TWI408370B

TWI408370B - 胰臟癌之血清生物檢測標誌及其應用

Info

Publication number: TWI408370B
Application number: TW100117502A
Authority: TW
Inventors: Jau Song Yu; Ya Ting Chang; Chih Ching Wu; Yi Ming Shyr; Yu Sun Chang
Original assignee: Univ Chang Gung
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2013-09-11
Also published as: EP2525227A1; ES2527830T3; TW201248151A; EP2525227B1; PL2525227T3; US20120295288A1

Description

胰臟癌之血清生物檢測標誌及其應用

本發明係關於一種胰臟癌的血清生物分子檢測標誌及其應用方法，特別係關於一種高靈敏度和高專一性的胰臟癌血清生物分子檢測標誌及其應用方法。

胰臟癌在台灣和美國分別占癌症死因的第十名和第四名，且近年來因胰臟癌所引發的死亡比例更具有升高的趨勢。胰臟在解剖學上因為處於較為深層的部位，且在癌細胞出現的早期並不會有明顯的病理特徵，因此並不容易被查覺診斷；一般只有低於7%的病患會在癌細胞仍侷限分佈在胰臟部位時被發現，並且可以進行手術切除治療，此外被診斷出胰臟癌的病患中有將近50%的比例已經出現癌細胞遠端轉移的現象，且五年的存活率低於5%。

目前對於胰臟癌的診斷與檢測，以影像檢查(例如腹部超音波檢查或高解析度電腦斷層掃描檢查)為主，配合核磁共振膽胰造影檢查及侵入性的內視鏡造影檢查，但是早期腫瘤由於體積太小，影像檢查不易查覺，所以也提高的胰臟癌的檢測難度；後來因為分子診斷學與癌症生物學的發展，碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，以下簡稱CA 19-9)開始以血液分子標誌被廣泛應用於胰臟癌的檢測。但是至今為止，利用CA 19-9檢測胰臟癌的方法仍具有靈敏度不夠高和專一性不佳，且無法對於早期胰臟癌進行有效檢測的諸多缺點。因此，如何利用其他有效的胰臟癌檢測分子標誌來彌補CA 19-9之不足，並提升胰臟癌的檢測效率將是改善目前胰臟癌治療效果不佳的重要課題。

本發明人為改善前述有關於現行胰臟癌檢測上的缺失，以致於無法對胰臟癌發揮早期診斷早期治療的效果，特致力於新穎胰臟癌檢測分子標誌的篩選、鑑定與提升胰臟癌檢測效率之研究，開發出本發明可以使用於檢測胰臟癌的血清分子標誌及其應用方法。

本發明之目的在於提供一種對胰臟癌具有專一性及高靈敏度檢測效果之胰臟癌血清分子檢測標誌，本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌係蛋白質UL16結合蛋白2(UL16 binding protein 2，以下簡稱ULBP2)。此標誌係過量表現於胰臟癌組織之腫瘤細胞中，而且此標誌含量在胰臟癌病人血清中較健康對照組血清中顯著升高，可以用來做為診斷胰臟癌之血清分子檢測標誌。且其於胰臟癌病人血清中的表現量係明顯高於鼻咽癌、大腸直腸癌、胃癌等非消化道及其他消化道器官之腫瘤病人血液中的表現量；因此藉由檢測血液中此標誌的含量並與一般正常人的讀值進行比對，便可做為胰臟癌檢測之判斷依據。

本發明亦提供了一種自行建立之光學微粒免疫分析方法(bead-based immunoassay)，對本發明之ULBP2在病人血液中的含量具有高度靈敏之檢測效果，其檢測極限可達3.91微微克/毫升(pg/mL)。

又，本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌係可與現行使用的CA 19-9檢測標誌搭配使用，並提升使用CA 19-9作為胰臟癌病患臨床診斷的偵測效力，且本發明之ULBP2比現行使用的胰臟癌檢測用血清標誌CA 19-9在胰臟癌檢測或是早期篩檢中更能產生優異的檢測效果，因此十分適合做為胰臟癌檢測之血輕生物標誌使用。

以下即以實施例對於本發明進行詳細的說明。

實施例一：胰臟癌血清分子檢測標誌的挑選

係以蛋白質體學的技術系統性地分析兩株不同胰臟癌細胞株(PANC-1與MIA PaCa-2)於特定培養基中進行培養時所分泌的蛋白質並鑑定到1812個蛋白質，利用公開資料庫中胰臟癌組織轉錄體學資料進行比對分析，其係將自胰管腺癌和一般非癌症病患身上取得之胰臟細胞進行陣列分析(array-based analysis)，進而鑑定出在胰管腺癌病患的胰臟細胞中訊息核醣核酸(message RNA，mRNA)表現量高於一般非癌症病患胰臟細胞的表現量的基因；在1812個蛋白質中，有30個蛋白質在此公開資料庫之胰臟癌組織轉錄體學資料呈現出在胰管腺癌病患的胰臟細胞中表現量至少比在一般非癌症病患胰臟細胞的表現量多出一倍之現象。在這30個蛋白質中，有11個蛋白質已經在先前其他學者的研究中被證實在胰臟癌組織切片中有過量表現的現象。本發明針對尚未被驗證的其他蛋白質，偵測這些蛋白質在胰臟癌組織切片檢體中表現狀況，其中蛋白質UL16結合蛋白2(UL16 binding protein 2，以下簡稱ULBP2)的表現量在癌細胞中顯著高於非癌細胞中的表現量(p<0.05)，因此被選為本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌。

本實施例中所使用的ULBP2蛋白質具有如下之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)：

然，熟知本技術領域之技藝人士皆可知曉，本實施例所揭露之SEQ ID NO：1其序列中胺基酸亦可進行近似特性之胺基酸置換而致序列上有所不同，因此可做為胰臟癌血清生物標誌之ULBP2蛋白質不應限定於此SEQ ID NO：1，在其他實施例中，與此SEQ ID NO：1在序列上具有95%以上相似度的ULBP2蛋白質亦可使用於做為胰臟癌血清生物標誌。

實施例二：胰臟癌血清分子檢測標誌在胰臟癌組織的表現狀況

ULBP2的免疫組織化學分析：本實施例中係使用山羊的抗ULBP2抗體，係先將組織切片分離後在0.01M的檸檬酸緩衝液(pH 6.0)中進行加熱，再添加阻隔緩衝液(blocking buffer)於室溫下反應5分鐘，隨後將此組織切片與抗ULBP2抗體在4℃下反應16小時後在室溫下進行N-Histofine^® (Nichirei,Japan)染色，並進行二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)基質呈色，此切片亦利用蘇木紫(Hematoxylin)進行對比染色(counterstain)。根據H分類系統中細胞染色強度(3分表示細胞被強力染色、2分表示細胞被中度染色、1分表示細胞被輕度染色、0分表示沒有細胞被染色)和細胞被染色比例(3分表示90%以上的細胞被染色、2分表示表示50-89%的細胞被染色、1分表示表示10-49%的細胞被染色、0分表示0-9%的細胞被染色)可以加以分析標的蛋白質的表現狀態，將細胞染色強度及細胞被染色比例的兩個分數相乘後再除以3得到ULBP2的免疫組織化學分析總分，正反應(陽性)的定義是總分超過0.67分。

請參考第4A圖和第4B圖所示，在67名患有胰臟癌病患身上取出的癌症組織上進行免疫組織化學染色分析可以發現，所有病患胰臟組織的ULBP2染色結果皆為陽性(100%)，且在癌細胞的部位，ULBP2的表現遠比其於非癌細胞的部位表現更加明顯(第4A圖和第4B圖中咖啡色的部分即為有ULBP2表現的部分)，在癌細胞組織ULBP2的表現值平均為2.71±0.49，非癌細胞組織ULBP2的表現值平均則為1.89±0.74，顯見ULBP2於胰臟癌病患的癌症組織切片中在非癌細胞和癌細胞之間的表現有明顯差異(p<0.0001)。

此外，更請參考表1所示，本發明胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2的另一項優點是ULBP2的組織表現程度並不會因為受試患者的性別、年齡、組織學評分結果、總體癌症狀態或是TNM分期系統結果等臨床病理特徵之影響，因此不會對於不同臨床病理特徵患者的胰臟癌檢測結果造成影響。

c為受試患者年齡之中位數。d有三名患者無法取得組織學評分資訊。e採用克-瓦二氏單因子等級變異數分析(Kruskal-Wallis Test)。

實施例三：胰臟癌血清分子檢測標誌在胰臟癌病人血清檢體中的含量變化

光學微粒免疫分析(bead-based immunoassay)：係用於檢測血清中ULBP2的含量變化情形，其係預先將ULBP2抗體與一帶有螢光之光學微粒上的羧基鍵結以做為捕捉抗體(capture antibody)，並使用鍵結有生物素的抗ULBP2抗體做為檢測抗體(detection antibody)，此帶有捕捉抗體之光學微粒會被添加在96孔的檢測盤上，並在檢測盤上的孔槽中添加檢品或標準濃度溶液(每毫升3.91~3.2×10⁴ 微微克)，在避光且為室溫的環境下作用一小時後，洗去檢品或標準濃度溶液，再於孔槽中加入檢測抗體溶液，同樣於避光且為室溫的環境下作用一小時，洗去檢測抗體溶液後，加入鍵結有藻紅蛋白(phycoerythrin)的卵白素(streptavidin)溶液反應10分鐘，使得卵白素和生物素可以進行交互作用，最後洗去孔槽中沒有進行反應的卵白素溶液，並藉由檢測光學微粒的藻紅蛋白螢光強度來推算檢品中的ULBP2含量。

請參考第1圖所示，將本發明胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2搭配使用光學微粒免疫分析進行胰臟癌檢測時，當血清中ULBP2濃度介於每毫升4.3至3.19×10⁴ 微微克時，都可以被精確的檢測出來，但是，在大多數的個案中，利用三明治酵素聯結免疫吸附分析法(sandwich ELISA)檢測血清中ULBP2含量時，卻往往無法取得精確的檢測結果；此外，ULBP2的濃度在胰臟癌患者血清中會有明顯大量增加情況，胰臟癌患者的血清中ULBP2的濃度高達200.2±168.6微微克/毫升，而健康的對照組受試者血清中ULBP2的濃度僅為51.4±64.6微微克/毫升，且以血清中ULBP2濃度高於60微微克/毫升當作陽性反應臨界值時，對於胰臟癌檢測的靈敏度和專一性分別為83.8%和73.9%；同前所述，胰臟癌病患血清中ULBP2含量的檢測亦不受到患者的性別、年齡、組織學評分結果、總體癌症狀態或是TNM分期系統結果等參數之影響，顯見ULBP2係一種十分適用於進行胰臟癌檢測的血清生物檢測標誌。

實施例四：胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2的有效性

將本發明的胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2與現行使用於進行胰臟癌檢測的CA 19-9篩檢標誌，以154名胰臟癌患者為對象，比較兩者對於胰臟癌的篩檢能力，發現胰臟癌病患身上檢測到的ULBP2和CA 19-9含量皆比健康的對照組受試者還高，ULBP2和CA 19-9的表現都不會受到患者臨床病理特徵的影響，但是若更進一步進行交叉比對時，則可以發現，CA 19-9對於胰臟癌檢測時的臨界值為40U/mL，此時的檢測靈敏度和專一性分別為84.4%和74.6%，但是在24名血清CA 19-9濃度值小於40U/mL的胰臟癌患者身上，若同時利用ULBP2濃度高於60pg/mL為陽性反應臨界值，則可更進一步檢測出21名胰臟癌患者，此外，對於36名對血清CA 19-9濃度值大於40U/mL的健康對照組受試者者身上，也可以利用ULBP2陽性反應臨界值則進一步的區分出健康的受試者，顯見相較於單獨使用ULBP2或CA 19-9，ULBP2結合現行使用之CA 19-9具有更好鑑別能力(請參見表3所示)。

請參考第2圖所示，若是對於所受試者進行接受者作業特徵(Receiver Operating Characteristic，以下簡稱ROC)分析可以發現，ULBP2比CA19-9具有更好的檢測效果；單獨使用ULBP2為胰臟癌篩檢標誌(標線1)時，其曲線下面積(area under curve，以下簡稱AUC)為0.862(95%信心區間介於0.821至0.904)，而單獨使用CA19-9為胰臟癌篩檢標誌(標線2)時，AUC值則為0.856(95%信心區間介於0.809至0.902)，特別是當胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2和CA19-9併用(標線3)時，其AUC值更高達0.910(95%信心區間介於0.877至0.943)，顯見ULBP2比現行使用之CA 19-9具有更好鑑別能力，確實可以做為胰臟癌血清分子檢測標誌，且兩者併用可以提升現行使用之CA 19-9的檢測胰臟癌能力。

實施例五：應用胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2進行胰臟癌早期篩檢的功效

對於142名對照組受試者和154名胰臟癌患者對進一步的探討ULBP2對於胰臟癌早期篩檢功效的結果可以發現，相對於對照組受試者血清中ULBP2的濃度為51.4±64.6 pg/mL(n=142)，胰臟癌患者血清中ULBP2的濃度會在TNM分期系統的T1/T2期、TNM分期系統的N0期和整體腫瘤分期第I-II期時皆有明顯提高的情形，其濃度值分別為205.7±184.3 pg/mL(n=34)、191.6±155.2 pg/mL(n=57)和181.2±158.8 pg/mL(n=106)(p值皆小於0.0001)。這樣的實驗結果與CA 19-9於同一批樣品檢驗的結果十分相似，顯示本發明的篩檢標誌ULBP2確實具有檢測早期胰臟癌的功效，請參考第3A至3C圖及表4所示，對於胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2和CA19-9進行ROC分析時可以發現，ULBP2對於胰臟癌的早期篩檢效果比CA19-9更好，同時，若將此二檢測標誌同時使用，將更有助於提升胰臟癌早期檢測的效果。

實施例六：胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2的專一性

為確認本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2是否會在其他癌症病人血液中過量表現而干擾檢測結果，我們進一步以胃癌(Gastric Cancer，GC)病患、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)病患和大腸直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)病患為對象，透過檢測這些NPC和CRC病患血清中ULBP2濃度和GC病患血漿中ULBP2濃度的方式，探討ULBP2對於這些癌症檢測的效果。結果如表5所示，其中，對於NPC和CRC來說，病患血清中的ULBP2濃度與健康的對照組比較僅有些微的增加(p值分別為0.122和0.038)，但其增加幅度並未如胰臟癌患者血清中ULBP2的濃度增加來的明顯(p值皆小於0.0001)；而以胃癌的檢測效果來說，病患血漿中的ULBP2濃度與健康的對照組2相較也並未有顯著的增加(p值為0.673)。因此，由表5的結果來看，ULBP2確實對於胰臟癌的檢測具有專一性。

由上述各實施例可以看出，胰臟癌患者的血液中，本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2含量會有大幅增加的情形，且ULBP2的含量改變並不會因為患者的臨床病理特徵而有明顯改變。同時，利用本發明之ULBP2進行胰臟癌檢測時可以大幅的將血液樣本的檢測靈敏度提升至3.91pg/mL。再者，本發明之ULBP2比現行使用的胰臟癌檢測用血清標誌CA 19-9在胰臟癌檢測或是早期篩檢中更能產生優異的檢測效果，並且對於胰臟癌的檢測具有高度專一性，而不會被其他種類癌症而影響其檢測效果，故本發明之胰臟癌血清分子檢測標誌ULBP2將有助胰臟癌的早期診斷和強化現行胰臟癌的臨床診斷效力。

1‧‧‧胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2對於胰臟癌檢測的靈敏度和專一性相對關係曲線

2‧‧‧胰臟癌血清生物檢測標誌CA19-9對於胰臟癌檢測的靈敏度和專一性相對關係曲線

3‧‧‧胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2和CA19-9併用時對於胰臟癌檢測的靈敏度和專一性相對關係曲線

第1圖為本發明胰臟癌血清生物檢測標誌的光學微粒免疫分析方法之標準檢量線。

第2圖為胰臟癌血清生物檢測標誌ULBP2和CA19-9的接受者作業特徵曲線(Receiver Operating Characteristic Curve)。

第3A圖係血清生物檢測標誌ULBP2、CA19-9和ULBP2併用CA19-9對於TNM分期系統的T1/T2期胰臟癌的檢測功效。

第3B圖係血清生物檢測標誌ULBP2、CA19-9和ULBP2併用CA19-9對於TNM分期系統的N0期胰臟癌的檢測功效。

第3C圖係血清生物檢測標誌ULBP2、CA19-9和ULBP2併用CA19-9對於整體腫瘤分期第I-II期胰臟癌的檢測功效。

第4A圖和第4B圖係分別為癌細胞組織和非癌細胞組織之免疫組織化學染色分析結果照片。

<110>長庚大學

<120>胰臟癌之血清生物檢測標誌及其應用

<160> 1

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 240

<212> NUCLEOTIDE

<213>人類

<400> 1

Claims

一種胰臟癌血清生物檢測標誌，其至少包括有一蛋白質UL16結合蛋白2(UL16 binding protein 2，ULBP2)，且該蛋白質UL16結合蛋白2係一與SEQ ID NO：1胺基酸序列具有95%以上相似度的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的胰臟癌血清生物檢測標誌，其中該胰臟癌血清生物檢測標誌更包括有至少一碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)。
如申請專利範圍第1至2項中任一項所述的胰臟癌血清生物檢測標誌，其中該胰臟癌血清生物檢測標誌係利用一光學微粒免疫分析方法、一三明治酵素聯結免疫吸附分析方法、一質譜分析方法(mass spectrometry-based assay)或一質譜免疫分析方法(mass spectrometry-based immunoassay)進行胰臟癌檢測。
一種胰臟癌檢測方法，其包括有下列步驟：檢測：檢測該血液樣本中至少包括有一蛋白質UL16結合蛋白2(UL16 binding protein 2，ULBP2)的血清生物檢測標誌，且該蛋白質UL16結合蛋白2係一與SEQ ID NO：1胺基酸序列具有95%以上相似度的胺基酸序列；及分析：利用一標準曲線計算該血液樣本中該血清生物檢測標誌的含量，並將所計算出之該血清生物檢測標誌的含量與一健康患者血液中血清生物檢測標誌的含量進行比較。
如申請專利範圍第4項所述的胰臟癌檢測方法，其中該血清生物檢測標誌更包括有一碳水化合物抗原19-9 (carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)。
如申請專利範圍第4至5項中任一項所述的胰臟癌檢測方法，其中該血液樣本係一全血樣本、一血清樣本或一血漿樣本。
如申請專利範圍第6項所述的胰臟癌檢測方法，其中該蛋白質UL16結合蛋白2具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
如申請專利範圍第7項所述的胰臟癌檢測方法，其中該檢測步驟中係使用一光學微粒免疫分析方法、一三明治酵素聯結免疫吸附分析方法、一質譜分析方法(mass spectrometry-based assay)或一質譜免疫分析方法(mass spectrometry-based immunoassay)檢測該血液樣本中的血清生物檢測標誌。