RU2810114C2 - Тиазолопиридиновые производные в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к конкретным тиазолопиридиновым производным, указанным в пункте 1 формулы изобретения, а также к фармацевтичекому препарату и лекарственному средству на основе указанных производных для ингибирования аденозиновых рецепторов А_2А и/или А_2В. Технический результат – получены новые соединения и лекарственное средство на их основе, которые могут найти применение в медицине для лечения или предотвращения гиперпролиферативных или инфекционных заболеваний и нарушений. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 10 табл., 10 пр.

Description

Изобретение относится к тиазолопиридиновым производным, которые подпадают под общую формулу I

,

и применению соединений настоящего изобретения для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных или инфекционных заболеваний и нарушений у млекопитающих, в особенности, людей, и фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения.

Предпосылки создания изобретения

Аденозин является распространенным модулятором многочисленных физиологических действий, особенно в сердечно-сосудистой, нервной и иммунной системах. Аденозин связан как структурно, так и метаболически с биоактивными нуклеотидами: аденозинтрифосфатом (АТФ), аденозиндифосфатом (АДФ), аденозинмонофосфатом (АМФ) и циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ), с биохимическим метилирующим агентом S-аденозил-L-метионом (SAM) и структурно с коферментами NAD, FAD и коферментом А и с РНК.

Через рецепторы клеточной поверхности аденозин модулирует различные физиологические функции, включая индукцию седации, вазодилатацию, подавление сердечного ритма и сократительной способности, ингибирование агрегации тромбоцитов, стимуляцию глюконеогенеза и ингибирование липолиза.

Исследования показывают, что аденозин способен активировать аденилатциклазы, открывать калиевые каналы, уменьшать поток через кальциевые каналы и ингибировать или стимулировать обмен фосфоинозитидов с помощью рецептор-опосредованных механизмов (Muller СЕ и Stein В., Current Pharmaceutical Design, 2: 501, 1996; Muller СЕ, Exp.Opin. Ther. Patents, 7 (5): 419, 1997).

Аденозиновые рецепторы принадлежат к суперсемейству рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCR). Четыре основных подтипа аденозиновых рецепторов были фармакологически, структурно и функционально охарактеризованы (Fredholm и др., Pharm. Rev., 46: 143-156, 1994) и названы как A₁, А_2А, А_2В и A₃. Хотя один и тот же аденозиновый рецептор может связываться с разными G-белками, аденозиновые рецепторы A₁ и А₃ обычно связываются с ингибирующими G-белками, называемыми G_i и G₀, которые ингибируют аденилатциклазу и понижающе регулируют уровни цАМФ в клетках. В отличие от этого, аденозиновые рецепторы А_2А и А_2В сопряжены со стимулирующими G-белками, называемыми G_s, которые активируют аденилатциклазу и повышают уровни цАМФ в клетках (Linden J., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 41: 775-87 2001).

В соответствии с изобретением, "лиганды, селективные к аденозиновым рецепторам" представляют собой вещества, которые селективно связываются с одним или несколькими подтипами аденозиновых рецепторов, таким образом либо имитируя действие аденозина (агонисты аденозина), либо блокируя его действие (антагонисты аденозина). В соответствии с их рецепторной селективностью, лиганды, селективные к аденозиновым рецепторам, можно разделить на различные категории, например, лиганды, которые селективно связываются с рецепторами A₁ или А₂, а в случае последних также, например, те, которые селективно связываются с рецепторами A_2A или A_2B. Также возможны лиганды аденозиновых рецепторов, которые селективно связываются с множеством подтипов аденозиновых рецепторов, например, лиганды, которые селективно связываются с A₁ и А₂, но не с рецепторами А₃. Селективность вышеупомянутых рецепторов может быть определена по воздействию веществ на клеточные линии, которые после стабильной трансфекции соответствующей кДНК, экспрессируют рассматриваемые подтипы рецепторов (Olah, М.Е. и др., J. Biol. Chem., 267: 10764-10770, 1992). Влияние веществ на такие клеточные линии можно контролировать с помощью биохимического измерения внутриклеточного мессенджера цАМФ (Klotz, K.N. и др., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 357: 1-9, 1998).

Известно, что система рецептора A1 включает активацию фосфолипазы С и модуляцию как калиевых, так и кальциевых ионных каналов. Подтип А₃, помимо своей ассоциации с аденилатциклазой, также стимулирует фосфолипазу С и, таким образом, активирует кальциевые ионные каналы.

Рецептор A₁ (326-328 аминокислот) был клонирован из различных видов (псовые, человек, крысы, собака, цыпленок, крупный рогатый скот, морская свинка) с 90-95% последовательностью, идентифицированной среди видов млекопитающих. Рецептор А_2А (409-412 аминокислот) был клонирован из псовых, крыс, человека, морской свинки и мыши. Рецептор А_2В (332 аминокислоты) был клонирован из человека и мыши с 45% гомологией A_2B человека с человеческими рецепторами A₁ и A_2A. Рецептор А3 (317-320 аминокислот) был клонирован из человека, крысы, собаки, кролика и овцы.

Предполагается, что подтипы рецепторов A₁ и A_2A играют взаимодополняющие роли в регуляции аденозинового энергоснабжения. Аденозин, который является продуктом метаболизма АТФ, диффузирует из клетки и действует локально, активируя аденозиновые рецепторы, уменьшая потребность в кислороде (A₁ и А₃) или увеличивая снабжение кислородом (A_2A), и таким образом восстанавливая баланс энергообеспечения/энергопотребления в тканях. Действия обоих подтипов заключаются в увеличении количества кислорода, доступного ткани, и защите клеток от повреждения, вызванного кратковременным дисбалансом кислорода. Одной из важных функций эндогенного аденозина является предотвращение повреждений при травмах, таких как гипоксия, ишемия, гипотензия и судорожная активность. Кроме того, известно, что связывание агониста аденозинового рецептора с тучными клетками, экспрессирующими рецептор А₃ крысы, приводило к повышению концентраций инозитолтрифосфата и внутриклеточного кальция, что усиливало антиген-индуцированную секрецию медиаторов воспаления. Следовательно, рецептор А₃ играет роль в опосредовании приступов астмы и других аллергических реакций.

Эти аденозиновые рецепторы кодируются различными генами и классифицируются по их сродству с аналогами аденозина и антагонистами метилксантина (Klinger и др., Cell Signal., 14 (2): 99-108, 2002).

Касательно роли аденозина в нервной системе, то были сделаны первые наблюдения о влиянии кофеина, который является наиболее широко используемым из всех психоактивных лекарственных веществ. На самом деле кофеин - это известный антагонист аденозинового рецептора, который способен повысить восприятие и способность к обучению млекопитающих. Путь аденозинового рецептора А_2А отвечает за эти эффекты (Fredholm и др., Pharmacol. Rev., 51 (1): 83-133, 1999; Huang и др., Nat Neurosci., 8 (7): 858-9, 2005), и влияние кофеина на сигнальный путь аденозинового рецептора A_2A стимулировало исследование высокоспецифических и сильнодействующих антагонистов аденозинового A_2A.

У млекопитающих аденозиновые рецепторы A_2A имеют ограниченное распределение в мозге и обнаруживаются в стриатуме, обонятельном бугорке и прилежащем ядре (Dixon и др., Br. J. Pharmacol., 118 (6): 1461-8, 1996). Высокие и промежуточные уровни экспрессии могут наблюдаться в иммунных клетках, сердце, легких и кровеносных сосудах. В периферической системе G₃, по-видимому, является основным G-белком, связанным с аденозиновым рецептором A_2A, но в стриатуме было показано, что стриарные аденозиновые рецепторы A_2A опосредуют свое действие посредством активации G-белка, называемого G_oif (KuIl и др., MoI. Pharmacol., 58 (4): 772-7, 2000), который подобен G₃ и также связан с аденилатциклазой.

На сегодняшний день исследования генетически модифицированных мышей и фармакологический анализ показывают, что рецептор A_2A является многообещающей терапевтической мишенью для лечения нарушений центральной нервной системы (ЦНС) и таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ), удар (ишемическая черепно-мозговая травма) и болезнь Альцгеймера (Fredholm и др., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45: 385-412, 2005; Higgins и др.; Behav. Brain Res. 185: 32-42, 2007; DaIl' Igna и др., Exp. Neurol., 203 (1): 241-5, 2007; Arendash и др., Neuroscience, 142 (4): 941-52, 2006; Trends in Neurosci., 29 (11), 647-654, 2006; Expert Opinion Ther. Patents, 17, 979-991, 2007; Exp. Neurol., 184 (1), 285-284, 2003; Prog. Brain Res, 183, 183-208, 2010; J. Alzheimer Dis., Suppl 1, 1 17-126, 2010; J. Neurosci., 29 (47), 14741-14751, 2009; Neuroscience, 166 (2), 590-603, 2010; J. Pharmacol. Exp.Ther., 330 (1), 294-303, 2009; Frontiers Biosci., 13, 2614-2632, 2008), а также для лечения различных психозов органического происхождения (Weiss и др., Neurology, 61 (11 Suppl 6): 88-93, 2003).

Применение аденозиновых рецепторов А_2А у нокаутных мышей показало, что инактивация аденозинового рецептора А_2А защищает от гибели нейрональных клеток, вызванной ишемией (Chen и др., J. Neurosci., 19 (21): 9192-200, 1999 и Monopoli и др., Neuroreport, 9 (17): 3955-9, 1998) и митохондриальным токсином 3-NP (Blum и др., J. Neurosci., 23 (12): 5361-9, 2003). Эти результаты послужили основой для лечения ишемии и болезни Хантингтона с помощью антагонистов аденозинового А_2А. Блокада аденозиновых рецепторов А_2А оказывает также антидепрессивное действие (El Yacoubi и др., Neuropharmacology, 40 (3): 424-32, 2001). В заключение, эта блокада предотвращает дисфункцию памяти (Cunha и др., Exp.Neurol., 210 (2): 776-81, 2008; Takahashi и др., Front. Biosci., 13: 2614-32, 2008), и это может быть перспективным терапевтическим путем для лечения и/или предотвращения болезни Альцгеймера.

Для обзора относительно аденозиновых рецепторов А_2А см., например, Moreau и др. (Brain Res. Reviews 31: 65-82, 1999) и Svenningsson и др. (Progress in Neurobiology 59: 355-396, 1999).

На сегодняшний день несколько антагонистов аденозиновых рецепторов А_2А продемонстрировали многообещающий потенциал для лечения болезни Паркинсона. В качестве примера, KW-6002 (истрадефиллин) завершил клиническое испытание III фазы в США после того, как исследования продемонстрировали его эффективность в смягчении симптомов заболевания (Bara-Himenez и др., Neurology, 61 (3): 293-6, 2003 и Hauser и др., Neurology, 61 (3): 297-303, 2003). SCH420814 (преладенант) в настоящее время находится на II фазе клинического испытания в США и обеспечивает улучшение моторной функции на животных моделях болезни Паркинсона (Neustadt и др., Bioorg. Med. Chem. Lett., 17 (5): 1376- 80, 2001), а также у пациентов-людей (Hunter J.С, poster Boston 2006 - http://www.a2apd.org/Speakerabstracts/Hunter.pdf).

Помимо полезности антагонистов рецепторов А_2А для лечения нейродегенеративных заболеваний, эти соединения были рассмотрены в качестве полезных для применения при дополнительных симптоматических показаниях. Это основано на доказательствах того, что активация рецептора A_2A может способствовать патофизиологии ряда психоневрологических нарушений и дисфункций, таких как депрессия, чрезмерная дневная сонливость, синдром беспокойных ног, синдром дефицита внимания и гиперактивности и когнитивная усталость (Neurology, 61 (Suppl 6), 82-87, 2003; Behav. Pharmacol., 20 (2), 134-145, 2009; CNS Drug Discov., 2 (1), 1-21, 2007).

Некоторые авторы предлагают применение антагонистов A_2A для лечения диабета (WO1999035147; WO2001002400). Другие исследования предполагают участие аденозиновых рецепторов A_2A в заживлении ран или мерцательной аритмии (Am. J. Path., 6, 1774-1778, 2007; Arthritis & Rheumatism, 54 (8), 2632-2642, 2006).

Некоторые из сильнодействующих антагонистов аденозиновых рецепторов A_2A, обнаруженных в прошлом фармацевтическими компаниями, перешли в клинические испытания, показывающие положительные результаты и демонстрирующие потенциал этого класса соединений для лечения нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Паркинсона, Хантингтона или Альцгеймера, а также при других заболеваниях, связанных с ЦНС, таких как депрессия, синдром беспокойства, нарушение сна и тревожное расстройство (Clin. Neuropharmacol., 33, 55-60, 2010; J. Neurosci., 30 (48), 2010), 16284-16292; Parkinson Relat. Disord., 16 (6), 423-426, 2010; Expert Opinion Ther. Patents, 20(8), 987-1005, 2010; Current Opinion in Drug Discovery & Development, 13 (4), 466-480, 2010 и ссылки в данной заявке; Mov. Disorders, 25 (2), S305, 2010).

Известными ингибиторами A_2A являются истрадефиллин (KW-6002), преладенант (SCH420814), SCH58261, CGS15943, тозаденант, випаденант (V-2006), V-81444 (CPI-444, HTL-1071, PBF-509, Medi-9447, PNQ-370, ZM-241385, ASO-5854, ST-1535, ST-4206, DT1133 и DT-0926, которые в большинстве случаев разработаны для лечения болезни Паркинсона.

Аденозиновые рецепторы A_2B были клонированы из гипоталамуса крысы (Rivkees и Reppert, 1992), гиппокампа человека (Pierce и др., 1992) и тучных клеток мыши (Marquardt и др., 1994) с использованием стандартных методов полимеразной цепной реакции с вырожденными олигонуклеотидными праймерами, предназначенными для распознавания консервативных областей большинства рецепторов, сопряженных с G-белком. Человеческий рецептор A_2B имеет от 86 до 87% гомологии аминокислотной последовательности с рецепторами A_2B крысы и мыши (Rivkees and Reppert, 1992; Pierce и др., 1992; Marquardt и др., 1994) и 45% гомологии аминокислотной последовательности с человеческими рецепторами A₁ и A_2A. Как и ожидалось для близкородственных видов, крысиные и мышиные рецепторы A_2B имеют 96% гомологию аминокислотной последовательности. Для сравнения, общая аминокислотная идентичность между рецепторами A₁ различных видов составляет 87% (Palmer и Stiles, 1995). Рецепторы A_2A имеют 90% гомологии между видами (Ongini и Fredholm, 1996), при этом большинство различий наблюдается во 2-й внеклеточной петле и длинном С-концевом домене (Palmer и Stiles, 1995). Самая низкая (72%) степень идентичности между видами наблюдается для последовательностей рецептора A₃ (Palmer и Stiles, 1995).

Аналог аденозина NECA остается наиболее мощным агонистом A_2B (Bruns, 1981; Feoktistov and Biaggioni, 1993, 1997; Brackett и Daly, 1994), с концентрацией, вызывающей полумаксимальный эффект (ЕС₅₀) для стимуляции аденилциклазы приблизительно 2 мкМ. Это, однако, неселективно и активирует другие аденозиновые рецепторы с еще большей аффинностью, со значением ЕС₅₀ в низком наномолярном (A₁ и A_2A) или высоком наномолярном (A₃) диапазоне. Поэтому определение характеристик рецепторов А_2В часто зависит от недостаточной эффективности соединений, которые являются сильными и селективными агонистами других типов рецепторов. Рецепторы A_2B были охарактеризованы методом исключения, то есть отсутствием эффективности агонистов, специфичных для других рецепторов. Селективный агонист А_2А CGS-21680 (Webb и др., 1992), например, был полезен для дифференциации между аденозиновыми рецепторами A_2A и A_2B (Hide и др., 1992; Chern и др., 1993; Feoktistov and Biaggioni, 1995; van der Ploeg и др., 1996). Оба рецептора положительно связаны с аденилциклазой и активируются неселективным агонистом NECA. CGS-21680 практически неэффективен в отношении рецепторов A_2B, но все же эффективен, как NECA, в активации рецепторов A_2A, со значением ЕС₅₀ в низком наномолярном диапазоне для обоих агонистов (Jarvis и др., 1989; Nakane и Chiba, 1990; Webb и др., 1992; Hide и др., 1992; Feoktistov и Biaggioni, 1993; Alexander и др., 1996). Рецепторы A_2B также имеют очень низкое сродство с A₁-селективным агонистом R-PIA (Feoktistov and Biaggioni, 1993; Brackett и Daly, 1994), а также с А₃-селективным агонистом N⁶-(3-йодбензил)-N-метил-5'-карбамоиладенозином (IB-MECA) (Feoktistov и Biaggioni, 1997). Профиль агонистов NECA>R-PIA=IB-MECA>CGS-21680 определяли в клетках эритролейкемии человека (HEL) для A_2B-опосредованного накопления цАМФ. Разница между ЕС₅₀ для NECA и остальных агонистов составляет приблизительно 2 порядка величин. Поэтому ответы, вызванные NECA при концентрациях в низком микромолярном диапазоне (110 мкМ), но не R-PIA, IB-MECA или CGS-21680, характерны для рецепторов A_2B.

В то время как рецепторы A_2B в общем имеют более низкое сродство с агонистами по сравнению с другими подтипами рецепторов, это не относится к антагонистам. Зависимость активности от структуры аденозиновых антагонистов на рецепторы А_2В не была полностью охарактеризована, но по крайней мере некоторые ксантины являются такими же или более сильными антагонистами подтипов рецепторов A_2B, чем других подтипов. В частности, DPSPX (1,3-дипропил-8-сульфофенилксантин), DPCPX (1,3-дипропил-8-циклопентилксантин), DPX (1,3-диэтилфенилксантин), противоастматическое лекарственное вещество энпрофиллин (3-н-пропилксантин) и нексантиновое соединение 2,4-диоксобензоптеридин (аллоксазин) имеют сродство в нМ диапазоне от средних до высоких значений.

Другими известными ингибиторами А_2В являются ATL801, PSB-605, PSB-1115, ISAM-140, GS6201, MRS1706 и MRS1754.

В данной заявке раскрыто, что аденозиновые рецепторы играют нередундантную роль в понижающей регуляции воспаления in vivo, действуя как физиологический "СТОП" (механизм прекращения), который может ограничивать иммунный ответ и тем самым защищать нормальные ткани от чрезмерного иммунного повреждения во время патогенеза различных заболеваний.

Антагонисты рецепторов A_2A обеспечивают долгосрочное усиление иммунных ответов путем уменьшения опосредованной Т-клетками переносимости антигенных стимулов, усиления индукции Т-клеток памяти и повышения эффективности введения пассивных антител для лечения злокачественного новообразования и инфекционных заболеваний, в то время как агонисты рецепторов A_2A обеспечивают длительное снижение иммунных ответов путем повышения переносимости, опосредованной Т-клетками, антигенных стимулов, в частности, для снижения использования иммунодепрессантов в определенных условиях.

Иммуномодуляция является критическим аспектом лечения ряда заболеваний и нарушений. В особенности, Т-клетки играют жизненно важную роль в борьбе с инфекциями и обладают способностью распознавать и уничтожать злокачественные клетки. Усиление опосредованных Т-клетками ответов является ключевым компонентом для усиления ответов на терапевтические средства. Однако для иммуномодуляции крайне важно, чтобы любое усиление иммунного ответа было сбалансировано с необходимостью предотвращения аутоиммунитета, а также хронического воспаления. Хроническое воспаление и самораспознавание Т-клетками является основной причиной патогенеза системных нарушений, таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и системная красная волчанка. Кроме того, для предотвращения отторжения пересаженных органов или трансплантатов требуется длительная иммуносупрессия.

Иммуносупрессия, индуцированная опухолью, является основным препятствием для эффективности современных методов лечения злокачественных новообразований. Из-за их замечательной клинической эффективности против более широкого спектра злокачественных новообразований, недавние успехи с ингибиторами блокады иммунных контрольных точек, такими как анти-CTLA-4 и анти-PD-1/PDL1, представляют собой революционное лечение злокачественных заболеваний.

Аденозин является одной из новых перспективных иммуносупрессивных мишеней, выявленных в доклинических исследованиях. Этот метаболит вырабатывается эктоэнзимом CD73, экспрессируемым на клетках-супрессорах хозяина и опухолевых клетках. Повышенная экспрессия CD73 коррелирует с плохим прогнозом у пациентов с рядом видов злокачественных новообразований, включая колоректальный рак (Liu и др., J. Surgical Oncol, 2012), рак желудка (Lu и др., World J. Gastroenterol., 2013), рак желчного пузыря (Xiong и др., Cell and Tissue Res., 2014). Доклинические исследования продемонстрировали, что проопухолевые эффекты CD73 могут быть вызваны (по крайней мере частично) аденозин-опосредованной иммуносупрессией. Как раскрыто выше, аденозин связывается с четырьмя известными рецепторами A₁, А_2А, А_2В и А₃, с активацией рецепторов A_2A и A_2B, которые, как известно, подавляют эффекторные функции многих иммунных клеток, то есть, рецепторы А_2А и A_2B индуцируют аденилат-циклаз-зависимое накопление цАМФ, что приводит к иммуносупрессии. Поскольку антагонизирование A₁ и A₃ будет противодействовать желаемому эффекту, а агонисты A₁ и A₃ служат потенциальными кардиозащитными агентами, необходимо достичь селективности по отношению к A₁ и A₃ (Antonioli и др., Nat. rev. Cancer, 2013, Thiel и др., Microbes и Infection, 2003). Было продемонстрировано, что в микроокружении опухоли активация рецепторов, как A_2A, так и A_2B, подавляет противоопухолевый иммунитет и увеличивает распространение опухолей CD73. Кроме того, блокада A_2A или A_2B низкомолекулярными антагонистами может уменьшить метастазирование опухоли. Было обнаружено, что блокирование рецептора A_2A может преодолеть механизмы ускользания опухоли, включая как анергию, так и регуляторную индукцию Т-клеток, вызванную опухолевыми клетками, и вызывать долговременную восприимчивость опухоли к лечению. Ohta и др. продемонстрировали отторжение приблизительно 60% установленных опухолей меланомы CL8-1 у мышей с дефицитом рецептора A_2A по сравнению с отсутствием отторжения у нормальных мышей (Ohta, и др.; PNAS 103 (35): 13132-7, 2006). В соответствии с этим, исследователи также показали улучшенное ингибирование роста опухоли, разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации противоопухолевыми Т-клетками после лечения антагонистом рецептора A_2A.

Было продемонстрировано, что опухоли избегают повреждения иммунной системой, препятствуя активации Т-клеток за счет ингибирования костимуляторных факторов в семействах B7-CD28 и TNF, а также путем привлечения регуляторных Т-клеток, которые ингибируют противоопухолевые Т-клеточные ответы (Wang, Cancer. Semin. Cancer. Biol. 16: 73-79, 2006; Greenwald и др., Ann. Rev. Immunol. 23: 515-48, 2005; Watts, Ann. Rev. Immunol. 23: 23-68, 2005; Sadum и др., Clin. Cane. Res. 13 (13): 4016-4025, 2007). Поскольку экспрессия рецептора A_2A увеличивается в лимфоцитах после активации, методы терапии, которые высвобождают ответы эффекторных лимфоцитов, такие как терапия анти-CTLA-4 и анти-PD-1, могут также усиливать эффекты A_2A-опосредованной иммуносупрессии. Иммунная блокада контрольных точек в сочетании с антагонистами A_2A или двойными антагонистами A_{2A/2 В} увеличивает величину иммунных ответов на опухоли и метастазы. Соответственно, комбинация ингибирования A_2A с терапией анти-PD-1 усиливает продуцирование IFN-γ Т-клетками в совместной культуре с опухолевыми клетками МС38, улучшает выживаемость мышей в модели опухоли молочной железы 4Т1 и уменьшает рост опухоли в опухолях AT-3ova^dim CD73⁺. (Beavis и др., Cancer Immunol. Res., 2015; Mittal и др., Cancer Res., 2014).

Кроме того, доклинические исследования показали, что ингибирование A_2B приводит к снижению роста опухоли и увеличению выживаемости мышей в моделях карциномы легких Льюиса, карциномы мочевого пузыря МВ49, карциномы молочной железы орто-4Т1 (Ryzhov и др., 2009, Cekic и др., 2012), и комбинация ингибирования A_2B с анти-PD-1 терапией уменьшает метастазы в легкие опухолей B16-F10 меланомы и улучшает выживаемость мышей в модели опухоли молочной железы 4Т1.

В WO 03/050241 описаны способы усиления иммунного ответа на антиген, повышения эффективности вакцины или усиления иммунного ответа на опухолевый антиген, или разрушения опухоли, опосредованного иммунными клетками, путем введения агента, который ингибирует внеклеточный аденозин или ингибирует аденозиновые рецепторы.

WO 2004/089942, WO 2005/000842 и WO 2006/008041 раскрывают бензотиазольные производные, включая тозаденант, в качестве ингибиторов А_2А для лечения болезни Паркинсона. WO 2004/092171 и WO 2005/028484 раскрывают подобные производные тиазолопиридина и пиразолопиримидина также в качестве ингибиторов A_2A для лечения болезни Паркинсона. Однако эти соединения не проявляют значительной ингибирующей активности на А_2В и показывают только хорошие фармакокинетические свойства у крыс, животных моделях болезни Паркинсона, но не у мышей, и животных моделях злокачественного новообразования. Кроме того, соединения не показывают, что они способны предотвращать иммуносупрессию и, следовательно, способны поддерживать индуцированное противораковыми Т-клетками ингибирование роста опухоли, уменьшение или разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации.

Таким образом, остается потребность в способах лечения, которые обеспечивают долгосрочное усиление иммунных ответов на специфические антигены, особенно для лечения и предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, и, таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в обеспечении способов лечения, которые позволили бы упростить протоколы лечения и улучшить иммунные ответы в отношении определенных антигенов. Конкретная задача изобретения состояла в обеспечении улучшенных способов предотвращения или лечения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений у хозяина, в особенности, в обеспечении эффективных антагонистов A_2A или двойных антагонистов A_2A/_2B для лечения и предотвращения таких заболеваний. Краткое описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что соединения в соответствии с изобретением являются высокоэффективными ингибиторами аденозинового рецептора A_2A или аденозиновых рецепторов А_2А и А_2В, и в то же время имеют высокую селективность к ним по сравнению с аденозиновыми рецепторами A₁ и A₃, и, таким образом, соединения настоящего изобретения могут применяться для лечения гиперпролиферативных заболеваний и нарушений, таких как злокачественное новообразование и инфекционные заболевания и нарушения.

В частности, в отличие от известного антагониста аденозинового рецептора A_2A тозаденанта и подобных бензотиазольных производных, соединения настоящего изобретения неожиданно проявляют двойную активность A_2A/A_2B, которая является предпочтительной для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше, или соединения настоящего изобретения демонстрируют, по меньшей мере, высокую ингибирующую активность на A_2A вместе с другими раскрытыми в данной заявке неожиданными преимуществами, которые приводят к высокой эффективности в лечении и/или предотвращении гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений.

Кроме того, в отличие от известного антагониста аденозинового рецептора A_2A тозаденанта и подобных бензотиазольных производных, соединения настоящего изобретения неожиданно демонстрируют лучшие фармакокинетические свойства у мыши как у животной модели, актуальной для злокачественного новообразования, что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше.

Кроме того, как отмечалось выше, аденозин в микроокружении опухоли может ингибировать активность Т-клеток путем передачи сигналов через рецепторы А_2А и подавлять секрецию цитокинов Т-клетками. А_2А-специфические агонисты, такие как CGS-21680 или NECA, как и аденозин, ингибируют секрецию цитокинов Т-клетками in vitro и in vivo. В отличие от этого, потенциальные антагонисты А_2А или двойные антагонисты А_2А/A_2B могут спасти Т-клетки от этого ингибирования. В отличие от известного антагониста аденозинового рецептора А_2А тозаденанта, соединения настоящего изобретения демонстрируют, что они способны спасти Т-клетки от ингибирования и способны предотвратить подавление секреции цитокинов, индуцированное аденозином или А_2А-специфическими агонистами, такими как CGS-2168, CGS-21680 или NECA, что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше. Таким образом, соединения настоящего изобретения неожиданно способны предотвращать иммуносупрессию и, следовательно, способны поддерживать индуцированное противораковыми Т-клетками ингибирование роста опухоли, уменьшение или разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации.

Изобретение относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из:

и его физиологически приемлемым солям, производным, сольватам, пролекарствам и стереоизомерам, включая их смеси во всех соотношениях. Соединения настоящего изобретения подпадают под общую формулу I

,

в которой

R¹ означает линейный или разветвленный алкил, содержащий 1-10 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁵ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO- -NHCONH-, -NHCO-NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или моно- или бициклический циклический алкил, содержащий 3-7 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁵ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или моно- или бициклический гетероарил, гетероциклил, арил или циклический алкиларил, содержащий от 3 до 14 атомов углерода и 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из N, О и S, который не замещен или моно-, ди- или тризамещен посредством R⁵,

R² означает линейный или разветвленный алкил, содержащий 1-10 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁵ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или циклический алкил, содержащий 3-7 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁵ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH- и/или, кроме того, 1-11 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или моно- или бициклический гетероарил, гетероциклил, арил или циклический алкиларил, содержащий от 3 до 14 атомов углерода и 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из N, О и S, который не замещен или моно-, ди- или тризамещен посредством R⁵,

R³ означает линейный или разветвленный алкил или О-алкил, содержащий 1-6 атомов С, или циклический алкил, содержащий 3-6 атомов С, который незамещен или моно-, ди- или тризамещен посредством Н, =S, =NH, =O, ОН, циклического алкила, содержащего 3-6 атомов С, СООН, Hal, NH₂, SO₂CH₃, SO₂NH₂, CN, CONH₂, NHCOCH₃, NHCONH₂ или NO₂,

R⁴ означает H, D, линейный или разветвленный алкил, содержащий 1-6 атомов С, CN или Hal,

R⁵ означает H, R⁶, =S, =NR⁶, =O, OH, COOH, Hal, NH₂, SO₂CH₃, SO₂NH₂, CN, CONH₂, NHCOCH₃, NHCONH₂, NO₂ или линейный или разветвленный алкил, содержащий 1-10 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁶ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или моно- или бициклический циклический алкил, содержащий 3-7 атомов С, который является незамещенным или моно-, ди- или тризамещенным посредством R⁶ и в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -NR⁶SO₂R⁷-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl, или моно- или бициклический гетероарил, гетероциклил, арил или циклический алкиларил, содержащий от 3 до 14 атомов углерода и 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из N, О и S, который не замещен или моно-, ди- или тризамещен посредством R⁶,

R⁶, R⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из Н, =S, =NH, =O, ОН, COOH, Hal, NH₂, SO₂CH₃, SO₂NH₂, CN, CONH₂, NHCOCH₃, NHCONH₂, NO₂ и линейного или разветвленного алкила, содержащего 1-10 атомов С, в котором 1-4 атомов С могут быть заменены, независимо друг от друга, на группы О, S, SO, SO₂, NH, NCH₃, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, -COO-, -CONH-, -NCH₃CO-, -CONCH₃-, -C≡C- и/или группы -CH=CH-, и/или, кроме того, 1-10 атомов Н могут быть заменены на F и/или Cl,

Hal означает F, Cl, Br или I,

D означает дейтерий,

и включают свои физиологически приемлемые соли, производные, сольваты, пролекарства и стереоизомеры, включая их смеси во всех соотношениях.

Кроме того, нижеприведенные сокращения имеют следующие значения:

Изобретение далее относится к фармацевтическому препарату, содержащему соединение в соответствии с настоящим изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях.

Изобретение также относится к фармацевтическому препарату в соответствии с изобретением данного типа, дополнительно содержащему наполнители и/или вспомогательные вещества.

Кроме того, изобретение относится к вышеупомянутому фармацевтическому препарату в соответствии с изобретением, содержащему по меньшей мере одно дополнительное активное соединение лекарственного средства.

Под фармацевтически или физиологически приемлемыми производными подразумевают, например, соли соединений настоящего изобретения, а также так называемые пролекарственные соединения. Под пролекарственными соединениями подразумевают производные соединений настоящего изобретения, которые были модифицированы с помощью, например, алкильной или ацильной групп (см. также амино- и гидроксилзащитные группы ниже), Сахаров или олигопептидов и которые быстро расщепляются или высвобождаются в организме с образованием эффективных молекул. Они также включают биоразлагаемые полимерные производные соединения настоящего изобретения, как описано, например, в Int. J. Pharm. 115 (1995), 61-67.

Соединение настоящего изобретения можно применять в его заключительной несолевой форме. С другой стороны, настоящее изобретение также охватывает применение пепстатина в форме его фармацевтически приемлемых солей, которые можно получить из различных органических и неорганических оснований с помощью методик, хорошо известных в данной области техники. Фармацевтически приемлемые солевые формы пепстатина получают, главным образом, путем использования традиционных методов. В случае, если соединение настоящего изобретения содержит карбоксильную группу, одна из его пригодных солей может быть образована по реакции соединения настоящего изобретения с пригодным основанием с получением соответствующей соли присоединения основания. Такими основаниями являются, например, гидроксиды щелочных металлов, включая гидроксид калия, гидроксид натрия и гидроксид лития; гидроксиды щелочноземельных металлов, такие как гидроксид бария и гидроксид кальция; алкоголяты щелочных металлов, например, этилат калия и пропилат натрия; и различные органические основания, такие как пиперидин, диэтаноламин и N-метилглутамин. Также включены соли алюминия с пепстатином.

Кроме того, основные соли соединений настоящего изобретения включают, но не ограничиваясь только ими, соли алюминия, аммония, кальция, меди, железа(III), железа(II), лития, магния, марганца(III), марганца(II), калия, натрия и цинка.

Из вышеупомянутых солей, предпочтение отдают аммониевым солям; солям щелочных металлов - натрия и калия, и солям щелочноземельных металлов - кальция и магния. Соли соединений настоящего изобретения, которые имеют происхождение из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают, но не ограничиваясь только ими, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, также включая природные замещенные амины, циклические амины, и основные ионообменные смолы, как, например, аргинин, бетаин, кофеин, хлорпрокаин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин (бензатин), дициклогексиламин, диэтаноламин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лидокаин, лизин, меглумин, N-метил-D-глюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтаноламин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин и трис(гидроксиметил)метиламин (трометамин).

Как уже упоминалось, фармацевтически приемлемые соли присоединения основания пепстатина образуют с металлами или аминами, такими как щелочные металлы и щелочноземельные металлы или органические амины. Предпочтительными металлами являются натрий, калий, магний и кальций. Предпочтительными органическими аминами являются N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, N-метил-D-глюкамин и прокаин.

Соли присоединения основания к соединениям настоящего изобретения получают путем приведения в контакт формы свободной кислоты с достаточным количеством желаемого основания, вызывая образование соли обычным образом. Свободную кислоту можно регенерировать путем приведения в контакт солевой формы с кислотой и выделения свободной кислоты обычным образом. Формы свободных кислот в некоторой степени отличаются от своих соответствующих солевых форм в части определенных физических свойств, таких как растворимость в полярных растворителях; для целей настоящего изобретения, однако, в остальном соли соответствуют их соответствующим формам свободных кислот.

В свете описанного выше можно увидеть, что под выражением "фармацевтически приемлемая соль" в контексте данной заявки подразумевают активное соединение, которое представляет собой соединение настоящего изобретения в форме одной из его солей, в частности, если такая солевая форма придает данному активному соединению улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению со свободной формой данного активного соединения или любой другой солевой формой данного активного соединения, применяемой ранее. Фармацевтически приемлемая солевая форма активного соединения также может впервые обеспечить данному активному соединению желаемое фармакокинетическое свойство, которым он ранее не обладал, и может даже положительно влиять на фармакодинамику данного активного соединения в отношении его терапевтической эффективности в организме.

Под сольватами соединения настоящего изобретения подразумевают аддукции молекул инертного растворителя и пепстатина, которые образуются благодаря их силе взаимного притяжения. Сольваты представляют собой, например, гидраты, такие как моногидраты или дигидраты, или алкоголяты, т.е. продукты присоединения спиртов, таких как, например, метанол или этанол, к соединениям.

Все физиологически приемлемые соли, производные, сольваты и стереоизомеры данных соединений, включая их смеси во всех соотношениях, также находятся в соответствии с настоящим изобретением.

Соединения настоящего изобретения могут содержать один или несколько центров хиральности, вследствие чего все стереоизомеры, энантиомеры, диастереомеры, и т.д., соединений настоящего изобретения также охватываются настоящим изобретением.

Изобретение также относится к оптически активным формам (стереоизомерам), энантиомерам, рацематам, диастереомерам и гидратам и сольватам этих соединений.

Соединения настоящего изобретения в соответствии с изобретением могут быть хиральными вследствие их молекулярного строения и, соответственно, могут встречаться в различных энантиомерных формах. Таким образом, они могут находиться в рацемической или оптически активной форме. Поскольку фармацевтическая эффективность рацематов или стереоизомеров соединений в соответствии с изобретением может отличаться, может оказаться желательным применение энантиомеров. В этих случаях, как конечный продукт, так даже и промежуточные соединения, могут быть разделены на энантиомерные соединения с помощью химических или физических методов, известных специалисту в данной области, или уже использоваться как таковые в синтезе.

Под фармацевтически или физиологически приемлемыми производными подразумевают, например, соли соединений в соответствии с изобретением, а также так называемые пролекарственные соединения. Под пролекарственными соединениями подразумевают соединения настоящего изобретения, которые были модифицированы, например, алкильными или ацильными группами (см. также амино- и гидроксилзащитные группы ниже), сахарами или олигопептидами и которые быстро расщепляются или высвобождаются в организме с образованием эффективных соединений в соответствии с изобретением. Таковые также включают биоразлагаемые полимерные производные соединений в соответствии с изобретением, как описано, например, в Int. J. Pharm. 115 (1995), 61-67.

Пригодными солями присоединения кислоты являются неорганические и органические соли всех физиологически или фармакологически приемлемых кислот, например, галогениды, в частности, гидрохлориды или гидробромиды, лактаты, сульфаты, цитраты, тартраты, малеаты, фумараты, оксалаты, ацетаты, фосфаты, метилсульфонаты или n-толуолсульфонаты.

Наибольшее предпочтение отдают гидрохлоридам, трифторацетатам или бистрифторацетатам соединений в соответствии с изобретением.

Под сольватами соединений настоящего изобретения подразумевают аддукции молекул инертного растворителя на соединениях настоящего изобретения, которые образуются благодаря их силе взаимного притяжения. Сольваты представляют собой, например, гидраты, такие как моногидраты или дигидраты, или алкоголяты, т.е. продукты присоединения спиртов, таких как, например, метанол или этанол, к соединениям.

Кроме того, предполагается, что соединение настоящего изобретения включает его изотопно-меченные формы. Изотопно-меченная форма соединения настоящего изобретения является идентичной указанному соединению, за исключением того факта, что один или несколько атомов указанного соединения были заменены на атом или атомы, которые имеют атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа упомянутого атома, который обычно встречается в природе. Примеры изотопов, которые являются легко доступными коммерчески и которые могут быть введены в соединение настоящего изобретения с помощью хорошо известных методов, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, например, ²Н, ³Н, ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³¹Р, ³²Р, ³⁵S, ¹⁸F и ³⁶CI, соответственно. Соединение настоящего изобретения, его пролекарство или фармацевтически приемлемая соль, которые содержат один или несколько указанных выше изотопов и/или других изотопов других атомов, также составляют объем настоящего изобретения. Изотопно-меченное соединение настоящего изобретения может использоваться в ряде полезных способов. Например, меченное изотопами соединение настоящего изобретения, например, в которое введен радиоактивный изотоп, такой, как ³Н или ¹⁴С, будет полезным в анализах исследования распределения лекарственного средства и/или субстрата в ткани. Такие радиоактивные изотопы, т.е. тритий (³Н) и углерод-14 (¹⁴С), являются особенно предпочтительными вследствие простоты получения и высокой способности к выявлению. Введение более тяжелых изотопов, например, дейтерия (²Н), в соединение настоящего изобретения, будет обеспечивать терапевтические преимущества, основывающиеся на большей метаболической стабильности указанного соединения, меченного изотопами. Большая метаболическая стабильность проявляется непосредственно в увеличении времени полувыведения in vivo или снижении требуемой дозы, что при большинстве условий будет представлять предпочтительный вариант осуществления указанного изобретения. Меченное изотопом соединение настоящего изобретения обычно можно получить путем осуществления методик, раскрытых в схемах синтеза и в описании, относящемся к ним, в разделах, касающихся примеров и способов получения, приведенных в данной заявке, путем замены немеченого изотопами реагента его соответствующим легко доступным реагентом, меченным изотопом.

С целью изменения окислительного метаболизма соединения посредством первичного кинетического изотопного эффекта, в соединение настоящего изобретения также может быть введен дейтерий (Н). Первичный кинетический изотопный эффект представляет собой изменение скорости химической реакции, которое происходит по причине обмена изотопных ядер, что, в свою очередь, вызывается изменением энергий основного состояния, необходимым для образования ковалентной связи после указанного изотопного обмена. Обмен на более тяжелый изотоп обычно будет приводить к снижению энергии основного состояния для химической связи, вызывая, таким образом, уменьшение скорости скорость-лимитирующего этапа разрушения связи. Когда происходит разрушение связи в или поблизости участка седлообразной конфигурации вдоль координаты реакции образования нескольких продуктов, коэффициент распределения продуктов может существенно изменяться. Например, в случае если дейтерий связывается с атомом углерода в положении, в котором обмен не происходит, различия скорости k_M/k_D=2-7 являются типичными. Если такая разница в скорости успешно применяется к соединению настоящего изобретения, которое чувствительно к окислению, профиль данного соединения in vivo может таким образом в значительной степени изменяться, что и приводит к улучшению фармакокинетических свойств.

В процессе обнаружения и совершенствования терапевтических агентов средний специалист в данной области ищет пути оптимизации фармакокинетических параметров до тех пор, пока не получит желательные in vitro свойства. Рационально предположить, что многие соединения со слабыми фармакокинетическими профилями восприимчивы к окислительному метаболизму. Анализы in vitro с микросомами печени, которые сейчас являются доступными, обеспечивают ценную информацию о процессе окислительного метаболизма этого типа, что, в свою очередь, позволяет получить рациональную модель меченных дейтерием соединений настоящего изобретения с улучшенной стабильностью вплоть до резистентности к такому окислительному метаболизму. Таким образом, получают значительное улучшение фармакокинетических профилей соединений настоящего изобретения, что может быть количественно выражено в величинах увеличения времени полувыведения in vivo (Т/2), в концентрации при максимальном терапевтическом эффекте (C_max), площадью под кривой ответа на определенную дозу (AUC) и F; в величинах уменьшения клиренса, дозы и материальных затрат.

Приведенное далее предназначено для иллюстрации сказанного выше: соединение настоящего изобретения, которое имеет многочисленные потенциальные сайты для окислительного метаболизма, например, атомы водорода бензила и атомы водорода, соединенные с атомом азота, получают в виде серии аналогов, в которых различные комбинации атомов водорода заменяют на атомы дейтерия таким образом, что в результате некоторые, большинство или все эти атомы водорода заменены на атомы дейтерия. Определение времени полувыведения обеспечивает подходящее и точное определение степени улучшения резистентности к окислительному метаболизму. Таким образом определяют, что время полувыведения исходного соединения может быть продлено вплоть до 100% как результат такого замещения водорода дейтерием.

Замещение водорода дейтерием в соединении настоящего изобретения также можно использовать для достижения благоприятного изменения спектра метаболитов исходного соединения в целях уменьшения или устранения нежелательных токсичных метаболитов. Например, если токсичный метаболит возникает при окислительном расщеплении углерод-водородной связи (С-Н), то можно рационально предположить, что меченый дейтерием аналог значительно уменьшит или устранит продуцирование нежелательного метаболита, даже в случае, когда отдельное окисление не является скорость-лимитирующим этапом. Дополнительная информация, относящаяся к уровню техники в отношении обмена водорода на дейтерий, приведена, например, в Hanzlik и др., J. Org. Chem. 55, 3992-3997, 1990; Reider и др., J. Org. Chem. 52, 3326-3334, 1987; Foster, Adv. Drug Res. 14, 1-40, 1985; Gillette и др., Biochemistry 33 (10) 2927-2937, 1994; и Jarman и др. Carcinogenesis 16 (4), 683-688, 1993.

Изобретение также относится к смесям соединений настоящего изобретения в соответствии с изобретением, например, смесям двух диастереомеров, например, в соотношении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:100 или 1:1000. Эти смеси особенно предпочтительно представляют собой смеси двух стереоизомерных соединений. Однако предпочтение также отдают смесям двух или более соединений настоящего изобретения.

Кроме того, изобретение относится к способу получения соединений настоящего изобретения, отличающемуся тем, что

а) соединение формулы II подвергают восстановлению с получением соединения формулы III, соединение формулы III подвергают реакции с соединением формулы IV при повышенной температуре с получением соединения формулы V, соединение формулы V превращают в соединение формулы VI с применением катализатора и основания, соединение формулы VI превращают в соединение формулы VII путем бромирования, соединение формулы VII превращают в соединение формулы VIII в по существу основных условиях, и соединение формулы VIII подвергают реакции с соединением формулы IX в стандартных условиях амидирования или образования карбамида с получением соединения формулы I

,

b) соединение формулы V подвергают реакции с соединением формулы X в условиях реакции типа Сузуки с получением соединения формулы VI, соединение формулы VI превращают в соединение формулы VII путем бромирования, соединение формулы VII превращают в соединение формулы VIII в по существу основных условиях, и соединение формулы VIII подвергают реакции с соединением формулы IX в стандартных условиях амидирования или образования карбамида с получением соединения формулы I,

,

с) соединение формулы XII йодируют с получением соединения формулы XIII, соединение формулы XIII превращают в соединение формулы XIV путем обработки основанием и электрофилом, соединение формулы XIV превращают в соединение формулы XV путем восстановления, соединение формулы XV подвергают реакции с соединением формулы IV при повышенной температуре с получением соединения формулы XVI, соединение формулы XVI превращают в каталитических условиях в соединение формулы XVII, соединение формулы XVII в основных условиях превращают в соединение формулы VIII, и соединение формулы VIII подвергают реакции с соединением формулы IX в стандартных условиях амидирования или образования карбамида с получением соединения формулы I

,

d) основание соединения настоящего изобретения превращают в одну из его солей путем обработки кислотой, или

e) кислоту соединения настоящего изобретения превращают в одну из его солей путем обработки основанием.

Кроме того, в каждом случае реакции можно проводить постадийно, а также можно модифицировать последовательность реакций сочетания структурных элементов с адаптацией концепции использования защитных групп.

Исходные вещества или исходные соединения являются общеизвестными. Если они являются новыми, их можно получить с помощью хорошо известных способов.

При необходимости, исходные вещества также можно образовать in situ, не выделяя их из реакционной смеси, а вместо этого немедленно превращая их далее в соединения настоящего изобретения.

Соединения настоящего изобретения предпочтительно получают путем их высвобождения из функциональных производных с помощью сольволиза, в частности, гидролиза, или с помощью гидрогенолиза. Предпочтительные исходные вещества для сольволиза или гидрогенолиза представляют собой вещества, которые содержат соответствующие защищенные амино, карбоксильные и/или гидроксильные группы взамен одной или нескольких свободных амино, карбоксильных и/или гидроксильных групп, предпочтительно вещества, которые несут аминозащитную группу взамен атома водорода, который присоединен к атому азота. Кроме того, предпочтение отдают исходным веществам, которые несут гидроксилзащитную группу взамен атома водорода гидроксильной группы. Предпочтение также отдают исходным веществам, которые несут защищенную карбоксильную группу взамен свободной карбоксильной группы. Также в молекуле исходного вещества может присутствовать множество одинаковых или разных защищенных амино, карбоксильных и/или гидроксильных групп.Если присутствующие защитные группы отличаются друг от друга, они во многих случаях могут быть отщеплены селективно.

Термин "аминозащитная группа" является общеизвестным и относится к группам, которые пригодны для защиты (блокирования) аминогруппы от химических реакций, но которые могут быть легко удалены после проведения желаемой химической реакции в другой части молекулы. Типичными такими группами являются, в частности, незамещенные или замещенные ацильные группы, кроме того, незамещенные или замещенные арильные (например, 2,4-динитрофенил) или аралкильные группы (например, бензил, 4-нитробензил, трифенилметил). Кроме того, поскольку аминозащитные группы удаляют после желаемой реакции или последовательности реакций, их тип и размер не являются решающими, однако предпочтение отдают группам, содержащим 1-20, в частности, 1-8 атомов углерода. Термин "ацильная группа" следует понимать в самом широком смысле в связи с настоящим способом. Он охватывает ацильные группы, полученные из алифатических, аралифатических, ароматических или гетероциклических карбоновых кислот или сульфоновых кислот и, в частности, алкоксикарбонильные, арилоксикарбонильные и, в особенности, аралкоксикарбонильные группы. Примерами таких ацильных групп являются алканоил, такой как ацетил, пропионил, бутирил, аралканоил, такой как фенилацетил, ароил, такой как бензоил или толуил, арилоксиалканоил, такой как феноксиацетил, алкоксикарбонил, такой как метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, ВОС, 2-йодэтоксикарбонил, аралкоксикарбонил, такой как CBZ, 4-метоксибензилоксикарбонил или FMOC. Предпочтительными ацильными группами являются CBZ, FMOC, бензил и ацетил.

Термин "кислотозащитная группа" или "карбоксилзащитная группа" также является общеизвестным и относится к группам, которые пригодны для защиты группы -СООН от химических реакций, но которые могут быть легко удалены после проведения желаемой химической реакции в другой части молекулы. Использование сложных эфиров взамен свободных кислот, например, замещенных и незамещенных алкиловых эфиров (таких как метиловые, этиловые, трет-бутиловые и их замещенные производные), замещенных и незамещенных бензиловых эфиров или сложных силиловых эфиров, является типичным. Тип и размер кислотозащитной группы не являются решающими, однако предпочтение отдают группам, содержащим 1-20, в частности, 1-10 атомов углерода.

Термин "гидроксилзащитная группа" также является общеизвестным и относится к группам, которые пригодны для защиты гидроксильной группы от химических реакций, но которые могут быть легко удалены после проведения желаемой химической реакции в другой части молекулы. Типичными такими группами являются вышеупомянутые незамещенные или замещенные арильные, аралкильные или ацильные группы, кроме того, также алкильные группы. Тип и размер гидроксилзащитных групп не являются решающими, однако предпочтение отдают группам, содержащим 1-20, в частности, 1-10 атомов углерода. Примерами гидроксилзащитных групп являются, среди прочего, бензил, n-нитробензоил, n-толуолсульфонил и ацетил, причем бензил и ацетил являются предпочтительными.

Дополнительные типичные примеры амино-, кислото- и гидроксилзащитных групп могут быть найдены, например, в "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", четвертое издание, Wiley-Interscience, 2007.

Функциональные производные соединений настоящего изобретения для использования в качестве исходных веществ можно получить известными методами синтеза аминокислот и пептидов, как описано, например, в указанных стандартных работах и заявках на патенты.

Соединения настоящего изобретения высвобождают из их функциональных производных, в зависимости от используемой защитной группы, например, с помощью сильных кислот, предпочтительно, при применении трифторуксусной кислоты или перхлорной кислоты, а также при применении других сильных неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота или серная кислота, сильных органических кислот, таких как трихлоруксусная кислота, или сульфоновые кислоты, такие как бензоил- или n-толуолсульфоновая кислота. Присутствие дополнительного инертного растворителя и/или катализатора возможно, но не является всегда необходимым.

В зависимости от соответствующего пути синтеза, исходные вещества необязательно можно подвергать реакции в присутствии инертного растворителя.

Пригодными инертными растворителями являются, например, гептан, гексан, петролейный эфир, ДМСО, бензол, толуол, ксилол, трихлорэтилен, 1,2-дихлорэтан, тетрахлорметан, хлороформ или дихлорметан; спирты, такие как метанол, этанол, изопропанол, н-пропанол, н-бутанол или трет-бутанол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир (предпочтительно для замещения на азоте индола), тетрагидрофуран (ТГФ) или диоксан; простые эфиры гликоля, такие как монометиловый эфир или моноэтиловый эфир этиленгликоля, диметиловый эфир диэтиленгликоля (диглим); кетоны, такие как ацетон или бутанон; амиды, такие как ацетамид, диметилацетамид, N-метилпирролидон (NMP) или диметилформамид (ДМФА); нитрилы, такие как ацетонитрил; сложные эфиры, такие как этилацетат, карбоновые кислоты или ангидриды кислот, такие как, например, уксусная кислота или ангидрид уксусной кислоты, нитросоединения, такие как нитрометан или нитробензол, необязательно также смеси указанных растворителей друг с другом или смеси с водой.

Количество растворителя не является решающим; предпочтительно можно добавлять от 10 г до 500 г растворителя на г соединения настоящего изобретения, подвергаемого реакции.

Может быть предпочтительным добавление связывающего кислоту средства, например, гидроксида, карбоната или бикарбоната щелочного металла или щелочноземельного металла, или других солей щелочного или щелочноземельного металла и слабых кислот, предпочтительно солей калия, натрия или кальция, или добавление органического основания, такого как, например, триэтиламин, диметиламин, пиридин или хинолин, или избытка аминного компонента.

Полученные соединения в соответствии с изобретением можно отделить от соответствующего раствора, в котором их получили (например, с помощью центрифугирования и промывки), и можно хранить в другой композиции после отделения, или их можно оставить непосредственно в растворе, в котором их получили. Полученные соединения в соответствии с изобретением также можно внести в желаемые растворители для конкретного применения.

Продолжительность реакций зависит от выбранных условий реакций. В общем, продолжительность реакций составляет от 0.5 часа до 10 дней, предпочтительно от 1 до 24 часов. При использовании микроволновой печи, время реакций можно сократить до значений от 1 до 60 минут.

Соединения настоящего изобретения, а также исходные вещества для их получения, кроме того, получают с помощью известных методов, как описано в литературе (например, в стандартных работах, таких как Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie [Методы органической химии], Georg-Thieme-Verlag, Штутгарт), например, в условиях реакций, которые известны и пригодны для указанных реакций. В данном случае также можно использовать хорошо известные варианты, которые здесь не описаны более подробно.

Стадии обычной обработки, такие как, например, добавление воды к реакционной смеси и экстрагирование, позволяют получить соединения после удаления растворителя. Может оказаться предпочтительным, если для дополнительной очистки продукта затем осуществлять перегонку или кристаллизацию, или проводить хроматографическую очистку.

Кислоту настоящего изобретения можно превратить в соответствующую соль присоединения, используя основание, например, по реакции эквивалентных количеств кислоты и основания в инертном растворителе, таком как этанол, с последующим упариванием. Пригодными основаниями для этой реакции являются, в частности, те, которые дают физиологически приемлемые соли. Таким образом, кислоту настоящего изобретения можно превратить в соответствующую соль металла, в частности, соль щелочного или щелочноземельного металла, используя основание (например, гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат натрия или карбонат калия) или в соответствующую аммониевую соль. Органические основания, которые дают физиологически приемлемые соли, такие как, например, этаноламин, также пригодны для этой реакции.

С другой стороны, основание настоящего изобретения можно превратить в соответствующую соль присоединения кислоты, используя кислоту, например, по реакции эквивалентных количеств основания и кислоты в инертном растворителе, таком как этанол, с последующим упариванием. Пригодными кислотами для этой реакции являются, в частности, те, которые дают физиологически приемлемые соли. Таким образом, можно использовать неорганические кислоты, например, серную кислоту, азотную кислоту, галогенводородные кислоты, такие как хлористоводородная кислота или бромистоводородная кислота, фосфорные кислоты, такие как ортофосфорная кислота, сульфаминовую кислоту и, кроме того, органические кислоты, в частности, алифатические, алициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические, моно- или многоосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, пивалевая кислота, диэтилуксусная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, пимелиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, винная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, метан- или этансульфоновая кислота, этандисульфоновая кислота, 2-гидроксисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, n-толуолсульфоновая кислота, нафталинмоно- и дисульфоновая кислоты или лаурилсерная кислота. Соли с физиологически неприемлемыми кислотами, например, пикраты, можно использовать для выделения и/или очистки соединений настоящего изобретения.

Было обнаружено, что соединения настоящего изобретения хорошо переносятся и обладают ценными фармакологическими свойствами.

Поскольку показано, что аденозиновые рецепторы, такие как А_2А и А_2В, оказывают понижающую регуляцию иммунного ответа во время воспаления и защищают ткани от иммунного повреждения, ингибирование передачи сигналов через аденозиновые рецепторы можно использовать для того, чтобы усилить и продлить иммунный ответ.

В данной заявке обеспечены способы усиления иммунного ответа. В одном примере, способ увеличивает желаемое и целевое повреждение ткани, такое как повреждение опухоли, например, злокачественного новообразования. В данной заявке раскрыты способы ингибирования одного или нескольких процессов, способствующих продуцированию внеклеточного аденозина и запускаемой аденозином передачи сигналов через аденозиновые рецепторы. Например, усиление иммунного ответа, местного воспаления тканей и направленного разрушения тканей достигается: путем ингибирования или снижения местной гипоксии ткани, продуцирующей аденозин; путем разложения (или превращения в неактивный) накопленного внеклеточного аденозина; путем предотвращения или снижения экспрессии аденозиновых рецепторов на иммунных клетках; и/или путем ингибирования/антагонизирования передачи сигналов аденозиновыми лигандами через аденозиновые рецепторы. Результаты, раскрытые в данной заявке, демонстрируют, что in vivo введение средств, которые нарушают путь "гипоксия -> накопление аденозина -> иммуносупрессивная передачи сигналов посредством аденозиновых рецепторов иммунным клеткам" у субъектов, страдающих различными заболеваниями (например, злокачественным новообразованием и сепсисом), может in vivo привести к обеспечению лечения опухолей или улучшенной иммунизации.

В одном примере, способ включает введение одного или нескольких ингибиторов внеклеточного аденозина и/или ингибиторов аденозиновых рецепторов, таких как антагонист аденозиновых рецепторов. Для повышения эффективности вакцины, один или несколько ингибиторов аденозиновых рецепторов и/или ингибиторов внеклеточного аденозина можно вводить в сочетании с вакциной. В одном примере, один или несколько ингибиторов аденозиновых рецепторов или ингибиторов внеклеточного аденозина вводят для усиления иммунного ответа/воспаления. В другом примере, способ обеспечивает достижение целевого повреждения ткани, такого как разрушение опухоли.

Следовательно, изобретение также относится к применению соединений в соответствии с изобретением для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, которые вызваны, спровоцированы и/или усилены агонистами аденозиновых или других рецепторов А_2А и/или А_2В.

Таким образом, изобретение также относится, в частности, к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний.

Особое предпочтение отдают, в частности, физиологическим и/или патофизиологическим состояниям, которые связаны с аденозиновыми рецепторами А_2А и/или А_2В.

Физиологические и/или патофизиологические состояния подразумевают физиологические и/или патофизиологические состояния, которые имеют медицинское значение, такие как, например, заболевания или расстройства и медицинские нарушения, жалобы, симптомы или осложнения и т.п, в частности, заболевания.

Изобретение кроме того относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений.

Изобретение дополнительно относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, где гиперпролиферативное заболевание или нарушение представляет собой злокачественное новообразование.

Таким образом, изобретение, в особенности, предпочтительно относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, как указано выше, где злокачественное новообразование выбирают из группы, состоящей из острой и хронической лимфоцитарной лейкемии, острой гранулоцитарной лейкемии, рака коры надпочечников, рака мочевого пузыря, рака головного мозга, рака молочной железы, рака шейки матки, гиперплазии шейки матки, рака шейки матки, хориокарциномы, хронической гранулоцитарной лейкемии, хронической лимфоцитарной лейкемии, рака ободочной кишки, рака эндометрия, рака пищевода, эссенциального тромбоцитоза, урогенитальной карциномы, глиомы, глиобластомы, волосатоклеточной лейкемии, карциномы головы и шеи, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, карциномы легких, лимфомы, злокачественной карциноидной опухоли, злокачественной гиперкальциемии, злокачественной меланомы, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, медуллярной карциномы щитовидной железы, меланомы, множественной миеломы, фунгоидного микоза, миелоидной и лимфоцитарной лейкемии, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легкого, остеогенной саркомы, карциномы яичника, карциномы поджелудочной железы, истинной полицитемии, первичной карциномы головного мозга, первичной макроглобулинемии, рака предстательной железы, почечно-клеточного рака, рабдомиосаркомы, рака кожи, мелкоклеточного рака легкого, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы и опухоли Вильмса.

Изобретение еще более предпочтительно относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, где гиперпролиферативное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, болезни Крона, цирроза, хронических нарушений, связанных с воспалением, пролиферативной диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии, ретролентальной фиброплазии, гранулематоза, иммунной гиперпролиферации, связанной с трансплантацией органа или ткани, и иммунопролиферативного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, псориаза, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), гиперпролиферации сосудов на фоне гипоксии сетчатки и васкулита.

Изобретение еще более предпочтительно относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, где инфекционное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из

a) вирусиндуцированных инфекционных заболеваний, которые вызваны ретровирусами, гепаднавирусами, герпесвирусами, флавивирусами и/или аденовирусами, где ретровирусы выбирают из лентивирусов или онкоретровирусов, где лентивирусы выбирают из группы, состоящей из HIV-1, HIV-2, FIV, BIV, вирусов SIV, SHIV, CAEV, VMV и EIAV, и онкоретровирусы выбирают из группы, состоящей из HTLV-I, HTLV-II и BLV, гепаднавирусы выбирают из группы, состоящей из HBV, GSHV и WHV, герпесвирусы выбирают из группы, состоящей из HSV I, HSV II, EBV, VZV, HCMV или HHV 8, и флавивирусы выбирают из группы, состоящей из HCV, вируса Западного Нила и вируса желтой лихорадки,

b) бактериальных инфекционных заболеваний, которые вызваны грамположительными бактериями, где грамположительные бактерии выбирают из группы, состоящей из метициллин-чувствительных и метициллин-резистентных стафилококков (включая Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus и коагулазоотрицательные стафилококки), Staphylococcus aureus с промежуточной чувствительностью к гликопептидам (GISA), пенициллин-чувствительных и пенициллин-резистентных стрептококков (включая Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus lactis, Streptococcus sanguis и Streptococci группы С (GCS), Streptococci группы G (GGS) и стрептококки группы "viridans"), энтерококков (включая ванкомицин-чувствительные и ванкомицин-резистентные штаммы, такие как Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium), Clostridium difficile, listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Chlamydia spp.(включая С.pneumoniae) и Mycobacterium tuberculosis,

c) бактериальных инфекционных заболеваний, которые вызваны грамотрицательными бактериями, где грамотрицательные бактерии выбирают из группы, состоящей из рода Enterobacteriacae, включая Escherichia spp.(включая Escherichia coli), Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp., Shigella spp., рода Pseudomonas (включая P. aeruginosa), Moraxella spp. (включая M. catarrhalis), Haemophilus spp.и Neisseria spp.,

d) инфекционных заболеваний, индуцированных внутриклеточными активными паразитами, выбранными из группы, состоящей из филума Apicomplexa или Sarcomastigophora (включая Trypanosoma, Plasmodia, Leishmania, Babesia или Theileria), Cryptosporidia, Sacrocystida, Amoebia, Coccidia и Trichomonadia.

Предполагается, что лекарственные средства, раскрытые выше, включают соответствующее применение соединений в соответствии с изобретением для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики вышеуказанных физиологических и/или патофизиологических состояний.

Дополнительно предполагается, что лекарственные средства, раскрытые выше, включают соответствующий способ лечения и/или профилактики вышеуказанных физиологических и/или патофизиологических состояний, в котором по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Соединения в соответствии с изобретением предпочтительно проявляют выгодную биологическую активность, которая может быть легко продемонстрирована в ферментных анализах и экспериментах на животных, как описано в примерах. В таких анализах активности ферментов, соединения в соответствии с изобретением предпочтительно проявляют и вызывают эффект ингибирования, который обычно подтверждается значениями IC₅₀ в пригодном диапазоне, предпочтительно в микромолярном диапазоне и более предпочтительно в наномолярном диапазоне.

Соединения в соответствии с изобретением можно вводить людям или животным, в частности, млекопитающим, таким как обезьяны, собаки, кошки, крысы или мыши, и можно применять для терапевтического лечения человека или животных и для борьбы с вышеупомянутыми заболеваниями. Кроме того, они могут применяться в качестве диагностических средств или в качестве реагентов.

Кроме того, соединения в соответствии с изобретением можно применять для выделения и исследования активности или экспрессии аденозиновых рецепторов А_2А и/или А_2В. Кроме того, они особенно пригодны для применения в методах диагностики заболеваний на фоне нарушения активности аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B. Следовательно, изобретение также относится к применению соединений в соответствии с изобретением для выделения и исследования активности или экспрессии аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B, или в качестве связующих и ингибиторов аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B.

Для диагностических целей, соединения в соответствии с изобретением, например, могут быть радиоактивно мечеными. Примерами радиоактивных меток являются ³Н, ¹⁴С, ²³¹I и ¹²⁵I. Предпочтительным методом мечения является способ с использованием йодогена (Fraker и др., 1978). Кроме того, соединения в соответствии с изобретением могут быть мечены с помощью ферментов, флуорофоров и хемофоров. Примерами ферментов являются щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и глюкозооксидаза, примером флуорофора является флуоресцеин, примером хемофора является люминол, а автоматизированные системы детектирования, например, флуоресцентного окрашивания, описаны, например, в US 4,125,828 и US 4,207,554.

Более того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения настоящего изобретения, и их применению для лечения и/или профилактики заболеваний и нарушений, при которых может быть полезной частичная или полная инактивация аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B.

Соединения настоящего изобретения можно применять для приготовления фармацевтических препаратов, в частности, с помощью нехимических способов. В этом случае, их вводят в пригодную дозированную форму вместе с по меньшей мере одним твердым, жидким и/или полужидким наполнителем или вспомогательным веществом и, необязательно, в комбинации с одним или несколькими дополнительным(-и) активным(-ыми) соединением(-ями).

Следовательно, изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, содержащим по меньшей мере одно соединение настоящего изобретения и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях. В частности, изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, которые дополнительно содержат наполнители и/или вспомогательные вещества, а также к фармацевтическим препаратам, которые содержат по меньшей мере одно дополнительное активное соединение лекарственного средства.

В частности, изобретение также относится к способу приготовления фармацевтического препарата, отличающемуся тем, что соединение настоящего изобретения и/или одну из его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, вводят в пригодную дозированную форму вместе с твердым, жидким или полужидким наполнителем или вспомогательным веществом и необязательно с дополнительным активным соединением лекарственного средства.

Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением можно применять в качестве лекарственных средств в медицине человека и ветеринарии. Пациент или хозяин может принадлежать к любому виду млекопитающих, например, такому как, приматы, особенно люди; грызуны, включая мышей, крыс и хомячков; кролики; лошади, крупный рогатый скот, собаки, кошки, и т.д. Животные модели представляют интерес для экспериментальных исследований, где они обеспечивают модель для лечения заболевания человека.

Пригодными веществами-носителями являются органические или неорганические вещества, которые пригодны для энтерального (например, перорального), парентерального или местного введения и не реагируют с новыми соединениями, например, вода, растительные масла (такие как подсолнечное масло или рыбий жир), бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, ланолин или вазелин. Благодаря своим экспертным знаниям, специалист в данной области осведомлен, какие вспомогательные вещества пригодны для желаемого состава лекарственного средства. Помимо растворителей, например, воды, физиологического солевого раствора или спиртов, таких как, например, этанол, пропанол или глицерин, растворы Сахаров, такие как растворы глюкозы или маннита, или смесь указанных растворителей, также можно использовать гелеобразователи, вспомогательные средства для таблеток и другие носители активного ингредиента, например, скользящие вещества, стабилизаторы и/или смачивающие средства, эмульгаторы, соли для воздействия на осмотическое давление, антиоксиданты, диспергаторы, антивспениватели, буферные вещества, вкусовые и/или ароматические вещества или корректоры вкуса, консерванты, солюбилизаторы или красители. При необходимости, препараты или лекарственные средства в соответствии с изобретением могут содержать одно или несколько дополнительных активных соединений, например, один или несколько витаминов.

При необходимости, препараты или лекарственные средства в соответствии с изобретением могут содержать одно или несколько дополнительных активных соединений и/или один или несколько усилителей действия (вспомогательных веществ).

Термины "фармацевтический состав" и "фармацевтический препарат" в целях настоящего изобретения используются в качестве синонимов.

В данном контексте, "фармацевтически переносимый" относится к лекарственным средствам, преципитирующим реагентам, наполнителям, вспомогательным веществам, стабилизаторам, растворителям и другим средствам, которые облегчают введение фармацевтических препаратов, полученных из них, млекопитающему без нежелательных физиологических побочных действий, таких как, например, тошнота, головокружение, проблемы с пищеварением или т.п.

В случае фармацевтических препаратов для парентерального введения, существует потребность в изотоничности, нормальной гидратации и переносимости и безопасности состава (низкая токсичность), используемых вспомогательных веществ и первичной упаковки. Неожиданно, соединения в соответствии с изобретением предпочтительно обладают тем преимуществом, что возможно прямое применение и дополнительные стадии очистки для удаления токсикологически неприемлемых веществ, таких как, например, органические растворители в высоких концентрациях или другие токсикологически неприемлемые вспомогательные вещества, таким образом, не являются необходимыми перед применением соединений в соответствии с изобретением в фармацевтических составах.

Изобретение особенно предпочтительно также относится к фармацевтическим препаратам, содержащим по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной или суспендированной форме, и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества и/или дополнительные фармацевтические активные соединения.

Предпочтительно, соединения в соответствии с изобретением позволяют приготовлять высококонцентрированные составы без вредной, нежелательной агрегации соединений в соответствии с изобретением. Таким образом, с помощью соединений в соответствии с изобретением можно получить готовые к применению растворы, имеющие высокое содержание активных компонентов, с водными растворителями или в водной среде.

Соединения и/или их физиологически приемлемые соли и сольваты также можно лиофилизировать и полученные в результате лиофилизаты применять, например, для приготовления препаратов для инъекций.

Водные препараты можно получить путем растворения или суспендирования соединений в соответствии с изобретением в водном растворе и необязательно добавления вспомогательных веществ. С этой целью, определенные объемы исходных растворов, включающих указанные дополнительные вспомогательные вещества в определенной концентрации, предпочтительно добавляют к раствору или суспензии, имеющему(-ей) определенную концентрацию соединений в соответствии с изобретением, и смесь необязательно разбавляют водой до предварительно рассчитанной концентрации. Альтернативно, вспомогательные вещества можно добавлять в твердой форме. Количества исходных растворов и/или воды, которые необходимы в каждом случае, вслед за этим можно добавлять к полученному(-ой) водному раствору или суспензии. Соединения в соответствии с изобретением предпочтительно также можно растворять или суспендировать непосредственно в растворе, включающем все дополнительные вспомогательные вещества.

Предпочтительно можно приготовить растворы или суспензии, которые включают соединения в соответствии с изобретением и имеют рН в диапазоне от 4 до 10, предпочтительно от 5 до 9, и осмоляльность в диапазоне от 250 до 350 мОсмол/кг. Фармацевтический препарат может таким образом быть введен непосредственно, по существу без боли внутривенно, внутриартериально, внутрисуставно, подкожно или чрескожно. Кроме того, препарат также можно добавлять к растворам для инфузий, таким как, например, раствор глюкозы, изотонический солевой раствор или раствор Рингера, который может также содержать дополнительные активные соединения, что также делает возможным введение относительно больших количеств активного соединения.

Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением также могут содержать смеси нескольких соединений в соответствии с изобретением.

Препараты в соответствии с изобретением хорошо переносятся физиологически, их легко приготовить, их можно четко распределить и предпочтительно они являются стабильными касательно условий анализа, продуктов разложения и агрегатов во время хранения и транспортировки, и при многократном осуществлении замораживания и процедур оттаивания. Они предпочтительно могут храниться в стабильном состоянии в течение, по меньшей мере, от трех месяцев до двух лет при температуре холодильника (2-8°С) и при комнатной температуре (23-27°С) и относительной влажности воздуха (О.В.) 60%.

Например, соединения в соответствии с изобретением можно хранить в стабильном состоянии с помощью сушки и при необходимости превращать в готовый к применению фармацевтический препарат путем растворения или суспендирования. Возможными методами сушки являются, например, не ограничиваясь этими примерами, сушка газообразным азотом, сушка в вакуумной печи, лиофилизация, промывка органическими растворителями и последующая сушка воздухом, сушка в жидком слое, сушка в псевдоожиженном слое, сушка распылением, вальцовая сушка, послойная сушка, сушка воздухом при комнатной температуре и дальнейшие методы.

Термин "эффективное количество" означает количество лекарственного средства или фармацевтического активного компонента, которое вызывает в ткани, системе, животном или человеке биологическую или медицинскую реакцию, которая является искомой или желаемой, например, исследователем или врачом.

Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" означает количество, которое, по сравнению с соответствующим субъектом, который не получил это количество, имеет следующие последствия: улучшение лечения, излечивание, предотвращение или устранение заболевания, синдрома, болезненного состояния, жалоб, нарушения или предотвращение побочных действий или также замедление прогрессирования заболевания, ослабление жалоб или нарушения. Термин "терапевтически эффективное количество" также охватывает количества, которые являются эффективными для усиления нормальной физиологической функции.

При применении препаратов или лекарственных средств в соответствии с изобретением, соединения в соответствии с изобретением и/или их физиологически приемлемые соли и сольваты обычно применяют по аналогии с известными, коммерчески доступными препаратами или препаративными формами, предпочтительно в дозировках между 0.1 и 500 мг, в частности, 5 и 300 мг, на применяемую единицу. Суточная доза составляет предпочтительно между 0.001 и 250 мг/кг, в частности, 0.01 и 100 мг/кг, массы тела. Препарат можно вводить один или несколько раз в день, например, два, три или четыре раза в день. Однако, индивидуальная доза для пациента зависит от большого числа индивидуальных факторов, таких как, например, эффективность конкретного применяемого соединения, возраст, масса тела, общее состояние здоровья, пол, питание, время и способ введения, скорость экскреции, сочетание с другими лекарственными средствами и тяжесть и продолжительность конкретного заболевания.

Мерой поглощения активного соединения лекарственного средства в организме является его биологическая доступность. Если активное соединение лекарственного средства доставляется в организм внутривенно в виде раствора для инъекции, его абсолютная биологическая доступность, т.е. доля фармацевтического средства, которая достигает системной крови, т.е. основной системы кровообращения, в неизмененной форме, составляет 100%. В случае перорального введения терапевтически активного соединения, активное соединение обычно находится в виде твердого вещества в составе и поэтому должно сначала быть растворено для того, чтобы быть способным преодолеть барьеры, например, желудочно-кишечный тракт, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку носа или кожу, в частности, роговой слой эпидермиса, или быть усвоенным организмом. Фармакокинетические данные, т.е. данные о биологической доступности, можно получить аналогично методу, описанному в J. Shaffer и др., J. Pharm. Sciences, 88 (1999), 313-318.

Кроме того, лекарственные средства этого типа можно получить с помощью одного из способов, которые являются общеизвестным в фармацевтическом уровне техники.

Лекарственные средства могут быть адаптированы для введения при помощи любого желаемого пригодного пути, например, перорального (включая буккальное или сублингвальное), ректального, легочного, назального, местного (включая буккальное, сублингвальное или трансдермальное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное и, в частности, внутрисуставное) пути введения. Лекарственные средства этого типа можно получить с помощью любого способа, известного в области фармацевтики, например, путем объединения активного соединения с наполнителем(-ями) или вспомогательным(-и) веществом(-ами).

Предпочтительно, для введения лекарственных средств в соответствии с изобретением пригодным является парентеральное введение. В случае парентерального введения, внутрисуставное введение является особенно предпочтительным.

Таким образом, изобретение предпочтительно также относится к применению фармацевтического препарата в соответствии с изобретением для внутрисуставного введения для лечения и/или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из остеоартрита, травматических повреждений хряща, артрита, боли, аллодинии или гипералгезии.

Преимущество внутрисуставного введения заключается в том, что соединение в соответствии с изобретением может быть введено непосредственно в синовиальную жидкость в непосредственной близости от суставного хряща и также способно распространяться оттуда в хрящевую ткань. Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением таким образом также могут быть введены непосредственно в суставную щель и таким образом осуществлять свое действие непосредственно на месте действия, как и предполагалось. Соединения в соответствии с изобретением также пригодны для приготовления лекарственных средств для парентерального введения, имеющих медленное, устойчивое и/или контролируемое высвобождения активного соединения. Таким образом, они также пригодны для приготовления составов замедленного высвобождения, которые являются предпочтительными для пациента, поскольку введение необходимо повторять только через относительно большие промежутки времени.

Лекарственные средства, адаптированные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекции, содержащие антиоксиданты, буферы, бактериостатические и растворенные вещества, с помощью которых состав является изотоническим по отношению к крови или синовиальной жидкости реципиента, которого подвергают лечению; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспензионную среду и загустители. Составы могут поставляться в однодозовых или многодозовых емкостях, например, запаянных ампулах и флаконах, и храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, так что необходимо только добавление стерильной жидкости-носителя, например, воды для инъекции, непосредственно перед применением. Растворы и суспензии для инъекции, приготовленные в соответствии с раскрытой рецептурой, можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток.

Соединения в соответствии с изобретением также можно вводить в виде липосомных систем доставки, таких как, например, небольшие однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как, например, холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.

Соединения в соответствии с изобретением также можно сочетать с растворимыми полимерами в качестве нацеливающих носителей лекарственных средств. Такие полимеры могут охватывать поливинилпирролидон, сополимерпирана, полигидроксипропилметакриламидофенол, полигидроксиэтиласпартамидофенол или полиэтиленоксид-полилизин, замещенный пальмитоиловыми радикалами. Кроме того, соединения в соответствии с изобретением можно сочетать с биоразлагаемыми полимерами, которые пригодны для обеспечения замедленного высвобождения лекарственного средства, например, такими как полимолочная кислота, поли-эпсилон-капролактон, полигидроксимасляная кислота, сложные полиортоэфиры, полиацетали, полидигидроксипираны, полицианоакрилаты, сополимер молочной кислоты с гликолевой кислотой, полимеры, такие как конъюгаты декстран -метакрилаты, сложные полифосфоэфиры, различные полисахариды и полиамины, и поли-ε-капролактон, альбумин, хитозан, коллаген или модифицированный желатин, и перекрестно-сшитые или амфипатические блок-сополимеры гидрогелей.

Пригодными для энтерального введения (перорального или ректального) являются, в частности, таблетки, драже, капсулы, сиропы, соки, капли или суппозитории, и пригодными для местного применения являются мази, кремы, пасты, лосьоны, гели, спреи, пены, аэрозоли, растворы (например, растворы в спиртах, таких как этанол или изопропанол, ацетонитрил, ДМФА, диметилацетамид, 1,2-пропандиол или их смеси друг с другом и/или с водой) или порошки. Также особенно пригодными для местного применения являются липосомальные препараты.

В случае состава в виде мази, активное соединение можно использовать либо с парафиновой, либо со смешивающейся с водой основой для крема. Альтернативно, активное соединение может быть введено в состав в виде крема с основой для крема типа масло-в-воде или вода-в-масле.

Лекарственные средства, адаптированные для трансдермального введения, могут доставляться в виде независимых пластырей для пролонгированного, тесного контакта с эпидермисом реципиента. Таким образом, например, активное соединение может доставляться из пластыря путем ионофореза, как описано в общих чертах в Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986).

Само собой разумеется, что кроме компонентов, особым образом упомянутых выше, лекарственные средства в соответствии с изобретением также могут содержать другие, обычные в данной области средства для конкретного типа фармацевтического состава.

Изобретение также относится к комплекту (набору), состоящему из отдельных упаковок

a) эффективного количества соединения настоящего изобретения и/или его физиологически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, и

b) эффективного количества дополнительного активного соединения лекарственного средства.

Комплект включает пригодные емкости, такие как коробки или пачки, индивидуальные бутылки, пакеты или ампулы. Комплект может включать, например, отдельные ампулы, каждая из которых содержит эффективное количество соединения настоящего изобретения и/или его фармацевтически приемлемых солей, производных, сольватов, пролекарств и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, и эффективное количество дополнительного активного соединения лекарственного средства в растворенной или лиофилизированной форме.

Кроме того, лекарственные средства в соответствии с изобретением можно применять с целью обеспечения аддитивных или синергетических эффектов в случае некоторых известных методов терапии и/или можно применять с целью восстановления эффективности определенных существующих методов терапии.

Помимо соединений в соответствии с изобретением, фармацевтические препараты в соответствии с изобретением также могут содержать дополнительные активные соединения лекарственного средства, например, для применения для лечения злокачественного новообразования, другие противоопухолевые лекарственные средства. Для лечения других упомянутых заболеваний, фармацевтические препараты в соответствии с изобретением также, помимо соединений в соответствии с изобретением, могут содержать дополнительные активные соединения лекарственного средства, которые, как известно специалисту в данной области, применяются для их лечения.

В одном основном варианте осуществления, обеспечиваются способы усиления иммунного ответа у хозяина, нуждающемуся в этом. Иммунный ответ может быть повышен путем уменьшения Т-клеточной переносимости, в том числе посредством усиления высвобождения IFN-γ, снижения продуцирования или активации регуляторных Т-клеток, или усиления продуцирования антиген-специфических Т-клеток памяти в хозяине. В одном варианте осуществления, способ включает введение соединения настоящего изобретения хозяину в комбинации или поочередно с антителом. В конкретных подвариантах осуществления, антитело представляет собой терапевтическое антитело. В одном отдельном варианте, обеспечивается способ повышения эффективности терапии пассивными антителами, включающий введение соединения настоящего изобретения в комбинации или поочередно с одним или нескольким пассивными антителами. Этот способ может повышать эффективность терапии антителами для лечения пролиферативных нарушений, таких как злокачественное новообразование, или может повышать эффективность терапии при лечении или предотвращении инфекционных заболеваний. Соединение настоящего изобретения можно вводить в комбинации или поочередно с антителами такими как, например, ритуксимаб, герцептин или эрбитукс.

В другом основном варианте, обеспечивается способ лечения или предотвращения аномальной клеточной пролиферации, включающий введение соединения настоящего изобретения хозяину, нуждающемуся в этом, по существу в отсутствие другого противоопухолевого средства.

В другом основном варианте, обеспечивается способ лечения или предотвращения аномальной клеточной пролиферации в хозяине, нуждающемся в этом, включающий введение хозяину первого соединения настоящего изобретения по существу в комбинации с первым противоопухолевым средством и вслед за этим введение второго антагониста рецепторов А_2А и/или А_2В. В одном подварианте осуществления, второй антагонист вводят по существу в отсутствие другого противоопухолевого средства. В другом основном варианте, обеспечивается способ лечения или предотвращения аномальной клеточной пролиферации в хозяине, нуждающемся в этом, включающий введение хозяину соединения настоящего изобретения, по существу, в комбинации с первым противоопухолевым средством и вслед за этим введение второго противоопухолевого средства в отсутствие антагониста.

Таким образом, лечение злокачественных заболеваний, раскрытое в данном случае, можно осуществлять либо в форме терапии соединением настоящего изобретения, либо в комбинации с оперативным вмешательством, облучением или химиотерапией. Химиотерапия этого типа может включать применение одного или нескольких активных соединений из следующих классов противоопухолевых активных соединений:

(i) антипролиферативные/противоопухолевые/повреждающие ДНК активные соединения и их комбинации, которые применяются в медицинской онкологии, такие как алкилирующие активные соединения (например, цисплатин, карбоплатин, циклофосфамид, азотный иприт, мельфалан, хлорамбуцил, бусульфан и нитрозомочевины); антиметаболиты (например, антифолаты, такие как фторпиримидины, такие как 5-фторурацил и тегафур, ралтитрексед, метотрексат, арабинозид цитозина, гидроксимочевина и гемцитабин); противоопухолевые антибиотики (например, антрациклины, такие как адриамицин, блеомицин, доксорубицин, дауномицин, эпирубицин, идарубицин, митомицин-С, дактиномицин и митрамицин); антимитотические активные соединения (например, алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин, и таксоиды, такие как таксол и таксотер); ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины, такие как этопозид и тенипозид, амсакрин, топотекан, иринотекан и камптотецин)и влияющие на дифференциацию клеток активные соединения (например, ретиноевая кислота, полностью находящаяся в транс-конфигурации, 13-цис-ретиноевая кислота и фенретинид);

(ii) цитостатические активные соединения, такие как антиэстрогены (например, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен и йодоксифен), регуляторы рецепторов эстрогена (например, фульвестрант), антиандрогены (например, бикалутамид, флутамид, нилутамид и ципротерон ацетат), антагонисты LHRH или агонисты LHRH (например, гозерелин, лейпрорелин и бузерелин), прогестероны (например, мегестрол ацетат), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, воразол и эксеместан) и ингибиторы 5α-редуктазы, такие как финастерид;

(iii) активные соединения, которые ингибируют инвазию злокачественных клеток, включая, например, ингибиторы металлопротеиназы, такие как маримастат, и ингибиторы функции рецептора урокиназного активатора плазминогена;

(iv) ингибиторы функции фактора роста, например, антитела к фактору роста, антитела к рецептору фактора роста, например, анти-erbb2 антитело трастузумаб [Герцептин™] и анти-erbbl антитело цетуксимаб [С225]), ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы серин/треонинкиназы, например, ингибиторы семейства фактора роста эпидермиса (например, ингибиторы тирозинкиназ EGFR семейства, такие как N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (гефитиниб, AZD1839), N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин (эрлотиниб, OSI-774) и 6-акриламидо-N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (CI 1033), например, ингибиторы семейства фактора роста тромбоцитов и, например, ингибиторы семейства фактора роста гепатоцитов;

(v) антиангиогенные активные соединения, такие как бевацизумаб, ангиостатин, эндостатин, линомид, батимастат, каптоприл, ингибитор из хрящевой ткани, генистеин, интерлейкин 12, лавендустин, ацетат медроксипрогестерона, рекомбинантный человеческий тромбоцитарный фактор 4, текогалан, тромбоспондин, TNP-470, моноклональное антитело анти-VEGF, растворимый химерный белок VEGF-рецептора, антитела к рецептору VEGF, антитела к рецептору PDGF, ингибиторы интегринов, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы серин/треонинкиназы, антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, миРНК, анти-VEGF аптамеры, фактор пигментного эпителия и соединения, которые были опубликованы в международных заявках на патенты WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 и WO 98/13354);

(vi) средства, разрушающие сосуды, такие как комбретастатин А4 и соединения, которые были опубликованы в международных заявках на патенты WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 и WO 02/08213;

(vii) методы антисмысловой терапии, например, такая, которая направлена на упомянутые выше мишени, такие как ISIS 2503, антисмысловая терапия, направленная против гена Ras;

(viii) методы генной терапии, включая, например, методы замены атипичных, модифицированных генов, таких как атипичный р53 или атипичный BRCA1 или BRCA2, методы GDEPT (ген-направленная ферментная пролекарственная терапия), такие как методы, в которых применяют цитозиндезаминазу, тимидинкиназу или бактериальный нитроредуктазный фермент, и методы, которые повышают переносимость пациента к химиотерапии или радиотерапии, такие как терапия множественной лекарственной устойчивости; и

(ix) методы иммунотерапии, включая, например, методы повышения иммуногенности опухолевых клеток пациента в условиях ex vivo и in vivo, такие как трансфекция цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, методы снижения анергии Т-клеток, методы с применением трансфектированных иммунных клеток, таких как цитокин-трансфектированные дендритные клетки, методы с применением цитокин-трансфектированных опухолевых клеток и методы с применением анти-идиотипичных антител;

(х) химиотерапевтические средства, включая, например, абареликс, альдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, алтретамин, амифостин, анастрозол, триоксид мышьяка, аспарагиназу, живую БЦЖ, бевацизумаб, бексаротен, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, калустерон, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, целекоксиб, цетуксимаб, хлорамбуцил, цинакальцет, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, дарбэпоэтин альфа, дауномицин, денилейкин-дифтитокс, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, дромостанолон, эпирубицин, эпоэтин альфа, эстрамустин, этопозид, эксеместан, филграстим, флоксуридин, флударабин, фторурацил, фульвестрант и гемцитабин.

Лекарственные средства из таблицы 1 можно предпочтительно, но не исключительно, комбинировать с соединениями настоящего изобретения.

Даже без дополнительных вариантов осуществления предполагается, что специалист в данной области сможет использовать приведенное выше описание в самом широком объеме. Предпочтительные варианты осуществления, следовательно, следует рассматривать просто как описательное раскрытие, которое никоим образом не ограничивает настоящее изобретение.

Таким образом, следующие примеры предназначены для пояснения изобретения и не ограничивают его. Если не указано иное, процентные значения означают процентные значения по массе. Все температуры указаны в градусах Цельсия. "Обычная обработка": при необходимости добавляют воду, рН доводят, при необходимости, до значений между 2 и 10, в зависимости от строения конечного продукта, смесь экстрагируют этилацетатом или дихлорметаном, фазы разделяют, органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают, и продукт очищают с помощью хроматографии на силикагеле и/или путем кристаллизации.

Значения RT приведены для силикагеля; масс-спектрометрия: EI (ионизация электронным ударом): М⁺, FAB (бомбардировка быстрыми атомами): (М+Н)⁺, ТГФ (тетрагидрофуран), NMP (N-метилпирролидон), ДМСО (диметилсульфоксид), ЭА (этилацетат), МеОН (метанол), ТСХ (тонкослойная хроматография).

Перечень сокращений

AUC Площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного вещества в плазме от времени

C_max Максимальная концентрация в плазме

CL Клиренс

CV Коэффициент вариации

CYP Цитохром Р450

ДМСО Диметилсульфоксид

F Биологическая доступность

f_a Поглощенная фракция

в/в Внутривенное

ЖХ-МС/МС Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией

LLOQ Нижний предел количественного определения

HP Не рассчитано

НО Не определено

ПЭГ Полиэтиленгликоль

Pgp Гликопротеин проницаемости

PK Фармакокинетический (фармакокинетика)

п/о Перорально (пероральный препарат)

t_1/2 Время полувыведения (полураспада)

t_max Время, при котором достигается максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме

СВЭЖХ Сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография

V_ss Объем распределения (в равновесном состоянии)

об./об. Объем к объему

Пример 1: Примеры соединений настоящего изобретения

В особенности, изобретение относится к соединениям таблицы 2 и их физиологически приемлемым солям, производным, сольватам, пролекарствам и стереоизомерам, включая их смеси во всех соотношениях.

Пример 2: Получение соединений настоящего изобретения и аналитические методы

Все используемые растворители были коммерчески доступными и использовались без дополнительной очистки. Реакции типично проводили с использованием безводных растворителей в инертной атмосфере азота. Колоночную флэш-хроматографию обычно проводили с использованием силикагеля Silica gel 60 (размер частиц 0.035-0.070 мм).

Данные всех ЯМР-экспериментов записывали либо на ЯМР-спектрометре Bruker Mercury Plus 400, оснащенном датчиком Bruker 400 BBFO на 400 МГц для протонного ЯМР, либо на ЯМР-спектрометре Bruker Mercury Plus 300, оснащенном датчиком Bruker 300 BBFO на 300 МГц для протонного ЯМР. Все дейтерированные растворители типично содержали от 0.03% до 0.05% об./об. тетраметилсилана, который использовали в качестве стандартного сигнала (установлен на δ=0.00 для обоих, ¹Н и ¹³C).

Анализы ЖХ-МС выполняли на приборе SHIMADZU LC-MC, состоящем из системы UFLC 20-AD и МС-детектора LCMS 2020. Используемая колонка представляла собой Shim-pack XR-ODS, 2.2 мкм, 3.0×50 мм. Применяли линейный градиент, начиная элюирование при 95% А (А: 0.05% ТФУ в воде) и заканчивая при 100% В (В: 0.05% ТФУ в ацетонитриле) в течение 2.2 мин с общим временем хроматографирования 3.6 мин. Температура колонки составляла 40°С при скорости потока 1.0 мл/мин. С использованием диодно-матричного детектора сканирование выполняли в диапазоне 200-400 нм. Масс-спектрометр был оснащен электрораспылительным источником ионов (ES), работающим в режиме положительных или отрицательных ионов. Сканирование на масс-спектрометре выполняли в диапазоне m/z 90-900 со временем сканирования 0.6 с. Если не установлено иное.

1. (5R)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид 24

и (5S)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид 25

a. 4-хлор-5-йод-3-нитропиридин-2-ол

В 250-мл круглодонную колбу помещали 4-хлор-3-нитропиридин-2-ол (10.0 г, 54.4 ммоль, 95%) и N-йодсукцинимид (NIS, 14.2 г, 59.9 ммоль, 95%) в ацетонитриле (115 мл). Раствор перемешивали в течение 1 ч, и затем в течение ночи при 80°С на масляной бане. Смесь концентрировали и образовавшийся осадок собирали путем фильтрования. Остаток два раза промывали петролейным эфиром (500 мл) и сушили в вакууме при 60°С в течение ночи. Это приводило к 4-хлор-5-йод-3-нитропиридин-2-олу (16.5 г, 97.9%, чистота 97%) в виде желтого твердого вещества. МС: m/z=300.9 [М+Н]⁺.

b. 4-хлор-5-йод-2-метокси-3-нитропиридин

В 500-мл круглодонную колбу помещали 4-хлор-5-йод-3-нитропиридин-2-ол (16.5 г, 53.3 ммоль, 97%) и Ag₂CO₃ (15.5 г, 53.3 ммоль, 95%) в толуоле (310 мл). К этой суспензии при 50°С добавляли CH₃I (15.9 г, 107 ммоль, 95%), и смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Осадок собирали путем фильтрования и отбрасывали. Фильтрат упаривали досуха в вакууме и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир (15:85). Это приводило к 4-хлор-5-йод-2-метокси-3-нитропиридину (9.90 г, 52.6%, чистота 89%) в виде светло-желтого твердого вещества. МС: m/z=315.5 [М+Н]⁺.

c. 4-хлор-5-йод-2-метоксипиридин-3-амин

В 250-мл 3-х горлую круглодонную колбу помещали 4-хлор-5-йод-2-метокси-3-нитропиридин (9.90 г, 28.0 ммоль, 89%), железо (16.5 г, 281 ммоль, 95%) и NH₄Cl (9.40 г, 174 ммоль, 99%) в этаноле (152 мл) и воде (30 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч при 80°С на масляной бане. Реакционную смесь фильтровали через целит, промывали этанолом и маточный раствор концентрировали досуха. Остаток перемешивали в течение 30 мин с 100 мл воды и сушили в вакууме при 60°. Это приводило к 4-хлор-5-йод-2-метоксипиридин-3-амину (7.20 г, 75%, чистота 83%) в виде не совсем белого твердого вещества. Его использовали без дополнительной очистки на следующей стадии. МС: m/z=285.9 [М+Н]⁺.

d. N-[7-йод-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

В 500-мл круглодонную колбу помещали 4-хлор-5-йод-2-метоксипиридин-3-амин (7.20 г, 21.0 ммоль, 83%) в ацетоне (150 мл) и по каплям добавляли бензоилизотиоцианат (5.21 г, 31.5 ммоль, 99%) при комнатной температуре. Раствор перемешивали в течение 1 ч при 50°С на масляной бане. Твердые вещества собирали путем фильтрования, промывали ацетоном и сушили в вакууме с получением N-[7-йод-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (8.73 г, 91%, чистота 90%) в виде белого твердого вещества. МС: m/z=412.2 [М+Н]⁺.

e. N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

К раствору N-[7-йод-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (6.00 г, 13.1 ммоль, 90%) и 2-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана (6.13 г, 27.7 ммоль, 95%) в диоксане (200 мл) и воде (40.00 мл) добавляли NaOH (2.90 г, 68.9 ммоль, 95%) и Pd(dppf)Cl₂ * дихлорметан (1.20 г, 1.40 ммоль, 95%). После перемешивания в течение 1 ч при 100°С в атмосфере азота, смесь концентрировали досуха в вакууме. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле с использованием смеси этилацетат/гексан (95:5). Это приводило к 3.32 г (62%, чистота 90%) N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида в виде бесцветного твердого вещества. МС: m/z=368.1 [М+Н]⁺.

f. 7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-амин

К перемешиваемой смеси N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (3.27 г, 8.00 ммоль, 90%) в смеси вода/метанол (1:1, 300 мл) в атмосфере азота добавляли NaOH (3.36 г, 80.0 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение ночи при 90°С в атмосфере азота и упаривали досуха. Остаток вносили в воду и 3 раза экстрагировали дихлорметаном (100 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью петролейный эфир/этилацетат (1:1) с получением 7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-амина (1.50 г, 68%, чистота 96%) в виде светло-коричневатого твердого вещества. МС: m/z=264.1 [М+Н]⁺.

g. фенил N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5 с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамат

К перемешиваемому раствору 7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-амина (600 мг, 2.19 ммоль, 96%) и фенил хлорформиата (1.81 г, 11.0 ммоль, 95%) в ТГФ (50 мл) в атмосфере азота добавляли K₂CO₃ (1.59 г, 11.0 ммоль, 95%) и пиридин (913 мг, 11.0 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 6 ч при 50° и затем после повторного охлаждения до комнатной температуры гасили путем добавления воды (300 мл). Смесь 3 раза экстрагировали дихлорметаном (200 мл), объединенные органические слои промывали один раз соляным раствором (200 мл), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении. Это приводило к фенил N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамату (1.00 г, 69%, чистота 76%) в виде светло-желтого твердого вещества. Сырой продукт непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z=504.1 [М+Н]⁺.

h. N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

К смеси фенил N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамата (1.00 г, 1.52 ммоль, 76%) и бис(7-окса-2-азаспиро[4.5]декана) * щавелевая кислота (1.19 г, 3.03 ммоль, 95%) в ТГФ (50 мл) в атмосфере азота добавляли диизопропилэтил амин (1.24 г, 9.09 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 1 ч при 60°. После повторного охлаждения до комнатной температуры смесь два раза экстрагировали дихлорметаном (100 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью петролейный эфир/этилацетат (1:1) с получением N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамида (600 мг, 92%) в виде белого твердого вещества. ВЭЖХ: чистота 99.9%, RT=1.17 мин. МС: m/z=431.1 [М+Н]⁺. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6) δ 11.37 (s, 1Н), 7.95 (s, 1Н), 6.25 (s, 1H), 4.30-4.29 (m, 2Н), 3.99 (s, 3Н), 3.89 (t, J=5.4 Гц, 2Н), 3.61-3.29 (m, 8Н), 2.55-2.51 (m, 2Н), 1.82-1.54 (m, 6Н).

i. (5R)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид 24

и (5S)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид 25

N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид (450 мг, 1.044 ммоль, 1 экв., 99.9%) очищали с помощью хиральной препаративной ВЭЖХ (колонка Preparative HPLC-032: ChiralPak IA, 2*25 см, 5 мкм; подвижная фаза: дихлорметан:этанол (20:80); детектор: УФ). Это приводило к (5R)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамиду (178 мг, 39%) в виде белого твердого вещества. ВЭЖХ: чистота 99.7%, RT (хиральное)=3.86 мин, 100% ее. МС: m/z=431.2 [М+Н]⁺. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11.36 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.24 (s, 1Н), 4.29-4.27 (m, 2Н), 3.97 (s, 3Н), 3.88 (t, J=5.2 Гц, 2Н), 3.51-3.19 (m, 8Н), 2.55-2.50 (m, 2Н), 1.83-1.53 (m, 6Н) и

(5S)-N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-7-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамиду (171 мг, 38%) в виде белого твердого вещества. ВЭЖХ: чистота 99.8%, RT (хиральное)=5.23 мин, 99.9% ее. МС: m/z=431.2 [М+Н]⁺. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11.35 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.24 (s, 1Н), 4.29-4.28 (m, 2Н), 3.99 (s, 3Н), 3.88-3.85 (m, 2Н), 3.61-3.29 (m, 8Н), 2.55-2.50 (m, 2Н), 1.83-1.53 (m, 6Н).

2. N-[7-(3-аминофенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид 39

j. N-[3-(2-бензамидо-4-метокси-1,3-бензотиазол-7-ил)фенил]карбамат

К раствору N-(7-йод-4-метокси-1,3-бензотиазол-2-ил)бензамида (400 мг, 0.878 ммоль, 90%) и (3-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)бороновой кислоты (328 мг, 1.32 ммоль, 95%) в 1,4-диоксане и воде добавляли NaOH (369 мг, 8.78 ммоль, 95%) и Pd(dppf)Cl₂ * дихлорметан (113 мг, 0.132 ммоль, 95%) в инертной атмосфере азота. После перемешивания в атмосфере азота при 100°С в течение ночи, смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью петролейный эфир/этилацетат (0-100%, 40 мин) с получением трет-бутил N-[3-(2-бензамидо-4-метокси-1,3-бензотиазол-7-ил)фенил]карбамата (390 мг, 86%, чистота 92%) в виде желтого твердого вещества. МС: m/z=477.0 [М+Н]⁺.

k. трет-бутил N-[3-(2-амино-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил)фенил]карбамат

К перемешиваемому раствору трет-бутил N-(3-[2-бензамидо-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил]фенил)карбамата (390 мг, 0.753 ммоль, 92%) в МеОН при комнатной температуре по каплям добавляли NaOH (318 мг, 7.55 ммоль, 95%), растворенный в воде (10 мл). Смесь перемешивали при 90°С в течение ночи, концентрировали в вакууме и водный слой 3 раза экстрагировали дихлорметаном (30 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрования, фильтрат концентрировали при пониженном давлении досуха с получением трет-бутил N-[3-(2-амино-4-метокситиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил)фенил]карбамата (220 мг, 54%, чистота 69%) в виде желтого твердого вещества. Сырой продукт непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z=372.9 [М+Н]⁺.

1. фенил N-[7-(3-[[трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамат

К перемешиваемой смеси трет-бутил N-(3-[2-амино-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил]фенил)карбамата (220 мг, 0.405 ммоль, 69%) и K₂CO₃ (294 мг, 2.02 ммоль, 95%) в ТГФ (15 мл) в атмосфере азота по каплям добавляли фенил хлорформиат (333 мг, 2.02 ммоль, 95%) и пиридин (168 мг, 2.02 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение дополнительных 4 ч при 50°. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, разбавляли водой (30 мл) и 3 раза экстрагировали дихлорметаном (30 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрования, фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением фенил N-[7-(3-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамата (350 мг, 74%, чистота 52%) в виде желтого твердого вещества. Сырой продукт непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z=613.3 [М+Н]⁺.

m. N-[4-метокси-7-(1-метил-1Н-пиразол-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-4-(метоксиметил)бензамид, 14

К перемешиваемой смеси фенил N-[7-(3-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамата (350 мг, 0.297 ммоль, 52%) и гидрохлорида 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана (111 мг, 0.594 ммоль, 95%) в ТГФ в атмосфере азота по каплям добавляли диизопропилэтиламин (242 мг, 1.78 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение ночи при 60° и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью петролейный эфир/этилацетат (1:1) с получением трет-бутил N-[3-[4-метокси-2-([8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбонил]амино)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил]фенил]карбамата (176 мг, 89%, чистота 81%) в виде желтого твердого вещества. МС: m/z=540.3 [М+Н]⁺.

n. N-[7-(3-аминофенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид, 39

К перемешиваемой смеси трет-бутил N-[3-[4-метокси-2-([8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбонил]амино)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-7-ил]фенил]карбамата (176 мг, 0.264 ммоль, 81%) в МеОН по каплям добавляли 4 и. раствор HCl в 1,4-диоксане (2.00 мл, 8.00 ммоль, 95%) при 0°С. Смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч при комнатной температуре, концентрировали досуха и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (2#SHIMADZU (HPLC-01), колонка: XBridge Prep OBD С18 Column, 30×150 мм 5 мкм; подвижная фаза: вода/ACN (30% фазы В вплоть до 60% в течение 8 мин); детектор: 254 УФ) с получением N-[7-(3-аминофенил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамида (60.0 мг, 80%, чистота 99%) в виде белого твердого вещества. ВЭЖХ: чистота 99.0%, RT=3.19 мин. МС: m/z=440.1 [М+Н]⁺. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6, м.д.): 11.31 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.16 (t, J=7.8 Гц, 1H), 6.84 (t, J=2.0 Гц, 1Н), 6.78-6.73 (m, 1H), 6.66-6.59 (m, 1Н), 5.30 (s, 2Н), 4.02 (s, 3Н), 3.69-3.44 (m, 4Н), 1.81 (s, 2Н), 1.50 (t, J=5.4 Гц, 4Н).

3. N-(6-фтор-4-метокси-7-тетрагидропиран-4-илтиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил)-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

о. N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

В 500-мл круглодонной колбе к раствору N-[7-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-4-метокси-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (4.10 г, 9.90 ммоль, 89%) в 100 мл МеОН в атмосфере азота добавляли Pd/C (10%, 19.6 г). Смесь перемешивали при 50°С в течение 3 дней в атмосфере водорода, фильтровали через набивку целита и концентрировали при пониженном давлении досуха. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью петролейный эфир/этилацетат (1:1) с получением N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (2.60 г, 54%, чистота 76%) в виде желтого твердого вещества. МС: m/z=370.1 [М+Н]⁺.

р. N-[6-бром-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

В 50-мл круглодонную колбу помещали N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид (2.60 г, 5.34 ммоль, 76%) и N-бром-сукцинимид (1.20 г, 6.40 ммоль, 95%) в ДМФА (30 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Реакцию затем останавливали путем добавления воды и смесь концентрировали досуха. Остаток наносили на колонку с силикагелем с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир (0-50%) с получением N-[6-бром-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида (2.50 г, 92%, чистота 88%) в виде желтого твердого вещества. МС: m/z=449.1 [М+Н]⁺.

q. N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-6-(триметилстаннил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

В 50-мл реактор высокого давления, который продували и в котором поддерживали инертную атмосферу азотом, помещали N-[6-бром-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид (2.50 г, 4.92 ммоль, 88%), Pd(PPh₃)₄ (1.44 г, 1.18 ммоль, 95%) и гексаметилдистаннан (1.70 г, 4.92 ммоль, 95%) в диоксане (35 мл). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 1 ч при 110°С. Реакцию затем останавливали путем добавления воды и смесь концентрировали досуха. Остаток наносили на колонку с силикагелем с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир (0-50%). Это приводило к 2.30 г (70%, чистота 79%) N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-6-(триметилстаннил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида в виде белого твердого вещества. МС: m/z=449.1 [М+Н]⁺.

r. N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид

В 100-мл круглодонную колбу помещали N-[4-метокси-7-(оксан-4-ил)-6-(триметилстаннил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид (2.30 г, 3.43 ммоль, 79%) и Selectfluor (2.56 г, 6.85 ммоль, 95%) в ацетонитриле (50 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Реакцию затем останавливали путем добавления воды и смесь концентрировали досуха. Остаток наносили на колонку с силикагелем с использованием смеси этилацетат/гексан (0-50%). Это приводило к 1.50 г (91%, чистота 81%) N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамида в виде белого твердого вещества. МС: m/z=388.1 [М+Н]⁺.

s. 6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-амин

В 20-мл запаянную трубку, которую продували и в которой поддерживали инертную атмосферу азотом, помещали N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]бензамид (1.50 г, 3.12 ммоль, 81%) в МеОН (20 мл). При к.т. добавляли NaOH (1.27 г, 31.2 ммоль, 98%), растворенный в воде (20 мл), и полученный в результате раствор перемешивали в течение 16 ч при 100°С. Полученную в результате смесь концентрировали и водный раствор 3 раза экстрагировали 100 мл дихлорметана. После фильтрования фильтрат упаривали досуха и использовали без дополнительной очистки с получением 6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-амина (320 мг, 32%, чистота 89%) в виде не совсем белого твердого вещества. МС: m/z=284.1 [М+Н]⁺.

t. фенил N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамат

К смеси 6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридина-амина (25 мг, 0.078 ммоль, 89%) и K₂CO₃ (56.9 мг, 0.391 ммоль, 95%) в ТГФ (3.00 мл) по каплям добавляли фенил хлорформиат (64.5 мг, 0.391 ммоль, 95%) и пиридин (32.6 мг, 0.391 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Полученную в результате смесь перемешивали в течение 6 ч при 50°С в атмосфере азота. Реакцию останавливали путем добавления воды (10 мл) и полученную в результате смесь два раза экстрагировали дихлорметаном (10 мл). Объединенные органические слои промывали соляным раствором (10 мл), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении с получением N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамата (60.0 мг, 73%, чистота 50%). Сырой продукт непосредственно использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС: m/z=524.1 [М+Н]⁺.

u. N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

К смеси фенил N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-N-(феноксикарбонил)карбамата (50 мг, 0.047 ммоль, 50%) и гидрохлорида 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана (26.5 мг, 0.142 ммоль, 95%) в ТГФ (3.00 мл) добавляли диизопропилэтиламин (38.6 мг, 0.284 ммоль, 95%) при комнатной температуре. Полученную в результате смесь перемешивали в течение 16 ч при 60°С в атмосфере азота. Смесь разбавляли водой (10 мл) и 3 раза экстрагировали дихлорметаном (10 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (2#SHIMADZU (HPLC-01): колонка: XBridge Prep OBD С18 30×150 мм, 5 мкм; подвижная фаза: вода/ацетонитрил, детектор: УФ). Это приводило к N-[6-фтор-4-метокси-7-(оксан-4-ил)-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамиду (12.4 мг, 57%) в виде светло-желтого твердого вещества. ВЭЖХ: чистота 97.9%, RT=5.93 мин. МС: m/z=451.2 [М+Н]⁺. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6, м.д.): 11.31 (s, 1H), 3.99-3.94 (m, 5Н), 3.61-3.45 (m, 10Н), 3.12 (t, J=12.4 Гц, 1H), 2.03 (q, J=12.5 Гц, 2Н), 1.82 (s, 2Н), 1.65-1.62 (m, 2Н),1.50 (s, 4Н).

4. N-[5-(дифторметил)-4-оксо-7-фенил-5лямбда4-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

v N-[4-гидрокси-7-фенил-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

В 25-мл круглодонную колбу помещали N-[4-метокси-7-фенил-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид (200 мг, 0.458 ммоль, 97%) в дихлорметане (8 мл). По каплям добавляли BBr₃ (0.138 мл, 0.138 ммоль, 1М в дихлорметане) при 0°С, и полученный в результате раствор перемешивали в течение дополнительных 2 ч при 0°С. Реакцию затем останавливали путем добавления ледяной воды. Смесь 3 раза экстрагировали дихлорметаном (10 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении. Остаток наносили на колонку с силикагелем с использованием смеси дихлорметан/метанол (0-30%) с получением 150 мг (78%, чистота 98%) N-[4-гидрокси-7-фенил-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамида в виде белого твердого вещества. МС: m/z=411.2 [М+Н]⁺.

w N-[5-(дифторметил)-4-оксо-7-фенил-5лямбда4-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид

В 50-мл запаянную трубку, которую продували и в которой поддерживали инертную атмосферу азотом, помещали N-[4-гидрокси-7-фенил-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамид (100 мг, 0.238 ммоль, 98%) и безводный Na₂SO₄ (3.37 мг, 0.024 ммоль, 98%) в ацетонитриле (5 мл). К этой смеси добавляли 2,2-дифтор-2-(фторсульфонил)уксусную кислоту (50.8 мг, 0.285 ммоль, 98%) при комнатной температуре, и полученный в результате раствор перемешивали в течение дополнительных 3 ч при комнатной температуре. Реакцию затем останавливали путем добавления воды (20 мл). Смесь 3 раза экстрагировали дихлорметаном (10 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (2#SHIMADZU (HPLC-01): колонка: Xselect CSH OBD Column 30*150 мм, 5 мкм, подвижная фаза: вода/ацетонитрил; детектор: УФ). Это приводило к N-[5-(дифторметил)-4-оксо-7-фенил-5 лямбда4-[1,3]тиазоло[4,5-с]пиридин-2-ил]-8-окса-2-азаспиро[4.5]декан-2-карбоксамиду (20.0 мг, 17%) в виде белого твердого вещества. Мр=225-226°С. ВЭЖХ: чистота 95.1%, RT=6.27 мин. МС: m/z=461.2 [М+Н]⁺. 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6, м.д.) 11.57 (s, 1H), 8.08 (d, J=8.6 Гц, 1H), 7.89 (s, 1Н), 7.72 (d, J=7.9 Гц, 2Н), 7.54 (dt, J=32.6, 7.5 Гц, 3Н), 3.52 (s, 7Н), 3.30 (s, 1H), 1.81 (d, J=38.2 Гц, 2Н), 1.50 (s, 4Н).

Пример 3: Исследование соединений настоящего изобретения на ингибирующую активность в отношении человеческих аденозиновых рецепторов в рекомбинантных клетках.

Функциональную активность человеческих рецепторов A_2A, A_2B, A₁ и А₃ определяли путем определения количества цАМФ, являющегося вторичным мессенджером для аденозиновых рецепторов.

Для этой цели рекомбинантные клетки HEK293, экспрессирующие человеческие рецепторы A_2A или A_2B (оба сопряженные с Gg-белками), высевали в 394-луночные микротитрационные планшеты и добавляли исследуемые соединения и агонист (NECA). После 15 минут инкубации добавляли реагенты HTRF (cAMP dynamic 2, Cis Bio), и уровни цАМФ в клетках определяли с использованием планшет-ридера ENVISION (Perkin Elmer).

Для человеческих рецепторов A₁ и А₃ использовали рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие рецептор A₁ или А₃. Поскольку оба рецептора сопряжены с G_i-белками, протокол анализа был адаптирован:

Клетки высевали в 384-луночные планшеты, добавляли форсколин, исследуемые соединения и агонисты (CPA для A₁- и IB-MECA для А₃-рецептора). После 30 минут инкубации добавляли реагенты HTRF (сАМР dynamic 2, Cis Bio), и уровни цАМФ в клетках определяли с использованием планшет-ридера ENVISION (Perkin Elmer).

Полученные исходные данные нормализовали по отношению к ингибиторному контролю и нейтральному контролю (ДМСО), и нормализованные данные выравнивали с использованием программного обеспечения GeneData.

Соединения настоящего изобретения демонстрируют высокую селективность в отношении аденозиновых рецепторов A_2A и A_2B по сравнению с аденозиновыми рецепторами A₁ и А₃ (см., например, данные некоторых примеров соединений настоящего изобретения в таблице 4).

В частности, в отличие от известного антагониста аденозинового рецептора A_2A тозаденанта и подобных бензотиазольных производных (см. таблицу 5), соединения настоящего изобретения неожиданно демонстрируют двойную активность A_2A/A_2B (см. таблицу 4), которая является предпочтительной для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше, или соединения настоящего изобретения демонстрируют, по меньшей мере, высокую ингибирующую активность на A_2A вместе с другими неожиданными преимуществами, раскрытыми в данной заявке, которые приводят к высокой эффективности в лечении и/или предотвращении гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений.

Пример 4: Исследование действия соединений настоящего изобретения в отношении эндогенного человеческого рецептора A_2A.

Эндогенную функциональную активность G_s-связанного человеческого рецептора A_2A измеряли в Т-клетках, где этот рецептор высоко экспрессируется. Определение активности рецептора осуществляли путем определения количества цАМФ, который является вторичным мессенджером для аденозиновых рецепторов.

В общем, человеческие пан-Т-клетки выделяли из человеческих МКПК (набор для выделения пан-Т-клеток MACS, Miltenyi Biotec), которые были получены из свежей цельной крови. Т-клетки высевали в 384-луночные микротитрационные планшеты и обрабатывали исследуемыми соединениями. После 10 минут инкубации при комнатной температуре добавляли агонист аденозинового рецептора A_2A CGS-21680 и планшеты инкубировали еще в течение 45 минут. В заключение в лунки добавляли реагенты HTRF (сАМР Femto Kit, CisBio), и через 1 ч определяли уровни цАМФ в клетках с использованием планшет-ридера ENVISION (Perkin Elmer).

Полученные исходные данные нормализовали по отношению к ингибиторному контролю и нейтральному контролю (ДМСО), и нормализованные данные выравнивали с использованием программного обеспечения GeneData Screener.

Соединения настоящего изобретения демонстрируют, что они способны ингибировать рецептор А_2А, экспрессируемый в человеческих Т-клетках, которые инкубируют с агонистом аденозинового рецептора A_2A CGS-21680 (по данным количественного определения цАМФ), что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше. Таким образом, соединения настоящего изобретения неожиданно способны предотвращать иммуносупрессию и, следовательно, способны поддерживать индуцированное противораковыми Т-клетками ингибирование роста опухоли, уменьшение или разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации.

Пример 5: Исследование фармакокинетических свойств соединений настоящего изобретения у крыс и мышей.

Целью исследования было получение информации о фармакокинетических свойствах соединений настоящего изобретения у самок крыс Вистар/мышей после однократного внутривенного и перорального введения.

Средства и методы:

Эксперименты на животных (прижизненная фаза)

Самкам крыс Вистар/мышей (n=6) вводили либо одну внутривенную (болюсную) инъекцию, либо выполняли пероральное введение (через желудочный зонд) исследуемого соединения. Дозы 0.2 и 10 мг/кг (в перерасчете на соединение) вводили внутривенно и перорально, соответственно, в виде раствора в ДМСО (0.2%)/ПЭГ 200 (40%)/вода для в/в введения и в виде суспензии в Methocel (0.5%)/Tween 20 (0.25%) в воде для перорального дозирования. Последующие образцы крови брали сублингвально при ингаляции изофлурана у 3 животных на один путь введения через 0.1 (только в/в), 0.25 (только перорально), 0.5, 1, 2, 4, 6 и 24 ч и дополнительно обрабатывали для получения плазмы. Также, образцы мочи и кала у 3 крыс на один путь введения собирали в течение промежутка времени от 0 до 24 ч и объединяли для анализа. Биоаналитика:

Концентрации соединений в плазме, фекалиях определяли количественно с использованием СВЭЖХ метода вместе с масс-спектрометрическим детектированием (ЖХ-МС/МС), ранее разработанным в "Институте метаболизма лекарств и фармакокинетики". Система ЖХ-МС/МС состояла из устройства Waters Acquity UPLC в сочетании с АВ Sciex масс-спектрометром API 5500 Q-trap. Разделение посредством СВЭЖХ проводили на колонке с обращенной фазой (HSS Т3, 1.8 мкМ, 2.1×50 мм) с использованием градиента подвижной фазы с 0.1% муравьиной кислоты и ацетонитрилом в качестве элюентов. Детектирование соединений осуществляли с использованием множественного мониторинга реакций в режиме положительной ионизации. В образцы плазмы добавляли внутренний стандарт (20 мкл) и аналит экстрагировали из матрицы с использованием трет-бутилметилового эфира (tBME). Органическую фазу упаривали досуха в потоке азота. Остаток растворяли в смеси ацетонитрил/0.1% муравьиной кислоты для анализа ЖХ-МС/МС. Образцы фекалий гомогенизировали с 4-кратным их объемом смеси этанол/вода (4:1, об./об.). В аликвоты водно-этанольных экстрактов добавляли внутренний стандарт, разбавляли смесью ацетонитрил/вода (1:1, об./об.) и непосредственно вводили в систему ЖХ-МС/МС.

Оценка фармакокинетических показателей:

Фармакокинетические параметры C_max и t_max были взяты из наблюдаемых данных. Площадь под кривой (AUC), клиренс (CL), объем (V), период полувыведения (t_1/2), F и все нормализированные по дозе значения были рассчитаны с использованием специального программного обеспечения "DDS-ТОХ". Значения "DDS-TOX" были оценены для нескольких соединений и показаны сопоставимыми со значениями, предоставленными проверенным программным обеспечением WinNonLin. Значения AUC рассчитывали с помощью некомпартментального анализа с использованием линейно-логарифмического метода трапеций. Числовые данные для средних концентраций в плазме и полученные фармакокинетические параметры были округлены до 3 значащих цифр для представления. Данные о пероральной биодоступности и экскреции - выраженные в % дозы - отображены с использованием 2 значащих цифр.

В отличие от известного антагониста аденозинового рецептора A_2A тозаденанта и подобных бензотиазольных производных, соединения настоящего изобретения неожиданно демонстрируют лучшие фармакокинетические свойства у мыши как у животной модели, актуальной для злокачественного новообразования (см. таблицу 6), что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше.

Пример 6: Исследование действия соединений настоящего изобретения на мышиных Т-клетках

Предпосылки:

Аденозин (Ado) в микроокружении опухоли может ингибировать активность Т-клеток путем передачи сигналов через рецепторы A_2A и подавлять секрецию цитокинов Т-клетками. А_2А-специфические агонисты, такие как NECA, выполняют похожую работу по ингибированию секреции Т-клеток цитокинов in vitro и in vivo. Потенциальные антагонисты A_2A или двойные антагонисты A_2A/A_2B могут спасти Т-клетки от этого ингибирования. В данном случае мы опишем систему in vitro, которую мы создали, используя пан-Т-клетки из селезенки мыши для скрининга потенциальных антагонистов A_2A или двойных антагонистов A_2A/A_2B на их активность. Описанный метод включает использование предварительно покрытых CD3/CD28 гранул для стимуляции пан-Т-клеток, очищенных от спленоцитов мыши, в комбинации с добавлением агониста A_2A вместе с потенциальными антагонистами A_2A или двойными антагонистами A_2A/A_2B для оценки потенцирования продукции цитокинов Т-клетками.

мТ-клеточный анализ, цАМФ, описание анализа:

Пан-Т-клетки выделяют из 6 черных мышей путем ручной диссоциации и очищают с использованием набора для выделения пан-Т-клеток Miltenyi Pan Т-cell isolation kit. Выделенные Т-клетки активируют в 96-луночных планшетах в течение 48 часов с использованием анти-CD3/CD28 гранул в среде для пролиферации Т-клеток.

Через 48 часов, Т-клетки объединяют, подсчитывают и суспендируют в бессывороточной среде, содержащей 0.1% BSA. Клетки высевают в планшеты при плотности 50,000 клеток на лунку в 10 мкл среды и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Исследуемые соединения распределяют в лунки с обеспечением 10-точек ответа на дозу, начиная с концентрации 10 мкМ. После добавления соединения, во все лунки добавляют агонист NECA в концентрации 1 мкМ. Планшеты инкубируют в течение 30 минут при 37°С и анализируют уровни цАМФ с использованием набора реагентов Cisbio cAMP Dynamic2 путем добавления 10 мкл реагентов набора в каждую лунку. Планшеты инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре и сигнал HTRF считывают на планшет-ридере Envision. Исходные данные анализируют в Genedata Screener, а полученные в результате данные загружают в базу данных.

мТ-клеточный анализ, IL-2, описание анализа:

Вкратце, мышиные пан-Т-клетки очищают от тканей селезенки мышей BALB/c с использованием набора для выделения пан-Т-клеток Pan Т cell isolation kit Mouse II (MACS Miltenyi biotech Cat# Order no. 130-095-130) в соответствии с протоколом производителя. Очищенные Т-клетки высевают в 96-луночные полистирольные круглодонные планшеты с микролунками фирмы Nunc™ в среде RPMI с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки. Клетки выдерживают при 37°С в течение 1 ч, и затем активируют предварительно покрытыми CD3/CD28 гранулами (Dynabeads™ Mouse Т-Activator CD3/CD28; Cat# 11456D). Через 30 мин клетки обрабатывают различными дозами исследуемого(-ых) антагониста(-ов). Клетки инкубируют в течение дополнительных 30 мин при 37°С, и затем обрабатывают агонистом А_2А NECA (1 мкМ) или нейтральным контролем (ДМСО). После 24-часовой инкубации уровни IL-2 в супернатантах измеряют с помощью ELISA в соответствии с протоколом производителя (R&D systems Cat# DY402 (IL-2)). Как только концентрации рассчитаны, вычисляют разницу концентрации цитокинов в ДМСО - контроле и в контроле одного агониста, и вычисляют процент спасения каждой концентрацией антагониста, используя Microsoft Excel. Эти проценты спасения цитокинов зависимым от дозы антагониста образом наносят на график с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, и рассчитывают значение IC₅₀.

В отличие от известного антагониста аденозинового рецептора А_2А тозаденанта и подобных соединений (см. таблицу 8), соединения настоящего изобретения демонстрируют, что они способны спасать Т-клетки от ингибирования и способны предотвращать подавление секреции цитокинов, индуцированной аденозином или А_2А специфическими агонистами, такими как NECA (см. таблицу 7), что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше. Таким образом, соединения настоящего изобретения неожиданно способны предотвращать иммуносупрессию и, следовательно, способны поддерживать индуцированное противораковыми Т-клетками ингибирование роста опухоли, уменьшение или разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации.

Пример 7: Исследование действия соединений настоящего изобретения на человеческие Т-клетки

Эндогенную функциональную активность G_s-связанного человеческого рецептора А_2А измеряли в Т-клетках, где этот рецептор высоко экспрессируется. Определение активности рецептора осуществляли путем определения количества цАМФ, который является вторичным мессенджером для аденозиновых рецепторов.

Описание анализа

В общем, человеческие пан-Т-клетки выделяли из человеческих МКПК (набор для выделения пан-Т-клеток MACS, Miltenyi Biotec), которые были получены из свежей цельной крови. Т-клетки высевали в 384-луночные микротитрационные планшеты и обрабатывали исследуемыми соединениями. После 10 минут инкубации при комнатной температуре добавляли агонист аденозинового рецептора А_2А NECA и планшеты инкубировали еще в течение 45 минут. В заключение в лунки добавляли реагенты HTRF (cAMP Femto Kit, CisBio), и через 1 ч определяли уровни цАМФ в клетках с использованием планшет-ридера ENVISION (Perkin Elmer).

Полученные исходные данные нормализовали по отношению к ингибиторному контролю и нейтральному контролю (ДМСО), и нормализованные данные выравнивали с использованием программного обеспечения Genedata Screener.

Соединения настоящего изобретения демонстрируют, что они способны ингибировать рецептор A_2A, экспрессируемый в человеческих Т-клетках, которые инкубируют с агонистом аденозинового рецептора A_2A NECA (по данным количественного определения цАМФ), что является предпочтительным для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений, как раскрыто выше. Таким образом, соединения настоящего изобретения неожиданно способны предотвращать иммуносупрессию и, следовательно, способны поддерживать индуцированное противораковыми Т-клетками ингибирование роста опухоли, уменьшение или разрушение метастазов и предотвращение неоваскуляризации.

Пример 8: Инъекционные флаконы

Раствор 100 г соединения настоящего изобретения и 5 г динатрийгидрофосфата в 3 л бидистиллированной воды доводят до рН 6.5 с помощью 2 н. соляной кислоты, фильтруют в стерильных условиях, переносят в инъекционные флаконы, лиофилизируют в стерильных условиях и герметизируют в стерильных условиях. Каждый инъекционный флакон содержит 5 мг соединения настоящего изобретения.

Пример 9: Раствор

Раствор готовят из 1 г соединения настоящего изобретения, 9.38 г NaH₂PO₄ 2H₂O, 28.48 г Na₂HPO₄ ⋅ 12H₂O и 0.1 г хлорида бензалкония в 940 мл бидистиллированной воды. Значение рН устанавливают на 6.8, и раствор доводят до 1 л и стерилизуют с помощью облучения.

Пример 10: Ампулы

Раствор 1 кг соединения настоящего изобретения в 60 л бидистиллированной воды фильтруют в стерильных условиях, переносят в ампулы, лиофилизируют в стерильных условиях и герметизируют в стерильных условиях. Каждая ампула содержит 10 мг соединения настоящего изобретения.

Claims (24)

1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

и его физиологически приемлемые соли, сольваты и стереоизомеры, включая их смеси во всех соотношениях.

2. Фармацевтический препарат для ингибирования аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B, содержащий по меньшей мере эффективное количество одного соединения по п. 1 и/или его физиологически приемлемые соли, сольваты и стереоизомеры, включая их смеси во всех соотношениях.

3. Фармацевтический препарат по п. 2, дополнительно содержащий наполнители и/или вспомогательные вещества.

4. Способ приготовления фармацевтического препарата, отличающийся тем, что соединение по п. 1 и/или одну из его физиологически приемлемых солей, сольватов и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, вводят в пригодную дозированную форму вместе с твердым, жидким или полужидким наполнителем или вспомогательным веществом.

5. Лекарственное средство для ингибирования аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B, содержащее по меньшей мере одно соединение по п. 1 и/или одну из его физиологически приемлемых солей, сольватов и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики патофизиологических состояний.

6. Лекарственное средство для ингибирования аденозиновых рецепторов A_2A и/или A_2B, содержащее по меньшей мере одно соединение по п. 1 и/или одну из его физиологически приемлемых солей, сольватов и стереоизомеров, включая их смеси во всех соотношениях, для применения для лечения и/или профилактики патофизиологических состояний, выбранных из группы, состоящей из гиперпролиферативных и инфекционных заболеваний и нарушений.

7. Лекарственное средство для применения по п. 6, где гиперпролиферативное заболевание или нарушение представляет собой злокачественное новообразование.

8. Лекарственное средство для применения по п. 7, где злокачественное новообразование выбирают из группы, состоящей из острой и хронической лимфоцитарной лейкемии, острой гранулоцитарной лейкемии, рака коры надпочечников, рака мочевого пузыря, рака головного мозга, рака молочной железы, рака шейки матки, гиперплазии шейки матки, хориокарциномы, хронической гранулоцитарной лейкемии, хронической лимфоцитарной лейкемии, рака ободочной кишки, рака эндометрия, рака пищевода, эссенциального тромбоцитоза, урогенитальной карциномы, глиомы, глиобластомы, волосатоклеточной лейкемии, карциномы головы и шеи, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, карциномы легких, лимфомы, злокачественной карциноидной опухоли, злокачественной гиперкальциемии, злокачественной меланомы, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, медуллярной карциномы щитовидной железы, меланомы, множественной миеломы, фунгоидного микоза, миелоидной и лимфоцитарной лейкемии, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легкого, остеогенной саркомы, карциномы яичника, карциномы поджелудочной железы, истинной полицитемии, первичной карциномы головного мозга, первичной макроглобулинемии, рака предстательной железы, почечно-клеточного рака, рабдомиосаркомы, рака кожи, мелкоклеточного рака легкого, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы и опухоли Вильмса.

9. Лекарственное средство для применения по п. 6, где гиперпролиферативное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, болезни Крона, цирроза, хронических нарушений, связанных с воспалением, пролиферативной диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии, ретролентальной фиброплазии, гранулематоза, иммунной гиперпролиферации, связанной с трансплантацией органа или ткани, и иммунопролиферативного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, псориаза, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), гиперпролиферации сосудов на фоне гипоксии сетчатки и васкулита.

10. Лекарственное средство для применения по п. 6, где инфекционное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из

i) вирусиндуцированных инфекционных заболеваний, которые вызваны ретровирусами, гепаднавирусами, герпесвирусами, флавивирусами и/или аденовирусами, где ретровирусы выбирают из лентивирусов или онкоретровирусов, где лентивирусы выбирают из группы, состоящей из HIV-1, HIV-2, FIV, BIV, вирусов SIV, SHIV, CAEV, VMV и EIAV, и онкоретровирусы выбирают из группы, состоящей из HTLV-I, HTLV-II и BLV, гепаднавирусы выбирают из группы, состоящей из HBV, GSHV и WHV, герпесвирусы выбирают из группы, состоящей из HSV I, HSV II, EBV, VZV, HCMV или HHV 8, и флавивирусы выбирают из группы, состоящей из HCV, вируса Западного Нила и вируса желтой лихорадки,

ii) бактериальных инфекционных заболеваний, которые вызваны грамположительными бактериями, где грамположительные бактерии выбирают из группы, состоящей из метициллин-чувствительных и метициллин-резистентных стафилококков (включая Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus и коагулазоотрицательные стафилококки), Staphylococcus aureus с промежуточной чувствительностью к гликопептидам (GISA), циллин-чувствительных и пенициллин-резистентных стрептококков (включая Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus lactis, Streptococcus sanguis и стрептококки группы С (GCS), стрептококки группы G (GGS) и стрептококки группы «viridans»), энтерококков (включая ванкомицин-чувствительные и ванкомицин-резистентные штаммы, такие как Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium), Clostridium difficile, Iisteria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Chlamydia spp (включая С. pneumoniae) и Mycobacterium tuberculosis,

iii) бактериальных инфекционных заболеваний, которые вызваны грамотрицательными бактериями, где грамотрицательные бактерии выбирают из группы, состоящей из представителей рода Enterobacteriacae, включая Escherichia spp. (включая Escherichia coli), Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp., Shigella spp., представителей рода Pseudomonas (включая P. aeruginosa), Moraxella spp. (включая M. catarrhalis), Haemophilus spp. и Neisseria spp.,

iv) инфекционных заболеваний, индуцированных внутриклеточными активными паразитами, выбранных из группы, состоящей из филума Apicomplexa или Sarcomastigophora (включая Trypanosoma, Plasmodia, Leishmania, Babesia или Theileria), Cryptosporidia, Sacrocystida, Amoebia, Coccidia и Trichomonadia.