WO1996029599A1

WO1996029599A1 - Methode de quantification du cholesterol dans une lipoproteine a faible densite ou a tres faible densite

Info

Publication number: WO1996029599A1
Application number: PCT/JP1996/000665
Authority: WO
Inventors: Norihiko Kayahara; Toshio Tatano; Eiko Shutoh; Hiroyuki Sugiuchi; Tetsumi Irie; Kaneto Uekama
Original assignee: Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority date: 1995-03-20
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 1996-09-26
Also published as: US5888827A; EP0764848A4; EP0764848A1; JP3091230B2; AU702445B2; CN1148891A; CA2190632A1; AU4955496A; MX9605693A

Description

明細書

低密度リボ蛋白中または超低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法技術分野

本発明は、臨床診断の分野において脂質代謝の面で重要な低密度リボ蛋白

(LDL) または超低密度リボ蛋白（VLDL) 中のコレステロール（以下、 LDLコレステロールおよび VLDLコレステロールという）の定量法に関する。背景技術

LDLは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有するとされ、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の指標となることが知られている。また、卜リグリセライド（TG) を豊富に含有する V L D Lも動脈硬化との関連性が注目されている。従来の LDL コレステロールの定量法としては、超遠心法、電気泳動法、換算法などがあり、 VLDLコレステロールの定量法としては、超遠心法、電気泳動法などがある。超遠心法は、基本的定量法として用いられており、分離用超遠心器で比重の差によって LDLあるいは VLDLを分離し、そのコレステロール量を測定する〔ァドバンスド ' リピッド * リサーチ（Ad v. L i p i d R e s . ) 、第 6巻、 1頁、 1 968年〕。しかしながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点がある。電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜ゃァガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法によりコレステロールを定量する（臨床検査、第 29巻、 1 344頁、 1 985年）。この方法は、簡便性、経済性などの面で問題がある。換算法では、次の計算式に従い LDLコレステロール量を算出する〔クリニカル · ケミストリー（C】 i n. C h em. ) 、第 1 8巻、 4 99頁、 1 972年〕。

(LDLコレステロール量） =( &コレステロール量）

-(HDLコレステロール量） - (トリグリセライド量） /5 しかし、この方法は、血清中の TGの含有量および高脂血症の型などにより制限されるため、簡便性、正確性、多数検体処理などの面で問題がある。以上のように、従来の LDLコレステロールまたは VLDLコレステロールの定量法は、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向きである。さらに、従来の定量法では、分離した LDL画分を定量ピぺッ卜ではかり取る場合などの人的誤差も生じ易い。しかしながら、単純に LDL または VLDLを分画せずに血淸検体を直接コレステロールエステラーゼとコレステロールォキシダーゼが含有された試薬に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わりがなく、 LDLコレステロールまたは VLDLコレステロールを特異的に定量できない。

発明の開示

本発明者らは、糖化合物および Zまたは蛋白可溶化剤を存在させたコレステロール測定試薬の系により超遠心で分画された高密度リポ蛋白（HDL) 、 LDL、 VLDLおよびカイロミクロン（CM) の各リボ蛋白を用いて測定したところ、糖化合物および/または蛋白可溶化剤の組み合わせにより各リポ蛋白との反応性が異なり、その結果 HDL中のコレステロール、 LDLコレステロール、 VLDLコレステロール、 CM中のコレステロールの反応性が異なることを見い出し、本発明に至った。

本発明は、搪化合物およびまたは蛋白可溶化剤存在下、試料中の LDLコレステロール量または VLDLコレステロール量を測定することを特徴とする LDしコレステロールまたは VLDLコレステロールの定量法に関する。上記測定の際には、さらに特異性を上げるため、 2価の金属塩を併用して添加することもできる

また、本発明により、糖化合物およびまたは蛋白可溶化剤を成分とする LDL または VLDL中のコレステロールの定量試薬、あるいは糖化合物と蛋白可溶化剤を組み合わせてなる LDLまたは VLDL中のコレステロールの定量試薬を提供することができる。

糖化合物としては、グルコース誘導体が好ましく用いられ、グルコース誘導体としては、例えば、一般式（ I )

〔式中、 R¹ 、 R² および R³ は同一または異なって水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルカノィル、 S〇₃ M² (式中、 M² は水素または金属を表す）、一（ダルコシル） _p — H (式中、 pは 1または 2を表す）または— （マルトシル） _Q — H (式中、 qは 1または 2を表す）を表し、 R⁴ および R⁵ は同一または異なって水素、金属または S〇₃ M³ (式中、 M³ は水素または金属を表す）を表し、 mは 6〜8の整数を表す〕で表される化合物、一般式（II)

〔式中、 R⁶ 、 R⁷ および R⁸ は同一または異なって水素または S〇₃ M⁴ (式中、 M⁴ は水素または金属を表す）を表し、 R⁹ は水素、 0M⁵ (式中、 M⁵ は水素または金属を表す）または OS〇₃ M⁶ (式中、 M⁶ は水素または金属を表す）を表し、 R^ieは水素、金属または S0₃ M⁷ (式中、 M⁷ は水素または金属を表す）を表し、 nは 4〜8000の整数を表す〕で表される化合物などがあげられる。

蛋白可溶化剤としては、一般式（III )

R¹¹(C₂H₄0)_a-(C₃H₆0)_bR¹² (III)

〔式中、 aおよび bは 0〜200の整数を表し、 R¹'は R²°— X-0— （式中、 R^2Dはアルキルまたはアルケニルを表し、 Xは単結合または COを表す）または H- (CH₂ CH₂ 0) c -N (R²¹) - (式中、 cは 1〜200の整数を表し, R²¹はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、 R¹²は C₂ H₄ COOR²²、 C₃H₆COOR²³、 C₂H₄CH (COOR²⁴) ₂ または C₂H₄CH(C00R²⁵)(C00R²⁶)

(式中、 R²²、 R²³、 R²⁴、 R²⁵および R²⁶は同一または異なって水素、金属、アルキルまたはアルケニルを表す）を表す。ただし、 aおよび bは同時には 0を表さず、両成分はランダムに存在することができる〕で表される化合物、一般式

(IV)

(式中、 R¹³、 R¹⁴、 R^l5、 R¹⁶、 R¹⁷および R¹⁸は同一または異なってアル力ノィルを表す）で表される化合物または一般式（V)

R¹⁹ - Y - S0₃M¹ (V)

〔式中、 R "はアルキル、アルケニルまたは置換もしくは非置換のァリールを表し、 Yは単結合、

一 0—、 -CH (R²⁷) — （式中、 R²⁷はアルキルまたはアルケニルを表す）、 -CH₂ CH (OH) (CH₂ ) _d - (式中、 dは 1〜22の整数を表す）、一 CH=CH(CH₂), 一 (式中、 eは 1〜22の整数を表す）、一 0C0CH(CH₂C00R²⁸)— (式中、 R²⁸はアルキルまたはアルケニルを表す）またはこれらの混合物を表し- M¹ は水素または金属を表す〕で表される化合物が好ましく用いられる。

以下、一般式（ I ) 〜一般式（V) で表される化合物をそれぞれ化合物（ I ) 〜化合物（V) という。

—般式（ I) 一 ~—般式（V) の各基の定義において、アルキルおよびアルカノィルのアルキル部分としては、直鎖または分技状の炭素数 1〜2 2の、例えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec-ブチル、 tert- ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、へキシル、へブチル、デシル、ペン夕デシル、ィコサニル、ドコサニルなどがあげられ、アルケニルとしては、直鎮または分技状の炭素数 2〜2 2の、例えば、ビニル、プロべニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、へブテニル、デセニル、ペン夕デセニル、ィコセニル、ドコセニルなどがあげられる。ァリールは、フエニルまたはナフチルを表し、金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。

置換アルキルおよび置換アルカノィルの置換基としては、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホなどがあげられる。置換ァリールの置換基としては、例えば、アルキルなどがあげられ、アルキルは、前記アルキルと同意義を表す。

糖化合物としては、化合物（ I ) または化合物（Π ) の中でもシクロデキストリン誘導体が、特にメチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられる。例えば、 α;—シクロデキストリン、 /5—シクロデキストリン、 7—シクロデキストリン、ジメチルー S—シクロデキストリン、トリメチル一 S—シクロデキストリン、ヒドロキシェチル一 /S—シクロデキストリン、 2—ヒドロキシプロピル一 —シクロデキストリン、 2—ヒドロキンプロピル一^一シクロデキストリン、力ルボキシメチルー /S—シクロデキストリン、グリコシルー —シクロデキストリン、マルトシルーなーシクロデキストリン、マルトシルー^ーシクロデキストリン、パーシャリーメチルー /5—シクロデキストリン、ーシクロデキストリンスルフェート、 —シクロデキストリンスルフエ一トなどがあげられる。

蛋白可溶化剤としては、化合物（Ι Π ) 、化合物（IV) または化合物（V ) などの界面活性剤の中でも、特にノニオン系界面活性剤、ァニオン系界面活性剤などが好ましく用いられる。ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキンエチレンセチルエーテル、ポリオキシェチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレンベへニルエーテル、ポリオキンエチレンモノラウレート、ポリオキシェチレンモノステアレート、ポリオキシエチレンモノォレエート、ボリォキシェチレンラウリルァミン、ポリオキンエチレンステアリルァミン、しょ糖脂肪酸エステルなどがあげられ、ァニオン系界面活性剤としては、例えば、ドデシルペンゼンスルホン酸ナトリウム、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラゥリル硫酸ナトリウム、高級アルコール硫酸エステルソーダなどがあげられる。

2価の金属塩としては、 0 . 0 1〜2 O mMのマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、コバルト塩などがあげられ、好ましくは、 0 . 0 1〜 2 O m Mのマグネシウム塩が用いられる。

本発明は、糖化合物およびノまたは蛋白可溶化剤をコレステロール測定試薬系と共存させる点に特徵を有するものであり、コレステロール測定系自体は下記の反応原理に基づく一般法に従うものである。ただし、色素源および測定波長はこれに限定されるものではない。

コレステロ一ルエステル

加水分解酵素

エステル型コレステロール + H O 遊離型コレステロール + 脂肪酸コレステロール

酸化酵素

遊離型コレステロール + 0, コレステノン + Ho 2O^2

パーォキシダ―ゼ

2H₂0₂ + 4一ァミノアンチピリン + EMSE + H₃ ⁺0 キノン色素 + 5H₂0

(λ max = 555 nm)

EMSE： N—ェチル一 N— (3—メチルフエニル）一 N'—サクシニルェチレンジァミン

コレステロールエステル

エステル型コレステロール + H₂0 ^ 遊離型コレステロール + 脂肪酸コレステロール

脱水窣酵素

遊離型コレステロール + NAD(P)+ ~ ^→ コレステノン + NAD(P)H + H+

(λ = 340nm)

例えば、色素源としては、一般に使用される 4一ァミノアンチピリンとフエノ —ル、 4一クロ口フエノール、 m—クレブール、 3—ヒドロキシー 2, 4 , 6— トリョード安息香酸（HT I B) などのフヱノール類との組合せの他、 4ーァミノアンチピリンとトリンダー試薬として知られている（同仁化学研究所第 1 9版総合カタログ、 1 9 9 4年） N—スルホプロピルァニリン、 N—ェチルー N—

(2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）一 m— トルイジン（TO OS) 、 N— ェチルー N— （ 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）一 3, 5—ジメチルァニリン（MA〇 S) 、 N—ェチルー N— （2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） — 3, 5—ジメトキシァニリン（DAOS) 、 N—ェチルー N—スルホプロピル一 m— トルイジン（TOPS) 、 N— ( 2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァニリン（HDAOS) 、 N, N—ジメチルー in— トルイジン、 N, N—ジスルホプロピル一 3, 5—ジメトキシァニリン、 N—ェチル一 N—スルホプロピル一 m—ァニシジン、 N—ェチルー N—スルホプロピルァニリン、 N—ェチルー N—スルホプロピル一 3, 5—ジメトキシァニリン、 N—スルホプロピル一 3, 5—ジメトキシァニリン、 N—ェチル一N—スルホプロピル一 3, 5—ジメチルァニリン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒドロキン一 3—スルホプ口ピル） —m—ァニシジン、 N—ェチルー N— （ 2—ヒドロキシ一 3—スルホプ口ピル）ァニリン、 N—ェチルー N— （ 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）一 3, 5—ジメトキシァニリンなどのァニリン類あるいは N—ェチルー N— （3 一メチルフエニル）一 N' —サクシニルエチレンジァミン（EMSE) 、 N—ェチルー N— （ 3—メチルフエニル）一 N' —ァセチルエチレンジァミンなどとの組合せが使用できる。また、高感度の色素源として、特公昭 6 0— 3 34 7 9で示される 1 0— （N-メチルカルバモイル）一 3, 7—ビス（ジメチルァミノ）フエノチアジン（MCDP) 、特公平 4 - 2783 9で示されるビス [ 3—ビス (4一クロ口フエニル）メチルー 4ージメチルァミノフエニル] ァミン（BCMA)、特開昭 62 - 2 9 6で示される色素源なども使用可能であり、これらに 4一アミノアンチピリンあるいは上記で示したトリンダ一試薬を組み合わせて用いることもできる。色素源の濃度としては、 0. 0 1〜 I OmgZm 1が好ましく、溶解度の関係で制限される。コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素あるいはコレステロール脱水素酵素としては、通常市販されている、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼゃリポプロティンリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールォキシダーゼ、微生物または動物由来のコレステロ一ルデヒドロゲナーゼなどがあげられる力これら酵素の特異性、安定性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ搪残基、スルホプロピル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作によってこれらの遣伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体なども好適に用いられる。

酵素を修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、例えば、ポリエチレングリコールにァミノ基と結合可能な基を結合させた化合物 {ポリエチレングリコールに N—ヒドロキシサクシンィミド基などのァミノ基と結合可能な基を結合させたサンブライト V F M 4 1 0 1 [日本油脂（株）製] など } 、ボリアルキレングリコール構造および酸無水物構造を有するサンブライト A K Mシリーズ、同 A D Mシリーズ、同 A C Mシリーズ [いずれも日本油脂（株）製：化学工学論文集、第 2 0巻、第 3号、 4 5 9頁、 1 9 9 4年] 、ポリエチレングリコールとボリプロピレングリコールの共重合体にァミノ基と結合可能な基を結合させた化合物、ボリェチレングリコールモノメタクリルモノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体などがあげられる。また、ボリウレタンの化学修飾剤であるポリゥレタン P 4 0 0 0 ac t i vated (ベーリンガーマンハイム社製 Enzyme modi f icat i on set能書）、デキストランの化学修飾剤であるデキストラン T 4 0 , T C T一 act i vated (同）、 1 , 3—プロパンサルトンなども使用できる。

次に、酵素に上記化学修飾剤を反応させる方法を例示するが、これによつて制約されない。まず、酵素を p H 8以上のリン酸緩衝液などの緩衝液中に溶解し、 0〜5 0 で例ぇば0 . 0 1〜5 0 0倍モル量のサンブライトを添加し、 5分間〜2 4時間撹拌する。この反応液をそのままあるいは必要に応じて限外濾過膜により低分子物を除去して用いる。コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロール脱水素酵素は、 0. 〜 l O O uZm l で使用するのが好ましい。

本発明方法は、血液、尿などの LDLあるいは VLDLを含有する体液に適用できる。

次に、本発明の定量法について例をあげて説明する。

方法 1

本発明を実施するに際しては、まず、糖化合物溶液および Zまたは蛋白可溶化剤溶液を調製する。糖化合物溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば 5 OmM

Tr i s -HC 1緩衝液（pH7. 4) に溶解し、反応時に例えば 1 0 OmM 以下、好ましくは 3〜8 OmMの漢度になるように調製する。なお、搪化合物はあらかじめコレステロール測定試薬中に共存させておいてもよい。蛋白可溶化剤溶液は、蛋白可溶化剤を適当な緩衝液、例えば 5 OmM Tr i s— HC I緩衝液（pH7. 4) に溶解し、コレステロール測定試薬と共存させ、反応時に例えば 5 O gZl以下、好ましくは 0. 1〜20 gZlの濃度になるように調製する。試薬は、糖化合物溶液および/またはコレステロール測定試薬が共存した蛋白可溶化剤溶液から調製し（蛋白可溶化剤溶液を使用しない場合は、糖化合物をあらかじめコレステロール測定試薬中に共存させておく）、 20〜50°C、好ましくは 30〜4 (TCで約 5分保温する。次いで、上記試薬に試料そのものもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を加え、 5〜30分間反応させる。反応終了後、反応液の吸光度を 340〜900 nm、例えば単波長の場合は 555 nmで、 2波長の場合は主波長 600 nm、副波長 700 nmで測定し、コレステロール量を算出する（2波長の場合は両波長での吸光度の差から算出する）。

血清から超遠心により分画された HDL、 LDL、 VLDLおよび CMの各フラクションを使用して上記試薬によりコレステロール量を測定した。その結果、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより HDLコレステロール、 LDL コレステロール、 VLDLコレステロール、 CMコレステロールの反応性が異なり、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより各リポ蛋白との反応性が異なることが確認された。

コレステロール測定試薬（未修飾）に糖化合物 5mMおよび蛋白可溶化剤ボリォキシエチレンモノラウレート 5 g/1を組み合わせて共存させたときの各リボ蛋白の反応性の差を第 1表に示す。第 1 表

一， +, ++, +++はそれぞれ反応の強さを不し，一 < + < ++ < +++であるコレステロール測定試薬（未修飾）に糖化合物トリメチルー —シクロデキストリン 5 mMおよび蛋白可溶化剤 5 g/ 1を組み合わせて共存させたときの各リボ蛋白の反応性の差を第 2表に示す。

第 2 表

方法 2

糖化合物溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば 5 OmM Tr i s -HC1 緩衝液（pH7. 4) に溶解し、反応時に例えば 1 0 OmM以下、好ましくは 3 〜8 OmMの濃度になるように調製する。蛋白可溶化剤溶液は、蛋白可溶化剤を適当な緩衝液、例えば 5 OmM Tr i s— HC 1緩衝液（pH 7. 4 ) に溶解し、反応時に例えば 5 0 z/ 1以下、好ましくは 0. 1〜20 g Iの濃度になるように調製する。あらかじめ 20〜5 0で、好ましくは 3 0〜4 0。C、例えば 37 ^eCで加温した糖化合物溶液および/または蛋白可溶化剤溶液に試料そのものもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を添加して例えば 3 7°Cで 5分間加温し、 5分後、得られた溶液の 5 5 5 nmにおける吸光度を測定する（E 1 ) 。次いで、あらかじめ 20〜5 0°C、好ましくは 3 0〜4 0て、例えば 37てで加温したコレステロール測定試薬を添加して撹拌し、 5分後に同波長における吸光度を測定する [E 2 (濃度補正後の値） ]。コレステロール量は、既知濃度のコレステロールを含有する標準液を用いて同様の操作を行い、 (E 2— E 1 ) の値を比較することにより算出する。

次に、実施例によって本発明の態様を説明する。

発明を実施するための最良の形態

実施例 1

直接 LDLコレステロ一ルを定量する本法とァガロース電気泳動法（臨床検査、第 2 9巻、 1 3 4 4頁、 1 9 8 5年）とを比較した。

本法の試薬組成

第一試薬

トリメチルー yS—シクロデキストリン 5 m

ポリオキシエチレンモノラウレート 5 z/ 1

EMS E 1. 1 mM

トリス緩衝液（pH 7. 0) 3 0 mM

第二

コレステロールエステラーゼ（未修飾） 1. 0 UZm 1 コレステロールォキシダーゼ（未修飾） 5. 0 U/m 1 パーォキシダーゼ 2 5 U/m 1

4一ァミノアンチピリン 2. 2 mM

トリス緩衝液（pH 7. 0) 3 0 mM 本法では、まず、血清サンプル 50 1をあらかじめ 3 7てで加温した第一試薬 2. 2 5m 1 に添加して 3 7 ^eCで 5分間加温し、 5分後、得られた溶液の 555 nmにおける吸光度を測定した（E 1 ) 。次いで、あらかじめ 3 7°Cで加温した第二試薬 0. 7 5m 1を添加して撹拌し、 5分後に同波長における吸光度を測定した [E 2 (漢度補正後の値） ] 。 LDLコレステロールの量は、コレステロ一ル濃度 2 0 Omg/d 1の標準液を用いて同様の操作を行い、（E 2 _E 1 ) の値を比較することにより算出した。

ァガロース電気泳動法では、鼋気泳動後の支持体上のリポ蛋白分画に対してコレステロールの酵素染色を行い、デンシトメトリ一（クリニスキャン 2 ；株式会社へレナ研究所）により LDLコレステロールを定量した。その結果を第 3表に示す _c 第 3 表

第 3表に示すように、本発明の方法による結果は、電気泳動法による結果と良好な相関を示した。

実施例 2

第一試薬で使用する糖化合物および蛋白可溶化剤を組み換える以外は、実施例 1の本法と同様の操作を行い、血清サンプル 2 0検体につき、ァガロース電気泳動法との相関を相関係数でみた。

第一試薬の組成

A. トリメチルー； 5—シクロデキストリン 5 mM

ポリオキシエチレンモノラウレート 5 z/ 1 EMS E 1. 1 mM 卜リス緩衝液（pH 7. 0) 30 mM

B. トリメチルー —シクロデキストリン 5 mM

ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 5 g/ 1 EMS E 1. 1 mM トリス緩衝液（pH7. 0) 30 mM C. ジメチルー /5—シクロデキストリン 5 mM

ボリォキシエチレンモノラウレート 5 g/ \

EMSE 1. 1 mM トリス緩衝液（pH7. 0) 30 mM

D. ジメチルーーシクロデキストリン 5 mM

ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 5 g/ \

EMSE 1. 1 mM トリス緩衝液（PH 7. 0) 3 0 mM 本法では、それぞれ、日立 0 7 0自動分析装置を用いて測定した。測定条件を下記に示す。

サンプル量： 4 11 1

第一試薬： 3 0 0 】

第二試薬： 1 0 0 1

測定波長主波長： 6 0 0 nm、副波長： 70 0 n m

結果を第 4表に示す _c

第 4

第 4表に示すように、本発明の方法による結果は、電気泳動法による結果と良好な相関を示した。

実施例 3

実施例 2の B. および D. においてさらに金属塩を添加する以外は、実施例 2 と同様の操作を行い、血清サンプル 20検体につき、ァガロース電気泳動法との相閱を相関係数でみた。第一試薬の組成

E. トリメチルー 5—シクロデキストリン 5 m

ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリゥム 5 g/\ 塩化 M g · 6水和物 6 mg/m 1 EMSE 1. 1 mM トリス緩衝液（pH 7. 0) 30 mM

F. ジメチル一 ^—シクロデキストリン 5 mM

ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 5 g/1 塩化 Mg · 6水和物 6 m g/m 1 EMSE 1. 1 mM トリス緩衝液（pH 7. 0) 3 0 mM 結果を第 5表に示す。

第 5 表

第 5表に示すように、本発明の方法による結果は、電気泳動法による結果と良好な相関を示した。

実施例 4

直接 VLDLコレステロールを定量する本法とァガロース電気泳動法（臨床検査、第 2 9巻、 1 3 4 4頁、 1 9 8 5年）とを、実施例 1 と同様の操作を行うことにより比較した。

本法の試薬組成

第一試薬

2—ヒドロキシプロピル一 S—シクロデキストリン 5 mM

ポリオキシエチレンラウリルエーテル 5 z/ 1

EMSE 1. 1 mM トリス緩衝液（pH 7. 0) 30 mM 第一試薬

修飾コレステロールエステラーゼ 1. 0 UZml 修飾コレステロ一ルォキシダ一ゼ 5. 0 UZml パーォキシダーゼ 25 U/m 1

4ーァミノアンチピリン 2. 2 mM トリス緩衝液（PH7. 0) 30 mM なお、修飾コレステロールエステラーゼおよび修飾コレステロールォキシダーゼは、 20 mMリン酸緩衝液（ρ H 8 ) にコレステロールエステラーゼまたはコレステロールォキシダ一ゼを溶解させて（1 Omg/ml ) 5てに冷却後、これに 20倍モルのサンブライト 400 1 (日本油脂）を添加して溶解させ、 5^eCで 4時間反応させてポリエチレングリコ一ルで修飾することにより調製し、この反応液のまま使用した（ボリエチレングリコール部分の分子量 6000 ) 。

結果を第 6表に示す。第 6 表

第 6表に示すように、本発明の方法による結果は、電気泳動法による結果と良好な相関を示した。

産業上の利用可能性

本発明によれば、煩雑な分画分離操作の不要な簡便でかつ自動分折装置に適用可能な LDLコレステロールまたは VLDLコレステロールの定量法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. 糖化合物およびノまたは蛋白可溶化剤存在下、試料中の低密度リボ蛋白 (LDL) または超低密度リボ蛋白（VLDL) 中のコレステロール量を測定することを特徵とする LDLまたは VLDL中のコレステロールの定量法。

2. 糖化合物およびノまたは蛋白可溶化剤存在下、試料中の LDL中のコレステロール量を測定することを特徴とする LDL中のコレステロールの定量法。

3. 糖化合物およびまたは蛋白可溶化剤存在下、試料中の VLDL中のコレステロール量を測定することを特徴とする VLDL中のコレステロールの定量法 _c

4. 糖化合物がグルコース誘導体である請求の範囲 1〜 3記載の定量法 ₃

5. 糖化合物が一般式（ I )

〔式中、 R¹ 、 R² および R³ は同一または異なって水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルカノィル、 S〇₃ M² (式中、 M² は水素ま rこは金属を表す）、一（ダルコシル） _p — H (式中、 pは 1または 2を表す）または一（マルトシル）。 — H (式中、 qは 1または 2を表す）を表し、 R⁴ および R⁵ は同一または異なって水素、金属または S〇₃ ³ (式中、 M³ は水素または金属を表す）を表し、 mは 6〜8の整数を表す〕で表される化合物 [以下、化合物（ I) という。他の式番号の化合物についても同様である] または一般式

〔式中、 R⁶ 、 R⁷ および R⁸ は同一または異なって水素または S0₃ M⁴ (式中、 M⁴ は水素または金属を表す）を表し、 R⁹ は水素、 OM⁵ (式中、 M⁵ は水素または金属を表す）または OS0₃ M⁶ (式中、 M⁶ は水素または金属を表す）を表し、 R^1Dは水素、金属または S0₃ M⁷ (式中、 M⁷ は水素または金属を表す）を表し、 nは 4〜8000の整数を表す〕で表される化合物である請求の範囲 4記載の定量法。

6. 糖化合物がシクロデキストリン誘導体である請求の範囲 5記載の定量法。

7. 蛋白可溶化剤が一般式（【1【）

R"(C₂H₄0)_a-(C₃H₆0)_bR¹² (III)

〔式中、 aおよび bは 0〜200の整数を表し、 R'¹は R^2e-X—〇一（式中、 R^2eはアルキルまたはアルケニルを表し、 Xは単結合または COを表す）または H- (CH₂ CH₂ 0) c -N (R²¹) - (式中、 cは 1〜200の整数を表し、 R²¹はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、 R¹²は C₂ H₄ COOR²²、 C₃HsC〇OR²³、 C₂H₄CH (COOR²" ₂ または C₂H₄CH(C00R^2S)(C00R^2e)

(式中、 R²²、 R²³、 R²\ R²⁵および R²⁶は同一または異なって水素、金属、アルキルまたはアルケニルを表す）を表す。ただし、 aおよび bは同時には 0を表さず、両成分はランダムに存在することができる〕で表される化合物、一般式

(IV)

(式中、 R¹³、 R^l4、 R¹⁵、 R¹⁶、 R¹⁷および R'⁸は同一または異なってアル力ノィルを表す）で表される化合物または一般式（V)

R¹⁹-Y-S0₃M (V)

〔式中、 R ¹⁹はアルキル、アルケニルまたは置換もしくは非 g換のァリールを表し、 Yは単結合、

一 0—、 -CH (R²⁷) — （式中、 R²⁷はアルキルまたはアルケニルを表す）、 - CH₂ CH (OH) (CH₂ ) « — （式中、 dは 1〜22の整数を表す）、 -CH=CHCCH₂), ― (式中、 eは 1〜22の整数を表す）、一 0C0CH(CH₂C00R²⁸) - (式中、 R²⁸はアルキルまたはアルケニルを表す）またはこれらの混合物を表し、 M¹ は水素または金属を表す〕で表される化合物である請求の範囲 1〜 6記載の定量法。

8. 蛋白可溶化剤がノニオン系界面活性剤またはァニオン系界面活性剤である請求の範囲 7記載の定量法。

9. コレステロール量を測定する際に 2価の金属塩を存在させることを特徴とする請求の範囲 1〜 8記載の定量法。

10. 試料中にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素またはコレステロ一ル脱水素酵素を作用させ生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量することからなるコレステロ一ル量を測定する方法において、使用するコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素またはコレステロ一ル脱水素酵素が化学修飾されたもしくは未修飾のコレステロールエステラーゼ、化学修飾されたもしくは未修飾のコレステロールォキシダーゼまたは化学修飾されたもしくは未修飾のコレステロールデヒドロゲナーゼである請求の範囲 1〜 9記載の定 i法。 .

11. 糖化合物およびまたは蛋白可溶化剤を成分とする LDLまたは VLDL 中のコレステロールの定量試薬。

12. 糖化合物および Zまたは蛋白可溶化剤を成分とする LDL中のコレステロ —ルの定量試薬。

13. 糖化合物および/または蛋白可溶化剤を成分とする V LDL中のコレステロールの定量試薬。

14. 糖化合物と蛋白可溶化剤を組み合わせてなる LDLまたは VLDL中のコレステロールの定量試薬。

15. 糖化合物と蛋白可溶化剤を組み合わせてなる LDL中のコレステロールの疋量試。

16. 搪化合物と蛋白可溶化剤を組み合わせてなる VLDL中のコレステロールの定量試薬。

17. 糖化合物がグルコース誘導体である請求の範囲 11〜16記載の定量試薬。

18. 糖化合物が化合物（ I) または化合物（II) である請求の範囲 17記載の定里 e ^ 。

19. 糖化合物がシクロデキストリン誘導体である請求の範囲 18記載の定量試薬 c

20. 蛋白可溶化剤が化合物（III )、化合物（IV) または化合物（V) である請求の範囲 11〜19記載の定量試薬。

21. 蛋白可溶化剤がノニオン系界面活性剤またはァニオン系界面活性剤である請求の範囲 20記載の定量試薬。