PL211212B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, białko, przeciwciało lub aptamer, regulatorowa sekwencja promotora, rekombinowana cząsteczka DNA, komórka rośliny transgenicznej i roślina transgeniczna, sposób identyfikacji i uzyskiwania czynnika wirulencji albo awirulencji patogenu i kompozycja diagnostyczna - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 370273 (22) Data zgłoszenia: 30.08.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

30.08.2002, PCT/EP02/009738 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

13.03.2003, WO03/020013 (11) 211212 (13) B1 (51) Int.Cl.

C12N 15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) C12N 15/03 (2006.01) C07K 16/16 (2006.01)

Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, białko, przeciwciało lub aptamer, regulatorowa sekwencja promotora, (54) rekombinowana cząsteczka DNA, komórka rośliny transgenicznej i roślina transgeniczna, sposób identyfikacji i uzyskiwania czynnika wirulencji albo awirulencji patogenu i kompozycja diagnostyczna (30) Pierwszeństwo:

31.08.2001, EP, 01120670.3 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

16.05.2005 BUP 10/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2012 WUP 04/12 (73) Uprawniony z patentu:

MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR

FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V,

Berlin, DE

KWS SAAT AG, Einbeck, DE (72) Twórca(y) wynalazku:

CHRISTIANE GEBHARDT, Frechen, DE

AGIM BALLVORA, Bonn, DE

MARIA RAFFAELLA ERCOLANO, Piano di

Sorrento, IT

JULIA WEISS, Cartagena, ES FRANCESCO SALAMINI, Koln, DE (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Witek Rafał WITEK TWARDOWSKA ŚNIEŻKO KANCELARIA RZECZNIKÓW

PATENTOWYCH Spółka Partnerska

PL 211 212 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest gen oporności R1, pochodzący z ziemniaka, jak również metody i materiały wykorzystujące gen i procesy identyfikacji lub tworzenia innych pokrewnych genów. Przedmiotem niniejszego wynalazku są także metody identyfikacji roślinnych czynników ochronnych, które są zdolne do indukcji genu R1 lub aktywności białka kodowanego przez ten gen. Ponadto, niniejszy wynalazek odnosi się do roślin transgenicznych, które stały się odporne na Zarazę Łodygową dzięki ekspresji transegnu R1.

Poniższy opis zawiera cytaty pochodzące z licznych dokumentów, oznaczonych w tekście nazwiskiem. Pełna bibliografia umieszczona jest na końcu tego opisu, bezpośrednio poprzedzając wykaz sekwencji i zastrzeżenia patentowe. Każdy, z cytowanych tutaj dokumentów (także opisy producentów, instrukcje, itp.), jest niniejszym włączony tutaj, jako odnośnik; jednak, nie przyjmuje się, że jakikolwiek cytowany dokument należy do wcześniejszego stanu techniki wobec do niniejszego wynalazku.

Zaraza Łodygowa jest najbardziej niszczycielską globalną chorobą upraw ziemniaków, która co roku jest przyczyną strat liczonych w miliardach dolarów (Kamoun et al. 1999). Tym nieobliczalnym patogenem jest Phytophthora infestans, grzyb oomycetous zakażający także pomidory (Judelson 1997). Całkowite zniszczenie zbiorów ziemniaka przez zarazę łodygową spowodowało „irlandzki głód ziemniaczany” w połowie XIX wieku zwalczały oporność uzyskaną za pośrednictwem genu R (Wastie 1991, Fry and Goodwin 1997). Indywidualna lub polowa oporność na zarazę łodygową została zidentyfikowana w dzikich gatunkach ziemniaka (Ross 1996). Ta oporność jest bardziej trwała niż oporność nabyta za pośrednictwem genów R lecz trudniej jest ją przenieść do odmian hodowlanych wykorzystując krzyżowanie oraz selekcję fenotypową. Zaraza łodygowa jest nadal pod kontrolą dzięki częstemu stosowaniu fungicydów, które tracą skuteczność poprzez selekcję izolantów odpornych na fungicydy.

Kilka genów R zostało zmapowanych na chromosomie ziemniaka przy użyciu markerów DNA (Leonards-Schippers et al. 1992, El-Kharbotly et al. 1994, 1996, Li et al. 1998, Ewing et al. 2000, Naess et al. 2000). R1 znajduje się na chromosomie V (Leonards-Schippers et al. 1992) w regionie, w którym zmapowano pojedyncze geny opornoś ci na Potato virus X (Ritter et al. 1994, De Jong 1997). Ten sam region zawiera główne obszary cech ilościowych (QTL) oporność na pasożytniczą cystę nicienia na korzeniu Globodera pallida (Kreike at al. 1994, Rouppe van der Voort et al. 1997, 2000) oraz oporność na zarazę łodygową (Leonards-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999, Collins 1999). Obecność gorącego miejsca zawierającego geny oporności sugeruje, że miały one wspólnych przodków i wyewoluowały poprzez miejscową duplikację genu, po której nastąpiło zróżnicowanie funkcjonalne (Leonards-Schippers et al. 1994, Leister et al. 1996, Oberhagemann et al. 1999, Gebhardt and Valkonen 2001). Jeżeli tak jest w rzeczywistości, to molekularne sklonowanie genu R1 powinno otworzyć możliwości zbadania kilku czynników na poziomie molekularnym i zmapowania regionu oraz przyczynienia się do jakościowej i ilościowej kontroli oporności na różne patogeny.

Zatem, technicznym problemem leżącym u podstaw niniejszego wynalazku było dostosowanie się do zapotrzebowania na roślinne geny oporności na patogeny oraz na ich sekwencje regulatorowe.

Rozwiązanie technicznego problemu zostało osiągnięte poprzez przedstawienie realizacji scharakteryzowanych w zastrzeżeniach i dalej opisanych poniżej. Według niniejszego wynalazku, R1, pierwszy gen oporności na zarazę łodygową, został sklonowany i scharakteryzowany na poziomie molekularnym. Gen został zidentyfikowany dzięki szczególnemu kombinacyjnemu pozycyjnemu klonowaniu i metodzie potencjalnego genu. Molekularna struktura genu pozwala na zaklasyfikowanie R1 do genów oporności zawierających konserwatywne motywy NBS-LRR i motyw suwaka leucynowego (Ellis et al. 2000, Dangl and Kones, 2001).

R1 został sklonowany przy zastosowaniu strategii pozycyjnego klonowania w powiązaniu z wyszukiwaniem potencjalnych genów wykazujących podobieństwo sekwencji DNA do znanych roślinnych genów oporności (Hammond-Kosack and Jones 1997, Ellis et al. 2000). Podobna metoda była z powodzeniem zastosowana w klonowaniu genów opornoś ci ziemniaka na Potato virus X (Rx1, Bendahmane et al. 1999) i cystę nicienia na korzeniu Globodera pallida (Gpa2, Van der Vossen et al. 2000). Wędrówka po chromosomie w kierunku R1 została zapoczątkowana od dwóch regionów markerowych SPUD237 i AFLP1, flankujących R1 w krótkich odległościach rzędu 0.1 cM. Wędrówka od markera AFLP1 okazała się bezowocna, ale było to wynikiem niedostatecznej ilości klonów BAC i YAC (Leister et al. 1997), które zawierały marker AFLP1. Zidentyfikowanie genomowych klonów, u ziemniaka, które posiadał y nakł adające się inserty, był a mo ż liwa dzię ki zastosowaniu technologii BAC w powiązaniu z użyciem makromacierzy klonów BAC. Metoda ta sprawdziła się w przypadku

PL 211 212 B1 ryżu (Nakamura et al. 1997, Yang et al. 1997, Yang at al. 1998) i pomidora (Folkertsma at al. 1998). Fizyczna mapa (figura 1) pokrywa przynajmniej 250 kb genomu ziemniaka. Około 200 kb stanowiło potencjalny region, który mógł zawierać gen R1, na podstawie powiązania bez rokombinacji z końcowymi markerami BAC. Potencjalny region był otwarty w kierunku regionu AFLP1 ponieważ pojedyncza rekombinacja oddzielająca R1 i AFLP1 nie była uwzględniona w fizycznej mapie. W częściowej sekwencji potencjalnego regionu zidentyfikowano gen oporności RGL podobny do fragmentu znanego genu, który posłużył do wykrycia rodziny genów, której członkowie byli obecni na obu chromosomach niosących allel wrażliwości r1 lub allel oporności R1. Sonda RGL, użyta w celu zidentyfikowania klonów cDNA i BAC zawierających R1, była częścią allela wrażliwości r1. Na podstawie oznaczenia allelo-specyficznego PCR uzyskanego z klonu cDNA kodującego część R1, pokazano że funkcjonalny przedstawiciel należący do rodziny potencjalnego genu był obecny w roślinach posiadających allel oporności R1 oraz że nie było go w podatnych roślinach. Potencjalny gen został sklonowany z BAC BA87d17 i był poddany stabilnej transformacji zawierających R1, była częścią allela wrażliwości r1. Na podstawie oznaczenia allelo-specyficznego PCR uzyskanego z klonu cDNA kodującego część R1, pokazano że funkcjonalny przedstawiciel należący do rodziny potencjalnego genu był obecny w roślinach posiadających allel oporności R1 oraz że nie było go w podatnych roślinach. Potencjalny gen został sklonowany z BAC BA87d17 i był poddany stabilnej transformacji do odmiany podatnej Desiree. Dopełnienie fenotypu R1 u kilku roślin transgenicznych pokazało, że potencjalny gen był w rzeczywistości genem R1.

Przedmiot wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd zdolny do nadawania oporności na patogen w roślinie, w której ten polipeptyd jest ekspresjonowany, w skład której to sekwencji wchodzi sekwencja wybrana z grupy:

(a) sekwencja nukleotydową kodująca białko zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2;

(b) sekwencja nukleotydową zawierająca obszary kodujące sekwencji DNA przedstawionej w SEQ ID NO: 1;

(c) sekwencja nukleotydową posiadająca przynajmniej 80% homologii do sekwencji nukleotydowej według (a) albo (b);

(d) sekwencja nukleotydową kodująca białko zdolne do nadawania oporności na patogen w roślinie, posiadające sekwencję aminokwasową przynajmniej w 60% identyczną z sekwencją aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową według (a) albo (b);

(e) sekwencja nukleotydową kodująca, co najmniej domenę suwaka leucynowego (LZ), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 308 do 329 w SEQ ID NO: 2, domenę nukleinowego miejsca wiązania (NBS), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 572 do 682 SEQ ID NO: 2 i/lub domenę zawierającą bogate w leucynę powtórzenie (LRR), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 780 do 1280 SEQ ID NO:2;

(f) sekwencja nukleotydową, która jest zdegenerowana, z uwagi na kod genetyczny, w stosunku do którejkolwiek sekwencji nukleotydowej od (a) do (e).

Korzystnie kwasem nukleinowym jest kwas nukleinowy kodujący polipeptyd zdolny do nadawania oporności na Phytophthora infestans.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający cząsteczkę wzmiankowanego kwasu nukleinowego.

Korzystnie wektor ten jest wektorem ekspresyjnym, w którym cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z jedną lub wieloma sekwencjami kontrolnymi umożliwiającymi transkrypcję i ewentualnie translację w prokariotycznej i/lub eukariotycznej komórce gospodarza.

Innym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca wzmiankowany wektor albo cząsteczkę wzmiankowanego kwasu nukleinowego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko R1 albo funkcjonalny fragment tego białka, zdolne do nadawania oporności na patogen w roślinie, w której ten polipeptyd jest ekspresjonowany, kodowane przez cząsteczkę wzmiankowanego kwasu nukleinowego. Innym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało lub aptamer specyficznie rozpoznający białko o sekwencji SEQ ID NO:2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka rośliny transgenicznej zawierająca cząsteczkę wzmiankowanego kwasu nukleinowego, która jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi umożliwiającymi transkrypcję i/lub ekspresję sekwencji DNA w komórkach roślinnych.

PL 211 212 B1

Następnym przedmiotem wynalazku jest roślina transgeniczna lub tkanka roślinna zawierająca wzmiankowane komórki roślinne.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest regulatorowa sekwencja promotora regulująca ekspresję genu zawierającego cząsteczkę wzmiankowanego kwasu nukleinowego; przy czym rzeczona sekwencja regulatorowa umożliwia lub moduluje ekspresję heterologicznej sekwencji DNA w odpowiedzi na infekcję patogenem i zawierająca sekwencję DNA przedstawioną w SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 1 do 2222 lub jej część zawierająca nukleotydy 1 do 2164.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowana cząsteczka DNA zawierająca wzmiankowaną sekwencję regulatorową.

Korzystnie sekwencja regulatorowa jest funkcjonalnie związana z sekwencją heterologicznego DNA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana wzmiankowaną regulatorową sekwencją, albo cząsteczką wzmiankowanego rekombinowanego DNA.

Innym przedmiotem wynalazku jest roślina transgeniczna, tkanka roślinna albo komórka roślinna, zawierająca wzmiankowaną sekwencję regulatorową, albo zawierająca wzmiankowaną cząsteczkę rekombinowanego DNA.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji i uzyskiwania czynnika wirulencji albo awirulencji patogenu, charakteryzujący się tym, że zawiera następujące etapy:

(a) screening białka R1, albo jego fragmentu, wobec peptydu lub białka z biblioteki ekspresyjnej patogenu, odbywający się w systemie odczytu w warunkach umożliwiających oddziaływanie białka i peptydu w tym systemie odczytu;

(b) identyfikacja lub weryfikacja cDNA, które powoduje supresję albo aktywację systemu odczytu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca wzmiankowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, wzmiankowany wektor, wzmiankowane białko, wzmiankowane przeciwciało lub aptamer, wzmiankowaną sekwencję regulatorową, albo wzmiankowaną cząsteczka rekombinowanego DNA oraz ewentualnie odpowiednie środki do wykrywania lub odpowiednie środki do hodowli komórki i tkanki roś linnej.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek ujawnia cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd zdolny do nadawania oporności na patogen w roślinie, w której polipeptyd ten ulega ekspresji, wyżej wymieniona cząsteczka kwasu nukleinowego składająca się lub taka, w której skład wchodzi sekwencja nukleotydów wyselekcjonowana z grupy składającej się z: (a) sekwencja nukleotydową kodująca przynajmniej dojrzałą postać białka (R1), w którego skład wchodzi sekwencja aminokwasową podana w SEQ ID N: 2:

(b) sekwencja nukleotydową, która zawiera co najmniej jeden lub więcej regionów kodujących sekwencji DNA przedstawionej w SEQ ID NO: 1:

(c) sekwencja nukleotydową hybrydyzująca z komplementarną nicią sekwencji nukleotydowej, zdefiniowanej w (a) i (b), w warunkach wysokiej sowistości reakcji;

(d) sekwencja nukleotydową kodująca białko, pochodzące od białka kodowanego przez sekwencję nukleotydową (a) lub (b), uzyskane poprzez substytucję, delecję i/lub dodanie jednego lub kilku aminokwasów z aminokwasowej sekwencji kodowanej przez sekwencję nukleotydową (a) lub (b);

(e) sekwencja nukleotydową kodująca białko, którego sekwencja aminokwasową jest co najmniej w 60% identyczna z sekwencją aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową (a) lub (b);

(f) sekwencja nukleotydową, która koduje przynajmniej domenę suwaka leucynowego (LZ), której odpowiadają aminokwasy w pozycji 308-329 SEQ ID NO: 2, domenę nukleinowego miejsca wiązania (NBS), której odpowiadają aminokwasy w pozycji 572-682 SEQ ID NO: 2 i/lub domenę zawierającą bogate w leucynę powtórzenie (LRR), której odpowiadają aminokwasy w pozycji 780-1280 SEQ ID NO:2;

(g) sekwencja nukleotydową kodująca część białka R1 zawierającą epitop, kodowaną przez sekwencję nukleotydową (a) lub (b);

(h) sekwencja nukleotydową, w której skład wchodzi co najmniej 15 kolejnych nukleotydów którejkolwiek z nukleotydowej sekwencji od (a) do (g);

(i) sekwencja nukleotydową kodująca polipeptyd, w którego skład wchodzi jeden lub wiele motywów przedstawionych w SEQ ID NOs: 10 i 12, na figurze 4 lub aminokwasową sekwencja LHD:

(j) Sekwencje DNA uzyskiwane poprzez screening odpowiedniej biblioteki, w warunkach wysokiej swoistości reakcji, z wykorzystaniem sondy składającej się z przynajmniej 17 kolejnych nukleotydów nukleotydowej sekwencji któregokolwiek z SEQ ID NOS: 1 lub 5 do 8;

(k) sekwencja nukleotydową kodująca fragment przynajmniej 6 kolejnych aminokwasów białka kodowanego przez sekwencję nukleotydową (a) lub (b); i

PL 211 212 B1 (1) sekwencja nukleotydową, która jest zdegenerowana (degeneracja kodu genetycznego) w stosunku do którejkolwiek sekwencji nukleotydowej (a) do (i).

Zgodnie z pierwszym aspektem niniejszego wynalazku, została przedstawiona cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd, który jest zdolny do nadawania oporności przeciwko patogenom, takim jak grzyby, w roślinach, w których ten polipeptyd jest ekspresjonowany.

Według niniejszego wynalazku, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być przedstawione w formie rekombinowanej lub w postaci wolnej albo prawie całkowicie pozbawionej kontekstu kwasu nukleinowego lub genów pochodzących od wymienionych tutaj gatunków, zawierające jedynie sekwencję kodujące polipeptyd wykazujący pożądaną aktywność. Cząsteczki kwasu nukleinowego (i ich kodowane produkty polipeptydowe) mogą także być (i) izolowane i/lub uzyskiwane z ich naturalnego środowiska (jednak niekoniecznie w postaci oczyszczonej per se), lub (ii) uzyskiwane w zasadniczo czystej postaci lub w postaci homogennej.

Według niniejszego wynalazku, kwas nukleinowy może być w postaci cDNA, RNA, genomowego DNA, najlepiej w postaci nienaruszonego genu, i może być całkowicie lub częściowo syntetycznymi konstruktami. Wyszczególniona sekwencja DNA jest przedstawiona, np. w odnośniku do figury lub SEQ ID NO, chyba, że kontekst wymaga przedstawienia odpowiednika RNA, gdzie U zastępuje T. Przedstawione są także nici komplentarne różnych sekwencji, które mogą być wykorzystane w eksperymentach z sondami lub obniżaniu aktywności sekwencji.

Szczególnym aspektem niniejszego wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego, w której skład wchodzi sekwencja lub część sekwencji pokazanej w SEQ ID NO:1, z uwzględnieniem (tam, gdzie jest to stosowne) zarówno regionów kodujących i/lub niekodujących. W SEQ ID NO:1 znajduje się duża otwarta ramka odczytu (ORF). Porównanie genomowej sekwencji z sekwencjami cDNA pokazało, że gen zawiera trzy eksony i trzy introny; patrz przykład 5 i figura 4. Przypuszczalna sekwencja polipeptydu R1 jest oznaczona SEQ ID NO:2 i pokazana na figurze 4. R1 składa się z 1293 reszt aminokwasowych o masie molekularnej 149.4 kDa. Ten aspekt niniejszego wynalazku dotyczy szczególnych cząsteczek kwasu nukleinowego, w których skład wchodzą te kodujące białkowy produkt R1 i cDNA, zasady 2223-6321 bez zaznaczonych intronów (4878-4970 i 6130-6229 włącznie). Ciekawe, że pierwszorzędowa struktura R1 jest podobna do L. ZipI NBS-LRR klasy białek R (Hammond-Kosack and Jones 1997). Na podstawie wydedukowanej białkowej sekwencji, R1 zakwalifikowano do klasy ZipI/NBS/LRR roślinnych genów oporności (Hammond-Kosack and Jones 1997). Uważa się, że motyw suwaka leucynowego (L.Zip), znajdujący się w N-końcowym regionie, bierze udział w dimeryzacji i oddział ywaniach z innymi biał kami. Znajduj ą ca się poniż ej (w kierunku 3') domena domniemanego miejsca wiązania nukleotydu (NBS) może brać udział w ścieżce przekazywania sygnałów, która prowadzi do rozpoczęcia odpowiedzi opornościowej. C-końcowa domena zawierająca bogaty w leucynę region (LRR), odpowiada konsensusowej sekwencji cytoplazmatycznej domeny (LRR) opisanej przez Jones and Jones (1997), może odgrywać rolę w oddziaływaniach białko-białko oraz w wiązaniu ligandu. Udowodniono, że domeny LRR alleli genu L oporności na flax rust są odpowiedzialne za rozpoznanie specyficznych szczepów patogenu (Ellis et al. 1999). Przewidywane, in silico, cztery miejsca myrystylacji i 43 miejsca fosforylacji w sekwencji R1, sugerują prawdopodone zakotwiczenie białka R1 w bł onie plazmatycznej oraz sugerują odbywanie się procesów fosforylacji/defosforylacji, które biorą udział w przekazywaniu sygnałów (Dangl and Jones 2001).

R1 jest położony na krótszym ramieniu chromosomu V (Leonards-Schippers et al. 1992, Dong et al. 2000) i jego sekwencja wykazują pokrewieństwo do genu oporności Prf, pochodzącego od pomidora, na Psudomonas syringae, który jest położony na 5 chromosomie pomidora wewnątrz zgrupowania Pto/Fen genu oporności (Salmeron et al. 1996). Chromosom piąty ziemniaka i pomidora są ze sobą współliniowe, za wyjątkiem paracentrycznej inwersji krótkiego ramienia (Tanksley et al. 1992). Region StPto u ziemniaka, który odpowiada Pto/Fen, znajduje się dalej niż 10 cM od R1 (Leister et al. 1996), co wyklucza zatem możliwość, że R1 i Prf znajdują się we współliniowym regionie genomu. Jednak tak właśnie jest, gdy rozważa się gen Bs4, pochodzący od pomidora, nadający oporność na bakteryjny patogen Xanthomonas campestris. Położenie regionu z ziemniaka, który odpowiada Bs4, można wywnioskować na podstawie bliskiego połączenia (1 cM) pomiędzy Bs4 i markerem TG432 (Ballvora et al. 2001), który znajduje się 3.8 cM dalej od GP21 na molekularnej mapie pomidora (Tanksley et al. 1992). Ten region chromosomu 5 pomidora, który rozciąga się dalej od markera GP21 powinien być współliniowy z przedziałem GP21 - GP179 ziemniaka, który zawiera R1, jeżeli weźmie się pod uwagę paracentryczną inwersje między dwoma genomami.

PL 211 212 B1

Oba geny oporności na Potato Virus X, Rx2 i Nb są także umiejscowione podobnie jak R1 (Ritter et al. 1991, Leonards-Schippers at al. 1992, De Jong et al. 1997). Gen Rx2 został sklonowany, i podobnie jak R1, jest członkiem klasy L.Zip/NBS/LRR genów oporności (Bendahmane et al. 2000). Sekwencje tych dwóch genów oporności są w 32% identyczne, zatem są to raczej dwaj różni przedstawiciele tej samej super rodziny genów. Nb jest położony w tym samym przedziale GP21 SPUD237 (De Jong et al. 1997), który nie zawiera R1 i jest zatem genetycznie oddzielony od R1.

Dalszy aspekt niniejszego wynalazku ujawnia aktywne, homologiczne warianty sekwencji R1, które mogą, na przykład, być mutantami lub innymi pochodnymi lub też naturalnie występującymi homologami R1, takimi jak odmiany allelowe, paralogowe (pochodzące z tego samego gatunku ale z innego regionu, np. pseudo allele w połączonych regionach), lub ortologowe (spokrewnione geny pochodzące z różnych gatunków). Ich przykłady są przedstawione poniżej. W każdym przypadku warianty kodują produkt, który jest homologiczny (podobny) do R1, który może być wyizolowany lub wytworzony na podstawie sekwencji i posiada zdolność nadawania oporności przeciwko jednemu lub wielu patogenom.

Aktywność genu oporności może być sprawdzona przy zastosowaniu znanych konwencjonalnych metod zawartych w obecnym stanie techniki, odpowiednich do charakteru badanej oporności. Przykładowe metody znajdują się w następujących publikacjach: bakteryjne (Grant, (1995) Science 269, 843-846); metody wykorzystujące grzyby (Dixon, (1996) Cell 84, 451-459; Jones, (1994) Science 266, 789-793; Thomas, (1997) The Plant Cell 9, 2209-2224; metody wykorzystujące nicienie i wirusy (Whitham, (1994) Cell 78, 1101-1115). Aktywność jest najczęściej sprawdzana poprzez dopełnienie (komplementację) roślinnej cechy; patrz przykład 4. Można to osiągnąć używając wyizolowanego genu albo na przykład poprzez sprzężenie domniemanego aktywnego warianta z promotorem i terminatorem ekspresji w roślinach i przekształcić ją we wrażliwą roślinę, która jest pozbawiona danej cechy oporności. Następnie aktywność warianta R1 potwierdza się poprzez poddanie rośliny działaniu odpowiedniego patogenu. Ewentualnie, w celu sprawdzenia aktywności warianta R1, można przeprowadzić test, w którym wykorzystuje się przejściową transfekcję, analogiczny do testu wykonanego przez Mindrinos, (1994) Cell 78, 1089-1099. Skrótowo, domniemany aktywny wariant R1 jest ekspresjonowany wspólnie z genem pochodzącym od patogenu (oba znajdują się na jednym plazmidzie), który jest induktorem specyficznej oporności domniemanego homologu R1 oraz genem reporterowym (np. GUS). Jeżeli ciągła ekspresja genu pochodzącego od patogenu powoduje aktywację wariantu, to nastąpi HR i aktywność genu reporterowego będzie zahamowana. Jeżeli aktywność nie została zainicjowana, to gen reporterowy będzie wykrywalny.

Podobieństwo czy homologia między wariantem i R1 może być określona i stwierdzona dzięki użyciu programu TBLASTIN, Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-10, który jest standardem w obecnym stanie techniki, lub, co może być preferowane, przy użyciu standardowego programu BestFit, który jest częścią Wisconsin Package, Version 10, January 1999, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711), który był używany do obliczenia homologii sekwencji w niniejszym zgłoszeniu. Można także zastosować oprogramowanie DNASTAR, które wykorzystuje metodę CLUSTAL z tabelą ważności reszt (kara za przerwę 10, długość przerwy 10). Homologia (lub podobieństwo, lub identyczność) może być na poziomie sekwencji nukleotydowej i/lub ekspresjonowanej sekwencji aminokwasowej. Preferencyjnie, sekwencja nukleotydową i/lub aminokwasową wykazuje homologię z sekwencją kodującą lub sekwencją kodowaną przez sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 1 albo inne sekwencje przedstawione tutaj, najlepiej wykazujące przynajmniej 50%, lub 60%, lub 70%, lub 80% homologię, a najlepiej żeby wykazywały przynajmniej 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% homologię. Homologia może rozciągać się na całej długości odpowiedniej sekwencji przedstawionej tutaj, albo najlepiej aby dotyczyła sąsiednich sekwencji o długości około lub dłuższych niż około np. 20, 100, 200, 300, 500, 600 lub też dłuższych sekwencji aminokwasów lub kodonów, w porównaniu z odpowiednią sekwencją aminokwasową lub nukleotydową.

Uważa się, że w genomie ziemniaka istnieją więcej niż dwa homologii R1. Jest prawdopodobne, że jeden lub więcej tych homologów to geny R1 działające przeciwko wirusom, grzybom, bakteriom lun nicieniom.

Naturalnie występujące warianty R1 mogą być izolowane bez żadnych problemów, w świetle niniejszego wynalazku, z odpowiednich roślin. Naturalnie występujące warianty R1 mogą być izolowane np. z genomowego DNA lub cDNA. Domniemane geny oporności można uzyskać wykorzystując materiały (np. primery lub sondy) oparte na szczególnych regionach R1, na przykład wskazanych na figurze 4. W dołączonych przykładach przedyskutowano fakt, że oczekuje się, iż zidentyfikowany,

PL 211 212 B1 według niniejszego wynalazku, gen R1 pochodzący z ziemniaka określi nową klasę roślinnych genów oporności. Odpowiednie geny kodujące białka wykazujące podobne właściwości powinny być zatem obecne także w innych roślinach.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być uzyskiwane za pomocą hybrydyzacji wyżej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego z cząsteczką(ami) kwasu nukleinowego pochodzącą z dowolnego źródła. Cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z wyżej opisanymi cząsteczkami kwasu nukleinowego mogą ogólnie pochodzić od jakiejkolwiek rośliny posiadającej takie cząsteczki, najlepiej od roślin dwuliściennych, w szczególności od jakiejkolwiek rośliny będącej w kręgu zainteresowania rolnictwa, ogrodnictwa lub leśnictwa, takich jak rośliny uprawne, a mianowicie rośliny z rodziny Solanaceae, takie jak ziemniak i pomidor ale także od roślin takich jak maniok, rośliny strączkowe, rośliny oleiste, takich jak soja, rośliny wykorzystujące sacharozę jako substancję zapasową, takich jak burak cukrowy lub trzcina cukrowa, drzewa, rośliny ozdobne jak również rośliny, które mogą być użyte do produkcji biomasy, energii odnawialnej lub materiałów budowlanych, takie jak trawa batystowa ect. Zatem ujawniono dalszy aspekt niniejszego wynalazku przedstawiający metodę identyfikacji i/lub klonowania homologów genu R1 z roślin. Metoda ta wykorzystuje całą lub część sekwencji nukleotydowej opisanej powyżej. Zatem jedna z realizacji niniejszego wynalazku przedstawia informację dotycząca sekwencji nukleotydowej, która może zostać wykorzystana w przeszukiwaniu baz danych (np. ESTs lub STSs lub innej informacji dotyczącej genomowych sekwencji) w celu znalezienia homologicznych sekwencji, produktów ekspresji, które mogą być sprawdzone pod kątem posiadania aktywności oporności na patogeny, np. wykorzystując metody oparte przejściowych testach przedstawionych w opisie niniejszego wynalazku lub metody oparte na konwencjonalnych testach fenotypowych wykonywanych na roślinach transgenicznych. Ewentualnie sondy oparte na sekwencji mogą być użyte np. w biocie Southern'a. Na przykład DNA może być uzyskane z komórek pochodzących z roślin, wykazujących odpowiednią cechę oporności, i trawione różnymi enzymami restrykcyjnymi. Fragmenty restrykcyjne mogą być potem rozdzielone (np. przez elektroforezę w żelu agarozowym) przed denaturacją i przeniesione na membranę nitrocelulozową. Znakowana sonda może hybrydyzować z fragmentami DNA znajdującymi się na membranie i można określić stopień przyłączenia.

Wstępne eksperymenty można przeprowadzić prowadząc hybrydyzację w warunkach niskiej swoistości reakcji. Najlepiej jest prowadzić hybrydyzację w takich warunkach swoistości reakcji, aby umożliwiły hybrydyzację tylko z kilkoma sekwencjami, które mogą być potem dalej analizowane. Na przykład do hybrydyzacji można wykorzystać roztwór, w którego skład wchodzi: 5x SSC (gdzie

SSC=0.15 M chlorek sodu; 0.15 M cytrynian sodu; pH 7), 5x roztwór Denhardfa, 0.5-1.0% SDS, 100 μg/ml zdenaturowanych fragmentów DNA spermy łososia, 0.05% pirofosforan sodu i do 50% formamidu. Hybrydyzacja jest prowadzona przez co najmniej sześć godzin w temperaturze 37-42°C. Po hybrydyzacji membrany są przemywane w następujący sposób: (1) roztworem 2x SSC i 1% SDS przez 5 minut w temperaturze pokojowej; (2) roztworem 2x SSC i 0.1% SDS przez 15 minut w temperaturze pokojowej; (3) roztworem 1x SSC i 1% SDS przez 30-60 minut w 37°C; (4) roztworem 1x SSC i 1% SDS przez 2 godziny w 42-65°C, zmieniając roztwór co 30 minut. Jeden ze znanych wzorów, stosowany do obliczenia warunków swoistości reakcji potrzebnych do osiągnięcia hybrydyzacji pomiędzy cząsteczkami kwasu nukleinowego o określonej homologii sekwencji, pochodzi z (Sambrook et al, 1989): Tm = 81.5°C + 16.6Log [Na⁺] + 0.41 (% G + C) - 0.63 (% formamidu) - 600/#par zasad w dupleksie. W celu zilustrowania powyższego wzoru, policzona została Tn,: używając [Na⁺] = [0.368] i 50% formamid, 42% zawartość GC w sondzie o długości 200 par zasad, Tm wynosi 57°C. Tm dupleksu obniża się o 1-1.5 stopnia z każdym obniżeniem stopnia homologii o 1%.

Zatem cele, których sekwencje są identyczne w więcej niż 75% mogą zostać wykryte przeprowadzając hybrydyzację w temperaturze 42°C. Taka sekwencja byłaby uważana za wysoce homologiczną z sekwencją kwasu nukleinowego, będącą przedmiotem niniejszego wynalazku. Powszechnie wiadomo, że zwiększa się stopniowo warunki swoistości reakcji hybrydyzacji aż do momentu gdy pozostanie tylko kilka pozytywnych klonów. Inne odpowiednie warunki to na przykład, dla wykrycia sekwencji o 80-90% identyczności, hybrydyzacja przez noc w temperaturze 42°C w obecności 0.25 M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% siarczan dekstranu i końcowe przemycie w temperaturze 55°C roztworem 0.1x SSC, 0.1% SDS. Odpowiednie warunki do wykrycia sekwencji, które są identyczne więcej niż w 90%, to hybrydyzacja przez noc w temperaturze 65°C w obecności 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% siarczan dekstranu i końcowe przemycie w temperaturze 60°C roztworem 0.1x SSC, 0.1% SDS.

PL 211 212 B1

Wiązanie sondy z docelową cząsteczką kwasu nukleinowego (np. z DNA) można mierzyć stosując różne metody znane i dostępne dla ekspertów z dziedziny. Na przykład sondy mogą być znakowane radioaktywnie, fluoroscencyjnie lub enzymatycznie. Inne metody, które nie wykorzystują znakowania sond, to amplifikacja metodą PCR (w odpowiednich przypadkach RACE PCR), test na ochronę przeciwko RNazie oraz allelo-specyficzne sondy nukleotydowe.

Następnym krokiem po hybrydyzacji, która zakończyła się identyfikacją pozytywnych klonów, jest izolacja kwasu nukleinowego, który hybrydyzował, polegająca na jednokrotnym lub kilkukrotnym cyklu PCR lub amplifikacji przez klonowanie do wektora, który jest zdolny do replikacji w odpowiednim gospodarzu.

W każdym przypadku, gdy chodzi o klony (np. lambda, kosmid, plazmid, BACs, biBACS) lub fragmenty zidentyfikowane podczas wyszukiwania, mogą być one wydłużane albo uzupełniane. Na przykład, jeżeli istnieje podejrzenie, że są one niekompletne, można sięgnąć po pierwotne źródło DNA (np. biblioteka klonów, preparacja mRNA ect.) i wyizolować brakujące fragmenty, np. wykorzystując do tego celu sekwencje, sondy lub primery uzyskane na podstawie sekwencji już uzyskanych fragmentów, aby zidentyfikować inne klony zawierające nakładające się sekwencje (patrz np. „Principles of Genome Analysis” autorstwa S.B. Primrose (1995) Pub. Blackwell Science Ltd., Oxford, UK).

Cząsteczki kwasu nukleinowych lub odpowiadające im geny mogą być następnie poddane testom funkcjonalnym, na przykład, opisanym w przykładach. Oto jeden ze schematów izolacji homologów R1:

I) utworzyć populację, w której cecha oporności uległa segregacji.

II) amplifikować DNA pochodzące od pojedynczych przedstawicieli populacji, metodą PCR, używając primerów stworzonych na podstawie sekwencji R1 (ale nie na podstawie konserwatywnych motywów genu R1).

III) sprawdzić produkty PCR (albo przez bezpośrednią analizę sekwencji lub przez restrykcyjne trawienie), na polimorfizm sekwencji, który pokrywa się z cechą R. Zidentyfikować odpowiednią polimorficzną sekwencję markera.

IV) wyizolować pełną sekwencję kodujące genu polimorficznego. Można to osiągnąć używając odpowiednią sklonowaną bibliotekę lub przez amplifikowanie tej sekwencji stosując końcowe primery 5' i 3' R1. W każdym przypadku zidentyfikowany polimorficzny produkt PCR, lub informacja o sekwencji uzyskana na podstawie tego produktu, jest wykorzystywany do identyfikacji genu.

Aktywność kodowana przez gen oporności może być następnie sprawdzona wykorzystując powyższy opis lub przytoczone przykłady.

Bardziej specyficzna metoda opiera się na fakcie, że homologiczne geny-R1 mogą być łączone w zgrupowania. Grupowanie genów R w ziemniaku został o już opisane (Leister et al. 1996; De Jong et al. 1997). Jedno z większych zgrupowań genu R, u ziemniaka, znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu V. Gorące miejsce oporności na chromosomie V, oprócz R1, zawiera główne QTL (Quantitative Trait Loci) dla oporności na Phytophthora infestans (Leonard-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999, Collins et al. 1999) oraz dla oporności na atakującą korzeń cystę nicienia Globodera pallida (Kreike et al. 1994, Rouppe van der Voort et al. 1997, 200). Zmapowanie tego regionu pozwoliło na ustalenie silnego związku pomiędzy markerami znajdującymi się w przedziale 0.8 cM SPUD237 - GP179, który zawiera R1 oraz oporność ulistnienia i bulwy na zarazę łodygową, co wspiera bliskie połączenie pomiędzy R1 i czynnikami kontrolującymi ilościową oporność na zarazę łodygową. Zaobserwowane połączenie sugeruje, że R1 i czynniki kontrolujące ilościową oporność na zarazę łodygową to allele tego samego genu lub przedstawiciele zgrupowanej rodziny genu (Leonard-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999). Pierwsza analiza molekularna regionu R1 pokazała, że R1 jest przedstawicielem rodziny genu i że jest on obecny w postaci dodatkowej kopii znajdującej się we wstawce DNA na chromosomie niosącym R1. Podobnego odkrycia dokonano w przypadku regionu Rpm1 z Arabidopsis (Stahl et al. 1999). Gen R1, pochodzący z dzikiego gatunku S. demissum, mógł być wprowadzony do genomu S. tuberosum poprzez heterogeniczny chromosomowy crossing-over. Często obserwuje się heterogeniczne tworzenie się par chromosomowych w przypadku krzyżowania między dzikim i uprawnym gatunkiem Solarium (Singh et al. 1989). Drugi przedstawiciel rodziny genu R1, wykazujący wysoką homologię i posiadający dwa allele r1.1 i r1.2, jest położny w fizycznej bliskości R1. Istnieje potrzeba przeprowadzenia dalszych badań funkcjonalności tego genu. Dostępność sekwencji R1 pozwala na identyfikację innych przedstawicieli rodziny R1 z regionu GP21 - GP179 lub też z innych regionów nieobjętych jeszcze fizyczną mapą i/lub innych części genomu

PL 211 212 B1 ziemniaka. Obecnie można izolować allelowe warianty S. tuberosum oraz homologii występujące w innych gatunkach Solanaceae biorące udział w ilościowej oporności na P. infestans.

Zatem korzystną realizacją niniejszego wynalazku jest roślina oporna na Phythophthora infestans, która ekspresjonuje cząsteczkę kwasu nukleinowego opisanego w niniejszym wynalazku.

Oddziaływanie między R1 i patogenem zarazy łodygowej jest zgodne z koncepcją gen-za-gen (Person et al. 1962, Flor 1971). Przekazanie pojedynczego genu wystarczyło aby wywołać u wrażliwej rośliny bardzo silną odpowiedź opornościową, która była wynikiem infekcji odmiany P. infestans posiadającej niewirulentny gen AvR1 (wszystkie odmiany oprócz tych o specyficzności odmiany 1). AvR1 oddziela się jako pojedynczy dominujący czynnik w potomstwie szczepów P. infestans, będącym heterozygotą ze względu na AvR1, i został zmapowany na połączeniu grupy IV mapy molekularnej P. infestans (Van der Lee et al. 2001). Jak dotąd nie sklonowano żadnego awirulentnego czynnika z P. infestans. Dalsze charakteryzowanie R1 na poziomie molekularnym oraz sklonowanie genu AvR1 powinno umożliwić wyjaśnienie w jaki sposób białko oporności rozpoznaje awirulentną cząsteczkę efektorową. Sklonowanie genów oporności na zarazę łodygową, które rozpoznają awirulentne czynniki, inne niż AvR1, może pozwolić na identyfikację molekularnych motywów, które określają specyficzność efektorowego rozpoznania i mogą pomóc w stworzeniu białek R, które nadawałyby szerszą i długotrwałą oporność na zarazę łodygową. Inne, połączone, warianty R1 (dostarczające różnych cech R) mogą być izolowane używając wyżej opisanych metod, ale DNA użyte do wstępnej amplifikacji jest uzyskiwane od przedstawicieli populacji, w której pożądana cecha R oddziela się wspólnie z samym R1 (lub wariantem R1).

Wynalazcy zauważyli, że sekwencja R1 jest podobna do sekwencji niespokrewnionego genu Prf, który nadaje u pomidora oporność przeciwko bakteryjnemu patogenowi, np. P. syringae (Salmeron et al. 1996). W świetle tej informacji wydaje się, że sekwencja R1 może być zmodyfikowana, np. przez ukierunkowaną lub przypadkową mutagenenezę, w celu uzyskania mutantów R1 lub innych pochodnych, które mogą przekazywać oporność na (np. włączać ją) patogeny, które całkowicie różnią się od P. infestans. Poniższy opis dotyczy sposobu w jaki można tego dokonać, wykorzystując wyżej opisane metody oznaczenia przejściowej ekspresji mutantów R1.

Najlepiej, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest mutantem lub inną pochodną, jest uzyskiwana, albo bezpośrednio lub pośrednio (np. przez amplifikację lub replikację), z pierwotnego kwasu nukleinowego odpowiadającego całej lub części sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 1 lub innym sekwencjom przedstawionym tutaj. Zatem ujawniono następny aspekt niniejszego wynalazku dotyczący metody stworzenia kwasu nukleinowego kodującego pochodną R1, gdzie modyfikuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą R1. Pochodna może zawierać zmiany w cząsteczce kwasu nukleinowego, które nie mają żadnego wpływu na zakodowaną sekwencję aminokwasową (np. zdegenerowany ekwiwalent). Zmiany w sekwencji, mające na celu stworzenie mutanta lub pochodnej, mogą być pojedynczą lub kilkukrotną addycją, wstawieniem, delecją lub substytucją jednego lub więcej nukleotydów w kwasie nukleinowym, co prowadzi do addycji, wstawienia, delecji lub substytucji jednego lub wielu aminokwasów w kodowanym polipeptydzie. Oprócz jednej lub wielu zmian w sekwencji R1, wariant kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową, która zawiera dodatkowe aminokwasy znajdujące się na C-końcu i/lub N-końcu.

Szczególnie uwzględnione są części lub fragmenty (jakkolwiek stworzone), odpowiadające częściom dostarczonej sekwencji, które kodują polipeptydy o aktywności biologicznej, na przykład oporność na patogen albo zdolność do wytworzenia lub wiązania przeciwciał wiążących R1.

Ogólnie mówiąc, zmiany mogą być pożądane z wielu względów, takich jak wprowadzanie lub usuwanie następujących cech: sekwencje rozpoznawane przez restrykcyjne endonukleazy; użycie kodonów; inne miejsca potrzebne do modyfikacji posttranslacyjnej; miejsca cięcia w kodowanym polipeptydzie; motywy odpowiedzialne za glikozylację, lipolizację w kodowanym polipeptydzie ect. Sekwencje prowadzące lub inne docelowe sekwencje mogą być dodane do ekspresjonowanego białka aby określić ich położenie po ekspresji. Powyżej opisane działania mogą efektywnie pomóc w klonowaniu i ekspresji rekombinowanego aktywnego polipeptydu (opisane poniżej). Preferowane modyfikacje zawierają te, które zmniejszają całkowity ładunek ujemny obszaru w lub wokół motywów QLPL, CFLY lub LHD. Sposoby i metody modyfikacji genów oporności są znane ekspertowi z dziedziny i są opisane, na przykład dla genu Rx pochodzącego z Solarium tuberosum, w WO 01/129219. Inne pożądane mutacje mogą być wynikiem przypadkowej lub ukierunkowanej mutagenezy, przeprowadzonej w celu zmiany aktywnoś ci (np. specyficzno ś ci) lub stabilnoś ci kodowanego polipeptydu.

PL 211 212 B1

Homologię, na poziomie aminokwasów, określa się na podstawie podobieństwa lub identyczności. Podobieństwo zezwala na konserwatywną zmienność, np. na zamianę jednej reszty hydrofobowej na inną, taką jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina lub zamianę jednej polarnej reszty na inną, taką jak zamiana argininy na lizynę, kwasu glutaminowego na kwas asparginowy lub glutaminy na asparaginę. Jak dobrze wiadomo specjalistom, zmiana pierwszorzędowej struktury polipeptydu w wyniku konserwatywnej substytucji może nie zmienić, w znaczący sposób, aktywności tego peptydu, ponieważ łańcuchy boczne, wstawionego do sekwencji, aminokwasu mogą być zdolne do tworzenia podobnych wiązań i kontaktów, jak łańcuchy boczne zamienionego aminokwasu. Tak jest także w przypadku, gdy zamiana odbywa się w obrębie obszaru odpowiedzialnego za konformację peptydów.

Uwzględnione są także homologii, u których dokonano niekonserwatywnych substytucji. Jak dobrze wiadomo specjalistom, substytucje w regionach peptydu, które nie są kluczowe dla jego konformacji, nie muszą wpływać na aktywność peptydu, ponieważ nie zmieniają one w znaczący sposób właściwości polipeptydu. Rzeczywiście, zmiany opisane powyżej mogą powodować wystąpienie drobnych korzystnych właściwości w peptydzie, np. zmienioną stabilność lub specyficzność, a w szczególności szerszą specyficzność. Mutanty o takich właściwościach mogą zostać wyslekcjonowane tak jak to zostało opisane powyżej. Inne metody mogą polegać na mieszaniu lub włączaniu sekwencji, pochodzących od pokrewnych genów oporności, do sekwencji R1. Na przykład fragmenty R1, uzyskane przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, mogą być zligowane razem z fragmentami homologu R1 albo nawet z niespokrewnionym genem, czego wynikiem jest stworzenie rekombinowanych wersji R1. W alternatywnej strategii moż na uż y ć PCR do modyfikacji R1, tak jak przedstawiono w (Ho et al., 1989 Gene 77, 51-59) lub wykorzystując metodę mieszania DNA (Crameri et al., 1998 Nature 391).

Zatem w skład metod, opisanych powyżej, ujawnionych w niniejszym wynalazku może wchodzić hybrydyzacja jednej lub wielu (np. dwóch) sond lub primerów opartych na sekwncji R1, w celu screeningu mającego na celu identyfikację homologów R1 lub w celu stworzenia pochodnych R1. Takie oligonukleotydy, sondy lub primery stanowią dalszą część niniejszego wynalazku. Oligonukleotyd, używany w sondzie lub PCR, może mieć długość około 30 nukleotydów (np. 18, 21 lub 24). Ogólnie, specyficzne primery są dłuższe niż 14, 15 nukleotydów. Primery o długości 16-24 nukleotydów pozwalają na uzyskanie optymalnej specyficzności oraz oszczędności. Specjaliści są dobrze wyszkoleni w projektowaniu primerów wykorzystywanych następnie np. w procesie PCR. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, to całe fragmenty restrykcyjne o długości kilkuset lub nawet kilku tysięcy nukleotydów, pochodzące od przedstawionego tutaj genu, mogą zostać użyte jako sonda.

Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy wyżej opisanej cząsteczki kwasu nukleinowego występującej w postaci rekombinowanej, preferencyjnie jako wektor replikujący.

„Wektor” jest zdefiniowany jako, inter alia, każdy plazmid, kosmid, fag lub binarny wektor Agrobacterium w postaci dwu-, jednoniciowej lub kolistej, która może występować albo nie występować w postaci samoprzekazywalnej lub przenośnej, która moż e transformować prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza czy to poprzez integrację z genomem czy to poprzez występowanie w postaci pozachromosomowej (np. autonomicznie replikujący się plazmid posiadający miejsce startu replikacji). Szczególnie uwzględnia się tutaj wektory czółenkowe, rozumiane jako nośniki DNA, które naturalnie lub celowo, posiadają zdolność do replikacji w dwóch różnych organizmach gospodarzy, takich jak actinomycetes i pokrewne gatunki, bakterie i organizmy eukariotyczne (np. komórki roślin wyższych, ssaków, drożdży lub grzybów).

Według niniejszego wynalazku, wektor zawierający kwas nukleinowy nie musi zawierać sekwencji promotorowej ani żadnej innej sekwencji regulatorowej, szczególnie jeśli wektor ten ma zostać użyty w celu wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórek i rekombinacji w genomie.

Najlepiej, jeżeli kwas nukleinowy w wektorze jest pod kontrolą, połączony operatywnie, odpowiedniego promotora lub innych elementów regulatorowych dla procesu transkrypcji w komórce gospodarza, np. mikroorganizmu (bakterii lub komórki roślinnej). Wektor może być wektorem o dwufunkcyjnej ekspresji, który działa w wielu gospodarzach. W przypadku genomowego DNA wektor może zawierać swój własny promotor lub inne elementy regulatorowe, a w przypadku cDNA, może ono być pod kontrolą odpowiedniego promotora lub innych elementów regulujących ekspresję w komórce gospodarza. Przez „promotor” rozumie się sekwencję nukleotydów, z której może być zainicjowana transkrypcja DNA połączonego operatywnie w kierunku 3' na nici sensownej dwuniciowego DNA.

„Operatywnie połączone” oznacza złączone, jako część tej samej cząsteczki kwasu nukleinowego, odpowiednio ustawione i zorientowane dla zainicjowania transkrypcji z danego promotora. DNA „operatywnie połączone” z promotorem jest pod „kontrolą inicjacji transkrypcji” promotora.

PL 211 212 B1

Zatem ten aspekt niniejszego wynalazku przedstawia konstrukt genu, preferencyjnie wektor replikujący, w którego skład wchodzi promotor operacyjnie połączony z sekwencją nukleotydową przedstawioną w niniejszego wynalazku, taką jak obszar kodujący gen R1 lub jego wariant (np. mutant, pochodna lub allel). Specjaliści potrafią konstruować wektory i tworzyć protokoły dla ekspresji rekombinowanych genów. Odpowiednie wektory, które mogą zostać dobrane lub stworzone, zawierają odpowiednie sekwencje regulatorowe, w których skład wchodzą sekwencje promotorowe, fragmenty terminatorów, sekwencje poliadenylacji, sekwencje enhancerowe, geny markerowe oraz inne odpowiednie sekwencje. Szczegóły można znaleźć, np. w Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Wiele znanych technik i protokołów manipulacji kwasem nukleinowym, na przykład preparacja konstruktów kwasu nukleinowego, mutageneza (patrz wyżej), sekwencjonowanie, wprowadzanie DNA do komórek i ekspresja genów, analiza białek, są szczegółowo opisane w Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Publikacje Sambrook et al. i Ausubel et al. są tutaj umieszczone jako odnośniki.

Jednym z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy konstruktu genu, preferencyjnie w postaci wektora replikującego, który zawiera indukowalny promotor operatywnie połączony z sekwencją nukleotydową przedstawioną w niniejszym wynalazku. Specjaliści stosują określenie „indukowany” w stosunku do promotora. Ekspresja bę d ą ca pod kontrolą indukowalnego promotora jest „włączana” lub zwiększana w odpowiedzi na zastosowany bodziec. Rodzaj bodźca różni się dla różnych promotorów. Niektóre indukowalne promotory powodują bardzo niskie lub nie wykrywalne poziomy ekspresji (lub brak ekspresji) w przypadku braku odpowiedniego bodźca. Inne indukowalne promotory powodują wykrywalną konstytutywną ekspresję, gdy nie ma odpowiedniego bodźca. Bez względu na poziom ekspresji, gdy nie ma odpowiedniego bodźca, ekspresja z jakiegokolwiek indukowalnego promotora zwiększa się w obecności odpowiedniego bodźca. Najlepiej, gdy poziom ekspresji zwiększa się, pod wpływem działania odpowiedniego bodźca, na tyle aby zmienić cechę fenotypową. Zatem można zastosować indukowalny promotor, który jest odpowiedzialny za konstytutywny poziom ekspresji, pod nieobecność bodźca, której poziom jest zbyt niski, aby wywołać pożądany fenotyp (w rzeczywistości poziom ten może wynosić zero). Po zastosowaniu bodźca ekspresja osiąga poziom wystarczający do pojawienie się pożądanego fenotypu.

Oto przykłady regulatorowych elementów pozwalających na ekspresję w komórkach prokariotycznego gospodarza: PL, lac, trp lub promotor lac w E. coli; a to przykłady regulatorowych elementów pozwalających na ekspresję w komórkach eukariotycznego gospodarza: AOX1 lub GAL1 promotor w droż d ż ach lub CMV-, SV40-, RSV- promotor (Rous sarcoma virus), CMV-enhancer, SV-40 enhancer lub intron globiny w ssaczych i innych zwierzęcych komórkach. W obecnym stanie techniki znane są wektory zawierające powyższe elementy, takie jak wektor ekspresyjny cDNA Okayama-Berg zwany pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORTl (GIBCO BRL).

Szczególnie istotne w powyższym kontekście są wektory roślinne. Specyficzne procedury oraz wektory, które stosowano z powodzeniem w roślinach są opisane przez Beven (Nuci. Acids Res. 12, 8711-8721 (1984)), przez Guerineau i Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp. 121-148). Odpowiednie promotory, które działają w roślinach, to między innymi promotor genu Wirusa Mozaiki Kalafiorowej (CaMV 35S), który ulega bardzo silnej ekspresji praktycznie w każdej roślinnej tkance (Benfey et al. 1990a i 1990b); promotor meri 5 kalafiora, które jest ekspresjonowany w wegeatycyjnej tkance apical meristem, jak również w pojawia się w kilku miejscach w roślinie, np, w łyku wewnętrznym, kwiecie pierwotnym, miejscach odgałęzienia w korzeniu i pędach (Medford, 1992; Medford et al. 1991); promotor Arabidopsis thaliana LEAFY, który jest ekspresjonowany we wczesnym etapie rozwoju kwiata (Weigel et al. 1992). Inne promotory to promotor ryżowej aktyny.

W skł ad promotora moż e wchodzić jeden lub wię cej motywów sekwencji lub elementy nadające kontrolę regululatorową, rozwojową lub tkankowo-specyficzną ekspresji.

Zatem wektory będące przedmiotem niniejszego wynalazku mogą zawierać, oprócz genu R1 lub jego wariantów, różne sekwencje potrzebne do replikacji, integracji i/lub ekspresji. Takie wektory mogą być wykorzystane, na przykład, w celu tworzenia roślin opornych na P. infestans lub inne grzyby.

Pożądane byłoby wywołanie oporności o szerszym spektrum działania. W świetle niniejszego wynalazku pojawiają się różne możliwości:

PL 211 212 B1 (a) Modyfikacja sekwencji R1, tak aby stworzyć mutanty lub inne pochodne, opisane powyżej, których efekt działania byłby wywoływany przez induktory lub patogeny inne niż sama P. infestans lub inne naturalne induktory opisane tutaj.

(b) Wspólna ekspresja R1 razem z odpowiednim induktorem (np. AvR1 z niewirulentnego szczepu).

(c) Wspólna ekspresja R1 i genu induktora, którego transkrypcja lub translacja jest hamowana przez aktywację R1.

Spowodowałoby to ponowne sprzężenie R1 ze swoim induktorem i pozwoliłoby na lepsze naśladowanie naturalnej odpowiedzi na infekcję P. infestans, czego wynikiem byłoby specyficzne wyciszenie o większym zakresie.

(d) Wspólna ekspresja R1 i genu induktora, której wynikiem byłaby aktywacja jednego albo obu genów; gen(y) byłby uruchamiany w różnoraki sposób, tak że HR występowałaby tylko w niektórych miejscach w roślinie (np. w obszarach zdefiniowanych somatycznie) a odpowiedź obronna rozciągałaby się poza te obszary. Można to osiągnąć, na przykład, w oparciu o metody przedstawione w WO 95/31564, gdzie po wstecznym krzyż owaniu roś liny, posiadają cej gen oporności oznaczony transpozonem (w tym przypadku cf-9) oraz nienaruszony induktor (Avr-9), z rośliną posiadającą aktywator transpozazy, potomstwo wykazywało somatyczną reaktywację cf-9, co prowadziło do miejscowej odpowiedzi nekrotycznej ale powodowało szeroką oporność.

Niniejszy wynalazek ujawnia także, oprócz wektorów i konstruktów wymienionych powyżej, metody wprowadzania konstruktów R1, przedyskutowanych powyżej (takich jak wektory), do komórki gospodarza i/lub wywołania ekspresji konstruktu wewnątrz roślinnej komórki poprzez zastosowanie odpowiednich bodźców, skutecznego egzogennego induktora. Wektory, opisane powyżej, mogą zostać wprowadzone do gospodarzy wykorzystując jakąkolwiek z odpowiednich metod opisanych poniżej, np. koniugację, mobilizację, transformację, transfekcję, transdukcję lub elektroporację. Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca kwas nukleinowy lub wektor, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, a w szczególności komórka roślinna albo mikroorganizmu. Komórką gospodarza może być każda komórka prokariotyczna lub eukariotyczna taka jak bakteryjna, owadzia, pochodząca od grzyba, roślinna lub zwierzęca. Preferowane komórki pochodzące od grzybów to komórki od rodzaju Saccharomyces, a w szczególności te od gatunku S. cerevisiae.

W celu ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego, będ ących przedmiotem niniejszego wynalazku, w komórkach roślinnych w orientacji sensownej lub antysensownej, cząsteczki te są umieszczane pod kontrolą elementów regulatorowych, które zapewniają ekspresję w komórkach roślinnych. Te elementy regulatorowe mogą być heterologiczne lub homologiczne w stosunku do cząsteczki kwasu nukleinowego, która ma ulec ekspresji, a także w stosunku do gatunku rośliny, który ma być transformowany. Ogólnie, w skład elementów regulatorowych wchodzi promotor, który jest aktywny w roślinach. W celu uzyskania ekspresji we wszystkich tkankach rośliny transgenicznej, najchętniej wykorzystuje się konstytutywne promotory, takie jak promotor 35 S z CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) lub promotory genu poliubikwityny pochodzącego z kukurydzy (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Aby uzyskać ekspresję jedynie w wybranych tkankach rośliny transgenicznej, można zastosować promotory tkankowo-specyficzne (patrz, np. Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Znane są także promotory aktywne w kanałach ziemniaka lub też w nasionach różnych gatunków roślin, takich jak kukurydza, Vicia, żyto, jęczmień ect. W celu dokładnego kontrolowania ekspresji można zastosować promotory indukowane. Przykładem indukowanych promotorów są promotory genów kodujących białka szoku termicznego. WO 96/16182 opisuje mikrosporo-specyficzne elementy regulatorowe. Ponadto można użyć indukowanego chemicznie systemu Tet (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Inne odpowiednie promotory są znane specjalistom i są opisane np. w Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). Elementy regulatorowe mogą zawierać ponadto, funkcjonalne u roś lin, enhancery transkrypcji i/lub translacji. Ponadto elementy regulatorowe mogą zawierać sygnały terminacji transkrypcji, takie jak sygnał poli-A, który prowadzi do dodania do transkryptu ogona poliA, który może wpłynąć dodatnio na stabilność transkryptu, w celu sprawdzenia literatury patrz także powyżej.

W przypadku gdy cząsteczka kwasu nukleinowego, bę d ąca przedmiotem niniejszego wynalazku, ulega ekspresji w orientacji sensownej, w zasadzie możliwa jest modyfikacja sekwencji kodującej w taki sposób, że białko jest zlokalizowane w każdym pożądanym przedziale komórkowym w komórce rośliny; w tym także w takich przedziałach jak retikulum endoplazmatyczne, wakuole, mitochondrium, plastydy, apoplast, cytoplazma ect. Specjalistom znane są metody modyfikacji oraz sekwencje sygnałowe

PL 211 212 B1 zapewniające lokalizację w pożądanym przedziale. W obecnym stanie techniki znane są także metody wprowadzania obcego DNA do roślin. W skład tych metod wchodzą, na przykład, transformacja komórek roślinnych lub tkanek T-DNA przy użyciu Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes, fuzja protoplastów, bezpośredni transfer genów (patrz, np. EP-A 164 575), iniekcja, elektroporacja, biobalistyczne metody takie jak mikrobombardowanie oraz inne metody istniejące w obecnym stanie techniki. Wektory, wykorzystane w metodzie będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą ponadto zawierać inne funkcjonalne elementy, na przykład sekwencje T-DNA, pochodzące z Agrobacterium, posiadające „granice lewostronne” i „granice prawostronne”, które umożliwiają stabilną integrację z roślinnym genomem. Ponadto wektory i metody, znane specjalistom, pozwalają na tworzenie roślin transgenicznych pozbawionych markerów, na przykład selekcjonujący gen markerowy lub znacznikowy gen markerowy jest gubiony w określonym stadium rozwoju rośliny lub podczas krzyżowania. Można tego dokonać, na przykład, przez kotransformację (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng, Plant. Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) i/lub używając systemów, które wykorzystują enzymy zdolne do prowadzenia homologicznej rekombinacji u roślin (patrz, np. WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361; Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nuci. Acids. Res. 19 (1991), 6373-6378). Metody tworzenia odpowiednich wektorów są opisane np. przez Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edifion (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Odpowiednie szczepy Agrobacterium tumefaciens oraz wektory, jak również transformacja Agrobacterium i odpowiednie pożywki dla wzrostu i selekcji, są doskonale znane ekspertom z dziedziny i są opisane we wcześniejszym stanie techniki (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucl. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies in : Plant Molecular Biology Manual Vol. 2, Gelvin and Schilperoort (Eds.), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekama: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Albasserdam (1985), Capter V, Fraley, Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287). Chociaż według metody będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, preferuje się użycie Agrobacterium tumefaciens, to inne szczepy Agrobacterium, takie jak rhizogenes, mogą być zastosowane, na przykład, jeśli pożądany jest fenotyp nadawany przez te szczepy.

Specjalistom znane są metody transformacji, które są oparte na metodach biobalistycznych; patrz, np., Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558 i Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431. Można także przeprowadzić mikroiniekcję, opisaną w Potrykus and Spangenberg (eds.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

Stosując powyżej opisane metody można z powodzeniem przeprowadzić transformację roślin dwuliściennych. Techniki transformacji opracowano także dla roślin jednoliściennych. W ich poczet można zaliczyć transformację przy zastosowaniu metod biobalistycznych, takich jak np. wyżej opisane metody, jak również transformację protoplastów, elektroporację częściowo permeabilizowanych komórek, wprowadzenie DNA przy użyciu włókien roślinnych, ect. Tak transformowana komórka roślinna może być następnie wykorzystana w procesie regeneracji transformowanej rośliny, w sposób znany jedynie ekspertowi z dziedziny. Przykłady można znaleźć w Hood, Molecular Breeding 3 (1997), 291-306; Coleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 7094-7097; Shilito, Biotechnology 7 (1989), 581-587.

Na ogół, rośliny, które mogą być modyfikowane według niniejszego wynalazku, i które wykazują nadekspresję białka, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, albo obniżają syntezę tego białka, mogą być uzyskane z każdego pożądanego gatunku roślin. Mogą to być rośliny jednoliścienne lub rośliny dwuliścienne, najlepiej gdy są to gatunki roślin będące w kręgu zainteresowania rolnictwa, leśnictwa lub ogrodnictwa, takie jak rośliny uprawne (np. kukurydza, ryż, jęczmień, pszenica, żyto, owies ect.), ziemniaki, rośliny oleiste (np. rzepak, słonecznik, orzeszek ziemny, soja ect.), bawełna, burak cukrowy, trzcina cukrowa, rośliny strączkowe (np. fasola, groch ect.), rośliny produkujące drewno, najlepiej drzewa, ect.

Wybór metody transformacji będzie określony przez jej skuteczność w transformowaniu określonych gatunków roślin, jak również przez doświadczenie i preferencje osoby wykorzystującej wynalazek w oparciu o wybraną metodologię. Dla eksperta z dziedziny jest jasne, że ani wybór specyficznego systemu wprowadzania kwasu nukleinowego do komórek roślinnych, ani wybór techniki regeneracji rośliny, nie są istotne i nie ograniczają wynalazku. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, to można zastosować selekcjonujące markery genetyczne, składające się z chimerycznych genów, które przekazują selekcjonujący

PL 211 212 B1 fenotyp, taki jak oporność na antybiotyki, takie jak kanamycyna, higromycyna, fosfinotrycyna, chlorosulforon, metotreksan, gentamycyna, spectynomycyna, imidazoliny i plifosforany.

Zatem następny aspekt niniejszego wynalazku ujawnia metody transformacji komórki roślinnej, która obejmuje wektor, w którego skład wchodzi kwas nukleinowy będący przedmiotem niniejszego wynalazku (np. R1 lub wariant R1), co powoduje lub pozwala na rekombinację pomiędzy wektorem i genomem roś liny i w rezultacie na wprowadzenie sekwencji nukleotydowej do genomu.

W skł ad niniejszego wynalazku wchodzi takż e komórka gospodarza transformowana czą steczką kwasu nukleinowego lub wektorem, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, szczególnie roślina lub komórka mikroorganizmu. Transgen w roślinie transgenicznej (np. transgenicznej ze względu na kwas nukleinowy, o którym mowa) może znajdować się na pozagenomowym wektorze lub być włączonym, najlepiej w sposób stabilny, do genomu. W haploidalnym genomie może występować więcej niż jedna heterologiczna sekwencja nukleotydów.

Określenie „heterologiczna” jest tutaj użyte w szerszym znaczeniu aby wskazać, że genom/sekwencja nukleotydów, o której mowa, została wprowadzona, do wyżej wymienionych komórek roślinnych lub ich przodków, przy użyciu inżynierii genetycznej, np. przez działanie człowieka. Gen heterologiczny może być dodatkowym genem, obok odpowiadającego mu genu endogennego. Heterologiczny kwas nukleinowy w komórce roślinnej, albo inaczej egzogenny lub obcy, to taki, który normalnie nie występuje w danym typie komórek, odmianie czy gatunku roślin. Zatem heterologiczny kwas nukleinowy może zawierać sekwencję kodującą lub uzyskaną z określonego typu komórki roślinnej, gatunku, lub odmiany rośliny, umieszczoną w kontekście komórki roślinnej pochodzącej od innego rodzaju, gatunku lub odmiany.

Po transformacji można zregenerować roślinę, np. z pojedynczych komórek, tkanki tworzącej się w wyniku uszkodzenia lub z krążków liścia, w oparciu o standardy obecnego stanu techniki. Niemal każda roślina może zostać w całości zregenerowana z roślinnych komórek, tkanek lub organów. Dostępne techniki są omówione w Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, i w Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

Udało się stworzyć pokolenie płodnych roślin transgenicznych u ryżu zbożowego, kukurydzy, pszenicy, owsa i jęczmienia (przegląd u Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Yain et al, 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702).

Niniejszy wynalazek dotyczy roślin, zawierających komórkę roślinną, oraz jej części lub strzępka, nasiona własnego lub hybrydowego potomstwa. Rośliną, według niniejszego wynalazku, może być dowolna dająca się namnożyć część, nasiono, siewka lub potomstwo hybrydowe i descendanty. Odmiany rośliny mogą być wyłączone, szczególnie rej estrowalne odmiany roślin zgodnie z Prawem Ochrony Odmian Roślin. Należy zauważyć, że roślina nie musi być uważana za „odmianę rośliny” tylko dlatego, że posiada w genomie stabilnie wbudowany transgen, który został wprowadzony do komórki roślinnej lub do przodka tej rośliny.

W korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, pod wpływem obecności genu R1 niniejszego wynalazku, roślina transgeniczna, będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, uzykuje oporność lub wzmocnienie oporności na patogen, na który roślina dzika nie była odporna.

Określenie „oporność” dotyczy zakresu ochrony od opóźnienia do całkowitej inhibicji rozwoju choroby. Poniżej przedstawiono przykłady patogenów: Phytophthora infestans, pospolity czynnik wywołujący zarazę łodygową ziemniaka, Phytophthora sojae, patogen soji powodujący gnicie korzenia, Peronospora parasitica (mączniak rzekomy), Megnaporthe grisea, pospolity czynnik wywołujący chorobę liści ryżu, Erysiphe spp (pleśń proszkowata), Pseudomonas syringae (czynnik zarazy bakteryjnej), Erwinia amylovora (zaraza ognista), Erwinia carotovora (mokra zgnilizna), Botrytis cinerea (mączniak rzekomy winogron), Rhizoctonia solani i Pythium debaryanum (czynniki wywołujące zarazę siewek lub zgorzel siewek). Korzystnie, roślina transgeniczna, będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, uzyskuje oporność na P. infestans. Niniejszy wynalazek obejmuje oprócz zregenerowanej rośliny, także: klon tej rośliny, nasiono, własne lub hybrydowe potomstwo oraz potomstwo (np. potomstwo F1 i F2) oraz każda ich część, taka jak sadzonka, nasiono. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy także strzępek pochodzących od takiej rośliny (włączając sadzonki, nasiono itd.), tzn. takich, które mogą być wykorzystane do rozmnażania, płciowego lub bezpłciowego. Sekwencje przedstawione w niniejszym opisie mogą być alternatywą dla metod biologii molekularnej, które są wykorzystywane w celu umieszczania genu R1 (lub jego wariantów) w roślinach, i mogą być wykorzystane do selekcji pożądanych

PL 211 212 B1 roślin, do których wprowadzi się cechę oporności za pomocą konwencjonalnych metod krzyżowania roślin.

Obecność genu u potomstwa będącego wynikiem takich krzyżowań można łatwo zidentyfikować poprzez screening w oparciu o sekwencję R1, w szczególności o sekwencję charakterystyczną dla R1.

Przedstawione metody identyfikacji markerów, znajdujących się w pobliżu regionu R1, mogą być ogólnie stosowane także w przypadkach innych genów znajdujących się w zgrupowaniu (np. geny oporności pochodzenia roślinnego). Charakterystyczną cechą tych metod jest zastosowanie niespecyficznego PCR z użyciem niezdegenerowanych primerów, które nie obejmują konserwatywnych motywów w sekwencji. Metoda ta może być podsumowana w następujący sposób: (a) Przygotuj populację, w której gen, bę d ący w krę gu zainteresowania, oddziela się , (b) Zidentyfikuj homolog(i) genu oporności znajdujące się w zgrupowaniu, będącym w kręgu zainteresowania, na podstawie obecności wysoce konserwatywnych motywów (genu oporności) oraz zdegenerowanych primerów (Leister et al., 1996) Nature Genet. 14,421-428, (c) Zidentyfikuj inne markery, odpowiadające genom homologicznym, które znajdują się w obszarze (oporności) oraz są bliżej genu, poprzez przeprowadzenie PCR o niskiej specyficznoś ci z wykorzystaniem niezdegenerowanych primerów, które nie obejmują konserwatywnych motywów w sekwencji, (d) Użyj powyższych markerów do identyfikacji (w bibliotece genomowej pochodzącej z rośliny transgenicznej) klonu niosącego gen oporności będący w kręgu zainteresowania, ewentualnie wykonaj także oznaczenia aktywności (Mindrinos et al (1994) lub jak przedstawiono w niniejszym opisie), (e) Potwierdź tożsamość sklonowanego genu na podstawie fenotypu rośliny transgenicznej.

Niniejszy wynalazek obejmuje także produkt ekspresji każdego R1 lub wariantu sekwencji kwasu nukleinowego, przedstawionego powyżej, oraz metody tworzenia produktu ekspresji poprzez prowadzenie ekspresji, w odpowiednich warunkach, z kodujących cząsteczek kwasu nukleinowego, które mogą znajdować się w odpowiednich komórkach gospodarza in vitro, lub które są syntetyzowane chemicznie, szczególnie jeżeli celem jest uzyskanie antygenów do produkcji przeciwciał. Do produkcji przeciwciał, skierowanych przeciwko oczyszczonemu polipeptydowi R1/wariant, można wykorzystać każdą znaną metodę (aby zobaczyć przegląd, patrz np w „lmmunology-5th Editio” napisana przez Riott, Brostoff, Mai: Pub 1998-Mosby Press, London). Uzyskane przeciwciała lub ich fragmenty albo pochodne, mogą służyć do wiązania R1 lub do identyfikacji lub izolacji białek będących homologami R1 (tzn. takich, które mają wspólne epitopy z R1), co może być alternatywną metodą, w stosunku do tych opisanych powyżej, izolacji genów kodujących te białka.

Można wykorzystywać aptamery wiążące się z polipeptydem R1, który jest przedmiotem niniejszego wynalazku. Sposób przygotowania aptamerów jest znany ekspertowi z dziedziny; patrz np. Thomas and Dinshaw (2000) Adaptive recognition by nucleic aptamers. Science 287: 820-825.

Niniejszy wynalazek dostarcza metodę wpływania na lub oddziaływania na cechę oporności rośliny. W metodzie tej znajduje się etap, który powoduje lub pozwala na ekspresję heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego w komórkach rośliny, tak jak już przedyskutowano powyżej (w każdym przypadku R1 lub wariant R1, ewentualnie odpowiedni induktor).

Alternatywnym rozwiązaniem mogłoby być osłabienie aktywności R1. Do tego celu można zastosować technologię wykorzystującą anty sensowne kwasy nukleinowe (przegląd u Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149 i Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496). Alternatywą dla powyższej technologii może być użycie całej kopii genu lub jej części, umieszczonej w tej samej orientacji jak docelowy gen, w celu ograniczenia ekpresji docelowego genu poprzez kosupresję; patrz, na przykład, van der Kroi et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588 i US-A-5,231,020.

Zatem niniejszy wynalazek odnosi się także do komórki rośliny transgenicznej i roślin transgenicznych składających się z takich komórek roślinnych, które według niniejszego wynalazku zawierają, najlepiej stabilnie zintegrowaną z genomem, cząsteczkę kwasu nukleinowego lub jej część, której transkrypcja i/lub ekspresja prowadzi do ograniczenia syntezy białka R1. W korzystnej realizacji wynalazku, obniżenie syntezy następuje w wyniku zastosowania antysensu, sensu, robozymu, kosupresji, efektu mutanta dominującego lub mutanta knock out w genie R1. Najlepiej jednak gdy wynalazek dostarcza metody, w której skład wchodzi ekspresja SEQ ID NO:1 lub jej wariantu w komórce rośliny (przez co powstaje kodowany polipeptyd), która następuje po wcześniejszym wprowadzeniu kwasu nukleinowego do komórki rośliny lub przodka rośliny. Metoda ta może być wykorzystana do wprowadzenia do rośliny oporności na grzyby. Oporność pochodząca od R1 jest wywoływana poprzez zetknięcie się z, pochodzącym od grzybów, odpowiednim induktorem, inicjatorem. Mówiąc szerzej, induktor lub inny czynnik wywołujący może być kodowany w grzybie inwazyjnym (takim jak wirulentne

PL 211 212 B1 białko z P. infestans lub innych grzybów). Induktor lub inny czynnik wywołujący może być ekspresjonowany przez osobny konsrtukt lub transgen. Ekspresja jest uruchamiana lub wzmacniana w wyniku infekcji grzyba. Dodatkowo, w obu tych przypadkach, modyfikacja sekwencji R1 (lub jej wariantu) może pozwolić na uruchomienie ekspresji w wyniku działania naturalnie niewystępującego induktora. Zgodnie z powyższym opisem, niniejszy wynalazek odnosi się także do roślin transgenicznych, które są bardziej podatne na infekcję zarazą łodygową niż ich dzikie odpowiedniki. Niniejszy wynalazek odnosi się do tych części rośliny, które można zbierać, oraz do materiału rozpłodowego tych roślin.

Zgodnie z opisanym przykładem, wyizolowany gen R1, po transformacji do wrażliwej odmiany Desiree, nadał mu oporność na P. infestans. Zatem jeżeli genomowy klon, którego sekwencja jest przedstawiona w SEQ ID NO:1, miał taki efekt, to jasne jest, że sekwencje regulatorowe R1, potrzebne i wystarczające do umożliwienia ekpresji polipeptydu R1 pod wpływem infekcji patogenem, znajdują się w wyizolowanej sekwencji DNA. Dla eksperta z dziedziny oczywiste jest, że takie regulatorowe sekwencje mają swoje własne ważne zastosowania, na przykład dla ekspresji heterologicznych sekwencji DNA pod wpływem infekcji patogenem, np. dla wywołania nadwrażliwej odpowiedzi na dany patogen.

Toteż niniejszy wynalazek dotyczy także sekwencji regulatorowej naturalnego promotora regulującego ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku lub cząsteczki kwasu nukleinowego będącej homologiem cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku. Ta sekwencja jest zdolna do rozpoczynania lub modulowania ekspresji heterologicznej sekwencji DNA w wyniku infekcji patogenem. W kontekście niniejszego wynalazku określenie „sekwencja regulatorowa” odnosi się do sekwencji, które wpływają na specyficzność i/lub na poziom ekspresji, na przykład w tym sensie, że nadają specyficzność komórkową i/lub tkankową. Takie obszary znajdują się powyżej miejsca inicjacji startu transkrypcji, ale mogą się także znajdować poniżej tego miejsca, tzn. w prowadzącej sekwencji, która ulega transkrypcji, ale nie ulega translacji lub w intronach.

Określenie „promotor”, w sensie niniejszego wynalazku, dotyczy sekwencji nukleotydowych potrzebnych do inicjacji transkrypcji, tzn. wiązania polimerazy RNA i udanego rozpoczęcia i tworzenia transkryptu, może także dotyczyć, na przykład TATA box.

Użyte tutaj określenie „cząsteczka kwasu nukleinowego będąca homologiem cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku” dotyczy także obszarów promotora oraz sekwencji regulatorowych innych genów R1, takich jak geny pochodzące z innych gatunków, na przykład, z pomidora, które są homologiczne genów R1 ziemniaka i wykazują w zasadzie ten sam model ekspresji. Takie promotory charakteryzują się zdolnością prowadzenia ekspresji w roślinie w oparciu o heterologiczna sekwencję DNA, najlepiej wyłącznie pod wpływem infekcji patogenem.

Użyte tutaj określenie „zdolna do rozpoczynania lub modulowania ekspresji heterologicznej sekwencji DNA w wyniku infekcji patogenem” oznacza, że dany promotor jest zdolny do kontrolowania lub jest ściśle związany z kontrolą ekpresji sekwencji DNA w roślinach w miejscach infekcji, jest analogiczny lub ściśle związany z kontrolowaną ekspresją genów pod wpływem infekcji patagenami. Geny te biorą udział w naturalnej oporności w najbardziej niekompatybilnych oddziaływaniach gospodarz/patogen, takich jak śmierć nadwrażliwych komórek znajdujących się w częściach rośliny, które uległy infekcji. Zatem sekwencja regulatorowa niniejszego wynalazku charakteryzuje się zdolnością pośredniczenia w miejscowej i wybiórczej aktywacji transkrypcji w odpowiedzi na atak patogenu lub w odpowiedzi na bodziec, taki jak induktor przygotowany z takich patogenów jak grzyby czy bakterie lub ich pochodne, który naśladuje atak patogenu. Aktywacja transkrypcji, będąca wynikiem działania sekwencji regulatorowej niniejszego wynalazku, może także wystąpić w komórkach otaczających właściwe miejsce infekcji i jest wynikiem oddziaływań międzykomórkowych. Sekwencja regulatorowa niniejszego wynalazku oraz chimeryczne promotory, składające się z takich sekwencji, mogą nie być indukowalne lub jedynie indukowalne w minimalnym stopniu przez takie bodźce jak stres abiotyczny. Preferencyjnie, wywołana, przez atak potogenu lub przez działanie induktora, indukcja ekspresji z chimerycznego promotora jest przynajmniej 10-krotnie silniejsza, preferencyjnie 20-krotnie silniejsza a w szczególności 30-krotnie silniejsza niż ekspresja wywołana stresem abiotycznym.

Jednakże specyficzność ekspresji, będącej wynikiem działania sekwencji regulatorowych niniejszego wynalazku, nie musi się ograniczać do lokalnej ekpresji genu wywołanej patogenami, na przykład sekwencje mogą być połączone z dalszymi sekwencjami regulatorowymi, które umożliwiają tkankowospecyficzną ekspresję genu. Szczególny model ekspresji może zależeć od użytego systemu roślina/wektor. Jednak ekspresja heterologicznych sekwencji DNA, zachodząca pod wpływem działania sekwencji regulatorowych niniejszego wynalazku, zachodzi głównie pod wpływem infekcji patogenem

PL 211 212 B1 lub pod wpływem działania odpowiednich induktorów, chyba że specjalista wykorzystał pewne elementy w celu kontroli ekspresji heterologicznej sekwencji DNA w określonych typach komórek.

Zatem, według niniejszego wynalazku, można stosować sekwencje regulatorowe pochodzące od innych gatunków, które są funkcjonalnie homologiczne z sekwencjami regulatorowymi promotora specyficznych cząsteczek kwasu nukleinowego R1 lub promotorów genów, które wykazują identyczny lub podobny model ekspresji. Szczególny model ekspresji może także zależeć od użytego systemu roślina/wektor. Jednak, ekspresja heterologicznych sekwencji DNA prowadzona przez sekwencje regulatorowe, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, zachodzi w każdej komórce zainfekowanej przez patogen, chyba że specjalista wykorzystał pewne elementy sekwencji regulatorowych w celu kontroli ekspresji heterologicznej sekwencji DNA w określonych tkankach lub też w inny kontrolowany sposób.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nowe sekwencje regulatorowe genów R1 mogą być izolowane i zostały przedstawione na przykładzie sekwencji regulatorowej genu R1 ziemniaka. Na przykład genomowe DNA może być trawione odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, zdenaturowane i poddane asocjacji z odwrotnym primerem uzyskanym w oparciu o sekwencję cDNA, będącą przedmiotem niniejszego wynalazku. Po wydłużeniu primera można przeprowadzić reakcję przyłączenia adaptora o tę pych koń cach i nastę pnie przeprowadzić PCR stosują c wewnę trzny 3' pimer uzyskany na podstawie wspomnianej cDNA oraz 5' primer stworzony na podstawie sekwencji adaptora. Inną metodą klonowania sekwencji regulatorowych, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, jest stworzenie fizycznej mapy genetycznej regionu znajdującego się powyżej regionu kodującego i jej analizą metodą Southern'a. Na podstawie tak uzyskanych informacji genomowe DNA może być trawione wybranymi enzymami restrykcyjnymi i następnie genomowe fragmenty zawierające odcinki powyżej sekwencji kodującej oraz fragmenty sekwencji kodującej mogą być oczyszczone w żelu i poddane samoligacji w dużej obję tości, aby sprzyjać tworzeniu się kolistych czą steczek, które mogą być następnie poddane amplifikacji metodą PCR przy zastosowaniu primerów 5' i 3', uzyskanych na podstawie sekwencji kodującej genu. Wykorzystując standardowe metody, znane specjalistom (5'-RACE, wydłużanie primerów lub mapowanie S1), można określić miejsce startu transkrypcji znajdujące się w obrębie sklonowanej sekwencji. Odpowiedni region jest włączany do genów markerowych, takich jak geny kodujące GUS lub GFP, co pozwala na określenie cis-regulatorowych elementów położonych powyżej miejsca startu transkrypcji (w obrębie regionu domniemanego promotora) i pozwala na stworzenie pochodnych tych konstruktów, które posiadają delecje 5'. Są one transformowane do odpowiedniego materiału roślinnego i następnie określa się ekspresję genów markerowych, będących pod kontrolą pozostałej sekwencji położonej powyżej (domniemany promotor). Te techniki są doskonale znane specjalistom.

Ujawniono sekwencję regulatorową, składająca się z sekwencji DNA wybranej z grupy składającej się z:

(a) Sekwencje DNA składające się z sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO. 1 od nukleotydu 1 do 2222 lub (a) jej części;

(b) Sekwencje DNA składające się przynajmniej z 14 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 1 do 2222;

(c) Sekwencje DNA hybrydyzujące, w warunkach zapewniających wysoką specyficzność reakcji, z sekwencją nukleotydową określona w (a) lub (b);

(d) Sekwencje DNA genu lub jego części uzyskane w wyniku screeningu odpowiednich genomowych bibliotek DNA przy pomocy sondy o sekwencji nukleotydowej określonej w zastrzeżeniu 1; i (e) Sekwencje DNA składające się z sekwencji nukleotydowych, które są konserwatywne w (a), (b) i (c).

Regulatorowe sekwencje homologiczne różnią się jedną lub kilkoma pozycjami od sekwencji regulatorowej (a) lub (b) ale nadal wykazują taką samą specyficzność, w ich skład wchodzą te same lub podobne motywy sekwencji, preferencyjnie o długości 6 do 10 nukleotydów, odpowiedzialne za wyżej opisany model ekspresji. Preferencyjnie, te regulatorowe sekwencje hybrydyzują z jedną z powyższych regulatorowych sekwencji, najlepiej w warunkach zapewniających wysoką specyficzność. Szczególnie preferencyjne są regulatorowe sekwencje, które są identyczne przynajmniej w 85% lub bardziej preferencyjnie w 90-95% lub najbardziej preferencyjnie w 96-99%) z jedną z wyżej wspomnianych sekwencji regulatorowych i posiadają taką samą lub praktycznie taką samą specyficzność. W skład tych sekwencji wchodzą także sekwencje powstałe na skutek zmiany jednego lub kilku nukleotydów w wyniku delecji, wstawienia(ń), podstawienia(ń), addycji i/lub rekombinacji i/lub innych modyfikacji, które znane są

PL 211 212 B1 specjalistom. Także metody, pozwalające na dokonanie zmian w sekwencji nukleotydowej sekwencji regulatorowych będących przedmiotem niniejszego wynalazku, znane są specjalistom. Ponadto specjalista doskonale orientuje się, że do sekwencji regulatorowych, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, można dołączyć inne elementy regulatorowe. Można na przykład zastosować enhancery transkrypcji i/lub sekwencje pozwalające na indukowalną ekspresję regulatorowych sekwencji będących przedmiotem niniejszego wynalazku. Przykładem odpowiedniego indukowalnego systemu ekspresji może być system ekspresji genów regulowany przez tetracyklinę, opisany np. przez Gatz, powyżej. Istnieje także możliwość modyfikowania sekwencji regulatorowych lub ich motywów przy pomocy zamiany nukleotydów, które nie wpływają na ogólną strukturę lub motyw wiążący sekwencji regulatorowej, która nadal jest w stanie uczestniczyć w ekspresji genu podczas infekcji patogenem. Sekwencja regulatorowa, będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, może pochodzić od genów R1 ziemniaka (patrz przykłady), chociaż także inne rośliny mogą być odpowiednim źródłem takich sekwencji regulatorowych. Ponadto sekwencje nukleotydowe, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być porównywane przy pomocy odpowiednich programów komputerowych znanych w obecnym stanie techniki, takich jak BLAST, który oznacza Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, 1997; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-390; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990); 403-410) i moż e być takż e uż yty do wyszukiwania lokalnych zestawień sekwencji (zestawianie sekwencji mają ce na celu ich porównanie). BLAST może dostarczyć zestawień sekwencji nukleotydowych na podstawie, których można określić podobieństwo sekwencji. BLAST jest szczególnie przydatny, ze względu na miejscowy charakter zestawień, w określaniu dokładnych dopasowań lub w identyfikacji homologów. Zatem wykorzystujące takie środki możliwa jest identyfikacja konserwatywnych sekwencji nukleotydowych, które mogą odgrywać rolę w ekpresji wynikającej z infekcji patogenem.

Zazwyczaj te sekwencje regulatorowe są częścią rekombinowanej cząsteczki DNA. W korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, sekwencja regulatorowa w cząsteczce DNA jest operatywnie połączona z heterologiczna sekwencją DNA. Określenie „heterologiczna”, odnoszące się do cząsteczki DNA operatywnie połączonej z regulatorową sekwencją będącą przedmiotem niniejszego wynalazku, oznacza że ta sekwencja DNA nie jest w naturalny sposób połączona (takie połączenie nie występuje w naturze) z regulatorową sekwencją będącą przedmiotem niniejszego wynalazku. Ekspresja tej heterologicznej sekwencji DNA polega na transkrypcji sekwencji DNA, preferencyjnie w mRNA, który będzie matrycą w procesie translacji. Specjalistom znane są regulatorowe elementy zapewniające ekspresję w komórkach eukariotycznych, preferencyjnie w komórkach roślinnych. Zazwyczaj elementy te składają się z sygnałów poli-A, które zapewniają zakończenie transkrypcji i stabilizację trankryptu, patrz także powyżej. Dodatkowe elementy regulatorowe mogą zawierać enhancery transkrypcji jak również enhancery translacji; patrz powyżej.

Ujawniono iż, w korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, heterologiczna sekwencja DNA opisanych powyżej rekombinowanych cząsteczek DNA koduje peptyd, białko antysensowny RNA, sensowny RNA i/lub rybozym. Rekombinowana cząsteczka DNA będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, może być użyta, samodzielnie lub jako część wektora, w celu ekspresji sekwencji heterologicznego DNA, które kodują białko, np białka zapasowe nasion, toksyny, przeciwciała roślinne lub w celu okreś lenia ekspresji związanej z R1. Rekombinowana czą steczka DNA lub wektor zawierają cy sekwencję DNA kodującą białko, będące w kręgu zainteresowania, jest wprowadzany do komórek, które następnie produkują to białko. Na przykład sekwencje regulatorowe, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być operatywnie połączone z sekwencjami kodującymi odpowiednio Barstar i Bemase, w celu wywołania HR u roślin. Zastosowania sekwencji regulatorowych znane są specjalistom i można je znaleźć w literaturze, np. Strittmatter and Wegner, Zeitschrift far Naturforschung 48c (1993), 673-688; Kahl, J. Microbiol. Biotechnol. 11 (1995), 449-460 oraz cytowane tutaj referencje. Z drugiej strony, powyższe białko może być markerem reporterowym, takim jak lucyferaza, białko o zielonej fluorescencji (GFP) lub β-galaktozydaza, który jest szczególnie przydatny w prostych i szybkich metodach screeningu mającego na celu identyfikację związków i substancji, opisanych poniżej, zdolnych do modulowania ekspresji genu R1. Na przykład roślina transgeniczna może być hodowana w obecności lub bez obecności rozpatrywanego związku w celu określenia czy związek ten wpływa na ekspresję genów będących pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które są przedmiotem niniejszego wynalazku. Wpływ rozpatrywanego związku na poziom ekspresji może być mierzony np. przez monitorowanie ekspresji wyżej wspomnianego markera. Możliwość zastosowania innych genów markerowych, kodujących na przykład selektywny marker, który pozwala na bezpośrednią selekcję związków indukujących lub hamujących ekspresję tego markera, jest oczywiste dla ekspertów z dziedziny.

PL 211 212 B1

Regulatorowe sekwencje, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być użyte w metodach wykorzystujących antysens. Antysensowne RNA może być krótką (zazwyczaj o długości przynajmniej 10, preferencyjnie o długości przynajmniej 14 nukleotydów, ewentualnie o długości do 100 lub więcej nukleotydów) sekwencją stworzoną w taki sposób, aby być komplementarną do części specyficznej sekwencji mRNA i/lub sekwencji DNA badanego genu. Standardowe metody stosowane w technologii antysensu został y opisane; patrz np., Klann, Plant Physiol. 112 (1996), 1321-1330 i powyżej. Antysensowne RNA, będące produktem transkrypcji sekwencji DNA, wiąże się ze swoją docelową sekwencją w komórce, przez co hamuje translację mRNA i obniża ekspresję białka kodowanego przez mRNA.

Ujawniono cząsteczkę kwasu nukleinowego o długości, co najmniej 15 nukleotydów, który specyficznie hybrydyzuje z opisaną powyżej regulatorową sekwencją lub hybrydyzuje z jej komplementarną nicią. Warunki zapewniające wysoką specyficzność, w których prowadzona jest specyficzna hybrydyzacja, praktycznie eliminują krzyżową hybrydyzację z sekwencjami nukleotydowymi, które nie wykazują podobnych cech regulatorowych lub wykazują całkowicie inne własności regulatorowe. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być wykorzystane, jako sondy i/lub w kontroli ekspresji genu. Technologia wykorzystująca kwasy nukleinowe, jako sondy jest dobrze znana specjalistom, którzy wiedzą, że sondy te mogą różnić się długością. Preferuje się sondy kwasów nukleinowych o długości od 17 do 35 nukleotydów. Oczywiście, właściwe może okazać się zastosowanie kwasów nukleinowych o długości 100 lub więcej nukleotydów. Sondy te, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą mieć wiele zastosowań. Z jednej strony według niniejszego wynalazku, mogą być one użyte, jako primery PCR w amplifikacji sekwencji regulatorowych. Innym zastosowaniem jest ich użycie, jako sondy do hybrydyzacji w celu identyfikacji sekwencji regulatorowych hybrydyzujących z sekwencjami regulatorowymi, które są przedmiotem niniejszego wynalazku, poprzez screening homologii genomowych bibliotek DNA. Według korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, komplementarne z regulatorowymi sekwencjami cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być także wykorzystane w represji transkrypcji genu, w którego skład wchodzą te sekwencje regulatorowe, na przykład w wyniku działania antysensu, kosupresji lub efektu potrójnej helisy albo stworzenia odpowiednich rybozymów (patrz np. EP-B1 0 291 533, EP-A1 O 321 201, EP-A2 0 360 257), które specyficznie tną (pre)-mRNA genu, w którego skład wchodzi regulatorowa sekwencja będąca przedmiotem niniejszego wynalazku. Wybór odpowiednich miejsc oraz odpowiadających im rybozymów jest dokonywany w sposób opisany na przykład w Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith at al. eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460. Specjaliści wiedzą, że sondy kwasu nukleinowego można wyznakować odpowiednim markerem i mogą one mieć specyficzne zastosowanie w wykrywaniu obecności cząsteczki kwasu nukleinowego, która jest przedmiotem niniejszego wynalazku, w próbce pochodzącej od organizmu.

Wyżej opisane cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być zarówno DNA lub RNA albo ich hybrydą. Ponadto ta cząsteczka kwasu nukleinowego może zawierać, na przykład, wiązania thioestrowe i/lub analogii nukleotydów, które są powszechnie stosowane metodach wykorzystujących antysensowne nukleotydy; patrz powyżej. Niniejszy wynalazek dotyczy także wektorów, w szczególności plazmidów, kosmidów, wirusów i bakteriofagów, stosowanych w konwencjonalnej inżynierii genetycznej, które zawierają sekwencję regulatorową lub odpowiadającą jej rekombinowana cząsteczkę DNA, która jest przedmiotem niniejszego wynalazku. Najlepiej gdy taki wektor jest wektorem ekspresyjnym i/lub w skład tego wektora wchodzi marker selekcjonujący u roś lin. Przykłady odpowiednich markerów selekcjonujących znajdują się w powyżej. Powszechnie znane metody są wykorzystywane do konstruowania rekombinowanych wektorów; patrz, na przykład, w technikach opisanych w Sambrool, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternatywna metoda dostarczenia rekombinowanych cząsteczek DNA oraz wektorów, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, do docelowych komórek polega na ich zawieszeniu w liposomach.

Niniejszy wynalazek odnosi się także do komórek gospodarza transformowanych sekwencją regulatorową, cząsteczką DNA lub wektorem, które są przedmiotem niniejszego wynalazku. Wspomniana komórka gospodarza może być komórką prokariotyczna lub eukariotyczną. Sekwencja regulatorowa, cząsteczka DNA lub wektor, które są przedmiotem niniejszego wynalazku, obecne w komórce gospodarza mogą być albo zintegrowane z genomem komórki gospodarza albo mogą być w postaci pozachromosomalnej. Komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną, taką jak komórka bakteryjna, owadzia, komórka grzyba, roślinna, zwierzęca lub ludzka. Preferuje się komórki roślinne.

PL 211 212 B1

Ujawniono następną korzystną realizację niniejszego wynalazku dotyczącą metody, która poprzez wprowadzenie do genomu rośliny, komórki roślinnej lub tkanki roślinnej cząsteczki kwasu nukleinowego, rekombinowanej cząsteczki DNA lub wektora, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, tworzy roślinę trangeniczną, transgeniczne komórki roślinne lub transgeniczne tkanki roślinne. Inne sekwencje regulatorowe, takie jak łańcuch poły-A, mogą być dołączone, najlepiej do 3' końca sekwencji heterologicznego DNA, w celu ekspresji, w komórkach roślinnych, sekwencji heterologicznego DNA, które znajduje się pod kontrolą sekwencji regulatorowej, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku. Inne możliwości to dodanie transkrypcyjnych lub translacyjnych enhancerów, które wzmagają ekspresję genu, lub dodanie sekwencji, która powoduje większą stabilność mRNA. Metody wprowadzania obcego DNA do roślin, komórek roślinnych i tkanek roślinnych zostały opisane powyżej.

Zatem niniejszy wynalazek odnosi się także do komórek rośliny transgenicznej, które preferencyjnie zawierają regulatorową sekwencję, rekombinowana cząsteczkę DNA lub wektor, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, stabilnie zintegrowane w genom. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy roślin transgenicznych i tkanki roślinnej, w których skład wchodzą wyżej wymienione komórki rośliny transgenicznej.

Ponadto ujawniono metodę identyfikacji czynnika chroniącego roślinę, która składa się z następujących etapów:

(a) prowadzenie hodowli komórki roślinnej lub tkanki albo utrzymywanie rośliny, która posiada rekombinowaną cząsteczkę DNA, w której skład wchodzi system reporterowy operatywnie połączony z sekwencją regulatorową, będącą przedmiotem niniejszego wynalazku, w obecności związku lub próbki, w której skład wchodzą różnorodne związki, w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego systemu reporterowego;

(b) identyfikacja lub weryfikacja odpowiednio próbki lub związku, który prowadzi do zahamowania lub aktywacji i/lub wzmocnienia ekspresji wspomnianego systemu reporterowego w tej roślinie, komórce roślinnej lub tkance roślinnej.

W kontekście ujawnienia określenie „system reporterowi” oznacza sekwencję DNA, która pod wpływem transkrypcji i/lub ekspresji w komórce, tkance lub organizmie, powoduje powstanie mierzalnego i/lub selekcjonującego fenotypu. Takie systemy reporterowe są doskonale znane specjalistom i składają się na przykład z rekombinowanej czą steczki DNA i genów markerowych opisanych powyż ej.

Użyte w metodzie określenie „różnorodne związki” powinno być rozumiane, jako różnorodność substancji, które mogą, ale nie muszą być identyczne.

Związek ten lub różnorodne związki mogą być związkami organicznymi lub nieorganicznymi, naturalnie występującymi lub stworzonymi przez człowieka a w ich skład mogą wchodzić, na przykład, próbki takie jak: ekstrakty komórkowe z roślin, zwierząt lub mikroorganizmów. Ponadto związek(ki) ten może być znany w obecnym stanie techniki, ale jak dotąd nie wiedziano o jego właściwościach hamowania lub aktywowania i/lub wzmacniania transkrypcji genu R1. Różnorodne związki mogą być dodane do pożywki lub wstrzyknięte roślinie, komórkom roślinnym lub tkankom, albo rozpylone na roślinę lub dostarczone w glebie.

Jeżeli próbka, zawierająca związek lub różnorodne związki, została zidentyfikowana przy użyciu ujawnionej metody to możliwa jest izolacja tego związku z pierwotnej próbki, w której stwierdzono obecność związku zdolnego do hamowania lub aktywacji i/lub wzmacniania transkrypcji genu R1 lub można też podzielić pierwotną próbkę, na przykład, jeżeli składa się ona z różniących się od siebie związków, tak aby ograniczyć liczbę różnych substancji w próbce i ponownie zastosować metodę, tym razem używając podzielonych próbek. Powyżej opisane etapy mogą być kilkukrotnie powtarzane, w zależności od złożoności próbki, najlepiej aż do uzyskania próbki, stosując metodę niniejszego wynalazku, która zawiera ograniczoną liczbę lub tylko jeden związek. Najlepiej, gdy powyższa próbka składa się substancji o podobnych właściwościach chemicznych i/lub fizycznych, najbardziej korzystnie, jeżeli te substancje są identyczne. Najlepiej, gdy związek, zidentyfikowany ujawnioną metodą, jest dalej przygotowany w postaci nadającej się do zastosowania podczas krzyżowania rośliny lub komórki roślinnej i hodowli komórkowej.

Składniki, które mogą zostać przetestowane i zidentyfikowane według ujawnionej metody, mogą być bibliotekami ekspresyjnymi, takimi jak biblioteki ekspresyjne cDNA, peptydami, białkami, kwasami nukleinowymi, przeciwciałami, małymi związkami organicznymi, hormonami, peptydomimetykami; patrz PNAS lub (Milner, Natute Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs Cell 79 (1994), 193-198 oraz referencje cytowane w powyżej). Ponadto geny kodujące potencjalne regulatory genu R1 mogą być zidentyfikowane wykorzystując powszechnie znane metody, na przykład

PL 211 212 B1 przez mutagenezę insercyjną z wykorzystaniem wektorów umożliwiających homologiczną wymianę genu (patrz Hayashi, Science 258 (1992), 1350-1353; Fritze and Wladen, Gene activation by T-DNA tagging. In Methods in Molecular biology 44 (Gartland, K.M.A. and Davey, M.R., eds). Totowa: Human Press (1995), 281-294) lub przez znakowanie transpozomu (Chandlee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105-115). Te związki mogą także być funkcjonalnymi pochodnymi lub analogami znanych inhbitorów lub aktywatorów. Specjalistom znane są metody przygotowania chemicznych pochodnych i analogów, w celu zapoznania się z przykł adami patrz Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fith Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. i Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Ponadto można badać właściwości wyżej wymienionych pochodnych i analogów wykorzystując do tego celu powszechnie znane metody. W ujawnionej metodzie można także stosować peptydomimetyki i/lub odpowiednie pochodne stworzone przy wykorzystaniu programów komputerowych. Zastosowanie genu reporterowego może umożliwić stwierdzenie czy, u roślin, dany związek jest zdolny do hamowania, aktywowania i/lub wzmacniania transkrypcji genu R1. W tym celu można także zastosować monitorowanie cech fenotypowych rośliny transgenicznej niniejszego wynalazku, która została poddana działaniu związków, i porównać te cechy z fenotypem dzikiej rośliny. W dodatkowej realizacji niniejszego wynalazku, wyżej wspomniane cechy mogą być porównane z cechami roś liny transgenicznej, która został a poddana dział aniu zwią zku, o którym wiadomo lub nie, że jest lub nie jest zdolny do hamowania, aktywowania i/lub wzmacniania ekspresji genu R1 lub aktywności białka. Oczekuje się, że związki, zidentyfikowane przy użyciu ujawnionej metody będą bardzo przydatne z uwagi na fakt, że znane promotory mogą mieć jedynie ograniczone zastosowanie, ponieważ infekcja patogenem nie oddziaływuje na ich sekwencje regulatorowe albo oddziaływuje jedynie w niewielkim stopniu na te sekwencje. Inhibitor lub aktywator, które zostały zidentyfikowane przy zastosowaniu wyżej opisanej metody, mogą okazać się przydatne, jako herbicydy, pestycydy i/lub regulatory wzrostu roślin. Zatem kolejno ujawniono związek uzyskany lub zidentyfikowany przy użyciu powyższej metody. Te przydatne związki mogą na przykład być aktywnymi czynnikami wiążącymi się z sekwencją regulatorową niniejszego wynalazku. Powszechnie stosowane metody mogą być wykorzystane do identyfikacji tych aktywnych czynników (patrz, np. Sambrook, powyżej i Ausubel, powyżej). Standardowa metoda DNA footprinting i/lub analiza w natywnym żelu mogą być wykorzystane w celu stwierdzenia czy białko wiąże się regulatorową sekwencją niniejszego wynalazku. Sekwencja regulatorowa może być użyta, w standardowych metodach oczyszczania białka, jako ligand lub jako sonda do screeningu biblioteki ekspresyjnej, w celu identyfikacji aktywnego czynnika wiążącego się z regulatorową sekwencją niniejszego wynalazku. Po identyfikacji aktywnego czynnika moż na prowadzić badania nad modulowaniem jego wiązania z sekwencjami regulatorowymi niniejszego wynalazku, rozpoczynając na przykład od znalezienia inhibitora, który zapobiega wiązaniu aktywnego czynnika z sekwencjami regulatorowymi niniejszego wynalazku. Następnie stosując czynnik aktywny (lub jego inhibitor) lub odpowiedni dla roślin transgenicznych wektor kodujący ten czynnik można aktywować lub hamować ekspresję genu R1 w roślinach. W przypadku gdy czynnik ten jest aktywny jako dimer wówczas jego dominująco-negatywne mutanty mogą być wykorzystane do zahamowania jego aktywności. Ponadto identyfikacja aktywnego czynnika może prowadzić do identyfikacji innych czynników biorących udział w ścieżce aktywacji lub represji (np. w przekazywaniu sygnałów) genu będącego pod kontrolą regulatorowych sekwencji niniejszego wynalazku. Następnie można zająć się modulacją aktywności tych czynników, co może prowadzić do powstania leków oraz metod modulacji ekspresji genu znajdującego się pod kontrolą regulatorowych sekwencji niniejszego wynalazku. Korzystnie, gdy związek, jego analog lub pochodna, zidentyfikowane przy użyciu powyżej opisanej metody, są następnie przygotowywane w postaci nadającej się do zastosowania podczas krzyżowania rośliny lub komórki roślinnej i hodowli komórkowej. Taki związek można dołączyć do powszechnie stosowanego w rolnictwie nośnika. Do przygotowania mieszaniny chroniącej roślinę moż na wykorzystać wyżej opisaną metodę niniejszego wynalazku i zsyntetyzować odpowiednią ilość związku zidentyfikowanego, jako inhibitor lub aktywator. Zatem niniejszy wynalazek ujawnia także metodę przygotowania mieszaniny (stosowanej w rolnictwie) chroniącej roślinę. W skład tej metody wchodzą wyżej opisane etapy metody ujawnione w niniejszym wynalazku oraz synteza zidentyfikowanego związku lub jego pochodnej.

Zidentyfikowany związek wchodzący w skład ujawnionej mieszaniny chroniącej roślinę, może być przetworzony przy zastosowaniu powszechnie stosowanych metod i użyty w postaci herbicydów i pestycydów lub w formie związków zdolnych do indukowania ogólnoustrojowej nabytej oporności (SAR). Specjalistom znane są stabilizatory lub substancje umożliwiające wchłanianie do komórki roślinnej, tkanki roślinnej lub rośliny, takie jak na przykład węglik krzemu lub 0.01% roztwór SDS (dodecylosiarczan

PL 211 212 B1 sodu). Następna realizacja niniejszego wynalazku dotyczy metody identyfikacji i uzyskania czynnika niewirulentnego lub wirulentnego pochodzącego od patogenu. Metoda ta składa się z następujących etapów:

(a) screening peptydowej lub białkowej biblioteki ekspresyjnej patogenu, wyposażonej w odpowiedni system odczytu, białkiem R1 lub jego fragmentem w warunkach pozwalających na interakcje białka i peptydu;

(b) identyfikacja lub weryfikacja cDNA prowadzącego do hamowania lub aktywacji systemu odczytu.

Opisane cząsteczki kwasu nukleinowego, niniejszego wynalazku, oprócz zastosowania w inżynierii genetycznej roślin o zmienionych cechach oraz w identyfikacji homologicznych cząsteczek, mogą mieć wiele zastosowań, na przykład mogą zostać użyte w identyfikacji cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują białka oddziałujące z opisanymi powyżej białkami R1. Do tego celu można zastosować powszechnie znane metody oznaczeniowe, na przykład opisane w Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) wykorzystujące tzw. dwu-hybrydowy system drożdżowy. W systemie tym białko, lub jego mniejsza część, kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego niniejszego wynalazku jest przyłączone do domeny wiążącej DNA czynnika transkrypcji GAL4. Szczep drożdżowy ekpresjujący to białko fuzyjne oraz gen reporterowy lacZ, będący pod kontrolą odpowiedniego promotora, który jest rozpoznawany przez czynnik transkrypcji GAL4, jest transformowany biblioteką cDNA, która ekspresjonuje roślinne białka lub ich peptydy połączone z domeną aktywacyjną. Zatem jeżeli peptyd kodowany przez jedno z cDNA jest zdolny do interakcji z peptydem fuzyjnym, w którego skład wchodzi peptyd lub białko niniejszego wynalazku, wówczas utworzony kompleks jest zdolny do prowadzenia ekspresji genu reporterowego. W ten sposób cząsteczki kwasu nukleinowego, niniejszego wynalazku, oraz kodowane białko mogą być wykorzystane do identyfikacji peptydów i białek oddziałujących z biał kami R1. Tę metodę moż na takż e zastosować w celu identyfikacji inhibitorów lub aktywatorów.

Inne metody pozwalające na identyfikację związków oddziałujących z białkami niniejszego wynalazku lub cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących te molekuły, to technologia „phage-display” do screeningu in vitro, oznaczenia wiązania z memebranami oraz mierzenie oddziaływań w „czasie rzeczywistym” przy użyciu urządzenia BIAcore (Pharmacia).

Podobną strategię można zastosować w przypadku tzw. systemu trój-hybrydowego. Drożdżowy system dwu-hybrydowy został po raz pierwszy opisany przez Fields i Song (Nature 340 (1989), 245-246; patrz także przegląd u Vidal, M, in Bartel, P.L. and Fields, S. (eds.), The yeast two-hybrid system. Oxford University Press, New York, NY, (1997), 109-147). Zmodyfikowana wersja tego systemu została opisana przez (Gyuris, Cell 75 (1993), 223-232; Zervos, Cell 72 (1993), 223-232). Domena polipeptydu jest użyta, jako przynęta dla przyłączających się związków. Pozytywne klony są selekcjonowane na podstawie ich zdolności do wzrostu na płytkach bez leucyny. Następnie sprawdza się ich zdolność do zmiany koloru na płytkach zawierających X-gal; zostało to szczegółowo opisane w WO 95/31544. Wersja zmodyfikowana to „odwrócony system dwu-hybrydowy”, który pozwala na identyfikację interakcji uszkodzonych alleli przy użyciu strategii negatywnej selekcji, opisanej na przykład w (Vidal, Proc. Natl Acad Sci. USA 93 (1996), 10321-10326; Vidal, Proc. Natl Acad Sci. USA 93 (1996), 10315-10320). Ten system wykorzystuje dodatkowo selekcjonujący gen reporterowy URA3. Komórki drożdżowe ekspresjonujące Ura3p przekształcają kwas 5-fluoroorotowy (FOA) w toksyczną pochodną 5-fluoro uracyl. Interakcja dwu-hybrydowa, prowadząca do aktywacji reporterowego genu URA3, może zatem prowadzić do dodatkowej selekcji w obecności FOA, której wynikiem jest wyselekcjonowanie mutantów, z dużej populacji dzikich alleli, które utraciły funkcjonalność.

Inna wygodna metoda to na przykład trój-hybrydowy system drożdżowy opisany w (SenGupta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 8496-8501). Trój-hybrydowy drożdżowy system selekcji został stworzony w celu izolacji genów białek, które oddziaływują z RNA oraz w celu badania oddziaływań RNA-białko. System ten, oparty na dwu-hybrydowym systemie drożdżowym, składa się z domeny wiążącej DNA przyłączonej do znanego białka wiążącego się z RNA, domeny aktywacyjnej połączonej z potencjalnym biał kiem wiążącym się z RNA oraz z hybrydy RNA. W odwróconym trój-hybrydowym systemie, oddziaływanie między białkami i RNA powoduje ekspresję genu reporterowego, którego produkt jest toksyczny dla komórek drożdżowych. Wszystkie te metody mogą być użyte w zgodzie z powyż ej opisaną metodą niniejszego wynalazku i mogą one stosować biał ko R1 lub jego peptydowe fragmenty jako przynętę wykorzystywaną do identyfikacji i uzyskania niewirulentnego lub wirulentnego czynnika oraz kodującego go, lub jego części, cDNA. Specjalistom znane są metody pozyskiwania sekwencji DNA pozytywnych klonów. Metody te są opisane w powyżej wymienionych publikacjach.

PL 211 212 B1

Niniejszy wynalazek dotyczy także cDNA i kodowanego przez to cDNA produktu uzyskanego lub zidentyfikowanego przez powyżej opisaną metodę.

Niniejszy wynalazek dotyczy także mieszanin składających się z przynajmniej jednej lub wielu cząsteczek kwasu nukleinowego i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarnej do wyżej wymienionej cząsteczki kwasu nukleinowego, wektora niniejszego wynalazku, białka R1 niniejszego wynalazku lub jego immunologicznie bądź biologicznie aktywnego fragmentu lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego takie białko lub jego fragment; regulatorowej sekwencji lub rekombinowanego DNA lub odpowiadającego im wektora niniejszego wynalazku, związku zaprojektowanego według białka niniejszego wynalazku i/lub zidentyfikowanego przy użyciu powyżej opisanej metody i/lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego taki związek lub regulatorowej sekwencji niniejszego wynalazku oraz ewentualnie odpowiednich sposobów detekcji dla komórek roślinnych i hodowli komórkowej.

Diagnostyczne mieszaniny mogą być wykorzystane w metodach prowadzących do detekcji ekspresji genu R1 poprzez wykrywanie obecności odpowiadającego mu mRNA. Proces wykrywania mRNA obejmuje izolację mRNA z komórki i poddanie go hybrydazacji z sondą kwasu nukleinowego w warunkach hybrydazacji pozwalających na detekcję obecności mRNA, które zhybrydyzowało z sondą, co w efekcie prowadzi do stwierdzenia ekspresji genu w komórce. Według niniejszego wynalazku, inne techniki pozwalające na wykrycie obecności białka to powszechnie stosowane immunotechniki, takie jak na przykład ELISA.

Ponadto ujawniono zestaw, w którego skład wchodzi przynajmniej jedna z wyżej wspomnianych cząsteczek kwasu nukleinowego, wektorów, białek, związków, przeciwciał lub aptamerów niniejszego wynalazku. W skład ujawnionego zestawu mogą także wchodzić inne składniki, takie jak selekcjonujące markery oraz substancje stosowane w selektywnych pożywkach używanych do hodowli komórek roślin transgenicznych, tkanek roślinnych lub roślin. Ponadto zestaw może zawierać bufory i substraty dla genu reporterowego, który może się znajdować razem z genem lub w wektorze niniejszego wynalazku. Ujawniony zestaw może być z powodzeniem wykorzystany w metodzie niniejszego wynalazku i może mieć, inter alia, wiele zastosowań w diagnostyce lub jako narzędzie badawcze. Części ujawnionego zestawu mogą być pakowane w osobnych probówkach lub być częścią większych pojemników. Podczas produkcji zestawu przestrzegane są standardowe procedury, które znane są osobom o odpowiednich kwalifikacjach. Ujawniony zestaw lub jego składniki mogą być stosowane w hodowlach komórkowych roślin lub hodowlach tkankowych roślin, na przykład, w każdej powyżej opisanej metodzie detekcji inhibitorów i aktywatorów genu R1. Oczekuje się, że zestaw oraz jego składniki będą użyteczne w krzyżowaniu nowych odmian roślin, które charakteryzowałyby się lepszymi własnościami, takimi jak lepsze wartości odżywcze lub oporność na choroby.

Dla ekspertów z dziedziny oczywiste jest, że sekwencje regulatorowe, cząsteczki rekombinowanego DNA, wektory i związki niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane w tworzeniu roślin transgenicznych o pożądanych cechach; przegląd w TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-397.

Ponadto, wg. niniejszego wynalazku, można wykorzystać cząsteczki kwasu nukleinowego, jako markery molekularne w krzyżowaniu roślin. Według niniejszego wynalazku można również wykorzystać nadekspresję cząsteczek kwasu nukleinowego w celu zmiany lub modyfikacji interakcji roślina/patogen. Określenie „patogen” oznacza, na przykład, bakterie, wirusy i grzyby jak również pierwotniaki. Najlepiej, gdy tym patogenem jest P. infestans.

Ujawniono także użycie cząsteczki kwasu nukleinowego, wektora, komórki gospodarza, białka, sekwencji regulatorowej, aptameru rekombinowanej cząsteczki DNA, wektora, związku, aptameru i/lub przeciwciała niniejszego wynalazku w metodzie screeningu, której celem jest identyfikacja genów wirulencji i awirulencji patogenu, znalezienie związków ochraniających roślinę, wywołanie u rośliny oporności na patogen. Sekwencja regulatorowa lub cząsteczka rekombinowanego DNA, które są przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być korzystnie wykorzystane w ekspresji heterologicznej sekwencji DNA.

Te i inne realizacje są przedstawione i zawarte w opisie i przykładach niniejszego wynalazku. Dodatkową literaturę, która dotyczy metod, zastosowań oraz substancji wykorzystanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można uzyskać z publicznych bibliotek używając do tego celu narzędzi elektronicznych, np. publiczna baza danych „Medline” dostępna na Internecie pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html oraz inne bazy danych, znajdujące się pod niniejszymi adresami:

PL 211 212 B1 http://ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http://www.tigr.org. Dostęp do powyższych baz danych, które są znane specjalistom, można uzyskać także korzystając z http://www.lycos.com. Przegląd informacji patentowej w biotechnologii oraz lista odpowiednich patentowych informacji źródłowych przydatnych w wyszukiwaniu znajduje się w Berks,

TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Niniejszy wynalazek jest dalej opisany jako odniesienie do poniższych figur i przykładów.

Figury przedstawiają:

Figura 1. Genetyczna i fizyczna mapa obszaru R1. GP21 i GP179 to markery użyte w konstruowaniu mapy obszaru R1 o dużej rozdzielczości. SPUD237 i AFLP1 oznaczają zmienione markery AFLP (Meksem et al. 1995, De Jong et al. 1997) flankujące R1. Odległości genetyczne zostały podane w cM. CosS to oznaczenie klonu kosmidowego wyselekcjonowanego przy pomocy SPUD237. Pozostałe klony na mapie fizycznej, to klony BAC o długości od 70 do 90 kb. Jednolicie czarne słupki: klony BAC z chromosomu niosącego R1. Szare słupki: klony BAC z chromosomu niosącego r1. Biały słupek: klon BAC o nieznanym pochodzeniu. Zmapowane końce klonów BAC są oznaczone przez liczbę rekombinantów oddzielających koniec klonu BAC od R1. Końce klonów kosmidowych i BAC, wykorzystane w wędrówce po chromosomie, są zaznaczone pionowymi strzałkami. RGL- fragment podobny do genu oporności (resistance-gene-like fragment).

Figura 2. Amplifikacja PCR fragmentu 1.4 kb genu R1 przy użyciu primerów allelospecyficznych 76-2sf2 i 76-2SR i matrycy DNA pochodzącej z (A) Desiree; (B) opornego rodzica P41; (C) wrażliwego rodzica P40; (D) transgenicznej rośliny Desiree 10-2_5; (E) klon BAC BA87d17 zawierający allel R1; (F), (G), (H), (I), (J) klony BAC- odpowiednio BA122p13, BA12101, BA76011, BA47F2 i BA27c1, (K) negatywna kontrola.

Figura 3. Test dopełnienia funkcji R1. Symptomy chorobowe w 9 dni po inokulacji liści (A) wrażliwej Desiree; (B) transgenicznej linii Desiree o numerze 10-2_5 transformowanej klonem g10-2 oraz (C) oporny rodzic P41 (R1R1).

Figura 4. Gen R1. (A) Struktura. Eksony są przedstawione w postaci prostokątów (pudełek) a introny w postaci ukośnych linii. (B) Uzyskana sekwencja aminokwasów. Motyw suwaka leucynowego jest dwukrotnie podkreślony. LRR jest przedstawiony pismem pochyłym. Motyw charakterystyczny dla kinaz jest oznaczony wewnątrz obszaru w kształcie pudełka, a miejsca N-glikozylacji są oznaczone tłustym drukiem. Konserwatywne motywy QLPL, CFLY i LHD, charakterystyczne dla roślinnych białek oporności, są podkreślone. Użyto standardowy jednoliterowy sposób oznaczenia aminokwasów.

Figura 5. Schematyczne przedstawienie regionu chromosomu 5 wokół obszaru R1. Prostokąty wypełnione pionowymi liniami oznaczają homologiczne regiony między chromosomami, które zawierają allele R1 i r1. Funkcjonalny allel R1.1 i obszar R1.2/r1.2 są oznaczone otwartymi prostokątami. Ukośna linia wskazuję delecję obecną na R1-chromosomie w porównaniu z r1-chromosomem.

PRZYKŁADY

Materiały i Metody:

Materiał roślinny:

W celu przeprowadzenia mapowania genetycznego R1, o wysokiej rozdzielczości, wykorzystano potomstwo FI, będące wynikiem krzyżowania między heterozygotycznymi diploidalnymi klonami H79.1506/1 (R1r1) i H80.696/4 (r1r1), określanymi odpowiednio jako P41 i P40 (Gebhardt et al. 1989, Leonards-Schippers et al. 1992). Selekcji, pochodzących od rodzica P41 (R1r1), rekombinantów w markerowym odcinku GP21-GP179, dokonano wg. Meksem et al. 1997. Klon hybrydowy P6/210 uzyskany z krzyżowania P41 x P40 (Leister et al. 1997), który zawiera R1 w postaci heterozygotycznej, został użyty do stworzenia genomowego kosmidu i bibliotek BAC. Rodzic P41 (R1r1) został użyty w tworzeniu biblioteki cDNA.

Test oporności na Phytophthora infestans:

Oporność na P.infestans, posiadający niewirulentny czynnik Avr1 (szczep 4), została określona tak jak to opisano w (Leonards-Schippers et al. 1992) ale zamiast krążków liści do inokulacji użyto listki. Obecność lub brak nadwrażliwej odpowiedzi (HR) oceniano po 8-10 dniach po inokulacji.

Genomowe biblioteki ziemniaka:

Biblioteka BAC została dostarczona przez LION Bioscience AG (Heidelberg, Germany). Bibliotekę stworzono, zgodnie z opisem w (Meksem et al. 2000), przez niecałkowite cięcie enzymem Hindlll genomowego DNA, o dużym ciężarze molekularnym, klonu P6/210, który znajdował się w binarnym wektorze pCLD04541 (Jones et al. 1992). Biblioteka BAC składa się z 101.376 klonów w których insert ma średnio długość 70 kb. Kolonie przechowywano na 264 384-dołkowych płytkach (Genetix,

PL 211 212 B1

Oxford, UK) w pożywce 2YT (Sambrook et al. 1989) z buforem do zamrażania (5.5% masa/objętość glicyny, 7 mM (NH4)SO4, 1.5 mM Na-cytrynian, 0.3 mM MgSO4, 13 mM KH2PO4, 27 mM K2HPO4). Biblioteka kosmidowa, około 150 000 klonów została skonstruowana, przy użyciu standardowych procedur (Sambrook et al. 1989), przez niecałkowite trawienie enzymem Sau3Al genomowego DNA (fragmenty 17-23 kb) klonu P6/210 i była umieszczona w wektorze wykorzystanym do stworzenia biblioteki BAC (miejsce klonowania BamHl). Kosmidy spakowano przy użyciu Gigapack II Gold Packaging extract (Stratagene, CA, USA) i transfekowano nimi szczep E. coli SURE™. DNA plazmidowe izolowano z puli około 1500 kolonii bakteryjnych (Sambrook et al. 1989). Stworzono sto trzy pule kosmidów i poddano je procedurze screeningu przy użyciu PCR, wykorzystując primery specyficzne dla SPUD237 (De Jong et al. 1997). Pozytywne pule wysiewano i screenowano poprzez hybrydyzację kolonii, wykorzystując w tym celu standardowe protokoły (Sambrook et al. 1989).

Screening biblioteki BAC i tworzenie kontigów (sekwencji przylegających)

W celu przeprowadzenia screeningu klonów BAC w oparciu o hybrydyzację, przygotowano filtry o dużym zagęszczeniu klonów przy użyciu robota BioGRID (Oxford, UK). Klony zostały ułożone w kratkę (każdy klon dwa razy) o ustawieniu 5 x 5. Na filtrze nylonowym o wymiarach 22.5 x 22.5 cm umieszczono 6 x 384 takich ustawień. Każde ustawienie 5 x 5 zawierało po 2 x 12 kolonii oraz kontrolę w postaci klonu pSW1 (PE Biosystems, Fosters City, CA USA). Taki układ kratkowania pozwolił na umieszczenie 27,648 klonów, i to dwukrotnie, na każdym filtrze. Screening biblioteki przeprowadzono używając zestawu czterech filtrów, w sumie 101,376 klonów. Filtry z koloniami inkubowano w pożywce LB przez 15 godzin w temperaturze 37°C i następnie poddano procesowi przygotowania kolonii do hybrydyzacji przy użyciu standardowych technik (Sambrook et al. 1989). Hybrydazację filtrów przeprowadzono zgodnie z opisem (Gebhardt et al. 1989), z tą różnicą że 300 pg pSWl kontrolnego insertu wyznakowano i poddano hybrydyzacji razem z sondą aby móc określić położenie pozytywnych klonów. Plazmidowe DNA oczyszczono z pozytywnych klonów i inserty zsekwencjonowano w obu kierunkach wykorzystując do tego celu oligonukleotydy T3 i T7 jako primery sekwencjonujące. Otrzymana w ten sposób sekwencja DNA końców insertów BAC została wykorzystana w zaprojektowaniu par primerów do PCR. Zamplifikowane, przy użyciu tych primerów, produkty PCR oraz odpowiadające im klony BAC zostały użyte jako matryce dla sond w nowej hybrydyzacji w celu identyfikacji pokrywających się klonów BAC, w celu ustalenia wzajemnej orientacji pokrywających się klonów BAC oraz w celu mapowania w rekombinowanych roślinach. Sekwencje pokrywających się odcinków potwierdzono przez sekwencjonowanie produktów PCR. Kierunek wydłużenia kontigów określono przez genetyczne mapowanie wykorzystując rekombinowane rośliny i RFLP lub analizę markerów metodą PCR. Aby określić wielkość insertów w klonach BAC DNA trawiono Notl a fragmenty rozdzielano przy użyciu elektroforezy pulsowej w żelu na CHEF DRIII (BioRad, Hercules, CA, USA) przez 12 godzin w 11°C z czasem początkowego pulsu wynoszącym 5 sekund i czasem ostatniego pulsu wynoszącym 10 sekund pod kątem 120° i 6 V/cm.

Izolacja DNA z BAC:

DNA z BAC izolowano przy użyciu QIAfilter Plasmid Purification Kit 100 (Qiagen, Hilden, Germany) nieznacznie modyfikując zalecenia producenta. Pojedyncza kolonia była najpierw hodowana w płynnej pożywce LB przez 8 godzin w 37°C. Następnie, użyto 75 μl tej hodowli dodano do 75 ml pożywki LB i dalej hodowano przez kolejne 15 godzin w 37°C. Dodano etap wirowania, który poprzedzał przepuszczenie supematantu przez QIAfilter, w celu usunięcia resztek bakteryjnych.

Przygotowanie sond na podstawie insertów BAC:

1.5 μg DNA pochodzącego z BAC strawiono całkowicie enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoR1, oddzielono od wektora w 0.8% niskotopliwej agarozie (Sea Plague GTG Agarose, Bioproducts, Pockland, Maine, USA). Inserty wyizolowano z żelu stosując system GELase (Epicentre Technologies lub Biozym) zgodnie z instrukcją producenta. DNA wytrącono etanolem, rozpuszczono w wodzie i wyznakowano ³²P-dCTP metodą przypadkowo wybranych primerów (Feinberg i Vogelstein 1984).

Klonowanie BAC BA87d17:

μg DNA pochodzącego z BAC trawiono 1U Tsp509I przez 15 minut w 65°C i rozdzielono na 0.8% niskotopliwej agarozie (Sea Plague GTG Agarose, Bioproducts, Pockland, Maine, USA). Fragmenty o wielkości około 10 kb wymywano z żelu stosując system GELase (Epicentre Technologies lub Biozym) zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone fragmenty wklonowano do binarnego wektora pCLD04541 przeciętego w jednym miejscu enzymem EcoRI, który został odfosforyzowany fosfatazą SHRIMP (Roche, Germany), i transformowano szczep DHIOB E. coli (Life Technologies, USA). Na płytkach wielodołkowych umieszczono dwieście rekombinowanych kolonii.

PL 211 212 B1

Konstrukcja i screening biblioteki cDNA:

Obcięte pędy 8-tygodniowych roślin rodzica P41 (R1R1) i wrażliwej Desiree zainfekowano odmianą 4 P. infestans i hodowano pod szklanym cylindrem (w celu zwiększenia wilgotności) w wodzie w komorze wzrostu w 17°C dostarczając światło przez 16 godzin. W tych warunkach, po ośmiu dniach, liście wrażliwej kontroli zostały przerośnięte przez grzybnię P. infestans. Zebrano równą liczbę liści rodzica P41 i zainfekowanych liści 2 godziny, 19 godzin, 3 dni, 7 dni i 9 dni po inokulacji. Przy użyciu Rneasy Plant Mini Kit lub 0ligotex mRNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) wyizolowano Poły A⁺ RNA stosując się do zaleceń producenta. Biblioteka cDNA Lambda ZAP II (Stratagene, CA, USA) została skonstruowana z poly-A⁺ RNA, według zaleceń producenta. Różne cDNA zostały zebrane razem przed etapem ligacji z wektorem Lambda ZAP. Na płytki wysiano 5 x 10⁵ pfu i poddano je screeningowi przez hybrydyzację łysinek (Sambrok et al. 1989) używając do tego celu insertów klonów BAC BA121ol i BA 76ol 1 jako sondy.

Analiza za pomocą szybkiej amplifikacji 5' końców cDNA (RACE):

Do izolacji całkowitego RNA z niezainfekowanej tkanki liścia P41 (R1R1) użyto Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), stosując się do zaleceń producenta. Do przeprowadzenia analizy RACE użyto 1 μg całkowitego RNA i zastosowano zestaw SMART™ Race cDNA Amplification Kit (Clontech, CA, USA), stosując się do zaleceń producenta. W amplifikacji PCR użyto następujących specyficznych dla genu wewnętrznych primerów, pierwszy z primerów to RTl-1: 5'-AAACCCGGTGTTCCAAATCTAACACT-3' (SEQ ID NO: 3) a drugi primer to RT2-1: 5'-CATGTAGTGAGGATATGTCACGAGTG-3' (SEQ ID NO: 4). Ostateczne produkty PCR reakcji RACE wklonowano do wektora pGEM-T (Promega, CA, USA). Zsekwencjonowano dwa niezależne klony.

Analiza sekwencji DNA:

Sekwencjonowanie DNA zostało wykonane na zamówienie przez jednostkę ADIS Max Planck Institute for Breeding Research. Użyto metodę sekwencjonowania didezoksy zakańczania łańcucha wykorzystując do tego celu zestaw ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit i zautomatyzowany sekwencer DNA o nazwie ABI377 (PE Biosystems, Poster City, CA USA).

Analiza sekwencji DNA została przeprowadzona przy użyciu Package Yersion 10.0 Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc, USA. Bazy danych zawierające sekwencje przeszukano stosując BlastX oraz inne algorytmy dostępne przez National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA i ExPASY www serwer (Apple at al. 1994).

Transformacia Agrobacterium tumefaciens:

Szczep LBA4404 A. tumefaciens elektroporowano klonem g10 pochodzącym od BA87d17, zgodnie z Wen-jun and Ford (1989). Do transformacji ziemniaka wykorzystano następujące trzy szczepy Agrobacterium: LABg10-2, LABg10-5 i LABg10-23.

Transformacja ziemniaka za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i analiza roślin transgenicznych:

We wszystkich doświadczeniach użyto wrażliwej odmiany ziemniaka Desiree. Transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens przeprowadzono w sposób opisany przez Rocha-Sosa et al. (1989), z tą różnicą, że pożywka MS zawierała 250 mg/l claforanu. Rośliny transgeniczne oporne na kanamycynę testowano metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu stwierdzenia obecności insertu g10 stosując specyficzne dla tego insertu primery 87e (5'-ATTACAATGGGTTGAACTCAG-3' (SEQ ID NO: 5)) i 87s (5'-ACCTCTTTCAATTGTTCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 6)). Warunki PCR Ta=55°C przez 45 sekund i wydłużanie w 72°C przez 60 sekund. Rośliny transgeniczne były poddane screeningowi przy użyciu specyficznych dla R1 primerów: 76-2sf2 (5'-CACTCGTGACATATCCTCACTA-3' (SEQ ID NO: 7)) oraz 76-2SR (5'-CAACCCTGGCATGCCACG-3' (SEQ ID NO: 8)) uzyskane w oparciu o cDNA c76-2. Warunki PCR Ta = 55°C przez 45 sekund i wydłużanie w 72°C przez 90 sekund. Testy na oporność na szczep 4 P. infestans przeprowadzono na trzech pędach z każdej rośliny w każdym teście.

P r z y k ł a d 1: Genetyczne mapowanie, o dużej rozdzielczości, obszaru R1

W celu ułatwienia fizycznego mapowania obszaru R1, spośród 588 roślin wyselekcjonowano 16 rekombinantów między markerami GP21 i GP179 flankującymi R1 (Leonards-Schippers et al. 1992) i poddano testowi na odporność na szczep P. infestans posiadający właściwy czynnik awirulentny AvR1. Razem z 15, uprzednio wybranymi, rekombinantami o tym samym przedziale (Meksem et al. 1995), wyselekcjonowana, spośród 1049 roślin, grupa składała się z 31 rekombinantów, co odpowiadało 3.0% częstotliwości rekombinacji (3 cM). Częstotliwości rekombinancji pomiędzy GP21 i R1 oraz pomiędzy R1 i GP179 wynosiła odpowiednio 2.2% i 0.8% (tabela 1).

PL 211 212 B1

T a b e l a 1. Liczba pojedynczych rekombinantów w przedziałach GP21 - R1, GP179 - R1 oraz GP21 - GP179, wyselekcjonowanych spośród 1049 roślin oddzielającej się populacji F1.

	GP21-R1	GP179-R1	GP21-GP179
Liczba rekombinantów	23	8	31
Rekombinanty o genotypie	12	4	16
R1r11
Rekombinanty o genotypie	11	4	15
rlrl
Częstotliwość rekombinacji	2.2	0.8	3.0

Oba markery SPUD237 i AFLP1 mapujące przedział GP21 - GP179 (De Jong et al. 1997, Meksem et al. 1995) flankują obszar R1. Oba markery oddzielono od R1 w ciągu pojedynczej (występującej tylko raz) rekombinacji w 1049 roślinach (0.1 cM, Figura 1).

P r z y k ł a d 2: Wędrówka po chromosomie w kierunku obszaru R1 oraz identyfikacja potencjalnego genu R1

Do screeningu biblioteki kosmidowej użyto, jako sondy, markera SPUD237. Zidentyfikowano jeden pozytywny klon CosS (figura 1). Sekwencjonowanie insertu klonu CosS pozwoliło na oddzielenie, z obszaru R1, jednego markera wskutek pojedynczej rekombinacji (0.1 cM). W wyniku screeningu biblioteki BAC, przy użyciu tego markera, zidentyfikowano klon BAC BA100e13. Trzy zdarzenia rekombinacyjne oddzieliły dalszy koniec BA100e13 od R1. Bliższy koniec BA100e13 w stosunku do R1 umożliwił identyfikację BA47f2. Dalszy koniec BA47f2 w stosunku do R1 pokrywał się z BA100e13 i oddzielony od R1 w wyniku pojedynczej rekombinacji. Bliż szy koniec oddzielił się wspólnie z R1, podobnie jak następne analizowane końce BAC (prawa stoma figury 1). Koniec BA47f2, który oddzielił się wspólnie z R1, pozwolił na identyfikację klonu. Niepokrywający się z BA47f2 koniec BA27c1 pozwolił na identyfikację klonów BA122p13 i BA121o1. Sekwencja niepokrywającego się z BA27c1 koniec BA121o1 wykazywała duże podobieństwo (37% identyczności, 56% podobieństwa sekwencji aminokwasowej) do genu oporności Prf z pomidora na Pseudomonas syringae (Salmeron et al. 1996). Ten fragmentu podobny do znanego genu RGL został wykorzystany jako sonda w powtórnym screeningu biblioteki BAC. Dzięki sondzie RGL zidentyfikowano, obok BA122p13, kilka pozytywnych klonów, z których dwa BA87d17 i BA76o11, poddano dalszej analizie. Klony te zawierały kopie genu RGL o pełnej długości, które uważano za potencjalnych kandydatów genu R1. Nienakładające się końce BA76o11 i BA87d17 oddzieliły się wspólnie z R1.

Markery końca BAC, które przyczyniły się do skonstruowania fizycznej mapy, zostały także wykorzystane do przypisania klonów BAC do chromosomu P6/210 (R1r1), niosącego allel R1 lub r1. Klony BA100e13, BA47f2 i BA87d17 (figura 1) były w pozycji cis w stosunku do allela R1, podczas gdy klony BA121o1, BA122p13 i BA76o11 pochodziły od homologu posiadającego R1 (figura 1). Na podstawie użytych markerów nie można było przypisać klon BA27c1 do żadnego z chromosomów R1 i r1.

P r z y k ł a d 3: Klony cDNA potencjalnych R1

Całe inserty klonów BAC BA121o1 i BA76o11 użyto jako sond dzięki którym wyizolowano, odpowiednio, sześć i osiem klonów cDNA z biblioteki cDNA przygotowanej z zainfekowanych liści o genotypie P41 (R1r1). Osiem z 14 klonów cDNA było podobnych do znanych roślinnych genów oporności. Najwyższy stopień podobieństwa określono dla genu oporności Prf z pomidora, na Pseudomonas syringae (Salmeron et al. 1996). Sekwencje cDNA ośmiu potencjalnych kandydatów były w około 80-90% identyczne. Klon cDNA c76-2, o długości 2292 nukletydów, był identyczny, poza sekwencjami intronów, z genomową sekwencją klonu g10, subklonu odpowiadającego części klonu BA87d17 (patrz dalej). Porównanie sekwencji klonu c76-2 ze, znajdującymi się w bazach danych, znanymi sekwencjami genów oporności pokazało, że klon ten był niekompletny. Wykorzystując analizę RACE, sekwencja cDNA została wydłużona o 1943 nukleotydy na końcu 5'. W ten sposób uzyskano sekwencje cDNA o pełnej długości 4235 nukletydów, w tym niepodlegający translacji obszar 5' o długości 59 nukleotydów oraz niepodlegającą translacji sekwencję 3' o długości 297 nukleotydów pomiędzy kodonem stop i łańcuchem poły A. cDNA zawierało kodon startu transkrypcji w pozycji 2223, genomowej sekwencji, która odpowiadała pierwszej metioninie z sekwencji uzyskanej z klonu g10 (figura 4B).

PL 211 212 B1

Zidentyfikowano dwie adeniny w pozycjach -3 i +4 (gdzie a z ATG jest w pozycji +1), określane jako sekwencja rozpoznawana przez rybosomy u roślin, drożdży i ssaków (Kozak 1991).

Primery PCR, specyficzne dla cDNA klonu c76-2, zostały zaprojektowane w oparciu o porównanie sekwencji z siedmioma pozostałymi cDNA kandydatów. Primery 76-2sf2 i 76-2SR (patrz Materiały i Metody) wygenerowały produkt PCR o wielkości 1.4 kb jedynie u rodzica P41 (R1r1), natomiast u rodzica P40 (r1r1) nie wygenerowały takiego produktu (figura 2). Obecność tego polimorfizmu sugeruje, że BAC BA87d17 (otrzymany z chromosomu zawierającego R1) zawierał gen R1, nawet jeśli informacje uzyskane na podstawie mapowania nadal wskazywały na brak obecności rekombinacji pomiędzy dalszym końcem tego klonu BAC i R1.

P r z y k ł a d 4: Dopełnienie fenotypu R1

Genomowa sub-biblioteka w binarnym wektorze pCLD04541 (patrz Materiały i Metody) została skonstruowana na podstawie BA87d17 (76 kb). Insert miał średnio długość 10 kb. Bibliotekę poddano screeningowi przez hybrydyzację kolonii z sondą RGL klonu BA121o1. Pozytywne klony były oceniane pod kątem obecności kompletnej kopii potencjalnego genu RGL na podstawie wielkości amplifikowanych produktów PCR (primery w kierunku 5' na podstawie T3 i T7 sekwencji wektora a primery w kierunku 3' na podstawie RGL). Klony sprawdzano takż e stosują c primery (76-2sf2 i 76-2SR) specyficzne dla cDNA klonu c76-2. Wybranym subklonem g10-2 transformowano A. tumefaciens. Trzy różne kolonie bakteryjne zostały użyte do transformacji pędów wrażliwej odmiany Desiree. W wyniku wykonania trzech transformacji stworzono piętnaście niezależnych linii transgenicznych a w czterech niezależnych eksperymentach sprawdzono ekspresję oporności na odmianę 4 P. infestans (tabela 2). T a b e l a 2. Test na oporność transgenicznych linii ziemniaka, transformowanych klonem g10, na odmianę 4 P. infestans. Linie transgeniczne sprawdzano, w czterech niezależnych doświadczeniach z trzema listkami z każdej linii, na obecność ekspresji nadwrażliwej oporności na odmianę 4 P. infestans.

	Nr linii transgenicznej	Opornośćc
10-2a	1b	S
10-2	2	R
10-2	3	R
10-2	4	R
10-5	1	R
10-5	2	S
10-5	3	n.d.
10-5	4	n.d.
10-5	5	R
10-23	1	n.d.
10-23	2	R
10-23	3	R
10-23	4	R
10-23	5	R
10-23	6	S

Dziewięć linii transgenicznych zgodnie wykazało typową odpowiedź HR, podobną do oporności linii P41 posiadającej R1 (figura 3); wyniki badań trzech linie były niespójne a pozostałe trzy odmiany były wrażliwe, podobnie jak kontrola Desiree, która nie była transformowana. Zatem wywnioskowano, że subklon g10 zawierał funkcjonalny gen R1.

Wszystkie linie transgeniczne, o fenotypie R1, zawierały gen odpowiadający cDNA 76-2, co udowodniono obecnością produktu PCR o długości 1.4 kb, zamplifikowanego primerami 76-2sf2 i 76-2SR. Produktu tego nie było w nietransformowanej kontroli Desiree oraz w żadnym klonie BAC,

PL 211 212 B1 przedstawionym na figurze 1, będącym przedstawicielem kontigów wokół R1, za wyjątkiem BA87d17 (figura 2).

P r z y k ł a d 5: Struktura genu R1

Subklon g10, który zawierał gen R1, został zsekwencjonowany; patrz SEQ ID NO: 1. Sekwencja składała się z 10,388 nukleotydów i zawierała jeden gen, którego sekwencja wykazywała podobieństwo do innych roślinnych genów oporności. W bazie danych GenEMBL nie zidentyfikowano żadnej innej ramki odczytu ani nie stwierdzono homologii sekwencji. Na podstawie porównania sekwencji z cDNA c76-2 oraz z produktem 5' RACE stwierdzono obecność trzech eksonów i trzech intronów. Dwa introny o długości 92 bp (pozycja 4878 do 4970) i 126 bp (pozycja 6103 do 6229) przerywały sekwencję kodującą. Trzeci intron, o długości 81 bp (pozycja 6323 do 6404), był położony w nie podlegającym translacji obszarze 3', znajdującym się poniżej kodonu stop (fig. 4a). Otrzymano sekwencję aminokwasową polipeptydu o długości 1293 aminokwasów o ciężarze molekularnym 149.4 kDa (figura 4B). Ta sekwencja aminokwasową genu R1 jest najbardziej podobna do (40% identyczności) genu oporności Prf, pochodzącego z pomidora, na P. syringae (Salmeron et al. 1996). W ten sposób uzyskane białko R1 posiada domniemaną domenę z miejscem wiązania nukleotydów (NBS), która składa się z pętli-P (aminokwasy 572-578) oraz motywów kinazy 2 (aminokwasy 649-653) i kinazy 3a (aminokwasy 677-682) (Figura 4B). Poniżej motywów kinazy znajdowały się inne sekwencje wykazujące podobieństwo do konserwatywnych, wśród genów oporności, domen o nie znanych funkcjach: GLPL (QLPL (SEQ ID NO: 10) w R1), CKLY (CFLY (SEQ ID NO: 12) w R1) oraz MHD (LHD w R1). Dzięki zastosowaniu algorytmu ExPASY w sekwencji aminokwasowej R1 udało się zidentyfikować inne konserwatywne motywy: 4 miejsca mirystylizacji, 9 miejsc glikozylacji, 43 miejsca fosforylacji i 1 miejsce amidyzacji. Potencjalne powtórzenie bogate w leucynę (LRR) z R1 zawiera 15-16 niedoskonałych powtórzeń, które znajdują się w karboksy-końcowej części genu. Białko R1 zawiera suwak leucynowy między aminokwasami 308 i 329 (Hammond-Kosack and Jones, 1997), podobnie jak niektóre roślinne białka R posiadające cytoplazmatyczne LRR.

P r z y k ł a d 6: Genomowa organizacja obszaru R1 Analiza Southem'a pokazała, że R1 jest członkiem rodziny genów.

Primery 76-2sf2 i 76-2SR, specyficzne dla R1, pozwoliły na amplifikację fragmentu 1.4 kb z BA87dl7 {R1), natomiast nie udało się zamplifikować takiego fragmentu w nienakładających się klonach BA121o1, BA122p13 i BA76o11 (r1) (figura 2). Analiza sekwencji DNA BA87d17 (R1) i BA122p13 (r1) wykazała, że w skład BA87d17 wchodziło dwóch przedstawicieli (o wysokiej homologii) rodziny genu R1, R1 odpowiadający funkcjonalnemu genowi R1 oraz r1.1, który był ortologiczny z allelem r1.2 wBA122p13.

Oczywiste jest, że niniejszy wynalazek może być wykorzystywany inaczej niż zostało to przedstawione w powyższym opisie i przykładach. W świetle powyższego opisu dopuszczalne są liczne modyfikacje i wariacje niniejszego wynalazku i są on w zakresie dołączonych zastrzeżeń.

Każdy dokument, cytowany (włączając patenty, zgłoszenia patentowe, artykuły z czasopism naukowych, abstrakty, protokoły laboratoryjne, książki, sekwencje i inne dokumenty) w Tle Wynalazku, Opisie, Przykładach i Liście Sekwencji, znajduje się tutaj, jako odnośnik.

PL 211 212 B1

Literatura

1. Appei, R-D., Bairoch, A. and Hochstrasser, D.F. (1994). A new generation of Information retrieval tools for biologists: the example of the ExPASY www server. Trends Blochem. Sci. 19:258-260

2. Ballvora, A., Schomack, S., Baker, B.J., Ganal, M., Bonas, U. and Lahaye, T. (2001) Chromosome landing at the tomato Bs4 locus. Mol Gen Genet, in press.

3. Bendahmane, A., Kanyuka, K. and Baulcombe, D.C. (1999) The Rx gene from potato Controls separate virus resistance and Cell death responses. The Plant Cell 11:781-791.

4. Bendahmane, A., Querci, M., Kanyuka, K. and Baulcombe, D.C. (2000) Agrobacterium transient expression system as a tool for the isolation of disease resistance genes: application to the Rx2 locus in potato. The Plant Journal 21: 73-81.

5. Dangl, J.L. and Jones, J.D.G. (2001). Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411:826-833.

6. De Jong, W., Forsyth, A., Leister, D, Gebhardt, C. and Baulcombe, D.C. (1997). A potato hypersensitive resistance gene against potato virus X maps to a resistance gene cluster on chromosome V. Theor Appl Genet 95:153-62.

7. Dong F, Song J, Naess SK, Helgeson JP, Gebhardt C, Jiang J (2000) Development and applications of a set of chromosome-specific cytogenetic DNA markers in potato. Theor Appl Genet

101: 1001-07.

8. EI-Kharbotly. A., Leonards-Schippers ,C., Huigen, D.J., Jacobsen, E., Pereira, A., Stiekema, W.J., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1994). Segregation analysis and RFLP mapping of the R1 and R3 alleles conferring race specific resistance to Phytophthora infestans in progenies of dihaploid potato parents. Mol. Gen. Genet. 242: 749-754.

9. EI-Kharbotly, A., Palomino-Sanchez, C, Salamini, F., Jacobsen, E. and Gebhardt, C. (1996). R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theor Appl Genet 92: 880-884.

10. Ellis, J.G., Lawrence, G.J., Luck, J.E. and Dodds, P.N. (1999). Identification of regions in alleles of the flax rust resistance gene L that determine differences in gene-for-gene specificity. Plant Cell 11:495-506.

11. Ellis, J.G., Dodds, P.N. and Pryor, T. (2000). Structure, function and evolution of plant disease resistance genes. Curr Opin Plant Biol 3:278-284.

12. Ewing, E.E., Simko, I., Smart, C.D., Bonierbale, M.W., Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E. (2000). Genetic mapping from field tests of quantitative and qualitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Mol Breeding 6: 25-36.

13. Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1984). A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity (addendum). Anal Blochem 137: 266-267.

14. Flor, H.H (1971) Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol 9: 275-296

15. Folkertsma, R.T., Spassova, M.I., Prins, M., Stevens, M.R., Hille, J. and Goldbach R.W. (1999). Construction of a bacterial artificial chromosome (BAC) library of Lycopersicon esculentum cv. Stevens and its application to physically map the Sw-5 locus. Molecular Breeding 5:197-207.

16. Fry, W.E. and Goodwin, S.B. (1997). Resurgence of the Irish potato famine fungus. Bioscience 47: 363-371.

17. Gebhardt, C, Ritter, E., Debener, T., Schachtschabel, U., Walkemeier, B., Uhrig, U. and Salamini, F. (1989). RFLP analysis and linkage mapping in Solanum tuberosum. Theor Appl Genet

78:65-75.

18. Gebhardt, C. and Valkonen, J.P.T. (2001). Organization of genes controlling disease resistance in the potato genome. Annu Rev. Phytopathol. 39: 79-102.

19. Hammond_Kosack, K. and Jones, J.D. (1997). Plant disease resistance genes Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 575-607.

20. Jones, D.A., Thomas, C.M., Hammond-Kosack. K.E., BaUnt-Kurti, P.J. and Jones, D.J.G. (1992). Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants. Transgenic Res. 1:285-297.

21. Jones, D.A. and Jones, D.J.G. (1997). The roles of leucine rich repeats in plant defences. Adv Bot Res Adv Plant Pathol 24:90-167.

PL 211 212 B1

22. Judelson, H.S. (1997). The genetics and biology of Phytophthora infestans: Modem approaches to a historical challenge. Fungal Genet and Biol 22: 65-76.

23. Kamoun, S. (2001). Nonhost resistance to Phytophthora: Novel prospects for a classical problem. Curr Opin Plant Biol 4:295-300.

24. Kreike, C.M., De Koning, J.R.A., Vinke, J.H., Van Ooijen, J.W., and Stiekema, W.J. (1994). Quantitatively-inherited resistance to Globodera pallida is dominated by one major locus in Solanum spegazzinii. Theor Appl Genet 88: 764-69.

25. Kozak, M. (1991) Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem 266:19867-19870.

26. Leister, D., Ballvora, A., Salamini., F, and Gebhardt, C. (1996). A PCR based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nature Genetics 14: 421-429.

27. Leister, D., Berger, A., Thelen, H., Lehmarm, W., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1997). constmction of a potato YAC library and Identification of clones linked to the disease resistance loci R1 and Grol. Theor Appl Genet 95: 954-960.

28. Leonards-Schippers, C, Gieffers, W., Gebhardt, C. and Salamini, F. (1992). The R1 gene conferring race-specific resistance to Phytophtora infestans in potato is located on potato chromosome V. Mol Gen Genet 233:278-283.

29. Leonards-Schippers, C, Gieffers, W., Schafer-Pregl, R., Ritter, E., Knapp, S.J., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1994). Quantitative resistance to Phytophthora infestans in potato: a case study for QTL mapping in an allogamous plant species. Genetics 137: 67-77.

30. Li,X., van Eck, H.J., Rouppe van der Voort, J., Huigem, D-J., Stam, P., and Jacobsen, E. (1998). Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: The R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theor Appl Genet 96: 1121-28.

31. Meksem, K. Leister, D. Peleman, J., Zabeau, M., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1995). A high-resolution map of the vicinity of the R1 locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers Mol Gen Genet 249:74-81.

32. Meksem, K., Zobrist, K., Ruben, E. Hyten, D., Quanzhou, T., Zhang, H-B. and Lightfoot, D.A. (2000). Two large-insert soybean genomie libraries constructed in a binary vector: applications in chromosome walking and genome wide physical mapping. Theor Appl Genet 101:747-755.

33. Naess, S.K., Bradeen, J.M., Wielgus, S.M., Habedach, G.T., McGrath, J.M., and Helgeson, J.P. (2000). Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor Appl Genet 101: 697-704.

34. Nakamura, S., Asakawa, S., Ohmido, N., Fukui, K., Shimizu, N. and Kawasaki, S. (1997). Construction of an 800-kb contig near-centromeric region of the rice blast resistance gene Pi-ta using a highly representative rice BAC library. Mol Gen Genet 254:611-620.

35. Oberhagemann, P., Chatot-Balandras, C, Bonnel, E., Schafer-Pregl, R., Wegener, D., Palomino, C, Salamini, F. and Gebhardt, C. (1999). A genetic analysis of quantitative resistance to late blight in potato: Towards marker assisted selection. Mol Breed5: 399-415.

36. Person, C, Samborski, D.J. and Rohringer, R. (1962) The gene-for-gene concept. Nature 194: 561-562

37. Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989). Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene. The EMBO Journal 8 (1):23-29.

38. Ross, H. (1986). Potato breeding. Problems and perspectives. Adv Plant Breed, Supplement 13.

39. Reiser, L., Modrusan, Z., Margossian, L., Samach, A., Ohad, N., Haughn, G.W. and Fischer, R. (1995). The BELLl Gene Encodes a Homeodomain Protein Involved in Pattem Formation in the Arabidopsis Ovule Primordium. Cell 83:735-742.

40. Ritter, E., Debener, T., Barone, A., Salamini, F. and Gebhardt, C. (1991). RFLP mapping on potato chromosomes of two genes controlling extreme resistance to potato virus X (PVX). Mol Gen Genet 227: 81-85.

41. Rouppe van der Voort, J., Wolters, P., Folkertsma, R., Hutten, R., van Zandvoort, P., Vinke, H., Kanyuka, K., Bendahmane, A., Jacobsen, E., Janssen, R. and Bakker, J. (1997). Mapping of the cyst nematode resistance locus Gpa2 in potato using a strategy based on comigrating AFLP markers. Theor Appl Genet 95: 874-80.

PL 211 212 B1

42. Rouppe van der Voort, J., van der Vossen, E., Bakker, E., Overmars, H., van Zandvoort, P., Hutten, R., Klein-Lankhorst, R. and Bakker, J. (2000). Two additive QTLs conferring broad-spectrum resistance in potato to Globodera pallida are localized on resistance gene clusters. Theor Appl Genet

101:1122-30.

43. Salaman, R.N. (1985). The potato famine: its causes and consequences. In The History and Social Influence of the Potato, revised impression, ed. JG Hawkes, pp 289-316. Cambridge/ New York/New Rochelle/Melboume/Sydney: Cambridge University Press.

44. Salmeron, J.M., Oldroyd, G.E., Rommens C.M., Scofield, S.R., Kim, H-S., Lavelle, D.T., Dahlbeck, D. and Staskawicz, B.J. (1996). Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell, Vol. 86:123-133.

45. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

46. Singh, A.K., Salamini, F. and Uhrig, H. (1989). Chromosome pairing in 14 FI hybrids among 11 diploid potato species. J Genet Breed 43:1-5.

47. Stahl, E.A., Dwyer, G., Mauricio, R., Kreitman, M. and Bergelson, J. (1999) Dynamics of disease resistance polymorphism at the Rpml locus in Arabidopsis. Nature 400:667-671.

48. Tanksley SD, Ganal MW, Prince JP, de Vicente MC, Bonierbale MW, Broun P, Fulton TM, Giovannoni JJ, Grandillo S, Martin GB, Messeguer R, Miller JC, Miller L, Paterson AH, Pineda O, Roder MS, Wing RA, Wu W, Young ND. 1992. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132: 1141-60.

49. Van der Lee, T., Robold, A., Testa, A., van't Klooster, J.W. and Govers, F. (2001). Mapping of Avirulece Genes in Phytophthora infestans With Amplified Fragment Length Polymorphism Markers Selected by Bulked Segregant Analysis. Genetics 157: 949-956.

50. Van der Vossen, E.A.G., Rouppe van der Voort, J.N.A.M., Kanyuka, K., Bendahmane, A., Sandbrink, H., Baulcombe, D.C, Bakker, J., Stiekema, W.J. and Klein-Lankhorst, R.M. (2000) Homologues of a single resistance-gene cluster in potato confer resistance to distinct pathogens: a virus and a nematode. The Plant Journal 23: 567-576.

51. Wastie, R.L. (1991). Breeding for resistance. Adv Plant Pathol 7: 193-223.

52. Wen-jun, S. and Forde, B.G. (1989). Efficient transformation of Agrobacterium spp. By high voltage electroporation. Nuc Acids Res 17:8385

53. Yang, D., Parco, A., Nandi, S., Subudhi, P., Zhu, Y., Wang, G. and Huang, N. (1997). Construction of a bacterial artificial chromosome (BAC) library and Identification of oveR1apping BAC clones with chromosome 4-specific RFLP markers.

54. Yang, D., Sanzhes, A., Khush, G.S., Zhu, Y., and Huang, N. (1998). Construction of a BAC contig containing the xa5 locus in rice. Theor Appl Genet 97:1120-1124.

PL 211 212 B1

<110>

Wykaz sekwencji Max-Planck-Gesellschaft zur Fórderung der Wissenschaften e.V

KWS Saat AG

<120>	Gen oporności pochodzenia roślinnego
<130>	F 2298 PCT
<150>	EP 01120670.3
<151>	2001-08-31
<160>	12
<170>	Patentln version 3.1
<210>	1
<211>	10388
<212>	DNA
<213>	Solanum tuberosum

<220>

<221>	Intron
<222>	(4878) . . (4970)

<223>

<220>
<221>	Intron
<222>	(6103)..(6229)

<220>
<221>	Intron
<222>	(6103)..(6229)
<223>

PL 211 212 B1 <220>

<221> Intron <222> (6323)..(6404) <223>

<220>

<221> CDS <222> (2223) . . (4877) <223>

<220>

<221> CDS <222> (4971) . . (6102) <223>

<220>

<221> CDS <222> (6230) . . (6321) <223>

<220>

<221> 5'UTR <222> (2164) . . (2222) <223>

<220>

<221> promotor <222> (1) . . (2164) <223>

PL 211 212 B1

<220>
<221>	3 ' UTR
<222>	(6405) .	. (6702
<223>
<400>	1

ttaatatata gatggaatcg gtgttttaaa aggcagggcg cgaggcgaga cgttttactt 60 agtatagagc gaggcgtaag cctaatgatt catttttcta agaacgatat taattcatta 120 aattacttaa ttataataaa tttatacact tcaaatacac ttggatatga ataagtaatt 180 atccttcacg agattcaaat gaaaaataag tggagttaat tagagtaaag tagagtaatt 240 taaacacttt agtctgaatc tttatacatt atacaaaaaa agtaattata tttcaccaaa 300 ttcaaatgga aattaaaaat atatgaagat aattacaaca caagtgttat gtgtcagttg 360 gaaagctcaa gcgtgggtcc taccatactc catgacattt cacttttagg gtatgattcg 420 taatttaatg aaaatgatga cctttttttt tggagttagt aatgaggtct aaataactaa 480 acatagagga caaccctctt aagcaagcaa atcttgcaat aacatttcaa agaccatgat 540 atcctcaaat tttttattaa tgactaaaaa ctaacatgtt aaactctcct gtgtattatt 600 cattgtaata ttttttttgg ttaaatcatt cattgtaaaa taaattcatt atacataatg 660 ttaatttttt cttaataatc aaatattatt catcgtatat ttactaaaaa tattcaatgt 720 atgatgatga gagaataaac tatataagaa atataagaaa tttaatgaaa ccatattcaa 780 aaatggcttc tcaatgtgtc aaaaaatcaa caatgacaga tcaaatacat tatcttattt 840 ctttaaattg tgttagatat atttgtactt ttagaggatt attaatttat aatatcaatg 900 aagccatata tttatataag agtcttctga aaatatatta tcttattatc ttatcaaaat 960 ggatgatttt ttccattgat ccaagtcggg accaaaaaag aatattatct caaagagatt 1020 attaatttac caaatattaa tttagtgagg ttttactgta atttgggtgt ggtccatgac 1080 catatatatt ttgaaaaaaa actgctttgt aaattccaag ttggaacgac atttctacag 1140 ccaatgttga aatactattc ttgtcctgat taggagactt attatttcat ttcatatata 1200 gataggtccc ttgagaacta gaaagattaa attaaagatt gagatccaat aatgcatatg 1260 aacacagaac atttgtcttt tttccaaagg ggaccatata tatataagat gtcattgtgc 1320 tttatgtatg gaagagagaa taacgatctc atatatatat ctcatatata tatatatcat 1380 ctaaaataag atgttttaaa ccatctggta ttcggtatac aatttacact aaaaagacca 1440

PL 211 212 B1

aacaggtggg	aaggacacaa	acattagatc	aaaaattaag	gttaagtgat	teagatatea	1500
agaggaacaa	tatactaatt	ggaacaaatt	aaagtatcct	cacttacaat	ggtcatatat	1560
agaagctact	taggtaatac	tctcactatc	cctaattatt	tgtccacttt	taaattagca	1620
cacctattaa	taaaacaatt	attggeatag	tgagtttacc	attttacctt	tttaattatg	1680
aagcgaatga	attaaaaact	taagatatta	aaaaaattct	gcctttaaca	aagtaattat	1740
ttgagggtat	aataggtaaa	aagaaattgt	ccttttttta	tttgtcaaaa	tgaacaagta	1800
gttagggaca	actaaaaaag	gaaaaatgga	tgagtaatta	ggaacggagg	gagtataaaa	1860
cactgtcatc	actcaaaaaa	tatgagtatc	ttgaettgea	caacataggt	acttaatcaa	1920
agactcaata	tacaaatctc	taaagtaaat	ttgtatttgt	atatacagtc	tctttgaaag	1980
cccaatttgt	ataaaatatt	taaatgcagc	tagatataca	aacggaaatt	ageatageaa	2040
ctgaaactat	agatatagaa	cataattagg	caatgacttt	gttttttgtt	tgtctgcctc	2100
acactttatt	tgactgcctt	ccttgaatac	tttgaatatt	ctaagtacgc	cagctataag	2160
gtgaagaaag	aattaaacta	taatactctg	tattgetett	cttccataat	agtgtaacaa	2220
gg atg aat Met Asn	ttc aac aat gaa ttg tct gat ctg Phe Asn Asn Glu Leu Ser Asp Leu	aaa aat cgc Lys Asn Arg	ttc eta Phe Leu	2267

10 15 ttt agg acg ctg aga gcc cag aaa tgc tcg gat gtt gca aga gat ega 2315

Phe Arg Thr Leu Arg Ala Gln Lys Cys Ser Asp Val Ala Arg Asp Arg

25 30 ata gat ttc ttt ata tgg gag tta aaa ttc ctt aat tgt ttt ctc cat 2363

Ile Asp Phe Phe Ile Trp Glu Leu Lys Phe Leu Asn Cys Phe Leu His

40 45 ttg cag agc ttc gct ttt gca agt gaa tgt ggt atg eta gat atc tca 2411

Leu Gln Ser Phe Ala Phe Ala Ser Glu Cys Gly Met Leu Asp Ile Ser

55 60 cag aaa atg ata gaa att tgc aag agg ttt aat aca cca cct cca cat 2459

Gln Lys Met Ile Glu Ile Cys Lys Arg Phe Asn Thr Pro Pro Pro His

70 75 aat tca ttt gca tac tgg aag gag gta att tgc aag agg ctg tgc gct 2507

Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Lys Glu Val Ile Cys Lys Arg Leu Cys Ala

85 90 95 att agc atc cag ccg gat gct agt tca gat gat gga ttt gca tgc tgg 2555

Ile Ser Ile Gln Pro Asp Ala Ser Ser Asp Asp Gly Phe Ala Cys Trp

100 105 110 aag aaa gta att tgg aag act aag caa gaa ttc aga gct aaa tac tcc 2603

Lys Lys Val Ile Trp Lys Thr Lys Gln Glu Phe Arg Ala Lys Tyr Ser

115 120 125 ttt cca aaa aca eta ctt gca gac aac aag gta tat gat gat gat gat 2651

Phe Pro Lys Thr Leu Leu Ala Asp Asn Lys Val Tyr Asp Asp Asp Asp

PL 211 212 B1

130 135 140

act Thr

aat Asn 145

ccc Pro

aaa Lys

ttt Phe

gtg Val

atg Met 150

gaa Glu

ttc Phe

atc Ile

gat Asp

get Ala 155

gtt Val

gtg Val

ggg Gly

aat Asn

2699

ctc

aat

gtt

eta

gtc

aag

atc

aat

gat

cca

tct

tea

ttg

Ctt

ttt

gtt

2747

Leu

Asn

Val

Leu

Val

Lys

Ile

Asn

Asp

Pro

Ser

Ser

Leu

Leu

Phe

Val

160

165

170

175

cca

gga

ccc

aag

gaa

caa

ata

gaa

caa

gtg

tta

aag

gag

ttg

aag

tta

2795

Pro

Gly

Pro

Lys

Glu

Gin

Ile

Glu

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

180

185

190

ttg

aga

ttt

ttt

gtc

tgc

ttt

gtt

tea

aac

aaa

tgt

ata

gag

cct

caa

2843

Leu

Arg

Phe

Phe

Val

Cys

Phe

Val

Ser

Asn

Lys

Cys

Ile

Glu

Pro

Gin

195

200

205

tac

caa

cat

act

act

ttt

tat

act

cac

get

tta

att

gag

get

age

cac

2891

Tyr

Gin

His

Thr

Thr

Phe

Tyr

Thr

His

Ala

Leu

Ile

Glu

Ala

Ser

His

210

215

220

atc

gca

atg

gtt

gtg

tgg

ttg

aat

ttg

cca

atc

tat

gga

aac

aga

aat

2939

Ile

Ala

Met

Val

Val

Trp

Leu

Asn

Leu

Pro

Ile

Tyr

Gly

Asn

Arg

Asn

225

230

235

caa

gac

ttg

get

tea

agt

gaa

gtt

agt

tgt

ttg

Ctt

tct

gat

ttc

atg

2987

Gin

Asp

Leu

Ala

Ser

Ser

Glu

Val

Ser

Cys

Leu

Leu

Ser

Asp

Phe

Met

240

245

250

255

gaa

atg

aag

att

aag

tcc

att

cag

cca

gac

atc

age

ege

aac

aat

att

3035

Glu

Met

Lys

Ile

Lys

Ser

Ile

Gin

Pro

Asp

Ile

Ser

Arg

Asn

Asn

Ile

260

265

270

tat

att

gat

gtc

ttg

agg

gcg

ttg

aag

tea

acc

ata

cca

caa

get

caa

3083

Tyr

Ile

Asp

Val

Leu

Arg

Ala

Leu

Lys

Ser

Thr

Ile

Pro

Gin

Ala

Gin

275

280

285

gat

aag

cat

get

get

gag

agt

ggc

att

gtg

gag

act

cca

aca

cac

aat

3131

Asp

Lys

His

Ala

Ala

Glu

Ser

Gly

Ile

Val

Glu

Thr

Pro

Thr

His

Asn

290

295

300

ctg

atg

gtt

ggt

ttg

agt

gat

caa

atg

gee

aac

ctt

cag

gag

atg

ctc

3179

Leu

Met

Val

Gly

Leu

Ser

Asp

Gin

Met

Ala

Asn

Leu

Gin

Glu

Met

Leu

305

310

315

tgc

ctt

eta

aga

gac

aat

ctc

att

cat

ctg

cca

ata

eta

gat

ctg

gaa

3227

Cys

Leu

Leu

Arg

Asp

Asn

Leu

Ile

His

Leu

Pro

Ile

Leu

Asp

Leu

Glu

320

325

330

335

ttt

cat

ctt

caa

gat

atg

gat

tct

gtt

att

gtt

gat

gee

gga

ctt

ctt

3275

Phe

His

Leu

Gin

Asp

Met

Asp

Ser

Val

Ile

Val

Asp

Ala

Gly

Leu

Leu

340

345

350

att

tac

tea

tta

tat

gat

atc

aag

ggg

cag

aag

gaa

gac

aca

aca

ttg

3323

Ile

Tyr

Ser

Leu

Tyr

Asp

Ile

Lys

Gly

Gin

Lys

Glu

Asp

Thr

Thr

Leu

355

360

365

gag

gat

atc

aac

cag

gca

ctt

ggt

ttt

gat

ctt

ccc

aga

aac

att

gag

3371

Glu

Asp

Ile

Asn

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

Asp

Leu

Pro

Arg

Asn

Ile

Glu

370

375

380

PL 211 212 B1

cct Pro

atc Ile 385

aag Lys

gca Ala

atg Met

atc Ile

aac Asn 390

ctt Leu

gtc Val

atg Met

caa Gin

aag Lys 395

gca Ala

ttt Phe

caa Gin

tgt Cys

3419

aac

ttg

cca

agg

att

cat

gga

eta

ggt

tat

gtc

gat

ttt

eta

ttg

aaa

3467

Asn

Leu

Pro

Arg

Ile

His

Gly

Leu

Gly

Tyr

Val

Asp

Phe

Leu

Leu

Lys

400

405

410

415

aac

ctg

aag

gat

ttc

caa

ggc

cgt

tat

tca

gat

tca

ctc

gat

ttc

ctc

3515

Asn

Leu

Lys

Asp

Phe

Gin

Gly

Arg

Tyr

Ser

Asp

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

420

425

430

aag

aat

caa

ctt

caa

gtt

att

caa

act

gaa

ttt

gag

agc

ttg

caa

cct

3563

Lys

Asn

Gin

Leu

Gin

Val

Ile

Gin

Thr

Glu

Phe

Glu

Ser

Leu

Gin

Pro

435

440

445

ttc

ttg

aag

gtt

gtc

gta

gaa

gag

cca

cac

aat

aag

ctc

aag

aca

ctg

3611

Phe

Leu

Lys

val

Val

Val

Glu

Glu

Pro

His

Asn

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

450

455

460

aat

gaa

gat

tgt

gct

aca

cag

ata

att

agg

aaa

gca

tat

gag

gtg

gaa

3659

Asn

Glu

Asp

Cys

Ala

Thr

Gin

Ile

Ile

Arg

Lys

Ala

Tyr

Glu

Val

Glu

465

470

475

tat

gta

gtt

gat

gct

tgt

ata

aac

aaa

gag

gtt

cct

cag

tgg

tgc

atc

3707

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Cys

Ile

Asn

Lys

Glu

Val

Pro

Gin

Trp

Cys

Ile

480

485

490

495

gag

cgt

tgg

ctc

ctg

gat

atc

ata

gag

gag

att

act

tgt

atc

aaa

gca

3755

Glu

Arg

Trp

Leu

Leu

Asp

I le

Ile

Glu

Glu

Ile

Thr

Cys

Ile

Lys

Ala

500

505

510

aag

att

cag

gaa

aag

aac

acg

gtt

gag

gat

aca

atg

aag

act

gtc

att

3803

Lys

Ile

Gin

Glu

Lys

Asn

Thr

Val

Glu

Asp

Thr

Met

Lys

Thr

Val

Ile

515

520

525

gct

cgt

aca

tca

tca

aaa

ctg

gca

agg

act

cca

agg

atg

aat

gaa

gag

3851

Ala

Arg

Thr

Ser

Ser

Lys

Leu

Ala

Arg

Thr

Pro

Arg

Met

Asn

Glu

Glu

530

535

540

att

gtt

ggg

ttt

gag

gat

gtc

ata

gaa

aat

tta

aga

aaa

aaa

eta

ctg

3899

Ile

Val

Gly

Phe

Glu

Asp

Val

Ile

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Lys

Leu

Leu

545

550

555

aat

gga

acc

aaa

ggg

caa

gat

gtc

att

tca

att

cac

ggc

atg

cca

ggt

3947

Asn

Gly

Thr

Lys

Gly

Gin

Asp

Val

Ile

Ser

Ile

His

Gly

Met

Pro

Gly

560

565

570

57 5

tta

ggt

aag

acg

act

tta

gcc

aac

agt

ctc

tat

tct

gac

agg

tca

gtt

3995

Leu

Gly

Lys

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Ser

Leu

Tyr

Ser

Asp

Arg

Ser

Val

580

585

590

ttt

tct

caa

ttt

gat

att

tgt

gca

caa

tgt

tgt

gtg

tct

caa

gta

tat

4043

Phe

Ser

Gin

Phe

Asp

Ile

Cys

Ala

Gin

Cys

Cys

Val

Ser

Gin

Val

Tyr

5 95

600

605

tct

tat

aag

gac

tta

ata

ttg

gcc

ttg

eta

cgt

gat

gct

att

ggt

gag

4091

Ser

Tyr

Lys

Asp

Leu

Ile

Leu

Ala

Leu

Leu

Arg

Asp

Ala

Ile

Gly

Glu

610 615 620

PL 211 212 B1

ggt Gly

tet Ser 625

gtg Val

cgt Arg

aga Arg

gaa Glu

ctt Leu 630

cat His

gcc Ala

aat Asn

gaa Glu

tta Leu 635

get Ala

gat Asp

atg Met

ctt Leu

4139

cgc

aaa

act

eta

ttg

ccc

ega

agg

tac

ctt

atc

ctt

gtt

gat

gac

gtg

4187

Arg

Lys

Thr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Tyr

Leu

Ile

Leu

Val

Asp

Asp

Val

640

645

650

655

tgg

gaa

aat

agt

gtt

tgg

gat

gat

tta

aga

ggt

tgt

ttt

cca

gat

gtc

4235

Trp

Glu

Asn

Ser

Val

Trp

Asp

Asp

Leu

Arg

Gly

Cys

Phe

Pro

Asp

Val

660

665

670

aat

aac

aga

age

aga

atc

att

eta

aca

aca

aga

cat

cat

gaa

gtt

gcc

4283

Asn

Asn

Arg

Ser

Arg

Ile

I le

Leu

Thr

Thr

Arg

His

His

Glu

Val

Ala

675

680

685

aaa

tat

get

agt

gtt

cat

agt

gat

ccc

ctt

cat

ctt

cgt

atg

ttt

gac

4331

Lys

Tyr

Ala

Ser

Val

His

Ser

Asp

Pro

Leu

His

Leu

Arg

Met

Phe

Asp

690

695

700

gaa

gtt

gaa

agt

tgg

aag

ttg

ctt

gaa

aag

aaa

gtg

ttt

ggt

gaa

gaa

4379

Glu

Val

Glu

Ser

Trp

Lys

Leu

Leu

Glu

Lys

Lys

Val

Phe

Gly

Glu

Glu

705

710

715

age

tgt

tcc

cct

ctc

eta

aaa

aat

gtt

ggg

eta

aga

ata

gca

aaa

atg

4427

Ser

Cys

Ser

Pro

Leu

Leu

Lys

Asn

Val

Gly

Leu

Arg

Ile

Ala

Lys

Met

720

725

730

735

tgt

gga

caa

eta

cct

Ctt

tea

att

gtt

ctg

gtg

get

ggt

att

ctg

tea

4475

Cys

Gly

Gln

Leu

Pro

Leu

Ser

Ile

Val

Leu

Val

Ala

Gly

Ile

Leu

Ser

740

745

750

gag

atg

gaa

aag

gaa

gta

gaa

tgt

tgg

gaa

caa

gtg

gcc

aac

aat

ttg

4523

Glu

Met

Glu

Lys

Glu

Val

Glu

Cys

Trp

Glu

Gln

Val

Ala

Asn

Asn

Leu

755

760

765

ggt

tcc

tac

att

cac

aat

gac

tea

aga

gcc

att

gta

gac

aaa

agt

tat

4571

Gly

Ser

Tyr

Ile

His

Asn

Asp

Ser

Arg

Ala

Ile

Val

Asp

Lys

Ser

Tyr

770

775

780

cat

gtt

tta

cct

tgt

cat

ctt

aag

tet

tgc

ttc

ctt

tat

ttt

gga

gca

4619

His

Val

Leu

Pro

Cys

Hi s

Leu

Lys

Ser

Cys

Phe

Leu

Tyr

Phe

Gly

Ala

785

790

795

ttt

tta

gaa

gat

aga

gtg

att

gac

att

tea

agg

tta

ata

agg

eta

tgg

4667

Phe

Leu

Glu

Asp

Arg

Val

Ile

Asp

Ile

Ser

Arg

Leu

Ile

Arg

Leu

Trp

800

805

810

815

ata

tea

gaa

gca

ttt

ata

aaa

agt

agt

gaa

ggc

agg

agg

ttg

gag

gat

4715

Ile

Ser

Glu

Ala

Phe

Ile

Lys

Ser

Ser

Glu

Gly

Arg

Arg

Leu

Glu

Asp

820

825

830

ata

gca

gaa

ggt

tac

ttg

gag

aat

ctt

att

gga

aga

aat

eta

gta

atg

4763

Ile

Ala

Glu

Gly

Tyr

Leu

Glu

Asn

Leu

Ile

Gly

Arg

Asn

Leu

Val

Met

835

840

845

gtt

act

cag

agg

tcc

att

tea

gat

ggt

aag

gcg

aaa

gaa

tgt

cgc

ctt

4811

Val

Thr

Gln

Arg

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Lys

Ala

Lys

Glu

Cys

Arg

Leu

850

855

860

cat

gat

gta

tta

ctc

gac

ttc

tgc

aag

gaa

aga

gca

get

gag

gag

aat

4859

PL 211 212 B1

His	Asp 865	Val	Leu	Leu Asp Phe Cys Lys Glu Arg Ala Ala Glu Glu 870 875	Asn
ttt Phe 880	eta Leu	eta Leu	tgg Trp	ata aat aggtaatatg ataagtaact gtactttcaa Ile Asn 885		4907
tcaatcaagt atttcaagtt atatctgaaa attaatgata tgattttgct aattgatata	4967
ttc	agg Arg	gat Asp	cag Gin	att acc aaa cct tct tcc tgt gtt tac tct cac Ile Thr Lys Pro Ser Ser Cys Val Tyr Ser His 890 895	aag Lys 900	5015
cag	cat	gct	cac	ttg gcc ttc act gaa atg cat aat ctt gta gaa	tgg	5063
Gin	His	Ala	His	Leu Ala Phe Thr Glu Met His Asn Leu Val Glu 905 910 915	Trp
agt	gcg	tct	tgc	tca ttt gtt ggc teg gta gta ctt tcc aat aaa	tat	5111
Ser	Ala	Ser	Cys 920	Ser Phe Val Gly Ser Val Val Leu Ser Asn Lys 925 930	Tyr
gac	tca	tac	ttt	tcc act cgt gac ata tcc tca eta cat gat ttt	tca	5159
Asp	Ser	Tyr 935	Phe	Ser Thr Arg Asp Ile Ser Ser Leu His Asp Phe 940 945	Ser
att	tca	cgc	att	tta cca aat ttc aag ttt eta aaa gtg tta gat	ttg	5207
Ile	Ser 950	Arg	Ile	Leu Pro Asn Phe Lys Phe Leu Lys Val Leu Asp 955 960	Leu
gaa	cac	cgg	gtt	ttt att gat ttt att cca act gag ctt gtt tac	ttg	5255
Glu 965	His	Arg	Val	Phe Ile Asp Phe Ile Pro Thr Glu Leu Val Tyr 970 975	Leu 980
aag	tat	ttt	tct	gca cac att gaa cag aat tca att cct tca agc	ata	5303
Lys	Tyr	Phe	Ser	Ala His Ile Glu Gin Asn Ser Ile Pro Ser Ser 985 990 995	Ile
tcc	aat	ctt	tgg	aac ctt gaa act ctt ata tta aaa agt cca	ata	5348
Ser	Asn	Leu	Trp 1000	Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Lys Ser Pro 1005 1010	Ile
tat	gcg	tta	cgt	tgc acg eta eta eta cct agt aca gtt tgg	gat	5393
Tyr	Ala	Leu	Arg 1015	Cys Thr Leu Leu Leu Pro Ser Thr Val Trp 1020 1025	Asp
atg	gtt	aaa	ttg	aga cat ctg tat att cct gac ttc agc aca	agg	5438
Met	Val	Lys	Leu 1030	Arg His Leu Tyr Ile Pro Asp Phe Ser Thr 1035 1040	Arg
att	gaa	gca	gca	tta ctt gag aac tct gca aaa ctt tat aat	ttg	5483
Ile	Glu	Ala	Ala 1045	Leu Leu Glu Asn Ser Ala Lys Leu Tyr Asn 1050 1055	Leu
gaa	acc	ctt	tcc	act eta tat ttc tct cgt gtt gag gat gca	gaa	5528
Glu	Thr	Leu	Ser 1060	Thr Leu Tyr Phe Ser Arg Val Glu Asp Ala 1065 1070	Glu
ttg	atg	ctg	aga	aaa aca cct aat ctt ega aaa ctg ata tgt	gaa	5573
Leu	Met	Leu	Arg 1075	Lys Thr Pro Asn Leu Arg Lys Leu Ile Cys 1080 1085	Glu

PL 211 212 B1

gtt Val

gaa Glu

tgt Cys

tta Leu 1090

gaa Glu

tac Tyr

ccc Pro

cct Pro

cag Gin 1095

tac Tyr

cat His

gtg Val

ttg Leu

aat Asn 1100

ttt Phe

5618

cca

ata

cgg

ctt

gaa

ata

eta

aag

ctt

tat

ega

tca

aaa

ttt

aaa

5663

Pro

Ile

Arg

Leu 1105

Glu

Ile

Leu

Lys

Leu 1110

Tyr

Arg

Ser

Lys

Phe 1115

Lys

acc

atc

ccc

ttt

tgc

atc

tct

gca

cca

aat

ctc

aaa

tac

ttg

aaa

5708

Thr

Ile

Pro

Phe 1120

Cys

Ile

Ser

Ala

Pro 1125

Asn

Leu

Lys

Tyr

Leu 1130

Lys

ctc

tgt

ggc

ttt

tcc

ctg

gat

tct

cag

tac

tta

tca

gaa

act

gct

5753

Leu

Cys

Gly

Phe 1135

Ser

Leu

Asp

Ser

Gin 1140

Tyr

Leu

Ser

Glu

Thr 1145

Ala

gat

cat

ctc

aag

cac

ctt

gag

gta

ctc

ata

ctg

tac

aag

gtt

gaa

5798

Asp

His

Leu

Lys 1150

His

Leu

Glu

Val

Leu 1155

Ile

Leu

Tyr

Lys

Val 1160

Glu

ttt

ggt

gat

cat

agg

gaa

tgg

aaa

gtg

agc

aat

ggc

aag

ttc

cct

5843

Phe

Gly

Asp

His 1165

Arg

Glu

Trp

Lys

Val 1170

Ser

Asn

Gly

Lys

Phe 1175

Pro

caa

ctc

aaa

atc

ttg

aaa

eta

gaa

tat

ttg

tcc

ttg

gtg

aaa

tgg

5888

Gin

Leu

Lys

Ile 1180

Leu

Lys

Leu

Glu

Tyr 1185

Leu

Ser

Leu

Val

Lys 1190

Trp

att

gta

gct

gat

gat

gcc

ttt

cct

aac

ctt

gaa

caa

ttg

gtt

ttg

5933

Ile

Val

Ala

Asp 1195

Asp

Ala

Phe

Pro

Asn 1200

Leu

Glu

Gin

Leu

val 1205

Leu

cgt

gga

tgt

caa

gat

ctt

atg

gag

atc

cct

tct

tgt

ttc

atg

gac

5978

Arg

Gly

Cys

Gin 1210

Asp

Leu

Met

Glu

Ile 1215

Pro

Ser

Cys

Phe

Met 1220

Asp

atc

ctt

tct

ctc

aag

tac

atc

ggg

gta

gaa

tac

tgc

aat

gag

tcg

6023

Ile

Leu

Ser

Leu 1225

Lys

Tyr

Ile

Gly

Val 1230

Glu

Tyr

Cys

Asn

Glu 1235

Ser

gtt

gtc

aag

tca

gcc

ttg

aat

ata

caa

gaa

aca

caa

gtc

gaa

gat

6068

Val

Val

Lys

Ser 1240

Ala

Leu

Asn

Ile

Gin 1245

Glu

Thr

Gin

Val

Glu 1250

Asp

tat Tyr

caa Gin

aat Asn

act Thr

aat Asn

ttc Phe

aag Lys

ctc Leu

gtt Val

ctc Leu

atc Ile

g aggtacacta

6112

1255 1260

ctgaaaaaag ctttattctg catgattttg	atgaatcaga aatcgcctaa ctcgttttac atttgggttc	attttacaaa ttetett	6172 6229
ctgttttctc agttatcttt	acctcgtggc
ag ttt tct ttg cag	aaa aag gcg	tgg aaa tta aat tta	act gat	6273
Glu Phe Ser Leu Gin	Lys Lys Ala	Trp Lys Leu Asn Leu	Thr Asp
1265	1270	1275
gcg gaa gat atg cac	aat gca gta	aaa aat att ctt gca	gaa ata	6318
Ala Glu Asp Met His	Asn Ala Val	Lys Asn Ile Leu Ala	Glu Ile
1280	1285	1290

aga taggtactac tttttttttt ttctttcctt tttttaaata caccaaatag 6371

PL 211 212 B1

Arg

atagattcat	cttttttgtc	ttttcgatat	gaaagggata	gaatcagttt	catctgatga	6431
gaaagagaag	aaacttactg	tgaccggaga	tgtggatgct	gatgaagttc	aattagttgt	6491
ggagaaactg	agaaagcgtg	gcatgccagg	gttgtagtcc	caacttgtca	acacaaatgt	6551
gctatactca	ttttgcttac	tgtaatacca	tttcatgaca	cacacacaca	aacattaact	6611
gtagtaaagt	tttgatggat	cagtaaatct	gagttcaacc	cattgtaatc	cgttcaaatt	6671
caactcaaaa	aattcccatt	gagttattct	ttaacagggt	atccagagtt	tgtagctgga	6731
gcaatttgga	atatcacatg	taatttcttt	atgagttaat	tcgtttaata	aaagattctg	6791
taaaacgtcc	aacggctgtt	gcattcattg	taaactaaat	atatctcagt	atgtaactat	6851
tgaacaaatt	tttcatttta	gtccctgagg	tttgatgtaa	gtcattagat	tttacggatc	6911
ctgaagtgaa	tggttttagc	cttttctatt	ttcttatgag	ttcaccaaaa	tgttgtgatg	6971
ccactctgct	acatgttaga	gaaatgagaa	tgttagcacc	cgagagtatg	gcctagcggt	7031
caatcaatga	agcaggtgaa	aacaacaaaa	gcaaaaaata	ctaagagatt	tcttcacatc	7091
tatctaagta	ccgctaagca	aagatactgt	aatgaccctc	ctggtcattt	atgtgtcttg	7151
ccttctgtgt	gtcgtttaga	gtgttcctat	agcgacccca	agtcatttat	gacttgctgg	7211
gactaacggt	tcggtcacat	ggtcgttcgt	ttggttttgg	tgcgagtttt	tgtgttttgg	7271
agcttatgaa	tcttgaacga	tgattttcga	tcaaaaattc	aagaagatga	catcggaatc	7331
catttctaac	gattccatca	gctccggaag	ggtcatttta	ggctagtagc	ttggtcggca	7391
tgactcccgg	tgcgattagg	ccttttaact	ttaagtttaa	gcctaagttt	gactttggtc	7451
aacattctga	gtaaacgcgc	tcggatgaga	attccgtcag	tgcggttagc	tccggaatgt	7511
caagtttggt	ttagattgac	ctttcttttg	tgtctcgagg	tttttgatat	ttttcggagc	7571
tcttttgtgg	gttttgactt	aaaatggcat	ttgggtgtgg	aatccacttt	ttgtcaagat	7631
gacctcgtat	agaaattttg	gctgtgccat	tgagtccgaa	atatcgaatt	tgatatgatt	7691
gcatatctcg	tttgtgtgca	cggggttccg	aacgagttcg	gagaaccttg	tcgcagtttt	7751
taaattttgg	ggtaagtgca	gaaaaatctg	cacttttgga	aaaccttaaa	aacctcatcc	7811
ctctctcatc	cctctctcat	ctctcaatca	tttaggcgat	tcgaagtgtg	ggaactttgt	7871
atttttgatg	gcttcgctgt	agagtattca	gaagctgttg	ggtgcgcgta	gttcgaggta	7931
aatttcgtaa	aatacctgct	gccacgatcc	ctttttgtgg	cttgattttg	gaatttttga	7991
gatttgtttt	cttagccatt	tttggtccga	tttcagtgat	tcttgaggct	atcttgagtg	8051
gtttttcgag	gagagcatcg	tggtgttgtc	ggaatttact	gtagaccacc	catttttggt	8111

PL 211 212 B1

aaatatgctg	aattaacttc	tgtcccattt	ctttagtttt	tgagaaaaat	ttgggttttg	8171
gttgcatgtt	ggttatgtgt	tgtttttgat	ccccgaatgg	tgtcccatca	tggaacacaa	8231
tttggggagc	tgttaagaac	ctatttttgg	ggttaattcc	ggagtttcca	gcgcgggtcc	8291
cacttctccc	gttttgaccc	cgaaattgat	atgtctccgt	ttcttgcgat	tttagtgtct	8351
aaacgaccgt	aataacattg	tgactctatt	tttgatagcg	gggcagcgtt	tcgaggccgt	8411
tcggaaaggg	aaagctccgg	agaagtgatt	tttggagcgt	gcgtgatctg	cccacaagta	8471
gggtatggtt	tccctctctt	agattgagct	tgagagtgtg	aatgcatgtt	gattagttgg	8531
gatttgggtt	ggtagttatt	gaatcatgca	taggtgttta	gaaatcatgt	tttggccttt	8591
tcgggaatta	tcgggtaact	gtgagcatgc	tatgtgttac	taattgaccc	tccttgctat	8651
gtggagtgct	tgaatgcttg	attactattt	atctgaagca	tgttgggcct	tagtttaggt	8711
ttgactaggg	cttgccttag	agatgcatga	ttcggatttg	ataggcctta	gtttttgccc	8771
cgacgtcgct	cggtcgactt	agatccatgt	agactggtgt	agcaacttga	gtctgatagt	8831
ttgggcctta	gctaggcgat	acgcttgctc	cgatgataat	tatcttcttc	ttcttttttt	8891
cgttgttacg	gcttcacgag	ttacgttggc	gacattgatt	ctgcttcgcg	atttgaagtt	8951
gattttttat	tcggttccaa	ggacttacat	tgattggcta	agtgtggacg	gcgttccacg	9011
gaaatttata	agcatggatc	gattgagacc	ctttcagcag	ctacattggc	acttatatag	9071
agcatccgat	ttaaggtccg	gcctctatcg	cccaaatact	tatatagagc	aaccggttta	9131
aggtccggcc	tctatcgccc	agatacttgt	atagagcatc	cggttagagg	tctggcctca	9191
gttacttgat	acttgtgatt	ggttacttgg	gtacttttgg	tgagcatccg	gttcgaggtc	9251
cggcctccgt	actgtcagat	tctactaatt	ggggttgaga	ttctggttcg	atgttttccg	9311
ttcttgggtt	cttatatgca	attttcttta	gttatagtta	ttttgtgtac	tcatcgggct	9371
tatggggatc	cgtttaggtt	tttatttaac	ttgcgcacga	gtgtaccttc	tgggcttatg	9431
ggggcccagt	taggtgtagt	tagcttatag	attactttag	ttagttcttt	ttacacttgt	9491
gtgctttcca	tggtttactt	agattgtcat	tcttgacctc	tgtttgtgtt	attccttctt	9551
ttcatattgc	ctttactttt	caagttcagt	cggcctataa	tgcatactgg	gtacctgttg	9611
ttttggtact	catgctacgc	tctgcatctg	tttcgtgatg	caggtctgag	caccagtggc	9671
cagcgttgat	ccagtttgga	gtagtctgat	ccggagacgg	gggtgagcac	atggcgtttt	9731
gtactatttc	agtctccatc	tgtgtatata	gacttgtctt	ttacctttcg	agacagtcca	9791
atctctgtgg	tccacttttg	ggacttgtac	tcgttttgtt	agtagctctg	tactggtgac	9851
ttcctggttc	taggagggat	ctttatttgt	atatatgttt	tggttcgctt	ccgcctgttt	9911
atattgttat	cataaaattt	tgcctactct	tgttagtttc	taccctcaga	cccattactt	9971

PL 211 212 B1

gttattccgg	gttacgggtt	ggcttaccta	ctggtgggtt	atagtatgtg	ccaocatgac	10031
tcgagaaatc	gggtcgtgac	agatacatga	tgcctctttg	gttggaagaa	gcgggtactc	10091
agtcaaatgg	tcgaggtgag	ctcgacacca	tcaataacat	cccaaaaaag	gaacaatgag	10151
aaagttacaa	atcacaatac	atgtccatat	gctttggaac	taaagaattc	aaagcacaca	10211
atgtatttca	ataatctttt	atctctgcct	gcagttgaat	ataccagata	tcagatctga	10271
gacgatgttt	aaaaaggaaa	ctattattcg	accctattcc	tttctcaaac	ctcgaaacca	10331
acaccagtta	tacaacaata	tatgcagaac	cctttaacta	tatactatat	acaaatt	10388

<210>	2
<211>	1293
<212>	PRT
<213>	Solanum tuberosum
<400>	2

Met Asn Phe Asn Asn Glu Leu Ser Asp Leu Lys Asn Arg Phe Leu Phe 15 10 15

Arg Thr Leu Arg Ala Gin Lys Cys Ser Asp Val Ala Arg Asp Arg Ile 20 25 30

Asp Phe Phe Ile Trp Glu Leu Lys Phe Leu Asn Cys Phe Leu His Leu 35 40 45

Gin Ser Phe Ala Phe Ala Ser Glu Cys Gly Met Leu Asp Ile Ser Gin 50 55 60

Lys Met Ile Glu Ile Cys Lys Arg Phe Asn Thr Pro Pro Pro His Asn

70 75 80

Ser Phe Ala Tyr Trp Lys Glu Val Ile Cys Lys Arg Leu Cys Ala Ile

90 95

Ser Ile Gin Pro Asp Ala Ser Ser Asp Asp Gly Phe Ala Cys Trp Lys 100 105 110

Lys Val Ile Trp Lys Thr Lys Gin Glu Phe Arg Ala Lys Tyr Ser Phe 115 120 125

Pro Lys Thr Leu Leu Ala Asp Asn Lys Val Tyr Asp Asp Asp Asp Thr

PL 211 212 B1

130

135

140

Asn Pro Lys Phe Val Met Glu Phe Ile Asp Ala Val Val Gly Asn Leu 145 150 155 160

Asn Val Leu Val Lys Ile Asn Asp Pro Ser Ser Leu Leu Phe Val Pro 165 170 175

Gly Pro Lys Glu Gin Ile Glu Gin Val Leu Lys Glu Leu Lys Leu Leu 180 185 190

Arg Phe Phe Val Cys Phe Val Ser Asn Lys Cys Ile Glu Pro Gin Tyr 195 200 205

Gin His Thr Thr Phe Tyr Thr His Ala Leu Ile Glu Ala Ser His Ile 210 215 220

Ala Met Val Val Trp Leu Asn Leu Pro Ile Tyr Gly Asn Arg Asn Gin 225 230 235 240

Asp Leu Ala Ser Ser Glu Val Ser Cys Leu Leu Ser Asp Phe Met Glu 245 250 255

Met Lys Ile Lys Ser Ile Gin Pro Asp Ile Ser Arg Asn Asn Ile Tyr 260 265 270

Ile Asp Val Leu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Ile Pro Gin Ala Gin Asp 275 280 285

Lys His Ala Ala Glu Ser Gly Ile Val Glu Thr Pro Thr His Asn Leu 290 295 300

Met Val Gly Leu Ser Asp Gin Met Ala Asn Leu Gin Glu Met Leu Cys 305 310 315 320

Leu Leu Arg Asp Asn Leu Ile His Leu Pro Ile Leu Asp Leu Glu Phe 325 330 335

His Leu Gin Asp Met Asp Ser Val Ile Val Asp Ala Gly Leu Leu Ile 340 345 350

Tyr Ser Leu Tyr Asp Ile Lys Gly Gin Lys Glu Asp Thr Thr Leu Glu 355 360 365

Asp Ile Asn Gin Ala Leu Gly Phe Asp Leu Pro Arg Asn Ile Glu Pro 370 375 380

PL 211 212 B1

Ile Lys Ala Met Ile Asn Leu Val 385 390

Met Gin Lys Ala Phe Gin Cys Asn 395 400

Leu Pro Arg Ile His Gly Leu Gly 405

Tyr Val Asp Phe Leu Leu Lys Asn 410 415

Leu Lys Asp Phe Gin Gly Arg Tyr 420

Ser Asp Ser Leu Asp Phe Leu Lys 425 430

Asn Gin Leu Gin Val Ile Gin Thr 435 440

Glu Phe Glu Ser Leu Gin Pro Phe 445

Leu Lys Val Val Val Glu Glu Pro 450 455

His Asn Lys Leu Lys Thr Leu Asn 460

Glu Asp Cys Ala Thr Gin Ile Ile 465 470

Arg Lys Ala Tyr Glu Val Glu Tyr 475 480

Val Val Asp Ala Cys Ile Asn Lys 485

Glu Val Pro Gin Trp Cys Ile Glu 490 495

Arg Trp Leu Leu Asp Ile Ile Glu 500

Glu Ile Thr Cys Ile Lys Ala Lys 505 510

Ile Gin Glu Lys Asn Thr Val Glu 515 520

Asp Thr Met Lys Thr Val Ile Ala 525

Arg Thr Ser Ser Lys Leu Ala Arg 530 535

Thr Pro Arg Met Asn Glu Glu Ile 540

Val Gly Phe Glu Asp Val Ile Glu 545 550

Asn Leu Arg Lys Lys Leu Leu Asn 555 560

Gly Thr Lys Gly Gin Asp Val Ile 565

Ser Ile His Gly Met Pro Gly Leu 570 575

Gly Lys Thr Thr Leu Ala Asn Ser 580

Leu Tyr Ser Asp Arg Ser Val Phe 585 590

Ser Gin Phe Asp Ile Cys Ala Gin 595 600

Cys Cys Val Ser Gin Val Tyr Ser 605

Tyr Lys Asp Leu Ile Leu Ala Leu 610 615

Leu Arg Asp Ala Ile Gly Glu Gly 620

PL 211 212 B1

Ser Val Arg Arg Glu Leu His Ala Asn Glu Leu Ala Asp Met Leu Arg 625 630 635 640

Lys Thr Leu Leu Pro Arg Arg Tyr Leu Ile Leu Val Asp Asp Val Trp 645 650 655

Glu Asn Ser Val Trp Asp Asp Leu Arg Gly Cys Phe Pro Asp Val Asn 660 665 670

Asn Arg Ser Arg Ile Ile Leu Thr Thr Arg His His Glu Val Ala Lys 675 680 685

Tyr Ala Ser Val His Ser Asp Pro Leu His Leu Arg Met Phe Asp Glu 690 695 700

Val Glu Ser Trp Lys Leu Leu Glu Lys Lys Val Phe Gly Glu Glu Ser 705 710 715 720

Cys Ser Pro Leu Leu Lys Asn Val Gly Leu Arg Ile Ala Lys Met Cys 725 730 735

Gly Gln Leu Pro Leu Ser Ile Val Leu Val Ala Gly Ile Leu Ser Glu 740 745 750

Met Glu Lys Glu Val Glu Cys Trp Glu Gln Val Ala Asn Asn Leu Gly 755 760 765

Ser Tyr Ile His Asn Asp Ser Arg Ala Ile Val Asp Lys Ser Tyr His 770 775 780

Val Leu Pro Cys His Leu Lys Ser Cys Phe Leu Tyr Phe Gly Ala Phe 785 790 795 800

Leu Glu Asp Arg Val Ile Asp Ile Ser Arg Leu Ile Arg Leu Trp Ile 805 810 815

Ser Glu Ala Phe Ile Lys Ser Ser Glu Gly Arg Arg Leu Glu Asp Ile 820 825 830

Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Asn Leu Ile Gly Arg Asn Leu Val Met Val 835 840 845

Thr Gln Arg Ser Ile Ser Asp Gly Lys Ala Lys Glu Cys Arg Leu His 850 855 860

PL 211 212 B1

Asp 865	Val	Leu	Leu Asp	Phe 870	Cys Lys	Glu Arg Ala Ala Glu 875	Glu Asn	Phe 880
Leu	Leu	Trp	Ile Asn	Arg	Asp Gin	Ile Thr Lys Pro Ser	Ser Cys	Val
			885			890	895
Tyr	Ser	His	Lys Gin	His	Ala His	Leu Ala Phe Thr Glu	Met His	Asn
			900			905	910
Leu	Val	Glu	Trp Ser	Ala	Ser Cys	Ser Phe Val Gly Ser	Val Val	Leu
		915			920	925
Ser	Asn	Lys	Tyr Asp	Ser	Tyr Phe	Ser Thr Arg Asp Ile	Ser Ser	Leu
	930				935	940
His	Asp	Phe	Ser Ile	Ser	Arg Ile	Leu Pro Asn Phe Lys	Phe Leu	Lys
945				950		955		960
Val	Leu	Asp	Leu Glu	His	Arg Val	Phe Ile Asp Phe Ile	Pro Thr	Glu
			965			970	975
Leu	Val	Tyr	Leu Lys	Tyr	Phe Ser	Ala His Ile Glu Gin	Asn Ser	Ile
			980			985	990
Pro	Ser	Ser	Ile Ser	Asn	Leu Trp	Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Lys
		995			1000 1005
Ser	Pro	Ile	Tyr Ala	. Leu	. Arg Cys Thr Leu Leu Leu	Pro Ser	Thr
	1010			1015	1020
Val	Trp	Asp	Met Val	Lys	Leu Arg His Leu Tyr Ile	Pro Asp	Phe
	1025			1030	1035
Ser	Thr	Arg	Ile Glu	. Ala	. Ala Leu Leu Glu Asn Ser	Ala Lys	Leu
	104 0			1045	1050
Tyr	Asn	Leu	Glu Thr	' Leu	Ser Thr Leu Tyr Phe Ser	Arg Val	Glu
	1055				1060	1065
Asp	Ala	Glu	Leu Met	Leu	Arg Lys Thr Pro Asn Leu	Arg Lys	Leu
	1070				1075	1080
Ile	Cys	Glu	Val Glu	Cys	Leu Glu Tyr Pro Pro Gin	Tyr His	Val
	1085				1090	1095
Leu	Asn	Phe	Pro Ile	Arg	Leu Glu Ile Leu Lys Leu	Tyr Arg	Ser

PL 211 212 B1

1100 1105 1110

Lys Phe Lys Thr Ile Pro Phe Cys Ile Ser Ala Pro Asn Leu Lys 1115 1120 1125

Tyr Leu Lys Leu Cys Gly Phe Ser Leu Asp Ser Gin Tyr Leu Ser 1130 1135 1140

Glu Thr Ala Asp His Leu Lys His Leu Glu Val Leu Ile Leu Tyr 1145 1150 1155

Lys Val Glu Phe Gly Asp His Arg Glu Trp Lys Val Ser Asn Gly 1160 1165 1170

Lys Phe Pro Gin Leu Lys Ile Leu Lys Leu Glu Tyr Leu Ser Leu 1175 1180 1185

Val Lys Trp Ile Val Ala Asp Asp Ala Phe Pro Asn Leu Glu Gin 1190 1195 1200

Leu Val Leu Arg Gly Cys Gin Asp Leu Met Glu Ile Pro Ser Cys 1205 1210 1215

Phe Met Asp Ile Leu Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Val Glu Tyr Cys 1220 1225 1230

Asn Glu Ser Val Val Lys Ser Ala Leu Asn Ile Gin Glu Thr Gin 1235 1240 1245

Val Glu Asp Tyr Gin Asn Thr Asn Phe Lys Leu Val Leu Ile Glu 1250 1255 1260

Phe Ser Leu Gin Lys Lys Ala Trp Lys Leu Asn Leu Thr Asp Ala 1265 1270 1275

Glu Asp Met His Asn Ala Val Lys Asn Ile Leu Ala Glu Ile Arg 1280 1285 1290

<210>	3
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Sekwencj a

sztuczna

PL 211 212 B1 <220>

<223> Oligonukleotyd <400> 3 aaacccggtg ttccaaatct aacact

<210>	4
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>

Oligonukleotyd

<400> 4 catgtagtga ggatatgtca cgagtg 26

<210>	5
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>

Oligonukleotyd

<400> 5 attacaatgg gttgaactca g 21

<210>	6
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Oligonukleotyd

<400> 6 acctctttca attgttctgg tg

PL 211 212 B1

<210>	7
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>

Oligonukleotyd

<400> 7 cactcgtgac atatcctcac ta

<210>	8
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>

Oligonukleotyd

<400> 6 caaccctggc atgccacg 28

<210>	9
<211>	4
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>	Domena konserwatywna
<400>	9

Gly Leu Pro Leu 1 <210> 10 <211> 4

PL 211 212 B1

<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>	Domena konserwatywna
<400>	10

Gin Leu Pro Leu 1

<210>	11
<211>	4
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>	Domena konserwatywna
<400>	11

Cys Lys Leu Tyr 1

<210>	12
<211>	4
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>

<223>	Domena konserwatywna
<400>	12

Cys Phe Leu Tyr

PL 211 212 B1

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd zdolny do nadawania oporności na patogen w roślinie, w której ten polipeptyd jest ekspresjonowany, w skład której to sekwencji wchodzi sekwencja wybrana z grupy:

   (a) sekwencja nukleotydową kodująca białko zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2;

   (b) sekwencja nukleotydową zawierająca obszary kodujące sekwencji DNA przedstawionej w SEQ ID NO: 1;

   (c) sekwencja nukleotydową posiadająca przynajmniej 80% homologii do sekwencji nukleotydowej według (a) albo (b);

   (d) sekwencja nukleotydową kodująca białko zdolne do nadawania oporności na patogen w roślinie, posiadające sekwencję aminokwasową przynajmniej w 60% identyczną z sekwencją aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową według (a) albo (b);

   (e) sekwencja nukleotydową kodująca, co najmniej domenę suwaka leucynowego (LZ), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 308 do 329 w SEQ ID NO: 2, domenę nukleinowego miejsca wiązania (NBS), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 572 do 682 SEQ ID NO: 2 i/lub domenę zawierającą bogate w leucynę powtórzenie (LRR), której odpowiadają aminokwasy w pozycji od 780 do 1280 SEQ ID NO:2;

   (f) sekwencja nukleotydową, która jest zdegenerowana, z uwagi na kod genetyczny, w stosunku do którejkolwiek sekwencji nukleotydowej od (a) do (e).
2. 2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że kwasem nukleinowym jest kwas nukleinowy kodujący polipeptyd zdolny do nadawania oporności na Phytophthora infestans.
3. 3. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 albo 2.
4. 4. Wektor według zastrz. 3, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym, w którym cząsteczka kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona z jedną lub wieloma sekwencjami kontrolnymi umożliwiającymi transkrypcję i ewentualnie translację w prokariotycznej i/lub eukariotycznej komórce gospodarza.
5. 5. Komórka gospodarza zawierająca wektor jak określono w zastrz. 3 albo 4, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 albo 2.
6. 6. Białko R1 albo funkcjonalny fragment tego białka, zdolne do nadawania oporności na patogen w roślinie, w której ten polipeptyd jest ekspresjonowany, kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 albo 2.
7. 7. Przeciwciało lub aptamer specyficznie rozpoznający białko o sekwencji SEQ ID NO:2.
8. 8. Komórka rośliny transgenicznej zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 albo 2, która jest funkcjonalnie połączona z elementami regulatorowymi umożliwiającymi transkrypcję i/lub ekspresję sekwencji DNA w komórkach roślinnych.
9. 9. Roślina transgeniczna lub tkanka roślinna zawierająca komórki roślinne jak określono w zastrz. 8.
10. 10. Regulatorowa sekwencja promotora regulująca ekspresję genu zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w jednym z zastrz. 1 albo 2; przy czym rzeczona sekwencja regulatorowa umożliwia lub moduluje ekspresję heterologicznej sekwencji DNA w odpowiedzi na infekcję patogenem i zawierająca sekwencję DNA przedstawioną w SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 1 do 2222 lub jej część zawierająca nukleotydy 1 do 2164.
11. 11. Rekombinowana cząsteczka DNA zawierająca sekwencję regulatorową jak określono w zastrz. 10.
12. 12. Rekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja regulatorowa jest funkcjonalnie związana z sekwencją heterologicznego DNA.
13. 13. Komórka gospodarza transformowana regulatorową sekwencją jak określono w zastrz. 10, albo cząsteczką rekombinowanego DNA jak określono w zastrz. 11 albo 12.
14. 14. Roślina transgeniczna, tkanka roślinna albo komórka roślinna, zawierająca sekwencję regulatorową jak określono w zastrz. 10, albo zawierająca cząsteczkę rekombinowanego DNA jak określono w zastrz. 11 albo 12.
15. 15. Sposób identyfikacji i uzyskiwania czynnika wirulencji albo awirulencji patogenu, znamienny tym, że zawiera następujące etapy:

    PL 211 212 B1 (a) screening białka R1 jak określono w zastrz. 6, albo jego fragmentu, wobec peptydu lub białka z biblioteki ekspresyjnej patogenu, odbywający się w systemie odczytu w warunkach umożliwiających oddziaływanie białka i peptydu w tym systemie odczytu;

    (b) identyfikacja lub weryfikacja cDNA, które powoduje supresję albo aktywację systemu odczytu.
16. 16. Kompozycja zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 albo 2, wektor jak określono w zastrz. 3 albo 4, białko jak określono w zastrz. 6, przeciwciało lub aptamer jak określono w zastrz. 7, sekwencję regulatorową jak określono w zastrz. 10, albo cząsteczka rekombinowanego DNA jak określono w zastrz. 11 albo 12 oraz ewentualnie odpowiednie środki do wykrywania lub odpowiednie środki do hodowli komórki i tkanki roślinnej.