RU2487931C1

RU2487931C1 - STRAIN OF YEAST Yarrowia lipolytica VKPM Y-3753 - PRODUCENT OF SUCCINIC ACID

Info

Publication number: RU2487931C1
Application number: RU2012128106/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Павлович Синеокий; Татьяна Ивановна Соболевская; Галина Павловна Лукина; Тигран Владимирович Юзбашев; Евгения Юрьевна Юзбашева; Иван Александрович Лаптев; Татьяна Владимировна Выборная
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2013-07-20

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: strain Yarrowia lipolytica All-Russian collection of industrial microorganisms Y-3753 is proposed - producent of succinic acid. The strain may be produced on nutrient medium, containing glucose as the consumable carbon source, in absence of substances that stabilise pH, succinic acid in amount of up to 60 g/l of cultural fluid.

EFFECT: improved properties of the strain.

1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к технологии микробиологического синтеза янтарной кислоты.The invention relates to the microbiological industry, in particular to the technology of microbiological synthesis of succinic acid.

Янтарная кислота (сукцинат), член семейства С₄-дикарбоновых кислот, является предшественником для получения ряда крупнотоннажных химических продуктов, биодеградируемых полимеров, а также используется в пищевой и фармацевтической промышленности. В настоящее время подавляющая часть янтарной кислоты для промышленного применения вырабатывается с помощью нефтехимического синтеза, что приводит к загрязнению окружающей среды. Поэтому перспективным является развитие конкурентоспособного микробиологического способа производства янтарной кислоты, поскольку он основывается на возобновляемом сырье и является более экологичным.Succinic acid (succinate), a member of the family of the C ₄ dicarboxylic acid is a precursor for the preparation of large number of chemical products, biodegradable polymers, and used in the food and pharmaceutical industries. Currently, the vast majority of succinic acid for industrial use is produced using petrochemical synthesis, which leads to environmental pollution. Therefore, the development of a competitive microbiological method for the production of succinic acid is promising, since it is based on renewable raw materials and is more environmentally friendly.

Известен штамм-продуцент янтарной кислоты Mannheimia succiniciproducens PALK (КСТС 10973 ВР) (ЕР 2054502), анаэробное культивирование которого на глюкозе, в условиях поддержания рН на уровне 6,5 с помощью подачи раствора аммиака, позволяет получить 46 г/л сукцината.A known strain producing succinic acid Mannheimia succiniciproducens PALK (CCC 10973 BP) (EP 2054502), anaerobic cultivation of which on glucose, while maintaining a pH of 6.5 with the help of a solution of ammonia, allows to obtain 46 g / l of succinate.

Накопление 99 г/л сукцината штаммом Escherichia coli AFPlll/pTrc99A-pyc осуществляют в процессе двухстадийной ферментации (J Ind Microbiol Biotechnol. 2002, Jun; 28(6):325-32). На первой стадии культуру наращивают аэробно, после чего следует анаэробная стадия, при этом рН культуры поддерживают на уровне 7,0 путем добавления NaOH.The accumulation of 99 g / l of succinate by the strain Escherichia coli AFPlll / pTrc99A-pyc is carried out in a two-stage fermentation process (J Ind Microbiol Biotechnol. 2002, Jun; 28 (6): 325-32). In the first stage, the culture is increased aerobically, followed by the anaerobic stage, while the pH of the culture is maintained at 7.0 by adding NaOH.

Основным недостатком используемых в настоящее время бактериальных продуцентов является то, что их выращивание требует поддержания рН, близкого к нейтральному, что приводит к образованию в культуральной жидкости солей янтарной кислоты, для превращения которых обратно в янтарную кислоту необходимо использовать сильную неорганическую кислоту.The main disadvantage of the currently used bacterial producers is that their growth requires maintaining a pH close to neutral, which leads to the formation of succinic acid salts in the culture fluid, to convert which back to succinic acid it is necessary to use a strong inorganic acid.

Затраты, связанные с поддержанием рН культуры и последующего перевода целевого продукта из соли в кислоту, составляют значительную часть себестоимости янтарной кислоты, поэтому в настоящее время актуальна задача разработки продуцентов, устойчивых к янтарной кислоте при низких значениях рН и способных обеспечить получение янтарной кислоты без применения нейтрализующего агента.The costs associated with maintaining the pH of the culture and the subsequent conversion of the target product from salt to acid make up a significant part of the cost of succinic acid, therefore, the task of developing producers resistant to succinic acid at low pH and capable of producing succinic acid without the use of neutralizing agents is currently relevant. agent.

В качестве перспективных объектов для разработки таких продуцентов могут быть рассмотрены дрожжи, обладающие способностью приспосабливаться к низким значениям рН среды и технологичные при культивировании.As promising objects for the development of such producers, yeast can be considered that have the ability to adapt to low pH values and are technologically advanced during cultivation.

Известен дикий штамм дрожжей Candida zeylanoides VKM Y-2324, продуцирующий 9,4 г/л янтарной кислоты при культивировании на этаноле в качестве источника углерода, в условиях поддержания рН среды на уровне 5,0 (Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Овчинникова, 2006, т. 2, №4: 7-19). Однако увеличение продуктивности данного организма ограничивается отсутствием разработанного генно-инженерного инструментария.Known wild strain of yeast Candida zeylanoides VKM Y-2324, producing 9.4 g / l of succinic acid when cultivated on ethanol as a carbon source, while maintaining the pH of the medium at 5.0 (Ovchinnikov Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology , 2006, vol. 2, No. 4: 7-19). However, the increase in the productivity of this organism is limited by the lack of developed genetic engineering tools.

Описан рекомбинантный штамм Saccharomyces cerevisiae SUC-194, продуцирующий при росте на среде с глюкозой 19,5 г/л янтарной кислоты (WO 2010/118932). Для получения наибольшего количества биомассы культуру сначала наращивают в течение 24 часов аэробно при рН 5,0, а на второй стадии культивирование осуществляют в течение 90 часов в анаэробных условиях, без регулирования рН, уровень которого в итоге снижается до 3,25.A recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae SUC-194 is described which produces 19.5 g / l succinic acid upon growth on a medium with glucose (WO 2010/118932). To obtain the largest amount of biomass, the culture is first grown aerobically within 24 hours at pH 5.0, and in the second stage, cultivation is carried out for 90 hours under anaerobic conditions, without pH adjustment, the level of which ultimately drops to 3.25.

В работе (RU 2422526) для получения янтарной кислоты предложено использовать штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica со сниженной активностью фермента сукцинатдегидрогеназы, наиболее продуктивный из которых, штамм ВКПМ Y-3314 (с инактивированным геном SDH2), продуцирует около 20 г/л янтарной кислоты при росте на полной питательной среде с глицерином, без добавления веществ, стабилизирующих рН. Однако предложенные штаммы оказались практически не способны расти без рН - статирования на средах с глюкозой (продукция менее 1 г/л культуральной жидкости, табл.), которая является более дешевым углеродсодержащим субстратом.In (RU 2422526), it was proposed to use succinic acid strains Yarrowia lipolytica with reduced activity of the enzyme succinate dehydrogenase, the most productive of which, the VKPM strain Y-3314 (with the SDH2 inactivated gene), produces about 20 g / l of succinic acid when grown on complete nutrient medium with glycerol, without the addition of pH stabilizing substances. However, the proposed strains were practically incapable of growing without pH-stating on media with glucose (production of less than 1 g / l of culture fluid, table), which is a cheaper carbon-containing substrate.

Технической задачей заявляемого изобретения является расширение ассортимента штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica, способных продуцировать янтарную кислоту.An object of the invention is to expand the range of Yarrowia lipolytica yeast strains capable of producing succinic acid.

Поставленная задача решена созданием штамма Yarrowia lipolytica, способного при росте на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве расходуемого углеродсодержащего компонента и без добавления веществ, стабилизирующих рН, продуцировать янтарную кислоту в количестве до 60 г/л культуральной жидкости.The problem was solved by creating a strain of Yarrowia lipolytica, capable of producing succinic acid in an amount of up to 60 g / l of culture fluid when grown on a nutrient medium containing glucose as a consumable carbon-containing component and without adding pH stabilizing substances.

Заявляемый штамм получен из штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3314 путем многоступенчатого мутагенеза с использованием нитрозогуанидина и последующей двухэтапной селекции. Первичный отбор мутантов осуществляли по способности к росту на агаризованной среде с глюкозой, в качестве единственного источника углерода, при низких значениях рН, а на втором этапе - по способности к продукции янтарной кислоты в жидкой культуре.The inventive strain was obtained from Yarrowia lipolytica VKPM Y-3314 strain by multistage mutagenesis using nitrosoguanidine and subsequent two-stage selection. The primary selection of mutants was carried out according to their ability to grow on an agar medium with glucose, as the only carbon source, at low pH values, and at the second stage, according to their ability to produce succinic acid in liquid culture.

Заявляемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под регистрационным номером ВКПМ Y-3753.The inventive strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (Russia, 117545 Moscow, 1st Road passage, 1) under registration number VKPM Y-3753.

Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological characters.

На модифицированной полной среде YPD (мас.%: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность складчатая, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.On modified YPD complete medium (wt.%: Glucose - 2, yeast extract - 1; peptone - 1, agar - 1.8, water - the rest), after four days of cultivation, the strain forms colonies with a diameter of 1-1.5 mm, with cream a shade. The edge of the colonies is uneven, the surface is folded, forms a similar funnel, the vertical growth of the colonies is expressed.

В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.In a similar liquid medium, a three-day culture has cells heterogeneous in size: from round to very elongated (2-4.5) × (4-22) microns, forms true and pseudomycelia.

На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), лейцина (0,01%), карбоната кальция (1%) и фосфатного буфера (50 мМ, рН 6,8), после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.On agar medium YNB (Himedia) supplemented with glucose (2%), leucine (0.01%), calcium carbonate (1%) and phosphate buffer (50 mM, pH 6.8), after six days of cultivation, the culture forms colonies almost white, with a diameter of 1-1.5 mm. After 3-5 days, the surface of the culture becomes folded, and the diameter of free-standing colonies can reach 3 mm.

Физиолого-биохимические признакиPhysiological and biochemical characteristics

Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину, лейцину. Не патогенен. Температура роста 28-30°С.Obligate aerob. No fermentation. Utilizes glucose, glycerin. It does not grow on ethanol, succinic and acetic acids, as the sole carbon source. Auxotroph on thiamine, leucine. Not pathogenic. The growth temperature is 28-30 ° C.

Штамм хранят в виде лиофильно высушенной культуры или в 10% глицерине при -70°С.The strain is stored as a freeze-dried culture or in 10% glycerol at -70 ° C.

Изобретение характеризуется следующим примером.The invention is characterized by the following example.

Пример. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753. Посевной материал получают высевая культуру, хранящуюся в 10% глицерине при -70°С, на среду, содержащую (мас.%): глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, карбонат кальция - 1, агар - 1,8, вода - остальное. Выращивают в течение 3 суток и для засева одной пробирки используют полную петлю посевного материала.Example. The cultivation of the strain Yarrowia lipolytica VKPM Y-3753. Inoculum is obtained by sowing a culture stored in 10% glycerol at -70 ° C on a medium containing (wt.%): Glucose - 2, yeast extract - 1; peptone - 1, calcium carbonate - 1, agar - 1.8, water - the rest. Grown for 3 days and for sowing one tube using a full loop of seed.

Культивируют штамм в пробирках при температуре 30°С при 250 об/мин в 5 мл полной питательной среды следующего состава (мас.%): глюкоза - 11; дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, вода - остальное. Время выращивания - 96 часов.The strain is cultured in test tubes at a temperature of 30 ° C at 250 rpm in 5 ml of a complete nutrient medium of the following composition (wt.%): Glucose - 11; yeast extract - 1; peptone - 1, water - the rest. Growing time is 96 hours.

Концентрацию янтарной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ с использованием системы Waters HPLC (Waters, США), колонки с обратной фазой ReproSil-Pur C18-AQ (4mm x 250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Германия) по методу, описанному в (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. l07(4): 673-682). Остаточную концентрацию глюкозы определяют спектрофотометрически глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Диаком Глюкоза» (Диаком-ВНЦМДЛ, Россия) согласно инструкции производителя.The concentration of succinic acid in the culture fluid was determined by HPLC using a Waters HPLC system (Waters, USA), ReproSil-Pur C18-AQ reverse phase columns (4mm x 250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Germany) according to the method described in (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. l07 (4): 673-682). The residual glucose concentration is determined spectrophotometrically by the glucose oxidase method using the Diacom Glucose reagent kit (Diacom-VNCMDL, Russia) according to the manufacturer's instructions.

По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 60 г/л, конверсия по глюкозе - 57%, конечное значение рН 3.At the end of the cultivation, the succinic acid content in the culture fluid is 60 g / l, glucose conversion is 57%, and the final pH value is 3.

Продукция янтарной кислоты штаммом Y. lipolytica ВКПМ Y-3753 при культивировании на среде, содержащей глюкозу в качестве расходуемого углеродсодержащего компонента и без добавления веществ, стабилизирующих рН, приведена в таблице.The production of succinic acid by Y. lipolytica strain VKPM Y-3753 when cultured on a medium containing glucose as a consumable carbon-containing component and without adding pH stabilizing substances is given in the table.

Регистрационный номер штаммаStrain registration number № цикла/ № клонаCycle No. / Clone No. Продукция янтарной кислоты, г/лSuccinic acid production, g / l ВКПМ Y-3314VKPM Y-3314 ИсходныйSource 0,50.5 ВКПМ Y-3753VKPM Y-3753 4/64/6 6060

Таким образом, получен высокопродуктивный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий производить янтарную кислоту путем конверсии глюкозы без добавления титрующих агентов, перспективный для использования в промышленности.Thus, a highly productive strain of Yarrowia lipolytica yeast was obtained, which allows the production of succinic acid by glucose conversion without the addition of titrating agents, which is promising for industrial use.

Claims

The yeast strain Yarrowia lipolytica VKPM Y-3753 is a producer of succinic acid.