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TWI758784B - 抗her2抗體及免疫結合物 - Google Patents

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TWI758784B
TWI758784B TW109123875A TW109123875A TWI758784B TW I758784 B TWI758784 B TW I758784B TW 109123875 A TW109123875 A TW 109123875A TW 109123875 A TW109123875 A TW 109123875A TW I758784 B TWI758784 B TW I758784B
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馬克 S 丹尼斯
賈格 瑞迪 瓊杜拉
蓋爾 李維斯 菲利浦
湯瑪斯 賀登 皮勒
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美商建南德克公司
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Abstract

本發明提供抗HER2抗體及免疫結合物以及其使用方法。

Description

抗HER2抗體及免疫結合物
本發明係關於抗HER2抗體及免疫結合物以及其使用方法。
在全世界範圍內，乳癌爲一個非常主要的發病及死亡原因。全球每年診斷超過一百三十萬乳癌病例，其中超過450,000例死亡與該疾病有關(Jemal A, Bray F, Center M等人, Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011; 61(2):69-90)。 HER2 (ErbB2)受體酪胺酸激酶爲跨膜受體表皮生長因子受體(EGFR)家族的一個成員。在大約20%人類乳癌中觀察到HER2過度表現，且其牽涉與此等腫瘤相關之侵襲性生長及不良臨床結果(Slamon等人, (1987) Science 235:177-182)。HER2蛋白過度表現可使用對經固定腫瘤塊之基於免疫組織化學之評估來測定(Press MF等人, (1993) Cancer Res 53:4960-70)。 曲妥珠單抗(CAS 180288-69-1，HERCEPTIN®、huMAb4D5-8、rhuMAb HER2，Genentech)爲來源於重組DNA之IgG1κ單株抗體，其爲在基於細胞之分析中以高親和力(Kd = 5 nM)選擇性結合HER2之細胞外域的鼠類抗HER2抗體(4D5)的人類化型式(US 5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US 7074404；Coussens等人(1985) Science 230:1132-9；Slamon等人(1989) Science 244:707-12；Slamon等人(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792)。曲妥珠單抗在體外分析及動物中均顯示抑制過度表現HER2之人類腫瘤細胞增殖(Hudziak等人(1989) Mol Cell Biol 9:1165-72；Lewis等人(1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63；Baselga等人(1998) Cancer Res. 58:2825-2831)。曲妥珠單抗爲抗體依賴性細胞毒性ADCC之介體(Lewis等人(1993) Cancer Immunol Immunother 37(4):255-263；Hotaling等人(1996) [摘要]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471；Pegram MD等人, (1997) [摘要]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602；Sliwkowski等人(1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70；Yarden Y.及Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., 第2卷:127-137)。 HERCEPTIN®在1998年經批准用於治療已經接受多種先前抗癌療法的HER2過度表現型轉移性乳癌患者(Baselga等人, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744)，且自此已用於超過300,000名患者(Slamon DJ等人, N Engl J Med 2001;344:783-92；Vogel CL等人, J Clin Oncol 2002;20:719-26；Marty M等人, J Clin Oncol 2005;23:4265-74；Romond EH等人, T N Engl J Med 2005;353:1673-84；Piccart-Gebhart MJ等人, N Engl J Med 2005;353:1659-72；Slamon D等人, [摘要]. Breast Cancer Res Treat 2006, 100 (增刊1): 52)。2006年，FDA批准HERCEPTIN® (曲妥珠單抗，Genentech Inc.)作爲含有阿黴素、環磷醯胺及太平洋紫杉醇之治療方案之一部分用於輔助治療HER2陽性淋巴節陽性乳癌患者。 用於治療HER2陽性乳癌之新穎抗體-藥物結合物(ADC)曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1、曲妥珠單抗-安坦辛(trastuzumab emtansine)、ado-曲妥珠單抗-安坦辛、KADCYLA®)由細胞毒性劑DM1 (含硫醇之類美登素抗微管劑)與曲妥珠單抗以約3.5之平均藥物負載(藥物對抗體比)經由MCC連接子在離胺酸側鏈處結合而組成。在與腫瘤細胞上表現之HER2結合之後，T-DM1進行受體介導之內在化，從而在細胞內釋放含DM1之細胞毒性分解代謝物且隨後細胞死亡。 美國食品藥物管理局於2013年2月22日批准以商標名KADCYLA®出售之曲妥珠單抗安坦辛用於治療先前已接受曲妥珠單抗及紫杉烷治療之HER2陽性轉移性乳癌患者。 帕妥珠單抗(也稱爲重組人類化單株抗體2C4、rhuMAb 2C4、PERJETA® ，Genentech, Inc，South San Francisco)代表一類稱爲HER二聚抑制劑(HDI)之新藥劑中首先問世的藥劑，且其功能在於抑制HER2與其他HER受體(諸如EGFR/HER1、HER2、HER3及HER4)形成活性異源二聚體或同源二聚體之能力。參見例如Harari及Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000)；Yarden及Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003)；Cho等人, Nature 421:756-60 (2003)；及Malik等人, Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)。 已證明帕妥珠單抗對腫瘤細胞中HER2-HER3異源二聚體形成之阻斷可抑制關鍵性細胞信號傳導，由此導致腫瘤增殖及存活時間減少(Agus等人, Cancer Cell 2:127-37 (2002))。 已在II期研究中評估帕妥珠單抗與曲妥珠單抗組合用於先前已接受曲妥珠單抗用於轉移性疾病之HER2陽性轉移性乳癌患者。由國家癌症學會(NCI)進行的一項研究登記11名先前經治療之HER2陽性轉移性乳癌患者。該11名患者中有兩名展現部分響應(PR) (Baselga等人, J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings; 25:18 S (6月20日增刊): 1004)。在2010年12月8日至12日CTRC-AACR聖安東尼奧乳癌研討會(SABCS)上呈遞之評估帕妥珠單抗與曲妥珠單抗加化學療法(多烯紫杉醇)之新穎組合方案在早期HER2陽性乳癌女性中之效應的II期新輔助研究結果顯示在手術前之新輔助處置中給與兩種HER2抗體加多烯紫杉醇顯著提高乳房中之完全腫瘤消失率(病理完全反應率，pCR，45.8%)，與曲妥珠單抗加多烯紫杉醇(pCR 29.0%)相比多出一倍，p = 0.014。 2012年批准以商標名PERJETA®出售之帕妥珠單抗用於治療晚期(轉移性) HER2陽性乳癌患者。HER2陽性乳癌中有助於癌細胞生長及存活之HER2蛋白的量有所增加。 2013年9月30日，美國食品藥物管理局授權加速批准PERJETA® (帕妥珠單抗)作爲手術前用於早期乳癌(EBC)患者之完全治療方案的一部分(新輔助處置)。PERJETA®爲用於乳癌新輔助治療之首個FDA批准藥物。 此項技術中需要用於治療諸如乳癌之HER2相關病狀的其他安全且有效之靶向HER2之藥劑，以供用於單療法及組合療法。本發明滿足該需要且提供其他效益。
本發明提供抗HER2抗體及免疫結合物及其使用方法。 在一些實施例中，提供一種結合HER2之經分離抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含有包含SEQ ID NO:11之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:10之序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體爲單株抗體。在一些實施例中，該抗體爲人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，該抗體爲結合HER2之抗體片段。 在一些實施例中，HER2爲包含SEQ ID NO:1之胺基酸23至1255的人類HER2。在一些實施例中，該抗體結合HER2之細胞外域I。在一些實施例中，HER2之細胞外域I具有SEQ ID NO:35之序列。在一些實施例中，該抗體結合細胞外域I之環163-189及環185-189 (例如，由細胞外域I之胺基酸163-189限定之第一環及由胺基酸185-189限定之第二環)。在一些實施例中，該抗體接觸細胞外域I之His171、Ser186、Ser187及Glu188。 在一些實施例中，該抗體爲IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。在一些實施例中，該抗體在重鏈恆定區中包含至少一個選自A118C及S400C之突變。在一些實施例中，該抗體在輕鏈恆定區中包含至少一個選自K149C及V205C之突變。 在一些實施例中，該抗體包含： a) 包含SEQ ID NO:19之序列的重鏈及包含SEQ ID NO:18之序列的輕鏈；或 b) 包含SEQ ID NO:19之序列的重鏈及包含SEQ ID NO:23之序列的輕鏈；或 c) 包含SEQ ID NO:24之序列的重鏈及包含SEQ ID NO:18之序列的輕鏈。 在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO:28之重鏈恆定區。在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO:25之輕鏈恆定區。 在一些實施例中，提供一種結合HER2之經分離抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO:19之序列的重鏈及包含SEQ ID NO:23之序列的輕鏈。在一些實施例中，提供一種結合HER2之經分離抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO:24之序列的重鏈及包含SEQ ID NO:18之序列的輕鏈。 在一些實施例中，提供一種經分離之核酸，其編碼本文中所描述之抗體。在一些實施例中，提供一種包含該核酸之宿主細胞。在一些實施例中，提供一種產生抗體之方法，其包括培養該宿主細胞以便產生該抗體。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其包含本文中所描述之抗體及細胞毒性劑。在一些實施例中，該免疫結合物具有式Ab-(L-D)p，其中： a) Ab爲如請求項1至16中任一項之抗體； b) L爲連接子； c) D爲細胞毒性劑；且 d) p在1至8之範圍內。 在一些實施例中，該細胞毒性劑係選自奧裏斯他汀(auristatin)、類美登素、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮呯、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。 在一些實施例中，提供免疫結合物，其中D爲式A之吡咯并苯二氮呯：
Figure 02_image002
A; 其中虛線指示C1與C2或C2與C3之間的雙鍵的可選存在； R2 係獨立地選自H、OH、=O、=CH2 、CN、R、OR、=CH-RD 、=C(RD )2 、O-SO2 -R、CO2 R及COR，且視情况進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD 係獨立地選自R、CO2 R、COR、CHO、CO2 H及鹵基； R6 及R9 係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR'、NO2 、Me3 Sn及鹵基； R7 係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR'、NO2 、Me3 Sn及鹵基； Q係獨立地選自O、S及NH； R11 爲H或R，或者在Q爲O的情况下爲SO3 M，其中M爲金屬陽離子； R及R'各自獨立地選自視情况經取代之C1-8 烷基、C3-8 雜環基及C5-20 芳基，且視情况關於基團NRR'，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情况經取代之4員、5員、6員或7員雜環； R12 、R16 、R19 及R17 分別如針對R2 、R6 、R9 及R7 所定義； R''爲C3-12 伸烷基，該鏈可間雜一或多個雜原子及/或視情况經取代之芳環；且 X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。 在一些實施例中，D具有以下結構：
Figure 02_image004
； 其中n爲0或1。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中D爲奈莫柔比星衍生物。在一些實施例中，D具有選自以下之結構：
Figure 02_image006
；及
Figure 02_image008
。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中D包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。在一些實施例中，D具有下式：
Figure 02_image010
， 其中 R1 係選自H、P(O)3 H2 、C(O)NRa Rb 或與L之鍵； R2 係選自H、P(O)3 H2 、C(O)NRa Rb 或與L之鍵； Ra 及Rb 係獨立地選自H及視情况經一或多個F取代之C1 -C6 烷基， 或Ra 與Rb 形成五員或六員雜環基； T爲選自C3 -C12 伸烷基、Y、(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)、(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)、(C2 -C6 伸烯基)-Y-(C2 -C6 伸烯基)及(C2 -C6 伸炔基)-Y-(C2 -C6 伸炔基)的繫鏈基團； 其中Y係獨立地選自O、S、NR1 、芳基及雜芳基； 其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基係獨立地且視情况經F、OH、O(C1 -C6 烷基)、NH2 、NHCH3 、N(CH3 )2 、OP(O)3 H2 及C1 -C6 烷基取代，其中烷基視情况經一或多個F取代； 或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立地且視情况經與L的鍵取代； D'爲選自以下之藥物部分：
Figure 02_image012
、
Figure 02_image014
及
Figure 02_image016
其中波狀線指示與T的連接位點； X1 及X2 係獨立地選自O及NR3 ，其中R3 係選自H及視情况經一或多個F取代之C1 -C6 烷基； R4 爲H、CO2 R或與連接基團(L)的鍵，其中R爲C1 -C6 烷基或苯甲基；且 R5 爲H或C1 -C6 烷基。 在一些實施例中，D具有選自以下之結構：
Figure 02_image018
；
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；及
Figure 02_image024
。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該連接子可由蛋白酶裂解。在一些實施例中，該連接子具有酸不穩定性。在一些實施例中，該連接子包含腙。在一些實施例中，該連接子包含二硫化物。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含選自以下之結構：
Figure 02_image026
；
Figure 02_image028
；及
Figure 02_image030
； 其中Ab爲本文中所描述之抗體。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含選自以下之結構：
Figure 02_image032
；
Figure 02_image034
；及
Figure 02_image036
； 其中Ab爲本文中所描述之抗體。 在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含選自以下之結構：
Figure 02_image038
；
Figure 02_image040
；
Figure 02_image042
；及
Figure 02_image044
； 其中Ab爲本文中所描述之抗體。 在本文中所描述之任何免疫結合物中，p可在1.3至2、1.4至2、1.5至2或2至5之範圍內。 在一些實施例中，提供一種醫藥調配物，其包含本文中所描述之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，該醫藥調配物進一步包含額外治療劑。在一些實施例中，該額外治療劑爲結合HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合HER2之結構域II的抗體或免疫結合物及/或(ii)結合結構域IV或HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合抗原决定基2C4之抗體或免疫結合物及/或(ii)結合抗原决定基4D5之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑係選自曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1)及帕妥珠單抗。在一些實施例中，該醫藥調配物進一步包含(1)曲妥珠單抗或T-DM1及(2)帕妥珠單抗。 在一些實施例中，提供治療患有HER2陽性癌症之個體的方法。在一些實施例中，方法包括向該個體投與有效量之本文中所描述之免疫結合物或本文中所描述之醫藥組合物。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲乳癌或胃癌。在一些實施例中，該HER2陽性乳癌爲早期乳癌。在一些實施例中，該HER2陽性乳癌爲轉移性乳癌。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲復發性癌症。在一些實施例中，該復發性癌症爲局部復發性癌症。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲晚期癌症。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲非可切除的。在一些實施例中，該方法進一步包括向該個體投與額外治療劑。 在一些實施例中，治療患有HER2陽性癌症之個體的方法包括向該個體投與有效量之本文中所描述之免疫結合物及至少至少一種額外治療劑。在一些實施例中，該額外治療劑爲結合HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合HER2之結構域II的抗體或免疫結合物及/或(ii)結合結構域IV或HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合抗原决定基2C4之抗體或免疫結合物及/或(ii)結合抗原决定基4D5之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑係選自曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1)及帕妥珠單抗。在一些實施例中，該額外治療劑爲(1)曲妥珠單抗或T-DM1及(2)帕妥珠單抗。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲乳癌或胃癌。在一些實施例中，該HER2陽性乳癌爲早期乳癌。在一些實施例中，該HER2陽性乳癌爲轉移性乳癌。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲復發性癌症。在一些實施例中，該復發性癌症爲局部復發性癌症。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲晚期癌症。在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲非可切除的。 在一些實施例中，提供一種治療患有HER2陽性癌症之個體的方法，其包括： a)   用本文中所描述之免疫結合物或本文中所描述之醫藥調配物對該個體進行新輔助治療； b) 藉由確定性手術移除該癌症；及 c) 用本文中所描述之免疫結合物或本文中所描述之醫藥調配物對該個體進行輔助治療。 在一些實施例中，該HER2陽性癌症爲乳癌或胃癌。 在一些實施例中，提供抑制HER2陽性細胞增殖之方法。在一些實施例中，方法包括在允許本文中所描述之免疫結合物與該細胞表面上之HER2結合的條件下將該細胞暴露於該免疫結合物，從而抑制該細胞增殖。在一些實施例中，該細胞爲胃癌細胞之乳癌細胞。 在一些實施例中，提供一種與標記結合之本文中所描述之抗體。在一些實施例中，該標記爲正電子發射體。在一些實施例中，該正電子發射體爲89 Zr。 在一些實施例中，提供在生物樣品中偵測人類HER2之方法。在一些實施例中，方法包括使該生物樣品與本文中所描述之抗HER2抗體在允許該抗HER2抗體與天然存在之人類HER2結合的條件下接觸，及偵測該抗HER2抗體與該生物樣品中天然存在之人類HER2之間是否形成複合物。在一些實施例中，該生物樣品爲乳癌或胃癌樣品。 在一些實施例中，提供用於在個體中偵測HER2陽性癌症之方法。在一些實施例中，方法包括(i)向患有或疑似患有HER2陽性癌症之個體投與經標記之抗HER2抗體，其中該經標記之抗HER2抗體包含本文中所描述之抗HER2抗體，及(ii)在該個體中偵測該經標記之抗HER2抗體，其中該經標記之抗HER2抗體之偵測指示該個體中之HER2陽性癌症。在一些實施例中，該經標記之抗HER2抗體包含與正電子發射體結合之抗HER2抗體。在一些實施例中，該正電子發射體爲89 Zr。
相關申請案之交互參照 本申請案主張2014年9月12日申請之美國臨時申請案第62/049,594號優先權之權利，為了任一目的，該案之全文以引用的方式併入本文中。 現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在所附結構及式中加以說明。儘管將結合所列舉之實施例來描述本發明，但應理解它們不意欲本發明僅限於彼等實施例。相反，本發明意欲覆蓋可包括在如申請專利範圍所限定之本發明範疇內的所有替代方案、修改及等效方案。熟習此項技術者將識別可用於實施本發明之與本文中所描述之方法及材料相似或等效之許多方法及材料。本發明决不僅限於所描述之方法及材料。 本發明中所引用之所有參考文獻明確地以全文引用之方式併入本文中。爲防止一或多個所併入之文獻、專利及類似材料與本申請案不同或矛盾，包括但不限於所定義之術語、術語用法、所描述之技術或類似物，以本申請案爲准。I ． 定義 字組「包含」及「包括」在用於本說明書及申請專利範圍中時意欲規定所陳述之特徵、整數、組分或步驟之存在，但其不排除一或多個其他特徵、整數、組分、步驟或其群組之存在或添加。 出於本文中之目的，「受體人類架構」爲包含來源於人類免疫球蛋白架構或如下文所定義之人類一致架構之輕鏈可變域(VL)架構或重鏈可變域(VH)架構的胺基酸序列的架構。「來源於」人類免疫球蛋白架構或人類一致架構之受體人類架構可包含與其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目爲10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或者2或更少。在一些實施例中，VL受體人類架構在序列上與VL人類免疫球蛋白架構序列或人類一致架構序列一致。 「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的總非共價相互作用總和的强度。除非另外指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指體現結合對之成員(例如抗體及抗原)之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知的常用方法，包括本文中所描述之方法來量測。以下描述用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例。 「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，與不具有此類改變之親本抗體相比，此類改變引起該抗體對抗原之親和力之改良。 術語「抗HER2抗體」及「結合HER2之抗體」係指能够以足够親和力結合HER2，使得該抗體適用作診斷及/或治療劑用於靶向HER2的抗體。在一個實施例中，抗HER2抗體與無關非HER2蛋白之結合程度小於該抗體與HER2結合之約10%，如例如藉由放射性免疫分析法(RIA)所量測。在某些實施例中，結合HER2之抗體的解離常數(Kd) ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 5 nm、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在某些實施例中，抗HER2抗體結合在來自不同物種之HER2間保守的HER2抗原决定基。 術語「抗體」在本文中以最廣範之意義使用，且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。 「抗體片段」係指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體之一部分且結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。 與參考抗體「結合相同抗原决定基之抗體」係指在競爭分析法中阻斷參考抗體與其抗原結合達50%或更多的抗體，且相反，該參考抗體在競爭分析法中阻斷該抗體與其抗原結合達50%或更多。本文中提供例示性競爭分析法。 術語「癌症」及「癌瘤」係指或描述哺乳動物中典型地以不受調節之細胞生長/增殖爲特徵的生理狀况。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。在一些實施例中，癌症爲乳癌或胃癌。在一些實施例中，癌症爲任何HER2陽性癌症。 「HER2陽性」癌症包含具有高於正常水準之HER2的癌細胞。HER2陽性癌症之實例包括HER2陽性乳癌及HER2陽性胃癌。視情况，HER2陽性癌症具有2+或3+之免疫組織化學(IHC)評分及/或≥2.0之原位雜交(ISH)擴增比。 術語「早期階段乳癌(EBC)」或「早期乳癌」在本文中用於指尚未傳播超出乳房或腋淋巴結之乳癌。此包括導管原位癌及階段I、階段IIA、階段IIB及階段IIIA乳癌。 提及腫瘤或癌症爲「0期」、「I期」、「II期」、「III期」或「IV期」及此分類內之各種亞期指示使用此項技術中已知的總體期別分組法或羅馬數字分期法得到的腫瘤或癌症分類。雖然癌症之實際期別視癌症類型而定，但一般而言，0期癌症爲原位病變，I期癌症爲小型局部腫瘤，II期及III期癌症爲展現涉及局部淋巴結之局部晚期腫瘤，且IV期癌症表示轉移性癌症。各腫瘤類型之特定期別對熟練臨床醫師爲已知的。 術語「轉移性乳癌」意謂癌細胞藉由血管或淋巴自原始部位傳播至體內其他處之一或多個部位，從而在除乳房以外的一或多個器官中形成一或多個繼發性腫瘤的乳癌狀態。 「晚期」癌症爲已藉由局部侵襲或轉移在原始部位或器官外傳播的癌症。因此，術語「晚期」癌症包括局部晚期及轉移性疾病。 「復發性」癌症爲在對諸如手術之初始療法作出反應之後在初始部位或在遠端部位再生長的癌症。 「局部復發性」癌症爲治療後在與先前所治療之癌症相同處重現的癌症。 「可手術」或「可切除」癌症爲局限於原發器官且適合於手術(切除術)的癌症。 「非可切除」或「不可切除」癌症不能够藉由手術移除(切除)。 術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同的來源或物質的抗體。 抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中的若干種可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同的免疫球蛋白類別的重鏈恆定域分別稱爲α、δ、ε、γ及μ。 如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如，胺甲蝶呤、阿黴素、長春花生物鹼(長春新鹼、長春花鹼、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾黴素或其他插入劑；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核苷酸分解酶；抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。 「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區之生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。 例如醫藥調配物之藥劑的「有效量」係指在必需之劑量及時間段下有效達成所要治療或預防結果的量。用於治療癌症之藥物有效量可減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳地終止)癌細胞浸入周圍器官中；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳地終止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與癌症相關之一或多種症狀。在藥物可預防生長及/或殺死現存癌細胞之程度上，其可具細胞抑制性及/或細胞毒性。有效量可延長無進展存活時間(例如，如藉由用於實性腫瘤、RECIST或CA-125變化之反應評估準則所度量)，產生客觀反應(包括部分反應PR或完全反應CR)，增加總體存活時間，及/或改良癌症之一或多種症狀(例如，如藉由FOSI所評估)。 術語「抗原决定基」係指抗原分子上與抗體結合之特定位點。 「抗原决定基4D5」或「4D5抗原决定基」或「4D5」爲HER2之細胞外域中與抗體4D5 (ATCC CRL 10463)及曲妥珠單抗結合之區域。此抗原决定基接近HER2之跨膜域且在HER2之結構域IV內。爲了篩選結合4D5抗原决定基之抗體，可進行諸如Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及David Lane編(1988)中所描述之常規交叉阻斷分析。替代地，可進行抗原决定基圖譜分析以評估抗體是否結合HER2之4D5抗原决定基(例如HER2 (SEQ ID NO:39)中自約殘基550至約殘基610之區域(包括端點)中的任何一或多個殘基)。 「抗原决定基2C4」或「2C4抗原决定基」爲HER2之細胞外域中與抗體2C4結合之區域。爲了篩選結合2C4抗原决定基之抗體，可進行諸如Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及David Lane編(1988)中所描述之常規交叉阻斷分析。替代地，可進行抗原决定基圖譜分析以評估抗體是否結合HER2之2C4抗原决定基。抗原决定基2C4包含來自HER2細胞外域中之結構域II的殘基。2C4抗體及帕妥珠單抗結合於HER2細胞外域中結構域I、II及III之接合處(Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328 (2004))。 術語「Fc區」在本文中用於定義含有恆定區之至少至少一部分的免疫球蛋白重鏈C末端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文中另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述之EU編號系統，亦稱爲EU指數。 「架構」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般出現在VH (或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「整抗體」在本文中可互換用於指結構實質上類似於天然抗體結構或重鏈含有如本文中所定義之Fc區的抗體。 術語「HER2之糖基化形式」係指藉由添加糖類殘基而經轉譯後修飾的天然存在之HER2形式。 術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉形系」及「轉型細胞」，其包括原代經轉型細胞及由其衍生之子代，不考慮繼代數。子代在核酸內容方面可能與親本細胞不完全一致，而是可能含有突變。本文中包括具有與針對原始經轉型細胞所篩選或選擇相同之功能或生物活性的突變子代。 「人類抗體」爲具有與由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義明確不包括包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 「人類一致架構」爲代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常存在之胺基酸殘基的架構。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選集來自可變域序列亞組。一般而言，序列亞組爲如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL，該亞組爲如Kabat等人, 同上 中之亞組κI。在一個實施例中，對於VL，該亞組爲如Kabat等人, 同上 中之亞組III。 「人類化」抗體係指包含來自非人HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有HVR (例如，CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR，且所有或實質上所有FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情况可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。 如本文中所使用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列方面高變及/或形成結構經限定之環(「高變環」)的各區域 。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補性决定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列變異性及/或涉及抗原識別。例示性高變環存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。)例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35B (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)。(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。)除VH中之CDR1以外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性决定殘基」或「SDR」，其爲接觸抗原之殘基。SDR包含在稱爲縮短CDR或a-CDR之CDR區內。例示性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)存在於胺基酸殘基31-34 (L1)、50-55 (L2)、89-96 (L3)、31-35B (H1)、50-58 (H2)及95-102 (H3)。(參見Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)。)在本文中，除非另外指示，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)係根據Kabat等人, 同上 進行編號。 「免疫結合物」爲與一或多個異源分子，包括但不限於細胞毒性劑結合之抗體。 「患者」或「個人」或「個體」爲哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該患者、個人或個體爲人類。在一些實施例中，該患者可爲「癌症患者」，亦即罹患或處在罹患癌症，特定言之，胃癌或乳癌之一或多種症狀之風險下的患者。 「患者群體」係指癌症患者群組。此類群體可用於顯示藥物之統計學上顯著之效力及/或安全性。 「復發性」患者爲緩解之後具有癌症病徵或症狀之患者。視情况，患者在輔助或新輔助療法之後復發。 「呈現HER表現、擴增或活化」之癌症或生物樣品爲在診斷性試驗中表現(包括過度表現) HER受體、具有經擴增之HER基因及/或以其他方式顯示HER受體活化或磷酸化的樣品。 「新輔助療法」或「手術前療法」在本文中係指在手術前給與之療法。新輔助療法之目的在於提供即時系統治療，從而可能根除微轉移，否則若按照手術後進行系統療法之標準順序，其將會增殖。新輔助療法亦可有助於減小腫瘤尺寸，從而允許完全切除最初不可切除之腫瘤，或保留部分器官及其功能。此外，新輔助療法允許體內評估藥物效力，由此可指導後續治療之選擇。 「輔助療法」在本文中係指在無法偵測到殘餘疾病證據之確定性手術後給與以降低疾病復發風險之療法。輔助療法之目的在於預防癌症復發，且因此降低癌症相關死亡之幾率。輔助療法在本文中明確不包括新輔助療法。 「確定性手術」係以醫學團體內使用該術語之方式加以使用。確定性手術包括例如移除或切除腫瘤之手術或其他程序，包括移除或切除所有非常明顯之腫瘤的那些程序。確定性手術包括例如腫瘤之完全或治愈性切除或完全全切除。確定性手術包括在一或多個階段內發生之程序，且包括例如在切除腫瘤之前進行一項或多項手術或其他程序之多階段手術程序。確定性手術包括移除或切除腫瘤，包括所涉及之器官、器官之一部分及組織以及諸如淋巴結之周圍器官、器官之一部分或組織的程序。移除可能不完全，使得腫瘤細胞可能殘餘，即使未偵測到。 「存活」係指患者仍活著，且包括無疾病存活(DFS)、無進展存活(PFS)及總體存活(OS)。存活可藉由Kaplan-Meier法加以評估，且使用分層對數秩檢驗來計算任何存活差異。 「無進展存活」(PFS)爲自治療第一天至記錄疾病進展(包括孤立CNS進展)或研究中因任何原因死亡(以首先發生者爲准)的時間。 「無疾病存活(DFS)」係指患者仍活著而無癌症再現經限定之時間段，諸如自開始治療或自初步診斷開始約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約10年等。在本發明之一個態樣中，根據意圖治療原則分析DFS，亦即，基於患者指派之療法評估患者。DFS分析中所使用之事件可包括局部、區域性及遠端癌症復發、出現繼發性癌症及在無先前事件之情况下因患者之任何原因而死亡(例如乳癌復發或第二原發癌)。 「總體存活」係指患者仍活著經限定之時間段，諸如自開始治療或自初步診斷開始約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約10年等。在作爲本發明之基礎的研究中，用於存活分析之事件爲因任何原因死亡。 「延長存活」意謂相對於未經治療之患者或相對於對照治療方案在經治療之患者中增加DFS及/或OS。在開始治療後或在初步診斷後，監測存活至少約六個月、或至少約1年、或至少約2年、或至少約3年、或至少約4年、或至少約5年、或至少約10年等。 「單療法」意謂在治療週期過程中僅包括單一治療劑用於治療癌症或腫瘤的治療方案。 「維持療法」意謂爲了降低疾病復發或進展之可能性而給與之治療方案。可提供維持療法持續任何時間長度，包括直至個體生命跨度之延伸時間週期。可在初始療法之後或連同初始或額外療法一起提供維持療法。用於維持療法之劑量可變化，且可包括與用於其他類型療法之劑量相比有所減少之劑量。 如本文中所定義，術語「曲妥珠單抗」、「HERCEPTIN®」及「huMAb4D5-8」可互換使用。此類抗體較佳分別包含SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:29中所示之輕鏈及重鏈胺基酸序列。 出於本文之目的，「帕妥珠單抗」、「PERJETA®」及「rhuMAb 2C4」可互換使用。此種抗體包含分別具有SEQ ID NO:32及31中之輕鏈及重鏈胺基酸序列的主要種類抗體(圖13A及圖13B)。在一些實施例中，帕妥珠單抗包含具有胺基末端前導序列延伸，例如包含SEQ ID NO:34之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:33之重鏈胺基酸序列的變異種類抗體。該抗體視情况由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生。 如本文中所定義，術語「T-DM1」、「曲妥珠單抗-MCC-DM1」、「ado-曲妥珠單抗-安坦辛」、「曲妥珠單抗-安坦辛」及「KADCYLA®」可互換使用，且係指曲妥珠單抗經由連接子部分MCC與類美登素藥物部分DM1連接，包括具有各種負載且經連接之抗體-藥物結合物的所有混合物，其中1、2、3、4、5、6、7及8個藥物部分共價連接於抗體曲妥珠單抗(US 7097840；US 8337856；US 2005/0276812；US 2005/0166993)。 「經分離抗體」爲已與其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中，抗體係純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於用於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。 「經分離核酸」係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離核酸包括通常含有該核酸分子但該核酸分子存在於染色體外或處在與其天然染色體位置不同的染色體位置的細胞中所含有的核酸分子。 「編碼抗HER2抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子，包括處於單一載體或獨立載體中之此種核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置上的此種核酸分子。 如本文中所使用之術語「HER2」係指由細胞中處理HER2前驅蛋白而產生的任何天然成熟HER2。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之HER2，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴)及嚙齒動物(小鼠及大鼠)。該術語亦包括天然存在之HER2變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。具有信號序列(具有信號序列，胺基酸1-22)之例示性人類HER2前驅蛋白之胺基酸序列示於SEQ ID NO:1中。例示性成熟人類HER2之胺基酸序列爲SEQ ID NO:1之胺基酸23-1255。 術語「HER2陽性細胞」係指在其表面上表現HER2之細胞。 如本文中所使用之術語「單株抗體」係指獲自實質上同源之抗體群體的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體爲一致的及/或結合相同抗原决定基，除了可能之變異抗體，例如，含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間產生，此種變異體一般以微量存在。與典型地包括針對不同决定子(抗原决定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體針對抗原上之單一决定子。因而，修飾語「單株」指示抗體在獲自實質上同源之抗體群體時的特徵且不應被視爲需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製造，包括但不限於雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此種方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。 「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。 「天然抗體」係指具有變化結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體爲由二硫化物鍵結的兩個一致輕鏈及兩個一致重鏈組成的約150,000道爾頓之異源四聚糖蛋白。自N末端至C末端，各重鏈具有可變區(VH，亦稱爲可變重鏈結構域或重鏈可變域)，隨後爲三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，各輕鏈具有可變區(VL，亦稱爲可變輕鏈結構域或輕鏈可變域)，隨後爲一個恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而指派爲兩種類型(稱爲κ及λ)之一。 「小瓶」爲適合於容納液體或凍乾製劑的容器。在一個實施例中，小瓶爲單次使用小瓶，例如具有瓶塞之20 cc單次使用小瓶。 術語「包裝插頁」用於指按例包括在治療產品之市售包裝中的說明書，其含有關於關於使用此種治療產品之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告。 關於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義爲在將候選序列與參考多肽序列對準且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比且不將任何保守取代視爲序列一致性之一部分之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，對準可用此項技術中之技術範圍內的各種方式達成，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於對準序列之適當參數，包括在所比較之序列全長上達成最大對準所需之任何算法。然而，出於本文中之目的，使用序列比較電腦程序ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程序係由Genentech, Inc.授權，且原始碼已與用戶文件一起提交於美國著作權辦公室(Washington D.C.，20559)，以美國著作權登記號TXU510087寄存於此。ALIGN-2程式可公開得自Genentech, Inc. (South San Francisco，California)，或可由原始碼彙編。ALIGN-2程式應經彙編以用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不加變化。 在采用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情况下，如下計算指定胺基酸序列A相對於、與或針對指定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (其可替代地表述爲指定胺基酸序列A相對於、與或針對指定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%)： 100×分數X/Y 其中X爲由序列比對程序ALIGN-2在該程序之A與B比對中評分爲一致匹配的胺基酸殘基數，且其中Y爲B中之胺基酸殘基總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確陳述，否則本文中所使用之所有胺基酸序列一致性%值均如前一段中所描述，使用ALIGN-2電腦程式獲得。 術語「醫藥調配物」係指呈允許其中所含有之活性成分的生物活性有效的且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受之毒性的額外組分的形式的製劑。 「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 如本文中所使用，「治療」(及其語法變化形式)係指試圖改變所治療個體之天然過程的臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學過程中進行。治療之理想效應包括但不限於預防疾病發生或復發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理學後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態及緩解或改良之預後。在一些實施例中，本發明之抗體係用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。 「共同投與」意謂在同一次投與期間經靜脈內投與兩種(或更多種)藥物，而不是相繼輸注該兩種或更多種藥物。一般而言，此舉將涉及將兩種(或更多種)藥物組合於同一IV袋中，隨後將其共同投與。 與一或多種其他藥物「同時」投與之藥物係在同一治療循環期間、與該一或多種其他藥物在治療同一天及視情况及與該一或多種其他藥物在同一時間投與。舉例而言，對於每3週給與之癌症療法，同時投與之藥物各自在3週循環之第1天投與。 「化學療法」爲使用適用於治療癌症之化學治療劑。 「化學治療劑」爲適用於治療癌症之化學化合物，不考慮作用機制。化學治療劑之類別包括但不限於：烷基化劑、抗代謝物、紡綞體抑制劑植物鹼、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、抗體、光敏劑及激酶抑制劑。化學治療劑之實例包括：蒽環類，諸如表柔比星或多柔比星(ADRIAMYCIN®)、環磷醯胺(CYTOXAN®、NEOSAR®)、蒽環類與環磷醯胺組合(「AC」)；紫杉烷，例如多烯紫杉醇(TAXOTERE®)或太平洋紫杉醇(TAXOL®)、5-FU (氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS號51-21-8)、拉帕替尼(TYKERB®)、卡培他濱(XELODA®)、吉西他濱(GEMZAR®，Lilly)、PD-0325901 (CAS號391210-10-9，Pfizer)、順鉑(順二胺二氯鉑(II)，CAS號15663-27-1)、卡鉑(CAS號41575-94-4)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS號85622-93-1，TEMODAR®、TEMODAL®，Schering Plough)、他莫西芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基-乙胺，NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)。 化學治療劑之更多實例包括：奧沙利鉑(ELOXATIN®，Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®，Millennium Pharm.)、索坦(SUNITINIB®，SU11248，Pfizer)、來曲唑(FEMARA®，Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC®，Novartis)、XL-518 (MEK抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886 (Mek抑制劑，AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca)、SF-1126 (PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235 (PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147 (PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584 (Novartis)、氟維司群(FASLODEX®，AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司，RAPAMUNE®，Wyeth)、洛那法尼(SARASAR™，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(NEXAVAR®，BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®，AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®，CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRA™，Johnson & Johnson)、ABRAXANE™ (無氫化蓖麻油)、太平洋紫杉醇之白蛋白工程改造奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Il)、凡德他尼(rINN，ZD6474，ZACTIMA®，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571 (SU 5271；Sugen)、西羅莫司(TORISEL®，Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、莰佛醯胺(TELCYTA®，Telik)、硫替派及環磷醯胺(CYTOXAN®，NEOSAR®)；烷基磺酸酯，諸如白消安、英丙舒凡及哌泊舒凡；氮丙啶，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡巴醌、美妥替派(meturedopa)及烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙烯磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺及三甲基蜜胺；聚乙醯(尤其是布拉他辛及布拉他辛酮)；喜樹鹼(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚抑素；海葵抑素(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡摺來新(carzelesin)及比摺來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌黴素(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；五加苷素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼；珊瑚素；海綿抑素；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、甲氮芥、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽留醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀及雷莫司汀；抗生素，諸如烯二炔類抗生素(例如，卡奇黴素、卡奇黴素γ1I、卡奇黴素ωI1(Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186)、達內黴素、達內黴素A；二磷酸鹽，諸如氯膦酸鹽；埃斯培拉黴素；以及新制癌菌素發色團及相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素、安麯黴素(anthramycin)、重氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌菌素、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素、地托比星、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、嗎啉基多柔比星、氰基嗎啉基多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星及脫氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、諸如絲裂黴素C之絲裂黴素、黴酚酸、諾拉黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲黴素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗代謝物，諸如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸、胺甲蝶呤、蝶醯蝶呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，諸如卡魯睾酮、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇、美雄烷、睾內酯；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝斯尿嘧啶(bestrabucil)；比生群；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨；埃博黴素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；類美登素，諸如美登素及安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK®聚糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根黴素；西佐喃；螺旋鍺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴素(T-2毒素、疣孢黴素A、桿孢菌素A及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌血生；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；環磷醯胺；噻替哌；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺基蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春花鹼；依托泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱(NAVELBINE®)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷；依達曲沙；道諾黴素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。 治療劑之「固定」或「不變」劑量在本文中係指在不考慮患者之體重(WT)或體表面積(BSA)的情况下投與人類患者之劑量。因此，固定或不變劑量不作爲mg/kg劑量或mg/m2 劑量，而是作爲治療劑之絕對量提供。 「負載」劑量在本文中一般包括投與患者之治療劑的初始劑量，且繼之以其一或多個維持劑量。一般而言，投與單一負載劑量，但本文中涵蓋多個負載劑量。通常，所投與之負載劑量的量超過所投與之維持劑量的量，及/或負載劑量比維持劑量更頻繁地投與，使得達成治療劑之所要穩態濃度可比用維持劑量更早達成。 「維持」劑量在本文中係指在治療週期中投與患者之一或多個劑量之治療劑。通常，維持劑量係以隔開之治療間隔投與，諸如大約每週、大約每2週、大約每3週或大約每4週，較佳每3週。 「輸注」係指將含藥物之溶液經靜脈引入體內以用於治療目的。一般而言，此舉係經由靜脈內(IV)袋實現。 「靜脈內袋」或「IV袋」爲可容納可經由患者靜脈投與之溶液的袋狀物。在一個實施例中，該溶液爲鹽水溶液(例如約0.9%或約0.45% NaCl)。視情况，該IV袋係由聚烯烴或聚氯乙烯形成。 術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈可變域(分別爲VH及VL)一般具有類似結構，各結構域包含四個保守架構區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人,Kuby Immunology , 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域來分別篩選互補VL或VH結構域文庫而加以分離。參見例如Portolano等人,J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628 (1991)。 如本文中所使用之術語「載體」係指能够使其所連接之另一核酸延伸的核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構形式的載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能够指導與其可操作地連接之核酸的表現。此種載體在本文中稱爲「表現載體」。 「烷基」爲含有正常、第二、第三或環狀碳原子之C1 -C18 烴。實例爲甲基(Me、-CH3 )、乙基(Et、-CH2 CH3 )、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH2 CH2 CH3 )、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3 )2 )、1-丁基(n-Bu、n-丁基、-CH2 CH2 CH2 CH3 )、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH2 CH(CH3 )2 )、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH3 )CH2 CH3 )、2-甲基-2-丙基(t-Bu、t-丁基、-C(CH3 )3 )、1-戊基(n-戊基、-CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 )、2-戊基(-CH(CH3 )CH2 CH2 CH3 )、3-戊基(-CH(CH2 CH3 )2 )、2-甲基-2-丁基(-C(CH3 )2 CH2 CH3 )、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3 )CH(CH3 )2 )、3-甲基-1-丁基(-CH2 CH2 CH(CH3 )2 )、2-甲基-1-丁基(-CH2 CH(CH3 )CH2 CH3 )、1-己基(-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 )、2-己基(-CH(CH3 )CH2 CH2 CH2 CH3 )、3-己基(-CH(CH2 CH3 )(CH2 CH2 CH3 ))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3 )2 CH2 CH2 CH3 )、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3 )CH(CH3 )CH2 CH3 )、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3 )CH2 CH(CH3 )2 )、3-甲基-3-戊基(-C(CH3 )(CH2 CH3 )2 )、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2 CH3 )CH(CH3 )2 )、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3 )2 CH(CH3 )2 )、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3 )C(CH3 )3 。 如本文中所使用之術語「C1 -C8 烷基」係指具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1 -C8 烷基」包括但不限於-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而分支鏈C1 -C8 烷基包括但不限於-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基、2-甲基丁基；不飽和C1 -C8 烷基包括但不限於-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。C1 -C8 烷基可未經取代或經一或多個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 如本文中所使用之術語「C1 -C12 烷基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。C1 -C12 烷基可未經取代或經一或多個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-SO3 R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 如本文中所使用之術語「C1 -C6 烷基」係指具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1 -C6 烷基」包括但不限於-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及-正己基；而分支鏈C1 -C6 烷基包括但不限於-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基及2-甲基丁基；不飽和C1 -C6 烷基包括但不限於-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基及3-己基。C1 -C6 烷基可未經取代或經一或多個基團取代，如上文關於C1 -C8 烷基所描述。 如本文中所使用之術語「C1 -C4 烷基」係指具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1 -C4 烷基」包括但不限於-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而分支鏈C1 -C4 烷基包括但不限於-異丙基、-第二丁基、異丁基、-第三丁基；不飽和C1 -C4 烷基包括但不限於-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基。C1 -C4 烷基可未經取代或經一或多個基團取代，如上文關於C1 -C8 烷基所描述。 「烷氧基」爲以單鍵與氧鍵結之烷基。例示性烷氧基包括但不限於甲氧基(-OCH3 )及乙氧基(-OCH2 CH3 )。「C1 -C5 烷氧基」爲具有1至5個碳原子之烷氧基。烷氧基可未經取代或經一或多個基團取代，如上文關於烷基所描述。 「烯基」爲含有正常、第二、第三或環狀碳原子與至少一個不飽和部位，亦即碳-碳sp2 雙鍵之C2 -C18 烴。實例包括但不限於：乙烯基(-CH=CH2 )、烯丙基(-CH2 CH=CH2 )、環戊烯基(-C5 H7 )及5-己烯基(-CH2 CH2 CH2 CH2 CH=CH2 )。「C2 -C8 烯基」爲含有2至8個正常、第二、第三或環狀碳原子與至少一個不飽和部位，亦即碳-碳sp2 雙鍵之烴。 「炔基」爲含有正常、第二、第三或環狀碳原子與至少一個不飽和部位，亦即碳-碳sp 三鍵之C2 -C18 烴。實例包括但不限於：乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2 C≡CH)。「C2 -C8 炔基」爲含有2至8個正常、第二、第三或環狀碳原子與至少一個不飽和部位，亦即碳-碳sp 三鍵之烴。 「伸烷基」係指自母體烷烴之同一碳原子或兩個不同的碳原子移除兩個氫原子而得到的具有1至18個碳原子且具有兩個單價基團中心之飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烷基包括但不限於：亞甲基(-CH2 -)、1,2-乙基(-CH2 CH2 -)、1,3-丙基(-CH2 CH2 CH2 -)、1,4-丁基(-CH2 CH2 CH2 CH2 -)及類似基團。 「伸烯基」係指自母體烯烴之同一碳原子或兩個不同的碳原子移除兩個氫原子而得到的具有2至18個碳原子且具有兩個單價基團中心之不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烯基包括但不限於：1,2-乙烯基(-CH=CH-)。 「伸炔基」係指自母體炔烴之同一碳原子或兩個不同的碳原子移除兩個氫原子而得到的具有2至18個碳原子且具有兩個單價基團中心之不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸炔基包括但不限於：乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2 C≡C-)及4-戊炔基(-CH2 CH2 CH2 C≡C-)。 「芳基」係指碳環芳基。芳基之實例包括但不限於苯基、萘基及蒽基。碳環芳基或雜環芳基可未經取代或經一或多個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「C5 -C20 芳基」爲在碳環芳環中具有5至20個碳原子之芳基。C5 -C20 芳基之實例包括但不限於苯基、萘基及蒽基。C5 -C20 芳基可經取代或未經取代，如上文關於芳基所描述。「C5 -C14 芳基」爲在碳環芳環中具有5至14個碳原子之芳基。C5 -C14 芳基之實例包括但不限於苯基、萘基及蒽基。C5 -C14 芳基可經取代或未經取代，如上文關於芳基所描述。 「伸芳基」爲具有兩個共價鍵且可呈鄰、間或對構型之芳基，如以下結構中所示：
Figure 02_image046
其中苯基可未經取代或經至多四個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「芳基烷基」係指與碳原子，典型地末端或sp3 碳原子鍵結之氫原子之一經芳基置換的非環狀烷基。典型芳基烷基包括但不限於苯甲基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘甲基、2-萘乙烷-1-基、2-萘乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯乙烷-1-基及類似基團。芳基烷基包含6至20個碳原子，例如芳基烷基之烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)爲1至6個碳原子且芳基部分爲5至14個碳原子。 「雜芳基烷基」係指與碳原子，典型地末端或sp3 碳原子鍵結之氫原子之一經雜芳基置換的非環狀烷基。典型雜芳基烷基包括但不限於2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及類似基團。雜芳基烷基包含6至20個碳原子，例如雜芳基烷基之烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)爲1至6個碳原子且雜芳基部分爲5至14個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可爲具有3至7個環成員(2至6個碳原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。 「經取代之烷基」、「經取代之芳基」及「經取代之芳基烷基」分別意謂一或多個氫原子各自獨立地經取代基置換之烷基、芳基及芳基烷基。典型取代基包括但不限於-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S- 、-NR2 、-NR3 、=NR、-CX3 、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2 、=N2 、-N3 、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2 、-SO3 - 、-SO3 H、-S(=O)2 R、-OS(=O)2 OR、-S(=O)2 NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2 、-P(=O)(OR)2 、-PO- 3 、-PO3 H2 、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2 R、-CO2 - 、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2 、-C(=S)NR2 、-C(=NR)NR2 ，其中各X獨立地爲鹵素：F、Cl、Br或I；且各R獨立地爲-H、C2 -C18 烷基、C6 -C20 芳基、C3 -C14 雜環、保護基或前藥部分。上文所描述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。 「雜芳基」及「雜環」係指一或多個環原子爲例如氮、氧及硫之雜原子的環系統。雜環基團包含3至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可爲具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。 例示性雜環描述於例如以下文獻中：Paquette, Leo A., 「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」 (W.A. Benjamin, New York, 1968), 尤其第1章、第3章、第4章、第6章、第7章及第9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」 (John Wiley & Sons, New York, 1950至今), 尤其第13卷、第14卷、第16卷、第19卷及第28卷；及J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566。 雜環之實例包括例如而不限於吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化之四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚啉基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖噌基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽烯基、哌喃基、異苯并呋喃基、色烯基、呫噸基、酚黃素基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲哚嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-哢唑基、哢唑基、β-哢啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋吖基、吩噁嗪基、異色滿基、色滿基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、奎寧環基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅醯基。 舉例而言但不具限制性，碳鍵結型雜環鍵結於吡啶之2、3、4、5或6位，噠嗪之3、4、5或6位，嘧啶之2、4、5或6位，吡嗪之2、3、5或6位，呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑之2、4或5位，異噁唑、吡唑或異噻唑之3、4或5位，氮丙啶之2或3位，氮雜環丁烷之2、3或4位，喹啉之2、3、4、5、6、7或8位，或異喹啉之1、3、4、5、6、7或8位。更典型地，碳鍵結型雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。 舉例而言但不具限制性，氮鍵結型雜環鍵結於氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑之1位，異吲哚或異吲哚啉之2位，嗎啉之4位，及哢唑或β-哢啉之9位。更典型地，氮鍵結型雜環包括1-氮丙啶基、1-氮雜環丁基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。 「C3 -C8 雜環」係指一至四個環碳原子獨立地經選自O、S及N之雜原子置換的芳族或非芳族C3 -C8 碳環。C3 -C8 雜環之代表性實例包括但不限於苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、熏草基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3 -C8 雜環可未經取代或經至多七個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「C3 -C8 雜環并」係指以上定義之C3 -C8 雜環基，其中該雜環基之氫原子之一經鍵置換。C3 -C8 雜環并可未經取代或經至多六個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「C3 -C20 雜環」係指一至四個環碳原子獨立地經選自O、S及N之雜原子置換的芳族或非芳族C3 -C8 碳環。C3 -C20 雜環可未經取代或經至多七個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「C3 -C20 雜環并」係指以上定義之C3 -C20 雜環基，其中該雜環基之氫原子之一經鍵置換。 「碳環」意謂具有3至7個碳原子呈單環形式或7至12個碳原子呈雙環形式之飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更典型地5或6個環原子。雙環碳環所具有之7至12個環原子例如排列爲雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統，或者9或10個環原子排列爲雙環[5,6]或[6,6]系統。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基及環辛基。 「C3 -C8 碳環」爲3、4、5、6、7或8員飽和或不飽和非芳族碳環。代表性C3 -C8 碳環包括但不限於-環丙基、-環丁基、-環戊基、-環戊二烯基、-環己基、-環己烯基、-1,3-環已二烯基、-1,4-環已二烯基、-環庚基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基、-環辛基及-環辛二烯基。C3 -C8 碳環基可未經取代或經一或多個基團取代，該等基團包括但不限於-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 、-NHC(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3 、-NH2 、-NH(R')、-N(R')2 及-CN，其中各R'係獨立地選自H、-C1 -C8 烷基及芳基。 「C3 -C8 碳環并」係指以上定義之C3 -C8 碳環基，其中該碳環基之氫原子之一經鍵置換。 「連接子」係指將抗體共價連接於藥物部分之包含共價鍵或原子鏈之化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價基團，諸如烷基二基、芳基二基、雜芳基二基；諸如-(CR2 )n O(CR2 )n -、烷氧基重複單元(例如，聚乙烯氧基、PEG、聚亞甲基氧基)及烷基胺基重複單元(例如，聚亞乙基胺基、JeffamineTM )之部分；及二酸酯及醯胺，包括琥珀酸酯、琥珀醯胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺。在各種實施例中，連接子可包含一或多個胺基酸殘基，諸如纈胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及高離胺酸。 術語「手性」係指具有鏡像搭配物之不可疊加性的分子，而術語「非手性」係指可疊加於其鏡像搭配物上之分子。 術語「立體異構體」係指具有相同的化學組成，但在原子或基團之空間排列方面不同的化合物。 「非對映異構體」係指具有兩個或更多個手性中心且其分子彼此不爲鏡像的立體異構體。非對映異構體具有不同的物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體之混合物可在諸如電泳及層析之高解析度分析程序下分離。 「對映異構體」係指彼此爲不可疊加之鏡像的兩種化合物立體異構體。 本文中所使用之立體化學定義及規定大體上按照S. P. Parker編,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及Eliel, E.及Wilen, S.,Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能够使平面偏振光之平面旋轉。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示分子關於其手性中心之絕對構型。字首d及l或(+)及(-)用於指定由化合物所致之平面偏振光旋轉標識，其中(-)或l意謂該化合物左旋。以(+)或d爲字首之化合物右旋。對於指定化學結構，此等立體異構體爲相同的，但其彼此爲鏡像。特定立體異構體亦可稱爲對映異構體，且此類異構體之混合物通常稱爲對映異構混合物。對映異構體之50:50混合物稱爲外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或過程中無立體選擇或立體特異性之情况下存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指缺乏光學活性之兩種對映異構種類的等莫耳混合物。 「離去基」係指可經另一官能基取代之官能基。某些離去基在此項技術中爲熟知的，且實例包括但不限於鹵化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯)及三氟甲基磺酸酯。 術語「保護基」係指通常用於封閉或保護特定官能度，同時使化合物上之其他官能基反應的取代基。舉例而言，「胺基保護基」爲與胺基連接從而封閉或保護化合物中之胺基官能度的取代基。適合之胺基保護基包括但不限於乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)。關於保護基及其用途之一般描述，參見T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991或較晚版本。II ． 組合物及方法 在一個態樣中，本發明部分基於結合HER2之抗體及包含此類抗體之免疫結合物。本發明之抗體及免疫結合物適用於例如診斷或治療HER2陽性癌症。A ． 例示性抗 HER2 抗體 本文中提供結合HER2之結構域I的經分離抗體。在一些實施例中，該等抗體不干擾曲妥珠單抗及/或帕妥珠單抗結合HER2。在一些實施例中，該等抗體不干擾曲妥珠單抗結合HER2且不干擾帕妥珠單抗結合HER2。在本文中所描述之任何實施例中，該等抗體可爲單株抗體。在一些實施例中，該等抗體可爲人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。 SEQ ID NO:1中提供具有信號序列(胺基酸1-22)之例示性天然存在之人類HER2前驅蛋白序列，且相應成熟HER2蛋白序列對應於SEQ ID NO:1之胺基酸23-1255。在一些實施例中，HER2之結構域I具有SEQ ID NO:35之胺基酸序列，結構域II具有SEQ ID NO:36之胺基酸序列，結構域III具有SEQ ID NO:37之胺基酸序列，且結構域IV具有SEQ ID NO:38之胺基酸序列(參見圖16)。抗體 hu7C2 及其他實施例 在一些實施例中，本發明提供一種抗HER2抗體，其包含至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供一種抗HER2抗體，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2及至少一、二、三、四或五個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3；(c)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(d)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(e)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含有(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3。 在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含有(a)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，本發明之抗體包含有(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列的VH結構域：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列的VL結構域：(i)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在任何以上實施例中，抗HER2抗體爲人類化抗體。在一個實施例中，抗HER2抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類受體架構，例如人類免疫球蛋白架構或人類一致架構。在某些實施例中，該人類受體架構爲人類VLκ IV一致(VLKIV )架構及/或VH架構VH1 。在某些實施例中，該人類受體架構爲包含本文中所描述之任一突變的人類VLκ IV一致(VLKIV )架構及/或VH架構VH1 。 在另一態樣中，抗HER2抗體包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO:11之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗HER2抗體保留結合HER2之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO:11中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO:11中總計1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，HVR以外之區域中(亦即，FR中)存在取代、插入或缺失。視情况，該抗HER2抗體包含SEQ ID NO:11之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，該VH包含有選自以下之一個、兩個或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2及(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3。 在另一態樣中，提供一種抗HER2抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗HER2抗體保留結合HER2之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO:10中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO:10中總計1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，HVR以外之區域中(亦即，FR中)存在取代、插入或缺失。視情况，該抗HER2抗體包含SEQ ID NO:10之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，該VL包含有選自以下之一個、兩個或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，提供一種抗HER2抗體，其中該抗體包含如以上所提供之任何實施例中之VH及如以上所提供之任何實施例中之VL。 在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:10中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。 在另一態樣中，本文中所提供之抗體與本文中所提供之抗HER2抗體結合同一抗原决定基。舉例而言，在某些實施例中，所提供之抗體與分別包含SEQ ID NO:11之VH序列及SEQ ID NO:10之VL序列的抗HER2抗體結合同一抗原决定基。 在另一態樣中，抗HER2抗體包含與SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的重鏈序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗HER2抗體保留結合HER2之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO:19中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO:19中總計1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，HVR以外之區域中(亦即，FR中)存在取代、插入或缺失。視情况，該抗HER2抗體包含SEQ ID NO:19之重鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，該重鏈包含有選自以下之一個、兩個或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-H2及(c)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-H3。 在另一態樣中，提供抗HER2抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈。在某些實施例中，與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的輕鏈序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗HER2抗體保留結合HER2之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO:18中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO:18中總計1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，HVR以外之區域中(亦即，FR中)存在取代、插入或缺失。視情况，該抗HER2抗體包含SEQ ID NO:18之輕鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定實施例中，該輕鏈包含有選自以下之一個、兩個或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，提供一種抗HER2抗體，其中該抗體包含如以上所提供之任何實施例中之重鏈及如以上所提供之任何實施例中之輕鏈。 在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:18中之重鏈及輕鏈序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。 在另一態樣中，本文中所提供之抗體與本文中所提供之抗HER2抗體結合同一抗原决定基。舉例而言，在某些實施例中，所提供之抗體與分別包含SEQ ID NO:19之重鏈序列及SEQ ID NO:18之輕鏈序列的抗HER2抗體結合同一抗原决定基。 本文中所提供之抗體包含有包含如圖1中所描繪之根據Kabat編號之HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC序列的輕鏈可變域及包含如圖2中所描繪之根據Kabat編號之HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗體包含有包含如圖1中所描繪之HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列的輕鏈可變域，以及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或FR4-LC序列。在一些實施例中，該抗體包含有包含如圖2中所描繪之HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列的重鏈可變域，以及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列。 在本發明之另一實施例中，根據任何以上實施例之抗HER2抗體爲單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗HER2抗體爲抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體或F(ab')2 片段。在另一實施例中，該抗體爲實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文中所定義之其他抗體類別或同型。 在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗HER2抗體可併入如以下所描述之任何特徵，單獨或組合。 1. 抗體親和力 在某些實施例中，本文中所提供之抗體的解離常數(Kd) ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 50 nM、≤ 10 nM、≤ 5 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM，且視情况≥ 10-13 M (例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。 在一個實施例中，Kd係藉由如以下分析中所描述用相關抗體之Fab型式及其抗原進行的經放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下方式來量測：在未經標記之抗原之滴定系列存在下以最低濃度之經(125 I)標記之抗原使Fab平衡，隨後以經抗Fab抗體塗佈之板俘獲已結合之抗原(參見例如Chen等人,J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。爲了創建分析條件，以含5 μg/ml俘獲抗Fab抗體(Cappel Labs)之50 mM碳酸鈉(pH 9.6)將MICROTITER® 多孔板(Thermo Scientific)塗佈隔夜，且隨後在室溫(大約23℃)下以含2% (w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷二至五小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [125 I]-抗原與相關Fab之連續稀釋混合(例如，與評估抗VEGF抗體Fab-12一致，Presta等人,Cancer Res. 57:4593-4599 (1997))。隨後將相關Fab培育隔夜；然而，該培育可持續更長週期(例如，約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至俘獲板以便在室溫下培育(例如，一小時)。隨後移出溶液且用含0.1%聚山梨酸酯20 (TWEEN-20® )之PBS將板洗滌八次。當板已乾燥時，添加150 μl/孔閃爍劑(MICROSCINT-20™；Packard)，且在TOPCOUNT™ γ計數儀(Packard)上對板計數十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合之20%之各Fab濃度用於競爭性結合分析。 根據另一實施例，使用表面電漿子共振分析法，使用BIACORE® -2000或BIACORE® -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ)在25℃下用經固定之抗原CM5晶片在約10個反應單位(RU)下量測Kd。簡而言之，根據供應商之說明書以N -乙基-N '-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N -羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基葡聚糖生化感測器晶片(CM5，BIACORE, Inc.)。以10 mM乙酸鈉pH 4.8將抗原稀釋至5 μg/ml (約0.2 μM)，隨後以5 μl/min流速注入以達成大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。繼注入抗原之後，注入1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25 μl/min之流速將Fab之兩倍連續稀釋(0.78 nM至500 nM)注入含0.05%聚山梨酸酯20 (TWEEN-20™)界面活性劑之PBS (PBST)中。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE® 評估軟體版本3.2)，藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(Kd)計算爲比率koff /kon 。參見例如Chen等人,J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若以上表面電漿子共振分析得到締合速率超過106 M-1 s-1 ，則可藉由使用螢光淬滅技術(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)測定締合速率，該技術量測含20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之PBS pH 7.2在25℃下在增加濃度之抗原存在下的螢光發射强度增減，如在諸如配備停流之分光光度計(Aviv儀器)或具有攪拌杯之8000系列SLM-AMINCO™分光光度計(ThermoSpectronic)之光譜儀中所量測。 2. 抗體片段 在某些實施例中，本文中所提供之抗體爲抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv及scFv片段及以下所描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, (Springer-Verlag, New York), 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；以及美國專利號5,571,894及5,587,458。關於包含救援受體結合抗原决定基殘基且具有增加之體內半衰期的Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。 雙抗體爲具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可能爲二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三抗體及四抗體亦描述於Hudson等人,Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。 單域抗體爲包含抗體之所有或部分重鏈可變域或者所有或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體爲人類單域抗體(Domantis, Inc.，Waltham，MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。 抗體片段可藉由各種技術來產生，包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化以及由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文中所描述。 3. 嵌合及人類化抗體 在某些實施例中，本文中所提供之抗體爲嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如猴之非人類靈長類動物的可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體爲「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已經自親本抗體之類別或亞類變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。 在某些實施例中，本文中所提供之嵌合抗體爲人類化抗體。典型地，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，而保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中例如CDR之HVR (或其部分)來源於非人類抗體且FR (或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情况亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基來源抗體)之相應殘基取代，例如，以修復或改良抗體特異性或親和力。 人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如以下文獻中：Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)；及Klimka等人,Br. J. Cancer , 83:252-260 (2000) (描述用於FR改組之「導向選擇」方法)。 可用於人類化之人類架構區包括但不限於：使用「最佳擬合」法選擇之架構區(參見例如Sims等人,J. Immunol. 151:2296 (1993))；來源於特定輕鏈或重鏈可變區亞組之人類抗體之一致序列的架構區(參見例如Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人,J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)架構區或人類生殖系架構區(參見例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選FR文庫之架構區(參見例如Baca等人,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)；及Rosok等人,J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。 4. 人類抗體 在某些實施例中，本文中所提供之抗體爲人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術來產生。人類抗體大體上描述於以下文獻中：van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)；及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。 人類抗體可藉由向經修飾以響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物投與免疫原來製備。此種動物典型地含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座，該等基因座置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合於動物之染色體中。在此種轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般經不活化。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如描述XENOMOUSE™技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。由此種動物產生之完整抗體之人類可變區可進一步經修飾，例如，藉由與不同的人類恆定區組合。 亦可藉由基於雜交瘤之方法產生人類抗體。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人,J. Immunol ., 147: 86 (1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括例如以下文獻中所描述者：美國專利第7,189,826號(描述由雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue , 26(4):265-268 (2006) (描述人類-人類雜交瘤)。人類雜交瘤技術(Trioma技術)亦描述於以下文獻中：Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)；及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)。 亦可藉由自來源於人類之噬菌體呈現庫分離所選Fv純系可變域序列來產生人類抗體。隨後可將此種可變域序列與所要人類恆定域組合。用於自抗體庫選擇人類抗體之技術描述如下。 5. 來源於文庫之抗體 本發明之抗體可藉由篩選組合庫中具有所要活性之抗體加以分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現庫及篩選此種庫中具有所要結合特徵之抗體的各種方法。此種方法之綜述見於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)中，且進一步描述於例如以下文獻中：McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。 在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)獨立地選殖VH及VL基因譜系，且隨後重組於噬菌體庫中，隨後可篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人,Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所描述。噬菌體典型地呈現呈單鏈Fv (scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。來自於經免疫來源之庫向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。替代地，可選殖(例如，自人類)天然譜系以提供單一抗體來源至大範圍非自體以及自體抗原而不進行任何免疫，如Griffiths等人,EMBO J, 12: 725-734 (1993)所描述。最後，亦可藉由選殖來自乾細胞之非重排V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高變CDR3區且在體外實現重排而合成產生天然庫，如Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)所描述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。 在本文中，自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段被視爲人類抗體或人類抗體片段。 6. 多特異性抗體 在某些實施例中，本文中所提供之抗體爲多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體爲對至少兩個不同的位點具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中一個係針對HER2且另一個係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中一個係針對HER2且另一個係針對CD3。參見例如美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合HER2之兩個不同的抗原决定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現HER2之細胞。雙特異性抗體可製備爲全長抗體或抗體片段。 用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同的特異性之兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人,EMBO J. 10: 3655 (1991))及「杵入臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。如本文中所使用之術語「杵入臼」或「KnH」技術係指藉由在相互作用界面上將突起(杵狀結構)引入一個多肽且將凹穴(臼狀結構)引入另一多肽從而在活體外或活體內指導兩個多肽配對在一起之技術。舉例而言，已將KnH引入抗體之Fc:Fc結合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面上(參見例如US 2011/0287009；US2007/0178552；WO 96/027011；WO 98/050431；Zhu等人, 1997, Protein Science 6:781-788；及WO 2012/106587)。在一些實施例中，KnH在製造多特異性抗體期間驅動兩個不同的重鏈配對在一起。舉例而言，Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含與各Fc區連接之單一可變域，或進一步包含可與類似或不同之輕鏈可變域配對的不同重鏈可變域。KnH技術亦可用於使兩個不同的受體細胞外域一起或使包含不同的靶識別序列之任何其他多肽序列(例如包括親和體、肽體及其他Fc融合物)配對。 如本文中所使用之術語「杵狀突變」係指將突起(杵狀結構)引入多肽中之該多肽與另一多肽相互作用之界面上的突變。在一些實施例中，該另一多肽具有臼狀突變。 如本文中所使用之術語「臼狀突變」係指將凹穴(臼狀結構)引入多肽中之該多肽與另一多肽相互作用之界面上的突變。在一些實施例中，該另一多肽具有杵狀突變。 以下提供簡要非限制性論述。 「突起」係指至少一個胺基酸側鏈自第一多肽之界面上突出，且因此可位於相鄰界面(亦即，第二多肽之界面)上之互補凹穴中以便穩定異源二聚體，且從而相對於同源二聚體形成有利於穩定異源二聚體形成。突起可存在於原始界面上，或可藉由合成引入(例如藉由改變編碼該界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第一多肽之界面之核酸經改變以編碼突起。爲了達成此舉，將編碼第一多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸置換爲編碼至少一個側鏈體積大於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基的核酸。應瞭解，可能存在多於一個原始殘基及相應的輸入殘基。各種胺基殘基之側鏈體積示於例如US2011/0287009之表1中。用於引入「突起」之突變可稱爲「杵狀突變」。 在一些實施例中，用於形成突起之輸入殘基爲選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)之天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基爲色胺酸或酪胺酸。在一些實施例中，用於形成突起之原始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、酥胺酸或纈胺酸。 「凹穴」係指自第二多肽之界面凹陷且因此可容納第一多肽之相鄰界面上之相應突起的至少一胺基酸側鏈。凹穴可存在於原始界面上，或可藉由合成引入(例如藉由改變編碼該界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第二多肽之界面之核酸經改變以編碼凹穴。爲了達成此舉，將編碼第二多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸置換爲編碼至少一個側鏈體積小於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基的DNA。應瞭解，可能存在多於一個原始殘基及相應的輸入殘基。在一些實施例中，用於形成凹穴之輸入殘基爲選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)及纈胺酸(V)之天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基爲絲胺酸、丙胺酸或酥胺酸。在一些實施例中，用於形成凹穴之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。用於引入「凹穴」之突變可稱爲「臼狀突變」。 突起「可位於」凹穴中，該凹穴意謂突起及凹穴分別在第一多肽及第二多肽之界面上的空間定位，且突起及凹穴之尺寸使得突起可位於凹穴中而不顯著干擾第一多肽與第二多肽在界面上之正常締合。因爲諸如Tyr、Phe及Trp之突起典型地不垂直於界面之軸而延伸且具有較佳構形，故在一些情况下，突起與相應凹穴對準可能依賴於基於三維結構(諸如藉由X射線結晶學或核磁共振(NMR)所獲得者)對突起/凹穴配對進行模型化。此舉可使用此項技術中經廣泛接受之技術來達成。 在一些實施例中，IgG1恆定區中之杵狀突變爲T366W (EU編號)。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼狀突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V之突變(EU編號)。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼狀突變包含T366S、L368A及Y407V (EU編號)。 在一些實施例中，IgG4恆定區中之杵狀突變爲T366W (EU編號)。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼狀突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V之突變(EU編號)。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼狀突變包含T366S、L368A及Y407V (EU編號)。 多特異性抗體亦可藉由以下方式來製造：對靜電牽引效應進行工程改造以製造抗體Fc異源二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人, Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈以產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用「雙抗體」技術用於製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人, J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及製備三特異性抗體，例如，如Tutt等人,J. Immunol. 147: 60 (1991)中所描述。 本文中亦包括具有三個或更多個功能抗原結合位點之經工程改造之抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。 本文中之抗體或片段亦包括「雙重作用Fab」或「DAF」，其包含結合HER2以及另一種不同的抗原的抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。 7. 抗體變異體 在某些實施例中，涵蓋本文中所提供之抗體的胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由向編碼該抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。此種修飾包括例如抗體胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，其限制條件爲最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。a) 取代、插入及缺失變異體 在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代性突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守取代示於表1中標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表1中標題「例示性取代」下，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選具有所要活性(例如，保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)之產物。表 1
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共同側鏈性質進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。 非保守取代將需要將此等類別之一的成員交換成另一類別。 一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人抗體)的一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得一或多種變異體相對於親本抗體將在某些生物學性質方面有所改變(例如改良) (例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物學性質。例示性取代變異體爲親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文中所描述者)便利地產生。簡而言之，使一或多個HVR殘基突變且使變異抗體呈現於噬菌體上並篩選特定生物學活性(例如結合親和力)。 可在HVR中進行改變(例如取代)，例如以改良抗體親和力。此種改變可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率進行突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))及/或SDR (a-CDR)中進行，測試所得變異VH或VL之結合親和力。藉由構築二級文庫且自其中再選擇來實現親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。隨後創建二級文庫。隨後篩選該文庫以鑒別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一種方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特異性地鑒別參與抗原結合之HVR殘基。特定言之，通常靶向以CDR-H3及CDR-L3。 在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此種改變實質上不降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行實質上不降低結合親和力之保守改變(例如，如本文中提供之保守取代)。此種改變可在HVR「熱點」或SDR以外。在以上所提供之變異VH及VL序列的某些實施例中，各HVR未改變或含有不多於一個、兩個或三個胺基酸取代。 適用於鑒別抗體中可作爲突變誘發靶標之殘基或區域的方法稱爲「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085中所描述。在此方法中，鑒別某一殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且置換爲中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置上引入進一步取代。替代地，或另外，使用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑒別抗體與抗原之間的接觸點。此種接觸殘基及相鄰殘基可作爲取代候選物而受到靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所要性質。 胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與增加該抗體血清半衰期之酶(例如用於ADEPT)或多肽的融合物。b) 糖基化變異體 在某些實施例中，改變本文中所提供之抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。對抗體進行糖基化位點添加或缺失可藉由改變胺基酸序列，從而創建或移除一或多個糖基化位點而便利地實現。 在抗體包含Fc區之情况下，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含一般由N-鍵聯連接於Fc區CH2結構域之Asn297的分支雙觸角寡糖。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接於雙觸角寡糖結構「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對抗體中之寡糖進行修飾以產生具有某些經改良性質之抗體變異體。 在一個實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接於Fc區之海藻糖的碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此種抗體中之海藻糖的量可爲1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。海藻糖之量係藉由計算Asn297處糖鏈內之海藻糖平均量相對於連接於Asn297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和來確定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，舉例而言，如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指位於Fc區中約297位(Fc區殘基之Eu編號)上之天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可由於抗體中之微小序列變異而位於297位上游或下游約±3個胺基酸處，即在294位與300位之間。此種海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏」抗體變異體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108; WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能够產生去海藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人,Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號, Presta, L；及WO 2004/056312 A1, Adams等人, 尤其實例11)及基因剔除細胞系，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8 剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。 進一步提供具有二等分寡糖之抗體變異體，例如其中連接於抗體Fc區之雙觸角寡糖經GlcNAc二等分。此種抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此種抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在連接於Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此種抗體變異體可具有改良之CDC功能。此種抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。c) Fc 區變異體 在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文中所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。 在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能的抗體變異體，由此使其成爲抗體之體內半衰期較爲重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或不利之應用的理想候選物。可進行體外及/或體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之降低/缺失。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現Fc(RIII，而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。造血細胞上之FcR表現彙總於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)第464頁表3中。評估相關分子之ADCC活性的體外分析法的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985))；第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。替代地，可采用非放射性分析法(參見例如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析法(Promega, Madison, WI)。適用於此種分析法之效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地，或另外，可例如在諸如Clynes等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。爲了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知的方法進行FcRn結合及體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B.等人,Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。 在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文中所提供之抗體之Fc部分中以增加與新生兒Fc受體之IgG結合。在某些實施例中，根據EU編號，該抗體包含以下三個突變：M252Y、S254T及T256E (「YTE突變」) (美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人, Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006))。在某些實施例中，YTE突變不影響抗體結合其同源抗原之能力。在某些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期。在一些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變使抗體之血清半衰期增加3倍。在一些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變使抗體之血清半衰期增加2倍。在一些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變使抗體之血清半衰期增加4倍。在一些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變使抗體之血清半衰期增加至少5倍。在一些實施例中，與天然(亦即，非YTE突變)抗體相比，YTE突變使抗體之血清半衰期增加至少10倍。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人, Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。 在某些實施例中，YTE突變體提供調節抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的手段。在某些實施例中，YTEO突變體提供調節人源化IgG抗體針對人類抗原之ADCC活性的手段。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人, Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。 在某些實施例中，YTE突變體允許同時調節血清半衰期、組織分布及抗體活性(例如，IgG抗體之ADCC活性)。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人, Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。 效應功能有所降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中一或多個經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。此種Fc突變異體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中兩個或更多個上具有取代之Fc突變異體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變異體(美國專利第7,332,581號)。 在某些實施例中，用甘胺酸或精胺酸或足够大從而足以破壞Fc之P329與FcγRIII之色胺酸殘基W87及W110之間所形成之Fc/Fcγ受體界面內之脯胺酸夾心的胺基酸殘基來取代野生型人類Fc區之位置329 (EU編號)上之脯胺酸(P329) (Sondermann等人, Nature 406, 267-273(2000年7月20日)。在另一實施例中，Fc變異體中之至少一個進一步胺基酸取代爲S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，且在另一實施例中，該至少一個進一步胺基酸取代爲人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E，均根據EU編號(美國專利第8,969,526號，其係以全文引用之方式併入)。 在某些實施例中，多肽包含野生型人類IgG Fc區之Fc變異體，其中該多肽中人類IgG Fc區之P329經甘胺酸取代且其中該Fc變異體在人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E上包含至少兩個進一步胺基酸取代，且其中該等殘基係根據EU編號進行編號(美國專利第8,969,526號，其係以全文引用其中方式併入)。在某些實施例中，包含P329G、L234A及L235A (EU編號)取代之多肽對人類FcγRIIIA及FcγRIIA展現降低之親和力，用於將ADCC下調至包含野生型人類IgG Fc區之多肽誘導之ADCC的至少20%，及/或用於下調ADCP (美國專利第8,969,526號，其係以全文引用其中方式併入)。 在一特定實施例中，包含野生型人類Fc多肽之Fc變異體的多肽包含三重突變：位置Pro329上之胺基酸取代、L234A及L235A突變(P329/LALA)，根據EU編號(美國專利第8,969,526號，其係以全文引用之方式併入)。在特定實施例中，該多肽包含以下胺基酸取代：P329G、L234A及L235A，根據EU編號。 已描述與FcR之結合有所改良或受到削弱之某些抗體變異體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。) 在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個可改良ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)上的取代)的Fc區。 在一些實施例中，在Fc區中進行引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，有所改良或受到削弱)之改變，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人,J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所描述。 半衰期有所增加且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn) (Guyer等人,J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人,J. Immunol. 24:249 (1994))之結合有所改良之抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個可改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此種Fc變異體包括在以下一或多個Fc區殘基處具有取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如對Fc區殘基434的取代(美國專利第7,371,826號)。 關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。d) 半胱胺酸工程改造之抗體變異體 在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造之抗體，例如「THIOMAB™」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體中可用於結合之位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基從而位於該抗體之可及位點處且可用於使抗體與其他部分(如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物，如本文中進一步描述。在某些實施例中，任何一或多個以下殘基均可經半胱胺酸取代：輕鏈之K149C (Kabat編號)；輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；重鏈之A140 (EU編號)；重鏈之L174 (EU編號)；重鏈之Y373 (EU編號)；及重鏈Fc區的S400 (EU編號)。在特定實施例中，本文中所描述之抗體包含HC-A140C (EU編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文中所描述之抗體包含LC-K149C (Kabat編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文中所描述之抗體包含HC-A118C (EU編號)半胱胺酸取代。可如例如美國專利第7,521,541號中所描述來產生經半胱胺酸工程改造之抗體。 在某些實施例中，該抗體包含以下重鏈半胱胺酸取代之一：
鏈(HC/LC) 殘基 EU 突變位點編號 Kabat 突變位點編號
HC T 114 110
HC A 140 136
HC L 174 170
HC L 179 175
HC T 187 183
HC T 209 205
HC V 262 258
HC G 371 367
HC Y 373 369
HC E 382 378
HC S 424 420
HC N 434 430
HC Q 438 434
在某些實施例中，該抗體包含以下輕鏈半胱胺酸取代之一：
鏈(HC/LC) 殘基 EU 突變位點編號 Kabat 突變位點編號
LC I 106 106
LC R 108 108
LC R 142 142
LC K 149 149
LC V 205 205
非限制性例示性hu7C2.v2.2.LA輕鏈(LC) K149C THIOMAB™分別具有SEQ ID NO:19及23之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性例示性hu7C2.v2.2.LA重鏈(HC) A118C THIOMAB™分別具有SEQ ID NO:24及18之重鏈及輕鏈胺基酸序列。 例示性S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區示於SEQ ID NO:28中。S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區可與SEQ ID NO:11中所示之hu7C2.v2.2.LA重鏈可變區之C末端融合。所得hu7C2.v2.2.LA HC S400C重鏈可與hu7C2.v2.2.LA κ輕鏈配對，諸如SEQ ID NO:18中所示之輕鏈。 例示性V205C半胱胺酸工程改造之輕鏈恆定區示於SEQ ID NO:25中。V205C半胱胺酸工程改造之輕鏈恆定區可與SEQ ID NO:10中所示之hu7C2.v2.2.LA輕鏈可變區之C末端融合。所得hu7C2.v2.2.LA LC V205C輕鏈可與hu7C2.v2.2.LA IgG重鏈配對，諸如SEQ ID NO:19中所示之重鏈。e) 抗體衍生物 在某些實施例中，本文中所提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且容易獲得之其他非蛋白質部分。適於對抗體進行衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可由於其在水中之穩定性而具有製造優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可爲分支或未分支的。連接於抗體之聚合物數目可變化，且若連接多於一個聚合物，則其可爲相同或不同的分子。一般而言，用於衍生化之聚合物數目及/或類型可基於多種考慮因素來確定，包括但不限於欲改良之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將在限定條件下用於療法中等。 在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於輻射而受到選擇性加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分爲碳奈米管(Kam等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括但不限於不會傷害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至能殺死與抗體-非蛋白質部分鄰近之細胞的溫度的波長。B ． 重組方法及組合物 可使用例如美國專利第4,816,567號中所描述之重組方法及組合物來產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文中所描述之抗HER2抗體的經分離核酸。此種核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH的胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此種核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供一種包含此種核酸之宿主細胞。在一個此種實施例中，宿主細胞包含(例如經轉型而具有)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列的核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列的核酸的第一載體及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列的核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞爲真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或類淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗HER2抗體之方法，其中該方法包括在適於表現該抗體之條件下培養如以上所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情况自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。 爲了重組產生抗HER2抗體，分離編碼例如以上所描述之抗體的核酸且將其插入一或多種載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此種核酸可使用習知程序(例如藉由使用能够特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及定序。 適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文中所描述之原核或真核細胞。舉例而言，可在細菌中產生抗體，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，描述在大腸桿菌中表現抗體片段。)在表現之後，抗體可自細菌細胞漿分離於可溶性部分中且可進一步純化。 除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦爲抗體編碼性載體之適合選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人源化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；及Li等人,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。 適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞及昆蟲細胞。已鑒別衆多可聯合昆蟲細胞一起使用之桿狀病毒菌株，尤其用於轉染草地貪夜蛾細胞。 植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第66,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES™技術)。 脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適應在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系可爲適用的。適用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例爲由SV40轉化之猴腎CV1細胞系(COS-7)；人胚腎細胞系(如例如Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞爾托利細胞(如例如Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)中所描述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。C ． 分析法 可藉由此項技術中已知的各種分析法來鑒別、篩選或表徵本文中所提供之抗HER2抗體之物理/化學性質及/或生物活性。 在一個態樣中，例如藉由已知方法，諸如ELISA、BIACore® 、FACS或西方墨點法來測試本發明抗體之抗原結合活性。 在另一態樣中，可使用競爭分析法來鑒別與本文中所描述之任何抗體競爭結合HER2的抗體。在某些實施例中，此種競爭性抗體結合與本文中所描述之抗體所結合的抗原决定基相同的抗原决定基(例如線性或構形抗原决定基)。用於對抗體所結合之抗原决定基進行圖譜分析之詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。 在一種例示性競爭分析法中，在包含可結合HER2之第一經標記抗體(例如本文中所描述之任何抗體)及欲測試與該第一抗體競爭結合HER2之能力的第二未標記抗體的溶液中培育經固定之HER2。該第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作爲對照，在包含該第一經標記抗體而無該第二未標記抗體之溶液中培育經固定之HER2。在允許該第一抗體與HER2結合之條件下培育之後，移除過量未結合之抗體，且量測與經固定之HER2締合的標記的量。若測試樣品中與經固定之HER2締合之標記的量相對於對照樣品實質上有所減少，則指示該第二抗體與該第一抗體競爭結合HER2。參見Harlow及Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual 第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。D ． 免疫結合物 本發明亦提供免疫結合物，其包含本文中所提供之抗HER2抗體與一或多種細胞毒性劑之結合物，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。 免疫結合物允許藥物部分靶向遞送至腫瘤，且在一些實施例中，允許在腫瘤中細胞內積聚，其中全身投與未結合之藥物可能對正常細胞造成不可接受之毒性水準(Polakis P. (2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。 抗體-藥物結合物(ADC)爲藉由使有效細胞毒性藥物靶向表現抗原之腫瘤細胞(Teicher, B.A. (2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-10044)，從而藉由使效力最大化且使脫靶毒性最小化來增强治療指數(Carter, P.J.及Senter P.D. (2008)The Cancer Jour . 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008)Acc. Chem. Res . 41:98-107)而組合抗體與細胞毒性藥物兩者之性質的被靶向化學治療分子。 本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些實施例中，ADC化合物包括結合(亦即共價連接)於藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接子共價連接於藥物部分。本發明之抗體-藥物結合物(ADC)將有效劑量之藥物選擇性地遞送至腫瘤組織，從而可達成較高選擇性(亦即，較低有效劑量)，同時增加治療指數(「治療窗」)。 抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細胞抑制效應之任何化合物、部分或基團。藥物部分可藉由多種機制賦予其細胞毒性及細胞抑制效應，包括但不限於微管蛋白結合、DNA結合或插入及對RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓撲異構酶之抑制。例示性藥物部分包括但不限於類美登素、多拉司他汀、奧裏斯他汀、卡奇黴素、吡咯并苯二氮呯(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環類、倍癌黴素、長春花生物鹼、紫杉烷、單端孢黴素、CC1065、喜樹鹼、依利奈法德(elinafide)及其具有細胞毒性活性之立體異構體、同電子排列體、類似物及衍生物。例示性藥物部分包括但不限於吡咯并苯并二氮雜草(PBD)及其 具有細胞毒性活性的衍生物。以下進一步詳細論述此種免疫結合物的非限制性實例。 1. 例示性抗體 - 藥物結合物 抗體-藥物結合物(ADC)化合物之例示性實施例包含靶向腫瘤細胞之抗體(Ab)、藥物部分(D)及將Ab連接於D之連接子部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基(諸如離胺酸及/或半胱胺酸)連接於連接子部分(L)。 例示性ADC具有式I： Ab-(L-D)p I 其中p爲1至約20。在一些實施例中，可與抗體結合之藥物部分數目受游離半胱胺酸殘基數目限制。在一些實施例中，藉由本文中所描述之方法將游離半胱胺酸殘基引入抗體胺基酸序列中。具有式I之例示性ADC包括但不限於具有1、2、3或4個經工程改造之半胱胺酸胺基酸的抗體(Lyon, R.等人(2012)Methods in Enzym . 502:123-138)。在一些實施例中，一或多個游離半胱胺酸殘基在不使用工程改造之情况下即已存在於抗體中，在此情况下該等存在之游離半胱胺酸殘基可用於使該抗體與藥物結合。在一些實施例中，將抗體暴露於還原條件，隨後結合該抗體以便產生一或多個游離半胱胺酸殘基。a) 例示性連接子 「連接子」(L)爲可用於將一或多個藥物部分(D)連接於抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)的雙官能或多官能部分。在一些實施例中，可使用具有用於共價連接於藥物及抗體之反應性官能度之連接子來製備抗體-藥物結合物(ADC)。舉例而言，在一些實施例中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成鍵以產生ADC。 在一個態樣中，連接子具有能够與抗體上所存在之游離半胱胺酸反應以形成共價鍵的官能度。非限制性例示性此種反應性官能度包括馬來醯亞胺、鹵基乙醯胺、α-鹵基乙醯基、諸如琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯之活化酯、酸酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。參見例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773第766頁之結合方法及本文中之實例。 在一些實施例中，連接子具有能够與抗體上所存在之親電子基團反應的官能度。例示性此種親電子基團包括但不限於醛及酮羰基。在一些實施例中，連接子之反應性官能度之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且與抗體單元形成共價鍵。非限制性例示性此種反應性官能度包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。 連接子可包含一或多種連接子組分。例示性連接子組分包括6-馬來醯亞胺基己醯基(「MC」)、馬來醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫)戊酸酯(「SPP」)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(「MCC」)。此項技術中已知各種連接子組分，其中一些描述如下。 連接子可爲促進藥物釋放之「可裂解連接子」。非限制性例示性可裂解連接子包括酸不穩定性連接子(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)連接子、光不穩定性連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人, Cancer Research 52:127-131 (1992)；US 5208020)。 在某些實施例中，連接子具有以下式II：
Figure 02_image048
II 其中A爲「延伸物單元」，且a爲整數0至1；W爲「胺基酸單元」，且w爲整數0至12；Y爲「間隔基單元」，且y爲0、1或2；且Ab、D及p如上文針對式I所定義。此種連接子之例示性實施例描述於美國專利第7,498,298號中，該專利係以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，連接子組分包含將抗體連接於另一連接子組分或藥物部分的「延伸物單元」。非限制性例示性延伸物單元顯示如下(其中波形線指示與抗體、藥物或其他連接子組分共價連接之部位)：
Figure 02_image050
MC
Figure 02_image052
MP
Figure 02_image054
mPEG
Figure 02_image056
。 在一些實施例中，連接子組分包含「胺基酸單元」。在一些此種實施例中，胺基酸單元允許連接子由蛋白酶裂解，從而有助於在暴露於諸如溶酶體酶之細胞內蛋白酶後自免疫結合物釋放藥物(Doronina等人(2003)Nat. Biotechnol. 21:778-784)。例示性胺基酸單元包括但不限於二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括但不限於纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括但不限於甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可經設計及優化以便藉由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或胞漿素蛋白酶進行酶促裂解。 在一些實施例中，連接子組分包含直接或經由延伸物單元及/或胺基酸單元連接抗體與藥物部分的「間隔基」單元。間隔基單元可爲「自犧牲」或「非自犧牲」的。「非自犧牲」間隔基單元爲ADC裂解後部分或所有間隔基單元保持與藥物部分結合的間隔基單元。非自犧牲間隔基單元之實例包括但不限於甘胺酸間隔基單元及甘胺酸-甘胺酸間隔基單元。在一些實施例中，藉由腫瘤細胞相關蛋白酶對含有甘胺酸-甘胺酸間隔基單元之ADC進行酶促裂解引起甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自ADC之其餘部分釋放。在一些此種實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中經受水解步驟，從而使甘胺酸-甘胺酸間隔基單元自藥物部分裂解。 「自犧牲」間隔基單元允許釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔基單元包含對胺基苯甲基單元。在一些此種實施例中，對胺基苯甲醇經由醯胺鍵連接於胺基酸單元，且該苯甲醇與藥物之間產生胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103)。在一些實施例中，該間隔基單元爲對胺基苯甲氧基羰基(PAB)。在一些實施例中，包含自犧牲連接子之ADC具有以下結構：
Figure 02_image057
， 其中Q爲-C1 -C8 烷基、-O-(C1 -C8 烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m爲整數0至4；且p在1至約20之範圍內。在一些實施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4之範圍內。 自犧牲間隔基之其他實例包括但不限於電子性質類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利第7,375,078號；Hay等人(1999)Bioorg. Med. Chem. Lett . 9:2237)及鄰胺基苯甲醛或對胺基苯縮醛。在一些實施例中，可使用在醯胺鍵水解後經歷環化的間隔基，諸如經取代或未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2:223)、適當經取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人(1972)J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人, (1990)J. Org. Chem . 55:5867)。藥物與甘胺酸殘基之α碳鍵聯爲可能適用於ADC之自犧牲間隔基之另一實例(Kingsbury等人(1984)J. Med. Chem . 27:1447)。 在一些實施例中，連接子L可爲經由分支多官能連接子部分將多於一個藥物部分共價連接於抗體的樹枝型連接子(Sun等人(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即，負載，此與ADC之效力有關。因而，在抗體僅帶有一個反應性半胱胺酸硫醇基之情况下，可經由樹枝狀連接子連接衆多藥物部分。 在具有式I之ADC的情形下，非限制性例示性連接子顯示如下：
Figure 02_image059
val-cit
Figure 02_image061
MC-val-cit
Figure 02_image063
MC-val-cit-PAB 其他非限制性例示性ADC包括以下結構：
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
， 其中X爲：
Figure 02_image075
; Y爲：
Figure 02_image076
或
Figure 02_image078
； 各R獨立地爲H或C1 -C6 烷基；且n爲1至12。 典型地，可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備肽型連接子。此種肽鍵可例如根據液相合成法來製備(例如，E. Schröder及K. Lübke (1965) 「The Peptides」, 第1卷, 第76-136頁, Academic Press)。 在一些實施例中，連接子經可調節溶解度及/或反應性之基團取代。作爲一個非限制性實例，諸如磺酸根(-SO3 - )或銨之帶電取代基可增加連接子試劑之水溶解度且促進連接子試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或促進抗體-連接子中間物(Ab-L)與D或藥物-連接子中間物(D-L)與Ab之偶合反應Ab，視用於製備ADC之合成途徑而定。在一些實施例中，使連接子之一部分與抗體偶合，且使連接子之一部分與藥物偶合，且隨後使Ab-(連接子部分)a 與藥物-(連接子部分)b 偶合以形成式I之ADC。在一些此種實施例中，該抗體包含多於一個(連接子部分)a 取代基，使得式I之ADC中多於一個藥物與抗體偶合。 本發明之化合物明確涵蓋但不限於用以下連接子試劑製備之ADC：雙馬來醯亞胺基三氧乙二醇(BMPEO)、N-(β-馬來醯亞胺基丙氧基)-N-羥基琥珀醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-馬來醯亞胺基己醯氧基)琥珀醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯碸(HBVS)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)琥珀醯亞胺基酯(LC-SMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺基酯(MBS)、4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸琥珀醯亞胺基酯(SBAP)、碘乙酸琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫)戊酸酯(SPP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、6-[(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)己酸]琥珀醯亞胺基酯(SMPH)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB、及琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯(SVSB)，且包括雙馬來醯亞胺試劑：二硫雙馬來醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙馬來醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙馬來醯亞胺基己烷(BMH)、雙馬來醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2 (顯示如下)及BM(PEG)3 (顯示如下)；醯亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如己二亞醯胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性含氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實施例中，雙馬來醯亞胺試劑允許抗體中之半胱胺酸之硫醇基連接於含硫醇之藥物部分、連接子或連接子-藥物中間物。與硫醇基具有反應性之其他官能基包括但不限於碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
Figure 02_image080
某些適用之連接子試劑可獲自各種商業來源，諸如Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford，IL)、Molecular Biosciences Inc. (Boulder，CO)，或根據此項技術中所描述之程序合成；例如Toki等人(2002)J. Org. Chem . 67:1866-1872；Dubowchik等人, (1997)Tetrahedron Letters , 38:5257-60；Walker, M.A. (1995)J. Org. Chem . 60:5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem . 7:180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。 經碳14標記之1-異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)爲用於結合放射性核苷酸與抗體的例示性螯合劑。參見例如WO94/11026。b) 例示性藥物部分 (1) 美登素及類美登素 在一些實施例中，免疫結合物包含與一或多個類美登素分子結合之抗體。類美登素爲美登素之衍生物，且爲藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲分裂抑制劑。美登素首先自東非灌木齒葉美登木中分離(美國專利第3896111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成類美登素揭示於例如美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中。 類美登素藥物部分在抗體-藥物結合物中爲具有吸引力之藥物部分，因爲其：(i)相對可藉由醗酵或對醗酵產物之化學修飾或衍生化來製備、(ii)可用適合於經由非二硫化物連接子與抗體結合之官能基衍生化、(iii)在血漿中穩定及(iv)對多種腫瘤細胞系有效。 適合用作類美登素藥物部分之某些類美登素在此項技術中爲已知的，且可根據已知方法自天然來源分離或使用基因工程改造技術產生(參見例如Yu等人(2002) PNAS 99:7968-7973)。類美登素亦可根據已知方法合成製備。 例示性類美登素藥物部分包括但不限於具有經修飾之芳環的類美登素藥物部分，諸如：C-19-脫氯(美國專利第4256746號) (舉例而言，藉由氫化鋰鋁還原安絲菌素P2來製備)；C-20-羥基(或C-20-脫甲基+/-C-19-脫氯(美國專利第4361650號及第4307016號) (舉例而言，藉由使用鏈黴菌或放線菌脫甲基或使用LAH脫氯來製備)；及C-20-脫甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)+/-脫氯(美國專利第4,294,757號) (舉例而言，藉由使用醯基氯進行醯化來製備)，以及在芳環之其他位置具有修飾的類美登素藥物部分。 例示性類美登素藥物部分亦包括具有諸如以下之修飾的類美登素藥物部分：C-9-SH (美國專利第4424219號) (舉例而言，藉由美登醇與H2 S或P2 S5 之反應來製備)；C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2 OR) (US 4331598)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2 OH或CH2 OAc) (美國專利第4450254號) (舉例而言，由奴卡菌屬製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4364866) (舉例而言，藉由鏈黴菌屬轉化美登醇來製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號) (舉例而言，自滑桃樹分離)；C-18-N-脫甲基(美國專利第4362663號及第4322348號) (舉例而言，藉由鏈黴菌屬對美登醇進行脫甲基來製備)；及4,5-脫氧(US 4371533) (舉例而言，藉由三氯化鈦/LAH還原美登醇來製備)。 類美登素化合物上之許多位置適用作鍵聯位置。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應而形成酯鍵聯。在一些實施例中，該反應可在具有羥基之C-3位置、經羥基甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15及具有羥基之C-20位置上發生。在一些實施例中，在美登醇或美登醇類似物之C-3位置上形成鍵聯。 類美登素藥物部分包括具有以下結構者：
Figure 02_image082
， 其中波形線指示類美登素藥物部分之硫原子與ADC之連接子共價連接。各R可獨立地爲H或C1 -C6 烷基。將醯胺基連接於硫原子之伸烷基鏈可爲甲烷基、乙烷基或丙基，亦即，m爲1、2或3 (US 633410；US 5208020；Chari等人(1992)Cancer Res. 52:127-131；Liu等人(1996)Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623)。 本發明之ADC涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體，亦即，手性碳處R 及S 構形之任何組合(US 7276497、US 6913748、US 6441163、US 633410 (RE39151)、US 5208020、Widdison等人(2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408，該等文獻係以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，類美登素藥物部分具有以下立體化學：
Figure 02_image084
類美登素藥物部分之例示性實施例包括但不限於具有以下結構之DM1、DM3及DM4：
Figure 02_image086
Figure 02_image088
Figure 02_image090
其中波形線指示藥物之硫原子與抗體-藥物結合物之連接子(L)共價連接。 其他例示性類美登素抗體-藥物結合物具有藥物以下結構及縮寫(其中Ab爲抗體且p爲1至約20。在一些實施例中，p爲1至10，p爲1至7，p爲1至5，或p爲1至4)：
Figure 02_image092
Ab -SPP-DM1
Figure 02_image094
Ab-SMCC-DM1 DM1經由BMPEO連接子連接於抗體之硫醇基的例示性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫：
Figure 02_image096
其中Ab爲抗體；n爲0、1或2；且p爲1至約20。在一些實施例中，p爲1至10，p爲1至7，p爲1至5，或p爲1至4。 含有類美登素之免疫結合物、其製造方法及其治療用途揭示於例如美國專利第5,208,020號及第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等文獻之揭示內容係以引用之方式明確併入在此。亦參見Liu等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)；及Chari等人,Cancer Research 52:127-131 (1992)。 在一些實施例中，抗體-類美登素結合物可藉由在不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性的情况下將抗體化學連接於類美登素分子來製備。參見例如美國專利第5,208,020號(其揭示內容係以引用之方式明確併入在此)。在一些實施例中，每個抗體分子平均結合3至4個類美登素分子之ADC已在增强靶細胞之細胞毒性而不負面影響抗體之功能或溶解度方面顯示效力。在一些情况下，預計即使一分子毒素/抗體與使用裸抗體相比亦可增强細胞毒性。 用於製造抗體-類美登素結合物之例示性連接基團包括例如本文中所描述者及以下文獻中所描述者：美國專利第5208020號；歐洲專利0 425 235 B1；Chari等人,Cancer Research 52:127-131 (1992)；US 2005/0276812 A1；及US 2005/016993 A1，該等文獻之揭示內容係以引用之方式明確併入在此。(2) 奧裏斯他汀及多拉司他汀 藥物部分包括多拉司他汀、奧裏斯他汀及其類似物及衍生物(US 5635483；US 5780588；US 5767237；US 6124431)。奧裏斯他汀爲海洋軟體動物化合物多拉司他汀10之衍生物。儘管不欲受任何特定理論束縛，但多拉司他汀及奧裏斯他汀已顯示干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob. Agents and Chemother . 45(12):3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob. Agents Chemother . 42:2961-2965)。多拉司他汀/奧裏斯他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N (胺基)末端或C (羧基)末端連接於抗體(WO 02/088172；Doronina等人(2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784；Francisco等人(2003)Blood 102(4):1458-1465)。 例示性奧裏斯他汀實施例包括US 7498298及US 7659241中所揭示之N末端連接之單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE 及DF ，該等文獻之揭示內容係以全文引用之方式明確併入：
Figure 02_image098
DE
Figure 02_image100
DF 其中DE 及DF 之波形線指示與抗體或抗體-連接子組分之共價連接部位，且在各位置上獨立地： R2 係選自H及C1 -C8 烷基； R3 係選自H、C1 -C8 烷基、C3 -C8 碳環、芳基、C1 -C8 烷基-芳基、C1 -C8 烷基-(C3 -C8 碳環)、C3 -C8 雜環及C1 -C8 烷基-(C3 -C8 雜環)； R4 係選自H、C1 -C8 烷基、C3 -C8 碳環、芳基、C1 -C8 烷基-芳基、C1 -C8 烷基-(C3 -C8 碳環)、C3 -C8 雜環及C1 -C8 烷基-(C3 -C8 雜環)； R5 係選自H及甲基； 或R4 與R5 共同形成碳環狀環且具有式-(CRa Rb )n -，其中Ra 及Rb 係獨立地選自H、C1 -C8 烷基及C3 -C8 碳環，且n係選自2、3、4、5及6； R6 係選自H及C1 -C8 烷基； R7 係選自H、C1 -C8 烷基、C3 -C8 碳環、芳基、C1 -C8 烷基-芳基、C1 -C8 烷基-(C3 -C8 碳環)、C3 -C8 雜環及C1 -C8 烷基-(C3 -C8 雜環)； 各R8 係獨立地選自H、OH、C1 -C8 烷基、C3 -C8 碳環及O-(C1 -C8 烷基)； R9 係選自H及C1 -C8 烷基； R10 係選自芳基或C3 -C8 雜環； Z爲O、S、NH或NR12 ，其中R12 爲C1 -C8 烷基； R11 係選自H、C1 -C20 烷基、芳基、C3 -C8 雜環、-(R13 O)m -R14 或-(R13 O)m -CH(R15 )2 ； M爲在1至1000範圍內之整數； R13 爲C2 -C8 烷基； R14 爲H或C1 -C8 烷基； R15 在各出現處獨立地爲H、COOH、-(CH2 )n -N(R16 )2 、-(CH2 )n -SO3 H或-(CH2 )n -SO3 -C1 -C8 烷基； R16 在各出現處獨立地爲H、C1 -C8 烷基或-(CH2 )n -COOH； R18 係選自-C(R8 )2 -C(R8 )2 -芳基、-C(R8 )2 -C(R8 )2 -(C3 -C8 雜環)及-C(R8 )2 -C(R8 )2 -(C3 -C8 碳環)；且 n爲在0至6範圍內之整數。 在一個實施例中，R3 、R4 及R7 獨立地爲異丙基或第二丁基，且R5 爲-H或甲基。在一例示性實施例中，R3 及R4 各自爲異丙基，R5 爲-H，且R7 爲第二丁基。 在另一實施例中，R2 及R6 各自爲甲基，且R9 爲-H。 在另一實施例中，R8 在各出現處爲-OCH3 。 在一例示性實施例中，R3 及R4 各自爲異丙基，R2 及R6 各自爲甲基，R5 爲-H，R7 爲第二丁基，R8 在各出現處爲-OCH3 ，且R9 爲-H。 在一個實施例中，Z爲-O-或-NH-。 在一個實施例中，R10 爲芳基。 在一例示性實施例中，R10 爲-苯基。 在一例示性實施例中，當Z爲-O-時，R11 爲-H、甲基或第三丁基。 在一個實施例中，當Z爲-NH時，R11 爲-CH(R15 )2 ，其中R15 爲-(CH2 )n -N(R16 )2 ，且R16 爲-C1 -C8 烷基或-(CH2 )n -COOH。 在另一實施例中，當Z爲-NH時，R11 爲-CH(R15 )2 ，其中R15 爲-(CH2 )n -SO3 H。 式DE 之例示性奧裏斯他汀實施例爲MMAE，其中波形線指示共價連接於抗體-藥物結合物之連接子(L)：
Figure 02_image102
MMAE 式DF 之例示性奧裏斯他汀實施例爲MMAF，其中波形線指示共價連接於抗體-藥物結合物之連接子(L)：
Figure 02_image104
MMAF 其他例示性實施例包括在五肽奧裏斯他汀藥物部分之C末端具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奧裏斯他汀藥物部分之C末端具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。 包含MMAE或MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性例示性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」爲抗體；p爲1至約8，「Val-Cit」爲纈胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」爲硫原子)：
Figure 02_image106
Ab-MC-vc-PAB-MMAF；
Figure 02_image108
Ab-MC-vc-PAB-MMAE；
Figure 02_image110
Ab-MC-MMAE；
Figure 02_image112
Ab-MC-MMAF 包含MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性例示性實施例進一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。包含由不可蛋白水解裂解之連接子連接於抗體之MMAF的免疫結合物已顯示具有與包含由可蛋白水解裂解之連接子連接於抗體之MMAF的免疫結合物相當的活性(Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem. 17:114-124)。在一些此種實施例中，據信藥物釋放受抗體在細胞中降解影響。 典型地，可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備基於肽之藥物部分。此種肽鍵可例如根據液相合成法來製備(參見例如，E. Schröder及K. Lübke, 「The Peptides」, 第1卷, 第76-136頁, 1965, Academic Press)。在一些實施例中，奧裏斯他汀/多拉司他汀藥物部分可根據以下文獻之方法製備：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R.等人,Synthesis , 1996, 719-725；Pettit等人(1996)J. Chem. Soc. Perkin Trans . 1 5:859-863；及Doronina (2003)Nat. Biotechnol . 21(7):778-784。 在一些實施例中，式DE (諸如MMAE)及式DF (諸如MMAF)之奧裏斯他汀/多拉司他汀藥物部分及藥物-連接子中間物及其衍生物(諸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用以下文獻中所描述之方法製備：US 7498298；Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem . 17:114-124；及Doronina等人(2003)Nat. Biotech . 21:778-784，且隨後與相關抗體結合。(3) 卡奇黴素 在一些實施例中，免疫結合物包含與一或多個卡奇黴素分子結合之抗體。卡奇黴素家族抗生素及其類似物能够在次皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂(Hinman等人, (1993)Cancer Research 53:3336-3342；Lode等人, (1998)Cancer Research 58:2925-2928)。卡奇黴素具有細胞內作用位點，但在某些情况下不容易越過胞質膜。因此，在一些實施例中，藉由抗體介導之內在化對此等藥劑進行細胞攝取可大幅增强其細胞毒性效應。用卡奇黴素藥物部分製備抗體-藥物結合物之非限制性例示性方法描述於例如US 5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。 在一些實施例中，與抗體結合之卡奇黴素藥物部分爲具有下式之化合物：
Figure 02_image114
， 其中X爲Br或I； L爲連接子；R爲氫、C1-6 烷基或-C(=O)C1-6 烷基；且Ra 爲氫或C1-6 烷基。 在一些實施例中，X爲Br，Ra 爲氫且R爲異丙基。 在其他實施例中，X爲Br，Ra 爲氫且R爲乙基。 在其他實施例中，X爲I，Ra 爲氫且R爲異丙基。 在其他實施例中，X爲I，Ra 爲氫且R爲乙基。 在一些實施例中，X爲Br，Ra 爲氫且R爲-C(=O)CH3 。 在其他實施例中，X爲I，Ra 爲氫且R爲-C(=O)CH3 。 在其他實施例中，X爲I，Ra 爲乙基且R爲-C(=O)CH3 。 在其他實施例中，X爲Br，Ra 爲乙基且R爲-C(=O)CH3 。(4) 吡咯并苯二氮呯 在一些實施例中，ADC包含吡咯并苯二氮呯(PBD)。在一些實施例中，PBD二聚體識別且結合特定DNA序列。1965年首次報導天然產物安麯黴素PBD (Leimgruber等人, (1965)J. Am. Chem. Soc ., 87:5793-5795；Leimgruber等人, (1965)J. Am. Chem. Soc ., 87:5791-5793)。自此，已報導許多天然存在之PBD及類似物(Thurston等人, (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465)，包括三環PBD支架之二聚體(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。不欲受任何特定理論束縛，據信二聚體結構賦予適當三維形狀以便與B型DNA之小溝具有等螺旋性，從而在結合位點處適貼配合(Kohn, Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, 第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter, (1986)Acc. Chem. Res ., 19:230-237)。帶有C2芳基取代基之二聚PBD化合物已顯示適用作細胞毒性劑(Hartley等人(2010)Cancer Res . 70(17):6849-6858；Antonow (2010)J. Med. Chem . 53(7):2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466)。 在一些實施例中，PBD化合物可藉由在N10位置上用在體內可移除之氮保護基對其進行保護而用作前藥(WO 00/12507；WO 2005/023814)。 已使PBD二聚體與抗體結合，且所得ADC顯示具有抗癌性(US 2010/0203007)。PBD二聚體上之非限制性例示性鍵聯位點包括五員吡咯并環、PBD單元之間的繫鏈及N10-C11亞胺基團(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。 ADC之非限制性例示性PBD二聚體組分具有式A：
Figure 02_image002
A 及其鹽及溶劑合物，其中： 波形線指示與連接子之共價連接位點； 虛線指示C1與C2或C2與C3之間視情况存在雙鍵； R2 係獨立地選自H、OH、=O、=CH2 、CN、R、OR、=CH-RD 、=C(RD )2 、O-SO2 -R、CO2 R及COR，且視情况進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD 係獨立地選自R、CO2 R、COR、CHO、CO2 H及鹵基； R6 及R9 係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR'、NO2 、Me3 Sn及鹵基； R7 係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR'、NO2 、Me3 Sn及鹵基； Q係獨立地選自O、S及NH； R11 爲H或R，或者在Q爲O的情况下爲SO3 M，其中M爲金屬陽離子； R及R'係各自獨立地選自視情况經取代之C1-8 烷基、C1-12 烷基、C3-8 雜環基、C3-20 雜環及C5-20 芳基，且視情况關於基團NRR'，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情况經取代之4、5、6或7員雜環； R12 、R16 、R19 及R17 分別如關於R2 、R6 、R9 及R7 所定義； R''爲C3-12 伸烷基，該鏈可間雜一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe；及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情况經取代；且 X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。 在一些實施例中，R及R'係各自獨立地選自視情况經取代之C1-12 烷基、C3-20 雜環及C5-20 芳基，且視情况關於基團NRR'，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情况經取代之4、5、6或7員雜環。 在一些實施例中，R9 及R19 爲H。 在一些實施例中，R6 及R16 爲H。 在一些實施例中，R7 及R17 均爲OR7A ，其中R7A 爲視情况經取代之C1-4 烷基。在一些實施例中，R7A 爲Me。在一些實施例中，R7A 爲Ch2 Ph，其中Ph爲苯基。 在一些實施例中，X爲O。 在一些實施例中，R11 爲H。 在一些實施例中，各單體單元中之C2與C3之間存在雙鍵。 在一些實施例中，R2 及R12 係獨立地選自H及R。在一些實施例中，R2 及R12 獨立地爲R。在一些實施例中，R2 及R12 獨立地爲視情况經取代之C5-20 芳基或C5-7 芳基或C8-10 芳基。在一些實施例中，R2 及R12 獨立地爲視情况經取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實施例中，R2 及R12 係獨立地選自=O、=CH2 、=CH-RD 及=C(RD )2 。在一些實施例中，R2 及R12 各自爲=CH2 。在一些實施例中，R2 及R12 各自爲H。在一些實施例中，R2 及R12 各自爲=O。在一些實施例中，R2 及R12 各自爲=CF2 。在一些實施例中，R2 及/或R12 獨立地爲=C(RD )2 。在一些實施例中，R2 及/或R12 獨立地爲=CH-RD 。 在一些實施例中，當R2 及/或R12 爲=CH-RD 時，各基團可獨立地具有以下所示之任一構形：
Figure 02_image117
在一些實施例中，=CH-RD =呈構形(I)。 在一些實施例中，R''爲C3 伸烷基或C5 伸烷基。 在一些實施例中，ADC之例示性PBD二聚體組分具有式A(I)之結構：
Figure 02_image119
A(I)； 其中n爲0或1。 在一些實施例中，ADC之例示性PBD二聚體組分具有式A(II)之結構：
Figure 02_image004
A(II)； 其中n爲0或1。 在一些實施例中，ADC之例示性PBD二聚體組分具有式A(III)之結構：
Figure 02_image121
A(III)； 其中RE 及RE'' 係各自獨立地選自H或RD ，其中RD 如以上所定義；且其中n爲0或1。 在一些實施例中，n爲0。在一些實施例中，n爲1。在一些實施例中，RE 及/或RE'' 爲H。在一些實施例中，RE 及RE'' 爲H。在一些實施例中，RE 及/或RE'' 爲RD ，其中RD 爲視情况經取代之C1-12 烷基。在一些實施例中，RE 及/或RE'' 爲RD ，其中RD 爲甲基。 在一些實施例中，ADC之例示性PBD二聚體組分具有式A(IV)之結構：
Figure 02_image123
A(IV)； 其中Ar1 及Ar2 各自獨立地爲視情况經取代之C5-20 芳基；其中Ar1 及Ar2 可能相同或不同；且 其中n爲0或1。 在一些實施例中，ADC之例示性PBD二聚體組分具有式A(V)之結構：
Figure 02_image125
A(V); 其中Ar1 及Ar2 各自獨立地爲視情况經取代之C5-20 芳基；其中Ar1 及Ar2 可能相同或不同；且 其中n爲0或1。 在一些實施例中，Ar1 及Ar2 係各自獨立地選自視情况經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些實施例中，Ar1 及Ar2 各自獨立地爲視情况經取代之苯基。在一些實施例中，Ar1 及Ar2 各自獨立地爲視情况經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施例中，Ar1 及Ar2 各自獨立地爲視情况經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可利用之環位置與PBD核心結合。舉例而言，喹啉基可爲喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些實施例中，喹啉基係選自喹啉-3-基及喹啉-6-基。異喹啉基可爲異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。在一些實施例中，異喹啉基係選自異喹啉-3-基及異喹啉-6-基。 ADC之其他非限制性例示性PBD二聚體組分具有式B：
Figure 02_image127
B 及其鹽及溶劑合物，其中： 波形線指示與連接子之共價連接位點； 連接於OH之波形線指示S或R構形； RV1 及RV2 係獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情况經氟取代，尤其在4位上)及C5-6 雜環基；其中RV1 及RV2 可能相同或不同；且 n爲0或1。 在一些實施例中，RV1 及RV2 係獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。 在一些實施例中，連接子可連接於PBD二聚體藥物部分之不同位點之一，包括B環之N10亞胺、C環之C-2內/外位置或連接A環之繫鏈單元(參見以下結構C(I)及C(II))。 ADC之非限制性例示性PBD二聚體組分包括式C(I)及式C(II)：
Figure 02_image129
C(I)
Figure 02_image131
C(II)。 式C(I)及式C(II)以其N10-C11亞胺形式顯示。例示性PBD藥物部分亦包括甲醇胺及經保護之甲醇胺形式，如下表中所示：
Figure 02_image133
亞胺
Figure 02_image135
甲醇胺
Figure 02_image137
經保護之甲醇胺
其中： X爲CH2 (n = 1至5)、N或O； Z及Z'係獨立地選自OR及NR2 ，其中R爲含有1至5個碳原子之第一、第二或第三烷基鏈； R1 、R'1 、R2 及R'2 係各自獨立地選自H、C1 -C8 烷基、C2 -C8 烯基、C2 -C8 炔基、C5-20 芳基(包括經取代之芳基)、C5-20 雜芳基、-NH2 、-NHMe、-OH及-SH，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子； R3 及R'3 係獨立地選自H、OR、NHR及NR2 ，其中R爲含有1至5個碳原子之第一、第二或第三烷基鏈； R4 及R'4 係獨立地選自H、Me及OMe； R5 係選自C1 -C8 烷基、C2 -C8 烯基、C2 -C8 炔基、C5-20 芳基(包括經鹵基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、雜環基取代之芳基)及C5-20 雜芳基，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子； R11 爲H、C1 -C8 烷基或保護基(諸如乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)、9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或包含諸如纈胺酸-瓜胺酸-PAB之自犧牲單元的部分)； R12 爲H、C1 -C8 烷基或保護基； 其中R1 、R'1 、R2 、R'2 、R5 或R12 之一的氫或A環之間的-OCH2 CH2 (X)n CH2 CH2 O-間隔基的氫經連接於ADC之連接子的鍵置換。 ADC之例示性PBD二聚體部分包括但不限於(波形線指示與連接子之共價連接位點)：
Figure 02_image139
PBD二聚體； 包含PBD二聚體之ADC的非限制性例示性實施例具有以下結構：
Figure 02_image026
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab；
Figure 02_image028
PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab，其中： n爲0至12。在一些實施例中，n爲2至10。在一些實施例中，n爲4至8。在一些實施例中，n係選自4、5、6、7及8。 包含PBD二聚體之另一非限制性例示性ADC可藉由以下方式製造：使單甲基二硫化物N10連接之PBD (顯示如下)與抗體結合：
Figure 02_image142
， 以產生單甲基二硫化物N10連接之PBD抗體-藥物結合物：
Figure 02_image030
。 參見例如PCT公開案第WO 2013/055987號。 PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab及PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab之連接子爲蛋白酶可裂解的，而PBD二聚體-馬來醯亞胺-縮醛之連接子爲酸不穩定的。 PBD二聚體及包含PBD二聚體之ADC可根據此項技術中已知的方法來製備。參見例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598；WO 2013/055987。(5) 蒽環類 在一些實施例中，ADC包含蒽環類。蒽環類爲展現細胞毒性活性之抗生素化合物。儘管不欲受任何特定理論束縛，但研究指示蒽環類可用於藉由許多不同的機制殺死細胞，包括：1) 將藥物分子插入細胞之DNA中，從而抑制DNA依賴性核酸合成；2) 由藥物產生自由基，隨後與細胞大分子反應以便對細胞造成損傷；及/或3) 藥物分子與細胞膜相互作用(參見例如C. Peterson等人, 「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」, Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, 「Free Radical Damage」，同前，第97-102頁)。由於其細胞毒性潜力，蒽環類已用於治療許多癌症，諸如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(參見例如P.H- Wiernik, Anthracycline: Current Status And New Developments第11頁)。 非限制性例示性蒽環類包括多柔比星、表柔比星、伊達比星、道諾黴素、奈莫柔比星及其衍生物。已製備並研究道諾黴素及多柔比星之免疫結合物及前藥(Kratz等人(2006)Current Med. Chem . 13:477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362；Torgov等人(2005)Bioconj. Chem . 16:717-721；Nagy等人(2000)Proc. Natl. Acad. Sci .USA 97:829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532；King等人(2002)J. Med. Chem . 45:4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗體-藥物結合物BR96-多柔比星特異性地與腫瘤相關抗原Lewis-Y反應且已在I期及II期研究中加以評估(Saleh等人(2000)J. Clin. Oncology 18:2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour . 6:78-81；Tolcher等人(1999)J. Clin. Oncology 17:478-484)。 PNU-159682爲奈莫柔比星之有效代謝物(或衍生物) (Quintieri等人, (2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星爲具有多柔比星之糖苷胺基上之2-甲氧基嗎啉基之半合成多柔比星類似物且已在臨床評估中(Grandi等人(1990)Cancer Treat. Rev . 17:133；Ripamonti等人(1992)Brit. J. Cancer 65:703)，包括針對肝細胞癌之II/III期試驗(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448；Quintieri (2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research , 44:第1版, Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour. Clin. Oncology 24:14116)。 包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之非限制性例示性ADC示於式Ia中：
Figure 02_image144
其中R1 爲氫原子、羥基或甲氧基，且R2 爲C1 -C5 烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽； L1 與Z一起爲如本文中所描述之連接子(L)； T爲如本文中所描述之抗體(Ab)；且 m爲1至約20。在一些實施例中，m爲1至10、1至7、1至5或1至4。 在一些實施例中，R1 及R2 均爲甲氧基(-OMe)。 包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之另一非限制性例示性ADC示於式Ib中：
Figure 02_image146
其中R1 爲氫原子、羥基或甲氧基，且R2 爲C1 -C5 烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽； L2 與Z一起爲如本文中所描述之連接子(L)； T爲如本文中所描述之抗體(Ab)；且 m爲1至約20。在一些實施例中，m爲1至10、1至7、1至5或1至4。 在一些實施例中，R1 及R2 均爲甲氧基(-OMe)。 在一些實施例中，含奈莫柔比星之ADC的奈莫柔比星組分爲PNU-159682。在一些此類實施例中，ADC之藥物部分可具有以下結構之一：
Figure 02_image006
；或
Figure 02_image008
； 其中波形線指示與連接子(L)連接。 蒽環類，包括PNU-159682，可經由若干鍵聯位點及多種連接子與抗體結合(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，包括本文中所描述之連接子。 包含奈莫柔比星及連接子之例示性ADC包括但不限於：
Figure 02_image032
PNU-159682馬來醯亞胺縮醛-Ab；
Figure 02_image148
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
Figure 02_image150
PNU-159682-val-cit-PAB-間隔基-Ab；
Figure 02_image152
PNU-159682-val-cit-PAB-間隔基(R1 R2 )-Ab，其中： R1 及R2 係獨立地選自H及C1 -C6 烷基；及
Figure 02_image154
PNU-159682-馬來醯亞胺-Ab。 包含PBD二聚體之另一非限制性例示性ADC可藉由以下方式來製造：使吡啶基二硫化物PNU醯胺(顯示如下)與抗體結合：
Figure 02_image156
， 以產生二硫化物連接之PNU-159682抗體-藥物結合物：
Figure 02_image036
。 PNU-159682馬來醯亞胺縮醛-Ab之連接子爲酸不穩定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-間隔基-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-間隔基(R1 R2 )-Ab之連接子爲蛋白酶可裂解的。(6) 1-( 氯甲基 )-2,3- 二氫 -1H- 苯并 [e] 吲哚 (CBI) 二聚體藥物部分 在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。DNA小溝烷基化劑之5-胺基-1-(氯甲基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚(胺基CBI)類別爲有效的細胞毒素(Atwell等人, (1999) J. Med. Chem., 42:3400)，且已用作針對癌症療法而設計之許多前藥類別中的效應單元。此等包括抗體結合物(Jeffrey等人, (2005) J. Med. Chem., 48:1344)、基於胺基甲酸硝基苯甲酯之用於基因療法之前藥(Hay等人, (2003) J. Med. Chem. 46:2456)及用作低氧活化前藥之相應硝基CBI衍生物(Tercel等人, (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609)。已藉由烷基鏈將CBI及吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯(PBD)藥效團連接在一起(Tercel等人(2003) J. Med. Chem 46:2132-2151)。 在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚體。在一些此種實施例中，該二聚體爲異源二聚體，其中該二聚體之一半爲CBI部分且該二聚體之另一半爲PBD部分。 在一些實施例中，CBI二聚體包含式：
Figure 02_image010
， 其中 R1 係選自H、P(O)3 H2 、C(O)NRa Rb 或與連接子(L)之鍵； R2 係選自H、P(O)3 H2 、C(O)NRa Rb 或與連接子(L)之鍵； Ra 及Rb 係獨立地選自H及視情况經一或多個F取代之C1 -C6 烷基，或Ra 與Rb 形成五員或六員雜環基； T爲選自C3 -C12 伸烷基、Y、(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)、(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)-Y-(C1 -C6 伸烷基)、(C2 -C6 伸烯基)-Y-(C2 -C6 伸烯基)及(C2 -C6 伸炔基)-Y-(C2 -C6 伸炔基)的繫鏈基團； 其中Y係獨立地選自O、S、NR1 、芳基及雜芳基； 其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基係獨立地且視情况經F、OH、O(C1 -C6 烷基)、NH2 、NHCH3 、N(CH3 )2 、OP(O)3 H2 及C1 -C6 烷基取代，其中烷基視情况經一或多個F取代； 或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立地且視情况經與L的鍵取代； D'爲選自以下之藥物部分：
Figure 02_image012
、
Figure 02_image014
及
Figure 02_image016
其中波狀線指示與T的連接位點； X1 及X2 係獨立地選自O及NR3 ，其中R3 係選自H及視情况經一或多個F取代之C1 -C6 烷基； R4 爲H、CO2 R或與連接基團(L)的鍵，其中R爲C1 -C6 烷基或苯甲基；且 R5 爲H或C1 -C6 烷基。 表A之連接子-藥物中間物51至86係藉由根據WO 2015/023355之程序使CBI二聚體或CBI/PBD異源二聚體藥物部分與連接子試劑偶合而製備，該案係以全文引用之方式併入本文中。 表A 連接子-CBI二聚體及CBI/PBD異源二聚體藥物中間物51至86
編號 結構 名稱
51
Figure 02_image158
 2-(2-溴-N-甲基乙醯胺基)乙基(甲基)胺基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5- ((S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)- 2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
52
Figure 02_image160
 8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)- 2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)- 6-側氧基己氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-第三丁酯
53
Figure 02_image162
 N-(€-1-(氯甲基)-3-(5-(€-1-(氯甲基) -5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基) -5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
54
Figure 02_image164
 N-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)己醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基)- 6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
55
Figure 02_image166
 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)- 3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
56
Figure 02_image168
 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)- 3-(6-((S)-7-甲氧基-5-側氧基- 2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)己醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
57
Figure 02_image170
 2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺基)乙基(甲基)胺基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5- ((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
58
Figure 02_image172
 4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)- 2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)- 5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
59
Figure 02_image174
 二氫磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)- 1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6- (2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)- 5-脲基戊醯胺基)苯甲氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
60
Figure 02_image176
 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)- 3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
61
Figure 02_image178
 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基) -5-(膦醯氧基)-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基胺基甲酸2-(咪唑-2-基二硫烷基)乙酯
62
Figure 02_image180
 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基) -5-(膦醯氧基)-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基胺基甲酸2-(咪唑-2-基二硫烷基)丙酯
63
Figure 02_image182
 2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺基)乙基(甲基)胺基甲酸(S)-1-(氯甲基)- 3-(5- ((S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-酯
64
Figure 02_image184
 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基) -5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基) -5-側氧基戊醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基胺基甲酸2-(咪唑-2-基二硫烷基)乙酯
65
Figure 02_image186
 8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-6-側氧基己氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a] [1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11aS)- 4-((S)-6-胺基-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)己醯胺基)苯甲酯
66
Figure 02_image188
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基)-3-側氧基丙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
67
Figure 02_image190
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基) -3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基)-3-側氧基丙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
68
Figure 02_image192
 二氫磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-(€-3- (4-(€-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羥基- 1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)-2-(3-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)丙醯胺基)苯基)丙烯醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
69
Figure 02_image194
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙- 1-烯基)苯基胺基)-3-側氧基丙基)- 6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
70
Figure 02_image196
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-((2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三羥基-四氫-2H-哌喃-2-羧基-6-氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基)-3-側氧基丙基)- 6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
71
Figure 02_image198
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基-N-(3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基)己醯胺
72
Figure 02_image200
 2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)- 3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基甲酸2-(咪唑-2-基二硫烷基)丙酯
72
Figure 02_image202
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚- 3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基)-7-(2-溴-N-甲基乙醯胺基) -N-(3-側氧基丙基)庚醯胺
74
Figure 02_image204
 N-(2-(2,5-雙((S)-1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-3-羰基)-1H-吡咯-1-基)乙基)- 6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
75
Figure 02_image206
 N-(2-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)- 5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)- 1H-吡咯-1-基)乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
76
Figure 02_image208
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)苯基胺基, 2-膦醯氧基)-3-側氧基丙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
77
Figure 02_image210
 N-(3-(2,5-雙(€-3-((S)-1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-側氧基丙-1-烯基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)-6- (2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
78
Figure 02_image212
 二氫磷酸[(1S)-1-(氯甲基)-3-[€-3- [4-[€-3-[(1S)-1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-3-側氧基-丙-1-烯基]-2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基]苯基]丙-2-烯醯基]-1,2-二氫苯并[e]吲哚-5-基]酯
79
Figure 02_image214
 二氫磷酸[(1S)-1-(氯甲基)-3-[€-3- [4-[€-3-[(1S)-1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-3-側氧基-丙-1-烯基]-2-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙氧基]苯基]丙-2-烯醯基]-1,2-二氫苯并[e]吲哚-5-基]酯
80
Figure 02_image216
 N-[1-(氯甲基)-3-[5-[1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]- 5-側氧基-戊醯基]-1,2-二氫苯并[e]吲哚-5-基]胺基甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯
81
Figure 02_image218
 3-[6-[1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯
82
Figure 02_image220
 3-[6-[1-(氯甲基)-5-膦醯氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯
83
Figure 02_image222
 3-[6-[1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c] [1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯
84
Figure 02_image224
 β-D-哌喃葡萄糖醛酸(1S )-1-(氯甲基)-3-((2E )-3-{4-((1E )-3-{(1S )-1-(氯甲基)-5-[(6-甲基-β-D-哌喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氫-3H -苯并[e ]吲哚-3-基}-3-側氧基-1-丙烯基)- 2-[(3-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)己醯基]胺基}丙醯基)胺基]苯基}-2-丙烯醯基)-1,2-二氫-3H -苯并[e ]吲哚-5-基酯甲酯
85
Figure 02_image226
 (11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a] [1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸2-((5-硝基吡啶吡啶-2-基)二硫烷基)丙酯
86
Figure 02_image228
 (11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a] [1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-6-胺基-2-(1-((5-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊基)胺甲醯基)環丁烷-1-甲醯胺基)己醯胺基)苯甲酯
表B之連接子-藥物中間物87及88係根據WO 2013/055987之程序藉由使PBD二聚體藥物部分與連接子試劑偶合來製備，該案以全文引用之方式併入本文中。 表B PBD二聚體藥物中間物87-88
編號 結構 名稱
87
Figure 02_image230
 (11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙酯
88
Figure 02_image232
 (11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酯
表C之連接子-藥物中間物89及90係根據WO 2015/095227之程序藉由使CBI二聚體藥物部分與肽模擬物連接子試劑偶合來製備，該案以全文引用之方式併入本文中。 表C CBI二聚體肽模擬物連接子藥物中間物89-90
編號 結構 名稱
89
Figure 02_image234
 (2,5-雙((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)苯基)胺基甲酸4-((S)-2-(1-((5- (2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊基)胺甲醯基)環丁烷-1-甲醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯
90
Figure 02_image236
 二氫磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-((E)- 3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)- 2-(3-((S)-2-(1-((5-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊基)胺甲醯基)環丁烷-1-甲醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)丙醯胺基)苯基)丙烯醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯
ADC之例示性CBI二聚體部分包括但不限於以下CBI-PBD二聚體(波形線指示與連接子之共價連接位點)：
Figure 02_image018
；
Figure 02_image020
；
Figure 02_image022
；及 以下CBI-CBI二聚體：
Figure 02_image024
。 包含CBI二聚體之ADC的非限制性例示性實施例具有以下結構：
Figure 02_image239
CBI-PBD-二硫化物-Ab；或
Figure 02_image040
CBI-PBD (哌嗪-胺基甲酸酯前藥)-二硫化物-Ab；
Figure 02_image042
CBI-PBD (磷酸鹽)-二硫化物-Ab；及
Figure 02_image044
CBI-CBI (磷酸鹽)-縮醛-馬來醯亞胺-Ab。 可與抗體結合以形成ADC之非限制性例示性CBI-PBD異源二聚體連接子-藥物中間物包括但不限於：
Figure 02_image244
CBI-PBD-2-丙基吡啶基二硫化物83 ；
Figure 02_image246
CBI-PBD (哌嗪-胺基甲酸酯前藥)-2-丙基吡啶基二硫化物81 ；
Figure 02_image248
CBI-PBD-(磷酸鹽)-2-丙基吡啶基二硫化物82 ；
Figure 02_image226
CBI-PBD-(磷酸鹽)-2-丙基硝基吡啶基二硫化物85 ；及
Figure 02_image228
CBI-PBD-(磷酸鹽)-肽模擬物連接子86 。 可與抗體結合以形成ADC之非限制性例示性CBI-CBI同源二聚體連接子-藥物中間物包括但不限於：
Figure 02_image212
CBI-CBI (磷酸鹽)-縮醛-馬來醯亞胺78 ；
Figure 02_image234
CBI-CBI (磷酸鹽)-肽模擬物PAB連接子89 ；及
Figure 02_image236
CBI-CBI (磷酸鹽)-肽模擬物EDA連接子90 。(7) 毒傘肽 在一些實施例中，該免疫結合物包含與一或多個毒傘肽分子結合之抗體。毒傘肽爲由8個胺基酸組成之環肽。其可自毒鵝膏蕈菌分離或藉由合成製備。毒傘肽特異性抑制哺乳動物細胞之DNA依賴性RNA聚合酶II，且從而亦抑制受影響細胞之轉錄及蛋白質生物合成。對細胞中之轉錄之抑制導致生長及增殖停止。參見例如Moldenhauer等人. JNCI 104:1-13 (2012)；WO2010115629、WO2012041504、WO2012119787、WO2014043403、WO2014135282及WO2012119787，該等文獻以全文引用之方式併入在此。在一些實施例中，該一或多個毒傘肽分子爲一或多個α-蠅蕈肽分子。(8) 其他藥物部分 藥物部分亦包括格爾德黴素(Mandler等人(2000)J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)；及酶活性毒素及其片段，包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(得自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、垂序商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林黴素、局限麯菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢菌毒素。參見例如WO 93/21232。 藥物部分亦包括具有核酸水解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶)。 在某些實施例中，免疫結合物可包含放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性結合抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，當免疫結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如Tc99 或I123 ，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱爲磁共振成象，MRI)之自旋標記物，諸如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且與抗體結合，例如，用於PET成像(WO 2011/056983)。 放射性標記或其他標記可用已知方式併入免疫結合物中。舉例而言，可使用包含例如一或多個氟-19原子替代一或多個氫之適合胺基酸前驅物來生物合成或化學合成肽。在一些實施例中，可經由抗體中之半胱胺酸殘基連接諸如Tc99 、I123 、Re186 、Re188 及In111 之標記。在一些實施例中，可經由抗體之離胺酸殘基連接釔-90。在一些實施例中，可使用IODOGEN法(Fraker等人(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)來併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」 (Chatal, CRC Press 1989)描述某些其他方法。 在某些實施例中，免疫結合物可包含與前藥活化酶結合之抗體。在一些此種實施例中，前藥活化酶將前藥(例如，肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化成活性藥物，諸如抗癌藥物。在一些實施例中，此種免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)。可與抗體結合之酶包括但不限於鹼性磷酸酯酶，其適用於將含磷酸酯之前藥轉化成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯之前藥轉化成游離藥物；胞嘧啶脫胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及組織蛋白酶L)，其適用於將含肽前藥轉化成游離藥物；D-丙胺醯羧基肽酶，其適用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；糖裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺酸脢，其適用於將糖基化前藥轉化成游離藥物；β-內醯胺酶，其適用於將經β-內醯胺衍生化之藥物轉化成游離藥物；及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將在其胺氮處分別經苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生化之藥物轉化成游離藥物。在一些實施例中，可藉由此項技術中熟知的重組DNA技術使酶與抗體共價結合。參見例如Neuberger等人,Nature 312:604-608 (1984)。c) 藥物負載 藥物負載由式I之分子中每抗體之藥物部分平均數p表示。藥物負載可在每抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。式I之ADC包括與一定範圍之藥物部分(1至20個)結合的抗體之集合。得自結合反應之ADC製劑中每抗體之藥物部分平均數可藉由習知方法加以表徵，諸如質譜法、ELISA分析法及HPLC。亦可測定p表示之ADC定量分布。在一些情况下，分離、純化及表徵p爲某一值之均質ADC與具有其他藥物負載之ADC可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段來達成。 對於一些抗體-藥物結合物，p可受抗體上之連接位點數目限制。舉例而言，當連接爲如以上某些例示性實施例中之半胱胺酸硫醇時，抗體可具有僅一個或若干個半胱胺酸硫醇基，或可具有僅一個或若干個具有足够反應性之可連接連接子之硫醇基。在某些實施例中，較高藥物負載(例如p＞5)可導致某些抗體-藥物結合物聚集、不溶解、毒性或細胞滲透性損失。在某些實施例中，ADC之平均藥物負載在1至約8；約2至約6；或約3至約5之範圍內。實際上，已顯示對於某些ADC，藥物部分/抗體之最佳比率可小於8，且可爲約2至約5 (US 7498298)。 在某些實施例中，少於理論最大值之藥物部分在結合反應期間與抗體結合。抗體可含有例如不與以下所論述之藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基。一般而言，抗體不含許多可連接於藥物部分之游離且具反應性之半胱胺酸硫醇基；實際上，抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋形式存在。在某些實施例中，可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑在部分或完全還原性條件下還原抗體以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經受變性條件以顯示反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。 ADC之負載(藥物/抗體比)可用不同方式加以控制，且例如藉由：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；及(iii)用於半胱胺酸硫醇修飾之部分或限制性還原性條件。 應理解。在多於一個親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之情况下，則所得產物爲具有一或多個藥物部分連接於抗體之分布的ADC化合物的混合物。每個抗體之藥物平均數可藉由對抗體具有特異性且對藥物具有特異性之雙重ELISA抗體分析法由混合物計算得到。可藉由質譜法鑒別混合物中之個別ADC分子且藉由HPLC加以分離，例如疏水性相互作用層析法(參見例如McDonagh等人(2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307；Hamblett等人(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Hamblett, K.J.等人, 「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, 摘要編號624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月；Alley, S.C.等人, 「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」, 摘要編號627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析法分離具有單一負載值之均質ADC與結合混合物。d) 某些製備免疫結合物之方法 可采用熟習此項技術者已知的有機化學反應、條件及試劑，藉由若干途徑製備式I之ADC，包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，隨後與抗體之親核基團反應。經由後一種途徑製備式I之ADC的例示性方法描述於US 7498298中，該專利係以引用的方式明確併入本文中。 抗體上之親核基團包括但不限於：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫醇基及羥基具有親核性且能够與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵，包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可經由用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑進行處理，使得抗體經完全或部分還原而使抗體具有反應性以便與連接子試劑結合。各半胱胺酸橋因而將在理論上形成兩個反應性硫醇親核體。其他親核基團可藉由修飾離胺酸殘基，例如藉由使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(特勞特氏試劑(Traut' s reagent))反應，從而使胺轉化成硫醇而引入抗體中。反應性硫醇基亦可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基而引入抗體中(例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)。 本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由抗體上之親電子基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核基團之間的反應來產生。連接子試劑上之適用親核基團包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能够與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應的親電子部分。在另一實施例中，糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基團。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵聯，或可例如由硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵聯。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可在抗體中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基(醒及酮) (Hermanson, Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或酥胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應，從而在第一胺基酸處產生醛(Geoghegan及Stroh, (1992)Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。可使此種醛與藥物部分或連接子親核體反應。 藥物部分上之例示性親核基團包括但不限於：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，其能够與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵，包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。。 可用於製備ADC之非限制性例示性交聯試劑描述於本文中標題爲「例示性連接子」之部分中。使用此種交聯試劑來連接兩個部分(包括蛋白質部分及化學部分)之方法在此項技術中爲已知的。在一些實施例中，可例如藉由重組技術或肽合成來製備包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分之區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不會破壞結合物之所要性質之連接子肽的區域隔開。 在另一實施例中，抗體可與「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於腫瘤預靶向，其中向患者投與抗體-受體結合物，繼而使用清除劑自循環中移除未結合之結合物，且隨後投與與細胞毒性劑(例如藥物或放射性核苷酸)結合之「配位體」(例如親和素)。E ． 曲妥珠單抗 -MCC-DM1 及帕妥珠單抗 曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1) 本發明包括用抗體藥物結合物曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1，亦稱爲曲妥珠單抗安坦辛) (CAS登記號139504-50-0)進行治療性治療，該抗體藥物結合物具有以下結構：
Figure 02_image255
其中Tr爲經由連接子部分MCC連接於類美登素藥物部分DM1之曲妥珠單抗(US 5208020；US 6441163)。藥物對抗體比或藥物負載由以上曲妥珠單抗-MCC-DM1結構中之p表示，且爲1至約8範圍內之整數值。曲妥珠單抗-MCC-DM1包括具有不同負載及連接之抗體-藥物結合物的所有混合物，其中1、2、3、4、5、6、7及8個藥物部分共價連接於抗體曲妥珠單抗(US 7097840；US 8337856；US 2005/0276812；US 2005/0166993)。 曲妥珠單抗可藉由哺乳動物細胞(中國倉鼠卵巢，CHO)懸浮液培養而產生。HER2 (或c-erbB2)原癌基因編碼在結構上與表皮生長因子受體有關之185 kDa跨膜受體蛋白。曲妥珠單抗爲具有或來源於鼠類4D5抗體(ATCC CRL 10463，1990年5月24日根據布達佩斯條約寄存於美國菌種保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Md. 20852))之抗原結合殘基的抗體。例示性人類化4D5抗體包括如US 5821337中之huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7及huMAb4D5-8 (曲妥珠單抗，HERCEPTIN®)。在一些實施例中，T-DM1之抗體部分包含分別示於SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:29中之輕鏈及重鏈胺基酸序列。 曲妥珠單抗-MCC-DM1可根據例如美國申請公開案第20110165155號之實例1來製備。 作爲一般建議，每劑量所投與之初始醫藥學上有效量之曲妥珠單抗-MCC-DM1將在約0.3至15 mg/kg患者體重/天之範圍內。 市售T-DM1調配物(KADCYLA®，ado-曲妥珠單抗安坦辛)爲處於單次使用小瓶中之無菌白色至灰白色無防腐劑凍乾粉末。各小瓶含有100 mg或160 mg ado-曲妥珠單抗安坦辛。在復原後，各單次使用小瓶含有ado-曲妥珠單抗安坦辛(20 mg/mL)、聚山梨醇酯20 [0.02% (w/v)]、琥珀酸鈉(10 mM)及蔗糖[6% (w/v)]，pH值爲5.0且密度爲1.026 g/mL。含有20 mg/mL ado-曲妥珠單抗安坦辛之所得溶液在稀釋後藉由靜脈內輸注來投與。在一些實施例中，ado-曲妥珠單抗安坦辛每三週以3.6 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，ado-曲妥珠單抗安坦辛每週以2.4 mg/kg之劑量投與。 帕妥珠單抗組合物 帕妥珠單抗組合物包含如上文所定義之主要種類帕妥珠單抗抗體與其一或多種變異體之混合物。本文中帕妥珠單抗主要種類抗體之較佳實施例爲包含SEQ ID NO:32之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO : 31之重鏈胺基酸序列(包括此等序列之脫醯胺基及/或氧化變異體)的抗體。在一些實施例中，該組合物包含主要種類帕妥珠單抗抗體與其包含胺基末端前導序列延伸之胺基酸序列變異體的混合物，例如包含SEQ ID NO:34之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:33之重鏈胺基酸序列。胺基末端前導序列延伸較佳在抗體變異體之輕鏈上(例如在抗體變異體之一或兩個輕鏈上)。主要種類HER2抗體或抗體變異體可爲全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 片段之Fab)，但較佳均爲全長抗體。本文中之抗體變異體可包含處在其重鏈或輕鏈中之任何一或多個上的胺基末端前導序列延伸。胺基末端前導序列延伸較佳在抗體之一或兩個輕鏈上。胺基末端前導序列延伸較佳包含VHS--或由其組成。組合物中胺基末端前導序列延伸之存在可藉由各種分析技術加以偵測，包括但不限於N末端序列分析、電荷異質性分析法(例如，陽離子交換層析或毛細管區電泳)、質譜等。組合物中之抗體變異體之量一般在構成用於偵測變異體之任何分析(較佳N末端序列分析)之偵測極限的量至小於主要種類抗體之量的量的範圍內。一般而言，組合物中約20%或更少(例如約1%至約15%，例如5%至約15%)之抗體分子包含胺基末端前導序列延伸。此種百分比量較佳使用定量N末端序列分析或陽離子交換分析(較佳使用高解析度弱陽離子交換管柱，諸如PROPAC WCX-10™陽離子交換管柱)來測定。除胺基末端前導序列延伸變異體以外，亦涵蓋主要種類抗體及/或變異體之其他胺基酸序列改變，包括但不限於在其一個或兩個重鏈上包含C末端離胺酸殘基之抗體、抗體變異體等。 此外，主要種類抗體或變異體可進一步包含糖基化變異，其非限制性實例包括包含連接於其Fc區之G1或G2寡糖結構之抗體、包含連接於其輕鏈之碳水化物部分(例如，連接於抗體之一或兩個輕鏈，例如連接於一或多個離胺酸殘基之一或兩個碳水化合物部分，諸如葡萄糖或半乳糖)之抗體、包含一或兩個未糖基化重鏈之抗體或包含連接於其一或兩個重鏈之唾液酸化寡糖之抗體等。 該組合物可自經基因工程改造之細胞系，例如表現HER2抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系回收，或可藉由肽合成來製備。 關於例示性帕妥珠單抗組合物之更多資訊，參見美國專利第7,560,111號及第7,879,325號以及US 2009/0202546A1。 市售帕妥珠單抗(PERJETA®)調配物含有呈無防腐劑溶液形式之帕妥珠單抗420 mg/14 mL (30 mg/mL)以用於經靜脈內輸注。在一些實施例中，帕妥珠單抗療法包含投與840 mg之初始負載劑量，繼而投與每三週420 mg之無波動維持劑量。F ． 用於診斷及偵測之方法及組合物 在某些實施例中，本文中所提供之任何抗HER2抗體均適用於偵測生物樣品中之HER2之存在。如本文中所使用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物樣品」包含例如細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或潜在癌性乳房組織)。 在一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法之抗HER2抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中之HER2之存在的方法。在某些實施例中，該方法包括使該生物樣品與如本文中所描述之抗HER2抗體在允許該抗HER2抗體與HER2結合之條件下接觸，及偵測該抗HER2抗體與該生物樣品中之HER2之間是否形成複合物。此種方法可爲體外或體內方法。在一個實施例中，使用抗HER2抗體來選擇適宜抗HER2抗體療法之個體，例如，在HER2爲用於選擇患者之生物標記物時。在另一實施例中，生物樣品爲細胞或組織。 在另一實施例中，抗HER2抗體用於體內偵測(例如藉由體內成像)個體之HER2陽性癌症，例如，出於對癌症進行診斷、預測或分期之目的，從而確定適當治療過程或監測癌症對療法之反應。此項技術中已知的一種體內偵測方法爲免疫正電子發射斷層掃描術(免疫PET)，如例如van Dongen等人,The Oncologist 12:1379-1389 (2007)及Verel等人,J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)中所描述。在此種實施例中，提供用於偵測個體之HER2陽性癌症之方法，該方法包括向患有或疑似患有HER2陽性癌症之個體投與經標記之抗HER2抗體，及在該個體中偵測該經標記之抗HER2抗體，其中該經標記之抗HER2抗體之偵測指示該個體中之HER2陽性癌症。在某些此種實施例中，該經標記之抗HER2抗體包含與諸如68 Ga、18 F、64 Cu、86 Y、76 Br、89 Zr及124 I之正電子發射體結合之抗HER2抗體。在一特定實施例中，該正電子發射體爲89 Zr。 在其他實施例中，診斷或偵測方法包括使固定於受質之第一抗HER2抗體與欲測試HER2之存在之生物樣品接觸，使該受質暴露於第二抗HER2抗體，及偵測該第二抗HER2是否與該第一抗HER2抗體與該生物樣品中之HER2之間的複合物結合。受質可爲任何支撑介質，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合物珠粒、載物片、晶片及其他受質。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施例中，該第一或第二抗HER2抗體爲本文中所描述之任何抗體。 可根據任何以上實施例診斷或偵測之例示性病症包括HER2陽性癌症，諸如HER2陽性乳癌及HER2陽性胃癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症具有2+或3+之免疫組織化學(IHC)評分及/或≥2.0之原位雜交(ISH)擴增比。 在某些實施例中，提供經標記之抗HER2抗體。標記包括但不限於可直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子密集標記、化學發光標記及放射性標記)，以及例如藉由酶反應或分子間相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。例示性標記包括但不限於放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I、螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、傘形酮、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、與采用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶合之雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、生物素/親和素、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基等。在另一實施例中，標記爲正電子發射體。正電子發射體包括但不限於68 Ga、18 F、64 Cu、86 Y、76 Br、89 Zr及124 I。在一特定實施例中，正電子發射體爲89 Zr。G ． 醫藥調配物 如本文中所描述之抗HER2抗體或免疫結合物之醫藥調配物係藉由將具有所要純度程度之此種抗體或免疫結合物與一或多種視情况選用之醫藥學上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性-活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX® ，Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶組合。 例示性凍乾抗體或免疫結合物調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體或免疫結合物調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所描述者，後一種調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。 本文中之調配物亦可含有多於一種如所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳爲具有對彼此無不利影響之互補活性的活性成分。 活性成分可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊中，例如分別於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此種技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編(1980)中。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體或免疫結合物之固體疏水性聚合物之半透性基質，該基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。 用於體內投與之調配物一般爲無菌的。滅菌可例如藉由經無菌過濾膜進行過濾而容易地實現。H ． 治療方法及組合物 本文中所提供之任何抗HER2抗體或免疫結合物均可用於例如治療方法之方法中。 在一個態樣中，本文中所提供之抗HER2抗體或免疫結合物用於抑制HER2陽性細胞增殖之方法中，該方法包括在允許該抗HER2抗體或免疫結合物與該細胞表面上之HER2結合之條件下使該細胞暴露於該抗HER2抗體或免疫結合物，從而抑制該細胞增殖。在某些實施例中，該方法爲體外或體內方法。在其他實施例中，該細胞爲乳癌細胞或胃癌細胞。 可使用可購自Promega (Madison, WI)之CellTiter-Glo™發光細胞活力分析法來分析體外細胞增殖抑制。該分析法基於對所存在之ATP的定量來確定培養物中之活細胞數，ATP爲代謝活性細胞之指標。參見Crouch等人(1993)J. Immunol. Meth. 160:81-88；美國專利第6602677號。該分析法可按96或384孔格式進行，使其適於自動高通量篩選(HTS)。參見Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。分析程序涉及向所培養之細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo® 試劑)。由此導致細胞溶解及產生由螢光素酶反應所產生之發光信號。發光信號與所存在之ATP的量成比例，所存在之ATP的量與培養物中所存在之活細胞數成正比。可藉由光度計或CCD攝影機成像裝置記錄數據。發光輸出表示爲相對光單位(RLU)。 在另一態樣中，提供一種用作藥劑的抗HER2抗體或免疫結合物。在其他態樣中，提供一種用於治療方法中之抗HER2抗體或免疫結合物。在某些實施例中，提供一種用於治療HER2陽性癌症之抗HER2抗體或免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有HER2陽性癌症之個體的方法中的抗HER2抗體或免疫結合物，該方法包括向該個體投與有效量之該抗HER2抗體或免疫結合物。在一個此種實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如，如以下所描述。 在另一態樣中，本發明提供抗HER2抗體或免疫結合物用於製造或製備藥劑之用途。在一個實施例中，該藥劑用於治療HER2陽性癌症。在另一實施例中，該藥劑用於治療HER2陽性癌症之方法中，該方法包括向患有HER2陽性癌症之個體投與有效量之該藥劑。在一個此種實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如，如以下所描述。 在另一態樣中，本發明提供一種用於治療HER2陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包括向患有此種HER2陽性癌症之個體投與有效量之抗HER2抗體或免疫結合物。在一個此種實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如以下所描述。 根據任何以上實施例之HER2陽性癌症可爲例如HER2陽性乳癌或HER2陽性胃癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症具有2+或3+之免疫組織化學(IHC)評分及/或≥2.0之原位雜交(ISH)擴增比。 根據任何以上實施例之「個人」、「患者」或「個體」可爲人類。 在另一態樣中，本發明提供包含本文中所提供之任何抗HER2抗體或免疫結合物的醫藥調配物，例如，以用於任何以上治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文中所提供之任何抗HER2抗體或免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文中所提供之任何抗HER2抗體或免疫結合物及至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。 本發明之抗體或免疫結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗體或免疫結合物(例如，hu7C2.v.2.2.LA抗體-藥物結合物(hu7C2 ADC))可與至少一種額外治療劑共同投與。在一些實施例中，該額外治療劑亦爲結合HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合HER2之結構域II的抗體或免疫結合物及/或(ii)結合結構域IV或HER2之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，該額外治療劑爲(i)結合抗原决定基2C4之抗體或免疫結合物及/或(ii)結合抗原决定基4D5之抗體或免疫結合物。 在一些實施例中，hu7C2.v.2.2.LA抗體-藥物結合物(hu7C2 ADC)與選自曲妥珠單抗(Herceptin®)、T-DM1 (Kadcyla®)及帕妥珠單抗(Perjeta®)之一或多種額外治療劑共同投與。在一些實施例中，hu7C2 ADC與曲妥珠單抗共同投與。在一些實施例中，hu7C2 ADC與T-DM1共同投與。在一些實施例中，hu7C2 ADC與帕妥珠單抗共同投與。在一些實施例中，hu7C2 ADC與曲妥珠單抗及帕妥珠單抗共同投與。在一些實施例中，hu7C2 ADC與T-DM1及帕妥珠單抗共同投與。 以上所指出之此種組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或獨立之調配物中)及獨立投與，在此情况下，投與本發明之抗體或免疫結合物可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。 本發明之抗體或免疫結合物(及任何額外治療劑)可藉由任何適合之方法投與，包括非經腸、肺內及鼻內及需要用於局部治療時經病變內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。投配可藉由任何適合之途徑，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分視投與是短暫的或是長期的而定。本文中涵蓋不同的投配時程，包括但不限於在不同的時間點單次或多次投與、推注投與及脈衝式輸注。 本發明之抗體或免疫結合物將以符合良好醫學實務之方式經調配、投配及投與。此情形下之考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之原因、藥劑之遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知的其他因素。該抗體或免疫結合物不必而是視情况與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此種其他藥劑之有效量視調配物中所存在之抗體或免疫結合物之量、病症或治療類型及以上所論述之其他因素而定。此等一般用與本文中所描述相同之劑量及投與途徑，或以本文中所描述劑量之約1%至99%，或以經驗上/臨床上確定適當之任何劑量及任何途徑來使用。 對於預防或治療疾病，本發明之抗體或免疫結合物(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視欲治療疾病之類型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體或免疫結合物是出於預防目的或是治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體或免疫結合物之反應及主治醫師之判斷。抗體或免疫結合物適合一次或經一系列治療投與患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體或免疫結合物可爲投與患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次獨立投與或是藉由連續輸注。視以上所提及之因素而定，一種典型每日劑量可在約1 µg/kg至100 mg/kg或更多的範圍內。對於經若干天或更長時間重複投與，視病狀而定，治療一般將持續直至出現所要疾病症狀抑制。抗體或免疫結合物之一個例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因而，可向患者投與一或多個約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg之劑量(或其任何組合)。此種劑量可間歇性地投與，例如每週或每三週(例如，使得患者接受約二至約二十個，或例如約六個劑量之抗體)。可依序投與初始較高負載劑量及一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可能適用。此療法之進展易於藉由習知技術及分析法進行監測。 應理解，任何以上調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物與抗HER2抗體兩者來進行。I ． 製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於本文中之治療方法的hu7C2.v.2.2.LA抗體-藥物結合物(hu7C2 ADC)及曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或帕妥珠單抗的製品或「套組」。在一些實施例中，該套組包括包含hu7C2 ADC之容器。在一些實施例中，該套組進一步包括包含曲妥珠單抗-MCC-DM1之容器。在一些實施例中，該套組進一步包括包含帕妥珠單抗之容器。在一些實施例中，該套組進一步包括包含曲妥珠單抗-MCC-DM1之容器及包含帕妥珠單抗之容器。在一些實施例中，該套組在同一容器中包含hu7C2 ADC、曲妥珠單抗-MCC-DM1及帕妥珠單抗中之兩種或更多種。該套組可進一步包括在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。術語「包裝插頁」係用於指照例包括在治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此種治療產品相關之適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或警告的資訊。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包裝等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器可容納對本文中之治療方法有效之hu7C2 ADC及視情况存在之曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或帕妥珠單抗或其調配物，且可具有無菌接取口(例如，容器可爲具有可藉由皮下注射針刺穿之栓塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。該標籤或包裝插頁指示組合物用於如本文中所描述及主張之治療方法。該製品亦可含有另一容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點看來理想之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 該套組可進一步包括關於投與hu7C2 ADC及視情况存在之曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或帕妥珠單抗之指導。舉例而言，若該套組包含有包含hu7C2 ADC及第二醫藥調配物之第一組合物，則該套組可進一步包括關於向需要其之患者同時、相繼或獨立投與該第一醫藥組合物及第二醫藥組合物之指導。 在另一實施例中，該等套組適用於遞送hu7C2 ADC及視情况存在之曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或帕妥珠單抗之固體經口形式，諸如錠劑或膠囊。此種套組較佳包括許多單位劑量。此種套組可包括具有按其預定用途之順序標定之劑量的卡。此種套組之實例爲「泡罩包裝」。泡罩包裝在包裝行業中爲熟知的且廣泛用於包裝醫藥單位劑型。需要時，可提供記憶輔助，例如呈數字、字母或其他標記形式或具有日曆插頁，從而指定治療時程中可投與劑量之日。 根據一個實施例，套組可包含(a)含hu7C2 ADC之第一容器及視情况存在之(b)其中含有曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或其中含有帕妥珠單抗之第二容器。在一些實施例中，套組可包含(a)含hu7C2 ADC之第一容器、(b)其中含有曲妥珠單抗-MCC-DM1之第二容器及(c)其中含有帕妥珠單抗之第三容器。在一些實施例中，該套組可進一步包括包含諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液之醫藥學上可接受之緩衝液的容器。其可進一步包括自商業及使用者觀點看來理想之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 在套組包含hu7C2 ADC及曲妥珠單抗-MCC-DM1及/或帕妥珠單抗之組合物時，該套組可包括諸如分隔瓶或分隔箔封包之用於容納個別組合物之容器，然而，個別組合物亦可容納於單一未分隔容器中。典型地，該套組包括關於投與個別組分之指導。當個別組分較佳以不同的劑型(例如經口及非經腸)投與時、以不同的劑量間隔投與時或當處方醫師需要滴定組合之個別組分時，套組形式尤其有利。 本文中之製品的一個實施例包括適用於投與癌症患者之含有hu7C2 ADC與帕妥珠單抗及/或T-DM1之穩定混合物的靜脈內(IV)袋。該混合物視情况呈生理鹽水溶液形式；例如包含約0.9% NaCl或約0.45% NaCl。例示性IV袋爲聚烯烴或聚氯乙烯輸注袋，例如250 mL IV袋。根據本發明之一些實施例，該混合物包括約420 mg或約840 mg帕妥珠單抗及約100 mg至約160 mg T-DM1。 視情况，IV袋中之混合物在5℃或30℃下穩定達24小時。可藉由一或多種選自以下之分析法評估混合物之穩定性：色彩、外觀及透明度(CAC)、濃度及混濁度分析、微粒分析、空間排阻層析(SEC)、離子交換層析(IEC)、毛細管區電泳(CZE)、影像毛細管等電聚焦(iCIEF)及效力分析。III. 實例 以下爲本發明之方法及組合物之實例。應理解，鑒於以上所提供之一般性描述，可實施各種其他實施例。實例 1 ：鼠類抗體 7C2 之人類化 抗HER2鼠類抗體7C2結合HER2結構域I中之抗原决定基。參見例如PCT公開案第WO 98/17797號。此抗原决定基與曲妥珠單抗所結合之結合HER2結構域IV之抗原决定基及帕妥珠單抗所結合之結合HER2結構域II之抗原决定基不同。參見圖3、圖16及圖18。藉由結合結構域IV，曲妥珠單抗使與配位體無關之HER2-HER3複合物分裂，從而抑制下游信號傳導(例如例如，PI3K/AKT)。相反，結合結構域II之帕妥珠單抗防止配位體驅動HER2與其他HER家族成員(例如HER3、HER1或HER4)相互作用，因而亦防止下游信號轉導。MAb 7C2與結構域I結合不干擾曲妥珠單抗或帕妥珠單抗分別結合結構域IV及II，從而可能組合MAb 7C2 ADC與曲妥珠單抗、曲妥珠單抗安坦辛(T-DM-1)及/或帕妥珠單抗。 如下對鼠類抗體7C2 (7C2.B9，參見PCT申請案第WO 98/17797號)進行人類化。A. 材料及方法 殘基編號係根據Kabat (Kabat等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。移植於受體人類一致架構上之直接高變區移植物。 7C2人類化期間構築之變異體以IgG形式經評估。將來自小鼠7C2之VL及VH結構域與人類VLκIV (VLKIV )及人類VH亞組I (VHI )一致序列對準。將來自小鼠7C2 (7C2.B9)抗體之高變區工程改造於VLKIV 及VHI 受體架構中以產生CDR移植變異體。自mu7C2 VL結構域將位置24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)移植於VLKI 中。自mu7C2 VH結構域將位置26-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)移植於VHI 中(圖1及圖2)。HVR定義由其序列高變性(Wu, T. T.及Kabat, E. A. (1970))、其結構位置(Chothia, C.及Lesk, A. M. (1987))及其參與抗原-抗體接觸(MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))定義。爲了評估可能重要之架構游標位置，使所選游標位置突變回鼠類序列。該等游標位置包括VL中之位置4及49以及VH中之位置37、67、69、71及73。合成VL序列及VH序列之三種不同的型式(Blue Heron，Bothell，WA)，且隨後次選殖於哺乳動物表現載體中。藉由組合LC與HC之不同型式，產生總計九種不同的hu7C2移植變異體(v1.1、v1.2、v1.3、v2.1、v2.2、v2.3、v3.1、v3.2及v3.3)。親和力成熟庫。 使用具有2個在單一phoA啓動子控制下之開放閱讀框的單價Fab-g3呈現噬菌粒載體。第一開放閱讀框由與受體輕鏈VL及CH1結構域融合之stII信號序列組成，且第二開放閱讀框由與受體重鏈VH及CH1結構域融合之stII信號序列及隨後之次要噬菌體殼蛋白P3組成。藉由Kunkel突變誘發，使用針對各高變區之個別寡核苷酸產生HVR移植變異體(7C2.v2.1)且作爲Fab呈現於噬菌體上。 爲了改良親和力，產生含有各高變區中之變化的噬菌體庫。使用Kunkel突變誘發在7C2.v2.1高變區中之各位置上單獨引入序列多樣性。使用編碼NNS之寡核苷酸使7C2.v2.1高變區中之各位置每次一個完全隨機化成所有可能之20個胺基酸。產生總計68個庫，各庫由20個成員組成，其中位於7C2高變區之一內的單一位置完全隨機化。彙集同一高變區中具有多個位置之庫以產生總計六個庫。噬菌體庫之產生。 使設計用以向如上文所陳述之各高變區中引入多樣性之寡核苷酸在37℃下在含有660 ng寡核苷酸、50 mM Tris pH 7.5、10 mM MgCl2 、1 mM ATP、20 mM DTT及5 U聚核苷酸激酶之20 µl反應物中各別地磷酸化1 h。 爲了產生親和力成熟庫，在96孔PCR板中進行68次個別Kunkel突變誘發反應。自磷酸化寡核苷酸反應(以上)將2 µl添加至含500 ng Kunkel模板之50 mM Tris pH 7.5、10 mM MgCl2 中，最終體積爲25 µl。使混合物在90℃下退火1 min、在50℃下退火3 min，且隨後在冰上冷却。隨後藉由在室溫下經2 h添加總體積爲30 µl之0.5 µl 10 mM ATP、0.5 µl 10 mM dNTP (dATP、dCTP、dGTP及dTTP各10 mM)、1 µl 100 mM DTT、1 µl 10×TM緩衝液(0.5 M Tris pH 7.5、0.1 M MgCl2 )、80 U T4連接酶及4 U T7聚合酶來填充經退火之模板。隨後將此等經填充且經結扎之產物各自轉化於XL1-藍細胞中。彙集在同一CDR區中含有多個位置之庫且在37℃下經1小時回收於10 ml SOC培養基中。添加羧苄青黴素(50 μg/ml)及M13/KO7輔助噬菌體(MOI 10)。在37℃下將培養物再培育30 min且轉移至含50 µg/ml羧苄青黴素及50 µg/ml卡那黴素之500 ml 2YT中，並且在37℃下生長20 h。噬菌體選擇。 使用NHS-PEG4-生物素(Pierce)藉由游離胺對Her2細胞外域(Her2 ECD)進行生物素標記。對於生物素標記反應，使用含4倍莫耳過量生物素試劑之PBS。反應後在PBS中進行透滲析。 細胞培養物上清液中收集噬菌體且懸浮於含1% BSA之PBS中。在室溫下將噬菌體庫與經生物素標記之Her2 ECD一起培育，且隨後在4℃下在已於PBS中固定於MaxiSorp微量滴定板(Nunc)上隔夜之neutrAvidin (10 µg/ml)上俘獲與生物素-Her2結合之噬菌體5 min。用含0.05% Tween 20之PBS (PBST)充分洗滌微量滴定板，且藉由將各孔與20 mM HCl、500 mM KCl一起培育30 min來溶離已結合之噬菌體。用1 M Tris pH 7.5中和所溶離之噬菌體且使用XL1-藍細胞及M13/KO7輔助噬菌體進行擴增，並且在37℃下在2YT、50 µg/ml羧苄青黴素及50 µg/ml卡那黴素中生長隔夜。將自含靶標之孔中溶離之噬菌體之滴定度與自不含靶標之孔中回收之噬菌體之滴定度相比較以評估增濃。藉由降低經生物素標記之Her2 ECD在結合期間之濃度(自5 nM至0.2 nM)及用1 μM未經標記之Her2 ECD溶液增加競爭時間(自0至60 min，在室溫下)來增加選擇嚴格度。變異體之表面電漿子共振評估。 藉由293瞬時轉染將7C2變異體表現爲IgG。用蛋白G親和層析法純化IgG。使用BIAcoreT100，藉由表面電漿子共振測定各7C2 IgG變異體對Her2之親和力。Biacore S系列CM5感測器晶片固定有單株小鼠抗人類IgG (Fc)抗體(人類抗體俘獲套組，GE Healthcare)。以30 µl/min之流速注入各7C2變異體之連續3倍稀釋。利用3分鐘締合及10分鐘解離來分析各樣品。在各注入步驟之後，使用3 M MgCl2 再生晶片。藉由自俘獲處在類似密度下之無關IgG之流動細胞減去RU來修正結合反應。使用同時擬合kon 及koff 之1:1朗繆爾模型進行動力學分析。B. 結果及論述 7C2 之人類化。 用於7C2人類化之人類受體架構係基於人類VLκIV一致序列(VLKIV )及人類VHI 一致序列。將鼠類7C2之VL及VH結構域與人類VLKIV 及VHI 結構域對準；鑒別高變區且移植於人類受體架構中以產生7C2.v1.1。7C2.v1.1之單價親和力相對於mu7C2.B9降低2.5倍，如藉由SPR所評估(參見表2)。 表2：7C2 CDR移植抗體之親和力
      VL
   KD (nM) K4 K4.K49 K4.L4.K49
VH VH1 v1.1 (20 nM) v2.1 (16 nM) v3.1 (15 nM)
VH1.V71 v1.2 (13 nM) v2.2 (11 nM) v3.2 (10 nM)
VH1.L37.A67.L69.V71.K73 v1.3 (11 nM) v2.3 (10 nM) v3.3 (9 nM)
爲了改良7C2.v1.1之結合親和力，將輕鏈中之位置4及49以及重鏈中之位置37、67、69、71及73改變爲在mu7C2.B9中之此等位置上所發現之殘基。將此等經改變之輕鏈及重鏈與來自7C2.v1.1之鏈的組合轉染於293細胞中，表現爲IgG且加以純化，且藉由SPR評估與Her2 ECD之結合(參見表2)。輕鏈中含有2個經改變之位置且重鏈中含有5個經改變之位置的變異體7C2.v3.3具有與嵌合mu7C2.B9相當之單價親和力(參見表2)。 探測親和力成熟庫以企圖使用輕鏈中含有最低限度經改變之游標位置(Y49K)的7C2.v2.1的架構來募集進一步改良。對於各高變區，使用Kunkle突變誘發將所有20個胺基酸各別地引入個別位置(總計68個各自含有20個成員之庫彙集於六個親和力成熟庫中)。在含經生物素標記之Her2 ECD之溶液中將該六個親和力成熟庫淘選4輪。藉由降低經生物素標記之Her2 ECD之濃度(自5 nM至0.2 nM)及用飽和量之未經標記Her2 ECD增加競爭時間(自0至1小時，在室溫下)來逐漸增加選擇嚴格度。對於H2庫，觀測到兩千倍噬菌體增濃。 揀選來自最後一輪之總計588個純系用於DNA序列分析。鑒別各HVR中之個別序列變化(參見表3)。最豐富之純系在VH中之位置S53上變成Met或Leu。將S53M及S53L變異體表現爲IgG且SPR分析指示S53M及S53L對Her2具有相當之親和力。選擇S53L變異體，此係因爲甲硫胺酸在製造過程中易於氧化之故。利用S55A突變消除HVR-H2中之潜在異天冬胺酸形成位點(參見表4)。 表3：親和力改良之變異體的動力學性質
變異體 HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
v2.1 GYWMN (SEQ ID NO: 15) MIHPSDSEIRANQKFRD (SEQ ID NO: 8) GTYDGGFEY (SEQ ID NO: 17) 2.6E+05 4.1E-03 15.5
v2.1.S53M    MIHPMDSEIRANQKFRD (SEQ ID NO: 20)    2.7E+05 6.7E-04 2.4
v2.1.S53L    MIHPLDSEIRANQKFRD (SEQ ID NO: 21)    2.5E+05 8.5E-04 3.4
v2.1.E101K       GTYDGGFKY (SEQ ID NO: 22) 2.2E+05 1.5E-03 6.8
表4：hu7C2變異體親和力之彙總
hu7C2變異體 KD (nM)
mu7C2.B9 8
hu7C2.v2.2 11
hu7C2.v2.2.LA (S53L、S55A)； SEQ ID NO: 16之HVR-H2 3
mu7C2.B9 (「7C2」)及hu7C2.v2.2.LA (在以下實例中稱爲「hu7C2」)之人類VLKIV 及VHI 結構域以及重鏈及輕鏈可變區之比對示於圖1及圖2中。實例 2 ：產生 hu7C2 抗體藥物結合物 對於較大規模之抗體產生，在CHO細胞中產生抗體。將編碼重鏈及輕鏈之載體轉染至CHO細胞中且藉由蛋白質A親和層析法自細胞培養物純化IgG。A. 吡啶基二硫化物 PNU 醯胺連接子藥物中間物之合成 具有下式之吡啶基二硫化物PNU醯胺連接子藥物中間物((2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-哌喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二側氧基-N-[2-(2-吡啶基二硫烷基)乙基]-3,4-二氫-1H-稠四苯-2-甲醯胺；「LD-51」)：
Figure 02_image156
LD-51 係以如下方式合成。按照US 8389697之實例3，向如WO 1998/02446及US 8470984之實例1中所報導而製備之PNU-159682 (15.3 mg，0.02038 mmol)於3 ml甲醇及2 ml H2 O中之溶液中添加NaIO4 (5.1 mg，0.0238 mmol)於1 ml H2 O中之溶液。在室溫下將反應混合物攪拌3小時，直至無可偵測之起始材料(TLC及HPLC分析)。在減壓下移除溶劑，且粗製紅色固體(2S ,4S )-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-{[(1S ,3R ,4aS ,9S ,9aR ,10aS )-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H -哌喃并[4',3':4,5][1,3]噁唑并[2,3-c ][1,4]噁嗪-3-基]氧基}-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫稠四苯-2-甲酸51a 不經進一步純化即用於下一步驟中。MS (ESI): 628 [M+H]+ 。
Figure 02_image258
51a 在氬氣氛圍下向粗製中間物51a於無水二氯甲烷中之溶液中添加無水三乙胺、TBTU (O -(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N' -四甲基脲鎓四氟硼酸鹽，亦稱爲N,N,N',N' -四甲基-O -(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸鹽，CAS號125700-67-6，Sigma-Aldrich B-2903)及N-羥基琥珀醯亞胺，以形成中間物51a之NHS酯。替代地，可使用諸如DCC或EDC之其他偶合試劑。在一小時之後，添加2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺鹽酸鹽(CAS號106139-15-5)。在室溫下將反應混合物攪拌30 min，直至起始材料消失(HPLC-MS分析)。在真空下蒸發溶劑且隨後在矽膠上藉由急驟管柱層析法純化殘餘物，得到LD-51。MS (ESI): 796.88 [M+H]+ 。B. 合成 CBI-PBD 連接子藥物中間物 具有下式之CBI-PBD二聚體(哌嗪胺基甲酸酯前藥)-2-丙基吡啶基二硫化物連接子-藥物中間物(3-[6-[1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯；表A之化合物81 )：
Figure 02_image260
， 及具有下式之CBI-PBD二聚體(磷酸鹽)-2-丙基吡啶基二硫化物連接子-藥物中間物(3-[6-[1-(氯甲基)-5-膦醯基氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯；表A之化合物82 )：
Figure 02_image262
係以如下方式合成。關於反應流程，包括試劑及中間物之式，參見圖9及圖10。此合成亦適合於產生3-[6-[1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-6-側氧基-己氧基]-6-羥基-2-甲氧基-11-側氧基-6a,7,8,9-四氫-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯(「CBI-PBD-2-丙基吡啶基二硫化物」)。 在室溫下將1 (1.40 g，4.00 mmol，按照文獻程序製備：J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151)、2 (1.31 g，5.22 mmol，按照文獻程序製備：WO2004065491 A1)及K2 CO3 (829 mg，6.00 mmol)於無水DMA (15 mL)中之混合物攪拌43 h。隨後用EtOAc及H2 O稀釋混合物，充分混合且進行層分離。用H2 O(3×)、鹽水(1×)洗滌有機層並乾燥(Na2 SO4 )，且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用EtOAc:Hex 50:50至67:33至100:0純化粗產物，得到呈黃色油狀之化合物3 (1.74 g，84%)。1 H NMR δ (400 MHz, CDCl3 ) 8.77 (br s, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.02-5.92 (m, 1H), 5.36 (dq,J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.26 (dq,J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 4.69-4.60 (m, 2H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.28 (br s, 1H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.90-3.80 (m, 1H), 3.74-3.70 (m, 1H), 3.65-3.59 (m, 1H), 3.54-3.47 (m, 1H), 2.25 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.20-2.15 (m, 1H), 1.93-1.84 (m, 3H), 1.81-1.72 (m, 1H), 1.70-1.63 (m, 3H), 1.53-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H)。HRMSm/z 543.2666 [(M+Na)+ C27 H40 N2 NaO8 計算值543.2677]。
Figure 02_image264
在室溫下將Et3 N (1.32 mL，9.47 mmol)添加至3 (821 mg，1.58 mmol)於無水DCM (6 mL)中之溶液中。隨後添加乙酸酐(0.75 mL，7.93 mmol)且在室溫下將混合物攪拌4.5 h。將反應混合物冷却至0℃且添加無水MeOH (1 mL)，並且在0℃下將混合物攪拌15 min。隨後添加EtOAc (120 mL)，且用H2 O (2×)、鹽水(1×)洗滌混合物，乾燥(Na2 SO4 )且在真空下移除溶劑，得到化合物4 (891 mg，定量)，其不經純化即用於下一步驟中。1 H NMR δ (400 MHz, CDCl3 ) 8.88 (br s, 1H), 7.82 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.01-5.91 (m, 1H), 5.36 (dq,J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.25 (dq,J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.61-4.54 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 2H), 4.09-4.06 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.55-3.47 (m, 2H), 2.26-2.23 (m, 2H), 2.18-2.12 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.97-1.77 (m, 5H), 1.70-1.63 (m, 2H), 1.54-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H)。HRMSm/z 585.2774 [(M+Na)+ C29 H42 N2 NaO9 計算值585.2783]。
Figure 02_image266
在室溫下將吡咯啶(1.6 mL，19.2 mmol)添加至4 (1.06 g，1.88 mmol)於無水DCM (20 mL)中之溶液中。隨後添加Pd(PPh3 )4 (109 mg，0.0943 mmol)且在室溫下將反應混合物攪拌40 min。用0.25 M HCl溶液(2×75 mL)洗滌反應混合物，乾燥(Na2 SO4 )且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用EtOAc:Hex 50:50至100:0純化粗產物，得到呈黃色油狀之化合物5 (726 mg，81%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 6.67 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.35-4.30 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 2H), 3.87 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.50-3.44 (m, 1H), 3.42-3.35 (m, 1H), 2.21 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.07-2.00 (m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.77-1.67 (m, 4H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H)。HRMSm/z 501.2573 [(M+Na)+ C25 H38 N2 NaO7 計算值501.2571]。
Figure 02_image268
在室溫下，在氮氣下將雙光氣(0.22 mL，1.82 mmol)添加至5 (726 mg，1.52 mmol)及DMAP (557 mg，4.56 mmol)於無水DCM (25 mL)中之混合物中。在30 min之後，添加6 (2.60 g，12.9 mmol；藉由以上所提及之程序新製造-先前未分派編號予醇)於無水DCM (25 mL)中之溶液且在室溫下將混合物攪拌隔夜。在18 h之後，用H2 O (1×)洗滌反應混合物，乾燥(Na2 SO4 )且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用DCM:EtOAc 100:0至95:5至94:6直至溶離過量6 ，且隨後用EtOAc:Hex 70:30純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之化合物7 (920 mg，86%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 9.16 (br s, 1H), 8.45-8.43 (m, 1H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.15 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 4.29 (br s, 1H), 4.17-3.99 (m, 4H), 3.92 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.42-3.30 (m, 3H), 2.20 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.06-1.95 (m, 4H), 1.83 (br s, 1H), 1.77-1.68 (m, 4H), 1.58-1.49 (m, 2H), 1.43-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d,J = 6.8 Hz, 3H)。HRMSm/z 706.2832 [(M+H)+ C34 H48 N3 O9 S2 計算值706.2826]。
Figure 02_image270
在室溫下將7 (949 mg，1.34 mmol)及K2 CO3 (1.85 g，13.4 mmol)於DCM-MeOH (34 mL/17 mL)中之混合物攪拌45 min。用DCM稀釋混合物，傾入冰H2 O (200 mL)中，充分混合且進行層分離。用DCM (1×)萃取水層，乾燥(Na2 SO4 )所合併之有機層且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用DCM:EtOAc 100:0至50:50純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之化合物8 (808 mg，91%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 9.20 (br s, 1H), 8.44 (d,J = 4.7 Hz, 1H), 7.81-7.80 (m, 2H), 7.25-7.20 (m, 2H), 6.94 (s, 1H), 4.75 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 4.17-3.99 (m, 3H), 3.92 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.37-3.20 (m, 3H), 2.20 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 1.93-1.76 (m, 3H), 1.75-1.68 (m, 3H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d,J = 6.9 Hz, 3H)。HRMSm/z 664.2721 [(M+H)+ C32 H46 N3 O8 S2 計算值664.2724]。
Figure 02_image272
在室溫下將(二乙醯氧基碘)苯(259 mg，0.804 mmol)添加至8 (349 mg，0.526 mmol)及TEMPO (82.2 mg，0.526 mmol)於無水DCM (10 mL)中之混合物中，且將反應混合物攪拌隔夜。在24 h之後，用DCM及飽和Na2 S2 O3 水溶液稀釋混合物且充分混合。進行層分離，且用飽和Na2 S2 O3 水溶液(1×)、飽和NaHCO3 水溶液(1×)洗滌有機層，乾燥(Na2 SO4 )，且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用EtOAc:Hex 70:30至100:0純化粗產物，得到呈白色發泡體狀之化合物9 (248 mg，71%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 8.45-8.43 (m, 1H), 7.79-7.69 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.24-7.20 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.96及6.91 (2s, 1H), 6.55 (t,J = 5.9 Hz, 1H), 5.46 (dd,J = 8.9, 6.1 Hz, 1H), 4.31-4.21 (m, 1H), 4.02-3.84 (m, 3H), 3.80及3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.40-3.18 (m, 3H), 2.19-2.13 (m, 2H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.96-1.85 (m, 3H), 1.70-1.67 (m, 2H), 1.56-1.45 (m, 2H), 1.40-1.34 (m, 2H), 1.38及1.37 (2s, 9H), 1.15-1.10 (m, 3H)。HRMSm/z 662.2592 [(M+H)+ C32 H44 N3 O8 S2 計算值662.2564]。
Figure 02_image274
在室溫下將9 (254 mg，0.384 mmol)及4 M HCl於二噁烷(11 mL)中之混合物攪拌1 h 15 min。在25℃至30℃下在真空下移除溶劑，得到化合物10 (162 mg，70%)，其不經純化即用於下一步驟中。
Figure 02_image246
在室溫下，在氮氣下將10 (161 mg，0.266 mmol)、58b (195 mg，0.542 mmol，藉由以上所提及之程序新製得)、EDCI·HCl (253 mg，1.32 mmol)及TsOH (19.5 mg，0.113 mmol)於無水DMA (5 mL)中之混合物攪拌隔夜。在23 h之後，用EtOAc及飽和NaHCO3 水溶液稀釋反應混合物且充分混合。進行層分離且用EtOAc (1×)萃取水層。用H2 O (1×)、鹽水(1×)洗滌所合併之有機層，乾燥(Na2 SO4 )且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用DCM:MeOH 100:0至93:7純化粗產物，且使用DCM:MeOH 99:1至94:6對該材料進行重新管柱層析，得到呈淺黃色發泡體狀之11 (化合物編號81，118 mg，47%，HPLC純度：98.0%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 8.43-8.41 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.96 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.83 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.66 (m, 1H), 7.61-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.97及6.92 (2s, 1H), 6.56 (t,J = 6.0 Hz, 1H), 5.46 (dd,J = 9.1, 6.2 Hz, 1H), 4.42-4.20 (m, 4H), 4.05-3.76 (m, 7H), 3.80及3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.11 (m, 4H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.65-1.62 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H), 9H部分經DMSO遮蔽。HRMSm/z 969.3070 [(M+Na)+ C47 H55 ClN6 NaO9 S2 計算值969.3053]。 如下製備化合物82 ：
Figure 02_image277
在室溫下，在氮氣下將10 (162 mg，0.267 mmol)、66d (178 mg，0.418 mmol，藉由以上所提及之程序新製得)、EDCI·HCl (184 mg，0.960 mmol)及TsOH (11 mg，0.0639 mmol)於無水DMA (5 mL)中之混合物攪拌隔夜。在18.5 h之後，用EtOAc及H2 O稀釋反應混合物且充分混合。進行層分離，且用飽和NaHCO3 水溶液(1×)、H2 O (1×)、鹽水(1×)洗滌有機層，乾燥(Na2 SO4 )，且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析使用EtOAc:MeOH 100:0至95:5純化粗產物，得到黃色殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Synergi-MAX RP 4μ，21.20×250 mm；流速：12 mL/min；移動相：溶劑A：H2 O/甲酸銨緩衝液pH 3.45，溶劑B：MeCN/H2 O 90:10；方法：梯度，溶劑A:溶劑B 90:10至10:90至0:100，30 min)進一步純化此物質，得到呈白色發泡體狀之化合物12 (89.3 mg，33%，HPLC純度：99.5%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 8.56 (s, 1H), 8.43-8.41 (m, 1H), 8.04 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98及6.92 (2s, 1H), 6.55 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.40-4.36 (m, 1H), 4.30-4.19 (m, 3H), 4.04-3.86 (m, 4H), 3.86-3.75 (m, 1H), 3.80及3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.38-3.22 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.85 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.55-1.40 (m, 2H), 1.47及1.47 (2s, 18H), 1.28-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H)。HRMSm/z 1035.3162 [(M+Na)+ C49 H62 ClN4 NaO11 PS2 計算值1035.3175]。
Figure 02_image248
在室溫下將12 (84.0 mg，0.0829 mmol)及TFA (1 mL)於無水DCM (2 mL)中之混合物攪拌40 min。隨後在25℃下在真空下移除溶劑，得到綠色殘餘物。將殘餘物溶解於DCM中，用EtOAc稀釋溶液且在真空下移除DCM，得到白色固體且傾析剩餘溶劑。重複此處理且將所得固體與EtOAc一起濕磨並乾燥，得到呈白色固體狀之13 (表A之化合物82 ，43.8 mg，59%，HPLC純度：93.8%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 8.47 (s, 1H), 8.44-8.42 (m, 1H), 8.08 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.90 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.58-7.54 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.22-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98及6.93 (2s, 1H), 5.46 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 4.39-4.18 (m, 4H), 4.04-3.95 (m, 3H), 3.90-3.85 (m, 1H), 3.84-3.76 (m, 1H), 3.80及3.80 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.40-3.27 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.10-2.02 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.16-1.10 (m, 3H), 3H未觀測到。HRMSm/z 923.1938 [(M+Na)+ C41 H46 ClN4 NaO11 PS2 計算值923.1923]。 如下製備化合物8 3 ：
Figure 02_image244
在室溫下，在氮氣下將10 (45.0 mg，0.0743 mmol)、67d (24.3 mg，0.0899 mmol，藉由以上所提及之程序新製得)、EDCI·HCl (42.7 mg，0.223 mmol)及TsOH (3 mg，0.0174 mmol)於無水DMA (3 mL)中之混合物攪拌5 h。向混合物中再添加部分67d (24.3 mg，0.0899 mmol)及EDCI·HCl (16.0 mg，0.0835 mmol)且在室溫下將反應物攪拌隔夜。在22 h之後，用EtOAc稀釋反應混合物且用H2 O (2×)、鹽水(1×)洗滌，乾燥(Na2 SO4 )且在真空下移除溶劑。在矽膠上藉由管柱層析法使用EtOAc純化粗產物，得到綠色粉末。第二次在矽膠上進行管柱層析法使用EtOAc進一步純化此物質，得到呈米色固體狀之14 (表A之化合物83 ，8.3 mg，13.5%，HPLC純度：81.2%)。1 H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6 ) 10.33 (s, 1H), 8.43-8.42 (m, 1H), 8.07 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.74-7.67 (m, 1H), 7.50-7.46 (m, 2H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.24-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98及6.92 (2s, 1H), 6.56 (t,J = 6.0 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.33-4.21 (m, 2H), 4.15-4.13 (m, 2H), 4.05-3.93 (m, 3H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.80及3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.13 (m, 4H), 2.10-1.99 (m, 1H), 1.94-1.89 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.52-1.41 (m, 2H), 1.32-1.24 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H)。HRMSm/z 843.2258 [(M+Na)+ C41 H45 ClN4 NaO8 S2 計算值843.2260]。 如下製備化合物85 ： 在20℃下向82 (15 mg，16.64 u mol)於DMF (1.0 mL)中之溶液中添加5-硝基吡啶-2-硫醇(25.99 mg，166.41 umol)之溶液。在20℃下將反應混合物攪拌1 h。過濾反應混合物且藉由製備型HPLC (FA)加以純化，得到呈灰色固體狀之(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)丙酯85 (7.5 mg，47.62%)。LCMS: (10-80, CD_NEG, 3.0 min), 1.161 min, MS = 944.2 [M-1]- ；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ 9.18 (s, 1H), 8.41 (br, 1H,J = 7.6 Hz), 8.11 (br, 1H), 7.80 (d, 1H,J = 8.0 Hz), 7.67 (d, 1H,J = 8.4 Hz), 7.46 (d, 1H,J = 7.6 Hz), 7.30 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.99-6.93 (m, 1H), 5.52 (d, 1H,J = 8.4 Hz), 4.26–4.14 (m, 4H), 3.98–3.80 (m, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.40–3.26 (m, 5H), 2.40–2.28 (m, 2H), 2.10-1.80 (m, 5H), 1.79-1.55 (m, 5H), 1.40 (br, 1H), 1.19 (s, 1H), 1.12 (d, 3H,J = 8.8 Hz)。 如下製備化合物8 6 ： 步驟A：(S)-磷酸二第三丁酯(1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1u 之合成
Figure 02_image281
在20℃下，在氮氣氛圍下向(S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-甲酸第三丁酯(3.34 g，10.0 mmol)於無水DCM (25 mL)中之攪拌均質溶液中添加含4 M HCl之二噁烷(12.5 mL，50.0 mmol)。添加之後，在20℃下在氮氣下將反應混合物再攪拌20 h。用石油醚(250 mL)稀釋混合物且在20℃下在氮氣下攪拌20 min。傾析溶劑且用石油醚(250 mL)將該程序再重複一次。在25℃下在真空下將所得固體乾燥1 h，得到(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-醇鹽酸鹽(2.7 g，100%)；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.80 (s, 1 H), 8.15 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.87 (d,J = 8.2 Hz, 1 H), 7.58 (br t,J = 7.5 Hz, 1 H), 7.43 (br t,J = 7.4 Hz, 1 H), 6.81 (s, 1 H), 4.27-4.17 (m, 1 H), 4.01 (dd,J = 11.0, 3.2 Hz, 1 H), 3.93-3.74 (m, 3 H), 2個質子未觀測到。粗產物不經進一步純化即用於下一步驟。 在0℃下，在氮氣氛圍下向(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-醇鹽酸鹽(2.7 g，10.0 mmol)於無水DCM (10 mL)及二噁烷(30 mL)中之攪拌非均質混合物中依序添加三氟乙酸酐(TFAA) (3.4 mL，24.0 mmol)及二異丙基乙胺( DIPEA) (8.71 mL，50.0 mmol)。添加之後，在0℃下在氮氣下將反應混合物再攪拌50 min。添加乙酸乙酯(400 mL)且在0℃下添加1 N HCl (200 mL)，且在氮氣下將混合物攪拌20 min。分離乙酸乙酯層，依序用1 N HCl (200 mL)及水(2×200 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並在25℃浴溫下在減壓下蒸發，得到呈灰綠色固體狀之(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮(3.3 g，100%)。此物質不經進一步純化即用於下一步驟。 在20℃下，在氮氣氛圍下向(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羥基-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮(3.3 g，10.0 mmol)於無水THF (40 mL)中之攪拌均質溶液中添加二第三丁基-N,N-二異丙基亞磷醯胺(4.31 mL，13.0 mmol)。添加之後，在20℃下在氮氣下將反應混合物攪拌5-10 min，且隨後經17 min逐滴添加四唑(於CH3 CN中之3%溶液，38.0 mL，13.0 mmol)。在20℃下在氮氣下將最終反應混合物再攪拌19 h。在冰浴中冷却混合物且添加30% H2 O2 (11.3 mL，100.0 mmol)。添加之後，在20℃下將反應混合物再攪拌1 h 30 min。用乙酸乙酯(300 mL)及10% Na2 S2 O3 水溶液(500 mL)稀釋混合物且在0℃下攪拌20 min。分離乙酸乙酯層且依序用水(200 mL)、飽和NaHCO3 (200 mL)及水(200 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )且在減壓下在25℃浴溫下蒸發，得到琥珀色油。藉由矽膠層析(用乙酸乙酯:石油醚1:3溶離)加以純化，得到呈無色發泡固體狀之1u (4.7 g, 90%)，mp 39-42℃；[α]D -61.8° (c 1.02，CHCl3 )。分析(C23 H28 ClF3 NO5 P)計算值：C，52.93；H，5.41；N，2.68. 實驗值：C，53.05；H，5.43；N，2.80。 步驟B：乙酸((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-6-((第三丁氧基羰基)胺基)己醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)胺基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-5-甲氧基苯甲醯基)吡咯啶-2-基)甲酯3g 之合成
Figure 02_image282
Figure 02_image284
向(S)-6-(5-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-4-(2-(羥基甲基)吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙酯3a (4.14 g，6.95 mmol) (J. Med. Chem. 2003,46 , 2132-2151)於無水DCM (25 mL)中之攪拌溶液中添加乙酸酐(3.30 mL，34.8 mmol)及三乙胺(5.81 mL，41.7 mmol)。在20℃下將混合物攪拌3 h 30 min。添加無水MeOH (4.0 mL)並且將混合物攪拌30 min。使混合物分配在EtOAc (400 mL)與水(400 mL)之間。分離EtOAc層，用水(2×200mL)洗滌且隨後乾燥(MgSO4 )並蒸發，得到呈油狀之(S)-6-(4-(2-(乙醯氧基甲基)吡咯啶-1-羰基)-5-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙酯3b (4.28 g，96%)；[α]D -57.4° (c 0.21，CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 9.10 (s, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 6.87 (s, 1 H), 6.01-5.87 (m, 1 H), 5.32 (dd,J = 17.2, 1.5 Hz, 1 H), 5.21 (dd,J = 10.4, 1.4 Hz, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.54 (d,J = 5.4 Hz, 2 H), 4.39-4.20 (m, 3 H), 3.93 (t,J = 6.4 Hz, 2 H), 3.75 (s, 3 H), 3.46-3.27 (m, 2 H), 2.13-1.90 (m, 4 H), 1.89-1.60 (m, 7 H), 1.54-1.40 (m, 2 H), 2個質子被DMSO峰遮蔽。HRMS (ESI) m/z C27 H36 Cl3 N2 O9 計算值: 637.1481, 實驗值: 637.1475 [MH+ ]; C27 H35 Cl3 N2 NaO9 計算值: 659.1300, 實驗值: 659.1303 [MNa+ ]; C27 H35 Cl3 KN2 O9 計算值: 675.1040, 實驗值: 675.1035 [MK+ ]。 向3b (4.27 g，6.69 mmol)於丙酮(75 mL)、水(50 mL)及THF (30 mL)中之攪拌溶液中添加鋅粉(17.5 g，268 mmol)及NH4 Cl (28.6 g，535 mmol)。在20℃下在氮氣氛圍下將混合物攪拌42 h。添加丙酮(100 mL)，將混合物攪拌10 min，且傾析上清液。將該程序重複兩次且在減壓下蒸發所合併之上清液以移除丙酮及THF。用水(50 mL)稀釋殘餘物且用1 N HCl水溶液酸化至pH~1。用石油醚(2×200 mL)洗滌該酸性混合物且用EtOAc (400 mL)萃取。用水(200 mL)洗滌EtOAc萃取物且乾燥(MgSO4 )並蒸發溶劑，得到呈油狀之(S)-6-(4-(2-(乙醯氧基甲基)吡咯啶-1-羰基)-5-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-2-甲氧基苯氧基)己酸3c (2.72 g，80%)；[α]D -73.5° (c 1.12, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ  11.99 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 9.10 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 6.87 (s, 1 H), 6.00-5.86 (m, 1 H), 5.32 (dd,J = 17.2, 1.5 Hz, 1 H), 5.20 (dd,J = 10.4, 1.5 Hz, 1 H), 4.57-4.52 (m, 2 H), 4.37-4.03 (m, 3 H), 3.93 (t,J = 6.5 Hz, 2 H), 3.75 (s, 3 H), 3.40-3.10 (m, 2 H), 2.23 (t,J = 7.3 Hz, 2 H), 2.07-1.93 (m, 4 H), 1.89-1.66 (m, 5 H), 1.62-1.49 (m, 2 H), 1.47-1.34 (m, 2 H)。HRMS (ESI) m/z C25 H35 N2 O9 計算值: 507.2337, 實驗值: 507.2340 [MH+ ]; C25 H34 KN2 O9 計算值: 545.1896, 實驗值: 545.1906 [MK+ ]; C25 H34 N2 NaO9 計算值: 529.2157, 實驗值: 529.2169 [MNa+ ]。 在0℃下，在氮氣氛圍下向磷酸(S)-二第三丁酯(1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1u (1.38 g，2.64 mmol)於MeOH (10 mL)中之攪拌溶液中添加Cs2 CO3 (1.03 g，3.17 mmol)。在0℃下將混合物攪拌2 h 30 min，且隨後分配在EtOAc (200 mL)與水(150 mL)之間。分離EtOAc層且再次用水(100 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )且在減壓下在25℃浴溫下蒸發，得到呈淺黃色發泡固體狀之磷酸(S)-二第三丁酯(1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1v (1.17 g)，在0-20℃下用含3c (1.24 g，2.45 mmol)、EDCI·HCl (1.41 g，7.35 mmol)及對甲苯磺酸(84 mg，0.49 mmol)之無水DMA (14 mL)處理22 h。使混合物分配在EtOAc ( 400 mL)與水(300 mL)之間。分離EtOAc層，且再次用水(100 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並蒸發。藉由矽膠層析(用EtOAc:石油醚2:1溶離)進行純化，得到呈淺黃色發泡固體狀之乙酸((S)-1-(2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-5-甲氧基苯甲醯基)吡咯啶-2-基)甲酯3d (1.49 g，66%)，mp 55-59℃；[α]D -68.0° (c 1.00, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 9.10 (s, 可與D2 O交換, 1 H),  8.56 (s, 1 H), 8.03 (d,J = 8.1 Hz, 1 H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.57 (t,J = 8.1 Hz, 1 H), 7.47 (t,J = 7.6 Hz, 1 H), 7.19 (s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 5.99-5.86 (m, 1 H), 5.32 (dd,J = 17.2, 1.6 Hz, 1 H), 5.20 (dd,J = 10.4, 1.5 Hz, 1 H), 4.53 (d,J = 5.4 Hz, 2 H), 4.45-3.84 (m, 10 H), 3.74 (s, 3 H), 3.44-3.26 (m, 2 H), 2.68-2.47 (m, 2 H), 2.02 (br s, 3 H), 1.93-1.43 (m, 10 H), 1.474及1.469 (2 s, 18 H)。HRMS (ESI) m/z C46 H62 ClN3 O12 P計算值: 914.3754, 實驗值: 914.3749 [MH+ ]; C46 H61 ClKN3 O12 P計算值: 952.3313, 實驗值: 952.3381 [MK+ ]; C46 H61 ClN3 NaO12 P計算值: 936.3574, 實驗值: 936.3589 [MNa+ ]。 在20℃下在氮氣氛圍下向3d (548 mg，0.60 mmol)於DCM (8 mL)中之攪拌溶液中添加Pd(Ph3 P)4 (17.1 mg；9.8% Pd)及吡咯啶(0.49 mL，6.00 mmol)。在20℃下將混合物攪拌30 min，且隨後分配在EtOAc (200 mL)與水(150 mL)之間。分離EtOAc層，且再次用水(50 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並在減壓下在25℃浴溫下蒸發。藉由矽膠層析(用EtOAc:MeOH 50:1溶離)純化粗產物，得到呈淺黃色發泡固體狀之乙酸((S)-1-(2-胺基-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-5-甲氧基苯甲醯基)吡咯啶-2-基)甲酯3e (323 mg，65%)，mp 46-49℃；[α]D -85.2° (c 0.36, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 8.56 (s, 1 H), 8.04 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.93 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.58 (t,J = 8.2 Hz, 1 H), 7.47 (t,J = 8.1 Hz, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 6.37 (s, 1 H), 5.09 (s, 可與D2 O交換, 2 H), 4.46-3.85 (m, 10 H), 3.63 (s, 3 H), 3.52-3.34 (m, 2 H), 2.69-2.50 (m, 2 H), 2.08-1.94 (m, 1 H), 2.01 (s, 3 H), 1.91-1.61 (m, 7 H), 1.58-1.44 (m, 2 H), 1.476 and 1.470 (2 s, 18 H)。HRMS (ESI) m/z C42 H58 ClN3 O10 P計算值: 830.3522, 實驗值: 830.3543 [MH+ ]。 在20℃下，在氮氣氛圍下向3e (293 mg，0.35 mmol)及DMAP (202 mg，1.65 mmol)於無水DCM (7 mL)中之攪拌溶液中添加雙光氣於無水DCM中之溶液(0.05 M，6.7 mL，0.33 mmol)。將混合物攪拌25 min且隨後添加(6-((4-(羥基甲基)苯基)胺基)-6-側氧基己-1,5-二基)(S)-二胺基甲酸烯丙酯第三丁酯3f (1.54 g，3.54 mmol)於無水DCM (20 mL)中之溶液。在20℃下在氮氣氛圍下將混合物攪拌68 h，且隨後分配在EtOAc (300 mL)與水(200 mL)之間。分離EtOAc層，且再次用水(100 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並在30℃浴溫下蒸發。藉由矽膠層析(用EtOAc:MeOH:石油醚30:0.5:10溶離)純化所得橘色油，得到呈發泡固體狀之乙酸((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-6-((第三丁氧基羰基)胺基)己醯胺基)苯甲基)氧基)羰基)胺基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-5-甲氧基苯甲醯基)吡咯啶-2-基)甲酯3g (385 mg，84%)，mp 72-75°C；[α]D -55.2° (c 0.53, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.04 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 9.12 (br s, 可與D2 O交換, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.52 (m, 3 H, 在D2 O之後減至2 H), 7.46 (t,J = 7.8 Hz, 2 H), 7.31 (d,J = 8.5 Hz, 2 H), 7.20 (br s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 6.75 (不良拆分之t, 可與D2 O交換, 1 H), 5.97-5.83 (m, 1 H), 5.30 (br d,J = 17.3 Hz, 1 H), 5.17 (br d,J = 10.6 Hz, 1 H), 5.18-4.97 (m, 2 H), 4.51-3.85 (m, 13 H), 3.74 (s, 3 H), 3.43-3.23 (m, 2 H, 部分被水峰遮蔽), 2.94-2.83 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, 部分被DMSO峰遮蔽), 2.07-1.91 (m, 1 H), 2.01 (br s, 3 H), 1.88-1.43 (m, 11 H), 1.473-1.468 (2 s, 18 H), 1.43-1.20 (m, 4 H), 1.35 (s, 9 H)。HRMS (ESI) m/z C65 H89 ClN6 O17 P計算值: 1291.5665, 實驗值: 1291.5705 [MH+ ]; C65 H88 ClKN6 O17 P計算值: 1329.5262, 實驗值: 1329.5264 [MK+ ]; C65 H88 ClN6 NaO17 P計算值: 1313.5554, 實驗值: 1313.5524 [MNa+ ]。 步驟C：86 之合成
Figure 02_image285
在0℃下將3g (366 mg，0.28 mmol)及K2 CO3 (1.14 g，8.24 mmol)於DCM (9 mL)及MeOH (9 mL)中之混合物攪拌3 h 30 min。將混合物與冷EtOAc (200 mL)及冰水(150 mL)一起攪拌10 min。分離EtOAc層，再次用水(100 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並在25℃浴溫下蒸發，得到呈無色發泡固體狀之((S)-6-((4-((((5-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-2-((S)-2-(羥基甲基)吡咯啶-1-羰基)-4-甲氧基苯基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-6-側氧基己烷-1,5-二基)二胺基甲酸烯丙酯第三丁酯3h (343 mg，97%)，mp 71-75℃；[α]D -58.2° (c 0.57, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.04 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 9.11 (br s, 可與D2 O交換, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.53 (m, 3 H, 在D2 O之後減至2 H), 7.46 (t,J = 7.6 Hz, 2 H), 7.32 (d,J = 8.6 Hz, 2 H), 7.27 (br s, 1 H), 6.93 (s, 1 H), 6.75 (不良拆分之t, 可與D2 O交換, 1 H), 5.97-5.82 (m, 1 H), 5.29 (br d,J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d,J = 10.5 Hz, 1 H), 5.03 (br s, 2 H), 4.73 (t,J = 5.8 Hz, 可與D2 O交換, 1 H), 4.50-3.82 (m, 11 H), 3.74 (s, 3 H), 3.62-3.44 (m, 2 H), 3.40-3.21 (m, 2 H, 部分被水峰遮蔽), 2.95-2.80 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, 部分被DMSO峰遮蔽), 1.93-1.21 (m, 16 H), 1.473-1.468 (2 s, 18 H), 1.35 (s, 9 H)。HRMS (ESI) m/z C63 H86 ClKN6 O16 P計算值: 1287.5158, 實驗值: 1287.5113 [MK+ ]; C63 H86 ClN6 NaO16 P計算值: 1271.5419, 實驗值: 1271.5381 [MNa+ ]。 在0℃下，經3 min向3h (322 mg，0.26 mmol)於無水DCM (14 mL)中之攪拌溶液中逐份添加戴斯馬丁過碘烷(DMP) (131 mg，0.31 mmol)。在0℃下將反應混合物再攪拌2 h，隨後在20℃下攪拌50 h。用DCM (40 mL)及10% Na2 S2 O3 (40 mL)稀釋混合物，在20℃下攪拌10 min，且隨後分配在DCM (200 mL)與飽和NaHCO3 溶液(150 mL)之間。分離DCM層且用DCM (2×50 mL)進一步萃取水層。用飽和NaHCO3 溶液(2×100 mL)及水(2×100 mL)洗滌所合併之DCM萃取物，且隨後乾燥(MgSO4 )並在25℃浴溫下蒸發。藉由矽膠層析(用CHCl3 :MeOH 40:1溶離)純化所得橘色油，得到呈淺棕色發泡固體狀之(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-6-((第三丁氧基羰基)胺基)己醯胺基)苯甲酯3i (228 mg，71%)，mp 98℃ (分解)；[α]D +74.5° (c 0.26, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.02 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.04 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.47 (m, 5 H, 在D2 O之後減至4 H), 7.25-7.12 (m, 2 H, br s及在D2 O交換時1 H), 7.03 (s, 1 H), 6.83-6.64 (m, 2 H), 6.48 (br s, 可與D2 O交換, 1 H), 5.96-5.80 (m, 1 H), 5.52-5.39 (m, 在D2 O交換時d,J = 9.6 Hz, 1 H), 5.27 (br d,J = 16.8 Hz, 1 H), 5.21-5.10 (m, 2 H), 4.81 (br d,J = 12.3 Hz, 1 H), 4.54-3.85 (m, 8 H), 3.83-3.70 (m, 5 H), 3.53-3.21 (m, 3 H, 部分被水峰遮蔽), 2.93-2.82 (m, 2 H), 2.64-2.47 (m, 2 H, 部分被DMSO峰遮蔽), 2.10-1.20 (m, 16 H), 1.470及1.464 (2 s, 18 H), 1.34 (s, 9 H)。HRMS (ESI) m/z C63 H84 ClKN6 O16 P計算值: 1285.5002, 實驗值: 1285.4938 [MK+ ]; C63 H84 ClN6 NaO16 P計算值: 1269.5262, 實驗值: 1269.5220 [MNa+ ]。 在20℃下在氮氣氛圍下向3i (125 mg，0.10 mmol)於DCM (2 mL)中之攪拌溶液中添加Pd(Ph3 P)4 (2.9 mg；9.8% Pd)及吡咯啶(0.08 mL，1.00 mmol)。在20℃下攪拌混合物且藉由TLC (EtOAc:MeOH 20:1)進行監測。在40 min之後，再添加Pd(Ph3 P)4 (5.8 mg；9.8% Pd)及吡咯啶(0.16 mL，2.00 mmol)且將混合物再攪拌3 h。使混合物分配在EtOAc (100 mL)與水(100 mL)之間。分離EtOAc層且再次用水(50 mL)洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )並在25℃浴溫下蒸發。粗製(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二第三丁氧基磷醯基)氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-胺基-6-((第三丁氧基羰基)胺基)己醯胺基)苯甲酯3j (94 mg，81%)不經進一步純化即用於下一步驟。HRMS (ESI) m/z C59 H81 ClN6 O14 P計算值: 1163.5231, 實驗值: 1163.5188 [MH+ ]。 在20℃下在氮氣氛圍下將3j (91 mg，0.078 mmol)於無水DMA (1.0 mL)中之溶液用1-((5-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊基)胺甲醯基)環丁烷甲酸1p (36 mg，0.12 mmol)、EDCI·HCl (34 mg，0.18 mmol)及TsOH (4.0 mg，0.023 mmol)於無水DMA (0.5 mL)中之預先形成(20℃，10 min)之混合物處理。10 min之後，添加DIPEA (0.016 mL，0.078 mmol)且將反應混合物攪拌23 h。使混合物分配在EtOAc (100 mL)與水(100 mL)之間。分離EtOAc層且用飽和NaHCO3 (50 mL)、水(50 mL)進一步洗滌，且隨後乾燥(MgSO4 )。在25℃浴溫下蒸發溶劑，得到粗產物，藉由矽膠層析(用CHCl3 :EtOAc:MeOH 30:10:2溶離)進行純化，得到呈淺棕色發泡固體狀之(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-側氧基己基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-6-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(1-((5-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)戊基)胺甲醯基)環丁烷-1-甲醯胺基)己醯胺基)苯甲酯3k (63 mg，56%)；mp 67-70℃；[α]D +23.9° (c 2.09, CHCl3 )；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.05 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d,J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1 H), 7.84-7.71 (m, 2 H, 可與D2 O交換), 7.62-7.52 (m, 3 H), 7.46 (t,J = 7.7 Hz, 1 H), 7.22-7.13 (m, 2 H), 7.03 (br s, 1 H), 6.96 (s, 2 H), 6.71 (br s, 2 H, 在D2 O之後減至1 H), 6.49 (br s, 可與D2 O交換, 1 H), 5.51-5.41 (m, 但在D2 O交換時d,J = 9.5 Hz, 1 H), 5.15 (d,J = 12.2 Hz, 1 H), 4.82 (br d,J = 12.4 Hz, 1 H), 4.47-3.85 (m, 8 H), 3.77 (br s, 3 H), 3.52-3.20 (m, 3 H, 部分被水峰遮蔽), 3.12-3.20 (m, 但在D2 O交換時t,J = 6.7 Hz, 2 H), 2.92-2.80 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, 部分被DMSO峰遮蔽), 2.39 (t,J = 7.9 Hz, 2 H), 2.07-1.24 (m, 28 H), 1.469 及 1.463 (2 s, 18 H), 1.33 (s, 9 H)。HRMS (ESI) m/z C74 H98 ClN8 NaO18 P計算值: 1475.6317, 實驗值: 1475.6267 [MNa+ ]。
Figure 02_image287
在20℃下向3k (45 mg，0.031 mmol)於DCM (1.0 mL)中之攪拌溶液中添加TFA (1.0 mL)且將混合物攪拌15 min。添加石油醚(20 mL)且將混合物攪拌30 min。傾析上清液且使用EtOAc:石油醚(1:5) ( 2×20 mL)重複該程序。收集所得固體且藉由製備型HPLC [Synergi PolarRP管柱；TFA水溶液(pH = 2.56；90%至2%)/10%水/CH3 CN (10%至98%)；經23 min梯度溶離，流速12 mL/min]進行純化，得到呈米色固體狀之純86 (17.5 mg，38%)，純度(HPLC)：99.1%；[α]D +54.9° (c 0.18, MeOH)；1 H NMR [(CD3 )2 SO] δ 10.20 (s, 可與D2 O交換, 1 H), 8.50 (s, 1 H), 8.20-7.78 (m, 7 H, 在D2 O之後減至1H), 8.12 (d,J = 9.1 Hz, 1 H), 7.72-7.47 (m, 4 H, 在D2 O之後減至3H), 7.40 (t,J = 7.5 Hz, 1 H), 7.17 (br d,J = 7.3 Hz, 2 H), 7.03 (br s, 1 H), 6.97 (s, 2 H), 6.66 (br s, 可與D2 O交換, 1 H), 5.51 (br s, 1 H), 5.48 (br d,J = 9.7 Hz, 1 H), 5.32-5.18 (m, 但在D2 O之後d,J = 12.6 Hz, 1 H), 4.75 (br d,J = 12.4 Hz, 1 H), 4.44-3.81 (m, 8 H), 3.77 (s, 3 H), 3.52-3.21 (m, 5 H, 部分經水峰遮蔽), 3.04 (q, 但在D2 O之後t,J = 6.8 Hz, 2 H), 2.80-2.68 (m, 2 H), 2.39 (t,J = 7.7 Hz, 2 H), 2.12-1.08 (m, 28 H)。HRMS (ESI) m/z C61 H75 ClN8 O16 P計算值: 1241.4722, 實驗值: 1241.4700 [MH+ ]; C61 H74 ClN8 NaO16 P計算值: 1263.4541, 實驗值: 1263.4531 [MNa+ ]。C. 合成 CBI 二聚體連接子藥物中間物 具有下式之CBI-CBI二聚體([(1S)-1-(氯甲基)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(氯甲基)-5-膦醯基氧基-1,2-二氫苯并[e]吲哚-3-基]-3-側氧基-丙-1-烯基]-2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基]苯基]丙-2-烯醯基]-1,2-二氫苯并[e]吲哚-5-基]二氫磷酸酯；表A之化合物78 )：
Figure 02_image212
係以如下方式合成。關於反應流程，包括試劑及中間物之式，參見圖11。 在室溫下向(S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸第三丁酯51a (2.00 g，5.99 mmol)於DMF (5 mL)中之溶液中添加溴甲苯(7.13 mL，59.90 mmol)、碘化鉀KI (50 mg，0.30 mmol)及碳酸鉀K2 CO3 (4.14 g，30.00 mmol)。將混合物攪拌2 h且隨後用乙酸乙酯稀釋。濾出沈澱物。使濾液再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土過濾。藉由旋轉蒸發器移除溶劑且泵出過量溴甲苯。藉由管柱層析法使用乙酸乙酯與石油醚之混合物(v/v 1:10)作爲溶離劑來純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之(S)-5-(苯甲氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸第三丁酯57a (1.97 g，78%)；mp 186℃-188℃。1 H NMR (CDCl3 ) δ 8.29 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.86 (br s, 1H), 7.65 (d,J = 8.29 Hz, 1H), 7.55-7.49 (m, 3H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.38-7.31 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.26 (br s, 1H), 4.13 (t,J = 10.8 Hz, 1H), 4.00-3.92 (m, 2H), 3.44 (t,J = 10.5 Hz, 1H), 1.61 (s, 9H) ppm。LRMS (APCI)計算值m/z 424.8 (M + H)。C25 H27 ClNO3 需要424.2。(Boger D., Ishizakilb T., Kitos P.及Suntornwat O., (1990)J. Org. Chem. ,55, 5823-5832。) 向由(S)-1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸第三丁酯51a (1.595 g，3.76 mmol)製備之(S)-5-(苯甲氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸第三丁酯57a 於DCM (15 mL)中之於冰浴中冷却之溶液中添加含4 N HCl之二噁烷(40 mL)。使混合物升溫至室溫且攪拌2 h。泵出所有揮發性組分。使所得殘餘物再分配於乙酸乙酯與冷5%氨水溶液之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。依序用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土過濾。移除溶劑，得到呈棕色膠狀之(S)-5-(苯甲氧基)-1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚57b ，其直接使用；1 H NMR (DMSO) δ 8.04 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (d,J = 7.2 Hz, 2H), 7.45-7.34 (m, 4H), 7.14 (t,J = 7.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.84 (dd,J = 3.4, 10.7 Hz, 1H),  3.70 (t,J = 9.3 Hz, 1H), 3.60 (dd,J = 2.4, 10.0 Hz, 1H), 3.55 (t,J = 10.3 Hz, 1H) ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 324.1150 (M + H)。C20 H19 ClNO需要324.1150。 在冰浴中冷却中間物57b 且添加吡啶(15 mL)，隨後添加三氟乙酸酐(3.14 mL，22.57 mmol)。將所得混合物攪拌10 min且添加冰。使混合物再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。依序用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土過濾。移除溶劑且藉由管柱層析法使用乙酸乙酯與石油醚之混合物(v/v 1:10)作爲溶離劑來純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之(S)-1-(5-(苯甲氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-2,2,2-三氟乙酮66a (1.11 g，70%)；mp 167℃-170℃。1 H NMR (CDCl3 ) δ 8.37 (d,J = 8.3Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.72 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 7.61-7.54 (m, 3H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39-7.35 (m, 1H), 5.30 (AB q,J = 11.7, 15.7 Hz, 2H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.49 (dd,J = 9.9, 11.3 Hz, 1H) ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 442.0799 (M + Na)。C22 H17 ClF3 NNaO2 需要442.0795。 在-10℃下，向66a (1.10 g，2.62 mmol)於THF (20 mL)中之溶液中依序添加25%甲酸銨水溶液(20 mL)及Pd-C催化劑(10%，濕潤，550 mg)且將混合物攪拌2 h，隨後再添加Pd-C催化劑(550 mg)。在-10℃下將所得混合物攪拌隔夜且經矽藻土濾出催化劑。自濾液中移除THF且使殘餘物再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。依序用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土過濾。移除溶劑且藉由管柱層析法使用乙酸乙酯與石油醚之混合物(v/v 1:5)作爲溶離劑來純化所得殘餘物，得到呈灰白色固體狀之(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羥基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-2,2,2-三氟乙酮66b (758 mg，88%)；mp 209℃-212℃。1 H NMR (CDCl3 ) δ 8.33 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.64 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.00-3.95 (m, 1H), 3.93-3.90 (m, 1H), 3.44 (dd,J = 9.8, 11.3 Hz, 1H) ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 352.0331 (M + Na)。C15 H11 ClF3 NNaO2 需要352.0323。 向66b (250 mg，0.76 mmol)於THF (15 mL)中之溶液中依序添加四唑(3%，於乙腈中，13.5 mL，4.55 mmol)及二第三丁基-N,N-二異丙基亞磷醯胺(1.51 mL，4.55 mmol)。在室溫下將混合物攪拌隔夜，隨後在冰浴中冷却且逐滴添加H2 O2 (30%水溶液，0.78 mL，7.58 mmol)。使所得混合物升溫至室溫且攪拌5 h。藉由在冰浴中冷却之情况下添加10%亞硫酸鈉水溶液來淬滅反應。藉由旋轉蒸發器移除有機揮發性物質。使所得混合物再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。依序用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土過濾。移除溶劑且藉由Florisil® (US Silica)管柱層析法使用乙酸乙酯與石油醚之梯度混合物(v/v 1:6至1:3)作爲溶離劑來純化所得殘餘物，得到呈無色油狀之(S)-磷酸二第三丁酯1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66c (367 mg，93%)。1 H NMR (DMSO) δ 8.44 (d,J = 1.0 Hz, 1H), 8.11 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 8.06 (d,J = 8.2 Hz, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 4.61-4.56 (m, 1H), 4.46-4.41 (m, 1H), 4.15-4.12 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 1H), 1.50 (s, 9H), 1.48 (s, 9H) ppm。31 P NMR (DMSO) δ -15.54 ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 544.1236 (M + Na)。C23 H28 ClF3 NNaO5 P需要544.1238。 向於冰浴中冷却之66c (239 mg，0.46 mmol)於MeOH (2 mL)中之溶液中添加CsCO3 (298 mg，0.92 mmol)及若干滴水。在冰浴中將混合物攪拌1 h，且隨後再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，經由矽藻土過濾且移除溶劑。將所得殘餘物溶解於乙酸乙酯中且經由Florisil® (US Silica)管柱層析之襯墊進行過濾，得到呈灰白色膠狀之(S)-磷酸二第三丁酯1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66d (183 mg，94%)，其不經進一步純化即直接使用；1 H NMR (DMSO) δ 8.08 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.58 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 7.46-7.42 (m, 1H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.13 (d,J = 0.8 Hz, 1H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.87-3.78 (m, 2H), 3.54-3.42 (m, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.49 (s, 9H) ppm。31 P NMR (DMSO) δ -15.58 ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 426.1587 (M + H)。C21 H30 ClNO4 P需要426.1595。 向76 mg (0.18 mmol)1 (66d ，藉由以上所提及之程序新製得)中添加2 (18 mg，0.045 mmol)、EDCI鹽酸鹽(69 mg，0.36 mmol)、甲苯磺酸(0.8 mg，0.005 mmol)及DMA (0.25 mL)。將混合物攪拌隔夜之後，在真空下移除大部分DMA且使殘餘物再分配於乙酸乙酯與水之間。用乙酸乙酯將水相萃取三次。依序用水及鹽水洗滌所合併之有機萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且經由矽藻土墊過濾。移除溶劑且將所得殘餘物溶解於最低限度之DCM中，且藉由添加庚烷引起沈澱，得到粗產物(54 mg)，藉由製備型HPLC (管柱：Synergi-Max RP 4μ，250×21.20 mm；移動相：A/ B= 20%至1% (A：甲酸銨pH 3.45，B：90%乙腈/水)；流速12 mL/min，梯度法；波長：254 nm、325 nm)進一步純化，得到呈黃色固體狀之3 (17 mg，30%)。1 H NMR (CDCl3 ) δ 8.72 (br s, 2H), 8.23 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.96 (d,J = 15.2 Hz, 1H), 7.83 (d,J = 15.3 Hz, 1H), 7.71 (d,J = 8.2 Hz, 2H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.26-7.12 (m, 3H), 6.95-6.88 (m, 1H), 6.67 (s, 2H), 4.57-4.52 (m, 2H), 4.47-4.38 (m, 2H), 4.28-4.24 (m, 2H), 4.16-4.09 (m, 2H), 4.00-3.94 (m, 4H), 3.78 (明顯s, 4H), 3.55-.348 (m, 2H), 1.57 (s, 36H) ppm。31 P NMR (CDCl3 ) δ -15.64 (s) ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 1238.3862 (M + Na)。C62 H73 Cl2 N3 NaO14 P2 需要1238.3837。 向於冰浴中冷却之3 (16 mg，0.013 mmol)於DCM (1 mL)中之溶液中添加TFA (0.5 mL，3.24 mmol)。使混合物升溫至室溫且攪拌3 h。泵出所有揮發性組分且將所得殘餘物與乙酸乙酯一起濕磨，得到呈黃色固體狀之化合物 78 (13 mg，100%，HPLC純度100%)。1 H NMR (DMSO) δ 8.60 (s, 2H), 8.12 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.95-7.87 (m, 4H), 7.72 (d,J = 15.1 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.53-7.45 (m, 4H), 7.38-7.32 (m, 2H), 6.97 (s, 2H), 4.60-4.48 (m, 4H), 4.30-4.28 (m, 4H), 4.08-3.88 (m, 6H), 3.68-3.58 (m, 4H)。31 P NMR (DMSO) δ -5.94 (s) ppm。HRMS (ESI)實驗值m/z 1014.1301 (M + Na)。C46 H41 Cl2 N3 NaO14 P2 需要1014.1333。D. 連接子 - 藥物部分與抗體之結合 藉由使hu7C2.v.2.2.LA與重鏈A118C突變(硫代hu7C2-HC A118C)或輕鏈K149C突變(硫代hu7C2-LC-K149C)與所選藥物-連接子部分結合來產生Hu7C2抗體-藥物結合物(ADC)。在初步分離時，抗體中經工程改造之半胱胺酸殘基作爲與細胞硫醇(例如麩胱甘肽)之混合二硫化物形式存在，且因而不可用於結合。此等抗體之部分還原(例如用DTT)、純化及用脫氫抗壞血酸(DHAA)再氧化得到具有可用於結合之游離半胱胺酸硫氫基之抗體，如先前所描述，例如，在Junutula等人(2008)Nat. Biotechnol . 26:925-932及US 2011/0301334中。簡而言之，將抗體與藥物-連接子部分組合以允許藥物-連接子部分與抗體之游離半胱胺酸殘基結合。若干小時之後，對ADC進行純化。測定各ADC之藥物負載(每抗體之藥物部分平均數)且在1.4至2.0之範圍內。 所得ADC結構及其下方所使用之術語示於圖12中。實例 3 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 MMTV-Her2 Fo5 轉殖基因乳房腫瘤移植異種移植模型中之效力 將CRL nu/nu小鼠(Charles River Laboratory)植入~2×2 mm MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤片段。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成7組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第1天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺酸；240 mM蔗糖，0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-HC-A118C-二硫化物-PBD，0.3 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-HC-A118C-二硫化物-PBD，1 mg/kg；(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PBD，0.3 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PBD，1 mg/kg；(6) 硫代-對照Ab-HC-A118C-二硫化物-PBD，1 mg/kg；或(7) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PBD，1 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 )×0.5。 該實驗之結果示於表5及圖4中。表5中之資料得自於第21天，但媒劑對照組得自第10天。各組在研究開始時含有8隻小鼠且在第21天含有8隻小鼠(或對於媒劑對照組，在第10天含有8隻小鼠)。使用下式計算AUC/天%TGI (腫瘤生長抑制)：%TGI = 100×(1-AUC治療/天÷AUC媒劑/天)。PR =部分反應，其定義爲在研究期間之任一天與起始腫瘤體積相比腫瘤體積減小大於50%但小於100%。此實驗中無動物顯示完全反應。 表5：hu7C2 ADC在MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤異種移植模型中之效力
群組 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) PR 最後一天之BW變化%
(1)媒劑 1258 0 (0, 0) 0 12.65
(2) 硫代-hu7C2-HC-A118C-二硫化物-PBD，0.3 mg/kg 604 72 (51,87) 0 5.34
(3) 硫代-hu7C2-HC-A118C-二硫化物-PBD，1 mg/kg 127 98 (89, 108) 2 2.81
(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PBD，0.3 mg/kg 208 82 (67,93) 1 3.83
(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PBD，1 mg/kg 70 99 (88, 107) 8 1.90
(6) 硫代-對照Ab-HC-A118C-二硫化物-PBD，1 mg/kg 1327 61 (35, 79) 0 6.40
(7) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PBD，1 mg/kg 757 61 (37, 79) 0 2.89
如表5中所示，硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PBD在1 mg/kg下顯示8個部分反應且在0.3 mg/kg下顯示1個部分反應。硫代-hu7C2-HC-A118C-二硫化物-PBD在1 mg/kg下顯示2個部分反應且在0.3 mg/kg下顯示無部分反應。實例 4 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 MMTV-Her2 Fo5 轉殖基因乳房腫瘤移植異種移植模型中之效力 將CRL nu/nu小鼠(Charles River Laboratory)植入~2×2 mm MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤片段。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成9組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第1天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1)媒劑(20 mM L-組胺酸、240 mM蔗糖、0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體，1 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體，3 mg/kg；(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體，6 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg；(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，3 mg/kg；(7) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，6 mg/kg；(8) 硫代-對照Ab-LC-K149C-CBI二聚體，6 mg/kg；或(9) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，6 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 )×0.5。 該實驗之結果示於表6及圖5中。表6中之資料得自於第21天，但媒劑對照組得自第14天。各組在研究開始時含有8隻小鼠且在第21天含有8隻小鼠，但媒劑對照組在研究開始時具有8隻小鼠且在第14天具有7隻小鼠。如前一實例中所描述來測定AUC/天TGI % (腫瘤生長抑制)及PR。CR =完全反應，其定義爲在研究期間之任一天腫瘤體積減少100% (無可量測之腫瘤)。用於該實驗之各抗體-藥物結合物之藥物:抗體比(DAR)示於第二欄。 表6：hu7C2 ADC在MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤異種移植模型中之效力
群組 DAR 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) PR CR 最後一天之BW變化%
(1) 媒劑    1331 0 (0, 0) 0 0 11.41
(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C- CBI 二聚體，1 mg/kg 2 151 101 (93, 109) 1 0 3.77
(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C- CBI 二聚體，3 mg/kg 2 72 109 (103, 119) 6 0 6.18
(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C –CBI 二聚體，6 mg/kg 2 32 114 (107, 124) 5 2 0.07
(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg 1.4 1095 69 (40, 86) 0 0 6.84
(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，3 mg/kg 1.4 314 94 (83, 102) 0 0 2.48
(7) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，6 mg/kg 1.4 150 108 (102, 117) 1 0 4.01
(8) 硫代-對照Ab-LC-K149C- CBI二聚體，6 mg/kg 2 231 98 (87, 106) 1 0 4.17
(9) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，6 mg/kg 1.4 1143 48 (8, 74) 0 0 11.10
如表6中所示，硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體在1 mg/kg下顯示1個部分反應，在3 mg/kg下顯示6個部分反應，且在6 mg/kg下顯示5個部分反應及2個完全反應。硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD在6 mg/kg下顯示1個部分反應。在劑量降至1 mg/kg之第二研究中，硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體在1 mg/kg下引起腫瘤消退，而硫代-對照Ab-LC-K149C-CBI二聚體在1 mg/kg引起60%之%TGI。不欲受任何特定理論束縛，據信對照之活性體現非靶向活性。實例 5 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 MMTV-Her2 Fo5 轉殖基因乳房腫瘤移植異種移植模型中之效力 將CRL nu/nu小鼠(Charles River Laboratory)植入~2×2 mm MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤片段。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成7組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第1天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺算、240 mM蔗糖、0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，1 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg；(4) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PNU，1 mg/kg；(5) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg；(6) 曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1、曲妥珠單抗安坦辛、ado-曲妥珠單抗安坦辛)，3 mg/kg；或(7) T-DM1，10 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 ) ×0.5。 該實驗之結果示於表7及圖6中。表7中之資料得自於第20天，但媒劑對照組、硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PNU 1 mg/kg組及T-DM1 3 mg/kg組得自於第14天。各組在研究開始時含有8隻小鼠且在結束時含有8隻小鼠，但媒劑對照組在研究開始時具有8隻小鼠且在結束時具有7隻小鼠。如先前實例中所描述來測定AUC/天%TGI (腫瘤生長抑制)。在此實驗中，無部分反應或完全反應。用於該實驗之各抗體-藥物結合物之藥物:抗體比(DAR)示於第二欄。 表7：hu7C2 ADC在MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤異種移植模型中之效力
群組 DAR 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) 最後一天之BW變化%
(1) 媒劑    1663 0 (0, 0) 8.08
(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C- 二硫化物-PNU，1 mg/kg 1.9 616 87 (72, 95) 0.52
(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg 1.9 162 104 (99, 110) 3.17
(4) 硫代-對照Ab-LC-K149C- 二硫化物-PNU，1 mg/kg 1.9 1160 31 (-21, 60) 6.26
(5) 硫代-對照Ab-LC-K149C- 二硫化物-PNU，3 mg/kg 1.9 607 81 (61, 92) 5.48
(6) T-DM1，3 mg/kg 3.8 1075 38 (-5, 64) 3.65
(7) T-DM1，10 mg/kg 3.8 734 86 (73, 95) 4.24
此等資料表明在此模型中硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU (3 mg/kg)具有比T-DM1或對照免疫結合物更大之效力。實例 6 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 MMTV-Her2 Fo5 轉殖基因乳房腫瘤移植異種移植模型中之效力 將CRL nu/nu小鼠(Charles River Laboratory)植入~2×2 mm MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤片段。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成9組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第1天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺酸、240 mM蔗糖、0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-HC-A118C-馬來醯亞胺-PNU，~1 mg/kg (與第IV組相匹配之藥物劑量)；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，0.3 mg/kg；(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，1 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg；(6) 硫代-對照Ab-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg；(7) 硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體，0.3 mg/kg；(8) 硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體，1 mg/kg；或(9) 硫代-對照Ab-LC-K149C-CBI二聚體，1 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 )×0.5。 該實驗之結果示於表8及圖7中。表8中之資料得自於各組研究最後一天，如該表之第二欄中所指示。各組在研究開始時含有8隻小鼠且在結束時含有8隻小鼠，但第(9)組在研究結束時具有7隻小鼠。如先前實例中所描述來測定AUC/天%TGI (腫瘤生長抑制)、PR及CR。用於該實驗之各抗體-藥物結合物之藥物:抗體比(DAR)示於第二欄。 表8：hu7C2 ADC在MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤異種移植模型中之效力
群組 DAR 最後一天 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) PR CR 最後一天之BW變化%
(1) 媒劑    14 1681 0 (0,0) 0 0 9.98
(2) 硫代-hu7C2-HC- A118C-馬來醯亞胺-PNU，~1 mg/kg 1.73 28 1054 88 (69, 99) 0 0 10.21
(3) 硫代-hu7C2-LC- K149C-馬來醯亞胺-PNU，0.3 mg/kg 1.8 20 1469 62 (25, 82) 0 0 8.11
(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，1 mg/kg 1.8 35 288 103 (94, 111) 3 0 8.73
(5) 硫代-hu7C2-LC- K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg 1.8 35 8 121 (112, 137) 0 8 6.65
(6) 硫代-對照Ab-LC- K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg 1.4-2 17 1244 56 (7, 79) 0 0 5.40
(7) 硫代-hu7C2-LC- K149C-CBI二聚體，0.3 mg/kg 2 35 833 90 (74, 100) 0 0 9.14
(8) 硫代-hu7C2-LC- K149C-CBI二聚體，1 mg/kg 2 35 65 100 (91, 109) 5 0 7.14
(9) 硫代-對照Ab-LC- K149C-CBI二聚體，1 mg/kg 2 20 1328 59 (11, 80) 0 0 9.92
如表8中所示，硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU在1 mg/kg下顯示3個部分反應且在3 mg/kg下顯示8個完全反應。硫代-hu7C2-LC-K149C-CBI二聚體在1 mg/kg下顯示5個部分反應。實例 7 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 KPL4 乳癌細胞系異種移植模型中之效力 SCI-Beige小鼠(C.B-17 SCID.bg，Charles River Laboratories)每小鼠於胸部乳房脂肪墊中接種體積爲0.2 ml之懸浮於HBSS/Matrigel中之3百萬個細胞。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成9組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第1天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺酸、240 mM蔗糖、0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，0.3 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，1 mg/kg；(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，0.3 mg/kg；(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，1 mg/kg；(7) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg；(8) 硫代-對照Ab-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg；(9) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 )×0.5。 該實驗之結果示於表9及圖8中。表9中所有群組之資料得自於第22天，但媒劑對照組及硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-PNU組得自於第18天。各組在研究開始時含有8隻小鼠且在結束時含有8隻小鼠，但第(6)組在研究結束時具有7隻小鼠。如先前實例中所描述來測定AUC/天%TGI (腫瘤生長抑制)、PR及CR。用於該實驗之各抗體-藥物結合物之藥物:抗體比(DAR)示於第二欄。 表9：hu7C2 ADC在KPL4乳癌細胞系異種移植模型中之效力
群組 DAR 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) PR CR 最後一天之BW變化%
(1) 媒劑    1084 0 (0, 0) 0 0 -3.73
(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，0.3 mg/kg 1.8 867 43 (-18, 75) 0 0 -3.98
(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，1 mg/kg 1.8 736 59 (11, 83) 0 0 0.01
(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg 1.8 51 127 (115, 151) 7 1 3.61
(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，0.3 mg/kg 1.9 1237 21 (-59, 65) 0 0 -4.67
(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，1 mg/kg 1.9 752 48 (-14, 78) 0 0 -4.65
(7) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg 1.9 60 130 (114, 155) 7 0 1.77
(8) 硫代-對照Ab-LC- K149C-馬來醯亞胺-PNU，3 mg/kg 1.4-2 831 30 (-48, 66) 0 0 -9.49
(9) 硫代-對照Ab-LC- K149C-二硫化物-PNU，3 mg/kg 1.9 1152 -5 (-100, 50) 0 0 -6.46
如表9中所示，硫代-hu7C2-LC-K149C-馬來醯亞胺-PNU在3 mg/kg下顯示7個部分反應及1個完全反應。硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-PNU在3 mg/kg下顯示7個部分反應。實例 8 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 MMTV-Her2 Fo5 轉殖基因乳房腫瘤移植異種移植模型中之效力 將CRL nu/nu小鼠(Charles River Laboratory)植入~2×2 mm MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤片段。當腫瘤達到100-250 mm3 之平均腫瘤體積時，將動物分成7組，每組8至10隻小鼠。小鼠在第0天經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺酸、240 mM蔗糖、0.02% Tween-20，pH 5.5)；(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，2 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，5 mg/kg；(4) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，5 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，2 mg/kg；(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，5 mg/kg；或(7) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，5 mg/kg。在研究持續期間，每週進行至少一次腫瘤及體重量測。當腫瘤達到1000至2000 mm3 時或若小鼠損失其體重之20%以上時，對小鼠施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 )×0.5。 該實驗之結果示於表10及圖17中。表10中之資料得自於第21天。各組在研究開始時含有7隻小鼠且在結束時含有7隻小鼠，但第(1)組在)研究開始時具有5隻小鼠，且第(4)組在研究結束時具有6隻小鼠。如先前實例中所描述來測定AUC/天TGI % (腫瘤生長抑制)及PR。此實驗中無小鼠顯示完全反應。用於該實驗之各抗體-藥物結合物之藥物:抗體比(DAR)示於第二欄。 表10：hu7C2 ADC在MMTV-Her2 Fo5轉殖基因乳房腫瘤異種移植模型中之效力
群組 DAR 最後一天之腫瘤體積 AUC/天 %TGI (下限, 上限) PR 最後一天之BW變化%
(1) 媒劑    2109 0 (0, 0) 0 5.36
(2) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，2 mg/kg 1.4 83 105 (100, 111) 2 1.02
(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，5 mg/kg 1.4 71 108 (103, 106) 4 0.81
(4) 硫代-對照Ab-LC-K149C- 二硫化物-CBI-PBD，5 mg/kg 1.4 635 75 (35, 92) 0 0.82
(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，2 mg/kg 1.4-2 161 98 (87, 104) 1 0.66
(6) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，5 mg/kg 1.4-2 61 108 (104, 116) 7 2.55
(7) 硫代-對照Ab-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)，5 mg/kg 1.4-2 826 70 (29, 88) 0 4.62
如表10中所示，硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD在2 mg/kg下顯示2個部分反應且在5 mg/kg下顯示4個部分反應。硫代-hu7C2-LC-K149C--二硫化物-CBI-PBD (磷酸鹽)在2 mg/kg下顯示1個部分反應且在5 mg/kg下顯示7個部分反應。實例 9 ： hu7C2 抗體藥物結合物在 HCC1569X2 移植異種移植模型中之效力 自ATCC (美國菌種保藏中心；Manassas，VA)獲得HCC1569人類乳癌細胞系且在Genentech產生子系HCC1569X2以便在小鼠中達成最佳生長。 雌性C.B-17 SCI-Beige小鼠(Charles River Laboratory)各自在胸部乳房脂肪墊區域中接種懸浮於HBSS/Matrigel (1:1比率)中之5百萬個HCC1569X2細胞。當異種移植腫瘤達到100-300 mm3之平均腫瘤體積時 (第0天)，將動物隨機分成7組，每組7隻小鼠，且經由靜脈內尾靜脈注射接受單次投與以下治療之一：(1) 媒劑(20 mM L-組胺酸，240 mM蔗糖，0.02% Tween-20, pH 5.5)；(2) 曲妥珠單抗-MCC-DM1 (T-DM1、曲妥珠單抗安坦辛、ado-曲妥珠單抗安坦辛)，3 mg/kg；(3) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，0.5 mg/kg；(4) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg；(5) 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，2 mg/kg；(6) T-DM1，3 mg/kg + 硫代-hu7C2- LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，0.5 mg/kg；或(7) T-DM1，3mg/kg + 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg。貫穿該研究，每週量測小鼠之腫瘤及體重1至2次。當體重損失大於其初始體重之20%時，對小鼠施以安樂死。在腫瘤達到3000 mm3 或顯示即將潰瘍之迹象之前對所有動物施以安樂死。在兩個維度(長度及寬度)上使用測徑規量測腫瘤體積且使用下式計算腫瘤體積：腫瘤尺寸(mm3 ) = (較長量測值×較短量測值2 ) × 0.5。 該實驗之結果示於表11及圖18中。表11中之資料得自於第14天，其中所有群組均具有7隻小鼠。 表11：hu7C2抗體藥物結合物在HCC1569X2移植異種移植模型中之效力。
群組 DAR 最後一天之腫瘤體積 AUC/天% TGI (下限, 上限) 最後一天之% BW變化
01 – 媒劑    1200 0 (0, 0) 5.15
02 - T-DM1，3mg/kg 3.8 506 84 (42, 104) 4.91
03 - 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，0.5 mg/kg 1.9    364 75 (28, 95) 5.65
04 - 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg 1.9    212 87 (53, 102) 5.21
05 - 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，2 mg/kg 1.9    94 106 (91, 123) 3.85
06 - T-DM1，3 mg/kg + 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，0.5 mg/kg 3.8 1.9    145 101 (82, 118) 4.2
07 - T-DM1，3 mg/kg + 硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD，1 mg/kg 3.8 1.9    33 122 (110, 146) 4.18
在本研究中，硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD顯示對腫瘤生長之劑量依賴性抑制，其中在2 mg/kg劑量下觀察到腫瘤消退。硫代-hu7C2-LC-K149C-二硫化物-CBI-PBD與T-DM1組合產生比任一單獨藥劑更大之效力，且基於動物體重量與媒劑組相比存在極小變化，其耐受性良好。實例 10 ：與 HER2 結合之 7C2 Fab 之晶體結構 方法7C2/HER2 複合物之表現、純化及結晶 -將7C2 Fab表現於大腸桿菌中，且使用蛋白G瓊脂糖凝膠親和力樹脂(GE)、SP瓊脂糖凝膠陽離子交換層析及尺寸排阻層析(SEC)進行純化。將HER2細胞外域(ECD)表現於CHO細胞中，且依序藉由使用與受控孔隙玻璃珠粒連接之曲妥珠單抗抗體的親和力層析以及DEAE陰離子交換及尺寸排阻層析加以純化。 藉由SEC純化Fab 7C2與HER2 ECD之間的複合物。使用酶組合(Endo F1、F2、F3、Endo H及PNG酶)對該複合物進行脫糖基，隨後藉由SEC在0.1 M NaCl、20 mM HEPES pH 7.2及2%甘油中加以純化。使該複合物結晶，在懸滴中一週之後使用相等份數之蛋白質(10 mg/mL)及儲備液(30% v/v PEG 550單甲基醚、0.1 M二水合檸檬酸三鈉pH 5.0)產生厚板，且在浸入液氮中之前用儲備液簡單處理。 在~ 110 K下在SSRL梁線11-1上收集延伸至2.7 Å解析度之複合物之繞射資料。使用程式HKL2000及CCP4套裝之元件對繞射影像進行積分及定標。參見Winn等人, 2011,Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr . 67: 235-42。 使用程式Phaser藉由分子置換(MR)解出結構。參見McCoy等人, 2005,Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr . 61: 458-64。MR搜索模型包括來源於HER2/Herceptin Fab複合物之晶體結構之HER2 ECD結構域(PDB碼：1N8Z)、Fab恆定域(PDB碼：1N8Z)及針對由程式Modeller產生之可變域的預測模型。參見Fiser等人, 2003,Methods Enzymol. , 374: 461-91。利用程式REFMAC5 (Marshudov等人, 2011,Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr . 67: 355-67)及PHENIX.refine (Adams等人, 2010,Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr . 66 (pt. 2): 213-21)，使用最大可能性目標函數、各向異性個別B因子及TLS精化來精化結構。資料及精化統計資料彙總於表12中。 表12：X射線繞射資料收集及結構精化之統計資料(括弧中之值針對最外解析殼層)
資料收集 SSRL 11-1
空間群 C2221
晶胞參數(Å) a=136.8，b=171.9，c=162.5
解析度(Å) 50-2.75 (2.85-2.75)
R對稱 0.112 (0.689)
觀測數目 319169
獨立反射 49078
冗餘度 6.5 (5.5)
完整度(%) 98.8 (92.2)
＜|＞/＜σ|＞ 20 (2.2)
Vm (A3 /Da) 4.2
     
精化   
解析度(Å) 48.33-2.75
反射數目 49053
R，R游離 0.23，0.25
殘基數目 1047
水數目 109
原子數目 8039
RMSD鍵(Å) 0.007
RMSD角度(°) 1.2
平均鍵結ΔB (Å2 ) 5.5
拉氏分析(%) 93/6/1
TLS群數目 3
＜B＞e (Å2 ) 7C2/HER2 88
結果 在2.75 Å解析度下測定7C2 Fab/HER2複合物之晶體結構。各不對稱單位晶胞含有一個Fab/HER2複合物。結構顯示7C2 Fab結合HER2 ECD之結構域I (圖19A)。結合抗原决定基與先前表徵之HER2 ECD與分別位於結構域IV及II上之治療抗體曲妥珠單抗(Tmab)或帕妥珠單抗(Pmab)之Fab片段之複合物中之彼等抗原决定基不同。參見例如Cho等人, 2003,Nature , 421: 756-60；Eigenbrot等人, 2010,PNAS , 107: 15039-44；及Franklin等人, 2004,Caner Cell , 5: 17-28。實際上，7C2 Fab/HER2 ECD複合物結構與Tmab/HER2 ECD複合物結構及Pmab/HER2 ECD複合物結構重疊顯示該三個Fab具有獨立之不重疊抗原决定基且在空間上不會干擾彼此與HER2結合(圖19A)。Tmab/HER2 ECD複合物、Pmab/HER2 ECD複合物及7C2 Fab/HER2 ECD複合物內之HER2 ECD結構疊合顯示極小結構差異(圖19B)。此觀測結果表明HER2 ECD爲相對剛性的，此結果與文獻中之先前報導一致。參見例如Cho等人, 2003,Nature , 421: 756-60；Eigenbrot等人, 2010,PNAS , 107: 15039-44；及Franklin等人, 2004,Caner Cell , 5: 17-28。 7C2 Fab結合HER2結構域I內之環163-175及環185-189 (亦即，成熟HER2之胺基酸163-175及185-189，例如SEQ ID NO:39；結構域I示於SEQ ID NO:35中)。該結合掩蔽界面每一側上~ 1160 Å2 之溶劑可接取表面積。存在疏水性氫鍵結及離子相互作用之交錯網路。參與結合之某些殘基標記於圖19C中。His171之側鏈與重鏈殘基His52及Asp55接觸。HER2殘基Ser186、Ser187及Glu188與來自重鏈之D102及來自輕鏈之兩個Tyr殘基(Tyr36及Tyr54)形成氫鍵結。 7C2結合抗原决定基與來自先前報導之抗HER2抗體chA21之抗原决定基部分重疊(圖19D)。參見Zhou等人, 2011,JBC , 286: 31676-83。兩個抗原决定基均包括結構域I中之環(殘基163-187)。令人感興趣的是，殘基His171在與兩種抗體之抗體相互作用中均起作用。然而，chA21結合抗原决定基跨越~ 1820 Å2 之溶劑可接取表面積，此結果比7C2抗原决定基高出~ 660 Å2 ，且包括兩個額外N末端環，殘基100-105及殘基135-144。 儘管已出於清楚理解之目的藉由說明及實例詳細描述上述本發明，但該描述及實例不應被視爲限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用之方式明確併入本文中。序列表
名稱 序列 SEQ ID NO
人類Her2前驅物 (UniProtKB/ Swiss-Prot: P04626.1)；aa 1-22信號序列；aa 23-1255成熟Her2 MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV    1
成熟人類HER2 TQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV 39
鼠類7C2.B9 (mu7C2)輕鏈可變區 DIVLTQSPAS LVVSLGQRAT ISCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPARFSGGG SGTDFTLNIH PVEEDDTATY YCQHSWEIPP WTFGGGTKLE IK 2
Mu7C2重鏈可變區 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT GYWMNWLKQR PGQGLEWIGM IHPSDSEIRA NQKFRDKATL TVDKSSTTAY MQLSSPTSED SAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTTLTVSS 3
Mu7C2 HVR-L1 RASQSVSGSRFTYMH 4
Mu7C2 HVR-L2 YASILES 5
Mu7C2 HVR-L3 QHSWEIPPWT 6
Mu7C2 HVR-H1 GYWMN 7
Mu7C2 HVR-H2 MIHPSDSEIRANQKFRD 8
Mu7C2 HVR-H3 GTYDGGFEY 9
人類化7C2.v2.2.LA (「hu7C2」)輕鏈可變區 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IK 10
Hu7C2重鏈可變區 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSS 11
Hu7C2 HVR-L1 RASQSVSGSRFTYMH 12
Hu7C2 HVR-L2 YASILES 13
Hu7C2 HVR-L3 QHSWEIPPWT 14
Hu7C2 HVR-H1 GYWMN 15
Hu7C2 HVR-H2 (Hu7C2. v2.1.S53L, S55A HVR-H2) MIHPLDAEIRANQKFRD 16
Hu7C2 HVR-H3 GTYDGGFEY 17
人類化C2.v2.2.LA (hu7C2) κ輕鏈 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 18
Hu7C2IgG1重鏈 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 19
Hu7C2. v2.1.S53M HVR-H2 MIHPMDSEIRANQKFRD 20
Hu7C2. v2.1.S53L HVR-H2 MIHPLDSEIRANQKFRD 21
Hu7C2. v2.1.E101K HVR-H3 GTYDGGFKY 22
人類化7C2.v2.2.LA (hu7C2) K149C κ輕鏈 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASQSVS GSRFTYMHWY QQKPGQPPKL LIKYASILES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSWEIPP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWCVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 23
Hu7C2 A118C IgG1重鏈 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IHPLDAEIRA NQKFRDRVTI TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARGT YDGGFEYWGQ GTLVTVSSCS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 24
V205C半胱胺酸經工程改造之輕鏈恆定區(Igκ) TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPCTKS FNRGEC 25
A118C半胱胺酸經工程改造之重鏈恆定區(IgG1) CSTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 26
K149C半胱胺酸經工程改造之輕鏈恆定區(Igκ) TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW CVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC 27
S400C半胱胺酸經工程改造之重鏈恆定區(IgG1) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDCDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 28
圖 1 顯示人類VH亞組I (VHI )一致序列與如實例1中所描述之鼠類7C2.B9 (「7C2」)及人類化7C2.v2.2.LA之重鏈可變區序列之比對。圖 2 顯示人類VLκ IV (VLKIV )一致序列與如實例1中所描述之鼠類7C2.B9 (「7C2」)及人類化7C2.v2.2.LA之輕鏈可變區序列之比對。圖 3 顯示Her2細胞外域結構，其中指示結構域I至IV及抗Her2抗體曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及7C2所結合之結構域。圖 4 顯示如實例3中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 5 顯示如實例4中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 6 顯示如實例5中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 7 顯示如實例6中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 8 顯示如實例7中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 9 及圖 10 顯示如實例3中所描述之用於製造某些CB-PBD連接子藥物中間物之例示性合成方法。圖 11 顯示如實例3中所描述之用於製造某些CBI-CBI連接子藥物中間物之例示性合成方法。圖 12A 至圖 12F 顯示用於本文中之實例中的某些抗體-藥物結合物的結構。圖 13A 至圖 13B 顯示帕妥珠單抗主要種類抗體輕鏈(A)及重鏈(B)胺基酸序列。圖 14A 至圖 14B 顯示例示性帕妥珠單抗變異種類抗體輕鏈(A)及重鏈(B)胺基酸序列。如 15A 至圖 15B 顯示曲妥珠單抗抗體輕鏈(A)及重鏈(B)胺基酸序列。圖 16 顯示Her2受體及結構域I至IV之序列的示意圖。圖 17 顯示如實例8中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 18 顯示如實例9中所描述用hu7C2.v2.2.LA抗體-藥物結合物(ADC)治療後腫瘤體積(mm3 )隨時間變化。圖 19A 至圖 19D 顯示(A) HER2 ECD (表面經結構域遮蔽且顯示爲空間填充模型)與7C2 Fab之間的複合物的晶體結構。7C2 Fab結合HER2之結構域I，此不同於結合曲妥珠單抗Fab (Tmab，PDB碼：1N8Z)及帕妥珠單抗Fab (Pmab，PDB碼：1S78)之抗原决定基。(B)曲妥珠單抗/HER2複合物、帕妥珠單抗/HER2複合物及7C2/HER2複合物內之HER2 ECD之結構重疊。(C) 7C2/HER2複合物界面。參與7C2/HER2相互作用之殘基的側鏈顯示爲桿狀。一些潜在分子間氫鍵顯示爲短劃線。(D) 7C2結合抗原决定基與chA21單鏈Fv (scFv)部分重疊。chA21 scFv/HER2複合物(PDB碼：3H3B)與7C2/HER2複合物之結構重疊。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (95)

  1. 一種結合HER2之經分離抗體，其中：(A)該抗體包含：(i)(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-L3；(ii)(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：20或21之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-L3；或(iii)(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-L3；以及(B)(i)該抗體包含有包含與SEQ ID NO：11具有至少90%一致性之序列的重鏈可變區及包含與SEQ ID NO：10具有至少90%一致性之序列的輕鏈可變區；(ii)該抗體為人類化IgG1、IgG2a或IgG2b抗體； (iii)該抗體為人類化抗體，且在重鏈恆定區中包含至少一個選自A118C及S400C之突變，或在輕鏈恆定區中包含至少一個選自K149C及V205C之突變；(iv)該抗體為人類化抗體，且包含SEQ ID NO：28或26之重鏈恆定區；(v)該抗體為人類化抗體，且包含SEQ ID NO：25或27之輕鏈恆定區；(vi)該抗體為杵入臼(knob-into-hole)雙特異性抗體、雙抗體(diabody)、雙重作用Fab或scFv二聚體；(vii)該抗體為結合HER2之Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')2片段、線性抗體、單鏈抗體、單域抗體或scFv；(viii)該抗體為去海藻糖基化或海藻糖缺乏抗體，或包含二等分寡糖或含有至少一個半乳糖殘基之寡糖；及/或(ix)該抗體包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸修飾之人類Fc區序列。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含有包含與SEQ ID NO：11具有至少90%一致性之序列的重鏈可變區及包含與SEQ ID NO：10具有至少90%一致性之序列的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含有包含與SEQ ID NO：11具有至少95%一致性之序列的重鏈可變區及包含與SEQ ID NO：10具有至少95%一致性之序列的輕鏈可變區。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化IgG2a或IgG2b抗體。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化IgG1抗體。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體，且在重鏈恆定區中包含至少一個選自A118C及S400C之突變。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體，且在輕鏈恆定區中包含至少一個選自K149C及V205C之突變。
  8. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體，且包含SEQ ID NO：28或26之重鏈恆定區。
  9. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體，且包含SEQ ID NO：25或27之輕鏈恆定區。
  10. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體，且包含SEQ ID NO：28或26之重鏈恆定區，以及SEQ ID NO：25或27之輕鏈恆定區。
  11. 如請求項1之抗體，其中該抗體為杵入臼雙特異性抗體。
  12. 如請求項1之抗體，其中該抗體為杵入臼雙特異性抗體，其包含有包 含T366W杵狀突變之IgG1或IgG4恆定區，及/或包含T366S、L368A或Y407V杵狀突變之IgG1或IgG4恆定區。
  13. 如請求項1之抗體，其中該抗體為雙抗體、雙重作用Fab或scFv二聚體。
  14. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸修飾之人類Fc區序列。
  15. 如請求項1之抗體，其中該胺基酸修飾包含M252Y、S254T及T256E突變。
  16. 如請求項1之抗體，其中該胺基酸修飾包含殘基265及297取代成丙胺酸。
  17. 如請求項1之抗體，其中該胺基酸修飾包含位置329之脯胺酸的取代。
  18. 如請求項1之抗體，其中該胺基酸修飾包含該Fc區之位置298、333及/或334的取代。
  19. 如請求項1之抗體，其中該胺基酸修飾包含在以下Fc區殘基處之一或多個取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、 317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及434。
  20. 如請求項1之抗體，其中該抗體為去海藻糖基化或海藻糖缺乏抗體。
  21. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含二等分寡糖。
  22. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含含有至少一個半乳糖殘基之寡糖。
  23. 如請求項1至22中任一項之抗體，其為單株抗體。
  24. 如請求項1至22中任一項之抗體，其中HER2為包含SEQ ID NO：1之胺基酸23至1255的人類HER2。
  25. 如請求項1至22中任一項之抗體，其中該抗體結合HER2之細胞外域I。
  26. 如請求項25之抗體，其中HER2之細胞外域I具有SEQ ID NO：35之序列。
  27. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至22中任一項之抗體。
  28. 一種宿主細胞，其包含如請求項27之核酸。
  29. 一種產生抗體之方法，其包括培養如請求項28之宿主細胞以便產生該抗體。
  30. 如請求項29之方法，其進一步包含分離該抗體。
  31. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  32. 如請求項31之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自奧裏斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮呯、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
  33. 如請求項32之免疫結合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為如請求項1至22中任一項之抗體；(b)L為連接子；(c)D為細胞毒性劑；且(d)p在1至8之範圍內。
  34. 如請求項33之免疫結合物，其中p在1.3至2或2至5之範圍內。
  35. 如請求項33之免疫結合物，其中p為約2。
  36. 如請求項33之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自奧裏斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯二氮呯、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
  37. 如請求項32或36之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為式A之吡咯并苯二氮呯：
    Figure 109123875-A0305-02-0275-1
     其中虛線指示雙鍵在C1與C2或C2與C3之間視情況的存在；R2係獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD係獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q係獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或者在Q為O時為SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5- 20芳基，且視情況關於該基團NRR'，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；R12、R16、R19及R17分別如針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可間雜一或多個視情況經取代之雜原子及/或芳環；且X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。
  38. 如請求項33之免疫結合物，其中D具有以下結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0276-2
     其中n為0或1。
  39. 如請求項31或33之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為奈莫柔比星衍生物。
  40. 如請求項39之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有選自以下之結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0277-3
  41. 如請求項31或33之免疫結合物，其中該細胞毒性劑包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
  42. 如請求項41之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有下式：
    Figure 109123875-A0305-02-0277-4
     其中R1係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或與L之鍵； R2係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或與L之鍵；Ra及Rb係獨立地選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基，或Ra與Rb形成五員或六員雜環基；T為選自C3-C12伸烷基、Y、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C2-C6伸烯基)-Y-(C2-C6伸烯基)及(C2-C6伸炔基)-Y-(C2-C6伸炔基)之繫鏈基團；其中Y係獨立地選自O、S、NR1、芳基及雜芳基；其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基係獨立地且視情況經F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基視情況經一或多個F取代；或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立地且視情況經與L之鍵取代；D'為選自以下之藥物部分：
    Figure 109123875-A0305-02-0278-5
     其中波狀線指示與T連接之位置；X1及X2係獨立地選自O及NR3，其中R3係選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基；R4為H、CO2R或與連接子(L)之鍵，其中R為C1-C6烷基或苯甲基；且R5為H或C1-C6烷基。
  43. 如請求項42之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有選自以下之結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0279-6
    Figure 109123875-A0305-02-0280-7
  44. 如請求項33至36及38中任一項之免疫結合物，其中該連接子可由蛋白酶裂解。
  45. 如請求項33至36及38中任一項之免疫結合物，其中該連接子具有酸不穩定性。
  46. 如請求項45之免疫結合物，其中該連接子包含腙。
  47. 如請求項33至36及38中任一項之免疫結合物，其中該連接子包含二硫化物。
  48. 如請求項33之免疫結合物，其具有選自以下之結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0280-8
    Figure 109123875-A0305-02-0281-9
  49. 如請求項33之免疫結合物，其具有選自以下之式：
    Figure 109123875-A0305-02-0281-10
    Figure 109123875-A0305-02-0282-11
  50. 如請求項33之免疫結合物，其具有選自以下之結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0282-12
    Figure 109123875-A0305-02-0283-13
  51. 如請求項31或33之免疫結合物，其中該細胞毒性劑包含以下結構：
    Figure 109123875-A0305-02-0283-14
  52. 如請求項33至36、38及48至50中任一項之免疫結合物，其中p在1.3至2範圍內。
  53. 如請求項33至36、38及48至50中任一項之免疫結合物，其中p在2至5範圍內。
  54. 一種醫藥調配物，其包含如請求項31至53中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  55. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  56. 如請求項54或55之醫藥調配物，其進一步包含額外治療劑。
  57. 如請求項56之醫藥調配物，其中該額外治療劑為結合HER2之抗體或免疫結合物。
  58. 如請求項57之醫藥調配物，其中該額外治療劑為(i)結合HER2之結構域II的抗體或免疫結合物，及/或(ii)結合結構域IV或HER2的抗體或免疫結合物。
  59. 如請求項57之醫藥調配物，其中該額外治療劑為(i)結合抗原決定基 2C4之抗體或免疫結合物，及/或(ii)結合抗原決定基4D5之抗體或免疫結合物。
  60. 如請求項56之醫藥調配物，其中該額外治療劑係選自曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-MCC-DM1(T-DM1)及帕妥珠單抗。
  61. 如請求項56之醫藥調配物，其進一步包含(1)曲妥珠單抗或T-DM1及(2)帕妥珠單抗。
  62. 一種如請求項31至53中任一項之免疫結合物或如請求項54至61中任一項之醫藥調配物之用途，其用於製備治療患有HER2陽性癌症之個體的藥劑。
  63. 如請求項62之用途，其中該HER2陽性癌症為胃癌。
  64. 如請求項62之用途，其中該HER2陽性癌症為乳癌。
  65. 如請求項64之用途，其中該HER2陽性乳癌為早期乳癌。
  66. 如請求項64之用途，其中該HER2陽性乳癌為轉移性乳癌。
  67. 如請求項62至66中任一項之用途，其中該藥劑進一步包括額外治療劑或與其併用。
  68. 一種如請求項31至53中任一項之免疫結合物之用途，其用於製備治療患有HER2陽性癌症之個體的藥劑，其中該藥劑進一步包括至少一種額外治療劑或與至少一種額外治療劑併用。
  69. 如請求項68之用途，其中該額外治療劑為結合HER2之抗體或免疫結合物。
  70. 如請求項69之用途，其中該額外治療劑為(i)結合HER2之結構域II的抗體或免疫結合物，及/或(ii)結合結構域IV或HER2之抗體或免疫結合物。
  71. 如請求項69之用途，其中該額外治療劑為(i)結合抗原決定基2C4之抗體或免疫結合物，及/或(ii)結合抗原決定基4D5之抗體或免疫結合物。
  72. 如請求項68之用途，其中該額外治療劑係選自曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-MCC-DM1(T-DM1)及帕妥珠單抗。
  73. 如請求項68之用途，其中該額外治療劑為(1)曲妥珠單抗或T-DM1及(2)帕妥珠單抗。
  74. 如請求項68至73中任一項之用途，其中該HER2陽性癌症為乳癌或胃癌。
  75. 如請求項74之用途，其中該HER2陽性乳癌為轉移性乳癌。
  76. 如請求項75之用途，其中該額外治療劑為T-DM1。
  77. 如請求項75之用途，其中該額外治療劑為曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及化學治療劑。
  78. 如請求項75之用途，其中該HER2陽性乳癌為早期乳癌。
  79. 如請求項62至66及68至73中任一項之用途，其中該HER2陽性癌症為復發性癌症。
  80. 如請求項79之用途，其中該復發性癌症為局部復發性癌症。
  81. 如請求項62至66及68至73中任一項之用途，其中該HER2陽性癌症為晚期癌症。
  82. 如請求項62至66及68至73中任一項之用途，其中該HER2陽性癌症為非可切除型。
  83. 一種如請求項31至53中任一項之免疫結合物或如請求項54至61中任一項之醫藥調配物之用途，其用於製備患有HER2陽性癌症之個體的藥 劑，其中該治療包括：a)用如請求項31至53中任一項之免疫結合物或如請求項54至61中任一項之醫藥調配物對該個體進行新輔助治療；b)藉由確定性手術移除該癌症；及c)用如請求項31至53中任一項之免疫結合物或如請求項54至61中任一項之醫藥調配物對該個體進行輔助治療。
  84. 如請求項83之用途，其中該HER2陽性癌症為胃癌。
  85. 如請求項83之用途，其中該HER2陽性癌症為乳癌。
  86. 一種如請求項31至53中任一項之免疫結合物或如請求項54至61中任一項之醫藥調配物之用途，其用於製備抑制HER2陽性細胞增殖之藥劑，其中該治療包括在允許如請求項31至53中任一項之免疫結合物與該細胞表面上之HER2結合的條件下將該細胞暴露於該免疫結合物，從而抑制該細胞增殖。
  87. 如請求項86之用途，其中該細胞為胃癌細胞之乳癌細胞。
  88. 如請求項1至22中任一項之抗體，其與標記結合。
  89. 如請求項88之抗體，其中該標記為正電子發射體。
  90. 如請求項89之抗體，其中該正電子發射體為89Zr。
  91. 一種活體外偵測生物樣品中之人類HER2的方法，其包括使該生物樣品與如請求項1至22及88至90中任一項之抗HER2抗體在允許該抗HER2抗體與天然存在之人類HER2結合的條件下接觸，及偵測在該抗HER2抗體與該生物樣品中天然存在之人類HER2之間是否形成複合物。
  92. 如請求項91之方法，其中該生物樣品為乳癌或胃癌樣品。
  93. 一種標記之抗HER2抗體之用途，其用於製備偵測HER2陽性癌症之藥劑，其中該HER2陽性癌症係以包括以下之方法所偵測：(i)向患有或疑似患有HER2陽性癌症之個體投與經標記之抗HER2抗體，其中該經標記之抗HER2抗體包含如請求項1至22中任一項之抗HER2抗體，及(ii)在該個體中偵測該經標記之抗HER2抗體，其中該經標記之抗HER2抗體之偵測指示該個體中之HER2陽性癌症。
  94. 如請求項93之用途，其中該經標記之抗HER2抗體包含與正電子發射體結合之抗HER2抗體。
  95. 如請求項94之用途，其中該正電子發射體為89Zr。
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