PT98949A

PT98949A - Metodo para a producao de proteina histidinol-desidrogenase e do respectivo dna e muteinas e plantas transgenicas

Info

Publication number: PT98949A
Application number: PT98949A
Authority: PT
Inventors: John A Ryals; Alfred Scheidegger; Atsuko Nagai-Hayashi; Eric R Ward
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1992-07-31
Also published as: DE69132935D1; US5290926A; AU8386791A; HU912963D0; BR9103947A; EP0478502B1; ATE213504T1; DE69132935T2; JPH0568544A; IL99458A0; EP0478502A2; HUT62930A; EP0478502A3; IE913244A1; CA2051240A1

Description

0 presente invento está relacionado com métodos de purificação de uma proteína a partir de plantas anteriormente não purificada, proteína purificada por tal método, DNA codificador de tal proteína, métodos de utilização da proteína e DNA para testar inibidores específicos da proteína relativamente a formas alteradas da proteína que são formas menos funcionais da mesma, de modo a produzir uma insensibilidade aos inibidores. A histidinol-desidrogenase [L-Histidinol-NAD Oxi-Redu-tase (EC 1.1.1.23)] catalisa os dois passos finais na biossíntese do aminoácido histidina. Esta reacção é uma oxidação de histidi-nol para histidinal para histidina, a qual está acoplada à redução de duas moles do cofactor NAD necessário por mole de histidina formada.

Histidinol + NAD+ ------> Histidina + 2 NADH

Se bem que a enzima e o gene codificador da mesma tenham sido bem caracterizados na bactéria Salmonella tvnhimurium [Yourno e Ino (1968); Gorisch e Holke (1985); e Grubmeyer et al (1977)] e na levedura Saccharomvces cerevisiae [Shaffer et al. (1972); Keesey et al. (1979)], esta enzima não foi anteriormente purificada até à homogeneidade a partir de quaisquer fontes vegetais. Isto é em parte devido às enzimas das funções metabólicas primárias tais como biossíntese de aminoácidos serem especialmente díficeis de purificar devido à sua baixa concentração no tecido fonte. Nas plantas, esta dificuldade é aumentada devido à existência de compostos fenólicos e outros metabolitos secundários que podem reagir com proteínas ao longo da sua purificação. A biossíntese da histidina na generalidade nas plantas superiores não está bem estudada. Existe alguma evidência

·ί?Γ·ν 'V relativamente à existência nas plantas de uma via^dê' biossíntese semelhante à existente em microorganismos foi obtida a partir de experiências in vivo usando várias plantas diferentes e uma alga azul [Dougall e Fulton (1967); Negrutiu et al. (1985); Heim et aJU (1989); Yavada (1979)]. A actividade de histidinol-desidrogenase foi detectada em dez espécies de plantas diferentes: espargo, couve, pepineiro, beringela, alface, rábano [Wong e Mazelis (1981)], rosa, abóbora [Wong e Mazelis (1981)], nabo [Wong e Mazelis (1981)], frutos [Wong e Mazelis (1981) e este trabalho], rebentos e células em cultura.

Foram feitas apenas algumas tentativas- para estudar as enzimas envolvidas na biossíntese da histidina nas plantas superiores. 0 objectivo até agora impossível de purificar até à homogeneidade qualquer enzima da biossíntese da histidina a partir de plantas parece ser o passo limitante nos estudos bioquímicos. Nos extractos brutos derivados de raízes de cevada, aveia e ervilha, foram detectadas as actividades de ATP-fosforri-bosil-transferase, imidazoleglicerol-fosfato-desidratase e histidinol-fosfato-fosfatase [Wiater et al. (1971)].

Encontrou-se actividade de histidinol-desidrogenase em extractos brutos de diferentes espécies vegetais [Wong et al. (1981)]. Estes resultados sugerem que a biossíntese da histidina nas plantas seguem a mesma via destes microorganismos, se bem que não tenha sido isolada qualquer proteína a partir de plantas e identificada como uma enzima envolvida directamente na biossíntese da histidina.

As vias para a biossíntese dos dez aminoãcidos essenciais à dieta humana são de especial interesse como alvos para o desenvolvimento de novos compostos inibidores que^pbssam actuar como herbicidas. Este interesse é devido à probabilidade de um inibidor específico de qualquer uma das enzimas destas vias ser totalmente não tóxico para vertebrados, os quais não possuem as vias de biossíntese dos aminoácidos essenciais.

Foi portanto um dos principais objectivos do presente invento desenvolver um método de purificação da enzima histidi-nol-desidrogenase a partir de plantas. É ainda um objectivo gerar sequências de DNA codificadoras de uma proteína apresentando actividade de histidinol-de-sidrogenase usando plantas como organismo fonte.

Constitui também um objectivo desenvolver um ensaio para a identificação de novos compostos inibidores que possam actuar como herbicidas.

Surpreendentemente no presente invento foram atingidos estes objectivos.

Assim, o presente invento compreende um novo método de purificação de histidinol-desidrogenase a partir de plantas essencialmente até homogeneidade caracterizando-se por: (a) exposição de um extracto de proteína a uma coluna de cromatografia de permuta iónica para produzir um primeiro eluato na presença de um gradiente linear; (b) exposição do primeiro eluato a uma coluna de cromatografia de afinidade para produzir um segundo eluato na presença de um solvente de deslocamento adequado, em que a referida coluna de cromatografia compreende um ligando específico para a histidinol-desidrogenase; (c) armazenamento do segundo eluato. -V. ? * ί· Γ' Λ

Um outro aspecto do presente invento' e 'af histidinol-de-sidrogenase purificada, preferencialmente tendo a sequência de aminoácidos idêntica ou substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l. 0 presente invento também compreende um método para a produção de uma proteína vegetal recombinante purificada apresentando actividade de histidinol-desidrogenase compreendendo: ο (a) transformação de um organismo hospedeiro adequado com um DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína com actividade de histidinol-desidrogenase; (b) isolamento da proteína a partir do sobrenadante de expressão. 0 invento também compreende um método de produção de uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína apresentando actividade de histidinol-desidrogenase, método esse que se caracteriza por: (a) preparação de uma biblioteca genómica ou de cDNA a partir de um organismo fonte adequado usando uma vector de clonagem adequado; (b) hibridação da biblioteca com uma molécula sonda; ν>· (c) identificação de hibridações positivas da sonda com os clones de DNA da biblioteca, ou seja clones potencialmente contendo a sequência de nucleótidos correspondendo à sequência de aminoácidos da histidinol-desidrogenase.

Também está incluído um método de produção de uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína apresentando actividade de histidinol-desidrogenase, método esse que compreende: (a) preparação de DNA total a partir*defuma biblioteca genómica ou de cDNA; (b) utilização do DNA do passo (a) como um molde para reacção de PCR com iniciadores representando porções de baixa degenerescência da sequência de aminoácidos da histidinol-desi-drogenase.

Está também englobado no presente invento uma proteína vegetal essencialmente pura -natural ou recombinante- apresentando actividade de histidinol-desidrogenase assim como uma sequência de cDNA codificadora da referida proteína. O invento também compreende um cDNA codificador de histidinol-desidrogenase de plantas, o passo final na biossintese da histidina.

Um outro aspecto do presente invento é um ensaio para identificar inibidores da actividade de histidinol-desidrogenase compreendendo: (a) incubação de uma primeira amostra de histidinol-desidrogenase e do seu substrato; (b) medição de uma reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) incubação de uma primeira amostra de histidinol--desidrogenase e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um composto inibidor; (d) medição de uma reactividade inibida da histidinol--desidrogenase do passo (c); e (e) comparação da reactividade inibida com a reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase. J? ΐ

identificar mutantes de histidinol-desidrogenase resistentes a inibidores compreendendo: (a) incubação de uma primeira amostra de histidinol-desidrogenase e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (b) medição de uma reactividade não mutagenizada da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) incubação de uma primeira amostra de uma histidinol--desidrogenase mutagenizada e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (d) medição de uma reactividade mutagenizada da histidinol-desidrogenase mutagenizada do passo (c) ; e (e) comparação da reactividade mutagenizada relativamente â reactividade não mutagenizada da histidinol desidrogena-se.

Outros aspectos do presente invento são inibidores assim identificados assim como composições contendo-os, os mutantes não inibidos da histidinol-desidrogenase, cultivares transgénicos contendo os mutantes não inibidos da histidinol-desidrogenase e métodos para o tratamentos de ervas daninhas utilizando a aplicação de inibidores da histidinol-desidrogenase a colheitas transgénicas contendo os mutantes não inibidos da histidinol-desidrogenase.

Para auxiliar a interpretação do signicado e âmbito do presente invento, os termos que se seguem destinam-se a ter os significados descritos abaixo, a menos que de outra forma seja indicado. Todas as referências citadas neste pedido são aqui incluídas como referência devido aos seus ensinamentos relevantes .

Sequência de DNA codificadora: Unfar 'sequência de DNA que, quando transcrita e traduzida, resulta na formação de um polipeptídeo celular.

Gene: Uma região cromossõmica discreta compreendendo sequências reguladoras de DNA responsáveis pelo controle de expressão, i.e., transcrição e tradução e uma sequência codificadora que é transcrita e traduzida para dar um polipeptídeo distinto.

Quantidade Inibidora Eficaz da Histidinol-Desidroqenase ou Decréscimo Significativo na Actividade de Histidinol-Desidro-genase: Um decréscimo significativo na capacidade da histidinol--desidrogenase para converter substratos tais como histidinol em produtos tais como histidina conforme medido por quantificação da actividade enzimática como é do conhecimento dos familiarizados com a matéria, incluindo constantes de equílibrio, velocidades de reacção do aparecimento de produtos de reacção ou do consumo dos substratos de reacção, cinética de reacção, termodinâmica da reacção,análise espectrofotométrica dos produtos de reacção, detecção de componentes marcados da reacção, etc., sendo o método de medição preferido a medição espectofotométrica de NAD+ como um produto secundário da reacção. Um decréscimo significativo na actividade enzimática é qualquer decréscimo que seja superior ã margem de erro inerente na técnica de medição , de preferência um decréscimo de 5%, mais preferencialmente um decréscimo de 90%, mais preferencialmente um decréscimo de 99% e mais preferencialmente um decréscimo para níveis essencialmente não detectáveis de actividade enzimática.

Homoloaia Substancial de Sequências: Equivalência substancial funcional e/ou estrutural entre sequências de nucleó-tidos ou de aminoãcidos. Diferenças funcionais e/ou estruturais entre sequências tendo homologia substancial' âè.\éequências serão de minimus. As sequências que diferem das sequências naturais são geralmente variantes da sequência natural, uma variante de uma sequência natural é uma forma modificada da sequência modificada que desempenha a mesma função. A variante pode ser uma mutação ou pode ser uma sequência sintética. Uma diferença funcional de minimus resulta de um nucleótido ou sequência de aminoácidos que codifica uma proteína tendo essencialmente as mesmas caracterís-ticas da proteína nativa. Tais características podem incluir, por exemplo, reactividade imunológica, actividade enzimática, integridade proteica estrutural, etc. Diferenças estruturais são consideradas de minimus se existe uma quantidade significativa de sobreposição de sequências ou semelhança entre duas ou mais sequências diferentes ou se as sequências diferentes apresentam propriedades físicas semelhantes. No caso da sequência de nucleó-tidos, as sequências diferentes terão preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente 75%, mais preferencialmente 90% ou mais de semelhança de sequências entre elas. No caso das sequências de aminoácidos, as sequências diferentes têm pelo menos 70%, mais preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% ou mais de semelhança entre os polipeptideos codificados nas sequências de aminoácidos. As propriedades físicas que podem ser semelhantes incluem, por exemplo, mobilidade electroforética, semelhanças cromatográficas, coeficientes em gradientes de sedimentação, etc.

Planta Transoénica: Uma planta tendo estavelmente integrado DNA exógeno no seu material genético. São conhecidos vários métodos diferentes de introdução de DNA exógeno nos protoplastos vegetais, células vegetais ou outro material vegetal e podem ser usados para produzir os protoplastos transgénicos, células transgénicas ou plantas transgénicas do presente invento.

Erva daninha: Qualquer espécie indesejável de planta que cresça entre uma cultura de plantas tais como searas, de preferência qualquer indíviduo de uma espécie que seja heterogéneo para a espécie de uma população homogénea de plantas. 0 presente invento está relacionado com métodos de purificação de uma proteína anteriormente não purificada derivada de plantas, a proteína purificada por tal método, DNA codificador de tal proteína, métodos de utilização da proteína e DNA para testar inibidores específicos da proteína e métodos de utilização de inibidores específicos para testar formas alteradas da proteína que são menos funcionais de forma a produzir uma insensibilidade aos inibidores. 0 método de purificaçãoutiliza uma coluna de cromato-grafia de afinidade que é específica da histidinol-desidrogenase. Podem ser empregues vários métodos conhecidos antes e depois da cromatografia de afinidade para produzir um extracto bruto para aplicar na coluna de afinidade e para caracterizar e guardar a proteína isolada através da coluna de afinidade.

Tais passos anteriores podem incluir homogenização, filtração, centrifugação, precipitação com sais de amónio, remoção de sal, cromatografia de permuta iónica, sonicação, etc. Numa realização preferida do presente invento, o tecido vegetal a partir do qual se obtem a histidinol-desidrogenase é obtido por homogenização usando por exemplo, um misturador. 0 homogenato é então preferencialmente passado através por filtros tais como gase-. 0 filtrado é então preferencialmente centrifugado, de preferência a cerca de 30000 xg durante pelo menos 20 minutos. 0 sobrenadante é então preferencialmente precipitado usando sulfato de amónio entre 40 e 70% da saturação, mais preferencialmente a cerca de 45% a 60% de saturação e o precipitado é colhido e removido o sal usando uma técnica de remoção de sal adequada como seja diálise ou filtração em gel, de preferência usando filtração em gel com Sephadex G-25 com aproximadamente 50 mM TRIS/HCL a um pH entre cerca de 7 e 7,5, de preferência a pH 7,4. O extracto de proteína sem sal pode ser então ainda preparado para cromatografia de afinidade usando uma coluna de permuta iónica adequada. Uma coluna de permuta iónica preferida é por exemplo uma resina derivatizada com Dietil-amino-etil (DEAE), tal como DEAE-celulose, mais preferencialmente DEAE-Toyopearl [uma resina de cromatografia de permuta iónica que pode ser adquirida à TOSOH, Ltd. (Tokyo)], equilibrada com um tampão adequado como seja o tampão usado no passo de remoção do sal, mais preferencialmente 50. mM TRIS/HCL a aproximadamente pH 7,4. A eluição da coluna de permuta iónica pode ser conseguida usando um gradiente linear contendo tampão de equilíbrio e um gradiente salino adequado. Um gradiente salino preferido é um gradiente de NaCl variando entre 0 mM e pelo menos 500 mM. O eluato da coluna de permuta iónica constitui então um extracto bruto aadequado para aplicação na coluna de cromatografia de afinidade.

Ligandos adequados para a coluna de cromatografia são qualquer substrato específico da enzima, histidinol-desidrogena-se, que se pretenda isolar. A ligação do ligando à resina da coluna ocorrerá preferencialmente numa posição no ligando que não interfirirã significativamente com a ligação do ligando à enzima a ser isolada. São ligandos preferidos para a histidinol-desidro-genase o histidinol e histidinal, mais preferencialmente histidi-nol. Qualquer resina adequada pode ser usada para ligar o ligando , sendo uma resina preferida a Sepharose-4B. São do conhecimento geral os métodos para a ligação de ligandos a resinas de cromatograf ia. * = - -S ·' V, ' y í c λ ’

Um método preferido de preparação de uma resina para uma coluna de afinidade adequada é como se segue. Sepharose-4B é activada com epicloroidrina como descrito anteriormente [Matsumoto et al. (1979)]. Gel de Sepharose-4B epoxiactivada foi suspenso em 0,1N NaOH contendo 0,5g de glucose por g de gel e incubado a 40°C num agitador durante 24 horas [Kanamori et al. (1986)]. Apôs lavagem extensiva com água, o gel foi suspenso em metaperiodato de sódio previamente arrefecido e a suspensão agitada durante 1 hora a 4°C. O gel foi lavado com água, suspenso em 0,1 M HC1 e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora. Novamente o gel foi lavado com extensivamente com água, seguido de lavagem com ^ tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0 à temperatura ambiente. 0 gel veículo formilado é suspenso num tampão de fosfatos, preferencialmente um tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0 contendo 100 mM de di-hidrocloreto de histidinol, o qual foi primeiro neutralizado, de preferência pela adição de NaOH e a suspensão incubada a 4°C durante a noite. Cinco miligramas de cianoboro-hidreto de sódio por g de gel foi então adicionado à suspensão e incubado com agitação à temperatura ambiente durante 6 horas. O gel foi lavado extensivamente com água destilada e tratado com 5 mg de boro-hidreto de sódio por g de gel durante 3 horas a 4°C poara converter os restantes grupos formilo em grupos hidroximetilo.

Após preparação de uma resina adequada para coluna de afinidade, a resina é colocada numa coluna adequada, preferencialmente uma coluna de cerca de 2,5 x 8 cm. O extracto bruto da ^ proteína é colocado na coluna de afinidade e preferencialmente lavado extensivamente com um tampão adequado, preferencialmente contendo uma força iónica adequada de sal, e.g. tampão 10 mM TRIS/HCl, cerca de pH 7,3, contendo cerca de 100 mM a 200 mM NaCl, de preferência cerca de 140 mM NaCl. A enzima ligada pode -13-

'w- ser eluida usando um solvente de deslocámehto' adequado. Um solvente de deslocamento adequado é um contendo uma substância que terá uma afinidade para a enzima a ser isolada que é semelhante ao ligando usado na coluna de afinidade. Quando a enzima é histidinol-desidrogenase e o ligando é histidinol, um solvente de deslocamento preferido é um que contenha imidazole, mais preferencialmente um contendo cerca de 50 mM TRIS/HCl, pH cerca de 7,3 e imidazole.

Subsequentemente à cromatografia de afinidade podem ser empregues métodos para caracterizar e guardar a proteína isolada pela cromatografia de afinidade. Estes incluem a remoção do sal do eluato da coluna de cromatografia de afinidade para um sal adequado para remover o solvente de deslocamento. A-proteína sem sal pode então ser ainda caracterizada ou concentrada e guardada criogenicamente, de preferência abaixo de -50°C, mais preferencialmente a cerca de -80°C. A proteína pode ser caracterizada usando técnicas convencionais tais como filtração em gel (massa molecular), electroforese em gel de poliacrilamida [Laemmli (1970)] (pureza e peso molecular), focagem isoeléctrica (ponto isoeléctrico), sequenciação de aminoácidos, ensaios enzimáticos adequados (para medir a actividade enzimática), etc. A actividade enzimática é preferencialmente testada espectrofotometricamente medindo o aumento da absorvância a 340 nm devido à redução de NAD+ num espectrofotómetro, como seja por exemplo um Hitachi U-3120. Numa realização preferida do invento a mistura de reacção contem tampão 150 mM Gli/NaOH, pH 9,2, 0,5 mM MnCl2, 2 mM NAD+, 5 mM histidinol e 2-5 mU de amostra de enzima num volume total de 0,5 ml. A reacção foi iniciada com a adição de histidinol e incubada preferencialmente a 30°C. Corre sempre -14

em paralelo uma amostra referência contendo 'àguá em lugar de histidinol. Uma unidade de enzima catalisa a formação de 25 M de NADH por minuto nas condições do ensaio. A actividade tamém pode ser seguida medindo a formação de His com uma analizador de aminoãcidos como seja por exempli um \J Hitachi L-850. A reacção enzimãtica pode ser terminada pela adição de ácido fórmico (concentração final 30%)à mistra de reacção. A amostra é então evaporada e o precipitado dissolvido em 0,2 N HCl. Esta preparação foi usada para análise de His, sequenciação de aminoãcidos, actividade enzimãtica, etc. A determinação da sequência de aminoãcidos pode ser conseguida por métodos conhecidos, e.g. reacção de degradação de Edman manual ou automática usando instrumentação comercial (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). A sequenciação de aminoãcidos pode ser conseguida em toda a proteína ou a sequenciação pode ser realizada em fragmentos ou fracções da proteína. Tais fragmentos incluem sequenciação N-terminal, sequenciação após digestão com Lis-C (Wako Pure Chemical Co., Osaka, Japan), sequenciação após digestão com brometo de cianogénio, etc. A clivagem com brometo de cianogénio pode ser realizada w in situ de acordo com Simpson e Nice (1984). A digestão com piroglutamato-aminopeptidase [Boehringer Mannheim] pode ser realizada de acordo com Allen (1981).

No decurso da digestão com LisC a proteína é preferen-^ cialmente digerida com endoproteinase Lis-C [Boehringer Mannheim] . em 0,1M Tris-HCl (pH 8,5) durante um período de 24 horas à temperatura ambiente, usando uma proporção de enzima:substrato de 1:10. Os peptídeos resultantes foram isolados por meio de HPLC [por exemplo, coluna Aquapore C-8 (1 x 22 cm, Brownlee)]. Como

eluente pode ser usado uiti gradiente linear dV"àcétonitrilo:iso-propanol (1:1) (0% a 60%) em 0,1% TFA.

Usando a(s) sequência(s) de aminoácidos, fracções da sequência de aminoácidos que apresentem degeneração mínima das sequências de nucleótidos codificadores da proteína podem ser usadas na síntese de oligonucleótidos sonda. Os oligonucleótidos sonda podem ser sintetizados por química de fosforamidetos, e.g. como realizado por um sintetizador de DNA Applied Biosystems 380B [Foster City, Califórnia] usando reagentes disponíveis no fabricante.

Exemplos de tais fracções úteis da sequência de aminoá eidos obtidas a partir de couve que podem ser usados para sinte tizar oligonucleótidos sonda incluem:

Lis-C#17 Tre Glu Ser Fen LÍS-C#18 Tre Vai Vai Leu Lis-C#32 Glu Ala Fen Asp Fen His Leu Ala Lis-C#45 Lis Fen Met. Tre Leu Arg Asn Leu Glu Ile Glu Gli Lis-C/48 Ala Leu Ser His Met Ile Glu Ala Pro Glu Lis CNBr#6 Met Ala Glu Ile Ala Vai Tre Leu CnBr#18 Leu Ala Ile Pro Vai Vai Leu Ala N-terminal Met lis Ile Tir Gin Vai Glu Asn

Ala Lis Ala Tre Pro Pro Tre Lis Vai Ala Tir Asp Asn ILe Tir Ala Gin Lis Vai Gin Ser Leu Tre Glu Glu Gli Gli Pro Tir Vai Ala Tre Met Ala Leu Asp Ala Ser Fen Tre Vai Fen Ala Arg Asp Ile Tre Fen Ser Asn Leu Tur Ala Glu Gli Leu Asp Ala His Lis Arg Arg 7 Lis Asp Ile Glu Ala Gin Ile Ala Gli Arg Lis Tre Tre Pro Arg Leu Ser Glu Leu Ser Fen 7 Leu Lis Ala Arg 7 7 Ile Asp .-X -- XV' em que a terminalogia de aminoácidos é as abreviaturas convencio nais.

Apôs marcação com uma marca adequada tal como p-3 2, estas sondas oligonucleótidicas podem ser usadas nó despiste de uma biblioteca de DNA, de preferência uma biblioteca de cDNA do mRNAderivado do organismo a partir do qual se obtem a histidinol--desidrogenase. Tal biblioteca (uma biblioteca de cDNA) de RNA poli A(+) do organismo fonte pode ser construida num vector de clonagem adequado, de preferência um vector de clonagem tal como lambda ZAPII (que pode ser adquirido à Stratagene, La Jolla, Califórnia usando o kit de cDNA Uni-ZAPXR, que também pode ser adquirido a Stratagene) utilizando os métodos conhecidos. A hibridação positiva dos oligonucleótidos sonda com um clone de cDNA da biblioteca identifica o clone qpe potencialmente contem a sequência de nucleótidos correspondente à sequência de aminoãci-dos da histidinol-desidrogenase.

Como alternativa, DNA total de uma biblioteca de DNA, preferencialmente de uma biblioteca de cDNA pode ser preparado e usado como molde para uma reacção de PCR com iniciadores representando segmentos de pouca degenerescência da sequência de aminoácidos. De preferência, os iniciadores usados darão origem a produtos de PCR que representam uma fracção significativa da sequência de nucleótidos. Os iniciadores preferidos que podem ser usados para fazer o despiste de DNA total da biblioteca de cDNA incluem: EW25: 5' TTAAGAATTCTAYGAYAAYATHTAYGC3' JR03: 5' CCYTCDATYTCNGCCAT3' a onde D undica qualquer uma das bases A, T ou G; H indica as bases A, T ou C; R indica as purinas A ou G; Y indica as pirimidinas T ou C. Os produtos de PCR podem ser ainda despistados para determinar se correspondem a uma fracção do gene da histidinol-desidrogenase usando um oligonucleótido sonda sintético correspondendo a uma sequência de aminoácidos situada no interior ou no meio da proteína histidinol-desidrogenase. Um exemplo de tal sonda incluiria a sonda marcada com P representada pela fórmula: JR02: 5'ATNGCYTCDATCATRTC3' onde D indica qualquer uma das bases A, T ou G; H indica as bases A, T ou C; R indica as purinas A ou G; Y indica as pirimidinas T ou C. 0 produto de PCR pode assim ser usado, por exemplo, para seleccionar e isolar mais clones de DNA usando técnicas convencionais [Maniatis et al. (1982)]. A sequenciação de nucleó-tidos do DNA de tamanho completo codificador da histidinol-desidrogenase pode ser obtido usando técnicas convencionais [Maxam e Gilbert (1977) ; e Sanger (1977)] ou usando instrumentação de sequênciação de nucleótidos adquirida comercialmente [adquirida à Applied Biosystems, Foster City, Califórnia e Dupont, Wilmington, Delaware].

Os clones de cDNA e os produtos de PCRpreparados como descrito atrás ou seus fragmentos pode ser usado como sonda de hibridação num processo de identificação de outras sequências de DNA a partir de um organismo fonte homólogo ou heterólogo codificador de uma proteína que apresenta actividade de histidinol-desidrogenase. Eles podem também ser usados como marcador de RFLP para determinar por exemplo a localização do gene da histidinol--desidrogenase ou de uma característica estreitamente ligada no genoma vegetal ou de cruzamento auxiliado por uma marca [EP-A 306,139; WO 89/07647].

Numa realização preferida do presente invento um cDNA de couve, a sequência da qual está apresentada em SEQ ID NO:1,foi usado como sonda de hibridação em condições restrigência baixa para identificar dois clones de cDNA pelo menos parciais [designados SA4 e SA5] derivados de trigo codificadores de um polipep-tídeo tendo actividade de histidinol-desidrogenase.

Uma vez tendo identificado e isolado o DNA codificador de um produto polipeptídico apresentando actividade de histidinol--desidrogenase pode ser obtida a partir de expressão transgénica do referido DNA,i.e. colocando um DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína tendo actividade de histidinol-desidrogenase num sistema de expressão adequado de bactéria, levedura ou de outra célula.

Hospedeiros adequados incluem bactérias tais como E. coli e levedura, incluindo a estirpe Saccharomvces cerevisiae. Outros hospedeiros de sistemas de expressão adequados incluem células de insectos crescidas em cultura. Estas células de insecto podem ser infectadas com um baculovírus contendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com o invento.

Como alternativa, o baculovírus pode ser usado para infectar as células de um insecto vivo e as células de insecto usadas como hospedeiro do sistema de expressão. Deixa-se então que o sistema de expressão produza um sobrenadante de expressão. Isto permite a obtenção fácil de grandes quantidades de histidinol-desidrogenase recombinante purificada através do isolamento a enzima a partir do sobrenadante de expressão

Encontrou-se que a histidinol-desidrogenase de plantas é codificada como uma proenzima. No caso da histidinol-desidrogenase de couve esta proenzima compreende um peptídeo amino-termi-nal de 31 resíduos de aminoácidos que não está presente na enzima madura. A extensão amino-terminal da proenzima da couve tem uma composição de sequências típica dos peptídeos de" trânsito dos cloroplastos.

As extensões amino-terminais da proenzima histidinol--desidrogenase derivada de plantas tendo sido operacionalmente ligada a uma sequência de DNA homóloga ou heteróloga pode assim ser usada para direccionar as referidas sequências de DNA para o compartimento cloroplastidial da célula vegetal, como descrito por exemplo, em EP-A 189,707. A histidinol-desidrogenase purificada pode então ser usada num ensaio para identificar inibidores da actividade de histidinol-desidrogenase, ensaio esse que compreende: (a) incubação de uma primeira amostra de histidinol--desidrogenase e seu substrato; (b) medição de uma reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) incubação de uma primeira amostra de histidinol-desidrogenase e seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um composto inibidor; (d) medição de uma reactividade inibida da histidinol-desidrogenase do passo (c); e (e) comparação da reactividade inibida com a reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase.

Histidinol-desidrogenase adequada para o ensaio acima pode ser obtida usando os métodos de purificação do presente invento. São substratos adequados o histidinol ou análogos estruturais que são capazes de serem convertidos num análogo da histidina pela enzima histidinol-desidrogenase, sendo um substrato preferido o histidinol. De preferência , o substrato está numa concentração de aproximadamente 1 mM a cerca de 100 mM, mais

preferencialmente entre cerca de 1 mM e cerca dé 10 mM, mais preferencialmente a cerca de 5 mM.

Para além da enzima histidinol-desidrogenase e de um substrato adequado, a mistura de reacção pode conter um tampão adequado, cofactores adequados e catiões divalentes adequados como cofactor. Um tampão adequado inclui qualquer tampão biológico adequado que possa fornecer capacidade tamponante a um pH que conduza às necessidades da reacção da enzima. Preferencialmente o tampão proporciona capacidade tamponante na gama de pH de 7,5 a 10,0, mais preferencialmente a um pH de aproximadamente 9,2, e.g., 150 mM Gli/NaOH (glicina/hidróxido de sódio) a pH 9,2. Um cofactor preferido para a enzima histidinol-desidrogenase é o NAD, preferencialmente numa concentração de aproximadamente 1 mM até cerca de 100 mM, mais preferencialmente a cerca de 2 mM. Preferencialmente, o catião divalente é um catião de um metal divalente, mais preferencialmente manganês. A reacção ê realizada a uma temperatura adequada para permitir que a reacção decorra. Tal temperatura adequada é entre cerca de 4°C e 40°C, mais preferencialmente entre aproximadamente a temperatura ambiente e cerca de 35 °C, mais preferencialmente a cerca de 30°C. A mistura de reacção mais preferida contem tampão 150 mM Gli/NaOH, pH 9,2, 0,5 mM MnCl2, 2 mM NAD+, 5 mM histidinol e 2-5 mUde uma amostra da enzima num volume total de 0,5 ml a 30°C. Preferencialmente, a reacção é iniciada coma adição de histidinol. A reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase é qualquer medição da actividade enzimãtica da enzima histidinol--desidrogenase enquanto na presença de um substrato adequado. Tais medições da actividade enzimãtica são geralmente conhecidas dos familiarizados com a matéria, incluindo constantes de equilíbrio, velocidades de reacção do aparecimento dos produtos de reacção ou do consumo dos substratos de reacção, cinética de i? Cn .v, v/ reacção, termodinâmica da reacção, análise espectrofotométrica dos produtos de reacção, detecção dos componentes de reacção marcados, etc. Ver, de um modo geral, Segel, Biochemical Calculations, 2§ Edição, John Wiley and Sons, New York (1976); Suelter, A Praticai Guide to Enzvmolocry. John Wiley and Sons, New York (1985). 0 método preferido de medição da actividade enzimã-tica é o espectrofotométrico por medição do aumento da absorvân-cia a 340 nm devido à redução de NAD+, e.g., usando por exemplo um espectrofotómetro Hitachi U-3120.

Foram identificados compostos inibidores adequados usando os métodos atrás referidos. Até à data foram identificados pelo menos sete compostos. A reactividade inibida foi determinada do mesmo modo que a reactividade não inibida com a adição de um inibidor da histidinol-desidrogenase. A concentração do inibidor pode variar dependendo da actividade inibidora, mas de um modo geral será uma quantidade que varia entre cerca de 10 mM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente cerca de 0,1 mM a cerca de 100 mM, mais preferencialmente cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, mais preferencialmente cerca de 0,1 mM a cerca de 100 mM, mais preferencialmente cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. Geralmente, o histidinolou outro substrato será adicionado a uma mistura contendo a enzima e o inibidor e então a actividade enzimática é determinada como descrito anteriormente. A comparação da reactividade inibida com a reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase inclui determinação de um decréscimo significativo na actividade enzimática observado na reactividade inibida comparado com a reactividade não inibida. Um decréscimo significativo é um decréscimo na actividade enzimática que é maior do que a margem de erro inerente na técnica de medição, preferencialmente um decréscimo de de "· cerca de 50% da actividade na ausência do inibidor, mais preferencialmente um decréscimo de cerca de 90%, mais preferencialmente um decréscimo de aproximadamente 99%, mais preferencialmente ainda um decréscimo para um nível de actividade enzimãtica que é essencialmente indetectável. * Uma vez identificado um composto herbicida que iniba a função da enzima tipo selvagem, matando o organismo contendo a enzima, os mutantes resistentes podem ser isolados por mutageni-zação de uma população do organismo em questão, crescimento da população mutagenizada na presença de uma concentração do inibidor suficiente para inibir o crescimento do organismo tipo selvagem e selecção dos indíviduos da população que são cpazes de crescer mais rapidamente do que os organismos tipo selvagem. A mutagénese in vivo pode ser por qualquer um de vários métodos, incluindo compostos químicos, e.g., metanossulfonato de etilo [Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) ; Davis et al.. Advanced Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1983); e Somerville e Ogren, Em Edelman et al. (eds) Methods in Chloroplast Molecular Bioloqy. Esevier Biomedical Press, pp. 129-138 (1982)], mutagénese com ultravioletas [Miller (1972)], mutagénese com raiso X [e.g., Hake e Freeling, (1986); e Poethig, (1988)] e irradiação gama. Como alternativa, a sequência codificadora de histidinol-desidrogenase pode ser mutagenizada in vitro por qualquer um de vários tratamentos químicos e enzimáti-cos [e.g., Zoller e Smith, (1983); Leung et al. (1989); e Shortle e Bolstein, (1983)]. Tais sequências mutagenizadas são reintrodu-zidas no organismo hospedeiro, de preferência um microorganismo e Ν-· Ν' ' a população contendo uma mistura de sequências'-'"'mutagenizadas reintroduzidas é crescida numa concentração não tóxica do inibi-dor. Os indivíduos são directamente seleccionados pela sua capacidade para crescerem na presença desta quantidade tóxica de inibidor, capacidade essa que é conferida pela sequência mutage-nizada introduzida.

Os indivíduos mutantes que resultam da mutagénese in vivo f tendo uma capacidade para tolerar concentrações normalmente tóxicas do inibidor, podem ser identificados e geneticamente purificados (por sementeira de forma a ter colónias isoladas várias vezes para o caso de microorganismos ou seleccionando repetidamente uma semente isolada, deixando-a crescer até à maturidade e fazendo auto-polinização no caso de uma planta). 0 gene codificador da ghistidinol-desidrogenase pode ser rapidamente isolado a partir do mutante por reacção em cadeia compolimera-se e a sua sequência de DNA determinada e traduzida numa sequência de aminoácidos prevista. Os aminoácidos encontrados no mutante que diferem do tipo selvagem pode-se assumir que sejam responsáveis pelo fenótipo de resistência ao inibidor. Preferencialmente, a causa das alterações de aminoácidos pode ser directamente testada através da expressão da sequência mutagenizada num sistema microbiano ou vegetal e demonstrando que a introdução da sequência mutagenizada é suficiente para conferir um fenótipo de resistência a inibidor num indivíduo que de outra forma seria selvagem.

Um ensaio para identificar mutantes de histidinol-desi-drogenase resistentes a inibidores compreende: (a) incubação de uma primeira amostra de histidinol-de-sidrogenase e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (b) medição de uma reactividade não mutagenizada da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) incubação de uma primeira amostra de uma histidinol--desidrogenase mutagenizada e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (d) medição de uma reactividade mutagenizada da histidinol-desidrogenase mutagenizada do passo (c); e (e) comparação da reactividade mutagenizada relativamente à reactividade não mutagenizada da histidinol desidrogena-se. A mistura de reacção e as condições de reacção são as mesmas do ensaio para identificação de inibidores da histidinol--desidrogenase (ensaio de inibidores) com as modificações que se seguem. Primeiro, um mutante das histidinol-desidrogenase obtido como descrito atrás, é substituído numa das misturas de reacção pela histidinol-desidrogenase tipo selvagem do ensaio dos inibidores. Segundo, um inibidor da histidinol-desidrogenase tipo selvagem está presente em ambas as misturas de reacção. Terceiro, a reactividade mutagenizada (actividade da enzima na presença de inibidor e histidinol-desidrogenase mutagenizada) e a reactividade não mutagenizada (actividade enzimãtica na presença de inibidor e histidinol-desidrogenase tipo selvagem) são comparados para determinar se se observa um aumento significativo na actividade enzimática na reactividade mutagenizada quando comparado com a reactividade não mutagenizada. A reactividade mutagenizada é qualquer medida de actividade enzimãtica da enzima histidinol-desidrogenase mutagenizadaenquanto na presença de um substrato adequado e do inibidor. A reactividade não mutagenizada é qualquer medida da actividade enzimática da enzima histidinol-desidrogenase tipo selvagem enquanto na presença de um substrato adequado e do inibidor. Um aumento significativo é um aumento na actividade enzimática que é superior à margem dê :erro inerente à técnica de medição, de preferência um aumento é de cerca de 2 vezes a actividade da enzima tipo selvagemna presença do inibi-dor, mais preferencialmente um aumento de cerca de 10 vezes, mais preferencialmente ainda uma aumento de cerca de 100 vezes.

Uma sequência de DNA mutagenizada codificadora de histidinol-desidrogenase que confere resistência a herbicidas pode então ser introduzida numa espécie de cultivar com interesse, permitindo que a colheita sobreviva na presença de uma concentração do herbicida que mate todas as plantas sem a forma resistente da enzima.

Para ser expressa na célula vegetal a sequência de DNA mutagenizada codificadora da histidinol-desiidrogenase é preferencialmente clonada num vector adequado para transformação de plantas que preferencialmente compreende uma ou mais sequências de DNA de promotores ou reguladoras para promover a expressão da sequência de DNA codificadora na célula vegetal transformada.

Sequências de controle adequadas são as que compreendem o promotor e sequências reguladoras 5' e 3' não traduzidas que são funcionais em plantas. Estas sequências podem, independentemente, ser derivadas de qualquer fonte, como seja, por exemplo vírus, genes vegetais ou bacterianos.

Estes promotores ou sequências reguladoras podem ser constitutivos na natureza ou podem ser regulados nos seus padrões de expressão. Tal regulação pode ser temporal ou espacial e incluem promotores regulados ao longo do desenvolvimento e promotores induzíveis. Os promotores preferidos incluem promotores do vírus do mosaico da couve flor, incluindo os promotores 35S e 19S. 0 vírus do mosaico da couve flor (CaMV) foi caracterizado e descrito por Hohn et al. em Current Topícs in Microbioloav and Immunoloqy. 96: 194-220 e apêndices A a G (1982). Esta descrição é aqui incluida como referência. São também preferidos os promotores dos genes da nopalina-sintetase, octopina-sintetase e manopina-sintetase.

Os promotores virais e sequências não traduzidas 5'e 3' adequadas para usar são funcionais em plantas e incluem, por exemplo, vírus de plantas tais como o vírus do mosaico da couve--flor.

CaMV é um vírus de plantas invulgar por conter DNA de cadeia dupla. Pelo menos dois promotores de transcrição do CaMV são funcionais em plantas, nomeadamente o promotor 19S, que resulta na transcrição do gene VI de CaMV e o promotor 35S. 0 promotor 19S e o promotor 35S são os. promotores preferidos de vírus de plantas para usar no presente invento.

Os promotores 19S de CaMV e as regiões 5' não traduzidas podem ser obtidas por meio de um mapa de restrição como seja o mapa descrito na Figura 4 na página 199 do artigo de Hohn et al. referido atrás, ou a partir da sequência que aparece no Apêndice C do artigo de Hohn et al.

Para isolar o promotor 19S de CaMV e, facultativamente, a região 5' adjacente não traduzida foi seleccionado um fragmento de restrição do genoma de CaMV contendo as sequências pretendidas. Um fragmento de restrição adequado que contem o promotor 19S e a região 5' não traduzida é o fragmento entre o sítio PstI começando na posição 5386 e o sítio HindIII começando na posição 5850 da Figura 4 e apêndice C do artigo de Hohn et al.. Λ' \v

Os nucleótidos pretendidos no fragmento’ de restrição podem ser facultativamente removidos por métodos convencionais. Alguns métodos adequados para a eliminação dos nucleótidos indesejáveis incluem a utilização de exonucleases [Maniatis et al. (1982); páginas 135-139] tecnologia de PCR [Mullis et al. (1987); Erlich, (ed.); PCR Technology, Stockton Press New York (1989)] e mutagénese dirigida com oligonucleõtidõs [Zoller e Smith (1983)].

Um processo semelhante pode ser usado para se obter uma região 3' não traduzida desejável. Por exemplo, uma sequência 3' não traduzida de um gene adequado de CaMV pode ser obtido por isolamento da região entre o sítio EcoRV na posição 7342 e o sítio BglII na posição 7643 do genoma de CaMV como descrito na Figura 4 e apêndice C do artigo de Hohn et a1..

Exemplos de promotores de genes de plantas e de regiões 5' e 3' não traduzidas adequadas para usar no presente invento também incluem os do gene codificador da subunidade pequena dda ribulose-bifosfato-carboxilase-oxigenase, fosfoenol-piruvatocar-boxilase e proteína de ligação à clorofila a/b. Estas regiões de genes de plantas podem ser isoladas a partir de células vegetais de formas comparáveis às descritas atrás para o isolamento das correspondentes regiões do CaMV; ver Morelli et al. (1985).

Promotores adequados e regiões 5' e 3' não traduzidas dos genes bacterianos incluem os presentes na região de T-DNA dos plasmídeos de Agrobacterium. Alguns exemplos de plasmídeos de Agrobacterium adequados incluem o plasmídeo Ti de A. tumefaciens e o plasmídeo Ri de A. rhizoaenes. Os promotores de Agrobacterium e as regiões não traduzidas 5' e 3' úteis no presente invento são, em particular, as presentes nos genes codificadores da octopina, manopina e nopalina-sintetases. Estas sequências podem o e ser obtidas por métodos semelhantes aos descritos atrás para isolamento de CaMV e de promotores e de promotores de plantas de sequências não traduzidas; ver Bevan et al. (1983).

Para além de um promotor, os genes quiméricos do presente invento podem incluir preferencialmente outras sequências não traduzidas no extremo 5', designado uma sequência líder. Sequências líder adequadas incluem sequências líder de vários comprimentos isoladas a partir do gene 35S de CaMV. Pierce et al.. Plant Gene Systems and their Bioloqy. (Alan R. Liss, Inc.) pp. 301-310. As sequências líder preferidas são as isoladas a partir do gene 35S de CaMV, tendo um comprimento entrè cerca 50 e cerca de 130 nucleótidos. O DNA recombinante compreendendo a sequência de DNA da histidinol-desidrogenase mutagenizada pode ser introduzido na célula vegetal de uma série de modos que são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, métodos de transformação de células vegetais incluem microinjecção [Crossway et al. (1986); Neuhaus (1987)], electroporação [Riggs et al. (1986)], transformação mediada por Aorobacterium (Hinchee et al. (1988)] e aceleração balística de partículas usando por exemplo sistemas disponíveis na Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware [ver por exemplo, Sanford et al., Patente U.S. 4,945,050; e McCabe et al.. (1988)]. Ver também,

Weissinger et al. (1988); Sanford et al. (1987) (cebola); Christou et al. (1988) (soja); McCabe et al. (1988) (soja); Datta et al. (1990) (arroz); Klein et al. (1988) (milho); Fromm et al. (1990); Gordon-Kamra et al. (1990) (milho)].

Um método possível para a introdução de material genético em células vegetais compreende, por exemplo, colocar as células vegetais em contacto com vírus ou com Aqrobacterium tendo .Ν' * ν ·' . · ·' ο DNA a ser introduzido. Isto pode ser conseguido infectando células vegetais sensíveis ou por cocultura de protoplastos derivados de células vegetais. Dentro do âmbito deste invento pode ser usado o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) como vector para a inserção da sequência de DNA mutagenizada da histidinol-desidrogenase de acordo com o invento numa planta.

Um. outro método de inserção de uma sequência de DNA codificador de histidinol-desidrogenase mutagenizada numa célula utilizá a infecção da célula vegetal com Aqrobacterium tumefaciens e/ou Aqrobacterium rhizoqenes, a qual foi previamente transformna-da com a referida construção de genes. As células vegetais transgénicas foram então cultivadas em condições de cultura adequadas conhecidas dos familiarizados com a matéria de modo a formarem-se rebentos e raízes e finalmente plantas completas. Um outro método possível de transformação de material vegetal compreende a infecção mista usando Aqrobacterium rhizoqenes e Aqrobacterium tumefaciens transformada, como descrito por Peti et al. (1986) para a trnasformação de cenouras. A sequência de DNA codificadora da histidinol-desidrogenase mutagenizada de acordo com com o invento pode pois ser transferida para células vegetais adequadas por exemplo por meio do plasmídeo Ti de Aqrobacterium tumefaciens ou do plasmídeo Ri de Aqrobacterium rhizoqenes. 0 plasmídeo Ti ou Ri é transferido para a planta no decurso da infecção por Aqrobacterium e integrado de forma estável no genoma vegetal.

Tanto os plamídeos Ti como os plasmídeo Ri têm das regiões que são essenciais para a produção de células transformadas. Uma destas regiões, a região de DNA de transferência (T-DNA) é transferido para a planta e conduz à indução de tumores. A outra egião, a região que confere virulência (vir), é essencial apenas para a formação dos tumores não para a sua manutenção. As dimensões da região do DNA de transferência podem ser alargadas pela incorporação da sequência codificadora da histidinol-desidro-genase mutagenizada sem que a capacidade de transferência seja alterada. Através da remoção dos genes indutores indutores de tumores e incorporação de uma marca selectiva, o plasmídeo Ti ou Ri pode ser usado como um vector para a transferência da construção de genes de acordo com o invento para uma célula vegetal adequada. A região vir faz a transferência da região de T-DNA de Acrobacterium para o genoma da célula vegetal independentemente da região de T-DNA e da região vir estarem presentes no mesmo vector ou em vectores diferentes dentro da mesma célula de Acrrobacterium. Uma região vir num cromossoma também induz a trnasferência do T-DNA de um vector para uma célula vegetal.

Assim para a transferência do DNA codificador de histidinol-desidrogenase para células vegetais pode ser usado um sistema em que a região vir e a região do T-DNA estejam situadas em diferentes vectores. Tal sistema é conhecido como um "sistema de vectores binário" e o vector contendo o T-DNA é pois designado um "vector binário".

Qualquer vector contendo T-DNA que pode ser transferido para células vegetais e permite selecção das células transformadas é adequado para usar dentro do âmbito deste invento, como seja por exemplo, um vector vai-vem que compreende a sequência de DNA codificador da histidinol-desidrogenase mutagenizada de acordo com o invento clonada entre a sequência deliitante esquerda (LB) e a sequência delimitante direita (RB) e que é capaz de se replicar estavelmente em E. coli e em A. tumefaciens.

Usando as novas técnicas de transformação também se tornou possível em principio transformar espécies vegetais in vitroque não são plantas hospedeiras naturais de Aqrobacterium.

Tornou-se cada vez mais evidente que as monocotilédo-neas podem ser também transformadas com Aqrobacterium. de forma que usando novas formulações experimentais que existem agora, cereais e espécies de gramíneas são susceptlveis à transformação [Grimsley NH et al. (1987)].

Um dos métodos preferidos para a introdução de DNA numa célula vegetal por meio de Aqrobacterium é a chamada transformação de discos de folhas usando Aqrobacterium [Uorsch et al. (1985)]. Os discos de folhas estéreis de uma planta alvo adequada são incubados com células de Aqrobacterium compreendendo uma das sequências de DNA codificadoras da histidinol-desidrogenase mutagenizada de acordo com o invento e são então transferidas para um meio nutritivo adequado. São especialmente adequados e portanto preferidos dentro do âmbito deste invento os meios LS que foram solidificados pela adição de agar e enriquecidos com um ou mais reguladores do crescimento de plantas normalmente usados, especialmente os seleccionados do grupo das auxinas consistindo no ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido indole-3-butírico, ácido indole-3-láctico, ácido indole-3-succínico, ácido indole-3-acéti-co e ácido p-clorofenoxiacético e do grupo das citocininas consistindo em cinetina, 6-benziladenina, 2-isopenteniladenina e zeatina. A concentração preferida das auxinas e citocininas situa-se na gama de 0,1 mg/1 a 10 mg/1.

Após incubação durante vários dias, mas preferencialmente após incubação durante 2a 3 dias a uma temperatura entre 20°C e 40°C, preferencialmente entre 23 °C e 35°C e mais especi-ficamente a 25°C e em luz difusa, os discos de folhas foram

transferidos para um meio adequado com a finalidade de induzir rebentos. São especialmente preferidos para a selecção dos transformantes um meio LS que não contenha auxina mas que contenha citocinina em seu lugar e ao qual foi adicionada uma substância selectiva dependente do gene marcador usado. As culturas foram mantidas na luz e depois transferidas para meio fresco em intervalos adequados, mas preferencialmente com intervalos de uma semana. Os rebentos verdes que se desenvolveram foram cortados e cultivados num meio que induz a formação de raízes nos rebentos. É especialmente preferido dentro do âmbito deste invento um meio LS que não contem auxina ou citocinina mas ao qual foi adicionada uma substância selectiva para a selecção dos transformantes.

Para além da transformação mediada por Aqrobacterium, dentro do âmbito deste invento é possível usar métodos de transformação directa para a inserção das construções de genes de acordo com o invento para o materila vegetal. Métodos possíveis para a transferência directa do material genético para uma célula vegetal compreendem por exemplo, o tratamento dos protoplastos usando processos que modificam a membrana plasmática, por exemplo tratamento com polietilenoglicol, tratamento com choque térmico ou electropora-ção ou uma combinação de ambos os processos [Shillito et al. (1985)].

Na técnica de electroporação os protoplastos vegetais juntamente com plasmídeos que compreendem a sequência de DNA ^ codificador da histidinol-desidrogenase mutagenizada são sujeitos a pulsos eléctricos de força de campo elevada. Isto resulta num aumento reversível na permeabilidade das biomembranas e portanto permite a inserção dos plasmídeos. Os protoplastos vegetais electroporados renovam a sua parede celular, dividem-se e formam .- \'/ tecido de calo. A selecção das células vegetais"' transformadas pode ter lugar com a ajuda das marcas fenotípicas.

Ainda um outro método para a introdução directa de material genético nas células vegetais, que se baseia em processos puramente químicos e que permite a realização da transformação de uma forma eficaz e rápida, está descrito em Negrutiu I et al. (1987). É também para a transformação do material vegetal a transferência dirigida de genes usando cotransformação (Schocher RJ et al. 1986). A cotransformação é um método que se baseia na interna-lização simultânea e integração de várias moléculas de DNA (genes não seleccionáveis e seleccionáveis) no genoma vegetal permitindo a detecção de células que tenham sido transformadas com genes não seleccioáveis.

Outros meios para a inserção de material genético contido num vector directamente numa célula vegetal compreende a utilização de processos puramente físicos, por exemplo por microinjecção usando micropipetas muito finas que são revestidas com o DNA transformante ["Microprojectile Bombardment"; Wang Y-C et al. (1988)] ou são aceleradas através de uma solução contendo o DNA na direcção das células a serem transformadas por um impacto de pressão sendo assim finamente atomizadas numa nuvem de nevoeiro com a solução como resultado do impacto da pressão [EP-A 434 616]. O bombardeamento com microprojécteis foi avançado como uma técnica de transformação eficaz para células de plantas. Em Sanford et al. (1987) foi descrito que o bombardeamento com

microprojécteis é eficaz para libertar ácido nucleico no citoplasma das células vegetais de Allium cena (cebola). Christou et al. (1988) descreveram a penetração em aproximadamente 0,1% a 5% das células. Christou descreveu níveis observáveis da actividade da enzima NPTII e resistência nos calos transformados até 400 mg/1 de canamicina. McCabe et al. (1988) descrevem a transformava ção estável de Glvcine max (soja) usando bombardeamento com microprojécteis. Mc Cabe et al. descreveram ainda a recuperação de uma planta transformada R1 a partir de uma planta quimérica

V ^ A transformação de plantas de milho, incluindo plantas de milho de elite, por bombardeamento com microprojécteis pode ser realizado de acordo com o seguinte protocolo geral:

Plantas de milho são transformadas usando uma molécula vector adequada compreendendo os genes da histidinol-desidroge-nase e preferencialmente uma mara que possa ser avaliada e/ou seleccionada. Um exemplo de tal vector adequado é um plasmídeo compreendendo uma dupla cassete do promotor/terminador 35S de CaMV contendo uma marca selectiva tal como por exemplo uma resistência a antibiótico, e.g. ampicilina ou cloranfenicol. ^ Neste invento é preferido o plasmídeo pCGN1761 [ver EXEMPLO 14 para a sua construção] o qual contem um duplo promotor 35S de CaMV e a região tml-3' com um sítio EcoRI entre eles contido num esqueleto de plasmídeo derivado de pUC. A cassete do sítio de processamento promotor-EcoRI-3' é delimitada por vários ' sítios de restrição para facilidade de remoção. 0 plasmídeo deriva de uma séire de passos (ver abaixo) desde um plasmídeo inicial de duplo 35S, pCGN2113, que por si só deriva do pCGN164 e pCGN638. 0 plasmídeo pCGN2113 foi depositado na ATCC em 22 de Março de 1989 com o número de acesso 40587. 0 -alvo para o bombardeamento microinjectável pode ser tassel primordia, meristemas dos rebentos, embriões zigóticos ou de preferência uma cultura de milho embrionário tipo II friável. Cada um dos alvos preferencialmente contem aproximadamente 250 miligramas desta cultura semeada em filtros tais como por exemplo filtros Durapore, os quais são colocados no topo de meio adequado. Um exemplo de um meio adequado é um meio N6 de Chu et al. (1975) suplementado com 3 por cento de sucrose e 2 miligramas por litro de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, que se designa "2N63S".

Numa realização preferida do presente invento uma dose de 2X de "equivalentes" do gene GUS dos plasmídeos pCHN1761, em que o gene da histidinol-desidrogenase é colocado no vector ou os clones da histidinol-desidrogenase nele contidos e plasmídeos contendo marcas selectivas tais como resistência à fosfinotrici-na, resistência à higromicina, resistência à paromomicina ou marcas quantificáveis tais como glucoronidase GUS) ou luciferase são coprecipitadas em partículas de tungsténio de acordo com o método de precipitação com CaC^-Espermidina de Klein et al. (1988). Cinco microlitros da preparação de DNA tungsténio é pipetado para o macroprojéctil e propelado para o alvo usando uma cassete de cinzento número 1 essencialmente como descrito nas instruções de funcionamento para o sistema de bombardeamento.

Após 5 dias as células foram transferidas para filtros frescos e colocadas em meio contendo agentes de selecção numa concentração de 1 a 500 miligramas por litro dependendo do agente usado. Os filtros com as células são transferidos quase semanalmente para meio fresco contendo o agente de selecção. A concentração do agente pode ser aumentada no decurso da selecção. Após 6 semanas de selecção, apareceram colónias ao acaso nos filtros. As colónias foram isoladas do decurso de três semanas, cada uma delas sendo transferida para meio fresco contendo o agente de selecção mas sem um filtro para um período de selecção secundário.

As culturas dos calos embrionários Tipo II empregeues como alvo para a transformação via bombardeamento com microprojéc-teis, pode ficar estabelecida usando uma de várias fontes de transplantes. Fontes de transplantes adequadas são por exemplo embriões imaturos, tasseles imaturos, bases das folhas, meriste-mas apicais de raízes ou rebentos, rebentos de espigas imaturos, anteras ou microsporos e óvulos. São fontes preferidas meristemas apicais, bases das folhas, embriões imaturos e tasseles imaturos. As fontes mais preferidas são embriões imaturos e tasseles imaturos.

Os meios que são capazes de iniciar a embriogénese Tipo II são os que compreendem uma formulação de sais inorgânicos semelhante ao presente no meio de Schenk e Hildebrandt (1972), mas com um maior teor de azoto e menor proporção de iões nitrato: amónio do que o empregue por Schenk e Hildebrandt.

Em particular, os meios compreendem concentrações de microelementos semelhantes aos empregues nos meios basais de Schenk e Hildebrandt. Os meios compreendem ainda um teor total de azoto entre cerca de 40 e cerca de 80 mM; mais preferencialmente cerca de 60 mM; uma proporção de iões nitrato:amónio inferior a cerca de 4,0, mais preferencialmente cerca de 1,9; e uma concentração total de sulfato de cerca de 1,6 a cerca de 8,6 mM, mais preferencialmente entre cerca de 1,6 e cerca de 4,6 mM. Os meios incluem ainda uma fonte de carbono, preferencialmente sucrose. A sucrose está preferencialmente presente em quantidades entre cerca de 1 e cerca de 6% peso por volume, mais preferencialmente 2%. Outra fonte de nutrientes para além da sucrose está preferencialmente presente no equivalente molar das concentrações de

-V sucrose acima descritas. Os.meios preferencialmente compreendem ainda uma auxina. A concentração da auxina é preferencialmente entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/1, mais preferencialmente entre cerca de 0,5 e cerca de 1 mg/1. Os meios também incluem preferencialmente um agente de solidificação. Os agentes de solidificação preferidos incluem Agar Noble, Phytagar e Gelrite,

. TM TM especialmente 0,8% Phytagar e 0,24% Gelrite . Utilizando esta

formulação de meios é possível iniciar calos embrionários Tipo II em linhas de milho, incluindo linhas de milho elite, com uma frequência superior a 2%, preferencialmente superior a cerca de 10% e mais preferencialmente com uma frequência superior a cerca de 20%. Utilizando os meios atrás referidos é ainda possível obter uma resposta embriogénica Tipo II dentro de um período de cerca de 14 dias e regenerar plantas completas a partir de linhas de milho, incluindo linhas de milho elite, com uma frequência para além da obtida com formulações de meios conhecidos. O calo embriogénico tipo II foi identificado pela sua morfologia. Ele foi definido como' "friável e de crescimento rápido [calo] com embriões somáticos bem definidos com estruturas tipo suspensoras" [Tomes et al., 1985] ou como "friável, embriogénico" [Armstrong et al.. US-P 4,761.373]. A natureza do calo embriogénico maduro Tipo II é tal que possui uma maior quantidade de células individualmente competentes para a embriogénese e regeneração, é mais fácil de manipular quando exposto a agentes selectivos nos meios de cultura, é mais susceptível como alvo para transformação e são usados como material de partida para culturas em suspensão e de protoplastos. O aparecimento visual de calos embriogénicos Tipo II está apresentado em Tomes et al. (1985) ("Tomes 2").

Assim os meios úteis para o presente invento são aqueless que induzem a formação de calos embriogénicos Tipo II, -38-

como descrito aqui. As culturas de calos embriogériicos Tipo II são desejáveis pois são o ponto de partida para as culturas em suspensão embriogénicas e culturas de protoplastos regeneráveis. Tipicamente, a resposta Tipo II iniciada de novo é estabelecida por subcultura num meio adequado, durante esse tempo a sua friabilidade e crescimento são melhorados. O potencial de regeneração é mantido durante este processo de subcultura. O despiste das células, tecido e plantas de milho relativamente à presença de sequências de DNA específicas é realizado por análise Southern [Southern, (1975)]. Os detalhes deste processo estão apreentados em Maniatis et al.(1983]. Este despiste pode também ser realizado utilizando os processos de Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR). Os processos de PCR estão descritos detalhadamente em Mullis et al. (1987) e Erlich, (1989). Os iniciadores específicos empregues neste invento estão descritos no EXEMPLO 10. A transformação de células vegetais inclui separação das células transformadas das que não foram transformadas. Um método conveniente para tal preparação ou selecção é incorporar no material a ser inserido na célula transformada um gene codificador de uma marca selectiva. Como resultado apenas as células que foram transformadas com êxito conterão o gene da marca. O produto da tradução do gene da marca conferirá então uma caracte-rística fenotípica que tornará possível a seleção. Geralmente a característica fenotípica é a capacidade para sobreviver na presença de algum agente químico, como seja um antibiótico, e.g., canamicina, G418, paromomicina, etc. o qual é colocado num meio selectivo.

Alguns exemplos de genes que conferem resistência a antibióticos incluem por exemplo os codificadores da -39-

neomicina-fosfotransferase [resistência à higromicina, van den Elzen et al.. Plant Molecular Biology 5:299-392 (1985)], o gene da resistência à canamicina (NPT II) derivado de Tn5 [Bevan et al. (1983); McBride et al. (1990)), o gene PAT descrito em Thompson et al. (1987) e cloranfenicol-acetiltransferase. ^ Um exemplo de um gene útil como marca selectiva em cultura de tecidos para identificação de células vegetais contendo vectores manipulados por engenharia genética é um gene que codifica uma enzima produtora de um produto cromogénico. Um exemplo é o gene codificador da produção de beta-glucuronidase (GUS). Esta enzima é largamente usada e a sua preparaçao e utilização está descrito em Jefferson (1987).

Uma vez cultivadas as células vegetais transformadas em meio selectivo as células sobreviventes são seleccionadas para posterior estudo e manipulação. Os métodos de selecção e materiais são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria, permitindo escolher as células sobreviventees com um elevado grau de previsão de que as células escolhidas tenham sido transformadas com êxito com DNA exógeno.

Após transformação da célula vegetal ou da planta v-v usando, por exemplo, o plasmídeo Ti de Acrobacterium. as células vegetais ou plantas transformadas pelo plasmídeo Ti de forma a ser expressa a enzima, podem ser seleccionadas por uma marca fenotípica adequada. Estas marcas fenotípicas incluem, mas não estão limitadas a resistência a antibióticos. Outras marcas fenotípicas são coonhecidas e podem ser usadas neste invento.

Todas as plantas das quais podem ser isolados protoplas-tos e cultivados para dar plantas completas regeneradas podem ser transformadas pelo presente invento de forma a que plantas completas sejam recuperadas contendo a sequência' "de ’DNA codificador. Algumas plantas adequadas incluem, por exemplo, espécies dos gêneros Fracraria. Lotus, Medicacro, Onobrvchis. Trifolium. Tricíonella. Vicma, Citrus. Linnum, Geranium, Manicot. Daucus, Arabidopsis. Brassica, Raphanus. Sinapsis. Atropa. Capsicum. Datura. Hvoscvamus. Lvcopersion. Nicotiana. Solanum, Petunia. Dactvlis. Maiorana. Cichorium. Helianthus. Lactuca. Bromus. Asparacrus. Antirrhinum. Nemes ia. Pelaraonium. Panicum. Pennisetum. Ranunculus. Senecio. Salpiclossis. Cucumis. Browallia. Glvcine. Lolium. Zea, Triticum, Sorahum e Datura. 'Existe cada vez mais evidência de que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos em cultura, incluindo mas não estando limitados a todas as principais espécies de cereais cultivadas, cana sacarina, beterraba açucareira, algodoeiro, árvores de fruto e outras, legumes e vegetais. Existe presentemente um conhecimento limitado

da cultura. Se estas três variáveis forem controladas, então a regeneração é totalmente reprodutível e repetivel. i

As plantas maduras, crescidas a partir de células" vegetais transformadas são auto-cruzadas para produzir uma planta consagulnea. A planta consagulnea produz sementes contendo o gene híbrido. Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que possuem o gene híbrido. Tais plantas transformadas e sementes são conhecidas como plantas e sementes transgênicas. As plantas transgênicas preferidas são searas transgênicas, as quais são plantas adequadas para agricultura, mais preferencialmente as plantas em parte ou na sua totalidade são adequadas ao consumo por animais usados como fonte de alimentos para' ' o homem, e.g. gado, aves de capoeira, peixe, etc. r

Tais sementes transformadas podem então ser usadas para melhorar o rendimento das searas por crescimento das plantas transformadas derivadas de sementes transformadas na presença de um inibidor da histidinol-desidrogenase que será um herbicida para as plantas não transformadas que crescem entre as searas transformadas (i.e., ervas daninhas). As searas manipuladas por engenharia genética tornando-se assim resistentes a um herbicida sem toxicidade para.vertebrados encorajariam a sua utilização como herbicidas seguros deste tipo como alternativa a herbicidas-de um modo geral mais tóxicos de segurança questionável para o ambiente e tóxicos para vertebrados. ΐ

Os ingredientes activos do presente invento são normal-mente aplicados na forma de composições juntamente com um ou mais veículos aceitáveis em agricultura e podem ser aplicados a uma seara ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Estes compostos podem ser fertilizantes ou dadores de micronutrientes ou outras preparações que influenciem o crescimento das plantas. Eles podem ser também herbicidas selectivos, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias destas preparações, caso se pretenda com outros veículos, tensioactivos ou adjuvantes promotores da aplicação normalmente empregues nas formulações. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem a substâncias normalmente empregues na tecnologia de formulações, e.g. substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes molhantes, aglomerantes ou fertilizantes. «*

Um método preferido da aplicação dosingredientes activos do presente invento ou de uma. composição agroquímica. que contenha pelo menos um dos ingredientes activos é a aplicação foliar. 0 número de aplicações e a frequências das mesmas depende da intensidade da infestação pela correspondente erva daninha. No entanto, os ingredientes activos podem também penetrar na planta através das raízes através do solo (acção sistémica) por impregnação do locus da planta com uma composição líquida ou pela aplicação dos compostos na forma sólida ao solo, e.g. na forma granular (aplicação no solo). Os ingredientes activos podem ser também aplicados a sementes (revestimento) por impregnação das sementes com uma formulação líquida contendo ingredientes activos ou revestindo-os com uma formulação sólida. Em casos especiais, são também possíveis outros tipos de aplicação, por exemplo, tratamento selectivo dos caules ou botões.

Os ingredientes activos são usados na forma não modificada ou preferencialmente juntamente com os adjuvantes normalmente empregues no campo das formulações e são portanto formulados de forma conhecida em concentrados emulsionáveis, pastas revetí-veis, soluções directamente vaporizáveis ou diluíveis, pós molháveis, pós solúveis, poeiras, granulados e também encapsulações, por exemplo, em substâncias poliméricas. Tal como a natureza das composições, os métodos de aplicação, tais como vaporização, atomização, empoeiramento, dispersão ou rega, são escolhido de acordo com os objectivos pretendidos e circunstâncias prevalecentes. Taxas de aplicação vantajosas são normalmente entre 50 g e 5 Kg de ingrediente activo (a.i.) por hectare ("haM, aproximadamente 2,471 acres), de preferência entre 100 g e 2 Kg a.i./ha, mais preferencialmente entre 200 g e 500 g a.i./ha.

As formulações, composições ou preparações contendo os ingredientes activos e, sempre que apropriado, um adjuvante solido ou líquido, são preparados de forma conhecida, por exemplo misturando homogeneamente e/ou triturando os ingredientes activos com agentes de enchimento, por exemplo solventes, veículos sólidos e sempre que adequado, compostos tensioactivos.

Solventes adequados incluem hidrocarbonetos aromáticos, preferencialmente as fracções tendo 8 a 12 átomos de carbono, por exemplo, misturas de xileno ou naftalenos substituídos, ftalatos tais como ftalato de dibutilo ou ftalato de dioctilo, hidrocarbonetos alifãticos tais como ciclo-hexano ou parafinas, álcoois e glicóis e seus éteres e ésteres, tais como etanol, etilenoglicol monometilado ou éter de monoetilo, cetonas tais como ciclo-hexa-nona, solventes fortemente polares tais como N-metil-2-pirrolido-na, dimetilsulf óxido ou dimetilformamida, assim como óleos vegetais epoxidados tais como óleo de coco epoxidado ou óleo de soja; ou água.

Os veículos sólidos usados e.g. para poeiras e pós dispersáveis, são normalmente agentes de enchimento naturais tais como calcite, talco, caulino, montemorilonite ou atapulgite. Para melhorar as propriedades físicas é também possível adicionar ácido silicico altamente disperso ou polímeros absorventes -45-

•V Λ.' altamente dispersos. Veículos adsortivos granulados adequados são do tipo poroso, por exemplo pumice, tijolo partido, sepiolite ou bentonite; e veículos não adsorventes adequados são materiais tais como calcite ou areia. Ainda, pode ser usado um grande número de materiais pré-granulados de natureza orgânica ou inorgânica, e.g. especialmente dolomite ou resíduos de plantas pulverizados.

Dependendo da natureza do ingrediente activo a ser usado na formulação, compostos tensioactivos adequados são não iónicos, catiónicos e/ou tensioactivos aniónicos tendoboas propriedades emulsionantes, dispersantes e molhantes. 0 termo ,,tensioactivos,,será também entendido como englobando misturas de tensioactivos.

Tensioactivos aniónicos adequados podem ser sabões solúveis em água e compostos tensioactivos sintéticos solúveis em água. São sabões adequados os sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos terrosos ou sais de amónio não substituídos ou substituídos de ácidos gordos superiores (cadeias de 10 a 22 átomos de carbono), por exemplo os sais de sódio ou potássio do ácido esteárico ou oleico ou de misturas de ácidos gordos naturais as quais podem ser obtidas por exemplo a partir de óleo de coco ou de sebo. Os sais de ácidos gordos de metiltaurino também podem ser usados.

Mais frequentemente, no entanto, são usados os chamados tensioactivos sintéticos, especialmente sulfonatos gordos, derivados de benzimidazole sulfonados ou alquilarilsulfonatos. 'S -·’ \ν

Os sulfonatos ou sulfatos gordos estão'geralmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos terrosos ou sais de amónio não substituídos ou substituídos e têm um radical alquilo de 8 a 22 carbonos o qual também inclui a fracção alquilo dos radicais alquilo, por exemplo, o sal de sódio ou cálcio do ácido linhossulfónico, de dodecilsulfato ou de uma mistura de sulfatos de alcóis gordos obtidos a partir de ácidos gordos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de ésteres de ácido sulfúrico e ácidos sulfónicos de aditivos álcool gordo/óxido de etileno. Os derivados sulfonados de benzimidazole preferencialmente contêm 2 grupos de ácido sulfónico e um radical de ácido gordo contendo 8a 22 átomos de carbono. Exemplos de alquilarilsulfonatos são os sais de sódio, cálcio ou trietanol-amina do ácido dodecilbenzenossulfõnico, ácido dibutilnaftalenos-sulfónico ou de um produto de condensação do ácido naftalenossul-fónico/formaldeído. São também adequados os correspondentes fosfatos, eg. sais do éster de ácido fosfórico de um aditivo de p-nonilfenol com 4 a 14 moles de óxido de etileno.

Os tensioactivos não iónicos são preferencialmente derivadoséteres de poliglicóis de álcoois alifáticos ou cicloali-fáticos ou ácidos gordos saturados ou insaturados e alquilfenóis, os referidos derivados contendo 3 a 30 grupos éter de glicol e 8 a 20 átomos de carbono na fracção hidrocarboneto (alifática) e 6 a 18 átomos de carbono na fracção alquilo dos alquilfenóis.

Outros tensioactivos não iónicos adequados são os aditivos solúveis em água de óxido de polietileno com polipropile-noglicol, etilenodiaminapropilenoglicol e alquilpolipropilenogli-col contendo 1 a 10 átomos de carbono na cadeia alquilo, aditivos esses que contem 20 a 250 grupos éter de etilenoglicol e 10 a 100 grupos éter de propilenoglicol. Estes compostos geralmente contêm 1 a 5 unidades de etilenoglicol por unidade de propilenoglicol. ' ν' ? Γ λ São exemplos representativos de tensioactivos não iónicos os nonilfenolpolietoxietanóis, éteres de poliglicóis de óleo de castor, aditivos polipropileno/óxido de polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol e octilfenoxie-toxietanol. Ésteres de ácidos gordos de polioxietilenossorbitano e trioleato de polioxietilenossorbitano são também tensioactivos não iónicos adequados.

Os tensioactivos catiónicos são preferencialmente sais de amónio quartenãrios os quais têm como N-substituinte , pelo menos um radical alquilo C-C»- e ainda como outros substituin-

O tes, radicais alquilo inferior não substituido ou halogenado, benzilo ou hidroxialquilo. Os sais são preferencialmente na forma de haletos, metilsulfatos ou etilsulfatos, e.g. cloreto de esteariltrimetilamónio ou brometo de benzildi(2-cloroetil)etil-amónio.

Os tensioactivos normalmente empregues em formulações estão descritos, por exemplo, em "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979 e Sisely and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents, "Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980.

As composições agroquimicas geralmente contêm entre cerca de 0,1 e cerca de 99%, de preferência entre cerca de 0,1% e cerca de 95% e mais preferencialmente entre cerca de 3 e cerca de 90%, e mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 95% de um adjuvante sólido ou líquido e entre cerca de 0 e cerca de 25%, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 25% e mais preferencialmente entre cerca de 0,1 e cerca de 20% de um tensioactivo.

Se bem que os produtos comerciais sejam preferencialmente formulados como concentrados o utilizador final empregará normalnmente formulações diluídas.

Segue-se uma breve descrição das Figuras, às quais é feita referência na descrição e nos EXEMPLOS.

Figura 1: Cromatografia de afinidade em Histidinol- -Sepharose-4B. (-----) Concentração proteica representada pela absorção a 280 nm; (o-o-o-) actividade de histidinol-desidrogena-se expressa em U/ml. A coluna de afinidade foi lavada com tampão 10 mM Tris/HCl, pH 7,3 contendo 140 mM NaCl até a proteína não adsorvida ser eluida (na fracção Ns 75) . A seta na fracção NQ 76 indica o inicio da eluição com tampão 50 mM Tris/HCl, pH 7,3 contendo 700 mM imidazole.

Figura 2: Dependência da actividade de histidinol-desi-drogenase relativamente ao pH. () reacção em tampão HEPES 50 mM; (0) reacção em tampão 50 mM Gli/NaOH; (a) reacção em tampão CHES 50 mM. Em todos os tampões foi incluído 0,5 mM MnCl2· A reacção foi realizada em condições convencionais como descrito em Materiais e Métodos. Não foi detectada actividade em tampão fosfato 50 mM, pH 7,5. SEP ID NO: 1: A sequência de aminoácidos de nucleõtidos da histidinol-desidrogenase da couve. Os aminoácidos estão representados pelas designações de três letras, os nucleõtidos estão representados pelas designações com letras convencionais onde A é adenina, T é timidina, C é citosina, G é guanina, H é seleccionado entre timidina ou citosina e Y é seleccionado entre adenina, timidina e citosina. SEP ID NO: 2/3: A sequência de nucleótidos da histidinol -desidrogenase do trigo. Os nucleótidos estão representados pelas designações com letras convencionais onde A é adenina, T é timidina, C é citosina e Y é seleccionado entre adenina, timidina e citosina.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem pretendem exemplificar realizações específicas do presente invento sem limitar de forma alguma o seu âmbito. EXEMPLO 1: Materiais e Estirpes

Sepharose-4B foi adquirida à Pharmacia LKB. Di-hidroclo-reto de histidinol foi comprado à Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) e NAD , metaperiodato de sódio, epicloro-hidrina e "nitroblue tetrazolium" são da Sigma (St. Louis, Missouri), 0 cianoboro-hi-dreto de sódio foi adquirido à Nakarai e fenazinametossulfato à Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan). 0 meio de cultura de células de insecto de Grace, soro fetal bovino, Yeastolate e hidrolisado de lactalbumina foram adquiridos à Difco Laboratories. 0 sulfato de gentamicina foi da Sigma. Todos os outros químicos usados foram de grau analítico.

Couve fBrassica oleracea), pepineiro (Cucumis sativa), espargo (Asparacrus officinalis) , beringela (Solanum meloncrena), alface (Lactuca sativa) e pimento (Capsicum annum) foram cultivados numa câmara de crescimento com 16h/8h de ciclo luz/escuro a 25°C durante o período de iluminação e 15°C durante o período escuro. A humidade relativa é constante a 80%. As culturas celulares de Rosa "Paul's Scarlet" foram.cultivadas em suspensão como anteriormente descrito por Strauss et al♦ (1985). As culturas celulares de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv Samsun NN) e culturas em . suspensão de trigo (Triticum aestivum var Chinês Spring) foram cultivadas como descrito por Kumpaisal et al. (1987); e Yamada e Sato, (1978). Couve da primavera madura (Brassica oleracea L. var caoitala L.) foi adquirida a um mercei- . ro local. 0 germén de trigo foi adquirido à Sigma (St. Louis, Missouri).

No entanto, deve-se dizer que para além das das culturas de células e de suspensões especificamente designadas no parágrafo anterior, qualquer outro material cultivado adequado pode ser igualmente usado como material de partida para a preparação de extractos enzimáticos.

As células de Spodoptera frugiperda (Sf9) podem ser adquiridas na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, Maryland, USA com o número de acesso CRL1711.As linhas celulares akternativas que podem ser também usadas no processo de acordo com o invento compreende as de Spodoptera frugiperda tal como Sf21, a partir de Mamestra brassicae e similares.

Um kit compreendendo uma combinação de vírus da polie-drose nuclear de Autoqrapha californica tipo selvagem (AcNPV, baculovírus) e os vectores de transferência de baculovírus pAC700, pAc701, pAc702, pVL1392 e pVL1393 podem ser comprados à Invitrogen.

As células Sf9 foram mantidas em meio de Grace suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 0,33% (p/v) de Yeastolate, 0,33% (p/v) de hidrolisado de lactalbumina e 50 jug/ml de sulfato de gentamicina a 27°c.

Cs -,N* -

V

k V EXEMPLO 2: Preparação de Extracto Enzimático

Plantas com duas semanas de idade, cabeças de couve completas ou tecidos celulares bem crescidos foram usados como fontes de enzimas. 0 material vegetal foi homogenizado com um misturador Polytron em tampão fosfato de sódio 100 mM frio, pH 7,2 (tampão A) e o homogenato foi passado através de uma gase. Após centrifugação a 30000 xg durante 20 minutos, o sobrenadante foi fraccio-nado com 45-60% de saturação de sulfato de amónio em gelo. 0 precipitado foi colhido por centrifugação, dissolvido em tampão A e removido o sal da solução em Sephadex G-25. Este extracto enriquecido em proteína foi usado na determinação da actividade de histidinol-desidrogenase em várias plantas. EXEMPLO 3: Purificação da histidinol-desidrogenase

Cabeças de couve primavera foram homogenizadas usando um misturador de cozinha e a suspensão processada como descrito atrás, excepto a remoção do sal ser realizada por diálise extensiva contra tampão 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 (tampão B). Todos os processos subsequentes foram realizados a 4°C. 0 extracto de proteína dialisado foi aplicado numa coluna de DEAE-Toyopearl [TOSOH Ltd (Tokyo)] equilibrada com tampão B. Após lavagem da coluna com tampão B, a proteína foi eluida com um gradiente linear de tampão B contendo cloreto de sódio (0-500 mM). A fracção proteica com actividade foi eluida da coluna de DEAE-Toyopearl antes do pico principal de proteína, a uma concentração de 150 mM cloreto de sódio no tampão.

As fracções contendo actividade enzimática foram reunidas e aplicadas directamente numa coluna de histidinol--Sepharose-4B (2,5 x 8 cm) (EXEMPLO 7) a um fluxo de 36 ml/h. A V'/ S V ^ ^ \ proteína não adsorvida foi eluida por lavagem· ""extensiva com tampão 10 mM Tris/HCl, pH 7,3 contendo 140 mM NaCl (tampão C). A histidinol-desidrogenase ligada foi eluida com 50 mM Tris/HCl, pH 7,3 contendo imidazole.

Foram feitas várias tentativas sem êxito para purificar histidinol desidrogenase a partir de cabeças de couve maduras por métodos de purificação convencionais. O desenvolvimento do gel de afinidade, altamente específico para esta enzima tornou finalmente possível purificar a proteína em três passos com elevado rendimento e aparente homogeneidade (Tabela I). Toda a actividade fica ligada ao gel, provavelmente muito fortemente, uma-vez que apenas 40% da actividade foi eluida especificamente com um passo de adição de uma concentração alta de imidazole-(700 mM)no tampão de eluição (Fig. 1). Apenas com este passo, a actividade enzimá-tica específica foi aumentada por um factor de 350 a 10,16 U/mg de proteína, mostrando ser esta cromatografia muito específica da histidinol-desidrogenase. A purificação global de 2116 vezes não inclui o primeiro passo da precipitação fraccionada com sulfato de amónio, uma vez que não foi detectada qualquer actividade no extracto bruto. Um gel de SDS-poliacrilamida com uma grande quantidade de amostra aplicada mostrou apenas uma banda principal.

Após remoção do sal de todas as fracções em Sephadex G-25, a actividade enzimática em cada uma das fracções foi determinada. As fracções activas foram reunidas e concentradas numa membrana de ultrafiltração Amicon (YM-10). Esta preparação de enzima foi guardada a -80°c e usada para todas as experiências excepto a detecção de actividade em plantas. 0 armazenamento da enzima durante mais de 4 meses a -80°C não alterou significativamente a actividade. A 4°C a enzima

perde 10% da su actividade durante uma semana. "Pela adição de glicerol para uma concentração final de 20% conseguiu-se manter a actividade total a 4°C durante mais de uma semana. TABELA I:

Purificação da histidinol-desidrogenase. Nesta purificação típica foram processados 10 Kg de cabeças de couve. Todas as actividades foram medidas após remoção do sal com Sephadex G-25 ou diálise. A actividade no extracto bruto não foi detectada (n.d.).

Passo de Purificação Proteína Actividade Activ. Activ. Total recuperada Especif. [U] (%] [U/mg] Pureza [-fold] Extracto bruto n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Fraccionamento com sulfato de amónio 4750 23 100 0.0048 1 Cromatografia de permuta iónica em DEAE-Toyopearl 560 20.1 87 0.029 6 Cromatografia de · afinidade em his-tidinol-Sepharose4l 0.75 j 7.6 33 10.16 2116

I ιΛ* EXEMPLO 4: Filtração em Gel

Uma coluna de Sepharose 12 (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey) foi equilibrada com tampão C de purificação [ver EXEMPLO 3] â temperatura ambiente. Amostras de enzima purificada foram aplicadas na coluna e eluidas com tampão C a um fluxo de 0,5 ml/min. A massa molecular foi calculada usando um kit de marcadores de peso molecular (Sigma, St. Louis, Missouri). O peso molecular da enzima nativa foi determinado por filtração em gel Superose 12 [um meio de filtração em gel analítico da LKO Pharmacia, Piscataway, NJ, USA] como sendo 103000. EXEMPLO 5; Electroforese em Gel de Poliacrilamida A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida foi realizada como descrito algures Laemmli (1970)] usando 10-12% de acrilamida. As proteínas no tampão de amostra [Tris-HCl (pH 6,8) 310 mM; SDS 1%; glicerol 5%; beta-mercaptoetanol 2,5%; EDTA 1,24 mM; azul de bromofenol 0,0005%] foram colocadas a 100°C durante 10 minutos. Para o cálculo do pseo molecular da proteína desnaturada e reduzida, usou-se um kit de calibração para determinação de pesos moleculares [Pharmacia, Piscataway, New Jersey]. Em condições desnaturantes e de redução, a enzima migrou como uma só banda de 52 KDaltons quando sujeita a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, sugerindo uma estrutura quaternária dimérica para a enzima. O peso molecular de 103000 para a enzima da couve nativa ê consideravelmente superior ao da enzima de S. typhimurium [82000, Burger et al. (1979)]; e 90000 [Eccleston et al. (1979)]. As enzimas da couve e de S. tvphimurium são cada uma delas compostas por duas subunidades com um peso molecular

s< V/ s λ ·; \ * semelhante de 52000 e 43000 [Burger et al. (1979) ] ," respectiva-mente. No entanto, o peso molecular das subunidades da enzima trifuncional de S. cerevisiae foi calculado a partir da sequência de nucleótidos como sendo 87935 [Donahue et al. (1982)] e calculado em géis de SDS como sendo de cerca de 95000 [Keesey et al. (1979)]. De acordo com estes resultados, as enzimas de levedura, S. tvphimurium e couve diferem significativamente nos seus pesos moleculares. EXEMPLO 6: Focagem Isoleléctrica

PhastGel (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey) com uma gama de pH de 4-6,5 foi usado na focagem isoeléctrica, realizada num Phast System (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey) de acordo com as instruções do manual do fabricante. O ponto isoeléctrico da proteína foi determinado usando um kit de calibração de pontos isoeléctricos (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey). A exposição da enzima purificada a focagem isoeléctrica analítica conduziu à sua separação em seis bandas proteicas com uma gama de pH de 5,1-5,4. Cinco bandas apresentaram actividade de histidinol-desidrogenase usando coloração da actividade. A sexta banda tinha apenas uma actividade muito ligeira ou não tinha actividade. Em' experiências testemunha sem histidinol ou sem NAD+ na mistura de reacção, "p-nitro blue tetrazolium" não é reduzido para dar "formazan". A actividade de cada uma das cinco bandas está correlacionada com as suas intensidades de corobtidas por coloração de proteína.

Para excluir artefactos do processo de purificação, realizaram-se várias purificações independentes, partindo de -56-

cabeças de couve em diferentes fases de crèscimeniio''. Em todos os casos obtiveram-se seis bandas de proteína.

EXEMPLO 7: Preparação do Gel Histidinol-Sepharose-4B

Sepharose-4B foi activada com epicloroidrina como anteriormente descrito [Matsumoto et al. (1979)]. Gel de Sepharose-4B epoxiactivado foi suspenso em 0,1N NaOH contendo 0,5 g de glucose por g de gel e incubou-se a 40°C num agitador durante 24 horas [Kanamori et al. (1986)]. Após lavagem extensiva com água, o gel foi suspenso em metaperiodato de sódio previamen-te arrefecido e a suspensão agitada durante 1 hora a· 4°C. 0 gel foi lavado com água, suspenso em 0,1M HC1 e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora. Novamente, o gel foi lavado extensivamente com água, seguido de lavagem abundante com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0 à temperatura ambiente. O gel com veículo formilado foi suspenso em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0 contendo 100 mM de di-hidrocloreto de histidinol, o qual foi previamente neutralizado com NaOH e a suspensão foi incubada a 4°C durante a noite. Adicionou-se então cinco miligramas de cianoboro-hidreto de sódio por g de gel foi então adicionado à suspensão e incubado com agitação à temperatura ambiente durante 6 horas. 0 gel foi lavado extensivamente com água destilada e tratado com 5 mg de boro-hidreto de sódio por g de gel durante 3 horas a 4°C para converter os restantes grupos formilo em grupos hidroximetilo. EXEMPLO 8: Ensaio Enzimático A actividade enzimática foi ensaiada espectrofotometri-camente medindo o aumento na absorvância a 340 nm devido â redução de NAD+ num espectofotómetro Hitachi U-3120. -57-

'w' A mistura de reacção continha tampão 150 mMJGli?k,aOH, pH 9,2, 0,5 mM MnCl2, 2 mM NAD+, 5 mM histidinol e 2-5 mU de amostra de enzima num volume total de 0,5 ml. A reacção foi iniciada com a adição de histidinol e incubada a 30°C. A amostra de referência contendo água em vez de histidinol foi sempre processada em paralelo. Uma unidade de enzima catalisa a formação de 25M de NADH por min nas condições do ensaio.

Nalgumas experiências a actividade foi também seguida medindo a formação de His com yum analisador de aminoácidos Hitachi L-850. A reacção enzimática foi terminada com ácido fórmico (concentração final 30%). A amostra foi então evaporada e o precipitado dissolvido em 0,2 N HC1. Esta preparação foi usada para análise de His. A distribuição de histidinol-desidrogenase em onze espécies de plantas ou preparações foi examinada por actividade de histidinol-desidrogenase. A actividade da enzima não foi detectada em qualquer um dos extractos brutos derivados de várias espécies de monocotiledõneas e dicotiledóneas (Tabela I). As células de rosa em cultura e de couve primavera apresentaram as actividades específicas mais elevadas. O germén de trigo tinha uma actividade extraível extremamente alta provavelmente devido ao seu baixo teor em água, no entanto, a sua actividade específica é modesta. Também os rebentos de couve e de pepineiro e cabeças de couve primavera continham uma actividade axtraível elevada. Não foi detectada actividade em rebentos de pimento de 2 semanas de idade e nas células de tabaco em cultura. A histidinol-desidrogenase em microorganismos catalisa as duas últimas reacções para formar o produto final His. Para verificar este papel catalítico para a proteína isolada a partir de couve, a sua reacção catalisada foi analisada estequiometricamente relativamente â formação'’dê e redução de NAD+. A quantidade de NADH produzido enzimaticamente foi determinada a aprtir da absorvância a 340 nm usando o coeficiente de absorvância de 6220. 0 outro produto formado foi identificado pela análise de aminoácidos como sendo His. His autêntica adicionada à amostra que reagiu foi co-eluida com His formada enzimaticamente. Nem His nem NADH são formados na ausência de NAD+, histidinol ou usando enzima desnaturada pelo calor. Formaram-se duas moles de NADH por 0,99 moles de His após um tempo de reacção de 2 min. (Tabela III). A formação de ambos os produtos histidina e NADH é dependente do tempo e estão correlacionados. O pH óptimo para a actividade foi de 9,2 em tampão 50 mH Gli/NaOH ou em tampão HEPES 50 mM. A pH 9,2-10, praticamente toda a actividade é mantida, mas acima de 10, deu-se uma perda rápida da actividade.

Os valores de aparentes da enzima para L-histidinol e NAD+ foram determinadas em condições de ensaio normalizadas tais como 15,5 e 42 μΜ, respectivamente. A influência dos iões metálicos divalentes na reacção enzimática está apresentado na Tabela IV. A reacção foi estimula- 2+ da em 26% pela adição de Mn comparado com as condições testemunha sem a adição de qualquer ião metálico divalente ao tampão de reacção (150 mM Gli/NaOH, pH 9,2). A adição de Ba2+, Mg2+, Ni2+, 2+ 2+ 2 +

Ca , Zn e Cu causou inibição da reacçao. A histidinol-desidrogenase da couve é a primeira enzima da biossíntese da His que foi purificada até à homogeneidade a partir de plantas superiores. Através da utilização de uma nova cromatografia de afinidade, foi possível a purificação desta enzima e o seu estudo. Evidência directa de que a proteína

* ν' i* L' ‘Λ Ό purificada é histidinol-desidrogenase foi obtida' a partir da coloração da actividade no gel após focagem isoeléctrica. O produto formado enzimaticamente partindo de histidinol foi identificado como His. His e NADH foram produzidos estequiometri-camente, apresentando a mesma redução de 2 moles de NAD+ por 1 mole de His formada como anteriormente descrito para esta reacção em microorganismos [Adams (1955)].Os presentes resultados demonstram que pelo menos dois passos de reacção na via de biossintese da His na couve são idênticos aos dos microorganismos e são catalisados pela mesma enzima. 0 Km desta enzima para L-histi-dinol (15,5 μΜ a pH 9,2) é muito semelhante (16 e 8,8 μΜ) aos das enzimas purificadas a partir de S. tvphimurium [Burger et al. (1981)] e a parcialmente purificada a partir de germén de trigo [Wong e Mazelis (1981)]. 0 Km (42 μΜ) para.o NAD+ é consideravelmente mais baixo do que os das enzimas deivadas de S. tvphimurium (1 mM) (24) e a partir de de germén de trigo (140 μΜ, usando enzima parcialmente purificada [Wong e Mazelis (1981)]. O pH óptimo da reacção está entre pH 9,2 e 9,4 é idêntico ao da histidinol-desidrogenase de outros organismos. Nenhum outro ião . 2+ metálico divalente para além do Mn apresentou estimulação da actividade enzimática. Isto está de acordo com os resultados obtidos com a enzima derivada de s. tvphimurium cuja reacção catalisada é também estimulada na presença de Mn+ [Grubmeyer et al. (1989)] . TABELA II:

Distribuição da tiistidinol-desidrogenase em diferentes espécies de plantas e preparações. Para o cálculo da actividade extraí-vel, usa-se o peso molhado do material. 0 peso das células das culturas submersas foi determinado após colheita por filtração com uma gase. *) mU/mg: unidades de actividade por mg de proteína; **) mU/g: unidades de actividade por g de material vegetal.

TABELA II

Fonte vegetal Actividade Actividade

Específica Extraível mU/mq*0_ mU/ma**l

Rebentos de couve (Brassica oleracea L. var. caoaitata L.1 1,6 3,3 Rebentos de esoaraos CAsparaqus officinalis 0,9 1,6 Rebentos de alface (Lactuca sativa) 0,4 0,3 Rebentos de berincfela CSolanum melonqena) 0,4 0,9 Rebentos de cecineiro (Cucumis sativus 0,3 3,3 Rebentos de cimento (Caosicum annum) 0 0 Couve crimavera (Brassica oleracea L. var. cacitata L.) 6,1 2,8 Germén de trigo 2,1 91 Cultura de células de trigo (Triticum aestivum var Chinese Spring) 0,5 0,4 Cultura de células de rosa (Rosa "Paul's Scarlet") 6,2 0,9 Cultura de céluças do tabaco (Nicotiana tabacum) L. cv Samsun 0 (NN) 0 -61-

TABELA III:

Estequiometria da reacção da histidinol-desidrogenase relativa-mente à formação de His e de NAD+. A reacção enzimática foi parada após 2, 5 e 30 minutos de tempo de reacção e a amostra analisada por análise de aminoácidos (a 50 nM).

TABELA III

Tempo de reacçao Concentração de His Concentração de NADA b/a min μιαοΐβ/χηΐ μιαοΐε/ηΐ (a) (b) 0 0 0 - 2 17,6 35,6 2,02 5 36,6 80,0 2,18 30 143,7 316,0 2,2

TABELA IV:

Efeito de iões metálicos divalentes na actividade de histidinol-desidrogenase. A concentração do ião metálico é de 0,5 mM. A actividade foi determinada após 3 min de tempo de reacção, enquanto que a velocidade ainda é constante.

TABELA IV

Adição Actividade relativa %

Nenhuma 100 Mn24" 126 Ba2+ 65 Mg2+ 54 Ni2+ 46 Ca2+ 36 Zn2+ 34 Cu2+ 24 EXEMPLO 9: Coloração da actividade

As proteínas de calibração do ponto isoeléctrico e enzima purificada (em quadruplicado) foram aplicadas num PhastGel (gama de pH 4-6,5) para dar cinco calhas. Após migração da focagem isoeléctrica o gel foi cortado em quatro pedaços. O que contem as proteínas dos marcadores para além da coloração para a enzima foi corado com Coomassie Brillant Blue R250. Um outro pedaço de gel contendo apenas enzima foi sujeito â coloração

específica da actividade como descrito algures’'""[Skyring et al. (1970)] com uma ligeira modificação. O gel foi imerso em 10 ml de mistura de reacção contendo 5 mM histidinol e 2 mM NAD+. Pela adição de 150 μΐ de "nitroblue tetrazolium" e 150 μΐ de meto-sul-fato de fenazina para dar uma concentração final de 0,5 mM e 0,13 mM, respectivamente, foi iniciado o processo de coloração. A incubação foi realizada a 30°C durante 30 minutos. Dois outros pedaços de gel contendo apenas enzima foram incubados de modo idêntico mas sem histidinol ou sem NAD+. EXEMPLO 10: Determinação da proteína A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de proteína de Bradford usando albumina sérica bovina como padrão [Bradford (1976)]. EXEMPLO 11: Sequenciação de Aminoácidos

Aproximadamente 50 jug de histidinol-desidrogenase foi seco e ressuspenso em 0,1% de ácido trifluoroacético e sujeito directamente a degradação automática de Edman com um sequenciador de proteínas de fases gasosa-líquida Applied Biosystems 477A [Strickler et al. (1984)]. Os derivados de aminoácidos com feniltio-hindantoína (PTH) são separados e identificados com uma analisador de PTH (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) com uma coluna PTH-C.,„. lo A primeira corrida da sequência mostrou uma recuperação de 15% da concentração de proteína determinado por análise de aminoácidos, indicando que 85% do extremo N está bloqueado por razão desconhecida. 0 primeiro aminoãcido N-terminal de 15% da enzima desbloqueadanão pode ser determinado-'sem 'ambiguidade em ambas as experiências. Ala e Lis são os mais abundantes mas também são detectados Ser, Gli, Glu, Vai e Leu todos em concentrações semelhantes. 0 restante da sequência de aminoãcidos N-terminais foi determinado como sendo:

Met Lis Ile Tir Arg Leu Ser Glu Leu Ser Fen ? Gin Vai Glu Asn

Leu Lis Ala Arg ? ? Ile Asp onde os pontos de interrogação indicam resíduos que não foram determinados a partir dos dados de sequenciação de aminoãcidos. 160 jug de histidinol-desidrogenase foram secas e ressuspensas em 415 μΐ de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Adicionou-se lisil endopeptidase [EC 3.4.21.50; Wako Chemicals, Osaka, Japan] para se conseguir uma concentração final de aproximadamente 33 μg/ml. Isto ê equivalente a uma proporção de pesos de aproximadamente 1:500 de peptidase:proteína substrato. A digestão foi incubada à temperatura ambiente durante 24 horas e os peptídeos resultantes foram separados por HPLC de fase reversa numa coluna Aquapore RP-300 (C-8) (2,1 x 220 mm). A coluna foi eluida com um gradiente linear de 45 minutos de 0-70% acetonitrilo em 0,1% TFA a um fluxo de 220 μ1/minuto. Os peptídeos que eluiram aos 17, 18, 32, 45 e 48 minutos foram colhidos e analisados por degradação automática de Edman comodescrito atras. Obtiveram-se as seguintes sequências de aminoãcidos:

Lis-C#17 Tre Glu Leu Ser Fen Ala Lis r* LÍS-C#18 Tre Vai Vai Leu Ala Tre Pro Pro Tre Lis Lis-C#32 Glu Ala Fen Asp Vai Ala Tir Asp Asn Ile Tir Ala Fen His Leu Ala Gin Lis LÍS-C#45 Lis Fen Met Tre Vai Gin Ser Leu Tre Glu Glu Gli Leu Arg Asn Leu Gli Pro Tir Vai Ala Tre Met Ala Glu Ile Glu Gli Leu Asp Ala Lis-C#48 Ala Leu Ser His Ser Fen Tre Vai Fen Ala Arg Asp Met Ile Glu Ala Ile Tre Fen Ser Asn Leu Tir Ala Pro Glu Lis 9 0 jicg da proteína histidinol-desidrogenase foi seco e ressuspenso em 200 μΐ de 2% CnBr em ácido fórmico a 70%. A proteína foi digerida à temperatura ambiente durante 24 horas. Os peptídeos resultantes foram purificados exactamente como descrito atrás, excepto ter-se usado um gradiente de 0-100% de acetonitri-lo. Os peptídeos que eluiram aos 6 e 18 minutos foram colhidos e sujeitos a degradação automática de Edman como descrito atrás. Obtiveram-se as seguintes sequências: CNBr#6 Met Ala Ala Vai CNBr#18 Leu Ala Vai Vai

Glu Ile Glu Gli Leu Tre Leu Arg ? Lis Ile Pro Ala Gin Ile Leu Ala Tre Pro

Asp Ala His Lis Arg Asp Ile Glu Ala Gli Arg Lis Tre EXEMPLO 12: Obtenção da Sequência de cDNA da Histidinol-Desidro-genase

Três oligonucleótidos que correspondem a fracções das sequências de aminoácidos foram sintetizados pela síntese de fosforamidetos automática num sintetizador de DNA Applied Biosystems (Foster City, Califórnia) Modelo 380B. V/ Λ

As suas sequências e os resíduos dé\;amihoácidos a que correspondem estão indicados abaixo: EW25 5' TTAAGAATTCTAYGAYAAYATHTAYGC 3' JR03 5' CCYTCDATYTCDATCATRTC 3' JR02 5' ATNGCYTCDATCATRTC 3' onde D indica qualquer uma das bases A, T ou G; H indica as bases A, T ou C; R indica as purinas A ou G; Y indica as pirimidinas T ou C. EW25 é uma mistura de 48 oligonucleótidos compreendendo todas as possíveis sequências de DNA codificadoras da sequência de aminoácidos Tir Asp Asn Ile Tir Ala, encontrados dentro do peptídeo Lis-C#32. JRo3 é uma mistura de 48 oligonucleótidos compreendendo os complementos de todas as . sequências de DNA possíveis codificadoras da sequência Met Ala Ile Glu Gli, encontrada em ambos os peptídeos Lis-C#45 e CNBr#6. JR02 é uma mistura de 48 oligonucleótidos compreendendo as cadeias complementares de todas as sequências de DNA possíveis codificadoras da sequência de aminoácidos Asp Met Ile Glu Ala Ile encontradas dentro do peptídeo Lis-C#48.

As sequências dos peptídeos da couve estão alinhadas com a sequência traduzida do gene HIS4C de levedura [Donahue et al. (1982)], o qual codifica histidinol-desidrogenase. Encontrou--se que os peptídeos da couve têm cerca de 45% de identidade com a sequência de levedura nas suas regiões partilhadas. Usando tal alinhamento e assumindo que a sequência da couve é aproximadamen-te colinear com a sequência de levedura, Lis-C #32 fica a montante (i.e. na direcção do extremo N da proteína) relativamente a Lis-C #45 e CNBr #6, os quai ficam perto do extremo C da proteína aproximadamente 320 aminoácidos a jusante. Lis-C #48 fica entre estes peptídeos. Assim, EW25 deverá ficar relativamente perto do -67-

Ο* jX* V/

- * %**' £ Λ \ τ,.: extremo 5' do cDNA, JR03 deverá ficar perto do"'extremo 3' do cDNA e JR02 deverá ficar entre estes oligonucleôtidos. 0 RNA total foi preparado a partir de tecido de folhas de couve congeladas por extracção com fenol seguido de precipitação com cloreto de lítio como descrito por Lagrimini et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USAM/ 7542-7546 (1987)]. Isolou-se mRNA Poli(A) a partir de RNA total usando um kit de isolamento rápido de mRNA poli(A) (Stratagene, La Jolla, Califórnia) exactamente como descrito nas instruções do fabricante. 0 mRNA foi enzimati-camente convertido em cDNA e clonado no vector lambda ΖΑΡ II usando um kit de síntese de ZAP-cDNA gigapack II (Stratagene, La Jolla, Califórnia) usando as instruções fornecidas juntamente com o kit pelo fabricante. A biblioteca de cDNA foi propagada e amplificada como descrito pelo fabricante do kit.

Preparou-se DNA total a partir de biblioteca usando reagente Lambdasorb (Promega Biotech, Madison, wisconsin) pelo método descrito pelo fabricante. Realizou-se uma reacção em cadeia com polimerase [PCR; Saiki et al. (1988) ] usando a biblioteca de DNA como molde e EW25 e JR03 como iniciadores. A reacção foi realizada num volume total de 50 μΐ, com 10μg de DNA molde, 200 pmoles de cada uma das misturas de iniciadores, dATP, dCTP, dGTP e dTTP 100 μΜ cada, tampão de PCR IX fornecido pelo fabricante (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) e 2,5 U de DNA-polimerase AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus). A reacção teve teve 40 ciclos com o perfil de temperatura que se segue num DNA Thermocycler (Perkin Elmer Cetus): 94°C durante 45 segundos, 42°C durante 45 segundos e 72°C durante 45 segundos. Em cada um dos ciclos o passo de 72°C foi aumentado em 2 segundos.

Os produtos de PCR foram separados num gel de 2% de agarose de baixa temperatura de gelificação (Nu-Sieve, FMC

BioProducts, Rockland, Maine). Foram detectádós vários fragmentos por coloração com brometo de etídio, um dos quais tem aproximada- mente 975 pb de comprimento, o tamanho aproximado esperado. 0 gel

foi transferido para membrana de nylon (GeneScreen Flus, NEN

Research Products, Boston, MA) em 0,4 M NaOH como descrito por

Reed e Mann (1985). O gel transferido foi hibridado com a mistura de oligonucleõtidos JR02 que foi marcada com P usando polinu- cleõtido-cinase de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) e 32 gama- P ATP (New England Nuclear, Boston, MA) . O fragmento com aproximadamente 975 pb foi especificamente detectado pela sonda JR02, indicando fortemente que ele compreende uma fracção do cDNA da histidinol-desidrogenase. 0 fragmento de PCR foi removido de um gel de'agarose de baixa temperatura de gelificação, digerido com EcoRI e subclonado no plasmídeo pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). A inserção 32 ... de PCR subclonada foi marcada com P por iniciação ao acaso usando o kit Prime Time (International Biotechnologies, New Haven, CT) e usado no despiste de levantamentos ("lifts") de placa da biblioteca de cDNA de couve em lambda ZAPII como descrito atrás. As placas que deram hibridação positiva foram purificadas e as suas inserções retiradas para o plasmídeo pBluescript in vivo usando o método descrito pelo fabricante do vector de clonagem lambda ΖΑΡ II (Stratagene, La Jolla, CA).

As sequências de DNA das inserções de cDNA de plasmídeo foram determinadas pelo método didesoxi usando um kit da sequena-se (United States Biochemical, Cleveland, OH). Um subclone do plasmídeo, designado pBSACabHdH7, contem uma inserção de 1613 pb que codifica· uma proteína prevista que encaixa nas sequências dos peptídeos derivados da histidinol-desidrogenase, incluindo o peptídeo N.terminal, indicando um cDNA de tamanho completo ou quase completo (ver, SEQ ID NO: 1 para a sequência de DNA) .

•V

EXEMPLO 13: Preparação de HDH Recombinante Usando um Sistema de Expressão de Baculovírus 13.1 Cultura de células de insecto Células Sf9 foram mantidas como uma cultura em monoca-mada em meio de Grace suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 0,33% (p/v) Yeastolate, 0,33% (p/v) de hidrolisato de lactalbumina e 50 μg/ml de sulfato de gentamicina a 27°C. 13.2 Construção e isolamento de vírus recombinantes O clone de cDNA de histidinol-desidrogenase da couve (pBSACabDdH7) foi digerido com as endonucleases Kpnl e BamHI. 0 fragemento Kpnl-BamHI (1,6 Kb) de HDH, incluindo a região codificadora da sequência de trânsito para o cloroplasto putativa de 93 pb, foi isolado e ligado a pVL1393 duplamente digerido com Kpnl-BamHI. O plasmídeo de transferência recombinante (pVL1339-/HDH) contendo o cDNA de HDH foi então integrado no genoma de AcnNPV por recombinação homóloga mediada por células. Um μg de DNA virai foi misturado com 8Ò μg do plasmídeo pVL1393/HDH em 950 μΐ de tampão HEPES 20 mM, 1 mM Na2HP04, 5 mM KCl, 140 mM NaCl e 10 mM glucose (pH 7,0). Após precipitação com 50 μΐ de 2,5 M CaCl2, o segmento de DNA foi colocado numa cultura em monocamada de células Sf9 e a cultura foi incubada à temperatura ambiente. Após 1 h, o sobrenadante da cultura foi substituído por 2 ml de meio de cultura. Após incubação a 27°C durante 4 dias, o sobrenadante foi diluido 10-1000 vezes e sujeito a purificação em placas. Os clones de baculovírus recombinantes AcNPV-HDH foram inicialmente identificados por análise de hibridação de DNA e pósteriormente purificados por observação num microscópio de dissecação.

13.3 Ensaio enzimático A actividade enzimãtica foi medida espectrofotometri-camente determinando a absorvância do NADH formado a 340 nm como descrito anteriormente (Nagai & Scheidegger, 1991). A mistura de reacção enzimãtica continha tampão 100 mM Gli-NaOH (pH 9,2), 0,5 mM MnCl2, 1 mM NAD+, 2 mM histidinol e enzima. Uma unidade de actividade da enzima foi definida como a quantidade de enzima que cataliza a formação de ljum NADH por minuto nas condições do ensaio. 13.4 Expressão e purificação de HDH recombinante A solução virai recombinante purificada foi amplificada

O para um título de 1-2 x 10 PFU/ml. As células foram infectadas com o vírus a Uma MOI de 5-10 e incubadas a 27°C. 5 dias após a g infecção as células infectadas (1 x 10 células, cultura em 2 monocamada de 5 x 150 cm ) as células foram homogenizadas em 10 ml de tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) (tampão A) usando um sonica-dor Branson (SONIFIER 450). O homogenato de células foi centrifu-gado a 10000 g durante 20 minutos e o sobrenadante foi diluído com tampão A para uma concentração adequada. Retirou-se o sal da amostra em Sephadex G-25. Após incubação a 30°C durante 2 horas o extracto de células bruto foi aplicado numa coluna de permuta aniónica Mono-Q HR 16/10 equilibrada com tampão A. Após lavagem intensa da coluna com tampão A, a proteína ligada foi eluida por um gradiente linear de NaCl (0-300 mM) em tampão A. As fracções activas foram reunidas e usadas para estudos posteriores.

Como resultado da purificação de enzimas atrás descrita obtiveram-se duas proteínas diferindo no seu peso molecular. A forma maior, contendo ainda 10 aminoácidos da sequência sinal putativa, pode ser totalmente convertida na forma mais pequena -71-

por incubação do lisado celular durante 2 tío^asa 45°C. Esta conversão proteolítica é completamente inibida na presença do inibidor de H-proteases leupeptina mas não na presença de PMSF [fluoreto de fenilmetanossulfonilo]. 0 extremo N da maior parte [80% do total] da forma mais pequena começou na posição -1, a parte mais pequena em +1 relativamente ao extremo N da enzima madura isolada a partir de couve. Todas as três formas de histi-dinol-desidrogenase recombinante apresentaram propriedades cinéticas idênticas à enzima da couve tipo selvagem.

V EXEMPLO 14: Preparação de clones de cDNA codificadores da histi-dinol-desidrogenase de trigo

Dois clones de cDNA de histidinol-desidrogenase do trigo [designados SA4 e SA5] foram obtidos de forma análoga ao processo descrito no EXEMPLO 12 usando o clone da couve como uma sonda de hibridação em condições de baixa restringência.

Num primeiro passo preparou-se RNA total a partir de germén de trigo [Sigma Chemical Co., St. Louis, MO] como descrito no EXEMPLO 12. RNA poli(A)+ foi isolado e construida uma biblioteca de cDNA como descrito no EXEMPLO 12. Uma fracção da biblioteca foi cultivada em placas do fago lambda e preparam-se réplicas em filtros seguindo métodos convencionaiscomo descrito em Maniatis et al. (1982). O cDNA clonado da histidinol-desidrogenase isolada de acordo com o EXEMPLO 12 e apresentado em SEQ ID NO: 1 foi marcado radioactivamente no EXEMPLO 12 e hibridado com os filtros numa solução consistindo em 7% de dodecil-sulfato de sódio, 0,5% de fosfato de sódio 0,5M pH 7, 1% de albumina sérica bovina, 1 mM EDTA [Church e Gilbert (1984)] a 50°C. Os filtros foram lavados numa solução consistindo em 1% de dodecilsulfato de sódio, 40 mM fosfato de sódio pH 7, 125 mM cloreto de sódio, 1 mM EDTA a 50°c. Estas condições de hibridação e restringência de lavagem reduzidas permitem a detecção de cDNAs de trigo tendo homologia substancial de sequências com a sequência da couve.

As colónias que deram hibridação positiva foram purificadas por ciclos sequenciados de diluição , sementeira e despiste. Os plasmídeos contendo inserções de cDNA do fago que deu hibridação positiva foram retiradas in vivo e as suas sequências de DNA determinadas como descrito no EXEMPLO 12.As sequências de dois cDNAs de trigo estreitamente relacionadòsV-iiíãs distintos, designados SA4 e SA5, estão apresentadas em SEQ ID NO:2 e 3. Ambas as sequências são 72% idênticas à sequência do clone da couve apresentada em SEQ ID NO:l e são 96% idênticas uma à outra. EXEMPLO 15: Construção de pCGN1761 (uma cassete dupla de promo-tor/terminador contendo resistência à ampicilina). pCGN1761 contem um duplo promotor 35S de CaMV e a região 3' tml com um sítio EcoRI entre eles contido num esqueleto de plasmídeo derivado do pUC. A cassete promotor-EcoRl-sítio de processamento 3' é delimitada por múltiplos sítios de restrição para uma remoção fácil. 0 plamídeo seriva através de umá série de passos (ver abaixo) de um plasmídeo inicial de duplo 35S, pCGN2113, o qual por sua vez deriva de pCGN164 e de pCGN638. O plasmídeo pCGN2113 foi depositado na ATCC em 22 de Março de 1989, com o número de acesso 40587 para fins de processos de patente de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste. 15.1 Construção ds pCGN164 0 fragmento Alui de CaMV (pb 7144-7735) [Gardner et al., (1981)] foi obtido por digestão com Alui e clonado no sítio HincII de M13mp7 [Vieira e Messing (1982)] para criar C614. Uma digestão com EcoRI de C614 produz o fragmento EcoRI de C614 contendo o promotor 35S que foi clonado no sítio EcoRI de pUC8 [Vieira e Messing (1982)] para produzirr pCGN146. Para preparar a região do promotor, o sítio BglII (pb 7670) foi tratado com BglII e Bal31 e subsequentemente um adaptador BglII foi ligado ao DNA tratado com Bal31 para produzir pCGN147. pCGN147foi digerido com EcoRI Hphl e o fragmento resultante EcoRI-Hphl contendo o promotor 3 5S foi ligado a M13mp8 digerido com. EodRl-S-nialI [Vieira e Messing, Gene 19:259-268 (1982)] para criar pCGN164. 15.2 Construção de PCGN638 A digestão de CaMVIO [Gardner et al. (1981)] com BglII produz um fragmento BglII contendo uma região do promotor 35S (pb 6493-7670) o qual foi ligado ao sitio BamHI do pUC19 [Norrander et al. (1983)] para criar pCGN638. 15.3 Construção de PCGN2113 PCGN164 foi digerido com EcoRV e BamHI para libertar um fragmento EcoRV-BamHI que continha uma fracção do promotor 35S (pb 7340-7433); pCGN638 foi digerido com HindIII e EcoRV para libertar o fragmento HindITI-EcoRV contendo uma fracção diferente do promotor 35S (pb 6493-7340). Estes dois fragmentos foram ligados a pCGN986 o qual foi então digerido com HindIII e BamHI para remover o fragmento HindIII-BamHI contendo o promotor 35S; esta ligação produz pCGN639, a qual contem o esqueleto da região 3' tml do pCGN986 e os dois fragmentos do promotor 35S do pCGN164 e pCGN638. pCGN638 foi digerido com EcoRV e Ddel para libertar um fragmento do promotor 35S (pb 7070-7340); o fragmento foi tratado com o fragmento Klenow da DNA-polimerase I para criar extremos cerses e foi ligado ao sitio EcoRV do pCGN639 para produzir pCGN2113 tendo o fragmento na orientação correcta.

pCGN2113 foi digerido com EcoRI e o plasmídeo foi ligado na presença de um adaptador de DNA sintético contendo um sítio Xbal e um sítio BamHI ( o adaptador contem extremos coesivos EcoRI em ambos os extremos, mas as bases adjacentes são tais que o sítio EcoRI não é reconstruído neste local) para produzir pCGN2113M. pCGN113M foi digerido totalmente com Saci e depois sujeito a digestão parcial com BamHI. Este DNA foi então tratado com DNA-polimerase de T4 para criar extremos cerses e um adaptador EcoRI foi ligado ao plasmídeo de extremos cerses. Após trnasformação um clone do plasmídeo que contem um sítio único EcoRI entre o promotor e a região 3! tml foi seleooionaao e designado pCGN1761.

Adams, J. Biol. Chem. 217:325-344 (1955)

Allen G, "Sequencing of proteins and peptides", in: Laboratorv Techníaues in Biochemistry and Molecular Biology, Vol 8. Eds. TS Work and RH Bordon, Elsevier, North-Holland, Biomedical Press, Amsterdara (1981)

Bevan et al, Nature 304:184-187 (1983).

Blnding, "Regeneration of Plants," in Plant Protoplasts, pp. 21-37 (CRC Press, Boca Raton, 1985)

Bitar et al., Biochim. Biophys. Acta 493:429-440 (1977)

Bradford, Anal.Biochem. 72:248-254 (1976)

Burger et al., Biochem. J. 181:771-774 (1979)

Burger et al., Eur. J. Biochem. JJj5:137-142 (1981)

Christou et al, Plant Physiol. 87:671-674 (1988)

Chu etal, Scientía Sinica, Vol. ΧΥΙΠ(Νο. 5):659-668 (1975)

Crossway et al, BioTechniques 4:320-334 (1986)

Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereais and Other Recalcitrant Crops," in Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, pp. 31-41 (Birkhauser, Basel, 1983) Datta et al, Bio/Technology 8:736-740 (1990)

Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts," Protoplasts 1983)

Davis et al, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980)

Donahue et al., Gene 18,:47-59 (1982)

Dougall andFulton, Plant Physiol. 42:941-945 (1967)

Eccleston etal., J. Biol. Chem. 254:11399-11404 (1979) 'w' Elzen et ai, Plant Molecular Biology 5:299-392 (1985)

Erlich, (ed.), PCR Technology, Stockton Press, New York (1989)

Evans et al, "Protoplast Isolaúon and Culture," in Handbook of Plant Cell Culture 1:124-176 (MacMillan Publishing Co., New York 1983)

Fromm et al, Bio/Technology 8:833-839 (1990)

Gardner etal, Nucl. Acids Res. 9: 2871-2888 (1981)

Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2:603-618 (1990)

Grimsley et al, EP-A 0 267 159

X

Gorisch and Holke, Eur. J. Biochem. 150:305-308 (1985)

Grubmeyer et ai, Arch. Biochem. Biophys. 272:311-317 (1989)

Grubmeyer et ai, Biochem. 28:8174-8180 (1989)

Hake andFreeling, Nature 320, 621-623 (1986)

Heim et al., Plant Physiol. 91.:1226-1231 (1989)

Hinchee et al Biotechnology 6:915-921 (1988)

Hohn et al, Current Topics in Microbiology and Immunology 96:194-220 (1982) Hooykas-Van Slogteren et ai, Nature 311:763-764 (1984)

Horsch et al, Science 227:1229 (1985)

Jefferson, Plant Molecular Biology Repórter 5:387-405 (1987)

Kanamori et ai, J. Chromatog. 363:231-242 (1986)

Keesey et ai, J. Biol. Chem. 254:7427-7433 (1979)

Klein et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (1988)

Klein et al Biotechnology 6:559-563 (1988)

Klein etal, Plant Physiol. 91:440-444 (1989)

Kumpaisal et al, Plant Physiol. 85:145-151 (1987)

Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)

Lagrimini et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,7542-7546 (1987)

Leung et al, Technique U11-15 (1989)

McBride et al, Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)

Maniatis et ai, Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)

Matsumoto et al., J. Biochem. 85:1091-1098 (1979)

Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74:560-564 (1977)

McCabe et al, Biotechnology 6:923-926 (1988)

McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual," MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979

Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972)

Morelli et al, Nature 315: 200-204 (1985)

Mullis et al, Meth. Enzymol., 155: 335-350 (1987)

Negrutiu et al., Mol. Gen. Genet. 199:330-337 (1985)

Neuhaus etal, Theor Appl Genet 75, 30-36 (1987)

Norrander et ai, Gene 26: 101-106 (1983)

Paszkowski et al, EMBO J. 3:2717-2722 (1984)

Petit etal, Mol. Gen. Genet. 202: 388 (1986) c-s •Ν' V '

Pierce etal, Plant Gene Systems and their Biology, (Alan R. Liss, Inc.) pp. 301-310 Poethig, Nature 336,82-83 (1988)

Reed and Mann, Nucleic Acids Res. 13:7207-7221 (1985)

Riggs et al, Proc. NaL Acad. Sei. USA 83:5602-5606 (1986)

Saiki et al, Science 239:487-491 (1988)

Sanford et al, U.S. Patent 4,945,050

Sanford et al, Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987)

Sanger, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)]

Schenk and Hildebrandt, Can J Botany 5Çh 199-204 (1972)

Schocher RJ et al, Bio/Technology, ±: 1093-1096 (1986)

Segel, Biochemical Calculations, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York (1976); Suelter, A Practical Guide to Enzymology, John Wiley and Sons, New York (1985). Shaffer et a/.,Brookhaven Symp. Biol. 23:250-270 (1972)

Sherman et al, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1983)

Shillito etal, Bio Technology, 3.: 1099-1103 (1985)

Shoutíe and Bolstein, Method. Enzymol. 100:457-468 (1983)

Simpson and Nice, Biochem Intl, 8:787 (1984) Sísely and Wood, "Encyclopedia of Surface Actíve Agents," Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980.

Skyríng et ai, Anal. Biochem., 36:511-520 (1970)

Somerville and Ogren, In Edelman et al (eds) Methods in Chloroplast Molecular Biology. Elsevier Biomedical Press, pp. 129-138 (1982)

Southern, J. Mol. Biol. 98 :503 (1975)

Strauss et al, Planta 163:554-562 (1985)

Strickler etal, Anal. Biochem. 140:553-566 (1984)

Thompson etal, EMBO J 6:2519-2523 (1987)

Tomes etal, in CerealTissue and Cel1 Culture, pp. 175-203 (Bright, ed.) (1985)(”Tomes 2")

Velten et al, EMBO J. 3:2723-2730 (1984)

Vieira and Messing, Gene 19;: 259-268 (1982)

Wang Y-C etal, Plant Mol. Biol. IV. 433-439 (1988)

Weissing et al, Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988)

Wiater et al., Acta Biochim. Polonica 18:299-307 (1971)

Wong etal, Phytochem. 20:1831-1834 (1981)

Wong and Mazelis, Phytochem. 20:1831-1834 (1981)

Yamada and Sato, Plant & Cell Physiol. 19:691-699 (1978) Yavada, Mol. Gen. GeneL 170:109-111 (1979)

Yourno and Ino, J. Biol. Chem. 243:3273-3276 (1968) Zoller and Smith, Meth. Enzymol. 100, 468-500 (1983)

Patentliteratur: EP-A 0 189 707 EP-A 0 267 159 EP-A 0 306 139 EP-A 0 434 616 WO 89/07647 US-P 4,761.373

SEQ ID NO: 1 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1613 pares de bases TIPO DE CADEIA: cadeia mais (codificadora) TOPOLOGIA: linear

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA cópia de mRNA ORGANISMO FONTE ORIGINAL: tecido da folha de couve

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE CELULAR: plasmídeo pBSACabHdH7 PROPRIEDADES: actividade de histidinol-desidrogenase AATTCGGCAC GAGCCTATTC GCCGGCGAAC ACACTCCTAT TTGAGCAAAC 50 CCGGTGAGG ATG TCA TTC GAT CTA TCT CGT CTC TCC CTC ACT TCC 95 Met Ser Phe Asp Leu Ser Arg Leu Ser Leu Thr Ser TCG CCT CGT CTC TCG TTT CTC ACT CGC ACT GCT ACT AAG AAA GGA 140 Ser Pro Arg Leu Ser Phe Leu Thr Arg Thr Ala Thr Lys Lys Gly TTC GTT AGG TGT TCG ATG AAG TCG TAC AGA TTA TCT GAA CTT AGT 185 Phe Vai Arg Cys Ser Met Lys Ser Tyr Arg Leu Ser Glu Leu Ser TTC TCT CAA GTT GAG AAC TTG AAG GCA CGC CCT CGC ATT GAC TTC 230 Phe Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Ala Arg Pro Arg Ile Asp Phe TCT TCC ATT TTC ACC ACT GTT AAC CCA ATC ATC GAC GCT GTT CGT 275 Ser Ser Ile Phe Thr Thr Vai Asn Pro Ile Ile Asp Ala Vai Arg AGC AAA GGA GAT ACT GCT GTC AAA GAG TAT ACA GAG AGA TTT GAC 320 Ser Lys Gly Asp Thr Ala Vai Lys Glu Tyr Thr Glu Arg Phe Asp AAA GTC CAG CTC AAT AAA GTG GTG GAG GAT GTG TCC GAA CTT GAT 365 Lys Vai Gin Leu Asn Lys Vai Vai Glu Asp Vai Ser Glu Leu Asp ATC CCT GAG CTC GAC TCC GCA GTT AAA GAA GCG TTT GAT GTT GCG 410 Ile Pro Glu Leu Asp Ser Ala Vai Lys Glu Ala Phe Asp Vai Ala

X .-

\V ΤΑΤ GAC AAC ATT TAT GCA TTT CAC TTT GCC CAA ATG TCA ACT GAG 455 ' Tyr Asp Asn Ile Tyr Ala Phe His Phe Ala Gin Met Ser Thr Glu ΑΑΑ AGC GTT GAG AAT. ATG AAA GGT GTA AGA TGT AAA AGG GTG TCG 500 Lys Ser Vai Glu Asn Met Lys Gly Vai Arg Cys Lys Arg Vai Ser AGA TCT ATT GGT TCT GTT GGT CTT TAT GTG CCT GGT GGA ACT GCT 545 Arg Ser Ile Gly Ser Vai Gly Leu Tyr Vai Pro Gly Gly Thr Ala GTT TTG CCA TCT ACT GCT TTG ATG CTT GCT ATT CCT GCT CAG ATT 590 Vai Leu Pro Ser Thr Ala Leu Met Leu Ala Ile Pro Ala Gin Ile GCT GGA TGT AAA ACA GTT GTC CTC GCA ACT CCA CCA ACT AAG GAA 635 Ala Gly Cys Lys Thr Vai Vai Leu Ala Thr Pro Pro Thr Lys Glu GGA AGC ATA TGT AAG GAG GTG CTG TAT TGT GCC AAG AGG GCT GGT 680 Gly Ser Ile Cys Lys Glu Vai Leu Tyr Cys Ala Lys Arg Ala Gly GTA ACT CAC ATT CTT AAA GCT GGT GGA GCA CAG GCT ATA GCT GCC 725 Vai Thr His Ile Leu Lys Ala Gly Gly Ala Gin Ala’ Ile Ala Ala ATG GCC TGG GGG ACA GAT TCT TGT CCT AAG GTT GAG AAG ATT TTT 770 Met Ala Trp Gly Thr Asp Ser Cys Pro Lys Vai Glu Lys Ile Phe GGT CCT GGG AAT CAG TAT GTT ACA GCT GCT AAG ATG ATT CTG CAA 815 Gly Pro Gly Asn Gin Tyr Vai Thr Ala Ala Lys Met Ile Leu Gin AAC AGC GAG GCA ATG GTT TCG ATT GAT ATG CCT GCT GGC CCT TCA 860 Asn Ser Glu Ala Met Vai Ser Ile Asp Met Pro Ala Gly Pro Ser GAA GTT CTT GTT ATC GCT GAT GAA CAT GCT AGT CCA GTT TAC ATT' 905 Glu Vai Leu Vai Ile Ala Asp Glu His Ala Ser Pro Vai Tyr Ile GCA GCC GAC TTA CTT TCT CAG GCT GAG CAT GGT CCA GAT AGT CAG 950 Ala Ala Asp Leu Leu Ser Gin Ala Glu His Gly Pro Asp Ser Gin GTT GTT CTT GTT GTT GTA GGC GAT GGT GTA AAT CTC AAA GCC ATC 995 Vai Vai Leu Vai Vai Vai Gly Asp Gly Vai Asn Leu Lys Ala Ile GAA GAA GAA ATT GCT AAA CAA TGC AAA AGC CTT CCT AGA GGC GAG 1040 Glu Glu Glu Ile Ala Lys Gin Cys Lys Ser Leu Pro Arg Gly Glu TTT GCT TCA AAA GCT CTA AGT CAC AGC TTC ACA GTA TTT GCT CGA 1085 Phe Ala Ser Lys Ala Leu Ser His Ser Phe Thr Vai Phe Ala Arg GAT ATG ATT GAG GCA ATA ACT TTC TCA AAC CTG TAT GCA CCT GAA 1130 Asp Met Ile Glu Ala Ile Thr Phe Ser Asn Leu Tyr Ala Pro Glu CAC TTG ATC ATC AAT GTC AAA GAC GCT GAG AAA TGG GAG GGA CTG 1175 His Leu Ile Ile Asn Vai Lys Asp Ala Glu Lys Trp Glu Gly Leu ATA GAG AAC GCA GGT TCG GTT TTC ATA GGG CCG TGG ACT CCT GAG 1220 Ile Glu Asn Ala Gly Ser Vai Phe Ile Gly Pro Trp Thr Pro Glu AGT GTT GGT GAT TAC GCG AGC GGG ACA AAC CAC GTT CTT CCA ACG 1265 Ser Vai Gly Asp Tyr Ala Ser Gly Thr Asn His Vai Leu ProThr TAC GGG TAT GCG AGA· ATG TAC AGT GGC GTC TCT CTC GAC TCT TTC 1310 Tyr Gly Tyr Ala Arg Met Tyr Ser Gly Val Ser Leu Asp Ser Phe CTG AAG TTC ATG ACT GTA CAG TCC TTG ACA GAG GAA GGT CTG CGA 1355 Leu Lys Phe Met Thr Vai Gin Ser Leu Thr Glu Glu Gly Leu Arg AAC CTT GGT CCG TAT GTT GCG ACT ATG GCT GAA ATT GAA GGT CTA 1400 Asn Leu Gly Pro Tyr Vai Ala Thr Met Ala Glu Ile Glu Gly Leu GAT GCA CAC AAG AGA GCC GTC ACT CTC AGA CTC AAG GAT ATC GAA 1445 Asp Ala His Lys Arg Ala Vai Thr Leu Arg Leu Lys Asp Ile Glu GCC AAA CAG ACC CAA ACA AAG TGA AATGAATGGC TGTCTTCATA 1489 Ala Lys Gin Thr Gin Thr Lys * TTCAAATGAG GTGACATTGG TTTAAAGAGA TAATAATAAT AAGAATAATA 1539 TAAGAGATGT TGTAACACTC TCTGTCATAA TCTGGATTTT CTTTCATTAT 1589

TGAAATTTGA

ATCCTTTCAC GCGT 1613 -83-

SEQ ID NO: 2 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1137 pares de bases TIPO DE CADEIA: cadeia roais (codificadora) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: cDNA cópia de mRNA ORGANISMO FONTE ORIGINAL: trigo FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE CELULAR: plasmídeo PROPRIEDADES: fracção do mRNA histidinol-desidrogenase CARACTERíSTICAS: codão de paragem em 951

GGCACGAGGC TGTATGTTCC AGGGGGCACT GCAGTCTTGC CTTCAACTGC

ATTGATGCTT GCTGTGCCTG CACAGATTGC TGGATGCAAA ACTGTAGTTC TTGCCACACC CCCTAGTCGT GATGGTAGCA TATGTAAGGA GGTTCTTTAC TGTGCTAAAA AAGCTGGTGT TACACACATA CTAAAAGCTG GGGGAGCTCA GGCAATCTCC GCTATGGCAT GGGGAACTGC ATCATGCCCA AAGGTTGAGA AAATATTTGG TCCCGGCAAC CAGTATGTCA CAGCTGCTAA AATGATTCTT CAGAACAGCG AAGCTATGGT CTCTATAGAC ATGCCTGCTG GCCCTTCAGA AGTTCTGGTA ATCGCTGACA AATATGCCAA CCCAGTTCAT GTTGCCGCTG ATCTGCTATC TCAGGCAGAA CATGGCCCAG ATAGTCAGGT TGTTCTAGTT ATTGCGGGAG ATGGTGTTGA TTTAGCTGCC ACTGAAGCAG AAGTTAGCAA GCAGTGTGAT GCTCTTCCTA GAGGCGACTT TGCTTCCAAA GCACTTGGCC 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 -84- -84-

ACAGTTTCAC TGTGTTTGCC AGAGATATGG CTGAGGCATT ATCGTTCTCA 600 AATATGTATG CTCCTGAGCA TTTGATCATC AATGTAAAGG ATGCTGAGCA 650 ATGGGAGGAG CTCATCGAGA ATGCAGGGTC AGTTTTCTTG GGACAATGGA .700 CCCCCGAGAG CGTCGGTGAC TACGCTAGTG GGACGAACCA CGTCCTCCCA 750 ACCTACGGTT ACGCGAGGAT GTACAGCGGT GTGTCGCTGA ATTCTTTCCT 800 CAAGTACATC ACTGTTCAAT CCCTGACTGA AGNAGGGCTG AGAAGGCTGG 850 GTCCCTACGT CGCAAAGATG GCAGAAGTCG AAGGCCTAGA AGCGCACAAG 900 CGAGCTGTTA CCCTCAGACT GCAAGAGATC GAAGCCACTG TAACTGTTTA 950 ÀACTGTTAAC atggtctgtt GTGCCAGTCT ATTTGATGCT TGGGAACTGA 1000 TATTTTTCTT AATTCTTATC GGATGGGACT TGCCAGAGTT TAAGGTGAAT 1050 ACGAAGCTGT TTCATGGAAT AATGCTACTT ATGTCGATCC GTTAAATGAA 1100 TAAACTTGTG AGTACAGTCT CTAAAAAAAA AAAAAAA 1137 Λ ^ : Υ« — Ν - \\ SEQ ID ΝΟ: 3 ' ÍS*.' · TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 995 pares de bases TIPO DE CADEIA: cadeia mais (codificadora) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: cDNA cópia de mRNA ORGANISMO FONTE ORIGINAL: trigo FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE CELULAR: plasmideo PROPRIEDADES: fracção do mRNA histidinol-desidrogenase CARACTERíSTICAS: codão de paragem em 828

GGCACGAGAT GTAAGGAGGT TCTTTACTGT GCCAAAAAAG CTGGTGTTAC

ACACATACTA AAAGCTGGGG GAGCTCAGGC AATCTCCGCT ATGGCATGGG GAACCGCATC ATGCCCAAAG GTTGAGAAAA TATTTGGTCC TGGCAACCAG TATGTCACAG CTGCTAAAAT GATTCTTCAG AACAGCGAAG CTATGGTCTC TATAGACATG CCTGCTGGCC CTTCAGAAGT TCTGGTAATT GCTGACAAAT ATGCCAACCC AGTTCATGTT GCCGCTGATC TGCTATCTCA GGCAGAACAT GGCCCAGATA GTCAGGTTGT TCTAGTTATT GCTGGAGATG GTGTTGATTT AGGTGCCATT GAAGCAGAAG TTAGCAAGCA GTGCGATGCT CTTCCTAGAG GCGACTTTGC TTCCAAAGCA CTTGGCCACA GTTTCACTGT GTTTGNCAGA GATATGGTTG AGGNATTATC GTTCTCAAAT ATGTATGCTC CTGAGCATTT GATCATCAAC GTAAAGGATG CTGAGCAATG GGAGGAGCTC ATCGAGAACG 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 -86-

CAGGGTCAGT TTTCTTGGGA CAATGGACCC CCGAGAGCGT GGGTGACTAT 600 GCCAGTGGGA CGAACCACGT CCTCCCAACC TACGGTTACG CGAGGATGTA 650 CAGCGGTGTG TCGCTGAACT CTTTCCTCAA GTACATCACT GTTCAATCCC 7.00 TGACTGAAGA AGGGCTGAGA AGGCTGGGCC CCTACGTCGC AAAGATGGCA 750 GAAGTCGAAG GGCTAGAAGC GCACAAGCGA GCTGTTACCC TCAGACTGCA 800 AGAGGTCGAA GCCACTGTAA CTGTGTAAAC TGTTAGCATG GTCTGTTGTG 850 CCAGTCTATT TGATGCTTGG GGACTGATAT TTTTCTTCAT TTTTATCGGA 900 TGGAACTTGC CAGAGTTTAA GGTGAAGAAT ACGAAGCTGT TTCATGGAAT 950 AATGCTACTT ATGTCGATCT GTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 995

Claims

REIVINDICAÇÕES ia. - Método para a produção de uma proteína histidi-nol-desidrogenase purificada a partir de plantas, caracterizado por compreender: (a) a exposição de um extracto de proteína a uma coluna de cromatografia de permuta iónica para produzir um primeiro eluato na presença de um gradiente linear; (b) a exposição do primeiro eluato a uma coluna de cromatografia de afinidade para produzir um segundo eluato na presença de um solvente de deslocamento adequado, em que a referida coluna de cromatografia compreende um ligando específico para a histidinol-desidrogenase; (c) o armazenamento do segundo eluato. 2 ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ligando compreender histidinol e/ou his-tidinal. 3 ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido solvente de deslocamento ser um contendo uma substância que é semelhante ao ligando usado na coluna de afinidade. 4ã. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido solvente de deslocamento ser imidazole. -88-

5ã. - Método de acordo com a reivihdlrc'a)çãó 1, caracte-rizado por a referida coluna de cromatografia de permuta iónica compreender uma resina derivada com dietil-amino-etilo (DEAE). 6a. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizado por a referida coluna de cromatografia de permuta iónica compreender uma celulose derivada com DEAE. 7§. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizado por a réferida coluna de cromatografia de permuta iónica compreender DEAE-Toyopearl. 'w1 8â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o referido gradiente linear compreender um tampão de equilíbrio e um gradiente salino adequado. 9â. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte-rizado por o referido gradiente salino compreender NaCl de 0 a pelo menos 500 mM.
10- Método de acordo com a reivindicação 8, caracte-rizado por o referido gradente salino compreende NaCl de 0 a cerca de 500 mM. lia. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se obter uma proteína vegetal essencialmente pura apresentando actividade de histidinol-desidrogenase.
12- Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se obter uma proteína essencialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos idêntica ou substancialmente homóloga de uma sequência proteica de SEQ ID N0:1: AATTCGGCAC GAGCCTATTC GCCGGCGAAC ACACTCCTAT TTGAGCAAAC 50 CCGGTGAGG ATG TCA TTC GAT CTA TCT CGT CTC TCC CTC ACT TCC 95 Met Ser Phe Asp Leu Ser Arg Leu Ser Leu Thr Ser TCG CCT CGT CTC TCG· TTT CTC ACT CGC ACT GCT ACT AAG AAA GGA 140 Ser Pro Arg Leu Ser Phe Leu Thr Arg Thr Ala Thr Lys Lys Gly TTC GTT AGG TGT TCG ATG AAG TCG TAC AGA TTA TCT GAA CTT AGT 185 Phe Vai Arg Cys Ser Met Lys Ser Tyr Arg Leu Ser Glu Leu Ser TTC TCT CAA GTT GAG AAC TTG AAG GCA CGC CCT CGC ATT GAC TTC 230 Phe Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Ala Arg Pro Arg Ile Asp Phe TCT TCC ATT TTC ACC ACT GTT AAC CCA ATC ATC GAC GCT GTT CGT 275 Ser Ser Ile Phe Thr Thr Vai Asn Pro Ile Ile Asp Alá Vai Arg AGC AAA GGA GAT ACT GCT GTC AAA GAG TAT ACA GAG AGA TTT GAC 320 Ser Lys Gly Asp Thr Ala Vai Lys Glu Tyr Thr Glu Arg Phe Asp AAA GTC CAG CTC AAT AAA GTG GTG GAG GAT GTG TCC GAA CTT GAT 365 Lys Vai Gin Leu Asn Lys Vai Vai Glu Asp Vai Ser Glu Leu Asp ATC CCT GA G CTC GAC TCC GCA GTT AAA GAA GCG TTT GAT GTT GCG 410 ile Pro Glu Leu Asp Ser Ala Vai Lys Glu Ala Phe Asp Vai Ala TAT GAC AAC ATT TAT GCA TTT CAC TTT GCC CAA ATG TCA ACT GAG 455 Tyr Asp Asn Ile Tyr Ala Phe His Phe Ala Gin Met Ser Thr Glu AAA AGC GTT GAG AAT ATG AAA GGT GTA AGA TGT AAA AGG GTG TCG 500 Lys Ser Vai Glu Asn Met Lys Gly Vai Arg Cys Lys Arg Vai Ser AGA TCT ATT GGT TCT GTT GGT CTT TAT GTG CCT GGT GGA ACT GCT 545 Arg Ser Ile Gly Ser Vai Gly Leu Tyr Vai Pro Gly Gly Thr Ala GTT TTG CCA TCT ACT GCT TTG ATG CTT GCT ATT CCT GCT CAG ATT 590 Vai Leu Pro Ser Thr Ala Leu Met Leu Ala Ile Pro Ala Gin Ile GCT GGA TGT AAA ACA GTT GTC CTC GCA ACT CCA CCA ACT AAG GAA 635 Ala Gly Cys Lys Thr Vai Vai Leu Ala Thr Pro Pro Thr Lys Glu GGA AGC ATA TGT AAG GAG GTG CTG TAT TGT GCC AAG AGG GCT GGT 680 Gly Ser Ile Cys Lys Glu Vai Leu Tyr Cys Ala Lys Arg Ala Gly GTA ACT CAC ATT CTT AAA GCT GGT GGA GCA CAG GCT ÀTA:'gCT GCC 725 Vai Thr His Ile Leu Lys Ala Gly Gly Ala Gin Ala Ile Ala Ala ATG GCC TGG GGG ACA GAT TCT TGT CCT AAG GTT GAG AAG ATT ΤΤΤ 770 Met Ala Trp Gly Thr Asp Ser Cys Bro Lys Vai Glu Lys Ile Phe GGT CCT GGG AAT CAG TAT GTT ACA GCT GCT AAG ATG ATT CTG CAA 815 Gly Bro Gly Asn Gin Tyr Vai Thr Ala Ala Lys Met Ile Leu Gin AAC AGC GAG GCA ATG GTT TCG ATT GAT ATG CCT GCT GGC CCT TCA 860 Asn Ser Glu Ala Met Vai Ser Ile Asp Met Pro Ala Gly Pro Ser GAA GTT CTT GTT ATC GCT GAT GAA CAT GCT AGT CCA GTT TAC ATT 905 Glu Vai Leu Vai Ile Ala Asp Glu His Ala Ser Pro Vai Tyr Ile GCA GCC GAC TTA CTT TCT CAG GCT GAG CAT GGT CCA GAT' AGT CAG 950 Ala Ala Asp Leu Leu Ser Gin Ala Glu His Gly Pro Asp Ser Gin GTT GTT CTT GTT GTT GTA GGC GAT GGT GTA AAT CTC AAA GCC ATC 995 Vai Vai Leu Vai Vai Vai Gly Asp Gly Vai Asn Leu Lys Ala Ile GAA GAA GAA ATT GCT AAA CAA TGC AAA AGC CTT CCT AGA GGC GAG 1040 Glu GlU Glu Ile Ala Lys Gin Cys Lys Ser Leu Pro Arg Gly Glu TTT GCT TCA AAA GCT CTA AGT CAC AGC TTC ACA GTA TTT GCT CGA 1085 Phe Ala Ser Lys Ala Leu Ser His Ser Phe Thr Vai Phe Ala Arg GAT ATG ATT GAG GCA ATA ACT TTC TCA AAC CTG TAT GCA CCT GAA 1130 Asp Met Ile Glu Ala Ile Thr Phe Ser Asn Leu Tyr Ala Pro Glu CAC TTG ATC ATC AAT GTC AAA GAC GCT GAG AAA TGG GAG GGA CTG 1175 His Leu Ile Ile Asn Vai Lys Asp Ala Glu Lys Trp Glu Gly Leu ATA GAG AAC GCA GGT TCG GTT TTC ATA GGG CCG TGG ACT CCT GAG 1220 ile GlU Asn Ala Gly Ser Vai Phe Ile Gly Pro Trp Thr Pro Glu AGT GTT GGT GAT TAC GCG AGC GGG ACA AAC CAC GTT CTT CCA ACG 1265 Ser Vai Gly Asp Tyr Ala Ser Gly Thr Asn His Vai Leu Pro Thr TAC GGG TAT GCG AGA ATG TAC AGT GGC GTC TCT CTC GAC TCT TTC 1310 Tyr Gly Tyr Ala Arg Met Tyr Ser Gly Vai Ser Leu Asp Ser Phe CTG AAG TTC ATG ACT GTA CAG TCC TTG ACA GAG GAA GGT CTG CGA 1355 Leu Lys Phe Met Thr Vai Gin Ser Leu Thr Glu Glu Gly Leu Arg AAC CTT GGT CCG TAT GTT GCG ACT ATG GCT GAA ATT GAA GGT CTA 1400 Asn Leu Gly Pro Tyr Vai Ala Thr Met Ala Glu Ile Glu Gly Leu GAT GCA CAC AAG AGA GCC GTC ACT CTC AGA CTC AAG GAT ATC GAA 1445 Asp Ala His Lys Arg Ala Vai Thr Leu Arg Leu Lys Asp Ile Glu GCC AAA CAG ACC CAA ACA AAG TGA AATGAATGGC TGTCTTCATA 1489 Ala Lys GIn Thr Gin Thr Lys * TTCAAATGAG GTGACATTGG TTTAAAGAGA TAATAATAAT AAGAATAATA 1539 TAAGAGATGT TGTAACACTC TCTGTCATAA TCTGGATTTT CTTTCATTAT 1589 TGAAATTTGA ATCCTTTCAC GCGT 1613 13 a. - Método de acordo com a reivindiçaç,$o' 12, carac-terizado por se obter uma proteína essencialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos que é homóloga de pelo menos 70 por cento da referida sequência proteica de SEQ ID NO:l. 14§. - Método de acordo com a reivindicação 13, carac-terizado por se obter uma proteína essencialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos que é homóloga de pelo menos 80 por cento da referida sequência proteica de SEQ ID NO:l. 15â. - Método de acordo com a reivindicação 13, carac-terizado por se obter uma proteína essencialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos que é homóloga de pelo menos 90 por cento da referida sequência proteica de SEQ ID N0:1. 16a. - Método de acordo com a reivindicação 13, carac-terizado por se obter uma proteína essencialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos que é homóloga de pelo menos 99 por cento da referida sequência proteica de SEQ ID N0:1. 17a. - Método para a produção de uma proteína vegetal recombinante purificada apresentando actividade de histidinol--desidrogenase, caracterizado por compreender: (a) a transformação de um organismo hospedeiro adequado com um DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína com actividade de histidinol-desi-drogenase; (b) o isolamento da proteína a partir do sobrenadante de expressão. carac- 18a. - Método de acordo com a reivindicação 17, terizado por os organismos hospedeiros serem seleccionados do grupo constituído por células de bactérias, leveduras e insectos. 19ã. - Método de acordo com a reivindicação 17, carac-terizado por se obter uma proteína vegetal essencialmente pura apresentando actividade de histidinol-desidrogenase. 20â. - Método para produção de uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que tem actividade de histidinol-desidrogenase, caracterizado por compreender: (a) a preparação de uma biblioteca genômica ou de cDNA a partir de um organismo fonte adequado usando uma vector de clonagem adequado; (b) a hibridação da biblioteca com uma molécula sonda; (c) a identificação de hibridações positivas da sonda com os clones de DNA da biblioteca, ou seja clones potencialmente contendo a sequência de nucleótidos correspondendo à sequência de aminoácidos da histidinol-desidrogenase. 21ã. - Método para a produção de uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína apresentando actividade de histidinol-desidrogenase, caracterizado por compreender : (a) a preparação de DNA total a partir de uma biblioteca genômica ou de cDNA; (b) a utilização do DNA do passo (a) como um molde para reacção de PCR com iniciadores representando porções de baixa Cn Os \V degenerescência da sequência de aminoácidos dá'"''bistidinol-desi-drogenase. 22a. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína isolada de acordo com a reivindicação 1. 23¾. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidinol-desidrogenase. 24¾. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado por se obtèr uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidinol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é idêntica ou substancialmente homologa da sequência de DNA de SEQ ID N0:1. 25¾. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidinol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é homóloga de pelo menos 60 por cento da sequência de DNA de SEQ ID N0:1. 26ã. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidinol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é homóloga de pelo menos 75 por cento da sequência de DNA de SEQ ID N0:1. - -ST \' ' carac- 27â. - Método de acordo com a reivindicação 26, terizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidi-nol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é homóloga de pelo menos 90 por cento da sequência de DNA de SEQ ID NO:l. ''w' 28â. - Método de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidi-nol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é a sequência de DNA de SEQ ID NO:l. 29a. - Método de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidi-nol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA é a sequência de DNA de SEQ ID NO:2.

GGCACGAGGC TGTATGTTCC AGGGGGCACT GCAGTCTTGC CTTCAACTGC ATTGATGCTT GCTGTGCCTG CACAGATTGC TGGATGCAAA ACTGTAGTTC TTGCCACACC CCCTAGTCGT GATGGTAGCA TATGTAAGGA GGTTCTTTAC TGTGCTAAAA AAGCTGGTGT TACACACATA CTAAAAGCTG GGGGAGCTCA GGCAATCTCC GCTATGGCAT GGGGAACTGC ATCATGCCCA AAGGTTGAGA AAATATTTGG TCCCGGCAAC CAGTATGTCA CAGCTGCTAA AATGATTCTT CAGAACAGCG AAGCTATGGT CTCTATAGAC ATGCCTGCTG GCCCTTCAGA AGTTCTGGTA ATCGCTGACA AATATGCCAA CCCAGTTCAT GTTGCCGCTG ATCTGCTATC TCAGGCAGAA CATGGCCCAG ATAGTCAGGT TGTTCTAGTT ATTGCGGGAG ATGGTGTTGA TTTAGCTGCC ACTGAAGCAG AAGTTAGCAA GCAGTGTGAT GCTCTTCCTA GAGGCGACTT TGCTTCCAAA GCACTTGGCC ACAGTTTCAC TGTGTTTGCC AGAGATATGG CTGAGGCATT ATCGTTCTCA AATATGTATG CTCCTGAGCA TTTGATCATC AATGTAAAGG ATGCTGAGCA ATGGGAGGAG CTCATCGAGA ATGCAGGGTC AGTTTTCTTG GGACAATGGA CCCCCGAGAG CGTCGGTGAC TACGCTAGTG GGACGAACCA CGTCCTCCCA ACCTACGGTT ACGCGAGGAT GTACAGCGGT GTGTCGCTGA ATTCTTTCCT CAAGTACATC ACTGTTCAAT CCCTGACTGA AGNAGGGCTG AGAAGGCTGG GTCCCTACGT CGCAAAGATG GCAGAAGTCG AAGGCCTAGA AGCGCACAAG CGAGCTGTTA CCCTCAGACT GCAAGAGATC GAAGCCACTG TAACTGTTTA AACTGTTAAC ATGGTCTGTT GTGCCAGTCT ATTTGATGCT TGGGAACTGA TATTTTTCTT AATTCTTATC GGATGGGACT TGCCAGAGTT TAAGGTGAAT ACGAAGCTGT TTCATGGAAT AATGCTACTT ATGTCGATCC GTTAAATGAA TAAACTTGTG AGTACAGTCT CTAAAAAAAA AAAAAAA -96- (

ν »Γ ' .\ %-· 3Οâ. - Método de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por se obter uma sequência de DNA essencialmente pura codificadora de uma proteína que apresenta actividade de histidi-nol-desidrogenase, em que a referida sequência de DNA ê a sequência de DNA de SEQ ID NO:3. GGCACGAGAT GTAAGGAGGT TCTTTACTGT GCCAAAAAAG CTGGTGTTAC 50 ACACATACTA AAAGCTGGGG GAGCTCAGGC AATCTCCGCT ATGGCATGGG 100 GAACCGCATC ATGCCCAAAG GTTGAGAAAA TATTTGGTCC TGGCAACCAG 150 TATGTCACAG CTGCTAAAAT GATTCTTCAG AACAGCGAAG CTATGGTCTC 200 TATAGACATG CCTGCTGGCC CTTCAGAAGT TCTGGTAATT GCTGACAAAT 250 ATGCCAACCC AGTTCATGTT GCCGCTGATC TGCTATCTCA GGCAGAACAT 300 GGCCCAGATA GTCAGGTTGT TCTAGTTATT GCTGGAGATG GTGTTGATTT 350 AGGTGCCATT GAAGCAGAAG TTAGCAAGCA GTGCGATGCT CTTCCTAGAG 400 GCGACTTTGC TTCCAAAGCA CTTGGCCACA GTTTCACTGT GTTTGNCAGA 450 GATATGGTTG AGGNATTATC GTTCTCAAAT ATGTATGCTC CTGAGCATTT 500 GATCATCAAC GTAAAGGATG CTGAGCAATG GGAGGAGCTC ATCGAGAACG 550 CAGGGTCAGT TTTCTTGGGA CAATGGACCC CCGAGAGCGT GGGTGACTAT 600 650 Ο. - 17 .. . Λ : V/ «. £ f ^ -s GCCAGTGGGA CGAACCACGT CCTCCCAACC TACGGTTACG CGAGGATGTA CAGCGGTGTG TCGCTGAACT CTTTCCTCAA GTACATCACT GTTCAATCCC 700 TGACTGAAGA AGGGCTGAGA AGGCTGGGCC CCTACGTCGC AAAGATGGCA 750 GAAGTCGAAG GGCTAGAAGC GCACAAGCGA GCTGTTACCC TCAGACTGCA 800 AGAGGTCGAA GCCACTGTAA CTGTGTAAAC TGTTAGCATG GTCTGTTGTG 850 CCAGTCTATT TGATGCTTGG GGACTGATAT TTTTCTTCAT TTTTATCGGA 900 TGGAACTTGC CAGAGTTTAA GGTGAAGAAT ACGAAGCTGT TTCATGGAAT 950 AATGCTACTT ATGTCGATCT GTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 995 31â. - Ensaio para identificar inibidores da acividade de histidinol-desidrogenase, caracterizado por compreender: (a) a incubação de uma primeira amostra de histidinol--desidrogenase e do seu substrato; (b) a medição de uma reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) a incubação de uma primeira amostra de histidinol--desidrogenase e do seu substrato na presença de uma segunda amostra c.ompreendendo um composto inibidor; (d) a medição de uma reactividade inibida da histidinol-desidrogenase do.passo (c); e (e) a comparação da reactividade inibida com a reactividade não inibida da histidinol-desidrogenase. 32ã. - Ensaio para identificar fe^tââtès^a histidinol- ••ΐτ. -desidrogenase resistentes a inibidores, caracterizado por compreender: (a) a incubação de uma primeira amostra de histidinol--desidrogenase e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (b) a medição de uma reactividade não mutagenizada da histidinol-desidrogenase do passo (a); (c) a incubação de uma primeira amostra de uma histidinol-desidrogenase mutagenizada e do seu substrato na presença de uma segunda amostra compreendendo um inibidor de histidinol-desidrogenase; (d) a medição de uma reactividade mutagenizada da histidinol-desidrogenase mutagenizada do passo (c); e (e) a comparação da reactividade mutagenizada relativamente à reactividade não mutagenizada da histidinol desidrogenase. 33¾. - Planta transgénica, caracterizada por ter sido transformada de modo a conter DNA codificador de um ou mais mutantes da histidinol-desidrogenase resistentes a inibidores identificados de acordo com o método da reivindicação 32. 34¾. - Método para a produção de uma planta transgénica contendo DNA codificador de um ou mais mutantes da histidinol-desidrogenase resistentes a inibidores identificados de acordo com o método da reivindicação 32, caracterizado por se transformar a referida planta com uma molécula de DNA recombinante • . . compreendendo a sequência de DNA codificaâârà^de um ou mais mutantes da histidinol-desidrogenase resistentes a inibidores. 35ã. - Método para a preparação de uma composição herbicida, caracterizado por compreender a mistura homogénea de um inibidor da actividade histidinol-desidrogenase identificado de acordo com o métodç da reivindicação 32 numa quantidade eficaz inibidora da histidinol-desidrogenase, com um ou mais veículos e/ou adjuvantes adequados habitualmente utilizados em formulações agrícolas. 36a. - Método para o controle de ervas daninhas numa população de uma seara com interesse, caracterizado por compreender a aplicação de uma composição herbicida preparada de acordo com a reivindicação 36, contendo um inibidor da actividade histidinol-desidrogenase numa quantidade eficaz inibidora da histidinol-desidrogenase, às referidas searas, em que as referidas searas são de uma planta transgénica contendo DNA codificador de um ou mais mutantes da histidinol-desidrogenase resistente a inibidores. 37a. - Método para a utilização da sequência de DNA preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29 ou seus fragmentos como sonda de hibridação num processo de identificação de outras sequências de DNA de uma origem homóloga ou heteróloga codificadoras de uma proteína tendo actividade de histidinol-desidrogenase, caracterizado por compreender: a) a preparação de uma biblioteca genómica ou de cDNA a partir de um organismo dador; b) a marcação de uma molécula sondacom uma marca adequada; c) a sondagen da biblioteca^do-^palsso (a) com a molécula sonda do passo (b) numa reacção de hibridação; e d) a identificação do clone da biblioteca que hibridou com a molécula sonda. 38a. - Método de acordo com a reivindicação 37, carac-terizado por as referidas sequências de DNA ou seus fragmentos, serem utilizadas como uma marca de RFLP. Lisboa, 12 de Setembro de 1991

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