-assembly reaction
  • PALS AR method The method of forming an aggregate by the self-assembly reaction. Disclosure of the invention
  • the present invention does not require expensive enzymes, it can be detected in a short time by an inexpensive and easy operation, and since the linear amplification method and the PCR method are not used, the length and expression amount of the original RNA can be reduced. It is an object of the present invention to provide a signal amplification method for detecting an expressed gene that enables corresponding detection.
  • the first embodiment of the signal amplification method for detecting an expressed gene of the present invention utilizes a reverse transcription reaction and a self-assembly reaction for forming a self-assembly by self-assembly of oligonucleotide probes.
  • the present invention improves the detection sensitivity of expressed genes in DNA chips, DNA microarrays, microwells, or spherical beads (in the present invention, DNA chips, DNA microarrays, microwells, or spherical beads are collectively referred to as DNA chips). It is characterized by that.
  • the second embodiment of the signal amplification method for detecting an expressed gene of the present invention This is a method for improving the detection sensitivity of an expressed gene on a DNA chip by using a transcription reaction and a self-assembly reaction to form a self-assembly by self-assembly of oligonucleotide probes. Performing a reverse transcription reaction of mRNA using a first probe having a region capable of hybridizing to the oligonucleotide probe as a primer, to form a second probe having a cDNA region.
  • Dissociating the mRNA from the second probe hybridizing the second probe to a capture probe having a region complementary to the cDNA region of the target mRNA; and A step of forming a self-assembly by a self-assembly reaction using an oligonucleotide probe.
  • the step of performing the step of forming a self-assembly by the self-assembly reaction is not particularly limited, but is preferably performed after the step of hybridizing the second probe to the capture probe.
  • each oligonucleotide of a pair of oligonucleotides of No. 1 and No. 2 is divided into three regions: 3, side region, central region, and 5 side region.
  • a second system comprising a plurality of pairs of cross-linking probes each having a non-complementary base sequence in the 3, 3 side region and the 5 'side region of each oligonucleotide.
  • a dimer formed from the dimer-forming probe is formed into a base sequence capable of cross-linking, and the probe is hybridized to use a self-assembly reaction in which oligonucleotides self-assemble to form a self-assembly. Can be.
  • the nucleotide sequence of the above probe is determined by comparing the 3′-side region of the first system No. 1_ oligonucleotide and the 3′-side region of the second system No. 3—oligonucleotide; The 5 'region of the 2-oligonucleotide and the No. 4 oligonucleotide of the second system, the 5 side region of the oligonucleotide, the No. 3 of the second system, the 3' side region of the oligonucleotide and the 1st oligonucleotide No. 2—oligonucleotide 3 ′ side region of the second system, No. 3—oligonucleotide 5, side region of the second system, and No. 1—oligonucleotide 5 ′ side of the first system
  • Each region can be a complementary base sequence.
  • the nucleotide sequence of the above-described probe was determined by comparing the No. 1—oligonucleotide 3 ′ side region of the first system, the No. 3—oligonucleotide 3 ′ side region of the second system, and the No. 1 2—The 5 ′ region of the oligonucleotide and the No. of the second system. 3—The 5 ′ region of the oligonucleotide, the No. 2—The 3 ′ region of the oligonucleotide and the second region of the second oligonucleotide.
  • No. 4 oligonucleotide 3 ′ side region of the first system, No. 1—oligonucleotide 5 ′ side region of the first system, and No. 4—oligonucleotide 5 ′ side of the second system
  • Each region can be a complementary base sequence.
  • the third embodiment of the signal amplification method for detecting an expressed gene according to the present invention includes a pair of oligos in which a reverse transcription reaction and a mutually complementary base sequence region are composed of n (n ⁇ 3) force points. Using multiple pairs of nucleotide and first HCPs and second HCPs, the hybridization was performed so as to intersect alternately.
  • This method uses a self-assembly reaction in which oligonucleotides self-assemble to form a self-assembly, thereby improving the detection sensitivity of expressed genes on a DNA chip.
  • a first probe having T and having at least a part of the base sequence region of the first HCP is bound to mRNA, and a reverse transcription reaction is carried out using a reverse transcriptase.
  • the second probe After forming a second probe having at least a portion of the nucleotide sequence region and removing the mRNA, the second probe is hybridized to a capture probe having a region complementary to the cDNA region of the target mRNA. And adding the first HCP and the second HCP or the second HCP to form a self-assembly by a self-assembly reaction of the oligonucleotide, thereby amplifying the signal.
  • mRNA containing poly A at the end can be used as the target expression gene.
  • the DNA chip has a support for binding a capture probe for capturing a target gene, and the support may be a microplate type, a slide glass type, a fine particle type, or an electrically conductive substrate type. It is preferable to use such a support.
  • Plastic, polystyrene, or the like can be used as the material of the microplate-type and fine-particle-type supports.
  • a material such as glass or plastic can be used.
  • Gold electrodes and ITO electrodes indium oxide electrodes
  • the presence of the self-assembly can be detected by hybridizing a labeled probe to the self-assembly.
  • the labeled probe is a labeled probe labeled with a chromogenic enzyme, a luminescent enzyme, or a radioisotope.
  • a fluorescent substance having the property of binding to the nucleus and acid is added to the above self-assembly, The presence of the self-assembly can be detected by the photochemical change of the fluorescent substance.
  • Oligonucleotides that form a self-assembly can be labeled in advance with a fluorescent substance, and the presence of the self-assembly can be detected by a photochemical change of the fluorescent substance.
  • Oligonucleotides that form a self-assembly can be labeled with a radioisotope in advance, and the presence of the self-assembly can be detected by the radioisotope.
  • Oligonucleotides that form a self-assembly can be labeled in advance with a chromogenic or luminescent enzyme, and the presence of the self-assembly can be detected by a photochemical change.
  • the oligonucleotide is composed of a base selected from any of DNA, RNA, PNA and LNA.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of a process sequence of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing in principle Step 200 in a first example of the order of steps of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic view showing in principle the step 202 in the first example of the process order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view showing in principle a step 204 in the first example of the order of steps of the ferrule method of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic view showing in principle the step 206 in the first example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 6 shows the steps in the first example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing the principle of the step 210.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing, in principle, Step 2 12 in the first example of the order of steps of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing, in principle, Step 2 14 in the first example of the order of steps in the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic view showing in principle Step 300 in the second example of the order of steps of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic view showing in principle the step 302 in the second example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing in principle the step 304 in the second example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic view showing in principle Step 3 • 6 in the second example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of Example 1 and Comparative Example 1. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of the order of steps in a signal amplification method for detecting an expressed gene of the present invention.
  • a first probe having a poly dT at its terminus and having a region that can hybridize with at least one of the oligonucleotide probes used for the self-assembly reaction Prepare Using the first probe as a primer, the first probe is bound to polyRNA-containing niRNA, and a reverse transcription reaction of mRNA is performed with a reverse transcriptase (Step 100).
  • W 200 a reverse transcriptase
  • the base sequence on the 5 ′ side of the first probe be configured to have at least a part of the base sequence of the oligonucleotide probe used in the self-assembly reaction.
  • the mRNA is dissociated from the second probe (step 102).
  • the method for dissociating mRNA is not particularly limited, and examples thereof include a method using thermal denaturation, denaturation with RNA, RNA digestion with RNAse H, and the like.
  • the dissociated second probe is hybridized to a capture probe having a region complementary to the cDNA region of the target mRNA to capture the second probe (step 104). It is preferable to bind the capture probe to the support in advance.
  • the oligonucleotide probe is added, and a self-assembly reaction is performed to form a self-assembly hybridized with the second probe (step 106), thereby amplifying the signal.
  • the target mRNA is not present in the sample, no signal amplification is performed because the second probe does not bind to the capture probe. Therefore, the presence of the target mRNA can be confirmed by the signal amplification method of the present invention.
  • the signal amplification method of the present invention does not use the linear amplification method, so that detection corresponding to the length of the original RNA is possible, and since the PCR method is not used, signal amplification corresponding to the expression level can be performed. It can be carried out.
  • a self-assembly reaction As a self-assembly reaction, a self-assembly reaction by a pair of HCPs composed of three regions complementary to each other and capable of self-assembly to form an aggregate is disclosed (Japanese Patent No. 326 7576, Japanese Patent No. 33'1). No. 0662, etc.) can be used. Also, a self-assembly reaction by a pair of dimer-forming probes forming a dimer by themselves and a pair of cross-linking probes capable of cross-linking a dimer formed from the dimer-forming probe (Japanese Patent Application Laid-Open No. -See 3-55081. ) Can also be used.
  • FIG. 1 shows an example in which step 106 is performed after step 104, step 106 can be performed before step 104 or simultaneously with step 104.
  • FIGS. 2 to 8 are schematic views showing in principle a first example of the signal amplification method for detecting an expressed gene of the present invention in the order of steps.
  • the first example is a signal amplification method using a PAL SAR method using a pair of HCPs previously labeled with a fluorescent substance 22 as a self-assembly reaction.
  • An example in the case of using HCP containing poly dT at the end is shown.
  • the first probe 12a contains poly dT at the 3 ′ end and has three HCP regions on the 5 ′ side.
  • Prepare an oligonucleotide 'probe (HCP-1) (step 200) and, as shown in Fig. 3, include a poly (! Cho at the 3' end of the poly A tail of the mRNA 10a !! (Step 202)
  • reverse transcription reaction is performed using reverse transcriptase, and the HCP having an mRNA complementary sequence is synthesized.
  • the mRNA lOa is dissociated into a single-stranded oligonucleotide consisting of a cDNA region and an HCP region (step 204). 20 6).
  • a capture probe 16a having a region complementary to the cDNA of the target gene 16a was bound to the support 18 (step 210), and as shown in FIG.
  • the second probe 14a which is the HCP having the cDNA region formed above, was hybridized to the capture probe 16a (step 2 12), and as shown in FIG.
  • One HCP (HCP-2) is added to form a self-assembly 20a by a self-assembly reaction (Step 2 14), and signal amplification can be performed.
  • Step 20 6 above When the target mRNA is removed, if a washing operation is performed, it is necessary to add a pair of HCPs in the above step 214.
  • FIGS. 9 to 12 are schematic diagrams showing in principle a second example of the order of steps of the signal amplification method for detecting an expressed gene of the present invention.
  • the second example is a signal amplification method using a PAL SAR method using a pair of HCPs not labeled with a fluorescent substance as a self-assembly reaction. Shows an example in which an oligonucleotide probe containing poly dT and one complementary region of HCP is used.
  • the first probe 12b contains poly dT at the 3 ′ end and one HCP complementary region on the 5, side.
  • An oligonucleotide having a probe is prepared (step 300), and as shown in FIG. 10, the oligonucleotide probe 12b is bound to the poly A tail portion of mRNA 10b, and reverse transcriptase is used.
  • a reverse transcription reaction is performed to prepare a second probe 14b having a complementary sequence of mRNA (step 302).
  • the mRNA lOb is dissociated into a single-stranded oligonucleotide containing a cDNA region and an HCP region.
  • the second probe 14 b was hybridized to the capture probe 16 b bound to the support 18 (step 304), and as shown in FIG. HCP was added to form a self-assembly 20b by a self-assembly reaction (Step 306), and an intercalator 24 and the like were inserted into the formed self-assembly 20b (Step 308), Signal amplification can be performed. Note that step 3 06 and step 3 08 It is also possible to do.
  • the probe as a labeling substance for the pre-detection, for example, I 1 2 5 and P 3 2, etc. radioisotopes, Jigokishige Yun Ya Akurijiniumu. Emission esters substances or C y 3 ⁇ C y 5
  • fluorescent dyes such as biotin for using 4-methylpumbelliferyl phosphate, etc., and a donor dye and an acceptor fluorescent dye for using fluorescence resonance energy transfer (FRET). It is also possible to detect target genes.
  • the target gene can be detected. It is preferable to detect the target gene using a fluorescent substance having a property of binding to a nucleic acid such as an intercalator.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it has a property of binding to a nucleic acid.
  • examples include SYBR Green I stain, SYBR Green ll stain, SYBR Green Gold stain ⁇ vistra reen stain, Gebar stain, Radiant Red stain , PicoGreen, Eiboureen, 011Green, Hoechst 33258 (Bis-Benzimide), Propidium Iodide, YO -PRO-1 lodide YO-PRO-3 Iodide (Molecular Probes) Acridine Orange, AOAO (homodimer) and the like can be used.
  • the nucleic acid constituting the above-mentioned pair of oligonucleotides is usually composed of DNA or RNA, but may be a nucleic acid analog.
  • nucleic acid analogs for example, peptide nucleic acids (PNA, for example, see WO92 / 07702 pamphlet) and Locked Nucleic Acid (LNA, for example, Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630, Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120, 13252-13253, and Wahlestedt C et al. PNAS. 2000. 97, 5633-5638.).
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the loops are usually composed of the same type of nucleic acid, but for example, DNA probes and RNA probes can be paired. That is, the type of the nucleic acid of the probe can be selected from DNA, RNA, or a nucleic acid analog (for example, PNA or LNA).
  • the nucleic acid composition in one probe does not need to be composed of only one kind, for example, only DNA. If necessary, for example, an oligonucleotide probe (chimera probe) composed of DNA and RNA is used. It is also possible and included in the present invention.
  • each complementary base sequence region of the oligonucleotide probe is at least 5 bases in terms of the number of bases, preferably 10 to 100 bases, and more preferably 15 to 30 bases.
  • probes can be synthesized by a known method.
  • a DNA probe it can be synthesized by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 from Applied Biosystems Inc.
  • a phosphoric triester method there are a phosphoric triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method, etc., but any method may be used.
  • a pair of HCPs having a complementary region to a target gene captured by a DNA chip forms a self-assembly.
  • the number of oligonucleotide probes to be used is not particularly limited, used in the range of 1 0 2-10 15 present.
  • the composition and concentration of the reaction buffer are not particularly limited, and ordinary buffers commonly used for nucleic acid amplification can be suitably used.
  • the pH is also suitable within the usual range, and preferably a pH in the range of 7.0 to 9.0 can be used.
  • the reaction temperature is 40-80 ° C, preferably 55-65 ° C.
  • any sample that may contain the nucleic acid can be applied.
  • the target gene may be appropriately prepared or isolated from a sample, and is not particularly limited.
  • blood blood Biological samples such as serum, urine, feces, cerebrospinal fluid, tissue fluid, cell culture, etc., samples that may contain or be infected with any eukaryote having mRNA containing a poly A chain at the end of mold, etc. And the like.
  • a nucleic acid obtained by amplifying a target gene in a sample by a known method can be used.
  • Target gene Tota1 RNA extracted from cultured cells
  • Capture probe Capture probe
  • HC P-1 (5 'end Cy 3 label, 60 m er): 5'-Cy3 "CGCCGGA GATATCTATATGCCCGGTATCACAAAGTATCCGGACGTTATAAGGGCG AACTC-3'
  • HC P-2 (5 'end Cy 3 label, 60 m er): 5'-Cy3-GCATATA GATATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATA ACGTC-3'
  • Polystyrene particle beads One type of particle beads Fixed capture probe
  • a reverse transcription reaction was performed at 37 ° C for 2 hours using the target gene, the first probe, reverse transcriptase (SuperScriptll: manufactured by Invitrogen), and a reaction solution (Reaction Buffer, DTT, dNTP, RNase inhibitor). . Thereafter, alkali treatment was performed at 65 ° C for 30 minutes, and neutralization was performed using hydrochloric acid.
  • the cDNA which is a reverse transcript, was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • the composition of [the obtained cDNA, the above-mentioned particle beads, 6XSSC, 0.2% SDS, 5X Denhardt solution] was adjusted to a total volume of 5 OL, and hybridized at 42 ° C for 2 hours. Did a demonstration. After completion, the mixture was filtered with a 0.22 ⁇ filter to remove unreacted probe, washed once with 2 ⁇ SSC + 0.1% SDS, once with 0.2 ⁇ SSC and filtered with the above filter.
  • the washed particle beads were resuspended in a sheath solution for a flow cytometer, and the fluorescence of Cy3 labeled on HCP was measured by a flow site meter.
  • the composition of [the obtained cDNA, the above-mentioned particle beads, 6XSSC, 0.2% SDS, and 5X Denhardt solution] was adjusted so that the total amount became 5 OL, and the temperature was changed to 42 ° C for 2 hours. High predication was performed. After completion, the mixture was filtered with a 0.22 ⁇ filter to remove unreacted probe, and washed and filtered once with 2 ⁇ SSC + 0.1% SDS.
  • the washed particle beads were resuspended in a sheath solution for a flow cytometer, and the fluorescence of Cy3 labeled on the cDNA bound to the capture probe on the particle beads was measured by a flow cytometer.
  • Example 1 The results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in FIG.
  • the fluorescence intensity the fluorescence intensity of 203 to 504 particle beads of each type was measured and the median value was shown.
  • the detection sensitivity of Example 1 was significantly improved as compared with Comparative Example 1.
  • the detection can be performed in a short time with an inexpensive and easy operation. Since no method is used, a significant effect is achieved in that detection can be performed according to the length and expression level of the original RNA.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法やＰＣＲ法を用いないため、元のＲＮＡの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

Description

発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 技術分野
本発明は、 発現遺伝子検出のた明めのシグナル増幅方法に関し、 更に詳し くは、 オリゴヌクレオチドによる自己集合反応を利用して、 検出感度を向 田
上させ、 標的 RNAの長さ及ぴ発現量に応じて目的遺伝子を検出すること ができる発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法に関する。 背景技術
通常、 DNAチップを用いた発現遺伝子の検出は、 ポリ d Tのみを有す るプライマーもしくはランダムプライマーを用い、 逆転写反応により、 C y 3や C y 5等の蛍光物質でラベルした核酸を取り込ませた標識 c DNA をプローブとしている。 また、 微量のサンプルに対しては、 リニア増幅法 を用いアンチセンス RNAを合成することが一般的である （例えば、 林崎 良英監修、 「DNAマイクロアレイ実戦マニュアル」 羊土社、 2000年 1 2月 1 日、 p . 8 0— 9 0参照。）。 しかし、 リニア増幅法は、 第 1鎖 c D NA合成後、 RN a s e H、 DNAポリメラーゼ I、 DNAリガーゼの 3 種類の酵素を用いて第二鎖 c DNAを合成し、 最終的に RN Aポリメラー ゼにより in vitro転写反応を行いアンチセンス RNAを増幅するという方 法であるが、 高額な酵素を多種用いなければならず、 その上操作も非常に 煩雑であるという欠点がある。 また、 サンプルが極微量である場合、 この リニァ増幅法を複数回繰り返さなければならない。 リニァ増幅法で得られ たアンチセンス RNAは、 元の RNAより短くなる傾向があり、 もとの R N Aの長さを正確には反映していないという問題点があった。 一方、 本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した (例えば、 米国特許第 6， 2 6 1， 84 6号公報、 特許第 3 26 7 5 7 6 号公報、 及ぴ欧州特許出願公開第 1， 0 0 2， 8 7 7 A号明細書参照。）。 この方法は、 3個所の領域から構成される 1対のオリ ゴヌクレオチド (HoneyComb Probe, 以下、 HC Pと称する） を用いる方法であり、 第 1 HC Pと第 2HC Pの各々の 3個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有 し、 両者を反応させた場合、 領域の 1個所のみとハイブリダィズする様に 塩基配列を工夫したものである。 この工夫により、 複数の一対の HC Pを 反応させた場合、 互いにハイブリダィズし、 HC Pの自己集合反応により 集合体を开成させることができる （Probe alternation link self-assembly reaction, 以下、 この H C Pの自己集合反応による集合体の形成法を P A L S AR法と称する）。 発明の開示
本発明は、 高価な酵素を必要とせず、 安価で安易な操作で短時間で検出 することができ、 更に、 リニア増幅法や P CR法を用いないため、 元の R N Aの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のための シグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、 本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増 幅方法の第 1の態様は、 逆転写反応及びオリゴヌクレオチド ·プローブの 自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチ ップ、 DNAマイクロアレイ、 マイクロウェル又は球状ビーズ （本発明で は、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ、 マイクロウェル又は球状ビー ズを DNAチップと総称する。） における発現遺伝子の検出感度を向上させ ることを特徴とする。
本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 2の態様は、 逆 転写反応及ぴオリゴヌク レオチド ·プローブの自己集合により自己集合体 を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝子の 検出感度を向上させる方法であって、 3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記 オリゴヌクレオチド .プローブにハイブリダイズすることが可能な領域を 有する第 1プローブをプライマーとして用いて mRN Aの逆転写反応を行 レ、、 c DNA領域を有する第 2プローブを形成させる工程、 前記 mRNA を前記第 2プローブから解離させる工程、 前記第 2プローブを、 標的 mR NAの c DN A領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダ ィズさせる工程、 及び前記第 2プローブと前記オリゴヌクレオチド ·プロ ーブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を有するこ とを特徴とする。
上記自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を行う段階は、 特 に限定されないが、 上記第 2プローブを上記捕捉用プローブにハイプリダ ィズさせる工程の後に行うことが望ましい。
上記自己集合反応として、 第 1に、互いに相補的な塩基配列領域が n (n ≥ 3) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブの複 数対を用いて、 互い違いに交差するようにハイプリダイゼーションさせる ことにより、 オリゴヌクレオチドが自己集合し、 二本鎖の自己集合体を形 成させる自己集合反応を用いることができる。
上記自己集合反応として、 第 2に、 N o . 1及ぴ N o . 2の一対のオリ ゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3， 側領域、 中央領域、 及ぴ 5， 側領域の 3つの領域に分け、 各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相 補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3， 側領域 及び 5 ' 側領域を互いに非相捕的な塩基配列とした一対のダイマー形成用 プロープを複数対含む第 1の系と、 N o . 3及ぴ N o . 4の一対のオリゴ ヌクレオチドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域及ぴ 5， 側領域の 2つ の領域に分け、 各オリゴヌクレオチドの 3， 側領域及び 5 ' 側領域を互い に非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第 2の系と を有し、 該架橋プローブを該ダイマー形成用プロープより形成されるダイ マーを架橋することが可能な塩基配列とし、 該プローブをハイプリダイゼ ーシヨンさせることにより、 オリゴヌクレオチドが自己集合し、 自己集合 体を形成させる自己集合反応を用いることができる。
上記プローブの塩基配列を、 第 1の系の N o . 1_オリゴヌクレオチド の 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌク レオチドの 3 ' 側領域、 第 1の系の N o . 2—ォリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5， 側領域、 第 2の系の N o . 4—オリゴヌク レオチドの 3， 側領域と第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5， 側領域と第 1の 系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域をそれぞれ相捕的な塩基 配列とすることができる。
上記プローブの塩基配列を、 第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチド の 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、 第 1の系の N o . 2—オリゴヌク レオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 4—オリ ゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の 系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域をそれぞれ相捕的な塩基 配列とすることができる。
本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 3の態様は、 逆 転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域が n (n≥ 3) 力所の数から構 成される一対のオリ ゴヌクレオチド · プローブである第 1 HC P及び第 2 HC Pの複数対を用いて、 互い違いに交差するようにハイプリダイゼーシ ヨンさせることにより、 オリ ゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を 形成させる自己集合反応を利用し、 DN Aチップにおける発現遺伝子の検 出感度を向上させる方法であって、 3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 1プローブを mRN Aに結合させ、 逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、 c DNA領域及び前 記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 2プローブを形 成させ、 mRNAを除去した後、 前記第 2プローブを標的 mRNAの c D NA領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダイゼーショ ンさせ、 前記第 1 H C P及ぴ前記第 2 H C P又は前記第 2 H C Pを添加し、 オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体を形成させ、 シグナ ルを増幅させることを特徴とする。
本発明のシグナル増幅方法において、 標的発現遺伝子としては、 末端に ポリ Aを含む mRN Aを用いることができる。
上記 DNAチップが、 ターゲット遺伝子を捕捉するための捕捉用プロ一 ブを結合する支持体を有し、 該支持体として、 マイクロプレート型、 スラ イ ドグラス型、 微粒子型、 又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いるこ とが好適である。 上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質には プラスチックやポリスチレン等を使用することができる。 また、 スライ ド グラス型の支持体では、 ガラスやプラスチック等の素材を使用することが できる。 電気伝導性の基板型の支持体には、 金電極や I TO電極 （indium oxide電極） などを使用することができる。
上記自己集合体に対して、 標識プローブをハイプリダイゼーションさせ ることによりより上記自己集合体の存在を検出することができる。
上記標識プローブが、 発色系酵素、 発光系酵素、 又はラジオァイソトー プで標識した標識プローブであることが好適である。
上記自己集合体に対して、 核.酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、 その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出するこ とができる。
あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識 し、 上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出するこ とができる。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソト ープで標識し、 上記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出す ることができる。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌク レオチドを発色系酵素又は 発光系酵素で標識し、 上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出 することができる。
上記オリゴヌクレオチドは、 D N A、 R N A、 P N Aまたは L N Aのい ずれかから選ばれる塩基から構成される。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の一例を示すフローチヤ一 トである。
図 2は、 本発明.のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 0 0を原理的に示す模式図である。
図 3は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 0 2を原理的に示す模式図である。
図 4は、 本発明のシダナル增幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 0 4を原理的に示す模式図である。
図 5は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 0 6を原理的に示す模式図である。
図 6は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 1 0を原理的に示す模式図である。
図 7は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 1 2を原理的に示す模式図である。
図 8は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツ プ 2 1 4を原理的に示す模式図である。
図 9は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステツ プ 3 0 0を原理的に示す模式図である。
図 1 0は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステ ップ 3 0 2を原理的に示す模式図である。
図 1 1は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステ ップ 3 0 4を原理的に示す模式図である。
図 1 2は、 本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステ ップ 3 ◦ 6を原理的に示す模式図である。
図 1 3は、 実施例 1及ぴ比較例 1の結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、 これらの 実施の形態は例示的に示されるもので、 本発明の技術思想から逸脱しない 限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。
図 1は、 本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の 一例を示すフローチヤ一トである。
図 1に示したように、 まず、 3， 末端にポリ d Tを有し且つ自己集合反 応に用いられるオリゴヌクレオチド ·プローブの少なく とも一つとハイプ リダイズすることが可能な領域を有する第 1プローブを準備する。 該第 1 プローブをプライマーとして用いて、 ポリ Aを含む ni R N Aに結合させ、 逆転写酵素により m R N Aの逆転写反応を行い （ステップ 1 0 0 )、 該第 1 W 200
8 プローブ及び該mRNAの c DN A領域からなる第 2プローブを形成させ る。 上記第 1プローブの 5 ' 側の塩基配列を、 上記自己集合反応に用いら れるオリゴヌク レオチド ·プローブの塩基配列を少なくとも一部分有する ように構成することが好適である。
次に、 mRNAを第 2プローブから解離させる （ステップ 1 02)。 mR NAを解離する方法としては、 特に限定されず、 例えば、 熱変性、 アル力 リ変性、 RNa s e Hによる RNA消化等を用いた方法が挙げられる。 解離後の第 2プローブを、 標的 mRNAの c DN A領域に相捕的な領域 を有する捕捉用プローブにハイプリダイズさせ、 第 2プローブを捕捉させ る （ステップ 1 04)。 捕捉用プローブを予め支持体に結合させておくこと が好ましい。
オリゴヌク レオチド .プローブを添加し、 自己集合反応により、 第 2プ ローブとハイプリダイズした自己集合体を形成させ （ステップ 106)、 シ グナルを増幅させることができる。
試料中に標的 mRNAが存在しない場合、 第 2プローブは、 捕捉用プロ ーブと結合しないため、 シグナル増幅は行われない。 よって、 本発明のシ グナル増幅方法により標的 mRNAの存在を確認することができる。 また、 本発明のシグナル増幅方法は、 リニア増幅法を用いないため、 元の RNA の長さに対応した検出が可能であり、 更に P CR法を用いないため、 発現 量に対応したシグナル増幅を行うことができる。
自己集合反応としては、 互いに相補的な 3領域から構成され、 自ら自己 集合して集合体を形成することができる一対の HC Pによる自己集合反応 (特許第 326 7576号公報、 特許第 33' 1 0662号公報等参照。） を 用いることができる。 また、 自らダイマーを形成する一対のダイマー形成 用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋 することが可能な一対の架橋プローブによる自己集合反応 （特開 200 2 - 3 5 508 1号公報等参照。） を用いることも可能である。
なお、 図 1においては、 ステップ 1 04の後にステップ 1 06を行った 場合の例を示したが、 ステップ 1 04の前もしくはステップ 1 04と同時 にステップ 1 06を行うことも可能である。
図 2〜図 8は、 本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法のェ 程順の第 1の例を原理的に示す模式図である。 第 1の例は、 自己集合反応 として、 予め蛍光物質 2 2で標識した一対の HC Pを用いた PAL S AR 法を利用したシグナル増幅法であり、 第 1プローブ 1 2 a として、 3 ' 末 端にポリ d Tを含む HC Pを用いた場合の例を示す。
図 2に示した如く、 ターゲッ ト遺伝子の mRNA 1 0 aを検出するため に、 第 1プローブ 1 2 a として、 3 ' 末端にポリ d Tを含み、 5 ' 側に H CPの 3領域を有するオリゴヌクレオチド ' プローブ （HC P— 1) を準 備し （ステップ 20 0)、 図 3に示した如く、 mRNA 1 0 aのポリ Aテー ル部分に 3 ' 末端にポリ （！丁を含む！！じ？一 1 (1 2 a) を結合させる （ス テツプ 202)。 その後、 図 4に示した如く、 逆転写酵素を用いて逆転写反 応させ、 mRNAの相補配列を有する HC Pである第 2プローブ 1 4 aを 作製した後 （ステップ 2 04)、 図 5に示した如く、 mRNA l O aを解離 し、 c DNA領域とHC P領域からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドとす る （ステップ 20 6)。
図 6に示した如く、 支持体 1 8上にターゲッ ト遺伝子の c DN Aと相補 的な領域を持つ捕捉用プローブ 1 6 aを結合させておき （ステップ 2 1 0)、 図 7に示した如く、 上記形成された c DNA領域を有する HC Pである第 2プローブ 1 4 aを捕捉用プローブ 1 6 aにハイプリダイゼーションさせ (ステップ 2 1 2)、 図 8に示した如く、 一対のもう一方の H CP (HCP - 2) を加え、 自己集合反応により 自己集合体 2 0 aを形成させ （ステツ プ 2 1 4)、 シグナル増幅を行うことができる。 なお、 上記ステップ 20 6 の標的 mRNAを除去する際、 .洗浄操作を行った場合は、 上記ステップ 2 1 4において、 一対の HC Pを添加する必要がある。
上記第 1の例では、 HC P— 1の 3領域中の 3， 側領域の一部をポリ d Tとした一対の HC Pを用いた例を示したが、 11〇卩ー 1の 3 ' 側領域を 全てポリ d Tとし、 HC P— 2の 3領域中の 3 ' 側領域を全てポリ Aとし た一対の HC Pを用いることもできる。
図 9〜図 1 2は、 本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の 工程順の第 2の例を原理的に示す模式図である。 第 2の例は、 自己集合反 応として、 蛍光物質で標識されていない一対の HC Pを用いた P AL S A R法を利用したシグナル増幅法であり、 第 1プローブ 1 2 bとして、 3 ' 末端にポリ d Tを含み且つ HC Pの相補領域を 1つ含んでいるオリゴヌク レオチド ·プローブを用いた場合の例を示す。
図 9に示した如く、 ターゲッ ト遺伝子の mRNA 1 0 bを検出するため に、 第 1プローブ 1 2 bとして、 3 ' 末端にポリ d Tを含み、 5， 側に H C Pの相補領域を一つ有するオリゴヌクレオチド 'プローブを準備し （ス テツプ 300)、 図 1 0に示した如く、 mRNA 1 0 bのポリ Aテール部分 に該オリゴヌクレオチド ·プローブ 1 2 bを結合させ、 逆転写酵素を用い て逆転写反応させ、 mRNAの相補配列を有する第 2プローブ 1 4 bを作 製する （ステップ 3 0 2)。 mRNA l O bを解離し、 c DNA領域と HC P領域を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドとする。
図 1 1に示した如く、 上記第 2プローブ 1 4 bを支持体 1 8に結合した 捕捉用プロープ 1 6 bにハイプリダイゼーションさせ （ステップ 3 04)、 図 1 2に示した如く、 一対の HC Pを添加し、 自己集合反応により自己集 合体 20 bを形成させ （ステップ 3 0 6)、 形成された自己集合体 20 bに 対してインターカレーター 24等を挿入し （ステップ 3 0 8)、 シグナル増 幅を行うことができる。 なお、 ステップ 3 0 6とステップ 3 08を同時に 行うことも可能である。
一対のオリゴヌクレオチド .プローブに、 あらかじめ検出のための標識 物質として、 例えば、 I 1 2 5や P 3 2等のラジオアイソトープ、 ジゴキシゲ ユンゃァクリジニゥム . エステル等の発光物質や C y 3 · C y 5等の蛍光 物質、 4ーメチルゥンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するための ビォチン等、 蛍光共鳴エネルギー転移 （F R E T ) を利用するためのドナ 一蛍光色素とァクセプター蛍光色素を付加させておき、 標的遺伝子を検出 することも可能である。
また、 核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、 標的遺 伝子を検出することも可能である。 インターカレーターのような核酸と結 合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが 好適である。 蛍光物質としては、 核酸と結合する性質を有する蛍光物質で あれば、 特に限定されないが、 例えば、 SYBR Green I stain、 SYBR Green ll stain、 SYBR Green Gold stain ^ vistra reen stain、 Geistar stain、 Radiant Red stain、 PicoGreen、 Eiboureen、 011Green、 Hoechst 33258 (Bis-Benzimide)、 Propidium Iodide, YO -PRO- 1 lodide YO-PRO-3 Iodide (以上、 Molecular Probes社製）、臭化工チジゥム、 Distamycin A、 TOTO、 Psoralen、 ァク リ ジニゥムオ レ ンジ ( Acridine Orange )、 AOAO (homodimer) 等が使用できる。
上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、 通常 D N A又は R N Aで構成されるが、 核酸類似体でも構わない。 核酸類似体として、 た とえば、 ぺプチド核酸 （P N A、 例えば、 国際公開第 9 2 Z 2 0 7 0 2号 パンフレツト参照。）や Locked Nucleic Acid ( L N A、例えば、 Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630、 Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120, 13252-13253、 及ぴ Wahlestedt C et al. PNAS. 2000. 97, 5633-5638.参照。） が挙げられる。 また、 一対のオリゴヌクレオチド 'プロ ープは、 通常、 同じ種類の核酸で構成されるが、 たとえば DNAプローブ と RNAプローブが一対になっても差し支えない。 即ち、 プローブの核酸 の種類は DNA、 RNAまたは核酸類似体 （たとえば P NAや L NA等） から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、 たとえば DNAのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、 DNAと RNAから構成されるオリゴヌクレオチド .プローブ （キメラプ ロープ） を使用することも可能であり、 本発明に含まれる。
オリゴヌクレオチド ·プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、 塩基 数にして、 少なく とも 5塩基であり、 好ましくは 1 0〜 1 00塩基、 さら に好ましくは 1 5〜 30塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。 たとえば D N Aプローブの場合、アプライ ドバイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc.) の DNAシンセサイザ一 394型を用いて、 ホスホアミダイ ド法によ り合成することができる。 また、 別法としてリン酸トリエステル法、 H— ホスホネート法、 チォホスホネート法等があるが、 いかなる方法で合成さ れたものであってもよい。
本発明は、 DNAチップで捕捉したターゲッ ト遺伝子に対して、 相補的 な領域を有する一対の HC Pで自己集合体を形成させるものである。 使用 するオリゴヌクレオチド ·プローブの本数は特に限定されないが、 1 02〜 1015本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、 核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。 p Hも常用の範 囲で好適であり、 好ましくは p H 7. 0〜9. 0の範囲のものが使用でき る。 反応温度は 40〜80°C、 好ましくは 55〜65°Cである。
本発明における標的発現遺伝子 （mRNA) 測定用試料は、 該核酸を含 む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。 標的遺伝子は試料より適宜調 製または単離したものでもよく、 特に限定されない。 たとえば、 血液、 血 清、 尿、 糞便、 脳脊髄液、 組織液、 細胞培養物等の生体由来試料、 カビ等 の末端にポリ A鎖を含む mRN Aを持つあらゆる真核生物の含有または感 染した可能性のある試料等が挙げられる。 また、 試料中の標的遺伝子を公 知の方法で増幅した核酸も使用可能である。
(実施例）
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、 これらの実 施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいう までもない。
以下に実施例において用いた材料を示す。
( a ) ターゲット遺伝子：培養細胞より抽出した T o t a 1 RN A
( b ) キヤプチヤープローブ （捕捉用プローブ） ：
1 ) C P— 1 ： 5'-CACGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'
2 ) C P - 2 5'-TGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3'
( c ) プライマー ：
1 ) 第 1プロープ （ポリ d T— HC P) ( 7 8 m e r ) ： 5'"GCATATAGA TATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATAAC GTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
2 ) ポリ d Tプライマー ( 1 8 m e r ) : 5'-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-3'
( d ) HC P ：
1 ) HC P— 1 ( 5 ' 末端 C y 3標識、 6 0 m e r ) : 5'-Cy3"CGCCGGA GATATCTATATGCCCGGTATCACAAAGTATCCGGACGTTATAAGGGCG AACTC-3'
2 ) HC P - 2 ( 5 ' 末端 C y 3標識、 6 0 m e r ) : 5'-Cy3-GCATATA GATATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATA ACGTC-3'
( e ) ポリスチレン製粒子ビーズ： 1種類の粒子ビーズに上記 2種類のキ ャプチヤープローブを固定したもの
(実施例 1 )
培養細胞から抽出した T o t a 1 RNAを用い、 ハウスキーピング遺伝 子である Beta-actinの検出を、 PAL S AR法を利用して試みた。
(1) RNAの逆転写反応及び逆転写産物の精製
上記ターゲット遺伝子、上記第 1プローブ、逆転写酵素（SuperScriptll： インビトロジェン社製）、 及ぴ反応溶液 （Reaction Buffer, DTT, dNTP, RNase inhibitor) を用いて逆転写反応を 37 °Cで 2時間行った。 その後 6 5 °Cで 30分アルカリ処理を行い、 塩酸を用いて中和した。 逆転写産物で' ある c DNAを QIAquick PCR Purification Kit (Q i a g e n社製） を用 いて精製した。
(2) ハイプリダイゼーシヨン
次に、 [上記得られた c DNA、 上記粒子ビーズ、 6 X S S C、 0. 2 % SDS、 5 Xデンハルト溶液]の組成を、全量 5 O Lになるように調整し、 42°Cで 2時間ハイブリダィゼーシヨンを行った。 終了後 0. 22μπιフィ ルターでろ過し、 未反応プローブを除去し、 2 X S S C + 0. 1 %SD Sで 1回、 0. 2 X S S Cで 1回洗浄し上記フィルターでろ過した。
その後、 [上記得られた粒子ビーズ、 上記 HCP— 1及ぴ 2 (1. 5 pm 0 1 / μ L )、 1 % Blocking Reagent ( R o c h e社製）、 0. 1 % N-lauroylsarcosine 0. 02%SD S、 5 X S S C] の組成 （全量 1 00 μ L) で 65°C30分間、 ハイブリダィゼーシヨ ンを行った。
(3) 検出
洗浄後の粒子ビーズをフローサイ トメーター用シース液に再懸濁しフロ 一サイ トメ一ターで、 HC Pに標識されている C y 3の蛍光を測定した。
(比較例 1 )
通常行われているポリ dTプライマーによる C y 3 - dNTP取り込み 5 の系を用いてターゲット遺伝子の検出を行った。
(1) RN Aの逆転写反応及び解離反応
プライマーとして上記ポリ d Tプライマーを用い、 dNTPの他に、 C 3ラべル£111丁 （Ame r c h a m社製） を取り込ませた以外は実施 例 1と同様にして逆転写反応及び逆転写産物の精製を行った。
( 2 ) ハイプリダイゼーション
次に、 [上記得られた c DNA、 上記粒子ビーズ、 6 X S S C、 0. 2 % SD S、 5 Xデンハルト溶液]の組成を、全量 5 O Lになるように調整し、 42 °Cで 2時間ハイプリダイゼーシヨンを行った。 終了後 0. 2 2μπιフィ ルターでろ過し、 未反応プローブを除去し、 2 X S S C + 0. 1 %SD Sで 1回洗浄ろ過した。
(3) 検出
洗浄後の粒子ビーズをフローサイ トメーター用シース液に再懸濁しフロ 一サイ トメ一ターで、 粒子ビーズ上のキヤプチヤープローブと結合した c DNAに標識されている C y 3の蛍光を測定した。
[結果]
実施例 1及び比較例 1の結果を図 1 3に示した。 蛍光強度は、 各々の種 類に対し 20 3から 5 04個の粒子ビーズの蛍光強度を測定しそのメジァ ン値を示した。 図 1 3に示した如く、 比較例 1と比べて実施例 1の検出感 度は著しく向上した。 産業上の利用可能性
以上述べた如く、 本発明によれば、 逆転写反応のみであるため、 高価な 酵素を必要とせず、 安価で安易な操作で短時間で検出することができ、 更 に、 リニア増幅法や P C R法を用いないため、 元の RNAの長さや発現量 に対応した検出が可能となるという著大なる効果を奏する。

Claims

冃 求 の 範 囲
1. 逆転写反応及びオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己 集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺 伝子の検出感度を向上させることを特徴とする発現遺伝子検出のためのシ グナル増幅方法。
2. 逆転写反応及ぴオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己 集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺 伝子の検出感度を向上させる方法であって、
3， 末端にポリ d Tを有し且つ前記オリゴヌク レオチド .プローブにハイ プリダイズすることが可能な領域を有する第 1プローブをプライマーとし て用いて mRNAの逆転写反応を行い、 c DNA領域を有する第 2プロ一 ブを形成させる工程、
前記 m R N Aを前記第 2プローブから解離させる工程、
前記第 2プローブを、 標的 mRNAの c DNA領域に相補的な領域を有す る捕捉用プローブにハイブリダィズさせる工程、 及び
前記第 2プローブと前記オリゴヌクレオチド ·プローブを用いた自己集合 反応により自己集合体を形成させる工程を有することを特徴とする発現遺 伝子検出のためのシグナル増幅方法。
3. 前記自己集合反応が、 互いに相補的な塩基配列領域が n (n≥ 3) 力 所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブの複数対を用 いて、 互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることによ り、 オリゴヌクレオチドが自己集合し、 二本鎖の自己集合体を形成させる 自己集合反応であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅 方法。
4. 逆転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域が n ( 1 ≥ 3 ) 力所の数 から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブである第 1 HC P及 び第 2 HC Pの複数対を用いて、 互い違いに交差するようにハイプリダイ ゼーションさせることにより、 オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集 合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝 子の検出感度を向上させる方法であって、
3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なく と も一部分有する第 1プローブを mRNAに結合させ、 逆転写酵素を用いて 逆転写反応させ、 c DNA領域及ぴ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少な くとも一部分有する第 2プローブを形成させ、 mRNAを除去した後、 前 記第 2プローブを標的 mRNAの c D N A領域に相補的な領域を有する捕 捉用プローブにハイプリダイゼーションさせ、 前記第 1 HC P及び前記第 211。？又は前記第2^[。？を添加し、 オリゴヌクレオチドの自己集合反 応による自己集合体を形成させ、 シグナルを増幅させることを特徴とする 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
5. 前記自己集合反応が、 N o . 1及ぴ N o . 2の一対のオリゴヌクレオ チドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、 中央領域、 及ぴ 5 ' 側領域の 3つの領域に分け、 各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩 基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3， 側領域及ぴ 5， 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブ を複数対含む第 1の系と、
N o . 3及ぴ N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチ ドを 3 ' 側領域及ぴ 5 ' 側領域の 2つの領域に分け、 各オリゴヌクレオチ ドの 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の 架橋プローブを複数対含む第 2の系とを有し、
該架橋プローブを該ダイマー形成用プロープより形成されるダイマーを架 橋することが可能な塩基配列とし、 該プローブをハイプリダイゼーションさせることにより、 オリゴヌクレオ チドが自己集合し、 自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特 徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。
6 . 前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3， 側領域と第 2の系の N o .
3—オリ ゴヌクレオチドの 3， 側領域、
第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、
第 2の系の N o . 4—オリ ゴヌクレオチドの 3， 側領域と第 1の系の N o . 2—ォリ ゴヌクレオチドの 3， 側領域、
第 2の系の N o . 3一オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の N 0 .
1一オリゴヌクレオチドの 5， 側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とする ことを特徴とする請求項 5記載のシグナル増幅方法。
7 . 前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3 '側領域と第 2の系の N o .
3—オリ ゴヌク レオチドの 3 ' 側領域、
第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5， 側領域、
第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 3， 側領域、
第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5， 側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とする ことを特徴とする請求項 5記載のシグナル増幅方法。
8 . 前記捕捉用プローブが、 支持体に結合していることを特徴とする請求 項 2〜 7のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
9 . 前記支持体が、 マイクロプレート型、 スライ ドグラス型、 微粒子型、 9 又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項 8記載の シグナル増幅方法。
1 0 . 前記自己集合体に対して、 標識プローブをハイブリダィゼーシヨン させることによりより前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする 請求項 1〜 9のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
1 1 . 前記標識プローブが、 発色系酵素、 発光系酵素、 又はラジオァイソ トープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項 1 0記載の 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
1 2 . 前記自己集合体に対して、 核酸と結合する性質を持った蛍光物質を 加え、 その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出 することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出 のためのシグナル増幅方法。
1 3 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌク レオチドを蛍光物質で 標識し、 前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出す ることを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出の ためのシグナル増幅方法。
1 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイ ソトープで標識し、 前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検 出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検 出のためのシグナル増幅方法。
1 5 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌク レオチドを発色系酵素 又は発光系酵素で標識し、 前記自己集合体の存在を光化学的な変化により 検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子 検出のためのシグナル増幅方法。
1 6 . 前記オリゴヌクレオチドが、 D N A、 R N A、 P N Aまたは L N A のいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項 1〜 のいずれか 1記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 c
PCT/JP2004/001588 2003-02-14 2004-02-13 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 WO2004072302A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2515734A CA2515734C (en) 2003-02-14 2004-02-13 Signal amplification method for detecting expressed gene
KR1020057012669A KR101050510B1 (ko) 2003-02-14 2004-02-13 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법
CN200480003402.1A CN1745180B (zh) 2003-02-14 2004-02-13 用于表达基因检测的信号扩增方法
US10/543,683 US20060035235A1 (en) 2003-02-14 2004-02-13 Signal amplification method for detecting expressed gene
JP2005505011A JP4351210B2 (ja) 2003-02-14 2004-02-13 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法
EP04710967A EP1593746B1 (en) 2003-02-14 2004-02-13 Signal amplification method for detecting expressed gene
AU2004212083A AU2004212083B2 (en) 2003-02-14 2004-02-13 Signal amplification method for detecting expressed gene

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003037212 2003-02-14
JP2003-037212 2003-02-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004072302A1 true WO2004072302A1 (ja) 2004-08-26

Family

ID=32866352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/001588 WO2004072302A1 (ja) 2003-02-14 2004-02-13 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20060035235A1 (ja)
EP (1) EP1593746B1 (ja)
JP (1) JP4351210B2 (ja)
KR (1) KR101050510B1 (ja)
CN (1) CN1745180B (ja)
AU (1) AU2004212083B2 (ja)
CA (1) CA2515734C (ja)
WO (1) WO2004072302A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007108378A1 (ja) 2006-03-15 2007-09-27 Eisai R & D Management Co., Ltd. シグナルプローブポリマーの形成方法
JPWO2006093097A1 (ja) * 2005-02-28 2008-08-07 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アシストプローブ及びその利用方法
US7862998B2 (en) 2005-02-28 2011-01-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Assist probe and method of using the same
WO2013172305A1 (ja) 2012-05-15 2013-11-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｒｎａの検出方法及び検出用キット
JP2020000157A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 積水メディカル株式会社 ｓｉＲＮＡの定量方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8450058B2 (en) * 2007-08-14 2013-05-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method of detecting target substance
CN109147869B (zh) * 2017-06-28 2021-10-22 上海思路迪生物医学科技有限公司 基因检测产品探针分管组合的优化方法、装置及系统
KR20200132494A (ko) 2019-05-17 2020-11-25 주식회사 향한 판재 측면 코팅방법
KR20200132496A (ko) 2019-05-17 2020-11-25 주식회사 향한 판재 측면 코팅장치

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021271A1 (en) * 1994-02-07 1995-08-10 Molecular Tool, Inc. Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysistm of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
WO2002018642A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 Sanko Junyaku Co., Ltd. Method of detecting gene
JP2002355081A (ja) * 2001-03-21 2002-12-10 Sanko Junyaku Kk オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法
JP2003061679A (ja) * 2001-08-29 2003-03-04 Sanko Junyaku Kk オリゴヌクレオチドの巨視的な自己集合体の検出方法及びその形成方法。

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932451A (en) * 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
JP3267576B2 (ja) * 1998-11-09 2002-03-18 三光純薬株式会社 プローブ高分子の形成方法
JP4860869B2 (ja) * 1999-12-29 2012-01-25 オックスフォード ジーン テクノロジー アイピー リミティド 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
CA2400680A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Datascope Investment Corp. Methods for assay and detection on a microarray
JP3310662B2 (ja) * 2000-03-31 2002-08-05 三光純薬株式会社 プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用
ATE341647T1 (de) * 2000-10-11 2006-10-15 Sanko Junyaku Kk Verfahren zur konstruktion von selbstassembierenden sonden und verfahren zu ihrer detektion

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021271A1 (en) * 1994-02-07 1995-08-10 Molecular Tool, Inc. Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysistm of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
WO2002018642A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 Sanko Junyaku Co., Ltd. Method of detecting gene
JP2002355081A (ja) * 2001-03-21 2002-12-10 Sanko Junyaku Kk オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法
JP2003061679A (ja) * 2001-08-29 2003-03-04 Sanko Junyaku Kk オリゴヌクレオチドの巨視的な自己集合体の検出方法及びその形成方法。

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006093097A1 (ja) * 2005-02-28 2008-08-07 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アシストプローブ及びその利用方法
US7862998B2 (en) 2005-02-28 2011-01-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Assist probe and method of using the same
JP4616881B2 (ja) * 2005-02-28 2011-01-19 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アシストプローブ及びその利用方法
WO2007108378A1 (ja) 2006-03-15 2007-09-27 Eisai R & D Management Co., Ltd. シグナルプローブポリマーの形成方法
WO2013172305A1 (ja) 2012-05-15 2013-11-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｒｎａの検出方法及び検出用キット
JP2020000157A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 積水メディカル株式会社 ｓｉＲＮＡの定量方法
JP7161173B2 (ja) 2018-06-29 2022-10-26 積水メディカル株式会社 ｓｉＲＮＡの定量方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20060035235A1 (en) 2006-02-16
CA2515734A1 (en) 2004-08-26
KR20050103904A (ko) 2005-11-01
EP1593746B1 (en) 2013-01-09
CN1745180A (zh) 2006-03-08
KR101050510B1 (ko) 2011-07-20
EP1593746A1 (en) 2005-11-09
JPWO2004072302A1 (ja) 2006-06-01
JP4351210B2 (ja) 2009-10-28
CA2515734C (en) 2013-04-09
AU2004212083B2 (en) 2009-01-29
AU2004212083A1 (en) 2004-08-26
CN1745180B (zh) 2013-03-13
EP1593746A4 (en) 2007-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8329394B2 (en) Methods and substances for isolation and detection of small polynucleotides
EP2920320B1 (en) Rca reporter probes and their use in detecting nucleic acid molecules
EP4077717B1 (en) Method of detecting an analyte
CN115176030A (zh) 检测分析物的方法
CA2744004A1 (en) Compositions and methods for detecting small rnas, and uses thereof
EP1188841B1 (en) Probe for constructing probe polymer, method of constructing probe polymer and utilization thereof
CA2545356A1 (en) Nucleic acid detection method having increased sensitivity
JP5663491B2 (ja) 標的核酸の検出方法
EP2619317B1 (en) Detection of target nucleic acid sequences by exonucleolytic activity using single-labeled immobilized probes on solid phase
KR100738082B1 (ko) 핵산 프라이머 세트, 핵산 프로브 세트 및 그들을 이용한호흡기 질환 바이러스의 검출방법
JP4351210B2 (ja) 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法
WO2004074480A1 (ja) 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法
AU2006219332B2 (en) Signal amplification method
CA2564838A1 (en) Hybridization method
US7550276B2 (en) Method of detecting nucleic acid
WO2007108378A1 (ja) シグナルプローブポリマーの形成方法
US20100113298A1 (en) Detection of rna with micro-arrays

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020057012669

Country of ref document: KR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006035235

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005505011

Country of ref document: JP

Ref document number: 10543683

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20048034021

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004212083

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2515734

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004710967

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2004212083

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20040213

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004212083

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057012669

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004710967

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10543683

Country of ref document: US