WO2004050118A1

WO2004050118A1 - システインプロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: WO2004050118A1
Application number: PCT/JP2003/014263
Authority: WO
Inventors: Nobuhiko Katunuma; Akio Yamada; Yasushi Kawaguchi; Natsuko Takakura
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2004-06-17
Also published as: US20050148504A1; NO20044258L; AU2003277644A1; JPWO2004050118A1; KR20050044758A; EP1568377A1; CA2481489A1

Abstract

　本発明は、乳由来のタンパク質であるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼインの加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能である。

Description

明細システィンプロテアーゼ阻害剤技術分野

本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 - ゥィルス感染症等の予防 ·治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシスティンプロテアーゼ阻害剤である。背景技術

活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシスティンプロテアーゼ（チォ

—ルプロテア一ゼ）と総称されている。カテブシン L、カテブシン B、力テプシン Kは、カルシウム依存性中性プロテア一ゼ ( C AM P )ヽパパイン、フイシン、ブロメライン等とともに代表的なシスティンプロテアーゼの一つである。そしてこれらシスティンプロテア一ゼに対して阻害作用を有する物質は、システィンプ口テアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬等として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテブシン L、カテブシン Bと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、それによつて、とりわけカテブシン L阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシゥム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある（勝沼信彦著、「： B I O raediaj, 第 7 卷、第 6号、第 7 3〜 7 7ページ、 1 9 9 2年）。骨組織においては、骨芽細胞 (osteoblast) による骨形成と、破骨細胞（osteoclast) による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊（骨吸収）を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に 2つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミン D誘導体、女性ホルモン（エストロゲン）等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシスティンプロテァーゼ群、中でも特にカテブシン L、カテブシン B、カテブシン Kによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテブシン L及び Bは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによつて古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテブシン L、カテブシン B及びカテブシン Kのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、夕ンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミン D、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテブシン L阻害、カテブシン B阻害、又はカテブシン K阻害のいわゆるシスティンプロテア一ゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている（特開平 7— 1 7 9 4 9 6号公報、特表 2 0 0 2— 5 0 1 5 0 2号公報）が、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。

一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は 1 0日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシゥムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピ一ドが腎臓の処理能力を上回つたとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。

本発明者らにより、このような目的に使用し得るシスティンプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下のものが開示されている。

(1) カテブシン L特異的阻害ポリペプチド（特開平 7— 179496号公報）

(2) チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平 9— 221425号公報）

(3) パリン誘導体およびその用途（特開 2001 - 139534号公報）

(4) チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平 7— 242600号公報）

(5) FA- 70C1物質（特開 2000- 72797号公報）

(6) FA- 70D物質、その製造法及びその用途（国際公開第 97/31122号パンフレット）

しかしながら、食品素材として利用の点から、より汎用性の高いシスティンプ口テアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。

他方、これまでに、母乳中にプロテア一ゼ阻害物質が存在することが知られている。母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、ひ1一アンチキモトリブシン、ひ 1—アンチトリプシンが挙げられ、ィン夕一 α2 —トリプシン阻害物質、ひ 2—アンチプラスミン、ひ 2—マクログロブリン、アンチトロンビン III、アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含まれている（清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第 80〜81ページ）。

乳中において、システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質については、すでに以下のものが開示されている。

( 1 )牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約 57 kDaの新規システィンプロテア一ゼインヒビ夕一（特開平 7— 2896号公報）

( 2 ) 牛初乳由来の分子量 16 ± 2 kDa又は 13 ± 2 kDaの新規システィンプ口テアーゼインヒビ夕一（特開平 7—126294号公報）

( 3 ) 人乳由来の分子量 16 ± 2 kDa又は 13 ± 2 kDaの新規夕ンパク質およびその製造方法（特開平 10— 80281号公報）

( 4 )牛乳から調製された牛乳由来塩基性シス夕チン及び/又は牛乳由来塩基性シス夕チン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開 2000-281587 号公報）

(5) 乳塩基性蛋白質（MBP) 中に含まれるシス夕チン C；、及びインビトロにおける該シス夕チン Cによる骨吸収阻害効果（バイオサイエンス 'バイオテクノロシ一 ' アンド ' ノィオケミストリ一 L Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry], 日本、第 66卷、第 12号、 2002年、 ρ· 2531 - 25 3 6 )

ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフヱリン及び/?一カゼインなどが挙げられる。カゼインは、ひ s—カゼイン、ーカゼイン及び一力ゼインに分類され、人乳中のカゼインは、 5—カゼインがほとんどであり、ひ s —カゼインは存在しないか、又は痕跡程度認められるのみであるが、牛乳中の力ゼインは、 cc s—カゼイン、 ?一カゼインをほぼ等量含む。カゼインは栄養成分としての働きの他に、最近ではそのタンパク質の一次構造に潜在的に含まれる力ルシゥム吸収促進作用やマクロファージ貪食活性化作用を有する生理活性ぺプチド等が発見され、注目を集めている。また、カゼインは高い栄養価とともに、乳製品の原材料として、あるいは、チーズ、ヨーグルト、スキムミルク等の様々な食品に含まれ、我々の食生活に寄与している。

カゼインを利用した発明としては、本出願人により、すでに一カゼイン又は /c—カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤（特開平 8— 8 1 3 8 8号公報）が開示されている。

また、ヒト乳から分離した /?—カゼィン若しくはその組換え形態又はそのいずれかの水解物は、ィンフルェンザ菌のヒト細胞への付着の阻害（特表平 1 0— 5 0 0 1 0 1号公報)、及び哺乳動物細胞の R Sウィルス (Respiratory Syncytial Virus) 感染阻害（特表平 1 0— 5 0 0 1 0 0号公報）が開示されている。

更に、ーカゼイン加水分解物のアンジォテンシン変換酵素阻害活性（特開平 6 - 1 2 8 2 8 7号公報及び特開平 6— 2 7 7 0 9 0号公報）が開示されている _c しかしながら、カゼィン及びその部分ぺプチドがシスティンプロテアーゼ阻害作用を有することは知られていない。発明の開示

本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 ·ウィルス感染症等の予防 ·治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシスティンプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。

本発明者は、抗原性のない、安全な素材として利用する事が可能なシスティンプロテア一ゼ阻害物質を鋭意探索した結果、乳由来のタンパク質であるカゼィン、カゼィンの部分ぺプチド、及びカゼィンの加水分解物にシスティンプロテアーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の要旨は以下の（ 1) 〜（24) のとおりである。

(1) カゼィン又はその部分べプチドを有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

(2) カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である（1) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

(3) 以下の（A) 又は（B) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

(A)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 133〜 15 1のアミノ酸配列を有するぺプチド。

( B )配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 133〜 15 1のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有するペプチド。

(4) 以下の（C) 又は（D) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシスティンプロテアーゼ阻害剤。

( C )配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともァミノ酸番号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチド。

(D)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なぐともアミノ酸番号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。

( 5 ) カゼィンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システィンプロテア一ゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

( 6 ) 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される 1種又は複数種である（5) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

( 7 ) 前記カゼィン加水分解物の分解率が 6〜 45 %である（ 5 )又は（ 6 ) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

( 8 ) 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 200〜 5000ダルトンである（5) 〜（7) のいずれかのシスティンプロテアーゼ阻害剤。 (9) カゼイン加水分解物を全量に対して 0.005質量％以上含有する、 (5) 〜（8) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

(10) システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防 ·治療剤である（1) 〜（9) のいずれかのシスティンプロテアーゼ阻害剤。

(1 1) システィンプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 ·ウィルス感染症等である（10) のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

(12) (1) 〜（1 1) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。

(13) (1) 〜（1 1) のいずれかのシスティンプロテア一ゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システィンプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。

(14) カゼイン又はその部分ペプチドの、システィンプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。

(15) カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である、（1 4) の使用。

(16) 以下の（A)又は（B)に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

(A)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 133〜 151のアミノ酸配列を有するぺプチド。

( B )配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 133〜 51のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有するペプチド。

(17) 以下の（C)又は（D)に示すカゼィン又はその部分ペプチドの、システィンプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。

( D )配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有するペプチド。

(18) カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システィンプロテア一ゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

(19) 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される 1種又は複数種である（18) の使用。

(20) 前記カゼイン加水分解物の分解率が 6〜45%である（ 18) 又は（19) の使用。

(21) 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 200〜 5000ダルトンである（18) 〜（20) のいずれかの使用。

(22) カゼィン加水分解物をシスティンプロテア一ゼ阻害剤の全量に対して 0. 005質量％以上含有させることを特徴とする、（ 18) 〜（21) のいずれかの使用。

(23) システィンプロテアーゼ阻害剤が、システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防 '治療剤である、（14) 〜（22) のいずれかの使用。

(24) システィンプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 ·ウィルス感染症等である（23) の使用。図面の簡単な説明

図 1は、ゥシ乳タンパク質の逆ザィモグラフィ一の検出を示す図（写真）である。

図 2は、ゥシカゼィン及びゥシ ?一力ゼィンぺプチドのアミノ酸配列を示す図である。

図 3は、パパインに対するカゼィン類のシスティンプロテア一ゼ阻害効果を示す図である。

図 4は、 ?一カゼインのシスティンプロテア一ゼ阻害活性スぺクトルを示す図である。

図 5は、ヒト ?—カゼイン及びヒト ?—カゼインペプチドのアミノ酸配列を示す図である。発明を実施するための最良の形態

次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。

本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシスティンプロテアーゼ阻害剤に関する。本発明に用いられるカゼインとしては、市販の各種カゼイン、若しくはヒト、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ等の乳等から常法（例えば、等電点沈殿法）により単離したもの、又は遺伝子組換え技術等によって生産されたものであってよい。カゼインは、ひ一カゼイン、 ?一カゼイン、及び一カゼインに分類されるが、本発明にはいずれのカゼインも用いることができ、好ましくは/?—カゼィン又は一カゼィンを用いることができる。その中でも特にヒト由来の ?—カゼイン（例えば、 Swiss-Prot Accession No.： P05814に記載のァミノ酸配列を有するヒト ?—カゼィン）、及びゥシ由来の/?—カゼィン（例えば、 Swiss-Prot Accession No.： P02666に記載のアミノ酸配列を有するゥシ ?—カゼイン）が好ましい。具体的には、ヒトの/? 一力ゼィンのアミノ酸配列を配列番号 1、ゥシの^—カゼィンのアミノ酸配列を配列番号 2に示す。

本発明に用いられるカゼインの部分ペプチドとしては、例えば、前記カゼインを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解し、生成した部分ぺプチドを精製することにより得ることができる。一例としては、カゼィンを 1 0 O mMのトリス塩酸緩衝液（ p H 8 . 5 ) 中でリシルェンドぺプチダーゼにより 3 5 で 3時間以上消化し、生成した部分べプチドを高速ク口マトグラフ法等により精製することにより製造することができる。

本発明において使用することができるカゼィン又はカゼィンの部分ぺプチドの好ましい形態としては、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するヒト ?一力ゼイン、又は配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。また、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するウシ^—カゼィン、又は配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチドも例示することができる。なお、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 1〜 1 5はシグナル配列である。

これらのカゼィン又はカゼィンの部分ぺプチドはシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するため、本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤に用いることができる。また、完全長のカゼインがシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有することから、配列表の配列番号 1のァミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1を含み、 N末端側もしくは C末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0を含み、 N末端側もしくは C末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するぺプチドも、システィンプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。

これらのペプチドは、例えば、本発明によりシスティンプロテアーゼ阻害活性領域が明らかになつたので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によつて得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに適当なプライマ一を作製し、該プライマ一を用いて目的の塩基配列を含む c D N Aを铸型として P C R等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。

また、通常遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、 1又は複数個の位置での 1又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が存在し、このような変異を有する遺伝子がコ一ドするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じることがあるので、本発明に用いることができるカゼィン及びカゼィン部分べプチドにおいても、システィンプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲でこのような変異を含むことが可能である。本発明に用いることができるカゼィン又はカゼィンの部分べプチドとしては、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド、並びに配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともァミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチドが例示される。ここで、複数とは、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸、及び、配列表の配列番号 2に記載のうち、アミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸において、ァミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、 2から 5個、好ましくは、 2から 3個である。

また、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、ァミノ酸番号 1 3 3 〜1 5 1のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、又は、配列表の配列番号 2に記載のうち、アミノ酸番号 1 4 2〜1 6 0のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において 1 又は複数個の置換 ·欠失等を含むものであってもよい。この場合の複数個とは、ァミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、 2から 1 0個、好ましくは、 2から 5個である。

さらに、本発明に用いることができるカゼィン又はカゼィンの部分べプチドとしては、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜1 5 1のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、又は、配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともァミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはべプチドと、アミノ酸配列において 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、より好ましくは 9 5 %以上の相同性を有し、システィンプロテア一ゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示され "3

前記のようなカゼィンタンパク質又はべプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、改変された塩基配列は従来知られている変異処理によっても取得されうる。変異を有する塩基配列は適当な細胞で発現させ、本発明の実施例に記載のシスティンプロテアーゼ阻害活性の測定法によつてシスティンプロテア一ゼ阻害活性を調べることにより、カゼィン又はべプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。本発明においては、カゼインの加水分解物を用いることもできる。加水分解に用いるカゼインは、前述したようなものを挙げることができる。これらのカゼィンを、以下のように加水分解酵素で加水分解することによって、カゼイン加水分解物を得ることができる。

すなわち、まず前記のような原料カゼインを水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で 5〜15%前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。得られた前記カゼィンを含有する溶液を 70〜90°Cで 10分間〜 15秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。次いで、前記カゼインを含有する溶液にアル力リ剤又は酸剤を添加し、 pHを使用する加水分解酵素の至適 pH又はその付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアル力リ剤又は酸剤であつてもよい。具体的には、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリゥム、炭酸カリウム等を、酸剤としては、塩酸、クェン酸、リン酸、酢酸等を例示することができる。

次いで、前記カゼイン溶液に加水分解酵素溶液を添加する。加水分解酵素は蛋白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、動物由来、又は微生物由来の酵素であることが好ましい。また、酵素はエンドぺプチダ一ゼであることが好ましい。エンドべプチダ一ゼとしては、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、エラス夕ーゼ等、種々の酵素を使用することができる。尚、「由来」とは、元来上記の生物が保持していることを意味し、採取原を意味するものではない。例えば、バチルス ·ズプチリスが産生するプロテア一ゼをコードする遺伝子をェシェリヒア ·コリに導入し、同遺伝子を発現させることにより製造したプロテア一ゼは、バチルス■ズブチリス「由来」である。

加水分解酵素はカゼイン 1 g当たり 20〜200活性単位（この単位については後記する）の割合で添加することが好ましい。ここで、活性単位は、例えば、次の方法により測定することができる。すなわち、プロテア一ゼを含有する粉末を 0. 2g/100mlの割合で 0. 1モルのリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシルパラニトロァニリド（国産化学社製。以後 Leu— pNAと記載する）を 0. 1モルのリン酸緩衝液（pH 7. 0)に溶解して 2 mMの基質溶液を調製する。酵素溶液 lmlに基質溶液 1 mlを添加し、 37 °Cで 5分間反応させ、その後 30%の酢酸溶液 2 mlを添加して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長 41 On mで濾液の吸光度を測定する。プロテア一ゼの活性単位は、 1分間に l /mol の L e u _ p N Aを分解するのに必要な酵素量を 1活性単位と定義し、次式により求めることができる。活性単位（粉末 1 g当たり） = 2 O x (A/B )

ただし、前記の式において A及び Bは、それぞれ波長 4 1 O n mにおける試料の吸光度及び 0 . 2 5 mMパラ二トロア二リンの吸光度を示す。

本発明において用いる加水分解酵素は 1種でもよく、 2種以上用いてもよい。 2種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。

酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば 3 0〜6 0 °C、望ましくは 4 5〜 5 5 °Cに保持してカゼィンの加水分解を開始する。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。尚、本発明において、カゼィン加水分解物の分解率は、 6〜4 5 % が特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の分解率が 6 %以上であると、より分解が進んでいると考えられる。すなわち、分解率が 6 %未満であると、酵素反応を受けない未分解のカゼィンが残存している可能性が考えられることから、分解率は 6 %以上が好ましい。

尚、蛋白質の分解率の算出方法は、例えば、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第 1 0 2頁、株式会社光琳、昭和 5 9年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第 5 4 7ページ、養賢堂、 1 9 7 0年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出することができる。

分解率（％) = (ホルモール態窒素量/全窒素量） X 1 0 0

加水分解反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、 8 0〜1 3 0 °Cの温度範囲で 3 0分間〜 2秒間の保持時間で行うことができる。尚、得られた反応液は必要に応じてクェン酸等の酸により p Hを 5 . 5〜7の範囲に調整しても良い。

本明細書において、数平均分子量とは、数平均分子量に関する文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第 1 1 6乃至 1 1 9頁、株式会社東京化学同人、 1 9 7 8年）に記載されるとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。即ち、蛋白質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、蛋白質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、 Mnと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖 iの分子量が Miであり、その分子数を N iとすると、次の一般式 Iにより定義される。

[一般式 I ] oo CO

Mn ΣΜ Ν /ΣΝ

ί=1 尚、本発明において数平均分子量を測定する場合は、高速液体クロマトグラフィ一により分子量分布を測定し、検量線から GP C分析システムによりデータ解析することにより、数平均分子量を算出することができる。高速液体クロマトグラフィ一の具体的条件としては、カラムとして、ポリハイドロキシェチル ·ァスノ、リレアミド ·カラム [P o 1 y Hydroxye thyl Aspart am i d e Co lumn ：ポリ 'エル ·シ一（P o 1 y 〇）社製。 4. 6 mmx 400mm] を使用し、 20mM塩化ナトリウム、 50mMギ酸により、溶出速度 0. 5ml/分で溶出する条件を挙げることができる。検出は UV検出器（島津製作所。 215nm) を使用して分子量分布を測定し、分子量が既知のサンプルにより検量線を作成し、 GPC分析システム（波長 215nm :島津製作所社製）によりデータ解析し、数平均分子量を求めることができる。

尚、本発明において、カゼィン加水分解物の数平均分子量は、 200〜500 0ダルトンが特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の数平均分子量が 5 000ダルトン以下である場合は、加水分解反応を受けない未分解のカゼィンは含まれず、本願発明の有効成分であるカゼィン加水分解物をより確実に得ることができると考えられることから、数平均分子量は 5000ダルトン以下が好ましい。

得られたカゼィン加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末、として使用することもできる。上記のようにして得られるカゼィン加水分解物は、システィンプロテアーゼ阻害作用を有する。したがって、システィンプロテアーゼ阻害作用を指標として、カゼィン加水分解物を製造する際の条件は、適宜設定することができる。

本発明のプロテアーゼ阻害剤においては、カゼィン、カゼィンの部分べプチド、または加水分解物を単独で使用することも、これらのうちの 2種以上を併用して使用することも可能である。さらに、カゼィンの部分ぺプチド及び加水分解物は、 1種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。本発明に用いることができるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物は、カテブシン B、 L及びパパイン等のシスティンプロテア一ゼに対して阻害活性を有する。システィンプロテアーゼ阻害活性は、 Barrett等の方法 [メソヅド .イン ·ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology), 第 8 0卷、第 5 3 5〜5 6 1ページ、 1 9 8 1年]に従って測定することができる。例えば、 0 . 1 酢酸緩衝液 11 5 . 5に溶解したカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/または加水分解物を含む溶液に、基質として Z— P h e— A r g— M C A ( Benzyloxycarbonyl- L-Phenylalanyl- L-Arginine 4-Methyl- Coumaryl- 7 - Amide：最終濃度 2 O mM：ペプチド研究所社製）を添加し、システィンプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度： 1 5 u n i t s /m l ) を添加して混合し、 3 7 °Cで 1 0分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離した AM C (7- Amino- 4-Methyl- Coumarin)の蛍光強度（励起波長： 3 7 0 nm、発光波長： 4 6 0 n m) を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定することができる。 .

本発明のシスティンプロテア一ゼ阻害剤は、カゼイン、カゼインの部分べプチド、及び/またはカゼイン加水分解物を使用し、これらを公知の製剤学的に許容される製剤担体と組合わせることにより製造することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。

本発明の製剤中に含まれるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/またはカゼィン加水分解物の量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に 0 . 0 0 5〜8 0質量％、好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％とするのがよい。本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与することにより、システィンプロテァーゼが関与する疾患を治療することができる。ここで、患者とは、ヒトであってもよいし、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのカゼィン、カゼィンの部分ペプチド、及び/またはカゼイン加水分解物の量は、 0 . 1〜 1 2 0 O m g/k g/日、好ましくは 1 0〜 5 0 O m g/k g/日の範囲となる量を目安とするのが良く、 1 日 1回又は複数回に分けて投与することができる。

本発明のシスティンプロテアーゼ阻害剤は、システィンプロテア一ゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防 ·治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌 (スタフイロコヅカス 'ァゥレウス V 8等) やウィルス（ポリオウイルス、ヘルぺスウィルス、コロナウィルス、エイズウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。本発明のシスティンプロテアーゼ阻害斉 IJは、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防'治療剤、又は前記細菌 - ゥィルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによつて、前記疾患の予防 ·治療効果、又は前記細菌 ·ウィルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する公知の前記疾患の予防 ·治療剤、又は前記細菌 ' ウィルス増殖抑制剤は、本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、本発明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化して使用時に組み合わせても良い。

本発明の飲食品組成物は、食品又は飲料の原料にカゼイン、カゼインの部分ぺプチド、及び/またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、経口的に摂取することが可能である。前記原料は、通常の飲料や食品に用いられているものを使用することができる。本発明の飲食品組成物は、システィンプロテア —ゼ阻害剤を添加する以外は、通常の飲食品組成物と同様にして調製することができる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；ァイスクリーム、シヤーべヅト、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディ一、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケヅト、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類：加工乳、乳飲料、発酵乳、バタ一等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。

本発明の飲食品組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/ またはカゼィン加水分解物を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中 0 . 0 0 5〜8 0質量％、好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％となるように添加すればよい。

本発明の飼料組成物は、飼料にカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/またはカゼィン加水分解物を添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。飼料組成物の形態としては、ぺットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示され、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、酵母類等とともに混合して本発明の飼料組成物を製造することができる。

本発明の飼料組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/またはカゼィン加水分解物を添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中 0 . 0 0 5〜8 0質量％、好ましくは 0 . 0 5〜6 0質量％となるように添加すればよい。

尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、システィンプロテア一ゼが関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 ·ウィルス感染症の予防用又は治療用であること、を表示することができる。

ここに、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装 ·広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成 1 5年 4月 3 0日、日本国厚生労働省令第 8 6号）の第 1 2条第 1項第 5号参照〕として表示する態様が好ましい。以下に、本発明のシスティンプロテア一ゼ阻害剤の有効成分として使用した力ゼィンの部分べプチドまたはカゼィン加水分解物の製造例を示す。

[製造例 1 ]

配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 133〜15 1のアミノ酸配列を有するペプチドを、以下の方法により製造した。

尚、前記本発明のペプチドは、自動アミノ酸合成装置（アプライド 'バイオシステムズ社製。 Model 433A) を用いて合成を行い製造を行った。

20%ピぺリジン含有 N—メチルピロリドン（アプライド ·バイオシステムズ社製。以下、 N—メチルピロリドンを NMPと略記する）により、ペプチド合成用固相樹脂である HMP樹脂（アプライド 'バイオシステムズ社製）のァミノ保護基である Fmo c基を切断除去し、 NMPで洗浄した後、 Fmoc—スレオニン [具体的には、合成するペプチドの C末端アミノ酸に相当する Fmoc—ァミノ酸（アプライド ·バイオシステムズ社製）] を FastMoc (登録商標）リージェントキット（アプライド 'バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、 NMPで洗浄した。次に、前記 Fmoc基の切断、続いて、 C末端から 2番目のアミノ酸に相当する Fmo c—ァラニンの縮合、及び洗浄を行い、さらに Fmo c—アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、保護ペプチド樹脂を作製し、樹脂より粗製ペプチドを回収した。

前記粗製ペプチドから、高速液体クロマトグラフィー（以下、 HPLCと略記する。）によりペプチドの精製を行った。使用するカラムは逆相系の C 18-0

D S (メルク社製。 LichrospherlOO) を例示することができる。得られた精製ぺプチドは HP LC分析を行い、精製物が単一であることを更に確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列を、気相式自動アミノ酸シーケンサ— （アプライド 'バイオシステムズ社製。 Model 473A) を用いて決定した結果、配列番号 1のアミノ酸番号 133〜151のアミノ酸配列を有していた。

尚、同様の方法により配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 142〜160のアミノ酸配列を有するペプチドも製造した。

[製造例 2 ]

市販牛乳カゼイン「ァラシッド」（蛋白質含量 90%、ニュージーランドミルクプロダクツ製） 100 gを 60°Cに加熱した精製水に 10%濃度に懸濁し、 2. 5 gの水酸化ナトリゥムを加えて完全に溶解した。その後、 85°Cで 10分間の殺菌を行い、溶解液を 50°Cに調整した後、加水分解酵素として、

ン（天野ェンザィム社製、 1 12, 00 OU/g) を 2500U添加し、 50°C で 4時閬保持することによって加水分解し、 90°Cで 10加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約 100 gを得た。得られたカゼィン加水分解物の分解率は 9. 5%、数平均分子量は 910ダルトンであった。

[製造例 3 ]

市販カゼインナトリウム「ァラネート」（蛋白質含量 90%、ニュージ一ランドミルクプロダクツ製） 100 gを 50°Cに加熱した精製水に 12%濃度に溶解した。その後、 85°Cで 10分間の殺菌を行い、溶解液を 40°Cに調整した後、加水分解酵素として、ブタトリブシン（PTN6. O S ;ノボザィム社製、 1, 250 U/g) を 250U添加し、 40°Cで 6時間保持することによって加水分解し、 90°Cで 10分間加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼィン加水分解物約 100 gを得た。得られたカゼィン加水分解物の分解率は 10. 8 %、数平均分子量は 750ダルトンであった。次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。

[試験例 1 ]

本試験は、乳中のシスティンプロテア一ゼ阻害物質を検出するために行った。 ( 1 ) 検出法

本発明者はプロテア一ゼ阻害物質の検出法として「逆ザィモグラフィー」という手法を用い、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロテア一ゼ阻害物質の検出を行った。逆ザィモグラフィ一とは通常のザィモグラフィ一の逆の手法によるものであり、基本的原理は次のとおりである。即ち、ゼラチンを含む SDSポリアクリルアミドゲルにプロテア一ゼ阻害物質を含むサンプルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲル中のタンパク質を分解する。この操作により阻害物質が存在する部分はプロテァーゼの活性を阻害することから、ゼラチンはプロテア一ゼによる分解を免れ、これが染色液によって染色されることにより、阻害物質を識別することが可能となる。

( 2 ) 試験方法本発明における逆ザィモグラフィ一の方法は以下のとおりである。

牛乳中の全タンパク質及び天然のゥシカゼインをサンプルとし、 0. 1% ゼラチンを含む 12. 5%SDSポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以下、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を SD S— PAGEと略記することがある。）を行った。泳動後、ゲルを 2. 5%Triton X- 100溶液に 45分間浸漬して洗浄した後、更に 45分間蒸留水に浸漬する操作を 3回繰り返してゲルを洗浄した。このゲルを、 I mgパパイン（3 lunits/ l) を含む 0. 025M酢酸緩衝液（pH 5. 5) 1 00mlに浸潰し、 37 °Cで 10時間保温してゼラチンを消化した。ゲルを蒸留水で洗浄後、染色液（ 0. 025 %クマシ一■プリリァント .ブルー（CBB) R— 250、 40%メタノール、 7%酢酸水溶液）で 1' 時間染色し、その後脱色液（40%メタノール、 10%酢酸水溶液）で脱色を行つた。

これとは別に、対照試験としてゼラチンを含まない 12. 5%SDSポリアクリルアミドゲルを用いて前記と同様に逆ザィモグラフィーを行った。さらに、通常の 12. 5%SD S-P AGE (CBB染色）を行った。

( 3 ) 試験結果

本試験の結果は図 1に示すとおりである。図 1は逆ザィモグラフィ一のパターンを示す結果である。図 1の 1レーンは牛乳中の全タンパク質の通常の SD S— PAGEのパターン、 2レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザィモグラフィ一のパターン、 3レーンは牛乳中の全夕ンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザィモグラフィー（対照）のパターン、 6レーンは天然のゥシ一カゼインの逆ザィモグラフィ一のパターン、 7レーンは天然のゥシ ?一力ゼィンのゲルにゼラチンを含まない逆ザィモグラフィ一（対照）のパターンを各々示している。尚、図中矢印は天然めゥシ'由来/?—カゼイン（分子量 35kDa) の SDS— PAGEによる泳動位置を示している。尚、 4レーン及び 5レーンは、本試験例とは直接関係がない。

図 1から明らかなとおり、 2レーンにおいてゥシ ?—カゼインの泳動位置（3 5kDa) とほぼ同位置に逆ザィモグラフィ一のポジティブなバンドが確認された。このことより、牛乳中にシスティンプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存在が確認された。また、 6レーンにおいて天然のゥシ ?一カゼインを泳動したパパインを用いた逆ザィモグラフィ一において、ポジティブなバンドが確認された以上の結果から、ゥシ由来の^—カゼィンにシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有することが示唆された。

[試験例 2 ]

本試験は、試験例 1においてシスティンプロテアーゼ阻害活性が示唆された 3 5 kD aのバンドについて N末端アミノ酸配列を決定するために行った。

( 1 ) 試験方法

試験例 1で使用した牛乳中の全夕ンパク質サンプルを同様に使用して S D S — PAGEを行った後、ポリビニリデンジフルオラィド（PVDF)膜に転写し、 P V D F膜を C B Bで染色後、 35 k D a付近に泳動された染色バンドを切り出した。このバンドについて、ヒューレットパッカード社製 G 1005 Aプロティンシーケンシングシステムを用いて N末端アミノ酸配列を決定した。

( 2 ) 試験結果

本試験の結果は図 2に示すとおりである。図 2は牛乳中の 35 k D a染色バンドのアミノ酸配列を決定した結果である。その結果、 35 kD a染色バンドの N 末端アミノ酸配列はゥシ 5—カゼインのそれと完全に一致した。従って、本試験の結果と試験例 1の結果の両者から、ゥシ ?一カゼインはシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有することが明らかとなった。

[試験例 3]

本試験は、カゼィン分子中におけるシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有する領域を検索するために行った。

( 1 ) 試験方法

ゥシ ?—カゼイン 250 /gを、 10 OmMトリス塩酸緩衝液（pH8. 5) に溶解し、リシルェンドぺプチダ一ゼにより 35°Cで 16時間消化した。消化後のゥシ ?—カゼインペプチド混合物にシスティンプロテア一ゼ阻害活性が保持されているかどうかを確認するために、システィンブロア一ゼ阻害活性を測定した。

阻害活性の測定方法は Barrett等の方法 [メソッド 'イン 'ェンザィモロジ一 (Methods in Enzyraology), 第 80巻、第 535〜 561ページ、 1981年] を参考にして、次のとおり行った。即ち、 0. 1M酢酸緩衝液 pH5. 5に溶解したゥシ ?一カゼインペプチド混合物溶液に、基質として Z- Phe- Arg- MCA (最終濃度 2 O mM：ペプチド研究所社製）を添加し、システィンプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度： 1 5 units/il) を添加して混合し、 3 7 °〇で 1 0分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離した AMCの蛍光強度（励起波長： 3 7 0 nm、発光波長： 4 6 0 n m) を蛍光分光度計（日立社製）を用いて測定した。

測定の結果、ゥシ ?一力ゼィンぺプチド混合物に阻害活性が保持されていることが確認されたので、引き続きペプチド混合物について、 TSK Gel DDS- 80Tsカラム（東ソ一社製）を用いた逆相 H P L Cによるァセトニトリル直線濃度勾配溶出法によって、主要なピークを分離した。次に、分離したピークのサンプル（以下、ペプチドサンプルと記載する。）の各々について、前記と同様の方法でシスティンプロテアーゼ阻害活性を測定した。

ぺプチドサンプルの阻害活性測定の結果、活性を有するぺプチドサンプルについて、ヒュ一レヅトパヅカード社製 G 1 0 0 5 Aプロティンシーケンシングシステムを用いてそのアミノ酸配列を決定した。

( 2 ) 試験結果

本試験の結果は図 2に示すとおりである。その結果、阻害活性を有する主要なぺプチドサンプルは、図 2中のゥシ ?—カゼィンのアミソ酸配列における 1 4 2 残基目 Leuから 1 6 0残基目 Hisまでのアミノ酸配列（下線部：以下、該配列のペプチドをゥシ ?—カゼィンぺプチドと記載する。）を有することが判明した。

[試験例 4 ]

本試験は、カゼィン類のシスティンプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。 '

( 1 ) 試験方法

試験試料として、ゥシ ?一カゼイン、ゥシひ一カゼイン、及びゥシ一力ゼィンを各々用いて、試験例 3に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害活性測定方法と同様の方法により前記試験試料のシスティンプロテアーゼ阻害活性を測定した。 ( 2 ) 試験結果

本試験の結果は、図 3に示すとおりである。図 3は、ゥシ一カゼイン、ゥシひ一カゼィン、及びゥシ Λ:—カゼィンのパパインに対するシスティンプロテア一ゼ阻害効果を示す。その結果、一カゼイン及び一カゼインは 1 0—⁵Mの濃度でパパインを完全に阻害し、ひ一カゼィンについても若干弱いながらも 1 0— ⁴M でパパインの活性をほぼ阻害することが判明した。従って、 ^—カゼインだけでなく、一カゼィンやひ一力ゼィンについてシスティンプロテァーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。

[試験例 5 ]

本試験は、ゥシ ?一カゼインのシスティンプロテアーゼ阻害活性スぺクトルを測定するために行った。

( 1 ) 試験方法

試験試料としてゥシカゼイン、システィンプロテア一ゼとしてパパイン、カテブシン B、及び力テプシン Lを使用して、試験例 3に記載のシスティンプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシスティンプロテア —ゼ阻害活性スベクトルを測定した。

( 2 ) 試験結果

本試験の結果は図 4に示すとおりである。図 4は、パパイン、カテブシン B、及び力テプシン Lに対するウシ^一力ゼィンの阻害効果を測定した結果である。その結果、ゥシ ?—カゼインが 1 0—⁵Mでパパインを完全に阻害することが判明した。またカテブシン B及びカテブシン Lについてもゥシ ?—カゼインが 1 CT⁴ Mでそれらのプロテアーゼ活性をほぼ阻害することが判明した。従って、ゥシ ? 一力ゼィンはパパイン、カテブシン B、及びカテプシン Lのプロテア一ゼ活性を阻害し、幅広いシスティンプロテア一ゼ阻害活性スぺクトルを有することが明らかとなつた。

[試験例 6 ]

本試験は、ヒト ? _カゼインのシスティンプロテア一ゼに対する阻害効果を測定するために行った。

( 1 ) 試験方法

常法に従って精製したヒト 5—カゼイン（例えば、ジャーナル ·ォブ 'ディリ一 -サイエンス [J. Daily Sci. j 第 5 3卷、第 2号、第 1 3 6〜1 4 5ページ、 1 9 7 0年、に記載の方法によって精製)、及び実施例 1で合成した配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列（ヒト ?—カゼインのアミノ酸配列）のうち、ァミノ酸番号 133〜151のアミノ酸配列を有するペプチド（図 5中、ヒト ?一カゼィンの下線部べプチド：以下、該配列のぺプチドをヒト^—カゼィンぺプチドと記載する。）を各々試験試料として、試験例 3に記載のシスティンプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシスティンプロテア一ゼ阻害活性を測定した。

( 2 ) 試験結果

本試験の結果、ヒト ?—カゼィンは 10— ⁵Mでパパインのプロテア一ゼ活性をほぼ完全に阻害することが判明した。また、ヒト ?一カゼインペプチドは、 10 —⁵Mでパパインのプロテア一ゼ活性を 65%阻害し、 10— ⁴Mでパパインのプロテァ一ゼ活性を完全に阻害することが判明した。

[試験例 7]

本試験は、カゼィン加水分解物のシスティンプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。

( 1 ) 試料の調製

加水分解物としてパンクレアチンをそれそれ 2000、 8000、及び 900 0ユニット（units) 添加して製造したこと以外は、製造例 2と同一の方法により製造したカゼィン加水分解物を試験試料 1、試験試料 2及び試験試料 3とした c 尚、試験試料 1、試験試料 2及び試験試料 3の分解率（％)は、それぞれ 8. 2、 33. 5及び 38. 0であった。また、試験試料 1、試験試料 2及び試験試料 3 の数平均分子量（ダルトン）は、それぞれ 1020、 250及び 210であった。

( 2 ) 試験方法

0. 1M酢酸緩衝液 pH5. 5に溶解した試験試料溶液に、基質として Z— P he-Ar g-MCA (最終濃度 20 mM：ペプチド研究所社製）を添加し、システィンプロテア一ゼであるパパイン溶液（最終濃度 15uni t s/ml) を添加して混合し、 37°Cで 10分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離した AM Cの蛍光強度（励起波長： 370 nm、発光波長： 460 nm) を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定した。

( 3 ) 試験結果

本試験の結果は、表 1に示すとおりである。表 1は、各試験試料のシスティンプロテア一ゼ阻害活性を示す。その結果、試験試料 1は、 0. lmg/mlの濃度でパパインによるシスティンプロテア一ゼ活性を 39%阻害し、 0. 2mg/ mlの濃度では 61%阻害した。試験試料 2は、 0. 2mg/mlの濃度でパパインによるシスティンプロテア一ゼ活性を 76%阻害し、 0. 05mg/mlの濃度においても 50%阻害した。試験試料 3は、 0. 2mgノ mlの濃度でパパインによるシスティンプロテア一ゼ活性を 53%阻害し、 0. lmg/mlの濃度で 44% 0. 05mg/mlの濃度においても 37%阻害した。

【表 1】

-a7- Sに一おける阻害率（％) δ¾料分解率（％) 数平均分子量 0.2 0.1 0.05

(ダルトン） (mg/il) (mg/ml) (mg/ml) Si験試料 1 8.2 1020 61 39 8

§式験 §i料 2 33.5 250 76 64 50 試験 a ^料 3 38.0 210 53 44 37 実施例

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[実施例 1 ]

(ゥシ ?一カゼインを配合した錠剤の調製）

次の組成からなる錠剤のシスティンプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。

ゥシ一カゼイン（シグマ社製） 40. 0 (%) 乳糖（森永乳業社製） 18. 5 トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） 30. 7 ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） 1. 4 カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） 9. 4 ゥシカゼイン、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、 50°Cで 3時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシゥムを添加して混合し、常法により打錠し、旋剤を得た。 [実施例 2 ]

(カプセル入りゥシ ?—カゼインの調製）

乳糖（和光純薬工業社製） 600 g、トウモロコシデンプン（日清製粉社製） 400 g、結晶セルロース（和光純薬工業社製） 400 g及びゥシーカゼィン (シグマ社製） 600 gを、 50メッシュ篩（ャマト科学社製）により篩分けし、厚さ 0. 5 mmのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Cesere Pedini社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。 1号ゼラチンカプセル、 Op.Yellow No.6 Body、空重量は 75mg) に内容量 275 mgで充填し、ゥシ一カゼイン 82mg入りのカプセル剤 7, 0 00個を得た。

[実施例 3]

(ゥシ ?—カゼインを添加した飲料の調製）

脱脂粉乳（森永乳業社製） 90 gを 50 °Cの温湯 800mlに溶解し、砂糖（日新製糖社製） 30 g、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製） 14 g、カラメル（昭和化工社製） 2 _g、及びコ一ヒ一フレーバー（三栄化学社製） 0. 01 g、を攪拌しながら順次添加して溶解し、 10°Cに冷却し、ゥシ ?—カゼイン（シグマ社製） l gを添加し、ゥシ ?一カゼイン約 0. 1%を含むシスティンプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。

[実施例 4]

(ゥシ ?—カゼインを添加した経腸栄養食粉末の調製）

ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製） 10. 8kg、デキストリン（昭和産業社製） 36 k g、及び少量の水溶性ビ夕ミンとミネラルを水 200 k gに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製） 3kg, パーム油（太陽油脂社製） 8. 5kg, サフラワー油（太陽油脂社製） 2. 5kg, レシチン（味の素社製） 0. 2kg、脂肪酸モノグリセリド（花王社製） 0. 2kg、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、 70°Cにカロ温し、更にホモゲナイザーにより 14. 7 MP aの圧力で均質化した。次いで、 90°Cで 10 分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約 59 k gを調製した。この中間製品粉末 5 Okgに、蔗糖 (ホクレン社製) 6. 8k , アミノ酸混合粉末（味の素社製） 167 g、及びゥシ 5—カゼィン（シグマ社製） 60 gを添加し、均一に混合して、ゥシ ?一カゼインを含有するシスティンプロテア一ゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約 57 kgを製造した。

[実施例 5]

(ゥシカゼィン加水分解物を配合した錠剤の調製）

次の組成からなる錠剤のシスティンプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製し/し

製造例 2で製造したカゼイン加水分解物 40. 0 (%) 乳糖（森永乳業社製） 18. 5 トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） 30. 7 ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） 1. 4 カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） 9. 4 ゥシカゼイン加水分解物、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、 5 0 °Cで 3時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシゥムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。

[実施例 6 ]

(ゥシカゼィン加水分解物を添加した飲料の調製）

脱脂粉乳（森永乳業社製） 90 gを 50 °Cの温湯 800mlに溶解し、砂糖（日新製糖社製） 3 0 g インスタントコ一ヒー粉末（ネスレ社製） 14 g、カラメル（昭和化工社製） 2 g、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製） 0. 0 1 g、を攪抻しながら順次添加して溶解し、 10°Cに冷却し、製造例 2で製造したゥシカゼイン加水分解物 1 gを添加し、ゥシカゼイン加水分解物約 0. 1%を含むシスティンプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。

[実施例 7 ] (ゥシカゼィン加水分解物を添加した経腸栄養食粉末の調製）

ホエー蛋白酵素分解物 (森永乳業社製) 10. 8kg、デキストリン（昭和産業社製） 36kg、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水 20 Okgに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製） 3k s パ一ム油（太陽油脂社製） 8. 5kg、サフラワー油（太陽油脂社製） 2. 5kg、レシチン（味の素社製） 0. 2kg、脂肪酸モノグリセリド（花王社製） 0. 2kg、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、 70°Cにカロ温し、更にホモゲナイザ一により 14. 7 MP aの圧力で均質化した。次いで、 90°Cで 10 分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約 59 k gを調製した。この中間製品粉末 5 Okgに、蔗糖（ホクレン社製） 6. 8kg, アミノ酸混合粉末（味の素社製） 167 g、及び製造例 2で製造したゥシカゼイン加水分解物 60gを添加し、均一に混合して、ゥシカゼイン加水分解物を含有するシスティンプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約 57kgを製造した。産業上の利用の可能性

以上詳記したとおり、本発明はカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び/又はカゼィン加水分解物を有効成分とするシスティンプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。

(1)食品素材として利用することができるタンパク質、その部分ペプチド及び /又はその加水分解物であるので、安全性に優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。

(2) 幅広いシスティンプロテアーゼに対して阻害活性スぺクトルを有する。

(3)システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防'治療剤として使用することが可能である。

(4)特定保健用食品、栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用することが可能である。

( 5 )食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である c

Claims

請求の範囲

1 . カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシスティンプロテアーゼ阻害剤。

2 . カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である請求項 1に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

3 . 以下の（A) 又は（B ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

( A) 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するぺプチド。

( B ) 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともァミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、揷入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。

4 . 以下の（C ) 又は（D ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシスティンプロテアーゼ阻害剤。

( C )配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するぺプチド。

( D ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。

5 . カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システィンプロテアーゼ阻害作用を有するカゼィン加水分解物を有効成分として含有するシスティンプロテアーゼ阻害剤。

6 . 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される 1種又は複数種である請求項 5に記載のシスインプロテアーゼ阻害剤。

7 . 前記カゼィン加水分解物の分解率が 6 ~ 4 5 %である請求項 5又は 6 に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

8 . 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 2 0 0〜 5 0 0 0ダルトンである請求項 5〜請求項 7のいずれか一項に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

9 . カゼイン加水分解物を全量に対して 0 . 0 0 5質量％以上含有する、請求項 5〜請求項 8のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

1 0 . システィンプロテアーゼが関与する疾患の予防 ·治療剤である請求項 1〜請求項 9のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤。

1 1 . システィンプロテア一ゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 ·ウィルス感染症である請求項 1 0に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤。

1 2 . 請求項 1〜請求項 1 1のいずれか一項に記載のシスティンプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。

1 3 .請求項 1〜 1 1のいずれか一項に記載のシスティンプロテア一ゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システィンプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。 .

1 4 . カゼィン又はその部分ぺプチドの、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

1 5 . カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はゥシ由来である、請求項 1 4に記載の使用。

1 6 . 以下の（A) 又は（B ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

(A) 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するペプチド。

( B )配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 3 3〜 1 5 1のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有するペプチド。

1 7 . 以下の（C ) 又は（D ) に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

( C ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチド。

(D ) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号 1 4 2〜 1 6 0のアミノ酸配列を有するペプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシスティンプロテア一ゼ阻害活性を有するペプチド。

1 8 . カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システィンプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システィンプロテア一ゼ阻害剤の製造のための使用。

1 9 . 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される 1種又は複数種である請求項 1 8に記載の使用。

2 0 . 前記カゼイン加水分解物の分解率が 6〜4 5 %である請求項 1 8又は 1 9に記載の使用。

2 1 . 前記カゼィン加水分解物の数平均分子量が 2 0 0〜 5 0 0 0ダルトンである請求項 1 8〜請求項 2 0のいずれか一項に記載の使用。

2 2 . カゼィン加水分解物をシスティンプロテアーゼ阻害剤の全量に対して 0 . 0 0 5質量％以上含有させることを特徴とする、請求項 1 8〜請求項 2 1 のいずれか一項に記載の使用。

2 3 . システィンプロテア一ゼ阻害剤が、システィンプロテア一ゼが関与する疾患の予防.治療剤である、請求項 1 4〜請求項 2 2のいずれか一項に記載の使用。

2 4 . システィンプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌 · ウィルス感染症である請求項 2 3に記載の使用。