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WO1991019565A1 - ADSORPTIONSMATERIAL ZUR SELEKTIVEN ENTFERNUNG VON LDL ODER/UND vLDL - Google Patents

ADSORPTIONSMATERIAL ZUR SELEKTIVEN ENTFERNUNG VON LDL ODER/UND vLDL Download PDF

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WO1991019565A1
WO1991019565A1 PCT/EP1991/001086 EP9101086W WO9119565A1 WO 1991019565 A1 WO1991019565 A1 WO 1991019565A1 EP 9101086 W EP9101086 W EP 9101086W WO 9119565 A1 WO9119565 A1 WO 9119565A1
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ligands
material according
ldl
adsorption
cholesterol
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Application number
PCT/EP1991/001086
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Rauh
Waltraud Sichler
Gudrun Henke
Wolfgang Feller
Gerold Morsch
Susan Koch
Original Assignee
B. Braun Melsungen Ag
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Publication date
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Priority to US07/955,881 priority patent/US5401415A/en
Priority to AT91910607T priority patent/ATE100354T1/de
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Definitions

  • Adsorption material for the selective removal of LDL and / or vLDL Adsorption material for the selective removal of LDL and / or vLDL
  • the invention relates to an adsorption material and a method for removing LDL or / and vLDL cholesterol or / and Lp (a) lipoprotein from aqueous liquids such as plasma or serum, a method for determining the concentration of LDL or / and vLDL cholesterol or / and Lp (a) - lipoprotein in liquids and a device for the above-mentioned processes.
  • LDL or / and Lp lipoprotein and / or fibrinogen from human blood is desirable from a medical point of view, in particular for the treatment of severe familial hypercholesterolemia and atherosclerosis (Trans.Am.Soc.Artig.Intern. Organs. (1986) 17, 104-107).
  • Familial hypercholesterolaemia is the most dangerous type of hyperlipidia. In its homozygous form, the group of people affected by it is at risk of illness and death from severe and rapidly progressing coronary disease (plasma sep. And plasma fracture) in adolescence (and even in childhood) 272-280 (Karger Basel, 1983)).
  • the third possibility of eliminating LDL cholesterol from blood or plasma is to adsorb it onto suitable carrier materials.
  • monoclonal and / or polyclonal antibodies which specifically bind the LDL cholesterol are coupled to a porous polyanionic carrier material (J.Clin.Apheresis 4, 59-65 (1988), Proc. Natl.Acad.Sci. USA 78, 611-615 (1981), JP 60239425).
  • porous polyanions such as heparin (DE 36 17 672, US 4,637,944, US 4,103,685) and synthetic oligo- or polyanions such as e.g.
  • sulfated polysaccharides (EP 0 110 409, EP 0 225 867, EP 143 369, US 4,096,136, US 4,603,010) are bound to carrier materials and examined for specific LDL adsorption from plasma or blood.
  • Cellulose, organic polymers, coated silica gels and agarose are described as the carrier matrix for binding the substances described.
  • the invention was therefore based on the object of providing materials which make it possible to remove the artherogenic lipoprotein fractions from aqueous liquids, in particular from whole blood, plasma and serum, and at the same time to meet the requirements for simple and safe use in an extracorporeal perfusion system for Meet people.
  • These requirements include, for example, sterilizability with steam, heat or y-rays, minimal release of particles in the micrometer range, no release of toxic ingredients and a sufficiently high flow rate through the materials in the range up to 200 ml / min, high specific selectivity and maximum capacity compared to the molecules to be eliminated.
  • this perfusion system or the material should be able to undergo a rapid kinetic binding reaction with the molecules to be bound.
  • the glass bodies used as carriers in the adsorption material according to the invention include glass beads, that is to say glass spheres of a certain size, consist of a silicon dioxide phase with residual contents of boric acid and alkali oxide, and glass membranes in the form of hollow fibers. Glass beads are described for example in DE-A 24 54 111 and DE 24 62 567.
  • the adsorption material according to the invention differs from the commercially available variants (Controlled Pore Glass, Nature 206 (1969) 693-696, provider, for example. Dow Corning, Electro Nucleonics, Waiko Industries) in that all freely accessible silanol groups are organic functional residues were substituted. The targeted elimination of silanol groups prevents the non-specific binding of proteins.
  • Adsorber materials based on pure CPG Controlled Pore Glass
  • silanol groups show undesirable HDL binding properties (see Example 1).
  • the adsorption materials substituted according to the invention which are substituted on all silanol groups, of which at least at one point by an ether group and then either a terminal ⁇ , ⁇ -diol group, are able with a previously unattained kinetic response, selectivity and binding capacity to bind LDL cholesterol and vLDL cholesterol and Lp (a) lipoprotein.
  • the ligands correspond to the general formula I.
  • the 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl residues are particularly preferred ligands.
  • the adsorption material according to the invention can, according to the invention, be substituted on all silanol groups with the ligands mentioned. However, it is also possible for it to have further ligands in addition to the ligands mentioned. In a preferred embodiment of the invention, the adsorption material has compounds of the general formula II as further ligands
  • x and y are integers from 1 to 5.
  • l-hydroxyethyl-3-oxybutyl and 1-hydroxypropyl-3-oxypropyl radicals are particularly preferred as ligands of the formula II.
  • R * ⁇ is a methoxy radical and R 2 and R 3 are H or a methoxy radical and x and y are integers from 1 to 5.
  • the l, l-dimethoxyethyl-3-oxypropyl radical is particularly preferred here.
  • ligands of both the general formula I and the formulas II and III are present in the adsorption material according to the invention, it is preferred that these are bound to the support material via the silanol groups in a quantitative ratio of approximately 1.3: 1: 0.8 are.
  • the adsorption materials according to the invention preferably have a surface area between 30 and 300 m 2 / g. Among other things, they are characterized by their ability to be steam sterilized.
  • the degree of coverage of the carrier material with ligands is preferably 2 to 4 ⁇ mol / m 2 , likewise depending on the porosity of the material used.
  • the pore diameter of the vitreous bodies in the adsorption material according to the invention is larger than the LDL and vLDL cholesterol molecules to be adsorbed, that is to say larger than 30 nm.
  • the glass beads used have a grain diameter of 60 to 250 ⁇ m and a pore diameter of 50 to 150 nm.
  • Another object of the invention is a method for producing an adsorption material according to the invention, in which the desired ligand is coupled to the SiOH groups of the vitreous by means of a silage reaction via a disiloxane bond (Si-O-Si-L, where L is the ligand) become.
  • This ensiling reaction is described by Shung et al. (J. of Chrom. 120 (1976) 321-333).
  • Starting materials which can be used according to the invention are, inter alia, from the manufacturers Schott, Mainz FRG under the name biorang load carrier materials or controlled pore glass (CPG) carriers; Dow Corning, Electro Nucleonics and Waiko Industries.
  • Jf-glycidoxypropyltrimethoxysilane and a silanol biorane carrier in the form of glass beads are used for the ensiling reaction to obtain glycidoxypropyl-bioran disiloxane and this product is subjected to an acid treatment, the epoxy residue opening up and becoming the ligand which is particularly preferred according to the invention 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl radical, bound as a disiloxane function, leads.
  • the intact silanol groups are reacted with y-glycidoxypropyltrimethoxysilane in accordance with the silage reaction instructions mentioned above.
  • the adsorptive materials synthesized and used according to the invention have excellent properties of selectively and quantitatively binding LDL and vLDL cholesterol, but also Lp (a) lipoprotein, without simultaneously eliminating HDL cholesterol.
  • Yet another object of the invention is a process for removing LDL or / and vLDL cholesterol from aqueous liquids, in particular blood, plasma or serum, in which the liquid is passed over an adsorption material according to the invention.
  • Another application of the adsorption material according to the invention and thus another object of the invention is a method for determining the concentration of LDL or / and vLDL cholesterol in aqueous liquids, in particular blood, plasma or serum, which is characterized in that with With the help of an adsorption material according to the invention, LDL and vLDL cholesterol are chromatographically separated from the liquid and, after elution, the concentration of the adsorption material is determined by methods known per se. It is preferred here to carry out the elution with high molecular weight saline solution, a glycerol / water mixture or a urea solution (Example 10).
  • the materials according to the invention are distinguished by the fact that they bind LDL and vLDL with a hitherto unmatched kinetic reaction, selectivity and binding capacity (> 20 mg LDL per ml adsorbent), that they not only these components from plasma or Serum, but also directly eliminated from stabilized whole blood with high efficiency and that they are not physiological Activate protective mechanisms (eg coagulation system, complement system) by unspecific adsorption of corresponding components (examples 10 and 11).
  • protective mechanisms eg coagulation system, complement system
  • Another object of the invention is a device for the extracorporeal removal of LDL and / or vLDL cholesterol from aqueous liquids, in particular blood, plasma or serum, this device consisting of a cylindrical housing which is filled with an adsorption material according to the invention and is provided at its front ends with lids, each having a central inlet and outlet connection.
  • This cylindrical housing preferably has a diameter of 3 to 20 cm, preferably 5 to 10 cm and a length of 1 to 40 cm, preferably 10 to 20 cm.
  • the preferred material for the housing is glass or plastic (Examples 10 and 11).
  • the housing on the inlet-side cover has a sieve with a pore size of 10 to 300 ⁇ m, preferably 20 to 100 ⁇ m. This prevents the device from being clogged by larger particles contained in the aqueous liquid.
  • the device according to the invention can be sterilized in a package by means of tf radiation or heat and is therefore particularly suitable for use in an extracorporeal perfusion system. However, it can also be used practically as a chromatography column, in particular for determining the LDL and / or vLDL cholesterol concentration according to the invention.
  • the housing of the device is integrated in a closed circuit in which the aqueous liquid is circulated by means of a pump.
  • the device is particularly preferably equipped with two cylindrical housings (two adsorption capsules) which are alternately controlled by valves and flushed with the aqueous liquid to be treated in a closed circuit by means of a pump.
  • the capsule which has not been flushed through and saturated with the LDL or vLDL, is eluted with a regeneration solution, preferably high-molecular saline solutions, glycerol / water mixtures, but also urea solutions.
  • the device according to the invention can also be integrated in the dialysis fluid circuit of a dialysis machine for the regeneration of the dialysis fluid in combination with other adsorbers.
  • CPG 500 glass (Serva, Heidelberg) with a pore diameter of 50 nm (contains free unreacted silanol groups as the surface).
  • the adsorbent is washed with bidistilled water over a G3 suction filter, in a disposable chromatography column (5 x 70 m) filled and then equilibrated with 100 ml 50 mM Tris-Cl pH 7.6 (resin volume 1.6 ml / column height 8 cm).
  • Eluates 2, 3, 4, 5 and 6 ml are used as evaluation parameters for kinetic adsorption capacity curves.
  • the intermediate eluates combined in the mixture are evaluated as a "screening criterion selectivity" for the selectivity of individual adsorber materials synthesized.
  • the total cholesterol, HDL, LDL and protein content of the eluates are determined (Chod Pap, Chod iodide and Biutret test).
  • Adsorption capacity in% is calculated from:
  • Adsorption capacity Aus ⁇ anqsplasma - according to intermediate eluate x 100
  • Table 2 shows the total cholesterol binding properties of all starting materials used.
  • Glass beads analogous to Example 2 were used as the starting product for the immobilization reaction (from Schott, pore size, grain size see Example 2), these are reacted with sulfuric acid. The epoxy group is opened, a 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl function is formed in each case.
  • Table 3 shows the total cholesterol binding properties of some synthesized adsorption materials.
  • Table 3 Total cholesterol determination of Bioran "glass beads” synthesis products
  • Tables 4 and 5 show the relevant clinical parameters of the above-described bioran disiloxane species (ratio 1.3: 1: 0.8) 100/130 (see Examples 1-3).
  • Example 4 The adsorption materials described in Example 4 show great selectivity and adsorption capacity with regard to LDL cholesterol. Neither HDL cholesterol nor total protein is bound by the adsorbent. After 6 ml of plasma flow, none of the kinetic experiments showed a saturation of the material.
  • the experimental procedure differs only in the choice of whole blood (stabilized with 3 IU / ml heparin sodium B. Braun Melsungen AG) in contrast to Example 1 (plasma stabilized with heparin).
  • Table 6 shows the results of the whole blood experiment.
  • the adsorption materials described according to the invention are able to eliminate well over 50% of the total cholesterol from whole blood. No hemolysis reaction occurred when the blood passed through the column.
  • Table 7 shows the relevant clinical parameters of a column experiment with human plasma with the synthesized adsorption medium 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl-bioran disiloxane.
  • the adsorption medium shows excellent selectivity and adsorption capacity properties compared to the relevant lipid parameters.
  • Adsorption material synthesized in analogy to Example 3 Bioran "glass beads” pore size 120 nm, grain size 130 ⁇ m analogous to Example 2) with org. functional spacer arms, consist of 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl-, l-hydroxyethyl-3- Oxypropyl and 1,1-dimethoxyethyl-2-oxypropyl residues in a ratio of 1: 1, 3: 0.8 are tested in a plasma experiment.
  • bio-carrier materials obtained directly from the manufacturer Schott, Mainz as base material (Example 2), but also synthesized in Example 3:
  • Bioran disiloxane C mixture l-hydroxyethyl-3-oxybutyl / l, 2-dihydroxypropyl
  • Example 9 The spectra determined for the compounds A / B / C are shown in Fig. 1. All three connections differ in their signals. Only the signal peak at 21.8 is the same for all samples. It represents the -CCC-0 framework. This is the basis for all residues (A / B / C). Only the adsorber material (sample C) synthesized according to example 3 fulfills the quality criteria set with regard to its LDL binding capacity. The solid-state NMR spectrum documented under C can be used as a quality criterion for the adsorber material.
  • Example 9 The solid-state NMR spectrum documented under C can be used as a quality criterion for the adsorber material.
  • Hydrophilic organic glasses with different OH / epoxy ratios (1: 4, 1: 1, 3: 1) are used as the starting product for the synthesis (for exact product names, see heading).
  • the reaction with sulfuric acid converts the epoxy function into a 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl function (reaction conditions, see Example 3).
  • the adsorption selectivity and capacity with regard to the cholesterol adsorption of the bioran species with different ratios of the l-hydroxyethyl-3-oxybutyl / l, 2-dihydroxy-propyl-3-oxypropyl content on the bioran disiloxane matrix are to be tested.
  • the adsorption capacity is determined via the surface integration of the adsorbed total, LDL and HDL cholesterol amounts.
  • the ratios 1: 4, 1: 1 and 3: 1 of the l-hydroxyethyl-3-oxybutyl / 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl-bioran-disiloxane samples were not determined analytically, but were taken from the sample nomenclature from the starting adsorbents . However, these OH / epoxy ratios of the starting products were determined by spectroscopic analyzes (GC-MS / NMR techniques)
  • the sample with the reaction ratio (1: 1) has the largest LDL cholesterol capacity without additional HDL cholesterol being bound.
  • the total cholesterol capacity of the sample with the ratio (1: 4) is 7.4% higher than for the sample with the ratio (1: 1), but HDL cholesterol is also bound.
  • Trisopor 200 native porous glass semolina (from VEB Trisola, Steinach, pore size 100 nm, grain size 100-200 ⁇ m) are reacted as in Example 6 with the corresponding silanization mixture.
  • the synthesized l-hydroxyethyl-3-0xy-propyl / 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl-trisola-disiloxane is used as the adsorbent.
  • the adsorption capacities with respect to total or LDL cholesterol of the 1st and 2nd run are compared.
  • all relevant clinical-biochemical diagnostic parameters (including urea determination) of the whole blood fractions (20 ml eluates) passed through the adsorption material are tested.
  • the adsorbent l-hydroxyethyl-3-oxypropyl / 1,2-dihydroxypropyl-3-oxypropyl-trisola-disiloxane does not bind HDL cholesterol.
  • Amounts of cholesterol are detected in the regeneration solution, the cholesterol adsorption capacity of the 1st and 2nd run with whole blood is identical, i.e. the 6 M urea solution is suitable as a regeneration agent.
  • Blood count analysis confirms that the adsorbent material is suitable for whole blood.
  • the leukocyte, erythrocyte and platelet values are identical to the values in the blood pool.
  • the differential images of the whole blood courses of the 1st and 2nd adsorption runs show no abnormalities.

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Abstract

Ein Adsorptionsmaterial zur selektiven Entfernung von Lp(a)-Lipoprotein, LDL- oder/und vLDL-Cholesterin aus wässrigen Flüssigkeiten, insbesondere aus Blut, Plasma oder Serum, besteht aus porösen Glaskörpern als festem Trägermaterial, dessen an der Oberfläche vorhandene Silanolgruppen kovalent gebunden Liganden tragen, welche mindestens eine Ethergruppierung mit einer endständigen α,β-Diolgruppe enthaltende Alkylreste mit 4 bis 12 C-Atomen aufweisen und keine freien Silanolgruppen mehr vorliegen.

Description

Adsorptionsmaterial zur selektiven Entfernung von LDL oder/ und vLDL
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft ein Adsorptionsmaterial und ein Ver¬ fahren zur Entfernung von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin oder/und Lp(a)-Lipoprotein aus wäßrigen Flüssigkeiten wie Plasma oder Serum, ein Verfahren zur Bestimmung der Konzen¬ tration von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin oder/und Lp(a)- Lipoprotein in Flüssigkeiten sowie eine Vorrichtung für die genannten Verfahren.
Die selektive Eliminierung von LDL oder/und Lp(a)-Lipoprotein und/oder Fibrinogen aus Humanblut ist aus medizinischer Sicht, insbesondere für die Behandlung einer schweren fami¬ liären Hypercholesterinämie und Atherosklerose, erwünscht (Trans.Am.Soc.Artig.Intern.Organs. (1986) 17, 104-107). Die familiäre Hypercholesterinämie stellt die gefährlichste Art der Hyperlipidä ie dar. In ihrer homozygoten Form drohen dem damit betroffenen Personenkreis bereits in der Jugend (und sogar im Kindesalter) die Erkrankung und der Tod an einer schweren und rapid fortschreitenden Koronaropathie (Plasma Sep. und Plasma Frac. 272-280 (Karger Basel, 1983)).
Die Behandlung der schweren Hypercholesterinämie hat bis heute nicht zu befriedigen vermocht. Dies gilt sowohl für die verschiedenen Formen einer Diät wie für die medikamentöse Therapie. Deshalb wurde versucht, die schweren Stoffwechsel- störungen über den Weg der extrakorporalen Entfernung der atherogenen Lipoproteinfraktionen (very Low Density und Low Density Lipoproteine, vLDL und LDL) aus Blut anzugehen. Durch ein extrakorporales Behandlungsverfahren sollten Gesamt-Cho- lesterinspiegel bzw. LDL-Cholesterinspiegel in den Bereichen von < 200 mg/dl bzw. < 130 mg/dl erreicht werden (Klin. Wo¬ chenzeitschrift (1987) 69, 161-168; GIT Labor Medizin (1989) 9, 386-395). Die Eliminierung von LDL-Cholesterin wird derzeit mit drei verschiedenen extrakorporalen Verfahren durchgeführt. Neben einer Kaskadenfiltration (Artherosclerosis 60, 23-37 (1988), Artherosclerosis 73, 197-202 (1988) kann LDL-Cholesterin durch Präzipitation mit Heparin im sauren pH-Wert-Bereich (HELP-Verfahren = Heparin induzierte extrakorporale LDL-Prä- zipitation) eliminiert werden (Klin. Wochenschrift 65, 161- 168 (1987), EP 0 166 324, DE 33 10 727).
Die dritte Möglichkeit, LDL-Cholesterin aus Blut oder Plasma zu eliminieren, besteht in der Adsorption an geeignete Trä¬ germaterialien. So können z.B. monoklonale und/oder polyklo- nale Antikörper, die das LDL-Cholesterin spezifisch binden, an ein poröses polyanionisches Trägermaterial gekoppelt wer¬ den (J.Clin.Apheresis 4, 59-65 (1988), Proc. Natl.Acad.Sci. USA 78, 611-615 (1981), JP 60239425). Neben Antikörpern sind auch poröse Polyanionen wie Heparin (DE 36 17 672, US 4,637,944, US 4,103,685) und synthetische Oligo- oder Polyanionen wie z.B. sulfatierte Polysaccharide (EP 0 110 409, EP 0 225 867, EP 143 369, US 4,096,136, US 4,603,010) an Trägermaterialien gebunden und für die spezifische LDL-Ad- sorption aus Plasma oder Blut untersucht. Als Trägermatrix für die Bindung der beschriebenen Substanzen werden Cellulo- se, organische Polymerisate, beschichtete Kieselgele und Agarose beschrieben.
Die mit den bisher beschriebenen Adsorptionsmaterialien er¬ zielten Erfolge sind jedoch insbesondere für die Belange der Adsorption von LDL an einer Matrix in einem extrakorporalen Perfusionssystem zu medizinisch-therapeutischen Zwecken unzu¬ reichend, da entweder die Bindungskapazität und/oder Selekti¬ vität dieser Materialien gegenüber LDL nicht den praktischen Anforderungen genügt und/oder physiologische Schutzmechanis¬ men (z.B. GerinnungsSystem, Komplementsystem) aktiviert wer- den (Artheriosclerosis 73, 143-148 (1988), Schweiz. ed.Wschr. 119, 55-58 (1989)).
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Materialien bereitzustellen, die es erlauben, die artherogenen Lipopro- teinfraktionen aus wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere aus Vollblut, Plasma und Serum zu entfernen und zugleich die Vor¬ aussetzungen zur einfachen und sicheren Verwendung in einem extrakorporalen Perfusionssystem für den Menschen erfüllen. Diese Voraussetzungen sind beispielsweise Sterilisierbarkeit mit Dampf, Hitze oder y-Strahlen, minimale Freisetzung von Partikeln im Mikrometerbereich, keine Freigabe toxischer Inhaltsstoffe und eine ausreichend hohe Durchflußgesσhwindig- keit durch die Materialien im Bereich bis zu 200 ml/min, hohe spezifische Selektivität und maximale Kapazität gegenüber den zu eliminierenden Molekülen. Neben den zitierten Kriterien sollte dieses Perfusionssystem, bzw. das Material eine schnelle kinetische Bindungsreaktion mit den zu bindenden Molekülen eingehen können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Adsorpti¬ onsmaterial zur selektiven Entfernung von LDL- oder/und vLDL- Cholesterin aus wässrigen Flüssigkeiten, insbesondere aus Blut, Plasma oder Serum, bestehend aus Glaskörpern, welche Poren aufweisen, als festem Trägermaterial mit über an deren Oberfläche vorhandene Silanolgruppen kovalent gebundenen organischen funktioneilen Gruppen als Liganden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Liganden mindestens eine Ethergruppierung mit einer endständigen α,ß-Diolgruppe ent¬ haltende Alkylreste mit 4 bis 12 C-Atomen aufweist und keine freien Silanolgruppen vorhanden sind.
Die im erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterial als Träger ver¬ wendeten Glaskörper schließen Glasbeads, also Glaskügelchen bestimmter Größe, bestehen aus einer Siliciumdioxid-Phase mit Restgehalten von Borsäure und Alkalioxid sowie Glasmembranen in Form von Hohlfasern ein. Glasbeads sind beispielsweise in der DE-A 24 54 111 und der DE 24 62 567 beschrieben. Das erfindungsgemäße Adsorptionsmaterial unterscheidet sich jedoch von den im Handel frei erhältlichen Varianten (Con- trolled Pore Glass, Nature 206 (1969) 693-696, Anbieter bspw. Dow Corning, Electro Nucleonics, Waiko Industries) insofern, daß alle frei zugänglichen Silanolgruppen durch organisch funktionelle Reste substituiert wurden. Die gezielte Elimi- nierung von Silanolgruppen verhindert die unspezifische Bindung von Proteinen. Adsorber-Materialien auf reiner CPG (Controlled Pore Glass)-Basis mit vollständig oder zum Teil intakten Silanolgruppen zeigen unerwünschte HDL-Bin- dungseigenschaften (siehe Beispiel 1) . Überraschenderweise wurde dagegen festgestellt, daß die erfindungsgemäß substi¬ tuierten Adsorptionsmaterialien, welche an allen Silanolgrup¬ pen substituiert sind, hiervon mindestens an einer Stelle durch eine Äthergruppierung und entweder daran folgend einer endständigen α,ß-Diolgruppe in der Lage sind, mit einer bislang unerreichten kinetischen Reaktion, Selektivität und Bindungskapazität LDL-Cholesterin und vLDL-Cholesterin und Lp(a)-Lipoprotein zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entspre¬ chen die Liganden der allgemeinen Formel I
-(CH2)X- 0 - (CH2)y - CH - R2 (I)
wobei x und y ganze Zahlen von 1 bis 5,
R1 H oder OH und
R2 CH2 OH, wenn R1 OH ist, bedeuten .
Besonders bevorzugte Liganden sind die 1,2-Dihydroxypropyl-3- oxypropyl-Reste. Das erfindungsgemäße Adsorptionsmaterial kann erfindungsgemäß an allen Silanolgruppen mit den genannten Liganden substi¬ tuiert sein. Es ist jedoch auch möglich, daß es neben den genannten Liganden weitere Liganden aufweist. In einer bevor¬ zugten Ausführungsform der Erfindung weist das Adsorptionsma¬ terial als weitere Liganden Verbindungen der allgemeinen Formel II
- (CH2)X - 0 - (CH2)y - CH2 - OH (II)
auf, worin x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 bedeuten.
Besonders bevorzugt sind hier als Liganden der Formel II erfindungsgemäß l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl- und 1-Hydroxypro- pyl-3-oxypropyl-Reste.
Als wiederum weitere bevorzugte Liganden können im erfin¬ dungsgemäßen Adsorptionsmaterial noch Verbindungen der allge¬ meinen Formel III
- (CH2)χ - 0 - (CH2)y - CR-RJJRS (III)
auftreten, wobei R*< einen Methoxyrest und R2 und R3 H oder einen Methoxyrest und x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 bedeuten.
Besonders bevorzugt ist hier der l,l-Dimethoxyethyl-3-oxypro- pyl-Rest..
Sind im erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterial Liganden sowohl der allgemeinen Formel I als auch der Formeln II und III vor¬ handen, ist es bevorzugt, daß diese in einem Mengenverhältnis von ungefähr 1,3:1:0,8 an das Trägermaterial über die Sila¬ nolgruppen gebunden sind.
Die erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterialien weisen je nach Porosität vorzugsweise eine Oberfläche zwischen 30 und 300 m2/g auf. Sie zeichnen sich unter anderem durch ihre Heißdampfsterilisierbarkeit aus.
Der Belegungsgrad des Trägermaterials mit Liganden beträgt vorzugsweise 2 bis 4 μmol/m2, ebenfalls je nach Porosität des eingesetzten Materials.
Der Porendurchmesser der Glaskörper ist im erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterial größer als die zu adsorbierenden Moleküle LDL- und vLDL-Cholesterin, also größer als 30 nm.
Es ist bevorzugt, daß die eingesetzten Glasbeads einen Korn¬ durchmesser von 60 bis 250 μm und einen Porendurchmesser von 50 bis 150 nm aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterials, bei dem der gewünschte Ligand mittels einer Silierungsreaktion über eine Disiloxan-Bindung -Si-O-Si-L, wobei L den Liganden bedeutet) an die SiOH-Gruppen der Glaskörper gekoppelt wer¬ den. Diese Silierungsreaktion ist von Shung et al. (J. of Chrom. 120 (1976) 321-333) beschrieben. Erfindungsgemäß einsetzbare Ausgangsmaterialien werden u.a. unter der Be¬ zeichnung Bioranglasträgermaterialien oder Controlled Pore Glass (CPG)-Träger von den Herstellern Schott, Mainz FRG; Dow Corning, Electro Nucleonics und Waiko Industries angeboten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man zur Silierungsreaktion Jf-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und einen Silanolbioranträger in Form von Glasbeads ein unter Erhalt von Glycidoxypropyl-Bioran-Disiloxan und unterzieht dieses Produkt einer Säurebehandlung, wobei der Epoxidrest sich öffnet und zu dem erfindungsgemäß besonders bevorzugten Liganden, dem l,2-Dihydroxypropyl-3-oxypropyl-Rest, gebunden als Disiloxanfunktion, führt. Die Umsetzung der intakten Silanolgruppen mit y-Glycidoxypro- pyltrimethoxysilan erfolgt nach der oben genannten Silie- rungsreaktionsvorschrift.
Die erfindungsgemäß synthetisierten und verwendeten Adsorpti¬ onsmaterialien zeigen ausgezeichnete Eigenschaften, selektiv und quantitativ LDL- und vLDL-Cholesterin, aber auch Lp(a)- Lipoprotein zu binden, ohne gleichzeitig HDL-Cholesterin zu eliminieren.
Wiederum ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Ver¬ fahren zur Entfernung von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin aus wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, bei dem man die Flüssigkeit über ein erfindungsgemäßes Ad¬ sorptionsmaterial leitet. Eine weitere Anwendung des erfin¬ dungsgemäßen Adsorptionsmaterials und damit ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mit Hilfe eines erfin¬ dungsgemäßen Adsorptionsmaterials LDL- und vLDL-Cholesterin chromatographisch aus der Flüssigkeit abtrennt und nach der Elution vom Adsorptionsmaterial deren Konzentration nach an sich bekannten Methoden bestimmt. Es ist hierbei bevorzugt, die Elution mit hochmolekularer Kochsalzlösung, einem Glyce- rin-Wasser-Gemisch oder einer Harnstoff-Lösung durchzufüh¬ ren (Beispiel 10).
Gegenüber vergleichbaren Materialien zeichnen sich die erfin¬ dungsgemäßen Materialien dadurch aus, daß sie LDL und vLDL mit einer bislang unerreichten kinetischen Reaktion, Selekti¬ vität und Bindungskapazität (> 20 mg LDL pro ml Adsorbens) binden, daß sie diese Komponenten nicht nur aus Plasma oder Serum, sondern auch direkt aus stabilisiertem Vollblut mit hoher Effizienz eliminieren und daß sie keine physiologischen Schutzmechanismen (z.B. GerinnungsSystem, Komplementsyste ) durch unspezifische Adsorption entsprechender Komponenten aktivieren (Beispiel 10 und 11).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur extrakorporalen Entfernung von LDL oder/und vLDL-Chole- sterin aus wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, wobei diese Vorrichtung aus einem zylindrischen Gehäuse besteht, das mit einem erfindungsgemäßen Adsorptions¬ material gefüllt ist und an seinen stirnseitigen Enden mit Deckeln versehen ist, die jeweils einen zentralen Zu- bzw. Ablaufstutzen aufweisen. Vorzugsweise weist dieses zylindri¬ sche Gehäuse einen Durchmesser von 3 bis 20 cm, vorzugsweise 5 bis 10 cm und eine Länge von 1 bis 40 cm, vorzugsweise 10 bis 20 cm auf. Das bevorzugte Material für das Gehäuse ist Glas oder Kunststoff (Beispiel 10 und 11).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung weist das Gehäuse am Zulaufseitigen Dek- kel ein Sieb mit Porenweite 10 bis 300 μm, vorzugsweise 20 bis 100 μm auf. Hierdurch wird das Verstopfen der Vorrichtung durch in der wäßrigen Flüssigkeit enthaltene größere Partikel verhindert. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in einer Verpackung mittels tf-Strahlung oder Hitze sterilisierbar und damit besonders geeignet zum Einsatz in einem extrakorporalen Perfusionssystem. Sie kann jedoch auch praktisch als Chroma¬ tographiesäule, insbesondere zur erfindungsgemäßen Bestimmung der LDL- und/oder vLDL-Cholesterinkonzentration verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Gehäuse der Vorrichtung in einen geschlossenen Kreis¬ lauf integriert, in dem die wäßrige Flüssigkeit mittels einer Pumpe zirkuliert wird. Besonders bevorzugt ist die Vorrich¬ tung mit zwei zylindrischen Gehäusen (zwei Adsorptionskap¬ seln) ausgerüstet, die wechselseitig über Ventile angesteuert und mit der zu behandelnden wäßrigen Flüssigkeit in einem geschlossenen Kreislauf mittels einer Pumpe durchgespült werden. Die jeweils nicht durchspülte, von dem LDL oder vLDL gesättigte Kapsel wird mit einer Regenerationslösung, vor¬ zugsweise handelt es sich dabei um hochmolekulare Kochsalzlö¬ sungen, um Glycerin-Wasser-Gemische, aber auch um Harnstoff- lösungen, eluiert.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch in den Dialysier- flüssigkeitskreislauf eines Dialysegerätes zur Regeneration der Dialysierflüssigkeit in Kombination mit weiteren Adsor- bern integriert werden.
Die folgenden Beispiele sollen in Verbindung mit den Abbil¬ dungen die Erfindung weiter erläutern. Hierbei zeigen die Figuren
Figur 1 Festkörper-C-13 NMR-Spektren der Bioranglasmateria¬ lien mit verschiedenen Liganden.
B e i s p i e l 1 Vergleichsbeispiel
Test der AdsorptionsSelektivität und -kapazität von nativen CPG-Gläsern.
Adsorbens
CPG 500-Glas (Serva, Heidelberg) mit einem Porendurchmesser von 50 nm (enthält freie nicht umgesetzte Silanolgruppen als Oberfläche) .
Versuchsdurchführunσ
Das Adsorbens wird mit bidestilliertem Wasser über eine G3 Nutsche gewaschen, in eine Einwegσhromatographiesäule (5 x 70 m) gefüllt und anschließend mit 100 ml 50 mM Tris-Cl pH 7,6 äquilibriert (Harzvolumen 1,6 ml/Säulenhöhe 8 cm).
Auf die Säule werden bei Raumtemperatur 6 ml Humanplasma (mit 3 Einheiten Na-Heparin/B. Braun Melsungen AG pro ml stabili¬ siert) gegeben und durch die Säule gepumpt (Volumenstrom 0,5 ml/min). Nach 2 ml Voreluat wurden aus jedem folgenden Milli¬ liter des Eluats jeweils 600 μl Fraktion gezogen, die auftre¬ tenden "Zwischeneluate" (dies sind jeweils 400 μl bis zur nächsten Einzelfraktion auf volle ml bezogen) werden getrennt in einem Gefäß gesammelt und so zu einem Gemisch vereinigt (jeweils 1,6 ml bei einem Volumenlauf von 6 ml).
Als Bewertungsparameter für kinetische Adsorptionskapazitäts- verläufe werden die Eluate 2, 3, 4, 5 und 6 ml herangezogen. Als "Screeningkriterium Selektivität" für die Selektivität einzelner synthetisierter Adsorbermaterialien werden die im Gemisch vereinigten Zwischeneluate ausgewertet. Von den Elua- ten werden der Gesamtcholesterin-, der HDL-, der LDL- sowie der Proteingehalt bestimmt (Chod Pap-, Chod Jodid- und Biu- ret-Test) .
Tabelle 1: CPG 500 (mit freien Silanolgruppen)
Figure imgf000012_0001
Adsorptionskapazität in % errechnet sich aus:
Adsorptionskapazität = Ausσanqsplasma - Gem. Zwischeneluate x 100
Ausgangsplasma
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, ist natives CPG 500 Glas mit nicht umgesetzten Silanolgruppen in der Lage, Gesamt-Cho- lesterin zu binden. Da jedoch das HDL Cholesterin quantitativ eliminiert wird, relativiert sich die LDL-Bindungskapazität. Die HDL-Cholesterineliminierung muß als großer Nachteil be¬ trachtet werden.
B e i s p i e l 2
Grundträger
Test der Gesamtcholesterin-Adsorptionskapazität von mit 1- Aminoethyl-3-oxybutyl-Gruppen bzw. alternativ 1-Hydroxyethyl- 3-oxybutyl-/Glycidoxypropylgruppen (Verhältnis 1:1) belegten "Glasbeads" (Herstellerbezeichnung NH2- und -OH/Epoxid-hydro- philes Bioranglas, Fa. Schott, Mainz) 100/130/250, Porengröße je nach Spezies 100-120 nm, Korngröße 60 - 280 μm) .
Versuchsdurchführunq
Analog Beispiel 1: In Tabelle 2 sind die Gesamt-Cholesterin- bindungseigenschaften aller eingesetzten Ausgangsmaterialien gezeigt.
Tabelle 2: Gesamt-Cholesteringeha_t
Ausgangs¬ Gemisch der Adsorptions¬ plasma Zwischenelu¬ kapazität (mg/dl) ate (mg/dl) (%)
-OH/Epoxid hydro¬ 249 225 10 philes Bioran 100 (Herstellerbe¬ zeichnung)
-OH/Epoxid hydro¬ 249 167 32 philes Bioran 130 (Herstellerbe¬ zeichnung)
-OH/Epoxid hydro¬ 217 219 philes Bioran 250 (Herstellerbe¬ zeichnung)
-NH -hydrophiles 249 90 64 Bioran 100 (Herstellerbe¬ zeichnung)
-NH2 hydrophi- 249 99 601es Bioran 130 (Herstellerbe¬ zeichnung)
NH2-hydrophi¬ 249 100 60 les Bioran 250 (Herstellerbe¬ zeichnung) Die in Tabelle 2 gezeigten Bindungskapazitäten des Gesamt- Cholesterins liegen für die mit NH2-Gruppen substituierten Bioran "Glasbeads" relativ hoch, diese Spezies adsorbiert jedoch das HDL-Cholesterin quantitativ (Daten nicht gezeigt) . Aus diesen Gründen können die NH2 modifizierten "Glasbeads" lediglich für Umsetzungen mit unterschiedlichsten Liganden eingesetzt werden.
B e i s p i e l 3 Grundträger und Säure
Immobilisierung von org. funktioneilen Gruppen an Bioran "Glasbeads" sowie Test der Adsorptionskapazität der syntheti¬ sierten Adsorptionsmaterialien.
Adsorbens
Als Ausgangsprodukt für die Immobilisierungsreaktion wurden "Glasbeads" analog Beispiel 2 eingesetzt (Fa. Schott, Poren¬ größe, Korngröße siehe Bsp. 2), diese werden mit Schwefelsäu¬ re umgesetzt. Die Epoxidgruppe wird dabei geöffnet, es ent¬ steht jeweils eine l,2-Dihydroxypropyl-3-oxypropyl-Funktion.
Je 6 g feuchte Bioran "Glasbeads" 100, 130, 250 (siehe Bsp. 2) mit -CH20H Gruppen und Epoxidgruppen (Verhältnis 1:1) werden 3 Tage bei 40°C mit 1 N H2S04 geschüttelt (100 rpm) . Das Adsorbens wird anschließend mit einer G3 Fritte mit 10 Volumenanteilen destilliertem Wasser gewaschen und im jewei¬ ligen Äquilibrierungspuffer aufgenommen.
Versuchsdurchführung
Analog Beispiel 1: In Tabelle 3 sind die Gesamt-Cholesterin- bindungseigenschaften einiger synthetisierter Adsorptionsma¬ terialien gezeigt. Tabelle 3: Gesamt-Cholesterinbestimmung von Bioran "Glas¬ beads" Syntheseprodukten
Ausgangs¬ Gemisch der Adsorptions¬ plasma Zwischenelu¬ kapazität (mg/ml) ate (mg/ml) (%)
1,2-Dihydroxypro- 217 126 42 pyl-3-oxypropyl- Bioran-Disilc "an 100
1,2-Dihydroxypro- 217 93 57 py1-3-oxypropy1- Bioran-Disiloxan 130
1,2-Dihydroxypro- 217 97 55 pyl-3-oxypropyl- Bioran-Disiloxan 250
Anmerkung: In der o.a. Tabelle werden die getesteten Materia¬ lien lediglich mit der umgesetzten aktiven Gruppe beschrie¬ ben. Neben den l,2-Dihydroxy-3-oxypropylresten sind an die "Glasbeads" l-Hydroxyethyl-3-oxypropylreste und 1,1-Dimeth- oxyethyl-2-oxypropylreste im Mengenverhältnis (1,3:1:0,8) gebunden (siehe Beispiel 8) .
Alle mit der erfindungsgemäßen funktioneilen Gruppe belegten Bioran "Glasbeads" zeigen ausgezeichnete Bindungseigenschaf¬ ten. Die Materialien sind nicht in der Lage, wie das NH2- modif. Bioran "Glasbeads" und das CPG-500 Glas, HDL zu binden (siehe Beispiele 1 und 4) . B e i s p i e l 4
Vergleichende Übersicht einiger klinisch relevanter Parameter am ausgewählten Adsorbensmaterial l,2-Dihydroxyethyl-3-oxy- propyl/l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/l,l-Dimethoxyethyl-2-oxy- propyl-Bioran-Disiloxan (Verhältnis 1,3:1:0,8).
In den Tabellen 4 und 5 sind die relevanten klinischen Para¬ meter der oben beschriebenen Bioran-Disiloxanspezies (Ver¬ hältnis 1,3:1:0,8) 100/130 gezeigt (siehe Bsp. 1 - 3).
Tabelle 4: l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/l,2-Dihydroxy-3-oxypro- pyl/1,l-Dimethoxyethyl-2-oxypropyl-Bioran-Disiloxan (Verhält¬ nis 1:1,3:0,8) 100
Figure imgf000017_0001
Tabelle 5: l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/l,2-Dihydroxy-3-oxypro- pyl/1,l-Dimethoxyethyl-2-oxypropyl-Bioran-Disiloxan (Verhält¬ nis 1:1,3:0,8) 130
Figure imgf000018_0001
Die in Beispiel 4 beschriebenen Adsorptionsmaterialien zeigen große Selektivität und Adsorptionskapazität bzgl. LDL-Chole¬ sterin. Weder HDL-Cholesterin noch Gesamt-Eiweiß wird vom Adsorptionsmaterial gebunden. Keines der Kinetikexperimente zeigt nach 6 ml Plasmadurchfluß eine Sättigung des Mate¬ rials.
B e i s p i e l 5
Test der Adsorptionsselektivität und -kapazität von "Glas¬ beads" mit l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl-/l,2-Dihydroxy-3-oxypro- pyl-Bioran-Disiloxan mit Vollblut.
Adsorbens
Als Adsorbens wird l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/l,2-Dihydroxy-3- oxypropyl-Bioran-Disiloxan (Verhältnis 1:1,3) 100/130 mit Vollblut getestet. Versuchsdurchführung
Die Versuchsdurchführung unterscheidet sich lediglich in der Wahl des Vollbluts (stabilisiert mit 3 IE/ml Heparin-Natrium B. Braun Melsungen AG) im Gegensatz zu Beispiel 1 (Plasma mit Heparin stabilisiert) .
In Tabelle 6 sind die Ergebnisse des Vollblutexperiments dargestellt.
Tabelle 6: l-Hydroxy-3-oxybutyl/l,2-Dihydroxy-3-oxypropyl- Bioran-Disiloxan (Verhältnis 1:1,3) 100/130
Ausgangs- Gemisch der Adsorptions¬ plasma Zwischenelu¬ kapazität (mg/ml) ate (mg/ml)
1-Hydroxyethyl- 221 100 55 3-oxybuty1-/ 1,2-Dihydroxy- 3-oxypropyl-Bioran- Disiloxan 100
1-Hydroxyethyl- 221 70 68
3-oxybutyl-/
1,2-Dihydroxy-
3-oxypropy1-Bioran-
Disiloxan 130
Die erfindungsgemäß beschriebenen Adsorptionsmaterialien sind in der Lage, weit über 50 % des Gesamt-Cholesterins aus Voll¬ blut zu eliminieren. Beim Passieren des Blutes durch die Säule trat keine Hämolysereaktion auf. B e i s p i e l 6
Synthese von porösen "Glasbeads" und Test der Adsorptionska¬ pazität der synthetisierten Adsorberspezies mit Humanplasma.
Zu 200 ml deminerausierte Wasser wurden unter Rühren und pH-Kontrolle mit Glaselektrode 12 ml 3-Glycidoxypropyltrime- thoxysilan (Fa. Sigma, Heidelberg) zugetropft, wobei der pH der Mischung durch tropfenweise Zugabe von 10"3 N KOH zwi¬ schen 5,5 und 5,8 gehalten wurde (Verbrauch ca. 30 ml). Es wurde genügend Wasser zugegeben, um die resultierende Lösung
5 %ig zu machen. Die Silylierungsmischung wurde gleich wei¬ terverarbeitet.
25 g natives Bioranglas 100 (Fa. Schott, Porengröße 100 nm, Korngröße 100 μm) wurden im 1-1-Rundkolben mit 200 ml (100 ml) der Silylierungsmischung übergössen und im Wasser¬ strahlvakuum ca. 1 min unter Schütteln entgast. Anschließend wurde das Gemisch belüftet und möglichst schnell in einem vorgeheizten Ölbad auf 90°C erhitzt (ca. 10 min Aufheizzeit). Es wurde 30 min unter Schwenken bei dieser Temperatur gehal¬ ten und dann möglichst schnell abgekühlt, auf einem Büchner¬ trichter abgenutscht und mit reichlich demineralisiertem Wasser gewaschen. Dann wurde noch 3mal mit je 150 ml Aceton gewaschen und solange genutscht, bis der Rückstand nicht mehr kalt war. Der feine Pulver wurde noch im Vakuum (20 h bei 20 hPa, 24 h bei 2Pa) getrocknet und gewogen. Es resultierten trotz eventueller Umfüllverluste 25 g Glycidoxy-3-propyl- Bioran-Disiloxan 100.
6 g feuchtes Glycidoxy-3-propyl-Bioran-Disiloxan 100 "Glas¬ beads" wurden 3 Tage bei 40°C mit 1 N U2S04 geschüttelt
(100 rpm). Das Adorbens wurde anschließend in einer G3 Fritte mit 10 Volumenanteilen destilliertem Wasser gewaschen und im Äquilibrierungspuffer aufgenommen. Versuchsdiirchführunq
Analog Beispiel 1: In Tabelle 7 sind die relevanten klini¬ schen Parameter eines Säulenexperimentes mit Humanplasma mit dem synthetisierten Adsorptionsmedium l,2-Dihydroxypropyl-3- oxypropyl-Bioran-Disiloxan gezeigt.
Tabelle 7: Über das Adsorbermaterial l,2-Dihydroxypropyl-3- oxypropyl-Bioran-Disiloxan passiertes Humanplasma
Figure imgf000021_0001
Wie in Tabelle 7 dokumentiert, zeigt das Adsorptionsmedium ausgezeichnete Selektivitäts- und Adsorptionskapazitätseigen- schaften gegenüber den relevanten Lipidparametern.
B e i s p i e l 7
Klinisch-biochemische Routinediagnostik von über poröse "Glasbeads" passierte Humanplasmafraktionen.
Adsorbens
Über analog Beispiel 3 synthetisiertes Adsorptionsmaterial (Bioran "Glasbeads" Porengröße 120 nm, Korngröße 130 μm ana¬ log Bsp. 2) mit org. funktioneilen Spacerarmen belegt, beste¬ hen aus l,2-Dihydroxypropyl-3-oxypropyl-, l-Hydroxyethyl-3- oxypropyl- und 1,l-Dimethoxyethyl-2-oxypropylreste im Ver¬ hältnis 1:1, 3:0,8 wird in einem Plasmaexperiment getestet.
Versuchsdurchführunq
Analog Beispiel 1. In Tabelle 8 sind alle relevanten klin.- biochem. Diagnostikparameter der über das Adsorptionsmaterial passierten Plasmafraktionen dargestellt.
Tabelle 8
Säulenfraktion
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Lp(a) mg/dl 24,5 1,85 2,0 2,65 4,1 6,6
Fibrinogen mg/dl 272 258 231 231 231 258
Plasminogen mg/dl 18,4 12,6 17,6 18,4 18,4 19,2
A = Ausgangswert
2-6 = Säulenfraktion (in ml)
Die dokumentierten Resultate der Diagnostik belegen die Se¬ lektivität und Kapazität des synthetisierten Adsorptionsmate¬ rials.
B e i s p i e l 8
Festkörper NMR-Spektrum des in Beispiel 7 eingesetzten syn¬ thetisierten Adsorptionsmaterials. Adsorbens/Versuchsdurchführung
Die vom Hersteller Schott, Mainz als Grundmaterial direkt bezogenen (Bsp. 2), aber auch in Bsp. 3 synthetisierten Bio¬ ranträgermaterialien:
A: l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl-Bioran-Disiloxan
B: 1:1 Gemisch l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/Glycidoxypropyl-
Bioran-Disiloxan C: Gemisch l-Hydroxyethyl-3-oxybutyl/l,2-Dihydroxypropyl-
3-oxypropy1-Bioran-Disiloxan
werden je 0,5 g des bei 50°C/14 Std. getrockneten Proben ein C 13-NMR Spektrum gemessen.
Parameter
Gerät: Bruker AM 00
Meßmethode: CP/MAS (Cross-Reaction-Magic-Angel-Spinning) Frequenz: 106,1 MHz Scan-Durch¬ gänge: 2743 X Probenmenge: 0,5 g Temperatur: 25°C
Die ermittelten Spektren der Verbindungen A/B/C sind in Abb. 1 dargestellt. Alle drei Verbindungen unterscheiden sich in ihren Signalen. Lediglich der Signalpeak bei 21,8 tritt bei allen Proben gleich auf. Er repräsentiert das -C-C-C-0 Ge¬ rüst. Dieses liegt bei allen Resten (A/B/C) als Grundfunktion zugrunde. Nur das gemäß Beispiel 3 synthetisierte Adsorberma- terial (Probe C) erfüllt die gestellten Qualitätskriterien bzgl. seiner LDL-Bindungskapazität. Das unter C dokumentierte Festkörper NMR-Spektrum kann als Qualitätskriterium für das Adsorbermaterial herangezogen werden. B e i s p i e l 9
Test der Gesamtcholesterin-Adsorptionskapazität von mit 1- Hydroxyethyl-3-Oxybutyl-/Glycidoxypropylgruppen belegten "Glasbeads" (Herstellerbezeichnung -OH/Epoxid-hydrophiles Bioranglas, Fa. Schott, Mainz), Porengröße je nach Spezies 100 - 120 nm, Korngröße 60 - 280 μm.
Adsorbens
Als Ausgangsprodukt für die Synthese werden hydrophile Bio¬ rangläser mit verschiedenen OH/Epoxid-Verhältnissen (1:4, 1:1, 3:1) eingesetzt (genaue Produktbezeichnungen siehe Überschrift). Durch die Umsetzung mit Schwefelsäure wandelt sich die Epoxidfunktion in eine l,2-Dihydroxypropyl-3-Oxy- propyl-Funktion (Reaktionsbedingungen, vgl. Beispiel 3).
Die AdsorptionsSelektivität und -kapäzität bzgl. der Chole- sterinadsorption der Bioranspezies mit unterschiedlichen Verhältnissen des l-Hydroxyethyl-3-Oxybutyl/l,2-Dihydroxy- propyl-3-Oxypropyl-Gehaltes an der Bioran-Disiloxanmatrix soll getestet werden.
Versuchsdurchführung
Das Adsorbens (Harzvolumen=l,6 ml) wird mit bidestilliertem Wasser über eine G3-Nutsche gewaschen, in eine Einwegchroma- tographiesäule (5 x 90 mm) gefüllt und anschließend mit 200 ml physiologischem Phosphatpuffer (pH 7,4, 20 mol P04 3" ) äquilibriert.
Auf die Säule werden bei Raumtemperatur 22 ml Humanplasma (mit 3 Einheiten Na-Heparin, Fa. B. Braun-Melsungen AG, pro ml Vollblut stabilisiert/Plasmavolumenstrom 0,5 ml/min) gegeben.
Nach 2 ml Voreluat werden 10 Eluate a 1 ml gewonnen, von denen im Vergleich zur Ausgangskonzentration des Plasmas der Gesamtcholesterin-, HDL-, LDL-Gehalt bestimmt wird (Chod-PAP, Chod-Jodid-Test) .
Die Ermittlung der Adorptionskapazität erfolgt über die Flächenintegration der adsorbierten Gesamt-, LDL- und HDL- Cholesterinmengen.
1-Hydroxyethyl-
3-0xybutyl/
1,2-Dihydroxy- propyl-3-oxy- propyl-Bioran- 45,6 16,6 36,4 30,4 15,1 49,8 9,6
Disiloxan 100
(Verhält. 1:1)
1-Hydroxyethyl-
3-Oxybutyl/
1,2-Dihydroxy- propyl-3-oxy- propyl-Bioran 45,6 13,4 29,3 30,4 13,9 45,8 9,6
Disiloxan 100
(Verhält. 3:1)
Figure imgf000027_0001
Die Verhältnisangaben 1:4, 1:1, und 3:1 der l-Hydroxyethyl-3- Oxybutyl/1,2-Dihydroxypropyl-3-Oxypropyl-Bioran-Disiloxan Proben wurden nicht analytisch bestimmt, sondern aus der Probennomenklatur von den Ausgangsadsorbentien übernommen. Diese OH/Epoxid-Verhältnisse der Ausgangsprodukte wurden jedoch durch spektroskopische Analysen ermittelt (GC-MS/NMR- Techniken)
Die Ergebnisse zeigen, daß die Bindungskapazitäten der adsor¬ bierten Cholesterinmengen von dem Verhältnis der 1-Hydrox- yethyl-3-0xybutyl/l,2-Dihydroxypropyl-3-0xypropyl- Zusammensetzung abhängig ist. Die Probe mit dem Reaktionsver¬ hältnis (1:1) besitzt die größte LDL-Cholesterinkapazität, ohne daß zusätzlich HDL-Cholesterin gebunden wird.
Die Gesamtcholesterinkapazität der Probe mit dem Verhältnis (1:4) liegt zwar um 7,4 % höher als bei der Probe mit dem Verhältnis (1:1), jedoch wird zusätzlich HDL-Cholesterin gebunden.
Diese zusätzliche HDL-Cholesterinbindungseigenschaft wird zwar bei der Probe mit dem Reaktionsverhältnis (3:1) nicht beobachtet, dafür verringert sich jedoch die Gesamtcholeste¬ rinkapazität und somit auch die LDL-Cholesterinbindungskapa- zität.
Die höchste Adsorptionskapazität mit entsprechender LDL- Cholesterin-Selektivität wird mit dem Reaktionsverhältnis (1:1) erzielt.
B e i s p i e l 10
Synthese von porösen "Glasbeads" und Test der Adsorptionska¬ pazität der synthetisierten Adsorberspezies mit Vollblut mit sich anschließender Regeneration. Synthese der porösen Glasbeads:
Nativer poröser Glasgrieß Trisopor 200 (Fa. VEB Trisola, Steinach, Porengröße 100 nm, Korngröße 100 - 200 μm) werden wie in Beispiel 6 mit der entsprechenden Silanisierungsmi- schung umgesetzt.
Die l-Hydroxyethyl-3-0xypropyl/Glycidoxypropyl-Trisola-Disi- loxan 200 (Verhältnis 3:1) "Glasbeads" werden nach der Be¬ handlung mit 1 N H2S0 mit destilliertem Wasser gewaschen und mit physiologischem Phosphatpuffer (pH 7,4, 20 Mol P04 3" ) äquilibriert.
Cholesterinadsorption aus Vollblut mit sich anschließender Regeneration
Als Adsorbens wird das synthetisierte l-Hydroxyethyl-3-0xy- propyl/ 1,2-Dihydroxypropyl-3-oxypropyl-Trisola-Disiloxan verwendet.
Versuchsdurchführung
18 g (Trockengewicht) synthetisiertes Adsorbens werden mit physiologischem Phosphatpuffer (pH 7,4 20 mMol P04 3' ) aufge¬ schwemmt und in ein zylindrisches Gehäuse eingefüllt. Die Vorrichtung besteht aus einem Kunststoffgehäuse (L=25 mm, D,-=38 mm) und weist am Zulaufseitigen Deckel ein Sieb mit Porenweite 20 - 100 μm auf. Das Adsorptionsmaterial wird in dem Kunststoffgehäuse mit Phosphatpuffer (s.o.) äquili¬ briert.
Im Adsorptionstest werden im 1. Lauf und 2. Lauf je 160 ml Vollblut (mit 2 mg EDTA/ml Vollblut stabilisiert) über das Adsorbens gepumpt (Volumenstrom 10 ml/min). Zwischen dem 1. und 2. Lauf erfolgt, nach dem Spülen mit physiologischer Kochsalzlösung, die Regeneration mit 6 M Harnstofflösung (Volumen 120 ml). Vor dem 2. Lauf mit Vollblut wird die Regenerationslösung wiederum mit physiologischer Kochsalzlö¬ sung aus der Adsorberkapsel freigespült.
Als Bewertungskriterium für die Regenerierbarkeit des Adsor¬ bens werden die Adsorptionskapazitäten bzgl. Gesamt- bzw. LDL-Cholesterin des 1. und 2. Laufes verglichen. Zusätzlich werden alle relevanten klinisch-biochemischen Diagnostikpara¬ meter (incl. Harnstoffbestimmung) der über das Adsorptionsma¬ terial passierten Vollblutfraktionen (20-ml-Eluate) getestet.
Tabelle 10 Cholesterinadsorption von Trisola-Glasbeads
Gesamtcholesterin adsorbiertes Gesamt¬
Figure imgf000031_0001
im Blutpool absolut in cholesterin absolut 80 ml Voll¬ aus 80 ml Vollblut blut σ (mg/dl) c (mg)
1. Lauf vor Regeneration 275 220
2. Lauf nach Regeneration 275 220
Figure imgf000031_0002
LDL-Cholesterin adsorbiertes LDL- i im Blutpool absolut in Cholesterin absolut VO I
80 ml Voll¬ aus 80 ml Vollblut blut c (mg/dl ) c (mg) c (mg) ( % )
1. Lauf vor Regeneration 175 140 99 69, 29
2. Lauf nach Regeneration 175 140 101 72 , 14
Das Adsorptionsmaterial l-Hydroxyethyl-3-Oxypropyl/ 1,2- Dihydroxypropyl-3-Oxypropyl-Trisola-Disiloxan bindet kein HDL-Cholesterin.
In der Regenerationslösung werden Cholesterinmengen nachge¬ wiesen, die Cholesterinadsorptionskapazität des 1. und 2. Laufes mit Vollblut ist identisch, d.h. die 6 M Harnstofflö- sung eignet sich als Regenerationsagens. Die Blutbildanalytik bestätigt, daß das Adsorptionsmaterial für Vollblut geeignet ist. Die Leukozyten, Erythrocyten- und Thrombozytenwerte sind mit den Werten des Blutpools identisch. Die Differentialbil¬ der der Vollbluteluate des 1. und 2. Adsorptionslaufes zeigen keine Abnormalitäten.
B e i s p i e l 11
Klinisch-biochemische Routinediagnostik von und über poröse "Glasbeads" passierter Vollblutfraktionen
Adsorbens
Ein analog Beispiel 10 synthetisiertes Adsorptionsmaterial, bestehend aus l-Hydroxyethy2 - -Oxypropyl/ 1,2-Dihydroxy- propyl-3-0xypropylresten (Vexnältnis 3:1) wird mit Vollblut getestet.
Versuchsdurchführung
28 g (Trockengewicht) synthetisiertes Adsorptionsmaterial werden im Äquilibrierungspuffer aufgeschlemmt, in eine zy¬ lindrische Kunststoffvorrichtung mit Deckel- und Siebver¬ schluß (L=49 mm, D,-=36 mm) gefüllt und äquilibriert. 400 ml Vollblut (mit 2 mg EDTA/ l Vollblut stabilisiert) werden mit dem Blutvolumenstrom von 16 ml/min über das Adsorptionsmate¬ rial gepumpt. Für die klinische Routineanalytik werden nach 100 ml Voreluat 20 ml Vollbluteluate gewonnen.
Tabelle 11 siehe Anlage
Die Ergebnisse der Blutbildanalytik (Tabelle 12) bestätigen die Biokompatibilität des Adsorptionsmaterials.
Die in der Tabelle 11 dokumentierten Resultate der klinischen Routineanalytik belegen sowohl die Selektivität als auch die Kapazität des synthetisierten Adsorptionsmaterials.
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Adsorptionsmaterial zur selektiven Entfernung von Lp(a)- Lipoprotein, LDL- oder/und vLDL- Cholesterin aus wässri- gen Flüssigkeiten, insbesondere aus Blut, Plasma oder Serum, bestehend aus porösen Glaskörpern als festem Trägermaterial mit über an deren Oberfläche vorhandene Silanolgruppen kovalent gebundenen organischen funktio¬ neilen Gruppen als Liganden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Liganden mindestens eine Ethergruppierung mit einer endständigen α,ß-Diolgruppe enthaltende Alkylreste mit 4 bis 12 C-Atomen aufweist und keine freien Sila¬ nolgruppen vorhanden sind.
2. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Liganden der allgemeinen Formel
-(CH2)X- 0 - (CH2)y - CH - R2 (I)
entsprechen, in der x und y ganze Zahlen von 1 bis 5,
R-i H oder OH und
R2 -CH2OH, wenn R1 OH ist, bedeuten.
3. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Liganden l-Aminoethyl-3-oxypropyl-Reste ent¬ hält.
4. Adsorptionsamterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß es als weitere Liganden Reste der allgemeinen For¬ mel
- (CH2)X - 0 - (CH2)y - CH2 - OH (II)
enthält, worin x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 bedeu¬ ten.
5. Adsoprtionsmaterial nach Anspruch 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Liganden der Formel II einen oder mehrere 1- Hydroxyethyl-3-oxybutyl-Reste enthält.
6. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Liganden einen oder mehrere 1-Hydroxypropyl- 3-oxypropyl-Reste enthält.
7. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß es als weitere Liganden Reste der allgemeinen For¬ mel
- (CH2)X - 0 - (CH2)y - CR1R2R3 (III)
enthält, wobei
R, einen Methoxyrest und
R2 und R3 H oder einen Methoxyrest und x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 bedeuten.
8. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß es als Ligaπden der Formel III einen oder mehrere 1,l-Dimethoxyethyl-3-oxypropyl-Reste enthält.
9. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Liganden der Formeln I, II und III in einem Mengenverhältnis etwa von 1,3 : 1 : 0,8 an das Trägerma¬ terial über die Silanolgruppen gebunden vorhanden sind.
10. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Liganden der Formeln I und II in einem Mengen¬ verhältnis von 1:1, 1:2, 1:3 und 1:4 sowie 2:1, 3:1 und 4:1 an das Trägermaterial über die Silanolgruppen gebun¬ den vorhanden sind.
11. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß es eine Oberfläche von 30 bis 300 m2/g aufweist.
12. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Belegungsgrad des Trägermaterials mit Liganden 2 bis 20 μmol/m2 beträgt.
13. Adsorptionsmaterial nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Glasbeads einen Korndurchmesser von 60 bis 500 μm und einen Porendurchmesser von 50 bis 350 nm aufweisen.
14. Verfahren zur Entfernung von LDL- oder/und vLDL-Chole- sterin oder/und Lp(a)-Lipoprotein aus wäßrigen Flüssig¬ keiten, insbesondere aus Blut, Plasma oder Serum, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Flüssigkeit über ein Adsorptionsmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 12 leitet.
15. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin oder/und Lp(a)-Lipoprotein in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man mit Hilfe eines Adsorptionsmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 12 LDL- und vLDL-Cholesterin und Lp(a)-Lipoprotein chromatographisch abtrennt und nach Elution vom Adsorptionsmaterial ihre Konzentration nach an sich bekannnten Methoden bestimmt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Elution mit hochmolekularer Kochsalzlösung, einem Glycerin-Wasser-Gemisch oder einer Harnstoff- Lösung durchführt.
17. Vorrichtung zur extrakorporalen Entfernung von LDL- oder/und vLDL-Cholesterin oder/und Lp(a)-Lipoprotein aus wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sie aus einem zylindrischen Gehäuse besteht, das mit einem Adsorptionsmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gefüllt ist und a: seinen stirnseitigen Enden mit Deckeln versehen ist, die jeweils einen zentralen Zu- bzw. Ablaufstutzen aufweisen.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Gehäuse einen Durchmesser von 3 bis 20 cm, vor¬ zugsweise 5 bis 10 cm, und eine Länge von 1 bis 40 cm, vorzugsweise 10 bis 20 cm aufweist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Gehäuse aus Glas oder Kunststoff besteht.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17, 18 oder 19, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Gehäuse am Zulaufseitigen Deckel ein Sieb mit Porenweite 10 bis 300 μm, vorzugsweise 20 bis 100 μm aufweist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Gehäuse in einen geschlossenen Kreislauf inte¬ griert ist, in dem die Flüssigkeit mittels einer Pumpe zirkuliert wird.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sich in dem Kreislauf ein weiteres mit dem Adsorpti¬ onsmaterial gefülltes und mit Deckeln mit Zu- bzw. Ab¬ laufstutzen versehenes zylindrischen Gehäuse befindet.
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