PT94276A

PT94276A - Anticorpo monoclonal capaz de neutralizar o prototipo mn de hiv

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Publication number: PT94276A
Application number: PT199094276A
Authority: PT
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1990-06-05
Publication date: 1991-02-08
Also published as: AU6036690A; WO1990015078A1; EP0478689A4; IL94624A0; JPH05506561A; EP0478689A1; CA2058630A1

Description

62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2

1 5 Antecedentes da invenção

Este pedido é uma continuação em parte de Scotl et al·, U.S.S.N. 431.281 pedido em 3 de Novembro de 1989 que é uma continuação em parte de U.S.S.N. 361.541 pedido em 5 de Junho de 1989. 10

Esta invenção refere-se a anticorpos específicos para o Virus da Imunodeficiência Humana (HIV) . 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 0 HIV é o agente responsável proposto do Síndroma de Imuno-deficiência Adquirida (SIDA). (popovic et al., 1984, Science 224:497). As estirpes diferentes de HIV diferem nas sequências de aminoácidos de proteínas codificadas pelo genoma virai,particularmente na sequência de aminoácidos da glicoproteína gp 120 de revestimento externo (Starcich, 1986, Cell 45:637; Hahn et al., 1986, Science 232:1548). A gp 120 liga o receptor celular do virus CD4. As células que expressam a proteína de revestimento fundem-se com células produtoras de CD3 em cultura (Lipson et al. 1986, Na-ture 323:725; Sodroski et al·, 1986, Nature 322:470), resultando na formação de syncytia multinucleada. A gp 120 e a gp recombinan-te extraem anticorpos que são capazes de neutralizar RIV em cultura de células (Robey et al., 1986, Proc. Nat. Aca. Sei. 83:9709; Ma-thews et al·, 1986, Proc. Nat. Aca. Sei. 83:9709; Laskey et al., 1986, Science 233:209; e Putney et al., 1986, Science 234:1392). Estes anticorpoos neutralizam geralmente, apenas, a variante virai a partir da qual gp 120 derivou.

Tem-se identificado cerca de 100 variantes de HIV; entre elas tem-se RF (Proponic et al., supra). WMJ-1 (Hahn et al., supra). LAV (Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40:9), ARV-2 (San-chez-Pescador et al., 1985, Science 227:484), e III-B (Ratner et al. 35 1 62*385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1985, Nature 313:277). A maior parte dos anticorpos monoclonais que neutralizam a variante HlV-IIIg liga-se a uma região específica da molécula IIIB gp 120 referida como o domínio de neutralizaçãc principal (PND) que tem sido representado para uma região altamente variável na posição 24 do aminoácido de gp 120 (Matsushita et al.f 1988, AIDS Research e Human Retrogiruses 4:187). 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 0 principal domínio de neutralização da molécula gp 120 de HIV é uma região do aminoácido 36 da molécula gp 120 entre os aminoácidos 303 e 338, inclusivé, de acordo com a convenção de numeração gp 120 de Ratner et al», supra. Ao longo do seu comprimento, a sequência polipeptídica de gp 120 varia desde uma variante de HIV até à seguinte em aproximadamente 20-25$ enquanto que a variação da sequência de aminoácidos entre as regiões determinantes de neutralização principais é aproximadamente 40-50 $· Esta região altamente variável é protegida por resíduos de sistema conservados que podem formar uma ligação dissulfeto e define uma região cíclica contendo a sequência conservada Gly-Pro-Gly no seu centro. Os peptidos sintéticos da região cíclica, 8 a-minoácidos ou mais em comprimento, têm provocado a produção de anticorpos que neutraliza o virus apenas a partir de porções isoladas ou variantes a partir das quais a sequência de aminoácido do pepti-do derivou.

Os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra proteínas HIV-1 têm sido produzidos pela formação de hibridoma ou transformação de EBV (Banapour et al·, 1987, J. Immunol. 139: 30 4027; Sugano et al·, 1988, Biochem. e Biophys. Res. Comm. 155:1105;

Morrow et al., 1988, J, Immunol. 140:941; Gorny et al., 1989, Proc. Nat. Aca. Sei. 86:1624; e Amadori et al., 1989, SIDA Res. e Retro-virus humanos 5:73). -2- 35 1 62.385 Refi Repligen -MNCIP 2 -5.jUn.-3

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Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25

Resumo da Invenção A invenção baseia^se no facto de a variante MN de HIV ser muito comum entre doentes infectados com HIV; 30$ dos seres humanos infectados com HIV estão, de acordo com as nossas estimativas injectados com uma variante MN ou uma variante relacionada estritamente, essencialmente o equivalente da variante MN.

Por consequência, a invenção descreve um anticorpo capaz de neutralizar o protótipo MN de IíIV ou uma variante virai do protótipo MN. (Como se utiliza aqui, a "neutralização" re-fere-se à capacidade do anticorpo para inibir a infecção HIV de células por viriões livres de células, ou fusão de células infectadas e não infectadas ou ambas)· 0 virus de protótipo MN é definido por uma subsequência particular de aminoácido dentro do domínio de neutralização principal (isto é, a região cíclica da proteína de re- X 17 vestimento gp 120) possuindo posições Â -Â : K-R-K-R-1-II-1-G-P-G-R-A-F-Y-T-T-K.As variantes virais MN são definidas aqui como variantes que exibem homologia de sequência de ami- 7 noácido completa para resíduos I-G-P-G-R, isto é, em posições A até A*\ e um pelo menos 36$ de homologia com os 12 aminoácidos restantes da sequência de MN indicada atrás.

Em formas de realização preferidas, o anticorpo tem uma capacidade de neutralização. (Como se utiliza aqui,"neutralização ampla" refere-se à capacidade do anticorpo de inibir a infecção através das estirpes de protótipo MN e/ou variantes virais MN e outras estirpes de HIV. Os anticorpos que possuem actividade de neutralização ampla são identificados após demonstração da sua capacidade para neutralizar duas ou mais estirpes de HIV). Como se utiliza nesta invenção, um anticorpo de neutralização ampla é capas de neutralizar uma estirpe de HIV que possui uma sequência de aminoácidos dentro do centro do domínio de neutralização principal que está presente em pelo menos 60$ de porções isoladas de HIV apresentadas nos Quadros la-d; de preferência, a sequência está presente em 70 $ destas porções isoladas de HIV. Preferencialmente, os anti- -3- 35

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 J V lJt 62 ·385 -5-VUS90 Ref í Repligen -MNCIP 2 /·. h 1 corpos de neutralização ampla da invenção são capazes de neutrali- 5 zar pelo menos duas estirpes de HIV que contêm a sequência de arai-11 12 noácidos G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização principal 11 da proteína de revestimento HIV, em que A compreende R ou qual·» . 12 quer substituição de R de aminoácidos conservadores A compreende A ou qualquer substituição de A de aminoácidos conservadores· Como se utiliza aqui uma substituição de aminoácidos "conservadores11 refere-se a uma substituição em que o caracter aromático, hidrofóbi-co, hidrofílico ou de carga do aminoácido é mantido. 10 X)0 ex. 89/07 σι Noutras formas de realização, a sequência de a-minoácidos de PND das porçoes isoladas de HIV neutralizada de acordo com a invenção é 100$ homologa em g-P-G-R-A da sequência de consenso de HN; de preferência, á 100$ homologa com a sequência I-G-P--G-R-A ou alternativamente, com a sequência G-P-G-R-A-F. De preferência, uma das duas estirpes neutralizadas amplamente de acordo com a invenção pode ser o protótipo ΙΙΙβ de HIV* o 1“ r> d | 20 Alternativamente, o epítope PND identificado como um anticorpo de neutralização larga de acordo com a invenção pode ser um epítope não contíguo que contém a sequência de aminoá- 0 *7 eido I-A-A -G-P-G-R entre o domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV, em que cada A e A compreende, inde-pendentemente, qualquer aminoácido. (Como se utiliza aqui, "epítope 25 não contíguo" refere-se a uma sequência de PND de consenso em que qualquer ou ambas as posiçães de aminoácidos, directamente terminal amino para C-P-G, podem incluir qualquer substituição de aminoácidc 30 sem disrupção da ligação de anticorpo). De preferência um anticor-po de neutralização ampla da invenção identifica o epítope I-A -A --G-P-G-R-A ou I-A6-I-G-P-G-R ou I-A6-I-G-P-G-R-A. Estes epítopes estão presentes em 69$, 68$ e 78$, respectivamente das porçães isoladas de HIV no Quadro I. 35 Os aminoácidos adjacentes aos epítopes descritos atrás podem também afectar a afinidade de ligação de um anticor- -4- ‘t 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2

10 15 po de neutralização. Âs frequências relativas das sequências da região cíclica de HIV são apresentadas no Quadro 2. Nas formas de realização preferidas, uma variai} te virai de MN neutralizada de acordo com a invenção tem uma sub- -sequência da região cíclica gp 120 da fórmula (l): .1 .2 .3 .4 .5 .6 _ _ _ _ .12 .13 .14 s15 .16.17 , .1 A -A -A -A -A -A -I-G-P-G-R-A -A -A -A -A A em que cada A - -A e A -A podem ser, independentemente, qualquer aminoácido; com maior preferência uma variante virai de MN da invenção tem uma sub-sequência da região cíclica de gp 120 da fórmula (l) em que A1 = K, T, A, R, V, P, S, ou I, A2 = R, T, I, M ou K A3 = K, R, T, N, ou A, A4-- R, S, G ou H, .5

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 112 113 114 115 L16 .17 ' I, M, ou L H, P, s, Y, K, N, = A, p, T, s, ou K - Pf V, I, w, ou L, II H, V, OU Pt - T, Y, ou L A - t, A, G, OU R, e = K, G, E, s, Q> R, 25

Noutras formas de realização preferidas, uma estirpe de HIV neutralizada de acordo com a invenção tem uma sub- -sequência da região cíclica gp 120 da fórmula (2): .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 n _ _ .12 .13 .14 .15 .16 .17 - A -A -A -A -A -A -A -G-P-G-R-A- -A -A -A -A -A em que qual- quer A -A e A -A podem ser independentemente, qualquer aminoácido· 30

De preferência, uma estirpe HIV neutralizada de acordo com a invenção e possuindo uma sub-sequência de fórmula (2) anterior tem a sub-sequência: em que A^ é I, A*2 «A, A*3 ó qua quer aminoácido e cada um de A* a A^ e cada um de A*4 a A^ ó inde· pendentemente, emiminado, em que a fórmula de aminoácido é I-G-P-G -5- 35

* 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 X3 13 ^ X4 -R-A-A ; em que A é F, cada um de A a A é, independentemente, qualquer aminoácido e cada um de A* a e cada um de í\}^ a A*^ é, independentemente eliminado, em que a fórmula de aminoácido compreende A^-G-P-G-R-A-F-A*^, em que A^ é I, cada um de A^ e iJ é,in-depandentemente, qualquer aminoácido, e A^- a A^ e A^ a A*^ é, in- dependentemente, eliminado em que a sequência de aminoácido ó I-A - 7 5 7 6 -A -G-P-6-R-A; ou em que A e A é independentemente, I, e A ó Λ qualquer aminoácido, em que a sequência de aminoácido I I-A-I-G-P--G-R-A. 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 0 anti-corpo da invenção pode ser monoclonal ou policlonal; é, de preferência, um anticorpo humano. 0 anticorpo pode ser também um anticorpo quimérico possuindo uma região variável derivada de uma espécie diferente da espécie humana e uma região constante derivada de seres humanos; pode ser também conjugado com um veículo. 20 25 35

Onde o anticorpo é monoclonal, é preparado por (a) imunização de um mamífero com um peptido ou um polipèptido possuindo tanto a sequência virai do protótipo de MN da região de PND de gp 120 como uma das sequências de aminoácidos apresentadas atráii para variantes de MN ou onde o anticorpo preparado é de neutralização ampla o imunogene tem uma sequência de protótipo contendo tanto o G-P-G-R-A-F como I-G-P-G-R-A como outras sequências de epítope de consenso descritas atrás; (b) fusão das células de baço imunizadas do mamífero com uma linha de células imortais para preparar clones independentes; e (c) selecção de um clone que produz um anticorpo monoclonal. De preferência, o passo de selecção pode ser por ensaio ELISA. 0 passo de selecção pode também incluir a capacidade do anticorpo para neutralizar a infecção pelo protótipo MN ou um vírus de variante MN ou por uma gama ampla de estirpes HIV contendo frequentemente sequências de epítope de ocorrência tais como G-P-G-R-A-F e I-G-P-G-R-A como se definiu atras.

Onde o anticorpo é policlonal, prepara-se por 6- * 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2

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Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 30 1 soros de seres humanos de exploração para a presença de anticorpos que reagem com um peptido ou um polipeptido possuindo tanto a sequência virai de protótipo MN entre a região PND de gp 120 como uma das sequências de uma variante MN, como uma sequência HIV (is-5 to é, contendo G-P-G-R-A-F) ocorrendo de modo comum, como se definiu atrás para anticorpos monoclonais. 0 plasma ó então removido por plasmaperese de um ser humano que tem valores elevados de anti·· corpos que reagem com estes peptidos. A fracção IgG do soro é utilizada como a fonte de anticorpos policlonais. Os anticorpos poli-10 clonais podem também ser purificados utilizando métodos convencionais, por exemplo, por cromatografia de afinidade de proteína A.

Num outro aspecto, a invenção proporciona um método de identificação de um anticorpo de neutralização ampla, co·· mo se definiu atrás, que inclui testar o anticorpo para uma ou ambas da (a) sua capacidade para se ligar a um peptido ou proteína incluindo (1) a sequência de aminoácido G-P-G-A -A dentro do do·· mínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV, em que A** é R ou qualquer substituição de aminoácido conservador de R e A é A ou qualquer substituição de aminoácido conservador 6 7 de A ou (2) a sequência de aminoácido I-A-A*-G-P-G-R dentro do do·· mínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV, em que cada de A e A* é. independentemente, qualquer aminoácido e (*) a sua actividade biológica na neutralização de HIV.

De preferência, o método inclui o teste do anticorpo num ou mais dos seguintes ensaios (à) um ensaio ELISA em que o anticorpo é testa·· do para ligar um peptido ou proteína incluindo (l) a sequência de 11 12 aminoácido G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização princi·· pal da proteína de revestimento HIV, em que A^ é R ou qualquer su·· bstituição de aminoácido conservador de R e A é A ou qualquer su-· bstituição de aminoácido conservador de A ou (2) a sequência de a-A 7 minoácido I-A -A-G-P-G-R dentro do domínio de neutralização prin- -7-

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Ref: Repligen -MNCIP 2 * 6 7 cipal da proteína de revestimento HIV em que cada A e A é inde- pendentemente qualquer aminoácido; (b) um ensaio ELISA de prova em que o anticorpo I testado por falta de ligação a um peptido ou proteína devido à prova através de um segundo peptido ou proteína incluindo a sequência de aminoácido (l) ou (2) anterior; (c) um ensaio de inibição syncytium em que o anticorpo» quando adicionado a células infectadas HIV, inibe a for·· mação de syncytia, em pelo menos 80 fo, de preferência» em pelo menos 90 em que HIV inclui a sequência de aminoácido (l) G-P-G- 11 12 -A -A dentro do domínio de neutralização principal da proteína 11 de revestimento HIV, em que A é R ou qualquer substituição de a- 12 minoácido conservador de R e A é A ou qualquer substituição de 6 7 aminoácido conservador de A ou (2) I-A -A -G-P-G^R dentro do domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV em 6 7 que cada A° e A e independentemente, qualquer aminoácido; (*) um ensaio de inibição de syncytium de prova em que o anticorpo é testado por carência de inibição de syncytium por incubação do anticorpo com um peptido que possui a sequência de aminoácido definida em (l) ou (2) atrás e adicionado às células infectadas HIV; (e) um ensaio de neutralização de infecção de HIV em que o anticorpo, quando incubado com HIV e adicionado às células susceptíveis de HIV, neutraliza a infecção de HIV; e (f) um ensaio de redução da infecção de HIV em que o anticorpo, quando incubado com HIV e adicionado a células susceptíveis de HIV, reduz a quantidade de HIV. Â invenção também apresenta um método de tratamento ou inibição da infecção» de HIV num doente, que inclui a admi· -8-

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Ref: Repligen -MNCIP 2 nistração ao doente de nm anticorpo que é capaz de neutralização. (a) um virus de protótipo MN ou um virus de variante MN correspondente, em que uma sequência de aminoácido dentre do domínio de neutralização principal do protótipo MN inclui a sub< 1 π -sequência, nas posições A -A do domínio de neutralização principal de resíduos de aminoácidos. K-R-K-R-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-T-T-IC, e a correspondente sequência de aminoácidos da variante MN compreende uma se· quência homóloga completa nos resíduos I-G-P-G-R para as posições 7 11 A - Ax e pelo menos 36$ de homologia sobre os resíduos restantes da sub-sequência de protótipo MN, e (b) pelo menos duas estirpes HIV que contêm a 11 12 sequência de aminoácidos G-P-G-A -A dentro do domínio de neutra' ligação principal da proteína de revestimento HIV em que A** é R ou qualquer substituição de aminoácido conservador de R e A é A ou qualquer substituição de aminoácido conservador de A, ou (c) pelo menos duas estirpes HIV que contêm a 6 7 sequência de aminoácido I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV em que cada 0 7 A e A é, independentemente, qualquer aminoácido.

De preferência, o anticorpo ó monoclonal, ou polielonal, 30

Num outro aspecto, a invenção descreve um virus de vaccinia recombinante capaz de expressar, após infusão de uma célula eucariótica, proteína de revestimento HIV de uma primeira es tirpe contendo o domínio de neutralização principal de uma segunda estirpe HIV. 0 virus inclui DNA codificando a proteína de revesti- -9- 35

Λ 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 mento» o DNA inclui uma sequência de DNA codificando o domínio de neutralização principal da segunda estirpe H1V, estando o DNÀ que codifica a proteína de revestimento sob o controle transcricional de um promotor de virus de vacina·

De preferência, a proteína de revestimento HIV que codifica o DNA do virus reeombinante é derivada de um vector recombinante. 0 vector inclui uma sequência de DNA que codifica a proteína de revestimento e o DNA inclui uma sequência de DNA que codifica o domínio de neutralização principal da segunda estirpe IIIV e o DNA capaz de provocar a integração do DNA que codifica a proteína de revestimento no genoma de virus de vaccinia· 0 DNA que codifica a proteína de revestimento HIV é uma sequência híbrida, isto é, a sequência que codifica o domínio de neutralização principal e o restante da sequência deriva de estirpes de HIV diferentes. Deste modo, por exemplo, o virus ou o vector a partir do qual é derivado pode funcionar como uma cassete em que a região que codifica o domínio de neutralização principal de qualquer estirpe desejada pode ser inserida sem alterar qua! quer outra porção do virus ou vector, incluindo o restante da região que codifica o revestimento. A proteína de envelope codificadi apesar da sua natureza híbrida, exibe propriedades imunológicas con viàta à neutralização de HIV da estirpe a partir da qual derivou a sequência que codifica o domínio de neutralização principal. Por ov tras palavras, onde, por exemplo, o domínio de neutralização principal é MN ou uma variante MN a proteína de envelope codificada é neutralizada especificamente por anticorpos específicos de variante MN; ou, por exemplo, onde o domínio de neutralização principal é de rivado do lado direito da extremidade do ciclo gp 120, isto é, contém G-P-G-R-A-F, a proteína de revestimento codificada é neutralizada por anticorpos de neutralização ampla que são capazes de neutralizar tanto as estirpes MN como as variantes MN, contendo as outras estirpes HIV a sequência G-P-G-R-A-F. Um virus que codifica o revestimento híbrido, pode ser utilizado, portanto, como um agente —10—

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Ref: Repligen -MNCIP 2 infeccioso capaz de conferir à célula encariótica a capacidade de exprimir a proteína de revestimento híbrida na sua superfície. Um vector que codifica o revestimento híbrido pode ser utilizado para proteger anticorpos para a capacidade de neutralizar qualquer estix-pe de HIV e para identificar anticorpos que pudessem neutralizar d« modo útil mais do que uma estirpe, por exemplo RF, WMJ-1, LAV, ou ARV-2.

Num outro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo monoclonal humano que neutraliza especificamente a variante MN do Virus da Imunodeficiência humana do tipo I e pode também ser capaz de neutralizar uma gama ampla de estirpes HIV, por exemplo, as que contêm as sequências descritas atrás e um método de tr« tamento de um ser humano infectado com HIV por administração ao doente de uma quantidade de neutralização de virus do anticorpo.

Em formas de realização preferidas, o anticorpo pode ser produzido por uma célula imortalizada δ derivada de um ser humano infectado com HIV; a célula B pode ser imortalizada por infecção com Virus Epstein Barr. Noutras formas de realização preferidas, o doente pode ser tratado por administração de uma composição contendo o anticorpo monoclonal em combinação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Â composição pode incluir, de preferência, um anticorpo que é capaz de neutralizar, pelo menos, duas estirpes HIV que incluem a sequência de aminoácidos (l) G-P-G-A -A dentre do domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV, em que A** é R ou qualquer substituição de aminoácido conser- vador de R e A é A ou qualquer substituição de aminoácido conser- 6 7 vador de A ou (2) I-A -A-G-P-G-R dentro do domínio de neutraliza** 0 y ção principal da proteína de revestimento HIV em que cada A e A* é, independentemente, qualquer aminoácido. A invenção também apresenta métodos de obtençãf -11- 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2

1 de um anticorpo monoclonal humano capaz de neutralizar HIV^ que pode também ser um anticorpo de neutralização ampla que é capaz de neutralizar estirpes HIV que contêm epítopes de ocorrência comum tais como G-P-G-R-A-F ou I-G-P-G-R-A como se descreve atrás, in-5 cluindo o método os passos de proporcionar um anticorpo monoclonal anti-IIIV e em primeiro lugar testar o anticorpo monoclonal para a capacidade de se ligar a um fragmento da proteína de revestimento gp 120 de IIIV^, compreendendo o fragmento o domínio de neutralização principal, sendo a ligação uma indicação da capacidade do anti·· 10 corpo de neutralizar 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

Em formas de realização preferidas, o anticorpo é capaz de neutralizar pelo menos duas estirpes de HIV compreen·· IX 12 dendo a sequência de aminoácidos (l) G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV em que A é R ou qualquer substituição de aminoácido conservador de 12 # R e A é A ou qualquer substituição de aminoácido conservador de e A ou (2) I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutralização princi·· pal da proteína de revestimento HIV em que cada A e A é, indepen·· dentemente, qualquer aminoácido. De preferência, o fragmento utili·· zado que compreende uma das sequências de epítope PHD de ocorrência comum descrita atrás pode incluir inteiramente um fragmento, um análogo da região de PND gp 120 M arquétipa com as sequências de aminoácidos I-G-P-G-R, I-G-P-G-R-A, G-P-G-R-A-F, I-A6-A7-G-P-G--R-A, I-A6-I-G-P-G-R, I-A®-I-G-P-G-R-A, ou K-R-K-R-I-H-I-G-P-G-R--A-F-Y-T-T-K cujas sequências estão contidas no domínio de neutralização principal da proteína gp 120 MN; o método pode ainda incluir o passo anterior ou posterior ao primeiro passo de teste, do segundo teste do anticorpo monoclonal para a capacidade de neutralizar HIV^ através, por exemplo, da determinação da inibição da formação de syncytium; e pode ainda incluir o passo anterior ou posterior ao primeiro e segundo passos do terceiro teste do anticorpo para a capacidade de neutralizar uma gama larga de estirpes HIV. De preferência, o fragmento é um peptido derivado de PND de gp 120; com maior preferência, é um peptido cíclico fechado. -12- 35

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Ref: Repligen -MNCIP 2

De preferência, o método pode incluir ainda o passo anterior ou posterior ao primeiro ou segundo passos do terceiro teste do anticorpo para a capacidade de neutralizar pelo menos uma estirpe HIV diferente de HIV.-.-, em que a referida estirpe 0 ^ 11 12 φ inclui a sequência de aminoácidos (l) G-P-G-A «A dentro do domínio de neutralização principal da proteína de revestimento HIV, em que A** é R ou qualquer substituição de aminoácido conservador de R e A é A ou qualquer substituição de aminoácido conservador de 6 7 A ou (2) I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutralização princi- 6 7 pal da proteína de revestimento IIIV em que cada A e A é, independentemente, qualquer aminoácido.

Com maior preferência, a sequência inclui R-I--H-I-G-P-G-R-A-P e tem menos do que 36$ de homologia sobre os resíduos restantes da sub-sequência de protótipo MN, em que a sub-sequência de protótipo inclui K-R-K-R-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-T-T-K.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para inibir a infecção de HIV num doente humano infectado com ou suspeito de ter sido infectado com HIV. A administração do anticorpo humano a um doente após exposição curta ou suspeito de exposiçã< aos agentes infecciosos pode evitar o estabelecimento de infecção pelo virus. For exemplo, um doente pode acidentalmente, ter estado em contacto com sangue, produtos sanguíneos ou secreções do corpo contaminados com HIV. Os anticorpos podem também evitar a transferência de HIV de uma fêmea grávida de HIV para a sua descendência através da administração prévia do anticorpo ou durante a gravidez e/ou através da adminiétração à descendência no nascimento e depois Os anticorpos podem também ser utilizados para a terapia de imunize ção passiva; por exemplo, os membros dos grupos de alto risco que são ainda seronegativos para HIV podem ser tratados em intervalos regulares com uma preparação de anticorpo com vista a evitar o estabelecimento de uma infecção de HIV crónica.

Os anticorpos da invenção são, devido à distri- —13—

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 i\ * * 62.385 cy Ref: Repligen -MNCIP 2 . 1 buição por propagação rápida das variantes MN em pessoas infectada: úteis para a detecção de HIV em amostras biológicas, para proteger abastecimentos de sangue e, potencialmente, para tratar um grande percentagem de doentes infectados com HIV. 5 10 Os anticorpos de neutralização ampla da invenção, porqde reconhecem as variantes MN ou MN e as estirpes HIV contendo sequências de epítopes comuns, são úteis, especialmente, para as aplicações descritas atrás. Outros aspectos e vantagens da invenção serão descritps na descrição a seguir das formas de realização preferidas e nas reivindicações. )0 ex. - 89/07 ai Descricão das formas de realização preferidas Os desenhos são descritos resumidamente0 8 0 1 20 Fig. 1 é uma análise da mancha de Western da reactividade de anticorpo monoclonal humano com duas estirpes de HIV-1. 25 Fig. 2 é uma mancha salpicada que mostra a reactividade de quatro HMabs com gp 120 a partir de estirpes diferentes. 30 Fig. 3 ó um gráfico que mostra a reactividade ELISA de IC24-3b e N70-23.a, dois dos anticorpos da Fig. 2, gp 120 imobilizada com Con-A a partir de nove estirpes de HIV-1. 35 Fig. 4 é um gráfico que mostra a reactividade ELISA de N70-23.a, N70-15.e, N70-19.b HMabs com gp 120 imobilizada com Con-A a partir de oito estirpes de HIV-1. -14-

5 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 Fig, 5 é uma mancha de Western que mostra a reactividade de K24-3b e N70-23.a HMahs com oito estirpes HIV-1 independentes.

Descreve-se agora a preparação e utilização de anticorpos da invenção.

Preparação do Imunogene 0 imunogene utilizado para gerar os anticorpos da invenção pode ser um peptido sintético, um fragmento de proteína, um polipeptido do protótipo MN ou uma variante MN, ou pode conter uma sub-sequência da sequência do protótipo MN que é L-eomum a um grande número de estirpes HIV. 0 peptido, polipeptido ou proteína de imunização devem ser, pelo menos B, e de preferência pelo menos 17 aminoácidos em comprimento e podem conter uma sequência de 5 aminoácidos ou maior que ó 100$ homóloga com sub-sequência de domínio de neutralização de protótipo MN dentro da gp 120 identificada atrás ou com preferência uma sequência de aminoácidos em que 5 dos aminoácidos centrais são 100$ homólogos e, em adição, os aminoácidos vizinhos são, pelo menos, 36$ homólogos. Um imunogene utilizado para gerar anticorpos de neutralização ampla da invenção é também uma sequência de aminoácidos em que 6 dos aminoácidos centrais são G-P-G-R-A-F ou I-G-P-G-R-A. 0 peptido, polipeptido ou proteína de imunização pode estar sob a forma linear ou alternativamente pode conter a porção de domínio de neutralização principal formada num ciclo fechado pela criação de uma ligação de dissulfeto sntre resíduos de cisteína na extremidade da sequência PND. Se o peptido de imunização contiver mais do que um PND, cada um deles pode ser formado separadamente num cielo através de uma ligação de dissulfeto»

Os peptidos sintéticos contendo a sequência completa de aminoácidos do domínio de neutralização principal gp 160 do protótipo virai HIV-MN ou uma variante virai MN ou contendo -15- 35 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 a sequência G-P-G-R-A-F ou I-G-P-G-R-A foram sintetizados pela síntese peptídica automática utilizando um sintetizador automático pe-ptídico. Em adição» o polipeptido de revestimento intacto foi produzido em células de insectos utilizando um sistema de baculovirus e purificado como se descreveu em Rusche et al. na patente U.S.S.lf< 091.481 pedida em 31 de Agosto de 1987» pedida pelo mesmo requerente da presente invenção e incorporada aqui como referência. Um fragmento de proteína de aminoácido 180 com uma sequência de aminoáci-dos transpondo o domínio de neutralização principal» denominado PBl (Putney et al·, 1986, Science 234:1392), foi expresso a partir de um fragmento de DNA 540 bp aproximadamente gerado por clivagem de PvuII + BglII do comprimento total do gene env, como se descreveu na patente U.S.S.N. 107.703, pedida em 9 de Outubro de 1987, pelo mesmo requerente da presente invenção e incorporada aqui como referência. Os fragmentos de peptidos e proteínas sintéticos para serem utilizados como imunogenes foram tanto conjugados como não conjugados com um veículo imunogénico, por exemplo, haemecianina (KLIl) ou ovalbumina, utilizando maleimidometil-ciclohexanilcarboxi-lato de succinilo (SMCC) como um agente de conjugação (Yoshitake et al., 1982, J. Biochem., 92:1413-1424). como se segue.

Fm resumo, adicionou-se 1 mg de SMCC dissolvid< em 50 ul de dimetilformamida a 6 mg de veículo (a uma concentração de 10-20 mg/ml em NaPO^, pH 6,5) e incubou-se à temperatura ambiente durante 0,5 h. Passou-se a solução através de uma coluna Sepha-dex G-25 para remover o excesso não reagido SMCC e adicionou-se 2 mg de peptido (suspenso numa solução desgaseifiçada de NaPO^, pli 8, EDTA 1 mM a uma concentração de 10 mg/ml) . Misturou-se a solução em Ng gasoso e incubou-se a 4?C durante a noite. A amostra foi submetida a diálise em ureia 6M, NaPO^, OjlM, pli 7 até que o precipitado se dissolva e elutriou-se então numa coluna Biogel P-1Q equilibrada com ureia 6M, NaPO^ 0,1M. A proteína expelida foi colhida e submetida a diálise em HgO destilada.

Um número destes imunogenes designados RP142, -16- 62.385

Iteí: Repligen - MNCIP 2 RP70, Rp342, RP100, RP102, RP108, RP123c, e RPl74c têm as sequências de aminoácidos na sub-sequência de domínio de neutralização da região cíclica gp 120 apresentada no Quadro 3.

Os peptidos RP70, RPl23c e RPl74c formaram-se em ciclos fechados por criação de uma ligação de dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína perto das extremidades da sequência de aminoácido. Um método para criar essa ligação esta descrito em Zhang et al«, (1988, Biochemistry 27:3785-3794)·

Os peptidos foram preparados para imunização por emulsificação em adjuvante de Freund completo de acordo com técnicas padrão. (CFA, Difco Labs, Grand Island, NY) .

Produção de anticorpos monoclonais específicos de M não humanos

Estirpes de ratos (Balb/c, C57BL/6, A.SW.B10. BR, ou B10.Â, Jackson Labs., Bar Ilarbor, ME) foram imunizadas sob o ponto de vista intraperitoneal com 10-50 ug por rato com um pe-ptido descrito atrás. Foram administrados aos ratos imunizações de reforço de imunogene tanto sob a forma de emulsificação de adjuvan» te de Freund incompleto como na forma solável, duas ou três vezes em intervalos de duas ou quatro semanas a seguir à imunização inicial. Os ratos foram mortos e os soros testados na presença de anticorpos reactivos com o imunogene. Os ratos que apresentavam uma resposta serolégica forte foram incentivados e 3-5 dias mais tarde foram fundidas com NS-1 (A.T.C.C. No. TIB18), SP2-0 (A.T.GoCo No. CRL8287, CRL8006), ou células de mieloma P3.X63.AG8.653 incapazes de proteger as cadeias de imunoglobulina leves e pesadas (Kearney et al», J. Immunol·, 1979, 123:1548) através de processos Standard baseados no método de ICohler e Milstein, Nature (1975) 256:495.

Os sobrenadantes dos hibridomas que apareceram 6-21 dias apés a fusão foram protegidos para produção de anticorpoi! reactivos com um ou mais dos peptidos apresentados no Quadro 3 por -17-

10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 ' 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 intermédio de um ensaio de protecção ELISA, como se segue.

Cada parede de um prato de microtituiador de fundo chato Costar de parede 96 foi revestida com um peptido colo» cando uma porçãode cinquenta microlitros de uma solução PBS contendo o peptido numa concentração final de 0,1-10 /ig/ml em cada parede. A solução peptídica foi aspirada e substituída por PBS + 0,5$ BSA. A seguir à incubação as paredes foram depois aspiradas, lavadas e adicionou-se 50 ul do sobrenadante de hibridona. A seguir à incubação as paredes foram lavadas 3 vezes com PBS e depois incubadas com 50 ul de uma diluição apropriada de anti-imunoglobulina de rato de cabra conjugada com peroxidase de rábano (HRP, Zymed Laboratories, San Francisco, CA). As paredes foram lavadas novamente 3 vezes com PBS e 50 ul de ABTS lmM (2,2 azino-bis (3-etilbenztiazoli-na-6-ácido sulfónico) em citrato de sódio 0.1M, pH 4,2 ao qual se adicionou uma diluição de 1:1000 de 30$ de HgOg), o substrato para IIRP, foi adicionado para detectar o anticorpo ligado. Às amostras ABTS foram depois lidas em 0D41Q num auto leitor espectrofotomótri-co Dynatech (Virginia)·

Os hibridomas que deram testes positivos pelo método ELISA foram ensaiados para inibição de formação de syncytiun como se segue. Em geral, o virus da vacina recombinante expressando o gene de revestimento da estirpe HIV de interesse (por exemplo, vac-env^) foi utilizado para infectar células de CD4+CEM linha de linfoma T humano (A.T.C.C. N2 de acesso CCL119), e os sobrenadantes de hibridoma foram depois adicionados às células para proteger por blocagem de fusão de células mediadas de revestimento IIIV por interj-médio de anticorpos monoclonais.

Construção de um virus de vaccinia recombinante/vector que codifica o revestimento HIV A construção de um virus de vacina recombinante capaz de expressar o gene de revestimento HIV de comprimento total a partir de um promotor de virus de vacina é descrita na publicação -18- 35 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 EP n?0^243 029, aqui incorporada como referência. 0 vector recombi·· nante pS25 contendo o gene env HIV e o gene lacZ de JU coli expres·· sos a partir de um segundo promotor de virus de vaecinia e flanqueit dos pelas sequências virais de vacina que em conjunto codificam ti·· midina quinase (TK), foi utilizado para produzir o virus recombi-nante.

Com o propósito da presente invenção foi neces-· sário construir um vector recombinante que continha DMA codificando um gene de revestimento que possui a especificidade da variante HIV-MN. Isto foi feito pela remoção de um fragmento bp BglII 570 (codificando 180 aminoácidos) a partir do gene env Ηΐν-ΙΙΙβ que transpõe a região do domínio de neutralização principal em psC25 e por substituição pelo análogo fragmento BglII a partir do gene env HIV-MN. 0 plasmido resultante pSCR2502 continha um gene de revesti·· mento híbrido que codificou numa proteína de revestimento possuindo o domínio de netralização principal do virus MN e o restante da sequência do gene env a partir do revestimento IIIV-III„.

Uma região mais pequena da proteína HIV-MN gp 160 pode ser utilizada em vez da substituição do aminoácido 180 descrito; por exemplo, o DNÂ que codifica o domínio de neutralização principal do aminoácido 36 pode ser inserido no DNA que codifica o revestimento em vez da sequência de DNA IIIB correspondente, ou pode substituir-se um PND a partir de qualquer gene env de HIV por PND a partir de qualquer outra variante. Alternativamente, podia ser utilizado um recombinante que contém o gene env. MN de HIV completo. As estirpes que expressam o revestimento HIV Múltiplo são úteis para determinar se um anticorpo tem actividade de neutralizai ção ampla. 0 vector recombinante pSCR2502 foi transfecta-do para as células hospedeiras CV-1 que tinham sido pré-infectadas com virus de vaccinia contendo um gene TK intacto. 0 gene de revestimento HIV foi integrado no DNA virai por recombinação homóloga -19- 1 5. 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 / 5 entre as sequências TK no vector e as sequências TK dentro do geno-ma virai. Os recombinantes contendo o gene de revestimento HIV foram seleccionados pela infecção de células TK~ e a galvanização em meio contendo bromodeoxiuridina (BUdR) e X-gal. BUdR é tóxico para células TK+ e deste modo seleciona-se para recombinantes TK~; X--gal é um substracto cromogénico clivado pelo produto do gene lacZ que dá origem à produção de placas azuis onde o gene lacZ é expresso e identifica também o virus recombinante que também contém o gene env de HIV. 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 0 virus recombinante que expressa o gene env foi utilizado para infectar células CD4+. A proteína de revestimento HIV apresentada sobre a superfície destas células liga-se ao re-ceptor de superfície das células, DC4, dando origem à fusão das células e à formação de células multinucleadas gigantes chamadas syn-cytia. A formação de syncyntia foi ensaiada na presença ou ausência de um sobrenadante de hibridoma ou anticorpos mono-clonais purificados em séries de diluições. 0 número de syncyntia que se formou foi quantificado, em 24 horas, pés-infecção. Um sobrenadante de hibridoma positivo, isto é, possuindo actividade de neutralização é definido como inibindo a formação de syncyntium em pelo menos 90$. 25 30

Os hibridomas que deram teste positivo para a ligação peptídica (ensaio ELISA) e actividade de neutralização (inibição de formação syncyntium) foram subclonados pelo método de diluição de limitação. As células de hibridoma e esplenócitos irradia-dos a partir de ratos singenéssicos (5 células e 2,5 X 10 células por cc, respectivaraente de concentração final) foram misturados e 200 ml da suspensão misturada foram galvanizadas nas paredes do mi-crotitulador para proporcionar 1 célula de hibridoma por parede.Os subclones que apareceram 7-14 dias mais tarde foram ensaiados novamente pelo procedimento ELISA descrito atrás. Os subclones positi- 20» 35 / Sry 5 ' 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 vos representativos foram subclonados uma segunda vez.

Obtiveram-se muitos anticorpos monoclonais positivos protegendo hibridomas* Os isotipos dos anticorpos foram de»· terminados, pelo método ELISA utilizando anti-preparaçoes 1RP de ra-· tos de cabra que correspondem a cada um dos cinco maiores isotipos de imunoglobulina de ratos (igM, IgGl» IgG2A, IgG2B e IgG3. 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25

Amplificação e Purificação de Anticorpos Monoclonais Os anticorpos purificados foram preparados pela injecção de subclones de hibridoma que repetidamente deram testes positivos pelo ensaio ELISA e pela inibiçSo de syncyntium sob o ponto de vista intraperitoneal em ratos singenésicos pristane. A ascite que se desenvolveu foi readquirida duas a três semanas após a injecção e os anticorpos monoclonais foram purificados como se segue utilizando procedimentos que foram dependentes no isotipo do anticorpo. Na elutriação seguinte todos os anticorpos IgG foram su· bmetidos a diálise em função PBS. Os anticorpos IgM foram purificados por precipitação de 50$ de NH9SO^ de fluido de ascite a partir de ratos in-jectados com as células de hibridoma correspondentes e depois diálise do precipitado em função de 4xPBS. 0 anticorpo submetido a diálise foi depois passado sobre uma coluna Ultrogel Â-6 (Biote-chnics, Villeneuve-La-Garenne, France) pré-equilibrada com 4x PBS. A fracção contendo o anticorpo foi identificado utilizando ELISA. 30 0 fluido ascite contendo anticorpos IgGl foi diluído 4 vezes em Tris-HC1,0,1M, NaCl 3M, pH 8,9 e isolado pela passagem através de uma coluna de afinidade de proteína A-Sepharo-se equilibrada com o mesmo tampão Tris-NaCl. 0 anticorpo foi ela-triado utilizando Citrato de Sódio 0,1M píl 6,0. 0 fluido ascite contendo anticorpos IgG2 foi -21-

62.385

Eef: Repligen -MNCIP 2 diluído duas vezes em PBS e depois ligado a uma coluna de afinidade de Proteína-A-Sepharose equilibrada com PBS· Foi depois elutria-do a partir de uma coluna com NaCl 0,15M, ácido acético 0,1M, pH 3,0* A seguir à elutriação, o anticorpo foi imediatamente neutralizado pela adição de Na^HCOg 1 M. 0 fluido ascite contendo anticorpos Ig63 foi diluído 4 vezes em Tris-HCl 0,1 M, NaCl 3 M, pH 8,9, passou sobre uma coluna de afinidade Proteína-A-Shepharose e o anticorpo foi e-lutriado a partir da coluna de Proteína A com NaCl 0,15 M, ácido acético 0,1 M.

Alternativamente, todas as subclasses IgG podem ser purificadas pelo processo seguinte. 0 fluido ascite é diluído 2 vezes em Tris-HCl 0,1 M, NaCl 3 M pll 8,9, passou sobre a coluna de afinidade de Proteína-A-Sepharose e é elutriado com NaCl 0,15 M, ácido acético 0,1 M, pll 3,0.

Caracterização de anticorpos purificados

Os anticorpos monoclonais ou policlonais foram caracterizados com respeito à especificidade e potência de ligação ao bloquearem a syncyntia induzida com revestimento HIV e a infec-çSo HIV. 0 valor terapêutico potencial de um anticorpo é inicialmente determinado utilizando uma combinação de ensaios bioquímicos (isto é, ligação) e biológicos (isto é neutralização de virus), indicando os resultados a potência e a especificidade de uma preparação de anticorpo.

Apresentação do local de ligação

Os locais de ligação dos anticorpos da invençãc foram medidos em ensaios ELISA padrão (descritos atrás), ensaios ELISA de exploração e ensaios de inibição de syncyntium de competição utilizando os peptidos descritos a seguir. Foram utilizados três grupos de peptidos: (l) uma série de 24 ou 25-meios representando as sequências PND a partir de uma variedade de variantes IIIV -22- -5 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 (Quadro 5); (2) séries de substituição MN que inclui uma série de 12-meros correspondendo à sequência de extremidade MN PND, (c) -K~ R-I~II~I“G“P«G-R-A«*P-Y“T-T-»(C) , possuindo cada um resíduo de a lamine substituído por um dos aminoácidos de partida no primeiro resíduo arginina (R) e procedendo o resíduo de tirosina (y) (Quadro 6). (Uma glicina foi substituída pela alamina de ocorrência natural). 0 reconhecimento de um epítope contido dentro da sequência MN é revelado pela perda de ligação do anticorpo a um peptido substituído por alamina, possuindo a substituição da alamina disrupção relativamente à interaeção de ligação; e (3) uma série de peptidos correspondendo às sequências de ocorrência frequente na extremidade do ciclo PND (Quadro 7).

Os ensaios ELISA de exploração foram realizados como para os ensaios ELISA padrão com as seguintes modificações Antes da aplicação do anticorpo ao prato, a preparação do anticorpo é incubada com um peptido teste a partir de grupos listados a-trás para concentrações variando entre IG^K e 0,0045 jaM,. Se o peptido teste competir com o imunogene imobilizado para ligação ao anticorpo, o ensaio ELISA revelara pouca ou nenhuma ligação do anticorpo ao prato.

Determinação da potência e especificidade do anticorpo A potência ou actividade de neutralização relativa dos anticorpos da invenção foi determinada utilizando três medidas biológicas. Em primeiro lugar, um ensaio de syncyntium de vírus de vaccinia recombinante mede a concentração na extremidade para a qual o anticorpo inibirá 90$ da formação da célula gigante. 0 anticorpo contendo a amostra I diluído e cada diluição é testada ps ra a actividade de inibição de fusão. A potência da amostra é expressa como a concentração para a qual a formação de syncyntium é inibida pelo menos 90$.

Em adição, os ensaios de inibição de syneyntiua -23-

62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 de exploração foram realizados de acordo com os ensaios de inibição de syncyntium padrão descritos atrás com as seguintes modificações. Antes de adicionar o anticorpo à cultura de gp 160 expressando as células 0D4+, o anticorpo é misturado com um peptido teste para concentrações que variaam entre 100 a 0,1 yug/ml. Se o peptido teste competir com o epítope gp 160 de superfície da célula para se ligar ao anticorpo de neutralização formar-se-á syncyntia. Recíprocamente, se o peptido teste não competir com o epítope da superfície da célula para se ligar ao anticorpo da neuiráliáação, a formação de syncyntia será inibida. Este ensaio permite o estudo das sequências de polipeptido virai para bloquear a actividade biológica sem actualmente utilizar o isolado virai. A segunda medida biológica é um ensaio de neutralização HIV. As diluições do anticorpo são incubadas com HIV e depois adicionadas às células CD4+ susceptíveis de HIV. Uma diluição de anticorpo que reduz a produção de proteína virai em 90$ é definida como a diluição final. Este ensaio é descrito geralmente em Robey et al., 1986, Proc. Nat. Aca. Sic. 83:7023, e Robert-Gu-roff, 1985, Nature 316:72. A terceira medida biológica é o Ensaio de Redu ção da capacidade de infecção (IRA) que mede a diferença entre a dose infecciosa de um virus em cultura de tecido na presença e ausência de uma diluição padrão de anticorpo. A potência do anticorpo é medida pela quantidade de redução na quantidade de virus total. Um bloco de 100$ de 10 unidades infecciosas é altamente significativo neste ensaio, em contraste com o ensaio de neutralização do soro padrão descrito atrás, devido às condições do ensaio do IRA que promove a divisão de células e a replicação do virus.

Caracterização de Anticorpos Monoclonais de Murino

Os passos realizados para caracterizar a preparação do anticorpo são apresentados no Quadro 8. 0 Quadro 8 também resume os ensaios descritos atrás. 0 Quadro 3 apresenta exemplos -24- ' 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 de peptidos utilizados como imunogenes ou reagentes de protecção. Os exemplos seguintes diserevem as características de murino e dos anticorpos de neutralização HIV humanos, hem como os anticorpos específicos que apresentam neutralização ampla. 5

Purificação e Especificidade de ligação de P7E4 A imunização do peptido RP142 dos ratos conduziu a um clone de hibridoma designado por P7E4 (ou F4/P7E4)· 10 15 0 clone P7E4 que produziu anticorpo anti~RP142 IgM foi expandido pela injesção via intraperitoneal nos ratbs Balb/ C. 0 fluido ascite foi recuperado a partir dos ratos e o anticorpo P7E4 foi purificado por cromatografia de filtração de gel como se descreveu atrás.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 0 anticorpo purificado saio ELISA para se ligar ao ciclo contendo de variantes MN (HP142, BP70, RP342), ΙΙΙ0 (Quadro 9). 0 P7E4 foi capaz de se ligar a tados. P7E4 foi testado no en-sequências peptídicas (RP136) e RF (RP339) todos rs peptidos tes- 25 30

Num ensaio de inibição syncyntium baseado no virus de vaecinia recombinante expressando o revestimento da variante MN, a actividade de neutralização observada foi de um tipo específico (Quadro 10)· As células CEM foram injeciadas com virus de vaecinia recombinante expressando o revestimento que possui o domínio de neutralização principal tanto das variantes III-, RF

D como das variantes MN. Os anticorpos monoclonais P7E4 ou FE1/5C5 (um IgG2a de murino que se liga a RP135 e neutraliza a variante III0 de HIV) foram adicionados no início da cultura. 0 número de syncyntia em cada parede foi eontado após 24 horas. Os resultados são expressos era anticorpo/número de syncyntia formada na ausência de anticorpo. -25- 35 62.385 Ref: Repligen- MNCIP 2

<nCQ -o /

10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 1 Especificidade de purificação e ligação de Anticorpos Monoclonais de neutralização

Anticorpos Monoclonais de Neutralização MN Em fusões sub-sequentes (F31, F50, F52, F58), a imunização do peptido RP70 dos ratos produziu clones de hibrido-ma designados por F31/P2B10, F50/P8D10, F52/P7F12, F52/P8CP, F52/ P7B9, F52/P5E9, F52/P6E9, F52/P8G10, e F52/P8F11 que foram considei rados específicos de MN»

Os clones que produziram anticorpos anti-RP70 IgG2a foram expandidos por infecção via intraperitoneal nos ratos nus. 0 fluido ascite foi recuperado a partir de ratos e os anticor-* pos foram purificados por cromatografia de filtração de gel, como se descreveu atrás.

Os anticorpos de neutralização MN isolados a partir das fusões F31, F50 e F52 foram testados para especificidade de ligação. Os resultados apresentados no Quadro 11, mostram que os anticorpos MN apresentam especificidade na direcção do lado esquerdo do cièlo MN, isto e para a sequência R-I-H-I-G.

Num ensaio de inibição syncyntium baseado num virus de vaccinia reeombinante expressando o revestimento da variante MN (vac-env^), todos os anticorpos foram capazes de inibir a formação de syncyntia a concentrações inferiores ou iguais a 0,5 /ig/ml.

As fusões adicionais foram realizadas a seguir à imunização de ratos C57/BL6 com peptidos lineares conjugados com KLII. Os clones de hibridoma designados arose F54/P5F4 e F56P6G4 a partir da imunização com 1P108-KLH e RP100-KLII, respectivamente.

Em adição, um clone de hibridoma designado arose F60/P5C2 a partir da imunização de um rato Balb/c com RP100-KLII. Os anticorpos produzidos por estes clones foram testados para a especificidade de MN

35

62.385

Eef: Repligen -MNCIP 2 por intermédio de ELISA e inibição de syneytia no ensaio vae-onv.

Os epítopes de PND reconhecidos por cada ua destes anticorpos foram apresentados como descrito. 0 anticorpo F54/P5F4 reconhece II-I-G-P-G-E-A-F-Y; F56/PÔG4 reconhece H“X“G-F«G-IK4; e F/60/P5C2 reconhece I-H-I-G-P-G-R.

Anticorpos de neutralização ampla

As fusões F58, F59 e F64 foram originadas a partir da imunização de ratos BALB/C com o imiinogene RP70 de ciclo fechado e F53 foi gerado por imunização de ratos C57B1/6 com RP102· -KLIL Os anticorpos designados F59/P7E3, F59/P5B3, F64/P6G5(64,10) e F53/P7C4 (53,4), foram identificados como sendo potencialmente anticorpos de neutralização ampla. Dois destes anticorpos, F59/P7 E3 e F59/P5B3 apresentaram quantidades ELISA significativas para ΠΡ108, possuindo um peptido uma sequência de aminoácidos que corresponde à sequência do lado direito da extremidade do ciclo PND·

Os peptidos substituídos por alanina que foram capazes de competir com RP7Q para se ligarem aos anticorpos F59/P7E3 e F59/P5B3 não continham substituições de alanina dentro da sequência G-P-G-E-A-F) De modo semelhante os peptidos que continham a sequência G-P-G-R--A-F foram capazes de competir com RP70 para se ligarem aos anticorpos F59/P7E3 ou F59/P5B3 enquanto os que não continham esta sequência (isto é, ΕΡ129 e RP175) não foram capazes de competir. Estes resultados indieam que os anticorpos F59/P7E3 e F59/P5B3 reconhecem o epítope G-P-G-R-A-F. Esta sequência está presente numa larga gama de variantes HIV. 0 anticorpo F04 reconhece o epítope não contíguo I-A -A -G-P-G-R e neutraliza as estirpes IIIB e MN. 0 anticorpo F53.4 reconhece o epítope X-G-P-G-B-A-F e neutraliza as estirpes MN e WMJ2. Um anticorpo anti-HIY que reconhece uma sequência comum é mais provável possuir capacidades de neutralização ampla. A amplitude de neutralização de um anticorpo da invenção pode ser testada utilizando ensaios de inibição de syncytium em que são utilizadas estirpes MN e outras estirpes HIV. -27· 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 62,385 Ref: Repligen -MCI? 2

Os anticorpos F59/P7E3 e F/59/P5B3 foram testados para a capacidade de neutralização ampla no ensaio de inibição de syncytium de virus de vaccinia recombinante descrito atrás e apresentaram capacidade de neutralização dos virus de vaccinia recombinante expressando revestimentos III^, M ou 'VMJ2 (Quadro 12), Em adição, estes anticorpos monoclonais foram testados nos ensaios da redução da capacidade infecciosa de niV e reduziram quantidades das variantes de HIV IIIB, M, SF2 e T7MJ2. A capacidade de um anticorpo da invenção para neutralizar virus com as sequências de protótipo MN (ou uma sequência de variante MN) e uma estirpe de IIIV contendo G-P-G-R-A-F revela actividade de neutralização ampla. Os anticorpos monoclonais adicionais que possuem este padrão de ligação e neutralização são F64.8, F64.9 e F64.1Q» (Quadro 13(a e b) é uma chave para os primeiros nomes e nomes correntes das linhas de células que produzem estes anticorpos monoclonais.)

Uma outra especificidade do anticorpo da invenção é dirigida para o epítope I-G-P-G-R-A. Estes anticorpos ligarão e neutralizarão uma percentagem insignificante mais elevada de isolados de EXV do que os anticorpos dirigidos G-P-G-R-A-F (ver Quadro 2), Foi isolado e earacterizado um anticorpo F53.4 que apresenta as propriedades de ligação e neutralização esperadas de um anticorpo ligando a sequência I-G-P-G-R-A (Quadro 12), Um aspecto que distingue este tipo de anticorpo ê a incapacidade de neutralizar o isolado niV-IIIg que contém a sequência E-G-P-G-R-A.

Deste modo, identificou-^se e caracterizou-se anticorpos para os dois epítopes hexaméricos de ocorrência mais frequente do domínio de neutralização principal de IIIV: I-G-P-G-E-J? que ocorre com uma frequência de 64$ entre os isolados testados e G-P-G-R-A-F que ocorre com uma frequência de 60$. Estas propriedades distinguem estes anticorpos como possuindo valor terapêutico na prevenção e/ou tratamento da infecção de HIV. -28- 62.385 íief: Repligen -MNCIP 2 .C !!j/í roj V'Í

Caracterização de anticorpos monoelonais humanos

Isolamento do anticorpo de neutralização MN produzindo a linha de células NT0-19.¾ A linha de células N70-19.b (N8 de acesso de ATCC IIB10290) que produz um anticorpo monoclonal humano que neutraliza IIIV^, foi obtido a partir do processo de Dr. James Ξ. ítobin-son de Louisiana State University Medicai School. 0 processo do Dr. Robinson envolveu o isolamento de células linfoides a partir de um doente humano assintomático para a infecção de HIV mas seropositi-vo para IIIV-1, seguindo-se a transformação das células com Viros de Epstein Barr (EBV) para as imortalizar e um passo de protecção inicial para a especificidade gpl20. Voltou-se a proteger depois as linhas de células linfoblastoides para a produção do anticorpo anti-IHVjjj.

Transformação de células linfoides humanas

Observou-se (Gorny et al«, 1989, supra; Yar-choan et al., J. Clin. Invest., 1986; 78:439-447) que células B de sangue periférico a partir de indivíduos infectados com HIV-1 variam muito na sua susceptibilidade para transformação de EBV. Em geral, as células B de doentes com a função imune muito enfranque-cida e quantidades de células CD4 muito baixas são as mais resistentes à transformação, enquanto as células B de doentes assintomá· ticos com quantidades de células CD4 relativamente elevadas tendem a transformar-se com maior facilidade. Porém, as velocidades de transformação mesmo dentro da população de doentes assintomátieos aparentemente saudáveis são variáveis e as tentativas para produzir anticorpos monoclonais humanos (ílIJahs) deste grupo não têm sido, de modo nenhum, bem sucedidas.

Determinou-se a especificidade antigénica do anticorpo N70-19.b que produz o clone pelo ensaio ELISA utilizando a proteína de revestimento gpl20 contendo o domínio de neutraliza- 29- 1 1 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25

62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 ção principal a partir de niV^ e investigou-se o anticorpo para a actividade de neutralização de HIV pela inibição de formação de syncytium. 0 epítope reconhecido por N70—19.b deveria ser expresso na estirpe do virus infectando o dador N70.

Outros IíMabs que reconhecem o PND de KIV-MN e que são capazes de neutralizar a variante MN de IIIV podem ser encontrados por transformação de células B humanos dos isolados de doentes seropositivos IXIV-1 e por protecção do anticorpo que produz células para ligação a HIVJJN gplOO ou um fragmento correspondente contendo o PND, ou por neutralização de infeceão de ΗΙΥ,^ como se descreve a seguir. A transformação do Yirus de Epstein Barr de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBÍ.IC) de dois adultos machos seropositivos de HIY-1 foi realizada pelo Pr. J, Robin-son como se segue. PBMC foram isoladas em gradientes de Ficoll-Hy-paque e foram descongestionadas de células T positivas de CD3 utilizando uma técnica laboratorial indireeta (Wysocki et al·, Proc. Xatl. Acad. Sei. USA, 1980, 75:2844—2848) em que as células que reagem com o anticorpo monoclonal 0KT3 foram absorvidas em discos petri revestidas com anticorpos F(ab)g em IgG de rato. As células não aderentes, enriquecidas em células B, foram inoculadas com a estirpe B95-8 de EBY (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1973, 70:190-194) e galvanizadas a IG^íçou 10 células por fonte em pratos de cultura de tecido de fonte 96 com linfócitos de sangue de cordão umbelical humano irradiado (HUCL) (10 células por fonte* como células alimentadoras. As culturas foram conservadas em BPMI-1640 contendo 5fo de soro de vitelo fetal (FCS) e 1$ de Nutridoma -IIu (Boehringer-Mannheim) , um substituto de soro de baixo conteúdo de proteína*

Isolamento de linhas de células B produzindo anticorpos -30- 35

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 62·385 -5 jmj -ocj Ref: Repligen -MNCIP 2 CU-j$ 1 / Um faetor crítico em produção de IIMab é a disponibilidade de um ensaio sensível e eficaz para protecção de centenas de culturas de microfontes para produção de anticorpos· No ensaio convencional ELISA, que é a base da maior parte dos equipa- 5 mentos ELISA comerciais para teste serolégico, os antigenes virais purificados são revestidos passivamente em fontes (paredes) de pratos ELISA· A preparação de antigenes para este ensaio necessita da produção de grandes quantidades de virus, que depois podem ser purificados e inactivados. 0 processo de purificação de virus pode 10 resultar em perdas significativas de gpl20· Assim, este ensaio pode ser ineficaz na detecção de anticorpos para gpl20 e favorece a detecção de anticorpos para outros antigenes HIY. Isto pode explicar, em parte, a predominância da reacção de IIMabs com proteínas 10000 ex. - 89/07 cn szast ou ep41 fBanapour et al*. 1987, supra: Sugano et al., 1988,su-pra* Morrow et al.. 1988, supra: Gorny et al.. 1989. supra: Amado-ri et al., 1989 supra). Utilizando o ensaio de protecção de anti-corpo convencional, isolou-se 1 HMab como se segue. r- r*. | 20 Ma primeira transformação do Dr. Robinson,EBV exposto, PBMC descongestionado com células T a partir de um dador infectado com IIIV-l foram galvanizados para 10 células por fonte em pratos de cultura de fonte 96 com células alimentadoras de IIUCL irradiado. Transformou-se, aproximadamente, 50fo das culturas apés 25 4-5 semanas de cultura. Os fluidos de cultura foram depois protegidos por ELISA para anticorpos IgG reagindo com células 119 fixas imobilizadas infectadas com HIY, como se segue. 30 As células 119 infectadas com Hl V-l foram imobilizadas em fontes de ensaio revestidas com Concanavalin-A (Oon-A) e depois fixas com acetona-metanol 1:1. As fontes foram bloqueadas com RPMI-10^ de FCS durante 1 hora. Os fluidos das culturas de fonte 96 foram transferidos para fontes nos pratos de ensaio. Após 1 35 hora, as fontes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1®- de triton-X 100 (PBS-TX) e depois reagi- -31- 1 G2.3S5

Eef: Eepligen -MSCIP2 -5.JiK.r*3 r * vj£ 10

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 20 25 \ das eon anticorpo conjugado com peroxidase para IgG humano (Pretos Labs, San Francisco, CA). A cor foi desenvolvida com ICO /il de te-trametilbenzidina (TMB)-Ho0o como substratb* A reacção foi parada

Urf (4 pela adição de UgSO^ e a eor foi lida como Densidade óptica a 450 na num leitor ELISA Titortek Multiskan.

Uma cultura transformada, designada 1124-3¾, foi um produtor estável de uai anticorpo que em teste adicional reagiu por imunofluorescêneia indirecta com células infectadas com ΙΓΐν-l fixes e não finas mas não com células não infectadas. As sul»-culturas múltiplas de células K24—8b foram estabelecidas a baixa densidade de células e continuaram a produzir anticorpos, embora tenham cessado do crescer após cerca de 8 meses. Porque as células originais foram galvanizadas a uma densidade de células relativa-monte baixa e a incidência de transformação foi inferior a 50{í, é provável que a linha de células U24-3b seja estabelecida como uai clene.

Porque a proteeção por intermédio de ELISA eon» vsnoional forneceu apenas um IPtab específico de ΙΙΠΓ, utilizou-se um novo imuno-eneaio para proteger as células 5 transformadas com EBY de un outro doente seropositivo para IIIY-1. Este imuno-ensaio é Isa-seado na observação que as glicoproteínas de revestimento IIIV ligam--se via as suas porções de hidrato de carbono a Cou-A (ííontagnier et al., 1985, Virology 144:283). Neste imuno-ensaio, as glieopro-teínas ΙΓΧΥ-1 libertadas por células infectadas cresceram em meio livre de soro e sã© imobilizadas por afinidade em fontes de ensaio revestidas com Coa-A. Este procedimento simplifica enormemente a preparação de antigenes de glicoproteína de fase sólida para pro-tecção em larga escala de anticorpos. 0 ensaio é altamente sensível e selectivo na detseeão de anticorpos para gp 120. 0 virus não necessita de ser purificado; apenas volumes pequenos de células desenvolvidas em meio livre de soro são necessários para produzir grandes quantidades de antigenes para imobilização de Gon-Λ. Na verdade, -32- 35 62.385

Pef: Eepligen- MNCIP 2 muitos "stoeks" de virus livres de soro podem ser diluídos na proporção 1:2 ou 1:4 sem diminuir a aeiividade dos antigenes e, por conseguinte, uma quantidade tão pequena como 100 jal de fluido so-brenadante pode ser utilizada para preparar 20-40 pratos de ELISA de fonte 96,

Na segunda experiência, PBMC descongestionado de células T expostas a EBV a partir de um doente positivo para IIIV foi cultivado em 10* eélulas/fonie com HUGL irradiado em dois pratos de fonte 96. A transformação ocorreu em 100$ das fontes. *0s fluidos de cultura foram protegidos pelo novo ensaio ELISA para anticorpos Ig(l que reagem com glicoproteínas virais imobilizadas com Con-A derivadas da estirpe J62 de IIIV-1 desenvolvida eai células MT4 em meio livre de soro, como se segue.

As fontes de pratos de ensaio Imnmlon-2 (I)yna-tech) foram revestidas com 200 ^ag/ml de Goa-A em PBS e depois incubadas com 100 p.1 de fluidos sobren&dantes desfeitos detergentes a partir das linhas de células produtoras de IIIV-1 desenvolvidas durante 2-3 dias em ΪΓΡΜΙ livre de soro suplementado com 1$ de Nutri-doma-IIu. Ma ausência de componentes de soro, as glicoproteínas virais desfeitas, presentes nesses fluidos de cultura, ligam-se a Com -A em quantidades suficientes para funcionar eomo antigenes de fase sólida num ensaio ELISA altamente sensível. Os locais de ligação Con-A não reagidos foram bloqueados com FPMI-10$ de PCS durante uma hora. Os antigenes de controle foram preparados de modo semelhante a partir de fluidos culturais de células MT4 não infectadas. -0 flui do de cultura de células SStransformado foi transferido para as fon tes revestidas de antigenes e de controle de pratos de ensaio que foram incubadas h temperatura ambiente durante 1 hora. A ligação de anticorpos foi medida eomo se descreve atrás. Este ensaio ELISA foi também utilizado nas ultimas experiências para testar a raaetivida-de de HMabs com glicoproteínas de estirpes de virus diferentes.

Pez culturas transformadas produziram anticor- -33-

"* C2.S35 r.ef: Eepligon -MITCIP 2 1 pog IgG reagindo com glicoproteínas J62 mas não com antigeaes de controlo. Sete culturas produziram anticorpos durante um tempo inferior a dois meses. Três linhas de células, designadas S79~23.g, N70-15*e, e ”70-19,b, respectivamente, foram produtores estáveis de anticorpos e foram clonadas para 10 células por fonte. Os elones do cada linha foram estáveis relativamente ao erescimento e produção 3e anticorpos durante 10 meses. Λ subclasse IgG e o tipo de cadeia leve de ca~ 10 3a anticorpo foi determinado pela reactividade com anticorpos mono-elonais de murina para as quatro Subclasses de cadeia pesada (Beh-ring Diagnosiies) ou anticorpos de cabra policlonais para eadeias leves lambda e Eappa num ELISA de sanduíche de acordo com as técnicas convencionais ieotípicas. As quatro IlMabs sã© da subclasse IgGl; 15 E2-4~3b, ”70-15.6, e M70~19.b contêm eadeias leves kappa e N?0-23.a

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 contém cadeias leves lambda.

Caracterização de especificidade III,íab por intermédio da Mancha de western e ensaios da Mancha de contos 20 25 35 A especificidade antigeniea de cada IIMab foi determinada utilizando ensaios de manchas de western e pontos· Na proteeção inicial dos anticorpos, o Dr. Eobinson utilizou 12 estirpes EIY-l como an ti genes alvo: as estirpes C39, J62, SA90, SA9G e 13G foram isoladas a partir de células T activadas com mitogene de 5 indivíduos infectados eom IIIV-l assintomáiico através de ce-cul-tura coei células T normais activadas em meio suplementado com- inter-leuquiaa-2; a estirpe SA3 foi de modo semelhante isolada de um doen-te com SIM; a estirpe IliTi é descrita eia Raskeed et al., Virology, 1080, 154:393-400; a estirpe E3 foi obtida a partir de Tulane Delta Primate Center, New Orleans, LA; IITLV— IIIB (Popovie et al·, Science 1984, 224:497-500), a estirpe MV-1 protótipo foi obtida a partir de American Cype Culture Collection, ATCC No. CRL 8543; UTLV-in,™ (Gallo et al., Science, 1984, 224:500-502; Skaw et al.,

iVi*I

Science, 1984, 226:1165-1170); o baculovirus produziu gp 129 LAY -34- 1 02,085 "v· 1 D**'. · ^

Bef: Repligea- MNCIP 2 recorabinanta (American Biotechonologies, Ine., Cambridge, MA.); bem como gp 120 reeombinante glicosilada a partir de IlIV-lg^ (Levy et al·, Science, 1984, 225:840-842) foram obtidos a partir de AIDS De-· search e Reference Reagent Program. As estirpes C39, JG2, SA9G e SA90 foram desenvolvidas ea células MT4 (liarada et al., Science, 1985, 229:563-566) ; HTLV-IIIB, 3TLV-III,_T, SA3, IliTi e E3 foram de-· senvolvidas ea células 39.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 A estirpe LSG isolada do dador de células B 10 de ua anticorpo moaoclonal (E24~8b), não replicou nas linhas de cé-· lulas contínuas e propagou-se em células T de cordão umbelieal a-eiivadas cota mitogene em meio contendo 190 unidades por ml de IL-2 reeombinante, Para se preparar antigenes para a imobilização de Gon-A, desenvolveram-se células infectadas com cada estirpe de vi-15 rus durante 2-3 dias em meio DPMI livre de soro suplementado coe 1 f de Mutridoraa-TIu. Os fluidos clarificados foram tratados com ld de Triton-Σ e armazenados em alí quotas." a -292 C até à utilização.

As manchas de western foram realizadas como 20 25 se segue. 7

Os extraetos de 1-2 x 10 células infectadas cori ΤΙΪΥ-1 preparadas por solubilização de células durante 30 minutos ora de Triten-X seguindo-se a remoção do material insolúvel por centrifugação numa mi croc entrífuga. As amostras foram misturadas na proporção de 1*1 com ura tampão de amostra SDS sem agentes do redução e aquecidas durante cinco minutos a 95^C. Os lisados do células do células MT4 e 110 aã© infectadas foram preparados de modo semelhante. As amostras foram fraceionadas por eleetroforese em 7,5^ de dodeeíl sulfato de sódio-geles de poliacrílamida num aparelho de mini-gel BioRad. As proteínas foram depois transferidas ele-· etroíoreticamente para membranas de nitroeelulose. As tiras das manchas de western foram incubadas com irspão de bloeagem (l<j de albumina do soro bovino, 0,5JÍ de Tv/een 29, em MaCl 0,5M, 10 mH fris, pT! 8), submetidas à reaeção cora cada uma das preparações de aati- -35- 35

10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 corpos e depois com anticorpos conjugados com fosfataso alcalina para IgO humano ou de carneiro, como apropriado. Desenvolveram-se bandas coloridas utilizando tetrazólio azul nitro e 5-br®mo-4-elo-ro-3-indolil-fosfate (NBTMBCIP, Sigma, St. Louis, MO) como substrato. Um anti-soro de carneiro para gp 120 de UTLY-HIB» obtido a par tir de AIDS Research and Referenee Reagent Program foi utilizado como controle positivo na detecção de gp 120/160. A Fig. 1 apresenta a reacti viciado de quatro UMabs nas manchas de western de antigenes de duas estirpes HIY-l, TTTLY-III2 e J62* As linhas 1-5 de cada um dos painéis Â e B são como se segue: Linha 1, K24-3b; Linha 2, N7Q-23.a; Linha 3 N70-15.e; Linha 4, N70-19.b; Linha 5, anti^BSJSlT-IIIB gp 120 de carneiro. Sobre as manchas de IITLY-IIIB como antigeno alvo (Painel A), três 11’fabs (E24—3b, N70-2.3a, e N79-l.Se) reagiram fortemente com uma banda saliente de aproximadamenie 120 Yd e com uma banda menos intensa de 100 Yd. Embora N70-19.b pareça reagir fracamente com gp!2{ nesta mancha (Painel A, iinha 4), noutros ensaios não reagiu de modo nenhum cora 3TLV-IIIB. Sobre manchas preparadas a partir da estirpe -J62 como o antigene alvo (Painel B), todas as quatro UMahs apresentaram idêntica ligação a uma banda saliente de 160 Yd a seguir que foi uma banda difusa estendendo-se aproximadamente a 120 Nd; este padrão é característico para esta estirpe. Os padrões de manchas obtidos com um anticorpo de carneiro policlonal para gp 12Ç nas manchas de ambas as estirpes foram idênticas ás observadas com os monoclonais (linha 5 em paineia A e B). Os IIMabs não reagiram com manchas de células 119 ou MT4 (não apresentadas).

Estes resultados indicaram que estas quatro IIYabs reagem com gp 120 e com o seu precursor celular não clivado, gp 100. Porém, com vista â possibilidade das bandas identificadas como gp 160/120 nalgumas tiras de manchas de western IIIV-l disponíveis comerei almeja te serem actualmenie multímeros de gp 41 (Zolla--Pazner et al», Mew Engl. J. Med., 1989, 320:1280), a especificidade cios quatro Ilmabs para gp 120 foi testada utilizando manchas de »36- 02.385 Ref: Repligen «41N0IP 2

1 pontos do gp 120 LAV reeorabinante e a leetina sob a forma de lentilhas purificou glieoproteínas <J62. 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Para os ensaios de manchas de pontos, as tiras de nitroceluiose foram dotadas com 1 μΐ de gp 120 LAV reconibinante produzida par baculovirus para 100 μg/ml e glieoproteínas de revestimento J62, que foram purificadas parcialmente a partir de detergente tratado com meio de cultura livre de soro por intermédio de eromatografia do afinidade de leetina sob a forma de lentilha (Mon-tagnier et al., Virology, 1985, 144:283-289) e coneentrado até 10 yug/ml. gp 120 recorabinante foi também ponteada apée ter sido aquecida durante 5 minutos a 95^0 na presença ou ausência de 2-merea-ptoetanol. Realizaram-se ensaios de anticorpos sobre tiras de manchas de pontos como para as manchas de western, sxcopto um anti-so-ro de cabra para gp 160 de HTLV-III33 (Rusahe ©t al., Proe, Natl. Aead. Sei. (lTSA), 1987, 84:6924—6928) foi utilizada como um controle positivo. 20 25 30

Corão se mostra na Fig. 2, três dos quatro ("24—3b, 1:79-23.a © H70-15.©) reagiram fort©mente com gp 120 recom-binante. N70-19.b não se ligou a LAV gp 120 mas ligou-se ao aníige-ne -JC2. Λ Figura 2 considera-se como se segue: "gp 120 -162" é gp 120 purificada de estirpe J62, wrgp 120 LAV” é gp 120 LAV recombi-uants não reduzido, ”rgp 120 reduzido" é gp 120 LAV reeorabinante reduzido e "rgp 120 aquecido" é gp 120 LAV aquecido não reduzido. Λ quantidade de antigene J62 ponteada foi cerca de 10 vezes menor do que o antigene reeorabinante, explicando a mancha mnis fraca observada com este antigene. Estes resultados, por conseguinte, indicam que as bandas de 120 e 100 TCd observadas nas manchas de western, na verdade, representara gp 120/100.

Nos estudos d® manchas western preliminares, neia E24— 3b nem N70-23«a reagiram cora manchas preparadas de lisadog de células aquecidas era amostras tampão contendo 2—raercaptoetaaol (não^representado), sugerindo que os epítopes identificados foram -37-

02.335

Roí: Repligen- 11MCIP 2 sensíveis à redução. Para testar ainda o efeito de redução nestes epítopQSj os anticorpos foram testados em manchas de pontos de gp 120 lay que foi aquecido a 95SC na presença ou ausência de 2-merca-ptoetanol. Os resultados apresentados na Figura 2 mostrara que 7324--3b e K70-15.e não se ligaras para reduzir antigenes e a ligação dc MT0-23*a a antigene reduzido foi diminuída de modo significativo, enquanto o aquecimento isolado diminui ligeiramente a actividado antigenica. Como N70~19«b não se ligou a gp 120 LAV, o efeito de redução no epítope não foi determinado nesta experiência. N70-19*b foi testado de modo subsequente nas manchas ponteadas de glicopro-teíuns JG2 reduzidas e não reduzidas e não se observou nenhuma rea— ctividade com antigene reduzido. Deste modo, as quatro HMabs identificaram epítopes sensíveis de redução.

Análise de especificádàde de estirpe de HMabs por intermédio de ELISA

Porque as estirpes de virus múltiplos isoladas a partir de cada dador de células B assintomáticas não replicaram em linhas de células contínuas (Cheng-Mayer et al., Science, 1938, 240:80-82) e normalmente podem ser propagadas ea células T primárias activadas dependentes de IL-2 ou em monocitos, a preparação cie antigenes de fase sólida em quantidades suficientes para ριν teger iauno-ensaios baseados no método de revestimento passivo a-presentou um problema. A técnica de imobilização Con-A ofereceu um; solução potencial para este problema porque apenas volumes pequenos de vinis são necessários em vez de quantidades de antigenes virais purificados. 0 Dr. Robiason testou os quatro HMabs por intermédio de ELISA para reactividade com glicoproteínas virais imobilizadas Con-A a partir de estirpes ΠΙΥ-1 diferentes. Teoricamente, a ligação de gp 120 a Con-A podia bloquear o acesso de anticorpos sos mesmos epítopes. Porém, o Dr. Robinson descobriu que os laonoclonais de murina conhecidos para reagir tanto com a região de -33-

5 10 1 ligação CM· como com o domínio hipervariável Y3 reagem fortemente cw® 2p 120 imobilizada com Con-A (não publicada) indicando que os epitopes dentro destas duas regiões são representados no ensaio·

Como se ilustrou na Figura 3, desenvolveu-se uma estirpe (lSG) numa cultura livre de soro de células ? primárias nctivndas dspendoateg de IL-2, e gp 120 libertada no meio funcionou ^es no ensaio de imobilização de Coa-A· Resultados semelhantes po-UQn £0T atingidos com outras estirpes isoladas a partir de dadores do eelulas !) assintomátieas; deste modo, pode ser- possível proteger nuiieorpos reagindo com antigenes de isolados homólogos. 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

Numa experiência (Figura 3), os fluidos de cultura 1-24-3¾ θ N70—23.a $ um soro de controle positivo ΙΓΙΥ—1 (372) foram testados por Dr, RoMnson nu® painel de nove estirpes diferentes j que incluíram::LSG, a estirpe isolada a partir do dador de células 3 de T!24—3b. N70-23.a reagiu com todas as nove estirpes. Os resultados foram apresentados como meio O.D. de determinações em triplicado; são apresentados barras de desvio padrão. Fmbora se o-b3ervassem algumas diferenças na ligação deste anticorpo ao painel, observaram-se de um modo geral diferenças paralelas com o soro de controle positivo. Reste modo, é provável que os níveis de ligação de N70-23»a e 1172 proporcionem uma medida relativa das quantidades de gp 120 imobilizada a partir de cada estirpe. A explicação para a reactividade muito fraca de N7G-23»a com a estirpe LSG comparada co® o soro positivo foi indefinida, mas pode ser que LS6 seja a única estirpe desenvolvida em células T primárias dependentes de· IL-2 que libertam menos vírus do que as linhas cie células contínuas. Ê possível que maie gp 41 do que gp 120 seja imobilizada na preparação do virus LSG e os anticorpos para gp 41 sejam responsáveis pela maior reactividade de soro.

Pela comparação cora N7Q*=23a, o mouoclonal N24-«,3b apresentou variabilidade notável na reactividade com estes virus. Rsta anticorpo reagiu com seis das neve estirpes mas não g© -39- 35

1 5 10

Mod. 71 -10000 ex. · 89/07 20 25 30 ligou às estirpes SA3 ou K3, e apresentou a mínima ligação à estirpe SA96· Enquanto que a reactividade de N70-23.a a 134-3¾ com estirpes L86 e J62 foram muito próximas, a ligação de !S24-3b a estirpes 3Λ00 e C39 foi muito menor do que F7Q-28.&, sendo a diferença maior do SA9Q. Estas observações têm sido reprodutíveis em ensaios realizados com diferentes cargas de antigenes. Diferenças menores na ligação destes dois anticorpos apareceram também com estirpes Ui Ti e IXTLY-III. Estas diferenças não foram relacionadas com concentrações do anticorpos, visto que as preparações dos anticorpos utilizados nestes ensaios saturaram os locais antigenieos disponíveis nos antigenes imobilizados; as densidades óptieas obtidas cora diluições em sórie de anticorpos até 1:32 foram muito próximas das mesmas (dados não apresentados) quando testados em função de -J62 isolado· Estes dados indicam qne N70-23.a a identifica um epítope eonserva-do, enquanto que E24~3b identifica um epítope variante que e expresso de modo heterogéneo neste painel de estirpes de vírus· A Figura 4 ilustra os resultados de uma experiência semelhante em que o Dr.Robinson comparou as reaetividades de ::70-15*o g ::70-19.¾ com glicoprotefaas imobilizadas cora Con-A derivadas de oito estirpes (os resultados são uma determinação simples), Festa experiência, N70-23.a serviu como um controle positivo. M7Q-15·© e 1170-23«a reagiram forteraento com as oito estirpes, enqunnlo N70-19,¾ reagiu apenas com J02 a estirpe que foi utilizada na proteeção de culturas de células B originais para a produção de anticorpos. Os'resultados indicam que 1170-15,9, bem eorao 1170-23,a reage eoB em epítope repartido por todas as estirpes testadas, enquanto ITT0-19*b reage com um epítope .restringido a estirpe· A reaof-tividade das quatro UMabs foi investigada, ainda, utilizando dois alvos adicionais de antigenes gp 160, HIY-III,_T & ΠΪΥ-1 _ recombi- --J ‘ SF2 noite. Os resultados, apresentados no Quadro 14 mostraram que ITT0— -19.b bem como os outros três UMabs reagiram fortemente por intermédio do ELISA com glieoproteínas imobilizadas com Con-A a partir ds HIY-I,„r o HIY-lgj.g. Não está claro a partir desta experiência -40- 35 5 10

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 20 25 32.585 T*o£: Hspligen -MNCXP 2 que porção das moléculas ou SF2 gp 100 aos anticorpos manoclo-uais humanos ligam. A EspeeificMád© dê estirpe de IBíafcs por intermédio da Análise da Mancha de western A especificidade da estirpe de dois ou quatro IIMabs, F24“3b e N70-23.a foi também testada pelo Dr.IioMnson nas manches de western preparadas a partir do painel anterior de estirpes IIIY-1. Os resultados apresentados na Figura 5, estão de acordo coei os resultados obtidos por intermédio de ELISA. A Fig* 5, painel A, apresenta reactividade de E24-3b; o painel B, reactividade de E7G-23*a. As estirpes diferentes são indicadas no cimo de cada linha ponteada; "IIIB" refere-se a HTLT-IIIB. 1170-23.a reagiu coai gp 120/lSO das oito estirpes. E24-3b reagido cosi gp 120/160 das mesmas estirpes é identificado por intermédio de ELISA. De raodo semelhante, I(24-3b é incapaz de reagir com SA3 s 13; a sua reaetivi-dadtí mínima cosa a estirpe SA96 foi abaixo da sensibilidade de fotografia. Embora N70-15.e e M70-19.b não tenham sido testados de modo semelhante através das manchas de western em todos os vírus» a reactividade restrita de estirpe de E70-lõ.b observada por ELISA é corroborada pela sua incapacidade de reagir com gp 120 LAV recombi-nante em ensaios de manchas de pontos.

Dois ensaios de transformação adicionais, um envolvendo células B do dador N70, conduziram para cima de 60 culturas de células B transformadas incluindo anti-anticorpo ÍIIV produzindo o cloae N70-II.3a descrito a seguir que produz anticorpos

IgG que reagem espeeifieamente com glieoproteínas HIY imobilizadas com Con-Λ* Aproximadamente, SOfj destas culturas podem conduzir a anticorpo estáveis produzindo clones, indicando deste modo a possibilidade de gerar números elevados de UMabs que em conjunto representam uma representação ampla de respostas de anticorpos humanos para variantes e opítopes conservados de gp 120 durante infec-ção nssintomática. -41- 35 -50 02.385

Bei: Eepligen -MNCIP 2 1 rrotecçã© para a especificidade de Πίν,^ 5 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20

Protegeu-se novamente alguns dos anticorpos nonoclorais humanos de ligação a gp 100 identificados por Dr. Eo-blnson utilizando ELISA e o ensaio da mancha de western {IBJ), S70--19.b, M79-15.e, !r24-3b e >170-11.3a, para determinar se alguns foram específicos para o protótipo 17-1 da molécula gp ISO. Mo ensaio ELISA atilisaram-se cinco proteínas recombinanies ou fragmentos de proteínas como antigenes testes: gp 160-1113, gp 160-EF, PB-1-III3, ΓΒ-1-ΒΤ e PB-l-MN. Nos ensaios das manchas de western, utilizou-se três antigenes testes diferentes: gp 160-ΙΠΒ, Ρ2-1-ΙΧΪ3 e PB-l-MM· o polipeptido gp 160 intacto foi produzido em células insectos utilizando n:n sistema de expressão de baculovirus e foi purificado eo-rr.õ εδ descreveu em Raselie et al., U.S.S.M. 001 481, pedido em 31 de Agosto de 1987 e pertencente ao mesmo titular da presente invenção, incorporado aqui como referência. Um fragmento de proteínas de 180 aminoácidos com uma sequência de aminoácidos alcançando o domínio de neutralização principal, designado ?B1 (Putney et al., 1086, . Science 234:1392), foi expresso a partir de um fragmento de DEA de nproximadamente 540bp gerado por clivagem de ΡνηΙΙ ψ BglII do gene gnv de comprimento total como se descreveu em U.S.S.N. 107 7OS pedido era 9 de Outubro de 1987, pelo mesmo requerente da presente invenção, incorporada aqui como referência. 25 30 0 ensaio ELISA foi realizado como se segue. Ca*” cia fonte de um. prato de microtitulador de fundo chato Gostar de fonte 96 foi revestida com um antigene eolocando uma porção de 50 rai-crolitros de uma solução de PBS contendo o antigene a uma concentração afinal de 2-19 yag/ml em cada fonte. 0 método de Con-A descrito atrás não foi utilizado aqui porque os antigenes (proteínas ou pe-ptidos) são purificados e por conseguinte, imobilizados em quantidades suficientes para a ligação de anticorpo. A solução de antigenes foi aspirada recolocada com PBS ·:· 0,5J? de BSA e incubada durante 1 hora. Λ seguir à incubação, as fontes foram depois aspiradas, lavadas e adicionou-se 50yal do anticorpo. A seguir à incubação as fon- -42- 35 “0 62,385

Fef: Bepligen - MNCIP 2 1 tas foram lavadas três vezes coa PBS e depois incubadas durante 20 minutos cora 50 μΐ de uma diluição apropriada de anti-ieuaoglobuli- na humana do cabra conjugada coai perosídase de rábano (ΐΙΒΡ, Boe·#-chringor Mannheira, T7ssí Germany). As fontes foram lavadas outra vesi 5 3 vezes cosi PBS e 50 μΐ d® 1 mM ABTS (2,2azino-bis (3-etil bsnz, artolina G-áeido sulf óuieo) em citrato de sódio 0,1’í, pH 4,2 para o qual se adicionou uma diluição de 3(# de II20o), o substrato para IIP? foi adicionado para detectar o anticorpo ligado. As amostras ΛΒΤ3 foram depois lidas para 0D4^q mm autoleitor (Virgínia) Dyna-10 tocli ospoctrofotométíieo. 15

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 20 25

Os quadros 15-18 fornecem os resultados de ELISA. 0 quadro 15 também fornece resultados de uma mancha de western, 9s números no Quadro 15 indicam o núemro de vezes positive/ número de vezes tratado. Os controles positivo e negativo para o ELISA foram niV ·*· soro e IIIV ~ soro respectivainente; o controle positivo na mancha de western foi anti anti-soro gp 1Q0IIIB.

Nos ELISA um dos cinco anticorpos N79-19eb foi positivo para a proteína P3-1MN recombinante, Este resultado foi confirmado elarameate na manelia de western (Quadro 15) e Quadros 15 e 17 apresentam resultados de ensaios ELISA em qu© os fragmentos ΡΠ-1 da proteína de envelope a partir de estirpes variantes HIY diferentes (lIIB, RF e MM) foram antigenes testes para ligação. Nos ensaios apresentados nos Quadros 15-17, os reagentes foram em tampão de redução.. Este pode explicar os resultados aparentemenie contraditórios da ligação de anticorpos no Quadro G em função dos Quadros 15-17j isto I, o ensaio ELISA do Quadro 14 não continha tampão de redução e consequentemente todos os anticorpos ligaram gp 129/169, Conclui-se que a presença de tampão de redução dá origem n ligação de anticorpos mais seleetiva. n@ resultados aos Quadros 15-17 mostram qne N7B-19.L liga-se especificamente ao protótipo ”N mas não aos protótipos IIXE ou I?E da molécula gp 160, 9 Quadro 10 mostra resultados -43«

•j de ur> outro ensaio ELISA em que ST79-10#b, M70-15.® s !-!7 0-11*3« forna: testados para a sua capacidade de se ligarem a a® fragmento da proteína de revestimento a partir de qualquer estirpe MIY-MN ou mv--ΙΪΙΒ. "?j?7 0" é "o ei elo total fechado" e "RP14-2" I 24 mero aberto 5 do domínio de neutralização principal (?MD) da proteína de revestimento PM; e "EP135" é um 24 mero do PNB da estirpe III3. Estes fragmentos contem sequências d® aminoáeidos na sub-sequência d® domínio da neutralização da região cíclica gp 120 como se definiu no Quadro 2. Os resultados apresentados no Quadro IS mostram que M70-10 -19.L monocloaal liga-se ao domínio de neutralização principal ou â região cíclica da molécula gp ISO de IIIV,^ (pj?70, RP142) mas não ao PMP da variante XII3 (FJ?135).

Neutralização de ΙΙΪΥ,ητ _*_i'ii\ 15

Mod. 71-10000 ex. · 89/07

Mnsaiou-se a seguir dois dos anticorpos, uai dos quais foi M70-19.1) para a sua capacidade de neutralização para n iufecçãc HIY. 0 ensaio utilizado foi a inibição de formação de syneytium pelas células infectadas MV^. Neste ensaio, como se des-20 creveu atrás, o Virus Yaccinia recombinante que expressou o gene de revestimento da estirpe ΗΙΥ,_γ de interesse foi utilizado para in- r.j *< fectar células de CS4*> linha GEM de linfoiaa T humano (A.T.C.C. Aces«= so Np. CCL119) θ adicionou-se depois o anticorpo às células, para proteger, para bloeagem de fusão de células intermédias de revesti-25 mento IIIY. Definiu-se um resultado positivo, indicando a capacidade do anticorpo para neutralizar o virus, eomo sendo pelo menos 99$ de inibição de formação de syncytia.

As células CEM foram infectadas com Virus Vae-30 cinia recombinante expressando gp 160 de IIIY,^ derivado do plasmido pSCR2592 que contém o fragmento P33-1 de MN; o restante de gp 160 foi de origem ΪΙΙΒ. Neste ensaio, syncytia são induzidas o que é inibitivo pelo anti—soro ou anticorpos monoclonais dirigidos em fun-çSo de PND. Os resultados apresentados no Quadro 19, mostram que 35 N70-lS.b inibe completamente syncytia induzidos por vaecinia gplGO- -44-

I I -5.χ*?ο 02.385

Yef: Fepligen -MMCIP 2 -MM dentro da gama de concentrações do anticorpo em que N70-15.O não inibe a formação de syneytia·

Utilizagão 0 anticorpo monoclonal humano da presente invenção pode ser incorporado em formulações farmacêuticas convencionais para utilização em tratamento de indivíduos que são atacados poa> ΠΙΥ ou para a profilaxia em indivíduos eom riseo de tais infec* ções. Dn adição, essas formulações podem compreender veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, diluentes, sais e outros materiais bem conhecidos da técnica» Solução salina isotoniea, á-gua esterilizada, 19$ de maltose, albumina de soro humano, glícina ou outros materiais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêuticos podem sor utilizados eoao diluentes, veículos ou solventes na preparação do formulações farmacêuticas compreendendo o anticorpo da invenção»

Quando utilizado para o tratamento de indivíduos infectados por UI V ou sofredores de SI1).'1., o anticorpo mono elo nal humano da presente invenção pode ser administrado como um agente de imunização passivo en quantidades eficazes variando de modo amplo entre cerca de 200 mg e cerca de 15 gramas e, de preferência c-nire mg e 1 grraa. A globulina imune polivalente para utilização oíu imunização passiva pode ser preparada por imunização de cavalos ou por reunião de soro humano imune e fraceionamento da componente IgG do plasma ou soro· 9 anticorpo monoclonal de rato ou humano produzindo linhas de células pode ser preparado por transformação padrão e tecnologia âe hibridoaa (Methods in Ynsymology, Yol 121, Sestions I c- II, 1986, eds, j.fcangone and Ytackis, Acadamie Press). Λ r.uticorpo monoclonal EIY poda ser preparado de acordo com os processos descritos por Matsushita et al·, 1088, J· Tirol. 62:2197 -45- 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 20 02.385 "ef: f.epligea JMQ1V 2 !WK.^Pí) na S?0 205 803 publicado em 21 de Dezembro d® 1088. Visto que a maio? parto cios anticorpos monoclonais são produzidos os espécies diferentes cios sores humanos, são muitas Teses imunogénicoa para os iCi-es humanos, Oom vista à utilização bem sucedida destes anticorpos wiiaiiocloiiais no tratamento de seres humanos, pode ser necessário criar una molécula do anticorpo quimérica em que a porção do polipwptido envolvido cora ligação de ligando (a.região variável) é derivada de uma das espécies e a porção envolvida proporcionando estabilidade estrutural e outras funções biológicas (a região -sons-tante) é derivada de um anticorpo humano. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos em que o domínio variável é derivado de tua hospedeiro e o domínio constante é derivado de um segundo hospedeiro são bem conhecidos dos peritos da técnica. Veja-se, por e-retiplo, Meuberger et al., Publicação da QMPI n3 86/01533, eom prioridade do 3 de Setembro de 1984; Morrison et al., Publicação da Patente Europeia ηδ 0173494, com prioridade d® 27 d® Agosto de 1984. TJm método alternativo em qu® se produz um anticorpo por reeoloeação, apenas, das regiões de determinação complementar (CDRs) da região variável com os CDUs a partir de uma imunoglçdmliaa da especificidade aniigénica desejada, é descrito por Vinter (Publicação GB n? 213863S, eom prioridade de 27 de Março de 1986). Os monoclonais de nsuriaa podem ser preparados de modo compatível com. a utilização terapêutica por produção de um anticorpo contendo uma porção Fe humana (Morrison, 1985, Science 229:1292). 9s processos estabelecidos permitirão a construção, expressãoô® purificação de um tal anticorpo monoclonal híbrido. Os regimens para administração terapêutica de globulina imune tem sido previamente utilizados para um número razoável de doenças infecciosas. 30 0 anticorpo da invenção é administrado por via parenteral, intravenosa ou intramuscular, Usi regimen de tratamento típico compreenderá a administração de uma quantidade eficaz de anticorpo administrado durante cerca de uma semana a S meses. 9 número de tratamentos necessários para controlar um doente pode va-35 riar de indivíduo para indivíduo, dependendo da gravidade e estado ,.40.=

62.385

Peí: HepligsB -MMCIP 2 da doença e das earacierísticas de eacla doente a se? testado» A dose total necessária para cada tratamento pode ser administrada, per doses múltiplas ou numa daica dose. 0 anticorpo monocloaal humano pode 3er administrado isoladamente ©u em conjunção com outros trata mentos do ΙΙΪΥ, tais como AZT, com vista a controlar uma doença. O tratamento anti-IIIV pode ser administrado uma ou duas vezes por semana ge mais conforme as condições do doente e o estado da doença.

Pode também utilizar-se um anticorpo da inven- ''ãí vara evitar a transmissão vertical de 3IV de uma mãe para o feto, por administração do anticorpo à mão ou ao feto ou a ambos.

Outras formas de realização

Outras formas de realização cairão dentro das ruiviadicaçãos descritas a seguir. Og anticorpos podem sor eonjuga-dos cosi um veículo, por exemplo, uma molécula, ua lipossoma, ou um outro anticoriso (isto é pera formar um heter©conjugado) para melhorar a nctívidade. Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados con ngeates iicotéxicos e utilizados como imunotoximas (como se des· croveu sE! Vitetta et al., 1987, Science 238:1098), ou incorporados na saperfíeie de lipossomas contendo fármacos unti-ÍIIY ou toxinas para atingir espeeificamente esses fármacos o» tosinas para células infectadas. Como se utilizou, o termo ímunotexinn refere-se a um conjugado de ma anticorpo com uma ou mais toxinas, fármacos, radio-nuclidos ou agentes eitotoxicos. Shtre os agentes eitotoxicos que podem ser conjugados com anticorpos da invenção estão a ricina, to-ria a de difteria e radionuclidos. A PA eina é uma toxina estremamen-te potente produzida pelo feijão da planta TUeinug coiaannis. Num tratamento típico utilizando anticorpos cia invenção como imunotoxi-nns, c anticorpo (que se liga a uma proteína que é expressa nas células infectadas por ÍIXV) é conjugado com uma toxina (por exemplo, rieiaa) que é tóxica para as células infectadas por IIIY (e para células não infectadas)· Por acoplamento do agente citotoxico anticorpo, atinge-se nm nível elevado de eficácia tóxica em função da -47-

'[ }JI C3.335

Peí; Popligen -Ι’ΝΟΙΡ 2 célula alvo com um nível marcadamente inferior de toxicidade não específica* Á utilização do agente tóxico é possível porque o anticorpo ao qual o agente é acoplado conduzirá o agente direetemente para o alvo (neste caso, células infectadas com KIV), poupando,por consequência, as células não infectadas cia toxina. As técnicas que podem ser utilizadas para conjugar os anticorpos com os agentes ei-totoricos são descritas com detalhe em Vitetta et al, supra e no Pedido tle patente Europeia nS 279 668 publicado em 24 de Agosto de 1988. -48- *r* 62.385,Ref: Repligen-MNCIP 2

Quadro 1 (a)

5 10 15 C7*h? Í4VN . . TAX S .Ή . . C7C . λι T . . . .«__....jl^GMfG \ / r . , í ; CTXrirv* . . TX-tf :w t. .C7CXJkT7 .TTCr.IirGM-JWlC r r 1 - 4 - i -------------------------------------- ΪΜ.. ---------------------------*------------- cr. 7 7 4-1. ----------------------------------------

Mod. 71 10000 tx. - 89/07 20 25 30 35

rr. 75» · l. ΓΧ173-t . rr j7f-1. ΓΧ7-Ι5-1. crJ-7-1.r.r. !ia-i. cr n 7 -1. cr r-7- 1 . CC 1 « l - 1 . rr 7 71 -1. CCfΠ í-l. CIU 7-7. cr. H 7.7. CC3 75- I . cir.n-i.rr 1 u - 3. CC 3 7 4-1 . cr.: t s -1. cr:15-7. ccICO-3 . cc1oo- i. CCS 20- 1 . cr.325-2.. CCS 3 S - I . SXSSI-t . ccsu-i. CT£J-l. CCíl-2 . CCI33-1. CC34S-3. CES-4-1. = 1. IXSK-l. 1X311-3. CC317-1. CC221-1. 01311-1. SC. . cr. 31T-1 - 1X3 11-1. C£<<3-3. 1X310-1. 1X310-7. CC1Í4-3. ΣΧΚ4-1. CEI-707-1 1X1-701-1 «H . **4-4-1. cr.331-1. rxi4 s-1. 033-1. 2=7-1. EZ337-J. 1X327-3. CCX—330-1 CC71Í-1. CZ.104-2. Λ3. ^133 , = 10-1 . WJ15. *. J S 4 7 4 . C*4-13-1. CE37-1. 1X354-1 .

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»-3 >« 1 >u. - 49 - =77-

'7^1 > 10 15 62.385Ref: Repligen-MNCIP 2

Quadro 1 (b) I. 71-10000 βχ. -89/07 20 25 30 35 — ZZZ77- 1 . ETÍ U-l. tzj-i-2. CT7 Π- I . CC5 1-1 . C£7 l-l . Cl-S-t. cr7i-:. ££301-2. E!’l-1 . £££«0 - I . crts-i. 7M5-U-1. CTÍC7- !. JCZ. £=353-1. ΠΠ5 J-2. cries-i. CCí«0-I. CSÍÍl-l. RM-7-2. ETIS J-7. R*<-7-l. cr í «5-1. CZ3J2-3. crso-t. cr««3-i. EC2I7-2. EE3U-1. rrizj-í. EESÍ3-2. ErílOS-Z. THl-11-1. 7MÍ-13-1. K*»UI. tZl-37i-I.no. tZK5-Z.·

CTSPHHH . .TRJlSln l . .CPCíAi"T .TTClí ICO I3QAHC ^r- -T- -T- —r- --X- ---X- --X- — X-_v_

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ο I 3 α 2 20 25 30 62.385Ref: Repligen-MNCIP 2

Quadro 1 (c)

-5 j1’’! «Q

Con**n«uíi EE343-3. rs.l\ 7- 1 . m- t -1. zzm-1 . E150-1. TMi-M-i . X*?-4-l. 7M3-l-l. csz:j-2. atlio-í-í . εεΐ22-2. EEÍ-l-i. LZi-l-t. ETSZt-l. tzi 5-1 . EXÍÍJ-3. LE3-5-2. 7M3-7-1. 0-1. XKJ-3-2. Af 1.30-5-1. 1X7-13-1. OOJ-J. l -1. SV4-2-2. ATEIO-2-1 XW2-2-2. rrs-í-l. ΣΧ3-10-1. ejes-u-i. 1X7-24-1. ATUO-1-7. ES2M-1. C25I-J. 2X324-2. IX33I-7. ΪΧΙ23-1. EE3032-2. XW4-7-1. XV 4-7-2. KM-«-l. iav-ixu. IXIl. ΕΠ7-3-3. 1X7-4-2. 1X5-10-1. JCK2-X-3. 2X3-3-1. ΓΧ7-13-2 . tS3-«-l. 7*4-14-2. KX3-4—2. CC3a<-2. 1X244-1. 2X147C-1. »3-1. ZX3--C-2. CE ¢-3-1. 7M5-U-1. 7tx2-<-l. jxs-io-s. 2X3-11-1. Π23-14-1. ATi-11-1

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USL -Γ- —x_c-r— ---X-C— ---G-X— ---X-C-X-- --X-C-X— --- --IX-ÇCEX-.— --[ — Α-ΑΛ-- --V--AOA-- --V-**X- --V—3-QX--- -X-T- -l-- ----RX5-A-- --*--«RC-X- ---fRC-A- ---ÍSC-X-- --JXC-A-- --ÍAC-X- ---ÍXC-X-- ----CXC-X-- --W-CCIX- -Il-A-EX- —iL-λ-εχ-—α-λ-εχ-—η,-Α-εχ- --Π,-Α-ΕΧ- --Π.-Α-ΕΧ- —ie-a-ca- ---1- -- — > 11 T .. ...... 1 1 f —:-c—m- -0— •ΗΓΗ-- —v-x-xq- -QX- -V—I-E- -X-CR- -V—Ι-Χ- -X-GX- —v—r-r-

—x-gx- -X-HJX- -a-a-cr- -K-X-CR- -x-x-qx- -R-X-H3R- -K-VfXC- -V—J-S-.-XH— -V—J-X-.-XH— -V—I-K-OiMX--V—l-x-.í -V—I-X-.J -v—ΐ-κ-.-χη- -V—.-ICC—XXX- e?CTLxr t«/e ruo ao r.S* i ta. mo . -,—,—XS-RV-V—Í-OK-— --r-rr*- I "i 'SΧΛ1 1 — —r--r—τ 35 10 15

Mod. 71 - 20.000 «x. - 90/08 20 25 30 62.385Ref: Repligen- MNCIP 2 -5 -un.

C onitniui t atuo-ií-i X*J->2-l . Χ*·Ι-12-2. TM2-7-J. xri.w. (V'l cr-(os-i. ezííi-i. nr<o5-7. cxn-i. 3AVA. X*7-l-2. 531-70 í-1 231-70 í-2 7ÍO-5-1. C3C <51. EX7-20 -1 . EX3 Π- t . EX510-1. EXJ10-3 . - 131-317-ΪΓ170. EX131-2. Ϊ3. X*2-<-2. 1X125-2. XX «21-1. 23M03-1 EX3-I-1. XW4—*-1. £31-707-2 ΣΧ1-317-2. ΙΓ33. LXV-HXL. ΣΧ211-2. TVM-K-l. X*7-2-l. EEÍÍ7-1. . craco-t. 2330—1. 7H-Í-H-3. EX7-21-3. 53Í-KJS-3. 53312-2. m-t-i. D01. ATU0-J-1. 237-21-1. 212. 7K<-Π-1. 7«<-13-2. ΑΓ130-3-1. W130-J-2. 233*7-1. EX32-5-1. 3«. JT1- LAVO.I.

Quadro 1 (d) C7APWWH..7AX3UIÍ. . C7CXAf 7 . T7CE1 ÍCOJAÇAHC

jcv—«-ο-T-.. --S-2-1-:jcsxi-<3—x- 222. -r- •x-c-r— -SX7- -s— Λ -T- — I— -K——— -K-A—O- -KV7—A—«-

-I—A-7X- -1—χ-τχ-rrr—a—ç-; -A-AX-7S-ΓτΧ- —as—r-o-t-IV-: -cr-í-i—a—o- -T—A-AS-XV-f-7-A?I—λ—J T- I-

-X--—A--1—A-ÍX- »r--1-t—A-»»_-

- 52 -

35 **» -5 62*385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 QUADRO 2 5

FREQUÊNCIA DAS SEQUÊNCIAS HEXAMÉBICAS EM DOMÍNIO DE NEUTRALIZAÇÃO PRINCIPAL DE REVESTIMENTO HIV-1

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 30 SEQUÊNCIA OCORRÊNCIA EM 245 PND (t ,0 IIIIGPGRAFY 65 27 IIÍIGPG 93 38 HIGPGR 92 38 IGPGRA 156 64 GPGRAF 146 60 PGRAFY ia6igpgr 120 49 168 68 IA®IGPGRA 155 63 ia6a7gpgr 6 7 191 78 IA A GPGRA 170 69 -53- 35 ‘f* 62.385 Ref: Repligen- MNCIP 2

-5. t C ‘f i'i cc-Ί ΛΜ· 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 QUADRO 3 / RP142 YNKRICRIHI GPGRAFYTTKNI I G(C) RP342 IHIGPGEAPYT RP70 INCTRPNYNKRKRIHIGPGRAFY TTTCNI IGTIRQAHCNI S RPlOO (S G G) TRKGIHIGPGRAIY(GGSC) RP102 (sgg) teksisigpgraf(ggsc) RP108 (sgg) II i g p g r a f y a t g (g g s c) RP123c (C) HIGPGRAF(C) RP135 (isolado de ΙΙΙβ) NNTRKSIRI QRGPGRAFYTI GEI G (C) RP174c (C)N NT RE SIRI QRGPGRAFVTI G K I G (C) RP339 (isolado RF) I tkgpgrviy(c)

Os aminoácidos entre parênteses não são parte da sequência natural »54- 35 62.385

Ref: Repligen- MNCIP 2 QUADRO 4

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Estirpe Fusão No. Imunosene Reactividade em Isotipt /Clone ELISA 5 RP-70 142 342 135 339 Balb/e F4/P7E4 KLH-142 + + t + + IgM Balb/c F5/PIG2 KLH-142 + + + IgM Balb/c F7/P4D8 RP70 + 4* + IgM B10.BR F8/P9D11 RP70 + 10 Balb/c F10/B4E11 RP142 + + IgM C57/B1 F10/C3B12 RP142 + - - - IgM Balb/c F13/P3A11 RP70 + CM Balb/c F13/P4E7 RP70 + m» 15 Balb/c F13/P7E2 RP70 + + Balb/c F13/P8B2 RP7 0 - Balb/c F13/P8D8 RP70 + •f Balb/c F13/P8F2 RP70 + +/- B10.BR F14/P2F11 RP70 + 20 B10.BR F14/P4B2 RP70 + - B10.BR F14/PGD12 RP70 + + B10.BR F14/plOB12 RP70 + + B10.BR F14/P16D2 RP70 + - C57/BL/6 F31/P2B10 RP70 -i- + ND - ND IgG2a 25 A.SW F50/P8D10 RP70 + 4. ND - ND IgG2a 30 55- 35 1 5 10 15 62.385 Ref: Repligen MNCIP 2

QUADRO 5

Mod. 71-10000 ex.-89/07 20 25 30

Peptido RP135 RP141 RP142 ΙΪΡ143 RP144 RP145 RP146 RP147 RP148 RP149 RP150 RP151 RP152 RP153 RP154 RP162 RP163

Sequência NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG C NNVRRSLSIGPGRAFRTREIIGC YNKRKPJHIGPGRAPYTTKNNIIGC NNTTRSIHIGPGRAPYATGDIIGC NNf SRGIRIGPGRAILATERIIG C NNTRKGIHIGPGRAFYATGDIIGC NNTKEGIRI GPGRAVYTARRIIG C NNTRKGIYVGSGRICYYTRIIEI IGC ENTKRSLYIGPGRRFIWTKAI IGC NNTRRSIHIGPGRIVSVHTTGEIVGC NNTRKSI YIGPGRAFIITTGRI IGC NNTKKGIAIGPGETLYAREKIIGC NNTEKRVIMGPGRWYTTGEXVGC NNfRARLSIGPGRSPYATRNIVGC SNVRNRIHIGPGRAFIITTKRI IGC NNTRKSIPIGPGRAFYATGDIIGC NNTEKGIFIGPGRNIYTTGNIIGC 56- 35 62.385

•5-JBH.IpPQ

Hef: Repligen -MNCIP 2 QUADRO 6

REPRESENTAÇÃO DE EPÍTOPES DE PEPTIDOS 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 MP 1 Acetyl-C K R I H I G P G R A P Y T T c MP 2 Acetyl-C K A I II I G P G R A F Y T T C MP 3 Acetyl-C K E A H I G P G R A P Y T T C MP 4 Acetyl-C K R I A I G P G H A F Y T T c MP 5 Acetyl-C K R I H A G P G R A F Y T T c MP 6 Acetyl-C K R I II I A P G R A F Y T T c MP 7 Acetyl-C tr X\. R I II I G A G R A F Y T T C MP 8 Acetyl-C K R I II I G P A R A F Y T T c MP 9 Acetyl-C K R I II I G P G A A F Y T T c MP 10 Aeetyl-C K R I H I G P G R G F Y T T c MP 11 Acetyl-C K R I II I G P G R A A Y T T c MP 12 Acetyl-C E R I H I G P G R A F A T T c 57« 35

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 25 62,385 -5 JU!v. Ref í Repligen - MNCIP 2 (H Quadro 7 / PEPTIDOS DE EXTREMIDADE CÍCLICA RP 142 YNKAKRIHIGPGRAFYTTKNIIGC RP 102 (sgg)tbksisigfgrap(ggsc) RP 108 HIGPGRAFYAT(GGSC) RP 129 [^RIIIIGPG^[3 RP 342 IHIGPGRAFYTC RP 175 QigpgraJ 3 RP 176 (sgg) igpgrae(ggsc) RP 177 £lGPGRAF]3 RP 116 £gpgrap23 Os aminoácidos entre parêntesis não são parte da sequência natural, -68- 35

62.385

Ref: Repligen- »1NCIP 2

Quadro 8 1. Ligação directa do peptido 2. Ligação de Competição 3. Ligação de competição com peptidos substituídos por alanil 4. Inibição de Syneytiá de vaccinia recombinante 5. Inibição de Syncytia de competição de peptido

6. Ensaio de neutralização de HIV 7. Ensaio de redução da capacidade infecciosa de HIV (IRA) -59- 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2

1 15

Anticorpo

Quadro 9

Reaetividade Peptídica RP142 RP70 RP342 RP135 RP339 BSA Nenhum .009 .005 .014 ND # 014 .029 F4.P7E4 .696 .487 .519 »46 3 .454 .030 F31.P2B10 1.74 1.65 ND . 08 ND . 030 F50.P8D1O 1.7 1.7 ND • 08 ND .030

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 6 0- 35 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 --5

Quadro 10

Anticorpo N8 de Svncytia +* Ab/NS .de jgyncytiá «Ab IIIB RF M F4.P7E4 sobrenadante 23/39 95/93 ND 10 /ug/ml ND ND 42/154 50 jag/ml ND ND 17/154 100 /ig/ml 128/239 ND 3/154 FE1/5C5 10 yug/ml 3/39 74/93 ND 50 /ig/ml 2/39 63/93 167/154 01 62.385

Ref; Repligen -MNCIP 2

1

Quadro 11

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30

ANTICORPOS MONOCLONAIS DE NEUTRALIZAÇAO ANTICORPO ESTIRPE ANTIGENE ISOTIPO MN VAC env EXTREMIDADE^ug/ml) EPÍTOPE reconheci:) (substituição de alcalina) F31.P2B10 C57/BL6 RP70 IgG2a 0.1 RIHIG F50.P8D10 A.SW RP70 IgG2a 0.1 IIHIG F52.P7F12 A.SW RP70 IgG2a 0.25-0.5 RIHIG F52.P8C9 A.SW RP70 IgG2a 0.1-0.25 RIHIG F52.P7B9 A.SW RP70 IgG2a 0.5 RIHIG F52.P5E9 A.SW RP70 IgG2a 0«25-0#5 RIHIG F52.P6E9 A.SW RP70 IgG2a 0.5 RIHIG F52.P8G10 A.SW RP70 IgG2a 0.25-0.5 RIHIG F52.P8F11 A.SW RP70 IgG2a 0.25 RIHIG F53.P1B6 C57BL/6 RP1Q2-KLH IgG3 10.0—20.0 IGPGRAF F53.P7C4 C57BL/6 RP102-ELH IgG3 1.0 IGPGRAF F54.P5F4 C57BL/6 RP108-KLH IgG3 5 HIGPGRAFY P56.P6B4 C57BL/6 RP1Q0-KLH IgGâb 2.5 IIIGPGRA F58.PfrF2 balb/c RP70 IgGl 1.0 IGPGR F59.P5B3 N RP70 IgGl 10 GFGRAF F59.P7E3 11 RP70 IgGl 10 GPGRAF F60.P5C2 » RP100-KLH IgG2b 1.0 IHIGPGR F64.P6G5 310.BR RP70 IgG2a 1.0 IXXGPGR 35 Η I. 71 -10000 ex. - 89/07 1 5 10 15 20 25 30 62.385 Ref: Re, PEPTIDO pligen -MNCIP 2 Quadro 12 COMPETIÇÃO DE PEPTIDO DE INIBIÇÃO DE FUSÃO MN MAB; R/V3- 53. 4 59.1 RP142 (MN) RIHIGPGRAFYTTK... + + ·> RPl35 (IIIB) SIRIQRGPGEAFVTIG... - + RPI41 (WMJ-2) ..SLSIGPGRAFRTRE..· + 4* RPl 16 (GPGRAF)s + RP123c UIIGPGRAF(c) + PP143 . .. SIÍIIGPGRAFYATG · . . + N.Do RP145 ... GIIIIGPGEAFYATG... + 4· RP162 ...SIPIGPGRAFYATG... «e. N.D. RPl 90 ...SITIGPGRAFYATG... φ + RP154 .. · RIHIGPGRAFIITTK... + RP150 ... SIYIGPGRAFIITTG... 4· + RP1G8 ...GIHIGPGEAIYATG *.. - N.Do RP146 .. · GIRIGPGRAVYTAR. .. + + RP144 ...GIRIGPGRAILATE... 4- RP149 . . .SIHIGPGRWSWTT.. . + - RP148 . . . SLYIGPGRRFÍIVTK... - - RP153 ...RLSIGPGRSFYATR... •f» +/- RP151 ..·GIAIGPGRTLYARE... "V - RP170 ...RITKGPGRVIYATG... - - RP152 .. .RVTMGPGRVWYTTG.. . ♦/- + RP147 . . ·GIYVGSGREVYTRII·.. - - MAB Cone. final fag/ml) MN; 1 10 IIIB; - 10 WMJ-2; 2.5 5 Ensaio de Competição de peptido: MAB Cone, (/ig/ml) 5 50 Cone. de Peptido = 50 /ig/ml -03- 35 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

62.385 Ilef: Repligen -MNCIP

Quadro 13(a) -5 JP.«P3CU_j%

Primeiro Nome Nome Corrente F27.P2F4 It/V3~ 27.1 F31.P2B10.C3 R/V3- 31.1* F31.P3C6.A9 R/V3- 31.2 F50.P8D10 R/V3- 50.1* F51.P1B8 r/Y3“ 51.1 F51.P7F6 R/V3- 51.2 F52.P5E9 R/y3- 52.1* F52.P6E9 R/V3~ 52.2* F52.P7B9 R/V3- 52.3* F52.P7F12 R/V3- 52.4* F52.P8C9 R/V3- 52.5* F52.P8F11 R/V3- 52.6* F52.P8G10 R/V3- 52.7* F53.P1B6 R/V3- 53.1* F53.P5G11 R/V3~ 53.2 F53.P6A1 R/V3- 53.3 F53.P7C4 R/V3- 53.4* F54.P5F4 R/V3- 54.1* F56.P6G4 R/yS- 56.1* F58.P2E1 R/V3“ 58.1* F58.P6F2 R/Y3- 58.2* F58.P8A5 R/V3- 58.3 F59.P5B3 R/V3- 59.1* + F59.P7E3 R/V3- 59.2* +- F59.P5G8 R/V3- 59.3* F59.P8B3 R/V3- 59.4* F59.P8G11 R/V3- 59.5 F60.P5C2 R/V3- 60.1* F60.P5IÍ9 R/V3- 60.2 F62.P5F10.A12 R/V3- 62.1* Θ4— 35 cn 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2

CuU% 1 Quadro 13(b) FG4.P1A9 R/V3- 64.1* P64.P1E7 R/Y3- 64.2* F64.P8H10 R/V3- 64.3 F64.P1F1.B10 R/V3- 64,4 F64.P8D4 R/V3- 64.5* F64.P4B6 R/V3- 64.6* F64.P2B8.A4 R/V3- 64.7* F64.P1G5 E/V3- 64.8* F64.P7G1 E/V3- 64.9* F64.P6G5 R/V3- 64.10' F64.P4C4 R/V3- 64.11

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 MN vac + (extremidade £10 yag/ml) IIIB vac + (extremidade <_10 yug/ml) -65· 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.385 Jtef: Repligen- MNCIP 2

Quadro 14

Xteactividade de quatro HMabs com gp 120 imobilizada com Con-A de três estirpes EIV-X Densidade óptica com estirpes indicada k IIMab HTLV-IIImT** MN rgP120/HIV-lspw J62*+ K24-3b 1.870 0.681 1.882 N70-23.a 2.018 1.149 2.007 N70-15.e 1.924 1.648 1.781 N70-19,b 1,710 1.307 1.397 A reactividade anterior de IIMbs com paredes revestidas com Con-A sem antigene foi < 0.100

e virus JS2 desenvolvido em meio livre de MN soro como nas Figs. 4 e 5 +**Pi,ecombinante glicosilado gp 120 de I-IIV-1 produzido em células de ovário de hamster chinês; incubada a 1 /ig/ml em paredes revestidas com Con-A -66- 35

62.385 P.ef: Repligen -MNCTP 2 1 Quadro 15 ELISA TC.B. gplSO IIIB gplGQ EE PB-1 IIIB PB-1 BE PB-1 MN gpl60 IIIB PB-1 IIIB PB—. MN IIIV+ sera 4/4 3/3 1/3 3/3 3/3 N.D* IIIV- sera 0/4 0/3 0/3 0/3 0/3 N.D# goat agp1160 (IIIB) sera N.D. 2/2 i/i N.D, N70-19.b 0/4 0/3 0/3 0/3 2/3 0/2 0/1* JUi N70-II.3a 0/4 0/3 0/3 0/3 0/3 sã. 0/1 0/1 K24-3B 0/4 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 o/l o/l Ν70-15.Θ 0/4 0/3 0/3 0/3 0/3 1/2 0/1 0/1 *muito : fraca positiiridade

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 30 35 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 Quadro 16

Exp. 1 Antigene de Captura

Teste Reagente PB-1 IIIB PB-1 EF PB-1 m BSA N ehhum • 162 .039 .041 -.003 IIIV- serum 1:1000 .282 .277 .251 .124 ÍIIV+ serum 1:1000 .299 .278 .308 .143 N70-19.b .241 .274 .659 .155 N70—II. 3 a .263 .250 .296 .181 K24-3B .294 .297 .302 .145 N70-15,e .261 .287 .298 .158 15

Mod. 71-10000 ex.-89/07 20 25 “6 8= 35 * 62.385

Ref ί Repligen “4ÍNCIP 2 1 5 10 15

Quadro 17

-C 5 S(1ÇQQ

Exp. 2 Antigene de Captura Teste reagente PB-1 aiiib PB-1_.„ RP BSA Nenhum .798 .086 .173 .065 HIV- soro 1:500 .491 .201 .233 .060 IIIV+ soro 1:500 .793 »45j6 .627 .088 N70-19.b .121 .170 .488 .054 N70-II.3a. .115 ,167 .164 .062 K24-3B .105 .190 .162 .077 Ν70-15.Θ .148 .204 .170 . 082

Mod. 71 -10000ex. 89/07 20 25 30 “09“ 35

62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 1 Quadro 18

Exp. 4 Exp. 5 Reagente Rp70 RP70 RP142 RP135 BSA Nenhum .002 N · D« Πΐν-soro 1:100 .038 .120 .139 .159 o 083 IlIV+soro 1:100 .312 . 308 ·239 .133 N70-19.¾ .266 .475 .574 .223 .164 N70-15.e .146 .110 .235 .147 ,058 N70-II.3a CM O 0 . 1 N.D. 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 35 - ‘ 62.385

Ref: Repligen -MNCIP 2 Quadro 19 4fV A \Λ Jjf ' ·. I *T7 Anticorpo Concentração õO^g/mL 10 yug/mL 5 yug/mL N7 0-19.1) 0 0 0 N70-15.e 68 79 M. D. IlIV-soro 1:200 1:400 104 95

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 -71- 35

Claims

62.385 Ref: Repligen- MtíCIP 2 -5-JÍM0

/ -REIVINDICAÇÕES- 1®·- Anticorpo capaz de neutralizar o prototi-po MN de HIV ou um virus de variante MN correspondente caracteriza-do por uma sequência de aminoácidos dentro do domínio de neutralização base do protótipo MN compreender a sub-sequência, nas posi-1 17 çães A -A do domínio que neutraliza o princípio, de resíduos de aminoácidos Jí-R-K-R-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-T-T-E e a correspondente subsequência de aminoácidos da variante MN compreender uma sequência completamente homóloga nos resíduos I-G-P-G-7 11 -R nas posições A -A e com pelo menos 36^ de homologia sobre os resíduos restantes da sub-sequência de prototipo MN» 2s.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser de neutralização ampla possuindo a neutralização a capacidade do anticorpo neutralizar pelo menos duas estir- 11 12 pes HIV que contêm a sequência de aminoácidos G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização base da proteína de invólucros de HIV por A*^ compreender R ou substituição de R por aminoácido estabili-zador e A compreender Á ou qualquer substituição de A por aminoácido estabilizador» 3®.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a sequência de aminoácidos compreender G-P-G-R-A.
45,- Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de aminoácido compreender G-P-G-R--A-P. 5®.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos compreender I-G-P-G-· -R-A. -72· 1 5 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2

6&,~ Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 de neutralização ampla caracterizado por a neutralização compreender a capacidade do anticorpo neutralizar, pelo menos, duas es- 6 7 tirpes HIV que contêm a sequência de aminoácidos I-A -A -G-P-G-R no domínio de neutralização base da proteína de invólucro MV, em 6 7 que A e A compreendem caia um, independentemente, qualquer amino·· ácido.
75,- Anticorpo de acordo com a reivindicação 10 2 ou 6, caracterizado por a sequência de aminoácidos compreender i-a6-a7-g-p-g-r-a. 8§.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 6 6, caracterizado por a sequência de aminoácidos compreender I-A -15 -I-G-P-G-R. Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 35
95.- Anticorpo de acordo com a reivindicação Q 7, caracterizado por a sequência de aminoácidos compreender I-A --I-G-P-G-R-A. IO®.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por uma das estirpes ser o prototipo III^ de MV. 1, do em de
115.- Anticorpo de acordo com a reivindicação caracterizado por a subseqnência da variante MN ser de aminoáci·· da fórmula; .1 .2 .3 ,4 .5 .6 T - _ _ _ .12 .13 .14 .15 .16 .17 A -A -A -A -A -A «I-G-P-G-R-A-- -A -A -A -A -A 1 6 12 17 * que A -A e A -A , independentemente são, cada um, resíduos aminoácidos.
125,- Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por A1 * K, T, A, R, V, P, S, ou I, A2 > R, T, I, M, ou K, A3 « K, R, T, N, ou A,

62.385 Ref: iíSepligen -MNCIP 2

10 15 Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 A - R, S, G, ou H, g A =1, M, ou L, A = E, P, S, Y, K, N ou R, A12- A, P, T, S, ou E, 13 A s F, V, I, W, ou L, A14= Y, II, V, ou F, Λ^β T, Y ou A .16 ,17 T, A, G, ou R, e A = lí, G, E, S, Q, R, T ou A* 13δ.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de estirpe IIIV compreender a fórmula de aminoácidos: .1 .2 .3 A .5 .6 .7 _T_ r Ώ .13 .14 .15 .16 ,17 A —A -A -A -A —A —A —G—P-G-R—A “A —A —A —A 1 7 13 17 Φ em que cada A -A e A -A , indeoendentemente ó qualquer resíduos de aminoácido ou ó eliminado. 14§.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 7 13 , 13 caracterizado por A ser I, Ã ser qualquer'aminoácido e cada 1 6 14 17 0 A a A e A a A ser, independentemente, eliminado em que a fór- 13 mula de aminoácidos compreende I-G-P-G-R-A-A · 25
155.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por A ser F, cada A e A ser, independentemente, qualquer aminoácido e cada A^- a A^ e a A^-7 ser, indepen dentemente eliminado em que a fórmula de aminoácidos compreende A7-G-P-G-R-A-F-A4 16£ Anticorpo de acordo com a reivindicação 30 5 6 7 13, caracterizado por A ser I, cada A e A ser, independentement 1 a ^ qualquer aminoácido e A a A* e A a A ser, independentemente, eliminado cm que a sequência de aminoácidos compreende I-A6 - A7-G-F-G-R-A 35
175,- Anticorpos de acordo com a reivindicaçã -74- 10 15 Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 13 62,385 Pef: Repligen -MNCIP 2 /*# ^7 5 7 ô , caracterizado por A e A ser» independentemente, I, e A ser qualquer aminoáeido em que a sequência de aminoácidos compreende i-a6-i-g-p~g-r-a 185*= Anticorpo de acordo com qualquer reivindicação 1-17 caracterizado por ser um anticorpo monoclonal,
195,- Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal humano,
205,- Anticorpo de acordo com qualquer das rei vindicações 1-17, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo quimérico possuindo uma região derivada de uma espécie que não o ser humano e uma região constante derivada de seres humanos*
215,- Anticorpo de acordo com quaisquer das reivindicações 1-17, caracterizado. por ser um anticorpo policlonal humano.
225,- Anticorpo de acordo com quaisquer das reivindicações 1-17 caracterizado por estar conjugado com um vexcu· lo.
235,- Método de identificação de um anticorpo de neutralização ampla de acordo com as reivindicações 2-17, caracterizado por compreender o teste do anticorpo para uma ou ambas de (a) a sequência de aminoáeido G-P-G-Á -A , dentro do domínio de neutralização base da proteína de invólucro HIV em que A** compreende R ou qualquer substituição de R por aminoáeido estabilizado e 12 A compreende A ou qualquer substituição de A por aminoáeido esta- ^ 6 7 bilizador ou (2) a sequência de aminoácidos I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutralização base da proteína de invólucros HIV em que cada A e A , compreende, independentemente, qualquer aminoáci-do e (b) a sua actividade biológica na neutralização de HIV, -75- 35 1 5 10 15 Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2 -5.JUÍ11F

24&.- Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender o teste do anticorpo num ou mais dos seguintes ensaios a) um ensaio ELISA ein que o anticorpo é testado para se ligar a um peptido ou proteína compreendendo (l) a se- quência de aminoácidos G-P-G-A -A dentro do domínio de neutrali- 11 zação base da proteína de invólucro HIV em que A compreende R ou qualquer substituição de R por aminoácido estabilizador e A compreende A ou qualquer substituição de A por aminoácido estabiliza-dor ou (2) a sequência de aminoácidos I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutralização base da proteína de invólucro MV em que ca-6 7 da À° e A compreende, independentemente, qualquer aminoácido; b) um ensaio de competição ELISA em que o anticorpo é testado para deixar de se ligar a um peptido ou proteína devido a competição de um segundo peptido ou proteína compreendendo a sequência de aminoácidos (l) ou (2) em que qualquer resíduos de aminoácidos da sequência é substituído por alanina; c) um ensaio de inibições de syncyntium em que os anticorpos quando adicionados a células infectadas de MV i-nibe a formação de synaytia em, pelo menos, 90$ em que MV compreen-de a sequência de aminoácidos (l) G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização base da proteína de invólucro MV em que A^ compreende R ou qualquer substituição de R por aminoácido estabiliza-dor e A compreende A ou qualquer substituição de A por aminoácido estabilizador ou (2) I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio de neutrali- 6 7 zação base da proteína de invólucro MV em que cada A e A compreende, independentemente, qualquer aminoácido; d) um ensaio de inibição de syncytium de competição em que o anticorpo é testado para deixar de ter inibição de syncytium por incubação do anticorpo com um peptido que possui a se·· quência de aminoácidos (l) ou (2) e adicionado a células infectadas IIIV; e) um ensaio de neutralização da infecção por MV em que o anticorpo, quando incubado com MV e adicionado a células susceptíveis de MV, neutraliza a infecção por MV; e -70- 35 y.w.

Λ 62.385 Ref: Repligen -MNCIP 2 f) Ensaio de redução das propriedades de infec-ção por UIV eia que o anticorpo» quando incubado com IIIV e adiciona do a células susceptíveis de IIIV reduz O título de IIIV.
252,- Virus de vacina recombinante capaz de expressar, após infecção de uma célula eucariótica, a proteína de invólucro HIV de uma primeira estirpe IIIV contendo o domínio de neutralização base de uma segunda estirpe HIV, compreendendo o vírus DMA que codifica a proteína de invólucro, incluindo o SNA uma sequência de MA que codifica o domínio de neutralização base da segunda estirpe HIV, estando a proteína de invólucro que codifica DNA sob o controlo transcricional de um promotor de vírus de vacina. 202,« Virus recombinante de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por a proteína de invólucro HIV que codifica o DNA do virus derivar de um vector recombinante compreendendo o vector uma sequência de DNA, que codifica, a proteína de invólucro, incluindo o DNA uma sequência de DNA que codifica o domínio de neutralização da segunda estirpe HIV e DNA capaz de provocar a integração da proteína de invólucro que codifica o DNA no vírus de vacina. 272,- virus recombinante de acordo com a reivindicação 26 caracterizado por o domínio de neutralização base compreender também, pelo menos, 5 aminoácidos de uma terceira estirpe IIIV.
283.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar uma quantidade eficaz do anticorpo preparado de acordo com a reivindicação 1, para o tratamento de um doente infectado com HIV, e um veículo farmacêuticamente aceitável.
203.- Processo de acordo com a reivindicação -77- 62.385

uma célula B com HIV. Ref: Repligen -MNCIP 2 28 caracterizado por o anticorpo ser produzido por imortalizada derivada de um doente humano infectado 30^·- Processo de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado por a célula B ser imortalizada por infec-ção com Epstein Barr Virus. 31&,- Método para a obtenção de um anticorpo monoclonal humano capaz de neutralizar HIV,_T caracterizado por com-preender os passos: proporcionar um anticorpo monoclonal anti-HIV; e testar o referido anticorpo para a capacidade de se ligar a um fragmento da proteína de invólucro gpl20 de nIVMN* coffi-preendendo o fragmento o domínio de neutralização base, sendo a ligação uma indicação da capacidade do referido anticorpo neutralizar IIIV^· 32a.- Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o anticorpo ser capaz, também, de neutralizar pelo menos, duas estirpes HIV que compreendem a sequência de amino- 11 12 ácidos (l) G-P-G-A -A dentro do domínio de neutralização base da 11 , proteína de invólucro 1XIV em que A compreende R por aminoacido 12 estabilizador e A compreende A ou qualquer substituição de A por 6 7 / aminoacido estabilizador ou (2) I-A -A -G-P-G-R dentro do domínio 0 de neutralização base da proteína de invólucro HIV, em que cada A e A compreende, independentemente, qualquer aminoacido.
333.- Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o fragmento compreender um de entre G-P-G-R-A 6 7 6 G-P-G-R-A-E, I-G-P-G-R-A, I-A -A -G-P-G-R-A, X“A -I-G-P-G-R-A, e R-R-!:-R~ I -II-I-G-P-G-R-A-F-Y-T-T-F. 34S.- Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por compreender também o passo antes ou a seguir ao passo do primeiro teste do anticorpo monoclonal testado *=» j o·*3 G2.385 Ref: Repligen -MNCIP 2 em segundo lugar para a capacidade de neutralizar IIIV^. 5 35®·»“ Método de acordo com a reivindicação 34, earaeterizado por 0 segundo passo do teste compreender a determinação da inibição da formação de syncytiúm., Lisboa, -5 jij;j ic;QQ Por REPLIGEN CORPORATION 0 AGENTE OFICIAL

fASCQ MARQUES LEITt Agente Ojidei 4e Propriedade Industriei (£«ríório-Arco de Concelçl·, 3, UMA Mod. 71 -10000 ex. 89/07 20 25 “TO™ 35