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TW201842938A - 可藉由胞漿素切斷之抗不溶性纖維蛋白抗體與藥物之複合體 - Google Patents

可藉由胞漿素切斷之抗不溶性纖維蛋白抗體與藥物之複合體 Download PDF

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TW201842938A
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松村保広
眞鍋史乃
史
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國立研究開發法人國立癌症研究中心
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Abstract

本發明係有關於一種抗體藥物複合體(ADC)及包含該複合體之供用於治療癌症的組成物。根據本發明，可提供一種在特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體與藥物的ADC中，連結抗體與藥物之連結子具有胞漿素切斷序列的ADC及包含該ADC之供用於治療癌症的醫藥組成物。

Description

可藉由胞漿素切斷之抗不溶性纖維蛋白抗體與藥物之複合體
本發明係有關於一種抗體藥物複合體及包含該複合體之供用於治療癌症的組成物。
當血管受損傷，血液接觸受損血管壁或血管內皮下組織、或組織因子流入血中時，便會開始發生血液凝固反應，周知血液中的纖維蛋白原會轉變為不溶性纖維蛋白，纖維蛋白網形成強固的止血栓而將傷口固化。
血液凝固自古以來即被指出與癌症有密切的關係(記載於1800年代法國外科醫師Trousseau之「胃癌患者之四肢血栓所引起的浮腫」)。近來的臨床疫學資料亦闡明，以胰臟癌、胃癌、腦腫瘤為主的大部分癌症，其中凝固亢進所引起的血栓症頻率比起健康正常人明顯偏高(非專利文獻1)。而且，一般認為在癌組織的內部，凝固異常所伴隨之不溶性纖維蛋白的累積、凝固壞死、血管新生也會隨著癌的惡化而重複發生。
不溶性纖維蛋白係有別於生物體內廣泛可見的前驅物之纖維蛋白原，在正常生理條件下的組織中不存在。其係藉此生成：藉由漏出至血管外而經活化的凝血酶將纖維蛋白原切斷，形成纖維蛋白單體，此纖維蛋白單體經聚合、交聯而形成纖維蛋白纖維。因此，不溶性纖維蛋白係特殊針對出血或發炎等病理狀態之組織的存在物質，在發生癌症或心肌梗塞、腦梗塞等伴有凝固之病理狀態時形成。從而，不溶性纖維蛋白便為所述血栓相關疾病的標記分子，尤其是存在於心肌梗塞或腦梗塞等無腦循環器官疾病之狀況下的癌組織中的不溶性纖維蛋白誠可謂特殊針對癌症的分子。
於此種技術背景下，有人提出特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體及使用該抗體之抗體藥物複合體(ADC)(專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] WO2014/133093
本案發明人等就特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體與藥物的ADC，開發出一種連結抗體與藥物之連結子具有胞漿素切斷序列的ADC。本案發明人等發現，所得ADC會傳遞至不溶性纖維蛋白，而且會在傳遞到的部位被胞漿素切斷，而於該處釋放出藥物。再者，本案發明人等發現，利用腫瘤模型動物，所得ADC可瞄準腫瘤周邊之不溶性纖維蛋白的累積處，並於該處釋放出藥物，對於腫瘤可發揮抗癌作用。此外，本案發明人等取得一種新穎特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體。本發明為基於此等見解之發明。
亦即，根據本發明，係提供以下之發明： 　　(1)一種抗體-藥物複合體(ADC)，其中， 　　抗體為結合於纖維蛋白之抗體，其對不溶性纖維蛋白之親和性係高於對纖維蛋白原之親和性， 　　藥物為細胞傷害劑， 　　抗體與藥物係經由連結子連結，該連結子係具有胞漿素切斷部位以便可藉由胞漿素切斷。 　　(2)如上述(1)之ADC，其中連結子係具有纈胺酸-白胺酸-離胺酸之胜肽序列作為胞漿素切斷部位。 　　(3)一種醫藥組成物，其係包含如上述(1)或(2)之ADC，且供用於治療癌症。 　　(4)如上述(3)之醫藥組成物，其中癌症為浸潤性癌。 　　(5)一種抗體；或者與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體；或此等之抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號1所示之CDR1、序列編號2所示之CDR2、與序列編號3所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號5所示之CDR1、序列編號6所示之CDR2、與序列編號7所示之CDR3。 　　(6)一種抗體、或其抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號4所示之重鏈可變區、與序列編號8所示之輕鏈可變區。 　　(7)一種抗體；或者與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體；或此等之抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號9所示之CDR1、序列編號10所示之CDR2、與序列編號11所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號13所示之CDR1、序列編號14所示之CDR2、與序列編號15所示之CDR3。 　　(8)一種抗體、或其抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號12所示之重鏈可變區、與序列編號16所示之輕鏈可變區。 　　(9)如上述(1)或(2)之ADC，其中抗體為如上述(5)～(8)中任一項之抗體。 　　(10)一種醫藥組成物，其係包含如上述(9)之ADC。 　　(11)如上述(10)之醫藥組成物，其係供用於治療癌症。
於本發明中，「對象」意指哺乳動物，尤其可為人類。
於本說明書中，「處置」係以包含治療(治療處置)與預防(預防處置)之意義使用。於本說明書中，「治療」係指疾病或者異常的治療、治癒、防止，或者緩解之改善、或降低疾病或者異常的惡化速度。於本說明書中，「預防」係指降低罹患疾病或者發病的可能性，或延緩疾病或者病情的發生。
於本說明書中，「疾病」係指治療對其有益之症狀。於本說明書中，「癌症」係指惡性腫瘤。
於本說明書中，「抗體」意指免疫球蛋白，係包含多株抗體及單株抗體。較佳之抗體為單株抗體。抗體的來源不特別限定，可舉出例如非人類動物之抗體、非人類哺乳動物之抗體、及人類抗體。又，抗體可為嵌合抗體、擬人化抗體、或人類抗體。再者，抗體可為二重特異性抗體。
於本說明書中，「治療上有效量」係指有效用於對疾病或狀態進行處置(預防或治療)的藥劑量。治療上有效量的藥劑可降低疾病或狀態之症狀的惡化速度；可遏止前述症狀的惡化；可改善前述症狀；可治癒前述症狀；或可抑制前述症狀的發病或惡化。
於本說明書中，「不溶性纖維蛋白」係指藉由第XIII因子交聯而成的纖維蛋白。於生物體中，例如一旦發生出血，纖維蛋白原便會因凝血酶的作用而轉換成纖維蛋白單體，纖維蛋白原單體經聚合而形成難溶性的纖維蛋白聚合物。纖維蛋白聚合物係藉由第XIII因子進行交聯，而形成不溶性纖維蛋白。
於本說明書中，「特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體」係指結合於不溶性纖維蛋白之抗體，為比起對纖維蛋白原，對不溶性纖維蛋白具有更高之親和性的抗體。此種特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體，可容易地根據對不溶性纖維蛋白之親和性與對纖維蛋白原之親和性進行篩檢而得。纖維蛋白在不溶性纖維蛋白中會發生立體結構轉換，由於呈不溶性而具有初次露出的抗原決定基部位。從而，「特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體」係可透過以此露出之區域，即D區(以下亦稱「D-domain」)作為免疫原進行免疫而得。又，亦可使用線形胜肽來獲得。例如，若將對應纖維蛋白Bβ鏈(例如人類纖維蛋白Bβ鏈可具有序列編號25所示之胺基酸序列)之胺基酸序列的231～246位之纖維蛋白Bβ鏈的部分胜肽免疫，則可獲得「特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體」。此外，以序列編號26或序列編號27之胜肽作為免疫原進行免疫，亦可得到「特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體」。此種特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體可為比起對纖維蛋白原、纖維蛋白單體及纖維蛋白聚合物之任一者，對不溶性纖維蛋白之親和性較高的抗體。能以對不溶性纖維蛋白之親和性與對纖維蛋白原之親和性的比例如超過1之1.5以上、2以上、3以上、4以上、或5以上的抗體作為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體而得。親和性係指結合親和性(KD)，能以ELISA或結合平衡排除法等周知之方法來決定。
於本說明書中，「競爭」係指在與抗原結合上，與其他的結合抗體互相爭奪結合之意。競爭可能在針對某一抗原，2個抗體的結合部位重疊時發生。此種抗體可藉由如上述使用抗原決定基的免疫而得；及/或藉由競爭分析法確認針對抗原的其中一抗體之結合是否因另一抗體而減少亦可獲得之。
於本說明書中，「抗體-藥物複合體」(以下亦稱「ADC」)係指抗體與細胞傷害劑連結而成的物質。就ADC而言，抗體與細胞傷害劑可經由適切的連結子連結而成。作為細胞傷害劑，可使用化學療法劑、放射性同位素、及毒素。ADC亦包含抗體之抗原結合性片段與藥物的複合體。
於本說明書中，「抗原結合性片段」係指可維持對抗原的結合性之抗體的一部分。抗原結合性片段可包含本發明之抗體之重鏈可變區或者輕鏈可變區或此兩者。抗原結合性片段亦可經嵌合化或擬人化。作為抗原結合性片段，可舉出例如Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙價抗體、sc(Fv)2 (單鏈(Fv)2 )。此種抗體之片段不特別限定，例如可對抗體以酵素進行處理而得。例如，將抗體以木瓜蛋白酶消化，可獲得Fab。或者，將抗體以胃蛋白酶消化，則可獲得F(ab’)2 ，再將此等進一步還原，則可獲得Fab’。於本發明中可使用此種抗體之抗原結合性片段。
於本發明中，就抗體-藥物複合體，抗體與細胞傷害劑係經由連結子連結。作為細胞傷害劑，可舉出化學療法劑(例如市售之抗癌劑等抗癌劑、例如澳瑞他汀(澳瑞他汀E、澳瑞他汀F苯二胺(AFP)、單甲基澳瑞他汀E、單甲基澳瑞他汀F與彼等之衍生物)、美登(Maytansinoid) DM1及DM4與彼等之衍生物)、喜樹鹼(SN-38、抗癌妥、勒托替康、DB67、BMP1350、ST1481、CKD602、托普樂肯及依喜替康(Exatecan)、以及彼等之衍生物)、DNA小溝黏合劑(烯二炔、樂希托星、多卡米星與彼等之衍生物)、紫杉烷(taxane)(太平洋紫杉醇及剋癌易與彼等之衍生物)、聚酮(迪卡莫奈德(discodermolide)與其衍生物)、蒽醌系(雙羥蒽醌與其衍生物)、苯二氮類藥物(吡咯并苯二氮類藥物、吲哚啉苯二氮類藥物、及噁唑啉酮苯二氮類藥物與彼等之衍生物)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春鹼、長春醯胺、及溫諾平與彼等之衍生物)、艾黴素類(艾黴素、嗎啉基-艾黴素、及氰基嗎啉基-艾黴素與彼等之衍生物)、強心配醣體(毛地黃毒苷或其衍生物)、卡奇黴素、埃博黴素、隱藻素、西馬多丁、西馬多丁、力索新、紡錘菌素、考布他丁、Eryuterobin、伊妥普賽、T67(Tularik)、及諾考達唑)、放射性同位素(例如32 P、60 C、90 Y、111 In、131 I、125 I、153 Sm、186 Re、188 Re、及212 Bi)、及毒素(例如白喉毒素A、假單孢菌內毒素、離胺酸、皂草毒蛋白等)，可作為本發明之ADC中的細胞傷害劑使用。作為本發明之ADC中的細胞傷害劑，較佳為例如使用喜樹鹼，尤為SN-38、或依喜替康。細胞傷害劑皆可使用用於癌症之治療者。作為細胞傷害劑，可使用上述細胞傷害劑之藥學上可許容的鹽、溶劑合物(例如水合物)、酯、或前驅藥。
於本發明中，ADC之連結子係包含胞漿素切斷序列，可於胞漿素存在下切斷。於本發明中，ADC之連結子係由胞漿素切斷序列以外的部位，在投予後傳遞至不溶性纖維蛋白前的過程中呈穩定的化學鍵所構成。透過採此種構成，本發明之ADC在投予後傳遞至不溶性纖維蛋白前呈穩定，而且在結合於不溶性纖維蛋白後可藉由胞漿素切斷，僅於不溶性纖維蛋白附近釋放出細胞傷害劑。胞漿素切斷序列為胺基酸序列，具體而言可為包含選自由纈胺酸-白胺酸-離胺酸、甘胺酸-脯胺酸-離胺酸、麩胺酸-離胺酸-離胺酸、離胺酸-苯丙胺酸-離胺酸、正纈胺酸-環己基丙胺醯基-離胺酸、及正白胺酸-六氫酪胺酸-離胺酸所成群組之胞漿素切斷序列等胺基酸序列的胜肽鏈。此種連結子可於ADC的製作中由本業者適宜選擇而合成。於一形態中，就連結子而言，例如在抗體與胞漿素切斷序列之間可導入第1間隔區，例如可使用聚乙二醇(PEG)，例如1分子中重複單元為5～40左右的PEG作為第1間隔區。在胞漿素切斷序列與細胞傷害劑之間亦可導入第2間隔區，例如可使用對胺基苯甲氧羰基(PABC)作為第2間隔區。 　　於一形態中，連結子係包含第1間隔區及胞漿素切斷序列。於一形態中，連結子係包含第1間隔區、胞漿素切斷序列、及第2間隔區。針對某一特定對象，連結子係包含PEG、胞漿素切斷序列、及PABC。 　　於一形態中，連結子不含胞漿素切斷序列以外的斷裂性部分。 　　抗體與連結子之結合，例如可經由馬來醯亞胺基連結於抗體之巰基。 　　於一形態中，抗體係經由該巰基，以具有馬來醯亞胺-PEG-胞漿素切斷序列的連結子與抗癌劑連結。於一形態中，抗體係經由該巰基，以具有馬來醯亞胺-PEG-胞漿素切斷序列-PABC的連結子與抗癌劑。 　　於任一種情況下，就本發明之ADC，抗癌劑係以具有可藉由胞漿素切斷之胞漿素切斷部位的連結子與抗癌劑連結，該ADC一到達不溶性纖維蛋白的累積部位，連結子便會由存在於其周圍的胞漿素，於胞漿素切斷部位切斷，而於不溶性纖維蛋白的周邊釋放出抗癌劑。於癌組織的周邊，一般認為存在多數根據癌細胞浸潤所引起之出血而累積不溶性纖維蛋白的部位(參照圖8)，而本發明之抗體(亦即特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體)係有用於在藥物傳遞系統中瞄準癌細胞，研判本發明之ADC有用於作為癌症的治療藥。
於本發明中，係提供以下抗體： 　　一種抗體；及與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號1所示之CDR1、序列編號2所示之CDR2、與序列編號3所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號5所示之CDR1、序列編號6所示之CDR2、與序列編號7所示之CDR3。此等抗體可作為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體使用。
於本發明中，又提供以下抗體： 　　一種抗體，其為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號4所示之重鏈可變區、與序列編號8所示之輕鏈可變區。此抗體可作為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體使用。 　　此抗體亦可謂具有以下兩區之抗體： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號1所示之CDR1、序列編號2所示之CDR2、與序列編號3所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號5所示之CDR1、序列編號6所示之CDR2、與序列編號7所示之CDR3。
於本發明中，係提供以下抗體： 　　一種抗體；及與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號9所示之CDR1、序列編號10所示之CDR2、與序列編號11所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號13所示之CDR1、序列編號14所示之CDR2、與序列編號15所示之CDR3。此等抗體可作為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體使用。
於本發明中，又提供以下抗體： 　　一種抗體，其為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號12所示之重鏈可變區、與序列編號16所示之輕鏈可變區。此抗體可作為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體使用。 　　此抗體亦可謂具有以下兩區之抗體： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號9所示之CDR1、序列編號10所示之CDR2、與序列編號11所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號13所示之CDR1、序列編號14所示之CDR2、與序列編號15所示之CDR3。
上述抗體、及特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體、以及此等之抗原結合性片段可於本發明之ADC中作為抗體部分使用。
根據本發明，係提供一種醫藥組成物，其係包含治療上有效量的上述ADC(亦稱「本發明之ADC」)。根據本發明，本發明之ADC及上述醫藥組成物可分別用於治療癌症。
作為本發明之ADC或醫藥組成物之治療對象的癌症，不特別限定，可舉出癌，例如肺癌、胰臟癌、頭頸部癌、攝護腺癌、膀胱癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胸腺癌、腎臟癌、精巢癌、陰莖癌、肝臟癌、膽管癌、腦腫瘤、骨軟部腫瘤、後腹膜腫瘤、血管・淋巴管肉瘤、及此等之轉移性癌。
作為本發明之對象，可為未罹患血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病的對象、或未經診斷為血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病的對象。藉此，可望減在輕癌以外之組織的副作用。從而，也可決定患有癌症之對象是否罹患血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病，其後，對未罹患血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病的對象投予本發明之ADC。是否罹患血栓性異常或伴有血栓性異常之疾病，可由醫師來適宜判斷。
於本發明一形態中，醫藥組成物係包含本發明之ADC與賦形劑。本發明之醫藥組成物可藉由靜脈內投予、皮下投予、腫瘤內投予、腹腔內投予、腦室內投予、肌肉內投予等投予方法來投予。其用量可考量患者的年齡、性別、體重、疾病的嚴重程度等，由醫師來適宜決定。
本發明之ADC可瞄準累積於此等癌症之間質的不溶性纖維蛋白，使細胞傷害劑累積於該瞄準部位，惟非僅如此，其進一步具有可藉由在存有不溶性纖維蛋白之處經活性化的胞漿素切斷的連結子，而於瞄準部位使細胞傷害劑游離。藉此，可指定部位地傷害游離部位周邊的癌症。
根據本發明，係提供一種特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體的使用，其係在供用於治療癌症之醫藥的製造中使用。根據本發明，係提供一種ADC的使用，該ADC為在供用於治療癌症之醫藥的製造中之特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體與細胞傷害劑的ADC，其中抗體與細胞傷害劑係具有可由胞漿素切斷的胞漿素切斷部位。
根據本發明，係提供一種方法，其為對有必要針對癌症之對象進行治療的方法，其係包含對前述對象投予治療上有效量的本發明之ADC。根據本發明，係提供一種方法，其為對有必要針對癌症之對象進行治療的方法，其係包含決定患有癌症之對象是否罹患血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病，其後，對未罹患血栓性異常或者伴有血栓性異常之疾病的對象投予治療上有效量的本發明之ADC。
根據本發明，係提供一種本發明之ADC的使用，其係供用於治療癌症的方法。 [實施例]
實施例1：特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體的製作 　　於本實施例中，係製作比起對纖維蛋白原，對不溶性纖維蛋白之親和性高為高選擇性的抗體(下稱「特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體」)。
(1)免疫原的說明 　　於本實施例中，係以具有序列編號26之胺基酸序列的胜肽及具有序列編號27之胺基酸序列的胜肽作為免疫原對動物進行免疫而得到抗體。
(2)免疫方法 　　對小鼠之免疫係如下進行。對小鼠之免疫係每隔2週進行6次。 　　第1次與第4次免疫的免疫原係如下調製。分別將具有序列編號26之胺基酸序列的胜肽及具有序列編號27之胺基酸序列的胜肽作為免疫原使用。製作以經滅菌之PBS調整成0.5mg/ml的免疫原，裝入1ml的注射器。將與該免疫原等量的Freund’s Complete Adjuvant(Difco公司)裝入另一1ml注射器，將各注射器以接頭相連結，相互擠出至感到阻力為止。於第1次與第4次免疫，免疫原係對腹腔投予200μl。 　　第2, 3, 5, 6次免疫的免疫原係如下調製。製作以經滅菌之PBS調整成0.5mg/ml的免疫原，將與該免疫原等量的GERBU ADJUVANT 100(Nacalai Tesque公司)於1.5ml tube內混合，裝入1ml的注射器。於第2, 3, 5, 6次免疫，免疫原係對腹腔投予100μl。最終免疫係製作以經滅菌之PBS調整成0.1mg/ml的免疫原，裝入1ml的注射器。免疫原係首先對腹腔投予100μl，10分鐘後對尾靜脈投予400μl。
(3)抗體價的測定 　　小鼠係於最終免疫的1週前自尾靜脈進行抽血。以4,000×g、10分、4℃進行離心，回收上清液而作成試樣。抗體價測定係使用從100倍稀釋至12800倍稀釋，按每2倍進行循序稀釋而成的試樣，以ELISA來進行。於進行ELISA之際，係事先進行抗原固相化孔盤的製備。以TBS(pH8.5)將Fibrinogen from human plasma(SIGMA公司)溶解，製成20μg/ml的纖維蛋白原溶解液。按50μl/well添加於96well Immuno Plate，於4℃靜置一夜後作成纖維蛋白原孔盤。對此纖維蛋白原孔盤，對各個well各以100μl添加以凝血酶稀釋液[7mM L-Cystein(Wako公司), 1mM CaCl2 (Wako公司), TBS(pH 8.5)]稀釋成0.05 NIH U/ml的凝血酶，於37℃培養2小時後作成纖維蛋白孔盤。將各抗原經固相化之孔盤以200μl的PBS-T(PBS, 0.5%(v/v)Tween20)洗淨3次，對各well添加200μl的阻斷溶液[PBS-T, 1%(w/v)BSA]，於室溫靜置1小時進行阻斷。按50μl/well添加經循序稀釋之試樣，於室溫靜置1小時。捨棄溶液，以PBS-T洗淨3次，將以阻斷溶液稀釋成0.3μg/ml的二次抗體各以50μl添加於各well並於室溫靜置30分鐘。二次抗體係依據試樣而分別使用Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP(Dako公司)與Polyclonal Rabbit Anti-Rat Immunoglobulins /HRP(Dako公司)。捨棄溶液，以PBS-T洗淨3次，將發色基質溶液(1-StepTM Slow TMB-ELISA Substrate Solution, Thermo Fisher Scientific公司)各以100μl添加於各well，於室溫使其反應10分鐘。將2N H2 SO4 各以30μl添加於各well而使反應停止。以Spectra Max paradigm(Molecular Devices公司)測定波長450nm的吸光度。
(4)融合瘤的調製 　　以外科方式由小鼠摘出脾臟，浸漬於對RPMI 1640添加200 units/ml Penicillin-200μg/ml Streptomycin-500ng/ml Amphotericin B而成的培養基。使用注射器10ml(TERUMO公司)與注射針22G(TERUMO公司)將RPMI1640注入脾臟，取出脾臟細胞，使其通過70μm網目的EASY strainer (greiner公司)。回收之細胞懸浮液係以270×g、5min、室溫之條件進行離心，去除上清液後，懸浮於10ml的RPMI 1640。重複此使用RPMI 1640之洗淨2次，懸浮於5ml的RPMI 1640，如使用小鼠的腸骨淋巴節之細胞融合地進行細胞融合。
(5)融合瘤的篩檢 　　自進行細胞融合10日後以ELISA起始篩檢。1次篩檢係由全部的well中分注50μl的培養上清液，作為1次抗體使用。準備使用於免疫之胜肽經固相化的孔盤。將胜肽以磷酸緩衝液稀釋成20μg/ml，對96well Immuno Plate(MAXI BREAKAPART NUNC-IMMUNO MODULE, nunc公司)之各well各添加50μl，於室溫靜置1小時來進行固相化。固相化後係以如與抗體價測定相同之方法進行ELISA。藉此來確認有產生抗體之細胞的well。 　　2次篩檢係僅由1次篩檢中呈陽性的well中分注培養50μl的上清液，作為1次抗體使用。使用纖維蛋白孔盤及纖維蛋白原孔盤以如與抗體價測定相同之方法進行ELISA。藉此來確認有產生特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體之細胞的well。就2次篩檢中呈陽性的well，係使用附200μl刻度之黃色晶片(Watson公司)進行菌落挑取。對菌落按壓晶片並吸取5μl，予以播種於新的Costar 96-Well Cell Culture Plates。 　　3次篩檢係由播種菌落的well中分注50μl的培養上清液，作為1次抗體使用。使用纖維蛋白孔盤及纖維蛋白原孔盤以如與抗體價測定相同之方法進行ELISA。將3次篩檢中呈陽性的well之細胞進行極限稀釋。 　　4次篩檢係僅由單一細胞的well中分注50μl的培養上清液，作為1次抗體使用。使用纖維蛋白孔盤及纖維蛋白原孔盤以如與抗體價測定相同之方法進行ELISA。藉此選出可產生特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體的細胞。 　　由將具有序列編號26之胺基酸序列的胜肽進行免疫的小鼠獲得99-5殖株。又，由將具有序列編號27之胺基酸序列的胜肽進行免疫的小鼠獲得1101殖株。以下，將此「99-5殖株」單純稱為「99殖株」。
實施例2：所得單株抗體的特性解析 　　於本實施例中，係藉由ELISA及表面電漿子共振(SPR)來驗證抗體的親和性。
(1)ELISA所產生之親和性的驗證 　　於進行ELISA之際，係事先進行抗原固相化孔盤的製備。以TBS(pH8.5)將Fibrinogen from human plasma (SIGMA公司)溶解，製成20μg/ml的纖維蛋白原溶解液。按50μl/well添加於96well Immuno Plate，於4℃靜置一夜後作成纖維蛋白原孔盤。對此纖維蛋白原孔盤，對各個well各以100μl添加以凝血酶稀釋液[7mM L-Cystein(Wako公司), 1mM CaCl2 (Wako公司), TBS(pH8.5)]稀釋成0.05NIH U/ml的凝血酶，於37℃培養2小時後作成纖維蛋白孔盤。將各抗原經固相化之孔盤以200μl的PBS-T(PBS, 0.5%(v/v)Tween20)洗淨3次，對各well添加200μL的阻斷溶液[PBS-T, 1%(w/v)BSA]，於室溫靜置1小時進行阻斷。按50μl/well添加以PBS循序稀釋之試樣，於室溫靜置1小時。捨棄溶液，以PBS-T洗淨3次，將以阻斷溶液稀釋成0.3μg/ml的二次抗體各以50μl添加於各well並於室溫靜置30分鐘。二次抗體係依據試樣而分別使用Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP(Dako公司)與Polyclonal Rabbit Anti-Rat Immunoglobulins/HRP(Dako公司)。捨棄溶液，以PBS-T洗淨3次，將發色基質溶液各以100μl添加於各well，於室溫使其反應10分鐘。將2N H2 SO4 各以30μl添加於各well而使反應停止。以Spectra Max paradigm(Molecular Devices公司)測定波長450nm的吸光度。
結果係如圖1所示。如圖1所示，由上述實施例中新得到的99殖株及1101殖株所得之抗體為對不溶性纖維蛋白，比起對纖維蛋白原會更強力地結合的特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體。又，比起由WO2016/167227中獲得的102-10殖株所得之抗體，對纖維蛋白會更強烈地反應。
(2)SPR所產生之親和性的驗證 　　當抗原為不溶性時，非適於SPR所產生之親和性的驗證，而為了比較抗體彼此的相對親和性強度而測定作為參考。 　　使用Biacore T200(GE Healthcare公司)，由表面電漿子共振(Surface plasmon resonance: SPR)解析算出抗體對不溶性纖維蛋白之親和性，來進行抗體之分子間相互作用的評定。流路中所使用的buffer係使用HBS-N buffer(GE Healthcare公司)。以10mM sodium acetate, pH 5.5(GE Healthcare公司)將102-10之抗原決定基部分的胜肽(參照WO2016/167227)稀釋成1μg/ml，並固定於感測器晶片(Biacore sensor chip CM5, GE Healthcare公司)。固定係使用amine coupling kit(BR-1000-50, GEHeathcare公司)，將固定量設為90 RU來進行。其次使用以1×HBS-N buffer稀釋成48.875、93.75、187.5、375、750、1500nM的抗體，依多循環動力學(Multi-cycle kinetics)法以表1之條件進行抗原抗體反應。測定後，為求出KD值、kd值、ka值而使用BIAevaluation(GE Healthcare公司)進行解析。
結果係如表2所示。
實施例3：使用胰臟癌之皮下移植模型之抗體對癌症之累積性的驗證 　　於本實施例中，係使由Y. Kawaguchi、C. Wright、D. Tuveson提供之LSL-KrasG12D/+ 與由Ptf1a-Cre、National Cancer Institute at Frederick提供之LSL-Trp53R172H/+ 交配來製作p53、p48、及K-Ras之三重突變小鼠(胰臟癌模型小鼠)，由於可建立取自三重突變小鼠之胰臟癌細胞株，而使用該細胞株來進行in vivo imaging。此三重突變小鼠經報導可模擬人類胰臟癌的發生。胰臟癌細胞株係以添加有對500ml的RPMI 1640(Wako公司) 呈非活性之100ml Fetal Bovine Serum(FBS, gibco公司)與10ml的100 units/ml Penicillin-100μg/ml Streptomycin-250ng/ml Amphotericin B(Wako公司)的培養基培養。然後，去除培養上清液，使用PBS(Invitrogen公司)加以洗淨，添加2ml的Trypsin-EDTA[0.25%(w/v) Trypsin-1.0 mmol/l thylenediaminetetraacetic acid・4Na Solution with Phenol Red, 和光純藥工業公司]，以吸量管吸放剝除細胞，裝入15ml tube(corning公司)。以270×g、3min、4℃之條件使用離心機(萬用離心機5800, KUBOTA公司)進行離心，去除上清液。以10ml的PBS予以再懸浮，以270×g、3min、4℃之條件進行離心。如此重複三次，以PBS調整成2×106 cells/50μl，對5週大的BALB/c Slc nu/nu小鼠(日本SLC公司)之左腳根部，按每隻各皮下注射50μl。1個月後，將經Alexa647標記之抗不溶性纖維蛋白抗體與控制組抗體按每隻300μg投予至尾靜脈。控制組係使用InVivoMAb Mouse IgG1 Isotype control(BioXCell公司)。於投予後1小時後、第1日、第3日、第5日、第7日以in vivo生物體觀察系統OV110(olympus公司)進行拍攝。
結果係如圖2所示。如圖2所示，由造影可知所得不溶性抗不溶性纖維蛋白抗體(尤為1101及99)對癌症的累積性極高。
接著，將以外科方式摘出的腫瘤包埋於OCT compound(Sakura Finetek Japan公司)予以冷凍，製作6μm的薄層切片。以乾燥機風乾45分鐘後，以冷丙酮(Wako公司)進行固定10分鐘。以PBS洗淨後，以Mayer蘇木精(武藤化學公司)進行核染色2分鐘。以流水進行10分鐘洗淨後，以用100%乙醇稀釋3倍的伊紅醇(武藤化學公司)將細胞質染色。以流水洗淨後，按每3分鐘浸漬於100%乙醇3次，並按每3分鐘浸漬於二甲苯(Wako公司)3次，來進行脫水與透明化。最後以Mount-Quick(大道產業公司)封入。
將以外科方式摘出的腫瘤包埋於OCT compound (Sakura Finetek Japan公司)予以冷凍，製作6μm的薄層切片。以乾燥機風乾45分鐘後，以冷丙酮(Wako公司)進行固定10分鐘。以PBS洗淨後，浸漬於0.3%(v/v)H2 O2 20分鐘，進行內生性過氧化酶抑制。以PBS進行5分鐘之洗淨3次後，以阻斷溶液[5%(w/v)脫脂乳(Difco公司), PBS]進行30分鐘阻斷。滴下200μl之以阻斷溶液稀釋成1μg/ml的HRP標記抗體，於4℃使其反應一夜。以PBS以5分鐘洗淨3次後，以3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(Dako公司)進行酵素基質反應。其後，以滅菌蒸餾水進行3分鐘洗淨，以Mayer蘇木精(武藤化學公司)進行核染色2分鐘。以流水進行10分鐘洗淨後，按每3分鐘浸漬於100%乙醇3次，並按每3分鐘浸漬於二甲苯(Wako公司)3次，來進行脫水與透明化。最後以Mount-Quick(大道產業公司)封入。
實施例4：in vitro抗癌作用 　　於本實施例中，係製作將單甲基澳瑞他汀E(MMAE)連結於所得之特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體而成的抗體藥物複合體(ADC)，並驗證其抗癌作用。
作為ADC，係合成圖3所示結構的ADC來使用。此ADC係使作為抗癌劑之MMAE連結於單株抗體(mAb)而成者。就此ADC，係聚乙二醇(PEG)間隔區與胞漿素切斷部位，經由Val-Leu-Lys，抗體與MMAE連結，在存有胞漿素的環境下經切斷，MMAE由抗體游離。
上述ADC，具體而言係如下合成。對Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-aminobenzylalcohol(0.74 g, 0.773mmol)的DMF(2ml)溶液於0度添加DIPEA(0.54ml, 3.10mmol)與p-nitrophenyl chloroformate(472mg, 1.55mmol)，並於室溫攪拌12小時。將反應液以飽和氯化銨水溶液停止，以氯仿進行萃取。將萃取層以飽和食鹽水洗淨，以Na2 SO4 乾燥後，於減壓下進行濃縮。將殘餘物以矽膠層析法(CHCl3 /MeOH 95/5-9/1)純化。得到無色非晶質之Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-p-nitrophenyl carbonate。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ): d 8.01 (br, 1H), 7.76 (br, 1H), 7.05-7.60 (m, 13H), 6.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.49 (br, 1H), 5.25 (br, 1H), 4.94 (br, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 4.00-4.85 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.55-3.90 (m, 2H), 3.26 (d, J =19.6 Hz, 1H), 3.00 (d, J = 19.6 Hz, 1H), 2.32 (br, 1H), 1.26 (s, 3H), 1.05-2.25(m, 15H), 0.70-1.05 (m, 12H); HRMS (ESI-MS) : calcd for C72 H85 N6 O17 : 1305.5971 [M+H]+ ; found 1305.5935。
對對硝基苯基碳酸酯體(33.2mg, 0.0296mmol), HOBt(0.5mg, 0.0039mmol)的哌啶(80mL)-DMF(0.4mL)溶液於0度添加MMAE(14.1mg, 0.0197mmol)。將反應液於室溫攪拌10小時後，將反應液直接藉由LH20(氯仿/甲醇1/1)純化，而得到無色非晶質之Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(22.7mg, 68%)。 　　MS(MALDI-TOFMS) calcd for[C99 H132 N10 O15 +K]+ 1739.95; found 1741.37。
對Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (626mg, 0.368mmol)的DMF(3mL)溶液添加哌啶(110mL, 1.10mmol)，於室溫攪拌40分鐘。將反應液以LH20(氯仿/甲醇1/1)與HPLC(YMC T4000 10.0ml/min, CHCl3 :MeOH 4:1, 254nm)純化，而得到無色非晶質之H-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(458mg, 84%)。 　　MS(MALDI-TOFMS)calcd for [C94 H122 N10 O13 +K]+ 1519.02; found 1519.65。
對H-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (458mg, 0.309mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)於0度添加DIPEA(160ml, 0.927mmol)與Mal-PEG12 -OSu(295mg, 0.340 mmol)的二氯甲烷溶液(1ml)。將反應液於室溫攪拌22小時後，藉由LH20(氯仿/甲醇1/1)與分子篩回收HPLC(YMC T4000 10.0ml/min, CHCl3 , 254nm)進行純化，而得到無色非晶質之Mal-PEG12 -Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(498mg, 72%)。 　　MS(MALDI-TOFMS)calcd for[C118 H180 N12 O29 +K-Mmt]+ 1997.51; found 1999.49。
將Mal-PEG12 -Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(498mg, 0.223mmol)溶解於5% TFA二氯甲烷溶液(2ml)，添加甲醇(50ml)，於室溫攪拌1小時。將反應液直接藉由LH20(氯仿/甲醇1/1)，接著藉由HPLC(YMC T4000 10.0ml/min, CHCl3 , 254nm))純化，而得到無色非晶質之Mal-PEG12 -Val-Leu-Lys-OPABC-MMAE(440mg, 90%)。 　　MS(MALDI-TOFMS)calcd for[C98 H164 N12 O28 +K]+ 1997.51; found 1998.31。
其次，製作纖維蛋白孔盤。對細胞培養用96well孔盤，將25mg/ml纖維蛋白原溶液5μL添加於壁面。將凝血酶溶液1μl添加於各well，在40×g, 4℃之條件下進行1分鐘離心。於37℃使其反應2小時，其後，於4℃保存至使用前。
將5-11細胞株(取自TG小鼠之胰臟癌細胞)播種於以2000cells/well獲得的塗覆纖維蛋白之孔盤，於37℃培養一夜。作為培養液，係採用含有10%FBS的RPMI培養基。
將ADC以最終濃度成為0～25nM(MMAE換算)的方式調整稀釋系列。
血纖維蛋白溶酶原、tPA、α2-抗胞漿素的最終濃度係調整成與正常血漿中的濃度同等程度，亦即各為約1500nM、約0.3nM、約1000nM。 　　由纖維蛋白孔盤中去除培養液，添加90μl之包含血纖維蛋白溶酶原、tPA、α2-抗胞漿素的上述溶液，其後，添加10μl之ADC(圖中稱「Fbn-ADC」)之稀釋系列。作為對照組，係採用不溶性纖維蛋白抗體單質(圖中稱「IgG」)及使用抗4M-Tag抗體(對照IgG)作為圖3之抗體的ADC(圖中稱「Control-ADC」)。於37℃培養72小時，其後去除培養液，添加以CCK-8(同仁化學)：培養液=1:10之比例混合而成的反應液，於37℃培養3小時。由藉由A450所求得的光學密度曲線算出IC50 。
結果係如圖4所示。特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體的ADC顯示出癌症細胞的增生抑制效果，而對照組卻未觀察到顯著的腫瘤增生抑制效果。此表示：特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC結合於塗覆於孔盤的纖維蛋白；及其後連結子藉由胞漿素切斷，釋放出MMAE，而殺害腫瘤。特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC的IC50 為19nM。
實施例5：活體內之上述特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC的抗癌作用 　　本案發明人等假設，癌細胞一旦在體內增生，便會損傷包圍癌細胞的血管，而發生出血；而且，由此，為了止血，不溶性纖維蛋白便累積於腫瘤附近，若使用結合於累積之不溶性纖維蛋白的抗體，便可將抗癌劑傳遞至癌症周邊。本案發明人等又創造出新的抗癌劑概念，其係藉由對ADC的連結子導入胞漿素切斷部位，到達不溶性纖維蛋白的ADC被切斷，進一步藉由在不溶性纖維蛋白上經活化的胞漿素，依隨不溶性纖維蛋白地釋放出抗癌劑。本案發明人等假設，藉此，ADC依隨不溶性纖維蛋白地累積，而且釋放出抗癌劑，由此可提高癌特定性。
對上述P53、K-ras、P48之3重突變小鼠中具有自然發生之胰臟癌的模型(胰臟癌自然發生模型)驗證上述ADC的治療效果。將特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC，以0.3mg(MMAE換算)/kg體重/3～4日(即20mg(ADC換算)/kg體重/3～4日將ADC投予至模型，求出卡本-麥爾曲線。將對數秩檢定中的顯著水準設為0.05。作為對照ADC(圖中稱「Control-ADC」)，係使用抗4M-Tag抗體。
結果係如圖5所示。如圖5所示，ADC(圖中稱「αFbn-ADC」)對於對照組可顯著地改善胰臟癌自然發生模型的生存率。由此證實上述假設為正確者。
實施例6：具有纖維蛋白沉積之皮下腫瘤模型中之上述特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC的抗癌作用 　　於本實施例中，係使用由從上述三重突變體自然發生的胰臟癌建立細胞株，並將該細胞株進行皮下移植所得的皮下腫瘤模型，來驗證特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC的抗癌作用。
由從上述三重突變體自然發生的胰臟癌建立細胞株而命名為5-11。將5-11以5×105 個移植於BALB/C裸鼠的皮下而製成皮下移植模型。此皮下移植模型係於皮下具有纖維蛋白之沉積。對所得皮下腫瘤模型，以0.3mg (MMEA換算)/kg體重/3～4日(即20mg(ADC換算)/kg體重/3～4日投予特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體-ADC，觀察腫瘤體積增加率的推移。將ANOVA中的比較之顯著水準設為0.01。
結果係如圖6A所示。如圖6A所示，ADC(圖中稱「αFbn-ADC」)對於對照組可顯著地抑制腫瘤體積的增加。
皮下移植模型之體重變化的歷時推移係如圖6B所示。如圖6B所示，對於體重無顯著的增減，可知本發明之ADC可為副作用較少的治療藥。
其次與連結子不具有胞漿素切斷序列的情形比較抗腫瘤效果。 　　將44As3播種於以3000 cells/well獲得的塗覆及未塗覆纖維蛋白之孔盤，於37℃培養一夜。作為培養液，係使用含有10%FBS的RPMI培養基。 　　將使用組織蛋白酶連結子(具有纈胺酸-瓜胺酸)之ADC以及使用胞漿素連結子之ADC分別以最終濃度為0～3nM(MMAE換算)的方式調整稀釋系列。 　　血纖維蛋白溶酶原、tPA、α2-抗胞漿素的最終濃度係調整成與正常血漿中的濃度同比程度，亦即各為約150nM、約0.03nM、約100nM。 　　由各孔盤中去除培養液，添加90μl之包含血纖維蛋白溶酶原、tPA、α2-抗胞漿素的上述溶液，其後，將ADC之稀釋系列以10μl添加於各孔盤。於37℃培養72小時，其後，去除培養液，添加以CCK-8(同仁化學)：培養液=1:10之比例混合而成的反應液，於37℃培養2小時。由藉由A450所求得的光學密度曲線算出IC50 。
結果係如圖7所示。如圖7所示，相對於具有胞漿素切斷部位的上述ADC(圖中稱「胞漿素連結子」)，明確顯示出對腫瘤細胞的細胞增生抑制效果，為替代具有胞漿素切斷部位的連結子而替換成具有組織蛋白酶切斷部位的連結子之ADC(圖中稱「組織蛋白酶連結子」)，幾乎未看出對腫瘤細胞的細胞增生抑制效果。
由上述結果，如圖8所示，具備具胞漿素切斷部位的連結子之抗不溶性纖維蛋白抗體-細胞傷害劑複合體，會由血液循環傳遞至累積不溶性纖維蛋白的癌症周邊部，並於纖維蛋白附近以胞漿素切斷連結子部分，而將細胞傷害劑向癌症周邊放出。藉此，癌便與細胞傷害劑接觸。研判此為本案發明之ADC的作用機制。
癌症其惡化程度愈高則對組織的浸潤性愈高。浸潤於血管時會發生出血，如此一來便於出血部位形成不溶性纖維蛋白。本發明之ADC，研判對此種高惡化程度的癌症有效性特別高。又，若為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體，在使用其他的抗體時，研判ADC仍會同樣地發揮抗癌作用。
實施例7：抗體的序列解讀 　　將5×105 個細胞由100mm dish(Corning公司)移至15ml tube，以270×g、3分、4℃之條件進行離心。去除上清液後，添加1ml之RNAiso Plus(Takara Bio公司)，移至微量離心管，進行渦漩(vortex)。其後，於室溫下靜置5分鐘。由此細胞懸浮液，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)萃取出total RNA。對細胞懸浮液添加200μl的氯仿(Wako公司)，進行渦漩30秒，靜置3分鐘。其後以20,400×g、15分、4℃之條件進行離心，回收500μl的上清液。對回收之上清液添加500μl的70% EtOH，將此溶液移至RNeasy Mini spin column。以15,000×g、1min、室溫之條件進行離心，捨棄流過物，添加700μl的Buffer RW1(Qiagen公司)，以8,000×g、1min、室溫之條件進行離心。捨棄流過物，添加500μl的Buffer RPE(Qiagen公司)，以8,000×g、1min、室溫之條件進行離心。重複此洗淨3次，最終添加50μl的滅菌蒸餾水，以20,400×g、1min、室溫之條件進行離心，萃取出RNA。 　　使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Takara Bio公司)，由萃取出來的RNA合成cDNA。預先調製Buffer Mix(5×First-Strand buffer 2μl, 20mM DTT 1μl, 10mM dNTP Mix 1μl)，置於室溫下。在PCR用8連tube(Thermo Scientific公司)中量取1μl的5'-CDS primer-A，添加total RNA 300ng後，使用Nuclease-free Water定容至3.75μl。使該試樣使用ProFlex PCR system，於72℃進行3分鐘反應後，於42℃進行2分鐘反應。快速離心後，添加1μl的SMARTerIIA寡聚物。對此試樣添加混有4μl之Buffer Mix、0.25μl之RNase inhibitor、1μl之SMART Scribe Reverse Transcriptase的溶液。使用ProFlex PCR system，於42℃進行90分鐘反應後，於72℃進行10分鐘反應而合成出cDNA，其後，解讀cDNA的序列。所得抗體的序列如下。
由99殖株(99-5殖株)所得之mAb(小鼠IgG1)之重鏈可變區
由99殖株(99-5殖株)所得之mAb(小鼠IgG1)之輕鏈可變區
由1101殖株所得之mAb(小鼠IgG1)之重鏈可變區
由1101殖株所得之mAb(小鼠IgG1)之輕鏈可變區
由0211殖株所得之mAb(小鼠IgG2b)之重鏈可變區
由0211殖株所得之mAb(小鼠IgG2b)之輕鏈可變區
序列表 　　序列編號1～3　　分別對應99抗體之重鏈CDR1～3 　　序列編號4　　　對應99抗體之重鏈可變區(胺基酸編號1～19為訊息序列) 　　序列編號5～7　　分別對應99抗體之輕鏈CDR1～3 　　序列編號8　　　對應99抗體之輕鏈可變區(胺基酸編號1～19為訊息序列) 　　序列編號9～11　　分別對應1101抗體之重鏈CDR1～3 　　序列編號12　　對應1101抗體之重鏈可變區(胺基酸編號1～19為訊息序列) 　　序列編號13～15　分別對應1101抗體之輕鏈CDR1～3 　　序列編號16　　對應1101抗體之輕鏈可變區(胺基酸編號1～27為訊息序列) 　　序列編號17～19　分別對應0211抗體之重鏈CDR1～3 　　序列編號20　　對應0211抗體之重鏈可變區(胺基酸編號1～19為訊息序列) 　　序列編號21～23　分別對應0211抗體之輕鏈CDR1～3 　　序列編號24　　對應0211抗體之輕鏈可變區(胺基酸編號1～20為訊息序列) 　　序列編號25　　人類纖維蛋白Bβ鏈 　　序列編號26　　作為99之免疫原使用之人類纖維蛋白Bβ鏈片段 　　序列編號27　　作為1101之免疫原使用之人類纖維蛋白Bβ鏈片段 　　序列編號28　　可作為免疫原而利用之人類纖維蛋白Bβ鏈片段(No.2胜肽)
圖1係表示本發明中所得之抗體為特殊針對不溶性纖維蛋白之抗體。 　　圖2係表示本發明中所得之特殊針對不溶性纖維蛋白之單株抗體會累積於腫瘤形成部。 　　圖3係表示本發明中所製作之抗體藥物複合體之尤為藥物部位及連結子部位者。 　　圖4係表示使用本發明中所製作之抗體藥物複合體之於活體外的抗癌作用的驗證結果。 　　圖5係表示本發明中所製作之抗體藥物複合體針對胰臟癌自然發生模型的卡本-麥爾曲線。 　　圖6A係表示本發明中所製作之抗體藥物複合體對腫瘤之皮下移植小鼠的腫瘤體積之增加的抑制效果。 　　圖6B係表示圖6A所觀察之小鼠的體重的歷時變化。 　　圖7係表示具有：具胞漿素切斷部位之胞漿素連結子與不具胞漿素切斷部位，取而代之具有組織蛋白酶切斷部位之組織蛋白酶連結子之ADC的細胞增生抑制作用。 　　圖8係表示本發明中所製作之抗體藥物複合體所推定的作用機制。

Claims (11)

  1. 一種抗體-藥物複合體(ADC)，其中， 　　抗體為結合於纖維蛋白之抗體，其對不溶性纖維蛋白之親和性係高於對纖維蛋白原之親和性， 　　藥物為細胞傷害劑， 　　抗體與藥物係經由連結子連結，該連結子係具有胞漿素切斷部位以便可藉由胞漿素切斷。
  2. 如請求項1之ADC，其中連結子係具有纈胺酸-白胺酸-離胺酸之胜肽序列作為胞漿素切斷部位。
  3. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項1或2之ADC，且供用於治療癌症。
  4. 如請求項3之醫藥組成物，其中癌症為浸潤性癌。
  5. 一種抗體；或者與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體；或此等之抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號1所示之CDR1、序列編號2所示之CDR2、與序列編號3所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號5所示之CDR1、序列編號6所示之CDR2、與序列編號7所示之CDR3。
  6. 或其抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號4所示之重鏈可變區、與序列編號8所示之輕鏈可變區。
  7. 一種抗體；或者與該抗體在與纖維蛋白結合上競爭之抗體；或此等之抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　重鏈可變區，其係具有：序列編號9所示之CDR1、序列編號10所示之CDR2、與序列編號11所示之CDR3；及 　　輕鏈可變區，其係具有：序列編號13所示之CDR1、序列編號14所示之CDR2、與序列編號15所示之CDR3。
  8. 或其抗原結合性片段，其中， 　　該抗體為結合於纖維蛋白之抗體，且具有： 　　序列編號12所示之重鏈可變區、與序列編號16所示之輕鏈可變區。
  9. 如請求項1或2之ADC，其中抗體為如請求項5～8中任一項之抗體。
  10. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項9之ADC。
  11. 如請求項10之醫藥組成物，其係供用於治療癌症。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020348876A1 (en) * 2019-09-19 2022-04-07 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
JPWO2021200922A1 (zh) * 2020-03-31 2021-10-07
CA3178880A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 National Cancer Center Fibrin-binding antibody and pharmaceutical composition containing antibody
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TW202405178A (zh) * 2022-04-08 2024-02-01 日商凜研究所股份有限公司 與纖維蛋白結合的抗體及含有該抗體的纖維蛋白溶解性蛋白質以及含有該蛋白質的醫藥製劑

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3177776B2 (ja) * 1988-09-27 2001-06-18 武田薬品工業株式会社 ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤
EP0710720A1 (en) 1988-06-13 1996-05-08 American Biogenetic Sciences, Inc. Method for the production of monoclonal antibodies utilizing a germfree animal
CN101073668A (zh) * 1999-04-28 2007-11-21 德克萨斯大学董事会 用于通过选择性抑制vegf来治疗癌症的组合物和方法
CN1531554A (zh) 2001-06-26 2004-09-22 ��������ҽѧ���޹�˾ 血纤维蛋白d-二聚体片段特异性的、来源于dd-3b6/22的人源化抗体
JP5593488B2 (ja) * 2008-11-17 2014-09-24 独立行政法人国立がん研究センター 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
LT2483416T (lt) * 2009-10-02 2017-04-25 The Regents Of The University Of California Monokloniniai antikūnai
JP2012000072A (ja) 2010-06-18 2012-01-05 Japan Health Science Foundation 新規な抗フィブリン抗体
EP3339327A3 (en) * 2013-02-28 2018-09-19 National Cancer Center Antibody against insoluble fibrin
CA2914438C (en) * 2013-07-23 2022-06-14 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
WO2016167227A1 (ja) 2015-04-13 2016-10-20 国立研究開発法人国立がん研究センター 不溶性フィブリンに対する抗体

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