UA126550C2

UA126550C2 - Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, що кодує гфпд, і спосіб її застосування

Info

Publication number: UA126550C2
Application number: UAA201803675A
Authority: UA
Inventors: Марк Лінка; Марк Линка; Фабієн Поре; Фабиен Поре; Бернд Лабер; Гудрун Ланге; Ян Теббе; Уейн Коко; Уэйн Коко; Міхаель Штрерат; Михаэль ШТРЕРАТ; Ернст Вебер; Эрнст ВЕБЕР; Ніколаус Павловскі; Николаус Павловски; Сандра Геске; Хайке Бальвен-Росс; Ніна Вобст; Нина Вобст; Крістіна Тіс
Original assignee: Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт; Байер Кропсайенс Акциенгезелльшафт; Байєр Кропсайєнс Лп; Байер Кропсайенс Лп
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2022-11-02
Also published as: WO2017042259A1; CA2998036A1; JP2018534911A; EP3347475B1; ZA201802329B; AR105984A1; AU2016319093A1; AU2016319093B2; CN108884470B; US20180208937A1; US10597674B2; KR20180043838A; EA201890696A1; JP6873979B2; BR112018004779A8; UY36898A; ES2933673T3; MX2018003044A; CN108884470A; BR112018004779A2

Description

Галузь, до якої відноситься винахід

Даний винахід відноситься до молекулярної біології рослин, зокрема до нових поліпептидів

ГФПОД, які надають покращену стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД.

Передумови створення винаходу 4-Гідроксифенілпіруватдіоксигсенази (ГФІПДи) представляють собою ферменти, які каталізують реакцію перетворення пара-гідроксифенілпірувату "(у даному описі скорочено як

ГФП), продукту розпаду тирозину, в гомогентизат (у даному описі скорочено як ГГ), попередник токоферолу і пластохінону в рослинах (Стоцисп М.Р. еї аї. (1997), Теігапеагоп, 53, 20, 6993-7010,

Етпйге еї аї. (2004), Ріапі Рпузіоїоду 134:1388-1400). Токоферол діє як мембраноасоційований антиоксидант. Пластохінон, по-перше, діє як переносник електронів між РБІЇ і комплексом цитохром Бб/, і по-друге, є редоко-кофактором фітоєндесатурази, яка бере участь у біосинтезі каротиноїдів.

До даного часу більше 1000 послідовностей нуклеїнових кислот з різних організмів, які присутні в базах даних МСВІ були анотовані як такі, що кодують передбачуваний білок з доменом ГФПД. Однак для більшості з них не було доказано те, що білок буде мати ферментативну активність ГФПД, ні під час аналізу іп міїго, ні у підході іп ріапіа, також як і те, що такий білок ГФПД може надавати гербіцидну стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД під час експресії в рослині. Деякі білки ГФПД і їх первинні послідовності були описані в попередньому рівні техніки, зокрема білки ГФПД бактерій, таких як Рзхейдотопа5 (Кйеївспі еї аї., Еиг. 9.

Віоспет., 205, 459-466, 1992, МУ/096/38567), Когаіа (МО2011/076889) Зупеспососсив (МО2011/076877), Асідобрасіегішт і Мисійадіпірасіег (М/О2015/022634), РЕПпПодососсив5 (МУО2011/076892), протист, таких як Віерпагізта (У/О02011/076882), еуріархеот, таких як

Рісгорпій5 (УМО02011/076885), водоростей, таких як Спіатудотопав геїппагайї (Ебв2275365;

МО2011145015), 5сепедезтив (М/О2015/022634), рослин, таких як Агабідорвзіз. (М/096/38567,

СЕМВАМКФ АБО47834), морква (УМО 96/38567, СЕМВАМКФ 87257), Амепа займа (М/О2002/046387, УМО2011/068567), пшениця (УМО2002/046387), Вгаспіапа ріагурпуйМа (М О2002/046387), Сепснгиб5 еспіпайнз (МО2002/046387), І оїйшт гідідит (МмО2002/046387),

Еевіиса агипаіпасєеєа (М/О2002/046387), Зеїапа їарей (МО 2002/046387), ЕїІєивіпе іпаїіса (М/О2002/046387), богуойит (М/02002046387, УМО2012021785), кукурудза (ММО2012/021785),

Соріїв їЇаропіса (М/О02006/132270), етпа (М/О2015/022634), або ссавців, таких як миша або свиня, або грибів, таких як Соссісоїде5 (ЗЕМВАМКФО СОЇІТЕКР).

Інгібування ГФІПД призводить до роз'єднання фотосинтезу, недостатності допоміжних світлозбиральних пігментів і, що важливіше за все, деструкції хлорофілу УФ випромінюванням і активними формами кисню (знебарвлювання) через нестачу фотозахисту, в нормі забезпечувану каротиноїдами (Моіті5 й інш. (1995), РіІапі СеїІ 7: 2139-2149). Знебарвлювання фотосинтетично активних тканин призводить до інгібування зростання й загибелі рослини.

Деякі молекули, які інгібують ГФПД (надалі називають як гербіциди, які інгібують ГФПД), і які інгібують перетворення ГФП на ГГ, незважаючи на специфічне зв'язування з ферментом, виявились дуже ефективними гербіцидами.

У даний час більшість комерційно доступних гербіцидів, які інгібують ГФПД належать до одного з наступних, перерахованих нижче хімічних родин: 1) трикетони, наприклад, бензобіциклон |гобто 3-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)бензоїл|-4- (фенілсульфаніл)біцикло|3.2.1|окт-3-ен-2-оні; сулькотрион І(гобто 2-(2-хлор-4- (метилсульфоніл)бензоїл|-1,3-циклогександіоні, о мезотрион тобто 2-(4-(метилсульфоніл)-2- нітробензоїл|-1,3-циклогександіоні| "у даному описі скорочено як М5Т); темботрион |гобто 2-(2- хлор-4-(метилсульфоніл)-3-((2,2,2,-трифторетокси)метилібензоїл|-1,3-циклогександіоні; тефурилтрион І(гобто 2-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)-3-| (тетрагідро-2- фураніл)метокси|метилібензоїл|-1,3-циклогександіоні|; біциклопірон Ігобто 4-гідрокси-3-(2-К(2- метоксиетокси)метил|-6-«трифторметил)-3-піридинілікарбоніл|біцикло|/3.2.1|окт-3-ен-2-оні; фенквінотрион |гобто 2-|((8-хлор-3,4-дигідро-4-(4-метоксифеніл)-3-оксо-2-квіноксалініліІікарбоніл|- 1,3-циклогександіон|!, і, як описано в УМО2007088876, УМО2009016841, УМО2010089993,

МО2010116122, МО2012002096, МО201131658, МО2012136703, УР2013040141,

МО2013080484, МО2014014904, МО2014031971, О0520140106968; 2) дикетонітрили, наприклад, 2-ціано-З-циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл -4- трифторметилфеніл)-пропан-1,3-діон і 2-ціано-1-(4-«(метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3- (1-метилциклопропіл)пропан-1,З-діон; 3) ізоксазоли, наприклад, ізоксафлутол (тобто (5-циклопропіл-4-ізоксазолил)(2- (метилсульфоніл)-4--трифторметил)феніл|метаноні. В рослинах, ізоксафлутол (у даному описі скорочено як ІЄТ) швидко метаболізується до ОКМ, дикетонітрильної сполуки, яка проявляє 60 властивості інгібітора ГФПД;

4) гідроксипіразоли, наприклад, піразоксифен |гобто 2-((4-(2,4-дихлорбензоїл)-1,3-диметил- 1Н-піразол-5-іл|окси|-1-фенілетаноні; бензофенап (гобто 2-((4-(2,4-дихлор-З3-метилбензоїл)-1,3- диметил-1Н-піразол-5-іл|окси|-1-(4-метилфеніл)етаноні; піразолінат Їгобто (2,4- дихлорфеніл)|1,3-диметил-5-|(4-метилфеніл)сульфоніл| окси|-1Н-піразол-4-іл|метаноні; пірасульфотол Їгобто (5-гідрокси-1,3-диметил-1 Н-піразол-4-іл)|2-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)феніл|метанон|і; топрамезон (тобто ІЗ-(4,5-дигідро-3-ізоксазолил)-2-метил-4- (метилсульфоніл)фенілі|(5-гідрокси-1-метил-1 Н-піразол-4-ілуметаноні; толпіралат (тобто 1-(1- етил-4-ІЗ-(2-метоксиетокси)-2-метил-4-(метилсульфоніл)бензоїл|-1 Н-піразол-5-іл|окси|етил- метил-карбонаті; 5) М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, як описано в УМО2011035874 і УО2012123416,

МО2012123409, ЕР2562174, МО2013064459, М/О2013087577, МО2013124238, МО2013124228,

МО2013164333, МО2013037342, МО2014053473, МО2014086737, МО2015007662,

МО2015007632, УМО2015007633 і, як описано в УуУО2013072300, УМО2013072402,

МО2013072450, МО2014184014, МО2014184019, МО2014184058, МО2014192936,

УМО2015052152, УМО2015052178 і М-(1,3,4-оксадіазол-2-ілубензаміди, як описано в

УМО2012126932 і ЕР2562174, ММО2013064459, УМО2013087577, ММО2013124238, МО2013124228,

МО2013124245, МО2013164333, УМУО2013037342, М/О20141053473, МО2014086737,

УМО2015007662, УМО2015007632, УМО2015007633; наприклад, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-«(трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 27); 2-хлор-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід; 2-хлор-3-(етилсульфоніл)-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-4- (трифторметил)бензамід; б) М-(тетразол-5-іл)- або М-(триазол-5-ілларилкарбоксаміди, як описано в МУМО2012028579 і

МО2012123409, М/О2013017559, ЕР2562174, М/О2013064459, М/О2013064457, МО2013087577,

МО2013104705, МО2013124238, МО2013124228, МО2013124245, МО2013164331,

МО2013164333, МО2013174843, МО2013037342, МО2014053473, МО2014086737,

УМО2015007662, УМО2015007632, УМО2015007633; наприклад, 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 4-(дифторметил)-2-метокси-3- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-

Зо метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід і, як описано в МО2013072528, УМО2013076315, ММО2013076316, УМО2013083859, УМО2013092834,

МО2013139760, МО2013144231, МО2014126070, МО2014135654, МО2014184015,

МО2014184016, МО2014184017, МО2014184073, МО2014184074, МО2014192936,

М О2015022284, МО2015052153, ММО2015052173; 7) похідні піридазинону, як описано в М/О02013050421 ії МЛО2013083774, УММО2014154828,

МО2014154882; 8) похідні оксопразину, як описано в /О2013054495; 9) М-(триазол-2-іллуарилкарбоксаміди, як описано в МЛО2013144234, УМО2015007564; 10) триазинони, як описано в УМО2014154829; і 11) піразолони, як описано в ЕР2881387 і ЕР2881388.

Ці гербіциди, які інгібують ГФПД, можуть бути застосовані проти злакових і/або широколистих бур'янистих трав у полях із сільськогосподарськими рослинами, які проявляють метаболічну стійкість, такими як маїс (7еа таувх), рис (Огула Заїїма) і пшениця (Тгйсит аевзіїмит), в яких вони швидко розкладаються (5спці7 еї аІ. (1993), ЕЕВ5 ІеЦег5, 318, 162-166;

Міїснеї! єї а!ї. (2001), Резї Мападетепі 5сіепсе, Мої 57, 120-128; Сагсіа єї а. (2000), Віоспет., 39, 7501-7507; Раїейк еї а). (2001), Ре5і Мападетепі зсієпсе, том 57, 133-142). З метою розширити спектр застосування цих гербіцидів, які інгібують ГФПД, були зроблені деякі зусилля для надання рослинам, зокрема, рослинам без або з недостатньою метаболічною стійкістю, рівня стійкості, прийнятного в польових агрономічних умовах.

За винятком спроби обходу опосередкованого ГФПД вироблення гомогентизату (05 6,812,010), була здійснена надекспресія чутливого ферменту з метою виробити в рослині кількості цільового ферменту, достатні стосовно гербіциду (М/096/38567). Надекспресія поліпептидів ГФОД приводила до кращої досходової стійкості до похідної дикетонітрилу (у даному описі скорочено як ОКМ) - ІЕТ, але рівень стійкості був недостатнім для виникнення стійкості при післясходовій обробці (Маїйгіпде еї аї. (2005), Ре5і Мападетепі Зсіепсе 61: 269- 276).

Третя стратегія полягала у тому, щоб мутувати ГФПД таким чином, щоб одержати цільовий фермент, який поряд із зберіганням його властивостей каталізувати перетворення ГФП на ГГ, є бо менш чутливим до інгібіторів ГФПД, ніж природний поліпептид ГФПД до мутації.

Цю стратегію успішно застосовували у виробництві рослин, стійких до 2-ціано-3- циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл. -4-трифторметилфеніл)-пропан-1,3-діону і до 2-ціано-1-|4- (метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3-(1-метилциклопропіл)упропан-1,3-діону (ЕР496630), двом гербіцидам, що інгібують ГФПД, які належать до родини дикетонітрилів (М/099/24585).

Рго215Іеи, СІуЗЗбОїм, сІуЗЗбІе, і особливо СІуЗЗ3бТгтр (положення мутованих амінокислот зазначені з посиланням на Рзепдотопах Пиогезсеп5 дикого типу поліпептид ГФПД, який відповідає 5ЕО ІЮ МО: 1 відповідно до даного винаходу) були ідентифіковані як мутації, які відповідають за підвищену стійкість до обробки цими дикетонітрильними гербіцидами.

Зовсім недавно введення гена ГФПД Рзепйдотопазх Пиогезсеп5 в пластидний геном тютюну і соєвих бобів показало більшу ефективність, ніж ядерна трансформація, надаючи стійкість при післясходовій обробці за допомогою ІЄТ (Ошоиптапгіеї еї аї. (2007), Ріапі Віоїесппої 9.5(1):118- 33).

У заявці М/О 2004/024928, винахідники намагались збільшити біосинтез пренілхінону (наприклад, синтез пластохінонів, токоферолів) в клітинах рослин шляхом збільшення припливу попередника ГФП в клітини цих рослин. Цього досягали шляхом приєднання синтезу зазначеного попередника до "шикиматного" шляху через надекспресію ферменту префенатдегідрогенази (ПДГ). Вони також зазначали, що трансформування рослин геном, що кодує фермент ПДГ і геном, що кодує фермент ГФПД, робить можливим підвищення стійкості згаданих рослин до гербіцидів, які інгібують ГФПД.

У заявці УМО 2009/144079 розкриті послідовності нуклеїнових кислот, що кодують гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (ГФПД) з конкретними мутаціями в положенні 336 білка ГФПД

Рзейдотопах Пиогезсеп5 і їх застосування для одержання рослин, стійких до гербіцидів, які інгібують ГФПД.

У заявці ММО 2002/046387 були ідентифіковані декілька доменів поліпептидів ГФПД, що походять із рослин, які можуть бути суттєвими для надання стійкості до різних гербіцидів, що інгібують ГФПД, але не представлені ані дані іп ріапіа, ані біохімічні дані, що підтверджують вплив описаних функцій доменів.

У заявці МО 2008/150473 була наведена у приклад комбінація з двох відмінних механізмів стійкості - модифікованого гена Амепа займа, який кодує мутантний фермент ГФПДдД і

Зо монооксигенази кукурудзи СУРАБ5О (ген п5Пї) - з метою одержати покращену стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД, але не були розкриті дані, що показують синергетичні ефекти, які базуються на комбінації обох білків.

Крім того, розкритий спосіб створення рослин, стійких до гербіцидів, які інгібують ГФПД, шляхом надекспресії не тільки гена, що кодує стійку ГФПД, як наприклад, з Амепа заїїма (052011/0173718) або Агабідорзі5 (ММО2013/064964, УМО2014/177999), а також в комбінації з деякими генами рослин, що кодують білок Н5Т (гомогентизатсоланезилтрансфераза). Тим не менше, рівень стійкості до деяких вибраних гербіцидів, що інгібують ГФПД був доволі обмеженим.

У заявках УМО 2011/094199 і О052011/0185444 була оцінена стійкість декількох сотень ліній соєвих бобів дикого типу до інгібітора ГФПД - ІРТ. Дуже мало ліній показували необхідний рівень стійкості до гербіцидів. Був ідентифікований передбачуваний ОТГ. (локус кількісних ознак), що відповідає за стійкість. На цій ділянці геному як основної ознаки, що відповідає за покращену стійкість до гербіциду, що інгібує ГФПД був ідентифікований ген, що кодує транспортер АВС.

Однак трансгенні рослини, які експресують ідентифіковані гени, не показували ніякого покращення стійкості до протестованих гербіцидів, що інгібують ГФПД.

У заявках МО 2010/085705 ії 005 2014/0053295 розкриті деякі мутанти поліпептиду ГФПД

Амепа займа. У заявці М/О 2010/085705 було показано, що деякі з варіантів проявляли покращену стійкість іп міго до трикетону "Мезотрион" (у даному описі скорочено як М5Т), тим не менше, тільки незначна кількість мутантів були експресовані в рослинах тютюну. Крім того, жодна з рослин тютюну, що експресують ці мутанти, не проявляла підвищеної стійкості до М5Т або ІЕТ, у порівнянні з рослинами тютюну, що експресують ген ГФПД дикого типу Амепа 5аїїма. У заявці О52014/0053295 описано, що декілька мутантів ГФПД Амепа 5аїїма були експресовані в рослинах соєвих бобів і мали гарний рівень стійкості до М5Т, як відомо з рослин, що експресують ген ГФПД Амепа займа дикого типу. Тим не менше, інші гербіциди, такі як темботрион або ІТ індукували значно більше високе ушкодження листя в цих рослинах соєвих бобів.

В 05 2012/0042413 описані мутантні поліпептиди ГФПД маїсу, що мають активність ГФПД, а також які демонструють певну нечутливість до щонайменше одного гербіциду, що інгібує ГФПД і крім того, запропонований певний набір мутацій в різних положеннях поліпептидів ГФПжД і бо насамкінець розкриті біохімічні дані, а також рівні стійкості рослин, що містять деякі з таких мутованих поліпептидів ГФПД. В ЕР 2453012 були описані деякі мутанти поліпептидів ГФПД; тим не менше, не представлена підвищена стійкість описаних мутантів іп ріапїа до деяких гербіцидів, що інгібують ГФПД.

У заявці М/О2014/043435 були описані молекули рекомбінантних нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди ГФПД Рзейдотопаз 5рр., що складаються з амінокислотної послідовності, що містить пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІО МО:1; або пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО:1 і триптофан в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО:1; або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО, серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО:1, треонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 339 5БО ІЮ МО:1, і глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮО МО:1; або триптофан в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 188 5ЕО

ІО МО:1 ії триптофан в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІО МО:1; або пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 ЗЕО ІО МО: 1, серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІО МО:1, і глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; або пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО, триптофан в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО

ІО МО-1, аланін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 339

ЗБО ІЮ МО:1, і глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1.

Описані в даний час і частково запущені у продаж гербіциди, які інгібують ГФПД, діють як повільно зв'язувальні або повільно, міцно зв'язувальні інгібітори (див. Могтізоп (1982) Тгтепав

Віоспет. Зсі. 7, 102-105). Ці інгібітори зв'язуються повільно (тобто з невеликою швидкістю асоціації, Коп), але не ковалентно з поліпептидом ГФПД (тобто вони здійснюють залежне від часу інгібування), і вивільняються дуже повільно (тобто з виключно низькою швидкістю дисоціації, КОїї) внаслідок їх надзвичайно сильної взаємодії з ферментом.

Ці інгібітори зв'язуються настільки сильно, що стають можливими стехіометричні титрування з ферментом.

Все в більшому ступені стає очевидним те, що повільно зв'язувальні або повільно, міцно зв'язувальні інгібітори є не тільки виключно сильними інгібіторами ГФПД, але також мають ознаки, що роблять їх привабливими агрохімічними речовинами для боротьби з бур'янистими травами. Повільна швидкість дисоціації підсилює ефективність інгібітора до такого ступеню, що в ідеальному випадку достатньо всього однієї молекули інгібітора на активний сайт поліпептиду

ГФПД для повного інгібування його активності й збереження цього рівня інгібування протягом тривалого періоду часу навіть за відсутності вільних молекул інгібітора в рослинній клітині. Це зумовлює низькі норми застосування цих інгібіторів, необхідні для боротьби з небажаними бур'янистими травами на площах вирощування сільськогосподарських культур.

Властивості повільно зв'язувальних або повільно, міцно зв'язувальних інгібіторів мають перевагу в тому випадку, коли метою є досягнення інгібування ГФПД і гербіцидна активність.

Тим не менше, ці самі властивості є більшим недоліком у випадку, коли необхідно створити поліпептиди ГФПД, стійкі до цих інгібіторів.

Мутації в поліпептиді ГФПД, які тільки знижують афінність інгібітора до ферменту (Кі) не можуть повністю подолати інгібування ГФПД, оскільки все ще може мати місце зв'язування інгібітора й інгібування поліпептиду ГФІД, тому, досягнутий рівень інгібування буде підтримуватися протягом тривалого періоду часу, навіть за відсутності вільного інгібітора в рослинній клітині. Крім того, частково комерційно доступні гербіциди, які інгібують ГФПД, належать до структурно відмінних хімічних класів, таких як трикетони, дикетонітрили, ізоксазоли, гідроксипіразоли, М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2- іл/бензаміди, М-(тетразол-б-ілу- або М-(триазол-5-іллуарилкарбоксаміди, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-іл), триазинони і піразолони. Наявні у даний час, описані в рівні техніки поліпептиди ГФПД демонструють доволі вузький діапазон стійкості до структурно відмінних гербіцидів, що інгібують ГФПД.

Завдяки наведеним вище кінетичним властивостям всіх описаних у даний час і частково наявних у продажі гербіцидів, які інгібують ГФПД, до теперішнього часу не були оприлюднені рослини, стійкі до гербіцидів, які інгібують ГФПД з повною стійкістю до гербіцидів, які інгібують бо ГФПД, незважаючи на чисельні зусилля з їх створення.

Суть винаходу

У даному винаході описані поліпептиди ГФПД і рослини, які їх містять, що проявляють повну стійкість до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, що належать до різних хімічних класів. Виявилось, що для створення таких поліпептидів ГФПД з підвищеною до максимуму і широкою стійкістю до деяких класів гербіцидів, які інгібують ГФПД, важливо знизити афінність до поліпептиду ГФПД (Кі), відносно відповідного(их) гербіцидів, які інгібують ГФПД і одночасно забезпечити більш високу швидкість дисоціації (Кої) повільно зв'язувального або повільно, міцно зв'язувального інгібітора, як відомо з поліпептидів ГФПД дикого типу і деяких мутантних поліпептидів ГФПД, щоб дося!ти високого рівня стійкості інгібітора.

В даному винаході ця задача була вирішена за допомогою розробки набору поліпептидів

ГФПД, які або не мають, або мають тільки суттєво знижену афінність до гербіцидів, які інгібують

ГФПД й, у той самий час, швидкість дисоціації гербіцидів, які інгібують ГФПД, збільшується до такого ступеню, що гербіциди, які інгібують ГФПД більше не діють як повільно зв'язувальні або повільно, міцно зв'язувальні інгібітори, а замість цього стають повністю оборотними інгібіторами.

В даному винаході запропоновані композиції і способи одержання нового набору поліпептидів ГФПД, що мають зазначені вище характеристики (тобто не мають або мають тільки суттєво знижену афінність до гербіцидів, які інгібують ГФПД, підвищену швидкість дисоціації гербіцидів, які інгібують ГФПД ферменту; гербіциди, які інгібують ГФПД більше не діють як повільно зв'язувальні або повільно, міцно зв'язувальні інгібітори, а замість цього стають повністю оборотними інгібіторами). Композиції містять поліпептиди ГФПД і виділені, рекомбінантні або химерні молекули нуклеїнових кислот, що кодують такі поліпептиди ГФПД, вектори і клітини-хазяї, що містять ці молекули нуклеїнових кислот. Композиції також містять антитіла до цих поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть бути використані в конструкціях

ДНК або експресійних касетах для трансформації і експресії в організмах, включаючи мікроорганізми і рослини. Нуклеотидні послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, розробленими для експресії в організмі, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроорганізм або рослину.

Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують гербіцидні стійкі поліпептиди

Зо ГФПД, включаючи молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид ГФПД, який містить (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 ЗЕО ІЮ

МО:1, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕСО ІО МО:ї1, ії (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮО МО:1 і, необов'язково, одну або декілька додаткових амінокислотних замін в положеннях, що відповідають амінокислотним положенням 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 5ЕО ІЮО МО: 1, включаючи поліпептиди ГФПД, викладені у будь-якій із ФЕО ІЮ МО:3-108, а також його фрагменти.

Композиції також містять трансформовані рослини, рослинні клітини, тканини і насіння, стійкі до гербіцидів-інгібіторів ГФОПД завдяки введенню послідовності нуклеїнових кислот згідно з винаходом в геном рослин, рослинних клітин, тканин і насіння. Введення послідовності дозволяє застосовувати гербіциди, які інгібують ГФПД на рослини для селективного знищення чутливих до інгібітора ГФПД бур'янистих трав або інших нетрансформованих рослин, а не трансформованого організму. Послідовності можуть також бути використані як маркер для селекції рослинних клітин, вирощуваних в присутності одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД.

Додатково запропоновані способи ідентифікації поліпептидів ГФПД з активністю гербіцидної стійкості до інгібітора ГФПД.

Композиції і способи згідно з винаходом придатні для створення організмів з посиленою стійкістю до гербіцидів, які інгібують ГФПД. Ці організми і композиції, що містять організми придатні для сільськогосподарських цілей. Рослини або насіння, що містять послідовність нуклеїнових кислот, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом можуть бути вирощені в полі й зібрані для одержання рослинного продукту. Композиції згідно з винаходом також є застосовними для виявлення присутності стійких до гербіцидів поліпептидів, які інгібують ГФПД, або нуклеїнових кислот в продуктах або організмах.

Короткий опис фігур

На Фігурі 1 представлена спрощена схема зв'язаного аналізу активності ГФПД, застосовного в даному винаході для визначення ферментативної активності примірних поліпептидів ГФПД.

На Фігурі 2 представлені примірні кінетичні зміни поглинання при 320 нм (Аб5320) у зразках необроблених екстрактів поліпептиду ГФПД дикого типу і нокаутного, спостережуваного з 200 бо МКМ ГФП і 0, 4 або 13 мкМ Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4-

(трифторметил)бензамід) згідно з Прикладом З у зв'язаному аналізі активності ГФПД. Нокаутний поліпептид ГФПД одержували шляхом заміни гістидину на аланін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 162 5ЕО ІЮ МО:1. Це положення добре відомо своєю важливістю з причини його участі в координованому зв'язуванні атома заліза в активній ділянці поліпептиду ГФПД (зЗеїте еї а. (1999), Бігисішиге, 7, 977-988).

На Фігурі З представлені примірні кінетичні зміни поглинання при 320 нм (Аре320) очищеного мутантного поліпептгиду ГФІПД, що відповідає 5ЕО ІО МО:17 згідно з Прикладом 3, спостережуваного при високій концентрації субстрату і з 0, 48, 240 або 1200 мкМ Спол. 2 (2- метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3--сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід) у зв'язаному аналізі активності ГФПД. Позірну кінетичну константу (Карр) визначали як зміну сигналу у часі (адаема АБр5ь320/хв) з обмеженим часовим інтервалом.

На Фігурі 4 зображені дані з примірного визначення Кі з очищеним мутантним поліпептидом

ГФПД, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:17, з різними концентраціями інгібітора і субстрату (ГФП) шляхом припасування згідно з моделлю конкурентного інгібування: а) Кінетичні зміни поглинання при 320 нм із спливанням часу (дейа Ар5320/хв) в присутності 0-0.0012 М Спол. 2 при заданій концентрації субстрату, згідно з Прикладом 3; б) Кінетичні зміни поглинання при 320 нм із спливанням часу (дейа Ар5320/хв) в присутності 0-0.0012 М Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід) при заданій концентрації субстрату, згідно з Прикладом 3; в) Кінетичні зміни поглинання при 320 нм із спливанням часу (дека Арз320/хв) в присутності 0-0.0012 М М5Т при заданій концентрації субстрату, згідно з Прикладом 3; г) Кінетичні зміни поглинання при 320 нм із спливанням часу (дека АБ5320/хв) в присутності 0-0.0012 М ОКМ при заданій концентрації субстрату, згідно з Прикладом 3.

Все примірні поліпептиди ГФПД, які наведені в Таблицях 2, 3, 4 і 5 були виміряні й проаналізовані, як показано, наприклад, з ЗЕО ІО МО:17 на Фігурі З 8. 4.

Докладний опис винаходу

Надалі даний винахід буде описано більше докладно з посиланнями на додані фігури, на яких представлені деякі, але не всі варіанти здійснення винаходу. Безперечно, ці винаходи можуть бути здійснені у багатьох різних формах і не повинні бути розтлумачені як такі, що обмежуються варіантами, наведеними у даній заявці; точніше, ці варіанти здійснення представлені таким чином, щоб це розкриття задовольняло застосовним вимогам закону. Одні й ті ж самі номерні позначення позначають ті ж самі елементи по всьому опису.

Багато модифікацій та інших варіантів здійснення винаходів, викладених у даній заявці, можуть прийти в голову спеціалісту у даній галузі техніки, до якої відносяться ці винаходи, маючи перевагу стосовно ідей, представлених у наведених вище описі й доданих кресленнях.

Тому слід розуміти, що винаходи не повинні обмежуватися розкритими конкретними варіантами здійснення, і що модифікації та інші варіанти здійснення призначені для включення в обсяг доданої формули винаходу. Хоча в даній заявці використані конкретні терміни, їх застосовують тільки у загальному і описовому змісті, а не з метою обмеження.

Огляд

Було розпочато декілька спроб для надання рослинам агрономічно прийнятного рівня стійкості до широкого спектра гербіцидів, які інгібують ГФІПД, включаючи обхід ГФПД опосередкованого вироблення гомогентизату (5 6,812,010), надекспресію чутливого ферменту з метою виробити в рослині достатню кількість цільового ферменту відносно гербіциду (М/О96/38567), і мутацію ГФПД, щоб одержати цільовий фермент, який при зберіганні його властивостей каталізувати перетворення ГФП в гомогентизат, є менш чутливим до інгібіторів

ГФПД, ніж природна ГФПД до мутації.

Незважаючи на ці успіхи, одержані для розробки рослин, які проявляють стійкість до декількох описаних вище гербіцидів, що інгібують ГРПД, все ж таки необхідно розробити і/або покращити стійкість рослин до більш нових або до декількох різних гербіцидів, що інгібують

ГФПД, які належать до різним хімічних класів, особливо до гербіцидів, які інгібують ГФПД, які належать до таких класів як трикетони (наприклад, бензобіциклон, сулькотрион мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (наприклад, ізоксафлутол), гідроксипіразоли (наприклад, піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М- (1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди (наприклад, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«-трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М- (тетразол-б5-іл)- або /М-(триазол-5-іл)л'арилкарбоксаміди (наприклад, 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід), 4-(дифторметил)-2-метокси-3- бо (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід); 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-

метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, трикетони, М-(триазол-2-ілл'арилкарбоксаміди, триазинони і піразолони.

Таким чином, даний винахід забезпечує покращені композиції і способи, які регулюють гербіцидну стійкість до інгібітора ГФПД. Гербіциди, які інгібують ГФПД, такі як гербіциди з класу трикетонів (наприклад, бензобіциклон, сулькотрион мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (наприклад, ізоксафлутол), гідроксипіразоли (наприклад, піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл/бензаміди (наприклад, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3--сметилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М-(тетразол-5-іл)у- або М- (триазол-5-іллуарилкарбоксаміди (наприклад, 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1 7"); 2-(метоксиметил)-3- (метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-«(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-іл)л'арилкарбоксаміди, триазинони і піразолони мають чудову гербіцидну ефективність проти широкого спектра економічно значущих однодольних і дводольних однорічних бур'янистих трав. Активні речовини також мають гарну здатність знищувати багаторічні шкідливі рослини, з якими важко вести боротьбу і які розповсюджуються з кореневищ, кореневих стрижнів або інших багаторічних органів. В рамках даного винаходу під поняттям "гербіцид" слід розуміти як гербіцидно активну речовину саму по собі або таку речовину, яка поєднана з добавкою, яка змінює її ефективність, такою як, наприклад, підвищувальний його активність агент (синергетичний агент), або обмежувальний його активність агент (сафенер). Гербіцид також може містити тверді або рідкі ад'юванти або носії зазвичай використовувані в технології приготування (наприклад, природні або регенеровані мінеральні речовини, розчинники, диспергатори, змочувальні агенти, агенти для надання клейкості, емульгатори, агенти посилення зростання тощо), а також один або більшу

Зо кількість інших гербіцидів і/або один або більшу кількість пестицидів (наприклад, інсектицидів, віруцидів, мікробіцидів, амебоцидів, пестицидів, фунгіцидів, бактерицидів, нематицидів, молюскоцидів тощо).

Способи містять трансформування організмів нуклеотидними послідовностями, що кодують ген стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД згідно з винаходом або введення іншим чином таких генів стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД в організми, які їх не містять (наприклад, спарюванням, злиттям клітин, або схрещуванням організмів, що містять введений ген стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД згідно з винаходом з організмами, які його не містять і одержанням потомства, яке містить такий ген). Нуклеотидні послідовності згідно з винаходом придатні для одержання рослин, які проявляють підвищену стійкість до гербіцидів, які інгібують

ГФПД, зокрема підвищену стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, або фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, або толпіралат), /М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)/бензаміди, /- М-(1,3,4-оксадіазол-2- іл/бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М-(тетразол-5-іл)у- або М- (триазол-5-іля'арилкарбоксаміди (переважно 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"; 2-(метоксиметил)-3- (метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-«(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони.

Експресія гена стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД згідно з винаходом може також привести до стійкості стосовно "гербіцидів похідних кумарону" (описано в УМО 2009/090401,

УМО2009/090402, УМО 2008/071918, УМО 2008/009908). У цьому зв'язку, будь-який з генів стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД згідно з винаходом може також бути експресований в рослині, яка також експресує химерний ген гомогентизатсоланезилтрансферази (Н5Т) або ген мутованої

Н5ЗТ, як описано в УМО 2011/145015, УМО 2013/064987, УМО 2013/064964, або ММО2010/029311, для одержання рослин, стійких до гербіцидів, які інгібують НУТ. Як застосовують у даному описі 60 "гербіцид похідна кумарону" або "гербіцид, що інгібує НТ" охоплює сполуки, які підпадають під номенклатуру ІЮПАК 5Н-тіопірано|4,3-бБ|Іпіридин-8-ол, 5Н-тіопіраноїЇ3,4-б|піразин-8-ол, оксатиїної|5,6-б|піридин-4-ол, і оксатиїної5, 6-б|піразин-4-ол.

Таким чином, під геном "стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД" відповідно до винаходу слід розуміти ген, що кодує поліпептид, який надає клітині або організму здатність переносити більше високі концентрації гербіциду, що інгібує ГФПД, ніж така ж сама клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити деяку концентрацію гербіциду, що інгібує ГФПД протягом більш тривалого періоду часу, ніж така ж сама клітина або організм, які не експресують білок, або ж який надає клітині або організму здатність здійснювати фотосинтез, рости і/або розмножуватися з меншим ушкодженням або інгібуванням зростання, ніж спостережувані у такої самої клітини або організму, які не експресують подібний білок. "Поліпептид стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД" містить поліпептид, який надає клітині або організму здатність переносити більш високі концентрації гербіцидів, які інгібують ГФПД, ніж така ж сама клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити певну концентрацію гербіцидів, які інгібують ГФПД протягом більше тривалого періоду часу, ніж така ж сама клітина або організм, які не експресують поліпептид, або ж який надає клітині або організму здатність здійснювати фотосинтез, зростати і/або розмножуватися з меншим ушкодженням або інгібуванням зростання, ніж спостережувані у такої ж самої клітини або організму, які не експресують подібний поліпептид.

Термін "поліпептид" містить у собі білки, такі як ферменти, антитіла і поліпептиди середньої довжини і короткі пептиди аж до довжини амінокислотної послідовності нижче десяти.

Термін "фермент" в даному винаході означає будь-який поліпептид, який каталізує реакцію, в якій пара-гідроксифенілпіруват перетворюється в гомогентизат. Він містить у собі природні ферменти, а також варіанти ферментів і їх похідні. Він також містить будь-який фрагмент такого ферменту, а також варіанти, спроектовані шляхом вставки, делеції, рекомбінації і/або будь- якого іншого методу, що призводить до ферментів, які відрізняються своєю амінокислотної послідовністю з природним ферментом або варіантами ферменту. Він також містить молекули білка з посттрансляційними і/або хімічними модифікаціями, наприклад, глікозилювання, гамма- карбоксилювання і ацетилювання, будь-який молекулярний комплекс або злитий білок, який містить один із згаданих вище білків.

Зо Терміни "варіант поліпептиду" або "мутантний поліпептид" означають будь-яку молекулу поліпептиду, одержану мутагенезом, переважно шляхом сайт-спрямованого або випадкового мутагенезу із зміненою амінокислотною послідовністю у порівнянні з відповідною послідовністю дикого типу. Під поняттями "стерпність", "стійкість" або "резистентний" слід розуміти або здатність витримати конкретне застосування гербіциду, що інгібує ГФПД, або здатність здійснювати основні клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка або дихання і розмноження таким способом, який явно не відрізняється від необроблених клітин або організмів, або ж здатність не мати значної різниці у врожайності або навіть мати покращену врожайність у рослин, оброблених гербіцидом, що інгібують ГФПД у порівнянні з такими ж самими рослинами, необробленими таким самим гербіцидом (але де бур'янисті трави були видалені або усунені механізмом, який відрізняється від застосування гербіциду, що інгібує

ГФПД, як наприклад, способами, описаними у заявці М/О 2011/100302, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання).

Крім надання клітині стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД, послідовності нуклеїнових кислот ГФПД згідно з винаходом кодують поліпептиди, що мають активність ГФПД, тобто які каталізують реакцію, в якій пара-гідроксифенілпіруват (ГФП) перетворюється на гомогентизат.

Каталітична активність поліпептиду ГФПД може бути визначена різними відомими у даній галузі методами. В заявках УМО2009/144079 і МО 2014/043435 описані різні придатні методи скринінгу.

Ферментативна активність поліпептидів ГФПД може бути виміряна будь-яким методом, який дозволяє або визначити зменшення кількості субстратів ГФП або ОС», або виміряти накопичення будь-яких продуктів, одержаних з ферментативної реакції, тобто гомогентизат або Со».

Зокрема, активність ГФПД може бути виміряна за допомогою метода, описаного в

МО2009/144079; Сагсіа єї а!. (1997), Віоснет. 9. 325, 761-769; Сагсіа єї а). (1999), Ріапі Рнузіо). 119, 1507-1516; або в М/О2012/021785, які включені в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.

Для цілей даного винаходу "еталонний" поліпептид ГФПД (або ген ГФПД, що кодує такий поліпептид) представляє собою будь-який поліпептид ГФПД або нуклеїнову кислоту, 3 якими порівнюють поліпептид ГФПД або нуклеїнову кислоту ГФПД згідно з винаходом. В цілях опису поліпептиди ГФПД відповідно до даного винаходу, терміни "білок" і "поліпептид" застосовують взаємозаміно. Цей еталонний поліпептид ГФПД може бути природною рослинною, 60 бактеріальною або тваринною ГФПД, або може представляти собою мутований поліпептид

ГФПД, відомий з рівня техніки, як наприклад, мутанти РІР2151І і РІСЗЗБЕ, Публікації міжнародної заявки УМО 2009/144079, або ж може бути будь-яким з білків РІНРР;о;емо33, РІНРРОемоз6,

РІНРРо;емо37, РІНРРОемо40, або РІНРРОемо41 з заявки УМО2014/043435;. РІНРРОемо41 викладений у даній заявці як 5ЕБЕО І МО:2. Такий еталонний поліпептид ГФПД можна застосовувати для визначення того, чи має поліпептид або нуклеїнова кислота ГФПД згідно з винаходом особливою відповідною властивістю (наприклад, покращеною, порівняною або зниженою стійкістю до гербіциду, що інгібує ГФПД або ферментною активністю поліпептиду

ГФПД; покращеною, порівняною або зниженою експресією в клітині-хазяїні; покращеною, порівняною або зниженою стабільністю білка тощо).

В різних варіантах здійснення даного винаходу гербіцидний стійкий до інгібітора ГФПД поліпептид, що кодується нуклесїновою кислотою (включаючи його виділені, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять їх нуклеїнову кислоту, поліпептиди ГФПД і композиції, що кодуються нуклеїновою кислотою, а також способи застосування поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою для підвищення стійкості рослини до гербіцидів, які інгібують ГФПД, зокрема підвищення стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М- (1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М- (тетразол-б-іл)- або /М-(триазол-5-іл)л'арилкарбоксаміди (переважно /2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід), похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони) має (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 ЗЕО ІЮ МО:1, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає

Зо амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО:1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮО МО:1 і, необов'язково, одну або декілька додаткових амінокислотних замін в положеннях, що відповідають амінокислотним положенням 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 5ЕО ІО МО:1, включаючи білки ГФПД, викладені в будь-який ЗЕО ІЮ МО5:3-108. Під "що відповідає" слід розуміти положення нуклеотиду або амінокислоти відносно такого положення в 5ЕО ІЮ МО:1, коли дві (або більша кількість) послідовності вирівняні із застосуванням стандартних алгоритмів вирівнювання.

Термін "положення" в полінуклеотиді або поліпептиді відноситься до конкретних поодиноких основ або амінокислот в послідовності полінуклеотиду або поліпептиду відповідно. Термін "сайт" в полінуклеотиді або поліпептиді відноситься до певного положення або області в послідовності полінуклеотиду або поліпептиду відповідно. Термін "полінуклеотид" відповідає будь-якому генетичному матеріалу будь-якої довжини і будь-якій послідовності, яка містить одноланцюгові й дволанцюгові молекули ДНК і РНК, включаючи регуляторні елементи, структурні гени, групи генів, плазміди, цілі геноми і їх фрагменти.

В одному варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335

ЗЕО ІЮО МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮ МО/1, і де зазначений поліпептид ГФПД є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом), що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, складається з амінокислотної послідовності, що містить

(а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335

ЗЕО ІЮ МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1, й що додатково містить і. метіонін, треонін, серин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 204 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або і. лізин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії. аргінін, лізин, глутамін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їм. аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м. аргінін, лейцин, глутамінова кислота, пролін або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 ЗЕО ІЮ МО 1; і/або мі. серин, гістидин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 310 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі. аргінін, метіонін або гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або мії. гістидин, аланін, фенілаланін, валін або гліцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їх. пролін, гістидин, серин, ізолейцин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 331 5ЕО ІЮ МО:1; і/або х. валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО

ІО МО:1; і/або хі. глутамінова кислота, аргінін, аланін або треонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 339 5ЕО ІЮ МО:1; і/або хії. аргінін, глутамін, метіонін, глутамінова кислота, гліцин, лейцин, або валін в

Зо амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО 1; і/або хії. глутамін, пролін, або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЗЕО ІЮ МО:1; і/або хім. лізин, аргінін, метіонін, аланін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 ЗЕО ІЮ МО:1.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що містить (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335

ЗЕО ІЮ МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1, й що додатково містить і лейцин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО ІЮ МО:1; і/або і. аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії. аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ім. глутамінова кислота або серин вв амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або м. аргінін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі. гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330

ЗЕО ІЮ МО:1; і/або мі. валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО

ІО МО:1; і/або мії. аргінін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їх. глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344

ЗЕО ІЮ МО:1; і/або х. лізин, валін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО:1.

ЗЕО І МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО й що додатково містить і. лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО

ІО МО:1; і/або і. аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії. гліцин або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ім. глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м. аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО

ІО МО:1; і/або мі. гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330

ЗЕО І МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО 1 й що додатково містить () гліцин або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному

БО положенню 268 5ЕО ІЮ МО1, (ї) глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО1, (ії) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО

ІО МО:1; і (ім) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО

ІО МО,

ЗЕО І МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1 й що додатково містить (Ї) лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО

ІО МО: 1, (ї) а гліцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268

ЗЕО І МО, (ії) глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО1, (ім) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО

ІО МО:1; і (у) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО

ІО МО.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом), що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, складається з амінокислотної послідовності, що містить (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335

ЗЕО І МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1 й що додатково містить

Зо (Ї) лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО

ІО МО: 1, (ї) лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264

ЗЕОІО МО: 1, (ії) гліцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268

ЗЕО І МО, (м) глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО1, (м) валін або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; (м) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344

ЗЕОІЮ МО: 1, і (мії) метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345

ЗЕО І МО-1.

ЗЕО І МО, (б) гістидин або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1 й що додатково містить () лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264

ЗЕОІО МО: 1, (її) аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268

ЗЕО І МО, (ії) глутамінова кислота в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному 60 положенню 270 5ЕО ІЮ МО1,

(ім) аргінін в амінокислотному положенні 315, що відповідає амінокислотному положенню

ЗЕОІЮ МО: 1, (у) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО

ІО МО:1; (м) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344

ЗЕОЮ МО: 1, і (мії) метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345

ЗЕО ІЮ МО.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що містить а. пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 ЗЕ

ІО МО-1, і б. гістидин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІО МО:1, або в. аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ

МО-1, і г. серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить: а. пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО

ІО МО:1; б. гістидин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО:1 або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ

МО:1; в. серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮО МО:1; і г. гістидин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 5ЕО ІЮ МО-1.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що містить: а. пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 ЗЕ

ІО МО:1; б. гістидин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮО МО:1, або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ

МО:1; в. серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮО МО:1; і г. валін в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1.

В іншому варіанті здійснення, поліпептид ГФПД відповідно до даного винаходу (включаючи що кодує його нуклеотидну послідовність, і його рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом) що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що містить: а. пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО

ІО МО:

БО б. гістидин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО:1 або аспарагінова кислота в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ

МО:1; в. серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1; і г. валін в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО:1.

В Таблиці 1 представлені відповідні положення амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом ГФПД Рвзтепйдотопах Пиогезсеп5 дикого типу (ЗЕО ІО МО:1), де варіанти поліпептиду ГФПД згідно з винаходом містять три або більшу кількість амінокислотних замін.

Якщо чітко не зазначене інше, то обміни у відповідних положеннях амінокислот завжди відносяться до еталонного поліпептиду ГФПД Рзеийдотопах Пиогезсеп5 дикого типу, який 60 відповідає ЗЕО ІЮ МО:1.

Таблиця 1:

Огляд примірних амінокислотних обмінів відносно поліпептиду ГФПД, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1 93611111 11111111 016РА7777777777777777777171

Амінокислоти згадуються у даній заявці, використовуючи назву амінокислоти, абревіатуру з трьох букв або абревіатуру з одною буквою. В наведеній нижче таблиці зазначений перелік стандартних амінокислот разом з їх скороченнями.

Аспарагновакислотаїд//-/:/ 10111111 ФАР: С: С:

Пволейцин.о/////7771111111111Т1 Пе

ШЮФролін.//////771111111111111111С1Р1111111111111|РЮ777777771

Глутамн.о/////777711111111111116111111111111 (ан

Аргінін 77111111 ТА 77777777

Спеціалісту у даній галузі техніки добре відомо, що генетичний код є виродженим, тобто більше ніж один триплет кодону може кодувати одну й ту ж саму амінокислоту. Відповідно, представлені у даному випадку амінокислотні послідовності можуть бути створені за допомогою альтернативних послідовностей, які використовують різні кодони для кодування однієї і тієї ж самої амінокислотної послідовності.

В іншому варіанті здійснення, послідовність поліпептидів ГФІПД згідно з винаходом щонайменше на 53 95, щонайменше 60 95, щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 91 95,

щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 965, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій тут як ХЕО ІЮ МО:1.

Примірні послідовності ГФПД, які можуть бути модифіковані відповідно до даного винаходу, містять послідовності від бактерій, зокрема, від типу Роепдотопавх 5рр., більше переважно від

Резепдотопавз Пиоогебсеп5, Рвзепдотопа5 рийда, Рбепдотопаб5 аегпидіпоза, Рзейдотопав

Іевіовівгопі (Сотатопазг іевіозівгопі).

Для цілей даного винаходу, поліпептид ГФПД згідно з винаходом може також включать інші модифікації, наприклад, в яких деякі амінокислоти (наприклад, амінокислоти 1-17) були замінені, додані або видалені в цілях клонування, для створення злиття транзитного пептиду тощо, який зберігає активність ГФПД, тобто здатність каталізувати перетворення пара- гідроксифенілпірувату на гомогентизат, або може бути будь-яким поліпептидом ГФПД, який може бути додатково покращений. Наприклад, поліпептид ГФПД, який може бути додатково покращений за допомогою описаних у даній заявці модифікацій, може представляти собою варіант ГФПД, одержаний з Рзхейдотопах Пиогезсеп5, викладений у даному випадку як будь-які

ЗЕО ІО МОз5:3-108.

У переважному варіанті здійснення, поліпептиди ГФПД згідно з даним винаходом і які є стійкими до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД є еквівалентними 5ЕО ІЮ

МО:1 (Рзхейдотопах Пиогезсеп5) окрім амінокислот, замінних відповідно до даного винаходу, тобто відповідний поліпептид ГФПД є ідентичним 5ЕО ІЮО МО:1, але який має (а) пролін в амінокислотному положенні 335 5ЕО ІЮ МО1, (б) гістидин або аспарагінову кислоту в амінокислотному положенні 336 5ЕО ІЮ МО-1, і (в) серин в амінокислотному положенні 337 ЗЕО ІЮ МО:1.

В іншому переважному варіанті здійснення, поліпептиди ГФІПД відповідно до даного винаходу, які є стійкими до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД є еквівалентними 5ЕО ІЮ МО:1 (Рзейдотопазх Пиогезсеп5) окрім амінокислот, замінних відповідно до даного винаходу, тобто, відповідний поліпептид ГФПД є ідентичним ЗЕО ІЮ МО:1, але має одну або більшу кількість замін у відповідному амінокислотному положенні згідно з наведеною

Зо вище Таблицею 1, за умови, що пролін існує в положенні 335 ЗЕО ІЮО МО:1, гістидин або аспарагінова кислота існують в положенні 336 5ЕО ІЮ МО, а серин існує в положенні 337 5ЕО

ІО МО-1.

В іншому переважному варіанті здійснення, ГФІПД поліпептиди відповідно до даного винаходу що є стійким до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД є еквівалентними 5ЕО ІЮ МО:1 (Рзейдотопазх Пиогезсеп5) окрім амінокислот, замінних відповідно до даного винаходу, тобто відповідний поліпептид ГФПД є ідентичним 5ЕО ІЮ МО:1, але має амінокислотні заміни у відповідному амінокислотному положенні(ях), як визначено в Таблиці 2 (нижче) у рядках 5ЕО ІЮ МО:7-5ЕО ІЮ МО:19 ії ЗЕО ІЮ МО: 21-5Е0 10 МО:108.

У деяких варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність згідно з винаходом (включаючи її виділені, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяї, рослини, частини рослин і насіння, що містять послідовність нуклеїнових кислот, амінокислотні послідовності і їх композиції, закодовані послідовністю нуклеїнових кислот, а також способи застосування послідовності нуклеїнових кислот для підвищення стійкості рослини до гербіцидів, які інгібують

ГФПД, зокрема, підвищення стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФІПД з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол) гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл/бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М-(тетразол-5-іл)у- або М- (триазол-5-іля'арилкарбоксаміди (переважно 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"; 2-(метоксиметил)-3- (метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-«(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілл'арилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, кодує амінокислотну послідовність, викладену у будь-якому з ЗЕО ІЮ МО5:3-108, і їх фрагменти і варіанти, які кодують поліпептид ГФПД, що інгібує стійкість до гербіцидів.

А. Способи вимірювання стійкості до інгібітора ГФПД

Для оцінки поліпептидів ГФІПД згідно з винаходом може бути використаний будь-який прийнятний метод вимірювання стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД. Стійкість може бути виміряна шляхом стеження за здатністю клітини або організму подолати застосування конкретного гербіциду, що інгібує ГФПД, або здатністю здійснювати найважливіші клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка, дихання або розмноження таким способом, який явно не відрізняється від необроблених клітин або організмів, або ж здатність не мати значної різниці у врожайності або навіть мати покращену врожайність у рослин, оброблених гербіцидом, що інгібує ГФІПД у порівнянні з такими ж самими рослинами, необробленими таким самим гербіцидом (але де бур'янисті трави були видалені або усунені механізмом, який відрізняється від застосування гербіциду, що інгібує ГФПД). В деяких варіантах здійснення, стійкість може бути виміряна за видимим індикаторним фенотипом клітини або організму, трансформованого нуклеїновою кислотою, що містить ген, що кодує відповідний поліпептид ГФПД, або в аналізі іп міго поліпептиду ГФПД, в присутності різних концентрацій різних гербіцидів, які інгібують ГФПД.

Реакції на дози і відносні зсуви в реакціях на дози, зв'язані з такими індикаторними фенотипами (утворення коричневого кольору, інгібування зростання, знебарвлювання, гербіцидний ефект тощо) для зручності виражені, наприклад, значеннями ОК5БО (концентрація, що викликає 50 9о зниження зростання) або МІС (мінімальна інгібувальна концентрація) де підвищення значень відповідає підвищенню стійкості, властивої поліпептиду ГФПД, звичайним чином, грунтуючись на ушкодженні рослин, симптомах знебарвлювання меристеми тощо, у діапазоні різних концентрацій гербіцидів. Ці дані можуть бути виражені, наприклад, значеннями СК50, одержаними з кривих доза/реакція, де на осі х нанесена "доза" і на осі у нанесені "процент загибелі", "гербіцидний ефект", "кількість зелених рослин, що зійшли" тощо, де підвищені значення К5О відповідають підвищеним рівням стійкості, властивої експресованому поліпептиду ГФПД. Гербіциди можуть бути застосовані придатним чином до появи або після появи рослин.

У різних варіантах здійснення, рівень стійкості нуклеїнової кислоти або гена, що кодує поліпептид ГФПД згідно з винаходом або поліпептид ГФПД згідно з винаходом може бути перевірений за допомогою перенесення генів, регенерації, розмноження і розпилювальних тестів досліджуваної рослини, такої як тютюн, або сільськогосподарської рослини, такої як соєві боби, кукурудза або бавовник. Згідно з результатами такої перевірки, подібні рослини є більш стійкими, переважно переносять дозу щонайменше у 2 разі більше нормальної дози, яку рекомендовано для застосування в полі, ще більш переважно переносять дозу до 4-х разів більше нормальної дози, яку рекомендовано для застосування в полі, до гербіцидів, які інгібують ГФПД (наприклад, гербіциди, які інгібують ГФІПД з такого класу як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат),

М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл/бензаміди (переважно 2-метил-М-(5- метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М-(тетразол-б5-іл)- або М-(триазол-5-ілларилкарбоксаміди (переважно 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2- метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-

М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4-«(трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 17"); 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, ніж такі рослини, не що містять ніякого екзогенного гена, що кодує поліпептид

ГФПД, або рослини, що містять ген, який містить еталонну ДНК, що кодує поліпептид ГФПД, наприклад, Рзепдотопаз Пиогезсеп5 ДНК, що кодує ГФПД, під контролем того ж самого промотора, що і у нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид ГФПД, запропонований в даному винаході. Відповідно, термін "здатний підвищувати стійкість рослини до щонайменше одного гербіциду, який впливає на ГФПД" означає стійкість рослини, яка експресує ГФПД згідно з винаходом до дози щонайменше у 1, у 2, або у 3, або в 4 або більше разів вище нормальної дози, яку застосовують у полях, гербіциду, що інгібує ГФПД, у порівнянні з рослиною, яка експресує тільки власну ендогенну ГФПД або рослиною, яка експресує еталонний поліпептид

ГФПД. У цьому відношенні термін "гербіцид, який впливає на ГФПД" не обмежується речовинами, відомими і/або які застосовують як гербіциди, але відноситься до будь-яких речовин, що інгібують каталітичну активність поліпептидів ГФПД.

Термін "гербіцидна стійкість", "стійкість до гербіцидів", або "нечутливість до гербіцидів" бо також означає здатність ферменту здійснювати свою відповідну каталітичну реакцію в присутності інгібітора/гербіциду або після впливу інгібітора/гербіциду. Гербіцидна стійкість ферментів, тобто їх здатність протидіяти інгібувальній дії гербіциду, може бути виражена якісно і кількісно. Якісно ферменти, що переносять різні категорії або навіть різні класи інгібіторів, мають високу стійкість і навпаки. У кількісному вираженні стійкість ферменту у порівнянні з одним гербіцидом може бути виражена як відповідна "залишкова активність" або "залишковий оберт", спостережувана в одному зразку цього ферменту, розрахована як співвідношення активності (Карр, кінетична міра) або загальний оберт субстрату (зміна сигналу, вимірювання кінцевої точки) за відсутності й в присутності одного інгібітора (Вегдтеуег, Н.О.: "Меїйоайв ої епгутаїйс апаїувів", 1974). В різних варіантах здійснення для визначення залишкової активності позірну кінетичну константу (Карр) визначеної конверсії субстрату можна виміряти як кінетичні зміни поглинання при 320 нм у зв'язаному аналізі в тому, що гомогентизат (ГГ), утворений за допомогою ГФПД з ГФП, безпосередньо перетворюється у добре поглинальну молекулу малеїлацетоацетату (МАА) іншим ферментом гомогентизат-діоксигеназою (НОЮ), застосовною у надлишку постійно у всіх аналізах. Співвідношення Кса/Км ферментативної активності є пропорційним до позірної кінетичної константи Карр і є пропорційним Кса/Км "ЇЕЇ (ФЕЇ) - концентрація ферменту). Конкурентоздатний інгібітор проявляє позірне збільшення Км і, відповідно, зворотне зменшення Карр при не насичувальних концентраціях субстрату. Оскільки обидва вимірювання Карр в присутності й за відсутності інгібітора здійснюють із застосуванням ідентичного зразку ферменту, сирого або очищеного, і таким чином, при тій самій концентрації ферменту, концентрацію ферменту виключають із розрахунку залишкової активності й співвідношення обох Карр безпосередньо вказує на зміну Км внаслідок інгібування. Слід зауважити, що це поняття відноситься до пар фермент/інгібітор, які взаємодіють з "конкурентним інгібуванням", ймовірно правильним для майже всіх варіантів поліпептидів й описаних інгібіторів. Константа інгібування Кі для ферменту і відповідного інгібітора описує міцність зв'язування інгібітора з цим ферментом. Підвищена стійкість дається для співвідношень 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 або вище й у порівнянні з еталонною послідовністю ГФПД в присутності або за відсутності будь-якого відповідного гербіциду, що інгібує ГФПД.

Спеціальним, хоча й не обмежувальним, типом аналізу, який може бути використаний для

Зо оцінки послідовностей поліпептиду ГФПД згідно з винаходом є колориметричний аналіз (як описано, наприклад, див. 05 6,768,044). В етом аналізі, наприклад, клітини Е. Соїї, що містять вектор рОЕ420-НРРОХ (НРРОХ означає будь-який ген, що кодує передбачуваний ГФПД поліпептид; основний вектор "р5Е420" одержували від Іпмігодеп Карлесрує, Німеччина) або модифіковану версію рЗЕ420 (р5Е420(КІ)МХ)-НРРОхХ виробляють розчинні меланіноподібні пігменти з катаболізму тирозину, коли надекспресований поліпептид ГФПД є активним. Ці меланіноподібні пігменти аналізують у рідкій культурі або шляхом нанесення культури Е. сої на твердий агар типу І! В-бульйону. Після від 16 годин до 8 днів при 20-30 "С, культуральне середовище або агарові лунки, які були інокульовані культурою Е. соїї, що містить пустий вектор рЗЕ420, не змінюють колір середовища або ті, які були висіяні за допомогою культури Е. сої, що містить вектор рЕ420-НРРОХ, який містить ген, що кодує неактивну ГФПД, також не змінює колір середовища, у той час як лунки, інокульовані культурою Е. соїї, що містить вектор рРЗЕ420-

НРРОХ, що кодує активну ГФПД, є коричнюватими. В присутності гербіциду, що інгібує ГФПД, це вироблення пігменту може бути інгібоване, і культура не буде змінювати колір середовища, якщо не експресується і не є активним поліпептид ГФПД, стійкий до гербіциду, який інгібує.

Раніше було продемонстровано, що цей тест відображає активність ГФПД і стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФІД, незалежно від походження цієї активності, й дозволяє ідентифікувати активність ГФПД (05 6,768,044), тобто на якісному рівні.

В. Способи введення мутацій в послідовності ГФПД

В мутованих поліпептидах ГФПД, які кодуються нуклеїновою кислотою згідно з винаходом щонайменше три амінокислоти були замінені як визначено вище.

Заміна може бути здійснена в послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує еталонний поліпептид ГФІПД, як визначено вище, будь-якими засобами, придатними для заміни, в зазначеній послідовності, кодон, який кодує необхідну заміні амінокислоту кодоном, який відповідає амінокислоті, яка повинна замінити його, причому зазначені кодони широко описані в літературних джерелах і добре відомі спеціалісту у даній галузі.

Для досягнення цієї заміни можуть бути використані декілька способів молекулярної біології.

Придатний спосіб одержання мутованої послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і відповідного білка містить здійснення сайт-спрямованого мутагенезу на кодонах, що кодують одну або більшу кількість заздалегідь вибраних амінокислот. Способи одержання таких сайт- бо спрямованих мутацій добре відомі спеціалісту і широко описані в літературних джерелах

(зокрема: Оігесієй Миїадепевзів: А Ргасіїса! Арргоасп, 1991, Едйеа ру М.). МеРНЕНКЗОМ, ІК.

РЕЕ55), або є способами, для яких можливо використовувати комерційні набори (наприклад, набір для мутагенезу ОШІКСНАМСОСЕ "М (ідпіепіпуд від Оіадеп або бігаїадепе). Після сайт- спрямованого мутагенезу необхідно відібрати клітини, що містять мутовану ГФПД, яка є менш чутливою до інгібітора ГФПД за допомогою відповідного скринінгового засобу. Відповідні методи скринінгу для досягнення цього були описані вище.

Альтернативно, послідовність ДНК, яка кодує еталонний поліпептид ГФПД, може бути модифікована іп 5йїсо для кодування поліпептиду ГФПД, що має одну або декілька замін, перерахованих у даній заявці, і потім синтезована де помо. Цей спосіб є також добре відомим з рівня техніки, описаний в літературних джерелах. Нуклеотидна послідовність, яка кодує мутований поліпептид ГФПД, може бути введена в клітину-хазяїна, як описано в іншому місці даної заявки.

С. Виділені полінуклеотиди і їх варіанти і фрагменти

В деяких варіантах здійснення, даний винахід містить виділені або рекомбінантні полінуклеотиди. Термін "полінуклеотид" відповідає будь-якому генетичному матеріалу будь-якої довжини і будь-якої послідовності, що містить одноланцюгові й дволанцюгові молекули ДНК і

РНК, включаючи регуляторні елементи, структурні гени, групи генів, плазміди, цілі геноми і їх фрагменти. "Рекомбінантний" полінуклеотид або поліпептид/білок, або його біологічно активна частина, як визначено у даній заявці, більше не присутні в його первинному, рідному організмі, наприклад, коли він міститься в гетерологічній клітині-хазяїні або в трансгенній рослинній клітині, насінні або рослині. В одному варіанті здійснення, рекомбінантний полінуклеотид не містить послідовностей (наприклад, що кодують білок або регуляторних послідовностей), які природним чином фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розташованих на 5 і 3" кінцях нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, з якого одержаний полінуклеотид. Термін "рекомбінантний" охоплює полінуклеотиди або поліпептиди, з якими проводили маніпуляції відносно природного полінуклеотиду або поліпептиду, так що полінуклеотид або поліпептид відрізняється (наприклад, хімічним складом або структурою) від наявного в природі. В іншому варіанті здійснення, "рекомбінантний" полінуклеотид не містить внутрішні послідовності (тобто інтрони), які зустрічаються в природі в геномній ДНК організму, з якого одержаний

Зо полінуклеотид. Типовим прикладом такого полінуклеотиду є так звана комплементарна ДНК (КДНК). Наприклад, в різних варіантах здійснення, виділений полінуклеотид, що кодує стійкість до гербіциду, що інгібує ГФПД, може містити менше ніж 5 Кб, 4 КБ, З КБ, 2 КБ, 1 КБ, 0.5 КО, або 0.1

КО нуклеотидної послідовності, яка природним чином фланкує полінуклеотид в геномній ДНК клітини, з якої одержаний полінуклеотид. Молекули нуклеїнових кислот згідно з винаходом містять ті, які кодують ГФПД згідно з винаходом. В деяких варіантах здійснення, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом функціонально зв'язана з промотором, здатним спрямовувати експресію молекули нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні (наприклад, рослинній клітині-хазяїні або бактеріальній клітині-хазяїні).

Крім того, в даному винаході передбачені примірні варіанти і фрагменти будь-який послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотні послідовності, викладені у будь-якій із ЗЕО ІЮО МО5:3-108. "Фрагмент" полінуклеотиду може кодувати біологічно активну частину поліпептиду, або ж це може бути фрагмент, який можна використовувати як гібридізаційний зонд або ПЛР-праймер, застосовуючи способи, розкриті в іншому місці даної заявки.

Полінуклеотиди, які є фрагментами полінуклеотиду, містять щонайменше приблизно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 суміжних нуклеотидів, або ж до кількості нуклеотидів, присутньої в описаному у даному випадку повнорозмірному полінуклеотиді, залежно від передбачуваного призначення (наприклад, описана у даній заявці нуклеїнова кислота ГФПД). Під "суміжними" нуклеотидами слід розуміти залишки нуклеотидів, розташовані безпосередньо рядом друг з другом.

Фрагменти полінуклеотидів відповідно до даного винаходу, як правило, будуть кодувати фрагменти поліпептиду, які зберігають біологічну активність повнорозмірного білка стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД; тобто активність стійкості до гербіциду. Під "зберіганням активності стійкості до гербіцидів" слід розуміти, що фрагмент буде мати щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 8095, 8595, 9096, 9595, 10096, 11095, 125965, 15095, 17596, 200 95, 250 9, щонайменше приблизно 300 95 або більше активності стійкості до гербіцидів повнорозмірного білка стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД, викладеного тут як 5ЕО ІО МО5: 3-108. Методи вимірювання активності стійкості до гербіцидів добре відомі в рівні техніки і Примірні способи описані в даному винаході. У необмежувальному прикладі фрагмент згідно з винаходом буде 60 стійким до тої ж самої дози гербіциду, що інгібує ГФПД, або стійким до 1х, 2х, Зх, 4х або ще більш високої дози гербіциду, що інгібує ГФПД, або фрагменти будуть такими ж самими або більш стійкими на основі Кі між фрагментом і 5ЕО 1Ю МО5:3-108.

Фрагмент полінуклеотиду, який кодує біологічно активну частину поліпептиду згідно з винаходом, буде кодувати щонайменше приблизно 150, 175, 200, 250, 300, 350 суміжних амінокислот, або до загальної кількості присутніх амінокислот у повнорозмірному поліпептиді згідно з винаходом. У необмежувальному прикладі фрагмент полінуклеотиду, який кодує біологічно активну частину поліпептиду ГФПД має (а) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІО МО 1 і (б) гістидин або аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮО МО:1 і (в) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО 1 і, необов'язково, одну або декілька додаткових амінокислотних замін в положеннях, що відповідають амінокислотним положенням 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345 5ЕО ІЮ МО, включаючи білок ГФПД, викладений у будь-якій із «ЕО ІЮ МО5:3-108.

Винахід також охоплює варіанти полінуклеотидів, як описано вище. "Варіанти" полінуклеотиду також містять те послідовності, які кодують ГФПД згідно з винаходом, однак які консервативно відрізняються з причини виродження генетичного коду, а також ті, які Є досить ідентичними. Варіанти відповідно до даного винаходу будуть зберігати активність поліпептиду

ГФПД ії стійкість до гербіциду, що інгібує ГФПД. Термін "досить ідентичні" означає поліпептид або полінуклеотидну послідовність яка має щонайменше приблизно 5395, щонайменше приблизно 60 95 або 65 95 ідентичності послідовності, приблизно 70 95 або 75 95 ідентичності послідовності, приблизно 80 95 або 85 95 ідентичності послідовності, приблизно 90 95, 91 95, 92 96, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності у порівнянні з еталонною послідовністю, використовуючи одну з програм вирівнювання із застосуванням стандартних параметрів. Спеціалісту у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ці значення можуть бути прийнятним чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, які кодуються двома полінуклеотидами, приймаючи до уваги виродження кодонів, схожість амінокислот, положення рамки зчитування тощо.

Бактеріальні гени дуже часто мають чисельні ініціаторні кодони метіоніну близько від початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції на одному або більше з цих

Зо стартових кодонів призводить до утворення функціонального білка. Такі стартові кодони можуть включать кодони АТО. Тим не менше, бактерії, такі як Васійн5 5р. також розпізнають кодон СТО як стартовий кодон, а білки, що ініціюють трансляцію на кодонах СТО, містять метіонін як першу амінокислоту. Більше того, часто апріорі не можливо визначити, який з цих кодонів природньо застосовується в бактерії. Таким чином, слід розуміти, що застосування одного з альтернативних кодонів метіоніну може привести до утворення варіантів, що надають стійкість до гербіцидів. Ці білки стійкості до гербіцидів охоплюються даним винаходом і можуть бути використані в способах відповідно до даного винаходу. Наявні в природі алельні варіанти можуть бути визначені за допомогою добре відомих технік молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і методики гібридизації, як зазначено нижче. Варіантні полінуклеотиди також містять полінуклеотиди синтетичного походження, утворені, наприклад, із застосуванням сайт-спрямованих або інших стратегій мутагенезу, але які все ще кодують поліпептид, який має необхідну біологічну активність.

Крім того, спеціаліст у даній галузі буде розуміти, що зміни можуть бути введені шляхом подальшої мутації полінуклеотидів згідно з винаходом, таким чином, приводячи до подальших змін в амінокислотній послідовності поліпептидів які кодуються, без зміни біологічної активності поліпептидів. Таким чином, варіанти виділених полінуклеотидів можуть бути створені введенням одного або більшої кількості додаткових нуклеотидних заміщень, добавлений або делецій у відповідній полінуклеотид, що кодує ГФПД згідно з винаходом, так що в поліпептид, що кодується, вводять 3-5, 1-7, 1-9, 1-11, 1-13, 1-15, або 1-17 амінокислотних заміщень,

БО додавань або делецій, або 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 амінокислотних заміщень, додавань або делецій. Інші мутації можуть бути введені стандартними техніками, такими як сайт-спрямований мутагенез і ПЛР-опосередкований мутагенез, або техніками генної перестановки. Такі варіанти полінуклеотидів також охоплюються даним винаходом.

Варіанти полінуклеотидів можуть бути створені введенням мутацій у випадковому порядку по всій кодувальній послідовності або її частини, таким як насичувальний мутагенез або перестановочний мутагенез, і одержані в результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу на здатність надавати активність стійкості до гербіцидів для виявлення мутантів, які зберігають активність.

Додаткові способи утворення варіантів містять у собі піддавання клітини, яка експресує 60 описаний у даній заявці білок (або їх бібліотеку) спеціальним умовам, які створюють навантаження на активність білка. Спеціальні умови можуть охоплювати (але не обмежуються ними) зміни температури, зміни рН, зміни концентрацій субстратів або інгібіторів і зміни в буферній композиції або їх концентрацій. Бібліотека білків може бути піддана цим умовам рід час експресії білка (наприклад, в Е. соїї або іншому хазяїні) або ж після створення білкового екстракту, або після очищення білка.

Функціональна або ферментативна активність бібліотеки білків, підданої стресовим умовам, потім може бути порівняна з еталонним білком для виявлення білків з покращеними властивостями. Це порівняння активностей можна здійснювати як частину скринінгу росту або альтернативно як частину ферментативного аналізу, який кількісно визначає активність білка.

Властивості, які можуть бути визначені як покращені, можуть охоплювати стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД, зміни в кінетичних константах (включаючи КМ, Кі, Кса), стабільність білка, термостабільність білка або оптимальне значення температури і рН для білка. р. Виділені білки і їх варіанти і фрагменти

Поліпептиди стійкості до гербіцидів також охоплені даним винаходом. Поліпептид стійкості до гербіцидів містить препарати поліпептидів, що містять менше ніж приблизно 30 95, 20 Об, 1095 або 595 (за сухою вагою) поліпептиду нестійкості до гербіцидів (тут і надалі також позначається як "забруднювальний білок"). В межах даного винаходу "білок стійкості до гербіцидів" означає описаний у даній заявці поліпептид ГФІПД. Також забезпечені його фрагменти, біологічно активні частини і варіанти, які можуть бути використані в практичному здійсненні способів згідно з даним винаходом. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" містять фрагменти поліпептиду, що містять частину амінокислотної послідовності, що кодує білок стійкості до гербіцидів і яка зберігає активність стійкості до гербіцидів. Біологічно активна частина білка стійкості до гербіцидів може бути поліпептидом довжиною, наприклад, в 10, 25, 50, 100 або більше амінокислот. Подібні біологічно активні частини можуть бути одержані за допомогою технік рекомбінації і оцінені на активність стійкості до гербіцидів.

Під "варіантами" слід розуміти білки або поліпептиди, амінокислотна послідовність яких щонайменше приблизно на 53 95, 60 95, 65 95, приблизно 70 95, 75 95, приблизно 80 95, 85 95, 90 Фо, 91 95, 92 90, 93 Фо, 94 95, 95 У, 96 Фо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентична будь-який з примірних

Зо ЗЕО ІЮ МО5:3-108, при цьому зазначений варіант має активність поліпептиду ГФПД і стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД. Спеціалісту у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ці значення можуть бути придатним чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, які кодуються двома полінуклеотидами, приймаючи до уваги виродження кодонів, схожість амінокислот, положення рамки зчитування тощо.

Наприклад, консервативні заміщення амінокислот можуть бути зроблені в одному або декількох замінних залишків амінокислот. "Замінний" амінокислотний залишок представляє собою залишок, який може бути змінений в еталонній послідовності поліпептиду без зміни біологічної активності, у той час як "незамінний" амінокислотний залишок необхідний для біологічної активності. "Консервативне заміщення амінокислоти" представляє собою заміщення, при якому амінокислотний залишок заміщують залишком, який має схожий бічний ланцюг.

Родини амінокислот зі схожими бічними ланцюгами визначені в рівні техніки. Ці родини містять амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Заміщення амінокислот можуть бути зроблені на неконсервативних ділянках, які зберігають свою функцію. Як правило, подібні заміщення не роблять для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків всередині консервативного мотиву, коли такі залишки є незамінними для активності поліпептиду. Тим не менше, спеціалісту у даній галузі буде зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні зміни в консервативних залишках.

У даний винахід також включені антитіла до ГФПД відповідно до даного винаходу, або до її варіантів або фрагментів. Способи одержання антитіл добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад, Нагіом/ апа Гапе (1988) Апійродіез: А Гарогагу Мапиа!ї, Соїй Зргіпд Нагрог

І арогагогу, Соїа 5ргіпд Нагрог, МУ; Патент США Мо 4,196,265).

Таким чином, один з аспектів згідно з винаходом відноситься до антитіл, одноланцюгових бо антигензв'язувальних молекул або інших білків, що специфічно зв'язуються з однією або більшою кількістю молекул білка або пептиду згідно з винаходом і їх гомологами, химерами або фрагментами. В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, амінокислотна послідовність якого викладена в ЗЕО ІЮ МО5:1-108 або його фрагментом.

Антитіла згідно з винаходом можуть бути використані для кількісного або якісного визначення молекул пептиду або білка згідно з винаходом, або ж для виявлення посттрансляційних модифікацій білків. Як застосовують у даній заявці, антитіло або пептид вважається "специфічно зв'язувальним" з молекулою білка або пептиду згідно з винаходом, якщо таке зв'язування конкурентно не інгібується присутністю неспоріднених молекул.

Е. Накопичення генів

У комерційному виробництві сільськогосподарських культур бажано знищити небажані рослини (тобто "бур'янисті трави") з полів сільськогосподарських рослин шляхом надійного пестицидного регулювання. Ідеальною обробкою стала б така, яку можна було б застосувати до всього поля, але яка знищувала б тільки небажані рослини, не маючи впливу на культурні рослини. Одна з подібних систем обробки містить використання стійких до гербіцидів сільськогосподарських рослин, так що при розпиленні гербіциду над полем стійких до гербіцидів культур вони продовжують зростати, у той час як нестійкі до гербіциду бур'янисті трави гинуть або піддаються серйозному ушкодженню. В ідеалі подібні системи обробки повинні мати перевагу варіювання властивостей гербіцидів, так що боротьба з бур'янистими травами була би найкращою з можливих комбінацій гнучкості й економії. Наприклад, окремі гербіциди мають різний період дії у польових умовах, і деякі гербіциди зберігаються і є ефективними протягом відносно тривалого часу після застосування в полі, , у той час як інші гербіциди швидко розпадаються на інші і/або неактивні сполуки. Ідеальна система обробки дозволила б застосування різних гербіцидів, так що виробники могли б адаптувати вибір гербіцидів під конкретну ситуацію.

У той час як на сьогоднішній день комерційно доступною є певна кількість стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур, проблемою в застосуванні багатьох комерційних гербіцидів і комбінацій гербіцид/культура є те, що окремі гербіциди звичайно мають неповний спектр активності відносно розповсюджених видів бур'янистих трав. Для більшості окремих гербіцидів, використовуваних уже протягом певного часу, стали переважати популяції стійких до

Зо гербіцидів видів і біотипів бур'янистих трав (див., наприклад, ТгапеіІ апа МугіднЕ (2002) М/еєд

Зсіепсе 50: 700-712; Омеп апа 7єіауа (2005) Резі Мапад. осі. 61: 301-311). Були описані трансгенні рослини, стійкі до більше ніж одного гербіциду (див., наприклад, МУ02005/012515).

Тим не менше, постійно необхідні вдосконалення в кожному аспекті виробництва сільськогосподарських культур, можливостях боротьби з бур'янистими травами, продовження залишкового контроля бур'янистих трав і покращення врожайності культурних рослин.

Білок ГФПД або нуклеотидна послідовність згідно з винаходом переважно скомбіновані в рослинах з іншими генами, що кодують білки або РНК, які надають таким рослинам корисні агрономічні властивості. Середовища генів, що кодують білки або РНК, які надають трансформованим рослинам корисні агрономічні властивості, можна згадати послідовності ДНК, що кодують білки, які надають стійкість до одного або більшої кількості гербіцидів, які за своєю хімічною структурою відрізняються від гербіцидів, які інгібують ГФІПД, й інші, які надають стійкість до деяких комах, які надають стійкість до деяких захворювань, ДНК, що кодують РНК, що забезпечують боротьбу з нематодами або комахами, тощо.

Подібні гени, зокрема, описані в опублікованих заявках РСТ УМО91/02071 ії М/О95/06128, а також в Патенті США 7,923,602 і Публікації патентної заявки США Мо 20100166723, кожна з яких включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.

Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, які надають трансформованим рослинним клітинам і рослинам стійкість до певних гербіцидів, можна зазначити ген Баг або РАТ або ген зігеріотусе5 соеїїсоЇог, описаний в УУМО2009/152359, що надає стійкості до глуфосинатних гербіцидів, ген, що кодує придатну ЕРБР5, що надає стійкість до гербіцидів, метою яких є

ЕРБ5БРЗ, таким як гліфосат і його солі (05 4,535,060, 05 4,769,061, 05 5,094,945, 05 4,940,835, 5 5,188,642, 5 4,971,908, 005 5,145,783, ОБ 5,310,667, 05 5,312,910, 005 5,627,061, 5 5,633,435), ген, що кодує гліфосат-н-ацетилтрансферазу (наприклад, 05 8,222,489, 05 8,088,972, 005 8,044,261, 005 8,021,857, 05 8,008,547, 005 7,999,152, 05 7,998,703, 05 7,863,503,

ОБ 7,714,188, 005 7,709,702, 5 7,666,644, ОБ 7,666,643, 05 7,531,339, 005 7,527,955, і 05 7,405,074), або ген, що кодує глифозатоксидоредуктазу (наприклад, 05 5,463,175).

Серед послідовностей ДНК, що кодують придатну ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРБР5, можна більше конкретно зазначити ген, що кодує рослинну

ЕРБРБ5, зокрема ЕРБРЗ5 маїсу, зокрема ЕРЗРЗ маїсу, що містить дві мутації, зокрема мутацію в бо амінокислотному положенні 102 і мутацію в амінокислотному положенні 106 (М/О2004/074443), і яка описана в Патентній заявці О5 6566587, надалі називають як подвійна мутантна ЕРБР5 маїсу або 2тптЕРБР5, або ген, що кодує ЕРБРБ5, виділену з Адгорасіегішт і яка описана послідовністю ІЮ Мо. 2 і послідовністю ІЮ Мо. З Патенту США 5,633,435, також яку позначають як

Ср.

Серед послідовностей ДНК, які кодують придатну ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРБР5, можна більш конкретно зазначити ген, що кодує ЕР5РБЗ оОо23 з Агіпгобасіег діобігтогітіх, а також і мутантні ОКО23 АСЕ1, СКО23 АСЕ2, або СКО23

АСЕЗ, зокрема мутанти або варіанти СОКОС23, як описано в М/О2008/100353, такі як сАО2г3(асе3)"17ЗК 5ЕО ІО Мо. 29 в ММО2008/100353.

У випадку послідовностей ДНК, які кодують ЕРБР5 і зокрема які кодують перераховані вище гени, послідовність, яка кодує ці ферменти переважно передується послідовністю, що кодує транзитний пептид, зокрема "оптимізований транзитний пептид", описаний в Патенті США 5,510,471 або 5,633,448.

Примірні ознаки стійкості до гербіцидів, які можуть бути скомбіновані з послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з винаходом також містять щонайменше один інгібітор АЛС (ацетолактатсинтази. (ММО2007/024782); мутований ген Агабрідорзіз АГ5/АНАЗ (Патент США 6,855,533); гени, що кодують 2,4-О-монооксигенази, які надають стійкість до 2,4-0 (2,4- дихлорфеноксиоцтової кислоти) шляхом метаболізації (Патент США 6,153,401); і гени, що кодують монооксигенази дикамба, які надають стійкість до дикамби (3,б-дихлор-2- метоксибензойної кислоти) шляхом метаболізації (05 2008/0119361 їі 05 2008/0120739).

У різних варіантах здійснення ГФПД згідно з винаходом зібрана з одним або більшою кількістю генів стійкості до гербіцидів, включаючи один або більше додаткових генів стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД, і/або один або більшу кількість генів, стійких до гліфосату і/або глуфосинату. В одному варіанті здійснення, ГФПД згідно з винаходом скомбінована з 2дІТЕРЗР5 і Баг.

Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, що стосуються властивостей стійкості до комах, слід зазначити білки Ві, широко описані в літературних джерелах і добре відомі спеціалістам у даній галузі. Також слід зазначити білки, виділені з бактерій, таких як

Ріпоїогнардиз (М/097/17432 5 М/098/08932).

Середовища таких послідовностей ДНК, що кодують цільові білки, які надають нові властивості стійкості до комах, слід більше конкретно зазначити білки ВІ Сту або МІР, широко описані в літературних джерелах і добре відомі спеціалістам у даній галузі. Вони містять білок

СтуїЕ або гібриди, одержані з білка СтгуїЕ (наприклад, гібридні білки СтутА-Стуї1Е описані в О5 6,326,169; 05 6,281,016; 05 6,218,188, або їх токсичні фрагменти), білки типу СтуїтА або їх токсичні фрагменти, переважно білок Сту1Ас або гібриди, одержані з білка Сту1тАс (наприклад, гібридний білок СгутАр-СтутАс, описаний в 05 5,880,275) або білок СтутАб або ВІ2 або їх інсектицидні фрагменти, як описано в ЕР451878, білки Сгуг2Ае, Стгуг2Аї або Сгуг2Ад, як описано в

УМО2002/057664 або їх токсичні фрагменти, білок СтутА.105, описаний в УМО 2007/140256 (5ЕО

ІО Мо. 7) або його токсичний фрагмент, білок МІРЗзАа19 під номером в каталозі МСВІ АВО20428, білок МІРЗАа20 під номером в каталозі АВО20429 (5ЕО ІЮО Мо. 2 в УМО 2007/142840), білки

МІРЗА, які виробляються у подіях бавовника СОТ202 або СОТ203 (ММО2005/054479 і відповідно

ММО2005/054480), білки Сгу, як описано в УМО2001/47952, білок МІРЗзАа або його токсичний фрагмент, як описано в Евігисп еї аї. (1996), Ргос Майї! Асай 5сі 0 5 А. 28:93(11):5389-94 1 05 6,291,156, інсектицидні білки з штамів видів Хепогпардив5 (як описано в М/О98/50427), беїтайа (зокрема з 5. епіоторнпійа) або видів Риоїютарашив, такі як То-білки з Рпоїогпардив, як описано в

УМУ098/08932 (наприклад, Умаїегіеїй еї а!І., 2001, Аррі Епмігоп Місгоріо!. 67(11):5017-24; ЕРітепср-

Сопеїапі апа Воуеп, 2000, Сеї! Мої І йе 5сі.; 57(5):828-33). Також у дану заявку включені будь-які варіанти і мутанти будь-якого з цих білків, що відрізняються декількома (1-10, переважно 1-5) амінокислотами від будь-якої з наведених вище послідовностей, особливо послідовності їх токсичного фрагмента, або які злиті з транзитним пептидом, таким як пластидний транзитний пептид або будь-який інший білок або пептид.

В різних варіантах здійснення послідовність ГФІПД згідно з винаходом може бути скомбінована в рослинах з одним або більшою кількістю генів, які надають необхідну ознаку, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до засухи, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, покращена поживна цінність, стійкість до захворювань, покращений фотосинтез, покращена якість волокон, стійкість до стресів, покращене розмноження тощо.

Особливо придатними трансгенні події, які можуть бути скомбіновані з генами відповідно до даного винаходу в рослинах того ж самого виду (наприклад, схрещуванням або бо ретрансформацією рослини, яка містить іншу трансгенну подію, з химерним геном згідно з винаходом), містять подія 531/ РУ-ЗНВКО4 (бавовник, боротьба з комахами, описано в

УМО2002/040677), подія 1143-14А (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в

УО2006/128569); подія 1143-5118 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в

МО2006/128570); подія 1445 (бавовник, стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в О5-А 2002-120964 або М/О2002/034946Емепі 17053 (рис, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА- 9843, описано в ММО2010/117737); подія 17314 (рис, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА- 9844, описано в М/О2010/117735); подія 281-24-236 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-6233, описано в ММО2005/103266 або 0О5-А 2005-216969); подія 3006-210-23 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як РТА- 6233, описано в Ш5-А 2007-143876 або М/О2005/103266); подія 3272 (кукурудза, ознаки якості, депонована як РТА-9972, описано в М/02006/098952 або 05-А 2006-230473); подія 33391 (пшениця, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-2347, описано в ММО2002/027004), подія 40416 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА- 11508, описано в М/О 11/075593); подія 43А47 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-11509, описано в УМО2011/075595); подія 5307 (кукурудза, боротьба з комахами, депонована як АТС РТА-9561, описано в М/О2010/077816); подія АЗЕ- 368 (мітлиця, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-4816, описано в Ш5-А 2006- 162007 або УМО2004/053062); подія В16б (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в И5-А 2003-126634); подія ВРБЗ-СМ127-9 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як МСІМВ Мо. 41603, описано в М/02010/080829); подія ВІКІ (олійний ріпак, відновлення стерильності чоловічих особин, депонована як МСІМВ 41193, описано в

УММО2005/074671); подія СЕ43-67В (бавовник, боротьба з комахами, депонована як О5М

АСС2724, описано в 05-А 2009-217423 або УМО2006/128573); подія СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в Ш5-А 2010-0024077); подія СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в УМО2006/128571); подія СЕ46-0О2А (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в М/О2006/128572); подія СОТ102 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в И5-А 2006-130175 або

УО2004/039986); подія СОТ202 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в О5-

А 2007-067868 або УМО2005/054479); подія СОТ203 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в М/02005/054480); подія ОА5З21606-3 / 1606 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11028, описано в М/О2012/033794), подія ОА540278 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-10244, описано в МУМО2011/022469); подія ОА5- 44406-6 / ррдав8264.44.06.1 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11336, описано в М/О2012/075426), подія ЮОА5-14536-7 /ррАВ8291.45.36.2 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11335, описано в М/02012/075429), подія рАБЗ-59122-7 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА 11384, описано в 05-А 2006-070139); подія ОА5-59132 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в М/О2009/100188); подія ОА568416 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-10442, описано в УМО2011/066384 або УМО2011/066360); подія ОР-098140-6 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-8296, описано в

И5Б-А 2009-137395 або М/О 08/112019); подія ЮР-305423-1 (соєві боби, ознаки якості, не депонована, описано в Ш5-А 2008-312082 або М/О2008/054747); подія ОР-32138-1 (кукурудза, система гібридизації депонована як АТСС РТА-9158, описано в Ш5-А 2009-0210970 або

УМОо2009/103049); подія ОР-356043-5 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС

РТА-8287, описано в О5-А 2010-0184079 або УМО2008/002872); подія ЕЕ-1 (баклажан, боротьба з комахами, не депонована, описано в УМО 07/091277); подія РІ117 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС 209031, описано в О5-А 2006-059581 або УМО 98/044140); подія

ЕС72 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11041, описано в М/О2011/063413), подія зА21 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТС 209033, описано в О5-А 2005-086719 або МО 98/044140); подія 3025 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як

АТСС 209032, описано в О5-А 2005-188434 або МО 98/044140); подія СНВІ119 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-8398, описано в

УМО2008/151780); подія СНВОЄ14 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА- 6878, описано в О5-А 2010-050282 або М/О2007/017186); подія 511 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС 209030, описано в Ше-А 2005-188434 або УМО98/044140); подія

СМ К213 (цукровий буряк, стійкість до вірусів, депонована як МСІМВ-41601, описано в

ММО2010/076212); подія Н7-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, депонована як МСІМВ 41158 або МСІМВ 41159, описано в Ш5-А 2004-172669 або УМО 2004/074492); подія ЗОРІ ІМ (пшениця, стійкість до захворювань, не депонована, описано в Ш5-А 2008-064032); подія ІІ 27 60 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як МСІМВ41658, описано в УУО2006/108674 або

И5Б-А 2008-320616); подія І І 55 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як МСІМВ 41660, описано в МО 2006/108675 або 0О5-А 2008-196127); подія ІІ сойоп25 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-3343, описано в ММО2003/013224 або 0О5-А 2003-097687); подія ГІ КІСЕОб (рис, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС 203353, описано в 05 6,468,747 або УМО2000/026345); подія ІІ Кісеб2 (рис, стійкість до гербіцидів, депонована як

АТСС 203352, описано в УМО2000/026345), подія ГІЇ КІСЕбО1 (рис, стійкість до гербіцидів, депонована як АТС РТА-2600, описано в О5-А 2008-2289060 або УМ/О2000/026356); подія

І М038 (кукурудза, ознаки якості, депонована як АТСС РТА-5623, описано в ШВ-А 2007-028322 або ММО2005/061720); подія МІК162 (кукурудза, боротьба з комахами, депонована як РТА-8166, описано в 0Ш5-А 2009-300784 або У/О2007/142840); подія МІКбО4 (кукурудза, боротьба з комахами, не депонована, описано в Ш5-А 2008-167456 або УМО2005/103301); подія МОМ15985 (бавовник, боротьба з комахами, депонована як АТСС РТА-2516, описано в ШВ-А 2004-250317 або ММО2002/100163); подія МОМ810 (кукурудза, боротьба з комахами, не депонована, описано в 05-А 2002-102582); подія МОМ863 (кукурудза, боротьба з комахами, депонована як АТОС

РТА-2605, описано в М/02004/011601 або 0О5-А 2006-095986); подія МОМ87427 (кукурудза, контроль обпилення, депонована як АТСС РТА-7899, описано в УМО2011/062904); подія

МОМ87460 (кукурудза, стійкість до стресів, депонована як АТСС РТА-8910, описано в

МО2009/111263 або Ш5-А 2011-0138504); подія МОМ87701 (соєві боби, боротьба з комахами, депонована як АТСС РТА-8194, описано в 05-А 2009-130071 або М/О2009/064652); подія

МОМ87705 (соєві боби, ознаки якості - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-9241, описано в Ш5-А 2010-0080887 або М/О2010/037016); подія МОМ87708 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-9670, описано в М/О2011/034704); подія МОМ87712 (соєві боби, врожайність, депонована як РТА-10296, описано в УМО2012/051199), подія МОМ87754 (соєві боби, ознаки якості, депонована як АТСС РТА-9385, описано в УМО2010/024976); подія

МОМ87769 (соєві боби, ознаки якості, депонована як АТС РТА-8911, описано в Ш5-А 2011- 0067141 або М/О2009/102873); подія МОМ88017 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-5582, описано в Ш5-А 2008-028482 або УММО2005/059103); подія МОМ88913 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-4854, описано в

УО2004/072235 або О5-А 2006-059590); подія МОМ88302 (олійний ріпак, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-10955, описано в М/О2011/153186), подія МОМ88701 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11754, описано в УМО2012/134808), подія МОМ89034 (кукурудза, боротьба з комахами, депонована як АТСС РТА-7455, описано в УМО 07/140256 або О5-А 2008- 260932); подія МОМ89788 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як АТС РТА-6708, описано в 05З-А 2006-282915 або УМО2006/130436); подія М511 (олійний ріпак, контроль обпилення - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-850 або РТА-2485, описано в

ММО2001/031042); подія М58 (олійний ріпак, контроль обпилення - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-730, описано в УМО2001/041558 або О5-А 2003-188347); подія МКбОЗ (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-2478, описано в И5-А 2007- 292854); подія РЕ-7 (рис, боротьба з комахами, не депонована, описано в М/О2008/114282); подія КЕЗ (олійний ріпак, контроль обпилення - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС

РТА-730, описано в М/О2001/041558 або 0О5-А 2003-188347); подія КТ73З (олійний ріпак, стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в УМО2002/036831 або 05-А 2008-070260); подія

ЗУНТОНаІ / БМІМ-О00Н2-5 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11226, описано в УМО2012/082548), подія Т227-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в М/О2002/44407 або 0О5-А 2009-265817); подія Т25 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в О5-А 2001-029014 або УМО2001/051654); подія 7304-40 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА-8171, описано в О5-А 2010-077501 або У/О2008/122406); подія 7342-142 (бавовник, боротьба з комахами, не депонована, описано в У/МО2006/128568); подія ТС1507 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депонована, описано в 05-А 2005-039226 або МО2004/099447); подія

МІР1034 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депонована як АТСС РТА- 3925., описано в УМО2003/052073), подія 32316 (кукурудза, боротьба з комахами-стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11507, описано в М/О2011/084632), подія 4114 (кукурудза, боротьба з комахами-стійкість до гербіцидів, депонована як РТА-11506б, описано в

МО2011/084621), подія ЕЕ-ОМ3 / ЕО72 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер РТА-11041) необов'язково зібрана з подією ЕЕ-ЗМ1/ЛІ27 або подія ЕЕ-Я4М2/ЛІ 55 (МО2011/063413А2), подія ОА5-68416-4 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, АТС обліковий номер РТА-10442, ММО2011/066360А1), подія ОА5-68416-4 (соєві боби, стійкість до гербіцидів,

АТСС обліковий номер РТА-10442, ММО2011/0663844А1), подія ОР-040416-8 (кукурудза, боротьба 60 з комахами, АТСС обліковий номер РТА-11508, М/О2011/075593А1), подія ЮР-0О43А47-3

(кукурудза, боротьба з комахами, АТСС обліковий номер РТА-11509, М/О2011/075595А1), подія

ОР-004114-3 (кукурудза, боротьба з комахами, АТСС обліковий номер РТА-11506,

УМО2011/084621А1), подія ОР-032316-8 (кукурудза, боротьба з комахами, АТСС обліковий номер РТА-11507, УУО2011/084632А1), подія МОМ-88302-9 (олійний ріпак, стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер РТА-10955, УМО2011/153186А1), подія ОА5З-21606-3 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, АТОС обліковий номер РТА-11028, М/О2012/033794А2), подія

МОМ-87712-4 (соєві боби, ознаки якості, АТСС обліковий номер. РТА-10296,

МО2012/051199А2), подія ОА5-44406-6 (соєві боби, накопичена стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер. РТА-11336, ММО2012/075426А1), подія ОА5-14536-7 (соєві боби, накопичена стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер. РТА-11335, М/О2012/075429А1), подія. 5УМ- 000Н2-5 (соєві боби, стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер РТА-11226,

УММО2012/082548А2), подія ЮОР-061061-7 (олійний ріпак, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, М/О2012071039А1), подія ОР-073496-4 (олійний ріпак, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, 052012131692), подія 8264.44.06.1 (соєві боби, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер РТА-11336, МО2012075426А2), подія 8291.45.36.2 (соєві боби, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер. РТА-11335,

УМО2012075429А2), подія 5УНТОН2 (соєві боби, АТСС обліковий номер. РТА-11226,

УМО2012/082548А2), подія МОМ88701 (бавовник, АТСС обліковий номер РТА-11754,

МО2012/134808А1), подія КК179-2 (люцерна АТСС обліковий номер РТА-11833,

МО2013/003558А1), подія ррАВ8264.42.32.1 (соєві боби, накопичена стійкість до гербіцидів,

АТСС обліковий номер РТА-11993, М/О2013/010094А1), подія М2ОТО9У (кукурудза, АТСС обліковий номер РТА-13025, УМО2013/012775А1), подія 4114 (маїс, боротьба з комахами, АТС обліковий номер РТА-11506) М/О201314901, подія МОМ87411 (маїс, АТСС обліковий номер

РТА-12669) УМО2013169923, подія А26-5 (бавовник, боротьба з комахами) ММО2013170398, подія

А2-6 (бавовник, боротьба з комахами) М/О2013170399, подія 9582.816.15.1 (соєві боби, боротьба з комахами, стійкість до гербіцидів), АТСС обліковий номер РТА-12588)

УММО2014004458, подія 33121 (маїс, боротьба з комахами, стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер РТА-13392) ММО2014116854, подія 32218 (маїс боротьба з комахами, стійкість до гербіцидів, АТСС обліковий номер РТА-13391) ММО2014116989, подія "ЗРТ-78-9490 5РІТ-7В-

Зо 14250" (чоловіча стерильність рису) ММО2014154115, подія МОМ87751 (соєві боби, АТСС обліковий номер. РМЖА-120166) УУО2014201235, подія "РроО09-401 РрО09-415 Рро09-469" (дернина, АТСС обліковий номер РТА-120354, РТА-120353, РТА-120355) УМО2015006774, подія

В52-Х5 (томат, АТСС) УМО2015017637, подія МОМ87403 (маїс, урожай зерна, АТСС обліковий номер РТА-13584 М/О2015053998, подія 32218 (маїс, боротьба з комахами, АТСС обліковий номер РТА-13391) МО2015112182.

Е. Полінуклеотидні конструкції

Полінуклеотиди, що кодують поліпептиди ГФПД відповідно до даного винаходу, можуть бути модифіковані для одержання або посилення експресії в рослинних клітинах. Полінуклеотиди, що кодують ідентифіковані у даній заявці поліпептиди, можуть бути забезпечені в експресійних касетах для експресії у відповідній рослині. "Експресійна касета рослини" містить конструкцію

ДНК, включаючи рекомбінантну конструкцію ДНК, здатну призводити до експресії полінуклеотиду в рослинній клітині. Касета може включать в напрямку 5'-3' транскрипції область ініціації транскрипції (тобто промотор, зокрема гетерологічний промотор) функціонально з'єднаний з одним або декількома відповідними полінуклеотидами, і/або область термінації трансляції і транскрипції (тобто область термінації), які функціонують в рослинах. Касета також може додатково містити щонайменше один додатковий полінуклеотид, який вводять в організм, такий як селектовуваний маркерний ген. Альтернативно, додатковий полінуклеотиді(ї) може бути забезпечений на касетах множинної експресії. Подібна експресійна касета забезпечена множиною сайтів рестрикції для вставки полінуклеотиду(ів) так, щоб він підпадав під регуляцію транскрипції в регуляторних областях.

В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до химерного гену, який містить кодуальну послідовність, яка містить гетерологічну нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, функціонально зв'язану з експресованим в рослинах промотором і необов'язково ділянкою переривання транскрипції і поліаденілювання. "Гетерологічний" загалом, відноситься до полінуклеотиду або поліпептиду, що не є ендогенним для клітини або не є ендогенним для розташування в природному геномі, у якому він є в наявності, й доданому в клітину шляхом інфекції, трансфекції, мікроїін'єкції, електропорації, мікропроекції або т.п. Під "функціональним зв'язком" мають на увазі функціональний зв'язок між двома полінуклеотидами. Наприклад, коли промотор функціонально зв'язаний з послідовністю ДНК, то послідовність промотора ініціює й бо виступає проміжною ланкою в транскрипції послідовності ДНК. Визнано, що функціонально з'єднані полінуклеотиди можуть бути суміжними, а можуть і не бути, і там, де цей термін використовують для позначення сполуки двох ділянок, що кодують поліпептид, поліпептиди експресуються в одній і тій самій рамці зчитування.

Промотором може бути будь-яка полінуклеотидна послідовність, що демонструє транскрипційну активність у вибраних рослинних клітинах, частинах рослин або рослинах.

Промотор може бути природним або аналогічним, або ж чужорідним і гетерологічним, по відношенню до рослини-хазяїна і/або послідовності ДНК згідно з винаходом. Якщо промотор є "природним" або "аналогічним" по відношенню до рослини-хазяїна, то мають на увазі, що промотор присутній у природній рослині, у яку його вводять. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" по відношенню до послідовності ДНК згідно з винаходом, то мають на увазі, що промотор не є природним промотором або не зустрічається в природі для функціонально зв'язаної з ним послідовності ДНК згідно з винаходом. Промотор може бути індукованим або конститутивним. Він може зустрічатися в природі, бути складеним із частин різних промоторів, що зустрічаються в природі, або ж може бути частково або повністю синтетичним. Посібник із проектування промоторів надає дослідження структури промоторів, такі як у Нагієу апа Кеупоїдз5 (1987) Мисівіс Асідб5 Вев. 15:2343-2361. Крім того, може бути оптимізовано розташування промотора відносно старту транскрипції. Див., наприклад, Кобегів еї аї. (1979) Ргос. Маї!. Асаа.

Зсі. США, 76:760-764. Для застосування в рослинах у цій галузі техніки добре відомі багато придатних промоторів.

Наприклад, придатні конститутивні промотори для застосування в рослинах містять: промотори вірусів рослин, таких як промотор каулімовірусу хлоротичної смугастості арахісу (РСІБМ) (Патент США Мо 5,850,019); промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму) (баеї! й інш. (1985) Маїшге 313:810-812); промотори метилтрансферазних генів вірусу СпіогеПа (Патент

США Мо 5,563,328) і повнорозмірний промотор транскрипції вірусу мозаїки ранника (ЕММ) (Патент США Мо 5,378,619); промотори таких генів, як рисовий актин (МеЕїгоу й інш. (1990) Ріапі

Сеї! 2:163-171 і Патент США Мо 5,641,876); убіквітин (Спгістепзеп й інш. (1989) Ріапі Мої. Віоі. 12:619-632 і Спгієтепзеп й інш. (1992) Ріапі Мої. Віо!. 18:675-689); РЕМИ (І аві й інш. (1991) Тпеог.

Аррі. Сепеї. 81:581-588); МА5 (МеМеп й інш. (1984) ЕМВО .). 3:2723-2730 і Патент США Мо 5,510,474); гістон НЗ кукурудзи (І ереїй й інш. (1992) Мої. беп. Сепеї. 231:276-285 і Агапаззома й

Зо інш. (1992) Ріапі 9. 2(3):291-300); Вгазвіса пари5 АГ 53 (РСТ-заявка УМО97/41228); ген малої субодиниці рослинної рибулозо-біскарбоксилази/оксигенази (КиВібзС; цирковірус (АО 689 311) або вірус мозаїки прожилок маніоки (С5ММУМ, 05 7,053,205); а також промотори різних генів

Адгорасієегічт (див. Патенти США Мо 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; і 5,428,147).

Придатні індуковані промотори для використання в рослинах містять: промотор з системи

АСЕЇТ, що реагує на мідь (Мей й інш. (1993) РМАЗ 90:4567-4571); промотор гена кукурудзи Іпг, що реагує на бензолсульфонамідні гербіцидні сафенери (Негепеу й інш. (1991) Мої. сеп.

Сепеїїйсв 227:229-237 і Саї; й інш. (1994) Мої. Сеп. Сепеїїс5 243:32-38); а також промотор репресора Теї з Тп10 (Саї; й інш. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 227:229-237). Іншим індукованим промотором для використання в рослинах є той, який реагує на агент, який індукує, на який рослини в нормі не реагують. Прикладом індукованого промотора такого типу є індукований промотор гену стероїдного гормону, транскрипційна активність якого індукується гормоном- глюкокортикостероїдом (5спепа й інш. (1991) Ргос. Маї). Асад. сі. США 88:10421) або недавнє застосування химерного активатора транскрипції ХМЕ, для використання в заснованій на рецепторе естрогену індукованої системи експресії в рослинах, що активується естрадіолом (оо й інш. (2000) Ріапі 9., 24:265-273).

Інші індуковані промотори для використання в рослинах описані в ЕР 332104, РСТ УМО 93/21334 і РСТ УМО 97/06269, які включені в даний опис у повному обсязі шляхом посилання.

Можуть бути також використані промотори, складені з частин інших промоторів, і частково або повністю синтетичні промотори. Див., наприклад, Мі й інш. (1995) Ріапі 9. 7:661-676 і РСТ МО 95/14098, що описують такі промотори для застосування в рослинах.

В одному варіанті здійснення даного винаходу для експресії білків ГФПД згідно з винаходом може бути використана послідовність промотора, специфічна для конкретних ділянок або тканин рослин, така як промотори, специфічні для насіння (Оацйа, К. й інш., 1997, Вібтесппоіоду

Апп. Вем. 3, 269-296), особливо промотор напіну (ЕР 255 378 АТ), промотор фазеоліну, промотор глютеніну, промотор геліантиніну (М/О92/17580), промотор альбуміну (М/О98/45460), промотор олеозину (ММО98/45461), промотор 5АТІ1 або промотор ЗАТЗ (РСТ/О598/06978).

Також можна використовувати індукований промотор, переважно вибраний з фенілаланінамоніаліази (ФАЛ), НМО-КоА редуктази (НМС), хітинази, глюканази, інгібітора протеїнази (ІП), гена родини РК, нопалінсинтази (по5) і промоторів мерВ (005 5 670 349, 60 Таблиця 3), промотора НМО2 (05 5 670 349), промотора яблучної бета-галактозидази (ЯБГ1) і промотора яблучної аміноциклопропанкарбоксилатсинтази (АЦК-синтази) (М/098/45445). В конструкціях згідно з винаходом можуть бути використані численні промотори, у тому числі які йдуть один за іншим.

Промотор може включати, або бути модифікованим таким чином, щоб містити один або більшу кількість елементів-енхансерів. В деяких варіантах здійснення промотор може містити множину елементів-енхансерів. Промотори, що містять елементи-енхансери, забезпечують більше високі рівні транскрипції у порівнянні з промоторами, які їх не містять. Придатні для використання в рослинах елементи-енхансери містять елемент-енхансер РСІЗМ (Патент США

Мо 5,850,019), елемент-енхансер СамМм 355 (Патент США Мо 5,106,739 і 5,164,316) і елемент- енхансер ЕММ (Майї й інш. (1997) Тгапздепіс Ке5. 6:143-156); активатор трансляції вірусу тютюнової мозаїки (ТММ), описаний у заявці М/О87/07644, або вірусу тютюнового гравіювання (ТЕМ), описаних Саїтіпдіоп 4 Егеей 1990, У). МігоїІ. 64: 1590-1597, наприклад, або інтронів, таких як інтрон адп1 кукурудзи або інтрон 1 рисового актину. Див. також РСТ УуО96/23898,

УМО2012/021794, УМО2012/021797, ММО2011/084370 ї ММО2011/028914.

Часто подібні конструкції можуть містити 5' і 3' нетрансльовані області. Подібні конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення ко- трансляційного або посттрансляційного транспорту розглянутого пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласти (або інші пластиди), ендоплазматичного ретикулуму або апарату Гольджі, або ж бути здатним до секреції. Наприклад, конструкція може бути спроектована таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переходу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Під "сигнальною послідовністю" слід розуміти послідовність, про яку відомо або передбачають, що результатом її дії є ко-трансляційний або посттрансляційний транспорт пептиду через клітинну мембрану. В еукаріотів це звичайно охоплює секрецію в апарат Гольджі, з деяким результівним глікозилюванням. Під "лідерною послідовністю" слід розуміти будь-яку послідовність, яка при трансляції дає амінокислотну послідовність, достатню для запуску ко-трансляційного транспорту пептидного ланцюга в субклітинну органелу.

Таким чином, це містить лідерні послідовності, націлені на транспорт і/або глікозилювання через перехід в ендоплазматичний ретикулум, перехід в вакуолі, пластиди, включаючи хлоропласти, мітохондрії тощо. Може також виявитися переважним сконструювати рослинну експресійну касету, що містить інтрон, так що для експресії необхідним є процесинг цього інтрону в мРНК.

Під "3 нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований нижче послідовності, яка кодує. Сигнальні послідовності поліааденілювання й інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на додавання ділянок поліаденіловои кислоти до 3'-кінця прекурсору мРНК, є 3'-чсетрансльованими ділянками. Під "5' нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований вище послідовності, яка кодує.

Інші нетрансльовані елементи вище або нижче містять енхансери. Енхансери представляють собою полінуклеотиди, дія яких підсилює експресію ділянки-промотора.

Енхансери добре відомі у даній галузі техніки і містять, але не обмежуються ними, ділянку- енхансер 5М40 і ділянку-енхансер 355.

Область термінації може бути спорідненою з областю ініціації транскрипції, може бути рідною з послідовністю відповідно до даного винаходу, або може бути одержана з іншого джерела. Придатні області термінації є доступними з Ті-плазміди А. іштегасієп5, такі як області термінації октопинсинтази і нопалінсинтази. Див. також Сиегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Се! 64:671-674; Запіасоп єї аІ. (1991) Сепе5 Оем. 5:141-149;

Модеп еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-14272; Мипгое еї аї. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїйаз еї аї. (1989) Мисівїс Асід5 Нев. 17:7891-7903; Що5пі еї аї. (1987) Мисівіс Асій Нев. 15:9627-96359; і

Європейську патентну заявку ЕР 0 633 317 А1.

В одному з аспектів винаходу синтетичні послідовності ДНК проектують для заданого поліпептиду, такого як поліпептиди згідно з винаходом. Експресія відкритої рамки зчитування синтетичної послідовності ДНК в клітині призводить до вироблення поліпептиду згідно з винаходом. Синтетичні послідовності ДНК можуть бути корисними для простого видалення небажаних сайтів рестрикції ендонуклеаз, для сприяння стратегіям клонування ДНК, для зміни або усунення будь-якого потенційного зсуву кодонів, для зміни або покращення вмісту ГЦ, для усунення або зміни альтернативних рамок зчитування, і/або для усунення або зміни сайтів розпізнавання сплайсингу інтронів/екзонів, сайтів поліаденілювання, послідовностей Шайна-

Дальгарно, небажаних елементів-промоторів тощо, які можуть бути присутні в нативній послідовності ДНК. Можливо також використання синтетичних послідовностей ДНК для 60 введення інших покращень у послідовність ДНК, таких як введення інтронної послідовності,

створення послідовності ДНК, яка експресується як злитий білок до націлених на органели послідовностей, таким як транзитні пептиди хлоропластів, націлені на апопласти/вакуолі пептиди, або пептидні послідовності, що приводять до утримання результівного пептиду в ендоплазматичному ретикулумі. Синтетичні гени можуть також бути синтезовані із застосуванням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращеної експресії, або можуть бути синтезовані із застосуванням кодонів із частотою, переважною для хазяїна. Див., наприклад, СатрбеїЇ апа Сом (1990) Ріапі Рпузіої. 92:1-11; Патенти США Мо 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; і 5,436,391, опубліковані патентні заявки США Мо 20040005600 і 20010003849, і Миггау й інш. (1989) Мисівїс Асій5 Нев. 17:477-498, включені в даний опис за допомогою посилання.

В одному з варіантів здійснення цільові полінуклеотиди для експресії націлені на хлоропласт. У цьому способі, якщо цільовий полінуклеотид не вводиться безпосередньо в хлоропласт, то експресійна касета додатково містить полінуклеотид, що кодує транзитний пептид для спрямовування цільового нуклеотиду в хлоропласти. Подібні транзитні пептиди відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неї|пе й інш. (1991) Ріапі Мої. Віої!. Кер. 9:104- 126; Сіагк й інш. (1989) 9. ВіоІ!. Спет. 264:17544-17550; ОеПа-Сіорра й інш. (1987) Ріапі Рпузіої. 84:965-968; Котег й інш. (1993) Віоспет. Віорпу5. Ке5. Соттип. 196:1414-1421; і 5папй й інш. (1986) Зсієпсе 233:478-481.

Цільові полінуклеотиди, які спрямовуються в хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропласті з урахуванням різниці у використанні кодонів у рослинному ядрі й цієї органелі. Таким способом цільові полінуклеотиди можуть бути синтезовані із застосуванням переважних для хлоропластів кодонів. Див., наприклад, Патент США Мо 5,380,831, включений в даний опис за допомогою посилання.

Така експресійна касета рослин може бути введена у вектор трансформації рослини. Під "вектором трансформації" слід розуміти молекулу ДНК, що робить можливою трансформацію клітини. Подібна молекула може складатися з однієї або більшої кількості експресійних касет і може бути організована в більше ніж одну векторну молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори представляють собою вектори трансформації рослин, що використовують два несуміжних вектори ДНК для кодування всіх необхідних цис- і транс-діючих функцій для трансформації

Зо рослинних клітин (Неїеп5 апа Мийпеаих (2000) Тгепаз іп Ріапі Зсіепсе 5:446-451). "Вектор" означає полінуклеотидну конструкцію, розроблену для перенесення між різними клітинками- хазяями. "Вектор експресії" означає вектор, що має здатність містити, інтегрувати й експресувати гетерологічну послідовність ДНК або її фрагменти в чужорідній клітині.

Вектор трансформації рослини містить один або більшу кількість векторів ДНК для досягнення трансформації рослини. Наприклад, загальноприйнятою практикою у даній галузі техніки є застосування векторів трансформації рослини, що містять більше ніж один суміжний сегмент ДНК. Ці вектори часто позначають як бінарні вектори. Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найбільш часто використовують для опосередкованої Адгорасієгічт трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, потрібних для досягнення ефективної трансформації, є дуже великими, і вигідно розділяти функції на окремі молекули ДНК. Бінарні вектори зазвичай містять плазмідний вектор, який містить цис-діючі послідовності, необхідні для перенесення Т-ДНК (такі як лівий примежовий район і правий примежовий район), селектовуваний маркер, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, і "цільовий полінуклеотид" (полінуклеотид, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, для якої бажано створення трансгенних рослин). Також у цьому плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для бактеріальної реплікації. Цис-діючі послідовності розташовані так, щоб дозволити ефективний трансфер в рослинні клітини і експресію в них. Наприклад, послідовність селектовуваного маркера і цільова послідовність розташовані між лівим і правим примежовими районами. Часто другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, що виконують роль проміжної ланки в перенесенні Т-ДНК з Адгобасіегішт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить функції вірулентності (гени Міг), що роблять можливим інфікування рослинних клітин АдгоБрасіегішт, і перенесення ДНК шляхом розщеплення на примежових послідовностях і мі-опосередковане перенесення ДНК, як це розуміють у даній галузі техніки (НеПеп5 апа Мипйпеаийх (2000) Тгепаз іп Ріапі Зсіепсе, 5:446-451). Для трансформації рослин можуть бути використані декілька типів штамів Адгобасіегічт (наприклад, І! ВА4404, 5МУ3101,

ЕНАТОЇ, ЕНАТО5, тощо). Другий плазмідний вектор не є необхідним для введення полінуклеотидів в рослини іншими методами, такими як мікропроекція, мікроін'єкція, електропорація, поліетиленгліколь тощо. 1. б. Трансформація рослин

Способи відповідно до винаходу містять введення нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" слід розуміти презентацію нуклеотидної конструкції рослині таким способом, що згадана конструкція одержує доступ усередину клітини рослини. Способи відповідно до винаходу не потребують використання особливого метода для введення нуклеотидної конструкції в рослину, а тільки того, щоб нуклеотидна конструкція одержала доступ усередину щонайменше однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструкцій в рослини відомі у даній галузі включаючи, але не обмежуючись ними, або методи стабільної трансформації, тимчасової трансформації й опосередковані вірусами методи. Див., наприклад, способи трансформації рослинних клітин і регенерації рослин, описані в: 05 4,459,355, 05 4,536,475, 005 5,464,763, 05 5,177,010, 005 5,187,073, ЕР 267,159 АТ, ЕР 604 662 АТ, ЕР 672 752

АТ, 05 4,945,050, 005 5,036,006, 005 5,100,792, 005 5,371,014, 05 5,478,744, 5 5,179,022, 05 5,565,346, 05 5,484,956, 05 5,508,468, 05 5,538,877, 05 5,554,798, 05 5,489,520, 05 5,510,318, 55204253, 05 5,405,765, ЕР 442 174 АТ, ЕР 486 233 АТ, ЕР 486 234 АТ, ЕР 539 563 АТ, ЕР 674 725 А1, М091/02071, М/095/06128, МО2011/095460, М/О2012006439А2, МО2012006443А2,

МО2012015039А1, ММО2012019660А1, ММО2012021494А1, М/О2012064827А1, МО2012075562А1,

МО2012077664А1, ММО2012083137А1, ММО2012084962А1, МО2012092577А1, МО2012109947А1,

МО2012129443А2, МО2012138629А2, ММО2012139416А1, ММО2012149011А1, М/О2013014585А1,

МО2013025670А1, МО2013033308А2, ММО2013066007А1, МУО2013077420А1, ММО2013090734А1,

МО2013149726А1, ММО2013180311А1, МУО2014029044А1, М/О2014029045А1, МУО2014062036А1,

МО2014065857А1, ММО2014100234А1, ММО2014100406А1, М/О2014123208А1, М/О2014143304А1,

МО2014144513А2, МО2014157541А1, МУО2014200842А2, МО2015051083А1, ММО2015077620А1,

УМО2015085990А1, УМУО2015099674А1, УУО2015118640А1, УМО2015119166А1, кожна з який включена в даний опис шляхом посилання, особливо стосовно описаних методів трансформації.

У цілому методи трансформації рослин містять перенос гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, незрілі або зрілі ембріони, суспензійні культури, недиференційваний калус, протопласти тощо), за яким іде застосування максимального порогового рівня придатного селектора (в залежно від гена селектовуваного маркера) для виділення трансформованих клітин рослин з нетрансформованої клітинної маси. Експлантати

Зо звичайно переносять у таке ж свіже середовище й культивують у плановому порядку. Після цього трансформовані клітини диференціюють у паростки після поміщення в регенераційне середовище з додаванням максимального порогового рівня селективного агента. Паростки потім переносять на селективне середовище для вкорінення з метою одержання вкоріненого паростка або саджанця. Трансгенні саджанці потім вирощують до зрілих рослин і вони збирають родюче насіння (наприклад, Нівї й інш. (1994) Тпе Ріапі дошигпаї! 6:271-282; ІзПпіда й інш. (1996)

Маїйге Віоїесппоіоду 14:745-750). Експлантати звичайно переносять у таке ж саме свіже середовище і культивують у плановому порядку. Загальний опис технік і методів створення трансгенних рослин можна знайти у Ауге5 апа Рак (1994) Стйіса! Кемієм5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 апа Воттіпепі апа Уашнаг (1997) Маудіса 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, то в будь-який частини цільового калусу, що піддають обробці або тканини або групи клітин присутні як трансформовані, так і нетрансформовані клітини.

Здатність убивати нетрансформовані клітини і дозволяти трансформованим клітинам розростатися приводить до трансформованих культур рослин. Часто здатність забирати нетрансформовані клітини є обмеженням швидкого виділення трансформованих клітин і успішного створення трансгенних рослин. Для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного цільового гена в геномі трансгенної рослини можуть бути використані молекулярні й біохімічні методи.

Створення трансгенних рослин може бути здійснено одним або декількома методами, включаючи, але не обмежуючись ними, введення гетерологічної ДНК в клітини рослин за допомогою Адгобасіегіит(Адгобасіегішт-опосередкована трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, прикріпленою до частинок, і різні інші прямі або опосередковані методи перенесення ДНК без участі частинок (наприклад, Ніеєї й інш. (1994)

Те Ріапі Ууоштпаї 6:271-282; І5піда й інш. (1996) Маїиге Віоїесппоіїоду 14:745-750; Ауге5 апа Рак (1994) Стйіса!| ВНеміємув іп Ріапі 5сіеєпсе 13:219-239; Воттіпепі апа дашнаг (1997) Маудіса 42:107- 120).

Методи трансформації хлоропластів відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, мар й інш. (1990) Ргос. Май). Асад. Зсі. США 87:8526-8530; 5мабр апа Маїїда (1993) Ргос. Маї)!. Асад. зсі.

США 90:913-917; мар апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Метод заснований на доставці

ДНК, що містить селектовуваний маркер, за допомогою генної гармати, і націлюванні ДНК на бо пластидний геном через гомологічну рекомбінацію. Крім того, трансформація пластид може бути виконана трансактивацією мовчазного стійкого пластидою трансгена шляхом переважної тканинної експресії ядернокодованої пластидоспрямованої РНК-полімерази. Про таку систему повідомляли в МеВгіде й інш. (1994) Ргос. Май. Асад. 5сі. США 91:7301-7305.

Трансформовані рослинні клітини можуть бути вирощені до рослин згідно зі стандартними методиками. Див., наприклад, МеоСогптіск й інш. (1986) Ріапі Сеї! Керогі5 5:81-84. Ці рослини можуть бути вирощені й обпилені таким самим трансформованим штамом або іншими штамами, з одержанням гібрида, що має конститутивну експресію бажаної фенотипової характеристики. Можуть бути вирощені два або декілька поколінь, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипової характеристики стабільно підтримується і успадковується, а потім може бути зібране насіння для того, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипової характеристики досягнута. Таким способом даний винахід надає трансформоване насіння (також позначають як "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію відповідно до винаходу, наприклад, експресійну касету відповідно до винаходу, стабільно включену в геном. В різних варіантах здійснення насіння може бути покрито щонайменше одним фунгіцидом і/або щонайменше одним інсектицидом, щонайменше одним гербіцидом, і/або щонайменше одним сафенером, або будь-який їх комбінацією.

Н. Оцінка трансформації рослин

Після введення гетерологічної чужорідної ДНК в клітини рослин трансформацію або інтегрування гетерологічного гена в геном рослини підтверджують різними методами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків і метаболітів, пов'язаних з інтегрованим геном.

Швидким способом скринінгу трансформованих клітин, тканин або паростків на присутність включеного гена на ранній стадії перед пересадженням у грунт є аналіз ПЛР (ЗатьгоокК апа

Виззеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпа: А І абогаюгу Мапиаї (Соїд 5ргіпд Натбог І арогаїогу Ргез5, Соїа зргіпд Нагрог, МУ)). ПЛР здійснюють, використовуючи олігонуклеотидні праймери, специфічні для цільового гена, або векторний фон Адгорасіегішт тощо.

Трансформація рослин може бути підтверджена саузерн-блот-аналізом геномної ДНК (ЗатргооК апа Кизхзеї! (2001) вище). У цілому, загальну ДНК екстрагують з трансформанта, розщеплюють за допомогою придатних ферментів-рестриктаз, фракціонують в агарозному гелі й переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрана або "блот" потім може бути зондована, наприклад, міченим радіоактивним ЗР фрагментом цільової ДНК для підтвердження включення введеного гена в геном рослини відповідно до стандартних методик (ЗатбгоокК апа Киззеї|, 2001, вище).

У нозерн-аналізі виділяють РНК з конкретних тканин трансформанту, фракціонують у формальдегід-агарозному гелі й наносять на нейлоновий фільтр відповідно до стандартних процедур, звичайно використовуваних у даній галузі (ЗатргоокК апа КиззеїЇ, 2001 зирга).

Експресію РНК, яку кодують нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу, потім перевіряють гібридизацією фільтра з радіоактивним зондом, одержаним з БОС відомими методами (ЗатьгоокК апа Киззеї| (2001) вище). РНК також може бути виявлена і/або визначена кількісно із застосуванням ПЛР зі зворотною транскриптазою, як відомо в рівні техніки (наприклад, Сгеєп апа Затогоок (2012) МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогафогу Мапаиаї, 42 изданиє, Соїд

Зргіпу Наог І арогаюгу Ргезз, Моодригу, МУ).

Трансгенні рослини можуть бути проаналізовані методами вестерн-блотингу, ЕГІЗА, тестами із краплею рідини, що розтікається, й біохімічними аналізами, для визначення наявності білка, який кодується геном стійкості до гербіциду, шляхом стандартних процедур (Затьгоок апа Киззеї! (2001) вище), використовуючи антитіла, зв" що зв'язуються з одним або більшою кількістю епітопів, що присутні на білку стійкості до гербіциду.

В одному з аспектів винаходу описані у даній заявці гени ГФПД придатні як маркери оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин.

І. Застосування як маркера трансформації

Винахід також відноситься до застосування в способі трансформації рослин нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД відповідно до винаходу, як маркерного гена або як послідовності, що кодує, яка робить можливим надання рослині стійкості до гербіцидів, які є інгібіторами ГФПД, і застосування одного або більшої кількості інгібітора (-ів) ГФПД на рослинах, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД відповідно до винаходу. Див., наприклад,

Патент США 6,791,014, включений у даний опис у повному обсязі шляхом посилання.

У цьому варіанті здійснення інгібітор ГФПД може бути введений в культуральне середовище компетентних рослинних клітин, щоб знебарвити згадані клітини перед трансформацією.

Знебарвлені компетентні клітини потім трансформують геном стійкості до інгібіторів ГФПД, як селектовуваним маркером, і трансформовані клітини, що включили зазначений маркер у свій

Зо геном, стають зеленими, уможливлюючи їх виділення. Подібний процес може зменшити час, необхідний на відбір трансформованих клітин.

Таким чином, один з варіантів здійснення даного винаходу полягає в способі трансформування рослинних клітин введенням гетерологічного гена в зазначені рослинні клітини з геном стійкості до інгібіторів ГФПД як селектовуваного маркера, при цьому спосіб містить підготовку й культивування компетентних рослинних клітин, здатних прийняти гетерологічний ген, на придатному середовищі, й введення достатньої кількості інгібітора ГФПД у придатне культуральне середовище з компетентними рослинними клітинами. Потім компетентні клітини трансформують гетерологічним геном і селектовуваним маркером, і трансформовані клітини, що містять гетерологічний ген, вирощують на придатному середовищі й відбирають трансформанти. Трансформовані клітини потім можуть бути регенеровані до плодоносної трансформованої рослини.

У). Рослини і частини рослин

Під "рослиною" слід розуміти цілу рослину, органи рослин (наприклад, листя, стебла, коріння тощо), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони і їх потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калус, клітини в суспензійній культурі, протопласти, клітини листя, клітини коренів, клітини флоеми, пилок).

Даний винахід може бути використаний для введення полінуклеотидів у будь-які види рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, однодольні й дводольні. Приклади цільових рослин містять, але не обмежуються ними, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, соєві боби, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь, олійний ріпак, види Вгаззіса, люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніоку, каву, кокос, ананас, цитрусові дерева, какао, чай, банани, авокадо, фігу, гуаву, манго, оливу, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочеві культури, декоративні рослини і хвойні дерева.

Овочеві рослини містять, але не обмежуються ними, томати, латук, зелений горошок, лімську квасолю, горох і членів з роду Сигситів, такі як огірок, канталупа і диня. Декоративні рослини містять, але не обмежуються ними, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, нарциси, петунії, гвоздики, пуансетію і хризантеми. Також можуть представляти інтерес сільськогосподарські культури, включаючи, наприклад, кукурудзу, сорго, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь, олійний ріпак тощо

Цей винахід є придатним для будь-якого члена родини однодольних рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, кукурудзу, рис, ячмінь, овес, пшеницю, сорго, жито, цукрову тростину, ананас, ямс, цибулю, банани, кокос і фініки.

К. Способи підвищення врожайності рослин

Надаються способи підвищення врожайності рослин. Способи містять забезпечення рослини, що містить полінуклеотид, або введення в рослину або рослинну клітину полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД відповідно до винаходу, вирощування рослини або її насіння в польових умовах і збирання врожаю з цих рослин або насіння. Як визначено у даній заявці "врожайність" рослини позначає якість і/або кількість біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" слід розуміти будь-який вимірюваний рослинний продукт. Підвищення вироблення біомаси представляє собою будь-яке покращення врожайності вимірюваного рослинного продукту. Підвищення врожайності рослин має декілька комерційних застосувань. Наприклад, підвищення біомаси листя рослин може підвищити врожайність листових овочів для вживання людиною й тваринами. Крім того, підвищення біомаси листя може бути використане для збільшення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів з рослин. Підвищення врожайності може включать будь-яке статистично значуще підвищення, включаючи, але не обмежуючись цим, підвищення щонайменше на 1 95, підвищення щонайменше на 3 95, підвищення щонайменше на 5 95, підвищення щонайменше на 1095, підвищення щонайменше на 2095, щонайменше на 3095, щонайменше на 50 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 100 95 або більше підвищення.

У конкретних способах рослину, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, обробляють ефективною концентрацією гербіциду, що інгібує ГФПД, такого як один або більшу кількість гербіцидів, які інгібують ГФПД, вибраних з групи, що містить гербіциди, які інгібують ГФПД з такого класу як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М- 60 (1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-

(метилсульфоніл)-4-«трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М- (тетразол-б-іл)- або /М-(триазол-5-іл)л'арилкарбоксаміди (переважно /2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, причому застосування гербіциду призводить до підвищення врожайності рослини.

Також забезпечені способи надання стійкості до гербіцидів рослині або частини рослини. В подібних способах в рослину вводять нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД згідно з винаходом, де експресія полінуклеотиду призводить до стійкості до гербіцидів, які інгібують

ГФПД. Рослини, створені таким способом, можуть бути оброблені ефективною концентрацією гербіциду (такого як один або більшу кількість гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних з групи, яка складається з гербіцидів, які інгібують ГФІПД з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат),

М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4-«(трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 17"); 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони і проявлять підвищену стійкість до гербіциду. "Ефективна концентрація" гербіциду у даній заявці означає кількість, достатню для уповільнення або зупинки зростання рослин або частин рослин, які не мають вродженої або набутої стійкості до гербіциду.

І. Способи боротьби з бур'янистими травами в польових умовах

Зо Даний винахід також відноситься до способу боротьби з небажаними рослинами або регулювання зростання рослин в посівах рослин, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД відповідно до винаходу, де один або більшу кількість гербіцидів, які інгібують ГФПД, наприклад, один або більшу кількість гербіцидів, які інгібують ГФПД, вибрані з групи, яка складається з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), /М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)/бензаміди, /- М-(1,3,4- оксадіазол-2-іл)бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М- (тетразол-б-іл)- або /М-(триазол-5-іл)л'арилкарбоксаміди (переважно /2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 17"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, застосовують на рослини (наприклад, шкідливі рослини, такі як однодольні або дводольні бур'янисті трави або небажані культурні рослини), на насіння (наприклад, зерно, насіння або вегетативні пагони, такі як бульби або паросткові частини з бруньками) або в зоні вирощування рослин (наприклад, зоні культивування). У цьому контексті ефективна

БО концентрація одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, наприклад, одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, вибраних з групи, що містить гербіциди, які інгібують ГФПД з такого класу, як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М- (1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М- (тетразол-б-іл)- або /М-(триазол-5-іл)л'арилкарбоксаміди (переважно /2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3- бо (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-

метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--'трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, може бути застосована, наприклад, до посадки (при необхідності шляхом введення у грунт), до появи або після появи, і може бути застосована в комбінації з іншими гербіцидами, до яких культура має вроджену стійкість або стійка через експресію одного або більше трансгенів стійкості до гербіцидів. Див., наприклад, 0.5. Арр. Рир. Мо. 2004/0058427 і заявку

РСТ Мо Публ. УМО98/20144. Під "ефективною концентрацією" слід розуміти концентрацію, яка контролює зростання або розповсюдження бур'янистих трав або інших нетрансформованих рослин без значного впливу на стійку до інгібітора ГФПД рослину або насіння. Спеціалістам у даній галузі зрозуміло, що застосування гербіцидів може приймати багато різних форм і може мати місце в різний час до і/або під час посіву насіння і процесу зростання. "Досходове" застосування представляє собою застосування гербіциду у відповідному місці (наприклад, полі або площі вирощування) до видимого сходження рослини з грунту. ""Післясходове" застосування представляє собою застосування гербіциду у відповідному місці після видимого сходу рослини з грунту. В деяких випадках терміни "досходовий" і "післясходовий" застосовують відносно бур'янистих трав у відповідному місці, а в деяких випадках ці терміни застосовують відносно культурної рослині у відповідному місці. При застосуванні відносно бур'янистих трав ці терміни можуть відноситися до конкретного типу або виду бур'яну, які знаходяться або передбачається їх поява у відповідному місці. "Допосадкове введення" гербіциду містить у себе введення сполук у грунт до садіння.

Таким чином, даний винахід містить у собі спосіб боротьби з бур'янистими травами в полі, який полягає в тому, що в поле висаджують рослину або її насіння, що містять запропонований в даному винаході поліпептид ГФПД, і на зазначену рослину або площу, яка оточує зазначену рослину, наносять ефективну концентрацію одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують

ГФПД.

В одному варіанті здійснення даного винаходу поле, яке повинно бути засаджено рослинами (такими як соєві боби, бавовник, кукурудза, або наприклад рослини пшениці), які містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблено гербіцидом, що

Зо інгібує ГФПД, таким як ізоксафлутол (ІЕТ), до садіння рослин або посіву насіння, який очищує поле від бур'янистих трав, які знешкоджуються гербіцидом, що інгібує ГФПД, дозволяє використовувати практики нульової обробки грунту, з наступною посадкою або посівом рослин на цьому ж попередньо обробленому полі (контактне застосування гербіциду, що інгібує ГФПД).

Залишкова активність ІТ також буде захищати рослини, які з'являються і ростуть від конкуренції з бур'янистими травами на ранніх стадіях зростання. Коли рослини досягають певного розміру, і бур'янисті трави як правило, з'являються знову, поверх рослин може бути застосований глуфосинат або гліфосат, або ж гербіцид, що інгібує ГФПД або суміш гербіциду, що інгібує ГФПД з іншим гербіцидом, таким як гліфосат, якщо такі рослини є стійкими до зазначеним гербіцидів.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, поле, засіяне насінням, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблено гербіцидом, що інгібують ГФПД, таким як ІЄТ, до появи рослин, але після посіву насіння (поле може бути попередньо очищено від бур'янистих трав іншими засобами, звичайно стандартними практиками обробки грунту, такими як орання, глибоке орання або підготовка посівних місць), при цьому залишкова активність буде підтримувати поле чистим від бур'янистих трав, знищених гербіцидом, так що рослини, які з'являються і ростуть не мають конкуренції з бур'янистими травами (досходове застосування гербіциду, що інгібує ГФПД). Коли рослини досягають визначеного розміру, і бур'янисті трави можуть з'явитися знову, поверх рослин може бути застосований глуфосинат або гліфосат, або ж гербіцид, що інгібує ГФПД або суміш гербіциду, що інгібує ГФПД з іншим гербіцидом, таким як гліфосат, якщо такі рослини є стійкими до зазначених гербіцидів.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, рослини, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, можуть бути оброблені гербіцидом, що інгібують ГФПД, поверх рослин, які вже з'явились з висіяного насіння, що очищує поле від бур'янистих трав, знешкоджених гербіцидом, що інгібує ГФПД, застосування якого можна здійснювати разом з (наприклад, у баковій суміші для обприскування), з наступною або попередньою обробкою гліфосатом або глуфосинатом як післясходовим гербіцидом поверх рослин (післясходове застосування гербіциду, що інгібує ГФПД (з або без гліфосату)), якщо такі рослини є стійкими до зазначених гербіцидів.

Приклади окремих представників однодольних і дводольних бур'янистих трав, з якими можна вести боротьбу за допомогою гербіциду, що інгібує ГФПД, містять:

Однодольні шкідливі рослини з родів: Аедіорз, Адгоругоп, Адговіїз, АІоресигив5, Арега, Амепа,

Вгасніапа, Вготивє, Сепспгиб5, Соттеїїпа, Суподоп, Сурегиз5, Оасіуіосієпішт, Оіднапна,

ЕсПіпоспіІоа, ЕПІеосНагі5, ЕІвивіпе, Егадгобії5, Епоспіоа, ЕРевіиса, Рітргівіуїйв5, Неїегапінега,

Ітрегаїа, Ізспаеєтит, І ероспіса, І от, Мопоспогіа, Рапісит, Разраїшт, РНаїйагі5, Рпієит, Роа,

Войбоеіа, Ззадіната, осігрив, Зеїага, 5огапит.

Дводольні шкідливі рослини з родів: Абшіоп, Атагапійи5, АтрБбго5іа, Апода, Апіпетів,

Арпапез, Апетівіа, Айрієх, Веїїї5, Відеп5, СарзеїІа, Сагдци5, Сазвіа, Сепіацгеа, Спепородійт,

Сіквішт, Сопмоїмиіив, Оаїшта, ЮОевтодійт, Етех, Егузітит, Еирпогбіа, СаїІеєорзів, Саїїпзода,

Саїїшт, Нірізсив, Іротоєа, Коспіа, Іатійт, І ерідіит, Гіпдетіа, Маїгісагіа, Мепіна, Мегсипіаїв,

Миїїшдо, Муозоїї5, Рарамег, РНатбії5, Ріапіадо, Роїудопит, Ропшаса, Напипсшив5, Нарпапив,

Вогірра, Роїаїа, Витех, зЗаївоїа, Зепесіо, Зезбрапіа, зіда, б5іпарі5, ЗХоїапит, опспив5, Зрпепосіва, зіеїЇагіа, Тагахасит, ТНІазврі, Титоїйшт, Опіса, Мегопіса, Міоіїа, Хапіпійт.

Гербіциди, які інгібують ГФПД, придатні в даному винаході, включаючи, але не обмежуючись гербіцидами, які інгібують ГФІПД, з такого класу як трикетони (переважно бензобіциклон, сулькотрион, мезотрион, темботрион, тефурилтрион, біциклопірон, фенквінотрион), дикетонітрили, ізоксазоли (переважно ізоксафлутол), гідроксипіразоли (переважно піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат), М-(1,2,5- оксадіазол-З-іл)/бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)убензаміди (переважно 2-метил-М-(5-метил- 1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-" метилсульфоніл)-4-"'трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 2"), М-(тетразол-5-іл)у- або М-(триазол-5-ілларилкарбоксаміди (переважно 2-хлор-3- етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-

З-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-ІМ-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (також згадується надалі як "Спол. 1"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфинил)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2-ілларилкарбоксаміди, триазинони і піразолони, можуть бути приготовлені у вигляді складів різними способами, залежно від переважних біологічних і/або фізико-хімічних параметрів. Прикладами можливих складів є:

Зо змочувальні порошки (МУР), водорозчинні порошки (5Р), водорозчинні концентрати, здатні до емульгування концентрати (ЕС), емульсії (ЕМУ), такі як емульсії типу "олія-в-воду" і "вода-в-олії", розчини для розпилення, суспензійні концентрати (5С), дисперсії на основі олії або води, змішувані з олією розчини, капсульні суспензії (С5), тонкі порошки (ОР), продукти для протравлювання насіння, гранули для застосування розкиданням і на грунт, гранули (СК) у вигляді мікрогранул, гранули для розпилення, покриті гранули і адсорбційні гранули, здатні до диспергування у воді гранули (М/С), водорозчинні гранули (505), склади наднизького об'єму ПМ, мікрокапсули і воски.

Ці окремі типи складів, в принципі, відомі й описані, наприклад, в: М/іппасКе!-Каспіег, "Спетізспе Тесппоїодіє" ІХімічна технологія), том 7, С. Напзег Мегіад Мипісп, 4-е вид. 1986;

Маде мап МаїЇКепригу, "Ревіїсіде Роптшиїайопв", Магсе! ОекКег, М.У., 1973; К. Мапйепв, "Зргау

Огуїпд" Напароок, 3-е вид. 1979, б. боодм/іп а. Гопаоп.

Необхідні допоміжні засоби для складів, такі як інертні речовини, поверхнево-активні речовини розчинники й інші добавки, рівним чином відомі і описані, наприклад, у: УмаїКіпв5, "Напабсок ої Іпзесіїсіде Юиві Онепів апа Сатієгїв", 2-е вид., Оапапа ВоокК5, СаЇдмжеї! М.У., Нм.

Оірнеп, "Іпітодисіюп Юю Сіау СоПоій Спетівігу"; 2-е вид., У. УМіеу 85 Боп5, М.У.; С. Магзаеєп, "БоЇмепів Спціде"; 2-е вид., Іпіегесіепсе, М.У. 1963; МеоСшиіїспеоп'є "Оеїегдепіє апа ЕЄтиїібійеге

Аппиа!" МО РибіІ. Согр., Віддежоой М.).; 5івієу апа М/осд, "Епсусіоредіа ої Бипасе Асіїме

Адепів", Спет. Рирі. Со. Іпс., М.У. 1964; Зспбпіеїді, "СгеплПаспепакіме Атуїепохідадаикіе"

ІПоверхнево-активні аддукти етиленоксиду|, М/55. Мепадздевзеїї, Штутгарт 1976;

М/іппасКе!-Киспіег, "Спетізспе Тесппоїодіє" (Хімічна технологія| том 7, С. Напзег Мепгіад

Мюнхен, 4-е вид. 1986.

На основі цих складів також можливо приготувати комбінації з іншими пестицидно активними речовинами, такими як, наприклад, інсектициди, акарициди, гербіциди, фунгіциди, а також з сафенерами, добривами й/або регуляторами росту, наприклад, у вигляді готових до застосування складів або у вигляді суміші в баку.

М. Способи введення гена згідно з винаходом в іншу рослину

У даній заявці також представлені способи введення нуклеотидної послідовності ГФПД згідно з винаходом в іншу рослину. Нуклеотидна послідовність ГФПД згідно з винаходом, або її фрагмент може бути введена в іншу рослину шляхом рекурентної селекції, зворотного схрещування, селекційного розведення, лінійної селекції, масової селекції, мутаційного розведення й/або селекції, посиленої генетичним маркером.

Таким чином, в одному варіанті здійснення способи згідно з винаходом містять в собі схрещування першої рослини, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом з другою рослиною для одержання спадкових рослин Е1 і відбирання спадкових рослин Н1, стійких до гербіциду, що інгібує ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом. Способи можуть також охоплювати схрещування відібраних спадкових рослин з першою рослиною, яка містить нуклеотидну послідовність згідно з винаходом, для одержання спадкових рослин зворотного схрещування і відбирання спадкових рослин зворотного схрещування, стійких до гербіциду, що інгібує ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність

ГФПД згідно з винаходом. Способи оцінки стійкості до гербіцидів, які інгібують ГФПД наведені у даній заявці в іншому місці. Крім того, способи можуть також охоплювати повторення цих стадій один або декілька разів послідовно для одержання відібраних спадкових рослин зворотного схрещування другого або наступних поколінь, стійких до гербіциду, що інгібує ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом.

У способі відповідно до даного винаходу може бути використаний будь-який метод розведення, що включає селекцію рослин за бажаним фенотипом. В деяких варіантах здійснення рослини Е1 можуть самозапилюватися для одержання покоління після розщеплення

Е2. Потім можуть бути відібрані окремі рослини, які являють собою бажаний фенотип (наприклад, стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД) у кожному поколінні (ЕЗ3, 4, Е5 тощо) поки ознаки не стануть гомозиготними або закріпленими всередині популяції для розведення.

Другою рослиною може бути рослина, яка має необхідну ознаку, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до посухи, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, покращена поживна цінність, стійкість до захворювань, покращений фотосинтез, покращена якість волокон, стійкість до стресів, покращене розмноження тощо. Друга рослина може бути елітною подією, як описано у даній заявці в іншому місці.

У різних варіантах здійснення частини рослин (цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, корені тощо), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони тощо) можуть бути

Зо зібрані з одержаного одноразового схрещування й або розповсюджені, або зібрані для подальшого використання для подальшого розмноження або обробки (такої як виробництво їжі, корму, біопалива, олії, борошна, вживання в їжу тощо).

М. Способи одержання рослинного продукту

Даний винахід також відноситься до способу одержання товарного продукту, який охоплює збирання врожаю і/або помел зерен культури, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, для одержання товарного продукту. Агрономічно й комерційно важливі продукти і/або композиції, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, корм для тварин, вироби, а також рослинні продукти і побічні продукти, призначені для використання як продуктів харчування для вживання у їжу людиною або для використання в композиціях і товарах, призначених для споживання людиною, зокрема позбавлених життєздатності насіння/зернових продуктів, у тому числі (напів-зоброблених продуктів, одержаних з таких зерен/насіння, причому зазначений продукт є або містить цілі або оброблене насіння або зерна, корм для тварин, кукурудзяне або соєве борошно крупного помелу, кукурудзяне або соєве борошно, кукурудзу, кукурудзяний крохмаль, соєве борошно крупного помелу, соєве борошно, пластівці, концентрат соєвого білка, ізоляти соєвого білка, текстурований концентрат соєвого білка, косметичні засоби, засоби з догляду за волоссям, соєва горіхова олія, натто, темпе, гідролізований соєвий білок, збиті вершки, шортенінг, лецитин, їстівні цілі соєві боби (сирі, смажені або як едамаме), соєвий йогурт, соєвий сир, тофу, юба, а також приготоване, шліфоване, оброблене паром, запечене або пропарене зерно тощо, призначені для включення в даний винахід якщо ці продукти і композиції містять виявлювальні кількості нуклеотидної і/або амінокислотної послідовності, викладеної у даній заявці як діагностичні для будь-якої рослини, що містить такі нуклеотидні послідовності.

Зазначені нижче приклади наведені з ілюстративною метою, а не для обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Огляд

Приклад 1: Створення мутованих поліпептидів ГФПД шляхом сайт-спрямованого мутагенезу

Приклад 2: Клонування, експресія й очищення рекомбінантних поліпептидів ГФПД дикого типу і мутантних поліпептидів ГФІПД

Приклад 3: Ферментний аналіз ГФПД для аналізу мутантних поліпептидів ГФПД з 60 покращеною стійкістю до гербіцидів, які інгібують ГФПД

Приклад 4: Покращена стійкість до гербіцидів, опосередкована обмінами залишків в поліпептидах ГФПД

Приклад 5: Аналіз коричневого кольору для тестування мутантних поліпептидів ГФПД, стійких до гербіцидів, які інгібують ГФОД

Приклад 6: трансформація соєвих бобів і стійкість рослин ТО соєвих бобів

Приклад 7: Створення і відбирання рослини бавовника ТО

Приклад 8: Трансформація рослинних клітин маїсу шляхом опосередкованої Адгорасіегійт трансформації

Приклад 9: Стійкість рослин соєвих бобів Т1 до гербіцидів, які інгібують ГФПД/польові дослідження

Приклад 1. Створення мутованих поліпептидів ГФПД шляхом сайт-спрямованого мутагенезу

Нуклеотидну послідовність ГФПД Рзепдотопах Пиогезсеп5 (5ЕО ІЮ МО:109), як описано в

УМО2009/144079, що кодує поліпептид ГФПД, що відповідає 5БЕО ІЮ МО:1 клонували згідно з добре відомими способами з рівня техніки і, як описано в УМО2014/043435. Подальший сайт- насичений мутагенез, сайт-спрямований мутагенез і комбінаторні варіанти з однією або декількома мутаціями нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність поліпептиду РІНРРО дикого типу, що кодує рекомбінантний поліпептид ГФПД, який відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1 здійснювали із застосуванням стандартного метода на основі ПЛР технологій, добре відомих з рівня техніки (і як описано в М/О2014/043435). Всі розроблені й синтезовані мутантні клони були підтверджені секвенуванням ДНК із застосуванням плазмідних специфічних олігонуклеотидів. У Таблиці 2 нижче наведені примірні мутантні поліпептиди ГФПД (ЗЕО ІЮ МО:2 - 5БЕО ІЮ МО 108).

Таблиця 2:

Зб

Таблиця 2:

Огляд примірних амінокислотних обмінів, що відповідають положенню амінокислоти в 5ЕО ІЮ МО:1 07 ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидуГФПДЗЕОІЮ МОЛ: 30 її | 5151 | ЇЇ |РІН|5| | |к. 3 її | /с1ЕЕЇ | Її |РІНнН|5| |У 32| | | |в8ЇЕЇ | Її |РІНнН|5| |У 33 | | | |(с1ЕЕЇ | Її |РІОоО|5|Ї |в 34| | | |(с1ЕЇ | | но |РІОоО|5|Ї |в |к. 35| | | |(с1ЕЇ | Її |РІоО|5| |в |к. 3| | || сІ1ЕЕЇ | |н |РІОоО|5їЇ | |м 37| | | |с|Ів| | |н/ |РІоО|5|Ї | |к. 38| | | |(с1ЕЕЇ | (мМ |РІОоО|5Ї 3: | (с1ЕЕЇ | Її |РІОоО|5Ї 40|мІ | (сІ1ЕЕЇ | Її |РІоО|5Ї ак |51 | | сІ1ЕЕЇ | Її |РІоО|5Ї 42 | | |(с1ЕЕЇ | Її |(РІоО|5Ї |У хх 43 | |к| |(сІ1ЕЕЇ | Її |РІоО|5Ї 44| 1-| (| с1ЕЕЇ | Її |(РІо|5Ї | хх 45| | | |сІ1ЕЇ |в| |РІОоО|5|Ї 46| | | |сІ1ЕЇ |м! | |РІОоО|5|Ї 4 | | | |(с1ЕЇ |н!І |РІОоО|5Ї | хх 48| | | |(с1ЕЕЇ | Її ніІРєРІо|5Ї 49| | | |(с1ЕЇ | Її 1!" |РІОоО|5Ї 50| | | їс1ЕЕЇ | | /РІРІО|5 51| її | їс1ЕЕЇ | Її г |РІОоО|5Ї 52| | | с ЕЕЇ | | 5з|РІОоО|5|Ї 5| | | |с01ЕЕЇ | Її |РІоО|51М 5Б| | | їс01ЕЇ | Її |РІоО|5| /АЇхХ: |. 55| | | |с01ЕЇ | Її | РІОоО|5Ї ЕМ |. 56/| | | |с01ЕЇ | Її |РІоО|5|Ї віх | | | їс1ЕЕЇ | Її |РІоО|5|Ї 7/1 58| | | |с01ЕЕЇ | Її |РІОоО|5| | Р. 59/| | | |с01ЕЕЇ | Її |РІоО|5Ї |мМ/ в/м 6б0| | || сС|ІЕЕЇ | | но |РєРІоО|5| |У ох 6| | || с|1ЕЕЇ | | но |РєРІОоО|5| | |М Р'Х 6в2| | | вп'с ЕЇ | |н|І |РІо|5| | (мМ вх в3| | | Їс/| | | Її |РІоО|5Ї |У 64| | | |(с ІЕЕ НІ | | |РІоО|5| |У 65| | | |с|ІЕєЕЇК| | | (РІО |5| | |У 66| | | |сІ1ЕЕЇ5З|Ї | | |РІОоО|5| |У 67| | |кіІс1ЕєЕЇ | Її |(РІоО|5| |У 6в8| | | |с1ЕЕЇ | Її |РІоО|5| |У в9| | |Оо|с|1ЕєЕЇ | Її |РІоО|5| | |У 7| | || с|1ЕєЕЇ | Її |(РІоО|5| |У й 1 Її ї1ЕЇ | ЇЇ |РІОоО|5|Ї |У 72| | | |в8їЇЕєЇ | Її ї |РІоО|51Ї |У 5З| | | |5ЇІЕЄЇ | Її |РІоО|5| |У 74| | | Іс! | |! |РІОоО|5| |У 75| | | |ІсІРІ | | |РІоО|5Ї |У 7| 1 | |с|в| | | |РІоО|5| |У 7 | | | Іс/|51 | | |РІоО|5| |У 75| | | |с|1ЕЕЇ | ГА | РІОоО|5| | |У 79| | | їс1ЕєЕЇ | в! |РІоЇ5| | Їх!

Таблиця 2:

Огляд примірних амінокислотних обмінів, що відповідають положенню амінокислоти в 5ЕО ІЮ МО:1 0007 ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидУГФПДЗЕО ІВ МОЛЛ/:ЖГ 80 ЇЇ | (са1ЕЇ! | /с0| (РІО! 5|Ї | М! У 8 Її | |а1їЕЕЇ! | Ї | РІО !5Ї | |! 82| | | |(а1Е!Ї Її | /РІОоО/!5| | ЕЕ! У 83| | | |(а1ЕЇ! | | "РІО! 5|Ї | 8! У 84| | | |(са1ЕЇ! ЇЇ | /РІОо!5Ї | Її У 85| | | |(а1ЕЇ! | ЇЇ | "РІО! 5|Ї | /м' У 86| | | |(с1ЕЇ! | ЇЇ | (РІО! 5|Ї | ОЇ У 87| | Її (а1ЕЇ! Її | /РІо!5| | "М! / А 88| | | |(а1ЕЇ! | ЇЇ | "РІО !5|Ї | М! 89| | | |(а1ЕЇ! | ЇЇ | (РІО! 5|Ї | М! к. 90 Її / |(а1ЕЕЇ | | РІО! 5Ї | М! / м. 9 Її її |аїЕЕЇ! | | РІО! 5|Ї | М! в. 92| | (вісі Е! | /н/іІ (РІоО/5| | "М! / А 93| | вісі ЕЕ! | /н/ (РІоО/5|Ї | М! 94| | | ві(са1Е! | /н/іІ (РІО 5| | "М! / к. 95| | | ві(са1Е! | /н/і (РІОоО/5| | "М! / в. 96| |кК/І (а71ЕЇ! | ЇЇ | (РІНІз|Ї | М! У 97| ЇЇ її ав | ні РІО, 5|Ї | МУ! к. 9| | / |(аК1ЕЕЇ! | / ні РІО/|5|Ї | /в/ к. 99 ЇЇ | (а1ЕЇ! | Її | "РІО 5 М! в! х ло Її са 1ЕЇ | / н/!І /РІОоО/!5|Ї | / м/о м. ли Її 41 са1ЕЇ! |в | /РІО/5 | | / М/о м. лог! | 48 ТЕЕЇ |в | /РІН/Зз| | / М/о м. лоз |к/с|са1ЕЇ! |в | "РІН/ІЗ|Ї | / м/о м. 14 |к/с|са1ЕЇ! | | | /РІН/І5з| | / м/о м. ло | к/с|са1ЕЇ! | | /РІН/ІЗз| | / в/о м лоб | / 4с|Іс1Е! | / ніІР'РІО/5|Ї | / М/о м. 107| |кІ (с1ЕЇ | | /РІНнН/Із|М| в У лов | | | |сі1іє!Ї |міІн! (ІРІо/51 | (М! м.

Для ясності пусті клітини у відповідному положенні амінокислоти в ЗЕО ІЮ МО:2-МО:108 визначені як ідентичні амінокислотам, що відповідають ЗЕО ІЮО МО:1, виділяючи тільки обміни в мутантних поліпептидах ГФПД. Представленні тут мутантні поліпептиди ГФПД є прикладами шляхом ілюстрації, а не шляхом обмеження.

Приклад 2: Клонування, експресія й очищення рекомбінантних поліпептидів ГФПД дикого типу і мутантних

Всі одержані послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ГФПД дикого типу і мутантну, що кодують рекомбінантний поліпептид ГФІД, були клоновані, продуковані й очищені із застосуванням способів, добре відомих в рівні техніки (ЗатьгоокК еї аї., МоІесшіаг Сіопіпд: А

І арогаїогу Мапиаї, 3-е вид., С5Н І арогафгу Ргез5, 2001, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ). Все одержані що кодують послідовності нуклеїнових кислот були клоновані в рЗЕ420(КІ)МХ, злитий з М- кінцевою Ніз-міткою (що кодує амінокислотну послідовність М1-А2-НЗ-Н4і-Н5-Нб-Н7-НВ-), як описано в УМО2014/043435, і експресували в штамі ЕзсПегіспіа соїї ВГ21 (ОЕЗ) (Мем ЕпдІапа

Віоїар5, Франкфурт, Німеччина). Для ясності всі перераховані положення з відповідними амінокислотними обмінами з мутантних поліпептидів ГФПД НРРО в Таблицях 1-5, і Таблиці 7, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:2-5ЕО ІЮО МО:108 в даному винаході, відносяться до амінокислотної послідовності природної ГФПД дикого типу без М-кінцевої Ніб-мітки, яка відповідає ЗЕО ІЮ МО:1.

Для створення зразків очищеного поліпепгиду ГФПД, клітини вирощували протягом З год. при 37 "С в 5 мл середовища ЛБ, що містить 100 мкг/мл ампіциліну в 50 мл змішувальній колбі з 140 об/хв. Один мл цієї вихідної культури застосовували як інокулят для культури експресії.

Клітини вирощували протягом приблизно З год. при 37 "С в 100 мл середовища ЛБ, що містить

100 мкг/мл ампіциліну м 150 мМ Нерез (МегсК, Дармштадт, Німеччина) у 500 мл змішувальній колбі з 120 об/хв. При 00600 приблизно в 0.6, ІРТО (Ко, Карлерує, Німеччина) додавали до концентрації в 0.4 мМ. Після подальшого зростання протягом 60 хв. при 37 "С, температура була знижена до 28 "С і зростанні продовжилося протягом ще 18 год. з 140 об/хв. Клітини збирали центрифугуванням при 4 "С, 3200 д протягом 30 хв. в 50 мл пробірках Раїсоп і згусток клітин зберігали при -80 "С. Клітини піддавали лізуванню і піз-мічений білок очищали згідно з протоколом виробника застосовуваного Мі-МТА Раві 5іагі Кі (Оіадеп, Гільден, Німеччина) з подальшими пристосуваннями для підвищення врожайності: клітини з 50 мл культури лізували в 4 мл і супернатант лізату одержували шляхом центрифугування протягом 15 хв. при 18000 4.

Кількість матриці в колонках була збільшена додаванням 1 мл МіІМТА Зирепом (Оіадеп,

Гільден, Німеччина) кожний і ретельно повторно забуферювали в 20 мМ Тгтгі5 (рН 7.6) (Мегск,

Дармштадт, Німеччина). Застосовували супернатант лізату, а Нібз-мічений білок зв'язували з матрицею Мі-МТА шляхом інкубації протягом 1 год. при 4 "С.

Одержані зразки білка повторно забуферювали в 20 мМ Тгів, 20 95 гліцерину (рН 7.8) (бБідта-

Аїдгісп, Сент-Луїс, США) шляхом застосування колонок 2ебра"м 5ріп Оезайніпо, 7К МУУСО, 10 мл (Тпегто Рібпег Зсіепійіс, Уолтем, США) і аналізували на концентрацію і чистоту білка за допомогою Аре280 (МАМОЮОКОР 8000, Тпепто Різпег Зсіепіййс, Уолтем, США) і 505-РАСЕ.

Концентрації очищених білків звичайно знаходились в діапазоні 0.6 - 4.6 мг/мл за розрахунковою чистотою приблизно в 90 95.

Для одержання неочищеного екстракту поліпептиду ГФПД в мікротитраційних планшетах (МТП) для визначення залишкової активності в аналізах на інгібування, клітини вирощували в 40 або 150 мкл середовища ЛБ, що містить 1 95 глюкозу (Мегск, Дармштадт, Німеччина) і 100 мкг/мл ампіциліну в стандартному 96-лунковому планшеті (Тпепто Рі5пег Зсіепійіс, Уолтем,

США) інкубували протягом приблизно 18 год. в інкубаторі з вологістю при 37 "С. мкл цієї вихідної культури додавали в 600 мкл середовища ЛБ, що містить 100 мкг/мл ампіциліну і 150 мМ Нерез (МегсК, Дармштадт, Німеччина) як інокулят для культури експресії в 9б-лункових планшетах (лунки глибиною 2 мл; Н.) Віоапа|мік, Еркеленц, Німеччина). Планшети герметизували алюмінієвою фольгою і клітини інкубували протягом 5 год. при 37 "С на струшувачі для планшетів з 750 об/хв. Експресію індукували додаванням ІРТО в кінцевій

Зо концентрації 1 мМ, після чого йшла подальша герметична інкубація протягом приблизно 18 год. при 30 "С на струшувачі для планшетів з 750 об/хв.

Клітини збирали центрифугуванням при 4"С, 2500 д протягом 15 хв., відкидаючи супернатант. Згусток клітин зберігали при -80 "С і лізували в 250 мкл їх ВидВивіег? (Мегеск,

Дармштадт, Німеччина) в 140 мМ Тіз (рН 7.8), з 1: 25000 розведеною ВМазеф (Оіадеп, Гільден,

Німеччина) шляхом інкубації ресуспендованих клітин протягом 30 хв. при 4 "С і 1000 об/хв.

Лізати освітлювали центрифугуванням протягом 15 хв. при 4 "С, 2500 9, і 150 мкл супернатанту переносили в стандартний 9б6-лунковий планшет (Тпегпто Різпег Зсіепійс, Уолтем, США) для подальшого тестування в квадруплетах.

Приклад 3: Ферментний аналіз ГФПД для аналізу мутантних поліпептидів ГФПД з покращеною стійкістю до гербіцидів, які інгібують ГФПД

Активність поліпептидів ГФПД визначали за відсутності або в присутності інгібіторів ГФПД із застосуванням зв'язаного аналізу активності ГФПД (Фігура 1).

Для визначення залишкової активності позірну кінетичну константу (Карр) визначеної конверсії субстрату вимірювали як кінетичні зміни поглинання при 320 нм у зв'язаному аналізі, оскільки сгомогентизат (ГГ), утворений за допомогою ГФПД з ГФП о безпосередньо перетворюється на добре поглинальну молекулу малеїлацетоацетату (МАА) за допомогою другого ферменту гомогентизатдіоксигенази (НО), застосовної у надлишку постійно у всіх аналізах (див. Фігуру 1). Вимірювання здійснювали в 384 мікротитраційних планшетах (Сгеїпег

Віо-СОпе ОтБН, Фрикенхаузен, Німеччина) за допомогою зчитувачів пластин (Тесап іпіїпйе

М1000 або МІОООРКО, Тесап, Меннедорф, Швейцария). Співвідношення Кса/Км ферментативної активності є пропорційним позірній кінетичній константі Карр і Є пропорційним Кса/Км "Е)Ї (Е) - концентрація ферменту). Конкурентоздатний інгібітор проявляє позірне збільшення Км і, відповідно, зворотне зменшення Карр при не насичувальних концентраціях субстрату. Оскільки обидва вимірювання Карр в присутності й за відсутності інгібітора здійснювали із застосуванням ідентичного зразку ферменту, неочищеного або очищеного і, таким чином, при тій самій концентрації ферменту, концентрація ферменту була виключена із розрахунку залишкової активності й співвідношення обох Карр безпосередньо вказує на зміну Км внаслідок інгібування.

Примітним є те, що ця концепція відноситься до пар фермент/нгібітор, при взаємодії в режимі "конкурентного інгібування", ймовірно правильна для майже всіх варіантів поліпептидів й 60 інгібіторів, описаних у даній заявці, але, безумовно, не відноситься до поліпептиду дикого типу,

який інгібується необоротно (для порівняння див. ММО2014/043435, Фігури 2 і 3). Відповідно, залишкова активність поліпептиду ГФІПД дикого типу, що відноситься до "конкурентного інгібування" і значенням Кі не може бути розрахована правильно, тим не менше, з метою ілюстрації, необгрунтовані значення наведені в Таблиці З для поліпептиду ГФПД дикого типу,

Б які розраховують шляхом первинних змін сигналу до того, як відбудеться необоротне інгібування.

Аналітичний розчин, використовуваний для визначення залишкової активності в сирих зразках поліпептиду ГФПД, складався з 200 мМ фосфату натрію (МегсКк, Дармштадт, Німеччина,

РН 7.0), 5 мм Маосі (МегсК, Дармштадт, Німеччина), 20 мМ аскорбату (Зідта-Аїагісп, Сент-Луїс,

США), 1 мМ ОТ (5ідпта-Аїагісп, Сент-Луїс, США), 0.1 95 РіІшгопіс Е-68 (бідта-Аїагісп, Сент-Луїс,

США), 40 мкМ Резох (5ідта-Аїадгісй, Сент-Луїс, США), приблизно 8 мг/мл очищеного НО і низьких або високих концентрацій субстрату ГФП (100 або 400 мкМ) з 1 М вихідного розчину в

ДМСО (Зідта-Аїагісп, Сент-Луїс, США) й урівноважували протягом 20 хв. на льоді. Для кожного зразку поліпептгиду ГФПД здійснювали два аналізи в квадруплетах, за допомогою чого 5 мкл зразку поліпептиду ГФПД спочатку змішували з 5 мкл буфера (їх ВидВивхіегт; (Мегск,

Дармштадт, Німеччина); в 140 мМ Ті, рН 7.8, з 1: 25000 розведеною ВМазеф; Оіадеп, Гільден,

Німеччина)) або 5 мкл інгібітора, розведеного в тому ж самому буфері з 0.1 М вихідного розчину в ДМСО (30, 100 або 120 мкМ, що призводить до 15, 50 і 60 мкМ у зразку поліпептид

ГФПДІ/нгібітор) у контрольному й інгібувальному аналізі, відповідно, і потім з 10 мкл аналітичного розчину. Зміну оптичної густини при 320 нм проводили з інтервалами в 1 хв. протягом 30 хв. Значення Карр підраховували як нахил сигналу із спливанням часу на ранній фазі кінетичної реакції, звичайно для перших 5 - 10 хвилин вимірювань (порівн. Фігуру 3).

Додатково і згідно з розрахованою залишковою активністю, повну конверсію, тобто абсолютну зміну сигналу, за 30 хв. інтервал часу контролювали як показник оберту, а залишковий оберт розраховували шляхом ділення зміни сигналу в присутності інгібітора на зміну сигналу в еталонному зразку без інгібітора.

Аналітичні розчини, застосовувані для визначення значень Кі, були складені таким самим чином і містили шість різних концентрацій субстрату ГФП (0 - 1350 мкМ) для кожної з чотирьох досліджуваних концентрацій інгібітора. Інгібітори розводили в 140 мМ Ттгі5, 0,05 95 РіІшгопіс Е-68

Зо (бБідта-Аїагісп, Сент-Луїс, США) і застосовували в концентраціях, прийнятних для відповідних пар поліпептид ГФПДІ/нгібітор для створення динамічних даних (Фігура 4 а-а); як правило, їх концентрації у зразку поліпептид ГФПД/нгібітор знаходились в діапазоні від О до 0.0012 М.

Коли стерпність мутантних поліпептидів ГФОД визначали до різних доступних хімічних класів гербіцидів, які інгібують ГФПД (трикетони, ізоксазоли, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди, або М-(тетразол-5-іл)у-арилкарбоксаміди), то стало очевидним, що деякі з нових варіантів здійснення даного винаходу не тільки значно покращені у порівнянні з еталонною ГФПД дикого типу (ЗЕО ІО МО:1), але також несподівано є кращими, ніж відомі з рівня техніки мутантні поліпептиди ГФПД (як, наприклад, те, які описані в УЛО2014/043435) з 5ЕО ІЮО МО:2 у цьому винаході як приклад.

Як зазначено в Таблиці 3, мутантні поліпептиди ГФПД із попереднього рівня техніки (М/О2014/043435), відповідні 5ЕО ІЮ МО:2 у цьому винаході містять обміни залишків у положеннях 335, 336, 339 і 340.

На основі мутантного поліпептиду ГФПД, що містить 335 (Е-» Р), 336 (5-20/Н), 337 (Ме»5), введення додаткових обмінів залишків в положенні 264, 268, 270, 330, 340 і/або 345, які продукують мутантні поліпептиди ГФПД, що демонструють суттєво покращену стійкість (Таблиця 3), стосовно багатьох застосовних інгібіторів ГФПД, що відносяться до різних хімічних класів.

Відповідно, винахідники створили й оцінили нові мутантні поліпептиди ГФПД шляхом комбінаторних обмінів залишків в положенні 335 (глутамінова кислота -» пролін), 336 (гліцин -» аспарагінова кислота/гістидин), 337 (аспарагін -» серин) і які, необов'язково, додатково містять обміни в положеннях 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344 і/або 345 (Таблиця 3, 4 і 5), які демонструють покращені залишкові активності, більш високий залишковий оберт, більш високі значення Кі й тим самим значно більш високу стійкість до гербіцидів.

Залежно від досліджуваного гербіциду, що інгібує ГФПД, рівень покращення може різнитися стосовно поліпептидів ГФПД, застосовуваних у такому аналізі, з рівнем від 1,5 до 110 разів, у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО: 2 (Таблиця 4).

Аналіз періоду дії інгібування проти різних хімічних класів гербіцидів, які інгібують ГФПД, 60 показав, що гербіциди, які інгібують ГФПД, ймовірно, є оборотними інгібіторами проти нових мутантних поліпептидів ГФІД, на відміну від повільно і міцно зв'язувального інгібітора, характерного для поліпептиду ГФПД дикого типу, що відповідає зЕО ІЮ МО: 1 (див. Фігури 2 і 3).

Такі поведінка забезпечує кращий і універсальний потенціал для стійкості в сільськогосподарських рослинах до різним гербіцидів, що інгібують ГФПД.

Для високої залишкової активності в присутності гербіцидів, які інгібують ГФПД, розкриті положення і зміни залишків виділені в Таблиці 1 відносно положення амінокислоти в поліпептиді

ГФПД, що відповідає ЗЕО ІО МО':1 в даному винаході представлені як важливі.

Таблиця 3:

Стійкість мутантних поліпептидів ГФПД до різним гербіцидів, що інгібують ГФПД, які належать до різним хімічним класів

Таблиця За)

Залишкова активність і оберт в присутності Спол. 1 згідно з Прикладом З при високій концентрації субстрату і 15 мкМ інгібітора о шо

ЗЕО ІЮ МО активність оберт 1 (МіІРІ|ТтТ|р0 Ес! М КА! | бе | б 2 ЇЇ Її 1 РІМІ АЇОЇ | 3996 | 506 щ / 3 | ЇЇ Її РІЇ ЇЇ 1 1 1 7199 | 95 4 1 11117154 1 1 1 396 | 296 5 ЇЇ ЇЇ РІЇ 541 ЇЇ 1 1 гот | гав щ 7 | ЇЇ 1 1 РОЇ 5 | 1 1 2/зь | зво щ 8 ЇЇ 1 1 1 РОЇ 5 МІ | із | 4496 9 ЇЇ 1 РОЇ 5 | |М зб | Бі ло Її Її | 1 РІО 5 |М|М лз6 | ббт ( 11 1 1 ні РІОї|5 | | 1 газ | зб щ и/9 12 | | | | ніРІОо/|5 |МІ | 396 | 5 13 ЇЇ Її | |ніРІОоОЇ|5 | |М | зов | 4096 щ 14 Її | /ніРІОо/|5 |М|М| 4496 | бот щ |/ 15! |5151ї1 / РІОЇ|5 |МІ|М| абз | 74956 щ 16 |515ї / РІІОЇ|5 |МІ|К| 45956 | бо 17 | |а1ЕЕЇ /РІО/|5 /|М|М 4395 | бо щ |/ 18 |в! | |н/РІІОЇ|5 |МІ | б/зь | 70956 щ 19 |(в|(са ЕН РІО|5 |МІ|М | бо | 7096 щ 20 | ЇЇ ЇЇ ЇЇ РН | | 1 1 л1496 | 1696 ( 21 | ЇЇ | ЇЇ РН вВ | | | 1 1896 | зб щ |/ 22 | | | | РІНІІ585 МІ | обов | 5396 щ 23 | | | ЇЇ /РІНІВБ | |М 2бов | Зб 24 | | | Її РІНІІВ8 |МІ|М гвовє | 5796 Ж 25 | | | |н/ РН | | 1 зо | 3796 щ « 256 | | | |н/РІНІІВ |МІ | 55956 | б 27 | | | |н/ РН | |М збо | дод щ 28 | | | |н/РІНІІВ |МІ|М 4595 | 57956 щ ( 29 | |515ї | РІНІВБ |МІ|М 1 зо | 5996 щ - 30 | |515ї | РІНІВБ |МІ|К 3996 | ббв з | |а1ЕєЇ ІРІНІВБІ |МІ|М| 4096 | б/д

Таблиця Зб)

Залишкова активність і оберт в присутності Спол. 2 згідно з Прикладом З при високій концентрації субстрату і 15 мкМ інгібітора 1

ЗЕО ІЮ МО

Терен т т

ІО | 264 | 268 | 270 | 330 | 395 | 336 | 337 | 339 | 340 | 345 :

МО активність оберт 1 !мМіРІ|тТ|о ЕЕ с МІК А! | 89 | 895 2 | ЇЇ ЇЇ РМ ГА ОЇ | 5195 | 72

З ЇЇ 1 1РІЇ ЇЇ 1 1 1111 лб695 | гг 4 Її 11717115: 1 1 11 895 | 179

ЇЇ ЇЇ РІЇ 15Ї | | | збо | 539 7 1 1 71 1Р/ о 5 | 1 11 7595 | 8396 ( 8 ЇЇ ЇЇ РІО 5 ЇЇ М | бязь | 7496 9 ЇЇ ЇЇ РОЇ | М 7995 | 8996 19 ГГ 1 1 1 Ро 5Ї ММ 8995 | нв. мг 71717 1нНніІРІОо 5 | 1 71115995 | 67 12! | Її |ніІР/ ОЇ М | 939 | нв. 13 Її ЇЇ |нНіІР/ ОЇ | 1|1М| вав | 8896 щ 14 | Ї |нНніІР/ о 5 | ММ вав | а |515їЇ |Р/О/ 5 /М/М| 9095 | нв. 16 |515Ї |Р/О/ 5 / Мк! 9495 | 949 17 || ЕЕЇ |Р/ ОО 5 / ММ 9095 | 9095 ( 188; | |нНіІР/ ОО 5 ЇЇ М | нвю | нв. 19 |в|сіЕ|НІР/ ОО 5 /М/М| 9295 | 939

ЇЇ ЇЇ Ї РН Її 1 1 1 3195 | 5096 Ср 21! | ЇЇ Ї РН | 1 | 7395 | ва ( 22 | | | | ІР'Нн/ Б М | 9095 | нв. 23! | | ЇЇ РІ Н/БзЇ | |МмМ/| 7боь | 839 24! | | ЇЇ ІР/НнН/зЇ / ММ 9095 | нв. 25| | | |нНіІР/ НІ ЗІЇ | | | вав | 8396 ( 256! | | |нНіІР/ НІ М | 926 | 9596 ( 27 | | | |ніР/ НІ | М во | 8бов щ ( 28! | | |нНіІР НІ / ММ! 8395 | 939 29! |515Ї |Р/'Н/ ЗІ /М/|М| 8595 | нв. |515Ї |Р/' НІ /М/|Кк/| 959 | нв. з |с9|ЕЕЇ |РІНІБЗІ| |М/|М| 959 | нв.

Таблиця Зс)

Залишкова активність і оберт в присутності мезотриону (М5Т) згідно з Прикладом З при високій концентрації субстрату і 60 мкМ інгібітора ві | шо

ГФПД ЗЕО ІЮ МО 1

ЗЕО Залишкова Залишковий 1 (МІРІТ 0 Ес | МІК А! 2 щ беж | 83» 2 | | ЇЇ | РІМЇ ГА ОЇ | 796 | 8555 3 ЇЇ 1 1 РІ ЇЇ ЇЇ 717 7171395 177717 41 Її 11 115 1 1 1 1695 1 л5

Її | 1 1 РІО! ММ! 826 |177717177снвшщ мг 71 1 0ніРІОо/|5| | | | баз 117785 4 12 Її | ЇЇ |нРІОо/|8| МІ | 8095 | 945 13 Її | Її |нРІО/|5| | ЇМ! аз | 8896 2 щ ( 14 Її | | |ніРІОоО/|5| ММ! 7095 щ | 89956

Її |5151 / РІО/|5Ї| / ММ! 8395 щ | 9495 16 Її |5151 / РІО/|5Ї| / Мік! 8895 2 ющю ЗІ 9296 2 щ 17 | |с1ЕЇ /РІО/|5Ї| / ММ! 8595 2 щ | 90956 19 (вс ІЕЇН РІО|5| /МІМ! 519 | 78956

Її | Її ЇЇ РІНІЇ ЇЇ 1 1 1 2595 юю |Дресє4об щу 21 ЇЇ | ЇЇ | РІНІІВ! | | 11 ба 17 8996 щ 22 | | | | /РІНІВ! МІ! | 7795 щ | 99956 23 | | | | / РІНІІВЗ! | ЇМ! 639 | 7996 24 | | | | / РІН/ІВ! ММ! 519 | 6895 2г5 | | | |н/РІНІВЗІ! | | | 70956 щЩщ | 87956 26 Її | | |н/РІНІІВЗІ МІ | 8195 щ| 9296 27 | | | |н/РІНІІВІ | ЇМ! баз 17782 4 28 | | | |н/РІНІІВЗІ| / ММ! 6ббо | 8496 4 29 | |5151 / РІНІВЗІЇ / ММ! 7995 2 щ | 9595 301 |5151 / РІНІВЗІЇ / МІК! 8795 2 щ | нв з | |с1ЕЕЇ (РІН/|В| ММ! 839 | нв

Таблиця За)

Залишкова активність і оберт в присутності дикетонітрилу (ОКМ) згідно з Прикладом З при високій концентрації субстрату і 60 мкМ інгібітора в 1

ЗЕО ІЮ МО: ее ер як нт

ІО |264 | 268 | 270 | 330 | 335 | 396 | 337 | 339 | 340 | 345 :

МО активність оберт 1 | мМ РІтТ|О|Е|с | МмМІКІАЇ І | 79 | 896 21 1 ЇЇ |РІІМ ГАЇ ОЇ | 8695 | 9395

З 1 ЇЇ РІЇ ЇЇ 1 117179 1 т 41 1 171 7171711751 1 1 1 179 1 ла 511 1 ЇЇ РІЇ /15Ї ЇЇ ЇЇ | 49 | 479 71 1 1 1 Ро 5 ЇЇ | 1 | 7995 | 9296 81 1 ЇЇ РІО ЇЇ |МЇ | 919 | 9596 ( 91 1 ЇЇ РІО 5 ЇЇ | М 9095 | 92956 ( ло Її 17717 1171 7 1РІІЇО | 5Ї |МІ|М| в. | нв ( 1 1 71 ні РІОо | 5 | 1 | 8195 | 9596 121 1 | |ніІРІОоО | ЇЇ |МІ | в. | нв ( 131 1 Її |ніІРІОоО | ЇЇ | |М| в. | нв ( 141 1 | |ніІРІОо | з ЇЇ |М|М| 919 | нв ( 151 5151 |РІО/ 5Ї |МІ|М| кв | нв Зо«( 161 5151 |РІО/ 5Ї |МІ|К| кв. | нв ((/ 1771 191 ЕЕЇ |РІО | 5 |МІ|М| в. | 95955 18 |в | |нНІРІО | ЇЇ |МІ | в. | нв К( 19 |в б ІЕЕ|НІІРІО | 5 ЇЇ |МІ|М| в | нв ( 201 1 ЇЇ РН Її 11113795 1 4096 211 17 1717171 7 1РІ нь | 1 1 819 | нв ( 221 | | | |РІІН/ З! |МІ | в. | нв ( 231 | | ЇЇ |РІН/ ЗІ | М 839 | 8796 « 241 1 | | |РІН/ ЗІ |М| М 9395 | нв ( 251 | | |нНІРІН/ ЗІ | ЇЇ | в | нв ( 2561 | | |нНІРІН/ ЗІ |МІ | в. | нв ( 27 | 1 | |ніІРІН/ ЗІ | М 9295 | нв К(( 281 1 | |нНніРІН/ ЗІ |МІ М 9095 | 95956 291 /5151Ї |РІН/ЗЇ |МІ|М| 949 | нв ( 301 5151 |РІІН/ЗІЇ |МІ|К| в. | нв. Н( з | | 9|ЕЇ |РІІНІ/ЗЇ |МІ|МІ| кв | нв.

Залишкова активність і залишковий оберт були визначені згідно з Прикладом З шляхом вимірювання Карр і загальної зміни сигналу, відповідно, в присутності й за відсутності (а) Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід), (б) Спол. 2 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-- метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), (в) мезотрион (М5Т), і (4) дикетонітрил (ОКМ). Для кожного мутантного поліпептиду ГФПД, Карр і повна зміна сигналу без гербіцидів, які інгібують ГФПД, служили для нормалізації Карр і повної зміни сигналу в присутності гербіциду. Підсумовані одержані «Уо-значення" у відповідних

Таблицях За), 35), Зс) і За) є інструментами двох незалежних експериментів з середнім стандартним відхиленням 5 95. Реакцію проводили при високих концентраціях субстрату з Спол. 1 ї Спол. 2 при концентрації 15 мкМ й інших двох гербіцидів (ОКМ, М5Т) у концентрації 60 мкМ.

Для ясності, пусті клітини у відповідному положенні амінокислоти в ЗЕО 10 МО:2-5ЕО ІЮ МО:108 визначені як ідентичні амінокислотам, що відповідають 5ЕО ІЮО МО:1, виділяючи тільки обміни у варіанті поліпептиду ГФПД. Скорочення "н.в7 означає, що в даних умовах не спостерігали інгібування, тобто Карр або повна зміна сигналу в присутності інгібітора не зменшувалось у порівнянні з відповідним значенням за відсутності інгібіторів.

Мутантні поліпептиди ГФПД, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:10 ії 5ЕО ІЮ МО:24 з обмінами амінокислотами в положеннях 335, 336, 337, 340 і 345 відносно поліпептиду ГФПД згідно з БЕО

ІО МО:1, в присутності різних протестованих інгібіторів ГФПД проявляють значне покращення стосовно залишкової активності й залишкових обертів (Таблиця За-а). Зображена стійкість до гербіцидів БЕО ІЮ МО:10 показує не тільки покращення у порівнянні з поліпептидом ГФПД дикого типу (ЗЕО ІЮО МО/:1), але також і у порівнянні з мутантним поліпептидом ГФПД з рівня техніки (М/О2014/043435), що відповідає БЕО ІЮО МО:2 в даному винаході на всіх чотирьох зображених різних класах гербіцидів.

Подальші покращення стійкості до інгібітора ГФПД є очевидними у варіантах з обмінами залишків в розкритих положеннях амінокислот 268 і 270.

Виходячи з 5ЕО ІО МО: 24, 5ЕО ІЮ МО:31 відрізняються тільки в зазначених положеннях 268 і 270. Ці зміни значно збільшують залишковий оберт в присутності інгібітора ГФПД Спол.1 і М5Т (Таблиця За і Зс), і зберігають уже досягнутий високий залишковий оберт в присутності Спол. 2 (Таблиця 35) ії ОКМ (Таблиця 34). Ці результати можна також побачити внаслідок значно покращених значень Кі БЕО ІЮ МО: 31 (Таблиця 4) у порівнянні з поліпептидом ГФПД (ЗЕО ІЮ

МО/:1), і мутантним поліпептидом ГФПД з рівня техніки (УМО2014/043435), який відповідає 5Е0

ІО МО:2 в даному винаході.

Виходячи з мутантного поліпептиду ГФПД, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:8, подальша зміна положення амінокислоти 330 (див. БЕО ІЮ МО: 12) демонструє додаткову покращену стійкість до інгібітора ГФПД (див. Таблицю 3)

Виходячи з мутантного поліпептиду ГФПД, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:12, подальша зміна положення амінокислоти 264 (див. БЕО ІЮ МО: 18) демонструє додаткову покращену стійкість до інгібітора ГФПД до Спол. 1 і Спол. 2 (див. Таблиці За, ЗБ).

При введенні всіх вищезгаданих обмінів у чотирьох положеннях 264, 268, 270, 330 поверх мутантного поліпептиду ГФПД, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:10, приводячи до 5ЕО ІЮ МО:19, виявляли найбільш сильну стійкість всіх зображених поліпептидів в Таблиці За із залишковою активністю і обертом в 68 95 і 79 95 до Спол. 1, що демонструє важливість обмінів комбінаторних залишків в розкритих положеннях амінокислот. Також мутантний поліпептид ГФПД, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:19, має покращені значення Кі для Спол. 1 і Спол. 2 (Таблиця 4) у порівнянні з зБЕО ІЮ МО:2.

Таблиця 4:

Оцінка стійкості мутованих поліпептидів ГФПД до різних гербіцидів, що інгібують ГФПД, які належать до різних хімічних класів шляхом визначення значень Кі 0001111 ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидугФПДЗЕО В МОМ: ОЇ ЇЇ 1 |в8ІмМміРІтІт о о ЕЇсСІМІє|К ТАЗ 17 Її 2 1 | | 111 РІМ!І | ГЇАТОЇ | 1 | з | гг 8 1 ЇЇ 11111 с РІОо|51 | ЇМ! | 48 | 90 | 72 17 | | (с1єЇ 7 7 РІОоО|Ї5| | ЇМ! мМ! 19 | 190 | 1950 31 | | (с фєЇ | (РІн|5| | ЇМ! (М 25 | їго | 75 32 | | |ІАЇЕЇ / / (РІНІ5|! | ЇМ! м! й | по | 120 33 | | |(СЇЕЇ / / (РІОоО|5| | |в| /мМ| 17 | т100 | 85 34 | | |(СЇєЇ (н/ (РІОоО|5| | |в/ /к| 21 | 89 | 120 | | |(СЇЕЄЇ / / (РІОоО|5| | |в/ кр; 88 | 160 | 150 16 | | 51517 1 (РєРІЇоО|5| | ЇМ! /к| 95 | 180 | 150 18 | |в! | | /н/ (РІЇОоО|5| | ЇМ! | 19 | 190 | з4 19 | |вВ|с71єЇ (н/ (РІЇОоО|5| | ЇМ! м! з3з | 180 | з5 36 | |вВ(сІєЇ (н/ (РІО|5| | ЇМ! /м/ з39 | 7120 | з9 37 | | (сів! (н/ (РІЇоО|5| | ЇМ! /к| 712 | 76 | 81 38 | | |(СЇЕЇ ТМ (РІОоО|5| | ЇМ! мМ! 74 | 170 | 490 | | (с |ЇЕєЇВ! / (РІОоО|5| | ЇМ! м! 97 | по | 120 48 | | |(сОЇєЇ | ніРєРІЇо|5| | ЇМ! м! з39 | 160 | 210 | | |(СЇЕЇ | РІРІТО|5| | ЇМ! м! 47 | 130 | 7140 60 | |вВІ|сІєЇ (н/ (РІОоО|5| | МО Мр! 24 | 130 | з2 96 |кК| |(сЇєЇ / / (РєРІНІ5|! | ЇМ! мМ! 19 | 98 | 93 97 | | |а|в| (нів |РєРІЇоО|5| | ЇМ! /к| 17 | 86 | 130 98 | | (сіє! | н/|5|РІІОо|5| | |в| |к| з3 | 40 | 150

Таблиця 4:

Оцінка стійкості мутованих поліпептидів ГФПД до різних гербіцидів, що інгібують ГФПД, які належать до різних хімічних класів шляхом визначення значень Кі 0001111 ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидугФПДЗЕО В МОМ / ОЇ ЇЇ 99 | |(с2ЇЕЇ / / (РІОоО|5|ІМ! |в; МІ лоо | 160 | 150 ло | (СІ 1єЇ ун (РІЇО|Ї5| | |МІО/ мур п00 | 120 | 120 лот | (сс |єЇВ) / (РІЇОоО|5| | |мМ|О м); 45 | 96 | 89 лог | (СІВ ТЕєЇВ) / (РІНІв)! | |МІО мур 40 | 230 | 290 лоз кіс іс |єЇВв) / (РІНІв| | |МІО мур 24 | 260 | 280 лом. кіс Іс 1єЇ | 7 (РІНІв! | (МО мур; аз | 370 | 270 ло кіс Іс1єЇ 7 (РІНІв! | |в мур 140 | 270 | 100 лов | | СІсЇєЄЇ | НіРІРІТО|5| | |М|О0 мур 95 | 240 | 120 7107 |к| |(сЇєЇ | (РІНІ5|М! |в; М) по | 190 | 100 лов | | (с |єЇмунуІ |(РІОо|5| | ЇМ) /м/| зз | т50 | 98

Для ясності, пусті клітини у відповідному амінокислотному положенні в ЗЕО ІЮ МО:2-5ЕБ0 ІЮ

МО:108 визначають як ідентичні амінокислотам, що відповідають ЗЕО ІО МО':1, виділяючи тільки обміни в мутантних поліпептидах ГФПД. Представлені у даній заявці мутантні поліпептиди

ГФПД є прикладами як ілюстрації, а не як обмеження.

Дані були одержані шляхом вимірювання початкових швидкостей реакції зі збільшенням концентрацій Спол. 1 (2-хлор-3-(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід), Спол. 2 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), і мезотрион (М5Т) згідно з Прикладом 3. Як правило, застосовували шість різних концентрацій субстрату ГФП (0 - 1350 мкМ) і чотири різні концентрації відповідного інгібітора (див. Фігуру 4). Концентрації інгібітора були прийняті для відповідних пар ГФПДінгібітора поліпептид для створення динамічних даних, тобто варіанти з більше низькою стійкістю аналізували в діапазоні більше низьких концентрацій інгібітора, а концентрації до 1200 мкМ застосовували для варіантів з стійкістю, доведеною до максимуму.

СгарпРай Ргізт (версія 6.00 для УМіпдому5, сСгарпРадй Боїймаге, Га доПа Каліфорнія США) застосовували для аналізу даних і припасування кінетичних констант, що застосовують обмеження згідно з конкурентним режимом інгібування. Там, де відбувались явні вкидання, або активності, одержані при дуже високих концентраціях субстрату, не відповідали математичним методам, що лежать в основі конкурентного режиму інгібування, відповідні значення були виключені з припасування.

Деякі результати систематичних варіантів, створених на основі двох уже значно покращених мутованих поліпептидів ГФПД ЗЕО ІЮ МО:17 і ЗЕО ІО МО:19 наведені в Таблице 5.

ЗЕО ІЮ МО:17 і БЕО ІО МО:19 відрізняються у двох положеннях амінокислот, і БЕО ІЮ МО:17 показує «20-разове, ЗЕО ІЮ МО:19 «30-разове збільшення Кі відносно Спол. 1 у порівнянні з мутантним поліпептидом ГФПД, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:2 (див. Таблицю 4).

Мутантний поліпептид ГФПД, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:17 має обміни залишків в положеннях 268, 270, 335, 336, 337, 340 і 345 і проявляє 29 95 залишкову активність, а оберт субстрату знижується лише на 46 95 в присутності 50 мкМ Спол. 1. Реверсування залишків в положенні 268, 270, 340, 345 в який відповідає залишок дикого типу (відповідно БЕО ІЮ МО 1) супроводжується падінням стійкості до 1995, 24965, 1795, і 2095 залишкової активності, відповідно (Таблиця 5; 5ЕО ІЮ МО:71, 5ЕО ІЮО МО:63, 5ЕО ІЮ МО:81, 5ЕО ІО МО:88, відповідно), надаючи особливого значення вигідним властивостям цих положень і мутацій.

Відповідно, реверсія залишку Валін в положенні 345 в 5ЕО І0:19 до відповідного залишку дикого типу Ізолейцин супроводжується падінням залишкової активності з 67/90 до 57 90 (Таблиця 5; ЗЕО ІЮ МО:93).

З іншого сторони, введення додаткових поодиноких залишкових обмінів в ЗЕО 10:17 в положенні 204, 213, 264, 310, 315, 330, 331, 338, 339 або 344 приводило для кожного положення у щонайменше одному варіанті з подальшою значно збільшеною залишкової активністю більше ніж 38 95, наприклад, А2гО4М (5ЕО ІЮО МО:40), К213І (ЗЕО ІЮ МО:44), М264К (ЗЕО ІЮ МО:67),

ОЗТОК (5ЕО ІЮ МО:65), Т3158 (5ЕО І МО:45), ОЗЗОМ (5ЕО ІЮ МО:38), 03911 (5ЕО ІЮ МО:49),

ЕЗЗ8М (ЗЕО ІЮ МО:53), КЗЗОЕ (ЗЕО ІО МО:55) і 5344Р (5ЕО ІО МО:58).

У висновку, специфічні додаткові обміни залишків поза мутацій 335 (глутамінова кислота (Е) - пролін (Р)), 336 (гліцин (5) -» аспарагінова кислота (0)/гістидин (Н)) і 337 (аспарагін (М) -» серин (5)) в поліпептидах ГФІПД забезпечують покращення стійкості до гербіцидів і демонструють додаткову важливість розкритих положень 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345, надаючи покращену стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД (Таблиця 5). Насамкінець, комбінація цих розкритих положень призводить до покращених Кі по різних класах інгібіторів ГФПД, як показано в Таблиці 4 (наприклад, 560 ІЮ МО:99, 100, 105, і 107) до Спол. 1 з більше ніж 100-разовим, до Спол. 2 з до 90-разовим, і у той самий час до «7- разовим покращеннями проти мезотриону (М5Т) у порівнянні з поліпептидом ГФПД дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1) і мутантним поліпептидом ГФПД з відомого рівня техніки (М/О2014/043435), що відповідає ЗЕО ІЮО МО:2 в даному винаході.

Таблиця 5:

Ефект поодиноких обмінів залишків в БЕО ІЮ МО:17 і БЕО ІЮ МО:19, проаналізований згідно з Прикладом З при низькій концентрації субстрату і 50 мкМ інгібітора Спол.1 о | ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидуГФПДЗЕОІЮ МОЛ |: !/|/ |/

Залиш- 5ЕОО кова | алиш-

МО 204|213|264|268|2701І310131513301331133513361337 І3381339134013441345 актив- оберт - т ність 171 | | | єЇ | 7 1 |РІЇо|5| | М! ЇМ 29 | 5495

З | ЇЇ |б1єЕЕЇ | 7 | |РІнНІ5! | (М! ЇМ 5095 | 8195 391 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |(РІЇо|5| | ЇМ! ЇМ зась | 615

ІМ)! | (б ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | (М! ЇМ бб5сь | 7795

Ам |51 | | 1єЇ | 7 ЇЇ (РІЇо|5| | М! ЇМ 545 | 7795 42 |7т| | (б ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | (М! ЇМ 5995 | 8795 43| |К! (б 1ЕєЇ | 7 | (РІЇо|5| | (М! ЇМ 2895 | 615 44 | |-Ї (б 1єЇ | 7 1 (РІЇОо|5| 1 М! ЇМ 5895 | 7895 67| | КІС ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | (М! |М| 7395 | 9695 68 | / Іс ЕєЇ | 7 | |(РІо|5| | ЇМ! ЇМ 42 | 7095 69 | (ОЇ ЕЇ | 7 | |РІо|5| | (М! МІ бось | 9095 701 | |в|сб ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | ЇМ! ЇМ 5595 | 7495 й | 1 1 ЕЕ! ЇЇ 7 1 РІо|5| | МІ! ЇМ лось | 4196 72 | | | (п ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | ЇМ! ЇМ 259» | 5595 753 | | | (5 ЄЇ | 7 | (РІо|5| | ЇМ! ЇМ 2995 | 5895 63 | | с. | | 1 | |РІо|5| | ЇМ! ЇМ гась | 545 74 | | | їЇс -Ї Її 17 1 1 РІЇо|5| 1 М! ЇМ обсь | 5995 751 | | (с РІ | 7 | |РІо|5| | (М! ЇМ збсь | 6795 76 | | |с/в8н! | 7 | |РІо|5| | (М! ЇМ лось | БО 77 | | | са 151 | 7 | |РІо|5| | (м! ЇМ ось | 4495 64 | | (б ЕєЇНІ 7 | (РІо|5| | (М! ЇМ бось | 6495 651 | | (б ЕєЇК! 7 | |(РІОо|5| | (М! МІ 9095 | 9695 66| | | (б ЕєЇ5ЗЇ Ї | |РІОо|5| | ЇМ! МІ 8795 | 9195 45| | | (сб ЕєЇ |в | (РІОо|5| | (М! МІ зось | 6895 46| | | (сб єЇ |м/ | |(РІо|5| | ЇМ! МІ Зась | 5995 47 | | | (сб ЕєЇ (ні | (РІо|5| | (М! ЇМ зтоь | 5995 78 | | (сб ЕєЇ | ТАЇ |РІОо|5| | ЇМ! ЇМ ззсь | 6395 79 | | | (сб єЇ | 7ТєЇ |(РІОо|5| | (мМ! МІ зось | 6695 801 | | (сб 1ЕєЇ | Тс! |РІОо|5| | (М! МІ 4995 | 7495 38| | | (сб 1ЕєЇ | ТМ! |(РІОо|5| | (м! |М| 7895 | 9495 48 | | (сб ЕєЇ | 7 (ніРІо|5| | ЇМ! ЇМ 4795 | 7495 49 | | (б 1ЕєЇ | 7 1 ІРІОо|5| | (М! |М| 5895 | 7895 | | | (б 1ЕєЇ | 7 |РІРІЇОоО|5| | ЇМ! МІ 4бзь | в8095 51 | | | |б1ЕєЇ | 7 | 4 ІРІОо|5| | ЇМ! ЇМ 275 | 5бов 52 | | | | 1ЕЇ | 7 |(5|РІІОоО|5| | ЇМ! МІ зтзь | 5795 53 | | | |сб01ЕєЇ | 7 | |РІо|5/|ЇМ) ЇМ! ЇМ 5095 | 6395

Таблиця 5:

Залиш- 5ЕОО кова | алиш-

МО 204|213|264|268|2701І310131513301331133513361337 І3381339134013441345 актив- оберт - т ність 54| | | (б 1ЕєЇ | 7 | (РІо|5| ТАЇМІ ЇМ ззсь | 5595 55| | | | 1ЕЇ | 7 | |РІОо|5| ТЕЇМІ! ЇМ 465 | 8195 55| | | (б 1ЕєЇ | 7 | |РІо|5| в/м! ЇМ 2795 | 5995 57 | | | (б 1ЕєЇ | 7 | (РІо|5| тм! ЇМ ззсь | 6895 811 | | |сб1єЇ | 7 | (РІЇо|5| 1 | | МІ 795 | Біо 82 | | | (б 1ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | |єЄЇ ЇМ з79ь | 7495 83 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |(РІо|5| | (с |М| 5395 | 8795 84 | | | (б ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | 1-4 ЇМ 1795 | 4395 851 | | | 1ЕЇ | 7 | |(РІо|5| | (м! ЇМ 1795 | 2595 86 | | (сб 1ЕєЇ | 7 | |(РІо|5| | (ОЇ МІ гзсь | 4595 з33| | | (б 1ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | |в МІ 4095 | 6595 58 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |РІо|5| | |МІРІМІ 4995 | 5995 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |РІо|5| | |(м/в/|М| то | 4695 87| | | (б ЕєЇ | 7 | (РІо|5| | ЇМ! ТА 1795 | 5395 88 | | (сб 1ЕєЇ | 7 | |(РІо|5| | ЇМ! | | гось | 4495 895 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |(РІо|5| | ЇМ! |КІ| гзсь | 4395 901 | | (б 1ЕєЇ | 7 | |РІо|5| | (М! |Мм| їбсь | 4395 9 | | ЇЇ |с1ЕЕЇ | 7 | |(РІо|5| | ЇМ! |В 2595 | Боб 191 | |в8|сб ЕєЇ | н/! |(РІОо|5| | (мМ! МІ 6795 | 8895 60 | | |в|сб ЕєЇ | н/! |РІо|5| | |М/О|М| бась | 8495 611 | |в|сб ЕєЇ | нн! |(РІо|5| | |МІРІМІ б1зь | 8895 62 | | Вс ЕЇ | нн! |(РІОо|5| | |(м/ В/М 52» | 7255 92 | | ВС ЕЇ | нн! |(РІОо|5| | ЇМ! ГАЇ бт1зь | 8195 931 | (Вс ЕЇ | нн! |(РІОо|5| | ЇМ! | | 5795 | 7595 94 | | Вс ЕЇ | н! |(РІОо|5| | ЇМ! |КІ| г2ось | баб 36| | |вВ|сб ЕєЇ | нн! |(РІОо|5| | мМ! |м/| 6795 | 8595 95| | |в|сієЇ | н/| |РІОо|5| | ЇМ! || 4095 | 8195

Для ясності, пусті клітини у відповідному положенні амінокислот в ЗЕО ІЮ МО:2-МО:108 визначають як ідентичні амінокислотам, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:1, виділяючи тільки обміни в мутантному поліпептиді ГФПД. Залишкова активність і залишковий оберт визначали згідно з 5 Прикладом З шляхом вимірювання Карр і загальної зміни сигналу відповідно в присутності й за відсутності Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід) (50 мкМ) при низькій концентрації субстрату. Для кожного мутантного поліпептиду ГФПІД, Карр і загальна зміна сигналу без гербіцидів, які інгібують ГФПД, служили для нормалізації Карр і загальної зміни сигналу в присутності гербіциду, і одержані 9о-значення підсумовують.

Приклад 5: Аналіз на коричневий колір для тестування мутантних поліпептидів ГФПД, стійких до гербіцидів, які інгібують ГФОД

Мутантні поліпептиди ГФПД аналізували, використовуючи аналіз на коричневий колір (М/О2014/043435). Бактеріальні клітини, які експресують мутантний поліпептид ГФПД згідно з винаходом аналізували в 9б-лунковому форматі на предмет стійкості до інгібітора ГФПД шляхом точкового нанесення на тверде середовище, що містить І В-агар, агент відбирання для вектора експресії РЗЕ42О(К)МХ (УММО2014/043435), 5 мМ тирозину (Зідта-Аїагісп, Сент-Луїс,

США), 42 мМ сукцинату (бідта-Аїагісп, Сент-Луїс, США) і шість різних концентрацій гербіциду, що інгібує ГФПД, Спол. 1 (0 - 500 мкМ).

В аналізі на коричневий колір, культуру клітин Е. Соїї, яка експресує протягом ночі один з відповідних мутантних поліпептидів ГФПД, розведену до 00600 в 1 і 10 мкл екстракту наносили точково в трьох повтореннях на планшети, що містять 0, 25, 50, 100, 250 або 500 мкМ Спол. 1.

Планшети покривали проникною для повітря стрічкою й інкубували при 30 градусах С. Через 24 години клітини витримували в темноті при кімнатній температурі й через 7 днів візуально оцінювали утворення коричневого пігменту. В присутності гербіциду, що інгібує ГФПД, це пігментне утворення інгібується і колір планшета з агаром не буде змінюватися, якщо експресується і є активним поліпептид ГФПД гербіциду, що інгібує стійку ГФПД. Рейтинг "---7 означає темно-коричневе забарвлення, як видно для клітин Е. соїї, що експресують один з відповідних мутантних поліпептидів ГФПД без інгібітора в пластині агару (В. чн" ї ч- оцінюють середню і світло-коричневу пігментацію, відповідно, а "0" означає, що на планшетах з агаром І В не виявлено розвиток коричневої пігментації.

Таблиця 6:

Оцінка стійкості мутантних поліпептидів ГФПД до Спол. 1 (0 - 500 мкМ) з застосуванням аналізу на коричневий колір

Концентрація Спол

МО: 1 МО:2 МО: 31 МО: 32 МО:96 | МО: 103 | МО: 104 61 нн на | ян | яні 1 1 72511770 13531 зн | зн 11 50111770 3401 зн | нн 3о1117701 351 | зн | 3811 25001179 31 | нн | 13 1 во 01011791 0 1: 1515101

Примірні мутантні поліпептиди ГФПД, представлені в Таблиці б, проявляли покращену стійкість до Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід) у порівнянні з поліпептидом ГФПД, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 1 в даному винаході. Уже при концентрації в 25 мкМ Спол. 1, клітини Е. соїї, які експресують поліпептид ГФПД (який відповідає 5ЕО ІЮ МО:1) не виробляють коричневу пігментацію і деякі мутантні поліпептиди ГФПД проявляють пігментацію від темно- до помірно коричневої.

Відомий з рівня техніки мутантний поліпептид ГФПД (М/02014/043435), який відповідає 5ЕО

ІО МО: 2 в даному винаході розвивав тільки незначну коричневу пігментацію при 250 мкМ Спол. 1. ї втрачав свою коричневу пігментацію при 500 мкМ Спол.1, показуючи повне інгібування експресованих поліпептидів ГФПД в клітині. Для порівняння, деякі мутантні поліпептиди ГФПД, зображені в Таблиці 6 з БЕО ІЮО МО:31, 32, 96 і особливо з 5ЕО ІЮ МО:104 показують більш сильне коричневе забарвлення в присутності 25, 50, 100, 250 і навіть 500 мкМ Спол. 1.

У додатковому експерименті мутантні поліпептиди ГФІПД аналізували з застосуванням принципу колориметричного аналізу коричневого кольору (як, наприклад, описано в 05 6,768,044). Бактеріальні клітини, які експресують поліпептиди ГФПД відповідно до даного винаходу аналізували в планшеті 96-лункового формату (планшет МипоФ 96 Оеерумеї! мМ, 5ідта-

Аїйгісп, Сент-Луїс, США) для поліпептидів ГФПД з покращеною стійкістю до гербіцидів, які

Зо інгібують ГФПД.

Е. соїї клітини вирощували у рідкому середовищі ЛБ (Сагі Кот ОтрНяСо. Ко, Карлерує,

Німеччина), що містить агент відбирання для вектора експресії Р2ЗЕ429(КІ)МХ (МУМО2014/043435) і 5 мМ пара-гідроксифенілпірувату (ГФП; бЗідта-Аїагісп, Сент-Луїс, США), в присутності або за відсутності гербіциду, що інгібує ГФПД, наприклад, Спол. 1 (1000 мкМ).

Нічну культуру культури Е. соїї, яка експресує один з відповідних поліпептидів ГФПД згідно з даним винаходом доводили до ООбО0 в 0.3 - 0.5 в кінцевому об'ємі 500 мкл й інкубували при 30 градусах Цельсія. Залишкове утворення коричневого кольору визначали шляхом вимірювання утворення коричневого кольору (ВСЕ) в присутності й за відсутності Спол. 1 (2-хлор-3- (метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід).

Тому через 96 годин культуру центрифугували і супернатант культури застосовували для вимірювання оптичної густини утворення розчинного коричневого пігменту при 440 нм (ООлаонм).

Таблиця 7:

Оцінка стійкості примірних мутантних поліпептидів ГФПД до Спол. 1 (1000 мкМ) із застосуванням біоаналізу на коричневий колір і виявлення залишкового утворення коричневого кольору (ВСЕ) через 96 годин 001111 |ПоложенняамінокислотвідноснополіпептидугФПД ЗБОЮ МОЛІ. , Контроль-ний Залиш-ковий 1 ІЇА|ВІМІРІТІО|Т О|О|Е сім є КІАЇ5І1| 266 | 15956 2 |! 11117171 1РМ| | САЇТОЇ | | 268 | 1896 7 | 11717171 Р Оої51 1 1 11771863 | 4096 10 ЇЇ 11117711 Р Оо|5| | ЇМ! ТМ; то9 | б 14 | ЇЇ 17 17 17177 ні! (Р о|5| | ЇМ! ТМ; 142 | 636 19 | | |в8|сбіє|Ї | н/| (Р о|5| / ЇМ! ТМ; 165 | боб 21 | ЇЇ 17171777 (Р нів! 1 1 17171089 | б 22 | | Її 1 71 71 71 7771 (Р нів! ЇМ! 1 | 167 | 5896 24 | ЇЇ 71 71 71 71 771771 (Р нів! 0 ЇМ! ТМ; 156 | «8956 29 | | | 15151 | | |РІНнНІв|! / ЇМ! ТМ! 203 | об 30 | | 15151 | | |РІНнІВ| / ЇМ! ук; 170 | 56 39 ІСІ | софієЇ ЇЇ 7 | (Р о|5| | ЇМЇ ТМ; 163 | 5595 40 |мМ! | сбієЇ | 7 | (Р о|5| | ЇМ! ТМ; т89 | 5896 44 | (СІ То ієЇ | 7 | (Р о|5| 0 ЇМ! ТМ; тво | 40956 46 | | | ТсієЇ м | (Р Оо|5| / ЇМ! ТМ; 247 | ббт 52 | | | Тс 1єЇ | |(5|Р 05) / ЇМ! ТМ; 208 | б 56 | | | Тс |єЇ | 7 | (Р о|5| В/М! ТМ; 198 | бо 57 | | | То єЇ | 7 | (Р о|5| ТІМ! ТМ; 139 | 466 | | | То |єЇ | 7 | (Р Оо|5| | (М |В8ІМ| ї29 | Бі 67 | | |кІсієЇ | 7 | (Р о|5| | ЇМ! ТМ; 193 | 795 72 | | | І8(ЕЇ ЇЇ 7 | (Р о|5| | ЇМ! ТМ; 277 | 72 73 | | | 151єЇ | 7 | (Р о|5| | ЇМ! ТМ; 275 | 7 76 | | | Тсоів/ 7 | (Р о|5| | |ЇМЇ ТМ; 273 | 5896 77 | | | 1015 | 1 | (Р о|5| | ЇМ! ТМ; 257 | 67 81 | ЇЇ | сієЇ ЇЇ 7 | (Р о|5| | | | ТМ; 205 | 3996 83 | | | ТсоієЇ | 7 | (Р о|5| | (20 ТМ; 183 | 4796 86 | | | (соієЇ | 7 | (Р о|5| | (ОЇ ТМ; 194 | 7496 87 | | | То ієЇ | 7 | (Р о|5| | |ЇМЇ ТАЇ 191 | бо / 88 | | | соієЇ | 7 | (Р Оо|5| | ЇМ! 1 | 221 | 7796 89 | | | сієЇ | 7 | (Р Оо|5| | ЇМ! Кк; 236 | б 92 | | |вІсієЇ | н/| (Р 'О|5| / |ЇМЇ ТАЇ 138 | 59956 97 | | | Тсоів/| | (ніБ|Р Оо|5| | ЇМ! Кк; 154 | 49956 99 | | | сф|єЇ | 7 | (Р Оо|5|ЇМ. |в)! ТМ; 152 | 87956 ло | | |сСІсбієЇ | н/| (Р о|5| / (МОм; 248 | 3395 лаг | | |СІВІЄЇ |в | |РІНнНІ5| | (МОМ; 247 | 2695 лоб | | (Сб ієЇ | НіРІР 05) / (МОм; 150 | 73956 107 | |к| сбіє|! | 71 | |(РІн|5|М) |в)| ТМ) 138 | вас

Примірні мутантні ГФПД поліпептиди, наведені в Таблиці 7, показали покращену стійкість до

Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) у 5 порівнянні з поліпептидом ГФПД, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 1 і мутантним поліпептидом ГФПД з рівня техніки (ММО2014/043435), що відповідає 5ЕБЕО ІЮ МО: 2 в даному винаході. Обидва поліпептиди ГФПД, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:1 і 5ЕО ІЮ МО: 2 не виробляли суттєвої коричневої пігментації в присутності інгібітора ГФІПД. Деякі мутантні поліпептиди ГФПД проявляли від середньої до темно-коричневої пігментації. Підсумовані одержані «Уо-значення" у відповідній Таблиці 7 є засобами щонайменше двох незалежних експериментів з середнім стандартним відхиленням 5 95.

Приклад 6: трансформація соєвих бобів і стійкість рослин соєві боби ТО

Трансформацію соєвих бобів здійснювали з застосуванням способів, добре відомих у даній галузі таких як описані з застосуванням опосередкованої Адгобасіегішт їшптегїасіеп5 трансформації напівнасіннєвих експлантатів соєвих бобів, по суті застосовуючи метод, описаний у Ра; еї аї. (2006), Ріапі сей Кер. 25:206. Трансформанти ідентифікували, використовуючи гербіцид, що інгібує ГФПД "темботрион" як селекційний маркер. Спостерігали появу зелених пагонів і документували як показник стійкості до гербіциду, що інгібує ГФПД - тебтротриону. Стійкі трансгенні пагони показували нормальний зелений колір, порівняний з пагонами соєвих бобів дикого типу, необроблених гербіцидом, що інгібують ГФПД - темботрионом, тоді як пагони соєвих бобів дикого типу, оброблені такою ж самою кількістю гербіциду, що інгібує ГФПД - темботрионом, повністю відбілювались. Це вказувало на те, що наявність відповідного поліпептиду ГФПД задіяло стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД, таким як темботрион.

Стійкі зелені пагони переносили в субстрат для вирощування рослин або прищеплювали.

Укорінені рослини були перенесені в теплицю після акліматизаційного періоду. Потім рослини, що містять трансген, обприскували гербіцидами, що інгібують ГФПД, як наприклад мезотрионом з нормою внесення 300 - 600 г АР/га, або Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) з нормою внесення 150 г - 300 г АР/га доповненим сульфатом амонію і метиловим ефіром ріпакової олії. Через 5-10 днів після застосування були оцінену симптоми, зв'язані із застосуванням гербіциду, і їх порівнювали з симптомами, спостережуваними на рослинах дикого типу при тих самих умовах.

Наприклад, рослини соєвих бобів ТО, що мають "експресійну касету рослини", яка містить поліпептид ГФІД, стійкий до інгібітора ГФПД відповідно до даного винаходу, тестували стосовно стійкості до Спол. 1.

До дослідів в теплиці з трансгенними рослинами трансформанти соєвих бобів регулярно аналізували на експресію і присутність трансгенів з застосуванням метода виявлення білка

ЕГІЗБА (див. докладний опис під пунктами ОО і Н). Для аналізу стійкості до гербіцидів застосовували тільки рослини, які відновлюються в середовищі відбирання і які мають визначальну експресію трансгенного білка ГФПД. Обприскувач ОемМгієх ТгтасКег був відкалібрований перед кожним обприскуванням. Хімічний склад, використовуваний для Спол. 1

Зо додавали сульфатом амонію і метилованою олією з насіння ріпаку. Дослідження на обприскування проводили з концентрацією, яка дорівнює 300 г АР на гектар (300 г АР/га).

Стійкість оцінювали через 5 днів після обприскування. Рослини соєвих бобів дикого типу, обприскані одним і тим самим гербіцидним складом, повністю відбілювались і проявляли більше ніж 95 95 ушкодження листя двох верхніх листків трилисника. Оцінка "1" була присвоєна рослинам з незначною стерпністю, тобто верхні два листка трилисника показують значне відбілювання і незначні ознаки відновлення з ушкодженням листя 50-9595. Оцінку "2" присвоювали рослинам з помірною стійкістю тобто між 10-49 95 площі листа верхніх двох листків трилисника, що свідчить про значну величині стійкості до обробки гербіцидами. Оцінку "3" присвоювали рослинам з гарною стійкістю, тобто менше ніж 10 95 площі листя з трьох верхніх листків трилисника, що демонструють хлороз або тільки дуже незначне відбілювання.

Результати наведені в Таблиці 8.

Таблиця 8:

Оцінка ушкодження площі листя трансгенних подій соєвих бобів ТО через п'ять днів після застосування Спол. 1 з нормою 300 г АР/га

Події соєвих бобів, які Оцінки стійкості до гербіцидів | загальна кількість| Процентне відношення експресують ов оброблених подій | подій з оцінкою "283" поліпептид ГФПД 5ЗЕОІЮМО2 | 5 | 10 | 26 | 49. ї..ЙЙюЙИЙ90 2 5юЮю КюРВЕЮЯВ | 833 4

ЗБОЮ МО:32 | 1 | 0 | 70 | 28 1.777739. | юри 5ЕОІЮМО:96 | 0 | 5 | 43 | 34 | 82 | ---.ю939956 щ -КРЗ

Результати, наведені в Таблиці 8 показують, що значна частина незалежних подій соєвих бобів ТО є стійкими до гербіциду, що інгібує ГФПД Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) з нормою 300 г АР/га у порівнянні з контрольними рослинами соєвих бобів дикого типу, також обробленими гербіцидом, що інгібують ГФПД - Спол. 1.

Більше ніж 90 95 подій соєвих бобів ТО з мутантними поліпептидами ГФПД, відповідними

ЗЕО ІЮО МО: 32, 5ЕО ІО МО: 96 і БЕО ІЮО МО: 31 мають менше ніж 50 956 ушкодження листя і тем самим також краще, ніж поліпептид ГФПД з рівня техніки (М/О2014/043435) популяції ТО з пропорцією в 83 95, який відповідає 5Е200 ІЮ МО:2 в даному винаході. До того ж «72 95 подій соєвих бобів ТО з мутантним поліпептидом ГФПД, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 32, показують менше ніж 10 95 ушкодження листя, що знову показує покращення у порівнянні з популяцією події соєвих бобів ТО (5495), з надекспресією поліпептиду ГФПД з рівня техніки (М/О2014/043435), що відповідає ЗЕО ІЮ МО:2 в даному винаході.

У додаткових дослідах в теплиці від 21 до 94 незалежних подій соєвих бобів ТО на конструкцію, що містить примірний мутантний поліпептид ГФПД обприскували гербіцидом, що інгібує ГФИД Спол.1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід) з нормою 300 г АР/га, доповненим сульфатом амонію і метиловим ефіром ріпакової олії. Через п'ять днів після застосування площу ушкодженого листя, через дію гербіциду, що інгібує ГФПД, оцінюють за шкалою від 0 (без ушкоджень) до 100 (повне відбілювання). В цих умовах рослини дикого типу були повністю відбіленими, а їх показник ушкоджень знаходився в діапазоні 95-100.

В Таблиці 9 представлений розподіл даних шкали ушкоджень, викликаних гербіцидом, що інгібують ГФПД як процентиль для примірних мутантних поліпептидів стійких до гербіциду, що інгібує ГФПД, (ЗЕО ІЮ МО5). Процентилі нормалізують категорії показника ушкоджень від окремої рослини в популяції. Значення 25-го процентиля представляє собою шкалу ушкодження, де 25 95 подій соєвих бобів в даній популяції мали більш низькі і 75 90 більш високі показники ушкоджень. Медіана представляє собою 50-й процентиль. Половина значень мала

Зо більш високі показники ушкоджень; у половини були більш низькі показники ушкоджень.

Значення 75-го і 90-го процентилей представляє собою показник ушкодження, де 75 95 і 90 95 подій соєвих бобів мали відповідно більш низькі показники ушкоджень. Різницю між 75-м і 25-м процентилем називають міжквартильним діапазоном і маркером для кількісного визначення розсіяння в популяції. Все конструкції мали тільки одну касетну вставку в геном соєвих бобів.

В Таблице 9, конструкції були ранжовані на основі показників ушкоджень згідно з 75-м процентилем, від мінімального до самого високого показника. Всі Примірні варіанти поліпептиду

ГФПД є кращими у всіх аналізах процентилей, ніж мутантний поліпептид ГФПД з рівня техніки (МИО2014/043435), який відповідає 5ЕО ІЮО МО:2 в даному винаході. Оцінка мутантного поліпептиду ГФПД з рівня техніки (М/02014/043435), що відповідає 5ЕО ІЮО МО:2 у даному винаході зазначена в нижньому ряді Таблиці 9.

Таблиця 9:

Оцінка ушкодження площі листя трансгенних подій соєвих бобів ТО через п'ять днів після застосування Спол. 1 з нормою 300 г АР/га за розподілом процентилей

Події соєвих бобів ТО, Загальне число . . . незалежних . . . Міжквартильний які експресують бприсканих 25-й Медіана 75-й діапазон поліпептид ооприска подій

ЗЕОІЮМО:т02 | 92 2 ющ | 80 | 100 | 200 | 120 | 450

Трансформації бавовника досягають за допомогою використання способів, добре відомих з рівня техніки, особливо переважний спосіб описаний в РСТ патентній публікації ММО 00/71733.

Регенеровані рослини переносять в теплицю. Після періоду акліматизації, рослини, що виросли в достатній мірі обприскують гербіцидами, які інгібують ГФПД, такими як, наприклад, темботрион, еквівалентний 100 або 200 г АР/га, з додаванням сульфату амонію і метилового ефіру ріпакової олії. Через сім днів після нанесення обприскуванням, симптоми, зв'язані з обробкою гербіцидом, що інгібують ГФПД, оцінюють і порівнюють 3 симптомами, спостережуваними на рослинах бавовника дикого типу, яких піддавали однаковій обробці при тих самих умовах.

Приклад 8: Трансформація рослинних клітин маїсу за допомогою трансформації, опосередкованої Адгорасіегійт

Побудова експресійної касети рослини для придатної експресії в рослині маїсу і трансформація маїсу добре відомі в рівні техніки і в цьому конкретному прикладі були описані і використані способи з заявок М/02014/043435 і М/О2008/100353. Полінуклеотидні послідовності, що кодують мутантні ГФПД поліпептиди, в даній заявці накопичуються з полінуклеотидною послідовністю, що кодує варіант білка ЕР5Р5 для надання стійкості до гербіцидів, які націлені на ЕРБРБ. Ген ЕРБР5 виділяли і піддавали мутації з Агіпгорасієг діорітогтіз (ММО2008/100353) і приєднували всередині рамки до транзитної пептидної послідовності, щоб спрямовувати транслокацію трансльованого білка в хлоропласт. Стабільну експресію здійснюють за допомогою убіквітарного промотора (промотор Убіквітин 4 з цукрової тростини, Патент США 6,638,766), і 355-термінирующую послідовність з мозаїчного вірусу цвітної капусти, яка клонується вище і нижче гена ЕРБР5, відповідно.

Відповідний мутантний поліпептид ГФІПД буде клонований з тим самим промотором, транзитним пептидом хлоропласту, і термінувальною послідовністю, як описано для експресійної касети гена ЕРБЗР5. Кодувальні послідовності для обох генів є кодонами, оптимізованими для експресії маїсу. Для трансформації маїсу початки краще за все збирають

Зо через 8-12 днів після обпилення. З качанів виділяють ембріони, і саме ці ембріони розміром 0, 8- 1,5 мм є переважними для використання при трансформації. Ембріони накладали стороною скутелуму догори на придатне середовище для інкубації, й інкубують протягом ночі при 25 "С в темноті.

Тим не менше, інкубувати ембріони саме протягом ночі по суті не є обов'язковим. Ембріони вводять у контакт зі штамом Адгобасіегійшт, який містить відповідні вектори, що мають нуклеотидну послідовність відповідно до даного винаходу для опосередкованого Ті плазмідою перенесення протягом приблизно 5-10 хв. і потім накладають на середовище для сумісного культивування протягом приблизно З днів (при 25 "С в темноті). Після сумісного культивування експлантати переносять в середовище періоду відновлення приблизно на п'ять днів (при 25 С в темноті). Експлантати інкубують в селективному середовищі з гліфосатом протягом до восьми тижнів, залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного селективного середовища. Після періоду селекції одержаний калус переносять в середовище дозрівання ембріонів, поки не спостерігали утворення зрілих соматичних ембріонів. Одержані зрілі соматичні ембріони потім поміщають під слабке освітлення, й ініціюють процес регенерації, як відомо з рівня техніки. Одержаним паросткам дають вкоренитися в субстраті для вирощування, і одержані рослини переносять у горщики для розсади і розмножують як трансгенні рослини.

Рослини регулярно аналізували на предмет експресії і присутності трансгенів, використовуючи метод виявлення білків ЕГІЗА. Для аналізу стійкості до гербіцидів застосовували тільки рослини, виділені в селективному середовищі і які мають виявлену експресію трансгенного білка ГФПД.

Приклад 9. Стійкість рослин Т1 соєвих бобів до гербіцидів, які інгібують ГФПД/польові дослідження

Рослини соєвих бобів, що експресують поліпептид, стійкий до гербіциду, що інгібує ГФПД, відповідно до даного винаходу, поодинокі, або поряд з геном, що надає стійкість до гліфосату іабо геном, що надає стійкість до глуфосинату або що мають "експресійну касету рослин", які містять тільки поліпептид, стійкий до гербіциду, що інгібує ГФПД, відповідно до даного винаходу, тестували на предмет стійкості до різним хімічним класів гербіцидів, які інгібують.

Трансгенні рослини регулярно аналізували відносно експресії і присутності трансгенів, використовуючи метод виявлення білків ЕГІЗА (див. докладний опис під пунктами ЮО і Н).

Регенерували тільки рослини, відновлені в селективному середовищі й що мають експресію

Зо виявленого трансгенного білка ГФПД, їх переносили в теплицю і на стадії зростання М2-У4 застосовували для аналізу на стійкість до гербіцидів, які інгібують ГФПД, подій соєвих бобів ТО в теплиці (Приклад 6). Хімічний склад з гербіцидами, що інгібують ГФПД, доповнювали сульфатом амонію і метиловим ефіром ріпакової олії. Оцінку стійкості до гербіцидів проводили через 5 - 21 день після обприскування.

Самі ефективні незалежні події соєвих бобів ТО були самозапилювальними для виробництва насіння соєвих бобів Т1.

В польових дослідженнях удосконалене насіння соєвих бобів Т1 висаджували і обробляли або за допомогою 210 г/га ізоксафлутолу або 150 г/га Спол. 1 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--'трифторметил)бензамід) на стадії зростання М2-У4 (Таблиця 10) і ушкодження листя оцінювали через вісім днів після нанесення гербіциду, що інгібує ГФПД. Всі рослини соєвих бобів дикого типу або сегреговані рослини соєвих бобів Т1 без поліпептиду, стійкого до інгібітора ГФПД обприскували тим самим гербіцидним складом і були повністю відбіленими і показували 100 95 ушкодження листя через вісім днів після нанесення.

В Таблиці 10, представлена частота подій соєвих бобів, які проявляють гарну стійкість, тобто яка дорівнює або менше ніж 15 95 ушкодження загальної площі листя.

Все примірні варіанти поліпептиду, стійкі до гербіциду, що інгібує ГФПД, наведені у даній заявці, мали більш високу частоту в популяції з гарною стійкістю з рівним або менше ніж 15 95 ушкодженням листя і тому виявлялись краще, ніж мутантний поліпептид ГФПД з відомого рівня техніки (М/О2014/043435), який відповідає 5ЕО ІЮ МО:2 у даному винаході.

Таблиця 10. Оцінка в польових дослідженнях ушкодження площі листя з примірних трансгенних подій соєвих бобів Т1 на стадії росту М2-М4, що експресують різні варіанти поліпептиду ГФПД, оброблених або за допомогою 210 г/га ізоксафлутолу (Таблиця 10а) або 150 г/га Спол. 1 (Таблиця 105).

Таблиця 10.а)

Польові дослідження примірних трансгенних подій соєвих бобів, обприсканих за допомогою 210 г/т ізоксафлутолу і оцінені через вісім днів після нанесення: - -05

Події соєвих бобів ТІ, які | Загальна кількість Незалежні події З З : 15 96о ушкодженням ш експресують поліпептид незалежних - Частота в популяції

ГФИД обприсканих подій листя після обприскування 5ЕО І МОг2 5ЕО ІЮ МО: 16 5ЕО ІЮ МО: 18 5ЕО ІЮ МО: 31 5ЕО ІЮ МО: 32 5ЕО Ір МО: 96

Таблиця 10.6)

Польові дослідження примірних трансгенних подій соєвих бобів Т1, обприсканих за допомогою 150 г/га Спол. 1 й оцінені через вісім днів після нанесення:

Події соєвих бобів Т1, які Загальна кількість ІНезалежні події з х 15 9/5 експресують поліпептид незалежних ушкодженням листя Частота в популяції

ГФПД обприсканих подій | після обприскування 5ЕО І МОг2 5ЕО ІЮ МО: 16 5ЕО ІЮ МО: 18 5ЕО ІЮ МО: 31 5ЕО ІЮ МО: 32 5ЕО Ір МО: 96

Всі публікації і патентні заявки, згадані в описі, вказують на рівень навичок спеціалістів в галузі техніки, до якої відноситься цей винахід. Всі публікації і патентні заявки включені в даний опис шляхом посилання в такому ж ступені, як якщо б кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно і окремо позначена як включена шляхом посилання.

Хоча викладений винахід описаний в певних подробицях шляхом ілюстрації і прикладів з метою ясності розуміння, буде очевидно, що в обсязі доданої формули винаходу можуть бути здійснені визначені зміни й модифікації.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Вауегк Сгорб5сіепсе АС «1205 ВАРІАНТИ ГФПД І СПОСОБИ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 Ввс5151036 «1605 109 «1705 РавепсІп уеквіоп 3.5 «2105 1 «2115 358 «212» РВТ «213» Рвечдотопав тТ1погевсепв «220» «221» 4-гідроксифенілпируватдіоксигеназа (НРРО; Рхечдотопав

ТІ погевсепв) «222» (1)..(358)

«4005 1

Меє Аза Авр Гечп Тук біш АвБп Рго Мес сіу Гей Меє біу Рре бій Рре 1 5 10 15

Іїе бій Рре Аїа бек Рго ТПг Рго біу ТПг Гей сій Рго І1їе Рое січ 20 25 Зо

Іїе Меє сіу Рре ТПг Гуз Уаі Аза ТрПг Ніб Агуд бБег Пубв АБп Уа1ї Нів 35 40 45

Теч Туг Акуд біп сіу сії І1їе АБп ІТечп Іїе Те АбБп Авп бій Рго АБпП 5о0 55 бо

Бек Іїе Аїа бек Тук Рпбе Аїа Аза бі Нів сіу Рго Бек Уа1і Суз б1Уу 65 70 75 80

Мес Аза Рпе Акуд Уаі1і ПЦув Авр бег Сбіп Пув Аїа Туг АБп Агуд Аїа Іеєч 85 90 95 біч Теч сіу Аїа сіп Рго Іїе Ніб5 Іїе АБр ТПг біу Ркго Меє січ Гей

Зо 100 105 110

АБп о Геч Рго Аїа Іїе Гуз біу Іїе сбіу сбіу Аза Рго Геч Туг Іеч І1е 115 120 125

З5

АБр Акуд Рбе сіу сії біу бек бек Іїе Туг Авр Іїе АБр Роре Уа1! Туг 130 135 140

Теч біч сіу Уаі сій Акуд Абп о Рго Уаі! біу Аїа біу Ге Ппуз Уаі Ше 145 150 155 160

Авр Нів Геч Типг Нів Авп Уаі Туг Агуд с1іу Аку Меє Ма1 Туг Тгр А1а 165 170 175

АвБп о Рпе Тук січ Ппуб5 Геч Робе АБп Рпе Агуд сбіц Аза Агуд Тугє Роре АБр 180 185 190

Іїе пув сіу бі Тук ТБ біу Пец ТПг бек Пу5 Аїа Меє бек Аза Рго 195 200 205

Авр сіу Меє Іїе Аку І1їе Рго ІТеч АБп біц бій бек Бек Ппув с1у Аа 210 215 220 60 біу біп Іїе сіц сі Рбе Гечп Меє біп Рбе АБп сбіу біц сіу ІШе сіп 225 230 235 240 65 Нів Маії Аїа Рре їеч ТПг Авр Авр Тез Ма1! Ппув Тіг Тгр Авр Аїа Іеч 245 250 255

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго Рго Авр ТПг Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Теч біп Аїа Акуд сіу Іїе Гечш Геї АБр біу бек бек Уаі бі с1у Авр 290 295 300

Туз Акуд Гей Геч Геч сіп І1їе Роре бек біч ТБПг Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Ппу5з біу Авр Авр сіу Рпое сіу біч с1Уу 325 330 335

АвБп о Рпе Пув Аїа ІГеч Роре біч бег І1їе бій Агуд Абр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 2

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 2

Меє Аза АБр Те Тук бій Аб5п Рго Меє сіу Іеч Месє сбіу Рпе сій Рібе 1 5 10 15

Теч Туг Акуд біп сіу сії І1їе АБп ІТечп Іїе Те АбБп Авп бій Рго АБпП 5о0 55 бо бек І1їе Аїа бек Туг Рре Аїа Аїа сії Нів Сіу Рго бег Уаі1і Сув СЩШ1У 65 70 75 80

Меє Аза Рбе Аку Уаі! пуб Авр бек сбіп Пув Аїа Туг АБп Агуд Аїа Гец бо 85 90 95 біч Теч сіу Аїа сіп Рго Іїе Ніб5 Іїе АБр ТПг біу Ркго Меє січ Гей 100 105 110 65

АвБр Нів Гечї ТПг Ніб АБп Уа! Туг Аку біу Акуд Меє Уаі1і Тугє Тгр Аза 165 170 175

АБп о Рпе Туг біч пуб Геч Рре Авп Рре Акуд бі Аза Агуд Туг Ре Авр 180 185 190

Авр сіу Меє Іїе Аку І1їе Рго ІТеч АБп біц бій бек Бек Ппув с1у Аа 210 215 220 біу біп Іїе сіц сі Рбе Гечп Меє біп Рбе АБп сбіу біц сіу ІШе сіп 225 230 235 240

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тпг Аза Рго Рго Авр ТіПг Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Тгр 325 330 335

АБп Рпе Аїа Сіп Іїеч Рре Сі бЗег І1їе сії Агуд Авр Сіп Уаі Агд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 З «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 З

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Ппу5з біу Авр Авр сіу Рое сі1у Рго б1Уу 325 330 335

АвБп о Рпе Пув Аїа ІГеч Роре біч бег І1їе бій Агуд Абр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 4

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 4

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Ппу5з біу Авр Авр сіу Рпое сіу біч с1Уу 325 330 335 бек Рпе пув Аїа Іїеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 15 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 5

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 6

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 6

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

АБп о Рпе Ппув Аїа Іеч Рре Сі бЗег І1їе сії Агуд Авр Сіп Уаі Агд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 7 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 7

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 8

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 8

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 19 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 19

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 10

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 10

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 11 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 11

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 12

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 12

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 13 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 13

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 14

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 14

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 15 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 15

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго бек Авр бег Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 16

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 16

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тпг Аза Рго бег Авр бБег Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ бек Ппув бі Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 17 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 17

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго біу Авр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 18

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 18

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пу пув І1е сіу Меє Агу Рпе Акуд Тпг Аза Рго Рго АвБр ТіПг Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 19 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 19

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб І1е сіу Меє Аку Ррбе Агу ТПг Аза Рго біу АвБр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 20

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 20

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335

АБп о Рпе Ппув Аїа Іеч Рре Сі бЗег І1їе сії Агуд Авр Сіп Уаі Агд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 21 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 21

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 22

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 22

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 23 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 23

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 24

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 24

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 25 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 25

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Нів Ар сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 26

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 26

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Нів Ар сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 27 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 27

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 28

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 28

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Нів Ар сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 29 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 29

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 30

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 30

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ бек Ппув бі Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 31 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 31

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 32

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 32

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пу пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тип Аза Рго Агуд АБр Січ Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 33 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 33

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Агу Геї Робе бічц бек Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 34

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 34

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тип Аза Рго сС1у АБр Січ Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 век Рпе Ппуз Агуд Гей Рпе бій бек Пув бій Агу Авр біп Уаії Агу Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 35 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 35

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Агу Геї Робе біч бек Пув бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 36

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 36

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пу пув І1е сіу Меє Агу Рпе Акуд Тип Аза Рго сС1у АБр Січ Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 37 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 37

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго біу Авр Агу Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Пув бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 38

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 38

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Акуд Пувз сіу Уаі Ар сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 39 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 39

Зо 100 105 110

З5

Іїе пув сіу бі Тук ТБ біу Пец ТПг бек пуб Ге Меє бек Аза Рго 195 200 205

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 40

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 40

Іїе пув сіу бі Тук ТБ біу Пец ТПг бек пуб Меє Меє бек Аза Рго 195 200 205

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 41 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 41

Зо 100 105 110

З5

Іїе пув сіу бі Тук ТБ біу Пец ТПг бек Ппубв бБег Меє бек Аза Рго 195 200 205

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 42

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 42

Іїе пув сіу бі Тук ТБ біу Пец ТПг бек Ппу5 Тс Меє бек Аза Рго 195 200 205

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 43 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 43

Зо 100 105 110

З5

Авр сіу Меє Іїе Ппуб5 І1е Рго Теч АБп біц бій бек Бек Ппув с1у Аа 210 215 220 60 біу біп Іїе сіц сі Рбе Гечп Меє біп Рбе АБп сбіу біц сіу ІШе сіп 225 230 235 240 65 Нів Маії Аїа Рре їеч ТПг Авр Авр Тез Ма1! Ппув Тіг Тгр Авр Аїа Іеч 245 250 255

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 144

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 44

Авр сіу Меє Іїе Геї І1їе Рго ІТеч АБп біц бій бек Бек Ппув с1у Аа 210 215 220 біу біп Іїе сіц сі Рбе Гечп Меє біп Рбе АБп сбіу біц сіу ІШе сіп 225 230 235 240

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 45 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 45

Зо 100 105 110

З5

Туз Акуд Гей Геч Геч сіп І1їе Роре бек біч Акуд Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 46

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 46

Зо

Туз Акуд Гей Геч Геч сіп І1їе Роре бек біч Меє Гец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 47 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 47

Зо 100 105 110

З5

Туз Акуд Гей Геч Геч сіп І1їе Роре бек біч Ніб Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 48

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 48

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Ар Нів сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 49 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 49

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу АвБр Іїе сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 550

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 50

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр Рго сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 51 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 51

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр Геї сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 чф1352

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 52

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр Бек сбіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 10553 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 53

Зо 100 105 110

З5

Зек Уа1і Ппув Маї Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 «54

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 54

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рре Аїа Уаї Іїеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 1655 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 1055

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе сії Маї Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 56

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 156

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рре Аку Уаі їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 157 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 57

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе ТПг Маї Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 158

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 58

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре бі Рго Ма1і Сі Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 59 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 59

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч Акуд Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 60

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 60

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ Сіп Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 61 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 61

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Роре біч Рко Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 62

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 62

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маі їеч Рре Січ Агд Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 63 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 63

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго біу Авр ТПг Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 64

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 64

Зо

Туз Акуд Гей Геч Геч Ні І1їе Роре бек біч ТБПг Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 65 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 65

Зо 100 105 110

З5

Туз Акуд Геч Геч Геч Ппу5 І1їе Роре бек біч ТБПг Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 656

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 66

Зо

Туз Агуд Гей Геч Гечс бБег І1їе Роре бек біч ТБПг Пец Меє сіу Рго Уаї 305 310 315 320

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 67 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 67

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Пуб5 ТПг Аза Рго біу АвБр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 68

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 68

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе їеп Тип Аза Рго сС1у АБр Січ Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 69 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 69

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб І1е сіу Меє Аку Рбе сіп ТБг Аза Рго біу АвБр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 70

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 70

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 71 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 71

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго Рго Ар бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 72

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 72

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 73 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 73

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго бек Авр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 174

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 174

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тпг Аза Рго сС1у АБр Іеч Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 75 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 75

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго біу Авр Рго Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 76

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 76

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Меє Тип Аза Рго сС1у АБр Агд Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 177 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 77

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Меє ТПг Аза Рго біу Авр бек Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 78

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 78

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Акуд пуб сіу Аїа Ар сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 79 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 79

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Акуд пуб сіу Рпе АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 80

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 80

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пувз сіу сіу АвБр сбіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 81 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 81

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Аїа Іеч Роре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 82

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 82

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Січ їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 83 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 83

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув біу Геї Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 84

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 84

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув їеч їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 85 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 85

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Меє Іечп Рре біч бек Уаі бій Агуд Авр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 86

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 86

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Сіп їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 87 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 87

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Аїа бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 88

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 88

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег І1е сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 89 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 89

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Пув бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 190

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 190

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пу5 сіу Авр АБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 91 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 191

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бег Акгуд бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 12

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 92

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бег Аїа сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 13 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 193

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек І1їе бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 194

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 194

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ бек Ппув бі Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 195 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 195

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бег Акгуд бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 196

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 196

Авр сіу Меє Іїе Ппуб5 І1е Рго Теч АБп біц бій бек Бек Ппув с1у Аа 210 215 220 біу біп Іїе сіц сі Рбе Гечп Меє біп Рбе АБп сбіу біц сіу ІШе сіп 225 230 235 240

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Ма1і сії Агуд Авр Сіп Уаі Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 197 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 197

Зо 100 105 110

З5

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пув сіу Нів Бек сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч бек Пув бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 198

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 198

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пув сіу Нів Бек сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 век Рпе Ппуз Агуд Гей Рпе бій бек Пув бій Агу Авр біп Уаії Агу Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 199 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 199

Зо 100 105 110

З5

Зек Уа1і Ппув Аку Геї Роре біч бек Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 100

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 100

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ Сіп Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 101 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 101

Зо 100 105 110

З5

Туз пуб Ії1е сіу Меє Аку Рре Геї ТПг Аза Рго біу АвБр бій Туг Туг 260 265 270 бі Меє Геп бі сб1у Агкуд Гей Рго АБр Нів біу бій Рго Уа1і Авр біп 275 280 285

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч біп Меє сій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 102

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 102

Зо

Нів Маії Аза Рбе їеч ТБг Ар Авр Геч Уа1ї Ппуб5 Тс Теср АБр Аїа Гец 245 250 255 пув пув І1е сіу Меє Агу Рпе Гей Тип Аза Рго Агуд АБр Січ Туг Туг 260 265 270 біч Меє Ге сі сіу Акд Геї Рго АБр Ні біу біц Рго Уаі Авр сіп 275 280 285

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ Сіп Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 103 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 103

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Ппув Маії Іеч Рре біч біп Меє сій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 104

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 104

Зо

Рпе Рпе сії Рре І1їе біп Агку Ппу5з біу Авр Авр сіу Роре сбіу Рго Нів 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ Сіп Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 105 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 105

Зо 100 105 110

З5

Зек Рпе Пув Агу Геї Робе біч біп Меє бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 106

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 106

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку Пув сіу Нів Рго сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Січ Сіп Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 107 «2115 358 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205

«223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 107

Зо 100 105 110

З5

Зек Уа1і Ппув Аку Геї Роре біч бек Уаі бій Агуд Абвр біп Уаі Агу Агд 340 345 350 сіу Уаі їеч ТрПг Аїа Авр 355 «2105 108

Зо «2115 358 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» мутантний поліпептид ГФПД «4005 108

Зо

Рпе Рпе сії Рре Іїе біп Аку пуб сіу Нів АвБр сіу Роре біу Рго Авр 325 330 335 бек Рпе Ппув Маії їеч Рре Сі бек Меє сії Агуд Авр Сіп Уаі1і Агуд Агд 340 345 350 біу Уаі Гей ТрПг Аза Авр бо 355 «2105 109 «2115 1074 65 «2125 РОМА «2135» Рвемчдотопаз ЕІпогевсепв «2205

«221» ср5 4-гідроксифенілпіруватдіоксигеназа (НРРБ) «222» (1)..(1074) «4005 109 асддсадасєс Сабасдаааа сссааєдуддс ссдасдддеє Єсдааєсєсає сдаасссосд бо

Есудссудасус суддудсасссє ддадссдаєс сЕСЧдчадаєса Єдддсесєсас сааадесос 120 асссассуєс ссаадаасує дсасссдсас сдссадддсу адчаєсаассє даєссеєсаас 180 аасадссса асадсассус ссссврассєс дсуддссдаас асуддсссуєс доаєсдесдсоадес 240 асддсдЕссс дсудєдаадда сссусаааа дссвєасаасс дсудсссєдча асссуддсдсс 300 садссудаєсс агасєдасас сдддссдаєд даасєдаасс Сдссддасдає саадддсаєс 360 часдадсЧдсус сусЕєдвасся даєсччассує сЕСсСддсдаа дсадсєсудає свеасудасаєс 420 чассєсуєдес ассеЕсЧдаадч ЄдЕЧ9Ччадсус аасссудЕсу дсдсаддеєсс сааадесаєс 480 чассасссда сссасаасує ссассусуддс сдсасудЕСЕ асєдддссаа сЕЄСсасдад 540 авдваасєдеЕсса ассеєссуєда адсусуєсас сЕСЧдаєаєса аддудсдадеа сассудссед 6о0 асЕсссаадд ссаєдадедс дссудасудс асдасссдса Єсссусєдаа сдаададесд ббо

Ессаадчдудсу сддддсачає саачадсєс сеєдасєдсаде Єсаасудсда аддсаєссад 720 сасдеддсдЕ Ессссассда сдассєддсс аадассєддад асдсдеЕєЄдаа дааааєссдддс 780

Зо асдсудсЕсса Сдассусусс дссадасасс Сассасдааа Єдсссдаада ссдесєдссе 840 чассасуддсу адссудсбудда Єсаассудсад дсасусудсба єсссдсєдчда судассєєсс 900

ЧЕддааддсд асааасудссс дсеЕдседсад ассЕссеєсудд ааасссеєдає дддсссдадаед 960 рЕСЕссдаає ссаєссадсу саадддсдас даєдадЧчеєсвєд дсудаддддаа сеЕсСсааддсд 1020 сЕдеЕЕсдаде ссаєсудаасу Єдассадууєд судсесудєддаєд баєєдассус сдає 1074

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид (М4- гідроксифенілпіруватдіоксигенази (ГФПД), де вказаний закодований поліпептид ГФПД містить амінокислотну послідовність, що має: (а) щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, викладеною в ЗЕО ІЮ МО, (б) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО, (в) гістидин або аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮ МО, і (г) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 ЗЕО ІЮ МО-1.

2. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: її метіонін, треонін, серин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 204 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії) лізин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії) аргінін, лізин, глутамін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає 60 амінокислотному положенню 264 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їм) аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін, лейцин, глутамінову кислоту, пролін або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі) серин, гістидин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 310 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін, метіонін або гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) гістидин, аланін, фенілаланін, валін або гліцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їх) пролін, гістидин, серин, ізолейцин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 331 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або х) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО І МО:1; і/або хі) глутамінову кислоту, аргінін, аланін або треонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 339 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або хії) аргінін, глутамін, метіонін, глутамінову кислоту, гліцин, лейцин або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або хії) глутамін, пролін або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО ІЮ МО:1; і/або хім) лізин, аргінін, метіонін, аланін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 ЗЕО ІЮ МО:1.

З. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: ї) лейцин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО І МО:1; і/або ії) аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІО МО:1; і/або ії) аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їм) глутамінову кислоту або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі) гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 5ЕО ІО МО:1; і/або мії) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їх) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО ІО МО:1; і/або х) лізин, валін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО:1.

4. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: ї) лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії) аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІО МО:1; і/або ії) гліцин або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІО МО:1; і/або ім) глутамінову кислоту в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному БО положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі) гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 5ЕО ІО МО:1; і/або мії) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їх) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО 60 ІО МО:1; і/або х) лізин, валін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО:1.

5. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за пп. 1, 2, З або 4, де зазначений закодований поліпептид ГФПД містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, викладеною в 5ЕО ІЮ МО:1.

6. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 5, де зазначений закодований поліпептид ГФПД містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, викладеною в 5ЕО ІЮ МО:1.

7. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-6, де її нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промотором, здатним спрямовувати експресію нуклеотидної послідовності в клітину рослини.

8. Клітина-хазяїн, яка містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-

7.

9. Клітина-хазяїн за п. 8, що являє собою бактеріальну клітину-хазяїна.

10. Клітина-хазяїн за п. 8, що являє собою клітину рослини.

11. Трансгенна рослина, стійка до гербіциду, який інгібує ГФПД, що містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-7.

12. Рослина за п. 11, де зазначену рослину вибирають з групи, що містить маїс, сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті рослини, перці, картоплю, бавовник, рис, соєві боби, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь і олійний ріпак.

13. Трансгенне насіння для вирощування рослини за п. 11 або 12, що містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-7.

14. Рекомбінантний ГФПД поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має: (а) щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, викладеною в ЗЕО ІЮ МО:1, (б) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО, (в) гістидин або аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮО МО, і Зо (г) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО:1.

15. Рекомбінантний поліпептид за п. 14, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: ї) метіонін, треонін, серин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 204 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або ї) лізин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО І МО:1; і/або ії) аргінін, лізин, глутамін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їм) аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін, лейцин, глутамінову кислоту, пролін або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або мі) серин, гістидин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 310 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін, метіонін або гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) гістидин, аланін, фенілаланін, валін або гліцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або їх) пролін, гістидин, серин, ізолейцин або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає БО амінокислотному положенню 331 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або х) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО І МО:1; і/або хі) глутамінову кислоту, аргінін, аланін або треонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 339 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або хії) аргінін, глутамін, метіонін, глутамінову кислоту, гліцин, лейцин або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 ЗЕО ІЮ МО:1; і/або хії) глутамін, пролін або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО ІЮ МО:1; і/або хім) лізин, аргінін, метіонін, аланін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає 60 амінокислотному положенню 345 ЗЕО ІЮ МО:1.

16. Рекомбінантний поліпептид за п. 15, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: ї) лейцин або лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 ЗЕО ІО МО:1; і/або ії) аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІО МО:1; і/або ії) аргінін, гліцин або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їм) глутамінову кислоту або серин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі) гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 5ЕО ІО МО:1; і/або мії) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їх) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО ІО МО:1; і/або х) лізин, валін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО1.

17. Рекомбінантний поліпептид за п. 15, де амінокислотна послідовність вказаного закодованого ГФПД поліпептиду додатково містить: ї) лізин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 213 5ЕО ІЮ МО:1; і/або ії) аргінін або лейцин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 264 5ЕО ІО МО:1; і/або ії) гліцин або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО ІО МО:1; і/або ім) глутамінову кислоту в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО:1; і/або м) аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 315 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мі) гістидин в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 330 5ЕО ІО МО:1; і/або мії) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 338 5ЕО ІЮ МО:1; і/або мії) аргінін або валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО ІЮ МО:1; і/або їх) глутамін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 344 5ЕО ІО МО:1; і/або х) лізин, валін або метіонін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ МО1.

18. Рекомбінантний ГФПД поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має: (а) щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, викладеною в ЗЕО ІЮ МО:1, (б) гліцин або аргінін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 268 5ЕО І МО, (в) глутамінову кислоту в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 270 5ЕО ІЮ МО-1, і (г) пролін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 335 5ЕО ІЮ МО, і (д) гістидин або аспарагінову кислоту в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 336 5ЕО ІЮО МО, і (є) серин в положенні, що відповідає амінокислотному положенню 337 5ЕО ІЮ МО-1, і (є) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 340 5ЕО 10 МО:1; і (ж) валін в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 345 5ЕО ІЮ 60 МО-1.

19. Спосіб одержання поліпептиду з активною стійкістю до гербіцидів, які інгібують ГФПД, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 8 в умовах, в яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид.

20. Рослина, яка має стійко вбудовану в її геном конструкцію ДНК, де зазначена конструкція містить промотор, функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою за будь-яким з пп. 1-7.

21. Рослина за п. 20, де зазначену рослину вибирають з групи, що містить клітину рослини, тканину рослини і насіння рослини.

22. Рослина за п. 20, де зазначену рослину вибирають з групи, яка містить маїс, сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті рослини, перці, картоплю, бавовник, рис, соєві боби, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь і олійний ріпак.

23. Трансгенне насіння рослини за п. 20, що має стійко вбудовану в його геном конструкцію ДНК, де зазначена конструкція ДНК містить промотор, функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою за будь-яким з пп. 1-7.

24. Спосіб боротьби з бур'янистими травами у полі з сільськогосподарськими рослинами за п. 20, що охоплює садіння рослини за п. 20 або її насіння в полі і нанесення на зазначене поле ефективної концентрації гербіциду, що інгібує ГФПД, у якому зазначений гербіцид, що інгібує ГФПД, вибирають з групи, яка містить трикетони, дикетонітрили, ізоксазоли, гідроксипіразоли, М- (1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди, М-(тетразол-б-іл)- або М- (триазол-5-іллуарилкарбоксаміди, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2- іллуарилкарбоксаміди, триазинони і піразолони.

25. Спосіб за п. 24, у якому зазначений гербіцид, який інгібує ГФПД, вибирають з групи, що містить бензобіциклон, сулькотріон, мезотріон, темботріон, тефурилтріон, біциклопірон, фенквінотріон, ізоксафлутол, дикетонітрил піразоксифен, бензофенап, піразолінат, пірасульфотол, топрамезон, толпіралат, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід, 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід, 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензамід, 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід, 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід.

26. Застосування нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-7 для надання рослині стійкості до одного або більшої кількості гербіцидів, які інгібують ГФПД, де зазначений гербіцид, що інгібує ГФПД, вибирають з групи, яка містить трикетони, дикетонітрили, ізоксазоли, гідроксипіразоли, М- (1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензаміди, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензаміди, М-(тетразол-б-іл)- або М- (триазол-5-іллуарилкарбоксаміди, похідні піридазинону, похідні оксопразину, М-(триазол-2- іллуарилкарбоксаміди, триазинони і піразолони. НРРО нар «б Об Ком ях вити ком на бує ом ге: ВЕ ее 7 тд Он дат З п а он доб о ов НРР НОВА МАА

Фіг. 1 нн Її м азк і : ІК от і Її І і Її дрчтмо і їх Х Ж ї Я ї ія ! Її І і Її І т ; і ї І дяка тил б мк і ї І дк - і Ех ї 1 з : 1 ї І і і дикак сип а мим. ! Ех ї 1 ми : 1 ї : І лавр : і Ех ї 1 : 1 Її І | - 478 їі і Її є : 4 ї дяякий зму 15 кА і їі : . І гееофнге : і їе : і | ШЕ їж ї й Н . з п : і НЯ І З одккднвн Кат ПМК: ! ї ї Темавдвнь КВУ зак ї Н р ї і : ї ї ь і : ї І й Зеніт утну Є МЕ і . і Ей ше Її чиї ще. у ї і РЯУ З одною, ча : ро : - ре ноюжкутину 15 кв: Її І : 3 ї і Її І і . ач ; і і ут і і І ск за Б 4 й ч с й і ї Е Каф , в дае х ще і Е Е з З фроціночіх ток зла СЕ ! Її с кн сткигоя кт У еЖ ее: і ї Є. пінні КН А і ї кт оо че Се 1 ї ли Я ЕЕ Ми и ! ї ек пись і і них їх АБ и І І у х У ї ря ї ї ОД я : х х : : Ь і Її і ї : є зх ЖЕ -к з чук; ща ї 5 ї КЕ КІх З З З За: ; І її ЩІ и ж. ОО 35 ФП Зо : ї

Ав5320 з , ж ! : : і ' і я і : : ! і се і і І ' с ! і : з ' 4 і і : і і : : ! і і і ! | І ' і 7 і : з в. и -а : : і е і : : 1 ж ; і : | ж -н 1200 : ї є 1 : , м т і З п І ' і : з ї : : і і З : : ! І і : 0 5 16 із хв. 20 25 зо 35 і

Фіг.3 ж т фу З й як ПО се 00 шеф В -- ПОН ке се Ка я ; ї свй Ф ; ооо Бо В о рий ж. є к зве в З в 7 : одое 5 ! ВОщю Зах Бл вл ЯКО субстрат (МІ

Фіг.4а

0034 - нак х -к- 0.000048 М во юн з 000024 З ї а п0по Я рон т ЛО в , з ; Ко ом 5 ' нн зло Кс зенккжнню як Я ооо ооо» бо004 о0006 0000008 субстрат МІ

Фіг.40 023 - -- Й х у -к- 0,000048 5 0024 ши «в П00024 « р и І --- 00012 є а к 5 до вдо а се» ех Б олово боро 00004 0006 0 о0008 субстрат ІМІ ФігаАв вда - --к- й х - -к- 0.000048 я Бо щи я 0000024 щ Й ра Е д в оон

8. 004 «і - Гя ооо ; одю0о дО х лю 02005 00908 субстрат ІМІ

Фіг.Аг 777 дпУкраїнський інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ -42,01601..-.