RU2390009C2

RU2390009C2 - Method of assessing nucleic acid depurination and device to this end

Info

Publication number: RU2390009C2
Application number: RU2008132249/28A
Authority: RU
Inventors: Ирина Игоревна Никитина (RU); Ирина Игоревна Никитина; Оксана Викторовна Бондарь (RU); Оксана Викторовна Бондарь; Тимур Илдарович Абдуллин (RU); Тимур Илдарович Абдуллин
Original assignee: Ирина Игоревна Никитина; Оксана Викторовна Бондарь; Тимур Илдарович Абдуллин
Priority date: 2008-08-04
Filing date: 2008-08-04
Publication date: 2010-05-20
Also published as: RU2008132249A

Abstract

FIELD: physics.

SUBSTANCE: in the method of assessing depurination of nucleic acid under the effect of internal and external factors, depurination assessment is carried out electrochemically by adsorbing depurination products on a working electrode modified with carbon nanomaterials. Guanine oxidation current released from the analysed sample during depurination is recorded and nucleic acid depurination is determined from the guanine oxidation peak on the voltametric curve. The value of the oxidation peak is proportional to intensity of the assessed depurination.

EFFECT: invention simplifies and cuts on analysis time, increases selectivity, increases labour efficiency during analysis, increases accuracy of results.

5 cl, 3 dwg

Description

Предлагаемое изобретение относится к области физики и может быть использовано для анализа материалов с помощью биохимических электродов.The present invention relates to the field of physics and can be used to analyze materials using biochemical electrodes.

Депуринизация - высвобождение пуриновых оснований из ДНК или РНК в результате гидролиза N-гликозидной связи - один из наиболее распространенных процессов, вызывающих повреждение нуклеиновых кислот в живых организмах. Депуринизация приводит к мутациям и развитию заболеваний [1]. В связи с этим, оценка интенсивности депуринизации нуклеиновых кислот под действием различных факторов позволяет делать вывод об их (факторов) влиянии на живые организмы, например - для экологического мониторинга генотоксических соединений.Depurinization - the release of purine bases from DNA or RNA as a result of hydrolysis of an N-glycosidic bond is one of the most common processes that cause damage to nucleic acids in living organisms. Depurinization leads to mutations and the development of diseases [1]. In this regard, an assessment of the intensity of nucleic acid depurinization under the influence of various factors allows us to conclude that they (factors) affect living organisms, for example, for environmental monitoring of genotoxic compounds.

Известен способ оценки депуринизации, основанный на использовании меченного биотином о-(карбоксиметил)гидразиламина, который специфически связывается с участками депуринизации [2]. Недостатком известного способа [2] является необходимость выполнения трудоемких и длительных процедур с применением токсичных химических реагентов. Кроме того, низка достоверность результатов определения.A known method for evaluating depurinization, based on the use of biotin-labeled o- (carboxymethyl) hydrazylamine, which specifically binds to depurinization sites [2]. The disadvantage of this method [2] is the need for time-consuming and lengthy procedures using toxic chemicals. In addition, the reliability of the determination results is low.

Известен способ оценки интенсивности депуринизации [3], наиболее близкий по существу к заявляемому способу. Способ [3] осуществляют путем хроматографирования продуктов депуринизации. Способ предполагает разделение продуктов депуринизации на колонке с сорбентом, последующее концентрирование элюата и спектрофотометрическое определение концентрации пуриновых оснований.A known method for assessing the intensity of depurinization [3], the closest to the essence of the claimed method. Method [3] is carried out by chromatography of depurinization products. The method involves the separation of depurinization products on a column with a sorbent, subsequent concentration of the eluate and spectrophotometric determination of the concentration of purine bases.

Недостатком способа [3] является его трудоемкость, связанная с проведением и оптимизацией хроматографического разделения, неоптимальная (превышающая продолжительность рабочего дня) длительность анализа (12-14 часов), недостаточная воспроизводимость и низкая достоверность результатов, а также необходимость использования большого количества разнообразных реактивов и материалов, например элюирующих буферов, сорбентов.The disadvantage of the method [3] is its complexity associated with carrying out and optimization of chromatographic separation, non-optimal (longer than the working day) analysis time (12-14 hours), insufficient reproducibility and low reliability of the results, as well as the need to use a large number of various reagents and materials e.g. eluting buffers, sorbents.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и сокращение продолжительности анализа, повышение избирательности, повышение производительности труда при анализе, повышение достоверности и точности результатов.The aim of the invention is to simplify and reduce the duration of the analysis, increase selectivity, increase labor productivity in the analysis, increase the reliability and accuracy of the results.

Цель достигают тем, что депуринизацию оценивают электрохимическим методом с использованием модифицированного электрода. Продукты депуринизации адсорбируют на модифицированном электроде и выполняют электрохимическое определение высвобождающегося при депуринизации гуанина. Для модификации электрода используют наноразмерные материалы. Для модификации электрода используют нанотрубки. Для модификации электрода используют нановолокна. Для модификации электрода используют наноконусы. Для модификации электрода используют углеродные наноматериалы.The goal is achieved by the fact that depurinization is evaluated by the electrochemical method using a modified electrode. Depurinization products are adsorbed on the modified electrode and the electrochemical determination of guanine released during depurinization is performed. To modify the electrode using nanoscale materials. Nanotubes are used to modify the electrode. Nanofibers are used to modify the electrode. To modify the electrode, nanocones are used. To modify the electrode, carbon nanomaterials are used.

Для оценки депуринизации нуклеиновых кислот используют устройство - электрохимический анализатор.To assess the depurinization of nucleic acids using a device - an electrochemical analyzer.

Предлагаемое изобретение реализуют, например, следующим образом. Используют электрохимический анализатор, блок-схема которого показана на фиг.1, где 1 - регистрирующее устройство, например потенциостат; 2 - электрохимическая ячейка, содержащая электролит 3; 4 - противоэлектрод, например никелевый; 5 - электрод сравнения, например хлоридсеребряный; 6 - рабочий электрод, например стеклоуглеродный, модифицированный, например, углеродными нанотрубками. Электроды 4, 5, 6 электрохимической ячейки 2 погружены в электролит 3 и соединены, например, электропроводами с регистрирующим устройством 1.The present invention is implemented, for example, as follows. An electrochemical analyzer is used, the block diagram of which is shown in FIG. 1, where 1 is a recording device, for example, a potentiostat; 2 - electrochemical cell containing electrolyte 3; 4 - counter electrode, for example, nickel; 5 - reference electrode, for example silver chloride; 6 - working electrode, for example glassy carbon, modified, for example, carbon nanotubes. The electrodes 4, 5, 6 of the electrochemical cell 2 are immersed in the electrolyte 3 and are connected, for example, by electric wires with a recording device 1.

До начала измерения стандартный электрод, например стеклоуглеродный, модифицируют водной суспензией, например, многостенных углеродных нанотрубок (далее по тексту - УНТ), подвергнутых химическому окислению, например, в смеси азотной и серной кислот. Рабочую поверхность стандартного электрода покрывают, например, с помощью автоматической пипетки слоем УНТ. Таким образом изготавливают рабочий электрод 6.Prior to measurement, a standard electrode, for example, glassy carbon, is modified with an aqueous suspension of, for example, multi-walled carbon nanotubes (hereinafter referred to as CNTs) subjected to chemical oxidation, for example, in a mixture of nitric and sulfuric acids. The working surface of a standard electrode is coated, for example, using an automatic pipette with a layer of CNTs. Thus, a working electrode 6 is made.

Далее на рабочий электрод 6, например, с помощью автоматической пипетки наносят раствор гуанина заданной концентрации, выдерживают, например, 15 секунд (далее - с) для адсорбции гуанина на рабочем электроде. Затем рабочий электрод с адсорбированным гуанином переносят в электрохимическую ячейку 2, например, трехэлектродную с электролитом 3, не содержащим электроактивных веществ, то есть веществ, не окисляющихся и не восстанавливающихся под действием потенциала. Ячейку 2 подсоединяют к регистрирующему устройству 1, например потенциостату, и при потенциале +0.9 В регистрируют величину тока окисления гуанина, адсорбированного на рабочем электроде 6. Повторяют измерения для различных концентраций гуанина и строят калибровочный график (фиг.2), где по оси абсцисс откладывают значения концентрации гуанина (С, моль/л, далее - М), а по оси ординат - значения тока окисления гуанина (I, µA). Калибровочный график далее используют для определения концентрации гуанина по току его (гуанина) окисления в нуклеиновой кислоте.Next, on a working electrode 6, for example, using an automatic pipette, a solution of guanine of a predetermined concentration is applied, withstand, for example, 15 seconds (hereinafter c) for adsorption of guanine on the working electrode. Then, the working electrode with adsorbed guanine is transferred to an electrochemical cell 2, for example, a three-electrode with an electrolyte 3 that does not contain electroactive substances, that is, substances that are not oxidized and cannot be reduced by the potential. Cell 2 is connected to a recording device 1, for example, a potentiostat, and at a potential of +0.9 V, the oxidation current of guanine adsorbed on the working electrode is recorded 6. Measurements are repeated for different concentrations of guanine and a calibration graph is constructed (Fig. 2), where the abscissa is plotted values of guanine concentration (C, mol / l, hereinafter - M), and along the ordinate axis, the values of guanine oxidation current (I, µA). The calibration graph is then used to determine the concentration of guanine by its current (guanine) oxidation in nucleic acid.

Затем вместо гуанина на рабочий электрод 6 наносят образец нуклеиновой кислоты, в котором необходимо оценить интенсивность депуринизации. Регистрируют ток окисления гуанина, выделившегося из образца при депуринизации. По калибровочному графику находят концентрацию С гуанина в исследуемом образце, соответствующую измеренному значению тока I. По результатам сравнения концентрации С гуанина в исследуемых образцах оценивают степень их (образцов) поврежденности, принимая, что более интенсивная депуринизация соответствует более поврежденным образцам, и наоборот, менее интенсивная депуринизация соответствует менее поврежденным образцам. Результаты оценки интенсивности депуринизации используют для достижения конкретных целей, например для выявления ДНК-повреждающих агентов в различных средах. Действие этих (ДНК-повреждающих) агентов наносит вред здоровью живых организмов, в том числе человека.Then, instead of guanine, a nucleic acid sample is applied to the working electrode 6, in which it is necessary to evaluate the depurinization rate. The oxidation current of guanine released from the sample during depurination is recorded. According to the calibration graph, the concentration of guanine C in the test sample corresponding to the measured value of current I is found. The degree of their damage (samples) is estimated by comparing the concentration of guanine C in the test samples, assuming that more intense depurinization corresponds to more damaged samples, and vice versa, less intense depurinization corresponds to less damaged samples. The results of evaluating the intensity of depurinization are used to achieve specific goals, for example, to identify DNA damaging agents in various environments. The action of these (DNA-damaging) agents is harmful to the health of living organisms, including humans.

Приведенным примером осуществление предлагаемого способа не ограничивается. Например, стандартные электроды в зависимости от потребности и цели исследования изготавливают из различных электропроводящих материалов, например металлов, полупроводников, композитов, полимеров. Модификацию электрода выполняют с использованием различных материалов, например однослойных и/или многослойных нанотрубок, углеродных нановолокон, фуллеренов, наноконусов, нанопластин и других материалов. Для модификации электрода используют нанотрубки, окисленные способами, отличными от приведенного примера, например в атмосфере кислорода и др. Измерения проводят с помощью различных, в том числе известных, средств измерения тока, например полярографов.The above example, the implementation of the proposed method is not limited. For example, standard electrodes, depending on the need and purpose of the study, are made of various electrically conductive materials, for example metals, semiconductors, composites, polymers. Modification of the electrode is carried out using various materials, for example, single-layer and / or multilayer nanotubes, carbon nanofibers, fullerenes, nanoconuses, nanoplates and other materials. To modify the electrode, nanotubes are used that are oxidized by methods other than the above example, for example, in an oxygen atmosphere, etc. Measurements are carried out using various, including well-known, means of measuring current, for example, polarographs.

В основе предлагаемого изобретения лежит использование электрокаталитических свойств УНТ [4], которыми обусловлено интенсивное окисление продуктов депуринизации на модифицированном УНТ электроде 6. Продуктами депуринизации нуклеиновых кислот являются пурины - аденин и гуанин, а также фрагменты ДНК, лишенные пуриновых оснований. Известно [5], что гуанин, как и другие пуриновые основания и их производные, претерпевает интенсивную адсорбцию на электроде 6, модифицированном УНТ. Адсорбция отсутствует на немодифицированных электродах. Так, насыщение поверхности модифицированного электрода гуанином наблюдается уже через 15-30 с выдерживания электрода в 1 мМ растворе вещества, что обусловлено гидрофобными взаимодействиями пуринового гетероцикла с графитовыми стенками УНТ.The basis of the present invention is the use of the electrocatalytic properties of CNTs [4], which are responsible for the intense oxidation of depurinization products on a modified CNT electrode 6. The products of nucleic acid depurinization are purines - adenine and guanine, as well as DNA fragments lacking purine bases. It is known [5] that guanine, like other purine bases and their derivatives, undergoes intense adsorption on the CNT-modified electrode 6. Adsorption is absent on unmodified electrodes. Thus, saturation of the surface of the modified electrode with guanine is already observed after 15-30 s of holding the electrode in a 1 mM solution of the substance, which is due to hydrophobic interactions of the purine heterocycle with the graphite walls of CNTs.

На фиг.3 показаны вольтамперограммы окисления ДНК, адсорбированной на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками, до (I) и после термической депуринизации (II). Вольтамперограмма - это график изменения тока (I, µА), возникающего при окислении вещества при наложении на рабочий электрод 6 потенциала (E, В) относительно электрода сравнения 5.Figure 3 shows voltammograms of the oxidation of DNA adsorbed on an electrode modified with carbon nanotubes before (I) and after thermal depurinization (II). A voltammogram is a graph of the change in current (I, µA) that occurs when a substance is oxidized when a potential (E, B) is applied to the working electrode 6 relative to the reference electrode 5.

Аденин и ДНК окисляются при потенциалах около +1.1 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения 5, что препятствует детектированию аденина в присутствии ДНК. Окисление гуанина, наблюдаемое при потенциале около +0.9 В, не подвержено мешающему влиянию компонентов ДНК. Пик 1 на вольтамперограмме II (см. фиг.3) соответствует пику окисления гуанина, величина которого (пика) пропорциональна интенсивности оцениваемой депуринизации ДНК. Пик 2 соответствует суммарному окислению ДНК и аденина, присутствующего в образце ДНК.Adenine and DNA are oxidized at potentials of about +1.1 V relative to the silver chloride reference electrode 5, which prevents the detection of adenine in the presence of DNA. Guanine oxidation, observed at a potential of about +0.9 V, is not affected by the interfering effect of the DNA components. Peak 1 in voltammogram II (see FIG. 3) corresponds to the peak of guanine oxidation, the magnitude of which (peak) is proportional to the intensity of the estimated DNA depurinization. Peak 2 corresponds to the total oxidation of DNA and adenine present in the DNA sample.

Предлагаемое изобретение применяют, например, для оценки термической депуринизации ДНК в растворах различного состава и рН. Авторами обнаружено, что величина пика 1 гуанина зависит как от времени прогревания, так и от рН и ионной силы раствора. Результаты, полученные с использованием предлагаемого способа, полностью согласуются с общепринятыми данными [1] о кислотном механизме гидролиза N-гликозидной связи и замедлении этого процесса с увеличением ионной силы раствора. Таким образом, результаты применения предлагаемого способа обладают высокой (100%) достоверностью и точностью.The present invention is used, for example, to assess the thermal depurinization of DNA in solutions of various compositions and pH. The authors found that the peak value of 1 guanine depends on both the heating time and the pH and ionic strength of the solution. The results obtained using the proposed method are fully consistent with generally accepted data [1] on the acid mechanism of hydrolysis of the N-glycosidic bond and the slowdown of this process with an increase in the ionic strength of the solution. Thus, the results of the application of the proposed method have high (100%) reliability and accuracy.

Предлагаемое изобретение используют, например, для выявления депуринизации нуклеиновых кислот под действием физических факторов (температура, давление, ионизирующее излучение и др.), а также химических факторов, приводящих к повреждению ДНК (активные формы кислорода, генотоксические антибиотики и ксенобиотики). Кроме того, предлагаемый способ применяют для оценки качества препаратов ДНК, используемых в биохимических и молекулярно-генетических исследованиях. Например, интенсивная депуринизация свидетельствует о низком качестве препаратов ДНК.The present invention is used, for example, to detect depurinization of nucleic acids under the influence of physical factors (temperature, pressure, ionizing radiation, etc.), as well as chemical factors that lead to DNA damage (reactive oxygen species, genotoxic antibiotics and xenobiotics). In addition, the proposed method is used to assess the quality of DNA preparations used in biochemical and molecular genetic studies. For example, intensive depurinization indicates a low quality of DNA preparations.

Преимуществами предложенного способа по сравнению с аналогами и прототипом являются пониженная трудоемкость, отсутствие необходимости разделения продуктов депуринизации с их потерей и затратой трудовых ресурсов, отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов и сложных протоколов. Кроме того, в отличие от аналогов и прототипа, для оценки депуринизации требуется существенно меньший объем образца (менее 5 мкл). Средняя продолжительность анализа одного образца нуклеиновой кислоты с помощью предлагаемого изобретения составляет менее 10 мин, тогда как оценка интенсивности депуринизации известными способами занимает несколько часов (до 12-14).The advantages of the proposed method in comparison with analogues and prototype are reduced complexity, the absence of the need for separation of depurinization products with their loss and labor costs, the absence of the need for expensive reagents and complex protocols. In addition, unlike analogues and prototype, to evaluate depurinization requires a significantly smaller sample volume (less than 5 μl). The average duration of analysis of one nucleic acid sample using the invention is less than 10 minutes, while the assessment of the depurinization intensity by known methods takes several hours (up to 12-14).

Полученные с использованием предлагаемого изобретения данные применяют, например, в медицине, фармакологии, экологии, ветеринарии, научных исследованиях. Предложенный способ адаптируют для получения различных технических решений, например, для создания одноразовых тестов на основе миниатюрных тест-полосок, используемых, например, в медицине, фармакологии, ветеринарии для диагностики и прогнозирования течения заболеваний.Obtained using the proposed invention, the data are used, for example, in medicine, pharmacology, ecology, veterinary medicine, scientific research. The proposed method is adapted to obtain various technical solutions, for example, to create one-time tests based on miniature test strips used, for example, in medicine, pharmacology, veterinary medicine for the diagnosis and prediction of the course of diseases.

Таким образом, техническим результатом изобретения является простота, высокая избирательность, экспрессность детектирования депуринизации образцов нуклеиновых кислот, отсутствие необходимости разделения и концентрирования продуктов депуринизации - то есть повышение достоверности и точности результатов, сопровождающееся повышением производительности и качества труда.Thus, the technical result of the invention is simplicity, high selectivity, rapid detection of depurinization of nucleic acid samples, the absence of the need for separation and concentration of depurinization products - that is, increasing the reliability and accuracy of the results, accompanied by an increase in productivity and quality of labor.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.The present invention satisfies the criteria of novelty, since when determining the level of technology, no means have been found that have characteristics that are identical (that is, matching the functions performed by them and the form in which these signs are performed) to all the signs listed in the claims, including the purpose of the application.

Способ оценки депуринизации имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.The method for evaluating depurinization has an inventive step, since no technical solutions have been identified that have features that match the distinguishing features of this invention, and the influence of the distinctive features on the specified technical result is not known.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности экологических организаций, организаций здравоохранения и животноводства, посредством использования стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.The claimed technical solution can be implemented in the industrial production of diagnostic equipment, in the activities of environmental organizations, healthcare organizations and livestock, through the use of standard technical devices and equipment. This meets the criterion of "industrial applicability" presented to the invention.

ЛитератураLiterature

1. Lindahl, Т., Nyberg, В. Biochemistry. 1972. V.11. Р.3610.1. Lindahl, T., Nyberg, B. Biochemistry. 1972.V.11. R.3610.

2. Nakamura, J. et al. Cancer research. 1998. V.58. P.222.2. Nakamura, J. et al. Cancer research. 1998. V. 58. P.222.

3. Cavalieri, E., Rogan, E. Polycyclic Aromat. Compd. 1996. V.10. P.251.3. Cavalieri, E., Rogan, E. Polycyclic Aromat. Compd 1996. V.10. P.251.

4. Абдуллин, Т.И. и др. Российские нанотехнологии. 2007. Т.2. №7-8. - С.156-160.4. Abdullin, T.I. and other Russian nanotechnology. 2007.V.2. No. 7-8. - S.156-160.

5. Абдуллин, Т.И. и др. Материалы XIV всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Казань, 2007. - С.4.5. Abdullin, T.I. and others. Materials of the XIV All-Russian Conference "Structure and Dynamics of Molecular Systems". - Kazan, 2007. - P. 4.

Claims

1. A method for evaluating the depurinization of nucleic acids under the influence of internal and external factors, characterized in that the depurinization is evaluated electrochemically, adsorbing the depurinization products on a working electrode modified with carbon nanomaterials, and the guanine oxidation current released from the analyzed sample during depurinization is recorded by the peak of guanine oxidation depurinization of nucleic acids is determined on the voltammogram, while the magnitude of the oxidation peak is proportional to the intensity estimated depurinization.

2. The method according to claim 1, characterized in that they use an electrode modified with nanotubes.

3. The method according to claim 1, characterized in that they use an electrode modified with nanofibres.

4. The method according to claim 1, characterized in that they use an electrode modified with nanocones.

5. The device for implementing the method according to claim 1, which is an electrochemical analyzer containing an electrochemical cell with a working electrode modified with carbon nanomaterials, a counter electrode, and a reference electrode immersed in an electrolyte and connected to a recording device designed to provide adsorption of depurinization products on the working electrode and registration of the oxidation current of guanine released from the analyzed sample during depurinization.