TWI631135B - 抗jagged1抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供抗Jagged1抗體及其使用方法。
Description
本發明係關於抗Jagged抗體及其使用方法。
Notch信號傳導路徑調節一系列不同之細胞功能(Kopan等人,Cell 137,216-233(2009))。已在哺乳動物中識別出四種Notch受體,亦即Notch 1-4,其共有包括細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域在內之基本結構要素。同樣,Notch之典型配體共有某些結構相似性,但亦已識別出Notch之多種非典型配體(Kopan等人,Cell 137,216-233(2009))。哺乳動物中之五種典型配體為Delta樣1、Delta樣3、Delta樣4、Jagged1及Jagged2。Notch配體與Notch受體之細胞外結構域結合使信號傳導級聯啟動,該信號傳導級聯起始於在細胞外S2位點處由ADAM(去整合素及金屬蛋白酶)家族之α分泌酶進行蛋白水解裂解。在S2處之裂解後,由γ分泌酶在細胞內S3位點處進行蛋白水解裂解,從而引起細胞內結構域之釋放及下游事件,最終活化Notch依賴性轉錄因子,諸如Hes1及Hey。
異常之Notch表現及信號傳導已涉及多種疾病,包括癌症(Koch等人,Cell.Mol.Life Sci.64,2746-2762(2007))。顯然,持續需要具有對於研發作為治療劑而言最優之臨床屬性的藥劑。本文所述之本發明滿足此需求且提供其他益處。
本發明提供抗Jagged1抗體及其使用方法。
本發明者出人意料地發現抗Jagged1抗體A-1(參見圖4及PCT公開案第2014/028446號)在熱處理及/或凍融條件之後在重鏈中裂解。該抗體的不良穩定性潛在地降低其作為治療劑的價值。對裂解位點之分析揭露無已知之蛋白酶裂解基元。因此尚不知曉使抗體序列發生變化是否可
減少所觀測到之裂解。此外,由於裂解位點處於重鏈HVR中,因此即使胺基酸變化會使得裂解減少,亦不知曉是否可進行該等變化而不顯著降低抗體對Jagged1之親和力。本發明者驚人地發現HVR-H3中位置101處之胺基酸的突變可減少裂解而僅使親和力略有損失。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其中該抗體包含HVR-H3,該HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59,其中X為除S以外的任何胺基酸。在一些實施例中,該抗體包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或五個選自以下之HVR:包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在一些實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3;或(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3;或(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3。在本文所述之任何實施例中,該抗體可包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;或(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;或(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在一些實施例中,結合Jagged1之分離的抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;或(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:
78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;或(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在一些實施例中,結合Jagged1之分離的抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:54、58或62具有至少95%一致性之VH序列。在一些實施例中,結合Jagged1之分離的抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:10、26或34具有至少95%一致性之VL序列。在一些實施例中,該抗體包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO:54具有至少95%一致性之VH序列及與胺基酸序列SEQ ID NO:34具有至少95%一致性之VL序列;或(b)與胺基酸序列SEQ ID NO:58具有至少95%一致性之VH序列及與胺基酸序列SEQ ID NO:10具有至少95%一致性之VL序列;或(c)與胺基酸序列SEQ ID NO:62具有至少95%一致性之VH序列及與胺基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95%一致性之VL序列。
在一些實施例中,結合人類Jagged1之分離的抗體包含(a)VH序列SEQ ID NO:54,其中X為除S以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:34;或(b)VH序列SEQ ID NO:58,其中X為除S以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:10;或(c)VH序列SEQ ID NO:62,其中X為除S以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:26。在一些實施例中,該抗體包含VH序列SEQ ID NO:54及VL序列SEQ ID NO:34。在一些實施例中,重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:56且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。在一些實施例中,重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:57且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。
在本文所述之任何實施例中,X可為除S或H以外的任何胺基酸。在本文所述之任何實施例中,X可選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、RT及V。在本文所述之任何實施例中,X可為T。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;或(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;或(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其包含(a)VH序列SEQ ID NO:33及VL序列SEQ ID NO:34;或(b)VH序列SEQ ID NO:65及VL序列SEQ ID NO:10;或(c)VH序列SEQ ID NO:66及VL序列SEQ ID NO:26。在一些實施例中,該抗體包含VH序列SEQ ID NO:33及VL序列SEQ ID NO:34。
在本文所述之以上任何實施例中,該抗體可為單株抗體。在某些實施例中,該抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在本文所述之以上任何實施例中,該抗體可為抗體片段。
以上任何實施例可為全長IgG1抗體。在一些實施例中,該抗體為缺乏效應物功能之IgG1抗體。在一些實施例中,該抗體為包含N297G或N297A突變之IgG1抗體。在一些實施例中,該抗體為包含N297G突變之IgG1抗體。
在一些實施例中,提供一種結合Jagged1之分離的抗體,其中重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:51且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。在一些實施例中,重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:52且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。在一些實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:69之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:75之輕鏈;或(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:70之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:76之輕鏈;或(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:79之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:75之輕鏈;或(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:80之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:76之輕鏈。
在本文所述之任何實施例中,該抗體可為Jagged1介導之信號傳導之拮抗劑。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1及鼠類Jagged1。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類、大鼠及石蟹獼猴Jagged1。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,而不結合人類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類、大鼠及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、石蟹獼猴或鼠類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2或DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,但不結合人類Jagged2或人類DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2或人類或鼠類DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、鼠類或石蟹獼猴Jagged2或者人類、鼠類或石蟹獼猴DLL1。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2、DLL1或DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,但不結合人類Jagged2、人類DLL1或人類DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2、人類或鼠類DLL1、或者人類或鼠類DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類、大鼠及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、鼠類或石蟹獼猴Jagged2、人類、鼠類或石蟹獼猴DLL1、或者人類、鼠類或石蟹獼猴DLL4。
在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之親和力(Kd)為2nM或更強(亦即小於2nM)。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之親和力(Kd)為1.5nM或更強、或1nM或更強、或0.9nM或更強、0.8nM或更強、或0.7nM或更強(亦即小於1.5nM、小於1nM、小於0.9nM、小於0.8nM、或小於0.7nM)。在一些實施例中,該抗體結合鼠類Jagged1之親和力(Kd)為2nM或更強(亦即小於2nM)。在一些實施例中,該抗體結合鼠類Jagged1之親和力(Kd)為1.5nM或更強、或1nM或更強、或0.9nM或更強、0.8nM或更強、0.7nM或更強、或0.6nM或更強、或0.5nM或更強(亦即小於1.5nM、小於1nM、小於0.9nM、小於0.8nM、小於0.7nM、小於0.6nM、或小於0.5nM)。在一些實施例中,使用表面電漿子共振來量測親和力(Kd)。
在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之締合常數(kon)為至少1.0E+04/Ms、或至少1.5E+04/Ms、或至少2.0E+04/Ms。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之解離常數(koff)小於10.0E-04/s、或小於9.0E-04/s、或小於8.0E-04/s、或小於7.0E-04/s。在一些實施例中,該抗體結合鼠類Jagged1之締合常數(kon)為至少1.0E+04/Ms、或至少1.5E+04/Ms、或至少2.0E+04/Ms、或至少3.0E+04/Ms、或至少4.0E+04/Ms、或至少5.0E+04/Ms、或至少6.0E+04/Ms、或至少7.0E+04/Ms。在一些實施例中,該抗體結合鼠類Jagged1之解離常數(koff)小於10.0E-04/s、或小於9.0E-04/s、或小於8.0E-04/s、或小於7.0E-04/s。在一些實施例中,使用表面電漿子共振來量測締合常數及解離常數。
在一些實施例中,該抗體結合原生折疊之Jagged1,但不結合變性之Jagged1。在一些實施例中,該抗體在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中結合Jagged1,但在西方印漬術(Western blot)時不結合Jagged1。在一些實施例中,該抗體在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中結合折疊之Jagged1,但在西方印漬術時不結合變性之Jagged1。在一些實施例中,該抗體在生理條件下結合折疊之Jagged1,但不結合變性之Jagged1。
在一些實施例中,該抗體減少小鼠異種移植模型中之腫瘤生長而不引起體重下降。在一些實施例中,該小鼠異種移植模型為肝癌異種
移植模型。在一些實施例中,使腫瘤生長減少至少50、至少60、至少70、至少80或至少90AUC/天TGI%。
在一些實施例中,使用Jagged1抗體可減少小鼠氣道高反應性模型之肺中的杯狀細胞化生。在一些實施例中,投與該抗體可使肺中杯狀細胞之數目減少至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。在另一態樣中,本發明提供一種與以上任何實施例競爭特異性結合Jagged1之分離的抗體。在一些實施例中,抗體與包含含序列SEQ ID NO:33之重鏈可變區及包含序列SEQ ID NO:34之輕鏈可變區的抗體競爭結合人類Jagged1,其中該抗體不為抗體A、抗體A-1或抗體A-2。
在另一態樣中,本發明提供一種編碼以上實施例之分離的抗體的分離的核酸。在另一態樣中,本發明提供一種宿主細胞,其包含編碼該抗體之分離的核酸。在另一態樣中,本發明提供一種產生抗體之方法,其包括培養該宿主細胞以產生該抗體。
在另一態樣中,本發明提供一種免疫結合物,其包含上述任何實施例之抗體及細胞毒性劑。
在另一態樣中,本發明提供一種醫藥調配物,其包含上述任何實施例之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中,提供上述任何實施例之抗體以用作藥物。在一些實施例中,提供上述任何實施例之抗體以用於治療癌症。在一些實施例中,提供上述任何實施例之抗體以用於減少癌細胞生長。
在另一態樣中,提供一種抑制Jagged1介導之信號傳導之方法。在一個實施例中,提供一種活體外抑制Jagged1介導之信號傳導之方法。在一個實施例中,提供一種活體內抑制Jagged1介導之信號傳導之方法。
在另一態樣中,治療患有癌症之個體之方法包括投與該個體有效量之上述任何實施例之抗體。在一個實施例中,該癌症選自由以下組成之群:乳癌、肺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚癌、B細胞惡性病及T細胞惡性病。
本發明者發現使用Jagged1抗體進行治療可使氣道中之細胞
命運自分泌細胞(包括杯狀細胞)命運偏離而朝向纖毛細胞命運。Jagged1信號傳導對於維持分泌細胞命運而言為重要的,且抑制Jagged1信號傳導可防止杯狀細胞化生。本發明者亦展示棒狀細胞向纖毛細胞之轉化為直接的且不涉及細胞分裂(資料未示)。一種細胞類型向另一種細胞類型之此轉分化出現於成人肺中且不同於諸如在損傷之後或在發育期間涉及祖細胞分裂之細胞命運選擇。杯狀細胞化生或過量黏液為若干氣道疾病之標誌,諸如氣喘、囊腫性纖維化、COPD及巴瑞特氏食道(Barrett's esophagus)。此等Jagged抑制結果提供如在氣道疾病(例如氣喘、COPD、囊腫性纖維化)及巴瑞特氏食道中涉及使用Jagged1或Jagged2抑制劑來預防或逆轉杯狀細胞化生及治療特徵在於過量黏液之病狀之治療應用的基礎。
在一些實施例中,提供使棒狀細胞轉化成纖毛細胞之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,提供增加棒狀細胞向纖毛細胞之轉化的方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1之拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,棒狀細胞存在於成人之氣道(例如肺)中。在一些實施例中,該轉化在不存在棒狀細胞分裂之情況下出現。在一些實施例中,該個體患有選自過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病的疾病。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供減少杯狀細胞數目之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,提供減少棒狀細胞向杯狀細胞轉化之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,杯狀細胞存在於成人氣道(例如肺)中。在一些實施例中,該個體患有選自過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病的疾病。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實
施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供減少受試者之杯狀細胞形成的方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,成人氣道(例如肺)中杯狀細胞之形成減少。在一些實施例中,該個體患有選自過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病的疾病。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供減少黏液之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,該黏液為氣道黏液。在一些實施例中,該黏液存在於成人氣道(例如肺)中。在一些實施例中,該個體患有選自過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病的疾病。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供增加纖毛細胞數目之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,提供增加纖毛細胞形成之方法,該等方法包括向個體投與結合人類Jagged1的拮抗劑抗體(包括(但不限於)本文所述之任何抗Jagged1抗體)。在一些實施例中,該纖毛細胞存在於成人氣道(例如肺)中。在一些實施例中,該個體患有選自過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病的疾病。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、
氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體增加成人氣道(例如肺)中棒狀細胞向纖毛細胞之轉化。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體減少成人氣道(例如肺)中杯狀細胞之數目。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體減少成人氣道(例如肺)中杯狀細胞之形成。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體減少成人氣道(例如肺)中之黏液。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體增加成人氣道(例如肺)中纖毛細胞之數目。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在一些實施例中,提供一種結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之任何抗Jagged1抗體),其用於治療選自以下之疾病:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過量黏液有關之疾病,該治療包括向患有癌症之個體投與有效量之本文所述之任何實施例之抗體,其中該結合人類Jagged1之抗體增加成人氣道(例如肺)中纖毛細胞之形成。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在另一個態樣中,提供(a)使纖毛細胞轉化成棒狀細胞(例如其中該纖毛細胞存在於成人氣道(例如肺)中)之方法;(b)增加黏液(例如氣道黏液)之方法;(c)減少纖毛細胞數目(例如人類氣道纖毛細胞)之方法,其包括向個體投與Jagged信號傳導之促效劑。
在一些實施例中,提供一種治療選自以下之疾病的方法:過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關之疾病及與過
量黏液有關之疾病,該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之結合人類Jagged1之抗體(包括例如本文所述之結合人類Jagged1之任何抗體)。在一些實施例中,該疾病與杯狀細胞化生(例如在肺中)有關。在一些實施例中,該疾病選自氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道。
在本文所述之任何實施例中,其中Jagged1抗體使小鼠異種移植模型之腫瘤生長減少而不引起體重下降。
在本文所述之任何實施例中,抗Jagged1抗體可與標記結合。在一些實施例中,該標記為正子發射體。在一些實施例中,該正子發射體為89Zr。在一些實施例中,提供一種在生物樣品中偵測人類Jagged1之方法,其包括使該生物樣品與本文所述之抗體在容許該抗體結合至天然存在之人類Jagged1的條件下接觸,及偵測在該抗體與該生物樣品中之天然存在之人類Jagged1之間是否形成複合體。在一些實施例中,該生物樣品選自乳癌、肺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚癌、B細胞惡性病及T細胞惡性病。
圖1展示人類及鼠類Jagged1蛋白質之例示性胺基酸序列。
圖2展示人類及鼠類Jagged2蛋白質之例示性胺基酸序列。
圖3A-D展示用於噬菌體抗體文庫篩選及選擇之肽的胺基酸序列。所有蛋白質在BEVS細胞中均表現為分泌蛋白且其序列以自N端至C端之方向列出。(A)所表現之蛋白質鼠類Jagged 1-DSL-EGF1-4(Q34-D377)之胺基酸序列。N端處之粗體字表示短連接子序列(ADLGS)(SEQ ID NO:82)。C端處之粗體字表示短連接子序列(EFG)、凝血酶裂解位點(LVPRGS)(SEQ ID NO:83)、G間隔子及6-His標簽。(B)所表現之蛋白質人類Jag1-DSL-EGF1-4之胺基酸序列。僅展示Jag1序列,但該抗原在C端處亦含有TEV蛋白酶裂解位點及6-His標簽。(C)所表現之蛋白質鼠類Jag2-DSL-EGF1-4(M27-E388)之胺基酸序列。N端處之粗體字表示短連接子序列(ADLGS)(SEQ ID NO:82)。C端處之粗體字表示短連接子序列(EFG)、凝血酶裂解位點(LVPRGS)(SEQ ID NO:83)、G間隔子及6-His標簽。(D)所表現之蛋白質人類Jag2-DSL-EGF1-4(R2-E388)之胺基酸序列。C端處之
粗體字表示短連接子序列(EFG)、凝血酶裂解位點(LVPRGS)(SEQ ID NO:83)、G間隔子及6-His標簽。
圖4A-1-B-2展示抗Jagged1抗體(A、A-1、A-2)、抗Jagged2抗體(B、B-1、B-2、B-3)及抗Jagged1/2抗體(C、C-1、D、D-1、D-2、D-3、D-4、D-5)之重鏈可變域(圖4A-1及圖4A-2)及輕鏈可變域(圖4B-1及圖4B-2)之胺基酸序列的比對。指示出互補決定區(CDR)之胺基酸位置。
圖5A-B展示如實例中所述之抗Jagged1抗體之H1、H2及H3重鏈高變區(HVR)序列。胺基酸位置係根據如本文及別處所述之Kabat編號系統來編號。
圖6展示實例中所述之抗Jagged1抗體之L1、L2及L3輕鏈HVR序列。胺基酸位置係根據如下文所述之Kabat編號系統來編號。
圖7展示實例中所述之抗Jagged1抗體之輕鏈及重鏈構架序列。上標中之數字指示根據Kabat之胺基酸位置。
圖8展示由篩選獲得之抗體之結合特異性。量測抗體A及B之結合特異性之ELISA分析之結果,該抗體A及該抗體B係在使用人類Jag1-DSL-EGF1-4(圖3B;抗體A)以及鼠類及人類Jag2-DSL-EGF1-4(圖3C及D;抗體B)篩選期間所識別出。黑色條柱=與人類Jagged1之結合;灰色條柱=與人類Jagged2之結合。C-1為結合Jagged1及Jagged2兩者之抗體。
圖9A-B展示親和力成熟之抗Jagged抗體對Notch信號傳導之抑制作用。如實例3中所述進行共培養物分析。所示濃度之噬菌體抗體標示於x軸上。所示濃度之DAPT用作抑制Notch信號傳導之陽性對照;DMSO用作媒劑對照。藉由Jagged1(深灰色條柱)或Jagged2(淺灰色條柱)誘導信號傳導。未處理組=未用配體刺激且未用抗體處理之培養物;無刺激組=未用配體刺激之培養物;agD=同型對照抗體;刺激/無AB組=用配體刺激但未用抗體處理之培養物;γ-分泌酶抑制劑DAPT或DAPT媒劑對照DMSO。
圖10A-B展示對Jagged1及Jagged2進行組合抑制會引起快速之體重下降。(A)使用抗Jagged1/2抗體C-1(抗J1/2;5-10mpk)、抗Jagged1抗體A-2(抗J1;5-20mpk)、抗Jagged2抗體B-3(抗J2;5-20mpk)、抗體
A-2連同B-3一起(抗J1及抗J2;各5mpk)或同型對照抗體(20mpk)每週兩次對小鼠進行給藥。在必要時,使用同型對照抗體使每次給藥之總抗體濃度達到20mpk。繪製呈相對於起始體重之百分比形式之平均體重變化(y軸)隨時間(x軸)變化之圖表。(B)使用30mpk之抗gD同型对照抗体或使用15mpk抗体A-2加上15mpk抗体B-3之组合每週两次对Balb/c小鼠(每组十隻,个别地圈养)进行腹膜內注射八天。藉由每天对在各个笼中所送入及残留之食物进行称重来评定食物摄入量。誤差槓表示標準偏差(n=10)。
圖11A-1-B-2展示抗Jagged1拮抗劑抗體在活體內對人類肺癌細胞生長之抑制作用。使用20mpk抗gD同型對照抗體(同型對照Ab)或使用抗Jagged1抗體A-2(抗Jagl)每週兩次對帶有人類肺癌異種移植物之小鼠進行腹膜內(IP)注射,在平均腫瘤體積(使用測徑規量測)達到約180mm3後開始注射。隨後量測腫瘤體積(y軸),持續19天。圖11A-1及圖11A-2:使用線性混合效應模型繪製各組(n=10)之平均腫瘤體積隨時間(x軸)變化之圖(圖11A-1)。各組中各小鼠之腫瘤體積描繪於圖11A-2中之兩個圖中。圖11B-1及圖11B-2:量測各小鼠之總體重且以各組平均之變化百分比(圖11B-1)或各組中各小鼠平均之變化百分比(圖11B-2)形式繪製成圖表。
圖12A-B展示抗Jagged1拮抗劑抗體及抗Jagged2拮抗劑抗體在活體內對人類乳癌細胞生長之抑制作用。在第0天、第4天、第7天、第12天、第15天、第18天、第22天、第25天、第29天、第32天、第36天、第43天、第50天及第57天,使用以下對帶有人類乳癌異種移植物之C.B-17 SCID.bg小鼠進行注射:抗gD同型對照抗體(抗gD)、抗豚草同型對照抗體(抗豚草)、人類IgG1主鏈中之抗Jagged1抗體A-2(抗Jag1 A-2(hIgG1))、鼠類IgG2a主鏈中之抗Jagged1抗體A-2(抗Jag1 A-2(mIgG2a))或人類IgG1主鏈中之抗Jagged2抗體B-3(抗Jag2 B-3(hIgG1))。使用線性混合效應模型繪製處理組(A)或個別動物(B)之腫瘤體積(y軸)隨時間(x軸)變化之圖。
圖13A-C展示抗Jagged1抗體在重鏈中之裂解。(A)藉由標準SDS-PAGE及蛋白質染色法在不存在(-)或存在(+)還原劑DTT之情況下分析抗體A、A-1及A-2,如所指示。亦展示分子質量標準(以kD為單位)。
圖(B)顯示對A-1之質譜(MS)分析(LC-MS/TOF,還原條件)之代表性掃描。註明相關片段(峰)之位置,且分子質量示於峰上方。此分析指示裂解位點處於CDR3中之HC胺基酸G100與S101之間,如圖(C)中之HC胺基酸序列中所圖示,其中用箭頭標記裂解位置。
圖14A-C展示對抗Jagged1抗體重鏈裂解位點之N端肽定序。遵循在還原條件下進行SDS-PAGE及蛋白質染色之標準方法,分離且識別所示抗體製劑之全長及裂解片段(A)。自凝膠中剪出C端(B)及N端(C)裂解之肽片段且使用肽N端定序之標準方法來定序以準確地識別裂解位點。圖(B)及(C)中以紅色字體突出顯示之序列指示所定序之肽各自之N端序列,其中圖(B)中之序列標記裂解位點且圖(C)中之序列標記HC之N端。
圖15展示抗Jagged1抗體之重鏈S101處之胺基酸變化對重鏈裂解之影響。
圖16A-B展示(A)在70℃下培育之抗Jagged1抗體之裂解的SDS-PAGE分析;及(B)在70℃及95℃下對各抗體製劑所觀測到之重鏈裂解百分比之總結。
圖17A-B展示(A)在不同次數之凍融循環後抗Jagged1抗體A-1之裂解之SDS-PAGE分析,及(B)在各種條件下所觀測到之重鏈裂解百分比。
圖18A-C展示(A)抗Jagged1抗體A-1(左側條柱)及A-1(S101T)(右側條柱)在各種濃度下對Jagged1誘導之活化的抑制作用。圖(B)及(C)分別展示平均螢火蟲螢光素酶值及平均海腎螢光素酶值,其用於計算(A)中之資料,如實例10中所述。
圖19展示接受抗Jagged2抗體與抗Jagged1抗體A-1或A-1(S101T)之組合或同型對照投藥的小鼠之細支氣管上皮中纖毛細胞(如由對α-微管蛋白之免疫螢光偵測而以紅色標記)及棒狀細胞(club cell)(如由對CC10之免疫螢光偵測而以綠色標記)之免疫螢光染色,如實例11中所述。
圖20A-B展示(A)接受抗Jagged1抗體A-1或A-1(S101T)處理之肝癌異種移植模型小鼠之腫瘤體積的LME(線性混合效應)圖表,及(B)(A)中所示之處理組及劑量、研究最後一天(第44天)之腫瘤體積、AUC/
天%TGI(相對於對照組之每天曲線下面積腫瘤生長抑制百分比(TGI),其中下限及上限分別係指各組中個別動物之最低及最高之%TGI值)、以天計之腫瘤倍增時間(TTP 2X)及在實驗期間表現出部分反應(PR)之小鼠的數目。
圖21A-B展示(A)圖20中所示之小鼠之小鼠體重隨時間變化之LME(線性混合效應)圖表,及(B)(A)中所示之處理組及劑量、研究最後一天之體重變化%(最後一天之BW%)、體重之最大變化%(最大BW%)及體重出現最大變化之日(最大BW%日)以及(AUC/天(下限,上限))。
圖22A-B展示抗Jagged1抗體A-1(S101T)之(A)重鏈可變域及(B)輕鏈可變域之胺基酸序列。指示出互補決定區(CDR)之胺基酸位置。
圖23a-c展示(a)對照小鼠、經抗Jagged1抗體、抗Jagged2抗體或抗Jagged1抗體+抗Jagged2抗體之組合處理之小鼠之肺氣道的過碘酸-希夫染色;(b)不同處理組之氣道中杯狀細胞數目的定量;及(c)如由蘇木精-伊紅染色法所評定之發炎指數。
圖24展示(左側)抗Jagged1抗體A-2及(右側)抗Jagged1/2抗體C-1與人類Jagged1、鼠類Jagged1、人類Jagged 2、鼠類Jagged2、人類DLL1、鼠類DLL1、人類DLL4及鼠類DLL4之結合。
圖25展示在向小鼠單次靜脈內投與三種不同劑量之抗Jagged1 A-1-S101T抗體後該抗體之清除。
用於本文之目的之「接受體人類構架」為包含如下文所定義之源自於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「源自於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與其相同之胺基酸序列,或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中,胺基酸變化之數目為10處或少於10處、9處或少於9處、8處或少於8處、7處或少於7處、6處或少於6處、5處或少於5處、4處或少於4處、3處或少於3處或者2處或少於2處。在一些實施例中,VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列相同。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示,否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)之成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常見方法來量測,包括本文所述之彼等方法。量測結合親和力之特定之說明性及例示性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指與親本抗體相比在一或多個高變區(HVR)中具有一或多處變化之抗體,該親本抗體不具有該等變化,該等變化使得抗體對抗原之親和力有所改良。
術語「抗Jagged抗體」及「結合Jagged之抗體」係指能夠以足夠之親和力結合Jagged1、Jagged2或Jagged1及2(Jagged1/2)之抗體,因此該抗體可用作靶向Jagged之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中,抗Jagged抗體與無關之非Jagged蛋白質之結合程度小於抗體與Jagged之結合的約10%,如例如由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中,結合Jagged之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中,抗Jagged抗體結合Jagged中在來自不同物種之Jagged之間保守之抗原決定基。術語「抗Jagged1抗體」及「結合Jagged1之抗體」係指能夠以足夠之親和力結合Jagged1之抗體,因此該抗體可用作靶向Jagged1之診斷劑及/或治療劑。
本文中之術語「抗體」在最廣泛之意義下使用且涵蓋各種抗體結構,包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段,只要其展現所需之抗原結合活性即可。
如本文所用之「氣喘」係指特徵在於可變且復發之症狀、可逆轉之空氣流阻塞(例如藉由支氣管擴張劑)及可能或未必與潛在發炎有關之支氣管高反應性的複雜病症。氣喘之實例包括阿司匹靈敏感性/加重型氣喘、異位性氣喘、重度氣喘、輕度氣喘、中度至重度氣喘、未接受過皮質類固醇治療之氣喘、慢性氣喘、皮質類固醇抗性氣喘、皮質類固醇難治性
氣喘、新診斷出且未經治療之氣喘、因吸煙所致之氣喘、在皮質類固醇下不受控制之氣喘及如J Allergy Clin Immunol(2010)126(5):926-938中所提及之其他氣喘。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為顯著抑制(部分或完全)與其結合之抗原之生物活性的抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原之部分的分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;雙功能抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「結合相同之抗原決定基之抗體」係指抗體在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或大於50%,及相反,在競爭分析中參考抗體將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或大於50%。例示性競爭分析提供於本文中。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自於特定來源或物種,而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自於不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五種主要類別之抗體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且此等類別中之若干種可進一步分成子類(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域係分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破裂之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素);化學治療劑或藥物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑);生長抑制劑;酶及其片段,諸如核分解酶;抗生素;毒素,諸如
細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段及/或變異體;及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應物功能」係指隨抗體同型而變之可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性。抗體效應物功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)下調;及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必要之劑量下且在必要之時段內有效達成所需之治療或預防結果之量。
本文中之術語「Fc區」係用於定義免疫球蛋白重鏈中含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中,人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而,Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外說明,否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統,該EU編號系統亦稱作EU索引,如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR一般由以下四個FR結構域組成:FR1、FR2、FR3及FR4。因此,HVR及FR序列一般以如下序列出現在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文可互換使用且係指具有與原生抗體結構實質上相似之結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入有外源性核酸之細胞,包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型之細胞」,其包括轉型之初級細胞及自其衍生之子代而不考慮傳代數目。子代在核酸含量方面可與母細胞不完全相同,但可含有突變。在本文中包括突變型子代,該突變型子代之功能或生物活性與在最初轉型之細胞中所篩選或選擇之功能或生物活性相同。
「人類抗體」為如下抗體,該抗體具有對應於由人類或人類細胞產生或源自於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列。此人類抗體之定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表所選擇之人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言,所選擇之人類免疫球蛋白VL或VH序列來自於可變域序列之亞群。一般而言,序列之亞群為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH出版號91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中之亞群。在一個實施例中,對於VL,亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群κI。在一個實施例中,對於VH,亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群III。
「人類化」抗體係指嵌合抗體,其包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基。在某些實施例中,人類化抗體將包含至少一個,且通常兩個可變域之實質上全部,其中所有或實質上所有HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之HVR,且所有或實質上所有FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源自於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上確定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸位點」)之各區域。一般而言,抗體包含六個HVR:三個處於VH中(H1、H2、H3),且三個處於VL中(L1、L2、L3)。本文中之例示性HVR包括:(a)存在於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));(b)存在於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991));(c)存在於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原接觸位點(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));以及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合,包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另外指示,否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)來編號。
「免疫結合物」為結合至一或多種異源性分子之抗體,該一或多種異源性分子包括(但不限於)細胞毒性劑。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物,諸如猴)、兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中,個體或受試者為人類。
「分離」之抗體為已與其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中,抗體經純化以達到大於95%或99%之純度,如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法的評述,參見例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
「分離」之核酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。分離的核酸包括如下之核酸分子,該核酸分子包含於通常含有該核酸分子之細胞中,但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗Jagged抗體之分離的核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子,包括處於單個載體或各別載體中之該(該等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之該(該等)核酸分子。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質之抗體獲得之抗體,亦即除了可能之變異抗體之外,該等構成該群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基,該等可能之變異抗體例如含有天然存在之突變或在製備單株抗體製劑期間產生,該等變異體一般以少量存在。與多株抗體製劑相反,該等多株抗體製劑通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體,而單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此,修飾語「單株」指示抗體之特徵在於自一群實質上均質之抗體獲得而不應被視為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言,欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術來製備,包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法,製備單株抗體之該等方法及其他例示性方法係描述於本文中。
「裸抗體」係指抗體未結合至異源性部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「原生抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言,原生IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白,由藉由二硫鍵鍵結的兩條相同之輕鏈及兩條相同之重鏈構成。自N端至C端,各重鏈具有可變區(VH),該可變區(VH)亦稱作可變重鏈結構域或重鏈可變域,之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地,自N端至C端,各輕鏈具有可變區(VL),該可變區(VL)亦稱作可變輕鏈結構域或輕鏈可變域,之後為恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而指定為稱作κ及λ之兩種類型中之一者。
術語「藥品說明書」用以指在治療產品之商業包裝中慣常包括之說明書,其含有關於與使用該等治療性產品相關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入空隙以達成最大之序列一致性百分比後,且在不將任何保守性取代視作序列一致性之一部分的情況下,在候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基
的百分比。可以在此項技術中之技能範圍內之各種方式達成比對以確定胺基酸序列一致性百分比,例如使用可公開獲得之電腦軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數,包括在所比較之序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何算法。然而,出於本文之目的,使用序列比較電腦程序ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程序由Genentech公司編寫,且原始碼已與用戶文件一起在華盛頓哥倫比亞特區之美國著作權辦公室(郵編:20559)(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)存檔,其中其係以美國著作權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程序可公開獲自Genentech公司(South San Francisco,California)或可自原始碼編譯。ALIGN-2程序應經編譯以用於UNIX操作系統上,包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程序設定且不發生變化。
在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下,既定胺基酸序列A相比於、與或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(其可替代地表述為既定胺基酸序列A相比於、與或相對於既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性百分比)係如下計算:100乘以分數X/Y
其中X為由序列比對程序ALIGN-2在彼程序之A與B之比對中評為相同匹配之胺基酸殘基的數目,且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解的是,在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度的情況下,A相比於B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B相比於A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外特定說明,否則本文所用之所有胺基酸序列一致性百分比值均如前一段中所述使用ALIGN-2電腦程序獲得。
術語「醫藥調配物」係指製劑,其呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效之形式且不含對於將接受該調配物投藥之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對受試者無毒的成分。,醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另外指示,否則如本文所用之術語「Jagged」或「Jag」係指來自任何脊椎動物來源之任何原生Jagged,該任何脊椎動物來源包括哺乳動物,諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未加工之Jagged以及在細胞中由加工產生之任何形式之Jagged。該術語亦涵蓋Jagged之天然存在之變異體,例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類及鼠類Jagged1及Jagged2之胺基酸序列分別示於圖1及2(SEQ ID NO:1-4)中。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法上之變型,諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指臨床干預以試圖改變所治療之個體之自然病程,且可出於預防之目的或在臨床病理期間進行。合乎需要之治療作用包括(但不限於)防止疾病發生或復發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接的病理性結果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中,本發明之抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體與抗原結合之結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有相似之結構,其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007)。)單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外,結合特定抗原之抗體可分別使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL域來篩選互補VL或VH域之文庫而分離。參見例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用之術語「載體」係指能夠使與其連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括呈自行複製之核酸結構形式之載體以及併入至當中已引入有其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引與其可操作地連接之核酸表現。該等載體在本文中稱作「表現載體」。
在一個態樣中,本發明部分地基於對抗Jagged抗體及其片段之識別。在某些實施例中,提供結合至少一種Jagged之抗體。本發明之
抗體可用於例如診斷或治療癌症。因此,本發明提供與抗Jagged抗體相關之方法、組合物、套組及製品。
A.例示性抗Jagged1抗體
在一個態樣中,本發明提供結合Jagged1之分離的抗體。
在一些實施例中,該抗體為Jagged1介導之信號傳導之拮抗劑。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1及鼠類Jagged1。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類及石蟹獼猴Jagged1。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,而不結合人類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、石蟹獼猴或鼠類Jagged2。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2或DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,但不結合人類Jagged2或人類DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2或人類或鼠類DLL1。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、鼠類或石蟹獼猴Jagged2或者人類、鼠類或石蟹獼猴DLL1。在一些實施例中,該抗體結合Jagged1,但不結合Jagged2、DLL1或DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1,但不結合人類Jagged2、人類DLL1或人類DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類及鼠類Jagged1,但不結合人類或鼠類Jagged2、人類或鼠類DLL1、或者人類或鼠類DLL4。在一些實施例中,該抗體結合人類、鼠類及石蟹獼猴Jagged1,但不結合人類、鼠類或石蟹獼猴Jagged2、人類、鼠類或石蟹獼猴DLL1、或者人類、鼠類或石蟹獼猴DLL4。
在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之親和力(Kd)為2nM或更強(亦即小於2nM)。在一些實施例中,該抗體結合人類Jagged1之親和力(Kd)為1.5nM或更強、或1nM或更強、或0.9nM或更強、0.8nM或更強、或0.7nM或更強(亦即小於1.5nM、小於1nM、小於0.9nM、小於0.8nM、或小於0.7nM)。在一些實施例中,該抗體結合鼠類Jagged1之親和力(Kd)為2nM或更強(亦即小於2nM)。在一些實施例中,該抗體結合
鼠類Jagged1之親和力(Kd)為1.5nM或更強、或1nM或更強、或0.9nM或更強、0.8nM或更強、0.7nM或更強、或0.6nM或更強、或0.5nM或更強(亦即小於1.5nM、小於1nM、小於0.9nM、小於0.8nM、小於0.7nM、小於0.6nM、或小於0.5nM)。
在一些實施例中,該抗體結合原生折疊之Jagged1,但不結合變性之Jagged1。在一些實施例中,該抗體在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中結合Jagged1,但在西方印漬術時不結合Jagged1。在一些實施例中,該抗體在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中結合折疊之Jagged1,但在西方印漬術時不結合變性之Jagged1。在一些實施例中,該抗體在生理條件下結合折疊之Jagged1,但不結合變性之Jagged1。「原生折疊之」Jagged1係指在生理條件下進行蛋白質折疊且維持呈折疊狀態之Jagged1。在一些實施例中,Jagged1在溶液中維持呈折疊狀態。
在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;(d)包含胺基酸序列SEQ
ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R、T及V。在一些實施例中,X為T。
在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之HVR-H3;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一些實施例中,本發明提供一種抗Jagged1抗體,其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體,其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一個實施例中,該抗體包含含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體,其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一個實施例中,該抗體包含含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列
SEQ ID NO:36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之HVR-H3。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體,其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一個實施例中,該抗體包含含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體,其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;
及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一個實施例中,該抗體包含含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個實施例中,該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。在另一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3。
在另一個態樣中,本發明提供一種抗體,其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一個實施例中,該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。
在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列
SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:55或59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:55之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一
些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。
在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:55或59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:55之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。
在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:37之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:64之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:64之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:37之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:
64之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。在另一個態樣中,本發明之抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2、及(iii)包含選自SEQ ID NO:64之胺基酸序列的HVR-H3;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含(a)包含以下之VH域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:71之HVR-H2,其中X1選自P及G,X2選自D及N,且X3選自T及S,以及(iii)包含選自SEQ ID NO:72之胺基酸序列的HVR-H3,其中X1為除S以外之任何胺基酸,且X2為W或L;以及(b)包含以下之VL域:(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2、及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:74之HVR-L3,其中X1為S或Y,X2為P或A,且X3為P或T。在一些實施例中,SEQ ID NO:72中之X1為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,SEQ ID NO:72中之X1選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,SEQ ID NO:72中之X1為T。
在一個實施例中,抗Jagged1抗體包含如上述任何實施例中之HVR,且進一步包含接受體人類構架,例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在另一個實施例中,抗Jagged1抗體包含如上述任何實施例中之HVR,且進一步包含VH,該VH包含至少一個、兩個、三個或四個選自以下之FR:包含胺基酸序列SEQ ID NO:47之FR1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:48之FR2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:49之FR3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:50之FR4。在另一個實施例中,抗Jagged1抗體包含如上述任何實施例中之HVR,且進一步包含VL,該VL包含至少一個、兩個、三個或四個選自以下之FR:包含胺基酸序列SEQ ID NO:43之FR1;包含胺
基酸序列SEQ ID NO:44之FR2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:45之FR3;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:46之FR4。
在另一個態樣中,抗Jagged1抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:54、58或62具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的重鏈可變域(VH)序列,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些該等實施例中,VH序列包含SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H2,其中X為除S以外之任何胺基酸;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或64之HVR-H3。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。在另一個態樣中,抗Jagged1抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:33、65或66具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在一些該等實施例中,VH序列包含SEQ ID NO:37或64之HVR-H3。在一些實施例中,VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:37或64之HVR-H3。在某些實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失,但包含該序列之抗Jagged1抗體保持結合至少一種Jagged1之能力。在某些實施例中,取代、插入或缺失存在於HVR以外之區域中(亦即在FR中)。在某些實施例中,抗Jagged1抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在一些該等實施例中,VH序列包含SEQ ID NO:37之HVR-H3。在一些實施例中,VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:36
之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之HVR-H3。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:33、65或66中之VH序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:33中之VH序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:65中之VH序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:66中之VH序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。
在另一個態樣中,提供一種抗Jagged1抗體,其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:10、26或34具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失,但包含該序列之抗Jagged1抗體保持結合Jagged1之能力。在某些實施例中,在SEQ ID NO:10、26或34中總共有1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中,取代、插入或缺失存在於HVR以外之區域中(亦即在FR中)。在一些實施例中,VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:10、26或34中之VL序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:34中之VL序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:10中之VL序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含SEQ ID NO:26中之VL序列,包括該序列之轉譯後修飾在內。
在另一個態樣中,提供一種抗Jagged1抗體,其中該抗體包含如上文提供之任何實施例中之VH以及如上文提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:54(其中X為除S以外之任何胺基酸)及SEQ ID NO:34中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:
58(其中X為除S以外之任何胺基酸)及SEQ ID NO:10中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:62(其中X為除S以外之任何胺基酸)及SEQ ID NO:26中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。
在另一個態樣中,提供一種抗Jagged1抗體,其中該抗體包含如上文提供之任何實施例中之VH以及如上文提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:34中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:10中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。在一個實施例中,該抗體包含分別於SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:26中之VH序列及VL序列,包括彼等序列之轉譯後修飾在內。
在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:57之重鏈,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含序列SEQ ID NO:53之輕鏈。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:67之重鏈,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含序列SEQ ID NO:75之輕鏈。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:68之重鏈,其中X為除S以外之任何胺基酸;及包含序列SEQ ID NO:76之輕鏈。在一些實施例中,X為除S以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X為除S或H以外之任何胺基酸。在一些實施例中,X選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R T及V。在一些實施例中,X為T。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:51之重鏈及包含序列SEQ ID NO:53之輕鏈。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:52之重鏈及包含序列SEQ ID NO:53之輕鏈。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:69之重鏈及包含序列SEQ ID NO:75之輕
鏈。在一些實施例中,抗Jagged1抗體包含:包含序列SEQ ID NO:70之重鏈及包含序列SEQ ID NO:76之輕鏈。
在另一個態樣中,本發明提供一種與本文提供之抗Jagged1抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例而言,在某些實施例中,提供一種抗體,其與包含VH序列SEQ ID NO:33及VL序列SEQ ID NO:34之抗Jagged1抗體結合相同之抗原決定基。
在另一個態樣中,本發明提供一種與本文提供之任何抗體競爭結合之抗體。
在本發明之另一個態樣中,根據上述任何實施例之抗Jagged1抗體為單株抗體,包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中,抗Jagged1抗體為抗體片段,例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab)2片段。在另一個實施例中,該抗體為全長抗體,例如如本文所定義之完整人類IgG1抗體或其他抗體類別或同型。
在另一個態樣中,根據上述任何實施例之抗Jagged1抗體可併有如以下部分1-7中所述之單獨或呈組合形式之任何特徵:
1.抗體親和力
在某些實施例中,本文所提供之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中,藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測Kd。在一個實施例中,用相關抗體之Fab型式及其抗原進行RIA。舉例而言,藉由在未經標記之抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記之抗原平衡,接著用經抗Fab抗體塗佈之培養盤捕捉結合之抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。為建立分析條件,用於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈MICROTITER®多孔培養盤(Thermo Scientific)隔夜,且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS封閉2至5小時。在非吸附性培養盤(Nunc,編號:269620)中,將100pM或26pM[125I]抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如符合Presta等人,
Cancer Res.57:4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評定)。接著培育相關Fab隔夜;然而,可繼續培育較長之時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後,在室溫下將混合物轉移至捕捉培養盤中以便培育(例如持續1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將培養盤洗滌8次。當培養盤已乾燥時,添加150微升/孔之閃爍劑(MICROSCINT-20TM;Packard),且在TOPCOUNTTMγ計數器(Packard)上對培養盤進行計數10分鐘。將產生小於或等於最大結合之20%的各Fab濃度選用於競爭性結合分析中。
根據另一個實施例,使用BIACORE®表面電漿子共振分析來量測Kd。舉例而言,使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIACORE公司(Piscataway,NJ))在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10反應單位(RU)進行分析。在一個實施例中,根據供應商之說明書,用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM),之後以5微升/分鐘之流速注射,達成約10反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原之後,注射1M乙醇胺以封閉未反應之基團。對於動力學量測,在25℃下,以約25微升/分鐘之流速注射含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的Fab之兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE®評估軟體3.2版),同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係計算為koff/kon比率。參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若藉由上述表面電漿子共振分析測定之締合速率超過106M-1s-1,則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率,該螢光淬滅技術量測在遞增濃度之抗原存在下PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25℃下之螢光發射強度的增加或減少(激發=295nm;發射=340nm,16nm帶通),如在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
2.抗體片段
在某些實施例中,本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之評述,參見Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。關於scFv片段之評述,參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編,(Springer-Verlag,New York),第269-315頁(1994);亦參見WO 93/16185;及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述,參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點且可具二價或雙特異性之抗體片段。參見例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中,單域抗體為人類單域抗體(Domantis公司(Waltham,MA);參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術製備抗體片段,包括(但不限於)如本文所述之蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
3.嵌合抗體及人類化抗體
在某些實施例中,本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一個實例中,嵌合抗體包含非人類可變區(例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一個實例中,嵌合抗體為「類別轉換」抗體,其中類別或子類相較於親本抗體之類別或子類已發生變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中,嵌合抗體為人類化抗體。通常,非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性,同時保持親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言,人類化抗體包含一或多個可變域,其中HVR,例如CDR(或其部分)源自非人類抗體且FR(或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中,人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代,例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat'l Acad. Sci.USA 86:10029-10033(1989);美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號;Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述「表面重修(resurfacing)」);Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述「FR改組」);以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改組之「定向選擇」法)中。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於):使用「最佳配合」法選擇之構架區(參見例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體共同序列的構架區(參見例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));及由篩選FR文庫獲得之構架區(參見例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997);及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中,本文所提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術製備。人類抗體一般描述於van Dijk及
van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001);及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可藉由向经改良之转殖基因动物投与免疫原以回應於抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区之完整抗体来製备人类抗体。該等動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座,該等人類免疫球蛋白基因座置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合於動物染色體中。在該等轉殖基因小鼠中,內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的評述,參見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號;描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號;描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號;及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。來自該等動物所產生之完整抗體的人類可變區可經進一步修飾,例如與不同人類恆定區組合。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker公司,New York,1987);及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如以下文獻中所述之方法:美國專利第7,189,826號(描述由融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體);及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三體瘤(Trioma)技術)亦描述於以下文獻中:Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005);以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
亦可藉由分離選自來源於人類之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列來產生人類抗體。接著可將該等可變域序列與所需人類恆定域組合。下文描述自抗體文庫中選擇人類抗體之技術。
5.源自於文庫之抗體
可藉由篩選組合文庫中具有所需活性之抗體來分離本發明之抗體。舉例而言,多種用於產生噬菌體呈現文庫及篩選該等文庫中具有所需結合特徵之抗體的方法在此項技術中已知。該等方法評述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,2001)中且進一步描述於例如McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中,藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨地選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體文庫中隨機重組,接著可如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常將抗體片段呈現為單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段。來自經免疫接種之來源的文庫不需建構融合瘤即可提供對免疫原具高親和力之抗體。或者,可選殖天然譜系(例如來自人類),以便在不進行任何免疫接種的情況下提供針對多種非自體抗原以及自體抗原之抗體的單一來源,如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最終,亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高度可變之CDR3區並實現活體外重排來合成性製備天然文庫,如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如:美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離的抗體或抗體片段在本文中視作人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中,本文所提供之抗體為多特異性抗體,例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中,結合特異性中之一者係針對Jagged1,而另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中,雙特異性抗體可結合Jagged1之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現Jagged1之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩對具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈(參見Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983);WO 93/08829;及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991));及「杵入臼(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下製備:工程改造靜電控制效應以製備抗體Fc雜二聚分子(WO 2009/089004A1);使兩個或多於兩個抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號;及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994));及製備三特異性抗體,如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述。
本文亦包括具有三個或多於三個功能性抗原結合位點之工程改造抗體,包括「章魚狀抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合Jagged1以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
7.抗體變異體
在某些實施例中,涵蓋本文所提供之抗體的胺基酸序列變異體。舉例而言,可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由在編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包括例如抗體胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體,限制條件為該最終構築體具有所需特徵,例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失型變異體
在某些實施例中,提供具有一或多處胺基酸取代之抗體變異體。取代型突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代示於表1中標題「較佳取代」下。更實質性之變化提供於表1中標題「例示性取代」下,且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。可在相關抗體中引入胺基酸取代,且篩選具有所需活性(例如保持/改良之抗原結合、免疫原性降低或ADCC或CDC改良)之產物。
表1
胺基酸可根據共同側鏈特性分組:(1)疏水性:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)鹼性:His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向之殘基:Gly、Pro;(6)芳族:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員交換成另一類別。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言,選用於進一步研究之所得變異體的某些生物學特性相對於親本抗體將有所改變(例如改良)(例如親
和力增強、免疫原性降低),及/或該(該等)所得變異體將實質上保持親本抗體之某些生物學特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體,其宜例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述者)產生。簡言之,使一或多個HVR殘基突變,且使變異抗體呈現於噬菌體上,並針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
可改變(例如取代)HVR以例如改良抗體親和力。可在HVR「熱點」及/或接觸抗原之殘基中進行該等改變,熱點亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變的密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)),測試所得變異VH或VL之結合親和力。藉由建構二次文庫及自二次文庫中再選擇而進行之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中,藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者向選用於成熟之可變基因中引入多樣性。接著建立二次文庫。接著篩選該文庫以識別出具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向法,其中將若干個HVR殘基(例如每次4至6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建模來特定識別涉及抗原結合之HVR殘基。通常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中,可在一或多個HVR內進行取代、插入或缺失,只要該等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言,可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。該等改變可例如在HVR中抗原接觸殘基以外。在上文所提供之變異VH及VL序列之某些實施例中,各HVR未經改變,或含有不多於一、兩或三處胺基酸取代。
一種適用於識別可作為突變誘發之目標的抗體殘基或區域之方法稱作「丙胺酸掃描突變誘發」,如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中,識別殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基,諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換來確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取
代表現出功能敏感性之胺基酸位置上引入其他取代。或者或另外,分析抗原-抗體複合體之晶體結構以識別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選者而被靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入物包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一百個殘基之多肽範圍內之胺基及/或羧基端融合體,以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如,對於ADEPT而言)或可延長抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
b)糖基化變異體
在某些實施例中,本文所提供之抗體經改變以增加或降低抗體糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體糖基化位點缺失宜藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來實現。
在抗體包含Fc區的情況下,可改變與其連接之碳水化合物。哺乳動物細胞所產生之原生抗體通常包含一般由N鍵聯與Fc區之CH2域之Asn297連接的分支雙觸寡醣。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物,例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸,以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中,可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中,提供具有缺乏連接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言,該抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由相對於連接至Asn 297之所有醣結構(例如複合甘露糖結構、混合甘露糖結構及高甘露糖結構)之總和計算糖鏈內Asn297處岩藻糖之平均量來確定,如藉由MALDI-TOF質譜所量測,如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中之大約位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基;然而,Asn297亦可因抗體中之微小序列變異而位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處,亦即位於位置294與位置300之間。該等岩藻糖
基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.);第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。在一些實施例中,包含N297G或N297A突變之IgG1恆定區實質上缺乏效應物功能。關於「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變異體之公開案的實例包括:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號(Presta,L);及WO 2004/056312 A1(Adams等人)(尤其實例11處)),及基因剔除細胞株,諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變異體,例如其中連接至抗體Fc區之雙觸寡醣係由GlcNAc平分。該等抗體變異體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人);WO 1998/58964(Raju,S.);及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中,可在本文所提供之抗體的Fc區中引入一或多處胺基酸修飾,從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類
IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中,本發明涵蓋具有一些而不是所有效應物功能的抗體變異體,由此使該抗體變異體成為許多應用之理想候選者,在該等應用中,活體內抗體半衰期非常重要,而某些效應物功能(諸如補體及ADCC)則為不必要的或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言,可進行Fc受體(FcR)結合分析,以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性),但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞,即NK細胞僅表現Fc(RIII,而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。FcR在造血細胞上之表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464頁之表3中。評定相關分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於以下文獻中:美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可使用非放射性分析法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司(Mountain View,CA));及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。適用於該等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外,例如可在動物模型(諸如Clynes等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所揭示之動物模型)中於活體內評定相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化,可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知的方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低之效應物功能的抗體包括Fc區殘基238、265、
269、270、297、327及329中之一或多者經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或多於兩者處具有取代之Fc突變體,包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合得以改良或削弱的某些抗體變異體有所描述。(參見例如美國專利第6,737,056號;WO 2004/056312;及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些實施例中,抗體變異體包含具有一或多處改良ADC C之胺基酸取代,例如在Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。
在一些實施例中,在Fc區中進行導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)發生改變(亦即改良或削弱)之改變,例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期有所延長且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得以改良之抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中,新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976);及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。此等抗體包含具有一或多處改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。該等Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代的變異體:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例,亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988);美國專利第5,648,260號;美國專利第5,624,821號;及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中,可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體,例如「thioMAb」,其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中,經取代之殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代該
等殘基,從而使反應性硫醇基定位於抗體之可及位點處且可用於使抗體與其他部分結合,諸如藥物部分或連接子-藥物部分,以產生免疫結合物,如本文中進一步所描述。在某些實施例中,以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代:輕鏈之V205(Kabat編號);重鏈之A118(EU編號);及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生半胱胺酸工程改造抗體。
e)抗體衍生物
在某些實施例中,本文所提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白部分。適用於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其於水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量,且可為分枝聚合物或不分枝聚合物。連接至抗體之聚合物的數目可變化,且若連接超過一個聚合物,則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言,用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良之抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將在規定之條件下用於療法中等考慮因素來確定。
在另一個實施例中,提供抗體與可藉由曝露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中,非蛋白部分為碳奈米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。此輻射可具有任何波長,且包括(但不限於)不損傷普通細胞,但可將非蛋白部分加熱至可殺死靠近抗體-非蛋白部分之細胞的溫度之波長。
B.重組方法及組合物
可例如使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物來產生抗體。在一個實施例中,提供編碼本文所述之抗Jagged1抗體
的分離的核酸。該核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH的胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一個實施例中,提供包含該核酸之一或多種載體(例如表現載體)。在另一個實施例中,提供包含該核酸之宿主細胞。在一個此種實施例中,宿主細胞包含(例如經轉型而具有):(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體,或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中,宿主細胞為真核細胞,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中,提供一種製備抗Jagged1抗體之方法,其中該方法包括在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
為重組產生抗Jagged1抗體,將例如如上文所述之編碼抗體之核酸分離且插入一或多種載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離該核酸且定序。
適用於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核細胞或真核細胞。舉例而言,可在細菌中產生抗體,尤其是當不需要糖基化及Fc效應物功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽,參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁,該文獻描述在大腸桿菌中表現抗體片段。)在表現後,可自可溶性部分中之細菌細胞糊狀物中分離抗體且可進一步純化。
除原核生物以外,真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)亦為適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主,包括糖基化路徑已經「人類化」,從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004);及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源自於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞及昆蟲細胞。已識別出許多可與昆蟲細胞聯合使用之桿狀病毒株,尤其是用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言,可使用適合於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。適用之哺乳動物宿主細胞株之其他實例為由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7);人胚腎細胞株(293或293細胞,如例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠賽托利細胞(sertoli cell)(TM4細胞,如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);犬科動物腎細胞(MDCK);布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562);TRI細胞,如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述;MRC 5細胞;及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));及骨髓瘤細胞株,諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的評述,參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。
C.分析
可藉由此項技術中已知的各種分析來識別、篩選或表徵本文所提供之抗Jagged1抗體的物理/化學特性及/或生物活性。
1.結合分析及其他分析
在一個態樣中,例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方印漬術等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一個態樣中,可使用競爭分析來識別與抗體A、A-1、
A-2或A-1(S101T)競爭結合人類或鼠類Jagged1之抗體。在某些實施例中,該競爭性抗體結合與A、A-1、A-2或A-1(S101T)所結合之抗原決定基相同的抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。
定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法提供於Morris(1996),「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology,第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在例示性競爭分析中,在包含結合Jagged1之第一標記抗體(例如A、A-1、A-2或A-1(S101T))及第二未標記抗體(將測試其與該第一抗體競爭結合Jagged1之能力)的溶液中培育固定之Jagged1。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照,在包含第一標記抗體而不含第二未標記抗體之溶液中培育固定之Jagged1。在允許第一抗體與Jagged1結合之條件下培育後,移除過量未結合抗體,且量測與固定之Jagged1締合之標記的量。若相對於對照樣品,在測試樣品中與固定之Jagged1締合之標記的量實質上減少,則指示第二抗體與第一抗體競爭結合Jagged1。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性分析
在一個態樣中,提供識別其具有生物活性之抗Jagged1抗體之分析。生物活性可包括例如抑制Jagged1誘導之經由Notch1進行之信號傳導。在某些其他實施例中,測試本發明之抗體抑制對Jagged1誘導之Notch信號傳導有反應之報導基因表現之能力。非限制性例示性分析提供於實例中。在某些實施例中,測試本發明抗體之該生物活性。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。
D.免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物,其包含與一或多種細胞毒性劑結合的本文之抗Jagged抗體,該一或多種細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中,免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC),
其中抗體結合至一或多種藥物,包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1);阿裏他汀(auristatin),諸如單甲基阿瑞他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號);海兔毒素;卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號;Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993);及Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998));蒽環黴素,諸如道諾黴素(daunomycin)或小紅莓(參見Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等人,Bioorganic & Med.Chem.Letters 16:358-362(2006);Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000);Dubowchik等人,Bioorg.& Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002);King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美國專利第6,630,579號);胺甲喋呤;長春地辛(vindesine);紫杉烷(taxane),諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel);新月毒素(trichothecene);及CC1065。
在另一個實施例中,免疫結合物包含與酶活性毒素或其片段結合之如本文所述之抗體,包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、有絲分裂素、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素。
在另一個實施例中,免疫結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物的如本文所述之抗體。可使用多種放射性同位素產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、
Pb212及Lu之放射性同位素。當使用放射性結合物進行偵測時,其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子,例如tc99m或I123;或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像,mri)之自旋標記,諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑製得,該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言,蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於在細胞中釋放細胞毒性藥物之「可裂解連接子」。舉例而言,可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992);美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確地涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之該等結合物,該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸丁二醯亞胺酯)且該等交聯試劑市售可得(例如購自Pierce Biotechnology公司(Rockford,IL.,U.S.A))。
E.用於診斷及偵測之方法與組合物
在某些實施例中,本文所提供之任何抗Jagged1抗體均適用於偵測生物樣品中Jagged1之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或
定性偵測。在某些實施例中,生物樣品包含細胞或組織,諸如癌組織。
在一個實施例中,提供用於診斷或偵測方法之抗Jagged1抗體。在另一個態樣中,提供偵測生物樣品中Jagged1之存在的方法。在某些實施例中,該方法包括使該生物樣品與如本文所述之抗Jagged1抗體在允許該抗Jagged1抗體與Jagged1結合的條件下接觸,及偵測該抗Jagged1抗體與Jagged1之間是否形成複合體。該方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中,使用抗Jagged1抗體選擇適於抗Jagged1抗體療法之受試者,例如在Jagged1為用於選擇患者之生物標記的情況下。
可使用本發明抗體來診斷之例示性病症包括癌症,例如乳癌、肺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚癌、B細胞惡性病及T細胞惡性病。
在某些實施例中,提供標記之抗Jagged1抗體。標記包括(但不限於)可直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記),以及例如經由酶反應或分子間相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I;螢光團,諸如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物;若丹明(rhodamine)及其衍生物;丹磺醯基(dansyl);傘酮(umbelliferone);螢光素酶,例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號);螢光素(luciferin);2,3-二氫酞嗪二酮;辣根過氧化酶(HRP);鹼性磷酸酶;β-半乳糖苷酶;葡糖澱粉酶;溶菌酶;醣氧化酶,例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;雜環氧化酶,諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶,聯同採用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶);生物素/抗生物素蛋白;自旋標記;噬菌體標記;穩定自由基;及其類似物。
F.醫藥調配物
如本文所述之抗Jagged1抗體之醫藥調配物係藉由混合具有所需純度之該抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑一般在所採用之劑量及
濃度下對接受者無毒,且包括(但不限於):緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨;氯化六羥季銨;氯化苯甲烴銨;苄索氯銨(benzethonium chloride);苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷基酯,諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);低分子量(少於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、二醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如鋅-蛋白質錯合物);及/或非離子型界面活性劑,諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑,諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP),例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白,諸如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International公司)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中,sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如硫酸軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述者,後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文中之調配物亦可含有多於一種為治療特定適應症所必需之活性成分,較佳為具有彼此無不利影響之互補活性的活性成分。舉例而言,可能需要進一步提供細胞毒性劑,例如化學治療劑。該等活性成分適當地以對預定目的有效之量存在於組合中。
可將活性成分包封於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中,例如分別在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質,該等基質呈成形物品(例如膜或微膠囊)形式。
用於活體內投藥之調配物一般為無菌的。可例如藉由經由無菌過濾膜過濾容易地實現無菌。
G.治療方法及組合物
本文所提供之任何抗Jagged1抗體均可用於治療方法中。
在一個態樣中,提供用作藥物之抗Jagged1抗體。在其他態樣中,提供用於治療與異常Notch信號傳導有關之疾病或病症(例如癌症)之抗Jagged1抗體。在某些實施例中,提供用於治療方法中之抗Jagged1抗體。在某些實施例中,本發明提供用於治療患有癌症之個體之方法中的抗Jagged1抗體,該方法包括投與該個體有效量之抗Jagged1抗體。在一個此種實施例中,該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,例如如下文所述。在一個此種實施例中,該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,例如如下文所述。
在其他實施例中,本發明提供用於抑制肺癌生長之抗Jagged1抗體。在某些實施例中,本發明提供用於減少個體之肺癌生長之方法中的抗Jagged1抗體,該方法包括投與該個體有效量之抗Jagged1抗體以減少肺癌生長。在某些實施例中,本發明提供用於減少個體之乳癌生長之方法中的抗Jagged1抗體,該方法包括投與該個體有效量之抗Jagged1抗體以減少乳癌生長。根據上述任何實施例之「個體」較佳為人類。
在一些實施例中,提供一種抗Jagged1抗體,其用於治療過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)及/或過量黏液有關之疾病。其他可用本文提供之抗Jagged1抗體治療之過敏性疾病包括(但不限於)過敏性鼻炎、異位性皮炎、食物過敏及蕁麻疹;免疫介導之皮膚疾病,包括大皰性皮膚疾病、多形紅斑及接觸性皮炎;自體免疫疾病,包括銀屑病、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎;發炎性腸病(亦即潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease));特發性間質性肺炎、與杯狀細胞化生有關之疾病(諸如氣喘、COPD、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道);肺病,諸
如囊腫性纖維化、麩質敏感性腸病、及惠普爾氏病(Whipple's disease);肺之免疫疾病,諸如嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎;慢性阻塞性肺病、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病、骨質疏鬆症及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。
在另一個態樣中,本發明提供抗Jagged1抗體用於製造或製備藥物之用途。在一個實施例中,該藥物係用於治療與異常Notch信號傳導有關之疾病或病症。在一個實施例中,該藥物係用於治療癌症。在另一個實施例中,該藥物係用於治療癌症之方法中,該方法包括投與患有癌症之個體有效量之該藥物。在一個此種實施例中,該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,例如如下文所述。根據上述任何實施例之「個體」可為人類。
在另一個態樣中,本發明提供治療與異常Notch信號傳導有關之疾病或病症的方法。在一個實施例中,該方法包括投與患有該疾病或病症之個體有效量之抗Jagged1抗體。在一個實施例中,該方法包括投與患有癌症之個體有效量之抗Jagged1抗體。在一個此種實施例中,該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,如下文所述。在一個此種實施例中,該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,如下文所述。根據上述任何實施例之「個體」可為人類。
在另一個態樣中,本發明提供抑制個體之癌細胞生長的方法。在一個實施例中,該方法包括投與該個體有效量之抗Jagged1抗體以抑制癌細胞生長。在一個實施例中,「個體」為人類。
在一些實施例中,本發明提供治療個體之過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)及/或過量黏液有關之疾病的方法。在一些實施例中,本發明提供治療個體之以下疾病之方法:過敏性鼻炎、異位性皮炎、食物過敏及蕁麻疹;免疫介導之皮膚疾病,包括大皰性皮膚疾病、多形紅斑及接觸性皮炎;自體免疫疾病,包括銀屑病、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎;發炎性腸病(亦即潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病);特發性間質性肺炎、與杯狀細胞化生有關之疾病(諸如氣喘、COPD、囊腫性纖維化及巴瑞特氏食道);肺病,諸如囊腫性纖維化、麩質敏感性腸
病、及惠普爾氏病;肺之免疫疾病,諸如嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎;慢性阻塞性肺病、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病、骨質疏鬆症及/或霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中,該方法包括投與該個體有效量之本文提供之抗Jagged1抗體。在一些實施例中,「個體」為人類。
在另一個態樣中,本發明提供包含本文所提供之任何抗Jagged1抗體之醫藥調配物,其例如用於上述任何治療方法中。在一個實施例中,醫藥調配物包含本文所提供之任何抗Jagged1抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中,醫藥調配物包含本文所提供之任何抗Jagged1抗體及至少一種其他治療劑,例如如下文所述。
本發明之抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言,本發明之抗體可與至少一種其他治療劑共同投與。在某些實施例中,其他治療劑為細胞毒性劑。在某些實施例中,其他治療劑為抗體。
上述該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或多於兩種治療劑包括在相同或各別調配物中),及單獨投藥,在此情況下可在投與其他治療劑之前、同時及/或之後投與本發明之抗體。在一個實施例中,抗Jagged1抗體之投藥與其他治療劑之投藥在彼此相隔約一個月內、或約一週、兩週或三週內、或約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。本發明之抗體亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合方式投與,包括非經腸、肺內及鼻內,及在需要用於局部治療之情況下的病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑(例如藉由注射,諸如靜脈內或皮下注射)給藥,部分地視投藥為短期或是長期而定。本文涵蓋各種給藥時程,包括(但不限於)單次投藥或在各個時間點多次投藥、快速注射投藥及脈衝輸注。
以符合良好醫療執業之方式調配、定量及投與本發明之抗體。在此情況下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知的其他因素。抗體無需但可視情況與一或多種當前用於預防或治療所討論之病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視
調配物中所存在之抗體的量、病症或治療之類型及上述其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所述相同之劑量及投藥途徑來使用,或以本文所述劑量之約1%至99%使用,或以任意劑量且藉由憑經驗/在臨床上確定為適當的任何途徑來使用。
為預防或治療疾病,本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、抗體類型、疾病嚴重度及病程、投與抗體是用於預防目的或是治療目的、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之斟酌而定。適當地一次性或經一系列治療投與患者該抗體。視疾病類型及嚴重度而定,約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)之抗體可為投與患者之初始候選劑量,無論是例如藉由一或多次分開投藥,或是藉由連續輸注投藥。一種典型之日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或大於100mg/kg之範圍內,視上文所提及之因素而定。對於經數天或更長時間之重複投藥,視病狀而定,治療一般將持續至對疾病症狀產生所需之抑制作用為止。抗體之一種例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此,可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多種劑量(或其任何組合)。該等劑量可間歇地投與,例如每週或每三週一次(例如以使患者接受約兩劑至約二十劑或例如約六劑抗體)。可先投與初始較高之起始劑量,接著可投與一或多種較低之劑量。例示性給藥方案包括先投與約4mg/kg抗體之初始起始劑量,之後投與約2mg/kg抗體之每週一次維持劑量。然而,可使用其他給藥方案。此療法之進展容易由習知技術及分析加以監測。
應瞭解,任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物替代抗Jagged1抗體或連同抗Jagged1抗體一起來進行。
H.製品
在本發明之另一個態樣中,提供一種製品,其含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質。該製品包含容器及於該容器上或伴隨該容器之標簽或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組合物自身或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物,且可
具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標簽或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病狀。此外,該製品可包含(a)容納有組合物之第一容器,其中該組合物包含本發明之抗體;及(b)容納有組合物之第二容器,其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含藥品說明書,該藥品說明書指示該等組合物可用於治療特定病狀。或者或另外,該製品可進一步包含第二(或第三)容器,其包含醫藥學上可接受之緩衝液,諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括根據商業及使用者觀點所需之其他物質,包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解,任何上述製品均可包括本發明之免疫結合物替代抗Jagged1抗體或除抗Jagged1抗體外亦包括本發明之免疫結合物。
以下為本發明方法及組合物之實例。應瞭解,鑑於上文提供之一般描述,可實施各種其他實施例。
實例1:產生抗Jagged抗體。
a.文庫分選及篩選以識別抗Jagged1抗體
使用在所選之互補決定區中具有模擬人類IgG譜系之天然多樣性之合成多樣性的人類噬菌體抗體文庫來淘選呈現於M13噬菌體粒子表面上之Fab片段。使用人類Jag1-DSL-EGF1-4(SEQ ID NO:6)或人類Jag2-DSL-EGF1-4(SEQ ID NO:8)作為用於文庫分選之抗原。在4℃下將Nunc 96孔Maxisorp免疫培養盤用標靶抗原(10μg/ml)塗佈隔夜且在室溫下用噬菌體封閉緩衝液PBST(磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)及1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)及0.05%(v/v)土溫-20(tween-20))封閉1小時。將抗體噬菌體文庫VH(參見例如Lee等人,J.Immunol.Meth.284:119-132(2004))及VH/VL(參見Liang等人,JMB.366:815-829(2007))單獨地添加至抗原培養盤中且在室溫下培育隔夜。第二天,用PBT(含0.05%土溫-20之PBS)將塗有抗原之培養盤洗滌十次,且用50mM HCl及500mM NaCl溶離結合之噬菌體30分
鐘且用等體積之1M Tris鹼(pH 7.5)中和。使回收之噬菌體在大腸桿菌XL-1 Blue細胞中擴增。在後續之幾輪選擇期間,將抗體噬菌體與塗有抗原之培養盤的培育縮短至2-3小時,且逐步增加培養盤洗滌之嚴格度。
在4輪淘選後,觀測到顯著之增濃。由VH及VH/VL文庫分選各自挑取96個純系以確定其是否特異性結合人類Jagged1或Jagged2。對此等純系之可變區進行PCR定序以識別獨特序列純系。使用點競爭ELISA將噬菌體抗體之親和力排序。使用競爭性噬菌體結合ELISA進一步測定噬菌體抗體IC50值。選擇特異性結合人類Jagged1(而不結合Jagged2)、Jagged2(而不結合Jagged1)或Jagged1及Jagged2兩者之獨特噬菌體抗體且重排成全長IgG以在活體外細胞分析中進行評估。
藉由將個別純系之VL區及VH區分別選殖至含有人類κ恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體(pRK.LPG3.人類κ)及編碼全長人類IgG1恆定域之表現載體(pRK.LPG4.人類HC)中以將相關純系重排成IgG(Shields等人,J Biol Chem 2000;276:6591-6604)。接著使抗體短暫表現於哺乳動物CHO細胞中,且用蛋白質A管柱純化。
b.建構文庫以對源自於V
H
或V
H
V
L
文庫之純系進行親和力改良
將衍生自噬菌粒pV0350-2b(Lee等人,J.Mol.Biol 340,1073-1093(2004),在所有CDR-L3位置處均含有終止密碼子(TAA)且在M13噬菌體表面上呈現單價Fab)之噬菌粒pW0703用作文庫模板以用於移植來自VH文庫之相關純系之重鏈可變域(VH)來進行親和力成熟。使用硬隨機化策略及軟隨機化策略來進行親和力成熟。對於硬隨機化,使用經設計以模擬天然人類抗體之胺基酸將具有三個輕鏈CDR之所選位置之一個輕鏈文庫隨機化且所設計之DNA簡併係如Lee等人(J.Mol.Biol 340,1073-1093(2004))中所述。為達成軟隨機化條件,該等軟隨機化條件在所選位置處引入約50%之突變率,用偏好野生型核苷酸之鹼基的70-10-10-10混合物合成誘發突變DNA(Gallop等人,Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251(1994))。對於軟隨機化,靶向CDR-L3之位置91-96;CDR-H1之位置30-33、35;CDR-H2之位置50、52、53-54及56;CDR-H3之位置95-98處之殘基;且選擇CDR環之三種不同組合H1/L3、H2/L3及H3/L3進行隨機化。
對於來源於VHVL文庫之純系,個別地產生在各CDR中含有4個終止密碼子(TAA)且在M13噬菌體表面上呈現單價Fab之噬菌粒,且將其用作模板以進行kunkel突變誘發以建構親和力成熟文庫。對於源自於VHVL文庫之純系僅使用軟隨機化策略,因為CDR-L3之多樣性已內置於天然文庫中。為達成軟隨機化條件,靶向CDR-L1之位置28-31;CDR-L2之位置50、53-55;CDR-L3之位置91-96;CDR-H1之位置30-35;CDR-H2之位置50-56;CDR-H3之位置95-100處之殘基;且選擇CDR環之四種不同組合,即H1/L3*、H2/L3*及H3/L3*以及L1/L2/L3*(其中*表示模板上終止密碼子之位置)進行隨機化。
c.產生親和力改良之噬菌體分選策略
對於親和力改良選擇,首先在限制試劑條件下將Jag1或Jag2抗原生物素化。對噬菌體文庫進行一輪培養盤分選且在嚴格度遞增之情況下進行五輪溶液分選。對於第一輪培養盤分選,首先將10ug/ml抗原塗佈於Maxisorp培養盤上且用封閉緩衝液(含1% BSA及0.05%土溫20之PBS)預封閉。將於封閉緩衝液中3O.D./ml之噬菌體輸入物在抗原培養盤中培育3小時。用PBS-0.05%土溫20將各孔洗滌十次。用150微升/孔之50mM HCl、500mM KCl將結合之噬菌體溶離30分鐘,且隨後用50微升/孔之1M Tris(pH 8)中和,滴定,且繁殖用於下一輪。對於後續幾輪,在溶液相中對噬菌體文庫進行淘選,其中在室溫下將噬菌體文庫與100nM生物素化之標靶蛋白(該濃度係基於親本純系噬菌體IC50值)一起在含有1% Superblock(Pierce Biotechnology)及0.05%土溫20之100μl緩衝液中培育2小時。用1% Superblock將混合物進一步10倍稀釋,且在室溫下在平緩振盪下以100微升/孔塗覆於塗有中性鏈親和素之孔(10μg/ml)中,持續30分鐘。為測定背景結合,在塗有中性鏈親和素之培養盤上捕捉容納噬菌體之對照孔。接著如對於第一輪所述,洗滌結合之噬菌體,溶離且繁殖。在選擇嚴格度遞增同時,再進行五輪溶液分選。前幾輪為藉由將生物素化之標靶蛋白質濃度自100nM降至0.1nM進行之締合速率選擇,且後兩輪為藉由在室溫下添加過量未生物素化之標靶蛋白質(300倍至1000倍過量)以競爭解離(compete off)較弱結合者而進行之解離速率選擇。
d.高通量親和力篩選ELISA(單點競爭)
由第六輪篩選挑取群落。將群落在37℃下在96孔培養盤(Falcon)中在150微升/孔之含50μg/ml卡本西林(carbenicillin)及1×1010個/毫升M13KO7之2YT培養基中培養隔夜。自同一培養盤中,挑取經XL-1感染之親本噬菌體之群落作為對照。在4℃下使用100微升/孔之於PBS中之Jag1或Jag2(0.5μg/ml)塗佈96孔Nunc Maxisorp培養盤隔夜。用150μl含1% BSA及0.05%土溫20之PBS 20將培養盤封閉1小時。
在含有或不含5nM Jag1或Jag2之ELISA(酶聯免疫吸附分析)緩衝液(含0.5% BSA、0.05%土溫20之PBS)中將35μl噬菌體上清液稀釋至75μl且將其在F培養盤(NUNC)中在室溫下培育1小時。將95μl混合物並排轉移至塗有抗原之培養盤中。將培養盤平緩振盪15分鐘且用PBS-0.05%土溫20洗滌十次。藉由添加含與辣根過氧化酶(HRP)結合之抗M13抗體的ELISA緩衝液(1:2500)且在室溫下培育30分鐘來對結合進行定量。用PBS-0.05%土溫20將培養盤洗滌十次。隨後,將100微升/孔之過氧化酶受質添加至各孔中且在室溫下培育5分鐘。藉由將100μl之0.1M磷酸(H3PO4)添加至各孔中且在室溫下培育5分鐘來停止反應。使用標準ELISA培養盤讀數器在450nm下測定各孔中黃色之O.D.(光密度)。與親本噬菌體之孔的OD450nm降低率(%)(100%)相比,挑取OD450nm降低率(%)低於50%的純系用於序列分析。藉由與各別親本純系相比較來選擇獨特純系以製備噬菌體來測定針對Jag1或Jag2之結合親和力(噬菌體IC50)。接著將親和力改良程度最大之純系重排成人類IgG1以產生抗體以及進行進一步BIAcore結合動力學分析及其他活體外或活體內分析。
進一步的幾輪篩選識別出僅對一種Jagged家族成員具有特異性之抗體,如由ELISA所確定。抗體A結合人類Jagged1及鼠類Jagged1,但不結合Jagged2(圖8;重鏈可變區序列示於SEQ ID NO:9中,輕鏈可變區序列示於SEQ ID NO:10中)。相反,抗體B(抗體B-3之親本抗體)結合人類Jagged2及鼠類Jagged2,但不結合Jagged1(圖8)。C-1結合Jagged1及Jagged2兩者,且用作對照。抗體C-1之重鏈及輕鏈可變區序列示於圖4中。
實例2:抗體結合親和力及抗原決定基定位。
使用BIAcoreTM-3000儀器藉由表面電漿子共振(SRP)來量測抗Jagged1噬菌體抗體之結合親和力。藉由塗佈於CM5感測器晶片上以達成約150反應單位(RU)之小鼠抗人類IgG來捕捉抗Jagged1/2噬菌體人類IgG。對於動力學量測,在25℃下以30毫升/分鐘之流速注射人類或小鼠Jag1/2 DSL_EGF1-4於PBT緩衝液(含0.05%土溫20之PBS)中之兩倍連續稀釋液(1.95nM至250nM)。使用簡單一對一朗繆耳結合模型(BIAcore評估軟體3.2版)計算締合速率(k on )及解離速率(k off ))。平衡解離常數(k d )計算為比率k off /k on 。
表2匯總抗體A、A-1、A-2、B及B-3結合純化之人類Jagged1、人類Jagged2及小鼠Jagged2之結合常數。親本抗體A特異性結合人類及鼠類Jagged1。親和力成熟抗體A-1及A-2以高親和力結合人類Jagged1及鼠類Jagged1兩者。抗體A、A-1及A-2不結合人類或鼠類Jagged2。相反,抗體B及B-3不結合人類或鼠類Jagged1。B-3特異性結合人類及小鼠Jagged2。
抗體A之重鏈及輕鏈可變區序列分別示於SEQ ID NO:9及10中。抗體A-1之重鏈及輕鏈可變區序列分別示於SEQ ID NO:17及18中。抗體A-2之重鏈及輕鏈可變區序列分別示於SEQ ID NO:25及26中。抗體B-3之重鏈及輕鏈可變區序列分別示於SEQ ID NO:41及42中。抗體B之重鏈及輕鏈可變區序列示於圖4中。
實例3:抗Jagged拮抗劑抗體在活體外抑制Jagged1誘導之信號傳導。
為確定抗Jagged抗體是否可充當Jagged誘導之Notch信號傳導之拮抗劑,基本上如Wu等人,Nature 464,1052-1057(2010年4月15日)所述進行共培養實驗。將經工程改造以表現Jagged1(作為Notch配體)之
NIH-3T3細胞與穩定表現Notch1且經短暫轉染以表現Notch反應性TP-1(12X CSL)螢火蟲螢光素酶報導基因及組成型表現之海腎螢光素酶報導基因(pRL-CMV,Promega)之NIH 3T3細胞共培養。在共培養物中觀測到強Notch報導基因信號(螢火蟲螢光素酶)(圖12,J1誘導陽性對照組)。當將γ-分泌酶抑制劑添加至共培養物中時,報導基因表現減少至背景含量,表明報導基因構築體之表現具有Notch依賴性。資料未示。
添加遞增量(0.016-50μg/ml)之抗Jagged抗體A-2(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:25及26)或B-3(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:41及42)對報導基因表現產生劑量依賴性抑制作用(圖9)。用Jagged1(圖9A,深灰色條柱)或Jagged2(圖9B,淺灰色條柱)誘導信號傳導且如上文所述測定抑制作用。對照組包括未用配體刺激且未接受抗體處理之培養物(圖9A及B,未處理組)、未用配體刺激之培養物(圖9A及B,無刺激組)、接受5-10μg/ml同型對照抗體處理之培養物(圖9A及B,agD)、用配體刺激但未接受抗體處理之培養物(圖9A及B,Stim/無AB)、接受5μM γ-分泌酶抑制劑DAPT或DAPT媒劑對照DMSO處理之培養物。
抗體A-2以劑量依賴性方式抑制Jagged1誘導之信號傳導,但不抑制Jagged2誘導之信號傳導(圖9A)。A-2抑制Jagged1之IC50為2μg/ml至10μg/ml,而甚至在最高濃度50μg/ml下亦幾乎未觀測到或未觀測到對Jagged2之抑制作用。該等結果表明抗體A-2為Jagged1選擇性拮抗劑,亦即抗體A-2抑制Jagged1介導之信號傳導,但不抑制Jagged2介導之信號傳導。相比之下,抗體B-3在最低測試濃度下強效地抑制Jagged2誘導之信號傳導,但在最高測試濃度下不抑制Jagged1誘導之信號傳導,因此確定B-3為Jagged1選擇性拮抗劑(圖9B)。
實例4:抗Jagged抗體治療對體重之影響。
如上文所述,γ-分泌酶抑制劑及多種Notch受體之其他抑制劑會引起體重下降及腸杯狀細胞化生,此對於臨床投藥而言為不合需要的。為確定本文所述之抗體影響體重及腸健康之程度,每週兩次給輿小鼠抗Jagged1抗體A-2(5-20mpk;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為
SEQ ID NO:25及26)、抗Jagged2抗體B-3(5-20mpk;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:41及42)、抗體A-2連同B-3一起(各5mpk)、結合Jagged1及Jagged2兩者之抗Jagged1/2抗體(C-1;每公斤小鼠體重5-10mg(mpk)抗體;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列示於圖4中)、或同型對照抗gD抗體(20mpk)。亦使用同型對照抗體使每次給藥之總抗體濃度達到20mpk。在首次投與抗體之前測定各小鼠之總體重且監測直至研究之第12天為止。平均體重變化描繪於圖10中,以相對於起始體重之百分比形式繪製圖表。使用抗Jagged1/2抗體C-1或Jagged1特異性抗體A-2連同Jagged2特異性抗體B-3之組合對Jagged1及Jagged2的雙重抑制作用引起快速且相當大之體重下降(圖10A)。至第4天時,接受抗Jagged1/2抗體C-1之一些小鼠的體重下降超過5%,至第7天時發展成體重下降差不多8%-10%(圖10A)。接受A-2及B-3兩者之小鼠之體重亦快速下降,在一些狀況下,至第11天時下降達17%(圖10A)。相比之下,在5mpk或20mpk下,單獨Jagged1特異性抗體或Jagged2特異性抗體中無一者在研究過程中引起體重下降(圖10A)。用抗Jagged1抗体加上抗Jagged2抗体之组合进行处理会使得食物摄入减少(圖10B),其与所观测到之体重减轻相關(图10A)且表明食物摄入减少可能部分或完全地解释相关之体重减轻。
實例5:抗Jagged1拮抗劑抗體在活體內抑制人類肺癌細胞生長。
用Calu-6細胞(人類非小細胞肺癌細胞株)對哈蘭(Harlan)無胸腺裸小鼠進行皮下接種。在腫瘤體積達到約200立方毫米後,每週兩次(第0天、第4天、第7天、第11天、第14天及第18天)對小鼠腹膜內(IP)注射20mpk之抗gD同型對照抗體(n=10)或抗Jagged1抗體A-2(n=10;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:25及26)。用測徑規量測各小鼠之腫瘤體積,再持續19天。在研究過程中監測各小鼠之總體重。
相對於對照組之腫瘤,接受抗Jagged1抗體處理之小鼠之腫瘤的腫瘤體積顯著減小(圖11A)。可早在處理後第七天偵測到抗Jagged1抗體處理之作用(圖11A)。在第18天時,接受抗Jagged1抗體之小鼠的平均腫瘤體積達到約500mm3,而在第18天時,對照動物之平均腫瘤體積達到約750mm3。在處理組與對照組之間未觀測到體重之顯著變化(圖11B)。
實例6:抗Jagged1抗體及抗Jagged2抗體在活體內抑制人類乳癌細胞生長。
用MDA-MD-468細胞(人類基底乳癌細胞株)在C.B-17 SCID.bg小鼠之乳房脂肪墊中進行接種。在腫瘤體積達到約200立方毫米後,在第0天、第4天、第7天、第12天、第15天、第18天、第22天、第25天、第29天、第32天、第36天、第43天、第50天及第57天對小鼠腹膜內給輿30mpk之抗gD同型對照抗體(人類IgG1同型)、抗豚草同型對照抗體(鼠類IgG2a同型)、於人類IgG1主鏈中之抗Jagged1抗體A-2(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:25及26)、於鼠類IgG2a主鏈中之抗Jagged1抗體A-2或於人類IgG1主鏈中之抗Jagged2抗體B-3(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:41及42)。在第一次注射後用測徑規量測腫瘤體積(y軸),持續60天。使用線性混合效應模型繪製各組(每組n=9)之腫瘤體積的圖(圖12A)。各組中各小鼠之腫瘤體積描繪於圖12B中。
實例7:抗Jagged1抗體在重鏈中裂解
藉由SDS-PAGE及質譜分析來分析抗體A(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:9及10)、A-1(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:17及18)及A-2(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:25及26)之重鏈及輕鏈的完整性。對於SDS-PAGE分析,將各抗體樣品與2×Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液(Novex LC2676)在不存在及存在10mM DTT之情況下以1:1 v/v比率混合。將樣品在95℃下加熱5分鐘,且將2μg各樣品加至Novex 4%-20% SDS-PAGE 1.0mm凝膠(Novex EC6025)上。亦將10μL Mark 12分子量標準(Invitrogen 100006637)加至凝膠上。在1×Tris-甘胺酸SDS電泳緩衝液(Invitrogen LC2675-5)中在恆定250V下進行電泳直至示蹤染料到達凝膠底部為止。接著用基於庫馬斯(Coommassie)之染色劑(Expedeon InstantBlue #ISB1L)將凝膠染色。
對於質譜分析,將各抗體在PBS中稀釋至1mg/mL之最終濃度。藉由添加1:10 v/v之1.0M Tris(pH 8.0)使抗體之pH值增加至8.0。添
加DTT達在溶液中10mM之最終濃度以將抗體還原。接著在37℃下加熱樣品15分鐘。接著使用Agilent 1200 HPLC系統將樣品注射至加熱至80℃的PLRP-S 1000Å之8μm、2.1×50mm管柱(Agilent,PL1912-1802)上,繼而在Agilent 6210 TOF LC/MS系統上電噴霧電離。
彼等分析之結果示於圖13中。SDS-PAGE分析(圖13A)揭露在各抗體中一部分重鏈(HC)裂解。對應於完整HC及輕鏈(LC)以及HC之羧基(C)端及胺基(N)端裂解片段的條帶標記在凝膠右側。抗體A-1之代表性質譜分析示於圖13B中。此分析指示裂解位點介於CDR3中之HC胺基酸G100與S101(序列編號,對應於根據Kabat編號之G96及S97)之間,如圖13C中之HC胺基酸序列中所圖示,其中用箭頭標記裂解位置。相似分析揭露在此等抗體之所有所測試之製劑(包括在兩種不同細胞類型CHO及293中表現後)中均發生HC裂解且裂解之發生與抗體Fc區之類型(人類IgG1或鼠類IgG2a)無關。
實質上如上文所述對抗Jagged1抗體之SDS-PAGE凝膠進行操作。使用XCell墨點模組(XCell Blot Module,Invitrogen EI9051)在恆定0.35A下將抗體轉移至PVDF膜(Invitrogen LC2002)上,而非用基於庫馬斯之染色劑進行染色。用庫馬斯藍R-250將膜染色。使用Applied Biosystems Procise定序器494,根據Niall,1973,Meth.Enzymol.27:942-1010中所述之定序原理對膜上之樣品進行N端序列分析。
定序分析之結果示於圖14中。此方法確認裂解位點與根據質譜分析結果所預測之裂解位點相同,其介於HC序列之G100與S101(序列編號,對應於根據Kabat編號之G96及S97)之間。
抗Jagged1抗體A、A-1及A-2之重鏈裂解為出人意料的。對裂解位點周圍之胺基酸序列的分析未識別出已知之蛋白酶裂解位點。裂解之機制尚不明確,且根據抗體之序列並非顯而易見。
實例8:重鏈S101之突變減少抗Jagged1抗體重鏈之裂解
由於所觀測到之抗Jagged1抗體之裂解為出人意料的且機制尚不明確,因此並不知曉使抗體序列發生變化是否可防止裂解,同時保持抗體之親和力及功效。此外,並不知曉應當使抗體序列中之哪個(哪些)位置
發生變化以防止裂解。為確定是否可藉由改變重鏈序列來防止抗體裂解,在重鏈位置S101(重鏈可變區序列SEQ ID NO:17之序列編號,對應於根據Kabat編號之S97)處進行一系列胺基酸變化。使抗體在哺乳動物細胞中表現且根據標準程序純化。藉由SDS-PAGE,如實例7中所述分析裂解。結果示於圖15中。在位置S101處之胺基酸變化顯著減少或消除HC裂解,但在S101H突變之情況下偵測到某種裂解(圖15,泳道5)。藉由質譜分析確認此等結果,如實例7中所述進行該質譜分析。
為確定該等變化對與純化之Jag1細胞外域蛋白質片段之結合的影響,使用BIAcore量測突變型A-1抗體之結合親和力。表3展示各突變型A-1抗體之片段化及Jagged1結合親和力之匯總。
如表3中所示,除了S101H以外,在位置101處之胺基酸殘基的變化使裂解減少至不可偵測之含量。此外,由於裂解的機制未知,因此亦測試位置100的變化,即G100A。G100A突變體仍發生裂解。參見表3。驚人的是,鑑於在HVR-H3中進行突變,S101突變型抗體保持結合Jagged1之能力。
實例9:溫度及凍融循環對抗Jagged1抗體重鏈之裂解的影響
為評定抗Jagged1抗體之裂解是否會因在遞增溫度下培育而增加,將抗Jagged1抗體A-1(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:17及18)及A-2(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:25及26)之各種獨立之製劑以及同型對照抗體(非抗Jagged1抗體)在70℃或95℃下培育10分鐘。使用標準SDS-PAGE及蛋白質染色來評定裂解之程度。結果示於圖16中。各抗Jagged1抗體製劑在70℃下裂解,而對照抗體並未裂解(圖16A)。如表(圖16B)中所匯總,與在70℃下進行培育相比,抗Jagged1抗體裂解之程度並未因在95℃下培育而發生顯著或持續的改變。
為評定是否會因抗Jagged1抗體製劑之凍融循環而引起裂解,對抗體A-1(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:17及18)進行多輪在-80℃下冷凍繼而融化。接著如所示,藉由在非還原(-DTT)或還原(+DTT)條件下進行SDS-PAGE及蛋白質染色來分析2μg之各樣品。使用Biorad GelDoc Easy成像儀使染色之凝膠成像,且使用Biorad影像實驗室軟體(Image Lab software)進行密度測定分析。該實驗之結果示於圖17中。F/T 1係指原始樣品,其中遞增之數字指示額外之凍融循環輪數。對於各循環,將A-1抗體在-80℃下冷凍且接著在室溫下融化。移出等分試樣以進行SDS-PAGE。再重複兩次冷凍/融化,總共3次冷凍/融化循環,在各融化步驟後移出等分試樣。表(圖17B)匯總在各條件下裂解之百分比。實驗揭露額外輪之凍融對裂解之百分比幾乎無影響。
實例10:A-1及A-1(S101T)在活體外阻斷Jagged1之活性
對Jag1誘導之Notch報導基因活性進行活體外共培養分析以量測A-1(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:17及18)及A-1(S101T)(重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:33及
34)阻斷Jag1之活性。用Notch反應性TP-1(12X CSL)螢火蟲(FF)螢光素酶報導基因及用於控制轉染效率之組成型表現之海腎螢光素酶報導基因(pRL-CMV,Promega)對表現高含量之Notch2的U87MG細胞進行共轉染。參見Wu等人,2010,Nature 464:1052-1057。在轉染後6小時之時添加抗Jagged1抗體A-1或A-1(S101T)、同型對照抗體、5μM DAPT(Calbiochem)、或DMSO媒劑對照以及配體表現細胞(經人類Jag1穩定轉染之NIH-3T3細胞或無配體對照)。在共培養20小時後量測螢光素酶活性(Promega,雙重Glo螢光素酶)。通常,對於各條件分析四個重複實驗,且值表示為相對螢光素酶單位(螢火蟲信號除以海腎信號)且以相對於抗豚草對照Jag1誘導活性之百分比的形式繪製圖表。
該實驗之結果示於圖18中。根據標準方法獲得FF及海腎螢光素酶量測結果(分別為圖18B及18C),且將FF與海腎螢光素酶之比率作為Jag1誘導之Notch活性的經正規化之量測結果繪製成圖表(圖18A)。結果展示A-1及A-1(S101T)均以劑量依賴性方式抑制Jag1誘導之Notch信號傳導。參見圖18A及B。因此,A-1(S101T)保持親本抗體A-1之抗Jagged1阻斷活性。
實例11:A-1及A-1(S101T)在活體內之Jagged1阻斷活性
為評定抗Jagged1抗體在活體內之Jagged1阻斷活性,在給輿小鼠對照或抗Jagged1抗體後量測小鼠肺支氣管上皮之棒狀細胞及纖毛細胞之組成。在第0天如下對野生型八週大之BALB/c雌性小鼠(每組三隻小鼠)進行給藥(所有組均含有抗Jagged2抗體(B-3)以使支氣管上皮致敏以明顯地揭露抗Jagged1活性之可量測之作用):1.對照1×:同型對照(每公斤小鼠體重15mg抗體)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:41及42);2. A-1 1×:抗Jag1抗體A-1(15mg/kg;重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:17及18)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);3. A-1.5×:抗Jag1抗體A-1(7.5mg/kg)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);4. A-1.25×:抗Jag1抗體A-1(3.75mg/kg)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);5. A-1-S101T 2×:抗Jag1抗體A-1(S101T)(30mg/kg;重鏈可變區序列
及輕鏈可變區序列分別為SEQ ID NO:33及34)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);6. A-1-S101T 1×:抗Jag1抗體A-1(S101T)(15mg/kg)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);7. A-1-S101T.5×:抗Jag1抗體A-1(S101T)(7.5mg/kg)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg);8. A-1-S101T.25×:抗Jag1抗體A-1(S101T)(3.75mg/kg)+抗Jag2抗體B-3(15mg/kg)。
在第5天,如下收集肺,使其充盈,固定且染色用於免疫螢光(IF)。用含4% PFA之PBS使肺充盈。將整個肺轉移至10%中性緩衝福馬林(NBF)中且在室溫下固定隔夜。將固定之肺轉移至70%乙醇中,持續至少24小時。將肺用石蠟包埋且以5μm切片。如下對纖毛細胞及克氏細胞(Clara cell)進行免疫螢光染色。將載玻片脫去石蠟且藉由將載玻片在壓力鍋中在檸檬酸鹽緩衝液(Dako S1700)中在125℃下煮沸15分鐘來修復抗原。將載玻片在2×PBS中短暫沖洗,且接著用含0.2% Triton-X100之PBS透化45分鐘或3×15分鐘。用5% FBS/2% BSA將切片封閉1小時。接著將載玻片與山羊抗CC10(1:1000)及小鼠抗乙醯化α微管蛋白(1:200)在封閉緩衝液中培育2至3小時或隔夜。用PBS將載玻片洗滌3次,持續15分鐘。將載玻片與二級抗體一起培育1小時(Invitrogen Alexa Fluor二級抗體,1:1000稀釋),接著用PBS沖洗兩次,持續15分鐘。用DAPI(0.5ug/ml)將核染色15分鐘。接著用PBS將載玻片沖洗兩次,持續15分鐘,且蓋上蓋玻片。
彼實驗之結果示於圖19中。阻斷Jagged1及Jagged2信號傳導引起小鼠支氣管上皮中纖毛細胞(如藉由對α-微管蛋白進行免疫螢光偵測而以紅色標記)的數目增加且棒狀細胞(如藉由對CC10進行免疫螢光偵測而以綠色標記)數目減少。阻斷Jagged1加上Jagged2兩者引起棒狀細胞幾乎完全喪失,因此所得之上皮主要由纖毛細胞(紅色;參見圖19中之「A-1,1×」及「A-1-S101T,2×」)組成。A-1及A-1(S101T)在活體內均以劑量依賴性方式抑制Jagged1誘導之Notch信號傳導。因此,A-1(S101T)在活體內保持親本抗體A-1之抗Jagged1阻斷活性。
實例12:抗Jagged1抗體A-1及A-1(S101T)在活體內抑制肝癌腫瘤生
長
使源自人類患者之肝癌腫瘤LIV#78(Genendesign,China)作為皮下異種移植物在BALB-c免疫功能低下之裸小鼠中生長。當腫瘤生長至150至200mm3時,將小鼠分成七個處理組,每組十隻小鼠且每週一次給輿(除組5以外,組5每三週給藥一次)所示劑量(以每公斤小鼠體重抗體之毫克數計)之所示抗體(A-1(S101T)抗體,其重鏈序列及輕鏈序列分別為SEQ ID NO:51及53;「A-1-DANG(效應物較少(effectorless))」,其重鏈序列及輕鏈序列分別為SEQ ID NO:52及53;及A-1抗體,其重鏈序列及輕鏈序列分別為SEQ ID NO:81及53)。參見圖20B。藉由測徑規量測(長度×寬度×高度/2)來評定腫瘤體積。
圖20A展示在研究過程中各處理組之腫瘤體積的LME(線性混合效應)圖表。圖20B匯總生長統計資料、組身份及給藥方案。抗Jagged1A-1及A-1(S101T)抗體在活體內顯著抑制肝癌生長;在各抗Jagged1抗體的情況下觀測到多種PR(部分反應)。同樣,抗Jagged1抗體處理組中無一者在研究之44天期間展現出腫瘤體積加倍,而對照組展現出18.5天之腫瘤進展加倍時間(TTP2×)。參見圖20B。與對照組相比隨每天曲線下面積(AUC/天)而變的腫瘤生長抑制百分比(TGI%,其中「下限」及「上限」分別係指各組中個別動物之最低及最高TGI%量測值)取決於抗Jagged1 A-1-S101T抗體之劑量,與反映Jagged1抑制程度之腫瘤生長抑制作用一致。同樣,在使用A-1或A-1(S101T)之情況下,對腫瘤生長之抑制作用相似。比較例如組3與組7,圖20B。腫瘤生長抑制作用不取決於抗體效應物功能,因為缺乏效應物功能之A-1之重鏈N297G突變形式與A-1同樣有效抑制腫瘤生長。比較組6與組7,圖20B。
圖21A展示圖20中所示之小鼠的小鼠體重隨時間變化之LME(線性混合效應)圖表。圖20B展示處理組之各種體重參數,包括研究最後一天之體重變化%(最後一天之BW%)、體重之最大變化%(最大BW%)及體重出現最大變化之日(最大BW%日)以及(AUC/天(下限,上限))。包括對照組在內之處理組的體重圖表在統計學上沒有區別,指示抗Jagged1抗體處理具有良好耐受性。
實例13:阻斷Jagged1可在活體內抑制杯狀細胞化生
在針對腹膜內注射之卵白蛋白致敏35天時段之後,在連續7日內使用氣溶膠化之卵白蛋白攻擊小鼠,之後將其處死且分析杯狀細胞之數目。在首次氣溶膠攻擊後24小時及96小時之時用對照抗體、抗Jagged1A-2抗體(具有鼠類IgG2a Fc)、抗Jagged2 B-3抗體(具有鼠類IgG2a Fc)或抗Jagged1抗體+抗Jagged2抗體之組合處理小鼠。
圖23A展示接受抗Jagged1抗體、抗Jagged2抗體、抗Jagged1抗體+抗Jagged2抗體或對照抗體處理之小鼠的肺氣道之過碘酸-希夫染色。圖23B展示不同處理組之氣道中杯狀細胞之定量。在對照組及抗Jagged2抗體組中,明顯有大量杯狀細胞。在抗Jagged1抗體組中存在很少杯狀細胞且在抗Jagged1抗體+抗Jagged2抗體組中幾乎未偵測到杯狀細胞。圖23C展示如由蘇木精伊紅(H&E)染色所評定之發炎指數。用Jagged1阻斷抗體或Jagged2阻斷抗體進行處理未影響肺中之發炎。
Jagged1誘導之Notch信號傳導使氣道中之細胞命運偏向分泌細胞(包括杯狀細胞)命運而遠離纖毛細胞命運。Jagged1信號傳導對於維持分泌細胞命運而言為重要的,且抑制Jagged1信號傳導可防止杯狀細胞化生。吾人亦展示棒狀細胞向纖毛細胞之轉化為直接的且不涉及細胞分裂(資料未示)。棒狀細胞在肺中產生杯狀細胞。一種細胞類型向另一種細胞類型之此轉分化出現於成人肺中且不同於諸如在損傷之後或在發育期間涉及祖細胞分裂之細胞命運選擇。杯狀細胞化生或過量黏液為若干氣道疾病之標誌,諸如氣喘、囊腫性纖維化、COPD及巴瑞特氏食道。此等Jagged抑制結果提供如在氣道疾病(例如氣喘、COPD、囊腫性纖維化)及巴瑞特氏食道中涉及使用Jagged1或Jagged2抑制劑來預防或逆轉杯狀細胞化生及治療特徵在於過量黏液之病狀之治療應用的基礎。
實例14:抗Jagged1抗體及抗Jagged2抗體之特異性結合
使用標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)測試抗體A-2(圖24,左圖)及C-1(圖24,右圖)與純化之重組Notch配體人類Jagged1(hJag-1)、人類Jagged2(hJag-2)、鼠類Jagged2(mJag-2)、人類Delta樣1(hDLL1)、鼠類Delta樣1(mDLL1)及人類Delta樣4(hDLL4)之結合。在40℃下將於PBS(pH 7.4)
中之1μg/ml之Notch配體蛋白(如所示)塗佈於ELISA培養盤(Nunc Maxisorp)上隔夜。在室溫下用於PBS中之酪蛋白封閉劑(Pierce)將培養盤封閉一小時。將抗體IgG(如所示)於PBST緩衝液(含0.5%(w/v)BSA之PBT緩衝液(PBS+0.05%(v/v)土溫20))中之連續3倍稀釋液添加至培養盤中且在室溫下培育一小時。接著用PBST洗滌培養盤且用與過氧化酶結合之山羊抗人類Fab特異性IgG(Sigma)偵測結合之抗體。使用TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)且使用標準ELISA培養盤讀數器讀取在630nM下之吸光度。使用KaleidaGraph(Synergy Software)繪製吸光度對IgG濃度之曲線。圖24展示結果,其中y軸上之A630表示結合程度。
抗體A2結合人類Jagged1及鼠類Jagged1,但不結合人類Jagged2、鼠類Jagged2、人類DLL1、鼠類DLL1、人類DLL4或鼠類DLL4(圖24,左圖)。抗體C1結合人類及鼠類Jagged1、人類及鼠類DLL1、人類及鼠類Jagged2,但不結合人類或鼠類DLL4(圖24,右圖)。
藉由表面電漿子共振(SPR),使用BIAcoreTM-T200儀器量測抗體結合親和力及速率常數。藉由塗於CM5感測器晶片上以達成約150反應單位(RU)之小鼠抗人類IgG來捕捉人類IgG1抗體。對於動力學或親和力量測,以30毫升/分鐘之流速在25℃下注射於HBS-T緩衝液(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.05% v/v界面活性劑P20,GE Healthcare)中之人類Jagged1、鼠類Jagged1、人類Jagged2、鼠類Jagged2、人類DLL1、鼠類DLL1、人類DLL4、鼠類DLL4及大鼠Jagged1之四倍連續稀釋液。除大鼠Jagged1外,配體片段為DSL-EGF1-4片段,該大鼠Jagged1購自R&D Systems。對於動力學分析,使用簡單一對一朗繆耳結合模型(BIAcore T200評估軟體2.0版)計算締合速率(k on )及解離速率(k off )。平衡解離常數(k d )係計算為比率k off /k on 。對於親和力分析,使用穩態親和力模型(BIAcore T200評估軟體2.0版)計算K d 。
表3匯總抗體A-2、B-3、C-1、A-1及A-1 S101T結合純化之人類Jagged1、鼠類Jagged1、人類Jagged2、鼠類Jagged2、人類DLL1、鼠類DLL1、人類DLL4、鼠類DLL4及/或大鼠Jagged1之結合常數。n.d.=未偵測出,n.t.=未測試。抗體A-2、A-1及A-1-S101T.NG(具有N297G突變
之抗體A-1S101T)以高親和力特異性結合至人類及鼠類Jagged1。抗體A-1及A-1-S101T.NG亦以高親和力結合大鼠Jagged1。抗體B-3以高親和力特異性結合至人類及鼠類Jagged2。抗體C-1特異性結合至人類及鼠類Jagged1及Jagged2。抗體B-3及C-1展示出與人類及小鼠DLL1之某種程度之結合,而抗體A-2未展示出。所測試之抗體中無一者結合人類或小鼠DLL4。
實例15:抗Jagged1 A-1-S101T抗體之藥物動力學
在雌性Balb/c裸小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)中評估在以1、10及100mg/kg單次靜脈內注射後抗Jagged1 A-1-S101T抗體之藥物動力學型態。小鼠為5-8週大且體重為約17.3-21.8g。採集血清樣品且藉由特異性酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析抗體濃度。使用JAG1細胞外域-組胺酸塗佈特異性ELISA且使用山羊抗人類Fc偵測。分析之靈敏度小於標準值6.25納克/毫升。用PhoenixTM WinNonlin®(6.3版;Pharsight公司;Mountain View,CA)使用非隔室模型估算藥物動力學參數。所有PK
分析均基於個別動物資料之純原始池。
在靜脈內投與1mg/kg與100mg/kg劑量範圍內之抗Jagged1 A-1-S101T抗體後觀測到暴露量大於劑量比例增加,表明存在抗體之標靶介導之清除機制(圖25及表4)。清除率值在約13至75毫升/天/公斤範圍內。
雖然上文已藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明以便清楚理解,但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文所引用之所有專利及科學文獻的揭示內容係以全文引用的方式明確併入本文中。
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<220>
<223> 合成:人類Jag1-DSL-EGF1-4(人類Jag1抗原)
<400> 6
<210> 7
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:鼠類Jag2-DSL-EGF1-4(小鼠Jag2抗原)
<400> 7
<210> 8
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:人類Jag2-DSL-EGF1-4(人類Jag2抗原)
<400> 8
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A重鏈可變區
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A輕鏈可變區
<400> 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A重鏈高變區1(HVR-H1)
<400> 11
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A HVR-H2
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A HVR-H3
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A輕鏈高變區1(HVR-L1)
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A HVR-L2
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A HVR-L3
<400> 16
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1重鏈可變區
<400> 17
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1輕鏈可變區
<400> 18
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-H1
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-H2
<400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-H3
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-L1
<400> 22
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-L2
<400> 23
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 HVR-L3
<400> 24
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2重鏈可變區
<400> 25
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2輕鏈可變區
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-H1
<400> 27
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-H2
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-H3
<400> 29
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-L1
<400> 30
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-L2
<400> 31
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2 HVR-L3
<400> 32
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)重鏈可變區
<400> 33
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)輕鏈可變區
<400> 34
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-H1
<400> 35
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-H2
<400> 36
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-H3
<400> 37
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-L1
<400> 38
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-L2
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)HVR-L3
<400> 40
<210> 41
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體B-3重鏈可變區
<400> 41
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體B-3輕鏈可變區
<400> 42
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3輕鏈構架1(LC-FR1)
<400> 43
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 LC-FR2
<400> 44
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 LC-FR3
<400> 45
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 LC-FR4
<400> 46
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3重鏈構架1(HC-FR1)
<400> 47
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 HC-FR2
<400> 48
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 HC-FR3
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-2、A-1(S101T)、B-3 HC-FR4
<400> 50
<210> 51
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)IgG1重鏈
<400> 51
<210> 52
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)IgG1重鏈N297G
<400> 52
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101T)輕鏈:抗體A-1輕鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101X)重鏈可變區
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 54
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101X)HVR-H3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 55
<210> 56
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101X)IgG1重鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 56
<210> 57
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1(S101X)IgG1重鏈N297G
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 57
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101X)重鏈可變區
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101X)HVR-H3;抗體A-2(S101X)HVR-H3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 59
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2(S101X)重鏈可變區
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 62
<210> 63
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 IgG1重鏈N297G
<400> 63
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101T)HVR-H3;抗體A-2(S101T)HVR-H3
<400> 64
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101T)重鏈可變區
<400> 65
<210> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2(S101T)重鏈可變區
<400> 66
<210> 67
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101X)IgG1重鏈N297G
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 67
<210> 68
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2(S101X)IgG1重鏈N297G
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸
<400> 68
<210> 69
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101T)IgG1重鏈N297G
<400> 69
<210> 70
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2(S101T)IgG1重鏈N297G
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:HVR-H2共同
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Pro或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Asp或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Thr或Ser
<400> 71
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:HVR-H3共同(101X)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為除Ser以外之任何胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Trp或Leu
<400> 72
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:HVR-H3共同(101T)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Trp或Leu
<400> 73
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:HVR-L3共同
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Pro或Thr
<400> 74
<210> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A輕鏈
<400> 75
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2輕鏈
<400> 76
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:HVR-H3共同
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Trp或Leu
<400> 77
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A、A-1、A-1(S101T)、A-2替代性HVR-H1
<400> 78
<210> 79
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A(S101T)IgG1重鏈
<400> 79
<210> 80
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-2(S101T)IgG1重鏈
<400> 80
<210> 81
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:抗體A-1 IgG1重鏈
<400> 81
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:短連接子序列
<400> 82
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成:凝血酶裂解位點
<400> 83
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
<210> 88
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
<210> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
<210> 90
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
<210> 91
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
<210> 92
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 92
<210> 93
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
<210> 95
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
<210> 100
<211> 107
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<223> 合成
<400> 111
Claims (55)
- 一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其中該抗體包含:包含胺基酸序列SEQ ID NO:35或78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:55或59之HVR-H3,其中X為除S或H以外之任何胺基酸;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:16或40之HVR-L3。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體包含:a)包含該胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:55之HVR-H3;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;或b)包含該胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;或c)包含該胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:59之HVR-H3;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:54、58或62具有至少95%一致性之VH序列。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO:10、26或34具有至少95%一致性之VL序列。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體包含:a)與該胺基酸序列SEQ ID NO:54具有至少95%一致性之VH序列及與該胺基酸序列SEQ ID NO:34具有至少95%一致性之VL序列;或b)與該胺基酸序列SEQ ID NO:58具有至少95%一致性之VH序列及與該胺基酸序列SEQ ID NO:10具有至少95%一致性之VL序列;或c)與該胺基酸序列SEQ ID NO:62具有至少95%一致性之VH序列及與該胺基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95%一致性之VL序列。
- 一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其包含:a)SEQ ID NO:54之VH序列,其中X為除S或H以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:34;或b)SEQ ID NO:58之VH序列,其中X為除S或H以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:10;或c)SEQ ID NO:62之VH序列,其中X為除S或H以外之任何胺基酸,及VL序列SEQ ID NO:26。
- 如請求項6之分離的抗體,其中該抗體包含SEQ ID NO:54之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列。
- 如請求項7之分離的抗體,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:56且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。
- 如請求項7之分離的抗體,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:57且該輕鏈包含該胺基酸序列SEQ ID NO:53。
- 如請求項1之分離的抗體,其中X係選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R、T及V。
- 如請求項2之分離的抗體,其中X係選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R、T及V。
- 如請求項5之分離的抗體,其中X係選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R、T及V。
- 如請求項6之分離的抗體,其中X係選自A、D、E、G、I、K、L、N、Q、R、T及V。
- 如請求項1之分離的抗體,其中X為T。
- 一種結合人類Jagged1之分離的抗體,其包含:a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之HVR-H3;包含胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:40之HVR-L3;或b)包含該胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:36之HVR-H2;包含胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3;或c)包含該胺基酸序列SEQ ID NO:78之HVR-H1;包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之HVR-H2;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:64之HVR-H3;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:38之HVR-L1;包含該胺基酸序列SEQ ID NO:39之HVR-L2;及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:16之HVR-L3。
- 如請求項15之分離的抗體,其中該抗體包含:a)VH序列SEQ ID NO:33及VL序列SEQ ID NO:34;或b)VH序列SEQ ID NO:65及VL序列SEQ ID NO:10;或c)VH序列SEQ ID NO:66及VL序列SEQ ID NO:26。
- 如請求項16之分離的抗體,其中該抗體包含VH序列SEQ ID NO:33及VL序列SEQ ID NO:34。
- 如請求項16之分離的抗體,其為全長IgG1抗體。
- 如請求項18之分離的抗體,其中該抗體實質上缺乏效應物功能。
- 如請求項18之分離的抗體,其中該重鏈包含N297G或N297A突變。
- 如請求項17之分離的抗體,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:51且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:53。
- 如請求項17之分離的抗體,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:52且該輕鏈包含該胺基酸序列SEQ ID NO:53。
- 如請求項16之分離的抗體,其中該抗體包含:a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:69之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:75之輕鏈;或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:70之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO:76之輕鏈;或c)包含胺基酸序列SEQ ID NO:79之重鏈及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:75之輕鏈;或d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:80之重鏈及包含該胺基酸序列SEQ ID NO:76之輕鏈。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體為Jagged1介導之信號傳導的拮抗劑。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體不結合人類Jagged2。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體不結合人類DLL4。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體不結合人類DLL1。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體不結合鼠類Jagged2、鼠類DLL4及/或鼠類DLL1。
- 如請求項1之分離的抗體,其中該抗體減少小鼠異種移植模型之腫瘤生長而不引起體重下降。
- 如請求項29之分離的抗體,其中該小鼠異種移植模型為肝癌異種移植模型。
- 如請求項29之分離的抗體,其中使腫瘤生長減少至少50、至少60、至少70、至少80、或至少90 AUC/天TGI%。
- 如請求項1至31中任一項之分離的抗體,其結合至標記。
- 如請求項32之分離的抗體,其中該標記為正子發射體。
- 如請求項33之分離的抗體,其中該正子發射體為89Zr。
- 如請求項1至31中任一項之分離的抗體,其用作藥物。
- 如請求項1至31中任一項之分離的抗體,其用於治療癌症。
- 如請求項1至31中任一項之分離的抗體,其用於減少癌細胞生長。
- 一種分離的核酸,其編碼如請求項1至37中任一項之分離的抗體。
- 一種分離的宿主細胞,其包含如請求項38之分離的核酸。
- 一種產生抗體之方法,其包括培養如請求項39之宿主細胞以產生該抗體。
- 一種免疫結合物,其包含如請求項1至37中任一項之分離的抗體及細胞毒性劑。
- 如請求項41之免疫結合物,其用作藥物。
- 如請求項41之免疫結合物,其用於治療癌症。
- 如請求項41之免疫結合物,其用於減少癌細胞生長。
- 一種醫藥調配物,其包含如請求項1至37中任一項之分離的抗體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種醫藥調配物,其包含如請求項41之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種如請求項1至37中任一項之分離的抗體之用途,其係用於製備治療癌症的藥物。
- 如請求項47之用途,其中該癌症係選自乳癌、肺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚癌、B細胞惡性病及T細胞惡性病。
- 一種如請求項41之免疫結合物之用途,其係用於製備治療癌症的藥物。
- 如請求項49之用途,其中該藥物用於減少癌細胞生長。
- 一種如請求項1至37中任一項之分離的抗體之用途,其係用於製備治療過敏、氣喘、自體免疫疾病、與杯狀細胞化生(例如在肺中)及/或過量黏液有關之疾病的藥物。
- 一種如請求項1至37中任一項之分離的抗體之用途,其係用於製備治療與杯狀細胞化生有關之疾病的藥物。
- 如請求項52之用途,其中該藥物用於治療氣喘、囊腫性纖維化、慢性阻塞性肺病、或巴瑞特氏食道(Barrett's esophagus)。
- 一種在生物樣品中偵測人類Jagged1之方法,其包括使該生物樣品與如請求項1至37中任一項之分離的抗體在容許該抗體與天然存在之人類Jagged1結合的條件下接觸,及偵測在該抗體與該生物樣品中之天然存在之人類Jagged1之間是否形成複合體。
- 如請求項54之方法,其中該生物樣品係選自乳癌、肺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚癌、B細胞惡性病及T細胞惡性病。
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