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TW202423482A - 可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒、及其合成方法和用途 - Google Patents

可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒、及其合成方法和用途 Download PDF

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TW202423482A
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lnp
peg
lipid
antibody
immune cell
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TW112121311A
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米爾 阿里
奧斯汀 柏施
達里爾 德拉蒙德
威廉 庫爾曼
烏爾里克 尼爾森
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美商泰德治療公司
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Abstract

提供了用於將核酸遞送至細胞（例如，免疫細胞）的可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒以及製備和使用此類脂質和靶向脂質奈米顆粒的方法。

Description

可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒、及其合成方法和用途
相關申請的交叉引用 [0001 ]本申請要求2022年6月8日提交的美國臨時申請號63/350,404的優先權和權益，將其公開內容特此通過引用以其整體併入本文。 對電子序列表的引用 [0002 ]將電子序列表（183952034242seqlist.xml；大小：168,364位元組；創建日期：2023年6月1日）的內容通過引用以其整體併入本文。 [0003 ]本發明提供了用於將核酸遞送至免疫細胞的可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒以及製備和使用此類脂質和靶向脂質奈米顆粒的方法。
[0004]近年來，已經開發了許多涉及將一種或多種核酸遞送至受試者的治療方式。治療方式包括例如基因療法，其中將呈去氧核糖核酸（DNA）形式的目的基因引入細胞中，然後表現所述目的基因以產生基因產物（例如，蛋白質），以用於治療由所述基因產物的缺陷或缺乏引起或與之相關的障礙。在此方法中，使基因轉錄成信使核糖核酸（mRNA），然後轉譯mRNA以產生基因產物。在另一種方法中，可以將mRNA而非目標基因遞送至細胞。所得的表現產物可以改善受試者中特定蛋白質的缺陷或缺乏（例如，在某些形式的囊性纖維化或溶酶體貯積症中發生的蛋白質缺陷），或者可以用於調節細胞功能，例如對免疫細胞進行重編程以啟動或以其他方式調節受試者的免疫反應（例如，作為用於治療癌症的治療劑或作為用於預防微生物或病毒感染或使其風險或嚴重程度最小化的預防性疫苗）。 [0005]然而，將mRNA遞送至細胞以在細胞內進行轉譯因多種因素而具有挑戰性，所述因素如mRNA在進入細胞之前以及在引入細胞之後但在轉譯之前的核酸酶降解。 [0006]可以使用不同的遞送載體將RNA遞送至受試者，例如基於與RNA一起形成奈米顆粒的陽離子聚合物或脂質。奈米顆粒旨在保護RNA免於降解，使RNA能夠遞送至靶位點，並且促進靶細胞的細胞吸收和加工。對於遞送功效，除了分子組成外，像粒徑、電荷或與分子部分（如聚乙二醇（PEG）或配體）的接枝等參數也起作用。與PEG接枝被認為可減少血清相互作用、增加血清穩定性和增加循環時間，這對於某些靶向方法可能是有幫助的。 [0007]與某些基因療法中使用的DNA遞送技術相比，基於mRNA的基因治療具有許多優越的特點，例如易於操作、快速且短暫的表現以及無需誘變的自我調整可轉換性。 [0008]然而，鑒於RNA的相對不穩定性和低細胞滲透性，將治療性RNA遞送至細胞是困難的。因此，需要開發用於促進將諸如mRNA等RNA遞送至細胞的方法和組成物。
[0009]本發明提供了可電離陽離子脂質、脂質-免疫細胞靶向基團接合物、和包含此類可電離陽離子脂質和/或脂質-免疫細胞（例如，T細胞）靶向基團接合物的脂質奈米顆粒組成物、含有此類脂質和/或接合物的醫用套組、以及製備和使用此類脂質和接合物的方法。 [0010]本文提供的脂質奈米顆粒組成物可以進一步包含核酸，如RNA，例如信使RNA或mRNA。所述脂質奈米顆粒組成物可以用於將mRNA遞送至受試者的細胞（例如，免疫細胞，如T細胞）。基於信使RNA的基因療法需要將mRNA有效地遞送至血漿中的循環細胞（例如，免疫細胞，如T細胞或NK細胞）或遞送至給定組織中的細胞。與有效mRNA遞送以達到穩健的蛋白質表現水平相關的主要挑戰包括：(a) 在投予受試者時保護mRNA有效載荷免受普遍存在的血清核酸酶影響的能力；(b) 將mRNA遞送特異性靶向至靶細胞（例如，T細胞）群，從而使其中的蛋白質表現最大化的能力；以及 (c) 將mRNA有效載荷最大程度地遞送至細胞（例如，T細胞）的胞質區室以在細胞質內轉譯成蛋白質的能力。 [0011]本發明提供了用於產生脂質奈米顆粒組成物的可電離陽離子脂質，所述脂質奈米顆粒組成物促進將放置在其中的有效載荷（例如，核酸，如DNA或RNA，如mRNA）遞送至細胞，例如哺乳動物細胞，例如免疫細胞。所述脂質被設計成能夠將核酸（例如，mRNA）細胞內地遞送至靶細胞類型的胞質區室並快速降解成無毒組分。這些複雜的功能是通過可電離脂質頭基、疏水「醯基尾」基團和連接可電離陽離子脂質中的頭基和醯基尾基團的連接子的化學與幾何形狀之間的相互作用來實現的。 [0012]在一個態樣，本發明提供了一種由式(I)表示的化合物： (I)，或其鹽。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基。在一些實施例中，R 3B是 。在一些實施例中，R 3B1是C 1-6伸烷基。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或C 1-6烷基。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H、未取代的C 1-6烷基或被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。 [0013]本文還提供了一種包含脂質摻合物的脂質奈米顆粒（LNP），所述脂質摻合物包含本文提供的可電離陽離子脂質和/或脂質-免疫細胞靶向基團接合物（例如，脂質-T細胞靶向基團接合物）。 [0014]在另一個態樣，本文提供了一種將核酸遞送至免疫細胞（例如，T細胞）的方法，所述方法包括在允許所述核酸進入所述免疫細胞的條件下使所述免疫細胞暴露於本文所述的含有所述核酸的LNP。 [0015]在另一個態樣，本文提供了一種將核酸遞送至有需要的受試者的免疫細胞（例如，T細胞）的方法，所述方法包括向所述受試者投予包含本文所述的含有核酸的LNP的組成物，從而將所述核酸遞送至所述免疫細胞。 [0016]在另一個態樣，本文提供了一種將核酸（例如，mRNA）的遞送靶向至受試者的免疫細胞（例如，T細胞）的方法，所述方法包括向所述受試者投予本文所述的含有所述核酸的LNP，以促進將所述核酸靶向遞送至所述免疫細胞。 [0017]在一個態樣，本文提供了用於將核酸靶向遞送至免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP），其包含脂質摻合物。在一些實施例中，所述脂質摻合物包含脂質-免疫細胞靶向基團接合物，其包含式(II)的化合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述脂質摻合物包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質包含如本文所述的可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含放置在其中的核酸。 [0018]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。在一些實施例中，所述T細胞抗原是CD3、CD4、CD7或CD8或其組合（例如，CD3和CD8兩者、CD4和CD8兩者或CD7和CD8兩者）。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。在一些實施例中，所述NK細胞抗原是CD7、CD8或CD56或其組合（例如，CD7和CD8兩者）。在一些實施例中，所述抗體是人類或人源化抗體。 [0019]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述脂質摻合物中的脂質共價連接。在一些實施例中，經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。在一些實施例中，所述PEG是PEG 2000。 [0020]在一些實施例中，所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.002至0.2莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述脂質摻合物包含結構脂質（例如，固醇）、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質以40至60莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述固醇以30至50莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述固醇以20-70莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述固醇是膽固醇。 [0021]在一些實施例中，所述中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）所組成的群組。在一些實施例中，所述中性磷脂以1至15莫耳百分比（如約5至15莫耳百分比）的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0022]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質選自由PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、N-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE-PEG）、1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DMG）、1,2-二棕櫚醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DPG）、1,2-二油醯-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇（DOG-PEG）、1,2-二硬脂醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）和DSPE-PEG-半胱胺酸或其衍生物所組成的群組。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質是兩種或更多種獨特的游離PEG-脂質的混合物。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質以1至4莫耳百分比的範圍（如約1至2莫耳百分比、或約2至4莫耳百分比、或約1.5莫耳百分比）存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 [0023]在一些實施例中，所述LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。在一些實施例中，所述LNP在pH 5下具有從約+5 mV至約+50 mV（如在pH 5下約+10 mV至約+30 mV）的ζ電位。在一些實施例中，所述LNP在pH 7.4下具有從約-10 mV至約+10 mV的ζ電位。 [0024]在一些實施例中，所述核酸是DNA或RNA。在一些實施例中，所述RNA是mRNA、tRNA、siRNA、gRNA（指導RNA）、circRNA（環狀RNA）、核酶、誘餌RNA（decoy RNA）或微小RNA（microRNA）。在一些實施例中，所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施例中，所述CAR是TTR-023 抗CD20（Leu-16）。在一些實施例中，所述CAR包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼所述CAR的mRNA包含25的多核苷酸序列。TTR-023抗CD20（Leu-16）CAR序列（包括前導序列）（SEQ ID NO: 24）： METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKAKEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGSGGGSGGGGSSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（SEQ ID NO: 24） [0025]相應的核酸序列（SEQ ID NO: 25）： atggagaccgacaccctgttgctttgggtactgttactttgggtgcccggatctaccggtgattacaaggccaaggaggtgcagctgcagcagagcggagccgagctggtgaagccaggcgcttccgtgaagatgtcttgtaaggcctccggctacacattcaccagctacaatatgcactgggtaaagcagactccggggcagggcctggagtggataggtgccatctaccctggcaacggcgacaccagctacaaccagaagtttaaggggaaggctactctaacagcggacaagtcgtcctctaccgcctacatgcaactcagctccctgacgagcgaggactccgcggactactactgtgcccgctccaactactacggctctagctattggttcttcgacgtgtggggcgctggaacgaccgtgaccgtgtcttccggtggaggttccgggggcggaagcggcggtggcggcagttcggacatcgtgctgacccagagccctgccatcctgtccgcttccccgggggagaaagttacgatgacctgccgagcgagctccagtgtcaactacatggattggtaccagaagaagcccggcagcagtcccaagccgtggatttacgctactagcaacctggcgtccggtgtcccggctcgcttctcaggttctggctcgggtactagttattcattaaccatttctcgcgtggaggctgaggacgctgccacctactactgccaacagtggtctttcaaccctcccactttcggaggcggcaccaagctcgagatcaagggcgggggtggctccgcagcagccattgaggtgatgtatcctcctccctatttggacaacgagaagtcaaatggcaccatcatccacgttaagggcaagcacctgtgcccatctcccctgttcccaggcccctctaagcccttctgggtcctggtggtggtcggcggcgtcctggcatgttactctctgctggtgaccgtcgcgttcatcatcttttgggtccggtccaagcgcagccgcctgctccactccgactacatgaatatgactcctcgtaggcccggtccaacccgcaagcactaccagccgtacgcgccgcccagagactttgctgcttaccgatccagagtgaaattttctaggtcggccgaacctcccgcatatcagcagggccagaaccagctgtacaacgaactcaacttgggacggcgcgaggaatacgatgtgctggataaacgccgtggccgcgatcccgagatgggcgggaagccacgtcgcaaaaaccctcaggagggcctttacaacgagttgcagaaggacaaaatggcggaggcctactccgagatcggaatgaagggggagcgccggcgcggcaaagggcatgacggcctctaccagggcctgtccacagccacgaaagacacctatgacgccctgcatatgcaggccctgcccccgcgctgataatga（SEQ ID NO: 25） [0026]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含被工程化以敲除一個或多個天然鏈間雙硫鍵的Fab。例如，在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段；和/或根據Kabat編號，含有C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含被工程化以引入一個或多個包埋的鏈間雙硫鍵的Fab。例如，在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab抗體包含含有F174C取代的重鏈片段；和/或根據Kabat編號，含有S176C取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，Fab被工程化以敲除一個或多個天然鏈間雙硫鍵並引入一個或多個包埋的鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，Fab在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸。在一些實施例中，所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的輕鏈可變結構域，其中所述CH1結構域和所述輕鏈恆定結構域透過一個或多個鏈間雙硫鍵連接，並且其中所述免疫細胞靶向基團進一步包含透過胺基酸連接子與所述輕鏈恆定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，所述Fab抗體是DS Fab（具有野生型（天然）鏈間雙硫鍵的Fab）、NoDS Fab（敲除了天然雙硫鍵的Fab，如根據Kabat編號，在重鏈上具有C233S取代和/或在輕鏈上具有C214S取代的Fab）、bDS Fab（沒有天然雙硫鍵並引入了非天然鏈間包埋的雙硫鍵的Fab，如根據Kabat編號，在重鏈上具有F174C和C233S和/或在輕鏈上具有S176C和C214S取代的Fab）或bDS Fab-ScFv（通過連接子（如(G4S)x）與ScFv連接到的bDS Fab），如圖31所展示。 [0027]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。在一些實施例中，所述奈米抗體進一步包含間隔子，其包含在所述V HH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。在一些實施例中，所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。在一些實施例中，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，和/或根據Kabat編號，所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。在一些實施例中，所述抗體是ScFv、V HH（Nb）、2xV HH、V HH-CH1/空Vk或V HH1-CH1/V HH-2-Nb bDS，如圖31所展示。 [0028]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。在一些實施例中，所述抗體是在例子中所述的抗體。 [0029]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段； (b) 含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的輕鏈片段； (c) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段； (d) 含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈片段； (e) 含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的輕鏈片段； (f) 含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的輕鏈片段； (g) 含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的輕鏈片段； (h) 含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的輕鏈片段； (i) 含有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的輕鏈片段； (j) 含有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的輕鏈片段；或者 (k) 含有SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的輕鏈片段。 [0030]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵的Fab。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含具有非天然鏈間雙硫鍵（例如，工程化的包埋的鏈間雙硫鍵）的Fab。在一些實施例中，所述Fab在所述重鏈片段中包含F174C取代，並且根據Kabat編號，在所述輕鏈片段中包含S176C取代。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。在一些實施例中，所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 [0031]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且進一步包含間隔子，其包含在所述VHH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個VHH結構域。在一些實施例中，所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域。在一些實施例中，所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的VHH結構域。在一些實施例中，所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。在一些實施例中，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且根據Kabat編號，所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。 [0032]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含：(a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段；或 (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。 [0033]在另一個態樣，本文提供了將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有下式(II)的化合物的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0034]在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP是如在本公開文本中本文所述的LNP。 [0035]在一些態樣，提供了在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下式(II)的結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼所述多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0036]在一些態樣，提供了調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下式(II)的結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼用於調節所述免疫細胞的細胞功能的多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在調節受試者的靶向免疫細胞的細胞功能的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0037]在一些實施例中，細胞功能的調節包括對所述免疫細胞進行重編程以啟動免疫反應。在一些實施例中，細胞功能的調節包括調節所述免疫細胞的抗原特異性。 [0038]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法。在本文所述的關於透過投予例如本發明的LNP來治療、改善和/或預防障礙或疾病的症狀的方法的任何實施例中，所述公開內容旨在還被解釋為提供例如LNP，用於在治療、改善和/或預防障礙或疾病的症狀的所述方法中使用。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米顆粒（LNP）以將核酸遞送至所述受試者的免疫細胞。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下式(II)的結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0039]在一些實施例中，所述核酸調節所述免疫細胞的免疫反應，從而治療或改善所述症狀。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法中使用。疾病或障礙可以如下文所公開。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0040]在一些實施例中，所述障礙是免疫障礙、炎性障礙或癌症。在一些實施例中，所述核酸編碼用於在治療或預防病原體感染的治療性或預防性疫苗中使用的抗原。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab抗體包含含有F174C取代的重鏈片段；和/或根據Kabat編號，含有S176C取代的輕鏈片段。 [0041]在一些實施例中，不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的不意在成為所述遞送的目標的不希望的免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，由所述LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期比由參考LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期長至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更長。 [0042]在一些實施例中，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多的意在成為所述遞送的目標的免疫細胞被所述LNP轉染。 [0043]在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸在相同免疫細胞中的表現水平高至少5%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。 [0044]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的NK細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD56的抗體。 [0045]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD7或CD8的抗體，並且所述游離PEG脂質是DMG-PEG或DPG-PEG。 [0046]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。在一些實施例中，所述Fab被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述Fab具有包埋的鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述抗體是免疫球蛋白單可變（ISV）結構域，並且所述ISV結構域是Nanobody® ISV。在一些實施例中，所述游離PEG脂質包含具有至少2000道爾頓的分子量的PEG。在一些實施例中，所述PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。在一些實施例中，所述Fab是抗CD3抗體，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約2000道爾頓的分子量的PEG。在一些實施例中，所述Fab是抗CD4抗體，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約3000至3500道爾頓的分子量的PEG。 [0047]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺、二烷基磷脂醯乙醇胺、二醯基甘油、神經醯胺、二烷基甘油或二烷基乙醯胺。在一些實施例中，所述烷基鏈是肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸或硬脂酸。在一些實施例中，所述游離PEG脂質是DMG-PEG。在一些實施例中，所述游離PEG脂質是DPG-PEG。 [0048]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD3的抗體和結合CD11a或CD18的抗體。 [0049]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD7的抗體和結合CD8的抗體。 [0050]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的兩種不同類型的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。 [0051]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含雙特異性靶向部分。在一些實施例中，所述雙特異性靶向部分與所述兩種不同類型的免疫細胞結合。在一些實施例中，所述兩種不同類型的免疫細胞是CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。在一些實施例中，所述雙特異性靶向部分是雙特異性抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是Fab-ScFv。 [0052]在一個態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的CD4+和CD8+ T細胞兩者的脂質奈米顆粒（LNP）。所述LNP包含 (a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與CD3或CD7結合的單一抗體。 [0053]進一步提供了一種用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP），其中所述LNP包含：(a) 可電離陽離子脂質；(b) 含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]；(c) 固醇或其他結構脂質；(d) 中性磷脂；(e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述核酸，其中所述免疫細胞靶向基團包含缺乏天然鏈間雙硫鍵的Fab。在一些實施例中，所述Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恆定輕鏈和天然恆定重鏈上的形成天然鏈間雙硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除所述Fab中的天然鏈間雙硫鍵。 [0054]還提供了一種與人CD8結合的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）。在一些實施例中，所述ISVD包含三個互補決定結構域CDR1、CDR2和CDR3，其中 (a) 所述CDR1包含GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）， (b) 所述CDR2包含IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101），並且 (c) 所述CDR3包含AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）。 [0055]在一些實施例中，所述ISVD是人源化的。 [0056]在一些實施例中，所述ISVD包含、由、或基本上由SEQ ID NO: 77組成。 [0057]還提供了一種多肽，其包含GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）、IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）和AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）。 [0058]在一些實施例中，所述多肽包含如本文所述的ISVD。 [0059]在一些實施例中，所述多肽進一步包含第二結合部分，其中所述第二結合部分與CD8或另一種不同的靶標結合。在一些實施例中，所述第二結合部分也是ISVD。 [0060]在一些實施例中，所述多肽進一步包含可檢測標記或治療劑。 [0061]還提供了一種組成物，其包含如本文所述的ISVD或多肽。 [0062]進一步提供了一種醫藥組成物，其包含如本文所述的ISVD或多肽以及醫藥上可接受的載劑。 [0063]進一步提供了一種治療受試者的與CD8相關的疾病或障礙的方法，所述方法包括向所述受試者投予如本文所述的醫藥組成物。 [0064]在一些實施例中，所述疾病是癌症。在一些實施例中，所述障礙是免疫障礙、炎性障礙或癌症。 [0065]在一些實施例中，所述核酸編碼用於在治療或預防病原體感染的治療性或預防性疫苗中使用的抗原。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質是如本文所公開的可電離陽離子脂質，如表1中的那些。 [0066]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。在一些實施例中，所述T細胞抗原是CD3、CD8或CD3和CD8.60兩者。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。在一些實施例中，所述NK細胞抗原是CD56。在一些實施例中，所述抗體是人類或人源化抗體。 [0067]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述脂質摻合物中的脂質共價連接。在一些實施例中，經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。在一些實施例中，所述PEG是PEG 2000。在一些實施例中，所述PEG是PEG 3400。 [0068]在一些實施例中，所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.002至0.2莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質以40至60莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0069]在一些實施例中，所述固醇是膽固醇。在一些實施例中，所述固醇以30至50莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）所組成的群組。 [0070]在一些實施例中，所述中性磷脂以1至15莫耳百分比（如約5至15莫耳百分比或約5至10莫耳百分比）的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0071]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質選自由PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質所組成的群組。 [0072]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質以約0.1至4莫耳百分比（如約0.5至2.5莫耳百分比、或約1至2莫耳百分比）存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質以約1.5莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 [0073]在一些實施例中，所述LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。在一些實施例中，所述LNP在pH 5下具有從約+5 mV至約+50 mV（如在pH 5下約+10 mV至約+30 mV）的ζ電位。在一些實施例中，所述LNP在pH 7.4下具有從約-10 mV至約+10 mV的ζ電位。 [0074]在一些實施例中，所述核酸是DNA或RNA。在一些實施例中，所述RNA是mRNA、tRNA、siRNA、gRNA（指導RNA）、circRNA（環狀RNA）、核酶、誘餌RNA或微小RNA。在一些實施例中，所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 [0075]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含選自以下的抗體片段：Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv和scFv片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含含有一個或多個鏈間雙硫鍵的Fab。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有F174C和C233S取代的重鏈片段和含有S176C和C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。 [0076]在一些實施例中，所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，所述CH1結構域和所述輕鏈恆定結構域透過一個或多個鏈間雙硫鍵連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團進一步包含透過胺基酸連接子與所述輕鏈恆定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。 [0077]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且進一步包含間隔子，其包含在所述VHH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個VHH結構域。在一些實施例中，所述兩個或更多個VHH結構域透過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一VHH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二VHH結構域。在一些實施例中，所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的VHH結構域。在一些實施例中，所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。 [0078]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段； (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。 [0079]在一些實施例中，不超過5%的非免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期比由參考LNP遞送的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期長至少10%。在一些實施例中，至少10%的免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸的表現水平高至少10%。 [0080]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞是NK細胞。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD56的抗體。 [0081]在一些態樣，本文提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含結合CD7或CD8的抗體。在一些實施例中，所述游離PEG脂質是DMG-PEG或DPG-PEG。 [0082]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含抗體。在一些實施例中，所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。 [0083]在一些實施例中，所述Fab被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述Fab包含非天然鏈間雙硫鍵。在一些實施例中，所述Fab在所述重鏈片段中包含F174C取代，並且在所述輕鏈片段中包含S176C取代。在一些實施例中，所述抗體是免疫球蛋白單可變（ISV）結構域，並且所述ISV結構域是Nanobody® ISV。在一些實施例中，所述游離PEG脂質包含具有至少2000道爾頓的分子量的PEG。在一些實施例中，所述PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。在一些實施例中，所述抗體是Fab。在一些實施例中，所述Fab結合CD3，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約2000道爾頓的分子量的PEG。在一些實施例中，所述Fab是抗CD4抗體，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約3000至3500道爾頓的分子量的PEG。 [0084]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個VHH結構域。在一些實施例中，所述兩個或更多個VHH結構域透過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一VHH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二VHH結構域。 [0085]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0086]在一些實施例中，所述LNP結合CD3，並且還結合CD11a或CD18。在一些實施例中，所述LNP包含兩種接合物。在一些實施例中，第一接合物包含結合CD3的抗體。在一些實施例中，第二接合物包含結合CD11a或CD18的抗體。在一些實施例中，所述LNP包含一種接合物。在一些實施例中，所述接合物包含結合CD3和CD11a兩者的雙特異性抗體。在一些實施例中，所述接合物包含結合CD3和CD18兩者的雙特異性抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述LNP結合所述免疫細胞的CD7和CD8。 [0087]在一些實施例中，所述LNP包含兩種接合物。在一些實施例中，第一接合物包含結合CD7的抗體，並且第二接合物包含結合CD8的抗體。在一些實施例中，所述LNP包含一種接合物。在一些實施例中，所述接合物包含結合CD7和CD8的雙特異性抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。 [0088]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的兩種不同類型的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含：可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述LNP與第一類型的免疫細胞的表面上的第一抗原結合，並且還與第二類型的免疫細胞的表面上的第二抗原結合。在一些實施例中，所述兩種不同類型的免疫細胞是CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。在一些實施例中，所述LNP包含兩種接合物。在一些實施例中，第一接合物包含與所述第一類型的免疫細胞的第一抗原結合的第一抗體，並且第二接合物包含與所述第二類型的免疫細胞的第二抗原結合的第二抗體。在一些實施例中，所述LNP包含一種接合物。在一些實施例中，所述接合物包含雙特異性抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體與所述第一類型的免疫細胞上的第一抗原和所述第二類型的免疫細胞上的第二抗原兩者結合。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。 [0089]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的CD4+和CD8+ T細胞兩者的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與CD3或CD7結合的單一抗體。 [0090]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的T細胞和NK細胞兩者的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與CD7、CD8或CD7和CD8兩者結合。 [0091]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的T細胞和NK細胞兩者的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或另一種結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與 (i) CD3和CD56兩者；(ii) CD8和CD56兩者；或 (iii) CD7和CD56兩者結合。 [0092]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述脂質摻合物中的脂質共價連接。在一些實施例中，經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）、二烷基乙醯胺或神經醯胺。在一些實施例中，所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.002至0.2莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述脂質摻合物進一步包含結構脂質（例如，固醇）、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。 [0093]在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質以40至60莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0094]在一些實施例中，所述固醇以30至50莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述固醇是膽固醇。 [0095]在一些實施例中，所述中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）所組成的群組。在一些實施例中，所述中性磷脂以1至15莫耳百分比（如約5至15莫耳百分比）的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0096]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質選自由PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、N-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE-PEG）、1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DMG）、1,2-二棕櫚醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DPG）、1,2-二油醯-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇（DOG-PEG）、1,2-二硬脂醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）和DSPE-PEG-半胱胺酸或其衍生物所組成的群組。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質以0.1至4莫耳百分比（如約0.5至2.5莫耳百分比）的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質為約1.5莫耳百分比。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 [0097]在一些實施例中，所述LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。在一些實施例中，所述LNP在pH 5下具有從約-5 mV至50 mV（如在pH 5下約+10 mV至約+30 mV）的ζ電位。在一些實施例中，所述LNP在pH 7.4下具有從約-10 mV至約+10 mV的ζ電位。 [0098]在一些實施例中，所述核酸是DNA或RNA。在一些實施例中，所述RNA是mRNA。在一些實施例中，所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 [0099]在一些態樣，提供了用於將核酸遞送至受試者的免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0100]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含缺乏天然鏈間雙硫鍵的Fab。在一些實施例中，所述Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恆定輕鏈和天然恆定重鏈上的形成天然鏈間雙硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除所述Fab中的天然鏈間雙硫鍵。 [0101]在一些態樣，提供了將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述方法用於靶向NK細胞。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與CD56結合。在一些實施例中，所述方法用於同時靶向T細胞和NK細胞兩者。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與CD7、CD8或CD7和CD8兩者結合。在一些實施例中，所述方法用於同時靶向CD4+和CD8+ T細胞兩者。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與CD3或CD7結合的多肽。 [0102]在一些態樣，提供了在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0103]在一些態樣，提供了調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）。 [0104]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）。 [0105]在一些態樣，提供了與人CD8結合的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）。在一些實施例中，所述ISVD包含三個互補決定結構域CDR1、CDR2和CDR3。在一些實施例中，所述CDR1包含GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）。在一些實施例中，所述CDR2包含IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）。在一些實施例中，所述CDR3包含AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）。在一些實施例中，所述ISVD是人源化的。在一些實施例中，所述ISVD包含SEQ ID NO: 77。 [0106]在一些態樣，提供了多肽，其包含GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）、IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）和AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）。在另一個態樣，提供了多肽，其包含本文提供的ISVD。在一些實施例中，所述多肽包含第二結合部分。在一些實施例中，所述第二結合部分與CD8或另一種不同的靶標結合。在一些實施例中，所述第二結合部分也是ISVD。在一些實施例中，所述多肽包含可檢測標記。在一些實施例中，所述多肽包含治療劑。 [0107]在一些態樣，提供了組成物，其包含本文提供的ISVD或本文提供的多肽。 [0108]在一些態樣，提供了醫藥組成物，其包含本文提供的ISVD或本文提供的多肽以及醫藥上可接受的載劑。 [0109]在一些態樣，提供了治療受試者的與CD8相關的疾病或障礙的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文所述的醫藥組成物。在一些實施例中，所述疾病或障礙是癌症。 [0110]下面進一步詳細地描述本發明的各個態樣和實施例。
[0363]本發明提供了可電離陽離子脂質、脂質-免疫細胞靶向基團接合物、和包含此類可電離陽離子脂質和/或脂質-免疫細胞（例如，T細胞）靶向基團接合物的脂質奈米顆粒組成物、含有此類脂質和/或接合物的醫用套組、以及製備和使用此類脂質和接合物的方法。 [0364]除非另外指示，否則本發明的實踐採用有機化學、藥理學、細胞生物學和生物化學的常規技術。這些技術在以下文獻中闡明，如「Comprehensive Organic Synthesis」（B.M. Trost和I. Fleming，編輯，1991-1992）；「Current protocols in molecular biology」（F.M. Ausubel等人，編輯，1987, 以及定期更新）；以及「Current protocols in immunology」（J.E. Coligan等人，編輯，1991），將其每一個通過引用以其整體併入本文。在下面的部分中闡述了本發明的各個態樣；然而，在一個特定部分中所述的本發明的態樣不限於任何特定部分。 I. 定義 [0365]為了便於理解本發明，下面定義了許多術語和片語。 [0366]除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科技術語均具有與本發明所屬領域的具有通常知識者通常所理解的相同含義。本文所用的縮寫具有其在化學和生物領域內的常規含義。本文闡述的化學結構和化學式應當根據化學領域已知的化學價的標準規則來解釋。另外，例如，當化學基團是雙自由基時，應理解化學基團可以在一個或兩個方向上與結構的其餘部分中的其相鄰原子鍵合，例如-OC(O)-可與-C(O)O-互換，或者-OC(S)-可與-C(S)O-互換。 [0367]除非上下文不恰當，否則如本文所用的術語「一個/一種（a）」和「一個/一種（an）」意指「一個或多個/一種或多種（one or more）」並且包括複數。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1或2。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2或3。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3或4。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3、4或5。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3、4、5或更大。 [0368]如本文所用的術語「烷基」是指飽和直鏈或支鏈烴，如1-12、1-10或1-6個碳原子的直鏈或支鏈基團，在本文中分別稱為C 1-C 12烷基、C 1-C 10烷基或C 1-C 6烷基。在一些實施例中，烷基是任選地經取代的。示例性烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。 [0369]術語「伸烷基」是指烷基的雙自由基。在一些實施例中，伸烷基是任選地經取代的。示例性伸烷基是-CH2CH2-。 [0370]術語「鹵代烷基」是指被至少一個鹵素取代的烷基。例如，-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CF 2CF 3等。 [0371]「烯基」是指具有所示數目的碳原子（例如，2至8個或2至6個碳原子）和至少一個碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基。所述基團可以呈關於一個或多個雙鍵的順式或反式組態（Z或E組態）。烯基包括但不限於乙烯基、丙烯基（例如，丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基（烯丙基）、丙-2-烯-2-基）和丁烯基（例如，丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基）。 [0372]「炔基」是指具有所示數目的碳原子（例如，2至8個或2至6個碳原子）和至少一個碳-碳三鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基。炔基包括但不限於乙炔基、丙炔基（例如，丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基）和丁炔基（例如，丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基）。 [0373]術語「側氧基」是本領域公認的並且是指「=O」取代基。例如，被側氧基基團取代的環戊烷是環戊酮。 [0374]術語「嗎啉基」是指具有以下結構的取代基： ，其是任選地經取代的。 [0375]術語「哌啶基」是指具有以下結構的取代基： ，其是任選地經取代的。 [0376]通常，術語「取代的」無論前面是否有術語「任選地」均意指指定部分的一個或多個氫被合適的取代基替換。除非另外指示，否則「任選取代的」基團可以在所述基團的每個可取代位置處具有合適的取代基，並且當任何給定結構中的超過一個位置可以被超過一個選自指定群組的取代基取代時，在每個位置處的取代基可以相同或不同。在本發明下預想的取代基組合優選地為導致形成穩定或化學上可行的化合物的取代基組合。在一些實施例中，「任選取代的」等同於「未取代的或取代的」。在一些實施例中，「任選取代的」表示指定的原子或基團任選地被一個或多個獨立地選自本文提供的任選取代基的取代基取代。在一些實施例中，任選的取代基可以選自：C 1-6烷基、氰基、鹵素、-O-C 1-6烷基、C 1-6鹵代烷基、C 3-7環烷基、3元至7元雜環基、5元至6元雜芳基和苯基。在一些實施例中，任選的取代基是烷基、氰基、鹵素、鹵代、疊氮化物、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、-C(O)烷基、-CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基。在一些實施例中，任選的取代基是-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13或-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。 [0377]術語「鹵代烷基」是指被至少一個鹵素取代的烷基。例如，-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CF 2CF 3等。 [0378]術語「環烷基」是指衍生自環烷烴的3-12、3-10、3-8、4-8或4-6個碳的單價飽和環狀、二環、橋環（例如，金剛烷基）或螺環烴基，在本文中被稱為例如「C 4-8環烷基」。在一些實施例中，環烷基是任選地經取代的。示例性環烷基包括但不限於環己烷、環戊烷、環丁烷和環丙烷。除非另外說明，否則環烷基在一個或多個環位置處任選地被例如烷醯基、烷氧基、烷基、鹵代烷基、烯基、炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基、芳基烷基、疊氮基、胺基甲酸酯、碳酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵代烷基、雜芳基、雜環基、羥基、亞胺基、酮、硝基、磷酸酯、膦酸基、次膦酸基、硫酸酯、硫化物、磺醯胺基、磺醯基或硫代羰基取代。在某些實施例中，環烷基沒有被取代，即它是未取代的。 [0379]術語「雜環基」和「雜環基團」是本領域公認的，並且是指飽和、部分不飽和或芳香族的3至10元環結構，可替代地3至7元環，其環結構包括一至四個雜原子，如氮、氧和硫。在一些實施例中，雜環基是任選地經取代的。雜環基中的環原子數可以使用C x-C x命名法指定，其中x是指定環原子數的整數。例如，C 3-C 7雜環基是指飽和或部分不飽和的3至7元環結構，其含有一至四個雜原子，如氮、氧和硫。名稱「C 3-C 7」指示雜環含有總共從3至7個環原子，包括佔據環原子位置的任何雜原子。C 3雜環基的一個例子是氮雜環丙烷基。雜環可以是例如單環、二環或其他多環環系統（例如，稠合、螺環、橋接二環的）。雜環可以與一個或多個芳基、部分不飽和或飽和的環稠合。雜環基包括例如生物素基、色烯基、二氫呋喃基、二氫吲哚基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二噻唑基、高哌啶基、咪唑烷基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、氧雜環戊烷基、噁唑烷基、吩𠮿基（phenoxanthenyl）、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑啶基、吡唑啉基、吡啶基、嘧啶基、吡咯啶基、吡咯啶-2-酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫喹啉基、噻唑烷基、硫雜環戊烷基、硫代嗎啉基、噻喃基、𠮿基、內酯、內醯胺（如氮雜環丁酮和吡咯啶酮）、磺內醯胺、磺內酯等。除非另外說明，否則雜環在一個或多個位置處任選地被諸如烷醯基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基、芳基烷基、疊氮基、胺基甲酸酯、碳酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵代烷基、雜芳基、雜環基、羥基、亞胺基、酮、硝基、側氧基、磷酸根、膦酸基、次膦酸基、硫酸根、硫化物、磺醯胺基、磺醯基和硫代羰基等取代基取代。在某些實施例中，雜環基沒有被取代，即它是未取代的。 [0380]術語「芳基」是本領域公認的並且是指碳環芳香族基團。在一些實施例中，芳基是任選地經取代的。代表性芳基包括苯基、萘基、蒽基等。術語「芳基」包括具有兩個或更多個碳環的多環環系統，其中兩個或更多個碳是兩個相鄰環（所述環是「稠環」）共有的，其中至少一個環是芳香族的，並且例如，其他一個或多個環可以是環烷基、環烯基、環炔基和/或芳基。除非另外說明，否則芳香環可以在一個或多個環位置處被例如鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、-C(O)烷基、CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基部分、-CF 3、-CN等取代。在某些實施例中，芳香環在一個或多個環位置處被鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代。在某些其他實施例中，芳香環沒有被取代，即它是未取代的。在某些實施例中，芳基是6元至10元環結構。在一些實施例中，芳基是C 6-C 14芳基。 [0381]術語「雜芳基」是本領域公認的並且是指包括至少一個環雜原子的芳香族基團。在一些實施例中，雜芳基是任選地經取代的。在某些情況下，雜芳基含有1、2、3或4個環雜原子。雜芳基的代表性例子包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、噠嗪基和嘧啶基等。除非另外說明，否則雜芳基環可以在一個或多個環位置處被例如鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、C(O)烷基、-CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基部分、-CF 3、-CN等取代。術語「雜芳基」還包括具有兩個或更多個環的多環環系統，其中兩個或更多個碳是兩個相鄰環（所述環是「稠環」）共有的，其中至少一個環是雜芳香族的，例如，其他環狀環可以是環烷基、環烯基、環炔基和/或芳基。在某些實施例中，雜芳基環在一個或多個環位置處被鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代。在某些其他實施例中，雜芳基環沒有被取代，即它是未取代的。在某些實施例中，雜芳基是5至10元環結構，可替代地5至6元環結構，其環結構包括1、2、3或4個雜原子，如氮、氧和硫。 [0382]術語「胺」和「胺基」是本領域公認的並且是指未取代和取代的胺兩者，例如由通式-N(R 10)(R 11)表示的部分，其中R 10和R 11各自獨立地代表氫、烷基、環烷基、雜環基、烯基、芳基、芳烷基或(CH 2) m-R 12；或者R 10和R 11與它們所附接的N原子一起構成在環結構中具有從4至8個原子的雜環；R 12代表芳基、環烷基、環烯基、雜環或多環；並且m是零或在1至8範圍內的整數。在某些實施例中，R 10和R 11各自獨立地代表氫、烷基、烯基或-(CH 2) m-R 12。 [0383]術語「烷氧基（alkoxyl）」或「烷氧基（alkoxy）」是本領域公認的並且是指如上所定義的具有與其附接的氧自由基的烷基。在一些實施例中，烷氧基是任選地經取代的。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、三級丁氧基等。「醚」是通過氧共價連接的兩個烴。因此，烷基的使該烷基成為醚的取代基是或類似於烷氧基，如可以由-O-烷基、-O-烯基、O-炔基、-O-(CH 2) m-R 12中的一個表示，其中m和R 12如上所述。術語「鹵代烷氧基」是指被至少一個鹵素取代的烷氧基。例如，-O-CH 2F、-O-CHF 2、-O-CF 3等。在某些實施例中，鹵代烷氧基是被至少一個氟基團取代的烷氧基。在某些實施例中，鹵代烷氧基是被從1-6、1-5、1-4、2-4或3個氟基團取代的烷氧基。 [0384]符號「 」指示附接點。 [0385]本公開文本的化合物可以含有一個或多個手性中心和/或雙鍵，因此作為立體異構體（如幾何異構體、對映異構體或非對映異構體）存在。當在本文中使用時，術語「立體異構體」由所有幾何異構體、對映異構體或非對映異構體組成。這些化合物可以由符號「R」或「S」指定，這取決於立體碳原子周圍的取代基的組態。本發明涵蓋這些化合物的各種立體異構體及其混合物。立體異構體包括對映異構體和非對映異構體。對映異構體或非對映異構體的混合物在命名法中可以由「(±)」指定，但是具有通常知識者應認識到結構可以隱含地表示手性中心。應理解，除非另外指示，否則化學結構（例如，通用化學結構）的圖形描繪涵蓋指定化合物的所有立體異構形式。 [0386]本發明化合物的單獨立體異構體可以由含有不對稱或立體中心的市售起始材料合成製備，或者通過製備外消旋混合物、然後進行本領域具有通常知識者熟知的離析方法來製備。這些離析方法由以下例示：(1) 將對映異構體混合物附接到手性助劑上，透過重結晶或層析法分離所得的非對映異構體混合物，並從助劑中釋放光學純的產物；(2) 採用光學活性離析劑形成鹽；或 (3) 在手性層析柱上直接分離光學對映異構體混合物。立體異構混合物也可以透過熟知的方法離析成其組成立體異構體，所述方法如手性相氣相層析法、手性相高效液相層析法、使化合物結晶為手性鹽接合物或使化合物在手性溶劑中結晶。進一步地，可以使用文獻中所述的超臨界流體層析（SFC）技術分離對映異構體。仍進一步地，立體異構體可以透過熟知的不對稱合成方法由立體異構體純的中間體、試劑和催化劑獲得。 [0387]幾何異構體也可以存在於本發明的化合物中。符號「 」表示可以是如本文所述的單鍵、雙鍵或三鍵的鍵。本發明涵蓋由碳-碳雙鍵周圍的取代基排列或碳環周圍的取代基排列產生的各種幾何異構體及其混合物。碳-碳雙鍵周圍的取代基被指定處於「 Z」或「 E」組態，其中根據IUPAC標準使用術語「 Z」和「 E」。除非另外說明，否則描述雙鍵的結構涵蓋「 E」和「 Z」異構體兩者。 [0388]碳-碳雙鍵周圍的取代基可替代地可以被稱為「順式」或「反式」，其中「順式」表示取代基在雙鍵的同一側，並且「反式」表示取代基在雙鍵的相對側。碳環周圍的取代基排列被指定為「順式」或「反式」。術語「順式」表示取代基在環平面的同一側，並且術語「反式」表示取代基在環平面的相對側。其中取代基被放置在環平面的同一側和相對側的化合物混合物被指定為「順式/反式」。 [0389]本發明還包括同位素標記的本發明化合物，其與本文所述的化合物相同，不同之處在於一個或多個原子被原子質量或質量數不同於在自然界中通常發現的原子質量或質量數的原子替換。可以摻入本發明的化合物中的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如對應地為 2H、 3H、 13C、 14C、 15N、 18O、 17O、 31P、 32P、 35S、 18F和 36Cl。 [0390]某些同位素標記的公開的化合物（例如，用3H和14C標記的化合物）可用於化合物和/或基質組織分佈測定。氚化的（即，3H）和碳-14（即，14C）同位素因其易於製備和可檢測性而是特別優選的。進一步地，用較重的同位素（如氘，即2H）取代可以提供某些治療優勢，這是由於其具有更高的代謝穩定性（例如，體內半衰期增加或劑量需求減少），因此在一些情況下可能是優選的。同位素標記的本發明化合物通常可以通過類似於例如本文實例中公開的程序的程序，透過用同位素標記的試劑取代非同位素標記的試劑來製備。 [0391]如本文所用，術語「受試者」和「患者」是指待通過本發明的方法治療的生物體。此類生物體優選地是哺乳動物（例如，鼠科動物、猿猴、馬科動物、牛科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物等），並且更優選地是人類。 [0392]如本文所用，術語「醫藥組成物」是指活性劑與惰性或活性載劑的組合，使得所述組成物特別適合於體內或離體的診斷或治療用途。 [0393]如本文所用，術語「醫藥上可接受的賦形劑」是指任何標準醫藥載劑，如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑（例如像油/水或水/油乳劑）和各種類型的潤濕劑。所述組成物還可以包括穩定劑和防腐劑。關於載劑、穩定劑和輔助劑的例子，參見Remington's The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins，巴爾的摩，馬里蘭州，2006。 [0394]如本領域具有通常知識者已知的，本發明化合物的「鹽」可以衍生自無機酸或有機酸和無機鹼或有機鹼。酸的例子包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸（如草酸）雖然本身不是醫藥上可接受的，但可以用於製備鹽，所述鹽可用作在獲得本發明的化合物及其醫藥上可接受的酸加成鹽時的中間體。 [0395]鹼的例子包括但不限於鹼金屬（例如，鈉）氫氧化物、鹼土金屬（例如，鎂）氫氧化物、氨和式NW 4 +的化合物（其中W是C 1-4烷基）等。 [0396]鹽的例子包括但不限於：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、氟庚酸鹽（flucoheptanoate）、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽等。鹽的其他例子包括與合適的陽離子如Na +、NH 4 +和NW 4 +（其中W是C 1-4烷基）等複合的本發明的化合物的陰離子。 [0397]如本文所用的縮寫包括二異丙基乙胺（DIPEA）；4-二甲基胺基吡啶（DMAP）；四丁基碘化銨（TBAI）；1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺（EDC）；六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻（PyBOP）；9-茀基甲氧基羰基（Fmoc）；四丁基二甲基甲矽烷基氯（TBDMSCl）；氟化氫（HF）；苯基（Ph）；雙(三甲基甲矽烷基)胺（HMDS）；二甲基甲醯胺（DMF）；二氯甲烷（DCM）；四氫呋喃（THF）；高效液相層析法（HPLC）；質譜法（MS）；蒸發光散射檢測器（ELSD）；電噴霧（ES）；核磁共振波譜法（NMR）。 [0398]如本文所用，術語「有效量」是指化合物（例如，核酸，例如mRNA）的足以實現有益或期望的結果的量。有效量可以在一次或多次投予、應用或劑量中投予，並不旨在限於特定的調配物或投予途徑。術語有效量可以被認為包括化合物的治療和/或預防有效量。 [0399]如本文所用的片語「治療有效量」意指化合物（例如，核酸，例如mRNA）、材料或包含化合物（例如，核酸，例如mRNA）的組成物的這樣的量，其是以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比有效地在哺乳動物（例如，人類）或受試者（例如，人類受試者）中的至少一個細胞亞群中產生一些期望的治療效果。 [0400]如本文所用的片語「預防有效量」意指化合物（例如，核酸，例如mRNA）、材料或包含化合物（例如，核酸，例如mRNA）的組成物的這樣的量，其是以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比透過降低、最小化或消除患上病症的風險或者降低或最小化病症的嚴重程度而有效地在哺乳動物（例如，人類）或受試者（例如，人類受試者）中的至少一個細胞亞群中產生一些期望的預防效果。 [0401]如本文所用，術語「治療（treat）」、「治療（treating）」和「治療（treatment）」包括導致病症、疾病、障礙等的改進或改善其症狀的任何作用，例如減少、減輕、調節、改善或消除。 [0402]片語「醫藥上可接受的」在本文中用於指代在合理的醫學判斷範圍內適用於與人和動物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的收益/風險比相稱的那些化合物、材料、組成物和/或劑型。 [0403]在本申請中，在要素或組分被說成包括在和/或選自所列舉的要素或組分的清單的情況下，應當理解所述要素或組分可以是所列舉的要素或組分中的任何一種，或者所述要素或組分可以選自所列舉的要素或組分中的兩種或更多種。 [0404]進一步地，應當理解，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，本文所述的組成物或方法的要素和/或特徵可以以多種方式組合，無論在本文中是明確的還是暗示的。例如，除非從上下文中另外理解，否則在提及特定化合物的情況下，該化合物可以用於本發明組成物的各種實施例和/或本發明的方法中。換言之，在本申請內，實施例已經以使得能夠書寫和繪製清晰且簡明的申請的方式進行了描述和描繪，但是意圖並且應理解的是，實施例可以在不背離本發明教導和一項或多項發明的情況下以各種方式組合或分離。例如，應理解的是，本文描述和描繪的所有特徵均可以適用於本文描述和描繪的一項或多項發明的所有態樣。 [0405]應當理解，除非從上下文和使用中另外理解，否則表述「……中的至少一個/至少一種（at least one of）」包括在所述表述後所列舉的物件中的單獨每一個/每一種以及所列舉物件中的兩個或更多個/兩種或更多種的各種組合。除非從上下文中另外理解，否則與三個或更多個/三種或更多種所列舉物件結合的表述「和/或」應當被理解為具有相同的含義。 [0406]除非另外明確說明或從上下文中另外理解，否則術語「包括（include）」、「包括（includes）」、「包括（including）」、「具有（have）」、「具有（has）」、「具有（having）」、「含有（contain）」、「含有（contains）」或「含有（containing）」（包括其語法對等詞）的使用通常應當被理解為開放式和非限制性的，例如不排除另外的未列舉的要素或步驟。 [0407]除非另外明確說明，否則在數值之前使用術語「約」的情況下，本發明還包括具體的數值本身。如本文所用，除非另外指示或推斷，否則術語「約」是指與標稱值相差 ± 10%的變化。 [0408]如本文所用，除非另外指示，否則術語「抗體」意指包含至少一個與特定抗原特異性結合或相互作用的互補決定區（CDR）的任何抗原結合分子或分子接合物。應理解，所述術語涵蓋完整抗體（例如，完整單株抗體）或其片段如抗體的Fc片段（例如，單株抗體的Fc片段）或抗體的抗原結合片段（例如，單株抗體的抗原結合片段），包括已經修飾或工程化的完整抗體、抗原結合片段或Fc片段。抗原結合片段的例子包括Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈抗體（例如，scFv）、微型抗體和雙抗體。已經修飾或工程化的抗體的例子包括嵌合抗體、人源化抗體和多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）。所述術語還涵蓋免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體（例如，V HH）。 [0409]如這裡所用，「與X結合的抗體」（即，X是特定抗原）或「抗X抗體」是特異性識別抗原X的抗體。 [0410]如本文所用，「包埋的鏈間雙硫鍵」或「鏈間包埋的雙硫鍵」是指多肽上的這樣的雙硫鍵，其不易被水溶性還原劑接近或有效地「包埋」在多肽的疏水區中，使得它既不能用於還原劑，也不能用於與其他親水PEG偶聯。包埋的鏈間雙硫鍵進一步描述於WO 2017096361A1中，將其通過引用以其整體而併入。 [0411]如本文所用，LNP的靶向遞送的特異性由接受所遞送的核酸的所需免疫細胞類型（例如，中靶遞送）的百分比與不意在成為所述遞送的目標但接受所遞送的核酸的不希望的免疫細胞類型（例如，脫靶遞送）的百分比之間的比率來定義。例如，當更多的希望的免疫細胞接受所遞送的核酸，同時更少的不希望的免疫細胞接受所遞送的核酸時，特異性更高。LNP的靶向遞送的特異性也可以定義為被遞送至希望的免疫細胞的核酸量（例如，中靶遞送）與被遞送至不希望的免疫細胞核酸量（例如，脫靶遞送）的比率。可以使用任何合適的方法確定遞送的特異性。作為非限制性例子，可以測量核酸在所需的免疫細胞類型中的表現水平，並且將其與核酸在不意在成為所述遞送的目標的不同免疫細胞類型中的表現水平進行比較。 [0412]如本文所用，在一些實施例中，參考LNP是不具有免疫細胞靶向基團但在其他方面與所測試的LNP相同的LNP。在一些其他實施例中，參考LNP是具有不同的可電離陽離子脂質但在其他方面與所測試的LNP相同的LNP。在一些實施例中，參考LNP包含作為可電離陽離子脂質的D-Lin-MC3-DMA（其不同於所測試LNP中的可電離陽離子脂質），但是在其他方面與所測試的LNP相同。 [0413]如本文所用，人源化抗體是這樣的抗體，其是完全或部分非人類起源的，並且其蛋白質序列已經被修飾以替換某些胺基酸，例如出現在來自人類的抗體序列中的VH和VL結構域的架構區中的一個或多個相應位置處的胺基酸，以增加其與在人類中天然產生的抗體的相似性，以便避免或最小化人類的免疫反應。例如，使用基因工程技術，可以將目的非人類抗體的可變結構域與人類抗體的恆定結構域組合。人源化抗體的恆定結構域在很多時候是人類CH和CL結構域。 [0414]如本文所用，術語「結構脂質」是指固醇，並且還指代含有固醇部分的脂質。 [0415]應當理解，步驟的順序或進行某些動作的順序是無關緊要的，只要本發明保持可操作即可。此外，可以同時進行兩個或更多個步驟或動作。 [0416]在本說明書中的各個地方，取代基以組或以範圍公開。特別地，意圖是所述描述包括此類組和範圍的成員的每個單獨的子組合。例如，術語「C 1-6烷基」具體旨在單獨公開C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1-C 6、C 1-C 5、C 1-C 4、C 1-C 3、C 1-C 2、C 2-C 6、C 2-C 5、C 2-C 4、C 2-C 3、C 3-C 6、C 3-C 5、C 3-C 4、C 4-C 6、C 4-C 5和C 5-C 6烷基。透過舉其他例子的方式，在0至40範圍內的整數具體旨在單獨公開0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40，並且在1至20範圍內的整數具體旨在單獨公開1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。 [0417]除非要求保護，否則在本文中使用任何和所有例子或示例性語言（例如，「如」或「包括」）均僅旨在更好地說明本發明，並不對本發明的範圍施加任何限制。在本說明書中的任何語言均不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本發明所必需。 [0418]在整個說明書中，在組成物和套組被描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或者在過程和方法被描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，設想了另外存在基本上由所列舉的組分組成或由所列舉的組分組成的本發明的組成物和套組，以及存在基本上由所列舉的處理步驟組成或由所列舉的處理步驟組成的根據本發明的過程和方法。 [0419]一般情況下，除非另外說明，否則指定百分比的組成物是按重量計的。進一步地，如果變數沒有伴隨定義，則以所述變數的先前定義為准。   免疫球蛋白單可變結構域 [0420]在一些實施例中，如本文所述的LNP的免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體。 [0421]與「單可變結構域」可互換使用的術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISV）定義了其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如，單株抗體）或其片段（如Fab、Fab'、F(ab') 2、scFv、di-scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用以形成抗原結合位點。通常，在常規的免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）相互作用形成抗原結合位點。在這種情況下，V H和V L二者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。鑒於以上定義，常規4鏈抗體（如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本領域已知）或者衍生自這種常規4鏈抗體的Fab、F(ab') 2片段、Fv片段（如雙硫鍵連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（全部本領域已知）的抗原結合結構域通常將不被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，與抗原相應表位的結合通常不會透過一個（單個）免疫球蛋白結構域發生，而是透過一對共同結合至相應抗原的表位上的（締合）免疫球蛋白結構域（如輕鏈和重鏈可變結構域）發生，即透過免疫球蛋白結構域的V H-V L對發生。 [0422]相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下與抗原表位特異性地結合。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點由單個V H、單個V HH或單個V L結構域形成。因此，免疫球蛋白單可變結構域的抗原結合位點由不超過三個CDR形成。 [0423]因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V L序列）或其合適的片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V H序列或V HH序列）或其合適的片段；只要它能夠形成單個抗原結合單元（即，基本上由單可變結構域組成的功能性抗原結合單元，使得單個抗原結合結構域不需要與另一個可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。 [0424]免疫球蛋白單可變結構域（ISV）可以例如是重鏈ISV，如V H、V HH，包括駝類化V H或人源化V HH。在一個實施例中，它是V HH，包括駝類化V H或人源化V HH。重鏈ISV可以衍生自常規的四鏈抗體或重鏈抗體。 [0425]例如，所述免疫球蛋白單可變結構域可以是（單）結構域抗體（或適合用作單結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）或Nanobody® ISV（如本文所定義，並且包括但不限於V HH）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適的片段。 [0426]特別地，所述免疫球蛋白單可變結構域可以是Nanobody® ISV（如V HH，包括人源化V HH或駝類化V H）或其合適的片段。[注意：Nanobody®是Ablynx N.V.的註冊商標]。 [0427]「V HH結構域」（也稱為V HH、V HH抗體片段和V HH抗體）最初已經被描述為「重鏈抗體」的（即，「沒有輕鏈的抗體」的；Hamers-Casterman等人，1993 Nature 363: 446-448）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。已選擇術語「V HH結構域」以將這些可變結構域與常規4鏈抗體中存在的重鏈可變結構域（其在本文中稱為「V H結構域」）以及與常規4鏈抗體中存在的輕鏈可變結構域（其在本文中稱為「V L結構域」）區分開來。關於V HH的進一步描述，參考Muyldermans 2001的評論文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302）。 [0428]對於術語「dAb's」和「結構域抗體」，例如參考Ward等人，1989（Nature 341: 544），Holt等人，2003（Trends Biotechnol. 21: 484）；以及例如WO 2004/068820、WO 2006/030220、WO 2006/003388和Domantis有限公司的其他公開的專利申請。還應當注意的是，儘管在本發明的上下文中不太優選，因為它們不是哺乳動物起源的，但單可變結構域可以衍生自某些鯊魚物種（例如，所謂的「IgNAR結構域」，參見例如WO 2005/18629）。 [0429]通常，免疫球蛋白的生成涉及對實驗動物的免疫、免疫球蛋白產生細胞的融合以產生雜交瘤、以及篩選所需的特異性。可替代地，可以透過篩選初始的、免疫的或合成的文庫，例如透過噬菌體展示來產生免疫球蛋白。 [0430]免疫球蛋白序列（如VHH）的產生已在各種出版物中廣泛描述，包括WO 1994/04678、Hamers-Casterman等人，1993（Nature 363: 446-448）以及Muyldermans等人，2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）。在這些方法中，用靶抗原免疫駱駝科動物以誘導針對所述靶抗原的免疫反應。進一步篩選從所述免疫獲得的VHH庫的結合靶抗原的VHH。 [0431]在這些情況下，抗體的生成需要純化的抗原用於免疫和/或篩選。可以從天然來源或在重組產生過程中純化抗原。免疫球蛋白序列的免疫和/或篩選可以使用此類抗原的肽片段進行。 [0432]在本文中可以使用不同起源的免疫球蛋白序列，包含小鼠、大鼠、兔、驢、人類和駱駝科動物免疫球蛋白序列。此外，完全人類的、人源化的或嵌合的序列可以用於本文所述的方法中。例如，本文可以使用駱駝科免疫球蛋白序列和人源化駱駝科免疫球蛋白序列或駱源化結構域抗體（例如，駱駝化dAb），如Ward等人 1989（Nature 341: 544）、WO 1994/04678以及Davis和Riechmann（1994, Febs Lett., 339:285-290；以及1996, Prot. Eng., 9:531-537）所述。此外，將ISV融合，形成多價和/或多特異性構築體（關於含有一個或多個V HH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，還參考Conrath等人，2001（J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350）以及例如WO 1996/34103和WO 1999/23221）。 [0433]「人源化V HH」包含與天然存在的V HH結構域的胺基酸序列對應但是已經被「人源化」的胺基酸序列，即透過將所述天然存在的V HH序列（並且特別是架構序列）的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基用來自人類的常規4鏈抗體（例如，上文所示）的V H結構域中的一個或多個相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基替代而人源化。這可以以本身已知的方式進行，這對於具有通常知識者來說應是清楚的，例如基於現有技術（例如WO 2008/020079）。此外，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類人源化V HH，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。 [0434]「駝類化V H」包含對應於天然存在的V H結構域的胺基酸序列但已經被「駝類化」（即通過用在（駱駝科動物）重鏈抗體的V HH結構域中的一個或多個相應位置處出現的一個或多個胺基酸殘基替換來自常規4鏈抗體的天然存在的V H結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基）的胺基酸序列。這可以以本身已知的方式進行，這對於具有通常知識者來說應是清楚的，例如基於現有技術的描述（例如，Davies和Riechman 1994, FEBS 339: 285；1995, Biotechnol. 13: 475；1996, Prot. Eng. 9: 531；以及Riechman 1999, J. Immunol. Methods 231: 25）。如本文所定義，此類「駝類化」取代插入在形成和/或存在於V H-V L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科動物標誌殘基處（參見例如WO 1994/04678以及Davies和Riechmann（1994和1996, 同上））。在一個實施例中，用作產生或設計駝類化V H的起始材料或起點的V H序列是來自哺乳動物的V H序列，如人類的V H序列，如V H3序列。然而應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類駝類化V H，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的V H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。 [0435]免疫球蛋白單可變結構域序列的結構可以被認為由四個架構區（「FR」）構成，其在本領域和本文中分別被稱為「架構區1」（「FR1」）；「架構區2」（「FR2」）；「架構區3」（「FR3」）；和「架構區4」（「FR4」）；所述架構區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在本領域和本文中分別被稱為「互補決定區1」（「CDR1」）；「互補決定區2」（「CDR2」）；和「互補決定區3」（「CDR3」）。 [0436]在這種免疫球蛋白序列中，所述架構序列可以是任何合適的架構序列，並且例如基於標準手冊以及本文中提及的另外的披露內容和現有技術，合適的架構序列的例子對具有通常知識者將是清楚的。 [0437]架構序列是免疫球蛋白架構序列或已經（例如，透過人源化或駝類化）衍生自免疫球蛋白架構序列的架構序列（的合適組合）。例如，所述架構序列可以是源自輕鏈可變結構域（例如V L序列）和/或重鏈可變結構域（例如V H序列或V HH序列）的架構序列。在一個特定態樣，架構序列是已經衍生自V HH序列的架構序列（其中所述架構序列可以任選地已經被部分或完全人源化）或者是已經駝類化的常規V H序列（如本文所定義）。 [0438]特別地，在本文所述的ISV序列中存在的架構序列可以含有一個或多個標誌殘基（如本文所定義），使得ISV序列是Nanobody® ISV，例如像V HH，包括人源化V HH或駝類化V H。此類架構序列（的合適組合）的非限制性例子將從本文的進一步公開中變得清楚。 [0439]V H結構域和V HH結構域中的胺基酸殘基總數通常在110至120，常常在112與115之間的範圍內。然而應注意，較小和較長的序列也可能適合於本文中描述的目的。 [0440]然而，應當注意的是，關於ISV序列（或用於表現它的核苷酸序列）的起源，以及關於產生或獲得（或者已經產生或獲得）ISV序列或核苷酸序列的方式，本文所述的ISV不受限。因此，所述ISV序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或合成或半合成序列。在一個特定但非限制性的態樣，ISV序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於「人源化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，特別是部分或完全人源化的V HH序列）、「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（特別是駱駝化V H序列）、以及已經透過諸如以下等技術獲得的ISV：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合衍生自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引子的PCR組裝、和具有通常知識者熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或任何前述的任何合適的組合。 [0441]類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成序列，並且可以例如是透過PCR從合適的天然存在的模板（例如，從細胞分離的DNA或RNA）分離的序列、已經從文庫（並且特別是表現文庫）分離的核苷酸序列、已經透過將突變引入天然存在的核苷酸序列中而製備（使用本身已知的任何合適技術，如錯配PCR）的核苷酸序列、已經使用重疊引子透過PCR製備的核苷酸序列或已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。 [0442]通常，Nanobody® ISV（特別是V HH序列，包括（部分）人源化V HH序列和駝類化V H序列）的特徵可以是在一個或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一個或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常，Nanobody® ISV可以被定義為具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一個或多個是如本文進一步所定義的。 [0443]特別地，Nanobody® ISV可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述架構序列是如本文進一步所定義的。 [0444]更特別地，Nanobody® ISV可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中：根據Kabat編號的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的一個或多個胺基酸殘基選自下 表 A中提及的標誌殘基。 表 A：Nanobody® ISV中的標誌殘基
位置 人類 V H3 標誌殘基
11 L、V；主要是L L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I；優選L
37 V、I、F；通常是V F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P，優選F (1)或Y
44 (8) G E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I； 優選G (2)、E (3)或Q (3)；最優選G (2)或Q (3)。
45 (8) L L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V；優選L (2)或R (3)
47 (8) W、Y F (1)、L (1)或W (2)、G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D；優選W (2)、L (1)或F (1)
83 R或K；通常是R R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H；優選K或R；最優選K
84 A、T、D；主要是A P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E；優選P
103 W W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C；優選W
104 G G、A、S、T、D、P、N、E、C、L；優選G
108 L、M或T；主要是L Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H；優選Q或L (7)
注釋： 特別但非排他地，與位置43-46處的KERE（SEQ ID NO: 103）或KQRE（SEQ ID NO: 104）組合。 通常為在位置44-47處的GLEW（SEQ ID NO: 105）。 通常為在位置43-46處的KERE（SEQ ID NO: 103）或KQRE（SEQ ID NO: 104），例如在位置43-47處的KEREL（SEQ ID NO: 106）、KEREF（SEQ ID NO: 107）、KQREL（SEQ ID NO: 108）、KQREF（SEQ ID NO: 109）、KEREG（SEQ ID NO: 110）、KQREW（SEQ ID NO: 111）或KQREG（SEQ ID NO: 112）。可替代地，諸如TERE（SEQ ID NO: 113）（例如TEREL（SEQ ID NO: 114））、TQRE（SEQ ID NO: 115）（例如TQREL（SEQ ID NO: 116））、KECE（SEQ ID NO: 117）（例如KECEL（SEQ ID NO: 118）或KECER（SEQ ID NO: 119））、KQCE（SEQ ID NO: 120）（例如KQCEL（SEQ ID NO: 121））、RERE（SEQ ID NO: 122）（例如REREG（SEQ ID NO: 123））、RQRE（SEQ ID NO: 124）（例如RQREL（SEQ ID NO: 125）、RQREF（SEQ ID NO: 126）或RQREW（SEQ ID NO: 127））、QERE（SEQ ID NO: 128）（例如QEREG（SEQ ID NO: 129））、QQRE（SEQ ID NO: 130）,（例如QQREW（SEQ ID NO: 131）、QQREL（SEQ ID NO: 132）或QQREF（SEQ ID NO: 133））、KGRE（SEQ ID NO: 134）（例如KGREG（SEQ ID NO: 135））、KDRE（SEQ ID NO: 136）（例如KDREV（SEQ ID NO: 137））等序列也是可能的。一些其他可能但不太優選的序列包括例如DECKL（SEQ ID NO: 138）和NVCEL（SEQ ID NO: 139）。 在位置44-47處具有GLEW（SEQ ID NO: 105）並且在位置43-46處具有KERE（SEQ ID NO: 103）或KQRE（SEQ ID NO: 104）。 常常為天然存在的V HH結構域的位置83-84處的KP或EP。 特別但非排他地，與位置44-47處的GLEW（SEQ ID NO: 105）組合。 前提是當位置44-47是GLEW（SEQ ID NO: 105）時，（非人源化）V HH序列中的位置108總是Q，所述序列還含有103處的W。 GLEW組還含有在位置44-47處的GLEW樣序列，例如像GVEW（SEQ ID NO: 140）、EPEW（SEQ ID NO: 141）、GLER（SEQ ID NO: 142）、DQEW（SEQ ID NO: 143）、DLEW（SEQ ID NO: 144）、GIEW（SEQ ID NO: 145）、ELEW（SEQ ID NO: 146）、GPEW（SEQ ID NO: 147）、EWLP（SEQ ID NO: 148）、GPER（SEQ ID NO: 149）、GLER（SEQ ID NO: 142）和ELEW（SEQ ID NO: 146）。
[0445]在一個實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域在架構區中具有有效地防止或減少所謂的「預先存在的抗體」與所述多肽的結合的某些胺基酸取代。已經在WO 2015/173325中描述了這樣的ISV，其中 (i) 在位置112處的胺基酸殘基是K或Q之一；和/或 (ii) 在位置89處的胺基酸殘基是T；和/或 (iii) 在位置89處的胺基酸殘基是L並且在位置110處的胺基酸殘基是K或Q之一；並且 (iv) 在 (i) 至 (iii) 中的每一種情況下，在位置11處的胺基酸優選地是V。   多肽 [0446]所述免疫球蛋白單可變結構域可以形成蛋白質或多肽的一部分，所述蛋白質或多肽可以包含一個或多個（至少一個）免疫球蛋白單可變結構域或基本上由其組成，並且可以任選地進一步包含一個或多個其他胺基酸序列（全部任選地經由一個或多個合適的連接子連接）。術語「免疫球蛋白單可變結構域」也可以涵蓋此類多肽。所述一個或多個免疫球蛋白單可變結構域可以用作這種蛋白質或多肽中的結合單元，所述蛋白質或多肽可以任選地含有可用作結合單元的一個或多個其他胺基酸，以便分別提供本發明的單價、多價或多特異性多肽（關於含有一個或多個VHH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，還參考Conrath等人，2001（J. Biol. Chem. 276: 7346）以及例如WO 1996/34103、WO 1999/23221和WO 2010/115998）。 [0447]所述多肽可以包含一個免疫球蛋白單可變結構域或基本上由其組成，如上所概述。此類多肽在本文中也被稱為單價多肽。 [0448]術語「多價」指示在多肽中存在多個ISV。在一個實施例中，所述多肽是「二價的」，即包含兩個ISV或由其組成。在一個實施例中，所述多肽是「三價的」，即包含三個ISV或由其組成。在另一個實施例中，所述多肽是「四價的」，即包含四個ISVD或由其組成。因此，所述多肽可以是「二價的」、「三價的」、「四價的」、「五價的」、「六價的」、「七價的」、「八價的」、「九價的」等，即所述多肽分別包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個等ISV或由其組成。在一個實施例中，所述多價ISV多肽是三價的。在另一個實施例中，所述多價ISV多肽是四價的。在仍另一個實施例中，所述多價ISV多肽是五價的。 [0449]在一個實施例中，所述多價ISV多肽也可以是多特異性的。術語「多特異性」是指與多種不同的靶分子（也稱為抗原）結合。因此，所述多價ISV多肽可以是「雙特異性的」、「三特異性的」、「四特異性的」等，即可以分別與兩種、三種、四種等不同的靶分子結合。 [0450]例如，所述多肽可以是雙特異性-三價的，如包含三個ISV或由其組成的多肽，其中兩個ISV與第一靶標結合，並且一個ISV與不同於第一靶標的第二靶標結合。在另一個例子中，所述多肽可以是三特異性-四價的，如包含四個ISV或由其組成的多肽，其中一個ISV與第一靶標結合，兩個ISV與不同於第一靶標的第二靶標結合，並且一個ISV與不同於第一和第二靶標的第三靶標結合。在仍另一個例子中，所述多肽可以是三特異性-五價的，如包含五個ISV或由其組成的多肽，其中兩個ISV與第一靶標結合，兩個ISV與不同於第一靶標的第二靶標結合，並且一個ISV與不同於第一和第二靶標的第三靶標結合。 [0451]在一個實施例中，所述多價ISV多肽也可以是多互補位的。術語「多互補位」是指與相同靶分子（也稱為抗原）上的多個不同表位結合。因此，所述多價ISV多肽可以是「雙互補位的」、「三互補位的」等，即可以分別與相同靶分子上的兩個、三個等不同的表位結合。 [0452]在另一個態樣，本發明的包含一個或多個免疫球蛋白單可變結構域（或其合適的片段）或基本上由一個或多個免疫球蛋白單可變結構域（或其合適的片段）組成的多肽可以進一步包含一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元。此類其他基團、殘基、部分、結合單元或胺基酸序列可以向或可以不向所述免疫球蛋白單可變結構域（和/或存在它的多肽）提供其他功能，並且可以改變或可以不改變所述免疫球蛋白單可變結構域的特性。 [0453]例如，此類其他基團、殘基、部分或結合單元可以是一個或多個另外的胺基酸，使得所述化合物、構築體或多肽是（融合）蛋白或（融合）多肽。在一個優選但非限制性的態樣，所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元是免疫球蛋白。甚至更優選地，所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自結構域抗體、適合用作結構域抗體的胺基酸、單結構域抗體、適合用作單結構域抗體的胺基酸、「dAb」、適合用作dAb的胺基酸或奈米抗體。 [0454]可替代地，此類基團、殘基、部分或結合單元可以例如是化學基團、殘基、部分，其本身可以具有或可以不具有生物學和/或藥理學活性。例如，但不限於，此類基團可以與所述一個或多個免疫球蛋白單可變結構域連接，以便提供所述免疫球蛋白單可變結構域的「衍生物」。 [0455]在另一個實施例中，所述其他殘基可以有效地防止或減少所謂的「預先存在的抗體」與所述多肽的結合。為此目的，所述多肽和構築體可以含有C末端延伸(X)n（SEQ ID NO: 150）（其中n是1至10，優選1至5，如1、2、3、4或5（優選1或2，如1）；並且每個X是獨立地選自，優選獨立地選自丙胺酸（A）、甘胺酸（G）、纈胺酸（V）、白胺酸（L）或異白胺酸（I）的（優選天然存在的）胺基酸殘基，關於其，參考WO 2012/175741）。因此，所述多肽可以進一步包含C末端延伸(X)n（SEQ ID NO: 151），其中n是1至5，如1、2、3、4或5，並且其中X是天然存在的胺基酸，優選不是半胱胺酸。 [0456]在上述多肽中，所述一個或多個免疫球蛋白單可變結構域和所述一個或多個基團、殘基、部分或結合單元可以彼此直接連接和/或經由一個或多個合適的連接子或間隔子連接。例如，當所述一個或多個基團、殘基、部分或結合單元是胺基酸時，所述連接子也可以是胺基酸，使得所得的多肽是融合蛋白或融合多肽。 [0457]如本文所用，術語「連接子」表示將兩個或更多個ISV融合在一起形成單一分子的肽。使用連接子連接兩個或更多個（多）肽是本領域熟知的。表B中示出了另外的示例性肽連接子。一類常用的肽連接子稱為「Gly-Ser」或「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序的一個或多個重複，所述肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 154）基序（例如，具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n（SEQ ID NO: 152），其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此類GS連接子的一些常用的例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 157）、15GS連接子（n = 3）和35GS連接子（n = 7）。例如，參考Chen等人，2013（Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369）和Klein等人 2014（Protein Eng. Des. Sel. 27 (10): 325-330）。 表 B：連接子序列（「ID」是指如本文所用的SEQ ID NO）
名稱 ID 胺基酸序列
3A連接子 153 AAA
5GS連接子 154 GGGGS
7GS連接子 155 SGGSGGS
8GS連接子 156 GGGGSGGS
9GS連接子 157 GGGGSGGGS
10GS連接子 158 GGGGSGGGGS
15GS連接子 159 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS連接子 160 GGGGSGGGGSGGGGSGGS
20GS連接子 161 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS連接子 162 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS連接子 163 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS連接子 164 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS連接子 165 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1鉸鏈 166 EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1鉸鏈 167 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
美洲駝上部長鉸鏈區 168 EPKTPKPQPAAA
G3鉸鏈 169 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
[0458]在一個態樣，本公開文本還涉及可以結合至和/或針對CD8並且包含通常如本文進一步所定義的CDR序列的此類胺基酸序列和/或奈米抗體；其合適的片段；以及包含一個或多個此類奈米抗體和/或合適片段或基本上由其組成的多肽。在一些態樣，本公開文本涉及具有SEQ ID NO: 77的奈米抗體。特別地，在一些特定態樣，本公開文本提供了： I) 針對CD8並且與SEQ ID NO: 77具有至少80%、優選至少85%（如90%或95%或更高）序列同一性的胺基酸序列； II) 交叉阻斷SEQ ID NO: 77的胺基酸序列與CD8的結合和/或至少與SEQ ID NO: 77的胺基酸序列競爭結合CD8的胺基酸序列。 [0459]此類胺基酸序列可以如本文進一步所述（並且可以例如是奈米抗體）；以及本公開文本的包含一個或多個此類胺基酸序列（其可以如本文進一步所述）的多肽，特別是如本文所述的雙特異性（或多特異性）多肽，和編碼此類胺基酸序列和多肽的核酸序列。此類胺基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配體。 [0460]在一些實施例中，CD8衍生自哺乳動物，如人類。在一個特定但非限制性的態樣，本公開文本涉及針對CD8的胺基酸序列，其包含： a) SEQ ID NO: 77的胺基酸序列； b) 與SEQ ID NO: 77具有至少80%胺基酸同一性的胺基酸序列，或 c) 與SEQ ID NO: 77具有3、2或1個胺基酸差異的胺基酸序列； 或其任何合適的組合。 [0461]在一些實施例中，公開了針對CD8的奈米抗體，其由4個架構區（分別為FR1至FR4）和3個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）組成。在一些實施例中，在這種奈米抗體中： (I) CDR1包含以下胺基酸序列或基本上由其組成：GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）的胺基酸序列， 或與GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或更高序列同一性的胺基酸序列，其中 (1) 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 (2) 與GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入； 和/或選自與GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）具有2個或僅1個胺基酸差異的胺基酸序列，其中 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 與GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入。 (II) CDR2包含以下胺基酸序列或基本上由其組成：IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）的胺基酸序列， 或與IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或更高序列同一性的胺基酸序列，其中 (1) 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 (2) 與IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入； 和/或選自與IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）具有2個或僅1個胺基酸差異的胺基酸序列，其中 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 與IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入。 (III) CDR3包含以下胺基酸序列或基本上由其組成：AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）的胺基酸序列， 或與AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或更高序列同一性的胺基酸序列，其中 (1) 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 (2) 與AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入； 和/或選自與AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）具有2個或僅1個胺基酸差異的胺基酸序列，其中 任何胺基酸取代均是保守胺基酸取代；和/或 與AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102）相比，所述胺基酸序列僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入。 如本文所公開的CD8奈米抗體可以包含上面明確列出的CDR中的一個、兩個或全部三個。在一些實施例中，CD8奈米抗體包含： CDR1：GSTFSDYG（SEQ ID NO: 100），基於IMGT名稱； CDR2：IDWNGEHT（SEQ ID NO: 101），基於IMGT名稱；以及 CDR3：AADALPYTVRKYNY（SEQ ID NO: 102），基於IMGT名稱。 [0462]在本公開文本的包含上面提及的CDR的組合的奈米抗體中，每個CDR可以被選自與所提及的CDR具有至少80%、優選至少90%、更優選至少95%、甚至更優選至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR替換；其中 (1) 任何胺基酸取代均優選地是保守胺基酸取代；和/或 (2) 與上面一個或多個胺基酸序列相比，所述胺基酸序列優選地僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入； 和/或選自與所提及的一個或多個CDR 以上胺基酸序列之一具有3個、2個或僅1個（如前一段中所指示）「胺基酸差異」的胺基酸序列，其中： (1) 任何胺基酸取代均優選地是保守胺基酸取代；和/或 (2) 與上面一個或多個胺基酸序列相比，所述胺基酸序列優選地僅含有胺基酸取代，並不含胺基酸缺失或插入。 [0463]在一個實施例中，CD8奈米抗體是BDSn： 抗 CD8 BDSn Nb 序列（CDR1、CDR2、CDR3加底線，基於IMGT名稱）： EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS GSTFSDYGVGWFRQAPGKGREFVAD IDWNGEHTSYADSVKGRFATSRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC AADALPYTVRKYNYWGQGTQVTVSSGGCGGHHHHHH（SEQ ID NO: 77） [0464]在一些實施例中，本公開文本的CD8奈米抗體以10 -5至10 -12莫耳/升（M）或更小、優選10 -7至10 -12莫耳/升（M）或更小、更優選10 -8至10 -12莫耳/升（M）的解離常數（KD），和/或以至少10 7M -1、優選至少10 8M -1、更優選至少10 9M -1（如至少10 12M -1）的締合常數（KA），特別是以小於500 nM、優選小於200 nM、更優選小於10 nM（如小於500 μM）的KD與CD8結合。本公開文本的奈米抗體針對vWF的KD和KA值可以以本身已知的方式確定，例如使用本文所述的測定來確定。更一般地，本文所述的奈米抗體優選地具有如本段所述的關於vWF的解離常數。 [0465]通常，應當注意的是，如本文以其最廣泛的意義使用的術語奈米抗體不限於特定的生物來源或特定的製備方法。例如，如下面將更詳細地討論的，奈米抗體可以透過以下方式來獲得：(1) 透過分離天然存在的重鏈抗體的VHH結構域；(2) 透過表現編碼天然存在的VHH結構域的核苷酸序列；(3) 透過「人源化」（如下所述）天然存在的VHH結構域或通過表現編碼這種人源化VHH結構域的核酸；(4) 通透過「駝類化」（如下所述）來自任何動物物種、特別是哺乳動物物種（如來自人類）的天然存在的VH結構域，或透過表現編碼這種駝類化VH結構域的核酸；(5) 透過如Ward等人（同上）所描述的「駝類化」「結構域抗體」或「Dab」，或透過表現編碼這種駝類化VH結構域的核酸；(6) 使用製備蛋白質、多肽或其他胺基酸序列的合成的或半合成的技術；(7) 透過使用核酸合成技術製備編碼奈米抗體的核酸，然後表現由此獲得的核酸；和/或 (8) 通過前述的任何組合。基於本文的公開，用於進行前述的合適方法和技術對於具有通常知識者來說應是清楚的，並且例如包括下文更詳細地描述的方法和技術。 [0466]在一些實施例中，本公開文本的CD8奈米抗體不具有與天然存在的VH結構域的胺基酸序列（如來自哺乳動物、特別是來自人類的天然存在的VH結構域的胺基酸序列）完全相同（即，與其具有100%的序列同一性程度）的胺基酸序列。 [0467]本公開文本的一類CD8奈米抗體包含具有對應於天然存在的VHH結構域的胺基酸序列但已經被「人源化」（即透過用在來自人類的常規4鏈抗體（例如上面所指示）的VH結構域中的一個或多個相應位置處出現的一個或多個胺基酸殘基替換所述天然存在的VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基）的胺基酸序列的奈米抗體。應當注意的是，本公開文本的此類人源化CD8奈米抗體可以以本身已知的任何合適的方式來獲得（即如在上面第 (1)-(8) 點下所指示），因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。 [0468]本公開文本的另一類CD8奈米抗體包含具有對應於天然存在的VH結構域的胺基酸序列的已經被「駝類化」（即透過用在重鏈抗體的VHH結構域中的一個或多個相應位置處出現的一個或多個胺基酸殘基替換來自常規4鏈抗體的天然存在的VH結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基）的胺基酸序列的奈米抗體。這可以以本身已知的方式進行，這對於具有通常知識者來說應是清楚的，例如基於下面的進一步描述。還參考WO 94/04678。這種駝類化可以優先發生在存在於VH-VL介面處的胺基酸位置和所謂的駱駝科動物標誌殘基處（還參見例如WO 94/04678），還如下面所提及。在一些實施例中，用作產生或設計駝類化奈米抗體的起始材料或起點的VH結構域或序列是來自哺乳動物的VH序列，例如人類的VH序列。應當注意的是，本公開文本的此類駝類化奈米抗體可以以本身已知的任何合適的方式來獲得，因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。 [0469]例如，「人源化」和「駝類化」兩者均可以透過以下方式進行：分別提供編碼這種天然存在的VHH結構域或VH結構域的核苷酸序列，然後以本身已知的方式改變所述核苷酸序列中的一個或多個密碼子，使得新的核苷酸序列分別編碼本公開文本的人源化或駱駝化奈米抗體，然後以本身已知的方式表現由此獲得的核苷酸序列，以便提供所需的奈米抗體。可替代地，分別基於天然存在的VHH結構域或VH結構域的胺基酸序列，可以分別設計本公開文本的所需的人源化或駝類化奈米抗體的胺基酸序列，然後使用本身已知的肽合成技術從頭合成。此外，分別基於天然存在的VHH結構域或VH結構域的胺基酸序列或核苷酸序列，可以設計編碼所希望的人源化或駝類化奈米抗體的核苷酸序列，然後使用本身已知的核酸合成技術從頭合成，之後可以以本身已知的方式表現由此獲得的核苷酸序列，以便提供所需的奈米抗體。 [0470]用於獲得奈米抗體和/或編碼其的核苷酸序列和/或核酸的其他合適的方式和技術（從天然存在的VH結構域或優選VHH結構域（的胺基酸序列）和/或從編碼其的核苷酸序列和/或核酸序列開始）對於具有通常知識者來說應是清楚的，並且可以例如包括以合適的方式將來自天然存在的VH結構域（如一個或多個FR和/或CDR）的一個或多個胺基酸序列和/或核苷酸序列與來自天然存在的VHH結構域（如一個或多個FR或CDR）的一個或多個胺基酸序列和/或核苷酸序列組合，以便提供奈米抗體（編碼其的核苷酸序列或核酸）。還提供了化合物和構築體、特別是蛋白質和多肽，其包含本公開文本的至少一個這種胺基酸序列和/或奈米抗體（或其合適的片段）或基本上由其組成，並且任選地進一步包含一個或多個其他基團，殘基、部分或結合單元。在一些實施例中，此類其他基團、殘基、部分、結合單元或胺基酸序列可以向或可以不向所述胺基酸序列和/或奈米抗體（和/或存在它的化合物或構築體）提供其他功能，並且可以改變或可以不改變所述胺基酸序列和/或奈米抗體的特性。 [0471]本公開文本還涵蓋本公開文本中已在一個或多個胺基酸位置處糖基化（這通常取決於用於表現多肽的熱）的任何多肽。多肽可以包含本公開文本的CD8奈米抗體的胺基酸序列，所述胺基酸序列在其胺基末端、其羧基末端或其胺基末端和羧基末端兩者處與至少一個其他胺基酸序列融合。這種其他胺基酸序列可以包含至少一個其他奈米抗體，以便提供包含至少兩個（如三個、四個或五個）奈米抗體的多肽，其中所述奈米抗體可以任選地經由一個或多個連接子序列（如本文所定義）連接。包含本公開文本的CD8奈米抗體和一個或多個另外的奈米抗體的多肽是多價多肽。在多價多肽中，所述兩個或更多個奈米抗體可以相同或不同。例如，多價多肽中的兩個或更多個奈米抗體： •可以針對相同的抗原，即針對所述抗原的相同部分或表位或者針對所述抗原的兩個或更多個不同的部分或表位；和/或 •可以針對不同的抗原； •或其組合。 因此，二價多肽，例如： •可以包含兩個相同的奈米抗體； •可以包含針對抗原的第一部分或表位的第一奈米抗體和針對所述抗原的相同部分或表位或者針對所述抗原的另一個部分或表位的第二奈米抗體； 或者可以包含針對第一抗原的第一奈米抗體和針對不同於所述第一抗原的第二抗原的第二奈米抗體； 而本發明的三價多肽例如： •可以包含針對相同抗原的相同或不同部分或表位的三個相同或不同的奈米抗體； •可以包含針對第一抗原上的相同或不同部分或表位的兩個相同或不同的奈米抗體和針對不同於所述第一抗原的第二抗原的第三奈米抗體；或者 •可以包含針對第一抗原的第一奈米抗體、針對不同於所述第一抗原的第二抗原的第二奈米抗體和針對不同於所述第一和第二抗原的第三抗原的第三奈米抗體。 [0472]如本文所公開的CD8奈米抗體和多肽也可以被引入並在多細胞生物體的一種或多種細胞、組織或器官中表現，例如用於預防和/或治療目的（例如作為基因療法）。為此目的，可以將編碼如本文所公開的CD8奈米抗體或多肽的核苷酸序列以任何合適的方式引入所述細胞或組織中，例如按原樣（例如使用脂質體）或者在已經將它們插入合適的基因治療載體（例如衍生自反轉錄病毒如腺病毒或細小病毒如腺相關病毒）之後。如具有通常知識者也應清楚的，可以透過將本發明的核酸或編碼所述核酸的合適的基因治療載體投予患者或患者的特定細胞或特定組織或器官而在所述患者的身體體內和/或原位進行這種基因療法；或者可以用本發明的核苷酸序列在體外處理合適的細胞（通常取自待治療的患者的身體，如移植的淋巴細胞、骨髓抽吸物或組織活檢物），然後適當地（重新）引入所述患者的身體。所有這些都可以使用具有通常知識者熟知的基因治療載體、技術和遞送系統來進行，參見Culver, K. W., 「Gene Therapy」, 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers，紐約，紐約州)；Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813；Verma, Nature 389 (1994), 239；Isner, Lancet 348 (1996), 370-374；Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Onodera, Blood 91; (1998), 30-36；Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699；Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-292；Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；美國專利號5,580,859；1美國專利號5,589,5466；或Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640。例如，已經在本領域中描述了ScFv片段（Afanasieva等人，Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)）和雙抗體（Blanco等人，J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)）的原位表現。 [0473]因此，還提供了編碼如本文所述的CD8奈米抗體的核酸序列以及包含所述核酸序列的表現構築體和宿主細胞。 [0474]還公開了使用本公開文本的CD8奈米抗體和多肽的方法。 [0475]在一些實施例中，包含CD8奈米抗體的多肽可以用於本公開文本的脂質奈米顆粒中以將核酸遞送至免疫細胞，如本文所述。在一些實施例中，本公開文本的CD8奈米抗體和多肽可以用於治療有需要的受試者的病症或疾病。在一些實施例中，此類病症或疾病包括但不限於癌症、感染、免疫障礙、自體免疫性疾病。 [0476]在一些實施例中，包含CD8奈米抗體的多肽可以用於成像劑中。在一些實施例中，成像劑允許檢測人類CD8，其是在T細胞子集表面上發現的用於免疫系統診斷成像的特異性生物標記。CD8的成像允許在體內檢測T細胞定位。T細胞定位的變化可以反映免疫反應的進展，並且可能由於各種治療性治療或甚至疾病狀態而隨著時間的推移發生。在一些實施例中，它用於成像T細胞定位以進行免疫治療。 [0477]另外，CD8在啟動下游信號傳導途徑中起作用，所述途徑對於啟動發揮清除病毒病原體和提供針對腫瘤的免疫的功能的溶細胞性T細胞很重要。CD8陽性T細胞可以識別抗原呈遞細胞的MHCI蛋白內呈遞的短肽。在一些實施例中，包含CD8奈米抗體的多肽可以增強通過T細胞受體的信號傳導，並且增強受試者清除病毒病原體和對腫瘤抗原做出反應的能力。因此，在一些實施例中，本文提供的抗原結合構築體可以是促效劑，並且可以啟動CD8靶標。 II. 可電離陽離子脂質 [0478]本文提供了可電離陽離子脂質，其可以用於產生脂質奈米顆粒組成物以促進將放置在其中的有效載荷（例如，核酸，如DNA或RNA，如mRNA）遞送至細胞，例如哺乳動物細胞，例如免疫細胞。所述可電離陽離子脂質已經被設計成能夠將核酸（例如，mRNA）細胞內地遞送至靶細胞類型的胞質區室並快速降解成無毒組分。所述可電離陽離子脂質的複雜功能是通過可電離脂質頭基、疏水「醯基尾」基團和連接所述頭基和所述醯基尾基團的連接子的化學與幾何形狀之間的相互作用來促進的。通常，所述可電離胺頭基的pK a被設計成在6-8的範圍內，如在6.2-7.4之間或在6.7-7.2之間，使得它在酸性調配條件（例如，pH 4 - pH 5.5）下保持是強陽離子的，在生理pH（7.4）下保持是中性或弱陰離子的，並且在早期和晚期內體區室（例如，pH 5.5 - pH 7）中保持是陽離子的。所述醯基尾基團在所述脂質奈米顆粒與內體膜的融合和通過結構擾動進行的膜失穩中起關鍵作用。所述醯基尾的三維結構（由其長度、不飽和度和位點決定）以及所述頭基和尾基的相對大小被認為在促進膜融合中起作用，因此在脂質奈米顆粒內體逃逸（核酸有效載荷的胞質遞送的關鍵要求）中起作用。連接所述頭基和醯基尾基團的連接子被設計成通過生理上普遍存在的酶（例如，酯酶或蛋白酶）或通過酸催化的水解來降解。 [0479]在一個態樣，本發明提供了一種由式(I)表示的化合物： (I)， 或其鹽，其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或C 1-6烷基。 [0480]在一個態樣，本發明提供了一種由式(I-A)表示的化合物： (I-A)， 或其鹽，其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H、未取代的C 1-6烷基或被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。 [0481]本文提供的任何變數或取代基未被取代或被一個或多個取代基取代。在一些實施例中，本文提供的任何變數或取代基是任選地經取代的。在一些實施例中，本文提供的任何變數或取代基任選地被一個或多個獨立地選自以下的取代基取代：-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13和-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。 [0482]在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或亞甲基。在一些實施例中，R 1和R 2各自是亞甲基並且R 3是鍵。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自是亞甲基。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3是未取代的。 [0483]在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵，各自是-CH 2-，各自是-(CH 2) 2-，各自是-(CH 2) 3-，各自是-(CH 2) 4-，各自是-(CH 2) 5-，各自是-(CH 2) 6-，各自是-(CH 2) 7-，或各自是-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵，各自是-(CH 2) 2-，各自是-(CH 2) 4-，各自是-(CH 2) 6-，各自是-(CH 2) 7-，或各自是-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A是未取代的。 [0484]在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A和R 3A各自是未取代的。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自是未取代的。在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A和R 3A各自是未取代的。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自是未取代的。 [0485]在一些實施例中，R 3B1是未取代的。在一些實施例中，R 3B1不被側氧基取代。 [0486]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 。在一些實施例中，R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。 [0487]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是C 1-15烷基；R 1A2和R 2A2各自是C 1-15烷基；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。在一些實施例中，R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵。 [0488]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)；R 2A1和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。在一些實施例中，R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵。 [0489]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是-C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；R 1A2和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。在一些實施例中，R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵。 [0490]在一些實施例中，R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。 [0491]在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、丙基、丁基、戊基、己基或庚基。在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、 、 、 或 。在一些實施例中，R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A是鍵。 [0492]在一些實施例中，R 3A1是C 1-15烷基；並且R 3A2和R 3A3各自是H。在一些實施例中，R 3A1是 。在一些實施例中，R 3A2和R 3A3各自是H。在一些實施例中，R 3A是鍵。 [0493]在一些實施例中，R 3A1是-C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)；並且R 3A2和R 3A3各自是H。在一些實施例中，R 3A1是 或 。在一些實施例中，R 3A1是 。在一些實施例中，R 3A是乙烯或-(CH 2) 2-。在一些實施例中，R 3A2和R 3A3各自是H。 [0494]在一些實施例中，R 3A1是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1是 或 ；並且R 3A2是 。在一些實施例中，R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A是鍵。 [0495]在一些實施例中，R 3A1是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1是 ；並且R 3A2是 或 。在一些實施例中，R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A是鍵。 [0496]在一些實施例中，R 3A1、R 3A2和R 3A3各自是H。 [0497]R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是-(CH 2) 0-15CH 3或-CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是 、 、 、 、 、 、 、 或 ，其各自是任選地經取代的。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是未取代的或取代的。在一些實施例中，R a1和R a2是未取代的。 [0498]在一些實施例中，R 3B是 。在一些實施例中，R 3B是H。在一些實施例中，R 3B是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 3B是未取代的。 [0499]在一些實施例中，R 3B1是C 1-6伸烷基。在一些實施例中，R 3B1是伸乙基或伸丙基。在一些實施例中，R 3B1是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 3B1是任選地經取代的。 [0500]在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是任選地經取代的。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自以下的取代基取代的C 1-6烷基：-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13和-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H、甲基、乙基、丙基、丁基或戊基，其各自任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自是甲基或各自是乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。 [0501]在一些實施例中， 是 、 、 、 或 ，其各自是任選地經取代的。 [0502]在一個態樣，本發明提供了一種由式(Ia)表示的化合物： (Ia)， 或其鹽，其中R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R 3B1、R 3B2和R 3B3如針對式(I)或其任何變體或實施例所定義的。 [0503]在一個態樣，本發明提供了一種由式(Ib)表示的化合物： (Ib)， 或其鹽，其中R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3如針對式(I)或其任何變體或實施例所定義的。 III. 脂質 - 免疫細胞靶向基團接合物 [0504]如本文所討論的，可以將所述LNP靶向至特定細胞類型，例如免疫細胞，例如T細胞、B細胞或自然殺手（NK）細胞。這可以透過使用本文所述的一種或多種脂質來實現。此外，靶向可以通過在LNP顆粒的溶劑可及表面上包括靶向基團來增強。例如，靶向基團可以包括特異性結合對（例如，抗體-抗原對、配體-受體對等）的成員。在某些實施例中，所述靶向基團是抗體。靶向可以例如透過使用本文所述的脂質-免疫細胞靶向基團接合物來實施。 [0505]任選地，所述靶向部分是沒有Fc組分的抗體片段。以前用LNP靶向循環免疫細胞的嘗試已經採用了全抗體（WO 2016/189532 Al）。具有偶聯的全抗體的脂質體或脂質基顆粒由於Fc的接合而從循環中更快地清除，從而降低了它們到達目的靶細胞的潛能（Harding等人 (1997) Biochim Biophys. Acta 1327, 181-192；Sapra等人 (2004) Clin Cancer Res 10, 1100-1111；Aragnol等人, (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83, 2699-2703）。像靶向EGFR（Mamot等人, (2005) Cancer Res 65, 11631-11638）、ErbB2（Park等人 (2002) Clin Cancer Res 8, 1172-1181）或EphA2（Kamoun等人, 2019 Nat. Biomed. Eng 3, 264-280）的那些脂質體一樣，用抗體片段靶向的脂質體保持其長循環特性。另外，可以使用膠束插入工藝製備脂質基載劑，所述膠束插入工藝允許在完成其單獨製造後幾乎定量地摻入抗體接合物（Nellis等人 (2005) Biotechnol Prog 21, 221-232），與偶聯全IgG時的極低效插入（Ishida等人 (1999) FEBS Lett. 460, 129-133）或需要直接在完整LNP上完成偶聯（WO 2016/189532 Al）相比。scFv、Fab或VHH片段也可以直接與活化的PEG-脂質偶聯，以製成可插入的接合物。 [0506]在一些實施例中，PEG-(脂質)等同於(脂質)-PEG。 [0507]在某些實施例中，靶向基團可以是表面結合抗體或其表面結合抗原結合片段，其可以允許調節細胞靶向特異性。這特別有用，因為可以針對所需的靶向位點的目的表位產生高度特異性的抗體。在一個實施例中，可以將多種不同的抗體摻入並呈遞在LNP的表面，其中每種抗體與相同抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位結合。此類方法可以增加與特定靶細胞的靶向相互作用的親合力和特異性。 [0508]可以基於給定靶細胞的所需定位、功能或結構特徵來選擇靶向基團或靶向基團組合。例如，為了靶向T細胞、T細胞群或T細胞亞群，可以選擇靶向T細胞（如經由T細胞表面抗原）的一種或多種抗體或其抗原結合片段或抗原結合衍生物。示例性T細胞表面抗原包括但不限於例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD28、CD39、CD69、CD103、CD137、CD45、T細胞受體（TCR）β、TCR-α、TCR-α/β,TCR-γ/δ、PD1、CTLA4、TIM3、LAG3、CD18、IL-2受體、CD11a、GL7、TLR2、TLR4、TLR5和IL-15受體。為了靶向NK細胞或NK細胞群，可以選擇靶向NK細胞（如經由NK細胞表面抗原）的一種或多種抗體、其抗原結合片段或抗原結合衍生物。示例性NK細胞表面抗原包括但不限於CD48、CD56、CD85a、CD85c、CD85d、CD85e、CD85f、CD85i、CD85j、CD158b2、CD161、CD244、CD16a、CD16b、IL-2受體、CD27、CD28、CD48、CD69、CD70、CD86、CD112、CD122、CD155、CD161、CD244、CD266、CD314/NKG2D、CD336/NKP44、CD337/NKP30。為了靶向B細胞或B細胞群，可以選擇靶向B細胞（如經由B細胞抗原）的一種或多種抗體、其抗原結合片段或抗原結合衍生物。示例性B細胞抗原包括但不限於CD19（對於除漿細胞外的所有B細胞），CD19、CD25和CD30（對於啟動的B細胞），CD27、CD38、CD78、CD138和CD319（對於漿細胞），CD20、CD27、CD40、CD80和PDL-2（對於記憶細胞），Notch2、CD1、CD21和CD27（對於邊緣區B細胞），CD21、CD22和CD23（對於濾泡性B細胞），以及CD1、CD5、CD21、CD24和TLR4（對於調節性B細胞）。 [0509]在某些實施例中，靶向可以例如透過使用本文所述的脂質-免疫細胞靶向基團接合物來實施。示例性脂質-免疫細胞靶向基團接合物可以包括式(II)的化合物， [脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團，例如，T細胞靶向分子，例如抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD7抗體或抗CD8抗體] (式II)。 [0510]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團是多肽，並且所述脂質與所述多肽的N末端、C末端或中間部分的任何位置偶聯。 [0511]在某些實施例中，所述靶向基團或靶向分子是與選自以下的T細胞抗原結合的T細胞靶向劑（例如，抗體）：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD28、CD137、CD45、T細胞受體（TCR）β、TCR-α、TCR-α/β,TCR-γ/δ、PD1、CTLA4、TIM3、LAG3、CD18、IL-2受體、CD11a、TLR2、TLR4、TLR5、IL-7受體或IL-15受體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD2，並且所述靶向基團可以是例如抗CD2抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD3，並且所述靶向基團可以是例如抗CD3抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD4，並且所述靶向基團可以是例如抗CD4抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD5，並且所述靶向基團可以是例如抗CD5抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD7，並且所述靶向基團可以是例如抗CD7抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是CD8，並且所述靶向基團可以是例如抗CD8抗體。在某些實施例中，所述T細胞抗原可以是TCR β，並且所述靶向基團可以是例如抗TCR β抗體。在一些實施例中，所述抗體是人類或人源化抗體。 [0512]示例性CD2結合劑可以是選自以下的抗體：9.6（https://academic.oup.com/intimm/article/10/12/1863/744536）、9-1（https://academic.oup.com/intimm/article/10/12/1863/744536）、TS2/18.1.1（ATCC HB-195）、Lo-CD2b（ATCC PTA-802）、Lo-CD2a/BTI-322（美國專利6849258B1）、西普珠單抗（Sipilzumab）/MEDI-507（美國專利6849258B1/en）、35.1（ATCC HB-222）、OKT11（ATCC CRL-8027）、RPA-2.1（PCT公開案WO 2020023559A1）、AF1856（R&D Systems）、MAB18562（R&D Systems）、MAB18561（R&D Systems）、MAB1856（R&D Systems）、PAB30359（Abnova Corporation）、10299-1（Abnova Corporation）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）：AF1856（R&D Systems）、MAB18562（R&D Systems）、MAB18561（R&D Systems）、MAB1856（R&D Systems）、PAB30359（Abnova Corporation）和10299-1（Abnova Corporation）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：AF1856（R&D Systems）、MAB18562（R&D Systems）、MAB18561（R&D Systems）、MAB1856（R&D Systems）、PAB30359（Abnova Corporation）和10299-1（Abnova Corporation），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人， (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0513]示例性CD2結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：9.6、9-1、TS2/18.1.1、Lo-CD2b、Lo-CD2a、BTI-322、西普珠單抗、35.1、OKT11、RPA-2.1、SQB-3.21、LT2、TS1/8、UT329、4F22、OX-34、UQ2/42、MU3、U7.4、NFN-76或MOM-181-4-F(E)。 [0514]示例性CD3結合劑（CD3γ/δ/ε、CD3γ、CD3δ、CD3γ/ε、CD3δ/ε或CD3ε）可以是選自以下的抗體：MEM-57（CD3γ/δ/ε，EnzoLife Sciences）、MAB100（CD3ε，R&D Systems）、CD3-H5（CD3ε，Abnova Corporation）、CD3-12（CD3ε，Cell Signaling Technology）、LE-CD3（CD3ε，Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、NBP1-31250（CD3γ，Novus Biologicals）、16669-1-AP（CD3δ，Invitrogen）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：MEM-57（CD3γ/δ/ε，EnzoLife Sciences）、MAB100（CD3ε，R&D Systems）、CD3-H5（CD3ε，Abnova Corporation）、CD3-12（CD3ε，Cell Signaling Technology）、LE-CD3（CD3ε，Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、NBP1-31250（CD3γ，Novus Biologicals）和16669-1-AP（CD3δ，Invitrogen）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：MEM-57（CD3γ/δ/ε，EnzoLife Sciences）、MAB100（CD3ε，R&D Systems）、CD3-H5（CD3ε，Abnova Corporation）、CD3-12（CD3ε，Cell Signaling Technology）、LE-CD3（CD3ε，Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、NBP1-31250（CD3γ，Novus Biologicals）和16669-1-AP（CD3δ，Invitrogen），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0515]示例性CD3結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：hsp34、OKT-3、UCHT1、38.1、HIT3a、RFT8、SK7、BC3、SP34-2、HU291、TRX4、卡妥索單抗（Catumaxomab）、替利珠單抗（teplizumab）、3-106、3-114、3-148、3-190、3-271、3-550、4-10、4-48、H2C、F12Q、I2C、SP7、3F3A1、CD3-12、301、RIV9、JB38-29、JE17-74、GT0013、4E2、7A4、4D10A6、SPV-T3b、M2AB、ICO-90、30A1或Hu38E4.v1（美國專利申請20200299409A1）、REGN5458（美國專利申請20200024356A1）、博納吐單抗（https://go.drugbank.com/drugs/DB09052/polypeptide_sequences.fasta）。在一些實施例中，所述接合物包含Fab，其中所述Fab包含 (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段。 [0516]示例性CD4結合劑可以是選自以下的抗體：伊巴珠單抗（https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?D09575）、AF1856（R&D Systems）、MAB554（R&D Systems）、BF0174（Affinity Biosciences）、PAB31115（Abnova Corporation）、CAL4（Abcam）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：AF1856（R&D Systems）、MAB554（R&D Systems）、BF0174（Affinity Biosciences）、PAB31115（Abnova Corporation）和CAL4（Abcam）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：AF1856（R&D Systems）、MAB554（R&D Systems）、BF0174（Affinity Biosciences）、PAB31115（Abnova Corporation）和CAL4（Abcam），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0517]示例性CD4結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：伊巴珠單抗、OKT4、RPA-T4、S3.5、SK3、N1UG0、RIV6、OTI18E3、MEM-241、B486A1、RFT-4g、7E14、MDX.2、MEM-115、MEM-16、ICO-86、Edu-2或伊巴珠單抗（ilbalizumab）。 [0518]示例性CD5結合劑可以是選自以下的抗體：He3、MAB1636（R&D Systems）、AF1636（R&D Systems）、MAB115（R&D Systems）、C5/473 + CD5/54/F6（Abcam）、CD5/54/F6（Abcam）、65152（Proteintech）及其抗原結合片段。在一些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：MAB1636（R&D Systems）、AF1636（R&D Systems）、MAB115（R&D Systems）、C5/473 + CD5/54/F6（Abcam）、CD5/54/F6（Abcam）和65152（Proteintech）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的VH和VL序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：MAB1636（R&D Systems）、AF1636（R&D Systems）、MAB115（R&D Systems）、C5/473 + CD5/54/F6（Abcam）、CD5/54/F6（Abcam）和65152（Proteintech），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0519]示例性CD5結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：佐莫單抗（zolimomab）、5D7、L17F12、和UCHT2、1D8、3I21、4H10、8J23、5O4、4H2、5G2、8G8、6M4、2E3、4E24、4F10、7J9、7P9、8E24、6L18、7H7、1E7、8J21、7I11、8M9、1P21、2H11、3M22、5M6、5H8、7I19、1A2、8E15、8C10、3P16、4F3、5M24、5O24、7B16、1E8、2H16、BLa1、1804、DK23、Cris1、MEM-32、H65、4C7、OX-19、Leu-1、53-7.3、4H8E6、T101、EP2952、D-9、H-3、HK231、N-20、Y2/178、H-300、CD5/54/F6、Q-20、CC17、MOM-18539-S(P)或MOM-18885-S(P)。 [0520]示例性CD7結合劑可以是選自以下的抗體所組成的群組：MAB7579（R&D Systems）、AF7579（R&D Systems）、EPR22065（Abcam）、1G10D8（Proteintech）、NBP2-32097（Novus Biologicals）、NBP2-38440（Novus Biologicals）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：MAB7579（R&D Systems）、AF7579（R&D Systems）、EPR22065（Abcam）、1G10D8（Proteintech）、NBP2-32097（Novus Biologicals）和NBP2-38440（Novus Biologicals）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：MAB7579（R&D Systems）、AF7579（R&D Systems）、EPR22065（Abcam）、1G10D8（Proteintech）、NBP2-32097（Novus Biologicals）和NBP2-38440（Novus Biologicals），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0521]示例性CD7結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：TH-69、3Afl1、T3-3A1、124-1D1、3A1f、CD7-6B7或VHH6。 [0522]示例性CD8（CD8α、CD8α/α、CD8α/β或CD8β）結合劑可以是選自以下的抗體：2.43（Invitrogen）、Du CD8-1（CD8α，Invitrogen）、9358-CD（CD8α/β，R&D Systems）、MAB116（CD8α，R&D Systems）、ab4055（CD8α，Abcam）、C8/144B（CD8α，Novus Biologicals）、YTS105.18（CD8α，Novus Biologicals）、TRX2（https://patents.justia.com/patent/20170198045）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：2.43（Invitrogen）、51.1（ATCC HB-230）、Du CD8-1（CD8α，Invitrogen）、9358-CD（CD8α/β，R&D Systems）、MAB116（CD8α，R&D Systems）、ab4055（CD8α，Abcam）、C8/144B（CD8α，Novus Biologicals）和YTS105.18（CD8α，Novus Biologicals）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：2.43（Invitrogen）、Du CD8-1（CD8α，Invitrogen）、9358-CD（CD8α/β，R&D Systems）、MAB116（CD8α，R&D Systems）、ab4055（CD8α，Abcam）、C8/144B（CD8α，Novus Biologicals）和YTS105.18（CD8α，Novus Biologicals），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0523]示例性CD8結合劑還可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：OKT-8、51.1、S6F1、TRX2、和UCHT4、SP16、3B5、C8-144B、HIT8a、RAVB3、LT8、17D8、MEM-31、MEM-87、RIV11、DK-25、YTC141.1HL或YTC182.20。在一些實施例中，所述接合物包含Fab，其中所述Fab包含含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。 [0524]示例性CD137結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：4B4-1、P566或烏瑞魯單抗（Urelumab）。示例性CD28結合劑可以選自採用殖株TAB08的CDR的抗體或抗體片段。示例性CD45結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：BC8、9.4、4B2、Tu116或GAP8.3。示例性CD18結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：1B4、TS1/18、MEM-48、YFC118-3、TA-4、MEM-148或R3-3, 24。示例性CD11a結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：MHM24或依法珠單抗（Efalizumab）。示例性IL-2受體結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：YTH 906.9HL、IL2R.1、BC96、B-B10、216、MEM-181、ITYV、MEM-140、ICO-105、達克珠單抗（Daclizumab），或者選自IL2或IL2片段。示例性IL-15R結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：JM7A4或OTI3D5，或者選自IL15或IL15片段。示例性TLR2結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：JM22-41、TL2.1、11G7或TLR2.45。示例性TLR4結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：HTA125或76B357-1。示例性TLR5結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：85B152-5或9D759-2。示例性GL7結合劑可以選自採用殖株GL7的CDR的抗體或抗體片段。 [0525]示例性PD1結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：MIH4、J116、J150、OTIB11、OTI17B10、OTI3A1或OTI16D4。另外，示例性抗PD-1抗體描述於例如美國專利號8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性抗PD-1抗體包括例如納武單抗（nivolumab）（Opdivo®，Bristol-Myers Squibb Co.）、派姆單抗（pembrolizumab）（Keytruda®，Merck Sharp & Dohme Corp.）、PDR001（Novartis Pharmaceuticals）和匹地利珠單抗（pidilizumab）（CT-011，Cure Tech）。示例性抗PD-L1抗體描述於例如美國專利號9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性抗PD-L1抗體包括例如阿特珠單抗（atezolizumab）（Tecentriq®，Genentech）、德瓦魯單抗（durvalumab）（AstraZeneca）、MEDI4736、阿維魯單抗（avelumab）和BMS 936559（Bristol Myers Squibb Co.）。 [0526]示例性CTLA-4結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：ER4.7G.11 [7G11]、OTI9G4、OTI9F3、OTI3A5、A3.4H2.H12、14D3、OTI3A12、OTI1A11、OTI1E8、OTI3B11、OTI3D2、OTI10C8、OTI2E9、OTI6F1、OTI7D3、OTI85B、OTI12C6。示例性抗CTLA-4抗體描述於美國專利號6,984,720、6,682,736、7,311,910、7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984；國際（PCT）公開號WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424；以及歐洲專利號EP 1212422 B1中。示例性CTLA-4抗體包括伊匹單抗（ipilimumab）或曲美木單抗（tremelimumab）。 [0527]示例性TCR β結合劑可以是選自以下的抗體：H57-597（Invitrogen）、8A3（Novus Biologicals）、R73（TCRα/β，Abcam）、E6Z3S（TRBC1/TCRβ，Cell Signaling Technology）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H結構域和V L結構域：H57-597（Invitrogen）、8A3（Novus Biologicals）、R73（TCRα/β，Abcam）和E6Z3S（TRBC1/TCRβ，Cell Signaling Technology）。在某些實施例中，所述結合劑包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：H57-597（Invitrogen）、8A3（Novus Biologicals）、R73（TCRα/β，Abcam）和E6Z3S（TRBC1/TCRβ，Cell Signaling Technology），所述CDR由Kabat（參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見，MacCallum R M等人，(1996) J. MOL. BIOL. 262: 732-745）或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。 [0528]示例性CD137結合劑可以選自採用以下殖株的CDR的抗體或抗體片段：4B4-1、P566或烏瑞魯單抗（Urelumab）。 [0529]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含選自以下的抗體所組成的群組：Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv和scFv片段。在一些實施例中，所述抗體是人類或人源化抗體。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含Fab或免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含不含有天然鏈間雙硫鍵的Fab。例如，在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和/或含有C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含含有一個或多個非天然鏈間雙硫鍵的Fab。在一些實施例中，所述鏈間雙硫鍵位於分別在所述輕鏈片段和所述重鏈片段上的兩個非天然半胱胺酸殘基之間。例如，在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有F174C取代的重鏈片段和/或含有S176C取代的輕鏈片段。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述Fab包含含有F174C和C233S取代的重鏈片段和/或含有S176C和C214S取代的輕鏈片段。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含C末端半胱胺酸殘基。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。在一些實施例中，所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。例如，在一些實施例中，所述Fab包含在所述Fab的C末端與所述C末端半胱胺酸之間的衍生自抗體鉸鏈區（例如，部分鉸鏈序列）的兩個或更多個胺基酸。在一些實施例中，所述Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的輕鏈可變結構域，其中所述CH1結構域和所述輕鏈恆定結構域透過一個或多個鏈間雙硫鍵連接，並且其中所述免疫細胞靶向基團進一步包含透過胺基酸連接子與所述輕鏈恆定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，如圖47所示，所述Fab抗體是DS Fab、NoDS Fab、bDS Fab、bDS Fab-ScFv。 [0530]在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體（例如，V HH）。在一些實施例中，所述奈米抗體在C末端包含半胱胺酸。在一些實施例中，所述奈米抗體進一步包含間隔子，其包含在所述V HH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述間隔子包含一個或多個甘胺酸殘基，例如兩個甘胺酸殘基。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。在一些實施例中，所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述胺基酸連接子包含一個或多個甘胺酸和/或絲胺酸殘基（例如，序列GGGGS的一個或多個重複）。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵（例如，鏈間雙硫鍵）連接。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。在一些實施例中，根據Kabat編號，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。在一些實施例中，如圖31所示，所述抗體是ScFv、V HH、2xV HH、V HH-CH1/空Vk或V HH1-CH1/V HH-2-Nb bDS。 [0531]示例性靶向部分可以具有如下所闡述的胺基酸序列： 抗 CD3 hSP34-Fab 序列：hSP34重鏈（HC）序列（SEQ ID NO: 1）： EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC hSP34-mlam輕鏈（LC）序列（小鼠λ）（SEQ ID NO: 2）： QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADSS SP34-hlam LC（人類λ）（SEQ ID NO: 3）： QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAESS 抗 CD3 Hu291-Fab 序列：Hu291 HC（SEQ ID NO: 4）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC Hu291 LC（SEQ ID NO: 5）： MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD8 TRX2-Fab 序列：TRX2 HC（SEQ ID NO: 6）： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDFGMNWVRQAPGKGLEWVALIYYDGSNKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHYDGYYHFFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC TRX2 LC（SEQ ID NO: 7）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKGSQDINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNTDILHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCYQYNNGYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD8 OKT8-Fab 序列：OKT8 HC（SEQ ID NO: 8）： QVQLVQSGAEDKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGYGYYVFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC OKT8 LC（SEQ ID NO: 9）： DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQEKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD4 伊巴珠單抗 -Fab 序列：伊巴珠單抗HC（SEQ ID NO: 10）： QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC 伊巴珠單抗LC（SEQ ID NO: 11）： DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD5 He3-Fab 序列：He3 HC（SEQ ID NO: 12）： EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC He3 LC（SEQ ID NO: 13）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD7 TH-69-Fab 序列：TH-69 HC（SEQ ID NO: 14）： EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC TH-69 LC（SEQ ID NO: 15）： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 抗 CD2 TS2/18.1-Fab 序列：TS2/18.1 HC（SEQ ID NO: 16）： EVQLVESGGGLVMPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISGGGFTYYPDTVKGRFTLSRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQGANWELVYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC TS2/18.1 LC（SEQ ID NO: 17）： DIVMTQSPATLSVTPGDRVFLSCRASQSISDFLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYFCQNGHNFPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD2 9.6-Fab 序列：9.6 HC（SEQ ID NO: 18）： QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTRYWIHWVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATEDLYYAMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC 9.6 LC（SEQ ID NO: 19）： NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAVYYCHQYLSSHTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD2 9-1-Fab 序列：9-1 HC（SEQ ID NO: 20）： QVQLQQPGTELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWVNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFTDKAISTIDTSSNTAYMQLSTLTSDASAVYYCSRSPRDSSTNLADWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC 9-1 LC（SEQ ID NO: 21）： DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES mutOKT8-Fab 序列：mutOKT8 HC（SEQ ID NO: 22）： QVQLVQSGAEDKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGAGAYVFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC mutOKT8 LC（SEQ ID NO: 23）： DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISAALAWYQEKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES. 抗 CD56 A1 Fab 序列A1 bDS HC（SEQ ID NO: 26）： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSNWIRQSPSGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARENIAAWTWAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH A1 bDS LC（SEQ ID NO: 27）： EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGLAPRLLIYDTSLRATDIPDRFSGSGSGTAFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD56 A2 Fab 序列A2 bDS HC（SEQ ID NO: 28）： EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLSSGYSGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH A2 bDS LC（SEQ ID NO: 29）： DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEGEDVGDYYCMQALQSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD56 A3 Fab 序列A3 bDS HC（SEQ ID NO: 30）： EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLSSGYSGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH A3 bDS LC（SEQ ID NO: 31）： DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGVYYCMQSLQTPWTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD56 洛沃妥珠單抗 ( Lorvotuzumab )Fab 序列洛沃妥珠單抗bDS HC（SEQ ID NO: 32）： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAYISSGSFTIYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARMR KGYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCHHHHHH 洛沃妥珠單抗bDS LC（SEQ ID NO: 33）： DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQIIIHSDGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD2 RPA-2.10v1 Fab 序列RPA-2.10v1 bDS HC（SEQ ID NO: 34）： 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DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGYPYSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGRTRYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNRMKPEDTAMYYCAARFGPMGCVDLSTLSFGHWGQGTQVTVSITGGGCHHHHHHHH 抗 TCR T017000700 Nb 序列（SEQ ID NO: 81） CDR1、CDR2、CDR3加底線，基於IMGT名稱： EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVAS GYVHKINFYGWYRQAPGKEREKVAH ISIGDQTDYADSAKGRFTISRDESKNTVYLQMNSLRPEDTAAYYC RALSRIWPYDYWGQGTLVTVSSGGCGGHHHHHH 抗 CD28 28CD065G01 Nb 序列（SEQ ID NO: 82） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRLHTMEWYRRTPETQREWVATITSGGTTNYPDSVKGRFTISRDDTKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCHAVATEDAGFPPSNYWGQGTLVTVSSGGCGGHHHHHH 抗 CD3 T0170061C09 Nb 序列（SEQ ID NO: 83） EVQLVESGGGPVQAGGSLRLSCAASGRTYRGYSMGWFRQAPGREREFVAAIVWSDGNTYYEDSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMTSLKPEDSATYYCAAKIRPYIFKIAGQYDYWGQGTLVTVSSGGCGGHHHHHH 抗 CD3 12D2 bDS Fab 序列12D2 bDS HC（SEQ ID NO: 84）： EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFYAYWMGWVRQAPGKGLEWIGEIKKDGTTINYTPSLKDRFTISRDNAQNTLYLQMTKLGSEDTALYYCAREERDGYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH 12D2 bDS LC（SEQ ID NO: 85）： QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGIVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAACSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAESS 抗 CD28 8G8A Fab 序列8G8A bDS HC（SEQ ID NO: 86）： EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSLTSEDSALYCARWGDGNYWGRGTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH 8G8A bDS LC（SEQ ID NO: 87）： DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD28 2E12 Fab 序列2E12 bDS HC（SEQ ID NO: 88）： QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYSNFHYYVMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH 2E12 bDS LC（SEQ ID NO: 89）： DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLISAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD28 CD28.9.3 Fab 序列CD28.9.3 bDS HC（SEQ ID NO: 90）： QVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH CD28.9.3 bDS LC（SEQ ID NO: 91）： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVEYYVTSLMQWY QQKPGQPPKL LIFAASNVES GVPARFSGSG SGTNFSLNIHPVDEDDVAMY FCQQSRKVPY TFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD28 HzTN228 Fab 序列HzTN228 bDS HC（SEQ ID NO: 92）： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGFSLTSYGVHWIRQPGKGLEWLGVIWPGTNFNSALMSRLTISEDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYCARDRAYGNYLYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH HzTN228 bDS LC（SEQ ID NO: 93）： DIQMTQSPSLSASVGDRVTITCRASESVEYVTSLMQWYQKPGKAPKLLIYAASNVDSGVPSRFSGSGTDFTLTISLQPEDIATYCQSRKVPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD28 TGN2122.C Fab 序列TGN2122.C bDS HC（SEQ ID NO: 94）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYSGSSDYNQKFKSRATLTVDNSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH TGN2122.C bDS LC（SEQ ID NO: 95）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQRKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDYTLTISSLQPEDFATYFCQNILGTWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD28 TGN2122.H Fab 序列TGN2122.H bDS HC（SEQ ID NO: 96）： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNIYYMSWVRQAPGKGLELVAAINPDGGNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGGPGFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH TGN2122.H bDS LC（SEQ ID NO: 97）： ENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLWIYDTSKLASGIPARFSGSGSRNDYTLTISSLEPEDFAVYYCFPGSGFPFMYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗 CD8 TRX2 ScFv 序列（SEQ ID NO: 98）： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDFGMNWVRQAPGKGLEWVALIYYDGSNKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHYDGYYHFFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKGSQDINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNTDILHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCYQYNNGYTFGQGTKVEIKGGGSGGCGGHHHHHH V1 VHH-CH1 bDS HC（SEQ ID NO: 99）： DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGYPYSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGRTRYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNRMKPEDTAMYYCAARFGPMGCVDLSTLSFGHWGQGTQVTVSITASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH [0532]在一些實施例中，所述靶向部分包含如本文所公開的多肽序列。在一些實施例中，所述靶向部分包含如本文所公開的多肽序列的所有六個CDR。在一些實施例中，所述靶向部分包含如本文所公開的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的CDR1、CDR2和CDR3。在其他實施例中，所述靶向部分結合如本文所公開的多肽序列所結合的、所述靶向分子上的相同表位。在其他實施例中，所述靶向部分與如本文所公開的多肽序列競爭以結合所述靶向分子上的相同表位。 [0533]在某些實施例中，所述靶向基團或免疫細胞靶向基團（例如，T細胞靶向劑、B細胞靶向劑或NK細胞靶向劑）可以經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與脂質共價連接。 [0534]在其他實施例中，用於產生接合物的脂質可以選自二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）： ， 二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）： ， 二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）： ， 二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）： ， 二肉豆蔻醯-甘油（DMG）： ， 二硬脂醯甘油（DSG）： ，和 N-棕櫚醯-鞘胺醇（C16-神經醯胺） 。 [0535]所述免疫細胞靶向基團可以直接或經由連接子（例如，含有聚乙二醇（PEG）的連接子）與脂質共價連接。在某些實施例中，所述PEG是PEG 1000、PEG 2000、PEG 3400、PEG 3000、PEG 3450、PEG 4000或PEG 5000。在某些實施例中，所述PEG是PEG 2000。 [0536]在一些實施例中，所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.001至0.5莫耳百分比、0.001至0.3莫耳百分比、0.002至0.2莫耳百分比、0.01至0.1莫耳百分比、0.1至0.3莫耳百分比或0.1至0.2莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 [0537]在某些實施例中，所述脂質-免疫細胞靶向劑接合物包含DSPE、PEG組分和靶向抗體。在某些實施例中，所述抗體是T細胞靶向劑，例如抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體或抗TCR β抗體。 [0538]示例性脂質-免疫細胞靶向基團接合物包含DSPE和PEG 2000，例如如Nellis等人 (2005) BIOTECHNOL. PROG. 21, 205-220中所述。示例性接合物包含式(III)的結構，其中scFv代表與目的靶標結合的工程化抗體結合位點。在某些實施例中，所述工程化抗體結合位點與上文所述的任何靶標結合。在某些實施例中，所述工程化抗體結合位點可以是例如工程化抗CD3抗體或工程化抗CD8抗體。在某些實施例中，所述工程化抗體結合位點可以是例如工程化抗CD2抗體或工程化抗CD7抗體。 [0539]式(III)的化合物的例子如下所示： (III)。 設想了式(III)中的scFv可以被完整抗體或其抗原片段（例如，Fab）替換。 [0540]式(IV)的化合物的另一個例子如下所示： (IV)， 其產生描述於Nellis等人(2005) 同上，或美國專利號7,022,336中。設想了式(IV)中的Fab可以被完整抗體或其抗原片段（例如，(Fab') 2片段）或工程化抗體結合位點（例如，scFv）替換。 [0541]其他脂質-免疫細胞靶向基團接合物描述於例如美國專利號7,022,336中，其中所述靶向基團可以被目的靶向基團（例如，結合如上文所述的T細胞或NK細胞表面抗原的靶向基團）替換。 [0542]在某些實施例中，式(II)的示例性接合物的脂質組分可以是本文所述的任何脂質。在一些實施例中，式(II)的接合物的脂質組分可以基於本文所述的可電離陽離子脂質，例如式(I)、式(Ia)、式(Ib)的可電離陽離子脂質或其鹽。例如，示例性可電離陽離子脂質可以選自表1或其鹽。 [0543]在某些實施例中，基於本公開文本的脂質的接合物可以包括： ，其中scFv代表結合上文所述的靶標（例如，CD2、CD3、CD7或CD8）的工程化抗體結合位點。 在某些實施例中，所述脂質摻合物可以進一步包含游離PEG-脂質，以便減少經由所述靶向基團的非特異性結合量。所述游離PEG-脂質可以與所述接合物中包括的PEG-脂質相同或不同。在某些實施例中，所述游離PEG-脂質選自PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、N-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE-PEG）、1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DMG）、1,2-二棕櫚醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DPG）、1,2-二油醯-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇（DOG-PEG）、1,2-二硬脂醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）、DSPE-PEG-半胱胺酸或其衍生物，全部具有在2000至5000之間，為2000、3400或5000的平均PEG長度。最終組成物可以含有兩種或更多種這些聚乙二醇化脂質的混合物。在某些實施例中，所述LNP組成物包含具有肉豆蔻醯基和硬脂酸醯基鏈的PEG-脂質的混合物。在某些實施例中，所述LNP組成物包含具有棕櫚醯基和硬脂醯基鏈的PEG-脂質的混合物。 [0544]在某些實施例中，所述PEG-脂質的衍生物在PEG末端具有甲氧基、羥基或羧酸端基。 [0545]可以將所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物摻入如下所述的LNP中，例如摻入含有例如可電離陽離子脂質、固醇、中性磷脂和PEG-脂質的LNP中。設想了在某些實施例中，含有所述脂質-免疫細胞靶向基團的LNP可以含有本文所述的可電離陽離子脂質，或者描述於例如美國專利號10,221,127、10,653,780或美國公開申請號US2018/0085474、US2016/0317676、國際公開號WO2009/086558、或Miao等人 (2019) NATURE BIOTECH 37:1174-1185或Jayaraman等人 (2012) ANGEW CHEM INT. 51: 8529-8533中的陽離子脂質。 [0546]在一些實施例中，所述陽離子脂質可以選自表1中所示的可電離陽離子脂質或其鹽。 表1.脂質結構
（脂質1）  
（脂質2）  
（脂質3）  
（脂質4）  
（脂質5）  
（脂質5A）  
（脂質6）  
（脂質7）  
（脂質8）  
（脂質9）  
（脂質10）  
（脂質10A）  
（脂質11）  
（脂質11A）
（脂質12）  
（脂質13）  
（脂質14）  
（脂質14A）  
（脂質15）  
（脂質16）  
（脂質17）  
（脂質17A）  
（脂質18）  
（脂質18A）  
（脂質19）  
（脂質19A）  
（脂質20）  
（脂質20A）  
（脂質21）  
（脂質21A）  
（脂質22）  
（脂質23）  
（脂質23A）  
（脂質24）  
（脂質24A）  
（脂質25）  
（脂質25A）  
（脂質26）  
（脂質27）  
（脂質28）  
（脂質29）  
（脂質30）  
（脂質31）  
（脂質32）  
（脂質33）  
（脂質34）  
（脂質35）  
（脂質36）  
（脂質37）  
（脂質38）  
（脂質37A）  
（脂質38A）  
[0547]本文提供的R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3，R 3A1、R 3A2、R 3A3、R a1、R a2、R 3B、R 3B1、R 3B2、R 3B3、R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14或R s15的任何變體或實施例可以與R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R a1、R a2、R 3B、R 3B1、R 3B2、R 3B3、R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14或R s15的每一個其他變體或實施例組合，如同每個組合已經被單獨且具體描述一樣。 [0548]可以使用在下面的以下部分中所述的方法和其他組分調配所述LNP。 IV. 脂質奈米顆粒組成物 [0549]本發明提供了包含脂質摻合物的脂質奈米顆粒（LNP）組成物，所述脂質摻合物含有本文所述的可電離陽離子脂質和/或本文所述的脂質-免疫細胞靶向劑接合物。在某些實施例中，所述脂質摻合物可以包含本文所述的可電離陽離子脂質以及固醇、中性磷脂、PEG-脂質和脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的一種或多種。 [0550]在某些實施例中，本文所述的可電離陽離子脂質可以以30至70莫耳百分比、30至60莫耳百分比、30至50莫耳百分比、40至70莫耳百分比、40至60莫耳百分比、40至50莫耳百分比、50至70莫耳百分比、50至60莫耳百分比的範圍，或者約30莫耳百分比、約35莫耳百分比、約40莫耳百分比、約45莫耳百分比、約50莫耳百分比、約55莫耳百分比、約60莫耳百分比、約65莫耳百分比或約70莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。 固醇 [0551]在某些實施例中，所述脂質奈米顆粒的脂質摻合物可以包含固醇組分，例如選自以下群組的一種或多種固醇：膽固醇、岩藻固醇、β-穀固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、豆甾烷醇、菜籽固醇。在某些實施例中，所述固醇是膽固醇。 [0552]所述固醇（例如，膽固醇）可以以20至70莫耳百分比、20至60莫耳百分比、20至50莫耳百分比、30至70莫耳百分比、30至60莫耳百分比、30至50莫耳百分比、40至70莫耳百分比、40至60莫耳百分比、40至50莫耳百分比、50至70莫耳百分比、50至60莫耳百分比的範圍，或者約20莫耳百分比、約25莫耳百分比、約30莫耳百分比、約35莫耳百分比、約40莫耳百分比、約45莫耳百分比、約50莫耳百分比、約55莫耳百分比、約60莫耳百分比或約65莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。 中性磷脂 [0553]在某些實施例中，所述脂質奈米顆粒的脂質摻合物可以包含一種或多種中性磷脂。所述中性磷脂可以選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）所組成的群組。 [0554]其他中性磷脂可以選自二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（DOPE）、二亞油醯-甘油-磷酸膽鹼（DLPC）、二肉豆蔻醯-甘油-磷酸膽鹼（DMPC）、二油醯-甘油-磷酸膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯-甘油-磷酸膽鹼（DPPC）、二十一烷醯-甘油-磷酸膽鹼（DUPC）、棕櫚醯-油醯-甘油-磷酸膽鹼（POPC）、二十八烯基-甘油-磷酸膽鹼、油醯-膽固醇基半琥珀醯-甘油-磷酸膽鹼、十六基-甘油-磷酸膽鹼、二亞麻醯-甘油-磷酸膽鹼、二花生四烯醯-甘油-3-磷酸膽鹼、二二十二碳六烯醯-甘油-磷酸膽鹼或鞘磷脂所組成的群組。 [0555]所述中性磷脂可以以1至10莫耳百分比、1至15莫耳百分比、1至12莫耳百分比、1至10莫耳百分比、3至15莫耳百分比、3至12莫耳百分比、3至10莫耳百分比、4至15莫耳百分比、4至12莫耳百分比、4至10莫耳百分比、4至8莫耳百分比、5至15莫耳百分比、5至12莫耳百分比、5至10莫耳百分比、6至15莫耳百分比、6至12莫耳百分比、6至10莫耳百分比的範圍，或者約1莫耳百分比、約2莫耳百分比、約3莫耳百分比、約4莫耳百分比、約5莫耳百分比、約6莫耳百分比、約7莫耳百分比、約8莫耳百分比、約9莫耳百分比、約10莫耳百分比、約11莫耳百分比、約12莫耳百分比、約13莫耳百分比、約14莫耳百分比或約15莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。 PEG- 脂質 [0556]所述脂質奈米顆粒的脂質摻合物可以包括一種或多種PEG或PEG修飾的脂質。此類種類可以可替代地稱為聚乙二醇化脂質。PEG脂質是用聚乙二醇修飾的脂質。如上面所指出的，當脂質-免疫細胞靶向基團被包括在所述脂質摻合物中時，游離PEG-脂質可以被包括在所述脂質摻合物中，以減少或消除經由靶向基團的非特異性結合。 [0557]PEG脂質可以選自由以下組成的非限制性群組：PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質。 [0558]在某些實施例中，所述摻合物可以含有游離PEG-脂質，其可以選自PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）和PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯膽鹼，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈所組成的群組。 [0559]所述PEG-脂質可以以1至10莫耳百分比、1至8莫耳百分比、1至7莫耳百分比、1至6莫耳百分比、1至5莫耳百分比、1至4莫耳百分比、1至3莫耳百分比、2至8莫耳百分比、2至7莫耳百分比、2至6莫耳百分比、2至5莫耳百分比、2至4莫耳百分比、2至3莫耳百分比的範圍，或者約1莫耳百分比、約2莫耳百分比、約3莫耳百分比、約4莫耳百分比或約5莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0560]在一些實施例中，所述PEG-脂質可以以0.01至10莫耳百分比、0.01至5莫耳百分比、0.01至4莫耳百分比、0.01至3莫耳百分比、0.01至2莫耳百分比、0.01至1莫耳百分比、0.1至10莫耳百分比、0.1至5莫耳百分比、0.1至4莫耳百分比、0.1至3莫耳百分比、0.1至2莫耳百分比、0.1至1莫耳百分比、0.5至10莫耳百分比、0.5至5莫耳百分比、0.5至4莫耳百分比、0.5至3莫耳百分比、0.5至2莫耳百分比、0.5至1莫耳百分比、1至2莫耳百分比、3至4莫耳百分比、4至5莫耳百分比、5至6莫耳百分比或1.25至1.75莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。在一些實施例中，所述PET-脂質可以是所述脂質摻合物的約0.5莫耳百分比、約1莫耳百分比、約1.5莫耳百分比、約2莫耳百分比、約2.5莫耳百分比、約3莫耳百分比、約3.5莫耳百分比、約4莫耳百分比、約4.5莫耳百分比、約5莫耳百分比或約5.5莫耳百分比。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0561]在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C14（如在PEG-DMG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C16（如在DPG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C18（如在PEG-DSG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的骨架或頭基是二醯基甘油或磷酸乙醇胺。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0562]本公開文本的LNP可以包含未與免疫細胞靶向基團偶聯的一種或多種游離PEG-脂質以及與免疫細胞靶向基團偶聯的PEG-脂質。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 免疫細胞靶向基團接合物 [0563]在某些實施例中，所述脂質摻合物還可以包括脂質-免疫細胞靶向基團接合物。 [0564]所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物可以以0.001至0.5莫耳百分比、0.001至0.1莫耳百分比、0.01至0.5莫耳百分比、0.05至0.5莫耳百分比、0.1至0.5莫耳百分比、0.1至0.3莫耳百分比、0.1至0.2莫耳百分比、0.2至0.3莫耳百分比的範圍，約0.01莫耳百分比、約0.05莫耳百分比、約0.1莫耳百分比、約0.15莫耳百分比、約0.2莫耳百分比、約0.25莫耳百分比、約0.3莫耳百分比、約0.35莫耳百分比、約0.4莫耳百分比、約0.45莫耳百分比或約0.5莫耳百分比存在於所述脂質摻合物中。 [0565]除了所述脂質摻合物中存在的脂質外，所述LNP組成物可以進一步包含有效載荷，例如下文所述的有效載荷。在某些實施例中，所述有效載荷是核酸，例如DNA或RNA，例如mRNA、轉移RNA（tRNA）、微小RNA或小干擾RNA（siRNA）。 [0566]在某些實施例中，所述核酸中的核苷酸數是從約400至約6000。 脂質奈米 顆粒的產生 [0567]在一些實施例中，透過使用經由軌道渦旋器快速混合或者透過微流體混合來產生所述LNP。透過以下方式完成軌道渦旋器混合：將脂質的乙醇溶液快速添加到目的核酸的水性溶液中，然後立即在2,500 rpm下渦旋。在一些實施例中，使用微流體混合步驟產生所述LNP。在一些實施例中，透過使用例如以優化的混合室幾何形狀為特色的NanoAssemblr裝置和微流體晶片（Precision Nanosystems，不列顛哥倫比亞省溫哥華）在微流體通道中在受控的流速下將水流和有機流混合來實現微流體混合。在一些實施例中，所述LNP使用微流體混合步驟產生，所述微流體混合步驟快速混合乙醇脂質溶液和核酸水溶液，使所述核酸包封在所述固體脂質奈米顆粒中。然後使用選擇的膜過濾裝置將奈米顆粒懸浮液進行緩衝液交換到全水緩衝液中，以進行乙醇去除和奈米顆粒成熟。 在某些實施例中，所得的LNP組成物包含脂質摻合物，其含有例如從約40莫耳百分比至約60莫耳百分比的本文所述的一種或多種可電離陽離子脂質、從約35莫耳百分比至約50莫耳百分比的一種或多種固醇、從約5莫耳百分比至約15莫耳百分比的一種或多種中性脂質以及從約0.5莫耳百分比至約5莫耳百分比的一種或多種PEG-脂質。 脂質奈米 顆粒的物理特性 [0568]LNP組成物的特徵可以取決於脂質奈米顆粒（LNP）組成物中含有的組分、其絕對或相對量。特徵還可以根據所述LNP組成物的製備方法和條件而變化。 [0569]可以透過多種方法來表徵LNP組成物。例如，顯微鏡檢查（例如，穿透式電子顯微鏡檢查或掃描電子顯微鏡檢查）可以用於檢查LNP組成物的形態和大小分佈。動態光散射或電位測定法（例如，電位滴定）可以用於測量ζ電位。動態光散射還可以用於確定粒徑。諸如Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd，英國烏斯特郡瑪律文）等儀器也可以用於測量LNP組成物的多種特徵，如粒徑、多分散性指數和ζ電位。透過依賴於RNA結合染料（用於確定染料可及RNA的比例的ribogreen、cybergreen）的方法和LNP去調配（de-formulation）的組合，然後對總RNA含量進行HPLC分析來確定RNA包封效率。 [0570]在一些實施例中，所述LNP具有在1至250 nm、1至200 nm、1至150 nm、1至100 nm、50至250 nm、50至200 nm、50至150 nm、50至100 nm、75至250 nm、75至200 nm、75至150 nm、75至100 nm、100至250 nm、100至200 nm、100至150 nm範圍內的平均直徑。在某些實施例中，所述LNP組成物可以具有約1 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約110 nm、約120 nm、約130 nm、約140 nm、約150 nm、約160 nm、約170 nm、約180 nm、約190 nm或約200 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。 [0571]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP顯示凍融後的平均直徑變化小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP顯示凍融後的平均直徑變化小於30%。在一些實施例中，使用在MES pH 6.5緩衝液中的10%蔗糖進行凍融和直徑測量。 [0572]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP顯示靶向抗體插入後的平均直徑變化小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP顯示靶向抗體插入後的平均直徑變化小於15%。在一些實施例中，使用37ºC培育持續4小時，在pH 6.5 MES中測量靶向抗體插入後的直徑變化。 [0573]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP具有小於50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 nm的平均LNP直徑。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP具有小於100 nm的平均LNP直徑。 [0574]可替代地或另外，所述LNP組成物可以具有在從0.05至1、0.05至0.75、0.05至0.5、0.05至0.4、0.05至0.3、0.05至0.2、0.08至1、0.08至0.75、0.08至0.5、0.08至0.4、0.08至0.3、0.08至0.2、0.1至1、0.1至0.75、0.1至0.5、0.1至0.4、0.1至0.3、0.1至0.2範圍內的多分散性指數。在某些實施例中，多分散性指數在0.1至0.25、0.1至0.2、0.1至0.19、0.1至0.18、0.1至0.17、0.1至0.16或0.1至0.15的範圍內。 [0575]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP具有小於0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1或0.05的多分散性。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP具有小於0.25的多分散性。 [0576]可替代地或另外，所述LNP組成物可以具有約-30 mV至約+30 mV的ζ電位。在某些實施例中，所述LNP組成物具有約-10 mV至約+20 mV的ζ電位。ζ電位可以隨著pH的變化而變化。因此，在某些實施例中，所述LNP組成物在pH 5.5或pH 5下可以具有約0 mV至約+30 mV或約+10 mV至+30 mV或約20 mV至約+30 mV的ζ電位，和/或在pH 7.4下可以具有約-30 mV至約+5 mV或約-20 mV至約+15 mV的ζ電位。 [0577]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 7.4下具有大於-10、-9、-8、-7、-6、-5.5、-5、-4.5、-4、-3.5、-3、-2.5、-2、-1.5、-1或-0.5 mV的ζ電位。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 7.4下具有大於-10 mV的ζ電位。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 7.4下具有大於-1 mV的ζ電位。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 5.5下具有大於-1、0、1、2、3、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5或25 mV的ζ電位。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 5.5下具有大於5 mV的ζ電位。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP組成物或LNP在pH 5.5下具有大於15 mV的ζ電位。 V. 有效載荷 [0578]所述LNP組成物可以包含用於遞送至細胞（例如，免疫細胞）或組織（例如，受試者的細胞（例如，免疫細胞）或組織）的藥劑，例如核酸分子。 [0579]本發明的LNP組成物可以包括核酸，例如DNA或RNA，如mRNA、tRNA、微小RNA、siRNA、gRNA（指導RNA）、circRNA（環狀RNA）、核酶、誘餌RNA或dicer基質siRNA。設想了核酸可以含有天然存在的組分，如天然存在的鹼基、糖或連接基團（例如，磷酸二酯連接基團）；或者可以含有非天然存在的組分或修飾（例如，硫酯連接基團）。例如，所述核酸可以被合成為含有本領域具有通常知識者已知的鹼基、糖、連接子修飾。此外，所述核酸可以是線性或環狀的，或者具有任何所需的組態。所述LNP組成物可以包括多種核酸分子（例如，多種RNA分子），它們可以相同或不同。 [0580]在某些實施例中，所述有效載荷是mRNA。在某些實施例中，特定LNP組成物可以含有許多mRNA分子，它們可以相同或不同。在某些實施例中，包括一種或多種不同mRNA的一種或多種LNP組成物可以與細胞組合和/或同時接觸。設想了mRNA可以包括莖環、鏈終止核苷、polyA序列、多腺苷酸化信號和/或5'帽結構中的一種或多種。所述mRNA可以編碼用於在例如免疫障礙、炎性障礙或癌症中使用的受體，如嵌合抗原受體（CAR）。另外，所述mRNA可以編碼用於在治療性或預防性疫苗中使用的抗原，例如用於治療或預防病原體（例如，微生物或病毒病原體）感染，或用於減少或改善由這種感染直接或間接引起的副作用。 [0581]在某些實施例中，所述LNP組成物可以包括一種或多種其他組分，包括但不限於一種或多種醫藥上可接受的賦形劑、疏水性小分子、治療劑、碳水化合物、聚合物、滲透性增強分子和表面改變劑。 [0582]在一些實施例中，在所得的LNP組成物中所述脂質組分與所述有效載荷（例如，mRNA）的wt/wt比是從約1：1至約50：1。在某些實施例中，在所得的組成物中所述脂質組分與所述有效載荷（例如，mRNA）的wt/wt比是從約5：1至約50：1。在某些實施例中，wt/wt比是從約5：1至約40：1。在某些實施例中，wt/wt比是從約10：1至約40：1。在某些實施例中，wt/wt比是從約15：1至約25：1。 [0583]在某些實施例中，在所述脂質奈米顆粒中所述有效載荷（例如，mRNA）的包封效率是至少50%。在某些實施例中，包封效率是至少80%、至少90%或大於90%。 [0584]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82.5%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%或99%的包封效率。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現大於87.5%的包封效率。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現小於50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、17.5%、15%、12.5%、10%、7.5%、5%、2.5%或1%的染料可及RNA。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現小於12.5%的染料可及RNA。 [0585]在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的總mRNA回收率。在一些實施例中，使用本文所述的方法製備並表徵的包含本文所述的可電離陽離子脂質的LNP展現大於80%的總mRNA回收率。 RNA 有 效載荷 [0586]在某些實施例中，所述RNA有效載荷是mRNA、tRNA、微小RNA或siRNA有效載荷。 [0587]在某些實施例中，優化所述脂質奈米顆粒組成物用於將RNA（例如，mRNA）遞送至靶細胞以在所述細胞內轉譯。mRNA可以是天然或非天然存在的mRNA。mRNA可以包括一種或多種修飾的核鹼基、核苷或核苷酸。 [0588]所述核鹼基可以選自由以下組成的非限制性組：腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羥基甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、假尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N1-甲基假尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤。在一些實施例中，核鹼基是N1-甲基假尿嘧啶。 [0589]mRNA的核苷是包括糖分子（例如，5碳或6碳糖，如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其去氧衍生物）與核鹼基的組合的化合物。核苷可以是經典核苷（例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、5-甲基尿苷、去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、去氧尿苷和胸苷）或其類似物，並且可以包括一個或多個取代或修飾。 [0590]mRNA的核苷酸是含有核苷和磷酸基團或替代基團（例如，硼酸磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、膦酸酯、烷基、醯胺化物和甘油）的化合物。核苷酸可以是經典核苷酸（例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、5-甲基尿苷、去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、去氧尿苷和胸苷單磷酸）或其類似物，並且可以包括一個或多個取代或修飾，包括但不限於烷基、芳基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基和/或硫代取代；一個或多個稠環或開環；核鹼基、糖和/或磷酸或替代組分的氧化；和/或還原。核苷酸可以包括一個或多個磷酸或替代基團。例如，核苷酸可以包括核苷和三磷酸基團。「核苷三磷酸」（例如，鳥苷三磷酸、腺苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸）可以指代經典核苷三磷酸或其類似物或衍生物，並且可以包括如本文所述的一個或多個取代或修飾。 [0591]mRNA可以包括5'非轉譯區、3'非轉譯區和/或編碼或轉譯序列。mRNA可以包括任何數目的鹼基對，包括數十、數百或數千個鹼基對。任何數目（例如，全部、一些或沒有）的核鹼基、核苷或核苷酸可以是經典種類的取代的、修飾的或以其他方式非天然存在的類似物。在某些實施例中，可以修飾特定核鹼基類型的全部。例如，mRNA中的所有胞嘧啶均可以是5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，一個或多個或所有尿苷鹼基可以是N1-甲基假尿苷。 [0592]在某些實施例中，mRNA可以包括5'帽結構、鏈終止核苷酸、莖環、polyA序列和/或多腺苷酸化信號。 [0593]帽結構或帽種類是包括透過連接子連接的兩個核苷部分的化合物，並且可以選自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽類似物。帽種類可以包括一種或多種修飾的核苷和/或連接子部分。例如，天然mRNA帽可以包括在其5'位處通過三磷酸鍵連接的鳥嘌呤核苷酸和在7位處甲基化的鳥嘌呤（G）核苷酸，例如m7G(5')ppp(5')G，通常寫成m7GpppG。帽種類也可以是抗反向帽類似物。可能的帽種類的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG和m27 02'GppppG。 [0594]可替代地或另外，mRNA可以包括鏈終止核苷。例如，鏈終止核苷可以包括在其糖基的2'和/或3'位處去氧的那些核苷。此類種類可以包括3'-去氧腺苷（蟲草素）、3'-去氧尿苷、3'-去氧胞嘧啶、3'-去氧鳥苷、3'-去氧胸腺嘧啶和2',3'-二去氧核苷，如2',3'-二去氧腺苷、2',3'-二去氧尿苷、2',3'-二去氧胞嘧啶、2',3'-二去氧鳥苷和2',3'-二去氧胸腺嘧啶。 [0595]可替代地或另外，mRNA可以包括莖環，如組蛋白莖環。莖環可以包括1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個核苷酸鹼基對。例如，莖環可以包括4、5、6、7或8個核苷酸鹼基對。莖環可以位於mRNA的任何區域。例如，莖環可以位於非轉譯區（5'非轉譯區或3'非轉譯區）、編碼區或polyA序列或尾中，之前或之後。 [0596]可替代地或另外，mRNA可以包括polyA序列和/或多腺苷酸化信號。polyA序列可以完全或主要由腺嘌呤核苷酸或其類似物或衍生物組成。polyA序列可以是位於mRNA的3'非轉譯區域附近的尾。 [0597]mRNA可以編碼任何目的多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其他方式修飾的多肽。由mRNA編碼的多肽可以具有任何大小，並且可以具有任何二級結構或活性。在一些實施例中，當在細胞中表現時，由mRNA編碼的多肽可以具有治療效果。在一些實施例中，所述mRNA可以編碼抗體、酶、生長因子、激素、細胞介素、病毒蛋白（例如，病毒衣殼蛋白）、抗原、疫苗或受體。在一些實施例中，所述mRNA可以編碼工程化受體（如CAR）或者用於在治療性疫苗（例如，癌症疫苗）或預防性疫苗（例如，用於使微生物或病毒病原體感染的風險或嚴重程度最小化的疫苗）中使用的抗原。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。在一些實施例中，所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 [0598]可以設計脂質組成物用於一種或多種特定的應用或靶標。例如，LNP組成物可以被設計成將mRNA遞送至哺乳動物身體的特定細胞、組織、器官或系統或其群組（如腎系統）。可以改變LNP組成物的物理化學特性，以便增加對受試者內的特定靶位點的選擇性。例如，可以基於不同器官的開窗大小來調整粒徑。LNP組成物中包括的mRNA還可以取決於一種或多種所需的遞送靶標。例如，可以選擇mRNA用於特定適應症、病症、疾病或障礙，和/或用於遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其群組（例如，局部或特異性遞送）。 [0599]脂質組成物中mRNA的量可以取決於所述mRNA的大小、序列和其他特徵。LNP中mRNA的量還可以取決於所述LNP組成物的大小、組成、所需的靶標和其他特徵。mRNA和其他要素（例如，脂質）的相對量也可以變化。可以例如使用吸收光譜法（例如，紫外-可見光譜法）測量LNP組成物中mRNA的量。 [0600]在一些實施例中，可以選擇所述一種或多種mRNA、脂質和聚合物及其量，以提供特定的N：P比（可帶正電荷的脂質或聚合物胺（N = 氮）基團與帶負電荷的核酸磷酸（P）基團的比率）。組成物的N：P比是指一種或多種脂質中的氮原子與mRNA中的磷酸基團數的莫耳比。通常，優選較低的N：P比。N：P比可以取決於特定的脂質及其pKa。在某些實施例中，可以選擇所述mRNA和LNP組成物和/或其相對量，以提供從約1：1至約30：1或從約1：1至約20：1的N：P比。在某些實施例中，N：P比可以是例如1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1或8：1。在某些實施例中，N：P比可以是從約2：1至約5：1。在某些實施例中，N：P比可以是約4：1。在其他實施例中，N：P比是從約4：1至約8：1。例如，N：P比可以是約4：1、約4.5：1、約4.6：1、約4.7：1、約4.8：1、約4.9：1、約5.0：1、約5.1：1、約5.2：1、約5.3：1、約5.4：1、約5.5：1、約5.6：1、約5.7：1、約6.0：1、約6.5：1或約7.0：1。 [0601]奈米顆粒組成物中mRNA的量可以取決於所述mRNA的大小、序列和其他特徵。奈米顆粒組成物中mRNA的量還可以取決於所述奈米顆粒組成物的大小、組成、所需的靶標和其他特徵。mRNA和其他要素（例如，脂質）的相對量也可以變化。在一些實施例中，在奈米顆粒組成物中所述脂質組分與mRNA的wt/wt比可以是從約5：1至約50：1，如5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1和50：1。例如，所述脂質組分與mRNA的wt/wt比可以是從約10：1至約40:1。可以例如使用吸收光譜法（例如，紫外-可見光譜法）測量奈米顆粒組成物中mRNA的量。 [0602]mRNA的包封效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被包封或以其他方式與脂質組成物相關的mRNA的量。包封效率理想地高（例如，接近100%）。可以例如透過比較在用一種或多種有機溶劑或去污劑分解所述LNP組成物之前和之後含有所述脂質組成物的溶液中mRNA的量來測量包封效率。螢光可以用於測量溶液中游離mRNA的量。對於本發明的LNP組成物，mRNA的包封效率可以是至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在某些實施例中，包封效率可以是至少80%。 VI. 調配和遞送方式 [0603]本發明的LNP組成物可以全部或部分調配成醫藥組成物。所述醫藥組成物可以進一步包括一種或多種醫藥上可接受的賦形劑或輔助成分，如本文所述的那些。用於調配和製造醫藥組成物和藥劑的一般指南可在例如Remington's (2006) 同上中獲得。常規賦形劑和輔助成分可以用於本發明的任何醫藥組成物中，除非任何常規賦形劑或輔助成分可能與本發明的LNP組成物的一種或多種組分不相容。如果賦形劑或輔助成分與LNP組成物的組分的組合可能導致任何不希望的生物學作用或在其他方面有害的作用，則它可能與所述組分不相容。 [0604]在一些實施例中，一種或多種賦形劑或輔助成分可以構成包括本發明的LNP組成物的醫藥組成物的總質量或體積的大於50%。例如，所述一種或多種賦形劑或輔助成分可以構成醫藥組成物的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些實施例中，所述賦形劑例如被美國食品和藥物管理局批准用於在人中使用和用於獸醫用途。在某些實施例中，所述賦形劑是醫藥級的。在某些實施例中，賦形劑符合美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）、英國藥典和/或國際藥典的標準。 [0605]醫藥組成物中所述一種或多種脂質或LNP、一種或多種醫藥上可接受的賦形劑和/或任何另外的成分的相對量將根據所治療受試者的身份、體型和/或狀況以及進一步根據投予組成物的途徑而變化。 [0606]可以將脂質組成物和/或包括一種或多種LNP組成物的醫藥組成物投予任何受試者，包括可以受益於由將核酸例如RNA（例如，mRNA、tRNA或siRNA）遞送至一種或多種特定細胞、組織、器官或系統或其群組（如腎系統）提供的治療效果的人類患者。儘管本文提供的關於LNP組成物和包括LNP組成物的醫藥組成物的描述主要針對適用於投予人的組成物，但具有通常知識者應理解，此類組成物通常適用於投予任何其他哺乳動物。理解對適用於投予人的組成物進行修飾，以便使所述組成物適用於投予各種動物。 [0607]根據本公開文本的醫藥組成物可以作為單一單位劑量和/或作為多個單一單位劑量製備、包裝和/或散裝出售。如本文所用，「單位劑量」是離散量的醫藥組成物，其包含預定量的活性成分（例如，有效載荷）。 [0608]本發明的醫藥組成物可以製備成適用於多種投予途徑和方法的多種形式。例如，本發明的醫藥組成物可以製備成液體劑型（例如，乳劑、微乳劑、奈米乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑）、可注射形式、固體劑型（例如，膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑）、用於局部和/或經皮投予的劑型（例如，軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、散劑、溶液劑、噴霧劑、吸入劑和貼劑）、混懸劑、散劑和其他形式。 [0609]用於口服和腸胃外投予的液體劑型包括但不限於醫藥上可接受的乳劑、微乳劑、奈米乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和/或酏劑。除了活性成分外，液體劑型還可以包含本領域中常用的惰性稀釋劑，例如像水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油（特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯、以及其混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組成物還可以包括輔助劑，如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調味劑和/或芳香劑。 [0610]可以根據已知技術使用適宜分散劑、潤濕劑和/或懸浮劑調配可注射製劑，例如，無菌可注射水性或油性懸浮液。無菌可注射製劑可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑和/或溶劑中的無菌可注射溶液、懸浮液和/或乳液，例如作為1,3-丁二醇中的溶液。可以採用的可接受的媒介物和溶劑尤其是水、林格氏溶液、U.S.P.和等滲氯化鈉溶液。常規採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可以採用任何溫和的不揮發性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。諸如油酸等脂肪酸可以用於注射劑的製備中。 [0611]可注射調配物可以例如通過以下方式來滅菌：經細菌截留過濾器過濾，和/或併入呈無菌固體組成物形式的滅菌劑，所述組成物可以在使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。 其他組分 [0612]另外，設想了所述醫藥組成物可以包括除了上文所述的那些外的一種或多種組分。 [0613]所述醫藥組成物還可以包括一種或多種滲透性增強劑分子、碳水化合物、聚合物、治療劑、表面改變劑或其他組分。滲透性增強劑分子可以是描述於例如美國專利申請公開號2005/0222064中的分子。碳水化合物可以包括單糖（例如，葡萄糖）和多糖（例如，糖原及其衍生物和類似物）。 [0614]所述醫藥組成物還可以含有表面改變劑，包括例如陰離子蛋白（例如，牛血清白蛋白）、表面活性劑（例如，陽離子表面活性劑，如二甲基二十八烷基-溴化銨）、糖或糖衍生物（例如，環糊精）、聚合物（例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆）、黏液溶解劑（例如，乙醯半胱胺酸、艾蒿（mugwort）、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青屬（clerodendrum）、溴己新（bromhexine）、羧甲司坦（carbocisteine）、依普拉酮（eprazinone）、美司鈉（mesna）、胺溴索（ambroxol）、索布瑞醇（sobrerol）、多米奧醇（domiodol）、來托司坦（letosteine）、司替羅寧（stepronin）、硫普羅寧（tiopronin）、凝溶膠蛋白（gelsolin）、胸腺素β4、阿法鏈道酶（dornase alfa）、奈替克新（neltenexine）和厄多司坦（erdosteine））和DNase（例如，rhDNase）。表面改變劑可以放置在本文所述的組成物內和/或其表面上。 [0615]除了這些組分外，含有本發明的LNP組成物的醫藥組成物還可以包括可用於醫藥組成物的任何物質。例如，所述醫藥組成物可以包括一種或多種醫藥上可接受的賦形劑或輔助成分，如但不限於一種或多種溶劑、分散介質、稀釋劑、分散助劑、懸浮助劑、製粒助劑、崩解劑、填充劑、助流劑、液體媒介物、黏合劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、緩衝劑、潤滑劑、油、防腐劑和其他種類。還可以包括諸如蠟、黃油、著色劑、包衣劑、調味劑和芳香劑等賦形劑。醫藥上可接受的賦形劑是本領域熟知的（參見例如，Remington's (2006) 同上）。 [0616]分散劑可以選自由以下組成的非限制性列表：馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、木薯澱粉、澱粉羥乙酸鈉、黏土、海藻酸、瓜爾膠、柑橘渣、瓊脂、膨潤土、纖維素和木製品、天然海綿、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、矽酸鹽、碳酸鈉、交聯聚(乙烯基-吡咯啶酮)（交聚維酮）、羧甲基澱粉鈉（澱粉羥乙酸鈉）、羧甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉（交聯羧甲纖維素）、甲基纖維素、預膠化澱粉（澱粉1500）、微晶澱粉、水不溶性澱粉、羧甲基纖維素鈣、矽酸鎂鋁（VEEGUM®）、十二烷基硫酸鈉、季銨化合物和/或其組合。 [0617]表面活性劑和/或乳化劑可以包括但不限於天然乳化劑（例如，阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、黃蓍膠、chondrux、膽固醇、黃原膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟和卵磷脂）、膠質黏土（例如，膨潤土 [矽酸鋁] 和VEEGUM® [矽酸鎂鋁]）、長鏈胺基酸衍生物、高分子量醇（例如，硬脂醇、鯨蠟醇、油醇、三醋精單硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、單硬脂酸甘油酯和丙二醇單硬脂酸酯、聚乙烯醇）、卡波姆（例如，基聚亞甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯聚合物）、角叉菜膠、纖維質素生物（例如，羧甲基纖維素鈉、粉狀纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素）、脫水山梨醇脂肪酸酯（例如，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯 [TWEEN® 20]、聚氧乙烯脫水山梨醇 [TWEEN® 60]、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯 [TWEEN® 80]、脫水山梨醇單棕櫚酸酯 [SPAN® 40]、脫水山梨醇單硬脂酸酯 [SPAN® 60]、脫水山梨醇三硬脂酸酯 [SPAN® 65]、單油酸甘油酯、脫水山梨醇單油酸酯 [SPAN® 80]）、聚氧乙烯酯（例如，聚氧乙烯單硬脂酸酯 [MYRJ® 45]、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和SOLUTOL®）、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯（例如，CREMOPHOR®）、聚氧乙烯醚（例如，聚氧乙烯十二烷基醚 [BRIJ® 30]）、聚(乙烯基-吡咯啶酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸鈉、PLURONIC®F 68、POLOXAMER® 188、西曲溴銨（cetrimonium bromide）、西吡氯銨（cetylpyridinium chloride）、苯紮氯銨（benzalkonium chloride）、多庫酯鈉（docusate sodium）和/或其組合。 [0618]防腐劑的例子可以包括但不限於抗氧化劑、螯合劑、抗微生物防腐劑、抗真菌防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑和/或其他防腐劑。抗氧化劑的例子包括但不限於α生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚、丁羥甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉和/或亞硫酸鈉。螯合劑的例子包括乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸一水合物、依地酸二鈉、依地酸二鉀、依地酸、富馬酸、蘋果酸、磷酸、依地酸鈉、酒石酸和/或依地酸三鈉。抗微生物防腐劑的例子包括但不限於苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、溴硝丙二醇、溴棕三甲銨、西吡氯銨、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪脲、酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐劑的例子包括但不限於對羥苯基甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉和/或山梨酸。醇防腐劑的例子包括但不限於乙醇、聚乙二醇、苯甲醇、酚、酚類化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐劑的例子包括但不限於維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、乙酸、脫氫抗壞血酸、抗壞血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐劑包括但不限於生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去鐵胺、溴棕三甲銨、丁羥茴醚（BHA）、丁羥甲苯（BHT）、乙二胺、十二烷基硫酸鈉（SLS）、十二烷基醚硫酸鈉（SLES）、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀。 [0619]緩衝劑的例子包括但不限於檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、d-葡糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、乳糖醛酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊酸、二鹼式磷酸鈣、磷酸、三鹼式磷酸鈣、磷酸氫氧化鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、胺丁三醇、胺基磺酸鹽緩衝液（例如，HEPES）、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原水、等滲鹽水、林格氏溶液、乙醇和/或其組合。 [0620]在某些實施例中，所述脂質奈米顆粒組成物及其調配物適於靜脈內、肌內、皮內、皮下、動脈內、腫瘤內或透過吸入投予。在某些實施例中，將約0.001 mg/kg至約10 mg/kg的劑量投予受試者。根據本公開文本的組成物可以調配成劑量單位形式以便於投予和劑量的一致性。然而，應理解，本公開文本的組成物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。 [0621]對於任何特定患者，具體的治療有效、預防有效或在其他方面適當的劑量水準（例如，用於成像）將取決於多種因素，包括所治療障礙（如果有的話）的嚴重程度和身份；所採用的一種或多種mRNA；所採用的具體組成物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所採用的具體醫藥組成物的投予時間、投予途徑和排泄速率；治療的持續時間；與所採用的具體醫藥組成物組合或同時使用的藥物；以及醫學領域熟知的類似因素。 VII. 方法 [0622]本公開文本提供了將有效載荷遞送至靶細胞或組織（例如，受試者的靶細胞或組織）的方法以及用於在此類方法中使用的LNP或含有所述LNP的醫藥組成物。本文中關於例如治療疾病或障礙、或者例如將核酸遞送至細胞、或者例如在細胞中產生目的多肽的方法的任何公開內容也應被解釋為關於用於在此類方法中使用的LNP或包含所述LNP的醫藥組成物的公開內容。 [0623]在某些實施例中，本發明提供了在哺乳動物細胞中產生目的多肽（例如，目的蛋白）的方法以及用於在此類方法中使用的LNP或含有所述LNP的醫藥組成物。在這種細胞中產生多肽的方法涉及使細胞與包含目的RNA（例如，編碼目的多肽（例如，目的蛋白）的mRNA）的LNP組成物接觸。在使所述細胞與所述LNP組成物接觸後，所述mRNA可以被吸收並在所述細胞中轉譯以產生目的多肽。 [0624]通常，使哺乳動物細胞與包括編碼目的多肽的mRNA的LNP組成物接觸的步驟可以在體內、離體或在體外進行。與細胞接觸的LNP組成物的量和/或其中的mRNA的量可以取決於所接觸細胞或組織的類型、投予方式、所述LNP組成物和其中的mRNA的物理化學特徵（例如，大小、電荷和化學成分）以及其他因素。通常，有效量的LNP組成物將允許在所述細胞中有效地產生多肽。效率度量可以包括多肽轉譯（由多肽表現指示）、mRNA降解水平和免疫反應指標。 [0625]使包括mRNA的LNP組成物與細胞接觸的步驟可以涉及或引起轉染，其中所述LNP組成物可以與細胞膜融合以允許將所述mRNA遞送至所述細胞中。在引入所述細胞的細胞質中後，然後經由所述細胞的細胞質內的蛋白質合成機器將所述mRNA轉譯成蛋白質或肽。 [0626]在某些實施例中，本文所述的LNP組成物可以用於將治療劑或預防劑遞送至受試者。例如，LNP組成物中包括的mRNA可以編碼多肽並在接觸和/或進入（例如，轉染）細胞時產生治療性或預防性多肽。在某些實施例中，本發明的LNP組成物中包括的mRNA可以編碼可改進或增加受試者的免疫力的多肽。 [0627]在某些實施例中，使細胞與包括mRNA的LNP組成物接觸可以降低細胞對外源核酸的先天免疫反應。可以使細胞與包括第一量的第一外源mRNA的第一LNP組成物接觸，所述第一外源mRNA包括可轉譯區，並且可以確定所述細胞對所述第一外源mRNA的先天免疫反應水準。隨後，可以使所述細胞與包括第二量的第一外源mRNA的第二組成物接觸，與第一量相比，第二量是較少量的第一外源mRNA。可替代地，所述第二組成物可以包括第一量的不同於所述第一外源mRNA的第二外源mRNA。使所述細胞與所述第一組成物和所述第二組成物接觸的步驟可以重複一次或多次。 [0628]另外，可以任選地確定所述細胞中多肽產生的效率，並且可以使所述細胞與所述第一組成物和/或所述第二組成物重複地再次接觸，直到達到靶蛋白質產生效率。 本公開文本提供了將核酸（例如，mRNA）遞送至哺乳動物細胞或組織（例如，受試者的哺乳動物細胞或組織）的方法。將mRNA遞送至這種細胞或組織涉及將包括所述mRNA的LNP組成物投予受試者，例如透過注射（例如，經由肌內注射）或血管內遞送至所述受試者。在投予後，所述LNP可以靶向和/或接觸細胞，例如免疫細胞，如T細胞。在使所述細胞與所述LNP組成物接觸後，可轉譯mRNA可以在所述細胞中轉譯以產生目的多肽。 [0629]在某些實施例中，本發明的LNP組成物可以靶向特定類型或類別的細胞。可以使用本文所述的脂質促進這種靶向以形成LNP，其還可以包括用於靶向目的細胞的靶向基團。在某些實施例中，特異性遞送可以導致與其他目標（例如，不表現或僅以低水平表現目的受體的細胞）相比，到達靶向目標（例如，表現或以高水準表現與所述LNP的免疫細胞靶向基團結合的目的受體的細胞）的mRNA的量增加大於2倍、5倍、10倍、15倍或20倍。 [0630]本發明的LNP組成物可用於治療特徵在於蛋白質或多肽活性缺失或異常的疾病、障礙或病症。在將編碼缺失或異常多肽的mRNA遞送至細胞後，所述mRNA的轉譯可以產生所述多肽，從而減少或消除由所述多肽的缺失或由所述多肽引起的活性異常引起的問題。因為轉譯可以快速發生，所以本發明的方法和組成物可用於治療急性疾病、障礙或病症，如敗血症、中風和心肌梗死。本發明的LNP組成物中包括的mRNA也能夠改變給定種類的轉錄速率，從而影響基因表現。 [0631]可以投予本發明的組成物的特徵在於蛋白質或多肽活性功能異常或異常的疾病、障礙和/或病症包括但不限於癌症和增殖性疾病、遺傳性疾病（例如，囊性纖維化）、自體免疫性疾病、糖尿病、神經退行性疾病、心血管和腎血管疾病以及代謝性疾病。多種疾病、障礙和/或病症的特徵可以在於蛋白質活性缺失（或大幅減少，使得不發生正確的蛋白質功能）。此類蛋白質可能不存在，或者它們可能基本上是非功能性的。功能異常蛋白的具體例子是囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白（CFTR）基因的錯義突變變體，其產生CFTR蛋白的功能異常蛋白變體，這導致囊性纖維化。本公開文本提供了用於透過投予包括mRNA和脂質組分的LNP組成物來治療受試者的此類疾病、障礙和/或病症的方法，所述脂質組分包括KL10、磷脂（任選不飽和的）、PEG脂質和結構脂質，其中所述mRNA編碼拮抗或以其他方式克服所述受試者的細胞中存在的異常蛋白質活性的多肽。 [0632]本文所述的治療性和/或預防性組成物可以使用有效地預防、治療、診斷或成像疾病、障礙和/或病症和/或任何其他目的的任何合理的量和任何投予途徑投予受試者。投予給定受試者的具體量可以根據受試者的物種、年齡和一般狀況、投予目的、特定組成物、投予方式等而變化。根據本公開文本的組成物可以調配成劑量單位形式以便於投予和劑量的一致性。然而，應理解，本公開文本的組成物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。 [0633]可以通過多種途徑投予包括一種或多種mRNA的LNP組成物，例如口服、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、皮下、室內、經皮或皮內、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內、局部、經黏膜、經鼻、腫瘤內投予。在某些實施例中，可以靜脈內、肌內、皮內、動脈內、腫瘤內或皮下投予LNP組成物。然而，本公開文本涵蓋通過任何適當的途徑遞送本發明的LNP組成物（考慮到藥物遞送科學的可能進步）。通常，最適當的投予途徑將取決於多種因素，包括包含一種或多種mRNA的LNP組成物的性質（例如，它在諸如血流和胃腸道等各種身體環境中的穩定性）、患者的情況（例如，患者是否能夠耐受特定的投予途徑）等。 [0634]包括一種或多種mRNA的LNP組成物可以與一種或多種其他治療劑、預防劑、診斷劑或成像劑組合使用。「與……組合」並不旨在暗示藥劑必須同時投予和/或被調配以供一起遞送，但這些遞送方法在本公開文本的範圍內。例如，包括一種或多種不同mRNA的一種或多種LNP組成物可以組合投予。組成物可以與一種或多種其他所需的治療劑或醫療程序同時、在其之前或在其之後投予。通常，每種藥劑將以針對該藥劑確定的劑量和/或時間表來投予。在一些實施例中，本公開文本涵蓋與這樣的藥劑組合遞送本發明的組成物或者其成像、診斷或預防組成物，所述藥劑改進其生物利用度、降低和/或修改其代謝、抑制其排泄和/或修改其在體內的分佈。 [0635]應進一步理解的是，組合利用的治療、預防、診斷或成像活性劑可以在單一組成物中一起投予或者在不同組成物中單獨投予。通常，期望組合利用的藥劑將以不超過單獨利用它們時的含量。在一些實施例中，組合利用的含量可以低於單獨利用的含量。 [0636]在組合方案中將採用的特定療法（治療劑或程序）組合將考慮所希望的治療劑和/或程序的相容性以及待實現的所需治療效果。還應理解的是，所採用的療法可以實現對相同障礙的期望效果（例如，可用於治療癌症的組成物可以與化學治療劑同時投予），或者它們可以實現不同的效果（例如，控制任何有害作用）。 [0637]在一些實施例中，不超過1%、不超過2%、不超過3%、不超過4%、不超過5%、不超過6%、不超過7%、不超過8%、不超過9%、不超過10%、不超過15%、不超過20%、不超過25%、不超過30%、不超過35%、不超過40%、不超過45%或不超過50%的不意在成為所述遞送的目標的細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是受試者的非免疫細胞。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是不被所述方法靶向的細胞。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是不被所述方法靶向的受試者細胞。 [0638]在一些實施例中，由本文所述的LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼且在所述免疫細胞中表現的多肽的半衰期比由參考LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼且在所述免疫細胞中表現的多肽的半衰期長至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。 [0639]在一些實施例中，所述LNP的組成物與所述參考LNP的組成物在以下方面不同：可電離陽離子脂質的類型、可電離陽離子脂質的相對量、PEG脂質中脂錨鉤的長度、PEG脂質的骨架或頭基、PEG脂質的相對量或免疫細胞靶向基團的類型或其任何組合。在一些實施例中，所述LNP的組成物與所述參考LNP的組成物僅在可電離陽離子脂質的類型方面不同。在一些實施例中，所述LNP的組成物與所述參考LNP的組成物僅在PEG脂質的量方面不同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質DLin-KC3-DMA，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質DLin-KC2-DMA，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質ALC-0315，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質SM-102，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，PEG脂質是游離PEG脂質。 [0640]在一些實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，所述免疫細胞是受試者的免疫細胞。在一些實施例中，所述免疫細胞是被所述方法靶向的免疫細胞。在一些實施例中，所述免疫細胞是被所述方法靶向的受試者免疫細胞。 [0641]在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸的表現水平高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施例中，用本文所述的方法測量和比較表現水平。在一些實施例中，透過表現所編碼多肽的細胞的比率來測量表現水平。在一些實施例中，用FACS測量表現水平。在一些實施例中，通過在細胞中表現的所編碼多肽的平均量來測量表現水平。在一些實施例中，表現水平被測量為平均螢光強度。在一些實施例中，透過所編碼多肽或由細胞分泌的其他材料的量來測量表現水平。 [0642]在另一個態樣，本文提供了將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有下式的化合物的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0643]在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP是如在本公開文本中本文所述的LNP。 [0644]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i)   與參考LNP相比，靶向遞送至所述免疫細胞的特異性增加； (ii)  與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述免疫細胞中的半衰期增加； (iii) 與參考LNP相比，轉染率增加；以及 (iv) 低水平的染料可及mRNA（＜ 15%）和高RNA包封效率，其中相對於在LNP批量製備中使用的總RNA，在最終調配物中回收至少80%的mRNA。 [0645]在一些態樣，提供了在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼所述多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0646]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，在所述免疫細胞中的表現水平增加； (ii) 與參考LNP相比，在所述免疫細胞中表現的特異性增加； (iii) 與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述免疫細胞中的半衰期增加； (iv) 與參考LNP相比，轉染率增加；和 (v) 低水準的染料可及mRNA（＜ 15%）和高RNA包封效率，其中相對於在LNP批量製備中使用的總RNA，在最終調配物中回收至少80%的mRNA。 [0647]在一些態樣，提供了調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼用於調節所述免疫細胞的細胞功能的多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在調節受試者的靶向免疫細胞的細胞功能的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病或障礙。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0648]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，在所述免疫細胞中的表現水平增加； (ii) 與參考LNP相比，在所述免疫細胞中表現的特異性增加； (iii) 與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述免疫細胞中的半衰期增加； (iv) 與參考LNP相比，轉染率增加； (v) 所述LNP能夠以與參考LNP相比更低的劑量投予，以在所述免疫細胞中實現相同的生物學作用；以及 (vi) 低水平的染料可及mRNA（＜ 15%）和高RNA包封效率，其中相對於在LNP批量製備中使用的總RNA，在最終調配物中回收至少80%的mRNA。 [0649]在一些實施例中，細胞功能的調節包括對所述免疫細胞進行重編程以啟動免疫反應。在一些實施例中，細胞功能的調節包括調節所述免疫細胞的抗原特異性。 [0650]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米顆粒（LNP）以將核酸遞送至所述受試者的免疫細胞。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含所述核酸。 [0651]在一些實施例中，所述核酸調節所述免疫細胞的免疫反應，從而治療或改善所述症狀。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組成物，用於在治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法中使用。疾病或障礙可以如下文所公開。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的免疫細胞在體外或離體地與脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0652]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，將所述核酸遞送至所述免疫細胞的特異性增加； (ii) 與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述免疫細胞中的半衰期增加； (iii) 與參考LNP相比，轉染率增加； (iv) 所述LNP可以以與參考LNP相比更低的劑量投予，以達到相同的治療功效； (v) 與參考LNP相比，免疫細胞的功能獲得水準增加；以及 (vi) 低水平的染料可及mRNA（＜ 15%）和高RNA包封效率，其中相對於在LNP批量製備中使用的總RNA，在最終調配物中回收至少80%的mRNA。 [0653]在一些實施例中，所述障礙是免疫障礙、炎性障礙或癌症。在一些實施例中，所述核酸編碼用於在治療或預防病原體感染的治療性或預防性疫苗中使用的抗原。 [0654]在一些實施例中，不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的不意在成為所述遞送的目標的不希望的免疫細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，由所述LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期比由參考LNP遞送至所述免疫細胞的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期長至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更長。 [0655]在一些實施例中，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多的意在成為所述遞送的目標的免疫細胞被所述LNP轉染。 [0656]在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸在相同免疫細胞中的表現水平高至少5%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、至少10%、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。 [0657]在一些態樣，提供了將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）接觸。在一些實施例中，所述方法用於靶向NK細胞。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與CD56結合。在一些實施例中，所述方法用於同時靶向T細胞和NK細胞兩者。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團與CD7、CD8或CD7和CD8兩者結合。在一些實施例中，所述方法用於同時靶向CD4+和CD8+ T細胞兩者。在一些實施例中，所述免疫細胞靶向基團包含與CD3或CD7結合的多肽。 [0658]在一些態樣，提供了在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述免疫細胞與本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）接觸。 [0659]在一些態樣，提供了調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）。 [0660]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的脂質奈米顆粒（LNP）。 [0661]在一些態樣，提供了治療受試者的與CD8相關的疾病或障礙的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文所述的醫藥組成物。在一些實施例中，所述疾病或障礙是癌症。 [0662]本公開文本中公開的和所要求保護的LNP適用於上述方法。 VIII. 用於在醫療應用中使用的套組 [0663]本發明的另一個態樣提供了用於治療障礙的套組。所述套組包含：可電離陽離子脂質、脂質-免疫細胞靶向基團接合物、包含可電離陽離子脂質和/或脂質-免疫細胞靶向基團接合物的脂質奈米顆粒組成物（具有或沒有包封的有效載荷（例如，mRNA））以及用於治療醫學障礙（如癌症或者微生物或病毒感染））的說明書。 列舉的實施例 [0664]以下列舉的實施例代表本發明的一些態樣。 1.    一種式(I)的化合物： (I)， 或其鹽，其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或C 1-6烷基。 2.    根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物是式(Ia) 的化合物： (Ia)。 3.    根據實施例1或2所述的化合物或其鹽，其中R 3B1是伸乙基或伸丙基。 4.    根據實施例1至3中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。 5.    根據實施例4所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。 6.    根據實施例5所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。 7.    根據實施例1或2所述的化合物或其鹽，其中 是 、 、 、 或 -O-。 8.    根據實施例1至7中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或亞甲基。 9.    根據實施例8所述的化合物或其鹽，其中R 1和R 2各自是亞甲基，並且R 3是鍵。 10.  根據實施例8所述的化合物或其鹽，其中R 1、R 2和R 3各自是亞甲基。 11.  根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物是式(Ib) 的化合物： (Ib)。 12.  根據實施例1至11中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。 13.  根據實施例12所述的化合物或其鹽，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。 14.  根據實施例13所述的化合物或其鹽，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。 15.  根據實施例12至14中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。 16.  根據實施例1至15中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2和R 2A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-( 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)。 17.  根據實施例16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。 18.  根據實施例17所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。 19.  根據實施例16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是C 1-15烷基；R 1A2和R 2A2各自是C 1-15烷基；並且R 1A3和R 2A3各自是H。 20.  根據實施例19所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。 21.  根據實施例16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)；R 2A1和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。 22.  根據實施例21所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。 23.  根據實施例16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是-C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；R 1A2和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。 24.  根據實施例23所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。 25.  根據實施例1至24中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。 26.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。 27.  根據實施例26所述的化合物或其鹽，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、 、 、 或 。 28.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是C 1-15烷基；並且R 3A2和R 3A3各自是H。 29.  根據實施例28所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 。 30.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)；並且R 3A2和R 3A3各自是H。 31.  根據實施例30所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 或 。 32.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。 33.  根據實施例32所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 或 ；並且R 3A2是 。 34.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。 35.  根據實施例34所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 ；並且R 3A2是 。 36.  根據實施例25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1、R 3A2和R 3A3各自是H。 37.  根據實施例1至15中任一項所述的化合物或其鹽，其中R a1和R a2各自獨立地是-(CH 2) 0-15CH 3或-CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)。 38.  根據實施例37所述的化合物或其鹽，其中R a1和R a2各自獨立地是 、 、 、 、 、 、 、 或 。 39.  根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物選自表1。 40.  根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物是 。 41.  根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物是 。 42.  根據實施例1所述的化合物或其鹽，其中所述化合物是 。 43.  一種用於將核酸靶向遞送至免疫細胞的脂質奈米顆粒（LNP），其包含脂質摻合物，所述脂質摻合物包含： (a) 脂質-免疫細胞靶向基團接合物，其包含式(II)的化合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]，和 (b) 可電離陽離子脂質，其包含根據實施例1至42所述的化合物中的任一種， 其中所述LNP進一步包含放置在其中的核酸。 44.  根據實施例43所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。 45. 根據實施例44所述的LNP，其中所述T細胞抗原是CD3、CD4、CD7、CD8或其組合（例如，CD3和CD8兩者、CD4和CD8兩者或CD7和CD8兩者）。 46.  根據實施例43至45中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。 47.  根據實施例46所述的LNP，其中所述NK細胞抗原是CD7、CD8、CD56或其組合（例如，CD7和CD8兩者）。 48.  根據實施例43至47中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述脂質摻合物中的脂質共價連接。 49.  根據實施例48所述的LNP，其中經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。 50.  根據實施例48或49所述的LNP，其中所述PEG是PEG 2000或PEG 3400。 51.  根據實施例43至50中任一項所述的LNP，其中所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.001至0.5莫耳百分比（例如，0.002至0.2莫耳百分比）的範圍存在於所述脂質摻合物中。 52.  根據實施例43至51中任一項所述的LNP，其中所述脂質摻合物進一步包含結構脂質（例如，固醇）、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。 53.  根據實施例43至52中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質以30至70（例如，40至60）莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 54.  根據實施例52所述的LNP，其中所述固醇以20至70（例如，30至50）莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 55.  根據實施例52或54所述的LNP，其中所述固醇是膽固醇。 56.  根據實施例52至55中任一項所述的LNP，其中所述中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）和鞘磷脂所組成的群組。 57.  根據實施例52至56中任一項所述的LNP，其中所述中性磷脂以5至15莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 58.  根據實施例52至57中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質選自由PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質所組成的群組。 59.  根據實施例52至57中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈，並且任選地所述游離PEG-脂質包含PEG-DPG和PEG-DMG。 60.  根據實施例52至59中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質以1至4莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 61.  根據實施例52至60中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 62.  根據實施例43至61中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。 63.  根據實施例62所述的LNP，其中所述LNP具有約100 nm的平均直徑。 64.  根據實施例43至63中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。 65.  根據實施例43至64中任一項所述的LNP，其中所述LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。 66.  根據實施例43至65中任一項所述的LNP，其中所述核酸是DNA或RNA。 67.  根據實施例66所述的LNP，其中所述RNA是mRNA。 68.  根據實施例67所述的LNP，其中所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。 69.  根據實施例67所述的LNP，其中所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。 70.  根據實施例67所述的LNP，其中所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。 71.  根據實施例69所述的LNP，其中所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 72.  根據實施例43至71中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域（例如，奈米抗體）。 73.  根據實施例43至71中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。 74.  根據實施例72或實施例73所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵的Fab。 75.  根據實施例74所述的LNP，其中根據Kabat編號，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。 76.  根據實施例73至75中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含具有非天然鏈間雙硫鍵（例如，工程化的包埋的鏈間雙硫鍵）的Fab。 77.  根據實施例76所述的LNP，其中根據Kabat編號，所述Fab在所述重鏈片段中包含F174C取代，並且在所述輕鏈片段中包含S176C取代。 78.  根據實施例73至77中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。 79.  根據實施例78所述的LNP，其中所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 80.  根據實施例72所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。 81.  根據實施例72或80所述的LNP，其中所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。 82.  根據實施例81所述的LNP，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且進一步包含間隔子，其包含在所述VHH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 83.  根據實施例73和80至82中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。 84.  根據實施例83所述的LNP，其中所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。 85.  根據實施例83所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。 86.  根據實施例72和80至82中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。 87.  根據實施例85或86所述的LNP，其中根據Kabat編號，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。 88.  根據實施例43至69中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段；或者 (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。 89.  根據實施例43至88中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。 90.  根據實施例43至88中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。 91.  根據實施例43至88中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。 92.  根據實施例43至91中任一項所述的LNP，其中所述LNP包含： (a)  所述可電離陽離子脂質， (b)  所述接合物，其包含下式的化合物： [脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]； (c)  固醇或其他結構脂質； (d)  中性磷脂 (e)  游離聚乙二醇（PEG）脂質，以及 (f)   所述核酸。 93.  根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述免疫細胞是NK細胞，並且所述免疫細胞靶向基團包含結合CD56的抗體。 94.  根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述免疫細胞靶向基團包含結合CD7或CD8的抗體，並且所述游離PEG脂質是DMG-PEG或PEG-DPG。 95.  根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。 96.  根據實施例95所述的LNP，其中所述Fab被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵。 97.  根據實施例96所述的LNP，其中所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。 98. 根據實施例96所述的LNP，其中所述Fab包含非天然鏈間二硫化物。 99.  根據實施例96所述的LNP，其中所述Fab在所述重鏈片段中包含F174C取代，並且在所述輕鏈片段中包含S176C取代。 100.      根據實施例95所述的LNP，其中所述抗體是免疫球蛋白單可變（ISV）結構域，並且所述ISV結構域是Nanobody® ISV。 101.      根據實施例100所述的LNP，其中所述游離PEG脂質包含具有至少2000道爾頓的分子量的PEG。 102.      根據實施例101所述的LNP，其中所述PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。 103.      根據實施例95所述的LNP，其中所述抗體是Fab。 104.      根據實施例103所述的LNP，其中所述Fab結合CD3，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約2000道爾頓的分子量的PEG。 105.      根據實施例103所述的LNP，其中所述Fab是抗CD4抗體，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約3000至3500道爾頓的分子量的PEG。 106.      根據實施例95所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。 107.      根據實施例106所述的LNP，其中所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。 108.      根據實施例107所述的LNP，其中所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域。 109.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述LNP結合CD3，並且還結合CD11a或CD18。 110.       根據實施例109所述的LNP，其中所述LNP包含兩種接合物，其中第一接合物包含結合CD3的抗體，並且第二接合物包含結合CD11a或CD18的抗體。 111. 根據實施例109所述的LNP，其中所述LNP包含一種接合物，並且所述接合物包含結合CD3和CD11a兩者的雙特異性抗體。 112.       根據實施例109所述的LNP，其中所述LNP包含一種接合物，並且所述接合物包含結合CD3和CD18兩者的雙特異性抗體。 113.       根據實施例111或112所述的LNP，其中所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。 114.       根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述LNP結合所述免疫細胞的CD7和CD8。 115.       根據實施例114所述的LNP，其中所述LNP包含兩種接合物，其中第一接合物包含結合CD7的抗體，並且第二接合物結合CD8。 116.       根據實施例114所述的LNP，其中所述LNP包含一種接合物，其中所述接合物包含結合CD7和CD8的雙特異性抗體。 117.       根據實施例116所述的LNP，其中所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。 118.       根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP與第一類型的免疫細胞的表面上的第一抗原結合，並且還與第二類型的免疫細胞的表面上的第二抗原結合。 119.       根據實施例118所述的LNP，其中所述兩種不同類型的免疫細胞是CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。 120.      根據實施例118所述的LNP，其中所述LNP包含兩種接合物，並且所述第一接合物包含與所述第一類型的免疫細胞的第一抗原結合的第一抗體，並且所述第二接合物包含與所述第二類型的免疫細胞的第二抗原結合的第二抗體。 121.      根據實施例118所述的LNP，其中所述LNP包含一種接合物，並且所述接合物包含雙特異性抗體，並且所述雙特異性抗體與所述第一類型的免疫細胞上的第一抗原和所述第二類型的免疫細胞上的第二抗原兩者結合。 122.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。 123.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述免疫細胞靶向基團包含結合CD3或CD7的單一抗體。 124.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述免疫細胞靶向基團結合CD7、CD8或者CD7和CD8兩者。 125.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至T細胞和NK細胞兩者，其中所述免疫細胞靶向基團與以下各項結合： (a) CD3和CD56兩者； (b) CD8和CD56兩者；或者 (c) CD7和CD56兩者。 126.      根據實施例93至125中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在50-200 nm範圍內的平均直徑。 127.      根據實施例126所述的LNP，其中所述LNP具有約100 nm的平均直徑。 128.      根據實施例93至125中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。 129.      根據實施例93至128中任一項所述的LNP，其中所述LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。 130.      根據實施例93至129中任一項所述的LNP，其中所述核酸是DNA或RNA。 131.      根據實施例130所述的LNP，其中所述RNA是mRNA。 132.      根據實施例131所述的LNP，其中所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。 133.      根據實施例131所述的LNP，其中所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。 134.      根據實施例133所述的LNP，其中所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。 135.      根據實施例134所述的LNP，其中所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 136.      根據實施例43至92中任一項所述的LNP，其中所述LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中所述免疫細胞靶向基團包含缺乏天然鏈間雙硫鍵的Fab。 137.      根據實施例136所述的LNP，其中所述Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恆定輕鏈和天然恆定重鏈上的形成天然鏈間雙硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除所述Fab中的天然鏈間雙硫鍵。 138.      一種將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法，所述方法包括使所述免疫細胞與根據實施例43至137中任一項所述的LNP接觸，其中所述LNP包含所述核酸。 139.      一種在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法，所述方法包括使所述免疫細胞與根據實施例43至137中任一項所述的LNP接觸，其中所述LNP包含編碼所述多肽的核酸。 140.      一種調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法，所述方法包括向所述受試者投予根據實施例43至137中任一項所述的LNP，其中所述LNP包含調節所述免疫細胞的細胞功能的核酸。 141.      一種治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法，所述方法包括向所述受試者投予LNP以將核酸遞送至所述受試者的免疫細胞，其中所述LNP是根據實施例43至137中所述的任一種，其中所述LNP包含所述核酸。 142.      根據實施例141所述的方法，其中所述障礙是免疫障礙、炎性障礙或癌症。 143.      根據實施例141所述的方法，其中所述核酸編碼用於在治療或預防病原體感染的治療性或預防性疫苗中使用的抗原。 144.      根據實施例138至143中任一項所述的方法，其中所述可電離陽離子脂質是 。 145.      根據實施例138至143中任一項所述的方法，其中所述可電離陽離子脂質是 。 146.      根據實施例138至143中任一項所述的方法，其中所述可電離陽離子脂質是 。 147.      根據實施例138至146中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。 148.      根據實施例147所述的方法，其中所述T細胞抗原是CD3、CD8或者CD3和CD8兩者。 149.      根據實施例138至146中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。 150.      根據實施例149所述的方法，其中所述NK細胞抗原是CD7、CD8或CD56。 151.      根據實施例138至150中任一項所述的方法，其中所述抗體是人類抗體或人源化抗體。 152.      根據實施例138至151中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述脂質摻合物中的脂質共價連接。 153.      根據實施例152所述的方法，其中經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。 154.      根據實施例152或153所述的方法，其中所述PEG是PEG 2000。 155.      根據實施例138至154中任一項所述的LNP，其中所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.002至0.2莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 156.      根據實施例138至155中任一項所述的方法，其中所述可電離陽離子脂質以40至60莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 157.      根據實施例138至156所述的方法，其中所述固醇是膽固醇。 158.      根據實施例49至157中任一項所述的方法，其中所述固醇以30至50莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 159.      根據請求項138至158所述的方法，其中所述中性磷脂選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）所組成的群組。 160.      根據實施例138至159所述的方法，其中所述中性磷脂以5至15莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 161.      根據實施例138至160中任一項所述的方法，其中所述游離PEG-脂質選自PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質所組成的群組。 162.      根據實施例138至160所述的方法，其中所述游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二肉豆蔻醯（C14）鏈、二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。 163.      根據實施例138至162中任一項所述的方法，其中所述游離PEG-脂質以0.5至2.5莫耳百分比的範圍存在於所述脂質摻合物中。 164.      根據實施例138至163中任一項所述的方法，其中所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。 165.      根據實施例138至164所述的方法，其中所述LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。 166.      根據實施例165所述的方法，其中所述LNP具有約100 nm的平均直徑。 167.      根據實施例138至166所述的方法，其中所述LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。 168.      根據實施例138至167所述的方法，其中所述LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。 169.      根據實施例138至168所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。 170.      根據實施例169所述的方法，其中所述RNA是mRNA、tRNA、siRNA、gNRA或微小RNA。 171.      根據實施例170所述的方法，其中所述mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。 172.      根據實施例170所述的方法，其中所述mRNA編碼能夠調節所述免疫細胞中的免疫反應的多肽。 173.      根據實施例170所述的方法，其中所述mRNA編碼能夠對所述免疫細胞進行重編程的多肽。 174.      根據實施例170所述的方法，其中所述mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。 175.      根據實施例138至174中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含抗體，並且所述抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。 176.      根據實施例138至174中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含選自以下的抗體片段所組成的群組：Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv和scFv片段。 177.      根據實施例175或176所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含含有一個或多個鏈間雙硫鍵的Fab。 178.      根據實施例177所述的方法，其中根據Kabat編號，所述Fab包含含有F174C和C233S取代的重鏈片段和含有S176C和C214S取代的輕鏈片段。 179.      根據實施例175至178中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含Fab，Fab在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸。 180.      根據實施例175所述的方法，其中所述Fab進一步包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 181.      根據實施例176至180中任一項所述的方法，其中所述Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的輕鏈可變結構域，其中所述CH1結構域和所述輕鏈恆定結構域透過一個或多個鏈間雙硫鍵連接，並且其中所述免疫細胞靶向基團進一步包含透過胺基酸連接子與所述輕鏈恆定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。 182.      根據實施例175所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。 183.      根據實施例175或182所述的方法，其中所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。 184.      根據實施例183所述的方法，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含V HH結構域，並且進一步包含間隔子，其包含在所述V HH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 185.      根據實施例175和182至184中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。 186.      根據實施例185所述的方法，其中所述兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。 187.      根據實施例185所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。 188.      根據實施例175和182至184中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。 189.      根據實施例185或186所述的方法，其中根據Kabat編號，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。 190.      根據實施例138至174中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段； (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。 191.      根據實施例138至190中任一項所述的方法，其中不超過5%的非免疫細胞被所述LNP轉染。 192.      根據實施例138至191中任一項所述的方法，其中由所述LNP遞送的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期比由參考LNP遞送的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期長至少10%。 193.      根據實施例138至192中任一項所述的方法，其中至少10%的免疫細胞被所述LNP轉染。 194.      根據實施例138至193中任一項所述的方法，其中由所述LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸的表現水平高至少10%。 實例 [0665]現在一般性地描述本發明，通過參考以下實例將更容易地理解本發明，所述實例僅用於說明本發明的某些態樣和實施例的目的而被包括在內，並不旨在限制本發明。   實例 1. 可電離陽離子脂質的製備 [0666]本實例描述了各種陽離子脂質的合成。 用於合成脂質 1 至脂質 30 的通用方案 [0667]在下面的方案1中提供了用於合成脂質1至脂質30的通用方案。在下面的表2至表4中提供了每種脂質的相應R和R’。 方案 1. 使用醯化和 還原胺化合成脂質 1 至脂質 30 中間體 13-11 和 13-11a 的合成 [0668]透過將二羥基丙酮（13-10）用亞油酸醯化來合成中間體13-11（方案2）。在50 mL DCM中，在DIPEA（55 mmol，9.6 mL，2.5當量）、DMAP（4.4 mmol，540 mg，0.2當量）存在下，在室溫下，使用EDCI（55 mmol，10.5 g，2.5當量）活化，使二羥基丙酮（22 mmol，2 g，1當量）與亞油酸1-5（55 mmol，15.4g，2.5當量）反應，產生11.1 g（79%）粗產物。透過柱層析法獲得純化的產物，並透過質子NMR譜進行表徵（圖1）。 方案 2. 使用 EDCI 介 導的亞油酸與二羥基丙酮的 O- 醯化反應 合成中間體 13-11 [0669]透過將二羥基丙酮（13-10）用油醯氯醯化來合成中間體13-11a（方案3）。在吡啶（133.3 mmol，11 mL，3當量）、DMAP（13.3 mmol，1.63 g，0.3當量）存在下，在80 mL DCM中，在室溫下，使二羥基丙酮（44.4 mmol，4 g，1當量）與油醯氯1-6a（111 mmol，36.7 mL，2.5當量）反應，產生14.9 g（54%）粗產物。透過柱層析純化粗產物，並透過質子NMR譜進行表徵（圖2A）。 方案 3. 透過油醯氯與二羥基丙酮的 O- 醯化合成中間體 13-11a 中間體 13-0a 和 13-11b 的合成 [0670]分別通過中間體13-11和13-11a的還原胺化來合成中間體13-0a和13-11b。 [0671]透過使用在DCM（10 mL）中的N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺15-3（26 mmol，3.2 mL，2.0當量），透過使用乙酸（26.0 mmol，1.50 mL，2當量）和三乙醯氧基硼氫化鈉（4.32 mmol，3.3 g，1.2當量），透過中間體13-11（13.1 mmol，8.1 g，1.0當量）的還原胺化（方案4）來產生中間體13-0，產生3.1 g（32%）粗產物。柱純化得到純化的產物（分別如圖3A和圖3B所示的質子NMR譜和LC-CAD層析圖）。 方案 4. 透過用 N1,N1- 二甲基丙烷 -1,3- 二胺還原胺化中間體 13-11 合成中間體 13-0 [0672]透過使用在DCM（60 mL）中的N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺15-3（48.4 mmol，6.05 mL，2.0當量），透過使用乙酸（48.4 mmol，2.8 mL，2當量）和三乙醯氧基硼氫化鈉（29.1 mmol，6.05 g，1.2當量），透過中間體13-11a（24.2 mmol，14.9 g，1.0當量）的還原胺化（方案5）來產生中間體13-11b，產生6 g（35%）粗產物。柱純化得到純化的產物（分別如圖2B和圖2C所示的質子NMR譜和LC-ELSD層析圖）。 方案 5. 透過用 N1,N1- 二甲基丙烷 -1,3- 二胺還原胺化中間體 13-11a 合成中間體 13-11b表2.脂質1至8的R（O-醯基）和R'（N-醯基）基團 表3.脂質9至16的R（O-醯基）和R'（N-醯基）基團 表4-1.脂質17、17A、18、19、19A、20、20A、21、21A、22和23的R（O-醯基）和R'（N-醯基）基團 表4-2.脂質24、25、25A、26、27、28、29和30的R（O-醯基）和R'（N-醯基）基團 表4-3.脂質31至38、37A和38A的R（O-醯基）和R'（N-醯基）基團 表5.命名的可電離脂質的預期和觀察質量（m/z）
條目 化合物代碼 預期質量（g/mol） 觀察質量（m/z）
1 脂質1 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
2 脂質2 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
3 脂質3 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
4 脂質4 845.39 845.7、846.7、847.7（M、M+1、M+2）
5 脂質5(S)異構體 （脂質5A） 827.33 827.7、828.7、829.7（M、M+1、M+2）
6 脂質6 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
7 脂質7 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
8 脂質8 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
9 脂質9 940.78 941.7、942.7、943.7（M+1、M+2、M+3）
10 脂質10(S)異構體 （脂質10A） 912.75 913.7、914.7、915.7（M+1、M+2、M+3）
11 脂質11(S)異構體 （脂質11A） 970.76 971.7、972.7、973.7（M+1、M+2、M+3）
12 脂質12  999.51  999.0、1001、1002（M+1、M+2、M+3）
13 脂質13 984.77 985.7、986.7、987.6（M+1、M+2、M+3）
14 脂質14A 1013.54 1013.1、1014.1、1015.1 （M+1、M+2、M+3）
15 脂質15 944.82 945.1、946.1、947.1（M+1、M+2、M+3）
16 脂質16 916.78  917.2、918.2、919.2（M+1、M+2、M+3）
17 脂質17A 896.67 897.9、898.9、899.9 （M+1、M+2、M+3）
18 脂質18A 952.73 953.7、954.7、955.7 （M+1、M+2、M+3）
19 脂質19A 1008.80 1009.8、1010.8、1011.8 （M+1、M+2、M+3）
20 脂質20A 1064.9 1065.7、1066.7、1067.7 （M+1、M+2、M+3）
21 脂質21A 1008.80 1009.7、1010.7、1011.7 （M+1、M+2、M+3）
22 脂質22 980.76 981.7、982.7、983.7 （M+1、M+2、M+3）
23 脂質23A 1036.8 1037.7、1038.6、1039.7 （M+1、M+2、M+3）
24 脂質19（脂質24A） 892.78 893.7、894.7、895.7（M+1、M+2、M+3）
25 脂質25A 1008.80 1009.7、1010.7、1011.7 （M+1、M+2、M+3）
26 脂質20（脂質26） 1064.86 1065.1、1066.1、1067.1、1068.1（M+1、M+2、M+3、M+4）
27 脂質27 1120.92 1121.9、1122.9、1123.9 （M+1、M+2、M+3）
28 脂質28 1092.9 1093.8、1094.8、1095.8 （M+1、M+2、M+3）
29 脂質29 1124.81 1125.8、1126.8、1127.8 （M+1、M+2、M+3）
30 脂質30 1180.87 NA
31 脂質31 854.75 855.1、856.1、857.1（M+1、M+2、M+3）
32 脂質32 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
33 脂質33 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
34 脂質34 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
35 脂質35 914.77 NA
36 脂質36 884.76 NA
37 脂質37A 1153.63 1153.8、1154.8、1155.8 （M+1、M+2、M+3）
38 脂質38A 1209.74 NA
透過中間體 13-0 或 13-11b 的 N- 醯化合成脂質 1-16 [0673]中間體13-0和13-11b與化合物R'CO 2H或R'COCl（表2和表3中所示的R'結構）的N-醯化產生脂質1至16，如以下實例中所述。 使用相應的醯氯，透過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 1 、 3 、 4 、 5 、 6 和 7 脂質 1 的合成 [0674]如下文方案6中所提供地並且如下合成脂質1。透過使用在6 mL苯中的草醯氯（3.7 mmol，320 µl，5當量）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料13l-1（0.75 mmol，130 mg，1.0當量）轉化為醯氯（步驟1）。產物（143 mg，98%）在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。透過使用TEA（240 µL，5當量，1.8 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（0.35 mmol，250 mg，1.0當量）用粗醯氯13l-1（0.75 mmol，143 mg，1.7當量）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（2次），產生124 mg（76%）純脂質1（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質1 NMR譜，參見圖4A-1；關於產物質量，參見表5）。 方案 6. 脂質 1 的合成 脂質 3 的合成 [0675]如下文方案7中所提供地並且如下合成脂質3。透過使用在60 mL苯中的草醯氯（2.8 mmol，2.4 ml，5當量）和DMF（100 µl，催化量），將起始材料13-13（8.3 mmol，1.30 g，1.0當量）轉化為醯氯13-13a（步驟1）。產物（1.44 g，98%）在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。透過使用在苯（100 mL）中的TEA（3.76 mL，5當量，27 mmol）和DMAP（50 mg，催化劑，催化量），將中間體13-0（5.4 mmol，3.78 g，1.0當量）用粗醯氯13-13a（1.44 g，1.5當量，8.1 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生2.1 g（46.3%）純脂質3（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質3 NMR譜，參見圖4B-1；關於脂質3 LC-MS，參見圖4B-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 7. 脂質 3 的合成 脂質 4 的合成 [0676]如下文方案7中所提供地並且如下合成脂質4。透過使用在6 mL苯中的草醯氯（3.23 mmol，227 µl，3.4當量）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料13-18（0.95 mmol，150 mg，1當量）轉化為醯氯13-18’（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟2）。透過使用在苯（10 mL）中的TEA（445 µL，5.0當量，3.2 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-11b（0.63 mmol，444 mg，1.0當量）用粗醯氯13-18’（167 mg，1.5當量，0.95 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（5次），產生140 mg（26%）純脂質4（通過LC-ELSD得到97%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質4 NMR譜，參見圖4C-1；關於脂質4 LC-MS，參見圖4C-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 8. 脂質 4 的合成 脂質 5 及其 (S) 異構體的合成 [0677]如下文方案9-1中所提供地並且如下合成脂質5的(S)異構體。透過使用在3 mL苯中的草醯氯（320 µL，1.0當量，3.7 mmol）和DMF（20 µl，催化量），在回流2小時下，將起始材料乙基己烯酸13m-1（110 mg，1.0當量，0.75 mmol）轉化為醯氯13m-2（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。在室溫下，透過使用在10 mL苯中的TEA（240 µL，5.0當量，1.8 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（250 mg，1.0當量，0.35 mmol）用粗醯氯13m-2（120 mg，1.8當量，0.75 mmol）醯化，反應隔夜。將粗產物透過柱層析法純化（2次），產生95 mg（32%）純脂質5（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質5 NMR譜，參見圖4D-1；關於脂質5 LC-MS，參見圖4D-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 9-1. 脂質 5(S) 異構體的合成 [0678]如下文方案9-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質5。 方案 9-2. 脂質 5 的合成 脂質 6 的合成 [0679]如下文方案10中所提供地並且如下合成脂質6。透過使用在6 mL苯中的草醯氯（207 µl，3.4當量，2.4 mmol）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料2-乙基壬酸13-14（132 mg，0.17 mmol，1當量）轉化為醯氯13-14’（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。透過使用在10 mL苯中的TEA（327 µL，5.0當量，2.4 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（0.47 mmol，330 mg，1當量）用粗醯氯13-14’（145 mg，1.5當量，0.7 mmol）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（2次），產生75 mg（18%）純脂質6（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質6 NMR譜，參見圖4E-1；關於脂質6 LC-MS，參見圖4E-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 10. 脂質 6 的合成 脂質 7 的合成 [0680]如下文方案11中所提供地並且如下合成脂質7。透過使用在HMPA（4.4 mL）和30 mL THF中的二異丙胺（7.2 mL，2.2當量，51 mmol），將起始材料庚酸13-15（23.1 mmol，3.0 g，1當量）用正丁基溴13-16（2.5 mL，1.0當量，23.1 mmol）和2.5 M在己烷中的正丁基鋰（20.0 mL，2.2當量，51 mmol）烷基化（步驟1）。透過快速層析法從反應混合物中分離1.5 g（35%）2-丁基庚酸13-17。透過使用在3 mL苯中的草醯氯（6.6 mmol，568 µl，3.4當量）和DMF（5 µl，催化量），將中間體13-17（360 mg，0.94 mmol，1當量）轉化為醯氯13-17’（步驟2）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟3）。將中間體13-0（0.64 mmol，450 mg，1當量）用在10 mL苯中的粗醯氯13-17'（395 mg，3.0當量，1.94 mmol）、TEA（446 µL，5.0當量，3.2 mmol）、DMAP（10 mg）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生228 mg（41 %）純脂質7（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質7 NMR譜，參見圖4F-1；關於脂質7 LC-MS，參見圖4F-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 11. 脂質 7 的合成 使用相應羧酸的碳二亞胺活化，透過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 2 、 8 、 9 和 10 脂質 2 的合成 [0681]如下文方案12中所提供地並且如下合成脂質2。將中間體13-0（0.14 mmol，320 mg，1.0當量）用在5 mL DCM中的壬酸13-12（1.15 mmol，198 uL，2.5當量）、EDCI（1.15 mmol，221 mg，2.5當量）、DIPEA（1.15 mmol，198 uL，2.5當量）和DMAP（0.05 mmol，6.4 mg，0.1當量）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（3次），產生107 mg（%）純脂質2（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質2 NMR譜，參見圖4G-1；關於脂質2 LC-MS，參見圖4G-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 12. 脂質 2 的合成 脂質 8 的合成 [0682]如下文方案13中所提供地並且如下合成脂質8。經由辛-3-酮13-46（2 g，15.6 mmol）與2-(二乙氧基磷醯基)乙酸乙酯13-47（7.0 g，2.0當量，31.2 mmol）、在THF中的2M NaHMDS（15.6 mL，2.0當量，31.2 mmol）和9 ml THF溶劑的HWE反應（步驟1）獲得烯烴13-48。反應後處理產生2.38 g（77%）經NMR、產物質量和單一TLC斑點確認的13-48。透過使用在8 mL乙酸乙酯中的Pd/C（50 mg），使烯烴13-48（5.1 mmol，1 g，1當量）氫化（步驟2），產生中間體13-48（958 mg，77%）。使用THF/MeOH/1M LiOH（3.0/2.0/3.0 mL）進行13-49（5.1 mmol，412 mg）的酯水解（步驟3），產生羧酸中間體13-50（336 mg，95%）。透過使用在2 mL DCM中的EDCI（0.66 mmol，102 mg，2.0當量）、DIPEA（0.66 mmol，114 µL，2.0當量）、DMAP（0.33 mmol，41 mg，1.0當量），將中間體13-0（0.33 mmol，234 mg）用13-50（0.66 mmol，115 mg，2.0當量）醯化，產生77 mg（27%）純脂質8（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質8 NMR譜，參見圖4H-1；關於脂質8 LC-MS，參見圖4H-2；關於產品質量，參見表5）。 方案 13. 脂質 8 的合成 脂質 9 的合成 [0683]如下文方案14中所提供地並且如下合成脂質9。透過使用在5 mL THF中的DMAP（3.55 g，1.0當量，32.0 mmol）和吡啶（5.0 ml），將起始材料癸-4-醇13-29（32.0 mmol，5.0 g，1.0當量）用琥珀酸13-30（6.3 g，2.0當量，63.0）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得4.26 g（81%）純酸中間體13-31。透過使用在50 mL DCM中的DIPEA（745 µL，4.26 mmol，2.5當量）、EDCI（820 mg，4.26 mmol，2.5當量）和DMAP（480 mg，0.43 mmol，0.25當量），將中間體13-0（2.1 mmol，1.5 g，1當量）用13-31（2.13 mmol，0.554 g，1.1當量）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（3次），產生1.4 g（73%）純脂質9（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質9 NMR譜，參見圖4I-1；關於脂質9 LC-MS，參見圖4I-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 14. 脂質 9 的合成 脂質 10 及其 (S) 異構體的合成 [0684]如下文方案15-1中所提供地並且如下合成脂質10的(S)異構體。透過使用在2 mL THF和6 mL DCM中的DMAP（1.72 g，1.0當量，15.3 mmol）和吡啶（2.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-46（2.0 g，1.0當量，15.3 mmol）用琥珀酸13-30（3.1 g，2.0當量，30.6 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得1.1 g（31%）純酸中間體13-47。透過使用在5 mL DCM中的EDCI（207 mg，3.0當量，1.80 mmol）、DIPEA（188 µL，3.0當量，1.8 mmol）和DMAP（15.0 mg，3.0當量，0.018 mmol），將中間體13-0（250 mg，1.0當量，0.36 mmol）用13-47（123 mg，1.5當量，0.53 mmol）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（2次），產生261 mg（54%）純脂質10（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質10 NMR譜，參見圖4J-1；關於脂質10 LC-MS，參見圖4J-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 15-1. 脂質 10(S) 異構體的合成 [0685]如下文方案15-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質10。透過使用在2 mL THF和6 mL DCM中的DMAP（1.72 g，1.0當量，15.3 mmol）和吡啶（2.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-46（2.0 g，1.0當量，15.3 mmol）用琥珀酸13-30（3.1 g，2.0當量，30.6 mmol）醯化，以獲得中間體13-47。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得1.1 g（31%）純酸中間體13-47。透過使用在5 mL DCM中的DIPEA（188 µL，3.0當量，1.8 mmol）、EDCI（207 mg，3.0當量，1.80 mmol）和DMAP（15.0 mg，3.0當量，0.018 mmol），將13-0（250 mg，1.0當量，0.36 mmol）用13-38（123 mg，1.5當量，0.53 mmol）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（2次），產生261 mg（54%）純脂質10（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質10 NMR譜，參見圖4J-1；關於脂質10 LC-MS，參見圖4J-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 15-2. 脂質 10 的合成 使用相應的醯氯，透過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 11 脂質 11 及其 (S) 異構體的合成 [0686]如下文方案16-1中所提供地並且如下合成脂質5的(S)異構體。使用EDCI（5.4 g，1.5當量，27.8 mmol）、DIPEA（4.6 mL，1.5當量，27.8 mmol）和DMAP（463 mg，0.2當量，3.7 mmol），使用起始材料苯甲醇13-39'（18.5 mmol，2 g）來醯化化合物13-39（4.8 g，1.5當量，27.8 mmol），產生3.6 g（74%）經柱純化的中間體13-40（透過質譜法和質子NMR確認的產物）。使中間體13-40（684 mg，2.6 mmol，1當量）在乙酸中脫保護，以獲得中間體13-41（約600 mg，定量，並透過質譜法和質子NMR確認產物結構）。生成另外量的中間體13-41，並透過使用在20 mL DCM中的TBSCl（1.7 g，11.25 mmol，1.5當量）、TEA（5.3 mL，5.0當量，37.5 mmol）和DMAP（92 mg，0.75 mmol，0.1當量），對1.68 g、7.5 mmol的13-41在羥基處進行選擇性保護，產生受保護的中間體13-41a（約2.5 g，定量）（通過質譜法和質子NMR確認產物質量）。透過使用在11.0 mL DCM中的EDCI（2.76 g，14.2 mmol，3.0當量）、DIPEA（1.6 mL，2.0當量，9.52 mmol）和DMAP（580 mg，4.76 mmol，1.0當量），將中間體13-41a（1.61 g，4.76 mmol）用正己醇13-34（2.94 mL，23.8 mmol，5.0當量）酯化，以獲得13-41b（0.95 g，48%）。生成另外量的13-41b，並使用在30 mL THF中的HF-吡啶（5.8 mL，80.6 mmol，25當量）使總計1.36 g（3.2 mmol）脫保護，以獲得中間體13-41c（837 mg，84%）。將中間體13-41c（456 mg，1.48 mmol）用在4.0 mL吡啶（4.0 mL）中的正丁醯氯13-42（760 µL，7.4 mmol，5.0當量）醯化，產生化合物13-44（505 mg，90%）。使用在3.0 mL乙酸乙酯中的Pd/C（30 mg），使中間體13-44（505 mg，1.34 mmol）脫保護，產生化合物13-45（370 mg，96%）。使用在3 mL苯中的草醯氯（190 µg，3.4當量，2.2 mmol）和DMF（10 µL，催化量），將化合物13-45（188 mg，0.65 mmol）轉化為醯氯中間體。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟9）。將中間體13-0（152 mg，0.22 mmol，1當量）用在5 mL苯中的粗醯氯13-45'（200 mg，3.0當量，0.65 mmol）、TEA（152 µL，5.0當量，1.1 mmol）、DMAP（10 mg）醯化，以獲得脂質11。將粗產物通過柱層析法純化，以產生77 mg（37%）純脂質11（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質11 NMR譜，參見圖4K-1；關於脂質11 LC-MS，參見圖4K-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 16. 脂質 11(S) 異構體的合成 [0687]如下文方案16-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質11。 方案 16-2. 脂質 11 的合成 脂質 12 的合成 [0688]如下文方案34中所提供地並且如下合成脂質12。在室溫下，在三氟乙酸酐（11.27 g，2.4當量，53.69 mmol）和苄醇（15 mL）中，對起始材料 14-3（3 g，1.0當量，22.37 mmol）進行選擇性保護，反應隔夜，產生中間體 14-4 。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得4.7 g（96%）純化的14-4。隨後在室溫下，透過使用在10 mL DCM中的EDCI（1.71 g，2當量，8.92 mmol）和DMAP（1.089 g，2當量，8.92 mmol），用正丁醇、13-34（4.55 g，10.0當量，44.60 mmol）醯化14-4（1.0當量，4.44 mmol），反應隔夜，產生14-5。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得800 mg（58%）純化的14-5。在室溫下，透過使用在10 mL甲苯中的TEA（1.31 g，5當量，12.97 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將14-5（800 mg，1.0當量，2.59 mmol）的游離羥基用己醯氯（1.39 g，4.0當量，10.37 mmol）醯化，反應隔夜，產生中間體14-7。透過柱層析法純化（1次）粗產物，產生470 mg（46%）純化的14-7。中間體14-7（470 mg，1當量，3.4 mmol）產生340 mg（93%）游離酸14-8。在室溫下，使用在1 mL甲苯中的草醯氯（50 µL，3.4當量，0.60 mmol）和DMF（0.2 µL，催化量），將粗品14-8（56 mg，1當量，0.18 mmol）轉化為相應的氯化物14-8'，反應隔夜，以提供56 mg粗氯化物14-8'。透過使用在3 mL甲苯中的TEA（39.0 µL，5.0當量，0.29 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將13-0（42 mg，1當量，0.059 mmol）用14-8'（56.0 mg，3.0當量，0.17 mmol）進行N-醯化，產生脂質12。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得純脂質12（23 mg，39%）（透過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質12 NMR譜，參見圖4L-1；關於脂質12 LC-ELSD層析圖，參見圖4L-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 34. 脂質 12 的合成 使用相應羧酸的碳二亞胺活化，透過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 13 脂質 13 的合成 [0689]如下文方案17中所提供地並且如下合成脂質13。透過使用在20 mL DCM中的EDCI（4.8 g，2當量，25.0 mmol）、DIPEA（4.35 mL，2當量，25.0 mmol）和DMAP（280 mg，0.2當量，2.5 mmol），將起始材料13-32（4.8 g，2.0當量，25.0 mmol）用1-丁醇（1.13 mL，1當量，12.4 mmol）酯化，以獲得中間體13-33。將粗產物透過柱層析法純化，以獲得2.78 g（44%）純中間體13-33。透過使用在50 mL乙腈中的NaHCO 3（3.95 g，1.0當量，47.0 mmol），透過將正己醇（2 g，2.4當量，19.6 mmol）用2-溴乙醯溴13-35（5.05 g，1.3當量，25.0 mmol）醯化來獲得中間體13-36。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得4.32 g（97%）純中間體13-36。 方案 17. 脂質 13 的合成 [0690]透過使用在8 mL DMF中的NaH（200 mg，1.0當量，5.0 mmol）並與中間體13-36（1.1 g，1.0當量，5.0 mmol）進行置換反應，透過原位生成13-33（1.25 g，1.0當量，5.0 mmol）的親核負碳離子來獲得中間體13-37。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得1.15g（58%）純中間體13-37。透過使中間體13-37（1.15 g，1.0當量，2.9 mmol）脫保護（230 mg Pd/C催化劑和在甲醇中的氫氣）來獲得游離酸中間體13-38。將粗產物透過柱層析法純化（4次），以獲得88 mg（9%）純中間體13-38。透過使用在2 mL DCM中的DIPEA（78 µL，3.0當量，0.45 mmol）、EDCI（87 mg，3.0當量，0.45 mmol）和DMAP（5 mg，0.3當量，0.04 mmol），將中間體13-0（105 mg，1.0當量，0.04 mmol）用13-38（2.13 mmol，0.554 g，1.1當量）醯化。將粗產物透過柱層析法純化（3次），產生41 mg（27%）純脂質13（通過LC-ELSD得到≥ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質13 NMR譜，參見圖4M-1；關於脂質13 LC-MS，參見圖4M-2；關於產物質量，參見表5）。 使用相應的醯氯，透過中間體 14-11 的 N- 醯化合成脂質 14A 脂質 14A 的合成 [0691]如下文方案37中所提供地並且如下合成脂質14A。 方案 37. 脂質 14A 的合成 [0692]在室溫下，透過使用在DCM（20 mL）中的EDCI（18.53 mmol，3.55 g，2當量）和DMAP（2.26 g，2當量，18.53 mmol），將單苄基保護的丙二酸 13-32起始材料（9.26 mmol，1.8 g，1.0當量）用正己醇 13-34（92.69 mmol，9.47 g，10.0當量）酯化，反應隔夜，以獲得中間體14-9（2.04 g，79%）。透過使用在30 mL乙腈中的NaHCO 3（5.9 g，2.4當量，70.47 mmol），透過使溴乙醯溴（38.17 mmol，7.70 g，1.3當量）與3.0 g正己醇 13-34（1.0當量，29.36 mmol）反應（0ºC至室溫）來製備化合物13-36，隔夜，以獲得6.0 g（91.6%）中間體 13-36。將中間體14-9（7.2 mmol，2.03 g，1.0當量）轉化為相應的負碳離子，並透過使用在30 mL乙腈中的NaHCO 3（5.9 g，2.4當量，70.47 mmol），與溴乙醯溴（7.70 g，1.3當量，38.17 mmol）反應（0ºC至室溫，隔夜），以獲得中間體 14-10（1.15 g，38%）。 [0693]透過在乙酸乙酯中氫化（Pd/C，H 2，室溫，隔夜）而使中間體 14-10（3.4 mmol，1.15 g，1.0當量）脫保護，產生中間體 14-11（850 mg，94%）。在室溫下，經2小時，使用在4 mL甲苯中的草醯氯（3.0 mmol，260 µL，3.4當量），使用DMF（0.2 µL，催化量），將14-11（300 mg，0.9 mmol，1.0當量）轉化為相應的氯化物14-11'。通過使用在3 mL甲苯中的TEA（39.0 µL，5.0當量，0.29 mmol）、DMAP（10 mg，催化量），將粗品 14-11’（0.17 mmol，280 mg，3.0當量）用於中間體13-0（0.059 mmol，200 mg，1.0當量）的N-醯化，以獲得脂質14A。透過柱層析法（DCM:在DCM中的10% MeOH）純化粗產物，產生220 mg（76%）純化的脂質14A（通過HPLC-CAD得到98%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4V-1和圖4V-2；針對質譜資料，參見表5）。 使用相應的醯氯，通過中間體 13-11a 的 N- 醯化合成脂質 15 脂質 15 的合成 [0694]如下文方案18中所提供地並且如下合成脂質15。透過使用在5 mL THF和15 mL DCM中的DMAP（7.7 g，63 mmol，1當量）和吡啶（5.0 ml），將起始材料癸-4-醇13-29（10.0 g，63.0 mmol）用琥珀酸13-30（12.6 g，126 mmol，2.0當量）醯化，以獲得中間體13-31。將粗產物透過柱層析法純化（3次），以獲得8.9 g（55%）純酸中間體13-31。使用在5 mL苯中的草醯氯（1.43 mL，3.4當量，16.66 mmol）和DMF（50 µL，催化量），將中間體13-31（1.26 g，4.9 mmol）轉化為醯氯中間體13-31’。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟3）。將中間體13-11b（275 mg，0.39 mmol）用在10 mL苯中的粗醯氯13-31'（324 mg，3.0當量，1.17 mmol）、TEA（270 µL，5.0當量，1.95 mmol）、DMAP（20 mg，催化量）醯化，以獲得脂質15。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以產生230 mg g（64%）純脂質15（通過LC-ELSD得到99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質15 NMR譜，參見圖4N-1；關於脂質15 LC-MS，參見圖4N-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 18. 脂質 15 的合成 脂質 16 的合成 [0695]如下文方案19中所提供地並且如下合成脂質16。透過使用在5 mL THF和15 mL DCM中的DMAP（23.04 mmol，2.8 g，1.0當量）和吡啶（5.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-48 rac（3 g，23 mmol）用琥珀酸13-30（46.08 mmol，4.61 g，2.0當量）醯化，以獲得中間體13-31。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得3.4 g（64%）純酸中間體13-47 rac。使用草醯氯（0.38 mL，4.4 mmol，3.4當量）和DMF（2 µL，催化量），將中間體13-47 rac（300 mg，0.42 mmol）轉化為醯氯中間體13-47' rac。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟3）。將中間體13-11b（270 mg，0.38 mmol）用在5 mL甲苯中的粗醯氯13-47’ rac（0.42 mmol，300 mg，3.0當量）、TEA（260 µL，5.0當量，1.9 mmol）、DMAP（20 mg，催化量）醯化，以獲得脂質16。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以產生165 mg（47%）純脂質16（通過LC-ELSD得到99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質16 NMR譜，參見圖4O-1；關於脂質16 LC-MS，參見圖4O-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 19. 脂質 16 的合成 脂質 17 的合成 [0696]如下文方案20中所提供地合成脂質17。在室溫下，透過使用在50 mL DCM/DMF（1:1 v/v）（50 mL）中的EDCI（3.29 g，1.2當量，17.2 mmol）、DMAP（160 mg，0.12當量，1.72 mmol）和TEA（9.96 mL，5.0當量，71.5 mmol），將辛二酸13-51（5.0 g，2.0當量，28.5 mmol）用癸-3-醇13-29（2.75 mL，1.0當量，14.3 mmol）單醯化，反應隔夜，以獲得游離酸13-53。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得1.06 g（28%）純化的13-53。在室溫下，透過使用在15 mL DCM中的EDCI（816 mg，2.5當量，4.25 mmol）、DMAP（50 mg，0.25當量，0.43 mmol）和DIPEA（740 µL，2.5當量，4.3 mmol），使酸13-53（1.06 g，2當量，3.7 mmol）與二羥基丙酮（152 mg，1.0當量，1.7 mmol）反應，反應隔夜，以獲得酮13-54。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得890 mg（69%）純化的13-54。在室溫下，透過使用在20 mL DCM（20 ml）中的乙酸（150 µL，2.0當量，2.6 mmol）和三乙醯氧基硼氫化鈉Na(OAc) 3BH（331 mg，1.2當量，1.5 mmol），將13-54（890 mg，1.0當量，1.3 mmol）用胺15-3（327 µl，2.0當量，2.6 mmol）進行還原胺化3小時，產生中間體13-55。將粗產物透過柱層析純化（1次），以獲得純化的13-55（470 mg，47%）。使用酸13-31對中間體13-55進行N-醯化，並報導了用於脂質15的合成的N-醯化反應條件，產生脂質17。 方案 20. 脂質 17 的合成 脂質 17A 的合成 [0697]在室溫下，透過使用在17 ml THF和50 mL DCM的混合物中的EDCI（2.65 g，2.5當量，126.3 mmol）、DMAP（7.7 g，1.0當量，63.1 mmol）和吡啶（17 mL），將起始材料4-羥基癸醇（63.1 mmol，10 g，1當量）用琥珀酸酐 13-30（12.64 g，2.0當量，12.2 mmol）醯化，反應隔夜，以獲得8.8 g（54%）酸中間體13-31。在室溫下，透過使用在20 mL DCM中的EDCI（3.98 g，2.5當量，20.8 mmol）和DMAP（0.203 g，0.2當量，1.6 mmol），將起始材料1,3-二羥基丙酮13-10（8.32 mmol，0.75 g，1當量）用中間體 13-31（20.8 mmol，5.36 g，2.5當量）二醯化，反應隔夜，以獲得1.89 g（40%）酮中間體 13-70。在室溫下，透過使用在15 mL DCM（15 mL）中的Na(OAc) 3BH（1.38 g，2.0當量，6.5 mmol）、乙酸（0.37 mL，2.0當量，6.5 mmol），透過用N,N-二甲基胺基-3-胺基丙烷 15-3（6.5 mmol，0.66 g，2.0當量）進行還原胺化3小時，將中間體 13-70（3.2 mmol，31.87 g，1當量）轉化為二胺中間體 13-71。透過2次柱層析法（在DCM中的10% MeOH）純化粗產物，產生500 mg（23%）純化的中間體 13-71。在室溫下，經2小時，使用在3 mL甲苯中的草醯氯（0.92 mmol，0.26 mL，3.4當量）和DMF（20 µL，催化量），將另外量的酸中間體13-31（19.4 mmol，0.24 g，1當量）轉化為相應的醯氯13-31’，並且在室溫下，通過使用在4 mL甲苯中的TEA（1.5 mmol，3.98 g，5.0當量）和DMAP（20 mg，催化量），將粗醯氯 13-31（0.9 mmol，0.23 g，3當量）用於二胺中間體 13-71（0.3 mmol，0.2 g，1當量）的N-醯化，反應隔夜，以產生 脂質 17A。將粗產物透過柱層析法（DCM:在DCM中的10% MeOH）純化2次，以獲得165 mg（60%）純 脂質 17A（通過HPLC-CAD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4W-1和圖4W-2；針對質譜資料，參見表5）。 方案 21. 脂質 17A 的合成 脂質 18 及其異構體的合成 [0698]如下文方案21-1中所提供地合成脂質18的異構體。使用與針對脂質17所報導的方法類似的方法，透過在步驟1中用辛-2-醇代替癸-3-醇，來合成脂質18。 方案 21-1. 脂質 18 異構體的合成 [0699]如下文方案21-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質18。 方案 21-2. 脂質 18 的合成 脂質 18A 的合成 [0700]在室溫（RT）下，透過使用在50 mL DCM（50 mL）、50 mL DMF（50 mL）的混合物中的EDCI（37.90 mmol，7.3 g，1.2當量）、DMAP（0.5 g，0.12當量，3.8 mmol，0.5 g，0.12當量）和TEA（158 mmol，22 mL，5.0當量），將起始材料4-羥基癸醇 13-29（31.6 mmol，5 g，1當量）用己二酸 13-72（10.4 g，2.0當量，63.2 mmol）醯化，反應隔夜，以獲得9.8 g（90%）酸中間體13-74。在室溫下，透過使用在30 mL中的EDCI（27.7 mmol，5.32 g，2.5當量）和DMAP（3.58 g，0.2當量，2.2 mmol），將起始材料1,3-二羥基丙酮13-10（11.09 mmol，1.0 g，1.0當量）用酸中間體 13-74 （ 27.7 mmol，7.93 g，2.5當量）二醯化，反應隔夜，以獲得1.18 g（17%）酮中間體 13-75。在室溫下，透過使用在15 mL DCM（15 mL）中的Na(OAc) 3BH（1.38 g，2.0當量，6.5 mmol）、乙酸（0.37 mL，2.0當量，6.5 mmol），透過用N,N-二甲基胺基-3-胺基丙烷 15-3（6.5 mmol，0.66 g，2.0當量）進行還原胺化3-4小時，將中間體 13-75（3.2 mmol，1.16 g，1.0當量）轉化為二胺中間體 13-76。透過2次柱層析法（在DCM中的10% MeOH）純化粗產物，產生660 mg（50%）純化的中間體 13-76。在室溫下，經2小時，使用在3 mL甲苯中的草醯氯（0.92 mmol，0.26 mL，3.4當量）和DMF（20 µL，催化量），將另外量的酸中間體13-31（19.4 mmol，0.24 g，1當量）轉化為相應的醯氯13-31’，並且在室溫下，透過使用在4 mL甲苯中的TEA（1.5 mmol，3.98 g，5.0當量）和DMAP（20 mg，催化量），將粗醯氯 13-31（0.9 mmol，0.23 g，3當量）用於二胺中間體 13-76（0.3 mmol，0.2 g，1當量）的N-醯化，反應隔夜，以產生 脂質 18A。將粗產物透過柱層析法（DCM:在DCM中的10% MeOH）純化2次，以獲得175 mg（60%）純 脂質 18A（通過HPLC-CAD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4X-1和圖4X-2；針對質譜資料，參見表5）。 方案 21-3. 脂質 18A 的合成 脂質 19 的合成 [0701]如下文方案22中所提供地並且如下合成脂質19。透過使用在10 mL DCM中的EDCI（2.24 g，2.5當量，11.71 mmol）、DIPEA（2.0 mL，2.5當量，11.71 mmol）和DMAP（115 mg，0.2當量，0.94 mmol），將起始材料二羥基丙酮（422 mg，4.7 mmol）用化合物13-56（3.0 g，2.5當量，11.71 mmol）醯化，產生2.1 g（79%）中間體13-57。透過使用在10.0 mL DCM中的乙酸（430 µL，2.0當量，7.4 mmol）、Na(OAc)3BH（923 mg，1.2當量，4.44 mmol），將13-57（2.1 g，1.0當量，3.7 mmol）用胺15-3（925 µL，2.0當量，7.4 mmol）進行還原胺化，產生1.55 g（65%）中間體13-58。如前文脂質9和脂質15的合成中所述地產生中間體13-31。在室溫下，透過使用在4.0 mL DCM中的EDCI（291 mg，2.0當量，1.48 mmol）、DIPEA（247 µL，2.0當量，1.48 mmol）和DMAP（45 mg，0.5當量，0.37 mmol），將中間體13-58（484 mg，1.0當量，0.74 mmol）用13-31（380 mg，2.0當量，1.48 mmol）進行N-醯化，反應隔夜，產生423 mg（63%）純脂質19（＞ 99%純度）。 [0702]關於脂質19 NMR譜，參見圖4P-1；關於脂質19反相LC-ELSD層析圖，參見圖4P-2；關於產物質量，參見表5。 方案 22. 脂質 19 的合成 脂質 19A 的合成 [0703]在室溫下，透過使用在20 mL二氯甲烷中的EDCI（13.02 mmol，2.49 g，1.5當量）、DMAP（4.3 mmol，0.53 g，0.5當量）和DIPEA（13.02 mmol，1.68 g，1.5當量），使用4-羥基癸醇 13-52（13.02 mmol，2.06 g，1.5當量）將起始材料三級丁基保護的辛二酸13-51（8.6 mmol，2.0 g，1當量）酯化4小時，產生2.83 g（88%）受保護的中間體13-53。在室溫下，使用在10 mL二噁烷中的4N HCl使中間體13-53（4.05 mmol，1.5 g，1.0當量）脫保護隔夜，產生1.07 g（84%）酸中間體13-54。 方案 22-1. 脂質 19A 的合成 方案 22-2. 中間體 13-4 的合成 [0704]在室溫下，使用在420 mL DCM（420.0 mL）中的三級丁基三甲基氯矽烷TBSCl（332 mmol，50 g，3.0當量）、TEA（148 mmol，160 mL，10.34當量）和DMAP（23 mmol，2.80 g，0.21當量）對起始材料二羥基丙酮13-32（111 mmol，10 g，1當量）進行保護，反應隔夜，產生受保護的中間體13-1。在室溫下，使用在800 mL DCM中的TBSCl（1.68 mol，250 g，3.0當量）、TEA（5.6 mol，400 mL，10.34當量）、DMAP（0.11 mol，13.7 g，0.21當量），反應隔夜，由另外50 g（0.56 mol，1.0當量）13-32產生第二批13-1。將兩個批次的粗產物分別還原胺化，並在純化之前合併。在室溫下，將第一批13-1（176 g，552.0 mmol）使用在1.5 L二氯甲烷中的N,N-二甲基胺基丙胺 15-3（1104.0 mmol，139 mL，2.0當量）、乙酸（1104.0 mmol，64 mL，2.0當量）和Na(OAc) 3BH（662.0 mmol，135 g，1.2當量）還原胺化3小時。在室溫下，將第二批13-1（36.8 g，115.4 mmol）使用在300 mL二氯甲烷中的N,N-二甲基胺基丙胺 15-3（230.8 mmol，29 mL，2.0當量）、乙酸（230.8 mmol，13.4 mL，2.0當量）和Na(OAc) 3BH（138.5 mmol，28.2 g，1.2當量）還原胺化3小時。將兩個批次的合併的粗產物透過過濾柱層析法在矽膠柱上純化，其中用DCM和（在DCM中的10% MeOH + 1% NH 4OH）洗脫，以獲得所需產物，產生17 g純中間體 13-2（基於TLC）。 [0705]在室溫下，使用相同的反應條件分別使兩個批次的 13-2脫保護2小時；每種反應條件由在 HF- 吡啶（4.65 mmol，0.42 mL，10.0當量）和2 mL THF中的 13-2（300 mg，0.465 mmol）組成。 [0706]在室溫下，經2小時，使用相同的反應條件，使用在6.0 mL甲苯中的草醯氯（9.5 mmol，0.8 mL，3.4當量）、DMF（100 µL，催化量），將兩個批次的酸中間體 13-54分別轉化為相應的醯氯；每種反應條件由 13-54（881 mg，2.8 mmol）組成。 [0707]在室溫下，將粗二羥基中間體13-4（194 mg，0.465 mmol）和粗醯氯13-54'（2.8 mmol，881 mg，6.0當量）與在8.0 mL甲苯中的TEA（4.65 mmol，0.65 mL，10.0當量）合併，隔夜。將粗產物通過ISCO柱層析法在矽膠柱上純化，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫。在分離產物後重複柱純化步驟，產生247 mg（53%）的76%純度（HPLC-CAD）的脂質19A。將產物透過ISCO柱層析法在矽膠柱上再次純化，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫，產生122 mg的＞ 99%純度（HPLC-CAD）的脂質19A（關於透過質子NMR和LC-CAD純度進行的表徵，參見圖4AI-1和圖4AI-2；關於質譜資料，參見表5）。   脂質 20 的合成 [0708]如下文方案23中所提供地並且如下合成脂質20。使用硼烷-二甲基硫醚（6.2 mL，7.0當量，67.0 mmol），將單保護的琥珀酸13-59（2.0 g，1.0當量，9.65 mmol）還原為相應的醇，在0ºC-5ºC反應1小時，隨後在室溫反應隔夜。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生1.3 g（71%）純化合物13-60。在室溫下，透過使用在10.0 mL DCM中的EDCI（1.63 g，1.7當量，8.5 mmol）、DIPEA（1.48 mL，1.7當量，8.5 mmol）和DMAP（98 mg，0.17當量，0.85 mmol），使用中間體13-60（1.3 g，1.3當量，6.7 mmol）來醯化酸13-56（1.51 mL，1.0當量，5.0 mmol），反應隔夜。將粗產物透過柱層析法純化（1次），產生1.88 g（65%）純中間體13-61。隨後透過在甲醇中經Pd/C/氫氣（400 mg）氫化而進行脫保護，產生1.42 g游離酸13-62（99%）粗產物。在室溫下，透過使用在10.0 mL DCM中的EDCI（958 mg，2.6當量，5.0 mmol）、DIPEA（870 µL，2.6當量，5.0 mmol）和DMAP（56 mg，0.26當量，0.5 mmol），使用粗品13-62（1.32 g，2.2當量，4.2 mmol）來醯化二羥基丙酮13-10（172 mg，1.0當量，1.9 mmol），反應隔夜，以獲得酮13-63。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得120 mg（3.8%）純13-63。在室溫下，通過使用在3 mL DCM中的乙酸（18 µL，2.0當量，7.8 mmol）和Na(OAc) 3BH（41 mg，1.2當量，0.19 mmol），將13-63（120 mg，1.0當量，0.16 mmol）用胺15-3（42 µl，2.0當量，0.32 mmol）進行還原胺化3小時，產生中間體13-64。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得23 mg（17%）純化的中間體13-64。在室溫下，透過使用在1.5 mL DCM中的EDCI（6.4 mg，1.2當量，0.034 mmol）、DIPEA（5.8 µL，1.2當量，0.034 mmol）和DMAP（1 mg，催化劑），將13-64（23 mg，1.0當量，0.028 mmol）用酸13-31（8.7 mg，1.2當量，0.034 mmol）進行N-醯化，反應隔夜，產生脂質20。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得21 mg（70%）純脂質20（99%）。 [0709]關於脂質20 NMR譜，參見圖4Q-1；關於脂質20反相LC-ELSD層析圖，參見圖4Q-2；關於產物質量，參見表5。 方案 23. 脂質 20 的合成 脂質 20A 的合成 [0710]在室溫下，透過使用在20 mL二氯甲烷中的4-羥基癸醇 14-20（23.25 mmol，3.7 g，1.5當量）、EDCI（23.25 mmol，4.5 g，1.5當量）、DMAP（7.75 mmol，0.95 g，0.5當量）和DIPEA（23.25 mmol，4 mL，1.5當量），將三級丁基保護的癸二酸14-19起始材料（15.5 mmol，4.0 g，1當量）酯化隔夜，產生4.1 g（66%）受保護的中間體酯 14-21。在室溫下，使用在15 mL二噁烷中的4N HCl使中間體 14-21（10.3 mmol，4.1 g，1.0當量）脫保護隔夜，產生2.7 g（77%）酸中間體 14-22。 方案 23-1. 脂質 20A 的合成 [0711]在室溫下，將受保護的中間體 13-3（400 mg，0,62 mmol，1當量）用在6.0 mL THF中的氟化氫/吡啶（15.5 mmol，1.11 mL，25.0當量）處理2小時，並透過TLC和質譜法確認脫保護。在室溫下，經2小時，使用在5.0 mL甲苯中的草醯氯（12.6 mmol，1.1 mL，3.4當量）和DMF（40 µL，催化量），將酸中間體 14-22（3.72 mmol，1.27 g，1當量）轉化為相應的醯氯14-22’，並透過TLC確認轉化為氯化物中間體。 [0712]在室溫下，經2小時，將粗二羥基中間體 13-4（258 mg，0.62 mmol，1當量）和粗醯氯 14-22’（3.72 mmol，1.34 g，6.0當量）與在5 mL甲苯中的TEA（6.2 mmol，0.87 mL，10.0當量）合併。將粗產物透過ISCO柱層析法在矽膠柱上純化，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫，產生300 mg的96%純度（HPLC-CAD）的脂質20A（關於透過質子NMR、質譜法和LC-CAD純度進行的表徵，參見圖4AJ-1和圖4AJ-2）。   脂質 21 及其異構體的合成 [0713]如下文方案24-1中所提供地合成脂質21的異構體。簡而言之，透過使用二乙基鋅對醛13-77進行親核加成來獲得醇13-78（步驟1），隨後將用於環酐13-52的開環加成中以獲得中間體13-79。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-79進行O-醯化，產生酮13-80。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-80用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-81。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-81用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質21。 方案24-1.脂質21異構體的合成 [0714]如下文方案24-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質21。簡而言之，使用類似於針對脂質21異構體所述的方法來獲得脂質21（外消旋體），除了在步驟1中使用乙基鋰來獲得外消旋醇。 方案24-2.脂質21的合成 脂質 21A 的合成 [0715]在室溫（RT）下，透過使用在25 mL DCM和25 mL DMF的混合物中的EDCI（14.9 mmol，2.83 g，1.2當量）、DMAP（1.5 mmol，183 mg，0.12當量）和TEA（62.0 mmol，8.6 mL，5.0當量），將起始材料3-羥基辛醇 13-66（12.4 mmol，1.61 g，1當量）用癸二酸 13-65（24.8 mmol，5.0 g，2.0當量）醯化，反應隔夜，以獲得2.2 g（56%）酸中間體13-67。在室溫下，透過使用在10 mL DCM中的EDCI（7.0 mmol，1.33 g，2.2當量）、DIPEA（7.0 mmol，1.22 mL，2.2當量）和DMAP（1.6 mmol，197 mg，0.5當量），將起始材料1,3-二羥基丙酮13-10（3.2 mmol，286 mg，1.0當量）用酸中間體 13-67（7.0 mmol，2.2 g，2.2當量）二醯化，反應隔夜，以獲得1.4 g（65%）酮中間體 13-68。 方案 24-3. 脂質 21A 的合成 [0716]在室溫下，透過使用在5 mL DCM中的Na(OAc) 3BH（10 mg，1.2當量，2.46 mmol）、乙酸（236 µL，2.0當量，4.10 mmol），透過用N,N-二甲基胺基-3-胺基丙烷 15-3（514 µL，2.0當量，4.10 mmol）進行還原胺化3小時，將中間體 13-68（2.05 mmol，1.4 g，1.0當量）轉化為二胺中間體 13-69。透過矽膠柱層析法（在DCM中的10% MeOH，1% NH 4OH）純化粗產物，產生480 mg（32%）純化的中間體 13-69。在室溫下，經2小時，使用在3 mL甲苯中的草醯氯（540 µL，3.4當量，6.38 mmol）和DMF（20 µL，催化量），將酸中間體13-31（1.86 mmol，484 mg，1當量）轉化為相應的醯氯13-31'，並且在室溫下，透過使用在3 mL甲苯中的TEA（435 µL，5.0當量，3.13 mmol），將粗醯氯 13-31'（518 mg，3.0當量，1.88 mmol）、TEA、甲苯（3.0 mL）、室溫、隔夜用於二胺中間體 13-69（0.3 mmol，0.2 g，1當量）的N-醯化，反應隔夜，以產生 脂質 21A。將粗產物透過柱層析法（己烷和EtAc，然後DCM:在DCM中的10% MeOH，在矽膠上）純化2次，以獲得51 mg純 脂質 21A（透過HPLC-UV得到＞ 99%純度，並且透過HPLC-CAD得到95%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4Y-1和圖4Y-2；針對質譜資料，參見表5）。   脂質 22 及其異構體的合成 [0717]如下文方案25-1中所提供地合成脂質22的異構體。簡而言之，將醇13-78（如上文針對脂質21的合成所述地那樣獲得）用於環酐13-73’的開環加成，以獲得中間體13-82。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-82進行O-醯化，產生酮13-83。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-83用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-84。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-84用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質22異構體。 方案 25-1. 脂質 22 異構體的合成 [0718]如下文方案25-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質22。透過用外消旋醇13-78 rac代替醇異構體13-78，使用上文針對脂質22異構體所述的方法獲得脂質22。 方案 25-2. 脂質 22 的合成 [0719]可替代地，在室溫下，透過使用在20 mL DCM和20 mL DMF的混合物中的EDCI（2.26 g，1.2當量，11.8 mmol）、DMAP（143 mg，0.12當量，1.2 mmol）和TEA（6.8 mL，5.0當量，49.0 mmol），將起始材料3-十一醇 13-78 外消旋物（31.6 mmol，5 g，1當量）用己二酸 13-82（9.8 mmol g，1.68 g，2.0當量）醯化，反應隔夜，以獲得1.35 g（46%）酸中間體13-83 rac。在室溫下，透過使用在6 mL DCM中的EDCI（856 mg，2.2當量，4.5 mmol）、DIPEA（782 µL，2.2當量，4.5 mmol）和DMAP（127 mg，0.5當量，1.03 mmol），將起始材料1,3-二羥基丙酮13-10（2.05 mmol，184 mg，1.0當量）用酸中間體 13-83-rac（1.35 g，2.2當量，4.5 mmol）二醯化，反應隔夜，以獲得610 mg（46%）酮中間體 13-84-rac。 方案 25-3. 脂質 22 的替代性合成 [0720]在室溫下，透過使用在3 mL DCM中的Na(OAc) 3BH（1.2 mmol，249 mg，1.2當量）、乙酸（1.86 mmol，107 µL，2.0當量），透過用N,N-二甲基胺基-3-胺基丙烷 15-3（1.86 mmol，233 µL，2.0當量）進行還原胺化3小時，將中間體 13-84-rac（0.93 mmol，610 mg，1.0當量）轉化為二胺中間體 13-85-rac。透過矽膠柱層析法（在DCM中的10% MeOH）純化粗產物，產生210 mg純化的中間體 13-85-rac。在室溫下，通過使用在3 mL甲苯中的TEA（1.4 mmol，197 µL，5.0當量），將來自先前批次的醯氯 13-31’（0.85 mmol，233 mg，3.0當量）用於二胺中間體 13-85-rac（0.28 mmol，210 mg，1當量）的N-醯化，反應隔夜，以產生 脂質 22。將粗產物透過柱層析法（DCM:在DCM中的10% MeOH）純化2次，以獲得56 mg（60%）純 脂質 22（通過HPLC-CAD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4Z-1和圖4Z-2；針對質譜資料A、B、C，參見表5）。   脂質 23 的合成 [0721]如下文方案26中所提供地合成脂質23。簡而言之，使用脂質9的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用酸13-31進行O-醯化，產生酮13-70。使用脂質9的合成中所述的條件，將13-70用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-71。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-71用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質23。 方案26-1.脂質23的合成 脂質 23A 的合成 [0722]在室溫下，透過使用在20 mL DCM和20 mL DMF的混合物中的EDCI（3.3 g，1.2當量，17.3 mmol）、DMAP（211 mg，0.12當量，1.73 mmol）和TEA（10.0 mL，5.0當量，72.0 mmol），將起始材料3-十一醇 13-78 外消旋物（14.4 mmol，2.47 g，1當量）用辛二酸 13-77（5.0 g，2.0當量，82.7 mmol）醯化，反應隔夜，以獲得2 g（43%）酸中間體13-879-rac。在室溫下，透過使用在8 mL DCM中的EDCI（1.16 g，2.2當量，6.1 mmol）、DIPEA（1.06 mL，2.2當量，6.1 mmol）和DMAP（172 mg，0.5當量，1.4 mmol），將起始材料1,3-二羥基丙酮13-10（2.8 mmol，250 mg，1.0當量）用酸中間體 13-79-rac（2.0 g，2.2當量，6.1 mmol）二醯化，反應隔夜，以獲得690 mg（35%）酮中間體 13-80-rac。 方案 26-2. 脂質 23A 的合成 [0723]在室溫下，透過使用在3 mL DCM中的Na(OAc) 3BH（1.2 mmol，249 mg，1.2當量）、乙酸（1.94 mmol，112 µL，2.0當量），透過用N,N-二甲基胺基-3-胺基丙烷 15-3（1.94 mmol，243 µL，2.0當量）進行還原胺化3小時，將中間體 13-80-rac（0.97 mmol，690 mg，1.0當量）轉化為二胺中間體 13-81-rac。透過矽膠柱層析法（在DCM中的10% MeOH）純化粗產物，產生520 mg純化的中間體 13-81-rac。在室溫下，透過使用在4 mL甲苯中的TEA（3.25 mmol，458 µL，5.0當量），將來自先前批次的醯氯 13-31’（1.63 mmol，447 mg，2.5當量）用於二胺中間體 13-81-rac（0.65 mmol，520 mg，1當量）的N-醯化，反應隔夜，以產生 脂質 23A。將粗產物透過柱層析法（DCM:在DCM中的10% MeOH）純化2次，以獲得230 mg（31%）純 脂質 23A（通過HPLC-UV得到＞ 99%純度，透過HPLC-CAD得到96%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（針對質子NMR和HPLC-CAD，參見圖4AA-1和圖4AA-2；針對質譜資料，參見表5）。 脂質24的合成 [0724]如下文方案27中所提供地合成脂質24。簡而言之，透過將單保護的二酸13-72用醇13-29進行O-醯化來獲得酸13-34，隨後使中間體13-73脫保護以產生酸13-74。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-74進行O-醯化，產生酮13-75。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-75用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-76。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-76用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質24。 方案27.脂質24的合成 脂質 25 的合成 [0725]如下文方案28中所提供地合成脂質25。簡而言之，進行醇13-29預環酐13-52’的開環加成，產生酸中間體13-85。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-85進行O-醯化，產生酮13-86。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-86用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-87。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-87用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質25。 方案 28-1. 脂質 25 的合成 脂質 25A 的合成 [0726]在室溫下，透過使用在60 mL二氯甲烷中的EDCI（5.80 g，1.97當量，30.26 mmol）、DMAP（0.40 g，0.21當量，3.27 mmol）和DIPEA（5.4 mL g，1.97當量，30.33 mmol），將苄基保護的乙醇酸14-24起始材料（15.4 mmol，2.61 g，1當量）用2-己基癸酸 14-25（6.10 g，96%，1.48當量，22.84 mmol）醯化，反應隔夜，產生2.75 g（49%）受保護的中間體酯 14-26。在室溫下，使用 Pd/C（930 mg，32% w/w）、EtOAc（35 mL），使中間體 14-26（10.3 mmol，4.1 g，1.0當量）脫保護隔夜，產生1.72 g（82%）酸中間體 14-27。 方案 28-2. 脂質 25A 的合成 [0727]在室溫下，將受保護的中間體 13-3（600 mg，0.9 mmol，1當量）用在4.0 mL THF中的氟化氫/吡啶（0.92 g，10.0當量，9.3 mmol）處理2小時，產生二羥基中間體13-4。透過TLC和質譜法確認脫保護。在室溫下，經2小時，使用在5.0 mL甲苯中的草醯氯（2.36 g，3.4當量，18.59 mmol）和DMF（100 µL，催化量），將酸中間體 14-27（5.4 mmol，1.72 g，1當量）轉化為相應的醯氯14-27’，並透過TLC確認轉化為氯化物中間體。 [0728]在室溫下，將粗二羥基中間體 13-4（350 mg，0.84 mmol，1當量）和粗醯氯 14-27’（1.58 g，6.0當量，5.04 mmol）與在9 mL甲苯中的TEA（0.85 g，10.0當量，8.4 mmol）合併，隔夜。將粗產物通過ISCO柱層析法在矽膠柱上純化，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫，產生240 mg（85%）的99%純度（HPLC-CAD）的脂質25A。（關於通過質子NMR和LC-CAD純度進行的表徵，參見圖4AC-1和圖4AC-2；關於質譜資料，參見表5）。   脂質 27 的合成 [0729]如下文方案29中所提供地並且如下合成脂質27。在室溫下，使用5 mL的0.5 M NaOH，使起始材料己內酯14-30（2 g，17.5 mmol）開環2小時，產生6-羥基己酸14-31（1.8 g，78%）。使用相同的條件，在第二次2 g規模的己內酯水解反應中產生另外的14-31，以獲得1.9 g（82%）14-31。在0ºC至室溫下，使用在6 mL MeOH和10 mL DMF中的DBU（1.38 g，1.2當量，9 mmol）、苄基溴（1.68 g，1.3當量，9.8 mmol）對6-羥基己酸14-31（1 g，7.5 mmol）進行苄基保護，反應隔夜，產生受保護的中間體14-32（1.3 g，77%）。在0ºC至室溫下，使用在12 mL MeOH和20 mL DMF中的DBU（2.76 g，1.2當量，18.1 mmol）、苄基溴（3.36 g，1.3當量，19.6 mmol）對另外的14-31（2 g，15.1 mmol）進行保護，反應隔夜，產生受保護的中間體14-32（2.65 g，79%）。 [0730]在室溫下，透過使用在20.0 mL DCM中的EDCI（2.58 g，2當量，13.4 mmol）、DIPEA（1.74 g，2當量，13.4 mmol）和DMAP（0.16 g，0.2當量，1.3 mmol），使用中間體14-32（2.45 g，1當量，11 mmol）來醯化酸14-25（2.59 g，1.5當量，10 mmol），反應隔夜。將粗產物透過柱層析法純化（1次），產生4.8 g（94%）受保護的純中間體14-33。隨後透過在30 mL乙酸乙酯中經Pd/C/氫氣（0.6 g，20% w/w）氫化而使14-33（4.8 g，22 mmol）脫保護，產生3.68 g（95%）柱純化材料游離酸14-34。 方案 29. 脂質 27 的合成 [0731]在室溫下，透過使用在10.0 mL DCM中的EDCI（1.06 g，2.5當量，5.5 mmol）、DIPEA（0.71 g，2.5當量，5.5 mmol）和DMAP（54 mg，0.2當量，0.4 mmol），使用酸中間體14-34（1.74 g，2.5當量，5.5 mmol）來醯化二羥基丙酮13-10（200 mg，1.0當量，6 mmol），反應隔夜，以獲得酮14-35。將粗產物透過柱層析法純化，以獲得1.27 mg（76%）純14-35。在室溫下，透過使用在15 mL DCM中的乙酸（0.19 g，2.0當量，3.1 mmol）和Na(OAc) 3BH（0.50 g，1.5當量，2.3 mmol），將14-35（1.26 mg，1.0當量，1.5 mmol）用胺15-3（0.32 g，2.0當量，3.1 mmol）進行還原胺化3小時，產生中間體14-36（330 mg，34%）。 [0732]在室溫下，經2小時，使用在4 mL甲苯中的草醯氯（0.48 g，3.4當量，3.8 mmol）和DMF（20 µL，催化量），將來自先前批次的化合物13-31（290 mg，1.1 mmol）轉化為相應的醯氯13-31'。在室溫下，透過使用在5 mL甲苯中的TEA（0.26 mL，5.0當量，1.8 mmol），將粗品13-31’（0.29 g，3.0當量，1.1 mmol）用於14-36（330 mg，1.0當量，0.3 mmol）的N-醯化，反應隔夜，以獲得柱純化的＞ 98%純度（HPLC-CAD）的脂質20（180 mg，43%）。 [0733]關於脂質27 NMR譜和反相LC-CAD層析圖，參見圖4AE-1和圖4AE-2；關於產物質量，參見表5。   脂質 28 的合成 [0734]如下文方案30中所提供地並且如下合成脂質28。如上所述地產生中間體14-36（參見脂質27的合成）。 方案 30. 脂質 28 的合成 [0735]透過使用在2 mL THF和5 mL DCM的混合物中的 13-30（1.53 g，2.0當量，15.3 mmol）、DMAP（0.93 g，1.0當量，7.6 mmol）和2 mL吡啶，透過將起始材料3-羥基辛醇14-1用琥珀酸醯化來產生酸中間體14-2，以獲得1.1 g（64%）14-2。在室溫下，經2小時，使用在3 mL甲苯中的草醯氯（0.651 g，5.13 mmol，3.4當量）和DMF（40 µL，催化量），將14-2（348 mg，1.51 mmol）轉化為相應的醯氯14-2''。在室溫下，透過使用在6 mL甲苯和2.5 mL DCM中的TEA（0.41 mL，2.94 mmol，6.02當量），將粗品14-2'（0.348 g，1.51 mmol，3.1當量）用於14-36（430 mg，1.51）的N-醯化，反應隔夜，以獲得柱純化（用DCM中的10%甲醇洗脫）的85%純度（HPLC-CAD）的脂質20（148 mg，28%）。第二次柱純化（用在DCM中的5%甲醇洗脫）產生115 mg 94%純度（HPLC-CAD）產物。 [0736]關於脂質27 NMR譜，參見圖4AF-1；關於脂質28反相LC-CAD層析圖，參見圖x4AF-2；關於產物質量，參見表5。   脂質 29 的合成 [0737]在室溫下，透過使用在30 mL DMF中的HATU（8.1 g，1.5當量，21.2 mmol）、DBU（4.3 g，2.0當量，28.3 mmol），將苄基保護的蘋果酸14-4（14.1 mmol，3.18 g，1當量）用 N-癸酸 14-12（3.86 g，1.5當量，21.2 mmol）醯化，反應隔夜，產生1.9 g（36%）受保護的中間體酯 14-13。在室溫下，將中間體 14-13（5.2 mmol，1.9 g，1當量）用在20 mL甲苯中的己醯氯 14-6（2.8 g，4.0當量，20.8 mmol）、TEA（2.63 g，5.0當量，26.0 mmol）、DMAP（127 mg，0.2當量，1.0 mmol）醯化，反應隔夜，以獲得中間體 14-14（630 mg，26%）。在室溫下，使用在15 mL乙酸乙酯中的 Pd/C（260 mg，32% w/w），使中間體 14-14（2.8 mmol，1.3 g，1.0當量）脫保護隔夜，產生1.025 g（98%）酸中間體 14-15。 方案 31. 脂質 29 的合成 [0738]在室溫下，經2小時，使用在6.0 mL甲苯中的草醯氯（0.82 mL，3.4當量，9.1）和DMF（100 µL，催化量），將酸中間體 14-15（2.6 mmol，1.0 g，1當量）轉化為相應的醯氯14-15’，並通過TLC確認轉化為氯化物中間體。 [0739]在室溫下，透過使用在4.0 mL THF中的HF-吡啶（0.71 mL，10.0當量，7.2 mmol），受保護的中間體13-3（0.72 mmol，300 mg），隔夜，並且在室溫下，將粗二羥基中間體 13-4（195 mg，0.46 mmol，1當量）和粗醯氯 14-15'（1.097 g，6.0當量，2.7 mmol）與在5 mL甲苯中的TEA（0.64 mL，10.0當量，4.6 mmol）合併，隔夜。將粗產物通過ISCO柱層析法在矽膠柱上純化，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫，以獲得270 mg（51%）的＞ 99%純度（HPLC-CAD）的脂質29。（關於通過質子NMR和LC-CAD純度進行的表徵，參見圖4AG-1和圖4AG-2；關於質譜資料，參見表5）。   脂質 31 的合成 [0740]如下文方案32中所提供地並且如下合成脂質31。透過使用在150 mL DCM中的吡啶（80 mmol，10.1 ml，1.2當量），將起始材料15-1（68 mmol，10 g，1當量）用對甲苯磺醯氯（70 mmol，13.3 g，1.03當量）處理，以獲得受保護的中間體15-2。將粗產物在乙酸乙酯和己烷中重結晶，產生20.4 g（99%）純中間體15.2。透過使15-2（16.5 mmol，5 g，1.2當量）和二胺15-3（33 mmol，3.35 g，2當量）在40 mL二噁烷中在回流條件下反應來獲得中間體15-4。將粗產物透過柱層析法純化，以獲得3.5 g（91%）純中間體15-4。透過使用在10 mL DCM中的EDCI（0.67 mmol，128 mg，2.5當量）、DIEA（0.67 mmol，86 mg，2.5當量）和DMAP（3 mg），使用壬酸13-12（0.67 mmol，106 mg，2.5當量）將15-4（108 mg，0.268 mmol）進行N-醯化，產生胺15-5。將粗產物透過柱層析法純化，以獲得113 mg（65%）純化的二胺15-5。透過在室溫下使15-5（113 mg）在4 mL的1M HCl和THF（1:3 v/v）中脫保護8小時，來獲得定量產率（102 mg）的二醇中間體15-6。透過使用EDCI（0.9 mmol，172 mg，3當量）、DIPEA（0.9 mmol，116 mg）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體15-6（0.3 mmol，100 mg，1當量）用亞油酸1-5（0.9 mmol，250 mg，3當量）醯化，以獲得脂質31。將粗產物通過柱層析法純化，產生120 mg（46%）純脂質31（透過LC-ELSD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質31 NMR譜，參見圖4R-1；關於脂質31 LC-MS，參見圖4R-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 32. 脂質 31 的合成 脂質 32 的合成 [0741]如下文方案33中所提供地並且如下合成脂質32。如上文（步驟1和2，方案30）針對脂質31所述地產生中間體15-4。透過使用在100 mL DCM中的EDCI（10.85 mmol，2.07 g，2.5當量）、DIEA（10.85 mmol，1.40 g，2.5當量）和DMAP（10 mg），使用2-乙基庚酸13-13（10.85 mmol，1.71 g，2.5當量）將15-4（4.34 mmol，1 g，1.0當量）進行N-醯化，產生胺15-7。將粗產物透過柱層析法純化，以獲得724 mg（52%）純化的二胺15-7。透過在室溫下使15-7（714 mg）在3 mL的1M HCl和7 mL THF中脫保護1小時，來獲得定量產率的二醇中間體15-8。透過使用EDCI（6.49 mmol，1.23 g，3.4當量）、DIPEA（6.49 mmol，830 mg，3.4當量）和DMAP（20 mg，催化量），將中間體15-8（1.9 mmol，630 mg，1當量）用亞油酸1-5（6.49 mmol，1.82 g，3.4當量）醯化，以獲得脂質32。將粗產物透過柱層析法純化（4次），產生27 mg（%）純級分脂質32（透過LC-ELSD得到＞ 98%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質32 NMR譜，參見圖4S-1；關於脂質32 LC-MS，參見圖4S-2；關於產物質量，參見表5）。 方案33. 脂質 32 的合成 脂質 33 的合成 [0742]如下文方案34中所提供地並且如下合成脂質33。透過使用在200 mL DCM中的TEA（19.01 mL，4當量，137 mmol）和DMAP（30 mg），使用對甲苯磺醯氯TsCl（6.52 g，1當量，34.3 mmol）將起始材料15-1（34.3 mmol，5 g，1當量）進行甲苯磺酸化。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得10.2 g（98%）反應性中間體15-2。將15-2（10.0 mmol，2.3 g，1當量）與二胺15-9（9.24 mmol，1.0 mL，1.2當量）在10 mL二噁烷（10 mL）中進行親核置換，產生1.6 g（97%）化合物15-10。使用另外的15-2（8.3 mmol，2.5 g，1當量）和二胺15-9（9.9 mmol，1.1 mL，1.2當量）在50 mL二噁烷中重複親核置換反應，以獲得另外量的化合物15-10。將來自這兩個反應的粗產物透過柱層析法純化，以獲得總共1.7 g（約50%）純15-10。使用在8 mL DCM中的EDCI（1.4 g，1.8當量，7.1 mmol）、DIPEA（1.3 mL，1.8當量，7.1 mmol）和DMAP（90 mg，0.2當量，0.81 mmol），將15-10（4.05 mmol，875 mg，1當量）用壬酸13-12（7.1 mmol，1.24 mL，1.8當量）進行N-醯化，產生中間體15-11。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得230 mg（16%）純中間體15-11。使15-11（0.64 mmol，230 mg，1當量）在5 mL的於二噁烷中的4M HCl中脫保護，產生中間體15-12。將粗產物透過柱層析法純化（1次），以獲得74 mg（37%）純中間體15-12。透過使用在5 mL DCM中的EDCI（120 mg，2.5當量，0.58 mmol）、DIPEA（102 µL，2.5當量，0.58 mmol）和DMAP（6 mg，0.2當量，0.048 mmol），將中間體15-12（0.24 mmol，74 mg，1當量）用亞油酸1-5（169 mg，2.5當量，0.58 mmol）醯化，以獲得脂質33。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得64 mg（32%）純脂質33（透過LC-ELSD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質33 NMR譜，參見圖4T-1；關於脂質33 LC-MS，參見圖4T-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 34. 脂質 33 的合成 脂質 34 的合成 [0743]如下文方案35中所提供地並且如下合成脂質34。如針對脂質33所述地獲得中間體15-2。將15-2（3.3 mmol，1 g，1當量）與二胺15-13（3.9 mmol，0.46 mL，1.2當量）在6 mL二噁烷（10 mL）中進行親核置換，產生520 mg（64%）化合物15-14。重複反應以獲得另外400 mg純化合物15-14。使用在10 mL DCM中的EDCI（5.3 mmol，1.06 g，2.0當量）、DIPEA（923 µL，2.0當量，5.3 mmol）和DMAP（58 mg，0.2當量，0.05 mmol），將15-14（2.6 mmol，620 mg，1當量）用壬酸13-12（5.3 mmol，915 µL，2.0當量）進行N-醯化，產生中間體15-15。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得355 mg（35%）純中間體15-15。使15-15（1.03 mmol，355 mg，1當量）在7 mL的於二噁烷中的4M HCl中脫保護，產生中間體15-16。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得40 mg（13%）純中間體15-16。透過使用在10 mL DCM中的EDCI（55 mg，2.5當量，0.29 mmol）、DIPEA（3.2 µL，2.5當量，0.29 mmol）和DMAP（2 mg，0.2當量，0.05 mmol），將中間體15-16（0.116 mmol，40 mg，1當量）用亞油酸1-5（81 mg，2.5當量，0.29 mmol）醯化，以獲得脂質34。將粗產物透過柱層析法純化（2次），以獲得73 mg（73%）純脂質34（通過LC-ELSD得到＞ 99%純度），並透過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質34 NMR譜，參見圖4U-1；關於脂質34 LC-MS，參見圖4U-2；關於產物質量，參見表5）。 方案 35. 脂質 34 的合成 脂質 35 的合成 [0744]如下文方案36中所提供地合成脂質35。 方案 36. 脂質 35 的合成 脂質 36 的合成 [0745]如下文方案37中所提供地合成脂質36。 方案 37. 脂質 36 的合成 脂質 37A 的合成 [0746]在室溫下，透過使用在8 mL DMF中的HATU（2.93 g，1.5當量，7.7 mmol）和DBU（1.56 g，2.0當量，10.3 mmol），將苄基保護的丙二酸13-32（5.1 mmol，1.0 g，1當量）用正己醇（0.78 g，1.5當量，7.7 mmol）酯化16小時，產生0.5 g（35%）受保護的中間體酯 14-9。使用相同的反應條件和試劑化學計量的第二個5 g規模批次產生另外6 g（84%）中間體14-9。經由將溴乙醯溴13-35用正癸醇醯化來產生中間體14-18。 [0747]在室溫下，透過使用在40 mL DMFat中的氫化鈉NaH（1.0 g，1.2當量，26.0 mmol），將中間體 14-9（21.6 mmol，6 g，1當量）用 14-18（7.2 g，1.2當量，26.0 mmol）烷基化，反應隔夜，以獲得受保護的中間體 14-19（2.5 g，25%）。在室溫下，使用在30 mL乙酸乙酯中的 Pd/C（500 mg，32% w/w），使中間體 14-19（2.5 g，1.0當量）脫保護隔夜，產生2.02 g（99%）酸中間體 14-20。 方案 38. 脂質 37A 的合成 [0748]在室溫下，經2小時，使用在6.0 mL甲苯中的草醯氯（0.79 mL，3.4當量，9.2 mmol）和DMF（100 µL，催化量），將酸中間體 14-20（2.7 mmol，1.05 g，1當量）轉化為相應的醯氯 14-20'，並透過TLC確認轉化為氯化物中間體。 [0749]在室溫下，透過使用在16.0 mL甲苯中的TEA（2.18 mL，10.0當量，15.7 mmol），使中間體13-4（1.57 mmol，195 mg）與粗品14-20'（2.83 g，6.0當量，9.4 mmol）反應隔夜。將粗產物透過ISCO柱層析法在矽膠柱上純化兩次，其中用DCM和在DCM中的10% MeOH洗脫，以獲得205 mg（38%）的＞ 99%純度（HPLC-CAD）的脂質37A。（關於透過質子NMR和LC-CAD純度進行的表徵，參見圖4AH-1和圖4AH-2；關於質譜資料，參見表5）。 實例 2. 使用示例性可電離脂質，透過微流體混合來製備 LNP [0750]使用實例1中合成的陽離子脂質9和陽離子脂質15來產生示例性LNP。 [0751]透過使用線上微流體混合方法將mRNA水溶液和乙醇脂質摻合物溶液（含有脂質比率如表6所示的可電離脂質、DSPC、DPG-PEG和膽固醇）混合來製備包封mRNA有效載荷的LNP。將mRNA（編碼eGFP的mRNA，TriLink Biotechnologies，美國加利福尼亞州）儲備溶液（1 mg/mL）在pH 4乙酸鹽緩衝液中在21.7 mM pH 4乙酸鹽緩衝液中稀釋（產生133 µg/mL mRNA溶液）。將脂質組分以下表6中所示的相對比率溶解在無水乙醇中。 表6
脂質 來源 脂質與 mRNA 的比率 (nmol 脂質 /100 µg mRNA) 在脂質 溶液中的濃度 (mM) 理論 LNP 脂質組成 (mol%)
可電離陽離子脂質 - 1,500 6 49.2
膽固醇 Dishman，荷蘭 1,200 4.8 39.4
DSPC Avanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州 300 1.2 9.8
DPG-PEG(2000) NOF America，美國紐約 46 0.18 1.5
DiIC18(5)-DS Invitrogen，美國麻塞諸塞州 1.8 0.007 0.06
[0752]使用來自Precision Nanosystems Inc.（加拿大不列顛哥倫比亞省）的NanoAssemblr Ignite微流體混合裝置（產品型號NIN0001）和NxGen混合柱體（產品型號NIN0002）混合mRNA和脂質溶液。簡而言之，將mRNA和脂質溶液各自載入到單獨的聚丙烯注射器中。將混合柱體插入NanoAssemblr Ignite中，並且將注射器定向安裝到混合柱體的魯爾埠上。然後使用NanoAssemblr Ignite，以9 mL/min的總流速以3：1 v/v比的mRNA溶液（1.5 mL）與脂質溶液（0.5 mL）混合這兩種溶液。將所得的懸浮液保持在室溫至少5分鐘，然後進行乙醇去除和緩衝液交換。 [0753]在混合後，使用不連續滲濾方法對所得的LNP懸浮液進行乙醇去除和緩衝液交換。將具有100,000 kDa MWCO再生纖維素膜的離心超濾裝置（Amicon Ultra-15，MilliporeSigma，美國麻塞諸塞州）用70%乙醇溶液消毒，然後用HBS交換緩衝液（具有150 mM NaCl的25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）洗滌兩次。然後將LNP懸浮液（2 mL）載入到裝置中並以500 RCF離心，直到體積減少一半（1 mL）。然後將懸浮液用交換緩衝液（1 mL，25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）稀釋，使懸浮液恢復到原來的體積。將這種兩倍濃縮和兩倍稀釋的方法再重複五次，總共進行六個不連續滲濾步驟。然後透過用MBS稀釋十倍並以500 RCF離心直至體積減少十分之一，將LNP懸浮液交換到MBS（具有150 mL NaCl的25 mM pH 6.5 MES緩衝液）中。將用MBS稀釋十倍和濃縮十倍的步驟再重複一次。從離心超濾裝置中回收在MBS中的含有LNP的滲餘物，並且將其在4ºC儲存直到進一步使用。   實例 3. LNP 的表徵 [0754]本實例描述了在實例2中產生的LNP的表徵。 [0755]表徵了實例2中產生的LNP樣品，以確定平均流體動力學直徑、ζ電位和mRNA含量（總mRNA和染料可及mRNA）。使用Zetasizer型號ZEN3600（Malvern Pananalytical，英國）透過動態光散射（DLS）確定流體動力學直徑。使用Zetasizer透過鐳射多普勒電泳在5 mM pH 5.5 MES緩衝液和5 mM pH 7.4 HEPES緩衝液中測量ζ電位。 [0756]使用Thermo Fisher Quant-iT RiboGreen RNA測定套組測量奈米顆粒的RNA含量。透過以下方式來測量染料可及RNA（其包括未包封的RNA和可到達LNP表面的RNA兩者）：使用HEPES緩衝鹽水將奈米顆粒稀釋至大約1 µg/mL mRNA，然後將Quant-iT試劑添加到混合物中。透過以下方式來測量總RNA含量：透過在HEPES緩衝鹽水中的0.5%曲通（Triton）溶液中稀釋所述儲備LNP批次（通常為≥ 40 ug/mL RNA）來破壞奈米顆粒懸浮液，以獲得1 ug/mL RNA溶液（基於調配物輸入值的最終標稱濃度），隨後在60ºC加熱30分鐘，然後添加Quant-It試劑。透過測量485/535 nm處的螢光來量化RNA，並且相對於同時運行的RNA標準曲線確定濃度。結果示於表7中。 表7
調配物編號 可電離脂質 DLS Z-平均直徑(nm) DLS PDI 在pH 5.5下的ζ電位 (mV) 在pH 7.4下的ζ電位 (mV) 染料可及mRNA(%)
1 陽離子脂質9 95 0.07 17 0.0 5
2 陽離子脂質15 98 0.06 20 0.3 5
實例 4. 製備 Fab 接合物以實現 T 細胞靶向 [0757]本實例描述了示例性脂質-免疫細胞靶向基團接合物的產生。 [0758]經由馬來醯亞胺基團與重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價連接使抗CD3 Fab（具有小鼠λ和人類λ的hSP34）（參見下面的胺基酸序列）與DSPE-PEG(2k)-馬來醯亞胺連接。也使用本文所述的類似方法連接抗CD3 Fab殖株Hu291、抗CD8 Fab殖株TRX2、抗CD8 Fab殖株OKT8、非功能性突變型OKT8（mutOKT8）、來自伊巴珠單抗序列的抗CD4 Fab、抗CD5 Fab殖株He3、抗CD7 Fab殖株TH-69、抗CD2 Fab殖株TS2/18.1、抗CD2 Fab殖株9.6、具有人類κ的抗CD2 Fab殖株9-1。在緩衝液交換到無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中後，將蛋白質（3-4 mg/mL）在無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中的2 mM TCEP中在室溫下還原1小時。使用7 kDa SEC柱分離還原的蛋白質以去除TCEP，並且緩衝液交換到新鮮的無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中。 [0759]透過添加在無氧pH 5.7檸檬酸鹽緩衝液（1 mM檸檬酸鹽）中的DSPE-PEG-馬來醯亞胺（Avanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州）和30 mg/mL DSPE-PEG-OCH 3（vanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州）的10 mg/mL膠束懸浮液（根據蛋白質，使用1：1至1：3的重量比）來啟動接合反應。使用10 kDa再生纖維素膜將蛋白質溶液濃縮至3-4 mg/mL，隨後使用40 kDa尺寸排阻柱進行緩衝液交換到無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中。在37ºC使用2-4 mg/mL蛋白質和3.5莫耳過量的馬來醯亞胺進行接合反應持續2小時，然後在室溫下再培育12-16小時。 [0760]透過HPLC監測所得的接合物的產生，並且將反應在2 mM半胱胺酸中淬滅。使用pH 7.4 HEPES緩衝鹽水（25 mM HEPES、150 mM NaCl）緩衝液、使用100 kDa Millipore再生纖維素膜過濾分離所得的接合物（DSPE-PEG(2k)-抗hSP34 Fab），並且在使用前在4ºC儲存。在淬滅後，最終的膠束組成物由DSPE-PEG-Fab、DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）和DSPE-PEG-OCH 3的混合物組成。這三種組分的比率是DSPE-PEG-Fab:DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）：DSPE-PEG-OCH 3= 1：2.45：3.45-10.35（按莫耳計）。 [0761]透過ELISA測定測得，所得的接合物顯示出與未接合的抗CD3 Fab相當的與重組恆河猴CD3ε的結合。 抗CD3 hSP34-Fab序列： hSP34 HC（SEQ ID NO: 1）： EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC hSP34-mlam LC（小鼠λ）（SEQ ID NO: 2）： QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADSS SP34-hlam LC（人類λ）（SEQ ID NO: 3）： QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAESS 抗CD8 TRX2-Fab序列： TRX2 HC（SEQ ID NO: 6）： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDFGMNWVRQAPGKGLEWVALIYYDGSNKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHYDGYYHFFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC TRX2 LC（SEQ ID NO: 7）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKGSQDINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNTDILHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCYQYNNGYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES 抗CD8 OKT8-Fab序列： OKT8 HC（SEQ ID NO: 8）： QVQLVQSGAEDKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGYGYYVFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC OKT8 LC（SEQ ID NO: 9）： DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQEKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES mutOKT8-Fab序列： mutOKT8 HC（SEQ ID NO: 22）： QVQLVQSGAEDKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGAGAYVFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTC mutOKT8 LC（SEQ ID NO: 23）： DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISAALAWYQEKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES   實例 5. 含有 T 細胞靶向基團的 LNP 的製備 [0762]本實例描述了將免疫細胞靶向接合物摻入預成型的LNP中。 [0763]將來自實例2的LNP和使用實例4中所述的方法製備的接合物（抗CD3（hSP34）和抗CD8（TRX-2）接合物）如表8中所示在Eppendorf管中合併，並且以2,500 rpm渦旋10秒。將Eppendorf管在37ºC以300 rpm置於ThermoMixer中，持續4小時。隨後將所得的靶向性LNP懸浮液儲存在4ºC直至使用，或者可替代地在透過使用適當體積的50 wt.%蔗糖儲備溶液（在HEPES緩衝鹽水中；25 mM HEPES、150 mM NaCl）進行稀釋而重構成最終蔗糖濃度為9.6 wt.%的蔗糖培養基之後，冷凍儲存並在-80ºC冷凍儲存。 表8
nmol總脂質/mg RNA 靶向性LNP g中的目標FAb密度(Fab/mol脂質) FAb mg/mg RNA LNP中的RNA濃度(mg/mL) FAb接合物濃度(mg/mL) Fab mg/mL LNP LNP mL/mL Fab
30,460 9 0.274 0.45 1.46 0.123 11.8
30,460 3 0.091 0.45 1.46 0.041 35.5
實例 6. 使用示例性可電離脂質，透過微流體線上混合和切向流過濾來製備 LNP [0764]本實例描述了使用可縮放單元操作（即線上微流體混合，然後是切向流過濾（TFF）用於乙醇去除和緩衝液交換）製備LNP。使用DLin-KC3-DMA或脂質15作為可電離脂質來製備單獨的LNP批次。 [0765]透過使用線上微流體混合方法將mRNA水溶液和乙醇脂質摻合物溶液混合來製備包封mRNA有效載荷的LNP。將mRNA（編碼eGFP或mCherry的mRNA，TriLink Biotechnologies，美國加利福尼亞州）儲備溶液在pH 4乙酸鹽緩衝液中在65 mM pH 4乙酸鹽緩衝液中稀釋（產生400 µg/mL mRNA溶液）。將脂質組分以下表9.1中所示的相對比率溶解在無水乙醇中。 表9.1
脂質 來源 脂質與 mRNA 的比率 (nmol 脂質 /100 µg mRNA) 在脂質 溶液中的濃度 (mM) 理論 LNP 脂質組成 (mol%)
可電離陽離子脂質 - 1,500 18.0 49.2
膽固醇 Dishman，荷蘭 1,200 14.4 39.4
DSPC Avanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州 300 3.6 9.8
DPG-PEG(2000) NOF America，美國紐約 46 0.55 1.5
[0766]使用來自Precision Nanosystems Inc.（加拿大不列顛哥倫比亞省）的NanoAssemblr Ignite微流體混合裝置（產品型號NIN0001）和NxGen混合柱體（產品型號NIN0002）混合mRNA和脂質溶液。簡而言之，將mRNA和脂質溶液各自載入到單獨的聚丙烯注射器中。將混合柱體插入NanoAssemblr Ignite中，並且將注射器定向安裝到混合柱體的魯爾埠（luer port）上。然後使用NanoAssemblr Ignite以9 mL/min的總流速以3：1 v/v比的mRNA溶液與脂質溶液混合這兩種溶液。將所得的懸浮液保持在室溫至少5分鐘，然後進行乙醇去除和緩衝液交換。隨後使用恆定體積切向流過濾（TFF）進行乙醇去除和緩衝液交換。 [0767]在混合後，使用中空纖維TFF模組（具有300 kDa MWCO的mPES膜，Repligen，美國）對所得的LNP懸浮液進行乙醇去除和緩衝液交換。簡而言之，在使用前，將TFF模組用DI水沖洗並抽乾。經選擇用作滲濾緩衝液的緩衝液取決於LNP調配物中的可電離脂質。對於DLin-KC3-DMA LNP，使用具有150 mM NaCl的25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液（HBS）作為滲濾緩衝液。對於脂質15 LNP，使用具有150 mM NaCl的25 mM pH 6.5 MES緩衝液（MBS）作為滲濾緩衝液。將乙醇/水溶液中的LNP混合物添加到儲器中，啟動TFF模組，並透過以下方式來啟動滲濾：使蠕動泵斜升到目標流速並調節滲餘物閥直到達到目標跨膜壓力（TMP）。一旦啟動滲濾，系統的目標指令引數為8000 s -1的剪切速率和3.5 psi的TMP。在整個滲濾過程中，透過調整滲餘物閥使TMP保持恆定。監測滲透通量，其在整個滲濾過程中＞ 20 LMH。進行六次滲濾交換體積，在每次滲濾體積完成時將樣品放在一邊，以便稍後跟蹤緩衝液交換過程。最終乙醇含量≤ 0.1%，如透過對滲透樣品進行折射率測量所測量的，並且pH測量確認了緩衝液交換到所需滲濾緩衝液中。在完成六次滲濾體積後，隨後對所得的LNP懸浮液進行濃縮。 [0768]使用在緩衝液交換過程期間使用的相同TFF模組進行LNP懸浮液的濃縮，濃縮至約0.8 mg/mL的目標總mRNA濃度。維持緩衝液交換過程期間的TMP和流速，並通過停止向滲余物儲器中添加滲濾緩衝液來使懸浮液濃縮。收集所得的LNP懸浮液並用0.2 µm注射器過濾器過濾。出於分析目的對懸浮液進行取樣，然後將其在4ºC儲存直到進一步使用。 [0769]使用實例3中的LNP表徵方法，表徵LNP批次以確定平均流體動力學直徑和mRNA含量（總的和染料可及的）；示於下表9中。如在表9.2中所見，微流體混合方法與通過TFF進行的乙醇去除和緩衝液交換得到展現窄的多分散性和良好的mRNA包封（＜ 20%的染料可及RNA）的低於100 nm的顆粒。 表9.2
樣品ID/批號 描述 DLS Z-平均直徑(nm) DLS PDI 總mRNA含量(µg/mL) 染料可及mRNA含量(µg/mL) 染料可及mRNA(%)
EXP22001562-NF40 在HBS中進行6次DV後的DLin-KC3-DMA LNP 85 0.07 846 115 14
EXP22007940-NU400 在MBS中進行6次DV後的脂質15 LNP 69 0.14 990 161 16
實例 7. 使用甲苯胺基 - 萘磺酸鹽（ TNS ）螢光探針測定 LNP 表觀 pKa 的方法 [0770]本實例描述了用於測量脂質奈米顆粒的表觀pK a的基於螢光染料的方法。表觀pK a決定了在生理pH條件下的奈米顆粒表面電荷，通常在內體pH範圍（6-7.4）內的pKa值導致LNP在血漿或細胞外空間（pH 7.4）呈中性或微帶電，並且在酸性內體環境下變為強陽性。這種正表面電荷驅動LNP表面與帶負電荷的內體膜的融合，導致內體區室失穩和破裂並且LNP逃逸到胞質區室中，這是經由細胞核糖體機器的接合進行胞質遞送mRNA和蛋白質表現的關鍵步驟。 [0771]透過在覆蓋一定範圍的pH值（pH 4至pH 10）的水性緩衝液中進行6-(對甲苯胺基)-2-萘磺酸（TNS）螢光測量來測定LNP的表觀pK a。TNS染料當在溶液中游離時不發螢光，但是在與帶正電荷的脂質奈米顆粒締合時會發出強烈的螢光。在低於奈米顆粒的pK a的pH值下，正LNP表面電荷導致染料在顆粒介面處募集，產生TNS螢光。在高於LNP pK a的pH值下，LNP表面電荷被中和，並且TNS染料與顆粒介面解離，導致螢光信號損失。LNP的表觀pK a被報告為螢光達到其最大值的50%時的pH，如使用四點邏輯曲線擬合所確定的。   實例 8. 包封 mRNA 的基於脂質 1-8 、 9-15 和 31-34 的 LNP 的通用調配物和理化表徵方法 [0772]透過以下方式調配帶有核酸（報告RNA或CAR RNA）的脂質奈米顆粒（LNP）：使用以上實例2和6中所述的脂質和溶劑成分進行微流體混合方法，並使用離心超濾膜過濾裝置或切向流過濾（TFF）方法將緩衝液交換到pH 7.4 HEPES緩衝鹽水中（導致乙醇去除和pH調節）；並透過動態光散射（DLS）表徵流體動力學大小（直徑，nm）、多分散性（PDI）以及在pH 5.5和pH 7.4下的電荷（ζ電位，mV）。使用實例3中所述的方法測定mRNA包封效率（染料可及RNA的百分比）和總mRNA含量（LNP懸浮液中的ug/mL RNA）。隨後將調配的LNP進行緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝鹽水中，並且在與所需量的靶向抗體接合物（參見表8，實例5）混合之前，透過DLS重新表徵大小分佈並在37ºC培育4小時以促進抗體插入（使用實例5中所述的方法），產生最終的抗體靶向性LNP。對獲得的靶向性LNP進行無菌過濾並使用實例3中所述的方法通過DLS進行表徵（大小（nm）和PDI）。   實例 9. 脂質 1-8 GFP RNA 脂質奈米 顆粒（ LNP ）的理化特性（ α CD3 Fab 接合物 hSP34 插入之前和之後） [0773]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP-mRNA（TriLink Biotechnologies Inc.）或CAR-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質1、2、3、4、5、6、7和8 LNP。表10至表12中總結了脂質1-8 LNP和使用比較可電離脂質（包括MC3、KC2、SM-102和ALC-0315）製備的LNP的經測量的LNP大小、PDI、電荷和RNA含量值。如圖5A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中導致脂質1-8 LNP的大小在80-120 nm的範圍內。所有脂質導致高包封效率（＜ 15%染料可及RNA）和＞ 70% RNA回收率。隨後的緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝液中以及抗體插入過程（37ºC，4小時）被脂質2、3、6、7和8 LNP良好耐受，這導致靶向性LNP直徑低於140 nm且PDI ＜ 0.2。脂質1和4 LNP展現相對較大的大小變化，導致最終的靶向性LNP在140至160 nm直徑範圍內，然而對於所有測試的脂質，粒徑分佈保持狹窄和單峰。脂質5 LNP展現最大的大小變化，最終的靶向性LNP展現＞ 160 nm直徑。在一個凍融循環後，脂質1、2、6、7和8未展現顯著的大小和多分散性變化，然而，觀察到基於脂質3、4和5的LNP的中等變化。總之，所有測試的脂質導致可行的mRNA包封和凍融穩定性以及＜ 200 nm的最終靶向性LNP直徑。如實例16和17中所述地評價脂質1-8 LNP在由αCD3或αCD8 T細胞受體靶向介導的原代人T細胞中誘導體外蛋白轉染的能力。 表10.在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中以及在αCD3抗體Fab（hSP34）接合物插入後，脂質1-8和比較型脂質LNP的大小、多分散性（DLS）資料
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；插入後；MBS Z-平均大小(nm)；F/T後 多分散性(DLS)；HBS 多分散性(DLS)；MBS 多分散性(DLS)；插入後；MBS 多分散性(DLS)；F/T後
脂質1，DPG-PEG；EXP22001910-NL 98.78 124.3 146.2 145.5 0.08 0.128 0.11 0.14
脂質2，DMG-PEG；EXP21002182-N3 105.4 103.95 116.5 110.5 0.136 0.142 0.133 0.15
脂質2，DPG-PEG；EXP21002182-N4 107 105 115.2 115.1 0.104 0.072 0.112 0.1
脂質2，DPG-PEG；EXP21002340-N5 94 101.3 114.7 114.8 0.07 0.07 0.16 0.127
脂質3，DMG-PEG；EXP21003471-N5 98.1 107.8 111.8 0.11 0.1 0.095
脂質3，DPG-PEG；EXP21003471-N4 85.3 93.7 110.4 0.07 0.08 0.16
脂質3，DPG-PEG；EXP21002340-N6 100.7 120.5 131.3 133.3 0.07 0.07 0.08 0.09
脂質3，DPG-PEG；EXP22001910-NC 101.5 110.8 123.6 150.2 0.08 0.09 0.127 0.2
脂質4，DPG-PEG；EXP21003651-N6 79.5 96.3 116.8 128.5 0.04 0.11 0.105 0.18
脂質4，DPG-PEG；EXP22001910-NI 95.5 120.6 155.4 170.3 0.09 0.13 0.137 0.17
表11.在pH 5.5 MES和pH 7.4 HBS中，脂質1-8 LNP的電荷（ζ電位，ZP）（DLS，mV）
可電離脂質，LNP編號 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4
脂質1，DPG-PEG；EXP22001910-NL 19.9 -0.212
脂質2，DMG-PEG；EXP21002182-N3 25.3 3.64
脂質2，DPG-PEG；EXP21002182-N4 23.1 2.03
脂質2，DPG-PEG；EXP21002340-N5 22.8 1.29
脂質3，DMG-PEG；EXP21003471-N5 21.7 1.18
脂質3，DPG-PEG；EXP21003471-N4 17.9 0.776
脂質3，DPG-PEG；EXP21002340-N6 19.6 -2.01
脂質3，DPG-PEG；EXP22001910-NC 23.9 3.99
脂質4，DPG-PEG；EXP21003651-N6 19 -0.508
脂質4，DPG-PEG；EXP22001910-NI 21.6 1.16
脂質5，DPG-PEG；EXP22001910-NM 19.1 -0.742
脂質6，DPG-PEG；EXP21003651-N7 13.5 -1.9
脂質7，DPG-PEG；EXP21003651-N8 10.8 -4.31
脂質8，DPG-PEG；EXP22002705-NO 20.6 0.051
SM-102，DPG-PEG；EXP21003651-N3 12.8 -2.25
ALC-0315，DPG-PEG；EXP21003651-N4 4.25 -2.95
MC-3，DPG-PEG；EXP21003651-N2 12.7 -0.43
KC-2，DPG-PEG；EXP21003651-N1 22.7 1.41
表12.脂質1-8和比較型脂質LNP的染料可及RNA和總RNA含量
可電離脂質，LNP編號 標稱mRNA濃度(µg/mL) 測量的總mRNA(µg/mL) 染料可及mRNA(µg/mL) 總mRNA回收率(%) 染料可及mRNA(%)
脂質1，DPG-PEG；EXP22001910-NL 100 75.5 8.9 75.5 11.8
脂質2，DMG-PEG；EXP21002182-N3 100 134.7 11.1 134.7 8.2
脂質2，DPG-PEG；EXP21002182-N4 100 136.9 9.4 136.9 6.9
脂質2，DPG-PEG；EXP21002340-N5 100 71.8 7.8 71.8 10.9
脂質3，DMG-PEG；EXP21003471-N5 100 83.2 8.1 83.2 9.8
脂質3，DPG-PEG；EXP21003471-N4 100 85.7 6.6 85.7 7.7
脂質3，DPG-PEG；EXP21002340-N6 100 93.5 10.3 93.5 11.0
脂質3，DPG-PEG；EXP22001910-NC 100 74.9 6.5 74.9 8.7
脂質4，DPG-PEG；EXP21003651-N6 50 37.1 4.3 74.2 11.5
脂質4，DPG-PEG；EXP22001910-NI 100 77.6 9 77.6 11.6
脂質5，DPG-PEG；EXP22001910-NM 100 73.4 11.8 73.4 16.1
脂質6，DPG-PEG；EXP21003651-N7 50 34.7 3.3 69.4 9.5
脂質7，DPG-PEG；EXP21003651-N8 50 38.9 4.3 77.8 11.1
脂質8，DPG-PEG；EXP22002705-NO 100 85.9 8.4 85.9 9.8
SM-102，DPG-PEG；EXP21003651-N3 50 28.7 4.3 57.4 15.0
ALC-0315，DPG-PEG；EXP21003651-N4 50 38.1 4.8 76.2 12.6
MC-3，DPG-PEG；EXP21003651-N2 50 36.8 1.8 73.6 4.9
KC-2，DPG-PEG；EXP21003651-N1 50 43 3.6 86 8.4
實例 10. 脂質 9 、 10 、 11 和 15 GFP RNA 脂質奈米 顆粒（ LNP ）的理化特性（ αCD3 Fab 接合物 hSP34 插入之前和之後） [0774]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP-mRNA（TriLink Biotechnologies Inc.）或CAR-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質9、10、11和15 LNP。表13至表15中總結了所得的LNP和使用比較可電離脂質（包括MC3、KC2、SM-102和ALC-0315）製備的LNP的經測量的LNP大小、PDI、電荷和RNA含量值。如圖6A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中導致具有脂質9、10、11和15的LNP的大小≤ 100 nm。所有脂質導致高包封效率（＜ 15%染料可及RNA）和＞ 70% RNA回收率。隨後的緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝液中以及抗體插入過程（37C，4小時）被脂質9、10和15 LNP良好耐受，這導致最終的靶向性LNP直徑低於140 nm且PDI ＜ 0.2。相對於測試的其他脂質，脂質11 LNP在緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝液中以後展現最大的尺寸變化，並且在抗體插入後展現中度較大的尺寸變化。所有四種測試的脂質LNP都穩定到一個凍融循環，其中沒有觀察到LNP直徑或多分散性的顯著變化。總之，所有四種測試的脂質導致可行的mRNA包封和凍融穩定性以及＜ 200 nm的最終靶向性LNP直徑。如實例16和17中所述地評價脂質9、10、11和15 LNP在由αCD3或αCD8 T細胞受體靶向介導的原代人T細胞中誘導體外蛋白轉染的能力。 表13. 在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中以及在αCD3抗體Fab（hSP34）接合物插入後，脂質9、10、11、15 LNP和比較型脂質LNP的大小、多分散性（DLS）資料
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；插入後；MBS Z-平均大小(nm)；F/T後 PDI(DLS)；HBS PDI(DLS)；MBS PDI(DLS)；插入後；MBS PDI(DLS)；F/T後
脂質9；EXP21004287-N2 87.6 102.4 118.9 125.3 0.09 0.11 0.11 0.15
脂質9；EXP22001910-NE 83.9 94.8 105.1 115.1 0.08 0.07 0.12 0.13
脂質10；EXP22002705-NQ 98.6 110.6 119.9 121.5 0.1 0.11 0.12 0.11
脂質11；EXP22002705-NN 101.9 154.6 174.5 162.9 0.14 0.14 0.11 0.12
脂質15；EXP22001910-NP 91.55 97.65 114.8 118.3 0.07 0.06 0.13 0.17
SM-102；EXP21003651-N3 68.4 102.9 125.7 125.6 0.06 0.11 0.13 0.12
ALC-0315；EXP21003651-N4 76.5 103.9 116.7 152.2 0.06 0.09 0.17 0.18
DLin-MC3-DMA；EXP21003651-N2 72.2 92.6 124.8 123.65 0.07 0.07 0.16 0.15
DLin-KC2-DMA；EXP21003651-N1 68.8 93.5 116.8 0.06 0.18 0.36
表14. 在pH 5.5 MES和pH 7.4 HBS中，脂質9、10、11、15脂質和比較型脂質LNP的電荷（ζ電位，ZP）（DLS，mV）
可電離脂質，LNP編號 LNP電荷(ZP，mV)；pH 5.5 LNP電荷(ZP，mV)；pH 7.4
脂質9；EXP21004287-N2 10.1 -2.34
脂質9；EXP22001910-NE 17.2 0.0437
脂質10；EXP22002705-NQ 21 -0.137
脂質11；EXP22002705-NN 16.5 -1.01
脂質15；EXP22001910-NP 19.7 -0.322
SM-102；EXP21003651-N3 12.8 -2.25
ALC-0315；EXP21003651-N4 4.25 -2.95
DLin-MC3-DMA；EXP21003651-N2 12.7 -0.43
DLin-KC2-DMA；EXP21003651-N1 22.7 1.41
表15. 脂質9、10、11、15 LNP和比較型脂質LNP的染料可及RNA和總RNA含量
可電離脂質，LNP編號 標稱mRNA濃度(µg/mL) 測量的總mRNA(µg/mL) 染料可及mRNA(µg/mL) 總mRNA回收率(%) 染料可及mRNA(%)
脂質9；EXP21004287-N2 100 72.3 7.5 72.3 10.4
脂質9；EXP22001910-NE 100 84.4 5.4 84.4 6.4
脂質10；EXP22002705-NQ 100 80.2 6.6 80.2 8.2
脂質11；EXP22002705-NN 100 85.6 13.6 85.6 15.9
脂質15；EXP22001910-NP 100 74.9 5.1 74.9 6.8
實例 11. 脂質 31-34 GFP RNA 脂質奈米 顆粒（ LNP ）的理化特性（ α CD3 Fab 接合物 hSP34 插入之前和之後） [0775]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP-mRNA（TriLink Biotechnologies Inc.）或CAR-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質31、32、33和34 LNP。表16至表18中總結了脂質31、32、33和34 LNP的經測量的LNP大小、PDI、電荷和RNA含量值。如圖7A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中導致具有脂質31、32、33和34的LNP的大小≤ 110 nm。所有LNP展現中等至較高的包封效率（＜ 20%染料可及RNA）和＞ 70% RNA回收率。隨後的緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝液中以及抗體插入過程（37C，4小時）導致最終的靶向性LNP的直徑在120 nm至160 nm範圍內且PDI在0.1至0.25範圍內，這表明脂質31至34 LNP的粒徑控制相對較差。脂質31、32和34 LNP在一個凍融循環後顯示出中等的尺寸增加，然而，觀察到脂質34 LNP的明顯更大的尺寸變化。總之，所有四種測試的脂質導致可行的mRNA包封和凍融穩定性以及＜ 200 nm的最終靶向性LNP直徑。如實例16和17中所述地評價脂質31、32、33、34 LNP在由αCD3或αCD8 T細胞受體靶向介導的原代人T細胞中誘導體外蛋白轉染的能力。 表16.在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中以及在αCD3抗體Fab（hSP34）接合物插入後，脂質31、32、33、34 LNP和比較型脂質LNP的大小、多分散性（DLS）資料
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；插入後；MBS Z-平均大小(nm)；F/T後 多分散性(DLS)；HBS 多分散性(DLS)；MBS 多分散性(DLS)；插入後；MBS 多分散性(DLS)；F/T後
脂質31，DMG-PEG；EXP21002002-N15B 77.1 75.2 159.8 171.7 0.14 0.12 0.21 0.25
脂質31，DMG-PEG；EXP21002179-N15B 79.23 94.3 108.3 ** 0.22 0.18 0.17
脂質32，DMG-PEG；EXP21002179-N15C 78.3 101.4 149.9 ** 0.26 0.17 0.23
脂質33，DPG-PEG；EXP21004287-N3 94.74 103.9 134.8 167.8 0.14 0.09 0.09 0.1
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 92.2 94.1 98.085 125.3 0.21 0.1 0.10 0.14
脂質34，DPG-PEG；EXP21004287-N4 97.31 113.3 155.1 207.5 0.093 0.07 0.13 0.14
** 未測量。 表17. 在pH 5.5 MES和pH 7.4 HBS中，脂質31、32、33、34脂質和比較型脂質LNP的電荷（ζ電位，ZP）（DLS，mV）
可電離脂質，LNP編號 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4
脂質31，DMG-PEG；EXP21002002-N15B 20.5 -0.138
脂質31，DMG-PEG；EXP21002179-N15B
脂質32，DMG-PEG；EXP21002179-N15C
脂質33，DPG-PEG；EXP21004287-N3 19.7 -0.867
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 19.6 1.5
脂質34，DPG-PEG；EXP21004287-N4 15 -1.79
表18. 脂質31、32、33、34 LNP和比較型脂質LNP的染料可及RNA和總RNA含量
可電離脂質，LNP編號 標稱mRNA濃度(µg/mL) 測量的總mRNA(µg/mL) 染料可及mRNA(µg/mL) 總mRNA回收率(%) 染料可及mRNA(%)
脂質31，DMG-PEG；EXP21002002-N15B 50 42.7 3.7 85.4 8.7
脂質31，DMG-PEG；EXP21002179-N15B 50 52.13 2.2 104.26 4.2
脂質32，DMG-PEG；EXP21002179-N15C 50 53.02 7.5 106.04 14.1
脂質33，DPG-PEG；EXP21004287-N3 100 81.2 14.3 81.2 17.6
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 150 116.4 12.8 77.6 110
脂質34，DPG-PEG；EXP21004287-N4 100 70 10.5 70 15
實例 12. 含有脂質 1 、 3 、 4 、 5 、 9 和 15 GFP RNA 的脂質奈 米顆粒（ LNP ）的理化特性（ αCD8 Fab 接合物 TRX-2 和 15C01 插入之前和之後） [0776]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質1、3、4、5、9和15 LNP。表19中總結了在αCD8 fab（TRX-1和15C01）接合物插入之前和之後，脂質1、3、4、5、9和15 LNP的經測量的LNP大小和PDI。如圖8A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中導致具有脂質3、9和15的LNP的大小≤ 120 nm，而緩衝液交換到pH 6.5 MBS中之後脂質5 LNP展現＞ 150 nm的直徑。在兩次αCD8抗體接合物（TRX-2和15C01）插入後以及一個凍融循環後，脂質9和15 LNP均展現最小尺寸（≤ 120 nm）。類似地，在凍融之前和之後，所有最終的αCD8靶向性LNP的多分散性保持＜ 0.2（圖8B）。如實例18和19中所述地評價脂質1、3、4、5、9和15 LNP在由αCD8 T細胞受體靶向性抗體（TRX-2和15C01）介導的原代人T細胞中誘導體外蛋白轉染的能力。 表19. 在αCD8（TRX-1和15C01）靶向性Fab接合物插入之前和之後，脂質1、3、4、5、9和15 LNP的大小和PDI
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；TRX-2插入後；MBS Z-平均大小(nm)；15C01插入後；MBS PDI(DLS)；HBS PDI(DLS)；MBS PDI(DLS)；TRX-2插入後；MBS PDI(DLS)；15C01插入後；MBS
脂質3，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NC 101.5 110.8 117.4 131.0 0.08 0.09 0.116 0.166
脂質9，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NE 83.9 94.8 102.5 108.1 0.08 0.07 0.1255 0.143
脂質4，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NI 95.5 120.6 127.8 133.7 0.09 0.13 0.1325 0.114
脂質1，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NL 98.78 124.25 130.2 133.7 0.08 0.128 0.108 0.123
脂質5，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NM 102.4 161.2 162.3 161.3 0.09 0.13 0.1335 0.095
脂質15；DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NP 91.55 97.65 106.0 115.1 0.07 0.06 0.1415 0.164
實例 13. 含有脂質 1 、 8 、 9 、 10 、 11 和 15 GFP RNA 的脂質奈 米顆粒（ LNP ）的理化特性（ αCD8 （ TRX-2 ） Fab 接合物插入之前和之後） [0777]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質1、8、9、10、11和15 LNP。表20中總結了在αCD8（TRX-2）Fab接合物插入之前和之後，脂質1、8、9、10、11和15 LNP的經測量的LNP大小和PDI。如圖9A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中導致具有脂質8、9、10、11和15的LNP的大小＜ 130 nm，而緩衝液交換到pH 6.5 MBS中之後，脂質1 LNP展現＞ 150 nm的直徑。在兩次αCD8抗體接合物（TRX-2和15C01）插入後以及一個凍融循環後，脂質8、9、10和15 LNP均展現最小大小（≤ 130 nm）。在凍融之前和之後，所有最終的αCD8靶向性LNP的多分散性保持＜ 0.2（圖9B）。如實例16和17中所述地評價脂質1、8、9、10、11和15 LNP在由αCD8 T細胞受體靶向性抗體（TRX-2和15C01）介導的原代人T細胞中誘導體外蛋白轉染的能力。 表20. 在αCD8（TRX-1）靶向性Fab接合物插入之前和之後，脂質1、8、9、10、11和15 LNP的大小和PDI
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；TRX-2插入後；MBS PDI(DLS)；HBS PDI(DLS)；MBS PDI(DLS)；TRX-2插入後；MBS
脂質11，DPG-PEG，TRX-2；EXP22002705-NN 101.5 110.8 155.45 0.08 0.09 0.13
脂質8，DPG-PEG，TRX-2；EXP22002705-NO 83.9 94.8 110 0.08 0.07 0.13
脂質10，DPG-PEG，TRX-2；EXP22002705-NQ 95.5 120.6 120.65 0.09 0.13 0.13
脂質9，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NE 98.78 124.25 114.45 0.08 0.128 0.14
脂質1，DPG-PEG，TRX-2 DPG-PEG；EXP22001910-NL 102.4 161.2 142.75 0.09 0.13 0.14
脂質15，DPG-PEG，TRX-2；EXP22001910-NP 91.55 97.65 114.45 0.07 0.06 0.14
實例 14. 脂質 3 、 4 、 33 和 34 CAR （ TTR-023 ） RNA 脂質奈米 顆粒（ LNP ）的理化特性（ αCD8 Fab 接合物 T8 插入之前和之後） [0778]脂質3、4、33和34 CAR（TTR-023）RNA脂質奈米顆粒（LNP）的理化特性（αCD8 Fab接合物T8插入之前和之後） [0779]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封CAR（TTR-023）RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）的脂質3、4、33和34 LNP。表21、表22和表23中總結了脂質3、4、33和34 LNP的經測量的LNP大小、PDI、電荷和RNA含量值。如圖10A所示，初始混合步驟和隨後的緩衝液交換到HBS中然後交換到MBS中導致具有脂質3和4 的LNP的大小≤125 nm，具有脂質33和34的LNP的大小≤ 100 nm。所有LNP展現中等至較高的包封效率（＜ 15%染料可及RNA）和＞ 70% RNA回收率，其中脂質33和34在回收率方面趨向更好，而在染料可及RNA方面趨向較差（圖10D）。隨後的緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝液中以及抗體插入過程（37C，4小時）導致脂質3和4 LNP的直徑在120 nm至135 nm的範圍內，而脂質33和34有小於100 nm的直徑。類似地，脂質3和4 LNP PDI在0.15至0.21範圍內呈稍高趨勢，而脂質33和34產生PDI ≤ 0.11，這表明了稍好的大小分佈特性。脂質4和34 LNP在一個凍融循環後顯示出中等的大小增加，然而，觀察到脂質3和33 LNP的明顯更大的大小變化。總之，所有四種測試的脂質導致可行的CAR mRNA包封和凍融穩定性以及＜ 150 nm的最終靶向性LNP直徑。如實例16和17中所述地評價脂質3、4、33和34 LNP在由αCD3或αCD8 T細胞受體靶向介導的原代人T細胞中誘導體外CAR蛋白表現的能力。 表21.在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中以及在αCD3抗體Fab（hSP34）接合物插入後，脂質3、4、33、34 LNP的大小、多分散性（DLS）資料
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；HBS Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；插入後；MBS Z-平均大小(nm)；F/T後 多分散性 (DLS)；HBS 多分散性 (DLS)；MBS 多分散性 (DLS)；插入後；MBS 多分散性 (DLS)；F/T後
脂質3，DPG-PEG；EXP21004781-N3 108.6 121.5 131.8 135.5 0.19 0.16 0.15 0.17
脂質4，DPG-PEG；EXP21004781-N5 92.8 110.2 121.7 127.1 0.15 0.17 0.16 0.21
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 92.2 94.1 97.5 116.9 0.21 0.1 0.10 0.18
脂質34，DPG-PEG；EXP21004781-N4 86.3 87.8 93.4 103 0.18 0.09 0.11 0.14
表22.在pH 5.5 MES和pH 7.4 HBS中，脂質3、4、33、34 LNP的電荷（ζ電位，ZP）（DLS，mV）
可電離脂質，LNP編號 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4
脂質3，DPG-PEG；EXP21004781-N3 15.7 0.786
脂質4，DPG-PEG；EXP21004781-N5 11.1 -1.23
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 17.4 1.01
脂質34，DPG-PEG；EXP21004781-N4 19.6 1.5
表23.脂質3、4、33、34 LNP的染料可及RNA和總RNA含量
可電離脂質，LNP編號 標稱mRNA濃度(µg/mL) 測量的總mRNA(µg/mL) 染料可及mRNA(µg/mL) 總mRNA回收率(%) 染料可及mRNA(%)
脂質3，DPG-PEG；EXP21004781-N3 150 107.1 15.5 71.4 14.5
脂質4，DPG-PEG；EXP21004781-N5 150 110.7 14.4 73.8 13.0
脂質33，DPG-PEG；EXP21004781-N6 150 116.4 12.8 77.6 11.0
脂質34，DPG-PEG；EXP21004781-N4 150 119.9 8.2 79.9 6.8
實例 15. LNP 懸浮液的冷凍（和解凍）過程的方法以及凍融後的 LNP 表徵 [0780]將LNP懸浮液與49 wt%蔗糖水溶液和另外的儲存緩衝液（如果需要）混合，以獲得含有大約45 µg/mL的LNP和大約9.6 wt%的蔗糖的最終樣品。然後由含有蔗糖的最終LNP樣品製備在1.5 mL離心管中的大約0.05 mL的等分試樣。然後將等分試樣放入-80ºC的冰箱中至少2 h以冷凍樣品。冷凍後，通過將等分試樣放置在室溫下至少10 min，將其解凍。然後通過以2500 rpm渦旋大約5 s來混合等分試樣。然後如實例3中所述地通過DLS分析解凍的材料的大小。   實例 16. 用 DiI-C18-5DS 標記的 LNP 轉染原代人 T 細胞的方法 [0781]在來自STEMCELL的RoboSep自動細胞分離系統上，使用EasySep人類T細胞分離套組從冷凍的外周血單個核細胞中分離CD3+ T細胞。將T細胞鋪板到圓底96孔板中的補充有glutamax、10%胎牛血清、pen-strep和40 ng/mL IL-2的RPMI細胞培養基中。每個孔以1M個T細胞/mL（100K個T細胞/孔）的密度接種100 μL的細胞懸浮液。使細胞在37ºC培養箱中靜置兩小時，然後透過輕輕添加10 μL的22 μg/mL（按mRNA計）奈米顆粒懸浮液進行轉染，導致最終的mRNA濃度為2 μg/mL（除非另外指出）。將細胞用移液管輕輕混合，然後在37ºC培養箱中培育24小時。在培育後，將細胞用FACS緩衝液（BD 554657）稀釋，並且使用BD Fortessa流式細胞儀進行分析。使用來自BD biosciences的FlowJo軟體分析資料。   實例 17. LNP 轉染後 CD4 和 CD69 染色方案 [0782]在24小時後，將細胞轉移到96孔錐形底聚丙烯板上，並且以350 × g離心5分鐘。除去上清液，並且轉移到新的錐形底聚丙烯板上以進一步分析。透過以下方式洗滌細胞：添加200 μL FACS緩衝液（BD 554657），以350 × g離心5 min，然後從每個孔中吸出上清液。透過向10 mL FACS緩衝液中添加100 μL每種抗體將BV421抗人類CD69（BioLegend 310930殖株FN50）和BV711抗人類CD4（BioLegend 344648殖株SK3）抗體稀釋100倍。將100 μL稀釋的抗體溶液添加到每個孔中，並且將板在室溫下培育20分鐘。然後透過以下方式洗滌板：以350 × g離心5 min，除去上清液，重懸浮在200 μL FACS緩衝液中，以350 × g離心5 min，並且從每個孔中吸出上清液。在洗滌後，將細胞重懸浮在100 μL的1.6%甲醛中，並且在4ºC儲存直到FACS分析。使用配備有高通量採樣器的BD Fortessa進行FACS分析。   實例 18. 人類 IFN-γ ELISA 方法 [0783]使用R&D Duoset IL-2 ELISA套組（PN DY285B）測定IFN-γ。簡而言之：透過向每個孔中添加100 µL的2 µg/mL R&D IL-2捕獲抗體溶液，然後在4ºC將板培育隔夜來塗覆Immulon 2HB 96孔板（Thermo X1506319）。將板用洗滌緩衝液（在pH 7.4 TRIS緩衝鹽水中的0.05吐溫-20，Thermo 28360）洗滌三次，在室溫下用試劑稀釋劑（在洗滌緩衝液中的0.1% BSA）封閉一小時，然後用洗滌緩衝液再洗滌三次。將上清液在試劑稀釋劑中稀釋三倍，然後將100 µL的稀釋上清液添加到每個孔中。透過連續稀釋在同一板上製備IFN-γ標準物。將板在室溫下培育兩小時，用洗滌緩衝液洗滌三次。添加100 µL在試劑稀釋劑中稀釋的檢測抗體，在室溫下培育2小時，然後將板用洗滌緩衝液洗滌三次。添加100 µL的鏈黴親和素-HRP，在室溫下培育20分鐘，然後將板用洗滌緩衝液洗滌三次。添加100 µL的基質溶液（Thermo N301），在室溫下培育20分鐘，然後透過添加100 µL的終止溶液（Invitrogen SS04）淬滅反應。在SpectraMax M5讀板器上讀取450 nm處的光密度。基於同時分析的IFN-γ標準物，相對於標準曲線量化IFN-γ濃度。   實例 19. TTR-023 CAR （ M1 ）染色方案 [0784]將細胞轉移到96孔錐形底板中，並透過以350 x g離心5分鐘然後在FACS緩衝液（BD 554657）中重懸浮而進行洗滌。透過在室溫下用與Alexa Fluor 488（Invitrogen A3750）接合的M1抗Flag抗體（Sigma Aldrich F3040）染色20分鐘來檢測含有FLAG標籤的TTR-023 CAR蛋白。染色後，透過以350 x g離心5分鐘然後在FACS緩衝液中重懸浮而將細胞洗滌兩次。使用BD Fortessa流式細胞儀（BD Biosciences）透過FACS分析細胞。 [0785]M1抗Flag抗體-Alexa Fluor 488接合物的合成和純化程序：使用Zeba 40K MWCO旋轉柱將M1抗FLAG抗體進行緩衝液交換到pH 8.3碳酸氫鈉緩衝液中。然後將8 mg/mL的Alexa Fluor 488 TFP酯（Invitrogen A37570）在DMSO中的溶液添加到最終的質量比為10:1的AB:染料中，並使混合物在溫和振盪下反應1小時。透過使反應混合物通過兩個連續的Zeba旋轉柱，將螢光團偶聯的M1純化並進行緩衝液交換到pH 7.4 PBS中。透過UV-Vis光譜法評估蛋白質含量和標記程度。   實例 20. 體外 LNP CAR 原代人 T 細胞轉染和 Raji （ B 細胞）共培養，以評估 T 細胞的功能。 [0786]根據製造商的說明，透過使用EasySep人CD8+ T細胞分離套組（目錄號17953）和EasySep人類T細胞分離套組（目錄號17951）從人類PBMC分離CD3+ 或CD8+ T細胞。將分離的T細胞以500,000個細胞/孔的密度在96孔板中的T細胞培養基（RPMI+Glutamax，Gibco，目錄號61870-036）中靜置隔夜，所述培養基含有10%熱滅活胎牛血清（HI-FBS，Gibco，目錄號16140-071）且補充有100IU人類IL-2（Miltenyi，目錄號130-097-748）。然後將T細胞用LNP轉染，其中mRNA濃度為2 µg/ml。透過使用流式細胞術，在LNP轉染後18h檢測CAR表現。在與Raji B細胞共培養之前，將轉染的T細胞用T細胞培養基洗滌兩次。將Raji B細胞用cell trace violet（CTV，Thermo Fisher，目錄號C34571）染色，並與不同效應細胞與靶細胞（E：T）比率的T細胞以96孔板形式共培養，並且在37ºC培育72小時。共培養後72小時，將細胞用live/dead染色劑（eBioscience可固定活力染料eFluor 780，Invitrogen，目錄號2290917）染色，並透過流式細胞術進行分析。用FlowJo和Graph Pad prism分析資料。   實例 21. 用於全血轉染的體外實驗方案 [0787]本實例描述了用於使用Fab靶向性mRNA LNP轉染全血中的免疫細胞的方法。 [0788]將來自健康志願者的靜脈血在肝素管（BD Biosciences #367526）中進行抗凝，並且以50 µL接種在96孔圓底板中。簡單地通過以下方式進行全血的轉染：將含有5 µg/mL mRNA的奈米顆粒添加到細胞中，並且在37ºC共培養直到分析時。為了評估轉染效率，在轉染後24小時通過流式細胞術分析細胞。以2.5 µg/mL:RDM073.23使用LNP（具有和沒有插入之後的靶標）。透過流式細胞術分析從人血獲得的細胞。在分析全血轉染效率前，將紅血球在室溫下用VersaLyse裂解溶液（Beckman Coulter #A09777）裂解兩次，持續10分鐘。在全血的流式細胞術分析中應用的一抗包括以下：CD4-FITC（1:200）（BD Biosiences #555346）、CD19-BUV395（1:400）（BD Biosiences #563551）、CD56-BUV737（1:400）（BD Biosiences #741842）。使用可固定活力染料eFluor780（eBiosciences #65-0865-14）來評估所有樣品的活力。對於流式分析，將1x10 5個細胞在冰上進行Fc封閉（BD Biosciences #564219）5分鐘，然後用可固定活力染料eFluor780標記死細胞，並且在冰上用特異性抗體進行表面染色30分鐘。 [0789]使用正負補償珠在多色流式面板中對每種螢光染料進行補償。包括螢光減一（FMO）樣品和未染色的對照，以確定背景螢光水準並為陰性細胞群與陽性細胞群設置門控。 [0790]在運行FACSDIVA軟體（Becton Dickinson）的BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）上獲取所有樣品。使用FlowJo 10.7.1軟體和GraphPad Prism 9.0版分析所收集的所有資料。   實例 22. 在植入人類 T 細胞的 NSG 小鼠中進行 體內 T 細胞重編程（使用 GFP 報告蛋白）的方案 [0791]以下是用表現GFP的DiI LNP對免疫細胞進行體內重編程的標準程式。   小鼠品系 和人源化 [0792]NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠模型購自Jax Laboratories。透過尾靜脈注射為6至8周齡的雄性小鼠植入在無菌PBS中的1000萬個合格供體的PBMC。每週監測兩次個體體重，並且以適當的間隔採集血液樣品以評價人類免疫細胞的植入。   人類 T 細胞在免疫缺陷小鼠中的植入的評價 [0793]透過尾靜脈採血從每隻小鼠採集50 ul血液。按照如由製造商指示的方案，使用Versalyse RBC裂解溶液（Beckman Coulter A09777）裂解紅血球。用hCD45 & hCD3對細胞進行染色，以確定人類T細胞的植入。在PBMC注射15天後，小鼠在任何地方均具有從30%至60% huCD45+。評價這些人類化小鼠的表現DiI染料和GFP的LNP對免疫細胞的重編程。   免疫細胞的重編程 [0794]在時間零時，為小鼠（每組n = 4）注射表現GFP的DiI LNP（ i.v.注射適當的緩衝液）。在每個時間點（24 h或48 h，取決於實例），處死用LNP或緩衝液處理的小鼠。如下進行末梢血液和組織採集，以確定DiI和GFP在不同器官和免疫細胞中的表現。   組織和血液樣品採集。 [0795]在上面指定的時間點，在樣品採集前用CO 2麻醉小鼠。為了採血，打開胸腔以暴露心臟。從左心室抽取多達300 µl血液，並且將其分配到K 3EDTA微型採集管（Greiner Bio-One）中。然後使用新的注射器盡可能多地從心臟抽取剩餘的血液。與肝臟和肺一起分離所有免疫器官：脾臟、骨髓。經由塗片並通過注射器將其撕碎來從脾臟中分離免疫細胞，並且將細胞懸浮液透過70 µM細胞濾網過濾並用PBS洗滌。用針沖洗骨髓以收集所有免疫細胞。用組織勻漿器輕輕研磨一塊肝臟和肺組織，並且使用militenyi肝臟解離套組（Miltenyi Biotec，目錄號130-105-807）和肺解離套組（Miltenyi Biotec，目錄號130-0950927）分離勻漿後的細胞，並且按照製造說明書遵循指示。   免疫表型分析 [0796]按照製造說明書用Versalyse RBC裂解緩衝液處理來自血液和上面所有器官的免疫細胞。如表24所示，採用標準流式分析方案用live/dead可固定染料和表面標記對免疫細胞進行染色。使用BD symphony流式細胞儀來確定陽性群體。   表 24
抗原 螢光團 殖株 公司 目錄號
DiI APC NA NA NA
GFP mRNA NA NA NA
抗CD45 BUV395 HI30 BD Biosciences 563792
抗CD3 BUV805 UCHT1 BD Biosciences 612895
抗CD4 BV711 SK3 BioLegend 344648
抗CD8 BV421 RPA-TB BD Biosciences 562428
抗CD45 BB700 30-F11 BD Biosciences 566439
抗CD11b BV785 M1/70 BioLegend 101243
抗F4/80 PE Dazzle BM8 BioLegend 123146
抗CD31 BUV737 MEC 13.3 BD Biosciences 612802
TruStain單核細胞阻滯劑 NA NA BioLegend 462103
Arc Amine Comp珠 NA NA NA 01-3333-42
UltraComp eBead NA NA Invitrogen 01-3333-42
LIVE/DEAD Far Red染色劑 NA NA Invitrogen L34974
TruStain Fc X NA NA Invitrogen 422302
實例 23. 在含有 4ºC 儲存和一個凍融循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 6 、 7 和比較型脂質 αCD3 靶向性 LNP （ DLin-MC3-DMA 和 ALC-0315 ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0797]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、6和7的LNP與使用比較型脂質DLin-MC3-DMA和ALC-0315製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。 [0798]脂質3和ALC-0315 LNP導致相似的GFP蛋白表現水平，如透過轉染的T細胞的相似GFP+ T細胞百分比和相似平均螢光強度（MFI）所示（參見圖11A、圖11B（GFP+百分比）、圖11C和圖11D（GFP MFI））。這表明抗體驅動的攝取對這兩種可電離脂質同樣有效，並且可電離脂質驅動的內體逃逸效率達到了相似水平。脂質7和DLin-MC3-DMA脂質導致相似且最低水平的GFP蛋白表現。脂質6 LNP展現中等水平的GFP蛋白表現。蛋白質表現水平表明，9碳N-醯基取代基（脂質3中的）比11碳N-醯基取代基（脂質6和7中的）增強了性能。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後）測試的所有脂質奈米顆粒調配物中，LNP功效的表現水平和相對等級被保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖11A與圖11B，以及圖11C與圖11D）。儘管所有測試的脂質調配物都被原代人T細胞良好耐受（圖11E）；但仍觀察到脂質7和DLin-MC3-DMA導致的T細胞活力的一些劑量依賴性損失。   實例 24. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 4 和比較型脂質 αCD3 靶向性 LNP （ DLin-KC2-DMA 和 SM-102 ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0799]本實例對以下進行比較：由源自脂質3和4的LNP與使用比較型脂質DLin-KC2-DMA和SM-102製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在≥ 0.1 ug/mL的劑量下，用SM-102 LNP和脂質4 LNP轉染相似數量的T細胞；然而，在低於0.1 ug/mL的劑量下，較大比例的T細胞是GFP+，其中用SM-102 LNP計數；並且在所有劑量下，相對於脂質4 LNP，GFP MFI值始終高約2倍，這表明包封的GFP mRNA的胞質進入/胞質釋放更高效。脂質3和DLin-KC2-DMA LNP在獲得的T細胞的比例和每個細胞表現的GFP蛋白的拷貝方面均表現相似，並且其水準相對於脂質4 LNP低2倍。這種趨勢表明，相對於脂質3的亞油醯基尾基團，脂質4的油醯基尾基團導致包封的GFP mRNA的更高效的胞質進入/胞質釋放。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後）測試的所有脂質奈米顆粒調配物中，LNP功效的表現水平和相對等級被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖12A與圖12B，以及圖12C與圖12D）。脂質3、4和SM-102 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖12E）；然而，在0.3和1 ug/mL的較高劑量下，觀察到DLin-KC2-DMA LNP導致的T細胞活力的稍微更大的損失。   實例 25. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 1 、 3 、 8 和比較型脂質 αCD3 靶向性 LNP （ DLin-KC2-DMA ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0800]本實例對以下進行比較：由源自脂質1、3和5的LNP與使用比較型脂質DLin-KC2-DMA製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在所有劑量水平下，脂質1 LNP和DLin-KC2-DMA LNP在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）兩個方面均表現相似。相對於脂質1 LNP，脂質3 LNP導致GFP+ T細胞的比例大約高3倍，並且在所有劑量下GFP MFI值始終高約3倍，這表明相對於脂質1，用脂質3包封的GFP mRNA的胞質進入/胞質釋放更高效，表明相對於10碳N-醯基取代基（脂質1的），9碳N-醯基取代基（脂質3的）有利於包封的GFP mRNA的高效胞質進入/胞質釋放。觀察到脂質5 LNP的最高的GFP蛋白表現，如透過在所有劑量水準下較高的GFP+百分比和GFP MFI值所示。這表明N-醯基取代基的碳數目的進一步減少至8碳骨架進一步提高了mRNA的遞送效率。然而，如實例9所指出的，脂質5 LNP在緩衝液交換和抗體接合物插入步驟中展現較大的大小變化，導致最終LNP流體動力學直徑＞ 150 nm，這表明9-碳N-醯基取代骨架證明是最佳LNP大小（用於實現0.2微米無菌過濾）並且具有最佳誘導報告基因表現的能力。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後）測試的所有調配物中，LNP功效的表現水平和相對等級被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖13A與圖13B，以及圖13C與圖13D）。脂質1、3、5 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖13E）。   實例 26. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 1 、 8 和比較型脂質 αCD3 靶向性 LNP （ DLin-KC2-DMA ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0801]本實例對以下進行比較：由源自脂質1和8的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在所有劑量水平下，脂質1和LNP均導致相似的GFP+ T細胞比例（透過GFP+ 細胞百分比反映），然而，在每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）方面，脂質8 LNP優於脂質1 LNP 3倍。這表明相對於α-乙基辛醯基N-醯基取代基（脂質1的），β-乙基辛醯基N-醯基取代基（脂質8的）改善了包封的GFP mRNA的胞質進入/胞質釋放。β-乙基取代的總體效果是更好的LNP大小分佈特性（相對於脂質1，如實例9所示）和mRNA遞送效率的增加，這導致報告基因表現水平提高2倍，儘管存在10碳N-醯基取代模式。這表明LNP特性和遞送效率均可經由N-醯基取代基的大小（碳數）和幾何形狀（β-乙基辛醯基與α-乙基辛醯基）來調節。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後），脂質8 LNP的性能被很好保持，如通過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖14A與圖14B）。脂質1和8 LNP均被原代人T細胞良好耐受（圖14C）。   實例 27. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 8 、 9 、 10 和比較型脂質 αCD3 靶向性 LNP （ DLin-KC3-DMA ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0802]本實例對以下進行比較：由源自脂質8、9和10的LNP與比較型脂質DLin-KC2-DMA LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。如圖15A和圖15C所示，在所有劑量水平下，脂質8和9 LNP在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）這兩個方面均表現相似。因此，相對於10碳N-醯基取代基（脂質8的），琥珀酸來源的14碳N-醯基取代基（在脂質9中）導致mRNA有效載荷的胞質進入/胞質釋放的相似效率，這表明在N-醯基取代基中羧酸酯的引入（和加入的O原子的極性）平衡並抵消了脂質6和7（均以11碳N-醯基取代基為特徵）所看到的脂質效率損失。如實例10所示，脂質9 LNP展現與脂質6、7和8相當的大小分佈特性，這表明可生物降解的酯連接（如在脂質9中）可以被引入N-醯基取代基中，而不損失LNP大小分佈特性。脂質10 LNP在GFP+ T細胞的比例（由GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）這兩個方面優於脂質9 LNP 1.5倍。這表明總碳數減少至12（在脂質10中）相比於14（在脂質9中）進一步提高了脂質效率。因此，類似於脂質3、5、6、7和8 LNP觀察到的趨勢，在脂質9和10中的琥珀酸來源的可生物降解的N-醯基取代基的活性也是可調的。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後），脂質10 LNP的性能被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖15A與圖15B，以及圖15C與圖15D）。脂質9和10 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖15E和圖15F）。   實例 28. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 4 、 9 、 15 和比較型脂質（ DLin-KC2-DMA ） αCD3 靶向性 LNP 的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0803]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、4、9、15的LNP與使用比較型脂質DLin-KC2-DMA製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在所有劑量水平下，在脂質3與脂質4之間以及脂質9與脂質15之間觀察到性能改善（在透過GFP+細胞百分比反映的GFP+ T細胞的比例以及通過GFP MFI值反應的每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數這兩個方面），這表明油醯基尾基團（在脂質4和15中）比相應的亞油醯基尾基團（在脂質3和9中）導致改善的性能。因此，經由較低的脂質尾不飽和度（具有單不飽和油酸）導致的脂質氧化穩定性增加（而不損失LNP效率）通常在較低的脂質膜流動性下觀察到。此外，與觀察到LNP大小分佈特性較差的脂質4（相對於脂質3）相比，脂質15 LNP的大小分佈特性與脂質9 LNP所觀察到的大小分佈特性相似，這表明與脂質尾基團的作用相比，N-醯基取代基在確定LNP的大小分佈特性方面起著更重要的作用。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後）測試的所有調配物中，LNP功效的表現水平和相對等級被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖16 A與圖16B，以及圖16C與圖16D）。脂質3、4、9和15 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖16E）。   實例 29. 具有脂質 3 、 4 、 9 、 15 αCD8 （ TRX-2 ）靶向性 LNP 和相應的非靶向性母體 LNP （均儲存在 4ºC ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0804]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、4、9、15的LNP與相應的非靶向性母體LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物TRX2摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD8 T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。此外，測試了母體LNP（未將任何靶向Fab接合物摻入LNP冠部），以檢查CD8 T細胞群體中的任何非特異性攝取。如圖17A和圖17B所示，脂質9和15導致CD8 T細胞群體的GFP蛋白表現水平相似（在透過GFP+ 細胞百分比反映的GFP+ T細胞的比例和透過GFP MFI值反映的每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數這兩個方面）。圖17C和圖17D顯示DiI+（染料）T細胞百分比和DiI MFI，這反映了由CD8 T細胞群體攝取的DiI染料標記的LNP的相對水準。值得注意的是，在所有靶向調配物中觀察到相似的DiI+ T細胞百分比，而在母體（非靶向）調配物中觀察到緩衝液對照樣染料水準（DiI MFI值，圖17D），這證實了TRX2靶向性Fab在締合和攝取到CD8 T細胞中的作用。如預期的那樣，在非靶向性母體LNP調配物中未觀察到GFP蛋白表現，這表明脂質化學未在此TRX2介導的細胞攝取機制中起作用。脂質3、4、9和15 αCD8（TRX2）靶向性LNP被原代人T細胞良好耐受（圖17E），其中，在脂質9和脂質15調配物中細胞活力趨向可測量的降低，這可能是由於用這些脂質觀察到GFP蛋白表現水平較高（如圖17B中所見的較高GFP MFI值所示）。   實例 30. 具有脂質 3 、 4 、 9 、 15 αCD8 （ T8 ）靶向性 LNP 和相應的非靶向性母體 LNP （均儲存在 4ºC ）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0805]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、4、9、15的LNP與相應的非靶向性母體LNP（均在一個凍融循環之後）產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物T8摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD8 T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。此外，測試了母體LNP（未將任何靶向Fab接合物摻入LNP冠部），以檢查CD8 T細胞群體中的任何非特異性攝取。如圖18A和圖18B所示，採用這種T8 αCD8靶向策略，脂質15 LNP的報告基因表現比脂質9 LNP高2-3倍（在透過GFP+ 細胞百分比反映的GFP+ T細胞的比例和透過GFP MFI值反映的每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數這兩個方面）。圖18C和圖18D顯示DiI+（染料）T細胞百分比和DiI MFI，這反映了由CD8 T細胞群體攝取的DiI染料標記的LNP的相對水準。值得注意的是，在所有靶向調配物中觀察到相似的DiI+ T細胞百分比，而在母體（非靶向）調配物中觀察到緩衝液對照樣染料水準（DiI MFI值，圖18D），這證實了T8靶向性Fab在締合和攝取到CD8 T細胞中的作用。如預期的那樣，用非靶向性母體LNP調配物未觀察到GFP蛋白表現，這表明脂質化學未在此T8介導的細胞攝取機制中起作用。脂質3、4、9和15 αCD8（T8）靶向性LNP被原代人T細胞良好耐受（圖18E），其中，在脂質9和脂質15調配物中細胞活力趨向可測量的降低，這可能是由於用這些脂質觀察到GFP蛋白表現水平較高（如圖18B中所見的較高GFP MFI值所示）。   實例 31. 在含有 4ºC 儲存的脂質 2 、 3 、 31 和 32 以及比較型脂質（ DLin-KC2-DMA ） αCD3 （ hSP34 ）靶向性 LNP 的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0806]本實例對以下進行比較：由源自脂質2、3、31和32的LNP與使用比較型脂質DLin-KC2-DMA製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在所有劑量水準下，脂質2和3在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）這兩個方面優於脂質31、32和DLin-KC2-DMA LNP（圖19A和圖19B）。這與脂質31和脂質32 LNP相對於脂質2和3 LNP的較高表觀pKa以及在酸性內體pH條件下（如實例13中所述）LNP電荷狀態的較不明顯變化以及因此脂質31和32預期的較低胞質進入水平相一致。脂質2、3、31和32 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖19C）。   實例 32. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 33 和 34 以及比較型脂質（ DLin-KC2-DMA ） αCD3 靶向性 LNP 以及非結合（突變型 OKT8 ）抗體靶向性 LNP 的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0807]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、31、32的LNP與使用比較型脂質DLin-KC2-DMA製備的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。另外，透過使用實例4中所述的抗體接合物插入方法將非結合突變型抗體Fab（mut-OKT8）接合物摻入母體LNP中來產生模擬靶向性LNP。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。在所有劑量水平下，脂質3和33在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝（通過GFP MFI值反映）這兩個方面優於脂質34和DLin-KC2-DMA LNP。此外，mut-OKT8功能性脂質33和脂質34 LNP並未導致任何蛋白質表現，這證實了αCD3抗體（hSP34）在用這些脂質調配物觀察到的細胞攝取機制中的作用。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後）測試的所有調配物中，LNP功效的表現水平和相對等級被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示（圖20A與圖20B，以及圖20C與圖20D）。脂質3、33和34 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖20E）。   實例 33. 在含有 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 4 、 9 和 34 αCD3 靶向性 αCD20 CAR-RNA LNP 的原代人 T 細胞中的體外 CAR 蛋白（ M1 標記的細胞外結構域）表現 [0808]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、4、9和33的LNP產生的αCD20 CAR（TTR-023）蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼αCD20 CAR的mRNA（TTR-023）的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物（hSP34）摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以經由檢測TTR-023跨膜CAR蛋白的細胞外結構域上的M1標籤來評估CAR表現。在所有測試的劑量水準下，相對於脂質9和33，脂質3和4檢測到更高的CAR水平，其中脂質4在該αCD3靶向途徑中表現最佳。CAR表現的相對水平與脂質4的油醯基尾基團一致，所述油醯基尾基團相對於在實例28、29和30中的報告（GFP）基因表現所示的脂質3和9的相應亞油醯基尾基團，產生改善的性能。此外，這說明在該αCD3介導的靶向和細胞攝取機制中，在報告基因（GFP）和治療性載荷（TTR-023 CAR蛋白）之間保持了脂質功效的這一相對等級。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後），LNP功效的表現水平和相對等級在脂質3、4和9 LNP中被很好保持。相比之下，在所有劑量的脂質33 LNP下檢測到CAR表現的下降，如透過在-80ºC儲存之前（4ºC儲存）和之後M1+ 細胞百分比和M1 MFI值的比較所示（圖21A與圖21B，以及圖21C與圖21D）。脂質3、4、9和33 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖21E和圖21F）。   實例 34. 在含有 4ºC 儲存的脂質 3 、 4 、 9 和 34 αCD8 （ T8 ）靶向性 αCD20 CAR-RNA LNP 的原代人 T 細胞中的體外 CAR 蛋白（ M1 標記的細胞外結構域）表現 [0809]本實例對以下進行比較：由源自脂質3、4、9和33的LNP產生的αCD20 CAR（TTR-023）蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼αCD20 CAR的mRNA（TTR-023）的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物（T8）摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以經由檢測TTR-023跨膜CAR蛋白的細胞外結構域上的M1標籤來評估CAR表現。將轉染的細胞門控為CD4+（CD4群體）和CD4-（CD8群體），並在這兩個群體中監測CAR表現（表示為M1+百分比和M1 MFI），以評估αCD8（T8）靶向策略在CD8群體中的特異性。在所有測試的劑量水平下，在CD4-群體（CD8細胞，如透過圖22A和圖22B中的M1%和M1 MFI值所示）中，相對於脂質3和33，檢測到脂質4和9的更高CAR表現，其中脂質4和9在該CD8靶向途徑中表現同樣出色。在CD4+ 群體（CD4細胞，如透過圖22C和圖22D中的M1%和M1 MFI值所示）中檢測到類似於緩衝液對照（PBS）的CAR水平，這證實T8抗體能夠實現受體介導的特異性攝取而攝取到CD8 T細胞中。脂質3、4、9和33 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖22E）。   實例 35. 在含有 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後）的脂質 3 、 4 、 9 和 34 αCD8 （ T8 ）靶向性 αCD20 CAR-RNA LNP 的原代人 T 細胞中的體外 CAR 蛋白（ M1 標記的細胞外結構域）表現 [0810]本實例對以下進行比較：由源自1個凍融循環後（-80ºC儲存後）的脂質3、4、9和33的LNP產生的αCD20 CAR（TTR-023）蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼αCD20 CAR的mRNA（TTR-023）的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物（T8）摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。使由此產生的顆粒經受1個凍融循環，然後在體外原代人CD3+ T細胞中進行測試，以經由檢測TTR-023跨膜CAR蛋白的細胞外結構域上的M1標籤來評估CAR表現。將轉染的T細胞門控為CD4+（CD4群體）和CD4-（CD8群體），並在這兩個群體中監測CAR表現（表示為M1+百分比和M1 MFI），以評估αCD8（T8）靶向策略在CD8群體中的特異性。在所有測試的劑量水平下，在CD4-群體（CD8細胞，如透過圖23A和圖23B中的M1%和M1 MFI值所示）中，相對於脂質3和33，檢測到脂質4和9的更高CAR表現，而脂質4和9在該CD8靶向途徑中表現同樣出色。在CD4+ 群體（CD4細胞，如通過圖23C和圖23D中的M1%和M1 MFI值所示）中檢測到類似於緩衝液對照（PBS）的CAR水準，這證實T8抗體能夠實現受體介導的特異性攝取而攝取到CD8 T細胞中。用已經受1個凍融循環的顆粒觀察到CAR表現水平和對CD8 T細胞的特異性，這證實調配物的完整性和功能得以保持。脂質3、4、9和33 LNP被原代人T細胞良好耐受（圖23E）。   實例 36. 在人類全血中，在具有脂質 9 、 15 、 DLin-KC3-DMA 脂質 αCD3 （ hSP34 ）靶向性 LNP 的 CD8 和 CD4 T 細胞中的 GFP 蛋白表現和 LNP 締 合（如 DiI 染料螢光所測量的） [0811]將脂質9、15和DLin-KC3-DMA αCD3和αCD8靶向性（以及非結合抗體mutOKT8作為陰性對照）GFP mRNA LNP投予於人靜脈全血，培育24小時，並使用實例21中所述的方案分析全血轉染。如圖24A、圖24B、圖24C和圖24D所示，αCD3（hSP34）靶向性LNP在CD4和CD8 T細胞兩者中均導致GFP表現，而如預期的那樣，αCD8（TRX2）靶向性LNP僅在CD8 T細胞中導致GFP選擇性表現。此外，非結合（mutOKT8）對照LNP在任一細胞類型中均未導致GFP表現。脂質9和15 αCD3（hSP34）靶向性LNP展現相似的GFP表現水平，這表明這兩種脂質在該細胞攝取途徑中同樣有效。然而，在CD8結合和攝取途徑中，αCD8（TRX2）靶向性脂質15 LNP優於相應的脂質9 LNP，在轉染較大比例的CD8 T細胞（表示為GFP+ 細胞百分比）以及每個細胞的GFP蛋白的更多拷貝數（表示為GFP MFI）方面。如圖24E、圖24F、圖24G、圖24H所示，αCD3（hSP34）靶向性LNP導致與CD4和CD8 T細胞兩者的結合，而αCD8（TRX2）靶向性LNP僅選擇性地與CD8 T細胞結合（在這兩個細胞群中測量為DiI染料%和MFI）。此外，如預期的那樣，非結合（mutOKT8）對照LNP未導致與任一T細胞類型的顯著結合。脂質9和15 LNP與相似比例的CD4和CD8 T細胞結合，如透過這兩個群體中相似的DiI+ 細胞百分比所示。然而，在CD8結合和攝取途徑中，相對於脂質9 LNP，觀察到脂質15 LNP的結合略高，如透過每個細胞的更亮染料螢光強度（DiI MFI值）所示。   實例 37. 在人類全血中，在具有脂質 9 、 15 、 DLin-KC3-DMA 脂質 αCD3 （ hSP34 ）靶向性 LNP 的 NK 細胞、顆粒球和 B 細胞中的 GFP 蛋白表現 [0812]使用實例21中所述的用於全血轉染的方案，還分析了脂質9、15和DLin-KC3-DMA αCD3和αCD8靶向性（以及非結合抗體mutOKT8作為陰性對照）GFP mRNA LNP轉染的全血樣品（實例38中的）在NK細胞、顆粒球和B細胞中的GFP表現。如圖25A和圖25B所示，如預期的那樣，αCD3（hSP34）靶向性LNP和αCD8（TRX2）靶向性LNP兩者均導致NK細胞中的GFP表現。此外，在具有非結合（mutOKT8）對照LNP的NK細胞中未觀察到GFP表現。脂質9和15 αCD3（hSP34）靶向性LNP在NK細胞中展現相似的GFP表現水平，這表明這兩種脂質在該細胞攝取途徑中同樣有效。然而，在CD8結合和攝取途徑中，αCD8（TRX2）靶向性脂質15 LNP優於相應的脂質9 LNP，在轉染較大比例的NK細胞（表示為GFP+ 細胞百分比）以及每個細胞的GFP蛋白的更多拷貝數（表示為GFP MFI）方面。如圖25C、圖25D、圖25E和圖25F所示，這兩種靶向方式在顆粒球和B細胞中均未導致任何顯著的GFP表現。   實例 38. 在人類全血中，在具有脂質 9 、 15 、 DLin-KC3-DMA 脂質 αCD3 （ hSP34 ）靶向性 LNP 的 NK 細胞、顆粒球和 B 細胞中的 LNP 締 合（如 DiI 染料螢光所測量的） [0813]使用實例23中所述的用於全血轉染的方案，還分析了脂質9、15和DLin-KC3-DMA αCD3和αCD8靶向性（以及非結合抗體mutOKT8作為陰性對照）GFP mRNA LNP轉染的全血樣品（實例36中的）與NK細胞、顆粒球和B細胞的結合。如圖26A和圖26B所示，如預期的那樣，αCD3（hSP34）靶向性LNP和αCD8（TRX2）靶向性LNP兩者均與NK細胞結合。此外，如預期的那樣，非結合（mutOKT8）對照LNP未導致與NK細胞的任何顯著結合。如圖26C、圖26D、圖26E和圖26F所示，這兩種靶向模式均導致與顆粒球和B細胞的非特異性結合，然而如上文實例39所報告，未觀察到GFP表現，這表明RNA未遞送至任一細胞類型的胞質中。   實例 39. 在用 αCD8 （ TRX2 ）靶向性脂質 9 和 DLin-KC3-DMA LNP 轉染的 原代人 T 細胞中的體外 CAR （ TTR-023 ）和 mCherry 表現 [0814]本實例對以下進行比較：由源自脂質9與比較型脂質DLin-KC3-DMA的LNP產生的報告蛋白（mCherry）和αCD20 CAR（TTR-023）蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有mCherry mRNA或編碼αCD20 CAR的mRNA（TTR-023）的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物（TRX2）摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以分別經由mCherry螢光或檢測TTR-023跨膜CAR蛋白的細胞外結構域上的M1標籤來評估蛋白（mCherry或CAR）表現。將轉染的細胞門控為CD4+（CD4群體）和CD4-（CD8群體），並使用在這兩個群體中監測的蛋白表現水平（關於CAR表現，表示為M1+百分比和M1 MFI；或關於mCherry表現，表示為報告蛋白螢光）來評估該αCD8（TRX2）靶向策略在CD8群體中的特異性。在CD4-群體（CD8細胞，如透過圖27B和圖27C中的M1%和M1 MFI值、圖27D和圖27E與圖27G和圖27H中的F和G或mCherry%和mCherry MFI值所示）中觀察到蛋白質選擇性表現，其中脂質9和比較型脂質DLin-KC3-DMA調配物均證實TRX2抗體能夠實現受體介導的特異性攝取而攝取到CD8 T細胞中。脂質9 LNP在CAR表現水平方面優於DLin-KC3-DMA LNP，而DLin-KC3-DMA LNP在mCherry表現水平方面優於脂質9 LNP，這表明細胞內蛋白與膜結合蛋白的表現可能需要不同的最佳脂質組成。1 ug/mL/500,000個T細胞劑量水準的具有CAR或mCherry有效載荷的這兩種TRX2靶向性脂質調配物被原代人T細胞良好耐受（圖27A）。   實例 40. 透過將 Raji （ B 細胞）與表現 αCD20 CAR （ TTR-023 ）的 T 細胞（透過用帶有 CAR-mRNA 或 mCherry -mRNA （ 作為陰性對照）的 αCD8 （ TRX2 ）靶向性脂質 9 和 DLin-KC3-DMA LNP 轉染原代人 T 細胞（實例 27 中的）得到）共培養來研究體外 CAR-T 細胞功能。 [0815]將實例39中產生的CAR-T細胞與Raji（B細胞）在1：1、4：1和8：1的效應細胞:靶細胞（E：T）（T細胞：B細胞）比率下共培養24小時，並且使用實例20中所述的方案測量活B細胞和T細胞的比例。如圖28A所示，在較高的E：T比率下，死亡B細胞的比例以劑量依賴性方式增加。此外，相對於mCherry轉染的T細胞，表現TTR-023 CAR蛋白的T細胞展現對B細胞的顯著更高的細胞毒性，如透過在測試的三個E：T比率下死亡Raji細胞的百分比增加4倍所示。這表明CAR與靶細胞CD20受體和下游靶標特異性顆粒酶穿孔素凋亡途徑的接合在觀察到的T細胞活性中起主要作用，而T細胞活化（可能由TRX2抗體接合CD8受體導致）超過T細胞對B細胞的細胞毒性的背景水平是此處觀察到的CAR-T細胞整體活性的次要貢獻者。脂質9和DLin-KC3-DMA LNP調配物兩者均對B細胞具有同等的細胞毒性，並且在共培養實驗中，這兩種調配物均被CD4和CD8 T細胞良好耐受，其中T細胞活力值保持在略低於（CD4細胞）或略高於（CD4-，CD8 T細胞）未轉染的對照，分別如圖28B和圖28C所示。   實例 41. 在用 αCD8 （ TRX2 ）靶向性脂質 15 和 DLin-KC3-DMA LNP 轉染的 原代人 T 細胞中的體外 CAR （ TTR-023 ）和 mCherry 表現 [0816]本實例對以下進行比較：由源自脂質15與比較型脂質DLin-KC3-DMA的LNP產生的報告蛋白（mCherry）和αCD20 CAR（TTR-023）蛋白表現。使用實例2和6中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有mCherry mRNA或編碼αCD20 CAR的mRNA（TTR-023）的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物（TRX2）摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以分別經由mCherry螢光或檢測TTR-023跨膜CAR蛋白的細胞外結構域上的M1標籤來評估蛋白（mCherry或CAR）表現。將轉染的細胞門控為CD4+（CD4群體）和CD4-（CD8群體），並在這兩個群體中監測蛋白表現水平（關於CAR表現，表示為M1+百分比和M1 MFI；或關於mCherry表現，表示為報告蛋白螢光）。脂質15 LNP在CAR表現水平方面優於DLin-KC3-DMA LNP（圖29B和圖29C），而DLin-KC3-DMA LNP在mCherry表現水平方面優於脂質15 LNP（圖29D和圖29E），這表明細胞內蛋白與膜結合蛋白的表現可能需要不同的最佳脂質組成。具有CAR或mCherry有效載荷的這兩種TRX2靶向性脂質調配物被原代人T細胞良好耐受（圖29A）。   實例 42. 透過將 Raji （ B 細胞）與表現 αCD20 CAR （ TTR-023 ）的 T 細胞（透過用帶有 CAR-mRNA 或 mCherry -mRNA （ 作為陰性對照）、 BiTE （作為陽性對照）的 αCD8 （ TRX2 ）靶向性脂質 15 和 DLin-KC3-DMA LNP 轉染原代人 T 細胞（實例 29 中的）得到）共培養來研究體外 CAR-T 細胞功能。 [0817]將實例40中產生的CAR-T細胞與Raji（B細胞）在0.31：1、1：1、3.16：1、10：1和31.6：1的效應細胞:靶細胞（E：T）（T細胞：B細胞）比率下共培養24小時，並且使用實例20中所述的方案測量活B細胞和T細胞的比例。如圖30A所示，在較高的E：T比率下，死亡B細胞的比例以劑量依賴性方式增加，直至3.16：1的E：T，並且在E：T比率下其達到穩定，這表明在3.16：1的E：T下具有強細胞毒性活性。此外，相對於mCherry轉染的T細胞，表現TTR-023 CAR蛋白的T細胞展現對B細胞的顯著更高的細胞毒性，如透過3.16及以下的E：T比率下死亡Raji細胞的百分比增加4倍所示。這表明CAR與靶細胞CD20受體和下游靶標特異性顆粒酶穿孔素凋亡途徑的接合在觀察到的T細胞活性中起主要作用，而T細胞活化（可能由TRX2抗體接合CD8受體導致）超過T細胞對B細胞的細胞毒性的背景水平是觀察到的CAR-T細胞整體活性的次要貢獻者。脂質15和DLin-KC3-DMA LNP調配物兩者均對B細胞具有同等的細胞毒性，還展現與雙特異性B細胞受體接合器（BiTE，雙特異性抗體）陽性對照相似的活性，如圖30A所示。脂質15和DLin-KC3-DMA調配物兩者均被良好耐受直至3.16：1的E：T比率，其中在10：1和31.6：1的較高E：T比率下的CD8 T細胞群體中觀察到較低的T細胞活力值，分別如圖30B和圖30C所示。 實例 43. 在含有 αCD3 靶向性脂 質 15 、 9 、 10 和 13 以及比較型（ DLIN-KC3-DMA ） LNP （ 4ºC 儲存和 1 個凍融 循環後（ -80ºC 儲存後））的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現和 LNP 締 合（如 DiI 染料螢光所測量的） [0818]本實例對以下進行比較：由源自脂質15、9和10的LNP與比較型脂質DLin-KC2-DMA LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2和6中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD3 Fab接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。如圖32A和圖32B所示，在所有劑量水平下，脂質15和10 LNP在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）這兩個方面表現相似，並且相對於脂質9 LNP，在每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）方面表現顯著更好，特別是在較低劑量水平下。因此，可以透過修改O-醯基取代基（從脂質9的亞油醯基到脂質15的油醯基）或透過修改N-醯基取代基（從脂質9的琥珀酸來源的14碳N-醯基取代基到脂質10的琥珀酸來源的12碳N-醯基取代基）來對脂質9的性能做出改善。此外，如圖32C和圖32D所示，脂質9和脂質13 LNP在所有劑量水準下均展現相似的細胞締合水平（在DiI+ 細胞的比例方面，以及在透過DiI MFI值反映的細胞締合的LNP的拷貝數方面，如圖32C和圖32D所示），然而，脂質9 LNP在蛋白表現方面、在GFP+ T細胞的比例（透過GFP+ 細胞百分比反映）和每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數（透過GFP MFI值反映）這兩個方面均優於脂質13 LNP，這表明相對於脂質9 LNP，脂質13 LNP有較差的內體逃逸能力。在1個凍融循環後（-80ºC儲存後），脂質10和13 LNP的性能被很好保持，如透過在-80ºC儲存之前（4ºC儲存）和之後的GFP+ 細胞百分比和GFP MFI值的比較所示，如圖32A與圖32B所示。 實例 44. 在植入人類 T 細胞的 NSG 小鼠中 ，使用 GFP 報告蛋白以及基於脂質 9 、 15 和比較型脂質 DLin-KC3-DMA 的 α-CD8 （ TRX-2 ）靶向性 LNP （用 1.5 mol% DPG-PEG 調配）進行體內 T 細胞重編程 [0819]使用實例22中所述的方案對NSG小鼠用劑。在殺死動物之前立即抽取血漿樣品，並且遵循表25中所示的研究設計，在注射後24小時，收集脾臟和肝臟進行分析。 表25.NSG小鼠GFP T細胞重編程研究設計
組 小鼠數 給予的調配物 有效載荷 靶向抗體
1 2 緩衝液對照 NA NA
2 4 脂質15；1.5% DPG-PEG；DiI染料標記 GFP-mRNA TRX-2
3 4 DLin-KC3-DMA；1.5% DPG-PEG；未使用染料標記 GFP-mRNA TRX-2
4 3 脂質9；1.5% DPG-PEG；DiI染料標記 GFP-mRNA TRX-2
對血液、脾臟和肝臟樣品中的CD4和CD8 T細胞進行分選染色（透過FACS），對肝臟樣品進行額外染色並且使用表26和表27中描述的流動面板分選肝細胞、內皮細胞、庫普弗細胞、小鼠巨噬細胞和小鼠髓樣細胞。將GFP螢光和DiI染料螢光用於定量所述目的細胞類型中的GFP蛋白表現（表示為GFP+ 細胞的百分比和GFP+ 細胞的平均螢光強度（MFI））和LNP締合（經由DiI標記螢光確定，表示為DiI+ 細胞的百分比和DiI+ 細胞的DiI-MFI）。 表26.使用的細胞標記（Dead-Live、LNP、蛋白質、HuCD45、huCD3、huCD4）和螢光團
標記 Dead live 染色 LNP ( Dil 染料 ) GFP- 蛋白質 huCD45 huCD3 huCD4
螢光團 e-flour780 APC 綠色螢光 BUV395 BUV805 BV711
表27.使用的細胞標記（Dead-Live、huCD8、muCD45、hu/muCD11b、muCD31、F4/80）和螢光團
標記 Dead live 染色 huCD8 muCD45 Hu/muCD11b+ muCD31 F4/80
螢光團 e-flour780 BV421 BB700 BV785 BUV737 PE Dazzle
[0820]如圖33A、33B和33C所示，在血液、脾臟和肝臟樣品中的CD8 T細胞群體中檢測到7%-25% GFP+細胞，而＜ 3%的CD4+ T細胞是GFP+，這證實了使用TRX-2 αCD8抗體對CD8+ T細胞群體和靶向性LNP的體內重編程差異。如圖34A、34B和34C所示，LNP締合對血液和脾臟樣品中的CD8 T細胞群體具有特異性，然而，在肝臟樣品中觀察到與CD4群體以及內皮細胞、庫普弗細胞和小鼠巨噬細胞的顯著締合水平。值得注意的是，儘管存在非特異性LNP締合，但未檢測到GFP蛋白（圖33C），這表明脫靶LNP締合不會導致脫靶mRNA遞送和蛋白表現。 實例 45. 具有 aCD2 、 aCD4 、 aCD7 、 CD28 、 TCR 和非結合（突變型 OKT8 ）靶向性 Fab 和奈米抗體 mRNA 滴定物 以及 aCD8 （ TRX2 和 15C01 ）和 aCD3 （ hSP34 ）抗體靶向性 LNP （與脂質 15 和 DLIN-KC3-DMA 相比）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現和 LNP 締 合（如 DiI 染料螢光所測量的） [0821]本實例對以下進行比較：由具有aCD2、aCD4、aCD7、aCD28、TCR和非結合（突變型OKT8）對照（作為aCD8和aCD3靶標的比較）的源自脂質15的LNP和脂質DLin-KC3-DMA LNP產生的GFP蛋白表現。 [0822]使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA和螢光染料標記（DiI-C18-5DS）的奈米顆粒。由實例4中所述的方法產生Fab-脂質接合物，而Nb-接合物的產生的不同之處在於使用1：1：4 Nb：DSPE-3.4K PEG-馬來醯亞胺：DSPE-2K PEG-OCH3和50 kD UF膜來將Nb-接合物與游離Nb分離。使用實例5中所述的方法，基於最佳Fab和Nb密度（表28），將Fab-接合物和Nb-接合物摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD3+ T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估在大約2.5 ug/mL、0.5 ug/mL和0.1 ug/mL mRNA下的報告基因表現，持續大約24小時。通過流式細胞術測量CD8和CD4細胞兩者的轉染水準。 表28.抗體插入條件
樣品 ID 靶標 殖 株 接合物插入密度 (g Ab/mol 脂質 ) 可電離脂質 插入條件
221101EYS-1-1 aCD2 9.6 Fab NoDS 3 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-4 aCD2 TS2/18.1 fab NoDS 3 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-7 TCR T017000700 Nb 2.7 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-10 aCD4 伊巴珠單抗Fab NoDS 18.4 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-13 aCD4 hBF5 Fab bDS 1.5 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-16 aCD4 T023200008 Nb 0.93 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-19 aCD7 V1 Nb 2.8 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-22 aCD28 Hz511.A1 Fab bDS 1.5 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-25 aCD28 28CD065G01 Nb 0.9 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-28 aCD8 T0347015C01 Nb 2 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-31 aCD8 A044300805_V8 Nb 5.5 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-34 aCD3 hSP34 Fab NoDS 9 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-37 aCD8 TRX2 Fab bDS 9 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-1-40 陰性對照 mutOKT8 Fab NoDS 9 脂質15 在pH 6.5 MBS中，37ºC，持續4小時
221101EYS-2-1 aCD2 9.6 Fab NoDS 3 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-4 aCD2 TS2/18.1 fab NoDS 3 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-7 TCR T017000700 Nb 2.7 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-10 aCD4 伊巴珠單抗Fab NoDS 18.4 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-13 aCD4 hBF5 Fab bDS 1.5 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-16 aCD4 T023200008 Nb 0.93 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-19 aCD7 V1 Nb 2.8 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-22 aCD28 Hz511.A1 Fab bDS 1.5 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-25 aCD28 28CD065G01 Nb 0.9 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-28 aCD8 T0347015C01 Nb 2 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-31 aCD8 A044300805_V8 Nb 5.5 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-34 aCD3 hSP34 Fab NoDS 9 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-37 aCD8 TRX2 Fab bDS 9 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
221101EYS-2-40 陰性對照 mutOKT8 Fab NoDS 9 DLIN-KC3-DMA 在pH 7.4 HBS中，60ºC，持續1小時
[0823]與脂質15（圖35A、35B、35E、35F）和DLin-KC3-DMA LNP（圖35C、35D、35G和35H）相比，相對於同時靶向CD8和CD4 T細胞亞群的mutOKT8 LNP對照，所有被評估的殖株均介導一定程度的轉染和GFP表現水平。aCD3、aCD7和TCR靶向性LNP在CD4和CD8 T細胞兩者中均導致GFP表現，而如預期的那樣，aCD8和aCD4靶向性LNP僅在其相應亞群中導致GFP選擇性表現。此外，非結合（mutOKT8）對照LNP在任一細胞類型中（不管哪種脂質）均未導致GFP表現。在所有劑量水平下，脂質15和DLin-KC3-DMA aCD2、aCD4、aCD7、aCD28和TCR靶向性LNP顯示相似的GFP表現水平，這表明這兩種脂質在該細胞攝取途徑中同樣有效，不只有aCD3和aCD8靶向性LNP才能做到。與在脂質15和DLin-KC3-DMA LNP中的aCD3或aCD8 Fab和奈米抗體相比，兩種aCD2靶向性Fab均顯示CD8和CD4 T細胞轉染群體的水平較低（在透過GFP+ 細胞百分比反映的GFP+ T細胞的比例和透過GFP MFI值反映的每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數這兩個方面）和LNP締合水平較低（其測量為DiI+（染料）T細胞百分比和DiI MFI，反映了由CD8和CD4 T細胞群體攝取的DiI染料標記的LNP的相對水平）（圖36A、36B、36C、36D、36E、36F、36G和36H）。在CD4靶向性Fab和奈米抗體中，伊巴珠單抗在CD4+ T細胞仲介導更高的轉染百分比和GFP表現水平，但是其低於脂質15和DLin-LC3-DMA LNP兩者中的aCD3 hSP34 Fab。為了同時靶向CD8和CD4 T細胞亞群，相比於插入具有脂質15和DLin-KC3-DMA的LNP後的mutOKT8，aCD7和抗TCR殖株在最高mRNA劑量下顯示出在這兩個細胞亞群之間的更大轉染和LNP締合。然而，這兩者均低於aCD3 hSP34 Fab。aCD28靶向性Fab和奈米抗體顯示CD8和CD4 T細胞的GFP轉染和表現水平僅略高於插入脂質15和DLin-KC3-DMA LNP後的mutOKT8顆粒。 [0824]該資料表明，在不同的靶向性Fab或奈米抗體（如aCD2、aCD4、aCD7、aCD28和TCR）中，脂質15和DLin-KC3-DMA LNP均同樣有效並且對轉染顯示出非常相關的作用。   實例 46. 脂質 10 、 15 、 16 、 24A 和 26 以及比較型脂質 ALC-0315 LNP 的理化性質 [0825]使用實例5至8中所述的方法製備並表徵包封GFP RNA（TriLink Biotechnologies Inc.）的脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP。表29、表30、表31以及圖37A至圖37D中總結了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP的經測量的LNP大小、PDI、電荷和RNA含量值。如圖37A所示，所有脂質在pH 6.5 MES緩衝液中均導致LNP大小＜ 100 nm。脂質10和ALC-0315 LNP在凍融（10%蔗糖，在MES pH 6.5緩衝液中）後展現顯著的尺寸增加，然而，脂質15、16、24A和26 LNP展現更好的凍融穩定性，對粒徑的影響最小。關於脂質15、16、24A和26，在靶向抗體插入（在pH 6.5 MES中，37ºC培育4小時）後觀察到LNP直徑略有增加；而關於脂質10和ALC-0315 LNP，則觀察到直徑的較大增加，並且關於靶向性LNP，觀察到類似的凍融穩定性趨勢。除ALC-0315 LNP（其中觀察到更高的染料可及RNA）外，所有LNP均展現中等至較高的包封效率（＜ 15%染料可及RNA）。脂質10、15和16 LNP在酸性pH（5.5）中展現強正電荷，而在生理pH（7.4）中展現近中性電荷。相比之下，脂質24A、26和ALC-0315 LNP在酸性pH（5.5）中展現相對較弱的正電荷，在生理pH（7.4）中展現輕微的負電荷，這表明了脂質尾部化學的作用，所述脂質尾部化學導致降低LNP表觀pK a的可電離頭基的這種介面呈現。總之，除了在凍融後展現靶向性LNP平均直徑為約200 nm的脂質10 LNP，所有測試的脂質均導致可行的GFP mRNA包封和凍融穩定性以及＜ 150 nm的最終靶向性LNP直徑。如實例12和13中所述地評價脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP在由αCD8 T細胞受體靶向介導的原代人T細胞中誘導體外GFP蛋白表現的能力。 表29. 在pH 6.5 MBS中以及在αCD8靶向性（T8）接合物插入後，脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP的大小、多分散性（DLS）資料
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)；MBS Z-平均大小(nm)；插入後；MBS Z-平均大小(nm)；F/T後 多分散性(DLS)；MBS 多分散性(DLS)；插入後；MBS 多分散性(DLS)；F/T後
脂質10，DPG-PEG；EXP22008471-3q 90 131 208 0.21 0.22 0.18
脂質15，DPG-PEG；EXP22001312-3p 86 90 94 0.11 0.12 0.11
脂質16，DPG-PEG；EXP22008471-4a 92 106 109 0.17 0.20 0.17
脂質24A，DPG-PEG；EXP22008471-3t 82 91 94 0.10 0.12 0.16
脂質26，DPG-PEG；EXP22008471-3u 83 87 93 0.07 0.07 0.09
ALC-0315，DPG-PEG；EXP22008471-ALC 93 111 136 0.12 0.13 0.14
表30. 在pH 5.5和pH 7.4下，脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP的ζ電位（DLS）
可電離脂質，LNP編號 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4
脂質10，DPG-PEG；EXP22008471-3q 25.8 0.8
脂質15，DPG-PEG；EXP22001312-3p 18.4 -0.2
脂質16，DPG-PEG；EXP22008471-4a 24.5 -0.6
脂質24A，DPG-PEG；EXP22008471-3t -0.7 -5.9
脂質26，DPG-PEG；EXP22008471-3u 4.3 -5.2
ALC-0315，DPG-PEG；EXP22008471-ALC 4.4 -10.5
表31. 脂質10、15、16、24A、26 LNP的染料可及RNA和總RNA含量
可電離脂質，LNP編號 標稱mRNA濃度(µg/mL) 測量的總mRNA(µg/mL) 染料可及mRNA(%)
脂質10，DPG-PEG；EXP22008471-3q 150 124.30 10.9
脂質15，DPG-PEG；EXP22001312-3p 150 117.60 10.3
脂質16，DPG-PEG；EXP22008471-4a 150 109.90 9.40
脂質24A，DPG-PEG；EXP22008471-3t 150 134.90 26.4
脂質26，DPG-PEG；EXP22008471-3u 150 124.40 ≤ 6 (5.5)
ALC-0315，DPG-PEG；EXP22008471-ALC 150 88.50 14.70
實例 47. 具有脂質 10 、 15 、 16 、 24A 、 26 和 ALC-0315 αCD8 （ T8 ）靶向性 LNP （ 4ºC 儲存和凍融後）的原代人 T 細胞中的體外蛋白（ GFP ）表現 [0826]本實例對以下進行比較：由源自脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315（在一個凍融循環之前和之後）的LNP產生的GFP蛋白表現。使用實例2中所述的微流體混合和緩衝液交換方法產生帶有編碼GFP的mRNA（以及任選的螢光染料標記（DiI-C18-5DS））的奈米顆粒。使用實例5中所述的方法將αCD8 Fab接合物T8摻入母體LNP中，以獲得最終的抗體靶向性LNP調配物。在體外原代人CD8 T細胞中測試由此產生的顆粒，以評估報告基因表現。如圖38C和圖38D所示，採用這種T8 αCD8靶向策略，所有測試的LNP均顯示出相似較高的DiI+（染料）T細胞百分比和DiI MFI，反映了同樣有效的LNP與CD8 T細胞群體的締合。然而，觀察到GFP蛋白表現水平的顯著差異（透過GFP+ 細胞百分比反映，以及透過GFP MFI值反映的每個細胞產生的GFP蛋白的拷貝數）（圖38A和圖38B）。脂質15 LNP優於所述組中的其他脂質，其中脂質16、26和ALC-0315能夠實現相似且相對較高水平的蛋白表現。值得注意的是，在pH 5.5和pH 7.4下的脂質15和脂質16 LNP的ζ電位值表明電荷發生了很大變化，因此在內體區室酸化後，與內體膜融合（以及內體破壞/內體逃逸）的能力很強，然而，脂質26和ALC-0315 LNP的ζ電位值表明在內體酸化下電荷變化相對較小。因此，儘管電荷驅動內體膜失穩的能力潛在較低，如透過較高蛋白表現水平所證明的，但脂質26和ALC-0315 LNP能夠有效地胞質遞送GFP RNA有效載荷。這表明分支的脂質尾基團結構對更大的膜流動性和更明顯的尾基團「錐」形狀的潛在作用，從而有助於更大的內體膜融合、膜失穩和RNA有效載荷的高效內體逃逸。脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 αCD8（T8）靶向性LNP被原代人T細胞良好耐受（圖38E）。 實例 48. 含有 DLin-KC3-DMA GFP 和 BiTE 的脂質奈 米顆粒（ LNP ）的理化特性（插入之前和之後） [0827]使用實例6中所述的方法製備包封GFP-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）或BiTE mRNA（由Vernal Biosciences定制）的DLin-KC3-DMA LNP，並使用實例8中所述的方法進行表徵。表32以及圖39A至圖39D中總結了插入之前，DLin-KC3-DMA LNP的經測量的LNP大小和PDI、ζ電位和mRNA回收率，以及插入後的LNP和PDI。如圖39B所示，用DLin-KC3-DMA製備GFP LNP和BiTE LNP導致LNP大小＜ 100 nm。類似地，這兩種LNP的多分散性保持＜ 0.2。這兩種LNP展現中等至較高的包封效率（＜ 15%染料可及RNA）和＞ 80% RNA回收率（圖39C）。如圖39D所示，抗CD3和抗CD8插入具有DLin-KC3-DMA的BiTE LNP中導致LNP大小＜ 140 nm且多分散性≤ 0.2。 表32.插入之前的DLin-KC3-DMA LNP大小和PDI、ζ電位和mRNA回收率，以及插入後的大小和PDI。
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)； PDI(DLS)； 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4 mRNA回收率(%)； 染料可及(%)；
DLin-KC3-DMA，GFP； 91.53 0.08 21.4 3.32 86.9 9.4
DLin-KC3-DMA，BiTE； 91.33 0.10 18.1 2.97 83.3 10.6
CD3/CD8，DLin-KC3-DMA，BiTE； 137.6 0.22 - - - -
實例 49. 用 αCD3 （ 500A2 ）、 αCD4 （ GK1.5 ）和 αCD8 （ YTS156.7.7 ）靶向性 DLin-KC3-DMA LNP 轉染的 鼠 T 細胞的活力、 LNP 締 合（測量為 DiI 染料螢光）和 GFP 表現 [0828]在體外初始鼠CD3+ T細胞中測試產生的顆粒，以評估T細胞活力、LNP締合（DiI螢光）和GFP蛋白表現。在透過頸椎脫位使其安樂死後，收集6至8周大的雌性Balb/c小鼠的脾臟，切成小塊，然後通過70 µm細胞過濾器。在冷PBS中洗滌後，對脾細胞進行計數，並按照製造商的說明（StemCell Technologies，加拿大溫哥華），使用直接負磁分離法來純化CD3 +T淋巴細胞。將分離的CD3 +鼠T細胞以1 x 106個細胞/mL的濃度接種在六孔板中的RPMI-1640（其補充有10% FBS、1X ITS、55 µM 2-巰基乙醇和20 ng/mL重組鼠IL-2和5 ng/mL重組鼠IL-7）中。在處理前，使細胞在37ºC靜息至少2小時。 [0829]1 ug/mL/100,000個T細胞劑量水平的具有GFP有效載荷的所有靶向性脂質調配物被初始鼠T細胞良好耐受（圖40A）。透過評價摻入的DiI染料的信號來評估LNP與特定T細胞亞群的締合。轉染後24小時，在對應於特異性靶向部分的T細胞亞群中觀察到增加的DiI平均螢光強度（MFI）信號（圖40B、圖40C、圖40D、圖40E）。為了評價mRNA轉染，評估了靶向性LNP將編碼報告蛋白增強型綠色螢光蛋白（GFP）的mRNA遞送至鼠原代T細胞中的能力。與顆粒締合數據類似，在靶向性T細胞亞群中觀察到的GFP表現增加優於對特異性靶向部分呈陰性的亞群（圖40F、圖40G、圖40H、圖40I）。此外，為了研究CD3和CD8共同靶向是否可以協同作用，從而比CD3和CD8單一靶向提高mRNA遞送效率，將鼠T細胞用插入抗CD3和抗CD8 Fab兩者後的LNP處理。分別與CD3單靶向和CD8單靶向相比，共靶向被證明可增加CD4- T細胞中的GFP表現（圖40H）。 實例 50. 在 DLin-KC3-DMA LNP 中的不同的 αCD3 、 αTCR, αCD4 和 αCD8 靶向密度 下，對鼠 T 細胞的轉染 [0830]本實例對以下進行比較：在插入到DLin-KC3-DMA LNP中的不同的αCD3、αTCR、αCD4和αCD8靶向密度下，對鼠T細胞的轉染（圖41A至41H）。在體外初始鼠CD3+ T細胞中測試產生的顆粒，以評估LNP締合（DiI）和報告蛋白表現（GFP）。觀察到30個Fab/LNP的密度增加了CD8和CD4靶向部分的轉染效率（GFP）（圖41B和圖41F）。觀察到15個Fab/LNP（Fab/顆粒）的密度增加了CD3和TCR靶向部分的轉染效率（GFP）（圖41D）。 實例 51. 用 αCD3 （ 500A2 ）和 αCD8 （ YTS156.7.7 ）靶向性 DLin-KC3-DMA LNP 轉染的 鼠 T 細胞的啟動、細胞介素釋放、表型分型和基因表現分析 [0831]本實例對以下進行比較：用CD3靶向性DLin-KC3-DMA LNP轉染的鼠T細胞與用CD8靶向性DLin-KC3-DMA LNP轉染的鼠T細胞的活化、細胞介素釋放、表型分型和基因表現譜。使用nCounter小鼠泛癌免疫譜分析面板（NanoString Technologies，美國華盛頓）評估LNP轉染的CD8+ T細胞的基因表現譜，從而表徵770個鼠免疫學相關和癌相關基因。簡而言之，如上所述地分離並轉染CD8+ 鼠T細胞。使用緩衝液RLT（Qiagen，德國希爾登）裂解細胞，並在按照製造商的說明進行雜交之前，用蛋白酶K（Thermo Fisher，美國麻塞諸塞州）處理細胞裂解物。 [0832]透過流式細胞術在CD3和CD3/CD8靶向組中觀察到早期啟動標記CD69的上調，但在CD8靶向組中未觀察到（圖42A）。另外，在用CD3靶向性LNP處理的T細胞的上清液中觀察到IFN-γ和TNF-α水準增加（圖42B和圖42C）。當在LNP處理後48小時評估T細胞表型時，在用CD3靶向性LNP處理的組中觀察到從幼稚亞群到記憶亞群的轉變（圖42D）。使用來自NanoString Technologies的nCounter小鼠泛癌免疫譜分析面板評估經處理的T細胞的基因表現譜。支援CD69啟動資料，與CD8靶向性LNP組和未處理組相比，在用CD3或CD3/CD8靶向性LNP處理的組中觀察到與T細胞啟動相關的基因的上調（圖42E）。 實例 52. 在同系 Balb /c 小鼠中 ，使用 mCherry 報告蛋白和 DiI 染料螢光與 αCD3 （ 500A2 ）、 αCD4 （ GK1.5 ）和 αCD8 （ YTS156.7.7 ）靶向性 DLin-KC3-DMA LNP 進行體內 T 細胞重編程 [0833]本實例對以下進行比較：用αCD3（500A2）、αCD4（GK1.5）和αCD8（YTS156.7.7）靶向性DLin-KC3-DMA LNP與非靶向性比較型DLin-KC3-DMA LNP處理的野生型Balb/c小鼠中的LNP締合（DiI）和mCherry表現。將0.3 mg/kg和1 mg/kg的LNP透過尾靜脈靜脈注射到野生型BALB/c小鼠中。注射後24小時使小鼠安樂死，並收集選定的組織（血液、脾臟和肝臟），進行處理並染色，以透過流式細胞術進行分析。血液中約78%的CD3 +CD8 +T細胞在用抗CD8靶向時顯示LNP締合，而未靶向性LNP在相同細胞群中顯示＜ 2%締合（圖43A）。類似地，在用抗CD4靶向性LNP處理的小鼠中約67%的CD3 +CD4 +細胞群體呈DiI陽性，而在用相等劑量的非靶向性LNP處理的組中為約2%（圖43B）。在脾臟中，相對於非靶向性LNP，觀察到用靶向性LNP處理的所有組的特異性靶標依賴性細胞締合趨勢（圖43E和圖43F）。相比之下，肝臟中的T細胞亞群顯示出更高水平的非特異性LNP締合（圖43I和圖43J）。 [0834]透過評估包封的mRNA編碼的mCherry蛋白表現水平來評價mRNA的轉染效率。在所有分析的組織中，在用抗CD3和抗CD3/CD8靶向性LNP處理的組中觀察到mCherry表現（圖43C、圖43D、圖43G、圖43H、圖43K和圖43L）。 實例 53. 基於 DLin-KC3-DMA 脂質的 BiTE mRNA 和 αCD3/αCD8 靶向性 LNP 的體外細胞毒性 [0835]按照製造商的方案，使用IncuCyte NucLight Red慢病毒試劑（Sartorius，德國哥廷根）來轉導CT26細胞。使用嘌呤黴素選擇轉導的NucLight Red陽性細胞，並且在共培養試驗之前通過流式細胞術確認＞ 95%純度。將鼠CD3 +T細胞用DLin-KC3-DMA αCD3、αCD4、αCD8或αCD3/αCD8靶向性 BiTEmRNA LNP，DLin-KC3-DMA αCD3、αCD4-、αCD8-或αCD3/αCD8靶向性非 BiTEmRNA LNP（作為對照），或重組BiTE蛋白轉染。轉染後4小時，透過在PBS中洗滌而去除未結合的LNP。然後將轉染的T細胞與NucLight Red慢病毒轉導的CT26細胞以不同的效應細胞與靶細胞比率在96孔平底板中的T細胞培養基（RPMI-1640，10% FBS，1X ITS，55 µM 2-巰基乙醇，20 ng/mL重組鼠IL-2，以及5 ng/mL重組鼠IL-7）中共培養。每3小時在SX5 IncuCyte中監測癌細胞殺傷。透過將紅血球計數相對於初始時間點標準化來量化細胞毒性水平。 [0836]如圖44A、圖44B、圖44C和圖44D所示，與αCD3、αCD4、αCD8或αCD3/αCD8靶向性非BiTE mRNA LNP對照相比，αCD3、αCD4、αCD8或αCD3/αCD8靶向性BiTE mRNA LNP導致統計學顯著的細胞毒性增加。 實例 54. 基於 DLin-KC3-DMA 脂質的 BiTE mRNA 和 αCD3/αCD8 靶向性 LNP 的體內功效 [0837]在開始處理前7天，給6-8周齡的雌性Balb/c小鼠（每組n = 4）皮下接種2.5x10 5個CT26細胞，接種到右腹（圖45A）。根據腫瘤大小對小鼠進行隨機分組。腹膜內投予抗小鼠PD-1（殖株RMP1-14），每週兩次，總計六個劑量，以10 mg/kg投予。將DLin-KC3-DMA αCD3/αCD8靶向性BiTE mRNA LNP、非BiTE mRNA LNP（作為陰性對照）和重組抗EphA2 x CD3 BiTE通過靜脈注射投予到尾靜脈中，每週一次，總計三個劑量，以0.2 mg/kg投予。在整個研究期間，每週監測三次體重和腫瘤大小。 [0838]如圖45B、圖45C、圖45D、圖45E、圖45F、圖45G和圖45H所示，與靶向性非BiTE mRNA LNP對照相比，αCD3/αCD8靶向性BiTE mRNA LNP導致腫瘤負荷降低，存活率增加。此外，在測試劑量下，在重組BiTE處理組和媒介物對照之間未觀察到統計學顯著的存活率差異。 有關使用的 BiTE 和靶向部分的詳細資訊： [0839]由Vernal Biosciences（美國佛蒙特州）產生mRNA。簡而言之，編碼GFP、Fluc和抗EphA2 x CD3雙特異性T細胞接合器（BiTE）的mRNA在體外轉錄，加poly-A尾，並加帽（Cap1）。抗小鼠CD3和EphA2 scFv的胺基酸序列源自公共來源（500A2 Genbank AAB81028.1，AAB81027.1；KT3 Genbank AVW80143.1；2C11 EF063578.1；EphA2 Uniprot P29317）。BiTE mRNA的設計如下：小鼠κ鏈來源的信號肽，每個結合物的VH和VL結構域之間的3x(G4S)連接子，兩個結合物之間的4x(G4S)連接子，以及在結合區的5'端的FLAG標籤（序列：DYKDDDDK）。 [0840]抗小鼠CD3、TCR、CD8和CD4殖株的可變重鏈和輕鏈胺基酸序列源自公共來源（500A2 Genbank AAB81028.1，AAB81027.1；KT3 Genbank AVW80143.1；2C11 EF063578.1；H57 PDB 1NFD，YTS105.18.10 PDB 2ARJ；YTS169.4.2.1，YTS156.7.7和2.43 AB030195；GK1.5 Genbank AAA51349.1；PMID 16901500）。在HEK中產生Fab，將其透過IMAC純化，並透過Biointron（中國泰州）調配到PBS中。 實例 55. 含有脂質 15 mcherry 和 CAR 的脂質奈 米顆粒（ LNP ）的理化特性（插入之前和之後） [0841]使用實例5中所述的方法製備包封mCherry-RNA（由TriLink Biotechnologies Inc.定制）或CAR mRNA（由Vernal Biosciences定制）的脂質15 LNP，並使用實例8中所述的方法進行表徵。表33以及圖46A至圖46D中總結了插入之前，脂質15 LNP的經測量的LNP大小和PDI、ζ電位和mRNA回收率。如圖46B所示，用脂質15製備mCherry和CAR LNP導致LNP大小＜ 120 nm。類似地，這兩種LNP的多分散性保持＜ 0.2。這兩種LNP展現中等至較高的包封效率（＜ 20%染料可及RNA）和＞ 90% RNA回收率（圖46C）。表34中總結了插入的脂質15 LNP的經測量的LNP大小和PDI。如圖46D所示，用脂質15製備插入抗CD4和/或抗CD8的mCherry和CAR LNP導致LNP大小＜ 140 nm。類似地，所有插入的LNP的多分散性保持≤ 0.2。 表33.插入之前，脂質15 LNP的大小和PDI、ζ電位和mRNA回收率。
可電離脂質，LNP編號 Z-平均大小(nm)； PDI(DLS)； 電荷(ZP，mV)；pH 5.5 電荷(ZP，mV)；pH 7.4 mRNA回收率(%)； 染料可及(%)；
脂質15，mCherry； 95.15 0.115 21.8 0.619 106 12
脂質15，CAR； 112.35 0.129 21.9 0.935 113 17
表34.插入後，脂質15 LNP的大小和PDI。
可電離脂質，LNP編號，mRNA，靶向部分 Z-平均大小(nm)； PDI(DLS)；
脂質15，mCherry，TRX2 128.6 0.24
脂質15，mCherry，伊巴珠單抗 138.3 0.20
脂質15，mCherry，TRX2/伊巴珠單抗(密度1) 134.2 0.17
脂質15，mCherry，TRX2/伊巴珠單抗(密度2) 130.1 0.18
脂質15，CAR，TRX2 125.2 0.15
脂質15，CAR，伊巴珠單抗 132.4 0.21
脂質15，CAR，TRX2/伊巴珠單抗(密度1) 127.4 0.16
脂質15，CAR，TRX2/伊巴珠單抗(密度2) 130.1 0.18
實例 56. 用 αCD4 （伊巴珠單抗）和 αCD8 （ TRX2 ）靶向性脂質 15 LNP 轉染的 人 CD3 + 、 CD4 + 和 CD8 + 原代 T 細胞的活力、 mCherry 和 CAR 表現 [0842]本實例將進行以下比較：由CD4（伊巴珠單抗）或CD8（TRX2）Fab接合物靶向的脂質15 LNP與CD4（伊巴珠單抗）和CD8（TRX2）Fab接合物靶向的那些脂質15 LNP產生的CAR和mCherry蛋白表現。對於單靶向性LNP，將伊巴珠單抗和TRX2分別以30個Fab/LNP和5個Fab/LNP插入。插入雙靶向性LNP，15個伊巴珠單抗Fab/LNP和5個TRX2 Fab/LNP（密度1），或15個伊巴珠單抗Fab/LNP和15個TRX2 Fab/LNP（密度2）。在體外原代人CD3+、CD4+和CD8+ T細胞中測試產生的顆粒，以分別評估T細胞活力以及mCherry和CAR表現。在體外實驗中，單靶向性和雙靶向性LNP兩者均被CD3、CD4和CD8 T細胞亞群良好耐受，其中經處理的樣品的T細胞活力值與未處理的對照相當，如圖47A所示。在相應的靶向性T細胞亞群（CD3+、CD4+和CD8+）中，單靶向性和雙靶向性LNP在mCherry+或CAR+ T細胞的比例以及每個細胞產生的mCherry或CAR蛋白的拷貝數（透過MFI值反映）這兩個方面表現相似（圖47B、圖47C、圖47D和圖47E）。 實例 57. 製備 Fab- 脂質接合物以實現體內靶向 [0843]本實例描述了一種用於產生靶向基團接合物的方法，所述靶向基團接合物用於將LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）摻入靶細胞中。 [0844]經由在Fab最初還原後馬來醯亞胺基團與重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價連接，將結合優選細胞類型的特定靶標的Fab與DSPE-PEG-馬來醯亞胺偶聯。將10 mg/mL的所述蛋白質用分子生物學級水在磷酸鹽緩衝鹽水（10 mM磷酸鹽，140 mM NaCl pH 7.4）中重構，並在還原緩衝液中進一步稀釋至5 mg/mL，所述還原緩衝液具有50 mM磷酸鹽、10 mM檸檬酸鹽、75 mM NaCl、5 mM EDTA（pH 6.0）的最終濃度以及20 mM L-半胱胺酸還原劑，並在25ºC在氬氣環境下在攪拌下培育1小時。在室溫下，使用配備有HEPA空氣過濾系統的自動超濾/滲濾緩衝液交換（Unchained Labs，美國加利福尼亞州），使用在24孔聚丙烯過濾板中的10 kDa截留分子量再生纖維素膜，將還原的蛋白質立即進行緩衝液交換到99.9%偶聯緩衝液（5 mM檸檬酸鹽，140 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 6.0）中。在還原和緩衝液交換後，根據製造商的方案（Thermo Fisher Scientific Peirce Biotechnology，美國伊利諾州），使用Ellman試劑（5,5'-二硫代-雙-[2-硝基苯甲酸]），還原和緩衝液交換後的游離巰基含量被測量為＜ 1.1/Fab分子。 [0845]在緩衝液交換後1小時內儘快通過添加在分子生物學級水中的具有12 mg/mL DSPE-PEG-OCH3（NOF America，美國紐約）和8 mg/mL DSPE-PEG-馬來醯亞胺（NOF America，美國紐約）的膠束懸浮液來啟動接合反應。接合反應以以下進行：最終濃度為3.8 mg/mL的Fab和8.25莫耳過量的馬來醯亞胺，在25ºC在氬氣環境下在攪拌下持續4小時。透過HPLC和SDS-PAGE監測所得接合物的產生。將反應在1.0 mM L-半胱胺酸中在室溫淬滅10分鐘，並在4ºC儲存12至16小時。在室溫下，使用配備有HEPA空氣過濾系統的自動超濾/滲濾緩衝液交換（Unchained Labs，美國加利福尼亞州），使用在24孔聚丙烯過濾板中的100 kDa截留分子量再生纖維素膜，將所得的含有DSPE-PEG-Fab的粗接合反應物從游離Fab中純化，並進行緩衝液交換到99.9%緩衝液（10 mM檸檬酸鹽，10%（w/v）蔗糖，pH 7.0）中。透過HPLC和SDS-PAGE評估最終接合物的純度。在淬滅後，最終的膠束組成物由DSPE-PEG-Fab、DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）和DSPE-PEG-OCH3的混合物組成。 透過引用併入 [0846]除非另外定義，否則本文中的所有技術和科技術語均具有與本發明所屬領域的具有通常知識者通常所理解的相同含義。儘管在實踐或測試本發明時可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但本文描述了優選的方法和材料。將引用的所有出版物、科學文章、專利和專利公開案出於所有目的均通過引用以其整體併入本文。 [0847]僅針對先於本申請的申請日的披露內容提供本文所討論的出版物。本文中的任何內容均不應解釋為承認本發明因在先發明而無權早於這個出版物。 等效方案 [0848]在不脫離本發明的精神或本質特徵的情況下，本發明可以以其他特定形式實施。因此，前述實施例在所有態樣均被認為是說明性的，而不是限制本文所述的本發明。因此，本發明的範圍由所附申請專利範圍而不是由前述描述來指示，並且在申請專利範圍的等同意義和範圍內的所有變化均旨在包含在其中。雖然已經結合本發明的具體實施例對本發明進行了描述，但應理解，能夠進行進一步修改，並且本申請旨在涵蓋對本發明的任何改變、使用或改編，所述改變、使用或改編大體上符合本發明的原理並且包括與本公開文本的此類偏離，所述偏離在本發明所屬領域內的已知或習慣實踐的範圍內，並且可以適用於上文所闡述的和如下在所附申請專利範圍的範圍內的實質特徵。
無
[0111]圖1描繪了中間體13-11的質子NMR譜。 [0112]圖2A描繪了中間體13-11a的質子NMR譜；圖2B描繪了中間體13-11b的質子NMR譜；圖2C描繪了中間體13-11b的LC-ELSD。 [0113]圖3A描繪了中間體13-10的質子NMR譜；圖3B描繪了中間體13-10的LC-CAD層析圖。 [0114]圖4A-1描繪了脂質1的質子NMR譜；圖4A-2描繪了脂質1的LC-CAD層析圖。 [0115]圖4B-1描繪了脂質3的質子NMR譜；圖4B-2描繪了脂質3的LC-CAD層析圖。 [0116]圖4C-1描繪了脂質4的質子NMR譜；圖4C-2描繪了脂質4的LC-CAD層析圖L。 [0117]圖4D-1描繪了脂質5A的質子NMR譜；圖4D-2描繪了脂質5A的LC-CAD層析圖。 [0118]圖4E-1描繪了脂質6的質子NMR譜；圖4E-2描繪了脂質6的LC-CAD層析圖。 [0119]圖4F-1描繪了脂質7的質子NMR譜；4F-2描繪了脂質7的LC-CAD層析圖。 [0120]圖4G-1描繪了脂質2的質子NMR譜；4G-2描繪了脂質2的LC-CAD層析圖。 [0121]圖4H-1描繪了脂質8的質子NMR譜；圖4H-2描繪了脂質8的LC-CAD層析圖。 [0122]圖4I-1描繪了脂質9的質子NMR譜；4I-2描繪了脂質9的LC-CAD層析圖。 [0123]圖4J-1描繪了脂質10A的質子NMR譜；圖4J-2描繪了脂質10A的LC-CAD層析圖。 [0124]圖4K-1描繪了脂質11A的質子NMR譜；4K-2描繪了脂質11A的LC-CAD層析圖。 [0125]圖4L-1描繪了脂質12的質子NMR譜；圖4L-2描繪了脂質12的LC-CAD層析圖。 [0126]圖4M-1描繪了脂質13的質子NMR譜；圖4M-2描繪了脂質13的LC-CAD層析圖。 [0127]圖4N-1描繪了脂質15的質子NMR譜；圖4N-2描繪了脂質15的LC-CAD層析圖。 [0128]圖4O-1描繪了脂質16的質子NMR譜；圖4O-2描繪了脂質16的LC-CAD。 [0129]圖4P-1描繪了脂質19的質子NMR譜；圖4P-2描繪了脂質19的LC-ELSD層析圖。 [0130]圖4Q-1描繪了脂質20的質子NMR譜；圖4Q-2描繪了脂質20的LC-ELSD層析圖。 [0131]圖4R-1描繪了脂質31的質子NMR譜；圖4R-2描繪了脂質31的LC-CAD層析圖。 [0132]圖4S-1描繪了脂質32的質子NMR譜；圖4S-2描繪了脂質32的LC-CAD層析圖。 [0133]圖4T-1描繪了脂質33的質子NMR譜；圖4T-2描繪了脂質33的LC-CAD層析圖。 [0134]圖4U-1描繪了脂質34的質子NMR譜；圖4U-2描繪了脂質34的LC-CAD層析圖。 [0135]圖4V-1描繪了脂質14A的質子NMR譜；4V-2描繪了脂質14A的LC-CAD層析圖。 [0136]圖4W-1描繪了脂質17A的質子NMR譜；4W-1描繪了脂質17A的LC-CAD層析圖。 [0137]圖4X-1描繪了脂質18A的質子NMR譜；4X-2描繪了脂質18A的LC-CAD層析圖。 [0138]圖4Y-1描繪了脂質21A的質子NMR譜；4Y-2描繪了脂質21A的LC-CAD層析圖。 [0139]圖4Z-1描繪了脂質22的質子NMR譜；圖4Z-2描繪了脂質22的LC-CAD層析圖。 [0140]圖4AA-1描繪了脂質23A的質子NMR譜；4AA-2描繪了脂質23A的LC-CAD層析圖。 [0141]圖4AC-1描繪了脂質25A的質子NMR譜；4AC-2描繪了脂質25A的LC-CAD層析圖。 [0142]圖4AE-1描繪了脂質27的質子NMR譜；圖4AE-2描繪了脂質27的LC-CAD層析圖。 [0143]圖4AF-1描繪了脂質28的質子NMR譜；圖4AF-2描繪了脂質28的LC-CAD層析圖。 [0144]圖4AG-1描繪了脂質29的質子NMR譜；4AG-2描繪了脂質29的LC-CAD層析圖。 [0145]圖4AH-1描繪了脂質37A的質子NMR譜；4AH-2描繪了脂質37A的LC-CAD層析圖。 [0146]圖4AI-1描繪了脂質19A的質子NMR譜；4AI-2描繪了脂質19A的LC-CAD層析圖。 [0147]圖4AJ-1描繪了脂質20A的質子NMR譜；4AJ-2描繪了脂質20A的LC-CAD層析圖。 [0148]圖5A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質1至脂質8的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0149]圖5B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質1至脂質8的LNP的多分散性（DLS）。 [0150]圖5C描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS中，基於脂質1至脂質8的LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0151]圖5D描繪了在基於脂質1至脂質8的LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0152]圖6A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質9、10、11和15的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0153]圖6B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質9、10、11和15的LNP的多分散性（DLS）。 [0154]圖6C描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS中，基於脂質9、10、11和15的LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0155]圖6D描繪了在基於脂質9、10、11和15的LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0156]圖7A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質31至脂質34的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0157]圖7B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質31至脂質34的LNP的多分散性（DLS）。 [0158]圖7C描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS中，基於脂質31至脂質34的LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0159]圖7D描繪了在基於脂質31至脂質34的LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0160]圖8A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在插入αCD8抗體接合物TRX-2和T8後，基於脂質1、3、4、5、9和15的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0161]圖8B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在插入αCD8抗體接合物TRX-2和T8後，基於脂質1、3、4、5、9和15的LNP的多分散性（DLS）。 [0162]圖9A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在插入αCD8抗體接合物TRX-2和T8後，基於脂質1、8、9、10、11和15的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0163]圖9B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在插入αCD8抗體接合物TRX-2和T8後，基於脂質1、8、9、10、11和15的LNP的多分散性（DLS）。 [0164]圖10A描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質3、4、33和34的LNP的直徑（DLS，nm）。 [0165]圖10B描繪了在pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質3、4、33和34的LNP的多分散性（DLS）。 [0166]圖10C描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS、pH 6.5 MBS中，在抗體（αCD3，hSP34）插入後和凍融（-80ºC）後，基於脂質3、4、33和34的LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0167]圖10D描繪了在基於脂質3、4、33和34的LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0168]圖11A描繪了被基於ALC-0315、DLin-MC3-DMA、脂質3、脂質6和脂質7（4ºC儲存）的αCD8（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處GFP +T細胞的百分比。 [0169]圖11B描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的ALC-0315、DLin-MC3-DMA、脂質3、脂質6和脂質7的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處GFP +T細胞的百分比。 [0170]圖11C描繪了被基於ALC-0315、DLin-MC3-DMA、脂質3、脂質6和脂質7（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0171]圖11D描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的ALC-0315、DLin-MC3-DMA、脂質3、脂質6和脂質7的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0172]圖11E描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的ALC-0315、DLin-MC3-DMA、脂質3、脂質6和脂質7的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比；在24小時處活T細胞的百分比。 [0173]圖12A描繪了被基於SM-102、DLin-KC2-DMA、脂質3、脂質4（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處GFP +T細胞的百分比。 [0174]圖12B描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的SM-102、DLin-KC2-DMA、脂質3、脂質4的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處GFP +T細胞的百分比。 [0175]圖12C描繪了被基於SM-102、DLin-KC2-DMA、脂質3、脂質4（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0176]圖12D描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的SM-102、DLin-KC2-DMA、脂質3、脂質4的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0177]圖12E描繪了被基於1個凍融循環（-80ºC儲存）後的SM-102、DLin-KC2-DMA、脂質3、脂質4的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比；在24小時處活T細胞的百分比。 [0178]圖13A描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質1（4ºC儲存）、脂質3（4ºC儲存）和脂質5（4ºC儲存）的靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0179]圖13B描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質1、脂質3和脂質5（凍融循環（-80ºC儲存）後）的靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0180]圖13C描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質1（4ºC儲存）、脂質3（4ºC儲存）和脂質5（4ºC儲存）的靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0181]圖13D描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質1、脂質3和脂質5（凍融循環（-80ºC儲存）後）的靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0182]圖13E描繪了被基於-80ºC儲存的DLin-KC2-DMA、脂質1、脂質3和脂質5的靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0183]圖14A描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質1（4ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）和脂質8（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0184]圖14B描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質1（4ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）和脂質8（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0185]圖14C描繪了具有基於DLin-KC2-DMA、脂質1（4ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）和脂質8（-80ºC儲存）的靶向性LNP的活細胞的百分比。 [0186]圖15A描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質10（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0187]圖15B描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（-80ºC儲存）和脂質10（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0188]圖15C描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質10（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0189]圖15D描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（-80ºC儲存）和脂質10（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0190]圖15E描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質10（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比；活T細胞的百分比。 [0191]圖15F描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質8（-80ºC儲存）和脂質10（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比；活T細胞的百分比。 [0192]圖16A描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質15（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0193]圖16B描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質15（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0194]圖16C描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質15（4ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0195]圖16D描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質15（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0196]圖16E描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）和脂質15（-80ºC儲存）的αCD3（hsp34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0197]圖17A描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較；GFP +T細胞的百分比。 [0198]圖17B描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較；在活T細胞中的GFP MFI。 [0199]圖17C描繪了具有基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（TRX2）靶向性LNP的+ Dil T細胞的百分比，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0200]圖17D描繪了具有基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（TRX2）靶向性LNP的活T細胞中的Dil MFI，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0201]圖17E描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0202]圖18A描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較；GFP +T細胞的百分比。 [0203]圖18B描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較；在活T細胞中的GFP MFI。 [0204]圖18C描繪了具有基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（T8）靶向性LNP的+ Dil T細胞的百分比，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0205]圖18D描繪了具有基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（T8）靶向性LNP的活T細胞中的Dil MFI，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0206]圖18E描繪了被基於脂質3、脂質4、脂質9、脂質15的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比，並與相應的非靶向性母體LNP進行比較。 [0207]圖19A描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質2、脂質3、脂質31和脂質32（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0208]圖19B描繪了被基於DLin-KC2-DMA、脂質2、脂質3、脂質31和脂質32（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0209]圖19C描繪了具有基於DLin-KC2-DMA、脂質2、脂質3、脂質31和脂質32（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP的活T細胞的百分比。 [0210]圖20A描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（4ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）、脂質34（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的，或被基於脂質33（4ºC儲存）、脂質34（4ºC儲存）的αCD8（muOKT8）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0211]圖20B描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）、脂質34（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；GFP +T細胞的百分比。 [0212]圖20C描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）、脂質34（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的，或被基於脂質33（4ºC儲存）、脂質34（4ºC儲存）的αCD8（muOKT8）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0213]圖20D描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）、脂質34（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的原代人T細胞中的GFP表現；在活T細胞中的GFP MFI。 [0214]圖20E描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）、脂質34（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的，或被基於脂質33（4ºC儲存）和脂質34（4ºC儲存）的αCD8（muOKT8）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0215]圖21A描繪了被基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質33（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的αCD20（TTR-023）CAR+ T細胞的百分比；如通過M1值百分比所示。 [0216]圖21B描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的αCD20（TTR-023）CAR+ T細胞的百分比；如通過M1值百分比所示。 [0217]圖21C描繪了被基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質33（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的T細胞中的αCD20（TTR-023）CAR MFI的百分比。 [0218]圖21D描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的T細胞中的αCD3（hSP34）CAR MFI的百分比。 [0219]圖21E描繪了被基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）和脂質33（4ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0220]圖21F描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD3（hSP34）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0221]圖22A描繪了具有基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP的αCD20（TTR-023）CAR+ T細胞（CD8群體）的百分比；如通過CD4-M1值百分比所示。 [0222]圖22B描繪了具有基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP的T細胞（CD8群體）中的αCD20（TTR-023）CAR MFI；如通過CD4-M1 MFI值所示。 [0223]圖22C描繪了被基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的αCD20（TTR-023）CAR水準；如通過M1值百分比所示。 [0224]圖22D描繪了被基於DLin-KC2-DMA（-80ºC儲存）、脂質3（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）、脂質34（-80ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的αCD20（TTR-023）CAR水準；如通過M1 MFI值所示。 [0225]圖22E描繪了被基於脂質3（4ºC儲存）、脂質4（4ºC儲存）、脂質9（4ºC儲存）、脂質33（4ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的活T細胞（CD4/CD8群體）的百分比。 [0226]圖23A描繪了被基於一個凍融循環後的脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的αCD20（TTR-023）CAR+ T細胞（CD8群體）的百分比；如通過CD4-M1值百分比所示。 [0227]圖23B描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）（一個凍融循環後）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的T細胞（CD8群體）中的αCD20（TTR-023）CAR MFI；如通過CD4-M1 MFI值所示。 [0228]圖23C描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的αCD20（TTR-023）CAR水平；如通過CD4+M1值百分比所示。 [0229]圖23D描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的αCD20（TTR-023）CAR水平；如通過CD4+ M1 MFI值所示。 [0230]圖23E描繪了被基於脂質3（-80ºC儲存）、脂質4（-80ºC儲存）、脂質9（-80ºC儲存）、脂質33（-80ºC儲存）的αCD8（T8）靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0231]圖24A描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8+ T細胞中的GFP表現；如通過GFP +T細胞的百分比所示。 [0232]圖24B描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8+ T細胞中的GFP表現；如通過GFP MFI所示。 [0233]圖24C描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的GFP表現；如通過GFP +T細胞的百分比所示。 [0234]圖24D描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的GFP表現；如通過GFP MFI所示。 [0235]圖24E描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的Dil+ CD8+ T細胞的百分比；如通過Dil+ T細胞的百分比所示。 [0236]圖24F描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8+ T細胞中的Dil MFI；如通過Dil MFI所示。 [0237]圖24G描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的Dil+ CD4+ T細胞的百分比；如通過Dil+ T細胞的百分比所示。 [0238]圖24H描繪了與載體對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD4+ T細胞中的Dil MFI；如通過Dil MFI所示。 [0239]圖25A描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的NK細胞中的GFP表現；如通過GFP +NK細胞的百分比所示。 [0240]圖25B描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的NK細胞中的GFP表現；如通過GFP MFI所示。 [0241]圖25C描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的顆粒球中的GFP表現；如通過GFP+顆粒球的百分比所示。 [0242]圖25D描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的顆粒球中的GFP表現；如通過GFP MFI所示。 [0243]圖25E描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的B細胞中的GFP表現；如通過GFP +B細胞的百分比所示。 [0244]圖25F描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的B細胞中的GFP表現；如通過GFP MFI所示。 [0245]圖26A描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的NK細胞結合的LNP；如通過Dil+ NK細胞的百分比所示。 [0246]圖26B描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的NK細胞結合的LNP；如通過Dil MFI所示。 [0247]圖26C描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的顆粒球結合的LNP；如通過Dil+顆粒球的百分比所示。 [0248]圖26D描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的顆粒球結合的LNP；如通過Dil MFI所示。 [0249]圖26E描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的B細胞結合的LNP；如通過Dil+ B細胞的百分比所示。 [0250]圖26F描繪了與未結合對照（mutOKT8）和未轉染的相比，與被基於脂質9、脂質15或DLin-KC3-DMA的αCD3（hSP34）靶向性或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的全血樣品中的B細胞結合的LNP；如通過Dil MFI所示。 [0251]圖27A描繪了被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後24小時的活T細胞的百分比。 [0252]圖27B描繪了在被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後表現M1（TRR-023）CAR的CD8（CD4-）T細胞的百分比。 [0253]圖27C描繪了被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8（CD4-）T細胞中的M1（TTR-023）表現平均螢光強度（MFI）。 [0254]圖27D描繪了在被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後具有mCherry表現的CD8（CD4-）T細胞的百分比。 [0255]圖27E描繪了被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8（CD4-）T細胞中的mCherry表現平均螢光強度（MFI）。 [0256]圖27F描繪了在被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後具有M1（TTR-023）CAR表現的CD4+ T細胞的百分比。 [0257]圖27G描繪了在被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後CD4+ T細胞中的M1（TRR-023）表現平均螢光強度（MFI）。 [0258]圖27H描繪了在被基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後具有mCherry表現的CD4+ T細胞的百分比。 [0259]圖27I描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T進行的共培養實驗中死亡Raji細胞的百分比。 [0260]圖28A描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中死亡Raji細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為1：1、4：1和8：1。 [0261]圖28B描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中活CD8（CD4-）T細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為1：1、4：1和8：1。 [0262]圖28C描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質9或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中活CD4+ T細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為1：1、4：1和8：1。 [0263]圖29A描繪了被基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後24小時的活T細胞的百分比。 [0264]圖29B描繪了在被基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後表現M1（TRR-023 CAR）的CD8（CD4-）T細胞的百分比。 [0265]圖29C描繪了被基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8（CD4-）T細胞中的M1（TTR-023 CAR）表現平均螢光強度（MFI）。 [0266]圖29D描繪了在被基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染後具有mCherry表現的CD8（CD4-）T細胞的百分比。 [0267]圖29E描繪了被基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD8（CD4-）T細胞中的mCherry表現平均螢光強度（MFI）。 [0268]圖30A描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中死亡Raji細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為0.31：1、1：1、3.16：1、10：1和31.6：1。 [0269]圖30B描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中活CD8（CD4-）T細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為0.31：1、1：1、3.16：1、10：1和31.6：1。 [0270]圖30C描繪了在Raji（B細胞）與使用基於脂質15或DLin-KC3-DMA的表現αCD20（TTR-023）CAR或mCherry的αCD8（TRX2）靶向性LNP產生的CAR-T細胞進行的共培養實驗中活CD4+ T細胞的百分比，其中效應細胞:靶細胞比率為0.31：1、1：1、3.16：1、10：1和31.6：1。 [0271]圖31描繪了各種Fab、VHH（Nb）、ScFv、Fab-ScFv和Fab-VHH雜交體的結構。 [0272]圖32A描繪了被基於脂質9、脂質10、脂質13、脂質15或DLin-KC2-DMA（4ºC或凍融後（-80ºC儲存）儲存）的αCD3靶向性LNP轉染的T細胞中的GFP表現，如通過GFP+ T細胞的百分比所示。 [0273]圖32B描繪了被基於脂質9、脂質10、脂質13、脂質15或DLin-KC2-DMA（4ºC或凍融後（-80ºC儲存）儲存）的αCD3靶向性LNP轉染的T細胞中的GFP表現，如通過GFP MFI所示。 [0274]圖32C描繪了被基於脂質9、脂質10、脂質13、脂質15或DLin-KC2-DMA（4ºC或凍融後（-80ºC儲存）儲存）的αCD3靶向性LNP轉染的Dil+ T細胞的百分比，如通過Dil+ T細胞的百分比所示。 [0275]圖32D描繪了被基於脂質9、脂質10、脂質13、脂質15或DLin-KC2-DMA（4ºC或凍融後（-80ºC儲存）儲存）的αCD3靶向性LNP轉染的活T細胞中的Dil MFI，如通過Dil MFI百分比所示。 [0276]圖32E描繪了被基於脂質9、脂質10、脂質13、脂質15或DLin-KC2-DMA（4ºC或凍融後（-80ºC儲存）儲存）的αCD3靶向性LNP轉染的活T細胞的百分比。 [0277]圖33A至圖33C描繪了在使用脂質15、DLin-KC3-DMA和脂質9 LNP調配物以及用α-CD8靶向性TRX-2抗體注射GFP RNA後24小時，血液（圖33A）、脾臟（圖33B）和肝臟（圖33C）樣品（分析每個圖例的其他目的細胞類型）中的GFP+ T細胞（CD4和CD8群體）的百分比。 [0278]圖34A至圖34C描繪了在使用脂質15（DiI染料標記的）、DLin-KC3-DMA（未使用DiI染料標記）和脂質9 LNP（DiI染料標記的）調配物以及α-CD8靶向性TRX-2抗體注射GFP RNA後24小時，血液（圖34A）、脾臟（圖34B）和肝臟（圖34C）樣品（分析每個圖例的其他目的細胞類型）中的DiI+ T細胞（CD4和CD8群體）的百分比。 [0279]圖35A描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的GFP表現的百分比。 [0280]圖35B描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的GFP表現平均螢光強度（MFI）。 [0281]圖35C描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的GFP表現的百分比。 [0282]圖35D描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的GFP表現平均螢光強度（MFI）。 [0283]圖35E描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的GFP表現的百分比。 [0284]圖35F描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的GFP表現平均螢光強度（MFI）。 [0285]圖35G描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的GFP表現的百分比。 [0286]圖35H描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的GFP表現平均螢光強度（MFI）。 [0287]圖36A描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的DiI+的百分比。 [0288]圖36B描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的DiI MFI。 [0289]圖36C描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的DiI+的百分比。 [0290]圖36D描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD8 T細胞中的DiI+的百分比。 [0291]圖36E描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的DiI+的百分比。 [0292]圖36F描繪了具有基於脂質15以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的DiI MFI。 [0293]圖36G描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的DiI+的百分比。 [0294]圖36H描繪了具有基於脂質DLin-KC3-DMA以及α-CD8和α-CD3靶標的α-CD2、α-CD4、α-CD7、α-CD28、α-TCR和非結合（突變型OKT8）靶向性LNP的CD4 T細胞中的DiI MFI。 [0295]圖37A描繪了凍融前後脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315脂質靶向性LNP（αCD8）的直徑（DLS，nm）。 [0296]圖37B描繪了凍融前後脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315脂質靶向性LNP（αCD8）的多分散性（DLS）。 [0297]圖37C描繪了在pH 5.5 MES和pH 7.4 HBS中，脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315脂質LNP的ζ電位（mV）。 [0298]圖37D描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315脂質的總RNA含量（ug/mL）和染料可及RNA的百分比。 [0299]圖38A描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP轉染中GFP+ T細胞的百分比。 [0300]圖38B描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP轉染中T細胞的GFP-MFI。 [0301]圖38C描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP轉染中DiI+ T細胞的百分比。 [0302]圖38D描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP轉染中T細胞的DiI-MFI。 [0303]圖38E描繪了脂質10、15、16、24A、26和ALC-0315 LNP轉染中活T細胞的百分比。 [0304]圖39A描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS中，在抗體插入之前，基於DLin-KC3-DMA的GFP LNP和BiTE LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0305]圖39B描繪了在抗體插入之前，基於DLin-KC3-DMA的GFP LNP和BiTE LNP的直徑（DLS，nm），以及基於DLin-KC3-DMA的GFP LNP和BiTE LNP的多分散性（DLS）。 [0306]圖39C描繪了在抗體插入之前，基於DLin-KC3-DMA的GFP LNP和BiTE LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0307]圖39D描繪了在抗體（αCD3（500A2）和αCD8（YTS156.7.7））插入後，基於DLin-KC3-DMA的BiTE LNP的直徑Z平均大小（DLS，nm），以及基於DLin-KC3-DMA的BiTE LNP的多分散性（DLS）。 [0308]圖40A描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的活初始鼠T細胞的百分比；在24小時處活T細胞的百分比。 [0309]圖40B描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD4-初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處DiI+活T細胞的百分比。 [0310]圖40C描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD8-初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處DiI+活T細胞的百分比。 [0311]圖40D描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD4-初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處在活T細胞中的DiI MFI。 [0312]圖40E描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD8-初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處在活T細胞中的DiI MFI。 [0313]圖40F描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD4-初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處GFP+活T細胞的百分比。 [0314]圖40G描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD8-初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處GFP+活T細胞的百分比。 [0315]圖40H描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD4-初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0316]圖40I描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5）、αCD3（500A2）和/或αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP電穿孔而轉染的CD8-初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處在活T細胞中的GFP MFI。 [0317]圖41A描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（2.43、YTS156.7.7或YTS169.4.2.1）靶向性LNP（以5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處DiI+活T細胞的百分比。 [0318]圖41B描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（2.43、YTS156.7.7或YTS169.4.2.1）靶向性LNP（以5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處GFP+活T細胞的百分比。 [0319]圖41C描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD3（2C11、500A2或KT3）或αTCR（H57）靶向性LNP（以5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處DiI+活T細胞的百分比。 [0320]圖41D描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD3（2C11、500A2或KT3）或αTCR（H57）靶向性LNP（以5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處GFP+活T細胞的百分比。 [0321]圖41E描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）靶向性LNP（以2.5、5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的DiI LNP締合；在24小時處DiI+活T細胞的百分比。 [0322]圖41F描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）靶向性LNP（以2.5、5、15或30 Fab/LNP插入）轉染的初始鼠T細胞中的GFP LNP轉染；在24小時處GFP+活T細胞的百分比。 [0323]圖41G描繪了被各種α-CD3/α-CD8靶向性DLIN-KC3-DMA LNP轉染的鼠T細胞中的DiI的百分比。 [0324]圖41H描繪了被各種α-CD3/α-CD8靶向性DLIN-KC3-DMA LNP轉染的鼠T細胞中的GFP+的百分比。 [0325]圖42A描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP轉染的初始鼠T細胞中的CD69表現；在24小時處CD69+活T細胞的百分比。 [0326]圖42B描繪了由被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP轉染的初始鼠T細胞進行的IFN-γ分泌；在24小時處IFN-γ在上清液中的濃度（pg/mL）。 [0327]圖42C描繪了由被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP轉染的初始鼠T細胞進行的TNF-α分泌；在24小時處TNF-α在上清液中的濃度（pg/mL）。 [0328]圖42D描繪了被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP轉染的初始鼠T細胞的表型；CM，中央記憶；EM，效應記憶；SCM，T記憶類幹細胞；在轉染後24小時對細胞進行表型分析。 [0329]圖42E描繪了與被基於DLin-KC3-DMA的αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP轉染的初始鼠T細胞的啟動相關的基因的基因表現水平；轉染後24小時對基因表現進行評估。 [0330]圖43A描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時血液中的DiI+ CD8+ T細胞的百分比。 [0331]圖43B描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時血液中的DiI+ CD4+ T細胞的百分比。 [0332]圖43C描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時血液中的mCherry+ CD8+ T細胞的百分比。 [0333]圖43D描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時血液中的mCherry+ CD4+ T細胞的百分比。 [0334]圖43E描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時脾臟中的DiI+ CD8+ T細胞的百分比。 [0335]圖43F描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP處理的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時脾臟中的DiI+ CD4+ T細胞的百分比。 [0336]圖43G描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時脾臟中的mCherry+ CD8+ T細胞的百分比。 [0337]圖43H描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時脾臟中的mCherry+ CD4+ T細胞的百分比。 [0338]圖43I描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時肝臟中的DiI+ CD8+ T細胞的百分比。 [0339]圖43J描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的DiI LNP締合；在靜脈注射後24小時肝臟中的DiI+ CD4+ T細胞的百分比。 [0340]圖43K描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時肝臟中的mCherry+ CD8+ T細胞的百分比。 [0341]圖43L描繪了用基於DLin-KC3-DMA的αCD4（GK1.5v1）、αCD8（YTS156.7.7）和/或αCD3（500A2）靶向性LNP治療的初始鼠T細胞體內的mCherry LNP表現；在靜脈注射後24小時肝臟中的mCherry+ CD4+ T細胞的百分比。 [0342]圖44A描繪了在時間進程（0至120小時）中，在CT26（EphA2+ 細胞株）與使用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE或表現Fluc的αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP產生的BiTE分泌型鼠T細胞進行的共培養實驗中死亡CT26細胞的百分比。 [0343]圖44B描繪了在時間進程（0至120小時）中，在CT26（EphA2+ 細胞株）與使用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE或表現Fluc的αCD8（YTS156.7.7）和αCD3（500A2）靶向性LNP產生的BiTE分泌型鼠T細胞進行的共培養實驗中死亡CT26細胞的百分比。 [0344]圖44C描繪了在時間進程（0至120小時）中，在CT26（EphA2+ 細胞株）與使用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE或表現Fluc的αCD4（GK1.5v1）靶向性LNP產生的BiTE分泌型鼠T細胞進行的共培養實驗中死亡CT26細胞的百分比。 [0345]圖44D描繪了在時間進程（0至120小時）中，在CT26（EphA2+ 細胞株）與使用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE或表現Fluc的αCD8（YTS156.7.7）靶向性LNP產生的BiTE分泌型鼠T細胞進行的共培養實驗中死亡CT26細胞的百分比。r500A2，重組500A2/EphA2 BiTE蛋白。Fluc，螢火蟲螢光素酶。 [0346]圖45A描繪了功效研究腫瘤接種和LNP用劑方案。 [0347]圖45B描繪了用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE的αCD8（YTS156.7.7）和αCD3（500A2）靶向性LNP治療小鼠的功效（存活曲線）。 [0348]圖45C描繪了用基於DLin-KC3-DMA的分泌BiTE的αCD8（YTS156.7.7）和αCD3（500A2）靶向性LNP治療的小鼠的腫瘤生長。 [0349]圖45D描繪了用基於DLin-KC3-DMA的表現非BiTE蛋白的αCD8（YTS156.7.7）和αCD3（500A2）靶向性LNP治療的小鼠的腫瘤生長。 [0350]圖45E描繪了用重組BiTE蛋白治療的小鼠的腫瘤生長。 [0351]圖45F描繪了用PD-1 Ab治療的小鼠的腫瘤生長。 [0352]圖45G描繪了用媒介物治療的小鼠的腫瘤生長。 [0353]圖45H描繪了用基於DLin-KC3-DMA的表現BiTE蛋白的αCD8（YTS156.7.7）和αCD3（500A2）靶向性LNP治療的小鼠的相對於基線的相對體重（%）。 [0354]圖46A描繪了在pH 5.5 MBS、pH 7.4 HBS中，在抗體插入之前，基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP的電荷（ζ電位，DLS）。 [0355]圖46B描繪了在抗體插入之前，基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP的直徑（DLS，nm），以及基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP的多分散性（DLS）。 [0356]圖46C描繪了在抗體插入之前，基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP中的RNA回收和染料可及RNA的百分比。 [0357]圖46D描繪了在抗體（αCD8（TRX2）和/或αCD8（伊巴珠單抗，Ibalizumab））插入之後，基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP的直徑（DLS，nm），以及基於脂質15的mCherry LNP和CAR LNP的多分散性（DLS）。 [0358]圖47A描繪了被基於脂質15的αCD4（伊巴珠單抗）和/或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的活CD3+、CD4+和CD8+原代人T細胞的百分比；在24小時處活T細胞的百分比。 [0359]圖47B描繪了轉染後24小時，被基於脂質15的αCD4（伊巴珠單抗）和/或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD3+、CD4+和CD8+原代人T細胞中的CAR表現；在24小時處活T細胞中的CAR MFI。 [0360]圖47C描繪了轉染後24小時，被基於脂質15的αCD4（伊巴珠單抗）和/或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD3+、CD4+和CD8+原代人T細胞中的CAR表現；在24小時處CAR+活T細胞的百分比。 [0361]圖47D描繪了轉染後24小時，被基於脂質15的αCD4（伊巴珠單抗）和/或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD3+、CD4+和CD8+原代人T細胞中的mCherry表現；在24小時處活T細胞中的mCherry MFI。 [0362]圖47E描繪了轉染後24小時，被基於脂質15的αCD4（伊巴珠單抗）和/或αCD8（TRX2）靶向性LNP轉染的CD3+、CD4+和CD8+原代人T細胞中的mCherry表現；在24小時處mCherry+活T細胞的百分比。
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Claims (194)

  1. 一種式(I)的化合物或其鹽： (I)， 其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或C 1-6烷基。
  2. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物是式(Ia) 的化合物： (Ia)。
  3. 如請求項1或2所述的化合物或其鹽，其中R 3B1是伸乙基或伸丙基。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個取代基取代的C 1-6烷基，該取代基各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)。
  5. 如請求項4所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。
  6. 如請求項5所述的化合物或其鹽，其中R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。
  7. 如請求項1或2所述的化合物或其鹽，其中 是 、 、 、 或 。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或亞甲基。
  9. 如請求項8所述的化合物或其鹽，其中R 1和R 2各自是亞甲基並且R 3是鍵。
  10. 如請求項8所述的化合物或其鹽，其中R 1、R 2和R 3各自是亞甲基。
  11. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物是式(Ib) 的化合物： (Ib)。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。
  13. 如請求項12所述的化合物或其鹽，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。
  14. 如請求項13所述的化合物或其鹽，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。
  15. 如請求項12至14中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2和R 2A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-( 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)。
  17. 如請求項16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。
  18. 如請求項17所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。
  19. 如請求項16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是C 1-15烷基；R 1A2和R 2A2各自是C 1-15烷基；並且R 1A3和R 2A3各自是H。
  20. 如請求項19所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。
  21. 如請求項16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)；R 2A1和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。
  22. 如請求項21所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。
  23. 如請求項16所述的化合物或其鹽，其中R 1A1和R 2A1各自是-C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；R 1A2和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。
  24. 如請求項23所述的化合物或其鹽， 其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 ；或者 其中R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的化合物或其鹽，其中R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。
  26. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。
  27. 如請求項26所述的化合物或其鹽，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、 、 、 或 。
  28. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是C 1-15烷基；並且R 3A2和R 3A3各自是H。
  29. 如請求項28所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 。
  30. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)；並且R 3A2和R 3A3各自是H。
  31. 如請求項30所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 或 。
  32. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。
  33. 如請求項32所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 或 ；並且R 3A2是 。
  34. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。
  35. 如請求項34所述的化合物或其鹽，其中R 3A1是 ；並且R 3A2是 或 。
  36. 如請求項25所述的化合物或其鹽，其中R 3A1、R 3A2和R 3A3各自是H。
  37. 如請求項1至15中任一項所述的化合物或其鹽，其中R a1和R a2各自獨立地是-(CH 2) 0-15CH 3或-CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)。
  38. 如請求項37所述的化合物或其鹽，其中R a1和R a2各自獨立地是 、 、 、 、 、 、 、 或 。
  39. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物選自表1。
  40. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物是 。
  41. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物是 。
  42. 如請求項1所述的化合物或其鹽，其中該化合物是 。
  43. 一種脂質奈米顆粒（LNP），該脂質奈米顆粒用於將核酸靶向遞送至免疫細胞，該脂質奈米顆粒包含脂質摻合物，該脂質摻合物包含： (a) 脂質-免疫細胞靶向基團接合物，其包含式(II)的化合物：[脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]，和 (b) 可電離陽離子脂質，其包含如請求項1至42中任一項所述的化合物， 其中該LNP進一步包含放置在其中的核酸。
  44. 如請求項43所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。
  45. 如請求項44所述的LNP，其中該T細胞抗原是CD3、CD4、CD7、CD8或其組合（例如，CD3和CD8兩者、CD4和CD8兩者或CD7和CD8兩者）。
  46. 如請求項43至45中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。
  47. 如請求項46所述的LNP，其中該NK細胞抗原是CD7、CD8、CD56或其組合（例如，CD7和CD8兩者）。
  48. 如請求項43至47中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與該脂質摻合物中的脂質共價連接。
  49. 如請求項48所述的LNP，其中經由含有PEG的連接子與所述免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。
  50. 如請求項48或49所述的LNP，其中所述PEG是PEG 2000或PEG 3400。
  51. 如請求項43至50中任一項所述的LNP，其中所述脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.001至0.5莫耳百分比（例如，0.002至0.2莫耳百分比）的範圍存在於該脂質摻合物中。
  52. 如請求項43至51中任一項所述的LNP，其中該脂質摻合物進一步包含結構脂質（例如，固醇）、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。
  53. 如請求項43至52中任一項所述的LNP，其中該可電離陽離子脂質以30至70（例如，40至60）莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  54. 如請求項52所述的LNP，其中該固醇以20至70（例如，30至50）莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  55. 如請求項52或54所述的LNP，其中所述固醇是膽固醇。
  56. 如請求項52至55中任一項所述的LNP，其中該中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）和鞘磷脂所組成的群組。
  57. 如請求項52至56中任一項所述的LNP，其中該中性磷脂以5至15莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  58. 如請求項52至57中任一項所述的LNP，其中該游離PEG-脂質選自由PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質所組成的群組。
  59. 如請求項52至57中任一項所述的LNP，其中該游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈，並且任選地該游離PEG-脂質包含PEG-DPG和PEG-DMG。
  60. 如請求項52至59中任一項所述的LNP，其中該游離PEG-脂質以1至4莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  61. 如請求項52至60中任一項所述的LNP，其中該游離PEG-脂質包含與該脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。
  62. 如請求項43至61中任一項所述的LNP，其中該LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。
  63. 如請求項62所述的LNP，其中該LNP具有約100 nm的平均直徑。
  64. 如請求項43至63中任一項所述的LNP，其中該LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。
  65. 如請求項43至64中任一項所述的LNP，其中該LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。
  66. 如請求項43至65中任一項所述的LNP，其中該核酸是DNA或RNA。
  67. 如請求項66所述的LNP，其中該RNA是mRNA。
  68. 如請求項67所述的LNP，其中該mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。
  69. 如請求項67所述的LNP，其中該mRNA編碼能夠調節該免疫細胞中的免疫反應的多肽。
  70. 如請求項67所述的LNP，其中該mRNA編碼能夠對該免疫細胞進行重編程的多肽。
  71. 如請求項69所述的LNP，其中該mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。
  72. 如請求項43至71中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含抗體，並且該抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域（例如，奈米抗體）。
  73. 如請求項43至71中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。
  74. 如請求項72或請求項73所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵的Fab。
  75. 如請求項74所述的LNP，其中根據Kabat編號，該Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。
  76. 如請求項73至75中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含具有非天然鏈間雙硫鍵（例如，工程化的包埋的鏈間雙硫鍵）的Fab。
  77. 如請求項76所述的LNP，其中根據Kabat編號，該Fab在重鏈片段中包含F174C取代，並且在輕鏈片段中包含S176C取代。
  78. 如請求項73至77所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含Fab，該Fab在該重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸。
  79. 如請求項78所述的LNP，其中該Fab進一步包含在該Fab的重鏈片段與該C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  80. 如請求項72所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。
  81. 如請求項72或80所述的LNP，其中該免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。
  82. 如請求項81所述的LNP，其中該免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且進一步包含間隔子，其包含在該VHH結構域與該C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  83. 如請求項73和80至82中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。
  84. 如請求項83所述的LNP，其中該兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。
  85. 如請求項83所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中該抗體CH1結構域和該抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。
  86. 如請求項72和80至82中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中該抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。
  87. 如請求項85或86所述的LNP，其中根據Kabat編號，該CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且該輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。
  88. 如請求項43至69中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含Fab，其包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段；或者 (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。
  89. 如請求項43至88中任一項所述的LNP，其中該可電離陽離子脂質是 。
  90. 如請求項43至88中任一項所述的LNP，其中該可電離陽離子脂質是 。
  91. 如請求項43至88中任一項所述的LNP，其中該可電離陽離子脂質是 。
  92. 如請求項43至91中任一項所述的LNP，其中該LNP包含： (a) 該可電離陽離子脂質， (b) 該接合物，其包含下式的化合物： [脂質] - [視情況存在的連接子] - [免疫細胞靶向基團]； (c) 固醇或其他結構脂質； (d) 中性磷脂 (e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質，以及 (f)  該核酸。
  93. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該免疫細胞是NK細胞，並且該免疫細胞靶向基團包含結合CD56的抗體。
  94. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該免疫細胞靶向基團包含結合CD7或CD8的抗體，並且該游離PEG脂質是DMG-PEG或PEG-DPG。
  95. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含抗體，並且該抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。
  96. 如請求項95所述的LNP，其中該Fab被工程化以敲除C末端的天然鏈間雙硫鍵。
  97. 如請求項96所述的LNP，其中該Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段。
  98. 如請求項96所述的LNP，其中該Fab包含非天然鏈間雙硫鍵。
  99. 如請求項96所述的LNP，其中該Fab在該重鏈片段中包含F174C取代，並且在該輕鏈片段中包含S176C取代。
  100. 如請求項95所述的LNP，其中該抗體是免疫球蛋白單可變（ISV）結構域，並且該ISV結構域是Nanobody® ISV。
  101. 如請求項100所述的LNP，其中該游離PEG脂質包含具有至少2000道爾頓的分子量的PEG。
  102. 如請求項101所述的LNP，其中該PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。
  103. 如請求項95所述的LNP，其中該抗體是Fab。
  104. 如請求項103所述的LNP，其中該Fab結合CD3，並且該LNP中的游離PEG脂質包含具有約2000道爾頓的分子量的PEG。
  105. 如請求項103所述的LNP，其中該Fab是抗CD4抗體，並且所述LNP中的游離PEG脂質包含具有約3000至3500道爾頓的分子量的PEG。
  106. 如請求項95所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。
  107. 如請求項106所述的LNP，其中該兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。
  108. 如請求項107所述的LNP，其中該免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域。
  109. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該LNP結合CD3，並且還結合CD11a或CD18。
  110. 如請求項109所述的LNP，其中該LNP包含兩種接合物，其中第一接合物包含結合CD3的抗體，並且第二接合物包含結合CD11a或CD18的抗體。
  111. 如請求項109所述的LNP，其中該LNP包含一種接合物，並且該接合物包含結合CD3和CD11a兩者的雙特異性抗體。
  112. 如請求項109所述的LNP，其中該LNP包含一種接合物，並且該接合物包含結合CD3和CD18兩者的雙特異性抗體。
  113. 如請求項111或112所述的LNP，其中該雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。
  114. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該LNP結合該免疫細胞的CD7和CD8。
  115. 如請求項114所述的LNP，其中該LNP包含兩種接合物，其中第一接合物包含結合CD7的抗體，並且第二接合物包含結合CD8的抗體。
  116. 如請求項114所述的LNP，其中該LNP包含一種接合物，其中該接合物包含結合CD7和CD8的雙特異性抗體。
  117. 如請求項116所述的LNP，其中該雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。
  118. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP與第一類型的免疫細胞的表面上的第一抗原結合，並且還與第二類型的免疫細胞的表面上的第二抗原結合。
  119. 如請求項118所述的LNP，其中所述兩種不同類型的免疫細胞是CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。
  120. 如請求項118所述的LNP，其中該LNP包含兩種接合物，並且第一接合物包含與該第一類型的免疫細胞的第一抗原結合的第一抗體，並且第二接合物包含與該第二類型的免疫細胞的第二抗原結合的第二抗體。
  121. 如請求項118所述的LNP，其中該LNP包含一種接合物，並且該接合物包含雙特異性抗體，並且該雙特異性抗體與該第一類型的免疫細胞上的第一抗原和該第二類型的免疫細胞上的第二抗原兩者結合。
  122. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該雙特異性抗體是免疫球蛋白單可變結構域或Fab-ScFv。
  123. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該免疫細胞靶向基團包含結合CD3或CD7的單一抗體。
  124. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該免疫細胞靶向基團結合CD7、CD8或者CD7和CD8兩者。
  125. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至T細胞和NK細胞兩者，其中該免疫細胞靶向基團與以下各項結合： (a) CD3和CD56兩者； (b) CD8和CD56兩者；或者 (c) CD7和CD56兩者。
  126. 如請求項93至125中任一項所述的LNP，其中該LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。
  127. 如請求項126所述的LNP，其中該LNP具有約100 nm的平均直徑。
  128. 如請求項93至125中任一項所述的LNP，其中該LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。
  129. 如請求項93至128中任一項所述的LNP，其中該LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。
  130. 如請求項93至129中任一項所述的LNP，其中該核酸是DNA或RNA。
  131. 如請求項130所述的LNP，其中該RNA是mRNA。
  132. 如請求項131所述的LNP，其中該mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。
  133. 如請求項131所述的LNP，其中該mRNA編碼能夠調節該免疫細胞中的免疫反應的多肽。
  134. 如請求項133所述的LNP，其中該mRNA編碼能夠對該免疫細胞進行重編程的多肽。
  135. 如請求項134所述的LNP，其中該mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。
  136. 如請求項43至92中任一項所述的LNP，其中該LNP用於將核酸遞送至免疫細胞，並且其中該免疫細胞靶向基團包含缺乏天然鏈間雙硫鍵的Fab。
  137. 如請求項136所述的LNP，其中該Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恆定輕鏈和天然恆定重鏈上的形成天然鏈間雙硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除該Fab中的天然鏈間雙硫鍵。
  138. 一種將核酸的遞送靶向至受試者的免疫細胞的方法，該方法包括使該免疫細胞與如請求項43至137中任一項所述的LNP接觸，其中該LNP包含該核酸。
  139. 一種在受試者的靶向免疫細胞中表現目的多肽的方法，該方法包括使該免疫細胞與如請求項43至137中任一項所述的LNP接觸，其中該LNP包含編碼該多肽的核酸。
  140. 一種調節受試者的靶免疫細胞的細胞功能的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項43至137中任一項所述的LNP，其中該LNP包含調節該免疫細胞的細胞功能的核酸。
  141. 一種治療、改善或預防有需要的受試者的障礙或疾病的症狀的方法，該方法包括向該受試者投予LNP以將核酸遞送至該受試者的免疫細胞，其中該LNP是如請求項43至137中任一項所述的，其中該LNP包含該核酸。
  142. 如請求項141所述的方法，其中該障礙是免疫障礙、炎性障礙或癌症。
  143. 如請求項141所述的方法，其中該核酸編碼抗原，用於在治療或預防病原體感染的治療性或預防性疫苗中使用。
  144. 如請求項138至143中任一項所述的方法，其中該可電離陽離子脂質是 。
  145. 如請求項138至143中任一項所述的方法，其中該可電離陽離子脂質是 。
  146. 如請求項138至143中任一項所述的方法，其中該可電離陽離子脂質是 。
  147. 如請求項138至146中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含結合T細胞抗原的抗體。
  148. 如請求項147所述的方法，其中該T細胞抗原是CD3、CD8或者CD3和CD8兩者。
  149. 如請求項138至146中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含結合自然殺手（NK）細胞抗原的抗體。
  150. 如請求項149所述的方法，其中該NK細胞抗原是CD7、CD8或CD56。
  151. 如請求項138至150中任一項所述的方法，其中該抗體是人類或人源化抗體。
  152. 如請求項138至151中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與該脂質摻合物中的脂質共價連接。
  153. 如請求項152所述的方法，其中經由含有PEG的連接子與該免疫細胞靶向基團共價連接的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。
  154. 如請求項152或153所述的方法，其中該PEG是PEG 2000。
  155. 如請求項138至154中任一項所述的方法，其中該脂質-免疫細胞靶向基團接合物以0.002至0.2莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  156. 如請求項138至155中任一項所述的方法，其中該可電離陽離子脂質以40至60莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  157. 如請求項138至156所述的方法，其中該固醇是膽固醇。
  158. 如請求項49至157中任一項所述的方法，其中該固醇以30至50莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  159. 如請求項138至158所述的方法，其中該中性磷脂選自由磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）所組成的群組。
  160. 如請求項138至159所述的方法，其中該中性磷脂以5至15莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  161. 如請求項138至160中任一項所述的方法，其中該游離PEG-脂質選自PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG-修飾的磷脂酸、PEG-修飾的神經醯胺、PEG-修飾的二烷基胺、PEG-修飾的二醯基甘油和PEG-修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質所組成的群組。
  162. 如請求項138至160所述的方法，其中該游離PEG-脂質包含二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二肉豆蔻醯（C14）鏈、二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。
  163. 如請求項138至162中任一項所述的方法，其中該游離PEG-脂質以0.5至2.5莫耳百分比的範圍存在於該脂質摻合物中。
  164. 如請求項138至163中任一項所述的方法，其中該游離PEG-脂質包含與該脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的脂質相同或不同的脂質。
  165. 如請求項138至164所述的方法，其中該LNP具有在50至200 nm範圍內的平均直徑。
  166. 如請求項165所述的方法，其中該LNP具有約100 nm的平均直徑。
  167. 如請求項138至166所述的方法，其中該LNP具有在從0.05至1範圍內的多分散性指數。
  168. 如請求項138至167所述的方法，其中該LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。
  169. 如請求項138至168所述的方法，其中該核酸是DNA或RNA。
  170. 如請求項169所述的方法，其中該RNA是mRNA、tRNA、siRNA、gNRA或微小RNA（microRNA）。
  171. 如請求項170所述的方法，其中該mRNA編碼受體、生長因子、激素、細胞介素、抗體、抗原、酶或疫苗。
  172. 如請求項170所述的方法，其中該mRNA編碼能夠調節該免疫細胞中的免疫反應的多肽。
  173. 如請求項170所述的方法，其中該mRNA編碼能夠對該免疫細胞進行重編程的多肽。
  174. 如請求項170所述的方法，其中該mRNA編碼合成T細胞受體（synTCR）或嵌合抗原受體（CAR）。
  175. 如請求項138至174中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含抗體，並且該抗體是Fab或免疫球蛋白單可變結構域。
  176. 如請求項138至174中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含選自以下的抗體片段：Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv和scFv片段。
  177. 如請求項175或176所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含含有一個或多個鏈間雙硫鍵的Fab。
  178. 如請求項177所述的方法，其中根據Kabat編號，該Fab包含含有F174C和C233S取代的重鏈片段和含有S176C和C214S取代的輕鏈片段。
  179. 如請求項175至178中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含在該重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。
  180. 如請求項175所述的方法，其中該Fab進一步包含在該Fab的重鏈片段與該C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  181. 如請求項176至180中任一項所述的方法，其中該Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的輕鏈可變結構域，其中該CH1結構域和該輕鏈恆定結構域透過一個或多個鏈間雙硫鍵連接，並且其中該免疫細胞靶向基團進一步包含透過胺基酸連接子與該輕鏈恆定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。
  182. 如請求項175所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含免疫球蛋白單可變結構域。
  183. 如請求項175或182所述的方法，其中該免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。
  184. 如請求項183所述的方法，其中該免疫球蛋白單可變結構域包含V HH結構域，並且進一步包含間隔子，該間隔子包含在該V HH結構域與該C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  185. 如請求項175和182至184中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含兩個或更多個V HH結構域。
  186. 如請求項185所述的方法，其中該兩個或更多個V HH結構域透過胺基酸連接子連接。
  187. 如請求項185所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恆定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中該抗體CH1結構域和該抗體輕鏈恆定結構域透過一個或多個雙硫鍵連接。
  188. 如請求項175和182至184中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中該抗體CH1結構域透過一個或多個雙硫鍵與抗體輕鏈恆定結構域連接。
  189. 如請求項185或186所述的方法，其中根據Kabat編號，該CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且該輕鏈恆定結構域包含S176C和C214S取代。
  190. 如請求項138至174中任一項所述的方法，其中該免疫細胞靶向基團包含Fab，該Fab包含： (a) 含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 2或3的胺基酸序列的輕鏈片段； (b) 含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈片段和含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的輕鏈片段。
  191. 如請求項138至190中任一項所述的方法，其中不超過5%的非免疫細胞被該LNP轉染。
  192. 如請求項138至191中任一項所述的方法，其中由該LNP遞送的核酸或由該LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期比由參考LNP遞送的核酸或由該參考LNP遞送的核酸所編碼的多肽的半衰期長至少10%。
  193. 如請求項138至192中任一項所述的方法，其中至少10%的免疫細胞被該LNP轉染。
  194. 如請求項138至193中任一項所述的方法，其中由該LNP遞送的核酸的表現水平比由參考LNP遞送的核酸的表現水平高至少10%。
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