TW202404596A

TW202404596A - 用於rdaa陽性疾病的診斷和治療的方法和試劑盒

Info

Publication number: TW202404596A
Application number: TW112127312A
Authority: TW
Inventors: 劉倫旭; 查正宇
Original assignee: 中國商貝達藥業股份有限公司
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2023-07-21
Publication date: 2024-02-01
Also published as: WO2024017352A1

Abstract

本揭露提供了一種用於治療疾病的方法，其至少包括以下步驟：對患有RDAA陽性疾病的患者施用間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑，所述RDAA陽性疾病定義為RNase1驅動的ALK活化所導致的疾病，其中來自所述患有RDAA陽性疾病的患者的樣本具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果，且其中所述患有RDAA陽性疾病的患者不是非小細胞肺癌患者。

Description

用於RDAA陽性疾病的診斷和治療的方法和試劑盒

本揭露涉及生物醫藥技術領域，具體涉及疾病的診斷和治療，特別是ALK抑制劑在治療RDAA陽性疾病中的具體應用。

ALK(anaplastic lymphoma kinase，間變性淋巴瘤激酶)是一類受體酪胺酸激酶，其變異與多種癌症的發生相關。ALK的變異形式包括 Alk基因重排； Alk基因的啟動突變；基因拷貝數變異等。ALK基因重排會導致淋巴瘤、肺癌、神經母細胞瘤、肌纖維母細胞瘤等多種癌症的發生，其中最常見的是間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)和非小細胞肺癌(NSCLC)，但ALK基因重排陽性僅占NSCLC患者中的6.7%，占ALCL成年患者中的50%。

對於不同類型的癌症，治療方案和預後評估都不盡相同。例如，對於ALK基因重排陽性的腫瘤患者，可以應用ALK抑制劑予以治療。但對於ALK為野生型的腫瘤患者(即，ALK基因重排陰性)，目前尚未發現相關的促癌機制，也沒有有效的標靶治療方法。

針對目前臨床上僅存在對ALK基因重排陽性患者有效治療方法(即，施用ALK抑制劑)，而對ALK基因重排陰性患者尚未發現有效治療手段這一亟待解決的問題，本揭露的發明人通過生物標記物的巧妙選擇，在ALK基因重排陰性患者群體中鑒定出了RDAA陽性疾病，並進一步發現，施用ALK抑制劑有效殺傷了RDAA陽性癌細胞，顯著抑制了RDAA陽性患者的腫瘤生長，從而能夠有效治療RDAA陽性疾病，為廣大患者帶來了福音。特別地，本揭露提供了用於診斷和/或治療RDAA陽性疾病的方法；其中使用的抗RNase1抗體或其抗原結合部分、抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分；用於診斷RDAA陽性疾病的試劑盒、設備；檢測ALK基因重排的試劑、檢測ALK磷酸化水準的試劑與檢測RNase1表達水準的試劑的組合在製備用於檢測RDAA陽性疾病的試劑盒中的用途。

在本揭露的第一方面，可以提供一種用於診斷和/或治療疾病的方法，其至少包括以下步驟：檢測受試者的間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準，若ALK基因重排的檢測結果為陰性、且ALK磷酸化水準和RNase1表達水平均高於參考人群水準，則定義所述疾病為RNase1驅動的ALK活化所導致的疾病(RDAA陽性疾病)，以及任選地對受試者施用ALK抑制劑。

在本揭露的第二方面，可以提供一種用於診斷和/或治療疾病的方法，其至少包括以下步驟： 1) 檢測受試者的ALK基因重排，若ALK基因重排的檢測結果為陰性，則進行下述步驟： 2) 檢測受試者的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準；以及 3) 將檢測得到的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準分別與參考人群的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準進行比較；以及 4) 任選地，在檢測得到的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準分別與參考人群的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準相比更高且達到或高於設定閾值的情況下，確定所述受試者患有RDAA陽性疾病；以及 5) 任選地，向患有RDAA陽性疾病的受試者施用ALK抑制劑。

在本揭露的協力廠商面，可以提供ALK抑制劑在製備用於治療非小細胞肺癌和/或胰腺導管腺癌的藥物中的用途。

在本揭露的第四方面，可以提供一種抗RNase1抗體或其抗原結合部分，其包含：具有如SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:25所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；或者具有如SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列的重鏈CDR3。

在本揭露的第五方面，可以提供一種抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分，其包含：具有如SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:43所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:44所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:45所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:46所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:49所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:50所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO: 51所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:53所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:54所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:57所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:58所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:59所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:60所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:62所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:65所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:66所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:67所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:68所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:69所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:70所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:73所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:74所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:75所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:76所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:77所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:78所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:81所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO: 82所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO: 83所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO: 84所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO: 85所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO: 86所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:89所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:90所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:91所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:92所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:94所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；具有如SEQ ID NO:97所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:98所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:100所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:102所示的胺基酸序列的重鏈CDR3；或者具有如SEQ ID NO:105所示的胺基酸序列的輕鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:106所示的胺基酸序列的輕鏈CDR2，具有如SEQ ID NO:107所示的胺基酸序列的輕鏈CDR3，具有如SEQ ID NO:108所示的胺基酸序列的重鏈CDR1，具有如SEQ ID NO:109所示的胺基酸序列的重鏈CDR2，以及具有如SEQ ID NO:110所示的胺基酸序列的重鏈CDR3。

在本揭露的第六方面，可以提供一種試劑盒，其包含：檢測ALK磷酸化水準的試劑；和檢測RNase1表達水準的試劑。

在本揭露的第七方面，可以提供檢測ALK磷酸化水準的試劑與檢測RNase1表達水準的試劑的組合在製備用於檢測RDAA陽性疾病的試劑盒中的用途，所述RDAA陽性疾病的患者具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果。

在本揭露的第八方面，可以提供檢測ALK基因重排表達水準的試劑、檢測ALK磷酸化水準的試劑與檢測RNase1表達水準的試劑的組合在製備用於檢測RDAA陽性疾病的試劑盒中的用途，所述RDAA陽性疾病的患者具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果。

在本揭露的第九方面，可以提供ALK抑制劑在製備用於治療RDAA陽性疾病的藥物中的用途，所述RDAA陽性疾病的患者具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果。

在本揭露的第十方面，可以提供一種用於診斷RDAA陽性疾病的設備，其包括：檢測部：包括其中分別設置有能夠檢測ALK基因重排表達水準的試劑、檢測ALK磷酸化水準的試劑和檢測RNase1表達水準的試劑的試劑部和進行檢測的測定部；資料獲取部：對檢測部輸出的結果進行收集；資料分析部：對資料獲取部收集的資料進行分析；和結果輸出部。

具體實施方式

除非另外定義，否則本揭露使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。本揭露的描述中使用的術語僅用於描述具體實施方式的目的，而無意限制本揭露。

在本文中使用時，術語“ALK”是指間變性淋巴瘤激酶，其相關資訊詳見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/238(ALK ALK receptor tyrosine kinase [Homo sapiens(human) ] Gene ID: 238)，及其同源物。

在本文中使用時，術語“ALK基因重排”包括但不限於美國第9,651,555號專利和Du等人(Thoracic Cancer.9:423‑430，2018)中所述的那些，這些文獻以全文引用方式併入本文。ALK基因重排可以為ALK與選自由以下項組成的組的基因的重排：EML4、KIF5B、KLC1、TFG、TPR、HIP1、STRN、DCTN1、SQSTM1、NPM1、BCL11A、BIRC6、RANBP2、ATIC、CLTC、TMP4、和MSN，導致融合癌基因的形成。

在本文中使用時，術語“ALK基因重排陰性”是指通過FISH(Fluorescence in situ hybridization)法、NGS (Next-generation sequencing)法、IHC(Immunohistochemistry)法等方法檢測時，結果為ALK基因重排陰性。例如，患者手術或穿刺病理組織樣本使用Vysis ALK Break Apart FISH 探針試劑盒(Abbott Molecular,Inc.)診斷為ALK分子重排(ALK rearrangement)陰性；患者手術或穿刺病理組織樣本使用二代高通量基因檢測技術(武漢昂科益科技諮詢有限公司、益善生物技術股份有限公司、深圳華大基因股份有限公司等)診斷無ALK基因相關突變，診斷為ALK分子重排陰性；患者手術或穿刺病理組織樣本使用抗ALK(D5F3)兔單克隆抗體試劑(免疫組織化學法)(VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody)診斷為ALK分子重排陰性。

在本文中使用時，術語“Rnase1”是指核糖核酸酶1(ribonuclease1)，屬於人體分泌型核糖核酸酶家族，其相關資訊詳見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6035(RNASE1 ribonuclease A family member 1, pancreatic [Homo sapiens(human) ])，及其同源物。

在本文中使用時，“RDAA陽性疾病”是指與RNAse1驅動的ALK活化相關的疾病。

在本文中使用時，“RDAA陽性疾病的患者”是指該患者具有陰性的ALK基因重排檢測結果，高於參考人群的ALK磷酸化水準的ALK磷酸化水準，以及高於參考人群的RNase1表達水準的RNase1表達水準；特別地，該患者具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果。

在本文中使用時，“參考人群”是指健康人或RDAA陰性疾病患者。

本揭露的發明人首次發現，對於RDAA陽性疾病的患者，施用ALK抑制劑能夠達到有效的治療效果。因此，ALK抑制劑在製備治療RDAA陽性疾病的藥物中具有良好的應用前景。

在本揭露的第一方面，可以提供一種用於診斷和/或治療疾病的方法，其至少包括以下步驟：檢測受試者的淋巴瘤激酶(ALK)基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準，若ALK基因重排的檢測結果為陰性、且ALK磷酸化水準和RNase1表達水平均高於參考人群水準，則定義所述疾病為RNase1驅動的ALK活化所導致的疾病(RDAA陽性疾病)，以及任選地對受試者施用ALK抑制劑。

在一些實施方式中，所述受試者可以是健康人，也可以是疾病(例如，癌症)疑似患者或者患有疾病(例如，癌症)的患者。在一些實施方式中，所述受試者可以是癌症疑似患者或者癌症患者。在一些實施方式中，所述癌症可以是肺癌或胰腺癌。在一些實施方式中，所述癌症可以是非小細胞肺癌或胰腺導管腺癌。

在一些實施方式中，所述檢測針對來自受試者的待測樣本進行。在一些實施方式中，所述待測樣本可以來自受試者的組織、細胞和/或體液。在一些實施方式中，所述待測樣本可以來自受試者的組織切片和/或血液。在一些實施方式中，所述待測樣本可以來自受試者的腫瘤組織切片和/或血液。在一些實施方式中，所述待測樣本可以來自受試者的肺癌或胰腺癌組織切片和/或血液。在一些實施方式中，所述待測樣本可以來自受試者的非小細胞肺癌或胰腺導管腺癌組織切片和/或血液。

在一些實施方式中，參考人群的ALK磷酸化水準為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果為陰性。在一些實施方式中，參考人群的ALK磷酸化水準為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分＜4分。

在一些實施方式中，參考人群的RNase1表達水準為血漿中的Rnase1表達水準＜418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色結果為陰性。在一些實施方式中，參考人群的RNase1表達水準為血漿中的Rnase1表達水準＜418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分＜4分。

在一些實施方式中，ALK磷酸化水準的設定閾值為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果為陽性。在一些實施方式中，ALK磷酸化水準的設定閾值為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分≥4分。

在一些實施方式中，RNase1表達水準的設定閾值為血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色結果為陽性。在一些實施方式中，RNase1表達水準的設定閾值為血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分≥4分。

在一些實施方式中，免疫組織化學染色是使用患病組織進行的。在一些實施方式中，免疫組織化學染色是使用腫瘤組織進行的。在一些實施方式中，免疫組織化學染色是使用肺癌或胰腺癌組織進行的。在一些實施方式中，免疫組織化學染色是使用非小細胞肺癌或胰腺導管腺癌組織進行的。

ALK基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準的檢測可以通過本領域已知的任何方法來完成，例如使用商業化的試劑盒、測序等。在一些實施方式中，ALK基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準的檢測彼此獨立地選自蛋白質轉漬法、免疫組織化學法、酶聯免疫吸附法中的一種或多種。在一些實施方式中，ALK基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和/或RNase1表達水準的檢測是使用抗體進行的。

在一些實施方式中，所述ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。在一些實施方式中，所述ALK抑制劑包括克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。

在本揭露的第二方面，可以提供一種用於診斷和/或治療疾病的方法，其至少包括以下步驟： 1)檢測受試者的ALK基因重排表達水準，若ALK基因重排的檢測結果為陰性，則進行下述步驟： 2)檢測受試者的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準；以及 3)將檢測得到的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準分別與參考人群的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準進行比較；以及 4)任選地，在檢測得到的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準分別與參考人群的ALK磷酸化水準和RNase1表達水準相比更高且達到或高於設定閾值的情況下，確定所述受試者患有RDAA陽性疾病；以及 5)任選地，向患有RDAA陽性疾病的受試者施用ALK抑制劑。

在一些實施方式中，所述抗RNase1抗體或其抗原結合部分包含：具有如SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列的重鏈可變區；或者具有如SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列的重鏈可變區。

在一些實施方式中，所述抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分包含：具有如SEQ ID NO:47所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:48所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:55所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:56所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:63所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:64所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:71所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:72所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:79所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:80所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO: 87所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO: 88所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:95所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:96所示的胺基酸序列的重鏈可變區；具有如SEQ ID NO:103所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:104所示的胺基酸序列的重鏈可變區；或者具有如SEQ ID NO:111所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及具有如SEQ ID NO:112所示的胺基酸序列的重鏈可變區。

在一些實施方式中，檢測ALK磷酸化水準的試劑、檢測RNase1表達水準的試劑、檢測ALK基因重排表達水準的試劑可以是本領域已知的任何能夠實現該功能的試劑。在一些實施方式中，檢測ALK磷酸化水準的試劑包括本揭露所述的抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分。在一些實施方式中，檢測RNase1表達水準的試劑包括本揭露所述的抗RNase1抗體或其抗原結合部分。在一些實施方式中，所述試劑盒還包含檢測ALK基因重排表達水準的試劑。

在一些實施方式中，陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果是指≥4分的針對Rnase1的免疫組織化學染色得分。

在一些實施方式中，陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果是指≥4分的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分。

ALK抑制劑可以是本領域已知的任何能夠有效抑制ALK的活性和/或表達等的物質。在一些實施方式中，ALK抑制劑包括但不限於克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。在一些實施方式中，ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。在一些實施方式中，ALK抑制劑包括本揭露所述的抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分。

在本揭露的第十方面，可以提供一種用於診斷RDAA陽性疾病的設備，其包括：檢測部：包括其中分別設置有能夠檢測ALK基因重排的試劑、檢測ALK磷酸化水準的試劑和檢測RNase1表達水準的試劑的試劑部和進行檢測的測定部；資料獲取部：對檢測部輸出的結果進行收集；資料分析部：對資料獲取部收集的資料進行分析；和結果輸出部。

在一些實施方式中，ALK基因重排、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準的檢測彼此獨立地選自蛋白質轉漬法、免疫組織化學法、酶聯免疫吸附法中的一種或多種。在一些實施方式中，ALK基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和/或RNase1表達水準的檢測是使用抗體進行的。

在一些實施方式中，資料分析部將收集的ALK基因重排表達水準、ALK磷酸化水準和RNase1表達水準的資料與設定閾值進行比較。

在一些實施方式中，ALK磷酸化水準的設定閾值為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果為陽性。

在一些實施方式中，ALK磷酸化水準的設定閾值為針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分≥4分。

在一些實施方式中，RNase1表達水準的設定閾值為血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色結果為陽性。

在一些實施方式中，RNase1表達水準的設定閾值為血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分≥4分。

在一些實施方式中，當資料分析部的分析表明ALK基因重排表達水準為陰性，針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果為陽性，並且血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色結果為陽性時，判定為RDAA陽性疾病。

在一些實施方式中，當資料分析部的分析表明ALK基因重排表達水準為陰性，針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分≥4分，並且血漿中的Rnase1表達水準≥418 ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分≥4分時，判定為RDAA陽性疾病。

在一些實施方式中，檢測部、資料獲取部、資料分析部和結果輸出部可以分離成單獨的設備單元或形成集成設備。

上文針對本揭露的方法所述的各種實施方式和優選項可以相互組合(只要它們彼此之間不是內在矛盾的)，並且同樣適用於本揭露的抗RNase1抗體或其抗原結合部分、抗ALK磷酸化抗體或其抗原結合部分、試劑盒、用途和設備，反之亦然，由此組合而形成的各種實施方式都視為本申請揭露的一部分。

特別地，本揭露提供了以下實施方案：

1.一種用於治療疾病的方法，其至少包括以下步驟：對患有RDAA陽性疾病的患者施用間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑，所述RDAA陽性疾病定義為RNase1驅動的ALK活化所導致的疾病，其中來自所述患有RDAA陽性疾病的患者的樣本具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果，且其中所述患有RDAA陽性疾病的患者不是非小細胞肺癌患者。

2. 實施方案1所述的方法，其中所述樣本來自患者的組織、細胞和/或體液；優選地，來自患者的組織切片和/或血液；優選地，來自患者的腫瘤組織切片和/或血液；優選地，來自受試者的肺癌或胰腺癌組織切片和/或血液；優選地，來自患者的胰腺導管腺癌組織切片和/或血液。

3.前述實施方案中任一項所述的方法，所述患者為胰腺導管腺癌患者。

4.前述實施方案中任一項所述的方法，所述ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。

5.前述實施方案中任一項所述的方法，所述ALK抑制劑包括克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。

6.一種ALK抑制劑在製備用於治療RDAA陽性疾病的藥物中的用途，其中來自患有所述RDAA陽性疾病的患者的樣本具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果，且其中所述患有RDAA陽性疾病的患者不是非小細胞肺癌患者。

7.實施方案6所述的用途，其中所述樣本來自患者的組織、細胞和/或體液；優選地，來自患者的組織切片和/或血液；優選地，來自患者的腫瘤組織切片和/或血液；優選地，來自受試者的肺癌或胰腺癌組織切片和/或血液；優選地，來自患者的胰腺導管腺癌組織切片和/或血液。

8.實施方案6或7所述的用途，所述患者為胰腺導管腺癌患者。

9.實施方案6-8中任一項所述的用途，其中所述ALK抑制劑包括克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。

10.實施方案6-9中任一項所述的用途，其中所述ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。

下面將結合實施例以例證的方式更清楚、明確地闡述本揭露的技術方案。應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，絕不旨在限制本揭露的保護範圍。本揭露的保護範圍僅通過請求項來限定。實施例

實施例1：抗RNase1抗體的製備和結合性能 RNase1抗體的製備

一、動物的選擇：純種BALB/C 小鼠

二、RNase1抗體免疫方案的選擇原核細胞純化的RNase1蛋白作為抗原(共5mg)與佐劑聯用。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。 a：初次免疫抗原50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射(共1ml,0.2ml/點)； b：3 周後，第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑腹腔內注射，劑量為0.3ml； c：3 周後，第三次免疫劑量同上，不加佐劑，腹腔內注射； d：3 周後，加強免疫，劑量0.5mg，腹腔內注射； e：3 天後，取脾融合。

三、細胞融合 1.細胞融合前準備（1）骨髓瘤細胞系的選擇： P3/X63-Ag8(X63)(BALB/C骨髓瘤MOPC-21來源)。骨髓瘤細胞的培養用DMEM培養基。小牛血清的濃度在10%，細胞濃度1×10 ⁵/ml 為宜。當細胞處於對數生長的中期時，按1：3比例傳代。每 3 天傳代一次。(定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對 HAT呈均一的敏感性。) (2)飼養細胞：本研究選用小鼠腹腔巨噬細胞，量為10 ⁵細胞/孔。

2．細胞融合的步驟（1）製備飼養細胞層：與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，8 周 ↓ 拉頸處死，浸泡在 75%酒精內，5min ↓ 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜 ↓ 用無菌注射器注入 6ml 預冷的培養液(嚴禁刺破腸管) ↓ 反覆沖洗，吸出沖洗液 ↓ 沖洗液放入 10ml 離心管，1200rpm/分離 5min ↓ 用20%胎牛血清(FCS)的培養液混懸，調整細胞數至1×10 ⁵/ml ↓ 加入 96 孔板，100μl/孔 ↓ 放入 37℃ CO2 孵箱培養 (2)製備免疫脾細胞最後一次加強免疫 3 天後小鼠拉頸處死 ↓ 無菌取脾臟，培養液洗一次 ↓ 脾臟研碎，過不銹鋼篩網 ↓ 離心，細胞用培養液洗2 次 ↓ 計數，取10 ⁸脾淋巴細胞懸液備用 (3)製備骨髓瘤細胞取對數生長骨髓瘤細胞離心 ↓ 用無血清培養液洗 2 次 ↓ 計數，取得1×10 ⁷細胞備用 (4)融合 ①將骨髓瘤細胞與脾細胞按 1：10或 1：5的比例混合在一起，在50ml 離心管中用無血清不完全培養液洗 1次，離心，1200rpm,8min；棄上清，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。 ②90s 內加入37℃預溫的1ml 45%PEG溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。 ③加 37℃預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 6ml。 ④離心，800rpm，6min。 ⑤充上清，用含 20%小牛血清 HAT選擇培養液重懸。 ⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的 96 孔板內，每孔加100μl。一個免疫脾臟可接種 4 塊 96 孔板。 ⑦將培養板置 37℃、5%CO2 培養箱中培養。

3.選擇雜交瘤細胞及抗體檢測 1） HAT選擇雜交瘤細胞於HAT 選擇培養液中培養融合細胞，培養 1～2 天內有大量瘤細胞死亡，3～4 天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT 選擇培養液維持 7～10 天後換用 HT 培養液，再維持 2 周，改用一般培養液。在選擇培養期間，雜交瘤細胞佈滿孔底1/10 面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3 天換一半培養液。

四、產生RNase1抗體雜交瘤的克隆化 1）克隆前1天製備飼養細胞層(同細胞融合)。 2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹乾，計數。 3）調整細胞為 10 個細胞/ml。 4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育於 37℃、5% CO2 孵箱中。 5）在第7天換液，以後每 2 天換液 1 次。 6)8 天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。 7)將陽性孔的細胞移至24 孔板中擴大培養。 8)凍存細胞克隆。

五、RNase1單克隆抗體的大量生產體內接種雜交瘤細胞，製備腹水。

腹水的製備：常規先腹腔注射 0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟於 BALB/C 鼠，2 周後腹腔注射 1×10 ⁶個雜交瘤細胞，接種細胞 10 天後可產生腹水。處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一隻小鼠可獲 10ml 腹水。

腹水中單克隆抗體含量可達到 5mg/ml。

獲得了5種抗RNase1抗體，其具體胺基酸序列如下表所示。

SEQ ID NO	胺基酸序列	說明
1	QSLLYSNGNTY	輕鏈CDR1	抗RNase1抗體CDC02
2	LVS	輕鏈CDR2
3	FQGTHFPRT	輕鏈CDR3
4	GYTFTNYG	重鏈CDR1
5	LNTYTGES	重鏈CDR2
6	CARGDYGYDDPLDY	重鏈CDR3
7	DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLYSNGNTYLSWFLQRPGQSPNRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHFPRTFGGGTKLEIK	輕鏈可變區
8	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQGTTVTVSS	重鏈可變區
9	QSLLHSGGKTY	輕鏈CDR1	抗RNase1抗體CDC03
10	LVS	輕鏈CDR2
11	CQGSHFPWT	輕鏈CDR3
12	GFTFSNYW	重鏈CDR1
13	IRLRSDNYGT	重鏈CDR2
14	TRGFAY	重鏈CDR3
15	DIQMTQTPLTLSVTIGQPASMSCKPSQSLLHSGGKTYLNWFLLRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCCQGSHFPWTFGGGTKLEIK	輕鏈可變區
16	EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLRSDNYGTHYAESVKGRFTISRDDSRSSVYLQVNNLRAEDTGIYYCTRGFAYWGQGTLVTVSST	重鏈可變區
17	QSLLHSGGKTY	輕鏈CDR1	抗RNase1抗體CDC04
18	LVSKLDSGVPD	輕鏈CDR2
19	CQGSHFPWT	輕鏈CDR3
20	GFTFSNYY	重鏈CDR1
21	IKLKSNNYATHFAESVQG	重鏈CDR2
22	EDTGIFYCTRG	重鏈CDR3
23	DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSGGKTYLNWFLQRPGQSPKRLMYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCCQGSHFPWTFGGGTKLEMKR	輕鏈可變區
24	EVQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYYMNWVRQSPEKGLEWVAEIKLKSNNYATHFAESVQGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIFYCTRGFCLLGPRDSGHCLC	重鏈可變區
25	QSLLNSDGKTY	輕鏈CDR1	抗RNase1抗體CDC05
26	LVS	輕鏈CDR2
27	CQGTHFPWT	輕鏈CDR3
28	GFTFSNYW	重鏈CDR1
29	IRLKSNNYAT	重鏈CDR2
30	TRGFAY	重鏈CDR3
31	FPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLNSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCCQGTHFPWTFGGGTKLEIKRRTELEIKQ	輕鏈可變區
32	EVKIEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSCVYLQMNNLRTEDTGIYYCTRGFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
33	QSLLYGNGKTY	輕鏈CDR1	抗RNase1抗體CDC06
34	LVS	輕鏈CDR2
35	MQGTHFPRT	輕鏈CDR3
36	GYVFSNYW	重鏈CDR1
37	IYPGDGNS	重鏈CDR2
38	VRWDGDYAV	重鏈CDR3
39	DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYGNGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGAPVRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCMQGTHFPRTFGGGTKLEMKR	輕鏈可變區
40	QAYLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYVFSNYWMNWVKQRPGQGLEWLGQIYPGDGNSNYNGKFKGKATLTAVKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCVRWDGDYAVWGAGTTVTVSS	重鏈可變區

利用這5個抗體進行蛋白質免疫轉漬雜交實驗(western blot)，實驗步驟如下：一、蛋白裂解液的配置 1. 蛋白裂解液2×sample buffer 40ml體系配置：按以下成分添加：80%甘油10ml，滅菌水1ml，10%SDS 24ml，1M Tris-HCL(pH6.8)5ml，充分混合後常溫儲存備用。 2. 蛋白上樣緩衝液的配置：將β-巰基乙醇與適量溴酚藍粉末於1.5mlEP管內充分混合，於-20℃冰箱常規保存備用。

二、總蛋白提取 1）從37℃恆溫孵箱中取出需要提取蛋白的細胞培養皿，於顯微鏡下評估細胞密度； 2）將培養皿置於冰上(整個操作步驟均在冰上進行)，吸去上層培養液，用遇冷的PBS清洗2次； 3）根據細胞密度按1：1的比例分別每孔加入20-50μl的PBS和蛋白裂解液，在液體覆蓋培養皿表面後立即用細胞刮勺將所加溶液與培養皿表面附著細胞充分攪拌混合裂解，並收集至EP管內； 4)100℃恆溫金屬浴加熱 10分鐘使蛋白變性，12000rpm瞬離，於4℃條件下短期保存備用。

三、蛋白濃度定量(BCA法) 1）實驗前將PBS與BSA原液定量混合配置成濃度為 0.5mg/ml 的 BSA 標準品，冰上或4℃保存備用； 2）配置 BCA混合液：根據實驗設置的檢測樣本和對應梯度標準品的數目，按 BCA 試劑:Cu試劑=50:1 的比例配製成淡綠色BCA 混合工作液，充分混勻後室溫短期保存備用； 3）於第一個孔開始將標準品從20μl-0μl遞減的體積加入蛋白標準品孔中，隨後加 PBS補足每孔液體至20μl，使各孔內標準品的濃度形成一系列濃度梯度； 4）酶標儀使用562nm的波長檢測的吸光度，記錄OD值，並繪製蛋白標準曲線； 5）樣品蛋白處理：取96孔板及製備好的蛋白樣品，每孔加入18μl PBS和2μl 樣本，並加入200μl的BCA混合液，於37℃金屬浴或孵箱中反應30分鐘； 6）取反應後樣本，檢測得到OD值後，根據繪製完成的蛋白標準曲線計算樣本蛋白濃度，並根據蛋白上樣量計算電泳時的樣本體積，具體計算公式：蛋白上樣體積=蛋白上樣量/樣本蛋白濃度； 7）將樣本蛋白與配好的蛋白上樣緩衝液按20：1的比例充分混合，12000rpm瞬離於-20℃冰箱保存備用。

四、SDS-PAGE凝膠電泳 1) 分離膠的製備：根據實驗檢測蛋白分子量的大小來選擇不同濃度的分離膠，本實驗檢測蛋白RNase1、p-ALK(Y1604)、p-ALK(Y1282/1283)所需分離膠濃度為10%、8%、8%。分離膠體系如表1所示。於水平桌面安裝好製膠板架，按分離膠體系配置好混合液(5ml)，迅速小心平穩地打入製膠板間預留縫隙。隨後沿製膠板壁邊緣自左向右水平緩慢打入100-200μl體積異丙醇或無水乙醇壓平膠面，輕微抬起並晃動一側製膠架使其排出潛在的氣泡，最後靜置於水平桌面常溫30-60分鐘待分離膠凝固；表1 分離膠配置體系(5ml)

成分	體積(ml)(8%/10%)
去離子水 30%丙烯醯胺 1.5M Tris-HCl(pH=6.8) 10% SDS 10%過硫酸銨 TEMED	2.3/1.9 1.3/1.7 1.3/1.3 0.05/0.05 0.05/0.05 0.003/0.002

2) 濃縮膠的製備：待分離膠凝固後，小心地吸去異丙醇或無水乙醇，自然通風條件下晾乾。隨後按濃縮膠體系(如表2所示)配置上層膠(2ml)，並迅速平穩地打入製膠板間隙至液體溢出。緩慢、平穩插入15孔梳。室溫下水平桌面靜置30-60分鐘；表2 濃縮膠配置體系(2ml)

成分	體積(ml)
去離子水 30%丙烯醯胺 1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 10% SDS 10%過硫酸銨 TEMED	1.1 2.5 1.3 0.05 0.05 0.002

3) 待上層濃縮膠凝3)固後，將膠板從製膠架上小心取下，嚴密地固定於電泳槽內，小心緩慢且垂直地拔出梳子留出上樣孔，並在電泳槽內依據膠板的數量倒入適量的電泳液；

4)蛋白上樣：取出-20℃冰箱內保存的蛋白樣品，待其解凍恢復至室溫。根據計算好的蛋白上樣體積等量地依次上樣，並根據實驗需要預留1-2孔加5μl蛋白上樣指示劑(marker)；

5)電泳：上樣後以80V電壓恆壓開始電泳，當見到製膠板底部開始產生串珠樣氣泡即標誌著電泳開始，隨後可見蛋白樣品內的溴酚藍被壓縮形成一條直線，根據marker判斷蛋白到達一條明顯區分度的透明分離膠介面後，調整電壓至120V恆壓，當溴酚藍指示劑下降製膠板最底緣時便停止電泳開始轉膜；

6)轉膜：預先準備好轉膜需要的濾紙，裝有啟動用的甲醇盒，轉膜夾， PVDF 膜等，並於轉膜前在4℃環境下預冷轉膜液。將一片濾紙置於水平容器中，倒入適量轉膜液，使其高度略微超過濾紙厚度。甲醇潤濕並活化PVDF 膜，接著將其置於濾紙之上。取出電泳完畢的膠板，從膠板上剝離蛋白膠，適當修剪邊界後置於PVDF 膜上，在其上再覆一層濾紙，操作期間不斷去除產生的氣泡。最後遵循“黑膠白膜”原則，將轉膜夾透明面作為最下層，其上覆海綿墊並水準置入前一步夾好的濾紙和PVDF 膜，再於其上蓋一層海綿墊，轉膜夾黑色面對齊合上扣緊轉膜夾卡扣。將扣好的轉膜夾固定於轉膜槽內，加入轉膜液直到其淹沒轉膜指示線，將轉膜槽置於合適的容器之後便開始轉膜，容器內加入冰水預備降溫。使用300mA恆流轉膜，根據目標蛋白的大小選擇合適的轉膜時間，R1和p-ALK蛋白的轉膜時間分別為1和2小時；

7)封閉：預先配置用PBST配置的5%脫脂牛奶及適量清洗用的PBST。轉膜完成後打開轉膜夾，小心取出完成轉膜的PVDF 膜。將膜置於PBST中清洗2-3次，每次2 分鐘。隨後移入由PBST配成的5%脫脂牛奶內，放置於搖床上，封閉1小時；

8)孵育一抗：按照比例使用一抗稀釋液、5%牛奶或5% BSA配置一抗，本實驗一抗配置濃度均為1:1000(本實驗抗體來源均為自製單克隆鼠抗)，每支抗體配置4ml。孵育前配好所用抗體，倒入孵育盒對應條帶的格內並置於冰上低溫維持抗體活性。將5%脫脂牛奶內的PVDF 膜取出並使用PBST略加漂洗以去除殘留牛奶。根據實驗檢測蛋白條帶大小，以顯色marker為刻度將膜才成條帶狀後，放入對應抗體的格內。密封後置於4℃搖床緩慢搖動12小時；

9)回收一抗：12小時後將一抗回收；

10)孵育二抗：使用辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(中杉金橋，貨號：ZB-2305)按照1：5000的比例使用PBST配成的5%脫脂牛奶提前配置相應二抗稀釋液。PVDF 膜用PBST漂洗至少3次，每次5-10分鐘，漂洗完倒去液體。隨後將二抗稀釋液倒入對應種屬的PVDF 膜格內，搖床緩慢搖動1小時；

11)回收二抗：將二抗回收並用PBST再次漂洗PVDF 膜3次，每次5-10分鐘；

12)ECL顯影：預先配置超敏ECL顯影液(UltraSignal 超敏ECL化學發光基質，四正柏，貨號：4AW011-100)，將ECL A液和B液等體積於EP管內混合後，避光低溫備用。顯影前，將PVDF膜置於泡沫板上，使殘留的PBST略微拭乾，隨後根據膜的大小於其上滴下配好的超敏ECL顯影液，待其兩面完全浸潤後。於Bio-rad成像儀器中曝光。

實驗結果見圖1。這5種RNase1單克隆抗體均能特異性的識別內源性的RNase1蛋白，目的條帶清晰且與RNase1的蛋白大小吻合、無非特異性條帶。結果表明：這5種抗RNase1抗體均與RNase1發生特異性結合，從而能夠有效用於檢測樣本中的RNase1。

實施例2：抗ALK磷酸化抗體的製備該抗體的製備過程與上述RNase1抗體的製備過程相同，僅在抗原使用上不同。製備ALK磷酸化抗體使用的抗原是合成的ALK蛋白磷酸化肽段，共2種ALK蛋白磷酸化肽段，每種5mg。

獲得了9種抗ALK磷酸化抗體，其具體胺基酸序列如下表所示。

SEQ ID NO	胺基酸序列	說明
41	QDINSY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDA04
42	RANRLVDGVPS	輕鏈CDR2
43	LQYEEFPLT	輕鏈CDR3
44	GFTFSSFG	重鏈CDR1
45	INSGSSSIFYADTVKG	重鏈CDR2
46	EDTAMYYC	重鏈CDR3
47	DTTVTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWLQQKPGKTPTTLIHRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEFEDMGIYYCLQYEEFPLTLGAGTKLEIKR	輕鏈可變區
48	EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYINSGSSSIFYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCTRRGAAYGSSPFSYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
49	QDINSY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDA01
50	RANRLVDGVPS	輕鏈CDR2
51	LQYDEFPLT	輕鏈CDR3
52	GFTFSSFG	重鏈CDR1
53	INSASSTVYYADTLKG	重鏈CDR2
54	TRRGHLGLPFAY	重鏈CDR3
55	DTTVTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAKTKLEMKR	輕鏈可變區
56	EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYINSASSTVYYADTLKGRFTISRDNPNNALFLQMTSLRSEDTAIYYCTRRGHLGLPFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
57	QSLVHSNGNTY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDB04
58	KVSN	輕鏈CDR2
59	SQSTHVPRT	輕鏈CDR3
60	GYSFPVYF	重鏈CDR1
61	INPYNGDTFYNQKFQV	重鏈CDR2
62	EDSAVYYCGGSGDGGAWFAY	重鏈CDR3
63	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLEI	輕鏈可變區
64	EVQLQESGPELVKPGTSVKISCKASGYSFPVYFVNWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFQVKTTLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGGSGDGGAWFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
65	QDINNY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDA05
66	RANRLVDGVPS	輕鏈CDR2
67	LQYDEFPLT	輕鏈CDR3
68	GFTFSSFG	重鏈CDR1
69	ISRGSNSI	重鏈CDR2
70	ARRGGDYGSSPFAY	重鏈CDR3
71	DTTVTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLTWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEMKR	輕鏈可變區
72	EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISRGSNSIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGGDYGSSPFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
73	QDINGY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDA02
74	RANRLVDGVPS	輕鏈CDR2
75	EDMEIYYCLQYDEFPLT	輕鏈CDR3
76	GFTFSSFG	重鏈CDR1
77	INSDSTNIYYADRVKG	重鏈CDR2
78	EDTAMYFCARRGSLGMIYGY	重鏈CDR3
79	DTTVTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINGYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMEIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEMKR	輕鏈可變區
80	DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWIAYINSDSTNIYYADRVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYFCARRGSLGMIYGYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
81	QDINSY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDB03
82	RANRLVDGVPS	輕鏈CDR2
83	LQYEEFPLT	輕鏈CDR3
84	GFTFSSFG	重鏈CDR1
85	ISRGSNSI	重鏈CDR2
86	ARRGLLGMVYAY	重鏈CDR3
87	DTTVTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISRLEYEDMGSYYCLQYEEFPLTFGAGTKLEIKR	輕鏈可變區
88	EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWIAYINSDSTNIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYFCARRGLLGMVYAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
89	QSLVHSNGNTY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDB01
90	KVS	輕鏈CDR2
91	EDRGVYFCSQSTHVPRT	輕鏈CDR3
92	GYSLTAYF	重鏈CDR1
93	INLNNGDIVYNQKFKD	重鏈CDR2
94	GKSGDGGAWFAY	重鏈CDR3
95	DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDRGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLEIKRRTELEIKQ	輕鏈可變區
96	DVQLQESGPEMVKPGASVKISCKASGYSLTAYFINWVKQSHGKSLEWIGRINLNNGDIVYNQKFKDKATLTVDKSSRSAHMEFRSLTSEDSAVYFCGKSGDGGAWFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
97	QSLVHSNGNTY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDB02
98	KVS	輕鏈CDR2
99	QSTHVPRT	輕鏈CDR3
100	GYPLPAYF	重鏈CDR1
101	INLNNGDI	重鏈CDR2
102	GKSGDGGAWFAY	重鏈CDR3
103	DVVVTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLEIKR	輕鏈可變區
104	EVQLQESGPEMVKPGASVKISCKASGYPLPAYFINWVKQSHGKRLEWIGRINLNNGDIFYNQNFKDKATLAVDRSSTSAHMELLSLTSEDSAVYYCGKSGDGGAWFAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區
105	QDINSY	輕鏈CDR1	抗ALK磷酸化抗體CDA03
106	RAN	輕鏈CDR2
107	LQYEEFPLT	輕鏈CDR3
108	GFTFSSFG	重鏈CDR1
109	INSDSTNI	重鏈CDR2
110	ARRGLLGMVYAY	重鏈CDR3
111	DIQMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISRLEYEDMGSYYCLQYEEFPLTFGAGTKLEIK	輕鏈可變區
112	EVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWIAYINSDSTNIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYFCARRGLLGMVYAYWGQGTLVTVSA	重鏈可變區

利用這9個抗體進行蛋白質免疫轉漬雜交實驗，實驗方法與實施例1中RNase1的western blot過程相同。

實驗結果見圖2。這9種ALK磷酸化單克隆抗體均能特異性的識別內源性的ALK磷酸化蛋白，目的條帶清晰且與ALK磷酸化蛋白大小吻合、無非特異性條帶。結果表明：這9種抗ALK磷酸化抗體均與磷酸化ALK發生特異性結合，從而能夠有效用於檢測樣本中的ALK磷酸化水準。

實施例3：ALK抑制劑對RDAA陽性疾病細胞的殺傷作用利用二代測序的方法檢測來3名受試者的腫瘤組織切片樣品中ALK基因重排表達水準：患者手術或穿刺病理組織樣本使用二代高通量基因檢測技術(深圳華大基因股份有限公司)診斷無ALK基因重排及相關突變，診斷為ALK基因重排陰性。

對ALK基因重排陰性的受試者繼續進行以下檢測。

利用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測來自3名ALK基因重排陰性受試者的血漿樣品中RNase1的表達水準。檢測方法如下： Elisa 檢測試劑及流程採用Rnase1 Elisa試劑盒(產品名及貨號：ELISA Kit for Ribonuclease1, human; Product Number: SEA297Hu)

一、試劑及物品準備(試劑盒內物品)

試劑	數(劑)量	試劑	數(劑)量
預處理，準備使用的96孔板	1個	96孔板板封	4個
標準品	2個	標準品稀釋液	1×20mL
檢測試劑 A	1×120µL	檢測稀釋液A	1×12mL
檢測試劑 B	1×120µL	檢測稀釋液B	1×12mL
TMB 反應基質溶液	1×9mL	終止液	1×6mL
清洗緩衝液 (30 × 濃度)	1×20mL	說明書	1份

二、實驗步驟 1. 準備所有試劑、樣品和標準品; 2. 每孔加入100 μ L標準品或樣品，37℃孵育1小時; 3. 抽取製備好的檢測試劑A 100 μ L/孔加入，37℃孵育1小時; 4. 抽吸並清洗3次; 5. 加入製備好的檢測試劑B 100 μ L/孔，37℃孵育30分鐘; 6. 抽吸並清洗5次; 7. 加入90 μ L/孔TMB反應基質溶液。37℃孵育120分鐘; 8. 添加終止液50 μ L/孔。酶標儀 450nm讀數。

根據吸光度數值，以標準品為參照，以及稀釋倍數，計算樣品中RNase1的濃度。將418ng/ml濃度作為區分RNase1表達高與低的分界點。(非小細胞型肺癌患者血漿中RNase1的濃度平均值為418ng/ml)。

利用免疫組織化學(IHC)法檢測來自3名ALK基因重排陰性受試者的腫瘤組織樣品中RNase1的表達水準。免疫組織化學實驗步驟：（1）組織切片用65℃的烤箱烘烤3小時；（2）石蠟切片經二甲苯脫蠟，不同濃度乙醇水化；（3） 3％過氧化氫抑制內源性過氧化物酶15 分鐘；（4） PBS洗3次，每次沖洗5分鐘；（5）將切片浸入檸檬酸緩衝液用微波進行修復，微波高火5分鐘，中火5分鐘(或進行高壓加熱120 ℃，2分鐘)；（6）自然冷卻至室溫後(約60分鐘)，PBS沖洗3次，每次5分鐘；（7）除去載玻片上多餘液體，滴加RNase1單克隆抗體，抗體稀釋濃度為1：100至1：1000，置於濕盒中，4℃過夜；（8）第二日取出室溫放置1h後PBS洗3次，每次5分鐘；（9）滴加多聚酶標二抗室溫放置30 分鐘，PBS沖洗3次，每次5 分鐘；（10） DAB顯色液顯色3分鐘，鏡下觀察；（11）流水終止顯色，蘇木素複染1分鐘；（12）自來水沖洗，分化液分化5s；（13）沖洗切片，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

免疫組織化學結果判定方法：所有的蘇木素染色的切片都被兩個病理醫師單獨的閱片。癌症標本的腫瘤含量大於70%。雙盲法進行RNase1染色的評估，觀察確定RNase1表達陽性的細胞定位，其表現為有棕黃色或棕褐色顆粒。免疫組織化學染色得分通過陽性染色細胞數乘以染色強度得到。光學顯微鏡下觀察組織標本，按陽性染色細胞所占的百分比計分：0：陰性表達；1分：陽性細胞數為＜15%；2分：陽性細胞15-50%；3分：陽性細胞≥50%；染色強度按照顯色深淺計分：0分：無陽性；1分：淺黃；2分：棕黃；3分：棕褐。將免疫組織化學染色得分=4分作為區分RNase1表達水準高與低的分界點。

採用上述HIC法，使用ALK磷酸化單克隆抗體(抗體製備部分展示的9種ALK磷酸化單克隆抗體中的CDA04)檢測來自3名受試者的腫瘤組織樣品中的ALK磷酸化水準。將免疫組織化學染色得分=4分作為區分ALK磷酸化水準高與低的分界點。

按照以下標準劃分為RDAA陽性受試者和非RDAA陽性(RDAA陰性)受試者： RDAA陽性受試者：血漿中的Rnase1表達水準≥418ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分≥4分；並且針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分≥4分； RDAA陰性受試者：血漿中的Rnase1表達水準＜418ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分＜4分；並且針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分＜4分。

將來自1名RDAA陽性和1名RDAA陰性的非小細胞型肺癌受試者的癌細胞分別用安慰劑(PBS緩衝液)、克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritininb)、蘿拉替尼(Loratinib)、阿來替尼(Alectinib)、布加替尼(Brigatinib)和恩沙替尼(Ensartinib)六種ALK抑制劑處理細胞(上述藥物使用終濃度均為1微克每毫升培養基、細胞密度為5萬個細胞每毫升培養基)，觀察細胞存活、每天計算存活細胞數量、並繪製生長曲線。

實驗結果如圖3所示，橫坐標軸為用藥的時間，單位為(天)，縱坐標軸為相對細胞數量。結果顯示：安慰劑無法抑制RDAA陽性肺癌細胞的生長，但各種ALK抑制劑均有效殺傷了RDAA陽性肺癌細胞(P＜0.01)，但對RDAA陰性肺癌細胞沒有顯著作用。

實施例4：ALK抑制劑對RDAA陽性肺癌小鼠的治療效果將來自1名RDAA陽性的非小細胞型肺癌患者的癌細胞接種至裸鼠腹部皮下組織，接種細胞數量為五十萬細胞每只小鼠，接種10天後可觀察到小鼠腹部皮下有腫塊生長，即構建出RDAA陽性的荷瘤小鼠。

將負荷RDAA陽性腫瘤的荷瘤小鼠隨機分成七組(每組5只)，分別口服施用安慰劑(PBS緩衝液)、克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、或恩沙替尼(ALK抑制劑的使用劑量為25毫克每日每公斤體重，安慰劑的使用劑量為2ul 每日每只小鼠，腫瘤接種2周後開始給藥，第四周起停止給藥)。

實驗結果如圖4、圖5所示。結果表明：相對於用安慰劑組小鼠，ALK抑制劑顯著抑制了RDAA陽性腫瘤荷瘤小鼠的腫瘤生長(P＜0.01)；同時，該荷瘤小鼠的生存也顯著得到改善(P＜0.01)。

實施例5：ALK抑制劑對RDAA陽性患者的治療效果來自四川大學華西醫院的40名患者已按照實施例3中的檢測方法確定為ALK基因重排陰性。然後，利用本試劑盒對患者的血漿樣本中的Rnase1表達水準和腫瘤組織樣本中的RNase1蛋白表達水準及ALK磷酸化水準進行測定，按照以下標準劃分為RDAA陽性患者和非RDAA陽性患者： RDAA陽性患者：血漿中的Rnase1表達水準≥418ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分≥4分；並且針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分≥4分； RDAA陰性患者：血漿中的Rnase1表達水準＜418ng/ml或者針對Rnase1的免疫組織化學染色得分＜4分；並且針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色得分＜4分。

共鑒定出3名RDAA陽性患者，均為非小細胞型肺癌患者。對這3名患者以每次250毫克，每天兩次的劑量施用克唑替尼，連續使用4周後前後的CT結果如圖6所示。能夠明顯看出：克唑替尼顯著抑制了RDAA陽性患者的腫瘤生長。

實施例6：ALK抑制劑對RDAA陽性PDAC患者的治療效果通過第二代高通量基因測序(NGS)的方法，確定了10名ALK基因重排為陰性的PDAC患者。將這些患者的腫瘤組織切片進行本試劑盒中提到的RNase1和ALK磷酸化免疫組化檢測。其中1名腫瘤組織切片免疫組化結果為RNase1表達＞4分且ALK磷酸化＞4分，鑒定為RDAA陽性的PDAC患者。將該患者的腫瘤細胞培養，分別以安慰劑對照(control， PBS緩衝液)、克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritininb)、蘿拉替尼(Loratinib)、阿來替尼(Alectinib)、布加替尼(Brigatinib)和恩沙替尼(Ensartinib)六種ALK抑制劑處理細胞(上述藥物使用終濃度均為1微克每毫升培養基、細胞密度為5萬個細胞每毫升培養基)，觀察細胞存活、每天計算存活細胞數量、並繪製生長曲線。

實驗結果如圖7所示，橫坐標軸為用藥的時間，單位為(天)，縱坐標軸為相對細胞數量。結果顯示：安慰劑無法抑制RDAA陽性PDAC細胞的生長，但各種ALK抑制劑均有效殺傷了RDAA陽性PDAC細胞(P＜0.01)。

無

圖1示出了實施例1的5個RNase1單克隆抗體的蛋白質免疫轉漬雜交實驗結果。圖2示出了實施例2的9個ALK蛋白磷酸化單克隆抗體的蛋白質免疫轉漬雜交實驗結果。圖3示出了ALK抑制劑對RDAA陽性肺癌細胞的殺傷作用實驗結果。圖4示出了ALK抑制劑對RDAA陽性腫瘤荷瘤小鼠腫瘤生長抑制效果。圖5示出了ALK抑制劑對RDAA陽性腫瘤荷瘤小鼠的生存影響結果。圖6示出了ALK抑制劑對RDAA陽性患者的腫瘤生長抑制效果。圖7示出了來自RDAA陽性PDAC患者的細胞對ALK抑制劑的敏感性。

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Claims

一種用於治療疾病的方法，其至少包括以下步驟：對患有RDAA陽性疾病的患者施用間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑，所述RDAA陽性疾病定義為RNase1驅動的ALK活化所導致的疾病，其中來自所述患有RDAA陽性疾病的患者的樣本具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果，且其中所述患有RDAA陽性疾病的患者不是非小細胞肺癌患者。
如請求項1所述的方法，其中所述樣本來自患者的組織、細胞和/或體液；優選地，來自患者的組織切片和/或血液；優選地，來自患者的腫瘤組織切片和/或血液；優選地，來自受試者的肺癌或胰腺癌組織切片和/或血液；優選地，來自患者的胰腺導管腺癌組織切片和/或血液。
如請求項1或2所述的方法，所述患者為胰腺導管腺癌患者。
如請求項1-3中任一項所述的方法，所述ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。
如請求項1-4中任一項所述的方法，所述ALK抑制劑包括克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。
一種ALK抑制劑在製備用於治療RDAA陽性疾病的藥物中的用途，其中來自患有所述RDAA陽性疾病的患者的樣本具有陰性的ALK基因重排檢測結果，≥418 ng/ml的血漿中的Rnase1表達水準或者陽性的針對Rnase1的免疫組織化學染色結果，以及陽性的針對ALK磷酸化的免疫組織化學染色結果，且其中所述患有RDAA陽性疾病的患者不是非小細胞肺癌患者。
如請求項6所述的用途，其中所述樣本來自患者的組織、細胞和/或體液；優選地，來自患者的組織切片和/或血液；優選地，來自患者的腫瘤組織切片和/或血液；優選地，來自受試者的肺癌或胰腺癌組織切片和/或血液；優選地，來自患者的胰腺導管腺癌組織切片和/或血液。
如請求項6或7所述的用途，所述患者為胰腺導管腺癌患者。
如請求項6-8中任一項所述的用途，其中所述ALK抑制劑包括克唑替尼、色瑞替尼、蘿拉替尼、阿來替尼、布加替尼、恩沙替尼中的任一種或其組合。
如請求項6-9中任一項所述的用途，其中所述ALK抑制劑包括能夠抑制ALK磷酸化的抗體或其抗原結合部分。