TW202039826A

TW202039826A - 用於生產重組蛋白質之方法

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Publication number: TW202039826A
Application number: TW108144815A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特奈爾威廉斯
Original assignee: 美商柯赫勒斯生物科學有限公司
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2020-11-01
Also published as: WO2020118043A1; US20200207812A1

Abstract

本文提供生產重組蛋白質之方法，其包括：提供包括編碼重組蛋白質之核酸的細菌；及在包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ 之液體培養基中於足以生產並釋放該重組蛋白質至該培養基內之條件下培養該細菌。

Description

用於生產重組蛋白質之方法

本發明係關於生物技術及製造重組蛋白質之方法。

重組細菌用於許多生物技術方案中，包括重組蛋白質之生產。重組蛋白質通常用於製備新穎治療藥物產品。用於在細菌中生產重組蛋白質之當前方法導致該蛋白質保留於該細菌內(例如，保留於該細菌之周質內)。周質係促進蛋白質適當再折疊之氧化空間(尤其彼等具有胱胺酸殘基者)。為收穫蛋白質，必須將細菌分離自培養基並溶解或破壞(化學及/或物理)以釋放重組蛋白質。溶解及/或破壞細菌亦釋放非所需之宿主細胞蛋白質及潛在危險之內毒素，其等必須在重組蛋白質可用於藥物產品中前必須自該重組蛋白質純化。因此，用於回收重組蛋白質之當前方法有本發明解決之限制。

本發明係(至少部分)基於在包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ ，或約0.07 g/L至約72.0 g/L鎂鹽之液體培養基中培養重組細菌，導致將保留於重組細菌之周質空間內之重組蛋白質顯著釋放至液體培養基內之發現。鑒於此發現，本文提供生產重組蛋白質之方法，其包括：提供包括編碼重組蛋白質之核酸之重組細菌；及在包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ ，或約0.07 g/L至約72.0 g/L鎂鹽之液體培養基中在足以生產並釋放重組蛋白質至該液體培養基內之條件下培養該重組細菌。

本文提供生產重組蛋白質之方法，其包括：提供包括編碼重組蛋白質之核酸之重組細菌；及在包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ 之液體培養基中在足以生產並釋放該重組蛋白質至該液體培養基內之條件下培養該重組細菌。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該液體培養基包括鎂鹽。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該鎂鹽係MgSO₄ 。

本文描述之方法中之任何一者之一些實施例進一步包括自液體培養基回收重組蛋白質。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，經回收之重組蛋白質係至少95%純度。

本文描述之方法中之任何一者之一些實施例進一步包括純化經回收之重組蛋白質。

本文描述之方法中之任何一者之一些實施例進一步包括調配經純化之重組蛋白質。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該方法不包括進行超過兩個層析步驟。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該方法不包括物理或化學破壞重組細菌之外膜。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，培養係使用發酵罐進行。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該培養係批次培養。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該培養係進料批次培養。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，培養包括在每分鐘約80轉(RPM)至約1000 RPM (例如，約100 RPM至約850 RPM)之旋轉攪拌速率下培養重組細菌。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，培養係在約30℃至約37℃下進行。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，重組細菌係革蘭氏陰性菌。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，重組細菌係選自由以下組成之群：K12大腸桿菌(E. coli )細菌細胞、耶爾森氏菌(Yersinia )細菌細胞、BL21大腸桿菌細菌細胞、60E4大腸桿菌、不動桿菌(Acinetobacter )細菌細胞、博爾德菌(Bordetlla )細菌細胞、布魯氏菌(Brucella )細菌細胞、藍藻細菌(Cyanobacter )細菌細胞、腸桿菌(Enterobacter )細菌細胞、螺桿菌(Helicobacter )細菌細胞、克雷伯菌(Klebsiella )細菌細胞、奈瑟菌(Neisseria )細菌細胞、巴氏桿菌(Pasteurella )細菌細胞、假單胞菌(Pseudomonas )細菌細胞、沙門氏菌(Salmonella )細菌細胞及志賀氏菌(Shigella )細菌細胞。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，將編碼重組蛋白質之核酸整合至重組細菌之染色體內。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，未將編碼重組蛋白質之核酸整合至重組細菌之染色體內。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，重組蛋白質係抗體或抗原結合抗體片段。在本文描述之重組蛋白質中之任何一者之一些實施例中，重組蛋白質係抗體或特異性結合至人類血管內皮生長因子A (VEGF-A)之抗原結合抗體片段。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，抗原結合抗體片段係雷珠單抗(ranibizumab)。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，編碼重組蛋白質之核酸係表現載體。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，編碼重組蛋白質之核酸包括編碼細菌信號序列之序列。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，液體培養基包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ (例如，約0.4 mM至約41 mM Mg²⁺ 、約0.4 mM至約20 mM Mg²⁺ 、約0.4 mM至約10 mM Mg²⁺ ，或約0.4 mM至約5 mM Mg²⁺ )。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，液體培養基包括約0.3 mM Mg²⁺ 、約0.92 mM Mg²⁺ 、約1.41 mM Mg²⁺ 、約2.70 mM Mg²⁺ 、約5.41 mM Mg²⁺ 、約9.57 mM Mg²⁺ ，或約300 mM Mg²⁺ 。

本文亦提供藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質。本文亦提供包括藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之任何一者之組合物。

本文亦提供包括治療有效量之藉由本文描述之方法中之任何一者生產之本文描述之重組蛋白質中之任何一者之醫藥組合物。在本文描述之醫藥組合物中之任何一者之一些實施例中，重組蛋白質係雷珠單抗。在本文描述之醫藥組合物中之任何一者之一些實施例中，醫藥組合物包括約5 mg/mL至約10 mg/mL雷珠單抗。本文描述之醫藥組合物中之任何一者之一些實施例進一步包括張力劑、緩衝液、表面活性劑及注射用水，且其中該醫藥組合物具有約5至約6之pH。本文描述之醫藥組合物中之任何一者之一些實施例，醫藥組合物包括α,α-海藻糖二水合物、組胺酸緩衝液、聚山梨酯20及注射用水，且該醫藥組合物具有約5至約6之pH。

本文亦提供包括本文描述之醫藥組合物中之任何一者之套組。本文描述之套組中之任何一者之一些實施例進一步包括無菌玻璃小瓶，其中將醫藥組合物放置於該無菌玻璃小瓶內。本文描述之套組中之任何一者之一些實施例進一步包括注射器，其中將醫藥組合物放置於該注射器內。

本文亦提供治療有此需要之個體之方法，該等方法包括向該個體投與治療有效量之本文描述之醫藥組合物中之任何一者。在本文描述之治療個體之方法中之任何一者之一些實施例中，該個體已經識別或診斷為患有濕性老年性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫或視網膜靜脈阻塞後黃斑水腫(例如，視網膜分支靜脈阻塞或視網膜中央靜脈阻塞)。

如本文使用，名詞前之單詞「一」表示特定名詞中之一者或多者。例如，「一重組細菌細胞」表示「一或多個重組細菌細胞」。

術語「細菌」或「細菌細胞」意謂來自或衍生自任何細菌(例如，革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌)之任何細胞。細菌之非限制性實例係描述於本文描述中。細菌之額外實例係為此項技術中已知。

術語「重組細菌」意謂含有非天然存在於細菌中之核酸之細菌。例如，非天然存在於細菌中之核酸可編碼重組蛋白質(例如，本文描述之例示性重組蛋白質中之任何一者)及/或可編碼可選擇之標記物(例如，本文描述之例示性可選擇之標記物中之任何一者)。可將非天然存在於細胞中之核酸(例如)整合於細菌之基因體內。在其他實例中，未將非天然存在於細胞中之核酸整合於細菌之基因體內。例如，非天然存在於細菌中之核酸可為附加型的。

如本文使用，術語「培養」或「細胞培養」係指在一組受控物理條件下維持或增殖細菌(例如，重組細菌)。可用於培養重組細菌之物理條件之非限制性實例係描述於本文中。

如本文使用之術語「進料批次培養」係指在容器(container)或容器(vessel) (例如，發酵罐)中培養已與液體培養基(例如，本文描述之例示性液體培養基中之任何一者)接觸以獲得重組蛋白質生產培養基之複數種細菌，其中存在於容器(container)或容器(vessel)中之細胞之培養包括向重組蛋白質生產培養基定期或連續添加一定體積之液體培養基而無需大量或顯著移除該重組蛋白質生產培養基。例如，非大量或顯著移除培養基包括移除少量培養基用於監測及/或分析培養物或培養條件。在一些實施例中，進料批次培養包括使可生產重組蛋白質之重組細菌與液體培養基在進料批次生物反應器中接觸，其包括向該進料批次生物反應器定期或連續添加一定體積之液體培養基而無需大量或顯著移除重組蛋白質生產培養基。在一些實施例中，在初始製備重組蛋白質生產培養基後添加之液體培養基(此項技術中瞭解此稍後添加之培養基，且在本文中被稱為進料液體培養基)係與首先與重組細菌接觸以初始獲得重組蛋白質生產培養基之初始液體培養基相同或不同的。在進料批次培養物之一些實例中，稍後添加之進料液體培養基係經濃縮之液體培養基。在一些實施例中，熟習從業者將知曉發酵罐可適用於進料批次培養(例如，適用於進料批次發酵罐)。

術語「液體培養基」包含(i)含有足夠營養素以容許細胞(例如，細菌細胞)活體外生長或增殖；及(ii)未經放置於此等細胞中、未與此等細胞接觸、未與此等細胞組合，或未添加至此等細胞之流體。在一些實施例中，液體培養基係最小培養基(例如，含有僅無機鹽、碳源及水之培養基)。液體培養基之非限制性實例係描述於本文中。液體培養基之額外實例係描述於此項技術中且係市售的。在一些實例中，液體培養基可意欲作為進料液體培養基添加至已製備之重組蛋白質生產培養基(如下文定義)。

如本文使用之術語「重組蛋白質生產培養基」包含適用於生產藉由使液體培養基與包含編碼重組蛋白質之核酸之細胞(例如，重組細菌)接觸獲得之重組蛋白質之流體。出於本文之目的，應瞭解「液體培養基」不同於「重組蛋白質生產培養基」，因為後者(例如)可含有細胞代謝之產物及由細胞(例如，重組細菌)生產之重組蛋白質。此外，在重組蛋白質生產培養基中發生之細胞代謝在液體培養基中消耗能量，並生產代謝物。在培養物之重組蛋白質生產階段期間，重組蛋白質生產培養基可於重組細菌之培養物中產生。在一些態樣中，重組蛋白質生產培養基不包括磷酸鹽。

如本文使用，術語「鎂鹽」、「Mg++鹽」、「Mg⁺² 鹽」及「Mg鹽」係指任何含有鎂離子之化合物，其包括(但不限於) MgCl₂ 、MgSO₄ 、吡酮酸Mg、MgHPO₄ 、MgBr₂ 及MgCrO₄ 。在一些實施例中，鎂鹽係作為固體(例如，顆粒或粉末)提供。在其他實施例中，鎂鹽係提供於液體溶液中(例如，溶解於諸如水之溶劑內)。在一些實施例中，鎂鹽係適用於添加至培養基，諸如液體培養基或重組蛋白質生產培養基。

術語「攪拌」意謂在生物反應器或容器(例如，發酵罐)中攪動或以其他方式移動一部分液體培養基及/或重組蛋白質培養基。在生物反應器或容器(例如，發酵罐)中進行攪拌以增加液體培養基及/或重組蛋白質培養基中之溶解O₂ 濃度。在一些實施例中，攪拌係使用任何此項技術中已知的方法(例如，儀器或螺旋槳)進行。用於在生物反應器或容器(例如，發酵罐)中進行一部分液體培養基或重組蛋白質培養基之攪拌之例示性裝置及方法係此項技術中已知的。

如本文使用之術語「免疫球蛋白」包含含有免疫球蛋白蛋白質之至少15個胺基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸)之胺基酸序列(例如，可變域序列、框架序列或恆定域序列)之多肽。在一些實施例中，免疫球蛋白包含輕鏈免疫球蛋白之至少15個胺基酸及重鏈免疫球蛋白之至少15個胺基酸。在一些實施例中，免疫球蛋白係經分離之抗體(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。在一些實施例中，免疫球蛋白係IgG之子類(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些實施例中，免疫球蛋白係小鼠、嵌合、人類化或人類抗體。在一些實施例中，免疫球蛋白係抗體片段，例如，Fab片段、F(ab')₂ 片段或scFv片段。在一些實施例中，免疫球蛋白係雙特異性抗體或三特異性抗體，或二聚體、三聚體或多聚體抗體，或雙功能抗體、Affibody®或Nanobody®。在一些實施例中，免疫球蛋白係含有至少一個免疫球蛋白域之經改造之蛋白質(例如，融合蛋白質)。免疫球蛋白之非限制性實例係描述於本文中及免疫球蛋白之額外實例係描述於此項技術中。

如本文使用，術語「捕獲」係指自重組蛋白質生產培養基或經稀釋之重組蛋白質生產培養基中存在之一或多種其他組分部分純化或分離及濃縮重組蛋白質。在一些實施例中，捕獲係使用結合重組蛋白質之樹脂(例如，通過使用親和力層析術)進行。用於自重組蛋白質生產培養基或經稀釋之重組蛋白質生產培養基捕獲重組蛋白質之非限制性方法係描述於本文及此項技術中。在一些實施例中，重組蛋白質係使用至少一種層析管柱(例如，本文描述之層析管柱中之任何一者)捕獲自重組蛋白質生產培養基或經稀釋之重組蛋白質生產培養基。

如本文使用，術語「回收」包括自重組蛋白質生產培養基(例如，重組細菌細胞)中存在之一或多種組分，或重組細菌細胞溶解物中存在之一或多種其他組分(例如，DNA、RNA或其他蛋白質))至少部分純化或分離(例如，至少或約4% (例如，至少或約5%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)重組蛋白質。用於自重組蛋白質生產培養基或自重組細菌細胞溶解物回收重組蛋白質之非限制性方法係描述於本文並揭示於此項技術中。

如本文使用，術語「純化」包括自含有重組蛋白質之流體(例如，重組蛋白質生產培養基)中存在之一或多種其他雜質(例如，大量雜質)或組分分離重組蛋白質。在一些實施例中，純化包括自細菌細胞中存在或分泌自細菌細胞之液體培養基蛋白質或一或多種其他組分(例如，DNA、RNA、其他蛋白質、內毒素、病毒等)分離重組蛋白質。在一些實施例中，純化係使用結合重組蛋白質或污染物之樹脂進行。非限制性實例包括親和力層析術、疏水性作用層析術、陰離子或陽離子交換層析術或分子篩層析術。在一些實施例中，重組蛋白質係使用至少一種層析管柱(例如，本文描述之層析管柱中之任何一者)純化自含有重組蛋白質之流體(例如，重組蛋白質生產培養基)。

如本文使用，術語「精煉」係指進行以自含有接近最終之所需純度之重組蛋白質之流體移除剩餘之痕量或少量污染物或雜質之步驟。在一非限制性實例中，精煉係藉由使含有重組蛋白質之流體通過選擇性結合至重組蛋白質或含有重組蛋白質之流體中存在之少量污染物或雜質之層析管柱或膜吸收器進行。在此實例中，層析管柱或膜吸收器之溶析液/濾液含有重組蛋白質。

如本文使用，術語「過濾」係指自液體(例如，重組蛋白質生產培養基或其他流體)移除至少部分非所需之生物污染物(例如，酵母細胞、病毒或細菌)及/或顆粒物質(例如，經沈澱之蛋白質)。

如本文使用之術語「經分泌之蛋白質」或「經釋放之蛋白質」包含在於細菌細胞內轉譯時最初含有至少一個分泌信號序列 (例如，重組蛋白質)且通過細菌細胞中分泌信號序列之(至少部分)酶促裂解分泌至細胞外空間內之蛋白質。在一些實施例中，細胞外空間係液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基。熟習從業者將知曉「經分泌」之蛋白質無需完全分離自細菌外膜即可視為經分泌之蛋白質。如本文使用，經分泌之重組蛋白質非係指保留在重組細菌之周質中之蛋白質。

如本文使用，術語「進料批次生物反應器」係指在重組蛋白質生產培養基中含有或適用於含有複數個細菌(例如，重組細菌)之生物反應器，其中該生物反應器中存在之細胞培養物包括向重組蛋白質生產培養基定期或連續添加進料液體培養基而無需自細胞培養物大量或顯著移除重組蛋白質生產培養基。在一些實施例中，接著向已製備之重組蛋白質生產培養基添加之進料液體培養基係與用於初始製備重組蛋白質生產培養基之液體培養基相同。在進料批次培養物之一些實例中，稍後添加之進料液體培養基係初始液體培養基之濃縮形式。

術語「產率」係指基於初始材料之量，獲得之重組蛋白質之總量相對於可獲得之重組蛋白質之理論量之比率(表示為百分率)。

術語「啟動子」係可操作地連接至編碼蛋白質(例如，重組蛋白質)之核酸序列之核酸序列，其可增加編碼該蛋白質之核酸序列之轉錄。在一些態樣中，啟動子係組成性的。在其他態樣中，啟動子係可誘導的。啟動子之非限制性實例係描述於本文中。啟動子之額外實例係此項技術中已知的。

如本文使用，術語「調配」包括以可與向個體投與重組蛋白質之預期投與途徑(例如，動脈內、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內、皮下或經口)相容之方式處理重組蛋白質。在一些態樣中，調配包括以劑量單位形式(即，為方便投與及劑量之均勻性，含有既定量重組蛋白質之物理離散單元)提供重組蛋白質。在一些態樣中，調配可包括無菌稀釋劑(例如，無菌水、生理鹽水或注射用水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑、抗菌或抗真菌劑(例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)、螫合劑(例如，乙二胺四乙酸)、緩衝液(例如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽)、等滲劑(例如，糖、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)或鹽(例如，氯化鈉)，或其任何組合。重組蛋白質之調配物之非限制性實例係描述於本文中。

除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與如由本發明所屬領域之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。本文描述用於本發明中之方法及材料；亦可使用此項技術中描述之其他合適之方法及材料。該等材料、方法及實例係僅說明性的且非意欲限制本發明。本文提及之所有公開案、專利申請案、專利案、序列、資料庫條目及其他參考案係以全文引用之方式併入本文中。在矛盾之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。

本發明之其他特徵及優點將自下列實施方式及圖式及自申請專利範圍中顯而易見。

相關申請案之交互參照

本申請案主張對2018年12月7日申請之美國臨時專利申請案系列第62/776,880號之優先權；該案之全部內容係以引用之方式併入本文中。

本發明係基於在包括約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ 之液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基中培養重組細菌導致自重組細菌之周質空間釋放至液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基內之重組蛋白質之量增加之發現(參見圖3至6)。鑒於此發現，本文提供生產重組蛋白質之方法，其包括：提供包含編碼重組蛋白質之核酸之重組細菌；及在包括約0.3 mM至約300 mM Mg2+之液體培養基中在足以生產並釋放重組蛋白質至培養基內之條件下培養重組細菌。

本文提供之方法可(例如)導致顯著無宿主細胞蛋白質及/或內毒素之重組蛋白質生產培養基之生產(例如，其中重組蛋白質生產培養基中存在之宿主細胞蛋白質及/或內毒素之量係小於約20% w/w、小於約18% w/w、小於約16% w/w、小於約14% w/w、小於約12% w/w、小於約10% w/w、小於約8% w/w、小於約6% w/w、小於約4% w/w、小於約2% w/w或小於約1% w/w (相較於總蛋白質，宿主細胞蛋白質及/或內毒素)(其中該重組蛋白質生產培養基未經處理以移除任何宿主細胞蛋白質及/或內毒素)。

本文提供之方法可(例如)導致顯著無宿主細胞蛋白質及/或內毒素之重組蛋白質生產培養基之生產(例如，其中重組蛋白質生產培養基中存在之宿主細胞蛋白質及/或內毒素之量係約1%至約20% w/w、約1%至約18% w/w、約1%至約16% w/w、約1%至約14% w/w、約1%至約12% w/w、約1%至約10% w/w、約1%至約8% w/w、約1%至約6% w/w、約1%至約4% w/w，或約1%至約2% w/w (相較於總蛋白質，宿主細胞蛋白質及/或內毒素) (其中該重組蛋白質生產培養基未經處理以移除任何宿主細胞蛋白質及/或內毒素)。

本文提供之方法導致(例如)包括約100 mg/L至約300 mg/L、約100 mg/L至約280 mg/L、約100 mg/L至約260 mg/L、約100 mg/L至約240 mg/L、約100 mg/L至約220 mg/L、約100 mg/L至約200 mg/L、約100 mg/L至約180 mg/L、約100 mg/L至約160 mg/L、約100 mg/L至約140 mg/L、約100 mg/L至約120 mg/L、約120 mg/L至約300 mg/L、約120 mg/L至約280 mg/L、約120 mg/L至約260 mg/L、約120 mg/L至約240 mg/L、約120 mg/L至約220 mg/L、約120 mg/L至約200 mg/L、約120 mg/L至約180 mg/L、約120 mg/L至約160 mg/L、約120 mg/L至約140 mg/L、約140 mg/L至約300 mg/L、約140 mg/L至約280 mg/L、約140 mg/L至約260 mg/L、約140 mg/L至約240 mg/L、約140 mg/L至約220 mg/L、約140 mg/L至約200 mg/L、約140 mg/L至約180 mg/L、約140 mg/L至約160 mg/L、約160 mg/L至約300 mg/L、約160 mg/L至約280 mg/L、約160 mg/L至約260 mg/L、約160 mg/L至約240 mg/L、約160 mg/L至約220 mg/L、約160 mg/L至約200 mg/L、約160 mg/L至約180 mg/L、約180 mg/L至約300 mg/L、約180 mg/L至約280 mg/L、約180 mg/L至約260 mg/L、約180 mg/L至約240 mg/L、約180 mg/L至約220 mg/L、約180 mg/L至約200 mg/L、約200 mg/L至約300 mg/L、約200 mg/L至約280 mg/L、約200 mg/L至約260 mg/L、約200 mg/L至約240 mg/L、約200 mg/L至約220 mg/L、約220 mg/L至約300 mg/L、約220 mg/L至約280 mg/L、約220 mg/L至約260 mg/L、約220 mg/L至約240 mg/L、約240 mg/L至約300 mg/L、約240 mg/L至約280 mg/L、約240 mg/L至約260 mg/L、約260 mg/L至約300 mg/L、約260 mg/L至約280 mg/L或約280 mg/L至約300 mg/L重組蛋白質之重組蛋白質生產培養基之生產(其中該等方法不涉及物理及/或化學破壞重組細菌之外膜之步驟)。

此等方法之一些實施例包括回收重組蛋白質、純化經回收之重組蛋白質，及調配經純化之重組蛋白質，其中該方法僅包括總計一個層析步驟、兩個層析步驟或三個層析步驟。

此等方法之各種例示性態樣係描述於下文中且可用於與本文提供之方法之任何組合中而無限制。本文提供之方法之例示性態樣係描述於下文中；然而，熟習此項技術者將知曉可向本文描述之方法添加額外步驟及其他材料可用於進行本文描述之方法之步驟中之任何一者。

重組蛋白質藉由本文提供之方法生產之重組蛋白質之非限制性實例包括免疫球蛋白(包括輕鏈及重鏈免疫球蛋白)、抗體或抗體片段(例如，本文描述之抗體片段中之任何一者)。可藉由本文描述之方法生產之重組蛋白質之非限制性實例包括雷珠單抗及貝伐單抗(bevacizumab)。

在一些實施例中，重組蛋白質係非糖基化的。

在一些實施例中，重組蛋白質係抗體或抗原結合抗體片段。

在一些實施例中，重組蛋白質可為CroFab®、DigiFab®、Digibind®、ReoPro®及Cimzia®。在一些實施例中，該重組蛋白質可為(例如) TOB5-D4、LA13-IIE3、抗MUC1、SH363-A9、SH365-C9、非格司亭(filgrastim) (優保津(Neupogen))、吡非司亭(pegfilgrastim) (培非格司亭(Neulasta))、胰島素((例如，甘精胰島素(來得時(Lantus))、門冬胰島素、賴穀胰島素、賴脯胰島素(速效胰島素類似物)、地特胰島素(長效胰島素)、低精蛋白胰島素(中效胰島素))、胰島素樣生長因子1 (美卡舍明(Mecasermin))、胰島素樣生長因子I及其結合蛋白IGFBP-3 (甲凱西敏(Mecasermin rinfabate))、丹尼洛丁(denileukin diftitox)、內皮抑素(endostatin)、介白素-2 (阿地白介素(Aldesleukin))、介白素-1 (IL1)受體拮抗劑、介白素-11、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α-1b、干擾素β-1b、干擾素γ-1a、干擾素γ-1b、他索納明(tasonermin)、莫拉司亭(molgramostim)、那托司亭(nartograstim)、帕利夫明(palifermin)、沙格司亭(sargramostim)、鮭降鈣素(salmon calcitonin)、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素樣肽1 (利拉魯肽(Liraglutide))、細菌羧肽酶G2 (穀卡匹酶(Glucarpidase))、B型利鈉肽、OspA (來自伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)之外表面蛋白A片段)、帕利夫明(截形角質細胞(truncade keratinocyte)生長因子)、甲狀旁腺激素、生長激素、培維索孟(pegvisomant) (經修飾之GH；索馬維特(Somavert))、瑞替普酶(reteplase) (纖維蛋白溶酶原活化劑(plasminogen activator)；拉皮利斯(Rapilysi))、生長激素(somatropin) (他索納明；優猛茁(Humatrope))、他索納明(細胞介素)、尿酸氧化酶、特立帕肽(teriparatide) (甲狀旁腺激素)、白蛋白、B型肝炎表面抗原、B型肝炎表面抗原及經滅活A型肝炎病毒、水蛭素(hirudine)、HPV疫苗、HPV表面抗原、血小板衍生之生長因子-BB、拉布立酶(rasburicase)、沙格司亭、細胞色素(例如，P450酶)、干擾素、瘦素及溴珠單抗(brolucizumab)。

在一些實施例中，重組蛋白質可為選自以下之群之抗體或抗原結合抗體片段：阿昔單抗(abciximab)、阿比妥單抗(abituzumab)、艾布瑞茲基單抗(abrezekimab)、阿布裡單抗(abrilumab)、阿克托單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿替洛單抗(atidortoxumab)、阿杜那單抗(aducanumab)、阿法西單抗(afasevikumab)、阿來珠單抗(alacizumab pegol)、阿崙單抗(alemtuzumab)、阿利庫單抗(alirocumab)、阿莫昔單抗(amatuximab)、安達昔單抗(andecaliximab)、安妥單抗(anetumab ravtansine)、安弗露單抗(anifrolumab)、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、阿波珠單抗(apolizumab)、依普魯單抗(aprutumab ixadotin)、阿斯萬卡單抗(ascrinvacumab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、安妥明單抗(atinumab)、阿托木單抗(atorolimumab)、阿維魯單抗(avelumab)、阿秦珠單抗維多汀(azintuxizumab vedotin)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴厘昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、BCD-100、貝蘭他單抗馬福汀(belantamab mafodotin)、貝利木單抗(belimumab)、貝馬妥珠單抗(bemarituzumab)、貝那利珠單抗(benralizumab)、貝立莫單抗(berlimatoxumab)、貝美單抗(bermekimab)、伯沙利瑪(bersanlimab)、貝蒂單抗(bertilimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝佐洛單抗(bezlotoxumab)、比格魯單抗(bimagrumab)、比美珠單抗(bimekizumab)、比他米單抗(birtamimab)、比伐珠單抗美登素(bivatuzumab mertansine)、比勒斯單抗(bleselumab)、布羅鎖珠單抗(blosozumab)、博庫斯珠單抗(bococizumab)、布拉茲庫單抗(brazikumab)、維布妥昔單抗(brentuximab vedotin)、貝伐珠單抗(briakinumab)、布羅達單抗(brodalumab)、溴珠單抗、支舒巴單抗(brontictuzumab)、布羅沙單抗(burosumab)、卡比拉珠單抗(cabiralizumab)、卡米丹單抗(camidanlumab tesirine)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)、卡那津單抗(canakinumab)、莫坎妥珠單抗(cantuzumab mertansine)、拉坎妥珠單抗(cantuzumab ravtansine)、卡普賽珠單抗(caplacizumab)、卡倫單抗(carlumab)、卡羅圖西單抗(carotuximab)、cBR96、西米單抗(cemiplimab)、克果圖珠單抗(cergutuzumab amunaleukin)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、西曲利單抗(cetrelimab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西比沙他單抗(cibisatamab)、瑟吐珠單抗(cirmtuzumab)、泊西他珠單抗(citatuzumab bogatox)、西妥木單抗(cixutumumab)、克萊贊珠單抗(clazakizumab)、克立昔單抗(clenoliximab)、克立瓦妥珠單抗特他坦(clivatuzumab tetraxetan)、鈷妥珠單抗(codrituzumab)、科非珠單抗佩里多汀(cofetuzumab pelidotin)、考圖昔單抗拉夫坦辛(coltuximab ravtansine)、卡那妥單抗(conatumumab)、康珠單抗(concizumab)、考西福維克斯單抗(cosfroviximab)、克雷內治單抗(crenezumab)、克拉紮利單抗(crizanlizumab)、克洛特單抗(crotedumab)、CR6261、庫沙唑單抗(cusatuzumab)、大麯珠單抗(dacetuzumab)、大麗珠單抗(daclizumab)、達魯珠單抗(dalotuzumab)、達皮羅珠單抗(dapirolizumab pegol)、達雷木單抗(daratumumab)、德克特單抗(dectrekumab)、登西珠單抗(demcizumab)、地甯圖珠單抗(denintuzumab mafodotin)、地諾單抗(denosumab)、德帕昔單抗莫福汀(depatuxizumab mafodotin)、地洛昔單抗生物素(derlotuximab biotin)、地紮珠單抗(dezamizumab)、丁妥昔單抗(dinutuximab)、迪裡達夫單抗(diridavumab)、多馬唑單抗(domagrozumab)、多斯達利單抗(dostarlimab)、屈曲單抗(drozitumab)、DS-8201、杜利唑妥單抗(duligotuzumab)、杜普單抗(dupilumab)、杜伐單抗(durvalumab)、杜昔單抗(dusigitumab)、雙伏妥昔單抗(duvortuxizumab)、氯美昔單抗(ecromeximab)、依庫麗單抗(eculizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、埃芬單抗(efungumab)、依德魯單抗(eldelumab)、伊萊單抗(elezanumab)、埃吉姆單抗(elgemtumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、依瑪妥珠單抗(emactuzumab)、依帕伐單抗(emapalumab)、依米妥珠單抗(emibetuzumab)、埃米珠單抗(emicizumab)、依那妥單抗(enapotamab vedotin)、依那瓦圖珠單抗(enavatuzumab)、恩福單抗維多汀(enfortumab vedotin)、依諾布列祖單抗(enoblituzumab)、依諾曲單抗(enokizumab)、烯醇單抗(enoticumab)、美妥昔單抗(ensituximab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、伊替咪唑單抗(eptinezumab)、厄瑞奴單抗(erenumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、艾達珠單抗(etaracizumab)、依替利單抗(etigilimab)、依託珠單抗(etrolizumab)、依伐單抗(evinacumab)、伊伏洛單抗(evolocumab)、艾韋單抗(exbivirumab)、法利昔單抗(faricimab)、法魯珠單抗(farletuzumab)、法西寧單抗(fasinumamb)、非維珠單抗(felvizumab)、非紮奴單抗(fezakinumab)、菲巴圖單抗(fibatuzumab)、立妥珠單抗(ficlatuzumab)、菲圖單抗(figitumumab)、福裡木單抗(firivumab)、法蘭諾特單抗(flanvotumab)、弗利珠單抗(fletikumab)、氟妥珠單抗(flotetuzumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、福拉魯單抗(foralumab)、福拉維單抗(foravirumab)、弗雷曼單抗(fremanezumab)、弗雷索單抗(fresolimumab)、弗羅沃單抗(frovocimab)、富拉單抗(fulranumab)、氟妥昔單抗(futuximab)、伽奈珠單抗(galcanezumab)、加利昔單抗(galiximab)、甘妥單抗(gancotamab)、加尼他單抗(ganitumab)、甘特珠單抗(gantenerumab)、加替泊單抗(gatipotuzumab)、吉地單抗(gedivumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab ozogamicin)、格沃珠單抗(gevokizumab)、金西單抗(gimsilumab)、吉倫妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗維多汀(glembatumumab vedotin)、戈利木單抗(golimumab)、戈米昔單抗(gomiliximab)、革蘭單抗(gosuranemab)、古斯庫單抗(guselkumab)、伊那魯單抗(ianalumab)、伊巴珠單抗(ibalizumab)、IBI308、伊庫魯單抗(icrucumab)、伊達珠單抗(idarucizumab)、伊波妥組單抗(ifabotuzumab)、依拉妥珠單抗維多汀(iladatuzumab vedotin)、IMAB362、阿米單抗(imalumab)、伊馬普利單抗(imaprelimab)、伊格單抗(imgatuzumab)、因克拉單抗(inclacumab)、依坦希單抗(indatuximab ravtansine)、維因度單抗(indusatumab vedotin)、尼比珠單抗(inebilizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、英特侖單抗(intelumumab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊曲妥單抗(iratumumab)、伊沙妥昔單抗(isatuximab)、伊斯卡利單抗(iscalimab)、異妥拉明單抗(istiratumab)、阿托珠單抗(itolizumab)、依克珠單抗(ixekizumab)、凱利昔單抗(keliximab)、拉貝單抗(labetuzumab)、拉妥單抗(lacnotuzumab)、拉迪拉妥珠單抗(ladiratuzumab vedotin)、蘭帕單抗(lampalizumab)、拉那魯單抗(lanadelumab)、地格羅單抗(landogrozumab)、拉普妥單抗(laprituximab emtansine)、拉卡昔單抗(larcaviximab)、左旋單抗(lebrikizumab)、倫達珠單抗(lendalizumab)、蘭維單抗(lenvervimab)、侖齊魯單抗(lenzilumab)、來德單抗(lerdelimumab)、來龍利單抗(leronlimab)、來舒單抗(lesolimab)、來曲單抗(letolizumab)、萊卡單抗(lexatumumab)、利比韋單抗(libivirumab)、利法珠單抗凡酯(lifastuzumab vedotin)、利格珠單抗(ligelizumab)、龍妥昔單抗(loncastuximab tesirine)、氯舒妥珠單抗(losatuxizumab vedotin)、林妥珠單抗(lintuzumab)、利魯單抗(lirilumab)、羅地珠單抗(lodelcizumab)、洛伐妥單抗美登素(lorvotuzumab mertansine)、盧卡單抗(lucatumumab)、魯利珠單抗(lulizumab)、魯米單抗(lumiliximab)、魯妥珠單抗(lumretuzumab)、盧帕單抗阿馬多丁(lupartumab amadotin)、魯替珠單抗(lutikizumab)、馬他妥單抗(mapatumumab)、馬格妥昔單抗(margetuximab)、馬賽昔單抗(marstacimab)、馬司莫單抗(maslimomab)、莫夫單抗(mavrilimumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊珠單抗(mepolizumab)、美替木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、米立單抗(mirikizumab)、米維妥單抗(mirvetuximab soravtansine)、莫妥昔單抗(modotuximab)、莫加單抗(mogamulizumab)、莫那珠單抗(monalizumab)、莫羅木單抗(morolimumab)、莫司妥單抗(mosunetuzumab)、莫他珠單抗(motavizumab)、納米單抗(namilumab)、納他昔單抗(naratuximab emtansine)、納那他單抗(narnatumab)、那他珠單抗(natalizumab)、納維昔單抗(navicixizumab)、納維單抗(navivumab)、納西他單抗(naxitamab)、奈巴單抗(nebacumab)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)、奈莫珠單抗(nemolizumab)、NEOD001、奈斯單抗(nesvacumab)、尼塔奇單抗(netakimab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼西維單抗(nirsevimab)、尼武單抗(nivolumab)、奧比妥昔單抗(obiltoxaximab)、奧比妥珠單抗(obinutuzumab)、奧卡珠單抗(ocaratuzumab)、奧珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉他單抗(olaratumab)、奧勒魯單抗(oleclumab)、奧崙達珠單抗(olendalizumab)、奧洛珠單抗(olokizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、OMS721、恩妥珠單抗(onartuzumab)、恩妥珠單抗(onartuzumab)、恩妥昔單抗(ontuxizumab)、恩伐地單抗(onvatilimab)、奧匹奴單抗(opicinumab)、莫奧珠單抗(oportuzumab monatox)、奧曲單抗(orticumab)、奧替利珠單抗(otelixizumab)、奧替利單抗(otilimab)、奧曲妥珠單抗(otlertuzumab)、奧昔單抗(oxelumab)、奧紮尼單抗(ozanezumab)、奧紮珠單抗(ozoralizumab)、帕吉巴昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗(palivizumab)、派姆瑞福單抗(pmrevlumab)、帕尼單抗(panitumumab)、潘科瑪單抗(pankomab)、泛桿菌單抗(panobacumab)、帕妥珠單抗(parsatuzumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、帕妥昔單抗(pasotuxizumab)、派特珠單抗(pateclizumab)、派特木單抗(patritumab)、PDR001、派姆單抗(pembrolizumab)、培拉珠單抗(perakizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、派珠單抗(pexelizumab)、吡地唑單抗(pidilizumab)、平那珠單抗(pinatuzumab vedotin)、普拉庫單抗(placulumab)、普羅珠單抗(plozalizumab)、泊加珠單抗(pogalizumab)、泊洛妥珠單抗(polatuzumab vedotin)、龐尼澤單抗(ponezumab)、波維昔單抗(porgaviximab)、普拉西單抗(prasinezumab)、普利珠單抗(prezalizumab)、普利昔單抗(priliximab)、帕妥昔單抗(pritoxaximab)、普瑞單抗(pritumumab)、PRO 140、雷珠單抗(quilizumab)、雷德單抗(radretumab)、雷莫昔單抗(rafivirumab)、雷帕西單抗(ralpancizumab)、雷莫昔單抗(ramucirumab)、雷珠單抗、拉克昔布單抗(raxibacumab)、拉伐加利單抗(ravagalimab)、雷武珠單抗(ravulizumab)、瑞法珠單抗(refanezumab)、雷格魯馬單抗(regavirumab)、雷利單抗(relatlimab)、倫妥單抗(remtolumab)、瑞珠單抗(reslizumab)、利洛單抗(rilotumumab)、魯那珠單抗(rinucumab)、利桑基單抗(risankizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、利巴唑單抗(rivabazumab pegol)、羅巴單抗(robatumumab)、單克隆抗體(Rmab)、羅德單抗(roledumab)、羅米單抗(romikimab)、羅莫單抗(romosozumab)、羅那珠單抗(rontalizumab))、羅曼妥珠單抗(rosmantuzumab)、羅伐他珠單抗(rovalptuzumab tesirine)、羅維珠單抗(rovelizumab)、羅紮諾昔單抗(rozanolixizumab)、魯普利珠單抗(ruplizumab)、SA237、塞妥珠單抗(sacituzumab govitecan)、薩馬珠單抗(samalizumab)、塞莫羅他單抗維多汀(samrotamab vedotin)、沙利魯單抗(sarilumab)、沙特拉珠單抗(satralizumab)、蘇金單抗(secukinumab)、塞利克魯單抗(selicrelumab)、塞立單抗(seribantumab)、賽妥昔單抗(setoxaximab)、西妥昔單抗(setrusumab)、西維魯單抗(sevirumab)、西羅妥珠單抗(sibrotuzumab)、SGN-CD19A、SHP647、西法木單抗(sifalimumab)、西妥昔單抗(siltuximab)、辛妥珠單抗(simtuzumab)、西普利珠單抗(siplizumab)、西妥拉單抗(sirtratumab vedotin)、西魯單抗(sirukumab)、索非妥珠單抗(sofituzumab vedotin)、索拉珠單抗(solanezumab)、索能單抗(sonepcizumab)、松妥珠單抗(sontuzumab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab))、司他珠單抗(stamulumab)、舒他單抗(suptavumab)、舒敏單抗(sutimlimab)、蘇威單抗(suvizumab)、蘇拉單抗(suvratoxumab)、塔巴單抗(tabalumab)、他克珠單抗(tacatuzumab tetraxetan)、托珠單抗(tadocizumab)、他珠單抗(talizumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、他瑞妥單抗(tarextumab)、塔伏利單抗(tavolimab)、替非單抗(tefibazumab)、維汀特立妥珠單抗(telisotuzumab vedotin)、替奈昔單抗(teneliximab)、特普珠單抗(teplizumab)、替泊他單抗(tepoditamab)、特富單抗(teprotumumab)、特西多魯單抗(tesidolumab)、替妥洛明(tetulomab)、特西普魯單抗(tezepelumab)、TGN1412、替布珠單抗(tibulizumab)、替拉珠單抗(tildrakizumab)、替格單抗(tigatuzumab)、替莫妥珠單抗(timigutuzumab)、噻嗎單抗(timolumab)、替拉托單抗(tiragotumab)、替賽珠單抗(tiselizumab)、布替索單抗凡酯(tisotumab vedotin)、TNX-650、托珠單抗(tocilizumab)、曲妥昔單抗(tomuzotuximab)、托拉珠單抗(toralizumab)、托沙妥單抗(tosatoxumab)、托西單抗(tositumomab)、托維特單抗(tovetumab)、曲妥單抗(tralokinumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、TRBS07、曲格珠單抗(tregalizumab)、曲美單抗(tremelimumab)、曲戈盧單抗(trevogrumab)、塞莫白介素-2-妥考妥珠單抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韋單抗(tuvirumab)、烏利妥昔單抗(ublituximab)、烏洛魯單抗(ulocuplumab)、烏瑞魯單抗(urelumab)、烏索單抗(urtoxazumab)、烏斯替單抗(ustekinumab)、烏托米單抗(utomilumab)、瓦他妥昔單抗他利林(vadastuximab talirine)、瓦那利單抗(vanalimab)、凡多珠單抗(vandotuzumab vedotin)、萬替珠單抗(vantictumab)、萬古珠單抗(vanucizumab)、伐昔單抗(vapaliximab)、伐沙司單抗(varisacumab)、伐利單抗(varlilumab)、伐他珠單抗(vatelizumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維森單抗(vesencumab)、維西珠單抗(visilizumab)、伏巴厘珠單抗(vobarilizumab)、沃洛昔單抗(volociximab)、伏尼曲列珠單抗(vonterolizumab)、伏泊單抗(vopratelimab)、伏妥珠單抗(vorsetuzumab)、沃妥單抗(votumumab)、伏那珠單抗(vunakizumab)、新妥珠單抗(xentuzumab)、XMAB-5574、紮妥木單抗(zalutumumab)、紮諾莫單抗(zanolimumab)、紮妥昔單抗(zatuximab)、昔諾單抗(zenocutuzumab)、齊拉單抗(ziralimumab)及佐貝妥單抗(zolbetuximab)及此等抗體中之任何一者之抗原結合抗體片段。

在一些實施例中，重組蛋白質係結合至血管內皮生長因子(VEGF)之抗體或抗原結合抗體片段。在一些實施例中，該抗原結合抗體片段係雷珠單抗。

雷珠單抗係重組人類化IgG1 κ同型單株抗體片段。雷珠單抗結合至人類血管內皮生長因子A (VEGF-A)並抑制人類血管內皮生長因子A (VEGF-A)之生物活性。缺乏Fc區域之雷珠單抗具有約48千達爾頓之分子量。雷珠單抗結合至VEGF-A之活性形式之受體結合位點，包括此分子之生物活性、裂解形式，VEGF110。雷珠單抗對VEGF-A之結合阻止VEGF-A與內皮細胞之表面上之其受體(VEGFR1及VEGFR2)之相互作用、減少內皮細胞增殖、血管滲漏及新血管形成。雷珠單抗已描述於美國專利案6,407,213 (除衍生自鼠科抗體之序列之非人類CDR外，雷珠單抗包含在輕鏈(VL)中之位置4及46處及在重鏈(VH)中之位置49、69、71、73、76、78及94處之可變域中之框架取代)，及於US 7,060,269 (Y0317輕鏈SEQ ID NO: 1及重鏈SEQ ID NO: 2)中。

輕鏈(SEQ ID NO: 1) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV

重鏈(SEQ ID NO: 2) SGGGSGSGDFDYEKMANANKGAMTENADENALQSDAKGKLDSVATDYGAAIDGFIGDVSGLANGNGATGDFAGSNSQMAQVGDGDNSPLMNNFRQYLPSLPQSVECRPFVFSAGKPYEFSIDCDKINLFRGVFAFLLYVATFMYVFSTFANILRNKES

在一些實施例中，雷珠單抗包括SEQ ID NO: 3及4中之一者或兩者之胺基酸序列。

雷珠單抗之輕鏈(SEQ ID NO: 3) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

雷珠單抗之重鏈(SEQ ID NO: 4) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMETNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMETNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL

在一些實施例中，重組蛋白質具有不同於參考蛋白質之胺基酸序列。例如，該參考蛋白質係雷珠單抗且該重組蛋白質針對雷珠單抗之胺基酸中之一者或多者具有保守胺基酸取代。

在一些實施例中，重組蛋白質包括與SEQ ID NO: 3具有至少80% (例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%)一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該重組蛋白質包括與SEQ ID NO: 4具有至少80% (例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%)一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，重組蛋白質包括一或多(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)個胺基酸不同於SEQ ID NO: 3之胺基序列之序列。在一些實施例中，該重組蛋白質包括一或多(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)個胺基酸不同於SEQ ID NO: 4之胺基序列之序列。

例如，在重組蛋白質包括一或多個胺基酸不同於SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之序列之情況下，存在於SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4中之胺基酸可經類似胺基酸置換。例如，絲胺酸可經甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或脯胺酸中之任何一者置換；精胺酸可經天冬醯胺酸、離胺酸、麩醯胺酸或組胺酸置換；白胺酸可經苯丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸或甲硫胺酸置換；脯胺酸可經甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸或蘇胺酸置換；丙胺酸可經甘胺酸、蘇胺酸、脯胺酸或絲胺酸置換；纈胺酸可經甲硫胺酸、苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸置換；甘胺酸可經丙胺酸、蘇胺酸、脯胺酸或絲胺酸置換；異白胺酸可經苯丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸置換；苯丙胺酸可經色胺酸或酪胺酸置換；酪胺酸可經色胺酸或苯丙胺酸置換；半胱胺酸可經絲胺酸或蘇胺酸置換；組胺酸可經天冬醯胺酸、離胺酸、麩醯胺酸或精胺酸置換；麩醯胺酸可經麩胺酸、天冬醯胺酸或天冬胺酸置換；天冬醯胺酸可經麩胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸置換；離胺酸可經天冬醯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸或組胺酸置換；天冬胺酸可經麩胺酸、天冬醯胺酸或麩醯胺酸置換；麩胺酸可經天冬醯胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸置換；甲硫胺酸可經苯丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸或白胺酸置換；及色胺酸可經苯丙胺酸或酪胺酸置換。

在一些實例中，重組蛋白質之前體形式可包括信號序列。信號序列之非限制性實例包括： MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 5)； MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 6)； MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA (SEQ ID NO: 7)； MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA (SEQ ID NO: 8)； MKQSTAILALLPLLFTPVTKA (SEQ ID NO: 9)； MMKRNILAVIVPALLVAGTANA (SEQ ID NO: 10)； MKKSTLALVVMGIVASASVQA (SEQ ID NO: 11)； MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (SEQ ID NO: 12)； MKVKVLSLLVPALLVAGAANA (SEQ ID NO: 13)； MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 14)； MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (SEQ ID NO: 15)； MRAKLLGIVLTTPIAISSFA (SEQ ID NO: 16)； MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA (SEQ ID NO: 17)； MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (SEQ ID NO: 18)； MKVMRTTVATVVAATLSMSAFSVFA (SEQ ID NO: 19)；及 MKKSLVLKASVAVATLVPMLSFA (SEQ ID NO: 20)。

在一些實施例中，經分泌之重組蛋白質係回收並視需要純化自重組蛋白質生產培養基(例如，使用此項技術中已知的例示性方法中之任何一者)。

在一些實施例中，經分泌之重組蛋白質之至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%)係在重組蛋白質生產培養基中適當折疊或展開。

在一些實施例中，經分泌之重組蛋白質之小於約30% (例如，小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約8%、小於約6%、小於約4%、小於約2%或小於約1%)係未在重組蛋白質生產培養基中適當折疊或展開。

重組細菌在一些實施例中，重組細菌係包括編碼重組蛋白質(例如，本文描述或此項技術中已知的例示性重組蛋白質中之任何一者)之核酸之重組細菌(例如，革蘭氏陰性菌)。在本文描述之重組細菌中之任何一者之一些實施例中，該重組細菌可具有II型分泌機制(描述於(例如) von Tils等人，Front. Cell Infect. Microbiol. 2(160):1-11, 2012及Mergulhao等人，Biotechnol. Advances 23:177-202, 2005)中(繪示於圖2中)。

以本文描述之方法中之任何一者培養之細菌之非限制性實例包括：大腸桿菌菌株(例如，BL21大腸桿菌菌株、60E4大腸桿菌菌株、大腸桿菌JM109菌株、大腸桿菌MC4100菌株、大腸桿菌DH5α菌株、大腸桿菌KS476 (degP)菌株、大腸桿菌TX1菌株、大腸桿菌HB101菌株、大腸桿菌JM105菌株、大腸桿菌TOP10菌株、大腸桿菌TOP10 F'菌株、大腸桿菌60E4菌株、大腸桿菌RV308菌株、大腸桿菌BL21 (DE3)菌株、大腸桿菌HM114菌株、大腸桿菌TB1、大腸桿菌K12菌株、大腸桿菌AF1000菌株、大腸桿菌MC1061菌株、大腸桿菌CC118菌株、大腸桿菌RB791菌株、大腸桿菌CC202菌株、大腸桿菌SF110菌株、大腸桿菌TG1菌株、大腸桿菌HB2151菌株、大腸桿菌XL1-藍色MRF'菌株、大腸桿菌WCM105菌株或大腸桿菌C600-1菌株)、耶爾森氏菌菌株、不動桿菌菌株、波氏桿菌菌株、布魯氏菌菌株、藍藻細菌菌株、腸桿菌菌株、螺桿菌菌株、克雷伯菌菌株、奈瑟菌菌株、巴氏桿菌菌株、假單胞菌菌株(例如，銅綠假單胞菌、螢光假單胞菌)、沙門氏菌菌株、羅爾斯氏菌菌株(例如，真養羅爾斯氏菌)及志賀氏菌菌株。

在一些實施例中，重組細菌包括具有編碼重組蛋白質之至少一個(例如，至少兩個)序列之至少一個核酸。例如，重組細菌可包括編碼抗體輕鏈及抗體重鏈之核酸。在一些實例中，重組細菌可包括編碼輕鏈可變域及重鏈可變域之核酸。在一些實例中，重組細菌可包括編碼抗體輕鏈之第一核酸及編碼抗體重鏈之第二核酸。在一些實例中，重組細菌可包括編碼輕鏈可變域之第一核酸及編碼重鏈可變域之第二核酸。

在一些實施例中，重組蛋白質係免疫球蛋白。在又另一實施例中，免疫球蛋白係抗體之輕鏈、抗體之重鏈，或抗體之重鏈及輕鏈兩者。

在又另一實施例中，抗原結合抗體片段係雷珠單抗。在另一實施例中，重組細菌包括編碼SEQ ID NO: 3之至少一個核酸。在一些實例中，重組細菌包括編碼SEQ ID NO: 4之至少一個核酸。在一些實例中，重組細菌包括編碼SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4之一個核酸。在一些實例中，重組細菌包括編碼SEQ ID NO: 3之第一核酸及編碼SEQ ID NO: 4之第二核酸。

在一些實施例中，重組細菌表現在至少一個啟動子之控制下之核酸(例如，可操作地連接至至少一個啟動子)。啟動子之非限制性實例包括phoA 啟動子、lac 啟動子、tac 啟動子、phoA 啟動子、tetA 啟動子、ara BAD啟動子、T7啟動子、T7/lac 啟動子、lacUV5啟動子、lacUV5 啟動子、trc 啟動子或cspA 啟動子。可用於在重組細菌中表現核酸之額外啟動子係此項技術中已知的。

可用於表現本文描述之重組蛋白質中之任何一者之表現載體之非限制性實例包括pOPE101-XP、pTTO-1或pDNAbEng-1。可用於表現本文描述之重組蛋白質中之任何一者之表現載體之另一實例係顯示於圖1中。在此等表現載體之一些實例中，表現可包括複製之起源。複製之起源之非限制性實例包括pMB1、ColE1、pUC、p15A或pSC101。

在此等表現載體之一些實例中，表現載體可進一步包括可選擇之標記物，例如，抗生素抗性基因(例如，Amp、Cm、Tet或Kan抗性基因)。表現載體及複製之起源及可用於表現載體中之啟動子之額外實例係描述於美國專利案第5,595,898號、美國專利申請公開案第2012/0137162號、美國專利案第7,754,447號、美國重新發佈之專利案第44,512號、歐洲專利案第1664278號及美國專利案第9,267,164號(以引用之方式併入本文中)中。

液體培養基及重組蛋白質生產培養基液體培養基及重組蛋白質生產培養基包括一般適用於細菌生長之成分及營養素(例如，碳源(例如，葡萄糖、麩胺酸鹽、半乳糖、檸檬酸、甘油或其組合)及氮源(例如，酵母提取物、銨鹽、硝酸鹽))。在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基係使用抗生素(例如，四環素)及/或磷酸鹽(例如，無機磷酸鹽)補充。在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基包括無動物之組分。在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基包括胰化蛋白及/或N-Z胺A型。

在一些實施例中，培養基之pH係在約3.0至約8.0 (例如，約3.0至約7.5、約3.0至約7.0、約3.0至約6.5、約3.0至約6.0、約3.0至約5.5、約3.0至約5.0、約3.0至約4.5、約3.0至約4.0、約3.0至約3.5、約4.0至約7.5、約4.0至約7.0、約4.0至約6.5、約4.0至約6.0、約4.0至約5.5、約4.0至約5.0、約4.0至約4.5、約5.0至約7.5、約5.0至約7.0、約5.0至約6.5、約5.0至約6.0、約5.0至約5.5、約6.0至約7.5、約6.0至約7.0、約6.0至約6.5、約6.5至約7.5、約6.5至約7.0或約7.0至約7.5)之間。

在一些實施例中，培養基包括約1.0 mg/L至約100.0 mg/L (例如，約1.0 mg/L至約75 mg/L、約10 mg/L至約50 mg/L、約1.0 mg/L至約12.5 mg/L、約1.0 mg/L至約10.0 mg/L、約1.0 mg/L至約7.5 mg/L、約1.0 mg/L至約5.0 mg/L、約1.0 mg/L至約2.5 mg/L、約2.5 mg/L至約15.0 mg/L、約2.5 mg/L至約12.5 mg/L、約2.5 mg/L至約10.0 mg/L、約2.5 mg/L至約7.5 mg/L、約2.5 mg/L至約5.0 mg/L、約5.0 mg/L至約15.0 mg/L、約5.0 mg/L至約12.5 mg/L、約5.0 mg/L至約10.0 mg/L、約5.0 mg/L至約7.5 mg/L、約7.5 mg/mL至約15.0 mg/L、約7.5 mg/L至約12.5 mg/L、約7.5 mg/L至約10.0 mg/L、約10.0 mg/L至約15.0 mg/L、約10.0 mg/L至約12.5 mg/L、約12.5 mg/L至約15.0 mg/L、約25 mg/L至約75 mg/L、約40 mg/L至約60 mg/L或約45 mg/L至約55 mg/L)之抗生素(例如，羧苄青黴素、四環素)。在一些實施例中，該培養基包括約50 mg/L羧苄青黴素或約10 mg/L四環素。

在一些實施例中，培養基包括約0.07 g/L至約100 g/L、約0.1 g/L至約100.0 g/L、約0.1 g/L至約95 g/L、約0.1 g/L至約90 g/L、約0.1 g/L至約85 g/L、約0.1 g/L至約80 g/L、約0.1 g/L至約75 g/L、約0.1 g/L至約72 g/L、約0.1 g/L至約70 g/L、約0.1 g/L至約65 g/L、約0.1 g/L至約60 g/L、約0.1 g/L至約55 g/L、約0.1 g/L至約50 g/L、約0.1 g/L至約45 g/L、約0.1 g/L至約40 g/L、約0.1 g/L至約35 g/L、約0.1 g/L至約30 g/L、約0.1 g/L至約25 g/L、約0.1 g/L至約20 g/L、約0.1 g/L至約15 g/L、約0.1 g/L至約10 g/L、約0.1 g/L至約約0.1 g/L至約9.5 g/L、約0.1 g/L至約9.0 g/L、約0.1 g/L至約8.5 g/L、約0.1 g/L至約8.0 g/L、約0.1 g/L至約7.5 g/L、約0.1 g/L至約7.0 g/L、約0.1 g/L至約6.5 g/L、約0.1 g/L至約6.0 g/L、約0.1 g/L至約5.5 g/L、約0.1 g/L至約5.0 g/L、約0.1 g/L至約4.5 g/L、約0.1 g/L至約4.0 g/L、約0.1 g/L至約3.5 g/L、約0.1 g/L至約3.0 g/L、約0.1 g/L至約2.5 g/L、約0.1 g/L至約2.0 g/L、約0.1 g/L至約1.5 g/L、約0.1 g/L至約1.0 g/L、約0.1 g/L至約0.5 g/L、約0.2 g/L至約100.0 g/L、約0.2 g/L至約95 g/L、約0.2 g/L至約90 g/L、約0.2 g/L至約85 g/L、約0.2 g/L至約80 g/L、約0.2 g/L至約75 g/L、約0.2 g/L至約72 g/L、約0.2 g/L至約70 g/L、約0.2 g/L至約65 g/L、約0.2 g/L至約60 g/L、約0.2 g/L至約55 g/L、約0.2 g/L至約50 g/L、約0.2 g/L至約45 g/L、約0.2 g/L至約40 g/L、約0.2 g/L至約35 g/L、約0.2 g/L至約30 g/L、約0.2 g/L至約25 g/L、約0.2 g/L至約20 g/L、約0.2 g/L至約15 g/L、約0.2 g/L至約10.0 g/L、約0.2 g/L至約9.5 g/L、約0.2 g/L至約9.0 g/L、約0.2 g/L至約8.5 g/L、約0.2 g/L至約8.0 g/L、約0.2 g/L至約7.5 g/L、約0.2 g/L至約7.0 g/L、約0.2 g/L至約6.5 g/L、約0.2 g/L至約6.0 g/L、約0.2 g/L至約5.5 g/L、約0.2 g/L至約5.0 g/L、約0.2 g/L至約4.5 g/L、約0.2 g/L至約4.0 g/L、約0.2 g/L至約3.5 g/L、約0.2 g/L至約3.0 g/L、約0.2 g/L至約2.5 g/L、約0.2 g/L至約2.0 g/L、約0.2 g/L至約1.5 g/L、約0.2 g/L至約1.0 g/L、約0.2 g/L至約0.5 g/L、約0.5 g/L至約100.0 g/L、約0.5 g/L至約95 g/L、約0.5 g/L至約90 g/L、約0.5 g/L至約85 g/L、約0.5 g/L至約80 g/L、約0.5 g/L至約75 g/L、約0.5 g/L至約72 g/L、約0.5 g/L至約70 g/L、約0.5 g/L至約65 g/L、約0.5 g/L至約60 g/L、約0.5 g/L至約55 g/L、約0.5 g/L至約50 g/L、約0.5 g/L至約45 g/L、約0.5 g/L至約40 g/L、約0.5 g/L至約35 g/L、約0.5 g/L至約30 g/L、約0.5 g/L至約25 g/L、約0.5 g/L至約20 g/L、約0.5 g/L至約15 g/L、約0.5 g/L至約10.0 g/L、約0.5 g/L至約9.5 g/L、約0.5 g/L至約9.0 g/L、約0.5 g/L至約8.5 g/L、約0.5 g/L至約8.0 g/L、約0.5 g/L至約7.5 g/L、約0.5 g/L至約7.0 g/L、約0.5 g/L至約6.5 g/L、約0.5 g/L至約6.0 g/L、約0.5 g/L至約5.5 g/L、約0.5 g/L至約5.0 g/L、約0.5 g/L至約4.5 g/L、約0.5 g/L至約4.0 g/L、約0.5 g/L至約3.5 g/L、約0.5 g/L至約3.0 g/L、約0.5 g/L至約2.5 g/L、約0.5 g/L至約2.0 g/L、約0.5 g/L至約1.5 g/L、約0.5 g/L至約1.0 g/L、約1.0 g/L至約100.0 g/L、約1.0 g/L至約95 g/L、約1.0 g/L至約90 g/L、約1.0 g/L至約85 g/L、約1.0 g/L至約80 g/L、約1.0 g/L至約75 g/L、約1.0 g/L至約72 g/L、約1.0 g/L至約70 g/L、約1.0 g/L至約65 g/L、約1.0 g/L至約60 g/L、約1.0 g/L至約55 g/L、約1.0 g/L至約50 g/L、約1.0 g/L至約45 g/L、約1.0 g/L至約40 g/L、約1.0 g/L至約35 g/L、約1.0 g/L至約30 g/L、約1.0 g/L至約25 g/L、約1.0 g/L至約20 g/L、約1.0 g/L至約15 g/L、約1.0 g/L至約10.0 g/L、約1.0 g/L至約9.5 g/L、約1.0 g/L至約9.0 g/L、約1.0 g/L至約8.5 g/L、約1.0 g/L至約8.0 g/L、約1.0 g/L至約7.5 g/L、約1.0 g/L至約7.0 g/L、約1.0 g/L至約6.5 g/L、約1.0 g/L至約6.0 g/L、約1.0 g/L至約5.5 g/L、約1.0 g/L至約5.0 g/L、約1.0 g/L至約4.5 g/L、約1.0 g/L至約4.0 g/L、約1.0 g/L至約3.5 g/L、約1.0 g/L至約3.0 g/L、約1.0 g/L至約2.5 g/L、約1.0 g/L至約2.0 g/L、 a約1.0 g/L至約1.5 g/L、約2.0 g/L至約100.0 g/L、約2.0 g/L至約95 g/L、約2.0 g/L至約90 g/L、約2.0 g/L至約85 g/L、約2.0 g/L至約80 g/L、約2.0 g/L至約75 g/L、約2.0 g/L至約72 g/L、約2.0 g/L至約70 g/L、約2.0 g/L至約65 g/L、約2.0 g/L至約60 g/L、約2.0 g/L至約55 g/L、約2.0 g/L至約50 g/L、約2.0 g/L至約45 g/L、約2.0 g/L至約40 g/L、約2.0 g/L至約35 g/L、約2.0 g/L至約30 g/L、約2.0 g/L至約25 g/L、約2.0 g/L至約20 g/L、約2.0 g/L至約15 g/L、約2.0 g/L至約10.0 g/L、約2.0 g/L至約9.5 g/L、約2.0 g/L至約9.0 g/L、約2.0 g/L至約8.5 g/L、約2.0 g/L至約8.0 g/L、約2.0 g/L至約7.5 g/L、約2.0 g/L至約7.0 g/L、約2.0 g/L至約6.5 g/L、約2.0 g/L至約6.0 g/L、約2.0 g/L至約5.5 g/L、約2.0 g/L至約5.0 g/L、約2.0 g/L至約4.5 g/L、約2.0 g/L至約4.0 g/L、約2.0 g/L至約3.5 g/L、約2.0 g/L至約3.0 g/L、約2.0 g/L至約2.5 g/L、約3.0 g/L至約100.0 g/L、約3.0 g/L至約95 g/L、約3.0 g/L至約90 g/L、約3.0 g/L至約85 g/L、約3.0 g/L至約80 g/L、約3.0 g/L至約75 g/L、約3.0 g/L至約72 g/L、約3.0 g/L至約70 g/L、約3.0 g/L至約65 g/L、約3.0 g/L至約60 g/L、約3.0 g/L至約55 g/L、約3.0 g/L至約50 g/L、約3.0 g/L至約45 g/L、約3.0 g/L至約40 g/L、約3.0 g/L至約35 g/L、約3.0 g/L至約30 g/L、約3.0 g/L至約25 g/L、約3.0 g/L至約20 g/L、約3.0 g/L至約15 g/L、約3.0 g/L至約10.0 g/L、約3.0 g/L至約9.5 g/L、約3.0 g/L至約9.0 g/L、約3.0 g/L至約8.5 g/L、約3.0 g/L至約8.0 g/L、約3.0 g/L至約7.5 g/L、約3.0 g/L至約7.0 g/L、約3.0 g/L至約6.5 g/L、約3.0 g/L至約6.0 g/L、約3.0 g/L至約5.5 g/L、約3.0 g/L至約5.0 g/L、約3.0 g/L至約4.5 g/L、約3.0 g/L至約4.0 g/L、約3.0 g/L至約3.5 g/L、約4.0 g/L至約100.0 g/L、約4.0 g/L至約95 g/L、約4.0 g/L至約90 g/L、約4.0 g/L至約85 g/L、約4.0 g/L至約80 g/L、約4.0 g/L至約75 g/L、約4.0 g/L至約72 g/L、約4.0 g/L至約70 g/L、約4.0 g/L至約65 g/L、約4.0 g/L至約60 g/L、約4.0 g/L至約55 g/L、約4.0 g/L至約50 g/L、約4.0 g/L至約45 g/L、約4.0 g/L至約40 g/L、約4.0 g/L至約35 g/L、約4.0 g/L至約30 g/L、約4.0 g/L至約25 g/L、約4.0 g/L至約20 g/L、約4.0 g/L至約15 g/L、約4.0 g/L至約10.0 g/L、約4.0 g/L至約9.5 g/L、約4.0 g/L至約9.0 g/L、約4.0 g/L至約8.5 g/L、約4.0 g/L至約8.0 g/L、約4.0 g/L至約7.5 g/L、約4.0 g/L至約7.0 g/L、約4.0 g/L至約6.5 g/L、約4.0 g/L至約6.0 g/L、約4.0 g/L至約5.5 g/L、約4.0 g/L至約5.0 g/L、約4.0 g/L至約4.5 g/L、約5.0 g/L至約100.0 g/L、約5.0 g/L至約95 g/L、約5.0 g/L至約90 g/L、約5.0 g/L至約85 g/L、約5.0 g/L至約80 g/L、約5.0 g/L至約75 g/L、約5.0 g/L至約72 g/L、約5.0 g/L至約70 g/L、約5.0 g/L至約65 g/L、約5.0 g/L至約60 g/L、約5.0 g/L至約55 g/L、約5.0 g/L至約50 g/L、約5.0 g/L至約45 g/L、約5.0 g/L至約40 g/L、約5.0 g/L至約35 g/L、約5.0 g/L至約30 g/L、約5.0 g/L至約25 g/L、約5.0 g/L至約20 g/L、約5.0 g/L至約15 g/L、約5.0 g/L至約10.0 g/L、約5.0 g/L至約9.5 g/L、約5.0 g/L至約9.0 g/L、約5.0 g/L至約8.5 g/L、約5.0 g/L至約8.0 g/L、約5.0 g/L至約7.5 g/L、約5.0 g/L至約7.0 g/L、約5.0 g/L至約6.5 g/L、約5.0 g/L至約6.0 g/L、約5.0 g/L至約5.5 g/L、約6.0 g/L至約100.0 g/L、約6.0 g/L至約95 g/L、約6.0 g/L至約90 g/L、約6.0 g/L至約85 g/L、約6.0 g/L至約80 g/L、約6.0 g/L至約75 g/L、約6.0 g/L至約72 g/L、約6.0 g/L至約70 g/L、約6.0 g/L至約65 g/L、約6.0 g/L至約60 g/L、約6.0 g/L至約55 g/L、約6.0 g/L至約50 g/L、約6.0 g/L至約45 g/L、約6.0 g/L至約40 g/L、約6.0 g/L至約35 g/L、約6.0 g/L至約30 g/L、約6.0 g/L至約25 g/L、約6.0 g/L至約20 g/L、約6.0 g/L至約15 g/L、約6.0 g/L至約10.0 g/L、約6.0 g/L至約9.5 g/L、約6.0 g/L至約9.0 g/L、約6.0 g/L至約8.5 g/L、約6.0 g/L至約8.0 g/L、約6.0 g/L至約7.5 g/L、約6.0 g/L至約7.0 g/L、約6.0 g/L至約6.5 g/L、約7.0 g/L至約100.0 g/L、約7.0 g/L至約95 g/L、約7.0 g/L至約90 g/L、約7.0 g/L至約85 g/L、約7.0 g/L至約80 g/L、約7.0 g/L至約75 g/L、約7.0 g/L至約72 g/L、約7.0 g/L至約70 g/L、約7.0 g/L至約65 g/L、約7.0 g/L至約60 g/L、約7.0 g/L至約55 g/L、約7.0 g/L至約50 g/L、約7.0 g/L至約45 g/L、約7.0 g/L至約40 g/L、約7.0 g/L至約35 g/L、約7.0 g/L至約30 g/L、約7.0 g/L至約25 g/L、約7.0 g/L至約20 g/L、約7.0 g/L至約15 g/L、約7.0 g/L至約10.0 g/L、約7.0 g/L至約9.5 g/L、約7.0 g/L至約9.0 g/L、約7.0 g/L至約8.5 g/L、約7.0 g/L至約8.0 g/L、 a約7.0 g/L至約7.5 g/L、約8.0 g/L至約100.0 g/L、約8.0 g/L至約95 g/L、約8.0 g/L至約90 g/L、約8.0 g/L至約85 g/L、約8.0 g/L至約80 g/L、約8.0 g/L至約75 g/L、約8.0 g/L至約72 g/L、約8.0 g/L至約70 g/L、約8.0 g/L至約65 g/L、約8.0 g/L至約60 g/L、約8.0 g/L至約55 g/L、約8.0 g/L至約50 g/L、約8.0 g/L至約45 g/L、約8.0 g/L至約40 g/L、約8.0 g/L至約35 g/L、約8.0 g/L至約30 g/L、約8.0 g/L至約25 g/L、約8.0 g/L至約20 g/L、約8.0 g/L至約15 g/L、約8.0 g/L至約10.0 g/L、約8.0 g/L至約9.5 g/L、約8.0 g/L至約9.0 g/L、約8.0 g/L至約8.5 g/L、約9.0 g/L至約100.0 g/L、約9.0 g/L至約95 g/L、約9.0 g/L至約90 g/L、約9.0 g/L至約85 g/L、約9.0 g/L至約80 g/L、約9.0 g/L至約75 g/L、約9.0 g/L至約72 g/L、約9.0 g/L至約70 g/L、約9.0 g/L至約65 g/L、約9.0 g/L至約60 g/L、約9.0 g/L至約55 g/L、約9.0 g/L至約50 g/L、約9.0 g/L至約45 g/L、約9.0 g/L至約40 g/L、約9.0 g/L至約35 g/L、約9.0 g/L至約30 g/L、約9.0 g/L至約25 g/L、約9.0 g/L至約20 g/L、約9.0 g/L至約15 g/L、約9.0 g/L至約10.0 g/L、約9.0 g/L至約9.5 g/L、約9.5 g/L至約10.0 g/L、約10.0 g/L至約100.0 g/L、約10.0 g/L至約95 g/L、約10.0 g/L至約90 g/L、約10.0 g/L至約85 g/L、約10.0 g/L至約80 g/L、約10.0 g/L至約75 g/L、約10.0 g/L至約72 g/L、約10.0 g/L至約70 g/L、約10.0 g/L至約65 g/L、約10.0 g/L至約60 g/L、約10.0 g/L至約55 g/L、約10.0 g/L至約50 g/L、約10.0 g/L至約45 g/L、約10.0 g/L至約40 g/L、約10.0 g/L至約35 g/L、約10.0 g/L至約30 g/L、約10.0 g/L至約25 g/L、約10.0 g/L至約20 g/L、約10.0 g/L至約15 g/L、約15 g/L至約100.0 g/L、約15 g/L至約95 g/L、約15 g/L至約90 g/L、約15 g/L至約85 g/L、約15 g/L至約80 g/L、約15 g/L至約75 g/L、約15 g/L至約72 g/L、約15 g/L至約70 g/L、約15 g/L至約65 g/L、約15 g/L至約60 g/L、約15 g/L至約55 g/L、約15 g/L至約50 g/L、約15 g/L至約45 g/L、約15 g/L至約40 g/L、約15 g/L至約35 g/L、約15 g/L至約30 g/L、約15 g/L至約25 g/L、約15 g/L至約20 g/L、約20 g/L至約100.0 g/L、約20 g/L至約95 g/L、約20 g/L至約90 g/L、約20 g/L至約85 g/L、約20 g/L至約80 g/L、約20 g/L至約75 g/L、約20 g/L至約72 g/L、約20 g/L至約70 g/L、約20 g/L至約65 g/L、約20 g/L至約60 g/L、約20 g/L至約55 g/L、約20 g/L至約50 g/L、約20 g/L至約45 g/L、約20 g/L至約40 g/L、約20 g/L至約35 g/L、約20 g/L至約30 g/L、約20 g/L至約25 g/L、約25 g/L至約100.0 g/L、約25 g/L至約95 g/L、約25 g/L至約90 g/L、約25 g/L至約85 g/L、約25 g/L至約80 g/L、約25 g/L至約75 g/L、約25 g/L至約72 g/L、約25 g/L至約70 g/L、約25 g/L至約65 g/L、約25 g/L至約60 g/L、約25 g/L至約55 g/L、約25 g/L至約50 g/L、約25 g/L至約45 g/L、約25 g/L至約40 g/L、約25 g/L至約35 g/L、約25 g/L至約30 g/L、約30 g/L至約100.0 g/L、約30 g/L至約95 g/L、約30 g/L至約90 g/L、約30 g/L至約85 g/L、約30 g/L至約80 g/L、約30 g/L至約75 g/L、約30 g/L至約72 g/L、約30 g/L至約70 g/L、約30 g/L至約65 g/L、約30 g/L至約60 g/L、約30 g/L至約55 g/L、約30 g/L至約50 g/L、約30 g/L至約45 g/L、約30 g/L至約40 g/L、約30 g/L至約35 g/L、約35 g/L至約100.0 g/L、約35 g/L至約95 g/L、約35 g/L至約90 g/L、約35 g/L至約85 g/L、約35 g/L至約80 g/L、約35 g/L至約75 g/L、約35 g/L至約72 g/L、約35 g/L至約70 g/L、約35 g/L至約65 g/L、約35 g/L至約60 g/L、約35 g/L至約55 g/L、約35 g/L至約50 g/L、約35 g/L至約45 g/L、約35 g/L至約40 g/L、約40 g/L至約100.0 g/L、約40 g/L至約95 g/L、約40 g/L至約90 g/L、約40 g/L至約85 g/L、約40 g/L至約80 g/L、約40 g/L至約75 g/L、約40 g/L至約72 g/L、約40 g/L至約70 g/L、約40 g/L至約65 g/L、約40 g/L至約60 g/L、約40 g/L至約55 g/L、約40 g/L至約50 g/L、約40 g/L至約45 g/L、約45 g/L至約100.0 g/L、約45 g/L至約95 g/L、約45 g/L至約90 g/L、約45 g/L至約85 g/L、約45 g/L至約80 g/L、約45 g/L至約75 g/L、約45 g/L至約72 g/L、約45 g/L至約70 g/L、約45 g/L至約65 g/L、約45 g/L至約60 g/L、約45 g/L至約55 g/L、約45 g/L至約50 g/L、約50 g/L至約100.0 g/L、約50 g/L至約95 g/L、約50 g/L至約90 g/L、約50 g/L至約85 g/L、約50 g/L至約80 g/L、約50 g/L至約75 g/L、約50 g/L至約72 g/L、約50 g/L至約70 g/L、約50 g/L至約65 g/L、約50 g/L至約60 g/L、約50 g/L至約55 g/L、約55 g/L至約100.0 g/L、約55 g/L至約95 g/L、約55 g/L至約90 g/L、約55 g/L至約85 g/L、約55 g/L至約80 g/L、約55 g/L至約75 g/L、約55 g/L至約72 g/L、約55 g/L至約70 g/L、約55 g/L至約65 g/L、約55 g/L至約60 g/L、約60 g/L至約100.0 g/L、約60 g/L至約95 g/L、約60 g/L至約90 g/L、約60 g/L至約85 g/L、約60 g/L至約80 g/L、約60 g/L至約75 g/L、約60 g/L至約72 g/L、約60 g/L至約70 g/L、約60 g/L至約65 g/L、約65 g/L至約100.0 g/L、約65 g/L至約95 g/L、約65 g/L至約90 g/L、約65 g/L至約85 g/L、約65 g/L至約80 g/L、約65 g/L至約75 g/L、約65 g/L至約72 g/L、約65 g/L至約70 g/L、約70 g/L至約100.0 g/L、約70 g/L至約95 g/L、約70 g/L至約90 g/L、約70 g/L至約85 g/L、約70 g/L至約80 g/L、約70 g/L至約75 g/L、約75 g/L至約100.0 g/L、約75 g/L至約95 g/L、約75 g/L至約90 g/L、約75 g/L至約85 g/L、約75 g/L至約80 g/L、約80 g/L至約100.0 g/L、約80 g/L至約95 g/L、約80 g/L至約90 g/L、約80 g/L至約85 g/L、約85 g/L至約100.0 g/L、約85 g/L至約95 g/L、約85 g/L至約90 g/L、約90 g/L至約100.0 g/L、約90 g/L至約95 g/L或約95 g/L至約100 g/L鎂鹽(例如，MgSO₄ ●7H₂ O或本文描述或此項技術中已知的其他鎂鹽中之任何一者)。

在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質培養基包括約0.1 mM至約300 mM、約0.1 mM至約275 mM、約0.1 mM至約250 mM、約0.1 mM至約225 mM、約0.1 mM至約200 mM、約0.1 mM至約175 mM、約0.1 mM至約150 mM、約0.1 mM至約125 mM、約0.1 mM至約100 mM、約0.1 mM至約75 mM、約0.1 mM至約50 mM、約0.1 mM至約41 mM、約0.1 mM至約40 mM、約0.1 mM至約35 mM、約0.1 mM至約30 mM、約0.1 mM至約25 mM、約0.1 mM至約20 mM、約0.1 mM至約10 mM、約0.1 mM至約5 mM、約0.1 mM至約2 mM、約0.1 mM至約1.0 mM、約0.1 mM至約0.5 mM、約0.2 mM至約300 mM、約0.2 mM至約275 mM、約0.2 mM至約250 mM、約0.2 mM至約225 mM、約0.2 mM至約200 mM、約0.2 mM至約175 mM、約0.2 mM至約150 mM、約0.2 mM至約125 mM、約0.2 mM至約100 mM、約0.2 mM至約75 mM、約0.2 mM至約50 mM、約0.2 mM至約41 mM、約0.2 mM至約40 mM、約0.2 mM至約35 mM、約0.2 mM至約30 mM、約0.2 mM至約25 mM、約0.2 mM至約20 mM、約0.2 mM至約10 mM、約0.2 mM至約5 mM、約0.2 mM至約2 mM、約0.2 mM至約1.0 mM、約0.2 mM至約0.5 mM、約0.5 mM至約300 mM、約0.5 mM至約275 mM、約0.5 mM至約250 mM、約0.5 mM至約225 mM、約0.5 mM至約200 mM、約0.5 mM至約175 mM、約0.5 mM至約150 mM、約0.5 mM至約125 mM、約0.5 mM至約100 mM、約0.5 mM至約75 mM、約0.5 mM至約50 mM、約0.5 mM至約41 mM、約0.5 mM至約40 mM、約0.5 mM至約35 mM、約0.5 mM至約30 mM、約0.5 mM至約25 mM、約0.5 mM至約20 mM、約0.5 mM至約10 mM、約0.5 mM至約5 mM、約0.5 mM至約2 mM、約0.5 mM至約1.0 mM、約1.0 mM至約300 mM、約1.0 mM至約275 mM、約1.0 mM至約250 mM、約1.0 mM至約225 mM、約1.0 mM至約200 mM、約1.0 mM至約175 mM、約1.0 mM至約150 mM、約1.0 mM至約125 mM、約1.0 mM至約100 mM、約1.0 mM至約75 mM、約1.0 mM至約50 mM、約1.0 mM至約41 mM、約1.0 mM至約40 mM、約1.0 mM至約35 mM、約1.0 mM至約30 mM、約1.0 mM至約25 mM、約1.0 mM至約20 mM、約1.0 mM至約10 mM、約1.0 mM至約5 mM、約1.0 mM至約2 mM、約2 mM至約41 mM、約2 mM至約300 mM、約2 mM至約275 mM、約2 mM至約250 mM、約2 mM至約225 mM、約2 mM至約200 mM、約2 mM至約175 mM、約2 mM至約150 mM、約2 mM至約125 mM、約2 mM至約100 mM、約2 mM至約75 mM、約2 mM至約50 mM、約2 mM至約41 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約35 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約25 mM、約2 mM至約20 mM、約2 mM至約10 mM、約2 mM至約5 mM、約5 mM至約300 mM、約5 mM至約275 mM、約5 mM至約250 mM、約5 mM至約225 mM、約5 mM至約200 mM、約5 mM至約175 mM、約5 mM至約150 mM、約5 mM至約125 mM、約5 mM至約100 mM、約5 mM至約75 mM、約5 mM至約50 mM、約5 mM至約41 mM、約5 mM至約40 mM、約5 mM至約35 mM、約5 mM至約30 mM、約5 mM至約25 mM、約5 mM至約20 mM、約5 mM至約10 mM、約10 mM至約300 mM、約10 mM至約275 mM、約10 mM至約250 mM、約10 mM至約225 mM、約10 mM至約200 mM、約10 mM至約175 mM、約10 mM至約150 mM、約10 mM至約125 mM、約10 mM至約100 mM、約10 mM至約75 mM、約10 mM至約50 mM、約10 mM至約41 mM、約10 mM至約40 mM、約10 mM至約35 mM、約10 mM至約30 mM、約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約20 mM至約300 mM、約20 mM至約275 mM、約20 mM至約250 mM、約20 mM至約225 mM、約20 mM至約200 mM、約20 mM至約175 mM、約20 mM至約150 mM、約20 mM至約125 mM、約20 mM至約100 mM、約20 mM至約75 mM、約20 mM至約50 mM、約20 mM至約41 mM、約20 mM至約40 mM、約20 mM至約35 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、約25 mM至約300 mM、約25 mM至約275 mM、約25 mM至約250 mM、約25 mM至約225 mM、約25 mM至約200 mM、約25 mM至約175 mM、約25 mM至約150 mM、約25 mM至約125 mM、約25 mM至約100 mM、約25 mM至約75 mM、約25 mM至約50 mM、約25 mM至約41 mM、約25 mM至約40 mM、約25 mM至約35 mM、約25 mM至約30 mM、約30 mM至約300 mM、約30 mM至約275 mM、約30 mM至約250 mM、約30 mM至約225 mM、約30 mM至約200 mM、約30 mM至約175 mM、約30 mM至約150 mM、約30 mM至約125 mM、約30 mM至約100 mM、約30 mM至約75 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約41 mM、約30 mM至約40 mM、約30 mM至約35 mM、約35 mM至約300 mM、約35 mM至約275 mM、約35 mM至約250 mM、約35 mM至約225 mM、約35 mM至約200 mM、約35 mM至約175 mM、約35 mM至約150 mM、約35 mM至約125 mM、約35 mM至約100 mM、約35 mM至約75 mM、約35 mM至約50 mM、約35 mM至約41 mM、約35 mM至約40 mM、約40 mM至約300 mM、約40 mM至約275 mM、約40 mM至約250 mM、約40 mM至約225 mM、約40 mM至約200 mM、約40 mM至約175 mM、約40 mM至約150 mM、約40 mM至約125 mM、約40 mM至約100 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約50 mM、約50 mM至約300 mM、約50 mM至約275 mM、約50 mM至約250 mM、約50 mM至約225 mM、約50 mM至約200 mM、約50 mM至約175 mM、約50 mM至約150 mM、約50 mM至約125 mM、約50 mM至約100 mM、約50 mM至約75 mM、約75 mM至約300 mM、約75 mM至約275 mM、約75 mM至約250 mM、約75 mM至約225 mM、約75 mM至約200 mM、約75 mM至約175 mM、約75 mM至約150 mM、約75 mM至約125 mM、約75 mM至約100 mM、約100 mM至約300 mM、約100 mM至約275 mM、約100 mM至約250 mM、約100 mM至約225 mM、約100 mM至約200 mM、約100 mM至約175 mM、約100 mM至約150 mM、約100 mM至約125 mM、約125 mM至約300 mM、約125 mM至約275 mM、約125 mM至約250 mM、約125 mM至約225 mM、約125 mM至約200 mM、約125 mM至約175 mM、約125 mM至約150 mM、約150 mM至約300 mM、約150 mM至約275 mM、約150 mM至約250 mM、約150 mM至約225 mM、約150 mM至約200 mM、約150 mM至約175 mM、約175 mM至約300 mM、約175 mM至約275 mM、約175 mM至約250 mM、約175 mM至約225 mM、約175 mM至約200 mM、約200 mM至約300 mM、約200 mM至約275 mM、約200 mM至約250 mM、約200 mM至約225 mM、約225 mM至約300 mM、約225 mM至約275 mM、約225 mM至約250 mM、約250 mM至約300 mM、約250 mM至約275 mM或約275 mM至約300 mM鎂離子(例如，Mg²⁺ )。

在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基包括約1 g/L至約25 g/L磷酸鹽(例如，無機磷酸鹽)。在其他實施例中，該等培養基包括約2 g/L至約15 g/L、約3 g/L至約8 g/L、約5 g/L至約20 g/L、約5 g/L至約15 g/L、約5 g/L至約10 g/L、約10 g/L至約25 g/L、約10 g/L至約20 g/L、約10 g/L至約15 g/L、約15 g/L至約25 g/L或約15 g/L至約20 g/L磷酸鹽(例如，無機磷酸鹽)。

在一些實施例中，液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基包括約1 g/L至約25 g/L磷酸鹽。在其他實施例中，該等培養基包括約2 g/L至約15 g/L、約4 g/L至約12 g/L、約4 g/L至約10 g/L、約4 g/L至約9 g/L、約5 g/L至約20 g/L、約5 g/L至約15 g/L、約5 g/L至約10 g/L、約10 g/L至約25 g/L、約10 g/L至約20 g/L、約10 g/L至約15 g/L、約15 g/L至約25 g/L或約15 g/L至約20 g/L磷酸鹽(例如，K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ )。

在一些實例中，培養開始時之液體培養基之體積係約50 mL至約1000 L、約50 mL至約750 L、約50 mL至約550 L、約50 mL至約500 L、約50 mL至約250 L、約50 mL至約200 L、約50 mL至約100 L、約50 mL至約90 L、約50 mL至約80 L、約50 mL至約70 L、約50 mL至約60 L、約50 mL至約50 L、約50 mL至約40 L、約50 mL至約30 L、約50 mL至約20 L、約50 mL至約10 L、約50 mL至約5 L、約50 mL至約1 L、約50 mL至約750 mL、約50 mL至約500 mL、約50 mL至約250 mL、約50 mL至約100 mL、約100 mL至約100 L、約100 mL至約90 L、約100 mL至約80 L、約100 mL至約70 L、約100 mL至約60 L、約100 mL至約50 L、約100 mL至約40 L、約100 mL至約30 L、約100 mL至約20 L、約100 mL至約10 L、約100 mL至約5 L、約100 mL至約1 L、約100 mL至約750 mL、約100 mL至約500 mL、約100 mL至約250 mL、約250 mL至約100 L、約250 mL至約90 L、約250 mL至約80 L、約250 mL至約70 L、約250 mL至約60 L、約250 mL至約50 L、約250 mL至約40 L、約250 mL至約30 L、約250 mL至約20 L、約250 mL至約10 L、約250 mL至約5 L、約250 mL至約1 L、約250 mL至約750 mL、約250 mL至約500 mL、約500 mL至約100 L、約500 mL至約90 L、約500 mL至約80 L、約500 mL至約70 L、約500 mL至約60 L、約500 mL至約50 L、約500 mL至約40 L、約500 mL至約30 L、約500 mL至約20 L、約500 mL至約10 L、約500 mL至約5 L、約500 mL至約1 L、約500 mL至約750 mL、約750 mL至約100 L、約750 mL至約90 L、約750 mL至約80 L、約750 mL至約70 L、約750 mL至約60 L、約750 mL至約50 L、約750 mL至約40 L、約750 mL至約30 L、約750 mL至約20 L、約750 mL至約10 L、約750 mL至約5 L、約750 mL至約1 L、約1 L至約100 L、約1 L至約90 L、約1 L至約80 L、約1 L至約70 L、約1 L至約60 L、約1 L至約50 L、約1 L至約40 L、約1 L至約30 L、約1 L至約20 L、約1 L至約10 L、約1 L至約5 L、約5 L至約100 L、約5 L至約90 L、約5 L至約80 L、約5 L至約70 L、約5 L至約60 L、約5 L至約50 L、約5 L至約40 L、約5 L至約30 L、約5 L至約20 L、約5 L至約10 L、約10 L至約100 L、約10 L至約90 L、約10 L至約80 L、約10 L至約70 L、約10 L至約60 L、約10 L至約50 L、約10 L至約40 L、約10 L至約30 L、約10 L至約20 L、約20 L至約100 L、約20 L至約90 L、約20 L至約80 L、約20 L至約70 L、約20 L至約60 L、約20 L至約50 L、約20 L至約40 L、約20 L至約30 L、約30 L至約100 L、約30 L至約90 L、約30 L至約80 L、約30 L至約70 L、約30 L至約60 L、約30 L至約50 L、約30 L至約40 L、約40 L至約100 L、約40 L至約90 L、約40 L至約80 L、約40 L至約70 L、約40 L至約60 L、約40 L至約50 L、約50 L至約100 L、約50 L至約90 L、約50 L至約80 L、約50 L至約70 L、約50 L至約60 L、約60 L至約100 L、約60 L至約90 L、約60 L至約80 L、約60 L至約70 L、約70 L至約100 L、約70 L至約90 L、約70 L至約80 L、約80 L至約100 L、約80 L至約90 L或約90 L至約100 L)。

細胞培養細胞培養包括在液體培養基中在一組受控條件下培養重組細菌(例如，本文描述之重組細菌中之任何一者)。在一些實施例中，細胞培養包括增殖階段(即，細胞質量積聚及快速之細胞生長)及生產階段(即，重組蛋白質生產階段)。在一些態樣中，一經消耗細胞培養基之組分(例如，消耗磷酸鹽)，即開始該生產階段。

在一些實施例中，增殖階段及生產階段依序發生。在一些實施例中，該增殖階段及該生產階段在相同容器中發生(例如，大體上同時)。在其他實施例中，該增殖階段及該生產階段在不同容器中發生。在一些實施例中，超過一個增殖階段或生產階段可在生產運行中發生。例如，第一增殖階段可在小容器(例如，搖瓶)中發生及將所得細胞培養物轉移至較大容器(例如，生物反應器或發酵罐)，其中在生產階段開始前，另一增殖階段在相同之較大容器中發生。

在一些實施例中，增殖階段導致具有在600 nm下約1至約200、約1至約180、約1至約160、約1至約140、約1至約120、約1至約100、約1至約80、約1至約60、約1至約40、約1至約20、約1至約10、約10至約200、約10至約180、約10至約160、約10至約140、約10至約120、約10至約100、約10至約80、約10至約60、約10至約40、約10至約20、約20至約200、約20至約180、約20至約160、約20至約140、約20至約120、約20至約100、約20至約80、約20至約60、約20至約40、約40至約200、約40至約180、約40至約160、約40至約140、約40至約120、約40至約100、約40至約80、約40至約60、約60至約200、約60至約180、約60至約160、約60至約140、約60至約120、約60至約100、約60至約80、約80至約200、約80至約180、約80至約160、約80至約140、約80至約120、約80至約100、約100至約200、約100至約180、約100至約160、約100至約140、約100至約120、約120至約200、約120至約180、約120至約160、約120至約140、約140至約200、約140至約180、約140至約160、約160至約200、約160至約180或約180至約200之光學密度(OD)之培養物。

在一些實施例中，增殖階段導致包括約10⁶ 至約10¹⁰ 個菌落形成單位(CFU)/mL之培養物。

在一些實施例中，生產階段導致包括約100 mg/L至約300 mg/L、約100 mg/L至約280 mg/L、約100 mg/L至約260 mg/L、約100 mg/L至約240 mg/L、約100 mg/L至約220 mg/L、約100 mg/L至約200 mg/L、約100 mg/L至約180 mg/L、約100 mg/L至約160 mg/L、約100 mg/L至約140 mg/L、約100 mg/L至約120 mg/L、約120 mg/L至約300 mg/L、約120 mg/L至約280 mg/L、約120 mg/L至約260 mg/L、約120 mg/L至約240 mg/L、約120 mg/L至約220 mg/L、約120 mg/L至約200 mg/L、約120 mg/L至約180 mg/L、約120 mg/L至約160 mg/L、約120 mg/L至約140 mg/L、約140 mg/L至約300 mg/L、約140 mg/L至約280 mg/L、約140 mg/L至約260 mg/L、約140 mg/L至約240 mg/L、約140 mg/L至約220 mg/L、約140 mg/L至約200 mg/L、約140 mg/L至約180 mg/L、約140 mg/L至約160 mg/L、約160 mg/L至約300 mg/L、約160 mg/L至約280 mg/L、約160 mg/L至約260 mg/L、約160 mg/L至約240 mg/L、約160 mg/L至約220 mg/L、約160 mg/L至約200 mg/L、約160 mg/L至約180 mg/L、約180 mg/L至約300 mg/L、約180 mg/L至約280 mg/L、約180 mg/L至約260 mg/L、約180 mg/L至約240 mg/L、約180 mg/L至約220 mg/L、約180 mg/L至約200 mg/L、約200 mg/L至約300 mg/L、約200 mg/L至約280 mg/L、約200 mg/L至約260 mg/L、約200 mg/L至約240 mg/L、約200 mg/L至約220 mg/L、約220 mg/L至約300 mg/L、約220 mg/L至約280 mg/L、約220 mg/L至約260 mg/L、約220 mg/L至約240 mg/L、約240 mg/L至約300 mg/L、約240 mg/L至約280 mg/L、約240 mg/L至約260 mg/L、約260 mg/L至約300 mg/L、約260 mg/L至約280 mg/L或約280 mg/L至約300 mg/L重組蛋白質之重組蛋白質生產培養基。

在一些實施例中，培養係進料批次培養。在一些實施例中，該進料批次培養包括向重組蛋白質生產培養基連續或定期添加進料液體培養基。在一些實施例中，該進料批次培養包括向該重組蛋白質生產培養基連續添加一定體積之進料液體培養基。在一些實施例中，該進料批次培養包括向該重組蛋白質生產培養基定期添加一定體積之進料液體培養基。在一非限制性實例中，向該重組蛋白質生產培養基定期添加進料液體培養基包括每6、12或24小時一次添加一定體積之進料液體培養基。

在一些實施例中，培養係使用搖瓶進行。在一些實施例中，該培養係使用生物反應器或發酵罐進行。在一些實施例中，該培養係使用進料批次生物反應器或發酵罐進行。

在一些實施例中，培養結束時之重組蛋白質生產培養基之體積係約50 mL至約500 L、約50 mL至約450 L、約50 mL至約400 L、約50 mL至約350 L、約50 mL至約300 L、約50 mL至約250 L、約50 mL至約200 L、約50 mL至約150 L、約50 mL至約100 L、約50 mL至約50 L、約50 mL至約10 L、約50 mL至約5 L、約50 mL至約1 L、約50 mL至約500 mL、約50 mL至約250 mL、約250 mL至約500 L、約250 mL至約450 L、約250 mL至約400 L、約250 mL至約350 L、約250 mL至約300 L、約250 mL至約250 L、約250 mL至約200 L、約250 mL至約150 L、約250 mL至約100 L、約250 mL至約50 L、約250 mL至約10 L、約250 mL至約5 L、約250 mL至約1 L、約250 mL至約500 mL、約500 mL至約500 L、約500 mL至約450 L、約500 mL至約400 L、約500 mL至約350 L、約500 mL至約300 L、約500 mL至約250 L、約500 mL至約200 L、約500 mL至約150 L、約500 mL至約100 L、約500 mL至約50 L、約500 mL至約10 L、約500 mL至約5 L、約500 mL至約1 L、約1 L至約500 L、約1 L至約450 L、約1 L至約400 L、約1 L至約350 L、約1 L至約300 L、約1 L至約250 L、約1 L至約200 L、約1 L至約150 L、約1 L至約100 L、約1 L至約50 L、約1 L至約10 L、約1 L至約5 L、約5 L至約500 L、約5 L至約450 L、約5 L至約400 L、約5 L至約350 L、約5 L至約300 L、約5 L至約250 L、約5 L至約200 L、約5 L至約150 L、約5 L至約100 L、約5 L至約50 L、約5 L至約10 L、約10 L至約500 L、約10 L至約450 L、約10 L至約400 L、約10 L至約350 L、約10 L至約300 L、約10 L至約250 L、約10 L至約200 L、約10 L至約150 L、約10 L至約100 L、約10 L至約50 L、約50 L至約500 L、約50 L至約450 L、約50 L至約400 L、約50 L至約350 L、約50 L至約300 L、約50 L至約250 L、約50 L至約200 L、約50 L至約150 L、約50 L至約100 L、約100 L至約500 L、約100 L至約450 L、約100 L至約400 L、約100 L至約350 L、約100 L至約300 L、約100 L至約250 L、約100 L至約200 L、約100 L至約150 L、約150 L至約500 L、約150 L至約450 L、約150 L至約400 L、約150 L至約350 L、約150 L至約300 L、約150 L至約250 L、約150 L至約200 L、約200 L至約500 L、約200 L至約450 L、約200 L至約400 L、約200 L至約350 L、約200 L至約300 L、約200 L至約250 L、約250 L至約500 L、約250 L至約450 L、約250 L至約400 L、約250 L至約350 L、約250 L至約300 L、約300 L至約500 L、約300 L至約450 L、約300 L至約400 L、約300 L至約350 L、約350 L至約500 L、約350 L至約450 L、約350 L至約400 L、約400 L至約500 L、約400 L至約450 L或約450至約500 L。

在一些實施例中，培養可包括在一段時間內變換重組蛋白質生產培養基之溫度。在一些實施例中，變換後之重組蛋白質生產培養基之溫度係約28℃至約35℃ (例如，約32℃至約35℃)。在一些實施例中，溫度之變換係在培養開始後約1天至約7天(例如，培養開始後約4天至約7天或培養開始後約5天至約7天)進行。

在一些實施例中，培養包括在重組蛋白質生產培養基中維持約5%至約60% (例如，約20%至約50%)之溶解O₂ (dO₂ )濃度。在一些實施例中，該培養包括在該重組蛋白質生產培養基中維持大於約30%之溶解O₂ (dO₂ )濃度。在一些實施例中，該培養包括在該重組蛋白質生產培養基中維持約30%至約55%之溶解O₂ (dO₂ )濃度。

在一些實施例中，培養包括攪拌重組蛋白質生產培養基。在一些實施例中，該攪拌係在每分鐘約100轉(RPM)至約800 RPM之旋轉攪拌速率下進行。

進料批次培養在容器(例如，進料批次生物反應器或發酵罐)中進料批次培養細胞包括在培養週期之大部分內，向重組蛋白質培養基添加(例如，定期或連續添加)一定體積之進料液體培養基，而不大量或顯著移除該重組蛋白質生產培養基。在一些實施例中，添加進料液體培養基係連續進行(例如，在培養開始時，在整個培養時間內，在添加一定體積之在約1%至約500% (例如，約1%至約450%、約1%至約400%、約1%至約350%、約1%至約300%、約1%至約250%、約1%至約200%、約1%至約150%、約1%至約100%、約1%至約50%、約1%至約25%、約10%至約500%、約10%至約450%、約10%至約400%、約10%至約350%、約10%至約300%、約10%至約250%、約10%至約200%、約10%至約150%、約10%至約100%、約10%至約50%、約10%至約25%、約25%至約500%、約25%至約450%、約25%至約400%、約25%至約350%、約25%至約300%、約25%至約250%、約25%至約200%、約25%至約150%、約25%至約100%、約25%至約50%、約50%至約500%、約50%至約450%、約50%至約400%、約50%至約350%、約50%至約300%、約50%至約250%、約50%至約200%、約50%至約150%、約50%至約100%、約100%至約500%、約100%至約450%、約100%至約400%、約100%至約350%、約100%至約300%、約100%至約250%、約100%至約200%、約100%至約150%、約150%至約500%、約150%至約450%、約150%至約400%、約150%至約350%、約150%至約300%、約150%至約250%、約150%至約200%、約200%至約500%、約200%至約450%、約200%至約400%、約200%至約350%、約200%至約300%、約200%至約250%、約250%至約500%、約250%至約450%、約250%至約400%、約250%至約350%、約250%至約300%、約300%至約500%、約300%至約450%、約300%至約400%、約300%至約350%、約350%至約500%、約350%至約450%、約350%至約400%、約400%至約500%或約450%至約500%)之間的體積之重組蛋白質生產培養基之速率下。

熟習從業者將知曉液體培養培養基首先與重組細胞接觸以製備重組蛋白質生產培養基，且向已獲得之重組蛋白質生產培養基添加之進料液體培養基可為相同或不同的。

在一些實施例中，在培養期間針對培養物之測試(例如)由機械系統移除最小體積之重組蛋白質生產培養基。在一些實施例中，以自動化方式(例如由灌注泵)向該重組蛋白質生產培養基添加一定體積之進料液體培養基。

在此等方法之一些實施例中，一經細胞培養物達成臨限值光學密度(例如，約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200之OD₆₀₀ )，則可向該重組蛋白質生產培養基添加包括磷酸鹽之進料液體培養基。

在此等方法之一些實施例中，倘若經過之發酵係約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時或約24小時，則向該重組蛋白質生產培養基添加包括磷酸鹽之進料液體培養基。

在一些實施例中，磷酸鹽係磷酸。在一些實施例中，該磷酸係85%磷酸。

在一些實施例中，磷酸鹽係以約0.1 g磷酸鹽/L/小時至約30 g磷酸鹽/L/小時、約0.1 g磷酸鹽/L/小時至約25 g磷酸鹽/L/小時、約0.1 g磷酸鹽/L/小時至約20 g磷酸鹽/L/小時、約0.1 g磷酸鹽/L/小時至約15 g磷酸鹽/L/小時、約1 g磷酸鹽/L/小時至約20 g磷酸鹽/L/小時、約1 g磷酸鹽/L/小時至約15 g磷酸鹽/L/小時、約5 g磷酸鹽/L/小時至約20 g磷酸鹽/L/小時、約5 g磷酸鹽/L/小時至約15 g磷酸鹽/L/小時、約10 g磷酸鹽/L/小時至約20 g磷酸鹽/L/小時、約10 g磷酸鹽/L/小時至約15 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約2.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約2.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約1.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約1.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.2 g磷酸鹽/L/小時至約0.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約2.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約2.0 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約1.5 g磷酸鹽/L/小時、約0.5 g磷酸鹽/L/小時至約1.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約2.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約2.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.0 g磷酸鹽/L/小時至約1.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約2.5 g磷酸鹽/L/小時、約1.5 g磷酸鹽/L/小時至約2.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.0 g磷酸鹽/L/小時至約2.5 g磷酸鹽/L/小時、約2.5 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約2.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約2.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約2.5 g磷酸鹽/L/小時至約3.0 g磷酸鹽/L/小時、約3.0 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約3.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約3.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約3.0 g磷酸鹽/L/小時至約3.5 g磷酸鹽/L/小時、約3.5 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約3.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時、約3.5 g磷酸鹽/L/小時至約4.0 g磷酸鹽/L/小時、約4.0 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時、約4.0 g磷酸鹽/L/小時至約4.5 g磷酸鹽/L/小時或約4.5 g磷酸鹽/L/小時至約5.0 g磷酸鹽/L/小時之速率向該重組蛋白質生產培養基添加，且可(例如)持續約1小時至約60小時(例如，約1小時至約58小時、約1小時至約56小時、約1小時至約54小時、約1小時至約52小時、約1小時至約50小時、約1小時至約48小時、約1小時至約46小時、約1小時至約44小時、約1小時至約42小時、約1小時至約40小時、約1小時至約38小時、約1小時至約36小時、約1小時至約34小時、約1小時至約32小時、約1小時至約30小時、約1小時至約28小時、約1小時至約26小時、約1小時至約24小時、約1小時至約22小時、約1小時至約20小時、約1小時至約18小時、約1小時至約16小時、約1小時至約14小時、約1小時至約12小時、約1小時至約10小時、約1小時至約8小時、約1小時至約6小時、約1小時至約4小時、約1小時至約2小時、約2小時至約32小時、約2小時至約30小時、約2小時至約28小時、約2小時至約26小時、約2小時至約24小時、約2小時至約22小時、約2小時至約20小時、約2小時至約18小時、約2小時至約16小時、約2小時至約14小時、約2小時至約12小時、約2小時至約10小時、約2小時至約8小時、約2小時至約6小時、約2小時至約4小時、約4小時至約32小時、約4小時至約30小時、約4小時至約28小時、約4小時至約26小時、約4小時至約24小時、約4小時至約22小時、約4小時至約20小時、約4小時至約18小時、約4小時至約16小時、約4小時至約14小時、約4小時至約12小時、約4小時至約10小時、約4小時至約8小時、約4小時至約6小時、約6小時至約32小時、約6小時至約30小時、約6小時至約28小時、約6小時至約26小時、約6小時至約24小時、約6小時至約22小時、約6小時至約20小時、約6小時至約18小時、約6小時至約16小時、約6小時至約14小時、約6小時至約12小時、約6小時至約10小時、約6小時至約8小時、約8小時至約32小時、約8小時至約30小時、約8小時至約28小時、約8小時至約26小時、約8小時至約24小時、約8小時至約22小時、約8小時至約20小時、約8小時至約18小時、約8小時至約16小時、約8小時至約14小時、約8小時至約12小時、約8小時至約10小時、約10小時至約32小時、約10小時至約30小時、約10小時至約28小時、約10小時至約26小時、約10小時至約24小時、約10小時至約22小時、約10小時至約20小時、約10小時至約18小時、約10小時至約16小時、約10小時至約14小時、約10小時至約12小時、約12小時至約32小時、約12小時至約30小時、約12小時至約28小時、約12小時至約26小時、約12小時至約24小時、約12小時至約22小時、約12小時至約20小時、約12小時至約18小時、約12小時至約16小時、約12小時至約14小時、約14小時至約32小時、約14小時至約30小時、約14小時至約28小時、約14小時至約26小時、約14小時至約24小時、約14小時至約22小時、約14小時至約20小時、約14小時至約18小時、約14小時至約16小時、約16小時至約32小時、約16小時至約30小時、約16小時至約28小時、約16小時至約26小時、約16小時至約24小時、約16小時至約22小時、約16小時至約20小時、約16小時至約18小時、約18小時至約32小時、約18小時至約30小時、約18小時至約28小時、約18小時至約26小時、約18小時至約24小時、約18小時至約22小時、約18小時至約20小時、約20小時至約32小時、約20小時至約30小時、約20小時至約28小時、約20小時至約26小時、約20小時至約24小時、約20小時至約22小時、約22小時至約32小時、約22小時至約30小時、約22小時至約28小時、約22小時至約26小時、約22小時至約24小時、約24小時至約32小時、約24小時至約30小時、約24小時至約28小時、約24小時至約26小時、約26小時至約32小時、約26小時至約30小時、約26小時至約28小時、約28小時至約32小時、約28小時至約30小時、約30小時至約32小時、約24小時至約50小時、約30小時至約50小時、約36小時至約50小時、約24小時至約48小時、約24小時至約36小時或約36小時至約48小時)之時間。

在一些實例中，進料液體培養基之添加係在培養開始後之約最初10分鐘、最初20分鐘、最初30分鐘、最初40分鐘、最初50分鐘、最初1小時、最初2小時、最初3小時、最初4小時、最初5小時、最初6小時、最初7小時、最初8小時、最初9小時、最初10小時、最初11小時、最初12小時、最初14小時、最初16小時、最初18小時、最初20小時、最初22小時、最初24小時、最初36小時或最初48小時)後開始。

在此等方法之一些實施例中，向重組蛋白質生產培養基添加包括鎂離子之進料液體培養基。在一些實施例中，該鎂離子係以鎂鹽提供。在一些實施例中，該鎂鹽係固體。在一些實施例中，該鎂鹽係以溶液(例如，水)提供。

在一些實施例中，鎂離子係以約0.1 g Mg²⁺ /L/小時至約30 g Mg²⁺ /L/小時、約0.1 g Mg²⁺ /L/小時至約25 g Mg²⁺ /L/小時、約0.1 g Mg²⁺ /L/小時至約20 g Mg²⁺ /L/小時、約0.1 g Mg²⁺ /L/小時至約15 g Mg²⁺ /L/小時、約1 g Mg²⁺ /L/小時至約20 g Mg²⁺ /L/小時、約1 g Mg²⁺ /L/小時至約15 g Mg²⁺ /L/小時、約5 g Mg²⁺ /L/小時至約20 g Mg²⁺ /L/小時、約5 g Mg²⁺ /L/小時至約15 g Mg²⁺ /L/小時、約10 g Mg²⁺ /L/小時至約20 g Mg²⁺ /L/小時、約10 g Mg²⁺ /L/小時至約15 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約2.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約2.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約1.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約1.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.2 g Mg²⁺ /L/小時至約0.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約2.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約2.0 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約1.5 g Mg²⁺ /L/小時、約0.5 g Mg²⁺ /L/小時至約1.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約2.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約2.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.0 g Mg²⁺ /L/小時至約1.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約2.5 g Mg²⁺ /L/小時、約1.5 g Mg²⁺ /L/小時至約2.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.0 g Mg²⁺ /L/小時至約2.5 g Mg²⁺ /L/小時、約2.5 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約2.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約2.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約2.5 g Mg²⁺ /L/小時至約3.0 g Mg²⁺ /L/小時、約3.0 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約3.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約3.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約3.0 g Mg²⁺ /L/小時至約3.5 g Mg²⁺ /L/小時、約3.5 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約3.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時、約3.5 g Mg²⁺ /L/小時至約4.0 g Mg²⁺ /L/小時、約4.0 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時、約4.0 g Mg²⁺ /L/小時至約4.5 g Mg²⁺ /L/小時或約4.5 g Mg²⁺ /L/小時至約5.0 g Mg²⁺ /L/小時之速率向重組蛋白質生產培養基添加，且可(例如)持續約1小時至約60小時(例如，約1小時至約58小時、約1小時至約56小時、約1小時至約54小時、約1小時至約52小時、約1小時至約50小時、約1小時至約48小時、約1小時至約46小時、約1小時至約44小時、約1小時至約42小時、約1小時至約40小時、約1小時至約38小時、約1小時至約36小時、約1小時至約34小時、約1小時至約32小時、約1小時至約30小時、約1小時至約28小時、約1小時至約26小時、約1小時至約24小時、約1小時至約22小時、約1小時至約20小時、約1小時至約18小時、約1小時至約16小時、約1小時至約14小時、約1小時至約12小時、約1小時至約10小時、約1小時至約8小時、約1小時至約6小時、約1小時至約4小時、約1小時至約2小時、約2小時至約32小時、約2小時至約30小時、約2小時至約28小時、約2小時至約26小時、約2小時至約24小時、約2小時至約22小時、約2小時至約20小時、約2小時至約18小時、約2小時至約16小時、約2小時至約14小時、約2小時至約12小時、約2小時至約10小時、約2小時至約8小時、約2小時至約6小時、約2小時至約4小時、約4小時至約32小時、約4小時至約30小時、約4小時至約28小時、約4小時至約26小時、約4小時至約24小時、約4小時至約22小時、約4小時至約20小時、約4小時至約18小時、約4小時至約16小時、約4小時至約14小時、約4小時至約12小時、約4小時至約10小時、約4小時至約8小時、約4小時至約6小時、約6小時至約32小時、約6小時至約30小時、約6小時至約28小時、約6小時至約26小時、約6小時至約24小時、約6小時至約22小時、約6小時至約20小時、約6小時至約18小時、約6小時至約16小時、約6小時至約14小時、約6小時至約12小時、約6小時至約10小時、約6小時至約8小時、約8小時至約32小時、約8小時至約30小時、約8小時至約28小時、約8小時至約26小時、約8小時至約24小時、約8小時至約22小時、約8小時至約20小時、約8小時至約18小時、約8小時至約16小時、約8小時至約14小時、約8小時至約12小時、約8小時至約10小時、約10小時至約32小時、約10小時至約30小時、約10小時至約28小時、約10小時至約26小時、約10小時至約24小時、約10小時至約22小時、約10小時至約20小時、約10小時至約18小時、約10小時至約16小時、約10小時至約14小時、約10小時至約12小時、約12小時至約32小時、約12小時至約30小時、約12小時至約28小時、約12小時至約26小時、約12小時至約24小時、約12小時至約22小時、約12小時至約20小時、約12小時至約18小時、約12小時至約16小時、約12小時至約14小時、約14小時至約32小時、約14小時至約30小時、約14小時至約28小時、約14小時至約26小時、約14小時至約24小時、約14小時至約22小時、約14小時至約20小時、約14小時至約18小時、約14小時至約16小時、約16小時至約32小時、約16小時至約30小時、約16小時至約28小時、約16小時至約26小時、約16小時至約24小時、約16小時至約22小時、約16小時至約20小時、約16小時至約18小時、約18小時至約32小時、約18小時至約30小時、約18小時至約28小時、約18小時至約26小時、約18小時至約24小時、約18小時至約22小時、約18小時至約20小時、約20小時至約32小時、約20小時至約30小時、約20小時至約28小時、約20小時至約26小時、約20小時至約24小時、約20小時至約22小時、約22小時至約32小時、約22小時至約30小時、約22小時至約28小時、約22小時至約26小時、約22小時至約24小時、約24小時至約32小時、約24小時至約30小時、約24小時至約28小時、約24小時至約26小時、約26小時至約32小時、約26小時至約30小時、約26小時至約28小時、約28小時至約32小時、約28小時至約30小時、約30小時至約32小時、約24小時至約50小時、約30小時至約50小時、約36小時至約50小時、約24小時至約48小時、約24小時至約36小時或約36小時至約48小時)之時間。

在一些實施例中，鎂離子係包括於磷酸鹽進料液體培養基中。在一些實施例中，該進料液體培養基含有一定量之磷酸鹽及一定量之鎂鹽以提供向重組蛋白質生產培養基添加磷酸鹽及Mg²⁺ 兩者之所需之添加速率。

生物反應器及發酵罐在一些實例中，培養係使用搖瓶進行。在一些實例中，該培養係使用生物反應器(例如，進料批次發酵罐)進行。如此項技術中描述，在一些實施例中，生物反應器(例如，發酵罐)配備幾個通口用於(例如)移除流體(例如，重組蛋白質生產培養基，例如，大體上無重組細菌或包括重組細菌之重組蛋白質生產培養基)或添加流體(例如，進料液體培養基，用於調節pH之鹼性或酸性溶液，及/或包括磷酸鹽之流體)。生物反應器(例如，發酵罐)亦可配備pH監測器、溶解氧監測器、溶解CO₂ 監測器、一或多個氣體噴氣器及用於攪拌重組蛋白質生產培養基之構件(例如，螺旋槳)。各種不同之生物反應器(例如，發酵罐)係市售的。在一些實施例中，生物反應器配備可自生物反應器移除一定體積之重組蛋白質生產培養基之機械裝置，及視需要用於添加一定體積之進料液體培養基)之機械裝置。

在一些實施例中，生物反應器(例如，生物反應器或發酵罐)之內部體積係約100 mL至約1,000 L、約100 mL至約750 L、約100 mL至約500 L、約100 mL至約250 L、約100 mL至約100 L、約100 mL至約10 L、約100 mL至約1 L、約100 mL至約500 mL、約500 mL至約1,000 L、約500 mL至約750 L、約500 mL至約500 L、約500 mL至約250 L、約500 mL至約100 L、約500 mL至約10 L、約500 mL至約1 L、約1 L至約1,000 L、約1 L至約750 L、約1 L至約500 L、約1 L至約250 L、約1 L至約100 L、約1 L至約10 L、約10 L至約1,000 L、約10 L至約750 L、約10 L至約500 L、約10 L至約250 L、約10 L至約100 L、約100 L至約1,000 L、約100 L至約750 L、約100 L至約500 L、約100 L至約250 L、約250 L至約1,000 L、約250 L至約750 L、約250 L至約500 L、約500 L至約1,000 L、約500 L至約750 L或約750 L至約1,000 L。

時間週期在一些實例中，培養係進行約1天至約7天、約1天至約156小時、約1天至約6天、約1天至約132小時、約1天至約5天、約1天至約108小時、約1天至約4天、約1天至約84小時、約1天至約3天、約1天至約60小時、約1天至約2天、約1天至約36小時、約36小時至約7天、約36小時至約156小時、約36小時至約6天、約36小時至約132小時、約36小時至約5天、約36小時至約108小時、約36小時至約4天、約36小時至約84小時、約36小時至約3天、約36小時至約60小時、約36小時至約2天、約2天至約7天、約2天至約156小時、約2天至約6天、約2天至約132小時、約2天至約5天、約2天至約108小時、約2天至約4天、約2天至約84小時、約2天至約3天、約2天至約60小時、約60小時至約7天、約60小時至約156小時、約60小時至約6天、約60小時至約132小時、約60小時至約5天、約60小時至約108小時、約60小時至約4天、約60小時至約84小時、約60小時至約3天、約3天至約7天、約3天至約156小時、約3天至約6天、約3天至約132小時、約3天至約5天、約3天至約108小時、約3天至約4天、約3天至約84小時、約84小時至約7天、約84小時至約156小時、約84小時至約6天、約84小時至約132小時、約84小時至約5天、約84小時至約108小時、約84小時至約4天、約4天至約7天、約4天至約156小時、約4天至約6天、約4天至約132小時、約4天至約5天、約4天至約108小時、約108小時至約7天、約108小時至約156小時、約108小時至約6天、約108小時至約132小時、約108小時至約5天、約5天至約7天、約5天至約156小時、約5天至約6天、約5天至約132小時、約132小時至約7天、約132小時至約156小時、約132小時至約6天、約6天至約7天、約6天至約156小時或約156小時至約7天。

溫度及溫度變換在一些實施例中，重組蛋白質生產培養基在培養步驟期間之溫度係約25℃至約37℃ (例如，約25℃至約35℃、約25℃至約30℃、約30℃至約37℃、約30℃至約35℃或約35℃至約37℃)。熟習從業者將知曉該重組蛋白質生產培養基之溫度可在培養步驟期間在特定時間點下變化。在非限制性實例中，該重組蛋白質生產培養基之溫度係在培養開始後之約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天變化或變換(例如，增加或減小)。例如，溫度之變換係在培養開始後之約2天至約7天(例如，約2天至約6天、約2天至約5天、約2天至約4天、約3天至約7天、約3天至約6天、約3天至約5天、約4天至約7天、約4天至約6天或約5天至約7天)進行。

溶解氧(dO₂ ) 培養可包括在重組蛋白質生產培養基中維持溶解氧(dO₂ )濃度。在一些實施例中，該dO₂ 濃度係維持在約5%至約55% (例如，約5%至約50%、約5%至約45%、約5%至約40%、約5%至約35%、約5%至約30%、約5%至約25%、約5%至約20%、約5%至約15%、約5%至約10%、約10%至約55%、約10%至約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約15%至約55%、約15%至約50%、約15%至約45%、約15%至約40%、約15%至約35%、約15%至約30%、約15%至約25%、約15%至約20%、約20%至約55%、約20%至約50%、約20%至約45%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約25%至約55%、約25%至約50%、約25%至約45%、約25%至約40%、約25%至約35%、約25%至約30%、約30%至約55%、約30%至約50%、約30%至約45%、約30%至約40%、約30%至約35%、約35%至約55%、約35%至約50%、約35%至約45%、約35%至約40%、約40%至約55%、約40%至約50%、約40%至約45%、約45%至約55%、約45%至約50%或約50%至約55%)。在一些實施例中，該dO₂ 濃度係維持在大於約10%、大於約15%、大於約20%、大於約25%、大於約30%、大於約35%、大於約40%、大於約45%或大於約50%。

攪拌在一些實施例中，培養包括攪拌液體培養基及/或重組蛋白質生產培養基。在培養之一些實例中，該攪拌係在約100 RPM至約800 RPM、約100 RPM至約750 RPM、約100 RPM至約700 RPM、約100 RPM至約650 RPM、約100 RPM至約600 RPM、約100 RPM至約550 RPM、約100 RPM至約500 RPM、約100 RPM至約450 RPM、約100 RPM至約400 RPM、約100 RPM至約350 RPM、約100 RPM至約300 RPM、約100 RPM至約250 RPM、約100 RPM至約200 RPM、約100 RPM至約150 RPM、約150 RPM至約800 RPM、約150 RPM至約750 RPM、約150 RPM至約700 RPM、約150 RPM至約650 RPM、約150 RPM至約600 RPM、約150 RPM至約550 RPM、約150 RPM至約500 RPM、約150 RPM至約450 RPM、約150 RPM至約400 RPM、約150 RPM至約350 RPM、約150 RPM至約300 RPM、約150 RPM至約250 RPM、約150 RPM至約200 RPM、約200 RPM至約800 RPM、約200 RPM至約750 RPM、約200 RPM至約700 RPM、約200 RPM至約650 RPM、約200 RPM至約600 RPM、約200 RPM至約550 RPM、約200 RPM至約500 RPM、約200 RPM至約450 RPM、約200 RPM至約400 RPM、約200 RPM至約350 RPM、約200 RPM至約300 RPM、約200 RPM至約250 RPM約250 RPM至約800 RPM、約250 RPM至約750 RPM、約250 RPM至約700 RPM、約250 RPM至約650 RPM、約250 RPM至約600 RPM、約250 RPM至約550 RPM、約250 RPM至約500 RPM、約250 RPM至約450 RPM、約250 RPM至約400 RPM、約250 RPM至約350 RPM、約250 RPM至約300 RPM、約300 RPM至約800 RPM、約300 RPM至約750 RPM、約300 RPM至約700 RPM、約300 RPM至約650 RPM、約300 RPM至約600 RPM、約300 RPM至約550 RPM、約300 RPM至約500 RPM、約300 RPM至約450 RPM、約300 RPM至約400 RPM、約300 RPM至約350 RPM、約350 RPM至約800 RPM、約350 RPM至約750 RPM、約350 RPM至約700 RPM、約350 RPM至約650 RPM、約350 RPM至約600 RPM、約350 RPM至約550 RPM、約350 RPM至約500 RPM、約350 RPM至約450 RPM、約350 RPM至約400 RPM、約400 RPM至約800 RPM、約400 RPM至約750 RPM、約400 RPM至約700 RPM、約400 RPM至約650 RPM、約400 RPM至約600 RPM、約400 RPM至約550 RPM、約400 RPM至約500 RPM、約400 RPM至約450 RPM、約450 RPM至約800 RPM、約450 RPM至約750 RPM、約450 RPM至約700 RPM、約450 RPM至約650 RPM、約450 RPM至約600 RPM、約450 RPM至約550 RPM、約450 RPM至約500 RPM、約500 RPM至約800 RPM、約500 RPM至約750 RPM、約500 RPM至約700 RPM、約500 RPM至約650 RPM、約500 RPM至約600 RPM、約500 RPM至約550 RPM、約550 RPM至約800 RPM、約550 RPM至約750 RPM、約550 RPM至約700 RPM、約550 RPM至約650 RPM、約550 RPM至約600 RPM、約600 RPM至約800 RPM、約600 RPM至約750 RPM、約600 RPM至約700 RPM、約600 RPM至約650 RPM、約650 RPM至約800 RPM、約650 RPM至約750 RPM、約650 RPM至約700 RPM、約700 RPM至約800 RPM、約700 RPM至約750 RPM或約750 RPM至約800 RPM之頻率下進行。

濕度在一些實例中，培養可在受控加濕氣氛下(例如，在大於20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之濕度下)進行。

回收重組蛋白質在一些實施例中，重組蛋白質係藉由自重組細菌移除或以其他方式物理分離重組蛋白質生產培養基收穫自該重組蛋白質生產培養基。用於自重組細菌移除重組蛋白質生產培養基之各種不同方法係為此項技術中已知，包括(例如)離心、過濾、移液及/或抽吸。在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，該方法不包括物理(例如，均質化、法式壓碎機、玻璃或陶瓷珠、音振作用、高壓釜、微波、冷凍/解凍或研缽及研杵)或化學步驟(例如，酶，例如，諸如纖維素酶、殼質酶、溶菌酶、聚甘露糖酶或聚醣酶；醇；氯仿；醚；或螯合劑(例如，EDTA))以破壞重組細菌之外膜。

在一些實施例中，重組蛋白質係係以在重組蛋白質生產培養基中約10 mg/L至約350 mg/L、約10 mg/L至約325 mg/L、約10 mg/L至約300 mg/L、約10 mg/L至約275 mg/L、約10 mg/L至約250 mg/L、約10 mg/L至約225 mg/L、約10 mg/L至約200 mg/L、約10 mg/L至約175 mg/L、約10 mg/L至約150 mg/L、約10 mg/L至約125 mg/L、約10 mg/L至約100 mg/L、約10 mg/L至約75 mg/L、約10 mg/L至約50 mg/L、約10 mg/L至約25 mg/L、約25 mg/L至約350 mg/L、約25 mg/L至約325 mg/L、約25 mg/L至約300 mg/L、約25 mg/L至約275 mg/L、約25 mg/L至約250 mg/L、約25 mg/L至約225 mg/L、約25 mg/L至約200 mg/L、約25 mg/L至約175 mg/L、約25 mg/L至約150 mg/L、約25 mg/L至約125 mg/L、約25 mg/L至約100 mg/L、約25 mg/L至約75 mg/L、約25 mg/L至約50 mg/L、約50 mg/L至約350 mg/L、約50 mg/L至約325 mg/L、約50 mg/L至約300 mg/L、約50 mg/L至約275 mg/L、約50 mg/L至約250 mg/L、約50 mg/L至約225 mg/L、約50 mg/L至約200 mg/L、約50 mg/L至約175 mg/L、約50 mg/L至約150 mg/L、約50 mg/L至約125 mg/L、約50 mg/L至約100 mg/L、約50 mg/L至約75 mg/L、約75 mg/L至約350 mg/L、約75 mg/L至約325 mg/L、約75 mg/L至約300 mg/L、約75 mg/L至約275 mg/L、約75 mg/L至約250 mg/L、約75 mg/L至約225 mg/L、約75 mg/L至約200 mg/L、約75 mg/L至約175 mg/L、約75 mg/L至約150 mg/L、約75 mg/L至約125 mg/L、約75 mg/L至約100 mg/L、約100 mg/L至約350 mg/L、約100 mg/L至約325 mg/L、約100 mg/L至約300 mg/L、約100 mg/L至約275 mg/L、約100 mg/L至約250 mg/L、約100 mg/L至約225 mg/L、約100 mg/L至約200 mg/L、約100 mg/L至約175 mg/L、約100 mg/L至約150 mg/L、約100 mg/L至約125 mg/L、約125 mg/L至約350 mg/L、約125 mg/L至約325 mg/L、約125 mg/L至約300 mg/L、約125 mg/L至約275 mg/L、約125 mg/L至約250 mg/L、約125 mg/L至約225 mg/L、約125 mg/L至約200 mg/L、約125 mg/L至約175 mg/L、約125 mg/L至約150 mg/L、約150 mg/L至約350 mg/L、約150 mg/L至約325 mg/L、約150 mg/L至約300 mg/L、約150 mg/L至約275 mg/L、約150 mg/L至約250 mg/L、約150 mg/L至約225 mg/L、約150 mg/L至約200 mg/L、約150 mg/L至約175 mg/L、約175 mg/L至約350 mg/L、約175 mg/L至約325 mg/L、約175 mg/L至約300 mg/L、約175 mg/L至約275 mg/L、約175 mg/L至約250 mg/L、約175 mg/L至約225 mg/L、約175 mg/L至約200 mg/L、約200 mg/L至約350 mg/L、約200 mg/L至約325 mg/L、約200 mg/L至約300 mg/L、約200 mg/L至約275 mg/L、約200 mg/L至約250 mg/L、約200 mg/L至約225 mg/L、約225 mg/L至約350 mg/L、約225 mg/L至約325 mg/L、約225 mg/L至約300 mg/L、約225 mg/L至約275 mg/L、約225 mg/L至約250 mg/L、約250 mg/L至約350 mg/L、約250 mg/L至約325 mg/L、約250 mg/L至約300 mg/L、約250 mg/L至約275 mg/L、約275 mg/L至約350 mg/L、約275 mg/L至約325 mg/L、約275 mg/L至約300 mg/L、約300 mg/L至約350 mg/L、約300 mg/L至約325 mg/L或約335 mg/L至約350 mg/L之濃度回收(例如，在不包括物理或化學步驟以破壞重組細菌之外膜之方法中)。

在本發明之一項實施例中，細胞培養係在發酵罐中以1,100 kg之起始重組蛋白質生產培養基重量進行，培養基包含30 mM磷酸鹽及1.3 g/L MgSO₄ ，總計EFT係28小時，最大OD₆₀₀ 係130，及該重組蛋白質(例如，雷珠單抗)於該培養基中之效價係70至90 mg/L。

在本發明之另一實施例中，細胞培養係在發酵罐中以600 kg之起始重組蛋白質生產培養基重量進行，培養基包含60 mM磷酸鹽及2.3 g/L MgSO₄ ，總計EFT係48至50小時，最大OD₆₀₀ 係約180，及該重組蛋白質(例如，雷珠單抗)於該培養基中之效價係200至250 mg/L。

純化重組蛋白質此等方法之一些實施例進一步包括自重組蛋白質生產培養基(例如，大體上無重組細菌之重組蛋白質生產培養基)或經稀釋之重組蛋白質生產培養基(例如，大體上無重組細菌之經稀釋之重組蛋白質生產培養基)純化重組蛋白質。在一些實例中，純化重組蛋白質包括進行以下中之一者或多者：過濾、捕獲、純化及精煉。

過濾在一些實施例中，純化重組蛋白質之方法可包括(至少部分)過濾含有該重組蛋白質之液體之步驟。該過濾可(例如)使用過濾器或含有分子篩樹脂之層析管柱或層析膜進行。

捕獲在一些實施例中，重組蛋白質可使用(至少部分)自液體捕獲重組蛋白質之步驟純化。捕獲重組蛋白質可包括使用(例如)層析管柱或層析樹脂，例如，其利用捕獲機制。捕獲機制之非限制性實例包括抗體或抗體片段結合捕獲機制、適配體結合捕獲機制、蛋白質L結合捕獲機制、受質結合捕獲機制及輔因子結合捕獲機制。例如，若重組蛋白質係抗體或抗原結合片段，則捕獲機制可為蛋白質L-或蛋白質A結合捕獲機制或抗原結合捕獲機制(其中捕獲抗原係由重組抗體或重組抗原結合片段特異性識別)。捕獲重組蛋白質之非限制性樹脂係描述於此項技術中。為使用層析管柱或層析膜捕獲重組蛋白質，吾人通常進行裝載、清洗、溶析及再生層析管柱或層析膜之依序層析步驟。如熟習此項技術者可知曉，待用於裝載、清洗、溶析及再生步驟之流動速率及緩衝液係基於重組蛋白質之化學性質選擇。

純化在一些實施例中，純化重組蛋白質之方法可包括使用含有樹脂(例如，結合重組蛋白質)之層析管柱或層析膜純化重組蛋白質之步驟。例如，層析管柱或層析膜可用於進行陽離子交換或陰離子交換層析術，或分子篩層析術。可用於純化重組蛋白質之例示性樹脂係此項技術中已知的。

如由熟習此項技術者知曉，純化重組蛋白質之步驟可(例如)包括裝載、清洗、溶析及平衡用於進行純化重組蛋白質之操作單元之至少一個層析管柱或層析膜之步驟。通常，出自用於進行純化之單元操作之層析管柱或層析膜之溶析緩衝液含有重組蛋白質。

在將重組蛋白質裝載於用於進行純化該重組蛋白質之單元操作之層析管柱或層析膜上後，層析管柱或層析膜用至少一種清洗緩衝液清洗。如此項技術中可知曉，清洗緩衝液係意欲自層析管柱或層析膜溶析非重組蛋白質之所有蛋白質，而不干擾重組蛋白質與樹脂之相互作用或以其他方式溶析重組蛋白質。

用於此等方法中之溶析緩衝液之非限制性實例將取決於樹脂及/或重組蛋白質。例如，溶析緩衝液可含有不同濃度之鹽(例如，增加之鹽濃度)、不同pH (例如，增加或減小之pH)，或將與重組蛋白質競爭結合至樹脂之分子。此等溶析緩衝液之實例係此項技術中已知的。

在自用於進行純化重組蛋白質之單元操作之層析管柱或層析膜溶析該重組蛋白質後，層析管柱或層析膜可使用再生緩衝液平衡。

精煉在一些實施例中，純化重組蛋白質之方法可(至少部分)包括精煉該重組蛋白質之步驟。重組蛋白質可使用(例如)含有樹脂之層析管柱或層析膜(例如，陽離子交換、陰離子交換或分子篩層析術)精煉。用於精煉重組蛋白質之樹脂之非限制性實例係此項技術中已知的。

如此項技術中可知曉，使用層析管柱或層析膜精煉重組蛋白質可包括(例如)裝載、追蹤及再生層析管柱或層析膜之步驟。例如，當使用裝載、追蹤及再生之步驟進行精煉時，重組蛋白質在層析管柱或層析膜中不結合樹脂，且該重組蛋白質係在裝載及追蹤步驟中溶析自層析管柱或層析膜，及再生步驟係用於自層析管柱或層析膜移除任何雜質。待用於裝載、追蹤及再生步驟之各者中之流動速率及緩衝液體積之實例係此項技術中已知的。

醫藥組合物本文亦提供包括使用本文提供之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之至少一者(例如，至少兩者、至少三者、至少四者或至少五者)之醫藥組合物。在一些實施例中，本文描述之重組蛋白質中之任何一者之兩者或更多者(例如，二、三、四或五者)係以任何組合存在於醫藥組合物中。

醫藥組合物可以此項技術中描述之任何方式調配。醫藥組合物係經調配以與其等預期投與途徑(例如，動脈內、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或皮下)可相容，且以劑量單位形式(即，為方便投與及劑量之均勻性，含有既定量重組蛋白質之物理離散單元)調配。醫藥組合物可包括無菌稀釋劑(例如，無菌水、生理鹽水或注射用水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑、抗菌或抗真菌劑(例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸或乙汞硫柳酸鈉)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)、螫合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))、緩衝液(例如，乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液)、等滲劑(例如，糖、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，或鹽(例如，氯化鈉)，或其任何組合。

包括藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之任何一者(例如，雷珠單抗)之醫藥組合物可包括約5 mg/mL至約10 mg/mL、約5 mg/mL至約9 mg/mL、約5 mg/mL至約8 mg/mL、約5 mg/mL至約7 mg/mL、約5 mg/mL至約6 mg/mL、約6 mg/mL至約10 mg/mL、約6 mg/mL至約9 mg/mL、約6 mg/mL至約8 mg/mL、約6 mg/mL至約7 mg/mL、約7 mg/mL至約10 mg/mL、約7 mg/mL至約9 mg/mL、約7 mg/mL至約8 mg/mL、約8 mg/mL至約10 mg/mL、約8 mg/mL至約9 mg/mL，或約9 mg/mL至約10 mg/mL藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質(例如，雷珠單抗)。本文描述之醫藥組合物中之任何一者之一些實施例可進一步包括張力劑(例如，α,α-海藻糖二水合物)、緩衝液(例如，組胺酸緩衝液)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20)及注射用水，且具有約5.0至約7.5、約5.0至約7.0、約5.0至約6.5、約5.0至約6.0、約5.0至約5.5、約5.5至約7.5、約5.5至約7.0、約5.5至約6.5、約5.5至約6.0、約6.0至約7.5、約6.0至約7.0、約6.0至約6.5、約6.5至約7.5、約6.5至約7.0，或約7.0至約7.5之pH。在一些實施例中，可將本文提供之醫藥組合物中之任何一者放置於玻璃小瓶(例如，一次性I型玻璃小瓶)或注射器中。

在一些實施例中，本文描述之醫藥組合物中之任何一者包括小於100 ppm、小於95 ppm、小於90 ppm、小於80 ppm、小於70 ppm、小於60 ppm、小於50 ppm、小於45 ppm、小於40 ppm、小於35 ppm、小於30 ppm、小於25 ppm、小於20 ppm、小於15 ppm、小於10 ppm或小於5 ppm宿主細胞蛋白質。

治療方法本文亦提供治療有此需要之個體(例如，人類)之方法，其包括向該個體投與治療有效量之本文描述之醫藥組合物中之任何一者，本文描述之醫藥組合物包括藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之任何一者。在此等方法之一些實施例中，個體已經識別或診斷為患有濕性老年性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫或視網膜靜脈阻塞後黃斑水腫(例如，視網膜分支靜脈阻塞或視網膜中央靜脈阻塞)。

一些實施例包括向個體投與一或多個劑量(例如，兩個或更多個劑量、四個或更多個劑量、六個或更多個劑量、八個或更多個劑量，或十個或更多個劑量)之本文描述之醫藥組合物中之任何一者。

在本文描述之方法中之任何一者之一些實施例中，醫藥組合物可藉由皮下投與、肌內投與、靜脈內投與、眼內投與、動脈內投與或腹膜內投與進行投與。

套組本文亦提供包括至少一個劑量之本文描述之醫藥組合物中之任何一者之套組。在一些實施例中，套組可進一步包括用於向哺乳動物(例如，人類)投與醫藥組合物(例如，本文描述之醫藥組合物中之任何一者)之物品。

在一些實例中，套組可進一步包括無菌玻璃小瓶，其中將醫藥組合物放置於該無菌玻璃小瓶內。在一些實施例中，套組可進一步包括注射器並將醫藥組合物放置於該注射器內。

套組之一些實例包括一或多個劑量(例如，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個、至少十四個、至少二十個、至少三十個、至少四十個或至少五十個劑量) (例如，靜脈內、腹膜內、皮下、肌內或眼內劑量)之本文描述之醫藥組合物中之任何一者。在一些實例中，套組進一步包括用於向哺乳動物(例如，有此需要之人類，例如，本文描述之例示性個體中之任何一者)投與醫藥組合物(或一定劑量之醫藥組合物)之使用說明。

本文亦包括包含凍乾重組蛋白質餅或粉末之無菌小瓶、用於復水該餅或粉末之使用說明，及用於向哺乳動物(例如，有此需要之人類或本文描述之例示性個體中之任何一者)投與(例如，靜脈內、肌內、腹膜內、動脈內或眼內投與)經復水之溶液之使用說明之套組。

在一些實施例中，套組包括包含藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之至少一者之醫藥組合物，及包含至少一種額外治療劑之組合物。在一些實施例中，套組進一步含有用於向哺乳動物(例如，有此需要之人類或本文描述之其他例示性個體中之任何一者)投與包括藉由本文描述之方法中之任何一者生產之重組蛋白質中之至少一者之醫藥組合物及包括至少一種額外治療劑之組合物。

實例本發明係進一步描述於下列實例中，下列實例不限制申請專利範圍中描述之揭示內容之範圍。

實例1：針對雷珠單抗之表現測試phoA啟動子種子培養物將冷凍大腸桿菌BL21 phoA322之內容物轉移至含有250 mL無菌種子培養基(20.92 g/L (MOPS)、1.30 g/L K₂ HPO₄ 、3.36 g/L KH₂ PO₄ 、23.88 g/L酵母提取物、3.88 g/L硫酸銨、0.72 g/L檸檬酸、0.19 g/L FeCl₃ -6H₂ O、4.50 g/L葡萄糖、0.65 g/L MgSO₄ -7H₂ O、50.0 mg/L羧苄青黴素)之無菌1 L帶擋板之搖瓶內。在30℃下將該燒瓶放置於振盪培養器內並在200 RPM下旋轉。

生產反應器將經校準之pH及dO₂ 探針放置於6.6 L Bioflo3000生物反應器內，且該反應器用批次發酵培養基(1.30 g/L K₂ HPO₄ 、3.35 g/L KH₂ PO₄ 、23.87 g/L酵母提取物、3.87 g/L硫酸銨、0.71 g/L FeCl₃ -6H₂ O及0.20 g/L消泡劑204)批次處理。如圖7中顯示，在122℃ ± 1℃下將該反應器滅菌40分鐘。該反應器一經冷卻，即無菌添加葡萄糖及硫酸鎂。取樣後，將羧苄青黴素添加至該反應器以產生完全培養基(2.0 g/L葡萄糖、0.65 g/L MgSO₄ -7H₂ O及50.0 mg/L羧苄青黴素)。

接種及生長培養13.25小時後，種子燒瓶已達成8.6之QD₆₀₀ 。一部分培養物(75 mL)係用於接種生物反應器。此時開始進行資料收集及pH控制。然後，容許該生產反應器繼續，定期取樣(表1)。5小時時，開始葡萄糖進料(726.0 g/L單水合葡萄糖)。使用下文等式將葡萄糖以指數方式進料8小時。

進料速率(L/h) = (CDW*V*μ_max e^ μ_max *t)(進料濃度*細胞產率) 使用參數：CDW = 3 g/L；V = 3 L；μ_max = 0.20；進料濃度= 600 g/L；細胞產率= 0.45 g/g；及t =經過之發酵時間(EFT)。

10小時時，OD₆₀₀ 已達成49.9，且此時以1.4 t/L/hr之目標速率開始磷酸鹽/鎂進料(4.6 g/L脫水檸檬酸鈉、1.6 g/L FeCl₃ -6H₂ O、18.26 g/L磷酸(85%)及6.5 g/L MgSO₄ -7H₂ O)直至運行結束。13小時EFT時，將葡萄糖進料設定至DO狀態，視需要在整個運行過程中逐步調節，藉由使用YSI進行測試在培養物中保持葡萄糖限制。運行資料係顯示於表1及圖8至10中。表1：COH04616之採樣點

時間(h)	OD600	WCW (g/g)	葡萄糖濃度(g/L)	注釋
0	0.44	NA	2.08	接種
3	2.91	NA	1.05
5	8.29	NA	0.004	開始葡萄糖進料
7	20.9	NA	0.005
9	38.9	NA	0.002	開始磷酸鹽進料
10	49.9	0.1079	0.004
12	74.9	0.1593	0.007
13	90	0.1975	0.009
16	132	0.2456	0.013
19	147	0.257	0.013
22	145	0.2519	0.020
25	145	0.2526	0.017
28	143	0.2375	0.024
31	153	0.2319	0.059
34	148	0.2225	4.24
36	123	0.2193	7.36
38	115	0.2368	2.98
40	114	0.2091	0.020	冷卻以收穫
NA，未分析

產物之收穫生長40小時後，OD₆₀₀ 已達成114並將生產反應器冷卻至＜ 20℃用於收穫。細胞之顯微鏡檢查顯示無可見內含物。細胞漿糊係藉由用Sorvall離心機在10,000x g下快速旋轉15分鐘離心進行收集。亦收集上清液並在-20℃下冷凍。在液氮中冷凍細胞漿糊並放置於熱封袋中，以1355.1 g之重量。

使用總計178.5 g氫氧化銨進行pH控制。在運行期間進料總計2567.8 g葡萄糖進料、163 g磷酸鹽/鎂進料。來自反應器之培養物之最終重量係4830 g。

在還原條件下溶解整個細胞後，蛋白質表現係藉由在梯度4至20% SDS凝膠上運行預誘導及後誘導樣本測定(圖11)。16小時後，該凝膠未顯示任何新條帶。

實例2：針對雷珠單抗之表現用phoA啟動子測試2X鎂種子培養物將冷凍大腸桿菌BL21 phoA322之內容物轉移至含有250 mL無菌種子培養基(20.92 g/L (MOPS)、1.30 g/L K₂ HPO₄ 、3.36 g/L KH₂ PO₄ 、23.88 g/L酵母提取物、3.88 g/L硫酸銨、0.72 g/L檸檬酸、0.19 g/L FeCl₃ -6H₂ O及10 mg/L四環素)之無菌1 L帶擋板之搖瓶內。在30℃下將該燒瓶放置於振盪培養器中並在200 RPM下旋轉。

生產反應器將經校準之pH及dO₂ 探針放置於6.6 L Bioflo3000生物反應器內，且該反應器用批次發酵培養基(與實例1中描述相同)批次處理。如圖13中顯示，在122℃ ± 1℃下將該反應器滅菌40分鐘。該反應器一經冷卻，即無菌添加葡萄糖及硫酸鎂。取樣後，將四環素添加至該反應器以產生完全培養基(2.25 g/L葡萄糖、1.3 g/L MgSO₄ -7H₂ O及10.0 mg/L 四環素)。

接種及生長培養13小時後，種子燒瓶已達成16.2之QD₆₀₀ 。一部分培養物(75 mL)係用於接種生物反應器。此時開始資料收集及pH控制。然後，容許該生產反應器繼續，定期取樣(表2)。5小時時，開始葡萄糖進料(726.0 g/L單水合葡萄糖)。該葡萄糖係使用分步進料程序進料8小時。葡萄糖係藉由使用YSI監測以自各時間點分析上清液。濃度及泵速率係顯示於圖13中。由於此培養物之緩慢生長，視需要減小葡萄糖進料速率以防止葡萄糖堆積於該反應器中(圖13)。

9小時時，OD₆₀₀ 已達成51.0，且此時以1.8 g/L/hr之目標速率開始磷酸鹽/鎂進料(4.6 g/L脫水檸檬酸鈉、1.6 g/L FeCl₃ -6H₂ O、18.26 g/L 磷酸(85%)及6.5 g/L MgSO₄ -7H₂ O)直至運行結束。13小時EFT時，將葡萄糖進料設定至線性速率，視需要在整個運行過程中逐步調節，藉由使用YSI進行測試在培養物中保持葡萄糖限制。運行資料係顯示於表2及圖13至16中。表2：COH17616之採樣點

時間(h)	OD600	WCW (g/g)	葡萄糖濃度(g/L)	注釋
0	0.61	NA	2.73	接種
3	7.30	NA	1.07
4	16.3	NA	0.046	開始葡萄糖進料
6	37.9	NA	1.01
8	67.3	NA	0.082	開始磷酸鹽進料
10	121	0.2033	0.141
12	133	0.2239	19.8
14	132	0.2372	15.5
16	146	0.2444	0.643
18	140	0.238	1.04
20	140	0.2271	6.14
22	135	0.2212	9.05
24	121	0.2232	7.56
26	107	0.2365	4.80
28	102	0.2226	4.08
30	89	0.2192	5.38	冷卻以收穫
NA，未分析

產物之收穫生長34.5小時後，OD₆₀₀ 已達成165並將生產反應器冷卻至＜ 20℃用於收穫。細胞之顯微鏡檢查顯示無可見內含物。細胞漿糊係藉由用Sorvall離心機在10,000x g下快速旋轉15分鐘離心進行收集。亦收集上清液並保存。收集總計3269 g上清液。藉由添加500 mM EDTA溶液使上清液達到5 mM EDTA。

使用總計166.1 g氫氧化銨進行pH控制此運行。在運行期間進料總計1920.5 g葡萄糖進料、120.5 g磷酸鹽/鎂進料。來自反應器之培養物之最終重量係4346 g。

在還原條件下溶解整個細胞後，蛋白質表現係藉由在梯度4至20% SDS凝膠上運行預誘導及後誘導樣本測定(圖17)。16小時後，在集結粒樣本中在25至30 kDa之範圍內，該凝膠顯示誘導條帶。

實例3：針對雷珠單抗之表現用phOA啟動子測試1/3鎂種子培養物將冷凍大腸桿菌BL21 phoA322之內容物轉移至含有250 mL無菌種子培養基(如實例2中描述)之無菌1 L帶擋板之搖瓶內。在30℃下將該燒瓶放置於振盪培養器內並在200 RPM下旋轉。

生產反應器將經校準之pH及dO₂ 探針放置於6.6 L Bioflo3000生物反應器內，且該反應器係用批次發酵培養基(1.30 g/L K₂ HPO₄ 、3.35 g/L KH₂ PO₄ 、23.85 g/L酵母提取物、3.85 g/L硫酸銨、0.71 g/L FeCl₃ -6H₂ O及0.20 g/L消泡劑204)批次處理。如圖18中顯示，在122℃ ± 1℃下將該反應器滅菌40分鐘。該反應器一經冷卻，即無菌添加葡萄糖及硫酸鎂。將四環素添加至該反應器以產生完全培養基(2.25 g/L葡萄糖、0.22 g/L MgSO₄ -7H₂ O及10.0 mg/L四環素)。

接種及生長培養13小時後，種子燒瓶達成16.2之QD₆₀₀ 。一部分培養物(75 mL)係用於接種生物反應器。此時開始進行資料收集及pH控制。然後，容許該生產反應器繼續，定期取樣(表3)。5小時時，開始葡萄糖進料(726.0 g/L單水合葡萄糖)。葡萄糖係使用分步進料程序進料8小時。葡萄糖係藉由使用YSI監測以自各時間點分析上清液。水平及泵速率係顯示於圖19中。

9小時時，OD₆₀₀ 已達成51.0，且此時以1.8 g/L/hr之目標速率開始磷酸鹽/鎂進料(4.6 g/L脫水檸檬酸鈉、1.6 g/L FeCl₃ -6H₂ O、18.26 g/L磷酸(85%)及6.5 g/L MgSO₄ -7H₂ O)直至運行結束。13小時EFT時，將葡萄糖進料設定至線性速率，視需要在整個運行過程中逐步調節，藉由使用YSI進行測試在培養物中保持葡萄糖限制。運行資料係顯示於表3及圖19至22中。表3：COH17516之採樣點

時間(h)	OD600	WCW (g/g)	葡萄糖濃度(g/L)	注釋
0	0.68	NA	2.65	接種
3	4.06	NA	1.79
5	16.1	NA	0.057	開始葡萄糖進料
7	30.1	NA	7.17
9	51	NA	0.052	開始磷酸鹽進料
11	80	0.1436	2.29
13	95	0.1853	10.8
15	110	0.212	4.26
17	121	0.2282	0.152
19	134	0.2311	0.148
21	139	0.2413	0.156
23	144	0.2481	0.163
25	146	0.2525	0.173
27	145	0.253	0.177
29	151	0.2538	0.167
31	153	0.2597	0.160
33	159	0.2594	0.138
34.5	165	0.2619	0.121	冷卻以收穫
NA，未分析

產物之收穫生長34.5小時後，OD₆₀₀ 達成165並將生產反應器冷卻至＜ 20℃用於收穫。細胞之顯微鏡檢查顯示無可見內含物。細胞漿糊係藉由用Sorvall離心機在10,000x g下快速旋轉15分鐘離心進行收集。亦收集上清液並保存。收集總計3135 g上清液。藉由添加500 mM EDTA溶液使該上清液達到5 mM EDTA。

使用總計150.9 g氫氧化銨進行pH控制。在運行期間進料總計1875.7 g葡萄糖進料、131.6 g磷酸鹽/鎂進料。來自反應器之培養物之最終重量係4830 g。

在還原條件下溶解整個細胞後，蛋白質表現係藉由在梯度4至20% SDS凝膠上運行預誘導及後誘導樣本測定(圖23)。25小時後，在25至30 kDa之範圍內，該凝膠顯示弱誘導條帶。

實例4：鎂濃度對自重組細菌之周質之雷珠單抗之分泌之影響評估Mg²⁺ 濃度對由微生物表現之重組蛋白質之分泌之影響。在此實驗中，評估編碼雷珠單抗之大腸桿菌BL21 phoA322細胞。

雷珠單抗培養運行係如上文描述用包含0.21、0.32、0.64或1.3 g/L MgSO₄ 之批次發酵培養基進行。周質中之雷珠單抗之量及分泌至培養基內之雷珠單抗之量係繪製於圖3及4中。

圖3顯示在運行期間於周質中之雷珠單抗效價。在用具有0.21及0.32 g/L MgSO₄ 之培養基之運行中，周質中之雷珠單抗之量經時增加而無顯著下降。出乎意料地，當MgSO₄ 之量增加至至少0.64 g/L (例如，0.64 g/L、1.3 g/L)時，周質中之雷珠單抗之量在運行中係快得多地增加且然後減小而未曾再次達成峰值濃度。相較於使用0.64 g/L MgSO₄ 之運行，在培養基中使用最高量之Mg²⁺ (1.3 g/L MgSO₄ )之運行在周質效價中具有最顯著減小及較低周質效價，其中可見相同結果，但減小之程度。

圖4顯示在運行期間在上清液(培養基)中之雷珠單抗效價。在使用具有0.21及0.32 g/L MgSO₄ 之培養基之運行中，在運行期間，上清液中之雷珠單抗之量係平坦的而無顯著增加。出乎意料地，當MgSO₄ 之量增加至至少0.64 g/L (例如，0.64 g/L、1.3 g/L)時，上清液中之雷珠單抗之量在運行中係快得多地增加且在運行期間繼續增加。相較於使用0.64 g/L MgSO₄ 之運行，在培養基中使用最高量之Mg²⁺ (1.3 g/L MgSO₄ )之運行在上清液效價中具有更早之增加。儘管在運行後期，使用0.64 g/L MgSO₄ 之運行亦證實上清液效價之急劇增加。

圖3及4中以圖表表示之結果顯示自周質分泌至培養基內之重組蛋白質可由Mg²⁺ 以劑量依賴性方式增加。應注意所有運行係用含有6.5 g/L MgSO₄ 之進料培養基進料。由於此值在運行間無變化，因此如相較於使用在培養基中少量Mg²⁺ 之運行，Mg²⁺ 之進料對在使用在培養基中較高量Mg²⁺ 之運行中可見之效應無貢獻。

因此，在具有至少約0.64 g/L MgSO₄ 之液體培養基中培養表現蛋白質之重組細菌導致該蛋白質分泌至該培養基內。

實例5：磷酸鹽濃度對自重組細菌之周質之雷珠單抗之分泌之影響在大腸桿菌BL21 phoA322細胞中，磷酸鹽飢餓誘導重組蛋白質表現。為確定磷酸鹽對自周質之重組蛋白質之分泌之影響，評估具有較高及較低量之磷酸鹽之培養基。

雷珠單抗培養運行係如上文描述使用包含較低量之磷酸鹽(1.30 g/L K₂ HPO₄ 及3.35 g/L KH₂ PO₄ )或較高量之磷酸鹽(2.60 g/L K₂ HPO₄ 及6.70 g/L KH₂ PO₄ )之批次發酵培養基進行。將分泌至培養基內之雷珠單抗之量、周質中之雷珠單抗之量及細胞培養物之OD₆₀₀ 繪製於圖24至26中。

圖24顯示在運行期間在具有較低及較高量之磷酸鹽之培養基中分泌至該培養基中之雷珠單抗(上清液效價)。在此，無論培養基中之磷酸鹽之量，雷珠單抗均分泌至該培養基內。在具有較高磷酸鹽之培養基中，較大量之雷珠單抗經時分泌至該培養基內。

圖25顯示在運行期間在具有較低及較高量之磷酸鹽之培養基中在周質中之雷珠單抗。在此，雷珠單抗之量在誘導後初始增加但在達成拐點後減少。此指示雷珠單抗進入周質內，然後接著自細胞分泌至培養基內。無論培養基中存在之磷酸鹽之量，此模式均係相同的。

當一起評估圖24及25時，顯而易見的是，在細胞培養運行期間，當周質效價達成峰值時，此時雷珠單抗分泌至培養基內之速率增加。就低磷酸鹽運行而言，周質效價峰值在17至18小時EFT周圍(圖25)及在圖24中，分泌至周質內之速率同時增加。無論培養基中之磷酸鹽之量，此等結果均係一致的且係與圖3至5中可見之Mg²⁺ 依賴性分泌一致。

圖26顯示較高細胞密度(OD₆₀₀ )係在使用含有較高量之磷酸鹽之培養基之運行中獲得。由於存在更多磷酸鹽，該等磷酸鹽在達成磷酸鹽飢餓前需由細胞消耗，因此指數之細胞生長持續更長導致生產更多細胞。一經藉由磷酸鹽飢餓觸發誘導，即較大量之細胞可存活更久並生產更多重組蛋白質。高磷酸鹽運行係在約46小時EFT後終止，而低磷酸鹽運行係在30小時EFT後終止。

為測定產生自低及高磷酸鹽運行之雷珠單抗之量，自培養基收穫雷珠單抗並純化。純化後，低磷酸鹽運行具有40 mg/L之產率及高磷酸鹽運行具有100 mg/L之產率。

圖24及25中可見，由於培養基中具有較高磷酸鹽含量，細胞密度增加，首先在周質中及之後在培養基中導致較高之雷珠單抗效價。

在另一培養運行中，評估包含甚至更高量之磷酸鹽(3.25 g/L K₂ HPO₄ 及8.38 g/L KH₂ PO₄ )之批次發酵培養基。在16小時EFT時，該運行達成197之OD₆₀₀ 。在18、20、22、24、26、28、29、30及32小時EFT時之OD₆₀₀ 值分別係200、206、195、200、188、186、200、179及167。48小時EFT時，該OD₆₀₀ 係123且該運行終止。此等結果係與上文描述之高磷酸鹽運行(2.60 g/L K₂ HPO₄ 及6.70 g/L KH₂ PO₄ )一致，指示培養基中較高量之磷酸鹽可用於生產及分泌重組蛋白質。

總之，培養基中磷酸鹽之量不干擾Mg²⁺ 介導之重組蛋白質分泌至培養基內之分泌。然而，培養基中較高量之磷酸鹽導致增加之細胞密度。高磷酸鹽運行中之較高量之細胞可生產更多蛋白質，其導致更高之產率。其他實施例

應瞭解儘管本發明已結合其實施方式描述，但前述描述係意欲闡述且非限制由隨附申請專利範圍定義之範圍。其他態樣、優點及修飾係於下列申請專利範圍之範圍內。

圖1係pBR322:236715質體(6418鹼基對(bp))之基因圖譜之例示性示意圖。載體包括引子抑制物(ROP)、複製之起源(Ori_ColE1)、安比西林啟動子(P_Amp)、安比西林抗性基因(M_安比西林-r)、四環素抗性基因(M_四環素-r)及基因。

圖2係表現雷珠單抗之重組細菌細胞之例示性示意圖。

圖3係顯示在重組細菌培養物中使用包括不同濃度之MgSO₄ ●7H₂ O (0.21 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L或1.3 g/L)之液體培養基之經時雷珠單抗(mg/L)之周質效價之代表圖。

圖4係顯示在重組細菌培養物中使用包括不同濃度之MgSO₄ ●7H₂ O (0.21 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L或1.3g/L)之液體培養基之經時雷珠單抗(mg/L)之上清液效價之代表圖。

圖5係顯示在重組細菌培養物中使用包括不同濃度之MgSO₄ 之液體培養基之經時雷珠單抗(mg/L)之周質效價之代表圖。

圖6係在重組蛋白質生產培養基(加號)及周質(圓圈)之上清液中之經時雷珠單抗(mg/L)之濃度之代表圖。

圖7係如實例1中描述之溫度(℃)經時(小時)之滅菌概況之代表圖。

圖8係如實例1中描述之運行概況之代表圖。

圖9係如實例1中描述之光學密度(OD)及濕細胞重量(g/g)概況之代表圖。

圖10係如實例1中描述之葡萄糖濃度、泵速率及進料重量之代表圖。

圖11係十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之代表影像。第1道：分子量標記物(M.W.)，5 μL；第2道：T = 16，4 μL，第3道：T = 19，4 μL；第4道：T = 22，4 μL；第5道：T = 25，4 μL；第6道：T = 28，4 μL；第7道：T = 31，4 μL；第8道：T = 34，4 μL；第9道：T = 36，4 μL；第10道：T = 38，4 μL；第11道：T = 40，4 μL；第12道：T= 25 Sup，10 μL；第13道：T= 28 Sup，10 μL；第14道：T= 34 Sup，10 μL；及第15道：T = 38 Sup，10 μL。

圖12係如實例2中描述之溫度(℃)經時(小時)之滅菌概況之代表圖。

圖13係如實例2中描述之葡萄糖濃度、泵速率及進料重量之代表圖。

圖14係如實例2中描述之運行概況之代表圖。

圖15係如實例2中描述之OD及濕細胞重量(g/g)概況之代表圖。

圖16係上清液中之磷酸鹽(nM)經時(小時)之代表圖。

圖17係十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之代表影像。第3道：分子量標記物(M.W.)，5 μL；第4道：T = 10P，4 μL，第5道：T=16P，4 μL；第6道：T=18P，4 μL；第7道：T= 24P，4 μL；第8道：T=30P，8 μL；第9道：T=10S，8 μL；第10道：T=16S，8 μL；第11道：T=18S，8 μL；第12道：T=24S，8 μL；第13道：T=30S，8 μL。

圖18係如實例3中描述之溫度(℃)經時(小時)之滅菌概況之代表圖。

圖19係如實例3中描述之葡萄糖濃度、泵速率及進料重量之代表圖。

圖20係如實例3中描述之運行概況之代表圖。

圖21係如實例3中描述之OD及濕細胞重量(g/g)概況之代表圖。

圖22係上清液中之無機磷酸鹽(nM)經時(小時)之代表圖。

圖23係十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之代表影像。第3道：分子量標記物(M.W.)，5 μL；第4道：T = 11P，4 μL，第5道：T=19P，4 μL；第6道：T=25P，4 μL；第7道：T= 29P，4 μL；第8道：T=34.5P，8 μL；第9道：T=11S，8 μL；第10道：T=19S，8 μL；第11道：T=25S，8 μL；第12道：T=29S，8 μL；第13道：T=34.5S，8 μL。

圖24係顯示在重組細菌批次培養物中使用包括低PO₄ 濃度(1.30 g/L K₂ HPO₄ 及3.35 g/L KH₂ PO₄ )或高PO₄ 濃度(2.60 g/L K₂ HPO₄ 及6.70 g/L KH₂ PO₄ )之液體培養基之經時雷珠單抗之上清液效價(mg/L)之圖。

圖25係顯示在重組細菌批次培養物中使用包括低PO₄ 濃度(1.30 g/L K₂ HPO₄ 及3.35 g/L KH₂ PO₄ )或高PO₄ 濃度(2.60 g/L K₂ HPO₄ 及6.70 g/L KH₂ PO₄ )之液體培養基之經時雷珠單抗之周質效價(mg/L)之圖。

圖26係顯示使用包括低PO₄ 濃度(1.30 g/L K₂ HPO₄ 及3.35 g/L KH₂ PO₄ )或高PO₄ 濃度(2.60 g/L K₂ HPO₄ 及6.70 g/L KH₂ PO₄ )之液體培養基生產雷珠單抗之重組細菌批次培養物之光學密度之圖。

Claims

一種生產重組蛋白質之方法，該方法包括：提供包含編碼重組蛋白質之核酸的重組細菌；及在包含約0.3 mM至約300 mM Mg²⁺ 之液體培養基中，於足以生產並釋放該重組蛋白質至該培養基內之條件下培養該重組細菌。
如請求項1之方法，其中該液體培養基包含鎂鹽。
如請求項2之方法，其中該鎂鹽係MgSO₄ 。
如請求項1之方法，其進一步包括自該液體培養基回收該重組蛋白質。
如請求項4之方法，其中該經回收之重組蛋白質係至少95%純度。
如請求項4或5之方法，其進一步包括純化該經回收之重組蛋白質。
如請求項6之方法，其進一步包括調配該經純化之重組蛋白質。
如請求項7之方法，其中該方法不包括進行超過兩個層析步驟。
如請求項7或8之方法，其中該方法不包括該重組細菌外膜之物理或化學破壞。
如請求項1至9中任一項之方法，其中該培養係使用發酵罐進行。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該培養係批次培養。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該培養係進料批次培養。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該培養包括以每分鐘約80轉(RPM)至約1000 RPM之旋轉攪拌速率培養該細菌。
如請求項13之方法，其中該培養包括以約100 RPM至約800 RPM之旋轉攪拌速率培養該重組細菌。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該培養係在約30℃至約37℃下進行。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該重組細菌係革蘭氏陰性菌。
如請求項1至16中任一項之方法，其中該重組細菌係選自由以下組成之群：K12大腸桿菌(E. coli )細菌細胞、耶爾森氏菌(Yersinia )細菌細胞、BL21大腸桿菌細菌細胞、60E4大腸桿菌、不動桿菌(Acinetobacter )細菌細胞、博爾德菌(Bordetlla )細菌細胞、布魯氏菌(Brucella )細菌細胞、藍藻細菌(Cyanobacter )細菌細胞、腸桿菌(Enterobacter )細菌細胞、螺桿菌(Helicobacter )細菌細胞、克雷伯菌(Klebsiella )細菌細胞、奈瑟菌(Neisseria )細菌細胞、巴氏桿菌(Pasteurella )細菌細胞、假單胞菌(Pseudomonas )細菌細胞、沙門氏菌(Salmonella )細菌細胞及志賀氏菌(Shigella )細菌細胞。
如請求項1至17中任一項之方法，其中編碼該重組蛋白質之核酸係經整合至該重組細菌之染色體內。
如請求項1至17中任一項之方法，其中編碼該重組蛋白質之核酸未經整合至該重組細菌之染色體內。
如請求項1至19中任一項之方法，其中該重組蛋白質係抗體或抗原結合抗體片段。
如請求項1至20中任一項之方法，其中該重組蛋白質係特異性結合至人類血管內皮生長因子A (VEGFA)之抗體或抗原結合抗體片段。
如請求項21之方法，其中該抗原結合抗體片段係雷珠單抗(ranibizumab)。
如請求項1至22中任一項之方法，其中編碼該重組蛋白質之核酸係表現載體。
如請求項23之方法，其中編碼該重組蛋白質之核酸包含編碼細菌信號序列之序列。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該液體培養基包含約0.4 mM至約35 mM Mg²⁺ 。
如請求項25之方法，其中該液體培養基包含約0.4 mM至約30 mM Mg²⁺ 。
如請求項26之方法，其中該液體培養基包含約0.4 mM至約20 mM Mg²⁺ 。
如請求項27之方法，其中該液體培養基包含約0.4 mM至約10 mM Mg²⁺ 。
如請求項28之方法，其中該液體培養基包含約0.4 mM至約5 mM Mg²⁺ 。
一種重組蛋白質，其藉由如請求項1至29中任一項之方法生產。
一種組合物，其包含如請求項30之重組蛋白質。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項30之重組蛋白質。
如請求項32之醫藥組合物，其中該重組蛋白質係雷珠單抗。
如請求項33之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含約5 mg/mL至約10 mg/mL雷珠單抗。
如請求項33或34之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含張力劑、緩衝液、表面活性劑及注射用水，且其中該醫藥組合物具有約5至約6之pH。
如請求項35之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含α,α-海藻糖二水合物、組胺酸緩衝液、聚山梨酯20及注射用水，且該醫藥組合物具有約5至約6之pH。
一種套組，其包含如請求項32至36中任一項之醫藥組合物。
如請求項37之套組，其進一步包含無菌玻璃小瓶，其中該醫藥組合物係放置於該無菌玻璃小瓶內。
如請求項37之套組，其進一步包含注射器，其中該醫藥組合物係放置於該注射器內。
一種治療有此需要之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如請求項32至36中任一項之醫藥組合物。
如請求項40之方法，其中該個體係經鑑別或經診斷為患有濕性老年性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫或視網膜靜脈阻塞後黃斑水腫。
如請求項41之方法，其中該視網膜靜脈阻塞後黃斑水腫係視網膜分支靜脈阻塞。
如請求項41之方法，其中該視網膜靜脈阻塞後黃斑水腫係視網膜中央靜脈阻塞。