Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

PL202698B1 - Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała

Info

Publication number
PL202698B1
PL202698B1 PL384503A PL38450398A PL202698B1 PL 202698 B1 PL202698 B1 PL 202698B1 PL 384503 A PL384503 A PL 384503A PL 38450398 A PL38450398 A PL 38450398A PL 202698 B1 PL202698 B1 PL 202698B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pbs
peptide
mice
antibody
patient
Prior art date
Application number
PL384503A
Other languages
English (en)
Inventor
Dale B. Schenk
Original Assignee
Elan Pharma Int Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26748211&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL202698(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Elan Pharma Int Ltd filed Critical Elan Pharma Int Ltd
Publication of PL202698B1 publication Critical patent/PL202698B1/pl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739Lipopolysaccharides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193Colony stimulating factors [CSF]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0007Nervous system antigens; Prions
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2031Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyethylene oxide, poloxamers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2054Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. hydroxypropyl methylcellulose
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866Organic macromolecular compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53DNA (RNA) vaccination
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505Inorganic adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55555Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55572Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55577Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031Proteins
    • A61K2039/6037Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031Proteins
    • A61K2039/605MHC molecules or ligands thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2009Inorganic compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7023Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567Framework region [FR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej ludzkie lub humanizowane przeciwciało oraz ich zastosowania do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera.
Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą wywołującą otępienie starcze. Patrz ogólnie Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy i inni, WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff i inni, Nature 373, 476-477 (1995); Games i inni, Nature 373, 523 (1995). Ogólnie chorobę można podzielić na dwie kategorie: o późnym początku, która pojawia się w podeszłym wieku (od 65 roku życia) oraz o wczesnym początku, która rozwija się przed okresem starości, to jest pomiędzy 35 a 60 rokiem życia. W obu typach choroby patologia jest taka sama, ale nieprawidłowości wydają się być znacznie poważniejsze i bardziej rozległe w przypadkach gdy choroba rozpoczyna się w młodszym wieku. Chorobę charakteryzują dwa typy uszkodzeń w mózgu, płytki starcze oraz kłębki neurofibrylarne. Płytki starcze stanowią obszary zdezorganizowanego neuropilu o szerokości do 150 μm z zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidowymi występującymi w centrum widocznym przy analizie mikroskopowej przekrojów tkanki mózgowej. Kłębki neurofibrylarne stanowią wewnątrzkomórkowe złogi białka tau składające się z dwóch filamentów owiniętych parami wokół siebie.
Głównym składnikiem płytek jest peptyd nazywany Ae lub peptydem β-amyloidowym. Peptyd Ae jest wewnętrznym fragmentem 39-43 aminokwasów białka prekursorowego nazywanego białkiem prekursorowym amyloidu (APP). Kilka mutacji białka APP powiązano z występowaniem choroby Alzheimera. Patrz np. Goate i inni, Nature 349, 704 (1991) (walina717 do izoleucyny); Chartier Harlan inni, Nature 353, 844 (1991) (walina717 do glicyny); Murrell i inni, Science 254, 97 (1991) (walina717 do
595 fenyloalaniny); Mullan i inni, Nature Genet. 1, 345 (1992) (podwójna mutacja zmieniająca lizynę595metioninę596 w asparaginę595-leucynę596). Uważa się, że mutacje te wywołują chorobę Alzheimera w wyniku zwiększonego lub zmienionego przetwarzania APP w Ae, w szczególności przetwarzania APP w zwiększone ilości długich form Ae (czyli Ae1-42 i Ae-1-43). Uważa się, że mutacje w innych genach, takich jak geny preseniliny, PS1 i PS2, pośrednio wpływają na przetwarzanie APP powodując powstanie zwiększonych ilości długich form Ae (patrz Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Obserwacje te wskazują, że Ae, a zwłaszcza jego długa forma, jest elementem przyczynowym w chorobie Alzheimera.
McMichael, EP 526511, zaproponował podawanie homeopatycznych dawek (mniejszych niż lub równych 10-2 mg/dzień) Ae pacjentom z wcześniej rozwiniętą AD. Oczekuje się, że u typowego człowieka z około 5 litrami osocza nawet wyższa granica tej dawki wytworzy stężenie nie większe niż pg/ml. Normalne stężenie Ae w osoczu człowieka wynosi 50 - 200 pg/ml (Seubert i inni, Nature 359, 325-327 (1992). Ze względu na to, że dawka proponowana w EP 526511 w niewielkim stopniu zmienia poziom endogennego Ae w krążeniu oraz że EP 526511 nie zaleca stosowania adiuwanta, wydaje się niemożliwym, że wystąpi jakikolwiek skutek leczniczy.
W przeciwieństwie do powyższego wynalazek dotyczy ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera. Zatem wynalazek dostarcza od dawna potrzebnego sposobu leczniczej do zapobiegania lub poprawy neuropatologii choroby Alzheimera.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z Ae i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym izotyp tego przeciwciała stanowi ludzkie IgG1.
Korzystnie przeciwciało stanowi monoklonalne przeciwciało.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała, które specyficznie wiąże się z Ae, gdzie izotyp przeciwciała stanowi ludzkie IgG1, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera u pacjenta, przy czym złogi amyloidowe zawierają zagregowany peptyd Ae.
W korzystnym zastosowaniu przeciwciało stanowi monoklonalne przeciwciało.
Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjentem jest człowiek.
Korzystne jest zastosowanie do wytwarzania leku do profilaktyki choroby Alzheimera u pacjenta, w którym u pacjenta nie występują objawy.
Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjent ma mniej niż 50 lat.
Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjent ma odziedziczone czynniki ryzyka wskazujące podatność na chorobę Alzheimera.
Korzystne jest także zastosowanie, w którym pacjent nie ma znanych czynników ryzyka choroby Alzheimera.
PL 202 698 B1
Korzystne jest zastosowanie, w którym lek podaje się doustnie, podskórnie, domięśniowo, miejscowo lub dożylnie. Korzystniej lek podaje się domięśniowo lub podskórnie.
Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjent jest monitorowany pod względem odpowiedzi immunologicznej.
Sposoby profilaktyki lub leczenia chorób charakteryzujących się odkładaniem amyloidu u pacjenta powodują wywołanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowemu składnikowi złogów amyloidowych u pacjenta. Takie wywołanie odpowiedzi może zajść czynnie przez podanie immunogenu, albo biernie przez podanie przeciwciała lub aktywnego fragmentu lub pochodnej przeciwciała.
U niektórych pacjentów złogiem amyloidowym jest skupisko peptydu Αβ i choroba jest chorobą Alzheimera. W niektórych sposobach u pacjenta brak objawów. W niektórych sposobach pacjent ma ponad 50 lat. W niektórych sposobach pacjent odziedziczył czynniki ryzyka wskazujące na podatność na chorobę Alzheimera. Te czynniki ryzyka obejmują zmienne allele genów preseniliny PS1 i PS2 oraz zmienne formy APP. W innych sposobach nie ma znanych czynników ryzyka wystąpienia choroby Alzheimera.
W leczeniu pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera jeden ze sposobów leczenia obejmuje podawanie pacjentowi dawki peptydu Ap, aby wywołać odpowiedź immunologiczną. Niekiedy peptyd Ae podaje się z adiuwantem wzmacniającym odpowiedź immunologiczną na peptyd Ap. Może nim być ałun lub MPL. Dawka peptydu Ap podawanego pacjentowi zazwyczaj wynosi co najmniej 1 lub 10 μg przy podawaniu z adjuwantem, a co najmniej 50 μg przy podawaniu bez adiuwanta. Może również wynosić co najmniej 100 μg.
Peptydem Ap może też być Ap1-42. Niekiedy peptyd Ap jest podawany w postaci zagregowanej lub w postaci zdysocjowanej. Środkiem leczniczym może też być skuteczna dawka kwasu nukleinowego kodującego Ap lub jego aktywny fragment lub jego pochodną. Kwas nukleinowy kodujący Ap lub jego fragment jest eksprymowany u pacjenta z wytworzeniem Ap lub jego aktywnego fragmentu wywołującego odpowiedź immunologiczną. Niekiedy kwas nukleinowy podaje się przez skórę, ewentualnie w postaci plastra. Środek leczniczy można znajdować przeszukując bibliotekę związków w celu zidentyfikowania związku oddziaływującego z przeciwciałami względem Ap oraz podawać związek pacjentowi w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.
Odpowiedź immunologiczna może być skierowana przeciw peptydowi Ap w postaci zagregowanej, a nie przeciw peptydowi Ap w postaci zdysocjowanej. Przykładowo na odpowiedź immunologiczną mogą składać się przeciwciała wiążące zagregowaną postać peptydu Ap, nie wiążące zdysocjowanego peptydu Ap. Odpowiedź immunologiczna może obejmować komórki T wiążące Ap skompleksowany z MCHI lub MCHII na komórkach CD8 lub CD4, lub jest indukowana przez podanie pacjentowi przeciwciała przeciw Ap. Odpowiedź immunologiczna może też być indukowana przez pobranie komórek T od pacjenta, poddanie komórek T działaniu peptydu Ap w warunkach, w których komórki T są aktywowane, a następnie ponowne umieszczenie komórek T w organizmie pacjenta.
Środek leczniczy zazwyczaj podaje się doustnie, donosowo, śródskórnie, podskórnie, domięśniowo, miejscowo lub dożylnie. Pacjenta po podaniu leku można monitorować w celu określenia odpowiedzi immunologicznej. Jeżeli podczas monitorowania wystąpi obniżenie odpowiedzi immunologicznej w czasie, pacjentowi można podać jedną lub większą liczbę kolejnych dawek leku.
Środki farmaceutyczne mogą zawierać Ap oraz zaróbkę odpowiednią do podawania doustnego i innymi drogami, lub też środek skuteczny w wywoływaniu u pacjenta odpowiedzi immunologicznej przeciw Ap oraz dopuszczalny farmaceutycznie adiuwant. Środkiem może być niekiedy Ap lub jego aktywny fragment. Adiuwant może stanowić ałun, a niekiedy jest to emulsja typu olej w wodzie. Ap lub jego aktywny fragment może także być składnikiem kopolimeru polilaktyd-poliglikolid (PLPG) lub innej cząstki. Możliwe jest łączenie Ap lub jego aktywnego fragmentu z cząsteczką koniugatową sprzyjającą dostarczaniu Ap do krwioobiegu pacjenta i/lub sprzyjającą odpowiedzi immunologicznej przeciw Ap. Koniugat może na przykład sprzyjać wywołaniu odpowiedzi immunologicznej przeciw Ap i może nim być toksyna cholery, immunoglobulina, atenuowana toksyna błonicy CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-3 (1997)).
Środek farmaceutyczny może zawierać środek skutecznie wywołujący u pacjenta odpowiedź immunologiczną przeciw Ap, z tym, że środek nie powinien zawierać kompletnego adiuwantu Freunda. Środek może także zawierać wektor wirusowy kodujący Ap lub jego aktywny fragment skutecznie wywołujący odpowiedź immunologiczną przeciw Ap. Odpowiednimi wektorami wirusowymi mogą być: wirus opryszczki, adenowirus, wirus adenosatelitarny, retrowirus, wirus Sindibs, wirus gorączki Semliki Forest, wirus ospy krowiej lub ospy ptasiej.
PL 202 698 B1
W sposobach zapobiegania chorobie Alzheimera oraz jej leczenia pacjentowi podaje się skuteczną dawkę peptydu Αβ. Można stosować Αβ lub przeciwciała skierowane przeciw niemu do wytwarzania leku przeciwdziałającego chorobie Alzheimera lub leczącego ją.
Można również oceniać skuteczność sposobu leczenia choroby Alzheimera u pacjenta. Oznacza się w próbkach tkanek pacjenta podstawową ilość przeciwciał specyficznych przeciw Αβ przed podaniem środka. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Αβ w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu środkiem można porównać z podstawową ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Αβ. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Αβ zmierzona po leczeniu, znacząco większa od ilości podstawowej przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Αβ, wskazuje na pozytywny wynik leczenia.
W ocenie skuteczności sposobów leczenia choroby Alzheimera u pacjenta można oznaczać w próbkach tkanek pacjenta podstawową ilość przeciwciał specyficznych przeciw Αβ przed podaniem środka. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu środkiem można porównać z podstawową ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae. Obniżenie ilości lub brak znaczącej różnicy pomiędzy ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae zmierzoną po leczeniu a ilością podstawową przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae wskazuje na negatywny wynik leczenia.
W ocenie innym sposobem skuteczności leczenia choroby Alzheimera u pacjenta można oznaczać w próbkach tkanek kontrolnej populacji kontrolną ilość przeciwciał specyficznych przeciw Ae. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu środkiem można porównać z kontrolną ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae zmierzona po leczeniu, znacząco większa od ilości kontrolnej przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae, wskazuje na pozytywny wynik leczenia.
W ocenie innym sposobem skuteczności leczenia choroby Alzheimera u pacjenta można oznaczać w próbkach tkanek kontrolnej populacji kontrolną ilość przeciwciał specyficznych przeciw Ae. Ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae w próbkach tkanek pacjenta po podaniu środka można porównać z kontrolną ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae. Brak znaczącej różnicy pomiędzy ilością przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae zmierzoną po rozpoczęciu leczenia a ilością kontrolną przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae wskazuje na negatywny wynik leczenia.
Inne sposoby monitorowania u pacjenta choroby Alzheimera lub podatności na tę chorobę mogą obejmować wykrywanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowi Ae w próbce pobranej od pacjenta. Niekiedy pacjentowi podaje się środek skuteczny w leczeniu choroby Alzheimera lub jej zapobieganiu, a poziom odpowiedzi określa przyszły tryb leczenia pacjenta.
W ocenie innym sposobem skuteczności leczenia choroby Alzheimera u pacjenta można oznaczać ilość przeciwciał specyficznych przeciw peptydowi Ae w próbce tkanki pacjenta leczonego środkiem. Ilość tę można porównać z kontrolną ilością oznaczoną w populacji pacjentów u których występuje poprawa lub zanik objawów choroby Alzheimera pod wpływem leczenia środkiem. Wartość u pacjenta równa co najmniej wartości kontrolnej wskazuje na pozytywną odpowiedź na leczenie.
Zestawy do takich ocen zazwyczaj mogą zawierać odczynnik specyficznie wiążący się z przeciwciałami przeciw Ae lub stymulujący proliferację komórek T reaktywnych wobec Ae.
Wynalazek stanie się bardziej zrozumiały dzięki załączonym rysunkom, przy czym
Fig. 1: Miano przeciwciał po iniekcji transgenicznym myszom Ae1-42.
Fig. 2: Obciążenie hipokampu amyloidem. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilościowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu hipokampu zajmowanego przez płytki amyloidowe, określony na podstawie reaktywności z mAe 3D6 specyficznymi dla Ae. Wartości dla poszczególnych myszy podano dzieląc je na grupy badawcze. Linia pozioma dla każdej z grup wskazuje wartość mediany rozkładu.
Fig. 3: Dystrofia neurytowa w hipokampie. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilościowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu hipokampu zajmowany przez zwyrodniałe neuryty, określony przez ich oddziaływanie z ludzkimi mAe 8E5 specyficznymi dla APP. Wartości dla poszczególnych myszy podano dla grupy traktowanej AN1792 oraz grupy kontrolnej traktowanej PBS. Linia pozioma dla każdej z grup wskazuje wartość mediany rozkładu.
Fig. 4: Astrocytoza w korze pozamodzelowatej. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilościowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu korowego zajmowany przez astrocyty pozytywne pod względem kwaśnego włóknistego białka glejoPL 202 698 B1 wego (GFAP). Wartości dla poszczególnych myszy podano dzieląc je na grupy badawcze, a wartości mediany dla grup wskazano poziomymi liniami.
Fig. 5: Średnie geometryczne mian przeciwciał przeciw Αβ1-42 po immunizacji w zakresie ośmiu dawek AN1792 zawierających 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11,33, 100 lub 300 μg.
Fig. 6: Kinetyka odpowiedzi na przeciwciała po immunizacji AN1792. Miana wyrażono w postaci średnich geometrycznych wartości dla 6 zwierząt w każdej z grup.
Fig. 7: Ilościowa analiza obrazu obciążenia kory amyloidem u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.
Fig. 8: Ilościowa analiza obrazu obciążenia płytkami neurytycznymi u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.
Fig. 9: Ilościowa analiza obrazu procentu kory pozamodzelowatej objętej astrocytozą u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.
Fig. 10: Test proliferacji limfocytów na komórkach śledziony u myszy poddanych działaniu AN1792 (górny wykres) i PBS (dolny wykres).
Fig. 11: Całkowity poziom Ae w korze. Wykres rozrzutu poszczególnych profili Ae u myszy immunizowanych Ae lub pochodnymi APP w połączeniu z adiuwantem Freunda.
Fig. 12: Obciążenie kory amyloidem określono na podstawie sterowanej komputerowo ilościowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu myszy immunizowanych koniugatami peptydu Ae - Λβ1-5, Ae1-12, Ae13-28, agregatami AN1792 o pełnej długości Ae (Ae1-42) i AN1528 (Άβ1-40) oraz poddanej działaniu PBS grupy kontrolnej.
Fig. 13: Średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych dla Ae dla grup myszy immunizowanych Ae lub pochodnymi APP, w połączeniu z adiuwantem Freunda.
Fig. 14: Średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych dla Ae dla grup świnek morskich immunizowanych AN1792 lub jego palmitoliowaną pochodną, w połączeniu z różnymi adiuwantami.
Fig. 15: Poziomy Ae w korze 12-miesięcznych myszy PDAPP poddanych działaniu AN1792 lub AN1528, z różnymi adiuwantami.
Określenie „zasadniczo identyczne oznacza, że dwie sekwencje białkowe, najlepiej przyrównywane z zastosowaniem takich programów jak GAP lub BESTFIT, z użyciem domyślnych ważności luk (gap weights), wykazują co najmniej 65 procent identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 80 lub 90 procent identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 95 procent identyczności sekwencji lub więcej (np. 99 procent identyczności sekwencji lub więcej). Korzystnie pozycje reszt, które nie są takie same, różnią się podstawieniem konserwatywnymi aminokwasami.
Przy przyrównywaniu sekwencji zazwyczaj jedną z sekwencji stosuje się jako sekwencję odniesienia, z którą porównuje się badane sekwencje. Z zastosowaniem algorytmu porównującego sekwencje, sekwencję badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, jeżeli jest to konieczne określa się współrzędne podsekwencji, a następnie ustala się parametry algorytmu programowego. Następnie algorytm porównujący sekwencje oblicza procent identyczności sekwencji badanej(ych) do sekwencji odniesienia na podstawie ustalonych parametrów programu.
Optymalne przyrównanie porównywanych sekwencji można przeprowadzić, np. z zastosowaniem algorytmu homologii lokalnej Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algorytmu przyrównującego homologie Needelemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), szukając podobieństw metodą Pearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), za pomocą skomputeryzowanych wersji tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA oraz TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) albo na podstawie oceny wzrokowej (patrz głównie Ausubel i inni, supra). Jednym z przykładów algorytmu odpowiedniego do określania procentu podobieństwa i identyczności sekwencji jest algorytm BLAST opisany przez Altschul i inni, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Oprogramowanie do przeprowadzania algorytmu BLAST jest publicznie dostępne przez National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Zazwyczaj domyślne parametry programu można stosować do wykonywania porównania sekwencji, ale można także użyć dostosowanych parametrów. Dla sekwencji aminokwasowych program BLAST używa jako domyślnych długości słowa (wordlength) (W) równej 3, oczekiwania (expectation) (E) równego 10 oraz macierzy punktującej (scoring matrix) BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).
Celem klasyfikacji podstawień aminokwasowych konserwatywnych i niekonserwatywnych aminokwasy grupuje się w następujący sposób: Grupa I (hydrofobowe, łańcuchy boczne): norleucyna, met, ala, val, leu, ile; Grupa II (obojętne, hydrofilowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; Grupa III (kwa6
PL 202 698 B1 sowe, łańcuchy boczne): asp, glu; Grupa IV (zasadowe, łańcuchy boczne): asn, gln, his, lys, arg; Grupa V (aminokwasy wpływające na orientację łańcucha): gly, pro oraz Grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, phe. Konserwatywne podstawienia obejmują podstawienia pomiędzy aminokwasami tej samej klasy. Niekonserwatywne podstawienia obejmują zmiany aminokwasu jednej klasy na aminokwas drugiej klasy.
Środki lecznicze zawarte w kompozycjach według wynalazku zazwyczaj są zasadniczo czyste. Oznacza to, że środek jest zazwyczaj co najmniej w 50% (wagowo) czyste, a ponadto są zasadniczo wolne od przeszkadzających białek lub zanieczyszczeń. Czasem środki są co najmniej w 80% (wagowo), korzystniej w co najmniej 80 lub około 95% (wagowo) czyste. Jednakże za pomocą standardowych technik oczyszczania białek można uzyskać preparaty białek homogenne co najmniej w 99%.
Specyficzne wiązanie dwóch jednostek oznacza powinowactwo co najmniej 106, 107, 108, 109 -1 10 -1 8 -1
M-1 lub 1010 M-1. Korzystne są wartości powinowactwa większe niż 108 M-1.
Określenie „przeciwciało stosowano tutaj w odniesieniu do nienaruszonych przeciwciał jak i ich fragmentów wiążących. Zazwyczaj fragmenty współzawodniczą w wiązaniu antygenu z nienaruszonymi przeciwciałami od których pochodzą. Ponadto przeciwciała lub ich fragmenty wiążące mogą być chemicznie połączone lub wyeksprymowane jako białka fuzyjne z innymi białkami.
APP695, APP751 i APP770 dotyczą odpowiednio polipeptydów o długości 695, 751 i 770 aminokwasów kodowanych przez ludzki gen APP. Patrz Kang i inni, Nature 325, 773 (1987); Ponte i inni, Nature 331, 525 (1988), oraz Kitaguchi i inni, Nature 331, 530 (1988). Aminokwasy w obrębie ludzkiego białka prekursorowego amyloidu (APP) mają przypisane numery zgodnie z sekwencją izoformy APP770. Określenia takie jak Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 i Αβ43 oznaczają peptydy Αβ zawierające aminokwasy 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 i 1-43.
Określenie „epitop lub „determinanta antygenowa oznacza miejsce na antygenie, na które odpowiadają komórki B i/lub T. Epitopy komórek B mogą być utworzone z dwóch przylegających lub nieprzylegających aminokwasów zestawionych obok siebie przez trzeciorzędowe złożenie białka. Epitopy utworzone z przylegających aminokwasów są zazwyczaj zachowane przy działaniu rozpuszczalników denaturujących, podczas gdy epitopy utworzone w wyniku trzeciorzędowego składania znikają po działaniu rozpuszczalnikami denaturującymi. Epitop zazwyczaj obejmuje co najmniej 3, a częściej co najmniej 5 lub 8-10 aminokwasów w unikatowej konformacji przestrzennej. Sposoby określania przestrzennej konformacji epitopów obejmują np. krystalografię rentgenowską i dwuwymiarowy jądrowy rezonans magnetyczny. Patrz np. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, red. Glenn E. Morris (1996) . Przeciwciała rozpoznające ten sam epitop można zidentyfikować w prostym teście immunologicznym pokazującym zdolność jednego przeciwciała do blokowania wiązania innego przeciwciała z docelowym antygenem. Komórki T rozpoznają ciągłe epitopy o długości około 9 aminokwasów dla komórek CD8 lub około 13-15 aminokwasów dla komórek CD4. Komórki T rozpoznające epitop można zidentyfikować w testach in vitro mierzących zależną od antygenu proliferację, oznaczaną przez inkorporację 3H-tymidyny w uczulonych komórkach T, w odpowiedzi na epitop (Burke i inni, J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), zależne od antygenu uśmiercanie (test limfocytów T cytotoksycznych, Tigges i inni, J. Immunol. 156, 3901-3910) lub wydzielanie cytokin.
Określenie „immunologiczny lub odpowiedź „immunologiczna oznacza rozwój korzystnej odpowiedzi humoralnej (pośredniczonej przez przeciwciała) i/lub komórkowej (pośredniczonej przez specyficzne dla antygenu komórki T lub ich produkty wydzielnicze) skierowanej przeciw peptydowi amyloidowemu u pacjenta biorcy. Taka odpowiedź może być czynną odpowiedzią wywołana przez podanie immunogenu, albo bierną odpowiedzią wywołaną przez podanie przeciwciał lub uczulonych komórek T. Komórkowa odpowiedź immunologiczna jest wywoływana przez prezentację epitopów polipeptydowych w połączeniu z cząsteczkami MHC Klasy I lub Klasy II w celu aktywowania specyficznych dla antygenu pomocniczych komórek T CD4+ i/lub cytotoksycznych komórek T CD8+. Odpowiedź może także obejmować aktywacje monocytów, makrofagów, komórek NK, bazofili, komórek dendrytycznych, astrocytów, komórek mikrogleju, eozynofili lub innych składników odporności wrodzonej. Wystąpienie pośredniczonej przez komórki odpowiedzi immunologicznej można okeślić w testach proliferacji (komórek T CD4+) lub testach CTL (limfocytów T cytotoksycznych) (patrz Burke, supra; Tiggers, supra). Względne udziały odpowiedzi humoralnej i komórkowej w ochronnym lub leczniczym działaniu immunogenu można rozróżnić oddzielnie izolując IgG i komórki T z immunizowanego syngeneicznego zwierzęcia i mierząc ochronne lub lecznicze działanie u drugiego zwierzęcia.
„Środek immunogenny lub „immunogen jest zdolny po podaniu pacjentowi wywołać odpowiedź immunologiczną przeciw sobie samemu, ewentualnie w połączeniu z adiuwantem.
PL 202 698 B1
Określenie „nagi polinukleotyd oznacza polinukleotyd nie skompleksowany z materiałem koloidalnym. Nagie polinukleotydy czasem klonuje się w wektory plazmidowe.
Określenie „adiuwant oznacza związek, który podany razem z antygenem wzmaga odpowiedź immunologiczną na antygen, ale podany oddzielnie nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej na antygen. Adiuwanty mogą wzmagać odpowiedź immunologiczną na drodze kilku różnych mechanizmów, włącznie z rekrutacją limfocytów, stymulacją komórek B i/lub T oraz stymulacją makrofagów.
Określenie „pacjent oznacza człowieka lub innego ssaka poddawanego profilaktyce lub leczeniu.
Zdezintegrowany lub monomeryczny Αβ oznacza rozpuszczalne, monomeryczne jednostki peptydowe Ap. Jednym ze sposobów preparowania monomerycznych Ae jest rozpuszczenie liofilizowanego peptydu w czystym DMSO z rozbijaniem ultradźwiękami. Powstały roztwór odwirowuje się w celu usunięcia cząstek nierozpuszczalnych. Zagregowany Ap jest mieszaniną oligomerów, w której monomeryczne jednostki są utrzymywane razem wiązaniami niekowalencyjnymi.
Środki lub sposoby „obejmujące jeden lub większą liczbę wymienionych elementów mogą zawierać inne elementy nie wymienione specyficznie. Przykładowo środek zawierający peptyd Ap obejmuje zarówno wyizolowany peptyd Ap, jak i peptyd Ap jako składnik dłuższej sekwencji polipeptydowej.
Wynalazek dotyczy środków leczniczych oraz sposobów profilaktyki i leczenia chorób charakteryzujących się nagromadzeniem złogów amyloidowych. Złogi amyloidowe zawierają peptydy zagregowane w nierozpuszczalną masę. Natura peptydów różni się w różnych chorobach, ale w większości przypadków agregat ma strukturę p-pofałdowanej kartki i wybarwia się barwnikiem Congo Red. Choroby charakteryzujące się złogami amyloidowymi obejmują chorobę Alzheimera (AD), zarówno o wczesnym jak i późnym początku. W obu chorobach złogi amyloidowe zawierają peptyd nazywany Ap, który gromadzi się w mózgu osób chorych. Przykładami innych chorób charakteryzujących się złogami amyloidu są amyloidoza SAA, dziedziczny zespół islandzki, szpiczak mnogi oraz encefalopatię gąbczaste, włącznie z chorobą szalonych krów, chorobą Creutzfeldta Jakoba, encefalopatia owiec oraz encefalopatią gąbczastą norek (patrz Weissmenn i inni, Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits i inni, Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997)), Nathanson i inni, Am. J. Epidemiol. 145, 959969 (1997)). Peptydy tworzące agregaty w tych chorobach, to odpowiednio dla pierwszych trzech surowiczy amyloid A, cystantyna C, lekki łańcuch IgG κ oraz białka prionowe dla pozostałych.
Środki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku wywołują odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi Ap. Środki te obejmują sam peptyd Ap oraz jego odmiany, analogi i mimetyki peptydu Ap indukujące przeciwciała skierowanymi przeciw peptydowi Ap i/lub reagujące z nimi krzyżowo oraz przeciwciała lub komórki T reagujące z peptydem Ap. Wywołanie odpowiedzi immunologicznej może być czynne, np. w przypadku podania pacjentowi immunogenu w celu zaindukowania przeciwciał lub komórek T reagujących z Ap, albo bierne, np. w przypadku podania pacjentowi przeciwciał, które same wiążą Ap.
Ap znany także jako peptyd p-amyloidowy lub peptyd A4 (patrz US 4666829; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984), jest peptydem o długości 39-43 aminokwasów, który jest główną składową charakterystycznych płytek w chorobie Alzheimera. Ap powstaje w wyniku przetwarzania większego białka APP przez dwa enzymy, nazywane sekretazami p i γ (patrz. Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Znane mutacje w APP związane z chorobą Alzheimera występują proksymalnie do miejsc p lub γ sekretaz lub w obrębie Ap. Przykładowo pozycja 717 leży proksymalnie do miejsca cięcia APP przez sekretazę γ podczas obróbki do Ap, a pozycje 670/671 leżą proksymalnie do miejsca cięcia przez sekretazę p. Uważa się, że mutacje powodują chorobę AD przez wpływanie na reakcje cięcia, w wyniku których powstaje Ap, tak że zwiększają ilość wytwarzanej 42/43 aminokwasowej formy Ap.
Ap ma tę niezwykłą zdolność, że może utrwalać i aktywować zarówno klasyczną, jak i alternatywną kaskadę dopełniacza. W szczególności wiąże się on z Clq i ostatecznie z C3bi. To połączenie ułatwia wiązanie do makrofagów, prowadzące do aktywacji komórek B. Ponadto C3bi dalej rozpada się i wiąże z CR2 na komórkach B w sposób zależny od komórek T, co prowadzi do 10000 krotnego wzrostu aktywacji tych komórek. Mechanizm ten powoduje, że Ap wytwarza większą niż inne antygeny odpowiedź immunologiczną.
Środek leczniczy zawarty w kompozycji farmaceutycznej może być dowolną naturalnie występującą postacią peptydu Ap, a zwłaszcza ludzką postacią (to jest Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 lub Ap43). Sekwencje tych peptydów i ich pokrewieństwo z prekursorowym APP przedstawiono na fig. 1 w Hardy i inni, TINS 20, 155-158 (1997). Przykładowo Ap42 ma sekwencję:
PL 202 698 B1
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-AlaGlu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH
Ae41, Ae40 i Ae39 różnią się od Ae42 pominięciem odpowiednio Ala, Ala-Ile i Ala-Ile-Val na C-końcu. Ae43 różni się od Ae42 obecnością reszty treoniny na C-końcu. Środkiem leczniczym może także być aktywny fragment lub analog naturalnego peptydu Ae, zawierający epitop indukujący podobną ochronną lub leczniczą odpowiedź immunologiczną po podaniu człowiekowi. Immunogenne fragmenty zazwyczaj mają ciągłą sekwencję co najmniej z 3, 5, 6, 10 lub 20 sąsiednich aminokwasów naturalnego peptydu. Immunogenne fragmenty obejmują Ae1-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 i 35-42. Fragmenty z N-końcowej połowy Ae są korzystniejsze w niektórych sposobach. Analogi obejmują odmiany alleliczne, gatunkowe i indukowane. Analogi zazwyczaj różnią się od naturalnie występujących peptydów w jednym lub kilku miejscach, często przez konserwatywne podstawienia. Analogi zazwyczaj wykazują co najmniej 80 lub 90% identyczności sekwencji z naturalnymi peptydami. Niektóre analogi zawierają także nienaturalne aminokwasy lub modyfikacje N- lub C-końcowych aminokwasów. Przykładami nienaturalnych aminokwasów są α,α-dwupodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy, 4-hydroksyprolina, γ-karboksyglutaminian, ε-N,N,N-trimetylolizyna, ε-N-acetylolizyna, O-fosfoseryna, N-acetyloseryna, N-formylometionina, 3-metylohistydyna, 5-hydroksylizyna, ω-N-metyloarginina. Profilaktyczne lub lecznicze działanie fragmentów i analogów można selekcjonować z użyciem zwierzęcych modeli transgenicznych, co opisano poniżej.
Ae, jego fragmenty, analogi i inne peptydy amyloidogenne można zsyntetyzować drogą syntezy peptydów w fazie stałej lub przez ekspresję rekombinacyjną, albo można je otrzymać z naturalnych źródeł. Automatyczne syntetyzatory białek są dostępne w handlu od wielu dostawców, takich jak Applied Biosystems, Foster City, California. Ekspresję rekombinacyjną można przeprowadzić w bakteriach, takich jak E. coli, w drożdżach, komórkach owadzich lub komórkach ssaczych. Procedury ekspresji rekombinacyjnej opisali Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2 wyd., 1989). Niektóre postacie peptydu Ae są także dostępne w handlu (np. American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA i California Peptide Research, Inc. Napa, CA).
Środki lecznicze obejmują także dłuższe polipeptydy obejmujące np. peptyd Ae, aktywny fragment lub analog razem z innymi aminokwasami. Przykładowo peptyd Ae może być obecny w nieaktywnym białku APP lub jego segmencie, takim jak fragment C-100 zaczynający się na N-końcu Ae i biegnący do końca APP. Takie polipeptydy można przebadać pod względem ich działania profilaktycznego lub leczniczego na modelach zwierzęcych w sposób opisany poniżej. Peptyd Ae, analog, aktywny fragment lub inny polipeptyd można podać w zasocjowanej postaci (to jest jako peptyd amyloidowy) lub w postaci zdysocjowanej. Środki lecznicze obejmują także multimery monomerycznych środków immunogennych.
W kolejnej odmianie peptyd immunogenny, taki jak Ae, może być stosowany jako szczepionka wirusowa lub bakteryjna. Kwas nukleinowy kodujący peptyd immunogenny wprowadza się do genomu lub episomu wirusa lub bakterii. Ewentualnie kwas nukleinowy wprowadza się w taki sposób, że peptyd immunogenny jest eksprymowany jako białko wydzielnicze lub białko fuzyjne z białkiem zewnętrznej powierzchni wirusa lub transbłonowym białkiem bakterii, tak że peptyd jest eksponowany. Wirusy lub bakterie użyte w takich metodach powinny być niepatogenne lub atenuowane. Odpowiednie wirusy obejmują adenowirusy, HSV, ospę krowią i ospę drobiu. Fuzja peptydu immunogennego z HBsAg z HBV jest szczególnie odpowiednia. Środki lecznicze obejmują także peptydy i inne związki, które nie koniecznie wykazują znaczące podobieństwo sekwencji z Ae, ale tym niemniej działają jako mimetyki Ae i wywołują podobną odpowiedź immunologiczną. Można np. przebadać pod względem przydatności dowolne peptydy lub białka tworzące e-pofałdowane kartki. Można także stosować przeciwciała przeciwidiotypowe przeciw przeciwciałom monoklonalnym przeciw Ae lub innym peptydom amyloidogennym. Takie przeciwciała przeciw-Id naśladują antygen i wytwarzają odpowiedź immunologiczną na niego (patrz Essential Immunology (red. Roit, Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, wyd. 6) str. 181).
Można także zbadać pod względem przydatności losowe biblioteki peptydów lub innych związków. Biblioteki kombinatoryjne można wytworzyć dla wielu typów związków, które mogą być syntetyzowane krok-po-kroku. Związki takie obejmują polipeptydy, mimetyki e-skrętu, polisacharydy, fosfolipidy, hormony, prostaglandyny, steroidy, związki aromatyczne, związki heterocykliczne, benzodiazepiny, oligomeryczne N-podstawione glicyny i oligokarbaminiany. Duże biblioteki kombinatoryjne związków można skonstruować metodą kodowanych syntetycznych bibliotek opisaną w Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/0851, Pharmacopeia, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642 (z których każdy cytuje się tutaj jako pozycję literaturową do wszystkich zastosowań).
PL 202 698 B1
Biblioteki peptydowe można także skonstruować metodami ekspozycji fagowej. Patrz np. Devlin, WO 91/18980.
Początkowo biblioteki kombinatoryjne i inne związki bada się pod względem przydatności określając ich zdolność do wiązania się do przeciwciał lub limfocytów (B lub T) znanych jako specyficzne dla Ap lub innych peptydów amyloidogennych. Na przykład początkowe przeszukiwania można przeprowadzić stosując jakiekolwiek surowice poliklonalne lub przeciwciała monoklonalne przeciw Ap lub innym peptydom amyloidogennym. Następnie związki zidentyfikowane w tych badaniach dalej analizuje się pod względem ich zdolności do indukowania przeciwciał lub reaktywnych limfocytów przeciw Ap lub innym peptydom amyloidogennym. Na przykład można przebadać wielokrotne rozcieńczenia surowicy na płytkach do mikromianowania wcześniej powleczonych peptydem Ap i przeprowadzić standardowy test ELISA w celu wykrycia reaktywnych przeciwciał na Ap. Następnie związki można zbadać pod względem ich profilaktycznej lub leczniczej skuteczności na zwierzętach transgenicznych predysponowanych do choroby amyloidogennej, co opisano w przykładach. Zwierzęta takie obejmują, np. myszy niosące mutację 717 APP opisane przez Games i innych, supra, oraz myszy niosące mutację Swedish APP, takie jak opisane przez McConlogue i innych, US 5612486 i Hsiao i innych, Science 274, 99 (1996); Staufenbiela i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); SturchleraPierrata i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Brochleta i innych, Neuron 19, 939-945 (1997). To samo podejście badawcze można zastosować w przypadku innych potencjalnych środków, takich jak opisane powyżej fragmenty Ap, analogi Ap i dłuższe peptydy zawierające Ap.
Środki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku zawierają także przeciwciała specyficznie wiążące Ap. Takie przeciwciała mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi. Niektóre z takich przeciwciał specyficznie wiążą się z zagregowaną formą Ap, nie wiążąc się z formą zdysocjowaną. Niektóre wiążą się z formą zdysocjowaną, nie wiążąc się z formą zagregowaną. Niektóre wiążą się zarówno z formą zagregowaną, jak i zdysocjowaną. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych nieczłowieczych, np. mysich lub szczurzych, można osiągnąć np. przez immunizację zwierzęcia z użyciem Ap. Patrz Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (przytoczony tutaj jako pozycja literaturowa do wszystkich zastosowań). Taki immunogen można otrzymać ze źródła naturalnego przez syntezę peptydów lub ekspresję rekombinacyjną.
Humanizowane postacie mysich przeciwciał można tworzyć z zastosowaniem technik rekombinacji DNA łącząc regiony CDR nieczłowieczych przeciwciał z ze stałymi regionami ludzkimi. Patrz Queen i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) i WO 90/07861 (przytoczone tutaj jako pozycje literaturowe do wszystkich zastosowań).
Ludzkie przeciwciała można uzyskać metodami ekspozycji fagowej. Patrz np. Dower i inni, WO 91/17271; McCafferty i inni, WO 92/01047. W tych metodach wytwarza się biblioteki fagowe, których członkowie eksponują różne przeciwciała na swoich powierzchniach zewnętrznych. Przeciwciała zazwyczaj są eksponowane jako fragmenty Fv lub Fab. Fagi eksponujące przeciwciała o wymaganej specyficzności wybiera się przez wzbogacenie powinowactwa do Ap lub jego fragmentów. Można także wytworzyć ludzkie przeciwciała przeciw Ap z niebędących ludźmi ssaków transgenicznych niosących transgeny kodujące co najmniej segment ludzkiego locus immunoglobulinowego oraz inaktywowane endogenne locus immunoglobulinowe. Patrz Lonberg i inni, WO93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (z których każde jest przytoczone tutaj jako pozycja literaturowa do wszystkich zastosowań). Ludzkie przeciwciała można wybrać w doświadczeniach wiązania kompetycyjnego lub inaczej, jako mające tę samą specyficzność epitopową jak konkretne przeciwciało mysie. Takie przeciwciała szczególnie prawdopodobnie wykazują korzystne funkcjonalne właściwości przeciwciał mysich. Ludzkie przeciwciała poliklonalne także można otrzymać w postaci surowicy od pacjentów immunizowanych środkiem immunogennym. Ponadto takie przeciwciała poliklonalne można zagęścić drogą oczyszczania na zasadzie powinowactwa stosując Ap lub inny peptyd amyloidowy jako odczynnik z powinowactwem.
Ludzkie lub humanizowane przeciwciała można tak zaprojektować, żeby miały region stały IgG, IgD, IgA lub IgE oraz jakikolwiek izotyp, włącznie z IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Przeciwciała można eksprymować jako tetramery zawierające dwa łańcuchy lekkie i dwa ciężkie, jako oddzielne łańcuchy ciężkie, łańcuchy lekkie, jako Fab, Fab', F(ab')2 i Fv lub jako pojedyncze łańcuchy przeciwciał, w których domeny zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich są połączone razem przez odstępnik.
Środki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują także komórki T wiążące peptyd Ap. Przykładowo komórki T mogą być aktywowane przeciw peptydowi Ap przez wyeksprymowanie ludzkiego genu MHC klasy I i ludzkiego genu p-2-mikroglobuliny z owadziej
PL 202 698 B1 linii komórkowej, gdzie pusty kompleks jest tworzony na powierzchni komórek i może związać peptyd Ae. Komórki T, które wystawiono na działanie linii komórkowej, stają się specyficznie zaktywowane przeciw peptydowi. Patrz Peterson i inni, US 5314813. Linie komórek owadzich eksprymujące antygen MHC klasy II można w podobny sposób stosować do aktywacji komórek T CD4.
Wytwarzanie leczniczych środków do leczenia innych chorób amyloidogennych określają te same lub analogiczne zasady. Ogólnie środki wymienione powyżej do zastosowań w leczeniu choroby Alzheimera można także stosować do leczenia choroby Alzheimera o wczesnym początku, związanej z zespołem Downa. W chorobie szalonych krów stosuje się peptyd prionowy, jego aktywne fragmenty lub analogi oraz przeciwciała przeciw peptydowi prionowemu zamiast peptydu Ae, jego aktywnych fragmentów lub analogów oraz przeciwciał przeciw peptydowi Ae stosowanych w leczeniu choroby Alzheimera. W leczeniu szpiczaka mnogiego stosuje się lekkie łańcuchy IgG oraz ich analogi i przeciwciała przeciw nim, itd. w przypadku innych chorób.
Niektóre środki wywołujące odpowiedź immunologiczną zawierają odpowiedni epitop do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciw złogom amyloidu, ale są zbyt małe, żeby mogły być immunogenne. W tej sytuacji immunogenny peptyd można połączyć z odpowiednim nośnikiem, aby ułatwić wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednie nośniki obejmują albuminy surowicze, hemocjaninę z mięczaka z rodzaju Fisurella (ang. keyhole limpet), cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulinę, albuminę jaja kurzego, toksynę tężca lub toksynę z innych bakterii patogennych, takich jak błonica, E. coli, cholera lub H. pylori lub atenuowne pochodne toksyn. Inne nośniki do stymulacji lub wzmacniania odpowiedzi immunologicznej obejmują cytokiny, takie jak IL-1, peptydy IL-1 α i e, IL-2, YlNF, IL-10, GM-CSF oraz chemokiny, takie jak M1P1a i β oraz RANTES. Środki immunogenne można także połączyć z peptydami polepszającymi transport przez tkanki, co opisano w O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614.
Środki immunogenne można połączyć z nośnikami przez sieciowanie chemiczne. Techniki łączenia immunogenu z nośnikiem obejmują tworzenie disulfidowych mostków z użyciem N-sukcynymidylo-3-(2-pirydylotio)propionianu (SPDP) i 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcymidylu (SMCC) (jeżeli w peptydzie nie ma grupy tiolowej, można ją wprowadzić przez dodanie cysteiny). Te reagenty tworzą wiązania disulfidowe między sobą i resztami cysteiny peptydu na jednym białku i wiązanie amidowe przez grupę ε-amidową lizyny lub inną wolną grupą aminową w innych aminokwasach. Wiele z takich środków tworzących mostki disulfidowe/amidowe opisano w Immun. Rev. 62, 185 (1982). Inne dwufunkcyjne środki sprzęgające tworzą raczej tioetery niż mostki disulfidowe. Wiele z tych środków tworzących tioetery jest dostępnych w handlu i obejmują one reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, kwasu 2-bromooctowego, kwasu 2-jodooctowego i kwasu 4-(maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylowego. Grupy karboksylowe można zaktywować łącząc je z imidem kwasu bursztynowego lub solą sodową kwasu 1-hydroksylo-2-nitro-4-sulfonowego.
Peptydy immunogenne można także wyeksprymować jako białka fuzyjne z nośnikami. Peptyd immunogenny można połączyć z nośnikiem na N-końcu, C-końcu lub w środku. Ponadto w białku fuzyjnym mogą być obecne wielokrotne powtórzenia peptydu immunogennego.
Odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw złogom amyloidowym można także wywołać podając kwasy nukleinowe kodujące peptyd Ae lub inne immunogeny peptydowe. Takim kwasem nukleinowym może być DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego kodujący immunogen jest zazwyczaj połączony z elementami regulatorowymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, które umożliwiają ekspresję segmentu DNA w przewidywanych komórkach docelowych pacjenta. Do ekspresji w komórkach krwi, co jest wymagane do wywołania odpowiedzi immunologicznej, do bezpośredniej ekspresji odpowiednie są elementy promotora i wzmacniacza z genów lekkich i ciężkich łańcuchów immunoglobulin lub promotor i wzmacniacz głównego produktu pośredniego CMV. Połączone elementy regulacyjne i sekwencje kodujące często wklonowuje się do wektora.
Dostępnych jest wiele wirusowych układów wektorowych obejmujących układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)), wektory adenowirusowe (patrz np. Bett i inni, J. Virol. 67, 5911 (1993)), wektory wirusów adenosatelitarnych (patrz np. Zhou i inni, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny ospy obejmujące wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirusowe wektory z rodzaju alfawirus, takie jak wyprowadzone z wirusów Sindibs i gorączki Semliki Forest (patrz np. Dubensky i inni, J. Virol. 70, 508-519 (1996)) oraz wirusy brodawek (Ohe i inni, Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo i inni, WO 94/12692 i Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 1996)).
PL 202 698 B1
DNA kodujący immunogen lub zawierający go wektor można umieścić w liposomach. Odpowiednie lipidy i pokrewne analogi opisano w US 5208036, 5264618, 5279833 i 5283185. Wektory i DNA kodujący immunogen mogą być także zaadsorbowane lub związane z odpowiednimi nośnikami w postaci cząstek, takimi jak np. polimetakrylan metylu, polimleczany i poli(mleczano-koglikolidy), patrz np. McGee i inni, J. Micro Encap. (1996).
Wektory do terapii genowej lub nagi DNA można dostarczyć in vivo podając konkretnemu pacjentowi, zazwyczaj ogólnoustrojowo (np. dożylnie, śródotrzewnowo, donosowo, dożołądkowo, śródskórnie, domięśniowo, podskórnie lub przez wlew wewnątrzczaszkowy) albo miejscowo (patrz np. US 5399346). DNA można także podawać za pomocą działa genowego. Patrz Xiao i Brandsma, supra. DNA kodujący immunogen osadza się na powierzchni mikroskopijnych metalowych kulek. Mikropociski są przyspieszane przez falę szokową lub rozprężany hel i przenikają do tkanek na głębokość kilku warstw komórek. Odpowiednie jest np. urządzenie The Accel™ Gene Delivery Device wytwarzane przez Agacetus, Inc. Middleton WI. Ponadto nagi DNA może przejść przez skórę do krwi, po prostu w wyniku naniesienia DNA na skórę podrażnioną chemicznie lub mechanicznie (patrz, WO 95/05853).
W innej odmianie wektory kodujące immunogeny można dostarczyć do komórek ex vivo, takich jak komórki eksplantowane od pojedynczego pacjenta (np. limfocyty, aspirat szpiku kostnego, biopsja tkankowa) albo uniwersalne donorowe hematopoetyczne komórki macierzyste, a następnie reimplantować te komórki pacjentowi, zazwyczaj po selekcji pod względem komórek, które mają włączony wektor.
Pacjenci, których można leczyć, stanowią osoby z ryzykiem choroby, ale u których nie wystąpiły objawy, a także pacjenci, u których wystąpiły objawy. Jeśli chodzi o chorobę Alzheimera, praktycznie u każdego występuje ryzyko choroby Alzheimera jeżeli on lub ona żyją dostatecznie długo. Zatem niniejsze sposoby można stosować profilaktycznie do ogólnej populacji, bez określania ryzyka u danego pacjenta. Niniejsze sposoby są szczególnie użyteczne w przypadku pacjentów ze znanym genetycznym ryzykiem choroby Alzheimera. Pacjenci tacy obejmują osoby mające krewnych, u których wystąpiła ta choroba, a także osoby u których ryzyko określa się analizując znaczniki genetyczne i biochemiczne. Znaczniki genetyczne ryzyka choroby Alzheimera obejmują mutacje genu APP, w szczególności mutacje w pozycji 717 oraz pozycjach 670 i 671 nazywane odpowiednio mutacjami Hardy'ego i Swedish (patrz Hardy, TINS, supra). Innymi znacznikami ryzyka są mutacje genów preseniliny, PS1 i PS2 oraz ApoE4, rodzinna historia AD, hipercholesterolemia lub miażdżyca tętnic. Osoby obecnie cierpiące na chorobę Alzheimera można rozpoznać po charakterystycznym otępieniu, a także po obecności opisanych wyżej czynników ryzyka. Ponadto dostępnych jest wiele testów diagnostycznych do identyfikacji osób z AD. Obejmują one pomiary poziomów CSF τ i Ae42. Podniesione poziomy τ i obniżone poziomy Ae42 wskazują na obecność AD. Pacjentów z chorobą Alzheimera można także zdiagnozować pod względem kryteriów MMSE i ADRDA, co opisano niżej w części z przykładami.
U pacjentów, u których nie występują objawy, leczenie można rozpocząć w dowolnym wieku (np. 10, 20, 30). Jednakże zazwyczaj nie jest konieczne rozpoczynanie leczenia zanim pacjent osiągnie 40, 50, 60 lub 70 rok życia. Leczenie zazwyczaj obejmuje podawanie wielu dawek w pewnym okresie czasu. Leczenie można monitorować określając odpowiedzi przeciwciał lub aktywowanych komórek T lub B na środek leczniczy (np. peptyd Ae) w czasie. Jeżeli odpowiedź słabnie, wskazana jest wzmocniona dawka. W przypadku pacjentów z potencjalnym zespołem Downa leczenie można rozpocząć przed urodzeniem podając środek leczniczy matce, lub wkrótce po urodzeniu.
W zastosowaniach profilaktycznych środki farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi, podatnemu na konkretną chorobę lub z ryzykiem konkretnej choroby, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka lub opóźnienia pojawienia się choroby. W zastosowaniach leczniczych środki farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi, u którego podejrzewa się taką chorobę lub u którego już wystąpiła taka choroba, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zahamowania objawów choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednią do osiągnięcia tego definiuje się jako leczniczo lub profilaktycznie skuteczną dawkę. Zarówno w trybie leczenia, jak i profilaktyki środki zazwyczaj podaje się w kilku dawkach do uzyskania wystarczającej odpowiedzi immunologicznej. Zazwyczaj odpowiedź immunologiczną monitoruje się i kolejne dawki podaje się gdy odpowiedź immunologiczna zaczyna zanikać.
Skuteczne dawki środków według wynalazku do leczenia opisanych powyżej stanów różnią się zależnie od wielu różnych czynników, włącznie z sposobem podawania, docelowym miejscem, stanem fizjologicznym pacjenta, czy pacjent jest człowiekiem czy zwierzęciem, innymi przyjmowanymi lekami, oraz od tego czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. Zazwyczaj pacjent jest człowiekiem, ale w niektórych chorobach, takich jak choroba szalonych krów, pacjent może być ssakiem nie będą12
PL 202 698 B1 cym człowiekiem, takim jak bydło. Dawki lecznicze powinno się mianować w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności. Ilość immunogenu zależy od tego, czy również podaje się adiuwant, przy czym przy braku adiuwanta wymagane są wyższe dawki. Ilość immunogenu do podawania czasami wynosi od 1 do 500 μg na pacjenta, a częściej 5 - 500 μg na zastrzyk przy podawaniu ludziom. Czasami stosuje się wyższą dawkę 1 - 2 mg na zastrzyk. Zazwyczaj przy podawaniu ludziom stosuje się 10, 20, 50 lub 100 μg na zastrzyk. Okresy wstrzykiwania mogą się znacząco różnić od jednego raza dziennie do jednego raza na rok, oraz do jednego raza na dekadę. W dowolnym danym dniu, w którym podaje się dawkę immunogenu, dawka jest większa niż 1 μg/pacjenta, a zazwyczaj większa niż 10 μg/ml gdy także podaje się adiuwant oraz większa niż 10 μg/pacjenta, a zazwyczaj 100 μg/pacjenta w przypadku braku adiuwanta. Typowy tryb leczenia obejmuje immunizację, a po niej zastrzyki dawek przypominających z przerwami 6-tygodniowymi. Inny tryb leczenia obejmuje immunizację, a następnie zastrzyki dawek przypominających po 1, 2 i 12 miesiącach. Inny tryb leczenia obejmuje zastrzyki co 2 miesiące przez całe życie. Ponadto zastrzyki przypominające mogą być nieregularne, wykonywane w oparciu o monitorowanie odpowiedzi immunologicznej. Dla biernej immunizacji przeciwciałami dawki wynoszą od 0,0001 do 100 mg/kg, a częściej 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała biorcy. Dawki kwasów nukleinowych kodujących immunogeny wynoszą od 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 μg do 10 mg lub 30300 μg DNA na pacjenta. Dawki dla infekcyjnych wektorów wirusowych wynoszą od 10 - 109 lub więcej wirionów na dawkę.
Środki do wywoływania odpowiedzi immunologicznej można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dootrzewnowo, donosowo lub domięśniowo przy leczeniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. Najczęstszą drogą podawania jest droga podskórna, ale inne mogą być równie skuteczne. Kolejną najczęstszą drogą są zastrzyki domięśniowe. Ten typ zastrzyków najczęściej wykonuje się w mięśnie ręki lub nogi. Także skuteczne w wytwarzaniu odpowiedzi immunologicznej są zastrzyki dożylne, a także zastrzyki śródotrzewnowe, dotętnicze, wewnątrzczaszkowe lub śródskórne. W niektórych sposobach środki wstrzykuje się bezpośrednio do konkretnej tkanki gdzie nagromadziły się złogi.
Ponadto środki według wynalazku można podawać w połączeniu z innymi środkami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby Alzheimera i zespołu Downa, gdzie złogi amyloidowe występują w mózgu, środki według wynalazku można podawać w połączeniu z innymi środkami polepszającymi przenikanie środków według wynalazku przez barierę krew-mózg.
Środki immunogenne według wynalazku, takie jak peptydy, czasami podaje się w połączeniu z adiuwantem. Można stosować wiele różnych adiuwantów w połączeniu z peptydem, takim jak Ap, aby wywołać odpowiedź immunologiczną. Korzystne adiuwanty wzmacniają wewnętrzną odpowiedź na immunogen nie powodując konformacyjnych zmian immunogenu, które wpływałyby na jakościową postać odpowiedzi. Korzystne adiuwanty obejmują ałun, de-O-acylowany monfosforylowany lipid A (MPL) (patrz GB 2220211). QS21 jest glikozydem triterpenu lub saponiną wyizolowaną z kory drzew Quillaja Saponaria Molina rosnącego w Południowej Ameryce (patrz Kensil i inni, w Vaccine Design: The Subunit and Adjuwant Approach (red. Powell i Newman, Plenum Press, NY, 1995); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5057540) . Inne adiuwanty to emulsje olej w wodzie (np. skwalenu lub oleju arachidowego), ewentualnie w połączeniu z immunostymulantami, takimi jak monofosforylowany lipid A (patrz Stoute i inni, N. Engl. Med. 336, 86-91 (1997)). Innym adiuwantem jest CpG (Bioworld Today, 15 listopada 1998 r.). Ponadto Ap może być sprzężony z adiuwantem. Przykładowo lipopeptydową wersję Ap można otrzymać przez sprzęganie kwasu palmitynowego lub innych lipidów bezpośrednio z N-końcem Ap, jak opisano dla szczepionek antygenem zapalenia wątroby typu B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Jednakże takie sprzęganie nie powinno zasadniczo zmienić konformacji Ap tak, że wpłynęłoby to także na Nature odpowiedzi na niego. Adiuwanty można podawać jako składnik środka leczniczego razem ze środkiem czynnym lub osobno, przed podaniem, równocześnie lub po podaniu środka leczniczego.
Korzystną klasą adiuwantów są sole glinu (ałun), takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, siarczan glinu. Takie adiuwanty można stosować z innymi konkretnymi środkami immunostymulującymi albo bez innych konkretnych środków immunostymulujących, takich jak MPL lub 3-DMP, QS21, polimeryczne lub monomeryczne aminokwasy, takie jak polikwas glutaminowy lub polilizyna. Inną klasą adiuwantów są preparaty typu emulsji olej w wodzie. Takie adiuwanty można stosować z innymi konkretnymi środkami immunostymulującymi albo bez innych konkretnych środków immunostymulujących, takich jak peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izogluPL 202 698 B1 tamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetyloglukozaminylo-N-acetylomuramylo-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksypropyloamid (DTP-DPP) teramid™) lub inne składniki ścian komórek bakteryjnych. Emulsje olej w wodzie obejmują (a) MF59 (WO 90/14837), zawierający 5% skwalenu, 0,5% Tween 80 i 0,5% Span 85 (ewentualnie zawierające różne ilości MTP-PE) w postaci submikronowych cząstek utworzonych z użyciem mikrofluidyzatora, takiego jak mikrofluidyzator Model 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, zawierający 10% skwalenu, 0,4% Tween 80, 5% polimeru blokowego Pluronic L121 i thr-MDP, wytworzony w postaci submikronowej emulsji drogą mikrofluidyzacji lub zworteksowane w celu wytworzenia emulsji cząstek o większym rozmiarze oraz (c) układ adiuwantowy Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) zawierający 2% skwalenu, 0,2% Tween 80 i jeden lub większą liczbę składników ścian komórek bakteryjnych z grupy obejmującej monofosforylolipid A (MPL), dimikolinian trehalozy (TDM) i szkielet ściany komórkowej (CWS), korzystnie MPL+CWS (Detox™). Inną klasę korzystnych adiuwantów stanowią adiuwanty saponinowe, takie jak Stimulon™ (qs21, Aquila, Worcester, MA) lub wytworzone z niego cząstki, takie jak ISCOM (kompleksy immunostymulujące) i ISCOMATRIX. Inne adiuwanty obejmują kompletny adiuwant Freunda (CFA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA). Inne adiuwanty obejmują cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik pobudzający tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF).
Adiuwant można podawać z immunogenem w jednym preparacie przed podaniem, równocześnie z podaniem albo po podaniu immunogenu. Immunogen i adiuwant mogą być zapakowane i dostarczane w tej samej fiolce albo mogą być umieszczone w oddzielnych fiolkach i mieszane przed użyciem. Immunogen i adiuwant zazwyczaj pakuje się z etykietką wskazującą zamierzone zastosowanie lecznicze. Jeżeli immunogen i adiuwant są zapakowane osobno, zazwyczaj opakowanie zawiera instrukcje odnośnie mieszania przed użyciem. Wybór adiuwanta i/lub nośnika zależy od trwałości szczepionki zawierającej adiuwant, drogi podawania, harmonogramu dawkowania, skuteczności adiuwanta u szczepionych gatunków oraz u ludzi. Farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest taki, który został dopuszczony lub jest dopuszczalny do podawania ludziom przez stosowne organy ustawodawcze. Na przykład kompletny adiuwant Freunda nie jest odpowiedni do podawania ludziom. Ałun, MPL i QS21 są korzystne. Ewentualnie można równocześnie stosować jeden lub większą liczbę adiuwantów. Korzystne połączenia obejmują ałun z MPL, ałun z QS21, MPL z QS21 oraz ałun, QS21 i MPL razem. Ponadto można stosować niekompletny adiuwant Freunda (Chung i inni, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), ewentualnie w połączeniu z jakimkolwiek składnikiem wybranym spośród ałunu, QS21 i MPL i wszystkich ich kombinacji.
Środki według wynalazku często podaje się jako środki farmaceutyczne zawierające środek leczniczo czynny i różne farmaceutycznie dopuszczalne składniki. Patrz Remington's Pharmaceutical Science (wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Korzystna postać zależy od zamierzonej drogi podawania oraz zastosowania leczniczego. Środki mogą także zawierać, zależnie od wymaganego preparatu, farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, które określa się jako nośniki powszechnie stosowane do formułowania środków farmaceutycznych do podawania ludziom i zwierzętom. Rozcieńczalnik wybiera się tak, żeby nie wpływał na aktywność biologiczną danego środka. Przykładami takich rozcieńczalników są woda destylowana, fizjologiczna sól buforowana fosforanem, płyny Ringera, roztwór dekstrozy oraz płyn Hanka. Ponadto środek farmaceutyczny lub preparat może także zawierać inne nośniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nielecznicze, nieimmunogenne stabilizatory itp. Jednakże niektóre odczynniki odpowiednie do podawania zwierzętom, takie jak kompletny adiuwant Freunda, zazwyczaj nie wchodzą w skład środków dla ludzi.
Środki farmaceutyczne mogą także zawierać duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe i kopolimery (takie jak funkcjonalizowana lateksem sefaroza, agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidów (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Nośniki te mogą ponadto działać jako środki immunostymulujące (to jest adiuwanty).
Do podawania pozajelitowego środki według wynalazku można podawać jako wstrzykiwane dawki roztworów lub zawiesin substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku z farmaceutycznym nośnikiem, którym może być jałowa ciecz, taka jak woda, oleje, roztwór soli, gliceryna lub etanol. Ponadto w preparatach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące, powierzchniowo czynne, substancje buforujące pH itp. Innymi składnikami środków farmaceutycznych są środki pochodzące z ropy naftowej, zwierzęce, roślinne lub syntetyczne, np. olej
PL 202 698 B1 arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Ogólnie glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikol polietylenowy, są korzystnymi ciekłymi nośnikami, szczególnie do roztworów do wstrzykiwania.
Zazwyczaj środki wytwarza się jako preparaty do wstrzykiwania, jako płynne roztwory lub zawiesiny; można także wytwarzać stałe postacie odpowiednie do rozpuszczania lub dyspergowania w ciekłych nośnikach przed iniekcją. Preparat może także być zemulgowany lub kapsułkowany w liposomach lub mikrocząstkach, takich jak polilaktyd, poliglikolid lub kopolimer, w celu wzmocnienia działania adiuwanta, co opisano powyżej (patrz Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Środki według wynalazku można także podawać jako zastrzyki typu depot lub preparaty w postaci wszczepów, które można wytwarzać w taki sposób, aby umożliwić przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie składnika czynnego.
Dodatkowe preparaty odpowiednie do innych sposobów podawania obejmują preparaty doustne, donosowe i dopłucne, czopki i preparaty przezskórne.
W przypadku czopków, substancje wiążące i nośniki obejmują np. glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki można wytwarzać z mieszanin zawierających składnik czynny w ilości od 0,5% do 10%, korzystnie 1%-2%. Doustne preparaty zawierają zaróbki, takie jak mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celulozę i węglan magnezu jakości farmaceutycznej. Środki te mają postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10%-95% składnika czynnego, korzystnie 25%-70%.
Podawanie miejscowe można osiągnąć drogą przezskórną lub śródskórną. Podawaniu miejscowemu może sprzyjać równoczesne podawanie środka z toksyną cholery lub jej detoksykowanymi pochodnymi lub podjednostkami, albo z podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i inni, Nature 391, 851 (1998)). Równoczesne podawanie można osiągnąć stosując składniki w postaci mieszaniny lub połączone cząsteczki uzyskane przez chemiczne sieciowanie lub ekspresję białka fuzyjnego.
Alternatywnie dostarczanie przezskórne można osiągnąć stosując plastry na skórę lub transferosomy (Paul i inni, Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i inni, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).
Możliwe jest wykrywanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowi Ae u pacjenta cierpiącego na lub podatnego na chorobę Alzheimera. Sposoby takie są szczególnie przydatne do monitorowania przebiegu leczenia stosowanego u pacjenta. Sposoby można stosować do monitorowania zarówno leczenia terapeutycznego u pacjentów, u których wystąpiły objawy, jak i leczenia profilaktycznego u pacjentów, u których nie wystąpiły objawy.
Możliwe jest ustalanie wartości podstawowej odpowiedzi immunologicznej u pacjenta przed podaniem dawki środka i porównanie jej z wartością odpowiedzi immunologicznej po leczeniu. Znaczący wzrost (to jest większy niż typowy margines błędu doświadczalnego w powtarzanych pomiarach tej samej próbki, wyrażony jako jedno odchylenie standardowe od średniej z tych pomiarów) wartości odpowiedzi immunologicznej sygnalizuje pozytywny wynik leczenia (to jest, że podanie środka wywołało lub wzmocniło odpowiedź immunologiczną). Jeżeli wartość odpowiedzi immunologicznej nie zmienia się znacząco lub obniża się, wskazuje to na negatywny wynik leczenia. Ogólnie u pacjentów w początkowym okresie leczenia środkiem oczekuje się wzrostu odpowiedzi immunologicznej po kolejno następujących dawkach, która ewentualnie może osiągnąć plateau. Ogólnie podawanie środka kontynuuje się gdy odpowiedź immunologiczna wzrasta. Osiągnięcie plateau wskazuje, że leczenia można dalej nie kontynuować lub zmniejszyć dawkę albo częstość jej podawania.
Możliwe jest też ustalenie kontrolnej wartości (to jest średniej z odchyleniem standardowym) odpowiedzi immunologicznej dla populacji kontrolnej. Zazwyczaj osoby w populacji kontrolnej nie były wcześniej poddawane leczeniu. Wartości odpowiedzi immunologicznej zmierzone u pacjenta po podaniu środka leczniczego porównuje się z wartością kontrolną. Znaczący wzrost w porównaniu z wartością kontrolną (to jest większy niż jedno odchylenie standardowe od średniej z tych pomiarów) sygnalizuje pozytywny wynik leczenia. Brak znaczącego wzrostu lub obniżenie sygnalizuje negatywny wynik leczenia. Ogólnie podawanie środka kontynuuje się do czasu gdy odpowiedź immunologiczna zacznie wzrastać w odniesieniu do wartości kontrolnej. Tak jak poprzednio, osiągnięcie plateau w odniesieniu do wartości kontrolnych wskazuje, że leczenia można dalej nie kontynuować lub zmniejszyć dawkę albo częstość jej podawania.
Wartość kontrolną odpowiedzi immunologicznej (np. średnią i odchylenie standardowe) można też ustalać z kontrolnej populacji osobników, którzy przeszli leczenie środkiem leczniczym i których odpowiedzi immunologiczne osiągnęły plateau w odpowiedzi na leczenie. Wartości odpowiedzi immunologicznej zmierzone u pacjenta porównuje się z wartością kontrolną. Jeżeli zmierzony u pacjenta
PL 202 698 B1 poziom nie różni się znacząco (np. więcej niż jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej leczenia można dalej nie kontynuować. Jeżeli poziom u pacjenta jest znacząco niższy od wartości kontrolnej, wskazane jest dalsze podawanie środka. Jeżeli poziom u pacjenta utrzymuje się poniżej wartości kontrolnej wskazana może być zmiana trybu leczenia, np. zastosowanie innego adiuwanta.
Pacjenta, który obecnie nie jest leczony, ale który przeszedł okres leczenia, można też monitorować pod względem odpowiedzi immunologicznej w celu określenia, czy wymagane jest wznowienie leczenia. Wartość odpowiedzi immunologicznej zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością odpowiedzi immunologicznej wcześniej osiągniętej u pacjenta podczas okresu leczenia. Znaczące obniżenie w porównaniu z poprzednimi pomiarami (to jest większe niż typowy margines błędu w powtórzonych pomiarach tej samej próbki) wskazuje, że leczenie należy wznowić. Ponadto wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną (średnia plus odchylenie standardowe) oznaczoną dla populacji pacjentów po przejściu okresu leczenia. Ponadto wartości zmierzone u pacjenta można porównać z wartością kontrolną populacji pacjentów leczonych profilaktycznie, u których nie wystąpiły objawy choroby lub leczonych terapeutycznie, u których wystąpiła poprawa cech charakterystycznych choroby. We wszystkich tych przypadkach znaczące obniżenie w odniesieniu do poziomów kontrolnych (to jest większe niż odchylenie standardowe) wskazuje, że leczenie pacjenta powinno być wznowione.
Tkanką pobieraną od pacjenta do analizy jest zazwyczaj krew, osocze, surowica, śluz lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Próbkę analizuje się pod względem wskaźników odpowiedzi immunologicznej na jakąkolwiek postać peptydu Ap, zazwyczaj Ap42. Odpowiedź immunologiczną można określić na podstawie obecności, np. przeciwciał lub komórek T, które specyficznie wiążą peptyd Ap. Metody ELISA stosowane do wykrywania przeciwciał specyficznie wiążących peptyd Ap opisano w części z przykładami. Sposoby wykrywania reaktywnych komórek T opisano powyżej (patrz Definicje).
Można sporządzać zestawy diagnostyczne do realizacji metod diagnostycznych opisanych powyżej. Zazwyczaj takie zestawy zawierają środek specyficznie wiążący przeciwciała przeciw Ap lub reagujący z komórkami T specyficznymi dla Ap. Zestaw może także zawierać znacznik. Do wykrywania przeciwciał przeciw Ap znacznik jest zazwyczaj w postaci znakowanych przeciwciał przeciwidiotypowych. Do wykrywania przeciwciał można dostarczyć środek wcześniej związany z fazą stałą, taką jak studzienki na płytce do mikromianowania. Do wykrywania reaktywnych komórek T znacznik można dostarczyć jako 3H-tymidynę w celu zmierzenia odpowiedzi proliferacyjnej. Zestawy także zazwyczaj zawierają etykiety z wskazówkami jak zastosować zestaw. Etykieta może także zawierać wykres lub inną formę korelującą poziomy zmierzonego znacznika z przeciwciałami przeciw Ap lub komórek T reaktywnych z Ap. Określenie etykieta odnosi się do jakiegokolwiek pisanego lub nagranego materiału dołączonego do zestawu lub w inny sposób towarzyszącego zestawowi, w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzedaży i stosowania. Na przykład określenie etykieta obejmuje ulotki reklamujące oraz broszury, materiały opakowaniowe, instrukcje, kasety audio i wideo, dyskietki komputerowe, a także napisy wydrukowane bezpośrednio na zestawach, towarzyszącego zestawowi, w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzedaży i stosowania. Na przykład określenie etykieta obejmuje ulotki reklamujące oraz broszury, materiały opakowaniowe, instrukcje, kasety audio i wideo, dyskietki komputerowe, a także napisy wydrukowane bezpośrednio na zestawach.
P r z y k ł a d y
I. Skuteczność profilaktyczna Ap przeciw AD
W przykładach tych opisano podawanie peptydu Ap42 myszom transgenicznym nadeksprymujacym APP z mutacją w pozycji 717 (APP717V^F) predysponującą je do rozwoju neuropatologii typu Alzheimera. Wytwarzanie i charakterystykę tych myszy (myszy PDAPP) opisano w Games i inni, Nature, supra. U zwierząt tych, w postaci heterozygot, zaczyna odkładać się Ap poczynając od wieku 6 miesięcy. W wieku 15 miesięcy wykazują one poziomy złogów Ap porównywalne z obserwowanymi w chorobie Alzheimera. Myszom PDAPP wstrzyknięto zagregowany Ap42 (zagregowany Ap42) lub sól buforowaną fosforanem. Zagregowany Ap42 wybrano ze względu na jego zdolność indukowania przeciwciał na wielokrotne epitopy Ap.
A. Metody
1. Źródło myszy
Trzydzieści heterogenicznych samic myszy PDAPP losowo podzielono na następujące grupy: 10 myszy, którym wstrzykiwano zagregowany Ap42 (jedna zdechła w transporcie), 5 myszy, którym
PL 202 698 B1 wstrzykiwano PBS/adiuwant lub PBS oraz 10 myszy kontrolnych, którym nie podawano zastrzyków. Pięciu myszom wstrzyknięto osoczowe białko amyloidu (SAP).
2. Przygotowanie immunogenów
Przygotowanie zagregowanego Ae42: 2 mg Ae42 (US Peptides Inc, partia K-42-12) rozpuszczono w 0,9 ml wody i doprowadzono do 1 ml przez dodanie 0,1 ml 10xPBS. Następnie mieszaninę zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C w warunkach, w których peptyd ulega agregacji. Jakikolwiek nie używany Ae przechowywano w postaci suchego liofilizowanego proszku w -20°C do czasu następnego zastrzyku.
3. Przygotowanie zastrzyków
100 μg zagregowanego Ae42 w PBS na mysz zemulgowano w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl emulsji do pierwszej immunizacji, a następnie podano przypominającą dawkę tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) po 2 tygodniach. Dwie dodatkowe dawki w IFA podano z przerwami miesięcznymi. Kolejne immunizację wykonywano z miesięcznymi przerwami w 500 μl PBS. Zastrzyki wykonywano śródotrzewnowo (i.p.).
Zastrzyki PBS podawano w takim samym porządku i myszom wstrzyknięto mieszaninę 1:1 PBS/adiuwant w objętości 400 μl na mysz lub 500 μl PBS na mysz. Zastrzyki z SAP podobnie podawano w tym samym porządku stosując dawki 100 μq na zastrzyk.
4. Mianowanie krwi mysiej, preparowanie tkanek i immunohistochemia
Powyższe metody opisano poniżej w Ogólnych Materiałach i Metodach.
B. Wyniki
Myszom PDAPP podano zagregowany Ae42 (zagregowany Ae42), peptydy SAP lub sól buforowaną fosforanem. Jedną grupę myszy traktowano jako kontrolę pozytywną i nie podawano im zastrzyków. Miana z myszy z grupy zagregowanego Ae42 monitorowano każdego miesiąca od czwartej dawki przypominającej aż myszy osiągnęły rok. Myszy uśmiercono w wieku 13 miesięcy. We wszystkich badanych punktach czasowych 8 z 9 myszy z grupy zagregowanego Ae42 rozwinęło wysokie miano przeciwciał, które pozostało wysokie przez serię zastrzyków (miana wyższe niż 1/10000). Dziewiąta mysz miała niskie, ale mierzalne miano około 1/1000 (fig. 1, tabela 1). Myszy, którym wstrzyknięto SAPP miały miana 1:1000 do 1:30000 wobec tego immunogenu, przy czym tylko u jednej myszy miano przekraczało 1:100000.
U myszy, którym podawano PBS zmierzono miana przeciw zagregowanemu Ae42 w wieku 6, 10 i 12 miesięcy. Miana przeciw zagregowanemu Ae42 myszy PBS w rozcieńczeniach 1/100 przekroczyły tylko 4-krotnie wartość podstawową w jednym punkcie danych, a w pozostałych punktach danych wynosiły mniej niż 4-krotna wartość podstawowa (tabela 1). Odpowiedź specyficzna dla SAP była nieistotna dla tych punktów czasowych i wszystkie miana były mniejsze niż 300.
Siedem z dziewięciu myszy z grupy zagregowanego Ae1-42 nie miało wykrywalnego amyloidu w mózgach. Natomiast tkanka mózgowa z myszy w grupach SAP i PBS zawierała wiele 3D6dodatnich złogów amyloidowych w hipokampie, a także korach czołowej i obręczowej. Wzór utworzonych złogów był podobny jak u nieleczonych myszy kontrolnych, z charakterystycznym występowaniem wrażliwych na uszkodzenie podregionów, takich jak zewnętrzna cząsteczkowa warstwa hipokampowego zakrętu zębatego. Jedna z myszy z grupy, której podawano Ae1-42 miała znacznie zmniejszone obciążenie amyloidem, graniczącym z hipokampem. Zidentyfikowano odizolowaną płytkę u innej myszy leczonej Ae1-42.
Ilościowa analiza obrazu dla obciążenia amyloidem hipokampu wykazała znaczne zmniejszenie osiągnięte u zwierząt leczonych AN1792 (fig. 2). Wartości mediany obciążenia amyloidem dla grupy PBS (2,22%) i dla nieleczonej grupy kontrolnej (2,65%) były znacznie większe niż dla myszy immunizowanych AN1792 (0,00%, p=0,0005). Natomiast wartość mediany dla grupy immunizowanej peptydami SAP (SAPP) wynosiła 5,74%. Tkanka mózgowa nie leczonych myszy kontrolnych zawierała liczne złogi Ae, ujawnione za pomocą specyficznych dla Ae przeciwciał monoklonalnych (mAb) 3D6, w hipokampie, a także w korze poza-modzelowatej. Podobny wzór złogów amyloidowych obserwowano także u myszy immunizowanych SAPP lub PBS (fig. 2). Ponadto we wszystkich trzech ostatnich grupach obserwowano znaczący udział wrażliwych na uszkodzenie podregionów mózgu klasycznie obserwowanych w AD, takich jak zewnętrzna cząsteczkowa warstwa hipokampowego zakrętu zębatego.
Mózgi, które nie zawierały złogów Ae, były także pozbawione płytek neurytycznych zazwyczaj widocznych u myszy PDAPP z ludzkim przeciwciałem przeciw APP 8E5. Wszystkie mózgi z pozostałych grup (którym wstrzykiwano SAP, PBS lub którym nie podawano zastrzyków) zawierały wiele płyPL 202 698 B1 tek neurytycznych typowych dla nieleczonych myszy PDAPP. Niewielka liczba płytek neurytycznych była obecna u jednej z myszy leczonych AN1792 oraz pojedyncze skupisko dystroficznych neurytów znaleziono u drugiej myszy leczonej AN1792. Analiza obrazu dla hipokampu, przedstawiona na fig. 3, wykazała faktyczną eliminację dystroficznych neurytów u myszy leczonych AN1792 (mediana 0,00%) w porównaniu z biorcami PBS (mediana 0,28%, p=0,0005).
Astrocytoza charakterystyczna dla towarzyszącego płytkom zapalenia także nie występowała w mózgach grupy, której podawano Ae1-42. Mózgi myszy z innych grup zawierały znaczną ilość zgrupowanych GFAP-dodatnich astrocytów typowych dla związanej z płytkami Ae glejozy. Część z reagujących z GFAP preparatów histologicznych wybarwiono przeciwnie Tioflawiną S w celu zlokalizowania złogów Ae. GFAP-dodatnie astrocyty były związane z płytkami Ae u myszy SAP, PBS oraz nieleczonych kontrolnych. Nie stwierdzono takiego związku u płytko-ujemnych myszy leczonych Ae1-42, podczas gdy minimalną glejozę związaną z płytkami obserwowano u jednej z myszy leczonych AN1792.
Analiza obrazu, przedstawiona na fig. 4 dla kory poza-modzelowatej, potwierdziła, że zmniejszenie astrocytozy było znaczące, z wartością mediany 1,56% dla myszy leczonych AN1792 wobec wartości mediany większych niż 6% dla grup immunizowanych peptydami SAP, PBS lub nieleczonymi (p=0,0017).
Dane z podzestawu myszy Ae1-42 i PBS wykazały brak związanej z płytkami MHC II immunoreaktywności u myszy Ae1-42, co zgadzało się z brakiem związanej z Ae odpowiedzi zapalnej.
Fragmenty mózgów myszy także poddano działaniu mAe specyficznych dla MAC-1, komórkowego białka powierzchniowego. MAC-1 (CD11b) jest członkiem rodziny integryn i występuje w postaci heterodimeru z CD18. Kompleks CD11b/CD18 występuje na monocytach, makrofagach, neutrofilach i komórkach NK (Mak i Simard). Komórka typu MAC-1-reaktywnego występująca w mózgu jest najprawdopodobniej mikroglejem, w oparciu o podobną morfologię fenotypową w MAC-1 immunoreaktywnych fragmentach. Związane z płytkami znakowanie MAC-1 było niższe w mózgach myszy leczonych AN1792 w porównaniu z kontrolną grupą PBS, przy czym obserwacja ta zgadzała się z brakiem związanej z Ae odpowiedzi zapalnej.
C. Wnioski
Brak płytek Ae i reaktywnych neuronalnych i glejowych zmian w mózgach myszy, którym podano Ae1-42 wskazują, że w ich mózgach amyloid nie odkładał się lub odkładała się jego minimalna ilość oraz, że nie wystąpiły konsekwencje patologiczne, takie jak glejoza i patologia neurytów. Myszy PDAPP leczone Ae1-42 wykazały zasadniczo taki sam brak patologii, co kontrolne myszy nietransgeniczne. Tak więc zastrzyki z Ae1-42 są bardzo skuteczne w zapobieganiu złogom lub w oczyszczeniu tkanki mózgowej z ludzkiej formy Ae oraz w eliminacji następujących później neuronalnych lub zapalnych zmian degeneracyjnych. Zatem podawanie peptydu Ae przynosi lecznicze korzyści w zapobieganiu AD.
II. Badania odpowiedzi na dawkę
Grupy 5-tygodniowych samic myszy Swiss Webster (N=6 na grupę) immunizowano dootrzewnowo 300, 100, 33, 3,7, 1,2, 0,4 lub 0,13 μg Ae przygotowanymi w CFA/IFA. Podano 3 dawki z dwutygodniowymi przerwami, a następnie czwartą dawkę miesiąc później. Pierwszą dawkę zemulgowano z CFA, a pozostałe dawki zemulgowano z IFA. Od zwierząt pobierano krew do pomiaru miana w 4-7 dni po każdej z immunizacji zaczynając po drugiej dawce. Od zwierząt z zestawu trzech grup, immunizowanych 11, 33 lub 300 μg antygenu, dodatkowo pobierano krew z około miesięcznymi przerwami przez 4 miesiące po czwartej immunizacji w celu monitorowania zaniku odpowiedzi przeciwciał w różnym zakresie dawek szczepionki. Zwierzętom tym wykonano piątą dodatkową immunizację w 7 miesięcy po rozpoczęciu badania. Zwierzęta uśmiercono tydzień później celem zmierzenia odpowiedzi przeciwciał na AN1792 i przeprowadzenia analizy toksykologicznej .
Przy dawkach od 300 do 3,7 μg obserwowano obniżającą się odpowiedź na dawkę, a przy dwóch niższych dawkach nie obserwowano odpowiedzi. Średnie wartości miana przeciwciał wynosiły około 1:1000 po trzech dawkach i około 1:10000 po czterech dawkach 11-300 μg antygenu (patrz fig. 5).
Miana przeciwciał znacznie wzrastały po trzeciej immunizacji dla wszystkich grup, z wyjątkiem grupy najniższej dawki, ze wzrostem GMT w zakresie od 5 do 25 razy. Niskie odpowiedzi przeciwciał wykryto wtedy nawet u biorców dawek 0,4 5 μg. Grupy 1,2 i 3,7 μg miały porównywalne miana z GMT około 1000, a cztery najwyższe dawki zgrupowały się razem z GMT około 25000, z wyjątkiem grupy dawki 33 μg z niższą GMT wynoszącą 3000. Po czwartej immunizacji wzrost miana był bardziej umiarkowany dla wszystkich grup. Zaobserwowano wyraźną odpowiedź na dawkę w grupach niższych dawek antygenu od 0,14 μg do 11 μg, wynoszącą od nie wykrywalnych przeciwciał dla biorców 0,14 μg
PL 202 698 B1 do GMT 36000 dla biorców 11 μg. Ponownie miana czterech najwyższych grup od 11 do 300 μg zgrupowały się razem. Zatem przez dwie kolejne immunizacje miano przeciwciał zależało od dawki antygenu w szerokim zakresie od 0,4 do 300 μg. Po trzeciej immunizacji miana z grup najwyższych czterech dawek były porównywalne i pozostały jako plateau po dodatkowej immunizacji.
Miesiąc po czwartej immunizacji miana były 2- do 3- krotnie wyższe w grupie 300 μg niż miana zmierzone w krwi pobranej 5 dni po immunizacji (fig. 6). Obserwacja ta sugeruje, że szczytowa anamnestyczna odpowiedź przeciwciał wystąpiła później niż 5 dni po immunizacji. Mniejszy (50%) wzrost obserwowano w tym czasie dla grupy 33 μg. W grupie dawki 300 μg po dwóch miesiącach od ostatniej dawki GMT obniżyła się stopniowo o około 70%. Po kolejnym miesiącu miano przeciwciał spadało mniej gwałtowne, o 45% (100 μg) i około 14% dla 33 i 11 μg dawek. Zatem szybkość obniżania miana przeciwciał w krążeniu po zaprzestaniu immunizacji jest dwufazowy z gwałtownym spadkiem w pierwszym miesiącu po szczytowej odpowiedzi, po którym następuje łagodniejszy spadek.
Miana przeciwciał i kinetyka odpowiedzi tych myszy Swiss Webster była podobna jak u młodych, heterozygotycznych, transgenicznych myszy PDAPP, immunizowanych w podobny sposób. Dawki skuteczne w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej u ludzi są zazwyczaj podobne do dawek skutecznych u myszy.
III. Poszukiwanie środków skutecznych leczniczo przeciw występującej AD
Test ten zaprojektowano w celu przebadania środków immunogennych pod względem aktywności w zatrzymywaniu lub odwracaniu charakterystyki neuropatologicznej AD u starych myszy. Immunizacje Ae o długości 42 aminokwasów (AN1792) zaczęto w punkcie czasowym w którym płytki amyloidowe były już obecne w mózgach myszy PDAPP.
Z upływem czasu w badaniu u nie leczonych myszy PDAPP rozwinęło się wiele zmian neurodegeneracyjnych przypominających występujące w AD (Games i inni, supra, oraz Johnson-Wood i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Odkładanie Ae w płytkach amyloidowych jest związane z degeneracyjną odpowiedzią neuronalną, obejmującą niewłaściwe elementy aksonalne i dendrytyczne, nazywane dystroficznymi neurytami. Złogi amyloidowe otoczone przez i zawierające dystroficzne neuryty nazywane są płytkami neurytycznymi. Zarówno u myszy AD, jak i u myszy PDAPP, neuryty dystroficzne mają wyróżniające się struktury globularne, są immunoreaktywne z zespołem przeciwciał rozpoznających APP i składniki cytoszkieletu i wykazują złożone, wewnątrzkomórkowe zmiany degeneracyjne na poziomie ultrastrukturalnym. Charakterystyki te pozwalają na istotne dla choroby, wybiórcze i powtarzalne pomiary tworzenia płytek neurytycznych w mózgach PDAPP. Dystroficzny składnik neuronalny płytek neurytycznych PDAPP łatwo jest uwidocznić przy pomocy przeciwciał specyficznych dla ludzkiego APP (mAe 8E5) i łatwo jest go zmierzyć przy pomocy komputerowo wspomaganej analizy obrazu. Zatem dodatkowo poza pomiarem działania AN1792 na tworzenie płytek amyloidowych monitorowano wpływ tego leczenia na rozwój dystrofii neurytycznej.
Astrocyty i mikroglej stanowią nieneuronalne komórki odpowiadające na i odzwierciedlające stopień uszkodzenia neuronalnego. W AD często obserwuje się astrocyty GFAP-dodatnie i MHC II-dodatni mikroglej, a ich aktywacja zwiększa się z ostrością choroby. Zatem monitorowano także rozwój reaktywnych astrocytów i mikroglejozy u myszy leczonych AN1792.
A. Materiały i metody
Czterdzieści osiem heterozygotycznych samic myszy PDAPP w wieku 11 do 11,5 miesięcy, otrzymanych z Charles River, losowo podzielono na dwie grupy: 24 myszy immunizowano 100 μq AN1792, a 24 immunizowano PBS, w każdym przypadku w połączeniu z adiuwantem Freunda. Grupy AN1792 i PBS powtórnie podzielono w wieku około 15 miesięcy. W wieku 15 miesięcy zwierzęta z około połowy z każdej z grup AN1792 i PBS uśmiercono (odpowiednio n=10 i 9), a pozostałe nadal otrzymywały immunizację aż do końca w wieku około 18 miesięcy (odpowiednio n=9 i 12). W czasie badań zdechło 8 zwierząt (5 AN1792, 3 PBS). Ponadto, poza immunizowanymi zwierzętami, do doświadczenia włączono nieleczone myszy PDAPP jednoroczne (n=10), 15-miesięczne (n=10) i 18miesięczne (n=10) dla porównania w testach ELISA pomiarów poziomu ae i APP w mózgach; dodatkowo zwierzęta jednoroczne włączono do analizy immunohistochemicznej.
Metodologia była taka jak w przykładzie 1, z wyjątkiem przypadków, gdy wskazano inaczej. Do przygotowania antygenu do 6 immunizacji, podawanych przed 15 miesiącem, zastosowano AN1792 z US Peptides seria 12 i California Peptides seria ME0339. Do 3 dodatkowych immunizacji podawanych pomiędzy 15 a 18 miesiącem zastosowano California Peptides serie ME0339 i ME0439.
Do immunizacji zemulgowano 100 μg AN1792 w 200 μl PBS, lub samej PBS, w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) lub niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA) lub PBS
PL 202 698 B1 w końcowej objętości 400 gl. Pierwszą immunizację wykonano z CFA jako adiuwantem, następne 4 dawki podano z IFA, a końcowe 4 dawki z samą PBS bez dodatku adiuwanta. Łącznie wykonano 9 immunizacji w okresie 7 miesięcy z dwutygodniowymi przerwami dla pierwszych 3 dawek, a następnie z czterotygodniowymi przerwami dla pozostałych dawek. Grupie leczonej przez 4 miesiące, uśmierconej w wieku 15 miesięcy, wykonano tylko pierwszych 6 immunizacji.
B. Wyniki
Wpływ leczenia AN1792 na obciążenie amyloidem
Wyniki leczenia AN1792 na obciążenie kory amyloidem oznaczone metodą ilościowej analizy obrazu, przedstawiono na fig. 7. Wartość mediany dla obciążenia amyloidem kory wynosiła 0,28% w grupie nieleczonych 12-miesięcznych myszy PDAPP, która to wartość odpowiadała obciążeniu płytkami u myszy na początku badania. W wieku 18 miesięcy obciążenie amyloidem wzrosło ponad 17-krotnie do 4,87% w myszach leczonych PBS, podczas gdy myszy leczone AN1792 miały znacznie obniżone obciążenie amyloidem wynoszące 0,01%, znacząco mniej niż 12-miesięczne nieleczone myszy i grupy 15- i 18-miesięczne leczone PBS. Obciążenie amyloidem było znacznie obniżone u biorców AN1792 zarówno w 15 (96% zmniejszenia, p=0,003) i 18 (>99% zmniejszenia, p=0,0002) miesiącu.
Zazwyczaj złogi amyloidowe w korze myszy PDAPP zaczynały się w korze czołowej i pozamodzelowatej (RSC), postępowały w kierunku brzuszno-bocznym i obejmowały korę skroniową i węchową (EC). Znaleziono niewiele lub wcale nie znaleziono amyloidu znaleziono w EC myszy 12-miesięcznych, tj. w wieku około którego podano pierwszą dawkę AN1792. Po 4 miesiącach leczenia AN1792 złogi amyloidowe znacznie zmalały w RSC, a postępujący udział EC został całkowicie wyeliminowany przez leczenie AN1792. Ostatnia obserwacja pokazała, że AN1792 całkowicie zatrzymał postępowanie amyloidu, który normalnie zaatakowałby korę skroniową i węchową, a także zatrzymał i ewentualnie cofnoł odkłanianie w RSC.
Znaczące działanie leczenia AN1792 na rozwój obciążenia kory amyloidem u myszy PDAPP pokazano dla grupy 18-miesięcznej, którą leczono przez 7 miesięcy. Stwierdzono prawie całkowity brak amyloidu w korze u myszy leczonych AN1792, z całkowitym brakiem rozproszonych płytek, a także zmniejszeniem litych złogów.
2. Zmiany komórkowe i morfologiczne towarzyszące leczeniu AN1792.
Populację komórek Ap-dodatnich znaleziono w regionach mózgu zazwyczaj zawierających złogi amyloidowe. Znaczące było to, że w kilku mózgach biorców AN1792 znaleziono bardzo niewiele korowych płytek amyloidowych lub nie znaleziono ich wcale. Większość immunoreaktywności Ap okazała się być związana z komórkami o dużym, płatkowym lub pozlepianym ciele. Fenotypowo komórki te przypominały aktywowany mikroglej lub monocyty. Były one immunoreaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi ligandy eksprymowane przez aktywowane monocyty i mikroglej (MHC II i CD11b), a czasami były związane ze ścianą lub światłem naczyń krwionośnych. Porównanie blisko sąsiadujących fragmentów znakowanych przeciwciałami specyficznymi dla Ap i MHC II ujawniło, że podobne wzory tych komórek były rozpoznawane przez obydwie klasy przeciwciał. Szczegółowe badanie mózgów myszy leczonych AN1792 ujawniło, że MHC II-dodatnie komórki były ograniczone do sąsiedztwa ograniczonego amyloidu pozostającego u tych zwierząt. W zastosowanych warunkach utrwalania komórki nie były immunoreaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi ligandy komórek T (CD3, CD3e) lub B (CD45RA, CD45RB) lub zwykły antygen leukocytowy (CD45), ale były reaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi leukosialinę (CD43), która reaguje krzyżowo z monocytami. Nie znaleziono takich komórek u żadnej z myszy leczonych PBS.
U myszy PDAPP niezmiennie rozwijały się ciężkie złogi amyloidowe w zewnętrznej warstwie cząsteczkowej hipokampowego zakrętu zębatego. Złogi tworzyły wyraźną smugę w obrębie ścieżki perforacji, regionu zazwyczaj zawierającego płytki amyloidowe w AD. Charakterystyczne występowanie tych złogów u myszy leczonych PBS przypominało wcześniej scharakteryzowane u nieleczonych myszy PDAPP. Złogi amyloidowe składały się z zarówno rozproszonych, jak i z litych płytek w ciągłym paśmie. Natomiast w wielu mózgach myszy leczonych AN1792 wzór ten był znacznie zmieniony. Złogi amyloidowe w hipokampie nie zawierały rozproszonego amyloidu i wzór pasmowy był częściowo zniszczony. Zamiast tego występowało wiele niezwykłych struktur nakrapianych, reagujących z przeciwciałami przeciw-Ap, z których kilka okazało się komórkami zawierającymi amyloid.
Komórki MHC II-dodatnie często obserwowano w sąsiedztwie amyloidu zewnątrzkomórkowego u zwierząt leczonych AN1792. Wzór związania komórek Ap-dodatnich z amyloidem był bardzo podobny w kilku mózgach myszy leczonych AN1792. Rozmieszczenie tych komórek monocytów było ogra20
PL 202 698 B1 niczone do sąsiedztwa złogów amyloidowych i było całkowicie nieobecne w innych regionach mózgu pozbawionych płytek Ap.
Ilościowa analiza obrazu fragmentów znakowanych MHC II i MAC I wykazała tendencję w kierunku zwiększonej reaktywności w RSC i hipokampie u myszy leczonych AN1792, w porównaniu z grupą PBS, która osiągnęła wartość znaczącą dla pomiarów reaktywności MAC 1 w hipokampie.
Wyniki te wskazują na aktywne, kierowane przez komórki, usuwanie amyloidu w regionach mózgu w których występują płytki.
3. Działanie AN1792 na poziomy Ap: oznaczenia ELISA.
(a) Poziomy korowe
U nieleczonych myszy PDAPP poziom mediany całkowitego Ap w korze w wieku 12 miesięcy wynosiła 1600 ng/g, w wieku 15 miesięcy wzrosła do 8700 ng/g (tabela 2). W wieku 18 miesięcy wartość wynosiła 22000 ng/g, co oznacza, że wzrosła ponad 10-krotnie podczas doświadczenia. Zwierzęta leczonych PBS miały 8600 ng/g całkowitego Ap w wieku 15 miesięcy, która to wartość wzrosła do 19000 ng/g w 18 miesiącu. W porównaniu z tym, zwierzęta leczone AN1792 miały 81% mniej całkowitego Ap w wieku 15 miesięcy (1600 ng/g) niż grupa immunizowana PBS. Znacząco mniej (0=0,0001) całkowitego Ap (5200 ng/g) znaleziono w 18 miesiącu porównując grupy AN1792 i PBS (tabela 2), co odpowiadało 72% zmniejszeniu ilości Ap, który by normalnie występował. Podobne wyniki uzyskano porównując korowe poziomy Ap42, gdyż stwierdzono, że grupa leczona AN1792 zawierała znacznie mniej Ap42, ale w tym wypadku różnice pomiędzy grupami AN1792 i PBS były znaczące zarówno w 15 (p=0,04), jak i 18 miesiącu (p=0,0001, tabela 2).
T a b e l a 2: Poziomy mediany Ap (ng/g) w korze
Nieleczone PBS AN1792
Wiek Całkowity Ap AP42 (n) Całkowity Ap Ap42 (n) Całkowity Ap Ap42 (n)
12 1600 1300 (10)
15 8700 8300 (10) 8600 7200 (9) 1600 1300* (10)
18 22200 18500 (10) 19000 15900 (12) 5200** 4000** (9)
*p=0,0412 **p=0,0001 (b) Poziomy w hipokampie
U nieleczonych myszy PDAPP poziomy mediany w hipokampie całkowitego Ap w wieku 12 miesięcy wynosiły 15000 ng/g, która to wartość wzrosła do 51000 ng/g w wieku 15 miesięcy i dalej wzrastała osiągając 81000 ng/g w wieku 18 miesięcy (tabela 3). Podobnie myszy immunizowane PBS miały 40000 ng/g i 65000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesięcy. U zwierząt leczonych AN1792 stwierdzono mniejszą całkowitą ilość Ap, to znaczy 25000 ng/g i 51000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesięcy. Wartość dla grupy leczonej AN1792 w wieku 18 miesięcy była znacząco niższa niż dla grupy leczonej PBS (p=0,0105; tabela 3). Pomiary Ap42 dały ten sam układ wyników, to znaczy poziomy u grupy leczonej AN1792 były znacząco niższe niż u grupy leczonej PBS (odpowiednio 39000 ng/g wobec 57000 ng/g; p=0,0022) w wieku 18 miesięcy (tabela 3).
T a b e l a 3: Poziomy mediany Ap (ng/g) w hipokampie
Nieleczone PBS AN1792
Wiek Całkowity Ap Ap42 (n) Całkowity Ap Ap42 (n) Całkowity Ap Ap42 (n)
12 15500 11100 (10)
15 51500 44400 (10) 40100 35700 (9) 24500 22100 (10)
18 80800 64200 (10) 65400 57100 (12) 50900* 38900** (9)
*p=0,0105 **p=0, 0022 (c) Poziomy w móżdżku
U 12 miesięcznych nieleczonych myszy PDAPP mediana poziomu całkowitego Ap wynosiła 15 ng/g (tabela 4). W wieku 15 miesięcy mediana ta wzrosła do 28 ng/g, a w wieku 18 miesięcy do 35 ng/g. U zwierząt leczonych PBS wartość mediany całkowitego Ap wynosiły 21 ng/g w wieku 15 miesięcy i 43 ng/g w wieku 18 miesięcy. U zwierząt leczonych AN1792 znaleziono 22 ng/g całkowiPL 202 698 B1 tego Ae w wieku 15 miesięcy i znacząco mniej (p=0,002) całkowitego Ae w wieku 18 miesięcy (25 ng/g), niż w odpowiadającej im grupie PBS (tabela 4).
T a b e l a 4: Średnie poziomy Ae (ng/g) w móżdżku
Nieleczone PBS AN1792
Wiek (miesiące) Całkowity Λβ (n) Całkowity Ae (n) Całkowity Ae (n)
12 15,6 (10)
15 27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10)
18 35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9)
*p=0,0018
4. Wpływ leczenia AN1792 na poziomy APP
APP-α oraz pełnej długości cząsteczka APP zawierają całość lub część sekwencji Ae, a zatem może na nie potencjalnie wpływać wytworzenie odpowiedzi immunologicznej kierowanej przez AN1792. W dotychczasowych badaniach stwierdzono niewielki wzrost poziomów APP wraz ze wzrostem neuropatologii u myszy PDAPP. W korze podczas leczenia poziomy zarówno APP-a/FL (pełnej długości), jak i APP-α pozostały zasadniczo bez zmian, z wyjątkiem tego, że poziom APP-α był zmniejszony o 19% u myszy w wieku 18 miesięcy w grupie leczonej AN1792 wobec grupy leczonej PBS. Wartości APP u 18 miesięcznych zwierząt z grupy AN1792 nie różniły się znacząco od tych wartości dla zwierząt 12- i 15-miesięcznych nieleczonych oraz 15-miesięcznych leczonych PBS. We wszystkich przypadkach wartości APP utrzymywały się w zakresie normalnie występującym u myszy PDAPP.
5. Działanie leczenia AN1792 na patologię neurodegeneracyjną i glejową.
Obciążenie płytkami neurytycznymi było znacząco zmniejszone w korze czołowej u myszy leczonych AN1792 w porównaniu z grupą leczoną PBS zarówno w wieku 15 (84%; p=0,03) jak i 18 miesięcy (55%; p=0,01) (fig. 8). Wartości mediany obciążenia płytkami neurytycznymi wzrosły od 0,32% do 0,49% w grupie PBS pomiędzy 15, a 18 miesiącem życia. W odróżnieniu od tego, rozwój płytek neurytycznych w grupie leczonej AN1792 był znacznie zmniejszony, z wartościami mediany obciążenia płytkami neurytycznymi wynoszącymi 0,05% i 0,22% odpowiednio dla wieku 15 i 18 miesięcy.
Immunizacje AN1792 wydawały się być dobrze tolerowane, reaktywna astrocytoza także zmalała znacząco w RSC u myszy leczonych AN1792 w porównaniu z grupą leczoną PBS zarówno w wieku 15 (56%; p=0,011), jak i 18 miesięcy (39%; p=0,028) (fig. 9). Wartości mediany procentu astrocytozy w grupie PBS wzrosły pomiędzy 15 a 18 miesiącem od 4,26% do 5,21%. Leczenie AN1792 przytłumiło rozwój astrocytozy w obu punktach czasowych odpowiednio do 1,89% i 3,2%. Sugeruje to, że neuropil nie był niszczony przez proces klirensu.
6. Odpowiedzi przeciwciał
Jak opisano powyżej, 11-miesięczne, heterozygotyczne myszy PDAPP (n=24) otrzymały serię 5 immunizacji, 100 μg AN1792 zemulgowanymi z adiuwantem Freunda, podawanych dootrzewnowo w tygodniach 0, 2, 4, 8 i 12, a szóstą immunizację wykonano samą PBS (bez adiuwanta Freunda) w 16 tygodniu. Jako kontrole negatywne przygotowano zestaw dobranych wiekowo 24 myszy, które immunizowano PBS zemulgowaną z tymi samymi adiuwantami i podawano w takim samym harmonogramie. Od zwierząt pobierano krew 3-7 dni po każdej immunizacji zaczynając od drugiej dawki. Odpowiedzi przeciwciał na AN1792 zmierzono metodą ELISA. Średnie geometryczne mian (GMT) dla zwierząt immunizowanych AN1792 wynosiły około 1900, 7600 i 45000 odpowiednio po drugiej, trzeciej i ostatniej (szóstej) dawce. Po szóstej immunizacji nie stwierdzono specyficznych dla Ae przeciwciał u zwierząt kontrolnych.
Około połowę zwierząt leczono przez kolejne 3 miesiące, immunizując je około 20, 24 i 27 tygodnia. Każdą z dawek podawano w podłożu samą PBS, bez adiuwanta Freunda. Średnie miana przeciwciał nie zmieniły się przez ten czas. W rzeczywistości miana przeciwciał pozostały stabilne w okresie od czwartego do ósmego pobrania krwi odpowiadającym okresowi od piątej do dziewiątej iniekcji.
Aby stwierdzić, czy przeciwciała specyficzne dla Ae, wytworzone przez immunizację, które wykryto w surowicy u myszy leczonych AN1792, także były związane z amyloidem odłożonym w mózgu, zestaw preparatów histologicznych z myszy leczonych AN1792 i PBS poddano działaniu przeciwciał specyficznych dla mysich IgG. W odróżnieniu od grupy PBS, płytki Ae w mózgach myszy leczonych AN1792 były pokryte endogennymi IgG. Tę różnicę pomiędzy oboma grupami zaobserwowano zarówno dla myszy w wieku 15, jak i 18 miesięcy. Szczególnie rażący był brak znakowania w grupie
PL 202 698 B1
PBS, pomimo obecności dużego obciążenia amyloidem u tych myszy. Wyniki te pokazują, że immunizacja syntetycznym białkiem Αβ wytwarza przeciwciała rozpoznające i wiążące się in vivo z Αβ w płytkach amyloidowych.
7. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne
Z dziewięciu myszy immunizowanych AN1792 i 12 immunizowanych PBS myszy PDAPP w wieku 18 miesięcy pobrano śledziony w 7 dni po dziewiątej immunizacji. Wyizolowano limfocyty śledziony i hodowano je przez 72 godziny w obecności Αβ40, Αβ42 lub Αβ40-1 (białko o odwrotnej sekwencji). Mitogen Con Α posłużył jako kontrola pozytywna. Optymalne odpowiedzi uzyskano stosując >1,7 μΜ białko. Komórki ze wszystkich dziewięciu myszy leczonych AN1792 proliferowały w odpowiedzi na białka Αβ1-40 lub Αβ1-42, z równym poziomem inkorporacji obu białek (fig. 10, górny wykres). Nie stwierdzono odpowiedzi na białko o odwrotnej sekwencji Αβ40-1. Komórki ze zwierząt kontrolnych nie odpowiadały na którekolwiek z białek Αβ (fig. 10, dolny wykres).
C. Wnioski
Wyniki tego badania wykazały, że immunizacja AN1792 myszy PDAPP mających złogi amyloidowe spowalnia postępujące odkładanie amyloidu i zapobiega mu, oraz hamuje występujące w konsekwencji zmiany neuropatologiczne w mózgach starych myszy PDAPP. Immunizację AN1792 znacząco hamują rozwój amyloidu w strukturach, które normalnie ulegają amyloidozie. Zatem podawanie peptydu Ae ma pozytywne działanie w leczeniu AD.
VI. Poszukiwanie fragmentów Αβ
100 myszy PDAPP w wieku 9-11 miesięcy immunizowano dziewięcioma różnymi regionami APP i Ae w celu oznaczenia, które epitopy uczestniczą w odpowiedzi. Dziewięć różnych immunogenów oraz jeden kontrolny podano i.p., jak opisano powyżej. Immunogeny zawierały 4 koniugaty ludzkich peptydów Ae 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, wszystkie połączone przez łącznik cysteinowy z owczymi przeciwciałami przeciwmysiej IgG, polipeptyd APP aminokwasy 592-695, zagregowany ludzki Ae1-40, zagregowany ludzki Ae25-35 oraz zagregowany Ae42 z gryzoni. Zagregowany Ae42 i PBS zastosowano jako kontrole. Na każdą z grup leczniczych przypadało 10 myszy. Miana monitorowano jak wyżej, a myszy uśmiercano na koniec 4-miesięcznych immunizacji. Po śmierci oznaczono histochemię, poziomy Ae oraz toksykologię.
A. Materiały i metody
1. Przygotowanie immunogenów
Przygotowanie sprzężonych peptydów Ae: 4 koniugaty ludzkich peptydów Ae (aminokwasy 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, każdy połączony z owczymi przeciwciałami przeciwmysiej IgG) przygotowano sprzęgając przez cysteinę sztucznie dodaną do peptydu Ae przy pomocy środka sieciującego sulfoEMCS. Pochodne peptydu Ae zsyntetyzowano z następującymi końcowymi sekwencjami aminokwasowymi. W każdym przypadku umiejscowienie wstawionej cysteiny wskazano przez podkreślenie. Pochodna peptydu Ae13-28 miała również, jak wskazano, dodane dwie glicyny przed C-końcową cysteiną.
peptyd Ap1-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC COOH peptyd Ap1-5 NH2-DAEFRC COOH peptyd Ae33-42 NH2-C-kwas aminoheptanowy-GLMVGGVVIA COOH peptyd Ae13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH
W celu przygotowania do reakcji sprzęgania 10 mg owczych przeciwciał przeciwmysiej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dializowano przez noc wobec 10 mM buforu boranu sodu, pH 8,5. Następnie oddializowane przeciwciała zagęszczono do objętości 2 ml z użyciem rurki Amicon Centriprep. Dziesięć mg sulfo-EMCS [Nfe-maleimidokuproiloksy)sukcynimidu] (Molecular Sciences Co.) rozpuszczono w 1 ml dejonizowanej wody. Czterdziestokrotny cząsteczkowy nadmiar sulfoEMCS wkroplono w trakcie mieszania do owczego przeciwciała przeciwmysiej IgG, a następnie roztwór mieszano nadal przez kolejnych 10 minut. Aktywowane owcze przeciwciała przeciwmysiej IgG oczyszczono i wymieniono bufor przez przepuszczanie przez 10 ml kolumnę do filtracji żelowej (Pierce Presto Column, uzyskana z Pierce Chemicals) równoważoną 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcje zawierające przeciwciała, zidentyfikowane przez pomiar absorbancji przy 280 nm, połączono i rozcieńczono do stężenia około 1 mg/ml, z użyciem 1,4 mg na OD jako współczynnik ekstynkcji. Czterdziestokrotny nadmiar cząsteczkowy peptydu Ae rozpuszczono w 20 ml 10 mM NaPO4, pH 8,0, z wyjątkiem peptydu Ae33-42, którego 10 mg najpierw rozpuszczono w 0,5 ml DMSO, a następnie rozcieńczono do 20 ml 10 mM buforem NaPO4. Każdy z roztworów peptydów dodano do 10 ml aktywowanych owczych przeciwciał przeciwmysiej IgG i kołysano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Powstałe koniugaty zagęszczono do końcowej objętości poniżej 10 ml z użyciem rurki Amicon
PL 202 698 B1
Centriprep, a następnie dializowano wobec buforu PBS, aby wymienić bufor i usunąć wolne peptydy. Koniugaty przepuszczono przez filtry o średnicy porów 0,22 μ w celu wyjałowienia, a następnie podzielono na równe frakcje po 1 mg i przechowywano zamrożone w -20°C. Stężenia koniugatów oznaczono z użyciem białkowego testu BSA (Pierce Chemicals) z końską IgG jako krzywą standardową. Sprzężenie zostało potwierdzone przez wzrost masy cząsteczkowej sprzężonych peptydów w porównaniu z aktywowanymi przeciwciałami przeciwmysiej IgG. Preparat koniugatu Ae1-5 z owczym przeciwciałem przeciwmysiej IgG zawierał połączone koniugaty z dwóch reakcji sprzęgania, reszta stanowiła pojedynczy preparat.
2. Przygotowanie zagregowanych peptydów Ae
Peptydy ludzki 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., seria ME0541), ludzki 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., serie ME0339 i ME0439), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42 (California Peptides Inc., seria ME0218) świeżo solubilizowano do przygotowania każdego z zestawu zastrzyków z liofilizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę zworteksowano aby wytworzyć względnie jednorodny roztwór lub zawiesinę. Z czterech peptydów jedynym rozpuszczalnym na tym etapie był AN1528. Następnie dodano równe objętości po 100 μl 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zaczął się wytrącać. Zawiesinę ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia.
Przygotowanie białka pBx6: Plazmid ekspresyjny kodujący pBx6, białko fuzyjne składające się z 100 aminokwasowej N-końcowej sekwencji liderowej z polimerazy bakteriofaga MS-2 oraz aminokwasów 592-695 z APP (eAPP) skonstruowano w sposób opisany w Oltersdorf i inni, J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmid transfekowano do E. coli i białko wyeksprymowano po indukcji promotora. Bakterie zlizowano w 8M moczniku i pBx6 częściowo oczyszczono metodą preperatywnej SDS PAGE. Frakcje zawierające pBx6 zidentyfikowano metodą Western blot używając króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciw pBx6, zebrano, zagęszczono za pomocą rurki Amicon Centriprep i dializowano wobec PBS. Czystość preparatu, oznaczona przez wybarwienie Coomassie Blue SDS PAGE, wynosiła około 5 do 10%.
B. Wyniki i ich omówienie
1. Projekt badań
Sto samic i samców, w wieku od 9 do 11 miesięcy heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP uzyskano z Charles River Laboratory i Taconic Laboratory. Myszy podzielono na 10 grup do immunizacji różnymi regionami Ae lub APP razem z adiuwantem Freunda. Zwierzęta podzielono tak by dobrać płeć, wiek, rodziców oraz źródło w obrębie grupy tak blisko jak to było możliwe. Immunogeny obejmowały 4 peptydy Ae wyprowadzone z ludzkiej sekwencji, 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, każdy sprzężony z owczym przeciwciałem przeciw mysiej IgG; 4 zagregowane peptydy Ae, ludzki 1-40 (AN1528), ludzki 1-42 (AN1792), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42; oraz fuzyjny polipeptyd nazwany pBx6, zawierający aminokwasy APP 592-695. Dziesiątą grupę immunizowano PBS w połączeniu z adiuwantem jako kontrolą.
Do każdej immunizacji zemulgowano 100 μg każdego z peptydów Ae w 200 μl PBS lub 200 μg pBx6 pochodnej APP w tej samej objętości PBS, lub samą PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl do pierwszej immunizacji, po czym stosowano dawki przypominające z tą samą ilością immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) w kolejnych czterech dawkach i PBS do końcowej dawki. Immunizację stosowano śródotrzewnowo w trybie dwutygodniowym przez 3 pierwsze dawki, a następnie w trybie miesięcznym. Od zwierząt pobierano krew w 4-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwciał. Zwierzęta uśmiercono około tydzień po końcowej dawce.
2. Poziomy Ae i APP w mózgu
Po 4 miesiącach immunizacji różnymi peptydami Ae lub pochodną APP ze zwierząt perfundowanych solą usunięto mózgi. Jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, a drugą użyto do oznaczenia poziomów Ae i APP. Aby zmierzyć stężenie różnych postaci peptydu e-amyloidowego i białka prekursorowego amyloidu, półkulę pocięto na części i przygotowano homogenaty regionów hipokampu, kory i móżdżka w 5 M guanidynie. Rozcieńczono je i oznaczono poziom amyloidu lub APP, porównując do serii rozcieńczeń wzorców peptydu Ae lub APP o znanych stężeniach, w formacie ELISA.
Średnie stężenie całkowitego Ae dla grup kontrolnych immunizowanych PBS była 5,8-raza większa w hipokampie niż w korze (mediana 24318 ng/g tkanki hipokampa w porównaniu do 4221 ng/g
PL 202 698 B1 kory). Poziom mediany w móżdżku grupy kontrolnej (23,4 ng/g tkanki) był około 1000-razy niższy niż w hipokampie. Poziomy te były podobne do wcześniej opisanych dla heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Woods i inni, 1997, supra).
Dla kory, zestaw grup leczniczych miały średnie całkowite poziomy Ap i Ap1-42 znacznie różniące się od grupy kontrolnej (p<0,05), zwierzęta otrzymujące peptydy AN1792, gryzoni Ap1-42 lub koniugat Ap1-5 przedstawiono na fig. 11. Poziomy mediany całkowitego Ap zmniejszyły się odpowiednio o 75%, 79% i 61% w porównaniu z kontrolą dla tych grup leczniczych. Nie stwierdzono dostrzegalnych współzależności pomiędzy mianami przeciwciał specyficznych dla Ap i poziomami Ap w regionie korowym mózgu dla jakiejkolwiek z tych grup.
W hipokampie średnie zmniejszenie całkowitej ilości Ap towarzysząca leczeniu AN1792 (46%, p=0,0543) nie była tak duża jak obserwowana w korze (75%, p=0,0021). Jednakże stopień zmniejszenia był znacznie wyższy w hipokampie niż w korze, zmniejszenie netto wynosiło 11186 ng/g tkanki w hipokampie wobec 3171 ng/g tkanki w korze. Dla grup zwierząt otrzymujących Ap1-42 z gryzoni lub Ap1-5 średnie całkowitych poziomów Ap zmniejszyły się odpowiednio o 36% i 26%. Jednakże, biorąc pod uwagę fakt, że grupy były małe oraz ze względu na zmienność poziomów peptydu amyloidowego u poszczególnych zwierząt w grupie, zmiany te nie były znaczące. Przy pomiarach Ap1-42 w hipokampie żadna ze zmian wywołanych leczeniem nie była znacząca. Zatem, ze względu na niższe obciążenie Ap kory, zmiany w tym regionie są znacznie czulszym wskaźnikiem skutków leczenia. Zmiany poziomów Ap zmierzone metodą ELISA w korze były podobne, ale nie takie same, jak wyniki analizy immunohistochemicznej (patrz poniżej).
Całkowity Ap zmierzono także w móżdżku, regionie zazwyczaj nie dotkniętym w patologii AD. Żadne ze średnich stężeń Ap jakiejkolwiek z grup immunizowanych różnymi peptydami Ap lub pochodną APP nie różniło się od wartości dla grupy kontrolnej w tym regionie mózgu. Wynik ten sugeruje, że leczenie nie wpływa na niepatologiczne poziomy Ap.
Stężenie APP oznaczono także metodą ELISA w korze i móżdżku z leczonych i kontrolnych zwierząt. Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, nazwany APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-α (α, wydzielaną postać APP, która została wzięta w obrębie sekwencji Ap), jak i postaci APP pełnej długości (FL), podczas gdy drugi rozpoznaje tylko APP-α. W odróżnieniu od towarzyszącego leczeniu zmniejszenia AP w zestawie grup leczniczych, poziomy APP pozostały bez zmian u wszystkich zwierząt leczonych w porównaniu z kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że immunizację peptydami Ap nie usuwają APP, a skutek leczniczy jest raczej specyficzny dla Ap.
W podsumowaniu, całkowite poziomy Ap i Ap1-42 były znacząco zmniejszone w korze przez leczenie AN1792, gryzoni Ap1-42 lub koniugatem Ap1-5. W hipokampie całkowity Ap był znacznie zmniejszony tylko przez leczenie AN1792. Żadne inne związane z leczeniem zmiany poziomów Ap lub APP w regionach hipokampu, kory lub móżdżku nie były znaczące.
2. Analiza histochemiczna
Mózgi z podzestawu sześciu grup przygotowano do analizy immunohistochemicznej, 3 grupy immunizowane koniugatami peptydu Ap - Ap1-5, Ap1-12 i Ap13-28; 3 grupy immunizowane agregatami Ap pełnej długości - AN1792 i AN1528 oraz grupę kontrolną leczoną PBS. Wyniki analizy obrazu dla obciążenia amyloidem skrawków histologicznych mózgu z tych grup przedstawiono na fig. 12. Stwierdzono znaczące obniżenie obciążenia amyloidem regionów korowych w 3 grupach leczniczych w stosunku do zwierząt kontrolnych. Największe obniżenie obciążenia amyloidem obserwowano w grupach otrzymujących AN1792, gdzie średnia wartość była zmniejszona o 97% (p=0,001). Znaczące obniżenie obserwowano także dla zwierząt leczonych AN1528 (95%, p=0,005) i koniugatem peptydu Ap1-5 (67%, p=0,02).
Wyniki uzyskane przez pomiar całkowitego Ap lub Ap1-42 metodą ELISA oraz obciążenia amyloidem metodą analizy obrazu w pewnym stopniu różnią się. Leczenie AN1528 miało znaczący wpływ na poziom obciążenia amyloidem kory w pomiarach metodą ilościowej analizy obrazu, ale nie miało wpływu na stężenie całkowitego Ap zmierzone metodą ELISA w tym samym regionie. Różnica pomiędzy tymi dwoma wynikami prawdopodobnie związana jest ze specyfiką testów. Analiza obrazu mierzy tylko nierozpuszczalne Ap zagregowane w płytkach. W odróżnieniu od tego ELISA mierzy wszystkie postaci Ap, zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne, monomeryczne i zagregowane. Ponieważ przypuszcza się, że patologia choroby jest związana z nierozpuszczalną formą Ap związaną z płytkami, technika analizy obrazu może mieć większą czułość w ocenie skutków leczenia. Jednakże z uwagi na to, że test ELISA jest szybszym i łatwiejszym testem, jest on bardzo użyteczny do celów poszukiwania nowych leków. Ponadto może to oznaczać, że związane z leczeniem zmniejszenie Ap jest większe dla związanego z płytkami niż całkowitego Ap.
PL 202 698 B1
Aby stwierdzić, czy specyficzne dla Ae przeciwciała wytworzone przez immunizację u leczonych zwierząt reagowały z odłożonym w mózgu amyloidem, podzestaw skrawków histologicznych ze zwierząt leczonych i kontrolnych poddano działaniu przeciwciał specyficznych dla mysich IgG. W odróżnieniu od grupy PBS, płytki zawierające Ae były pokryte endogenną IgG u zwierząt immunizowanych koniugatami peptydów Ae- Ae1-5, Ae1-12 i Ae13-28; oraz agregatami pełnej długości Ae - AN1792 i AN1528. Mózgów zwierząt immunizowanych innymi peptydami Ae lub peptydem APP pBx6 nie analizowano w tym teście.
3. Pomiar mian przeciwciał
Od myszy pobrano krew w 4-7 dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej immunizacji, łącznie 5 razy. Zmierzono miana przeciwciał jako przeciwciała wiążące Ae1-42 metodą kanapkowego ELISA na wielostudzienkowych płytkami z tworzywa sztucznego, powleczonych Ae1-42. Jak pokazano na fig. 13, szczytowe miana przeciwciał były wytworzone po czwartej dawce dla tych 4 szczepionek, które wywoływały najwyższe miana przeciwciał specyficznych dla AN1792: AN1792 (szczytowa GMT: 94647), AN1528 (szczytowe GMT: 88231), koniugat Ae1-12 (szczytowe GMT 47216) i gryzonia Ae1-42 (szczytowa GMT: 10766). Miana dla tych grup obniżyły się w pewnym stopniu po piątej i szóstej dawce. Dla pozostałych pięciu immunogenów szczytowe miana osiągnięto po piątej i szóstej dawce i były one znacznie mniejsze niż uzyskane dla czterech grup najwyższych mian: koniugat Ae1-5 (szczytowa GMT: 2356), pBx6 (szczytowa GMT: 1986), koniugat Ae13-28 (szczytowa GMT: 1183), koniugat Ae33-42 (szczytowa GMT: 658), Ae25-35 (szczytowa GMT: 125). Miana przeciwciał zmierzono także wobec homologicznych peptydów stosując ten sam format kanapkowego ELISA dla podzestawu immunogenów, grup immunizowanych Ae1-5, Ae13-28, Ae25-35, Ae33-42 i gryzoni Ae1-42. Miana te były w przybliżeniu takie same, jak zmierzone względem Ae1-42, z wyjątkiem immunogenu gryzoniego Ae1-42, dla którego miana przeciwciał względem homologicznego immunogenu były około 2-krotnie wyższe. Wielkość miana przeciwciał specyficznych względem AN1792 u poszczególnych zwierząt lub średnia wartość dla grup leczniczych nie miała związku ze skutecznością zmierzoną jako zmniejszenie Ae w korze.
4. Odpowiedzi limfoproliferacyjne
Zależną od Ae limfoproliferację zmierzono stosując komórki śledziony zebrane około tydzień po końcowej, szóstej, immunizacji. Świeżo zebrane komórki, 105 na studzienkę, hodowano przez 5 dni w obecności Ae1-40 w stężeniu 5 μM w celu stymulacji. Komórki z podzestawu siedmiu spośród dziesięciu grup także hodowano w obecności peptydu o odwrotnej sekwencji Ae40-1. Jako pozytywną kontrolę hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako negatywną kontrolę komórki hodowano bez dodanego peptydu.
Limfocyty z większości zwierząt proliferowały w odpowiedzi na PHA. Nie stwierdzono znaczących odpowiedzi na peptyd o odwrotnej sekwencji Ae40-1. Komórki ze zwierząt immunizowanych większymi zagregowanymi peptydami Ae, AN1792, gryzonim Ae1-42 i AN1528 silnie proliferowały po stymulacji Ae1-40 z najwyższymi cmp u biorców AN1792. U jednego ze zwierząt w każdej z grup immunizowanych koniugatami Ae1-12, Ae13-28 i Ae25-35 komórki proliferowały w odpowiedzi na Ae140. W pozostałych grupach otrzymujących koniugaty Ae1-5, Ae33-42 oraz pBx6 lub PBS nie było zwierząt z odpowiedzią stymulowaną Ae. Wyniki te zestawiono w tabeli 5 poniżej.
T a b e l a 5
Immunogen Koniugat Aminokwasy Ae Zwierzęta odpowiadające
Ae1-5 tak 5-mer 0/7
Ae1-12 tak 12-mer 1/8
Ae13-28 tak 16-mer 1/9
Ae25-35 11-mer 1/9
Ae33-42 tak 10-mer 0/10
Ae1-40 40-mer 5/8
Ae1-42 42-mer 9/9
gryzoni Ae1-42 42-mer 8/8
pBx6 0/9
PBS 0-mer 0/8
PL 202 698 B1
Wyniki te wskazują, że AN1792 i AN1528 najsilniej stymulują odpowiedzi komórek T, najprawdopodobniej o fenotypie CD4+. Brak specyficznej względem Ae odpowiedzi komórek T u zwierząt immunizowanych Ae1-5 nie jest zaskakująca, gdyż epitopy peptydowe rozpoznawane przez komórki T CD4+ mają zazwyczaj długość 15 aminokwasów, jakkolwiek krótsze peptydy mogą czasem działać z mniejszą skutecznością. Zatem większość epitopów komórek T pomocniczych dla czterech koniugatów peptydów znajduje się w części IgG koniugatu, a nie w regionie Ae. Hipotezę tę potwierdza bardzo niska częstość odpowiedzi proliferacyjnych dla zwierząt z każdej z tych grup leczniczych. Z uwagi na to, że koniugat Ae1-5 był skuteczny w znaczącym obniżaniu poziomu Ae w mózgu, przy widocznym braku komórek T specyficznych dla Ae, kluczową efektorową odpowiedzią immunologiczną wywołaną przez immunizację tym peptydem okazuje się być przeciwciało.
Brak komórek T oraz niska odpowiedź przeciwciał dla białka fuzyjnego pBx6, zawierającego aminokwasy APP 592-695 włącznie ze wszystkimi aminokwasami Ae, może być spowodowana słabą immunogennością konkretnego preparatu. Słaba immunogenność agregatu Ae25-35 jest prawdopodobnie spowodowana tym, że peptyd jest za mały, aby było prawdopodobne, że zawiera dobry epitop dla komórki T, aby wspomóc indukcję odpowiedzi przeciwciał. Jeżeli peptyd ten byłby sprzężony z białkiem nośnikowym prawdopodobnie byłby bardziej immunogenny.
V. Przygotowanie przeciwciał poliklonalnych do biernej ochrony nietransgenicznych myszy immunizowanych Ae lub innym immunogenem, dodatkowo z adiuwantem, uśmiercono w wieku 4-5 miesięcy. Zebrano krew immunizowanych myszy. Ewentualnie IgG wydzielono z innych składników krwi. Przeciwciała specyficzne dla immunogenu częściowo oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa. Otrzymano średnio 0,5-1 mg przeciwciał specyficznych dla immunogenu na mysz, co dało łącznie 5-10 mg.
VI. Bierna immunizacja przeciwciałami na Ae
Grupom 7-9 -miesięcznych myszy PDAPP podano 0,5 mg w PBS przeciwciał poliklonalnych przeciw-Ae lub specyficznych monoklonalnych przeciw-Ae, co pokazano poniżej. Przeciwciała monoklonalne można przygotować przeciw fragmentowi przez wstrzyknięcie myszy fragmentu lub dłuższej formy Ae, przygotowanie hybrydom i przeszukiwanie hybrydom pod względem przeciwciała specyficznie wiążącego wymagany fragment Ae nie wiążąc przy tym innych niezachodzących fragmentów Ae.
T a b e l a 6
Przeciwciało Epitop
2H3 Ae1-12
10D5 Ae1-12
266 Ae 13-28
21F12 Ae33-42
Mysie poliklonalne przeciwludzkie Ae42 przeciw zagregowanemu Ae42
Zwierzętom podawano przez 4 miesiące śródotrzewnowo preparaty, gdy było to potrzebne, aby utrzymać przeciwciała w krążeniu w stężeniach, mierzonych jako miana ELISA, większych niż 1/1000, oznaczanych w ELISA wobec Ae42 lub innego immunogenu. Miana monitorowano jak wyżej i myszy uśmiercono na koniec 4-miesięcznych wstrzykiwań. Po śmierci wykonano histochemię, oznaczanie poziomów Ae i toksykologię. W każdej z grup użyto po 10 myszy.
VII. Porównanie różnych adiuwantów
Przykłady te porównują CFA, ałun, emulsję olej w wodzie i MPL pod względem ich zdolności stymulowania odpowiedzi immunologicznej.
A. Materiały i metody
1. Projekt badań
Sto samic sześciotygodniowych świnek morskich rasy Hartley, otrzymanych z Elm Hill, podzielono na 10 grup do immunizacji AN1792 lub jego palmitoilowaną pochodną, połączonymi z różnymi adiuwantami. Siedem grup immunizowano przez iniekcję AN1792 (33 μg, z wyjątkiem gdy zaznaczono inaczej) połączonym z a) PBS, b) adiuwantem Freunda, c) MPL, d) skwalenem, e) MPL/skwalenem, f) niską dawką z ałunem lub g) wysoką dawką z ałunem (300 μg AN1792). Dwie grupy immunizowano przez iniekcję palmitoliowaną pochodną AN1792 (33 μg) połączoną z a) PBS lub b) skwalenem. Na koniec, dziesiąta grupa otrzymywała samą PBS, bez antygenu i dodatkowego adiuwanta. Dla grupy otrzymującej adiuwant Freunda pierwszą dawkę zemulgowano z CFA, a pozoPL 202 698 B1 stałe 4 dawki z IFA. Antygen podawano w dawce 33 μg dla wszystkich 11 grup, z wyjątkiem grupy wysokiej dawki z ałunem, która otrzymywała 300 μg AN1792. Immunizację wykonywano śródotrzewnowo dla CFA/IFA i domięśniowo do mięśnia czterogłowego tylnej łapy, na zmianę po prawej i lewej stronie dla wszystkich innych grup. Pierwsze trzy dawki podawano w trybie dwutygodniowym, a następnie podano dwie dawki z miesięczną przerwą. Krew pobierano 6-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, w celu pomiaru miana przeciwciał.
2. Przygotowanie immunogenów
Dwa mg Ae42 (California Peptide, seria ME0339) dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę zworteksowano, aby utworzyć względnie jednorodną zawiesinę. Dodano 100 μl 10x PBS (1X PBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5). Zawiesinę ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia. Nie zużyte Ae1-42 przechowywano z osuszaczem jako liofilizowany proszek w -20°C.
Palmitoilowaną pochodną AN1792 otrzymano przez sprzęganie bezwodnika palmitynowego, zawieszonego w dimetyloformamidzie, z N-końcowym aminokwasem AN1792, przed usunięciem powstającego peptydu z żywicy przez podziałanie kwasem fluorowodorowym.
Aby przygotować dawki szczepionek z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) (grupa 2) zemulgowano 33 μg AN1792 w 200 μl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z CFA w końcowej objętości 400 μl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie emulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA).
Aby przygotować dawki szczepionek z MPL dla grup 5 i 8 liofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) dodano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy, do końcowego stężenia 1 mg/ml i całość zworteksowano. Mieszaninę podgrzano do 65 do 70°C przez 30 sekund aby wytworzyć lekko nieprzezroczystą jednorodną zawiesinę miceli. Roztwór świeżo przygotowywano do każdego zestawu zastrzyków. Do każdego zastrzyku w grupie 5, zmieszano 33 μg AN1792 w 16,5 μl PBS, 50 gg MPL (50 μΓ) i 162 μl PBS w probówce borokrzemianowej bezpośrednio przed użyciem.
Aby przygotować dawki szczepionek z małą ilością emulsji olej w wodzie, AN1792 w PBS dodano do 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 w PBS, do końcowego stężenia w pojedynczej dawce 33 μg AN1792 w 250 μl (grupa 6). Mieszaninę zemulgowano przepuszczając przez dwukomorowe ręczne urządzenie 15 do 20 razy do momentu otrzymania kropelek emulsji o średnicy zbliżonej do standardowej perełki lateksowej o średnicy 1 μm, przy analizie mikroskopowej. Otrzymana zawiesina była opalizująca, mlecznobiała. Emulsje świeżo przygotowywano dla każdej z serii iniekcji. Dla grupy 8 dodano MPL w 0,2% trietyloaminie w stężeniu 50 μg na dawkę do mieszaniny skwalenu w detergencie w celu zemulgowania jak opisano powyżej. Dla pochodnej palmitoilowych (grupa 7), 33 gg na dawkę palmitoilo-NH-Ae1-42 dodano do skwalenu i zworteksowano. Następnie dodano Tween 80 i Span 85 i zworteksowano. Mieszaninę tę dodano do PBS, aby osiągnąć końcowe stężenia 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 i mieszaninę zemulgowano jak powyżej.
Aby przygotować dawki szczepionek z ałunem (grupy 9 i 10), AN1792 w PBS dodano do Alhydrogel (żel wodorotlenku glinu, Accurate, Wetsbury, NY) do osiągnięcia stężenie 33 μg (niska dawka, grupa 9) lub 300 μg (wysoka dawka, grupa 10) AN1792 na 5 mg ałunu, w końcowej objętości dawki 250 gl. Zawiesinę delikatnie mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Pomiary mian przeciwciał
Od świnek morskich pobierano krew 6-7 dni po immunizacji, zaczynając po drugiej immunizacji, wykonując to 4 razy. Mian przeciwciał przeciw Ae42 zmierzono metodą ELISA, jak opisano w ogólnych materiałach i metodach.
4. Preparaty tkanek
Po około 14 tygodniach wszystkim świnkom morskim podano CO2. Zebrano płyn mózgowordzeniowy i usunięto mózgi, po czym wypreparowano 3 regiony mózgowe (hipokamp, korę i móżdżek), które użyto do pomiarów stężenia całkowitego Ae metodą ELISA.
B. Wyniki
1. Odpowiedzi przeciwciał
Zaobserwowano szeroki zakres skuteczności różnych adiuwantów mierzonej w testach odpowiedzi przeciwciał na AN1792 po immunizacji. Jak pokazano na fig. 14, gdy AN1792 podawano w PBS, nie wykryto przeciwciał po dwóch lub trzech immunizacjach, a niewielkie odpowiedzi wykryto po czwartej i piątej dawce ze średnią geometryczną mian (GMT) zaledwie około 45. Emulsja olej w wodzie wytworzyła umiarkowane miana po trzeciej dawce (GMT 255), które utrzymywały się po czwartej dawce (GMT 301) i spadły po końcowej dawce (GMT 54). Wystąpiła wyraźna odpowiedź
PL 202 698 B1 antygenowa na dawkę dla AN1792 związanego z ałunem, przy czym 300 μg było bardziej immunogenne we wszystkich punktach czasowych niż 33 μg. W szczytowej odpowiedzi przeciwciał, po czwartej immunizacji, różnica pomiędzy dwoma dawkami wynosiła 43% z GMT około 1940 (33 μg) i 3400 (300 pg). Odpowiedź przeciwciał na 33 μg AN1792 plus MPL była bardzo podobna do wytworzonej przez prawie 10-krotnie większą dawkę antygenu (300 μg) związanego z ałunem. Dodatek MPL do emulsji olej w wodzie zmniejszył siłę szczepionki w stosunku do szczepionki z MPL, jako jedynym adiuwantem, aż o 75%. Palmitoilowana pochodna AN1792 była całkowicie nieimmunogenna przy podawaniu w PBS i dała średnie miana przy podawaniu w emulsji olej w wodzie z GMT, 340 i 105 dla trzeciego i czwartego pobrania krwi. Najwyższe miana przeciwciał wytworzył adiuwant Freunda z szczytem GMT około 87000, która to wartość była prawie 30-krotnie wyższa niż GMT kolejnych najsilniejszych szczepionek, MPL i wysokiej dawki AN1792/ałun.
Najbardziej obiecującymi adiuwantami zidentyfikowanymi w tym badaniu są MPL i ałun. Z tych dwóch MPL wydaje się być korzystny, gdyż 10-krotnie niższa dawka antygenu była niezbędna do wytworzenia tej samej odpowiedzi przeciwciał, co uzyskana dla ałunu. Odpowiedź można wzmocnić przez zwiększenie dawki antygenu i/lub adiuwanta, oraz optymalizację trybu immunizacji. Emulsja olej w wodzie była bardzo słabym adiuwantem dla AN1792, tak że dodanie emulsji olej w wodzie do adiuwanta MPL zmniejszyło wewnętrzną aktywność samego adiuwanta MPL.
2. Poziomy Ap w mózgu
W wieku około 14 tygodni świnki morskie głęboko uśpiono, pobrano płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i usunięto zwierzętom mózgi w podzestawie grup immunizowanych adiuwantem Freunda (grupa 2), MPL (grupa 5), ałunem z wysoką dawką, 300 μg AN1792 (grupa 10) i z immunizowanej PBS grupy kontrolnej (grupa 3). Aby zmierzyć poziom peptydu Ap, jedną półkulę wypreparowano i przygotowano homogenaty regionów hipokampa, kory i móżdżku w 5 M guanidynie. Następnie rozcieńczono je i oznaczono przez porównanie z serią rozcieńczeń standardowego białka Ap o znanych stężeniach, w formacie ELISA. Poziomy Ap w hipokampie, korze i móżdżku były bardzo podobne dla wszystkich grup, pomimo szerokiego zakresu odpowiedzi przeciwciał na Ap wywołanej przez te szczepionki. Zmierzono średnie poziomy Ap w tkance, wynoszące około 25 ng/g w hipokampie, 21 ng/g w korze i 12 ng/g w móżdżku. Zatem obecność w krążeniu wysokiego miana przeciwciał przeciw Ap przez prawie 3 miesiące u niektórych z tych zwierząt nie zmieniła całkowitych poziomów Ap w ich mózgach. Poziomy Ap w CFS także były podobne pomiędzy grupami. Brak wyraźnych skutków immunizacji AN1792 na endogenny Ap wskazuje, że odpowiedź immunologiczna jest skupiona na patologicznych formach Ap.
VIII. Odpowiedź immunologiczna na różne adiuwanty u myszy
Sześciotygodniowe samice myszy Swiss Webster zastosowano do tych badań z 10-13 zwierzętami na grupę. Immunizację wykonywano śródotrzewnowo w dniach 0, 14, 28, 60, 90 i 20, w dawkach o objętości 200 pl. Do wszystkich stymulacji jako bufor zastosowano PBS. Od zwierząt pobrano krew w 7 dni po każdej immunizacji, zaczynając po drugiej dawce, do analizy mian przeciwciał w teście ELISA. Tryb leczenia każdej z grup podano w tabeli 7.
T a b e l a 7. Projekt doświadczenia badania Betabloc 010
Grupa Na Adiuwantb Dawka Antygen Dawka (pg)
1 2 3 4 5 6
1 10 MPL 12,5 pg AN1792 33
2 10 MPL 25 pg AN1792 33
3 10 MPL 50 pg AN1792 33
4 13 MPL 125 pg AN1792 33
5 13 MPL 50 pg AN1792 150
6 13 MPL 50 pg AN1528 33
7 10 PBS AN1792 33
8 10 PBS -
9 10 zemulgowany skwalen 5% AN1792 33
10 10 domieszany skwalen 5% AN1792 33
PL 202 698 B1 cd. tabeli 7
1 2 3 4 5 6
11 10 ałun 2 mg AN1792 33
12 13 MPL+ałun 50 pg/2 mg AN1792 33
13 10 QS21 5 pg AN1792 33
14 10 QS21 10 pg AN1792 33
15 10 QS21 25 pg AN1792 33
16 13 QS21 25 pg AN1792 150
17 13 QS21 25 pg AN1528 33
18 13 QS21+MPL 25 pg/50 pg AN1792 33
19 13 QS21+ałun 25 pg/2 mg AN1792 33
Odnośniki:
a Liczba myszy w każdej grupie na początku doś wiadczenia b Wskazano adiuwanty. Jako bufor do wszystkich preparatów zastosowano PBS. Grupie 8 nie podano antygenu ani adiuwanta.
Miana ELISA przeciwciał przeciw Ae42 dla każdej grupy przedstawiono w tabeli 8 poniżej. T a b e l a 8. Geometryczne średnie mian przeciwciał
Tydzień pobierania krwi
Grupa lecznicza 2,9 5,0 8,7 12,9 16,7
1 248 1797 2577 6180 4177
2 598 3114 3984 5287 6878
3 1372 5000 7159 12333 12781
4 1278 20791 14368 20097 25631
5 3288 26242 13229 9315 23742
6 61 2536 2301 1442 4504
7 37 395 484 972 2149
8 25 25 25 25 25
9 25 183 744 952 1823
10 25 89 311 513 817
11 29 708 2618 2165 3666
12 198 1458 1079 612 797
13 38 433 566 1080 626
14 104 541 3247 1609 838
15 212 2630 2472 1224 1496
16 183 2616 6680 2085 1631
17 28 201 375 222 1540
18 31699 15544 23095 6412 9059
19 63 243 554 299 441
Tabela wykazuje, że najwyższe miana uzyskano dla grup 4, 5 i 18, w których adiuwantami było 125 pg MPL, 50 pg MPL oraz QS21 plus MPL.
IX. Lecznicza skuteczność różnych adiuwantów.
Badania nad skutecznością leczniczą prowadzono na transgenicznych myszach PDAPP, z zestawem adiuwantów odpowiednich do stosowania u ludzi, aby oznaczyć ich zdolność do wzmocnienia
PL 202 698 B1 odpowiedzi immunologicznej przeciw Ae i wywołać kierowane immunologicznie oczyszczanie złogów amyloidowych z mózgu.
Sto osiemdziesiąt samców i samic, w wieku 7,5 do 8,5 miesięcy, heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP otrzymano z Charles River Laboratories. Myszy podzielono na 9 grup zawierających po 15 do 23 zwierzęta w grupie, do immunizacji AN1792 i AN1528 w połączeniu z różnymi adiuwantami. Zwierzęta podzielono tak, by dobrać płeć, wiek oraz rodziców zwierząt w obrębie grupy tak blisko jak to tylko było możliwe. Jako adiuwanty zastosowano ałun, MPL i QS21, każdy w połączeniu z dwoma antygenami, oraz adiuwant Freunda (FA) połączony tylko z AN1792. Dodatkową grupę immunizowano AN1792 w buforze PBS ze środkiem konserwującym tymerozalem bez adiuwanta. Dziewiątą grupę, jako negatywną kontrolę, immunizowano samą PBS.
Przygotowanie zagregowanych peptydów: peptydy ludzki Ae1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; seria ME0541), ludzki Ae1-42 (AN1792; California Peptides Inc., seria ME0439), świeżo solubilizowano do przygotowania każdego z zestawu zastrzyków z liofilizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę zworteksowano, aby wytworzyć względnie jednorodny roztwór lub zawiesinę. AN1528 był rozpuszczalny na tym etapie, w odróżnieniu od AN1792. Następnie dodano równe objętości po 100 μl 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zaczął się wytrącać. Zawiesinę ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia.
Aby przygotować dawki szczepionek z ałunem (grupy 1 i 5), peptyd Ae w PBS dodano do Alhydrogelu (2% wodny żel wodorotlenku glinu, Sargeant, Inc., Clifton, NJ), do osiągnięcia stężenia 100 μg peptydu Ae na 1 mg ałunu. Dodano 10x PBS do końcowej objętości dawki wynoszącej 200 μl w 1x PBS. Zawiesinę delikatnie mieszano przez około 4 godziny w temperaturze pokojowej przed wstrzykiwaniem.
Aby przygotować dawki szczepionek z MPL (grupy 2 i 6) liofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; seria 67039-E0896B) dodano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy, do końcowego stężenia 1 mg/ml i zworteksowano. Mieszaninę podgrzano do 65 do 70°C przez 30 s, aby otrzymać lekko nieprzezroczystą jednorodną zawiesinę miceli. Roztwór przechowywano w 4°C. Do każdego zestawu iniekcji zmieszano 100 μg peptydu na dawkę w 50 μl PBS, 50 μg MPL na dawkę (50 μΓ) i 100 μl PBS na dawkę, w probówce borokrzemianowej, bezpośrednio przed użyciem.
Aby przygotować dawki szczepionek z QS21 (grupy 3 i 7) liofilizowany proszek (Aquila, Framingham, MA; seria A7018R) dodano do PBS, pH 6,6-6,7 do końcowego stężenia 1 mg/ml i zworteksowano. Roztwór przechowywano w -20°C. Do każdego zestawu zastrzyków zmieszano 100 μg peptydu na dawkę w 50 μl PBS, 25 μg QS21 na dawkę w 25 μl PBS i 125 μl PBS na dawkę w probówce borokrzemianowej bezpośrednio przed użyciem.
Aby przygotować dawki szczepionek z adiuwantem Freunda (grupa 4) zemulgowano 100 μg AN1792 w 200 μl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie zemulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA). Do szczepionek zawierających adiuwanty ałun, MPL lub QS21, połączono 100 μg na dawkę AN1792 lub AN1528 z ałunem (1 mg na dawkę) lub MPL (50 μg na dawkę) lub QS21 (25 μg na dawkę), w końcowej objętości 200 μl PBS i podawano szczepiąc podskórnie na boku pomiędzy łopatkami. Dla grupy otrzymującej FA 100 μg AN1792 zemulgowano w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl i podawano śródotrzewnowo przy pierwszej immunizacji, a następnie podawano dawki przypominające tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) przez kolejnych pięć dawek. Dla grupy otrzymującej AN1792 bez adiuwanta 10 μg AN1792 połączono z 5 μg tymerozalu w końcowej objętości 50 μl PBS i podawano podskórnie. Dziewiąta grupa kontrolna otrzymywała tylko 200 μl PBS w zastrzykach podskórnych. Immunizację wykonywano w trybie dwutygodniowym przez 3 pierwsze dawki, a następnie w trybie miesięcznym, a zatem w dniach 0, 16, 28, 56, 85 i 112. Od zwierząt pobierano krew w 6-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwciał. Zwierzęta uśmiercono około tygodnia po końcowej dawce. Wyniki oznaczono w teście ELISA mierząc poziomy Ae i APP w mózgu i na podstawie immunohistochemicznej oceny obecności płytek amyloidowych w skrawkach histologicznych mózgu. Ponadto oznaczono miana specyficznych przeciwciał przeciw Ae oraz zależne od Ae odpowiedzi, proliferacyjną i cytokin.
Z tabeli 9 wynika, że najwyższe miana przeciwciał przeciw Ae1-42 wytworzył FA z AN1792, miana, które osiągnęły szczyt po czwartej immunizacji (szczytowa GMT: 75386), a następnie spaPL 202 698 B1 dły o 59% po końcowej, szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwciał wytworzone przez MPL z AN1792 było o 62% niższe niż wytworzone przez FA (szczytowa GMT: 28867) i także zostało osiągnięte wcześnie podczas immunizacji, po trzech dawkach, a następnie spadło do 28% szczytowej wartości po szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwciał wytworzone przez QS21 połączony z AN1792 (GMT: 1511) było około 5-krotnie niższe niż uzyskane dla MPL. Ponadto kinetyka odpowiedzi była wolniejsza, gdyż dodatkowa immunizacja była konieczna do uzyskania szczytowej odpowiedzi. Miana wytworzone przez ałun związany z AN1792 były niewiele wyższe niż uzyskane dla QS21, a kinetyka odpowiedzi była szybsza. Dla AN1792 podawanego w PBS z tymerozalem częstość i wielkość mian była niewiele wyższa niż uzyskana dla samej PBS. Szczytowe miana wytworzone przez MPL i AN1528 (szczytowa GMT 3099) były około 9-krotnie niższe niż dla AN1792. AN1528 związany z ałunem był w niewielkim stopniu immunogenny, z niskimi mianami wytworzonymi tylko u paru zwierząt. Nie obserwowano odpowiedzi przeciwciał u zwierząt kontrolnych immunizowanych samą PBS.
T a b e l a 9. Średnie geometryczne mian przeciwciała
Tydzień pobierania krwi
Leczenie 3,3 5,0 9,0 13,0 17,0
Ałun/AN1792 102 (12/21 )b 1081 (17/20) 2366 (21/21) 1083 (19/21) 572 (18/21)
MPL/AN1792 6241 (21/21) 28867 (21/21) 11242 (21/21) 5665 (20/20) 8204 (20/20)
QS21/AN1792 30 (1/20) 227 (10/19) 327 (10/19) 1511 (17/18) 1188 (14/18)
CFA/AN1792 10076 (15/15) 61279 (15/15) 75386 (15/15) 41628 (15/15) 30574 (15/15)
Ałun/AN1528 25 (0/21) 33 (1/21) 39 (3/20) 37 (1/20) 31 (2/20)
MPL/AN1528 184 (15/21) 2591 (20/21) 1653 (21/21) 1156 (20/20) 3099 (20/20)
QS21/AN1528 29 (1/22) 221 (13/22) 51 (4/22) 820 (20/22) 2994 (21/22)
PBS+tymerozal 25 (0/16) 33 (2/16) 39 (4/16) 37 (3/16) 47 (4/16)
PBS 25 (0/16) 25 (0/16) 25 (0/15) 25 (0/12) 25 (0/16)
Odnośniki:
a Średnie geometryczne mian przeciwciał zmierzonych względem Ae1-42. b Liczba odpowiadających na grupę.
Wyniki leczenia AN1792 lub AN1592 z różnymi adiuwantami lub tymerozalem na obciążenie kory amyloidem u 12-miesięcznych myszy oznaczone metodą ELISA przedstawiono na fig. 15. U PBS kontrolnych myszy PDAPP średni poziom całkowitego Ae w korze w wieku 12 miesięcy wynosił 1817 ng/g. Znacznie obniżone poziomy Ae obserwowano u myszy leczonych AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL oraz QS21 plus AN1792. Obniżenie osiągnęło znaczącą statystycznie wartość (p<0,05) tylko dla AN1792 plus CFA/IFA. Jednakże, jak pokazano w przykładach I i III, działanie immunizacji na obniżenie poziomów Ae było znacząco większe u 15 i 18-miesięcznych myszy. Zatem oczekuje się, że przynajmniej leczenie preparatami AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS21 osiągnie znaczenie statystyczne u starszych myszy. W porównaniu z tym, AN1792 plus środek konserwujący tymerozal wytwarzał średni poziom Ae prawie taką samą jak u myszy leczonych PBS. Podobne wyniki uzyskano porównując korowe poziomy Ae42. Średni poziom Ae42 w kontrolach PBS wynosił 1624 ng/g. Wyraźnie obniżone średnich poziomów o wartościach 403, 1149, 620 i 714 obserwowano u myszy leczonych odpowiednio preparatami AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS21, ze zmniejszeniem osiągającym znaczenie statystyczne (p=0,05) dla grupy leczonej AN1792 plus CFA/IFA. Wartość średnia w grupie leczonej AN1792 z tymerozalem wynosiła 1619 ng/g Ae42.
X. Analiza toksyczności
Po zakończeniu badań opisanych w przykładach 2, 3 i 7 zebrano tkanki do oceny histopatologicznej. Ponadto w końcowych próbkach krwi z przykładów 3 i 7 wykonano analizy hematologiczne i chemiczne. Oceniono większość głównych organów, włącznie z mózgiem, płucami, tkanką limfatyczną, przewodem żołądkowo-jelitowym, wątrobą, nerkami, nadnerczami i gruczołami płciowymi. Pomimo, że zaobserwowano sporadyczne uszkodzenia u badanych zwierząt, nie stwierdzono żadnych
PL 202 698 B1 oczywistych różnic, ani w zaatakowanych tkankach, ani w ostrości uszkodzeń pomiędzy zwierzętami leczonymi AN1792 a nieleczonymi. Nie stwierdzono unikatowych uszkodzeń histopatologicznych u myszy immunizowanych AN1782 w porównaniu z myszami leczonymi PBS lub nieleczonymi. Nie stwierdzono także różnic w profilu analiz chemicznych pomiędzy grupami leczonymi adiuwantem a zwierzętami leczonymi PBS w przykładzie 7. Jakkolwiek zaobserwowano znaczne wzrosty kilku parametrów hematologicznych pomiędzy zwierzętami leczonymi AN1792 z adiuwantem Freunda w przykładzie 7 w porównaniu do zwierząt leczonych PBS, ale ten typ działania był oczekiwany z leczenia adiuwantem Freunda i towarzyszącego mu zapalenia otrzewnej i nie wskazuje na jakiekolwiek niekorzystne działanie leczenia AN1792. Szczegółowe badania patologii mózgów myszy PDAPP wykonano nie jako część oceny toksykologicznej, ale jako część punktów końcowych badania skuteczności. W żadnym z tych badań nie stwierdzono jakichkolwiek oznak niekorzystnego działania na morfologię mózgu. Wyniki te wskazują, że leczenie AN1792 jest dobrze tolerowane i przynajmniej w znacznym stopniu pozbawione skutków ubocznych.
XI. Profilaktyka i leczenie pacjentów
Przeprowadzono I fazę prób z pojedynczą dawką, aby oznaczyć bezpieczeństwo. Środek leczniczy podawano w wzrastających dawkach różnym pacjentom zaczynając od dawki około 0,01, poziomu o przypuszczalnej skuteczności, i zwiększano ją 3-krotnie do czasu gdy poziom osiągnął 10-krotność skutecznej mysiej dawki.
Badania fazy II prób przeprowadzono, by oznaczyć skuteczność leczniczą. Wybrano pacjentów we wczesnej do średniej fazie choroby Alzheimera, z użyciem kryterium Alzheimer's disease and Related Disorders Association (ADRDA) na prawdopodobieństwo AD. Odpowiedni pacjenci lokowali się w zakresie 12-26 w badaniach Mini-Mental State Exam (MMSE). Innymi kryteriami wyboru było to, że pacjenci są w stanie przeżyć czas trwania testu oraz brak komplikujących danych, takich jak równoczesne stosowanie leków, które mogą wpływać na leczenie. Podstawową ocenę funkcjonowania pacjentów wykonano z użyciem klasycznych pomiarów psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, które stanowią ogólną skalę oceny stanu i działania pacjentów z chorobą Alzheimera. Te skale psychometryczne dostarczają miary postępu stanu choroby Alzheimera. Do monitorowania leczenia można także zastosować odpowiednie skale jakości życia. Postęp choroby można także monitorować metodą MRI. Można także monitorować profile krwi pacjentów, włącznie z testami dla specyficznych dla antygenu odpowiedzi przeciwciał i komórek T.
Po podstawowych pomiarach pacjentów zaczęto poddawać leczenie. Losowo podzielono ich i leczono środkiem leczniczym lub placebo. Pacjentów monitorowano co najmniej 6 miesięcy. Skuteczność oznaczono jako znaczne zmniejszenie postępu w grupie leczonej względem grupy placebo.
Drugą fazę II próby przeprowadzono w celu oceny przejścia pacjentów z nie-Alzheimerowskiej wczesnej utraty pamięci, czasami nazywanej upośledzeniem pamięci związanym z wiekiem (AAMI), do prawdopodobnej choroby Alzheimera, określanej na podstawie kryterium ADRDA. Wybrano pacjentów z wysokim ryzykiem przejścia do choroby Alzheimera z nieklinicznej populacji, przeszukując populacje odniesienia pod względem wczesnych oznak utraty pamięci lub innych trudności związanych z przed-Alzheimerowskimi objawami, historii rodzinnej choroby Alzheimera, genetycznych czynników ryzyka, wieku, płci oraz innych cech, które wskazują wysokie ryzyko choroby Alzheimera. Zebrano punkty podstawowe odpowiednich miar włącznie z MMSE i ADAS, razem z innymi miernikami zaprojektowanymi do oceny bardziej normalnej populacji. Populacje tych pacjentów podzielono na dwie odpowiednie grupy z porównaniem placebo wobec wariantów dawek środka. Losy pacjentów z tych populacji śledzono z przerwami około sześciomiesięcznymi, a końcowym punktem dla każdego pacjenta było, czy na koniec obserwacji osoba ta przejdzie do fazy prawdopodobnej choroby Alzheimera oznaczonej na podstawie kryterium ADRDA.
XII. Ogólne materiały i metody
1. Pomiary miana przeciwciał
Od myszy pobrano krew robiąc niewielkie nakłucie w żyle ogonowej i zebrano około 200 gl krwi do probówki mikrowirówkowej. Od świnek morskich pobrano krew przez wygolenie najpierw okolicy tylnego golenia, a następnie nakłucie za pomocą igły nr 18 żyły śródstopowej i zebranie krwi do probówek mikrowirówkowych. Krew zostawiono do skrzepnięcia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), zworteksowano, a następnie odwirowano przy 14000 x g przez 10 minut, aby oddzielić skrzep od surowicy. Surowicę przeniesiono do czystych probówek mikrowirówkowych i przechowywano w 4°C do czasu oznaczania miana.
PL 202 698 B1
Miana przeciwciał zmierzono metodą ELISA. 96-studzienkowe płytki do mikromianowania (płytki Costar EIA) powleczono 100 gl roztworu zawierającego 10 gg/ml Ae42 lub SAPP albo innych antygenów, jak wskazano w każdym z poszczególnych przypadków, w buforze Well Coating Buffer (0,1 M fosforan sodu, pH 8,5, 0,1% azydek sodu) i trzymano przez noc w RT. Z płytek odessano płyn i dodano surowicę do studzienek, zaczynając od rozcieńczenia 1/100 w Specimen Diluent (0,014 M fosforan sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% surowiczej albuminy bydlęcej, 0,05% tymerozalu). Bezpośrednio na płytkach wykonano 7 kolejnych 3-krotnych rozcieńczeń próbek, tak by osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1/218700. Rozcieńczone preparaty inkubowano w powleczonych studzienkach na płytce przez 1 godzinę w RT. Następnie płytki przemyto 4-krotnie za pomocą PBS zawierającej 0,05% Tween 20. Następnie dodano do studzienek drugie przeciwciało, kozie przeciwmysiej Ig, sprzężone z peroksydazą chrzanową (otrzymane z Boehringer Mannheim), w ilości 100 gl rozcieńczenia 1/3000 w Specimen Diluent i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Płytki ponownie przemyto 4-krotnie za pomocą PBS, Tween 20. Aby wywołać chromogen do każdej studzienki dodano 100 gl Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna otrzymana z Pierce Chemicals) i inkubowano przez 15 minut w RT. Reakcję zatrzymano przez dodanie 25 gl 2M H2SO4. Następnie odczytano intensywność barwy w Molecular Devices Vmax przy 450 nm-650 nm.
Miana zdefiniowano jako odwrotność rozcieńczenia surowicy wywołującego połowę maksymalnego OD. Zazwyczaj maksymalne OD odczytywano z początkowego rozcieńczenia 1/100, z wyjątkiem przypadków bardzo wysokich mian, przy których niezbędne było większe początkowe rozcieńczenie do ustalenia maksymalnej OD. Jeżeli punkt 50% znajdował się pomiędzy dwoma rozcieńczeniami, wykonywano liniową ekstrapolację aby wyznaczyć końcowe miano. Aby policzyć średnią geometryczną mian przeciwciał, miana niższe niż 100 były umownie oznaczane jako wartość miana 25.
2. Test proliferacji limfocytów
Myszy uśpiono izofluranem. Śledziony usunięto i przepłukano dwukrotnie w 5 ml PBS zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (PBS-FBS), zhomogenizowano w 50 g Centricon Unit (Dako A/S, Denmark) w 1,5 ml PBS-FBS przez 10 sekund przy 10 rpm w Medimachine (Dako), a następnie przefiltrowano przez nylonowe sito o średnicy porów 100 g. Limfocyty śledzionowe przemyto jeden raz 15 ml PBS-FBS, następnie osadzono przez wirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Czerwone krwinki zlizowano zawieszając osad w 5 ml buforu zawierającego 0,15 M NH4CI, 1M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7.4 przez 5 minut w RT. Następnie leukocyty przemyto w sposób opisany powyżej. Świeżo wyizolowane komórki śledzionowe (105 na studzienkę) hodowano w 3 powtórzeniach zestawów w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania, do hodowli tkankowych, o dnie w kształcie litery U (Corning, Cambridge, MA) w pożywce RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wzbogaconej 2.05 ml L-glutaminy, 1% penicyliną/streptomycyną oraz 10% inaktywowaną termicznie FBS, przez 96 godzin w 37°C. Dodawano także różne peptydy Ae, Ae1-16, Ae1-40, Ae1-42 lub o odwrotnej sekwencji aminokwasowej Ae40-1, w dawkach wynoszących od 5 gM do 0,18 gM w czterech etapach. Komórki w studzienkach kontrolnych hodowano z konkanawaliną A (Con A) (Sigma, nr katalogowy C-5275, w stężeniu 1 gg/ml) bez dodawania białka. Do komórek na ostatnie 24 godziny dodano 3H-tymidynę (1 gCi/studzienkę uzyskanej z Amersham Corp., Arlington Heights IL). Następnie komórki zebrano na płytki UniFilter i zmierzono radioaktywność licznikiem Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Wyniki wyrażono jako impulsy na minutę (cpm) radioaktywności włączonej do nierozpuszczalnych makrocząsteczek.
4. Preparowanie tkanek mózgowych
Po uśmierceniu zwierząt mózgi usunięto i jedną półkulę przygotowano do analizy immunohistochemicznej, a z drugiej półkuli wypreparowano 3 regiony mózgu (hipokamp, korę i móżdżek) i zastosowano do zmierzenia stężeń różnych białek Ae i form APP metodą specyficznych testów ELISA (Johnson-Wood i inni, supra).
Tkanki przeznaczone do testów ELISA zhomogenizowano w 10 objętościach lodowatego buforu guanidynowego (5,0 M guanidyna-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogentay zmieszano przez delikatne wstrząsanie w aparacie Adams Nutator (Fisher) przez 3-4 godziny w RT i przechowywano w -20°C przed oznaczeniem Ae i APP. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że preparaty analityczne były stabilne w tych warunkach przechowywania, oraz że syntetyczne białko Ae (Bachem) można ilościowo odzyskać po wkłuciu homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej z miotów mysich (Johnson-Wood i inni, supra).
PL 202 698 B1
5. Pomiar poziomów Ae
Homogenaty mózgu rozcieńczono w stosunku 1:10 lodowatym Casein Diluent (0,25% kazeina, PBS, 0,05% azydek sodu, 20 μg/ml aprotyniny, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 μg/ml leupeptyny), a następnie odwirowano przy 16000 x g przez 20 minut w 4°C. Wzorce syntetycznego peptydu Ae (aminokwasy 1-42) i wzorce APP przygotowano tak, by zawierały 0,5 M guanidynę i 0,1% surowiczą albuminę bydlęcą (BSA) i ostatecznym preparacie. W teście kanapkowym ELISA „całkowitego Ae stosowano monoklonalne przeciwciała (mAe) 266, specyficzne dla aminokwasów 13-28 Ae (Seubert i inni) jako przeciwciało wychwytujące oraz biotynylowane mAe 3D6, specyficzne dla aminokwasów 1-5 Ae (Johnson-Wood i inni) jako przeciwciało reporterowe. 3D6 mAe nie rozpoznaje wydzielanej APP ani pełnej długości APP, ale wykrywa tylko Ae z N-końcowym kwasem asparaginowym. Test ten ma niższą granicę czułości ~50 pg/ml (11 pM) i nie wykazuje reaktywności krzyżowej z endogennym mysim białkiem Ae w stężeniach do 1 ng/ml (Johnson-Wood i inni, supra).
W specyficznym dla Ae1-42 kanapkowym teście ELISA stosuje się mAe 21F12, specyficzne dla aminokwasów 33-42 Ae (Johnson-Wood i inni) jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane mAe 3D6 jest także przeciwciałem reporterowym w tym teście, który ma niższą granicę czułości, wynoszącą około 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood i inni). Do testów Ae ELISA studzienki 96-studzienkowych płytek do immunotestów (Costar) powlekano 100 μl mAe 266 (w stężeniu 10 μg/ml) lub mAe 21F12 (w stężeniu 5 μg/ml) z inkubowaniem przez noc w RT. Roztwór usunięto przez odessanie i studzienki zablokowano przez dodanie 200 μl 0,25% surowiczej albuminy ludzkiej w buforze PBS na co najmniej 1 godzinę w RT. Roztwór blokujący usunięto i płytki przechowywano wysuszone w 4°C do czasu zastosowania. Płytki przed użyciem nawodniono buforem Wash Buffer [sól buforowana Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05% Tweed 20]. Próbki i wzorce dodano w trzech powtórzeniach równych części po 100 μl na studzienkę, a następnie inkubowano przez noc w 4°C. Płytki przemywano co najmniej 3-krotnie buforem Wash Buffer pomiędzy każdym z etapów testu. Dodano biotynylowane mAe 3D6, rozcieńczone do 0,5 nl/ml w buforze Casein Assay Buffer (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w RT. Koniugat awidynaperoksydaza chrzanowa (Avidin-HRP uzyskana z Vector, Burlingame, CA) rozcieńczony 1:4000 w Casein Assay Buffer dodano na 1 godzinę w TP. Dodano kolorymetryczny substrat, Slow TMBELISA (Pierce) i pozostawiono do reakcji przez 15 minut w RT, po czym reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 25 μl 2N H2SO4. Produkt reakcji oznaczono stosując Molecular Devices Vmax mierzący różnicę absorpcji przy 450 nm i 650 nm.
6. Pomiar poziomów APP
Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, nazwany APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APPalfa (a), jak i formy APP pełnej długości (FL). Drugi test rozpoznaje tylko APP-α. Test APP-a/FL rozpoznaje wydzielaną postać APP włącznie z pierwszymi 12 aminokwasami Ae. Ponieważ przeciwciało reporterowe (2H3) nie jest specyficzne dla miejsca α-klamerki, występującego pomiędzy 612-613 aminokwasem APP695 (Esch i inni, Science 248, 1122-1124 (1990)), test ten rozpoznaje również pełne długości APP (APP-FL). Wstępne doświadczenia z immobilizowanymi przeciwciałami APP przeciw cytoplastycznemu ogonowi APP-FL, w celu usunięcia APP-FL z homogenatów mózgowych zasugerowały, że około 30-40% APP-a/FL APP jest FL (dane nie prezentowane). Przeciwciałem wychwytującym w obu testach APP-a/FL i APP-a jest mAP 8E5 wytworzone przeciw aminokwasom 444 do 592 formy APP695 (Games i inni, supra). Reporterowym mAe dla testu APP-a/FL jest mAe 2H3, specyficzne dla aminokwasów 597-608 formy APP695 (Johnson-Wood i inni, supra), a przeciwciałem reporterowym dla testu APP-a jest biotynylowana pochodna mAe 16H9, wytworzona przeciw aminokwasom 605 do 611 APP. Niższa granica czułości testu APP-a/FL wynosi 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood i inni), a testu specyficznego dla APP-a wynosi 22 ng/ml (0,3 nM). Dla obydwu testów APP studzienki 96-studzienkowych płytek EIA powlekano mAP 8E5, jak opisano powyżej dla mAe 266. Oczyszczone, zrekombinowane wydzielane APP-a zastosowano jako wzorzec do testu APP-a i testu APP-a/FL (Esch i inni, supra). Próbki homogenatu mózgu w 5 M guanidynie rozcieńczono 1:10 w ELISA Specimen Diluent (0,014 M bufor fosforanowy, pH 7,4, 0,6% surowicza albumina bydlęca, 0,05% tymerozal, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Następnie rozcieńczono je 1:4 w Specimen Diluent zawierającym 0,5 M guanidynę. Rozcieńczone homogenaty odwirowano przy 16000 x g przez 15 sekund w RT. Wzorce APP i próbki dodano do płytek w dwóch powtórzeniach tych samych ilości i inkubowano przez 1,5 godziny w RT. Biotynylowane przeciwciała reporterowe 2H3 i 16H9 inkubowano z próbkami przez 1 godzinę w RT. Streptawidynę-alkaliczną fosfatazę (Boehringer Mannheim) rozcieńczoną 1:1000 w Specimen Diluent inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w RT. Dodano fluorescencyjnego
PL 202 698 B1 substratu, fosforanu 4-metylo-umbeliferylu i inkubowano 30 minut w RT, a następnie płytki odczytano w fluorymetrze Cytofluor tm 2350 (Millipore) przy 365 nm pobudzenia i 450 nm emisji.
7. Immunohistochemia
Mózgi utrwalano przez 3 dni w 4°C w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie przechowywano 1-7 dni w 4°C w 1% paraformaldehydzie, PBS przed pocięciem na skrawki. Wieńcowe skrawki histologiczne o grubości 40 mikronów cięto na wibratomie w RT i przechowywano w buforze chroniącym przed zamarznięciem (30% gliceryna, 30% glikol etylenowy w buforze fosforanowym) w -20°C przed obróbką immunohistochemiczną. Dla każdego mózgu 6 fragmentów na poziomie hipokampu grzbietowego, każdy oddzielony kolejnymi 240 μm przerwami, inkubowano przez noc z jednym z następujących przeciwciał: (1) biotynylowanym przeciw-Ae (mAe, 3D6, specyficznym dla ludzkiego Ae) rozcieńczonym do stężenia 2 μg/ml w PBS i 1% surowicy końskiej; lub (2) biotynylowanym mAe, specyficznym dla ludzkiego APP, 8E5, rozcieńczonym do stężenia 3 μg/ml w PBS i 1,0% surowicy końskiej; lub (3) mAe specyficznym dla glejowego włókienkowego białka kwasowego (GFAP; Sigma Chemical Co.) rozcieńczonym 1:500 w 0,25% Triton X-100 i 1% surowicy końskiej w soli buforowanej Trisem, pH 7,4 (TBS); lub (4) mAe specyficznym dla CD11b, antygenu MAC-1, (Chemicon International) rozcieńczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (5) mAe specyficznym dla antygenu MHC II, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (6) szczurzym mAe specyficznym dla CD 43, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (7) szczurzym mAe specyficznym dla CD 45RA, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (8) szczurzym monoklonalnym Ae specyficznym dla CD 45RB, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (9) szczurzym monoklonalnym Ae specyficznym dla CD 45, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (10) biotynylowanym chomiczym poliklonalnym Ae specyficznym dla CD3e, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (11) szczurzym mAe specyficznym dla CD3, (Serotec) rozcieńczonym w stosunku 1:200 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub z (12) roztworem PBS nie zawierającym pierwotnych przeciwciał, zawierającym 1% normalną surowicę końską.
Skrawki histologiczne poddane działaniu roztworów przeciwciał wymienionych w 1, 2 i 6-12 powyżej wcześniej traktowano roztworem 1,0% Triton X-100, 0,4% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 minut w RT aby zablokować endogenne peroksydazy. Następnie inkubowano je przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwciałami. Skrawki poddane działaniu 3D6 lub 8E5 lub CD3e mAe następnie poddano przez 1 godzinę w RT reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze składnikami zestawu „A i „B rozcieńczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Skrawki poddane działaniu przeciwciał specyficznych dla CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i roztworem PBS pozbawionym pierwotnych przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT odpowiednio z biotynylowanymi przeciwciałami przeciw-szczurzym IgG (Vector) rozcieńczonymi 1:75 w PBS lub biotynylowanymi przeciwciałami przeciw-mysim IgG (Vector) rozcieńczonymi 1:75 w PBS. Następnie skrawki przez 1 godzinę w RT reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidynabiotyna ze składnikami zestawu „A i „B rozcieńczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).
Skrawki wywołano w 0,01% nadtlenku wodoru, 0,05% 3,3'-diaminobenzydynie (DAB) w RT. Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwciałami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wcześniej traktowano 0,6% nadtlenkiem wodoru w RT aby zablokować endogenne peroksydazy, a następnie inkubowano przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwciałami. Skrawki poddane działaniu przeciwciała GFAP inkubowano 1 godzinę w RT z biotynylowanymi przeciwciałami przeciwmysiej IgG, wytworzonymi u koni (Vector Laboratories; zestaw Vectastain Elite ABC Kit) rozcieńczonymi 1:200 w TBS. Następnie skrawki inkubowano przez 1 godzinę z kompleksem peroksydaza-awidyna-biotyna (Vector Laboratories; \/ectastain Elite ABC Kit) rozcieńczonym 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami mAe specyficznymi dla MAC-1 i MHC Il jako pierwotnymi przeciwciałami kolejno poddano reakcji przez 1 godzinę w RT z biotynylowanymi przeciwciałami przeciw-szczurzym IgG wytworzonymi w królikach, rozcieńczonymi 1:200 w TBS, następnie inkubowane przez 1 godzinę z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna rozcieńczonym 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wywołano inkubując je w RT z 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu, TBS odpowiednio przez 4 i 11 minut.
PL 202 698 B1
Wyznakowane immunologicznie skrawki umieszczono na szklanych szkiełkach przedmiotowych (VWR, Superfrost slides), wysuszono na powietrzu przez noc, zanurzono w Propar (Anatech) i nałożono na nie szkiełka nakrywkowe stosując Permount (Fisher) jako środek osadzający.
Aby przeciwnie wybarwić płytki Ap podzestaw GFAP-dodatnich skrawków umieszczono na szkiełkach przedmiotowych Superfrost i inkubowano w wodnej 1% Thioflavin S (Sigma) przez 7 minut po obróbce immunohistochemicznej. Następnie skrawki odwodniono i oczyszczono w Propar, po czym nałożono na nie szkiełka nakrywkowe osadzając je z użyciem Permount.
8. Analiza obrazu
Do oceny ilościowej immunoreaktywnych skrawków zastosowano Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) sprzężony z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę wideo CCD i monitor Sony Trinitron. Obraz skrawków był przechowywany w buforze wideo i oznaczono próg koloru i nasycenia aby wybrać i policzyć całkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie struktury. Dla każdego skrawka hipokamp obrysowano ręcznie i obliczono całkowity obszar pikseli zajmowany przez hipokamp. Procent obciążenia amyloidem zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawierająca złogi Ap immunoreaktywne z mAp 3D6) x 100. Podobnie procent obciążenia neurytycznego zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawierająca dystroficzne neuryty reagujące z mAp 8E5) x100. C-Imaging System (Comprix, Inc., Cranberry Township, PA) wykorzystujący program Simple 32 Software Application połączono z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę Optronics i zastosowano do ilościowej oceny procentu kory pozamodzelowatej zajętej przez GFAP-dodatnie astrocyty i MAC-1- i MHC II-dodatni mikroglej. Obraz immunoreaktywnych skrawków przechowywano w buforze wideo i wyznaczono próg monochromatyczny, aby wybrać i policzyć całkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie komórki. Dla każdego skrawka korę pozamodzelowatą (RSC) ręcznie obrysowano i obliczono całkowity obszar pikseli zajmowany przez RSC. Procent astrocytozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSC zajmowana przez GFAP-reaktywne astrocyty) x 100. Podobnie procent mikroglejozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSc zajmowana przez mikroglej reaktywny z MAC-1 i MHC II) x 100. Do wszystkich analiz obrazu 6 skrawków na poziomie hipokampu grzbietowego, każdy oddzielony kolejnymi 240 pm przerwami, oznaczono ilościowo dla każdego zwierzęcia. We wszystkich przypadkach status leczniczy zwierząt nie był znany obserwatorowi.
Jakkolwiek powyższy wynalazek opisano szczegółowo w celu jego wyjaśnienia i zrozumienia, oczywiste jest, że dokonać można pewnych modyfikacji w ramach zakresu załączonych zastrzeżeń. Wszystkie cytowane publikacje i dokumenty patentowe wprowadza się niniejszym w całości jako odnośniki we wszystkich celach w stopniu, w jakim zostały one wymienione.
T a b e l a 1. Miana przy 50% O.D.
Myszy, którym wstrzykiwano zagregowany Ap
Wiek PDAPP mysz 100 mysz 101 mysz 102 mysz 103 mysz 104 mysz 105 mysz 106 mysz 107 mysz 108
4 70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 80000 100000
6 15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000
8 20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000
10 40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000
12 25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000
Myszy, którym wstrzykiwano PBS z dwoma immunogenami w 1/100
Wiek PDAPP mysz 113 mysz 114 mysz 115 mysz 116 mysz 117
6 <4x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg
10 5x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg
12 <4x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg <4x bkg
PL 202 698 B1

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z Ae i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym izotyp tego przeciwciała stanowi ludzkie IgG1.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało stanowi monoklonalne przeciwciało.
  3. 3. Zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała, które specyficznie wiąże się z Ae, gdzie izotyp przeciwciała stanowi ludzkie IgG1, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera u pacjenta, przy czym złogi amyloidowe zawierają zagregowany peptyd Ae.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym przeciwciało stanowi monoklonalne przeciwciało.
  5. 5. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym pacjentem jest człowiek.
  6. 6. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4 do wytwarzania leku do profilaktyki choroby Alzheimera u pacjenta, w którym u pacjenta nie występują objawy.
  7. 7. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym pacjent ma mniej niż 50 lat.
  8. 8. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym pacjent ma odziedziczone czynniki ryzyka wskazujące podatność na chorobę Alzheimera.
  9. 9. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym pacjent nie ma znanych czynników ryzyka choroby Alzheimera.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym lek podaje się doustnie, podskórnie, domięśniowo, miejscowo lub dożylnie.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym lek podaje się domięśniowo lub podskórnie.
  12. 12. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, w którym pacjent jest monitorowany pod względem odpowiedzi immunologicznej.
PL384503A 1997-12-02 1998-11-30 Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała PL202698B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6774097P 1997-12-02 1997-12-02
US8097098P 1998-04-07 1998-04-07
PCT/US1998/025386 WO1999027944A1 (en) 1997-12-02 1998-11-30 Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL202698B1 true PL202698B1 (pl) 2009-07-31

Family

ID=26748211

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384504A PL202706B1 (pl) 1997-12-02 1998-11-30 Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie immunogennego środka połączonego z cząsteczką nośnika
PL384503A PL202698B1 (pl) 1997-12-02 1998-11-30 Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384504A PL202706B1 (pl) 1997-12-02 1998-11-30 Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie immunogennego środka połączonego z cząsteczką nośnika

Country Status (38)

Country Link
US (26) US20040171816A1 (pl)
EP (5) EP1033996B1 (pl)
JP (4) JP4677094B2 (pl)
KR (3) KR20120135915A (pl)
CN (1) CN100374151C (pl)
AR (1) AR020050A1 (pl)
AT (4) ATE493149T1 (pl)
AU (1) AU1706199A (pl)
BG (1) BG104562A (pl)
BR (1) BR9815357A (pl)
CA (1) CA2312920C (pl)
CO (1) CO4980846A1 (pl)
CY (3) CY1108331T1 (pl)
CZ (1) CZ303137B6 (pl)
DE (7) DE69840969D1 (pl)
DK (4) DK1033996T3 (pl)
EA (3) EA200000608A1 (pl)
EE (1) EE05377B1 (pl)
ES (4) ES2263408T3 (pl)
GE (2) GEP20053715B (pl)
HK (2) HK1095265A1 (pl)
HR (2) HRP20000443B1 (pl)
HU (2) HU228493B1 (pl)
ID (1) ID25504A (pl)
IL (5) IL136252A0 (pl)
IS (1) IS5500A (pl)
MY (1) MY134906A (pl)
NO (3) NO328865B1 (pl)
NZ (1) NZ504569A (pl)
PE (1) PE20001383A1 (pl)
PL (2) PL202706B1 (pl)
PT (4) PT1994937E (pl)
SA (1) SA99191269B1 (pl)
SG (1) SG111083A1 (pl)
SI (4) SI1033996T1 (pl)
TR (1) TR200001608T2 (pl)
TW (1) TWI239847B (pl)
WO (1) WO1999027944A1 (pl)

Families Citing this family (295)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0866805A1 (en) 1995-12-12 1998-09-30 Karolinska Innovations AB PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6703015B1 (en) 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
WO1999060024A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 The University Of Tennessee Research Corporation Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US7060670B1 (en) 1999-05-05 2006-06-13 Neurochem (International) Limited Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof
KR100863367B1 (ko) 1999-05-13 2008-10-13 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제 배합 제형물
AU2008203784B2 (en) * 1999-05-28 2012-01-19 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
AU2005202644B2 (en) * 1999-06-01 2009-03-05 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) * 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
AU780474B2 (en) 1999-06-16 2005-03-24 Boston Biomedical Research Institute Incorporated Immunological control of beta-amyloid levels in vivo
US6919075B1 (en) * 1999-09-03 2005-07-19 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Bacteriophage displaying aβ epitopes and method of use
US7384640B1 (en) 1999-09-30 2008-06-10 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
US20070135337A2 (en) * 1999-11-29 2007-06-14 Neurochem (International) Limited Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1752472A3 (en) * 1999-12-08 2007-04-25 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
WO2001042306A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Mindset Biopharmaceuticals (Usa), Inc. Chimeric peptides (short b-cell epitope joined to a t-cell epitope) and their use for immunization
MXPA02007796A (es) 2000-02-21 2003-12-08 Pharmexa As Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides.
ATE306933T1 (de) * 2000-02-21 2005-11-15 Pharmexa As Verfahren zur herabregulierung von amyloid
MXPA02008145A (es) * 2000-02-24 2004-04-05 Univ Washington Anticuerpos humanizados que secuestran al peptido beta amiloide.
CA2404237C (en) 2000-04-05 2010-01-26 University Of Tennessee Research Corporation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
DE60108111T2 (de) 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP2003516929A (ja) * 2000-06-01 2003-05-20 ニユーララブ・リミテツド アミロイド形成性疾患の予防および治療
US7371920B2 (en) 2000-06-20 2008-05-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic mouse model of neurodegenerative disorders
DK1292187T3 (da) 2000-06-20 2006-08-21 Univ Toronto Transgen dyremodel for neurodegenerative lidelser
DK1294892T3 (da) 2000-06-23 2008-01-28 Wyeth Corp Aggregering af vildtype- og kimære influenzaviruslignende partikler (VLP'er)
AU2001268828C1 (en) 2000-06-28 2006-12-14 Prana Biotechnology Limited Neurotoxic oligomers
EP1309341A2 (en) * 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
AU2007200047B2 (en) * 2000-07-07 2009-11-26 Bioarctic Neuroscience Ab Prevention and treatment of Alzheimer's disease
DE60139788D1 (de) * 2000-09-06 2009-10-15 Aventis Pharma Sa Verfahren und zusammensetzungen für amyloidosis-verbundene krankheiten
AU1225702A (en) * 2000-09-19 2002-04-02 Evotec Neurosciences Gmbh Methods and compounds for treating brain amyloidosis
IL139308A0 (en) * 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
CN1533285A (zh) 2000-11-10 2004-09-29 ���Ͽع����޹�˾ 佐剂组合制剂
EP1346036B1 (en) 2000-11-29 2010-04-28 University of Rochester Helper virus-free herpes virus amplicon particles and uses thereof
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
ATE501161T1 (de) 2000-12-28 2011-03-15 Wyeth Llc Rekombinantes schutzprotein aus streptococcus pneumoniae
US7320793B2 (en) 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
US8092791B2 (en) 2001-05-23 2012-01-10 University Of Rochester Method of producing herpes simplex virus amplicons, resulting amplicons, and their use
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
KR100898648B1 (ko) 2001-06-07 2009-05-22 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제로서 콜레라 홀로톡신의 돌연변이체 형태
CN1541111A (zh) 2001-06-07 2004-10-27 ���Ͽع����޹�˾ 作为佐剂的霍乱全毒素的突变形式
US7829087B2 (en) 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
AU2002312566A1 (en) 2001-07-09 2003-01-29 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
WO2003016467A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
ES2391905T3 (es) 2001-08-17 2012-11-30 Washington University Método de ensayo para la enfermedad de alzheimer
US20040192898A1 (en) * 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
EP1416965B8 (en) * 2001-08-17 2008-02-13 Washington University Assay method for alzheimer's disease
WO2003015691A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030082191A1 (en) * 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
AU2002357007A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-10 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID Beta, PRION PROTEIN, AMYLIN, Alpha-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
US20040052928A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Ehud Gazit Peptides and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
WO2005000193A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 Tel Aviv University Future Technology Development L.P. Peptides antibodies directed thereagainst and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20040001848A1 (en) * 2002-03-01 2004-01-01 Szu-Yi Chou Method of producing disease-specific antigens
CA2477675C (en) * 2002-03-05 2013-05-21 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the .beta.-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20040091945A1 (en) * 2002-07-17 2004-05-13 Cheryl Fitzer-Attas Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against Alzheimer's Disease
WO2004016282A1 (en) 2002-07-19 2004-02-26 Cytos Biotechnology Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
US7252953B2 (en) 2002-08-13 2007-08-07 United States Of America Department Of Veterans Affairs Method of detecting and preventing Alzheimer's disease, particularly at prodromal and early stages
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US9535076B2 (en) 2002-09-12 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
DE60336848D1 (de) 2002-09-12 2011-06-01 Univ California Immunogene und entsprechende antikörper, die spezifisch sind für häufige hochmolekulare aggregations-zwischenprodukte von amyloiden aus proteinen unterschiedlicher sequenz
MXPA05003621A (es) * 2002-10-09 2005-10-19 Rinat Neuroscience Corp Metodos de tratamiento de la enfermedad de alzheimer usando anticuerpos dirigidos contra el peptido beta amiloide y composiciones de los mismos.
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
CN100450551C (zh) * 2002-11-29 2009-01-14 中国医学科学院基础医学研究所 用于治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途
WO2004056318A2 (en) 2002-12-19 2004-07-08 New York University Method for treating amyloid disease
DE10303974A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CA2513722A1 (en) 2003-02-01 2004-08-19 Neuralab Limited Active immunization to generate antibodies to soluble a-beta
EP1592709A2 (en) * 2003-02-10 2005-11-09 TO-BBB Holding B.V. Differentially expressed nucleic acids in the blood-brain barrier under inflammatory conditions
US7575747B2 (en) 2003-02-10 2009-08-18 Applied Molecular Evolution Aβ binding molecules
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
CA2519511A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
KR100546066B1 (ko) * 2003-03-21 2006-01-26 한국생명공학연구원 베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물
US7632816B2 (en) * 2003-03-28 2009-12-15 New York University Treatment of Alzheimer amyloid deposition
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP4888876B2 (ja) * 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
WO2005014041A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
WO2005046605A2 (en) * 2003-11-07 2005-05-26 University Of Rochester Compositions and methods of treating neurological diseases
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
SG149039A1 (en) * 2003-12-17 2009-01-29 Elan Pharm Inc Ass IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
US20050225165A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Naik Sanjeev M Brake by-wire control system
AU2005235271A1 (en) 2004-04-26 2005-11-03 Innate Pharma Adjuvant composition and methods for its use
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
AU2005259991B2 (en) * 2004-06-25 2011-05-26 Id Biomedical Corporation Of Quebec Compositions and methods for treating neurological disorders
US7955812B2 (en) 2004-07-19 2011-06-07 The General Hospital Corporation Methods of diagnosing alzheimer's disease by detecting antibodies to cross-linked β-amyloid oligomers
WO2006036291A2 (en) * 2004-07-30 2006-04-06 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
CA2576405A1 (en) 2004-08-11 2006-02-16 Mitsubishi Chemical Corporation Antibody and utilization of the same
CA2582157A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Wyeth Methods and compositions for improving recombinant protein production
WO2006044666A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Northeastern University Detection of disease associated proteolysis by direct mass spectrometry analysis of low molecular weight peptides
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
US20060257396A1 (en) * 2004-12-15 2006-11-16 Jacobsen Jack S Abeta antibodies for use in improving cognition
EP1838348B1 (en) 2004-12-15 2013-06-26 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
AU2006211625A1 (en) * 2005-01-14 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting drusen formation and for diagnosing or treating drusen-related disorders
CA2589860A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
EP1841456A2 (en) * 2005-01-28 2007-10-10 Wyeth Stabilized liquid polypeptide formulations
WO2006112553A2 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dnavec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating alzheimer's disease
CN101228272A (zh) * 2005-04-20 2008-07-23 生物载体株式会社 用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗
PE20061323A1 (es) * 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
WO2006119352A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 University Of South Florida Method of treating cognitive decline and synaptic loss related to alzheimer's disease
ATE535252T1 (de) 2005-05-05 2011-12-15 Merck Sharp & Dohme Peptid-konjugat-zusammensetzungen und -verfahren zur prävention und behandlung von alzheimer- krankheit
WO2006126682A1 (ja) * 2005-05-27 2006-11-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン
CA2611816C (en) 2005-06-17 2014-05-27 Wyeth Methods of purifying fc region containing proteins
US7830955B2 (en) 2005-07-10 2010-11-09 Adaptive Spectrum & Signal Alignment, Inc. Adaptive margin and band control
WO2007056401A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of osbp useful for treating alzheimer's disease
JP2009517406A (ja) * 2005-11-28 2009-04-30 ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド Il−21受容体アンタゴニスト
EP1963369B1 (en) * 2005-11-28 2013-05-15 Zymogenetics, Inc. Il-21 antagonists
PL1976877T5 (pl) 2005-11-30 2017-09-29 Abbvie Inc Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku amyloidu beta oraz ich zastosowania
CN117903302A (zh) 2005-11-30 2024-04-19 Abbvie 公司 抗-Aβ球聚体抗体,其相关产品,生产所述抗体的方法,所述抗体的应用以及使用方法
WO2007067512A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of adprh useful for treating alzheimer's disease
NO345996B1 (no) * 2005-12-12 2021-12-13 Ac Immune Sa A beta 1-42-spesifikke monoklonale antistoffer med terapeutiske egenskaper.
PE20100684A1 (es) 2005-12-12 2010-10-04 Hoffmann La Roche Anticuerpo anti b-4-amiloide que contiene asparagina glicosilada en la region variable de vh
CN101421299A (zh) * 2006-02-22 2009-04-29 株式会社林原生物化学研究所 用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗
CA2630344C (en) 2006-03-23 2015-04-28 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US7479550B2 (en) 2006-06-02 2009-01-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Amyloid β gene vaccines
AU2007275467B2 (en) * 2006-07-14 2013-12-05 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
WO2008021296A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Thymon, L.L.C. Compositions and methods for the treatment and prophylaxis of alzheimer's disease
EP2076287A2 (en) * 2006-10-12 2009-07-08 Wyeth Methods and compositions with reduced opalescence
US8188046B2 (en) * 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
US20080214987A1 (en) 2006-12-22 2008-09-04 Nanomed Devices, Inc. Microdevice And Method For Transdermal Delivery And Sampling Of Active Substances
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
PT2436696T (pt) 2007-01-05 2017-08-21 Univ Zuerich Anticorpo anti-beta-amiloide e usos do mesmo
EP2104682B1 (en) 2007-01-11 2016-09-21 Michael Bacher Diagnosis and treatment of alzheimer's and other neurodementing diseases
RS53948B1 (en) 2007-01-18 2015-08-31 Eli Lilly And Company PEGILATED AMYLOID BETA FAB
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DK3067066T3 (da) 2007-02-23 2019-05-20 Prothena Biosciences Ltd Forebyggelse og behandling af synukleinopatisk og amyloidogenisk sygdom
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
ZA200905537B (en) 2007-03-01 2010-10-27 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
US20080292625A1 (en) * 2007-04-18 2008-11-27 Sally Schroeter Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
US9656991B2 (en) 2007-04-18 2017-05-23 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2012122A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
JP2010528583A (ja) * 2007-06-11 2010-08-26 エーシー イミューン ソシエテ アノニム アミロイドβに対するヒト化抗体
NZ599497A (en) * 2007-06-12 2013-11-29 Ac Immune Sa Humanized antibodies to amyloid beta
US8048420B2 (en) * 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) * 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
DK2173378T3 (da) 2007-06-27 2014-05-12 Admune Therapeutics Llc Komplekser af il-15 og il-15ralfa og anvendelser deraf
US8613920B2 (en) 2007-07-27 2013-12-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
ES2588705T3 (es) 2007-09-27 2016-11-04 Immunovaccine Technologies Inc. Uso de liposomas en un vehículo que comprende una fase hidrófoba continua para la entrega de polinucleótidos in vivo
EP2650308A3 (en) * 2007-10-05 2014-11-12 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
BRPI0818621A8 (pt) * 2007-10-05 2018-01-30 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa e a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um indivíduo, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular, para diagnosticar uma doença ocular e uma predisposição a uma doença ocular, para monitorar doença ocular, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir pressão ocular nos olhos de um indivíduo
CN101883790B (zh) 2007-10-05 2015-09-09 基因技术公司 抗淀粉样蛋白β抗体在眼病中的用途
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
CN104098695B (zh) * 2007-10-29 2018-09-07 道健康生活医药株式会社 抗体及其应用
EP2217268B1 (en) 2007-12-07 2016-05-04 ZymoGenetics, Inc. Anti-human il-21 monoclonal antibodies
EP2261254A3 (en) 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
WO2009090650A2 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Vaccine for alzheimer's disease
ES2524699T3 (es) * 2008-06-05 2014-12-11 Immunovaccine Technologies Inc. Composiciones que comprenden liposomas, un antígeno, un polinucleótido y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba
CA2736187A1 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 Id Biomedical Corporation Of Quebec Novel compositions and adjuvants
AU2009295357A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 The University Of Melbourne Alzheimer's disease biomarkers
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
JPWO2010050585A1 (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ディナベック株式会社 アルツハイマー病治療用ベクター
ES2648231T3 (es) 2008-11-05 2017-12-29 Wyeth Llc Composición inmunogénica de múltiples componentes para la prevención de la enfermedad por estreptococos beta hemolíticos (EBH)
PL2370466T3 (pl) 2008-12-19 2015-12-31 Biogen Int Neuroscience Gmbh Ludzkie autoprzeciwciała anty-alfa-synukleina
US8614297B2 (en) * 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
JP2012519300A (ja) 2009-03-02 2012-08-23 ディグニティー ヘルス 治療デバイスおよび使用方法
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
AU2010282340B2 (en) 2009-08-13 2016-12-22 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
JP5934645B2 (ja) 2009-09-11 2016-06-15 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのヘテロ環式誘導体
WO2011102901A1 (en) * 2010-02-20 2011-08-25 Ebiotec (Euroespes Biotechnology) Prevention and treatment of alzheimer's disease by amyloid beta peptide and sphingosine-1-phosphate
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
AU2011223456A1 (en) * 2010-03-03 2012-10-18 The University Of British Columbia Oligomer-specific amyloid beta epitope and antibodies
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
MX2012010470A (es) 2010-03-10 2012-10-09 Probiodrug Ag Inhibidores heterociclicos d ciclasa de glutaminilo (qc, ec .3 2. 5).
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
EP2576617B1 (en) 2010-06-04 2016-04-27 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING Aß OLIGOMERS
SG187173A1 (en) 2010-07-30 2013-02-28 Ac Immune Sa Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody
EP3527220A1 (en) 2010-08-12 2019-08-21 AC Immune S.A. Vaccine engineering
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
ES2639035T3 (es) 2010-08-23 2017-10-25 Wyeth Llc Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis
ES2585328T5 (es) 2010-09-10 2022-12-14 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis
CA2817973C (en) 2010-10-15 2019-06-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
EP2632434A1 (en) 2010-10-26 2013-09-04 AC Immune S.A. Liposome-based construct comprising a peptide modified through hydrophobic moieties
AR083885A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Univ Ramot Analogos de dipeptidos para el tratamiento de afecciones asociadas con la formacion de fibrillas amiloides
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
RU2473133C2 (ru) * 2011-03-30 2013-01-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Осетинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития РФ Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных
CA2830027C (en) 2011-03-31 2016-04-26 Pfizer Inc. Novel bicyclic pyridinones
BR112013030963B1 (pt) 2011-06-01 2020-12-01 Xiamen University proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo
WO2012172449A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Pfizer Inc. Lactams as beta secretase inhibitors
EP2723379B1 (en) 2011-06-23 2018-09-12 Biogen International Neuroscience GmbH Anti-alpha synuclein binding molecules
WO2013013056A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 New York University Method for treating amyloid disease
US9926353B2 (en) 2011-07-19 2018-03-27 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
CN102895659B (zh) * 2011-07-29 2014-10-29 复旦大学 一种防治老年痴呆症复合疫苗及其制备方法
US20150065449A1 (en) 2011-08-12 2015-03-05 Florida State University Research Foundation, Inc. Treating Amyloidoses With A Vitamin B12 Composition Including Melatonin, Resveratrol, and EGCG
WO2013025607A1 (en) * 2011-08-12 2013-02-21 The Florida State University Research Foundation Inc. Methods of treating amyloidoses with vitamin b12 and test for detecting amyloid-beta peptides
WO2013030713A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Pfizer Inc. Hexahydropyrano [3,4-d][1,3] thiazin-2-amine compounds
PT2579042E (pt) 2011-10-04 2014-09-09 Affiris Ag Método para detecção de anticorpos específicos para a numa amostra biológica.
US20140294724A1 (en) * 2011-10-24 2014-10-02 Intellect Neurosciences, Inc. Compositions and methods for treatment of proteinopathies
JP2012102131A (ja) * 2012-01-05 2012-05-31 Elan Pharma Internatl Ltd アミロイド形成性疾患の予防および治療
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
CN105693830B (zh) 2012-03-09 2021-07-06 辉瑞公司 脑膜炎双球菌组合物及其方法
JP6110937B2 (ja) 2012-05-04 2017-04-05 ファイザー・インク APP、BACE1、およびBACE2の阻害剤としての複素環式置換ヘキサヒドロピラノ[3,4−d][1,3]チアジン−2−アミン化合物
CN105732639A (zh) 2012-06-29 2016-07-06 辉瑞大药厂 作为LRRK2抑制剂的4-(取代的氨基)-7H-吡咯并〔2,3-d〕嘧啶类
WO2014045162A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Pfizer Inc. ALKYL-SUBSTITUTED HEXAHYDROPYRANO[3,4-d] [1,3]THIAZIN-2-ANIME COMPOUNDS
UA110688C2 (uk) 2012-09-21 2016-01-25 Пфайзер Інк. Біциклічні піридинони
CA2889446C (en) 2012-10-25 2021-05-11 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of alzheimer's disease and related disorders
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
US9295393B2 (en) 2012-11-09 2016-03-29 Elwha Llc Embolism deflector
JP2016502978A (ja) 2012-12-11 2016-02-01 ファイザー・インク BACE1の阻害剤としてのヘキサヒドロピラノ[3,4−d][1,3]チアジン−2−アミン化合物
US9403846B2 (en) 2012-12-19 2016-08-02 Pfizer Inc. Carbocyclic- and heterocyclic-substituted hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
JP6469585B2 (ja) 2013-01-07 2019-02-13 バイオメディカル リサーチ モデルズ, インコーポレイテッド 単純ヘルペスウイルス2型感染を処置するための治療用ワクチン
JP2016507551A (ja) 2013-02-13 2016-03-10 ファイザー・インク ヘテロアリール置換ヘキサヒドロピラノ[3,4−d][1,3]チアジン−2−アミン化合物
US9233981B1 (en) 2013-02-15 2016-01-12 Pfizer Inc. Substituted phenyl hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
PE20151332A1 (es) 2013-02-19 2015-09-20 Pfizer Compuestos de azabencimidazol
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
WO2014159614A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Flow Pharma, Inc. Adjuvant and antigen particle formulation
US9102752B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
EP2787347A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting Aß-specific antibodies in a biological sample
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
EP3027205A4 (en) 2013-07-28 2017-07-19 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
WO2015033251A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2015049616A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Pfizer Inc. Novel bicyclic pyridinones as gamma-secretase modulators
US10188757B2 (en) 2013-10-22 2019-01-29 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
ES2663622T3 (es) 2013-12-17 2018-04-16 Pfizer Inc. Novedosas 1H-pirrolo[2,3-b]piridinas 3,4-disustituidas y 7H-pirrolo[2,3-c]piridacinas 4,5-disustituidas como inhibidores de LRRK2
WO2015150957A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Pfizer Inc. Chromene and 1,1 a,2,7b-tetrahydrocyclopropa[c]chromene pyridopyrazinediones as gamma-secretase modulators
CR20160455A (es) 2014-04-10 2016-12-16 Pfizer 2-AMINO-6-METIL-4,4a,5,6-TETRAHIDROPIRANO[3,4-d][1,3]TIAZIN-8a(8H)-IL-1,3-TIAZOL-4-ILA
KR102460465B1 (ko) 2014-04-29 2022-10-27 어드밴티지 테라퓨틱스, 인코포레이티드 알츠하이머병(ad)의 치료 및 예방
FI3137094T3 (fi) * 2014-04-29 2023-03-20 Advantage Therapeutics Inc Alzheimerin taudin (ad) hoitaminen ja ehkäiseminen
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015165971A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
EP3269376B1 (en) * 2014-04-29 2020-07-15 Affiris AG Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
ES2811303T3 (es) * 2014-06-17 2021-03-11 Academia Sinica Anticuerpos anti-IGE humanizados que entrecruzan CD23 en linfocitos B pero no sensibilizan los mastocitos
MA40224B1 (fr) 2014-07-10 2021-05-31 Eisai R&D Man Co Ltd Anticorps se liant aux protofibrilles ass améliorés
WO2016012896A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Pfizer Inc. Pyrazolopyrimidine compounds
WO2016020786A1 (en) 2014-08-06 2016-02-11 Pfizer Inc. Imidazopyridazine compounds
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
KR102000382B1 (ko) 2015-02-03 2019-07-15 화이자 인코포레이티드 신규 시클로프로파벤조푸라닐 피리도피라진디온
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
PL3766885T3 (pl) 2015-06-17 2022-09-19 Pfizer Inc. Związki tricykliczne i ich zastosowanie jako inhibitory fosfodiesterazy
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
RU2722149C1 (ru) 2015-09-14 2020-05-27 Пфайзер Инк. Новые производные имидазо[4,5-c] хинолинов и имидазо[4,5-c][1,5] нафтиридинов в качестве ингибиторов LRRK2
EP3353183A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 Pfizer Inc N-[2-(2-amino-6,6-disubstituted-4, 4a, 5, 6-tetrahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-8a (8h)-yl) -1, 3-thiazol-4-yl]amides
EP3353174A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 Pfizer Inc N-[2-(3-amino-2,5-dimethyl-1,1-dioxido-5,6-dihydro-2h-1,2,4-thiadiazin-5-yl)-1,3-thiazol-4-yl]amides useful as bace inhibitors
WO2017051303A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Pfizer Inc. Tetrahydropyrano[3,4-d][1,3]oxazin derivatives and their use as bace inhibitors
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
RU2753390C1 (ru) 2015-10-02 2021-08-13 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к человеческому cd20/человеческому рецептору трансферрина и способы их применения
WO2017079833A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 The University Of British Columbia Epitopes in amyloid beta mid-region and conformationally-selective antibodies thereto
US10772969B2 (en) 2015-11-09 2020-09-15 The University Of British Columbia N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
WO2017079835A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 The University Of British Columbia Amyloid beta epitopes and antibodies thereto
CN113332292A (zh) 2016-02-23 2021-09-03 辉瑞公司 6,7-二氢-5H-吡唑并[5,1-b][1,3]噁嗪-2-甲酰胺化合物
BR112018077257A2 (pt) 2016-07-01 2019-04-02 Pfizer Inc. derivados de 5,7-di-hidro-pirrolo-piridina para o tratamento de doenças neurológicas e neurodegenerativas
EP3484919A4 (en) 2016-07-18 2020-03-04 The University of British Columbia ANTIBODIES AGAINST AMYLOID BETA
AU2017321782B2 (en) 2016-08-31 2022-03-10 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
US10183070B2 (en) 2017-01-31 2019-01-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN111201226B (zh) 2017-03-10 2022-07-22 辉瑞大药厂 环状被取代的咪唑并[4,5-c]喹啉衍生物
SG11201908322WA (en) 2017-03-10 2019-10-30 Pfizer Novel imidazo[4,5-c]quinoline derivatives as lrrk2 inhibitors
RU2678987C2 (ru) 2017-04-28 2019-02-05 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Пептид для лечения болезни альцгеймера
EP3634978A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
KR20200013783A (ko) 2017-06-22 2020-02-07 화이자 인코포레이티드 디히드로-피롤로-피리딘 유도체
US11209638B2 (en) * 2017-07-05 2021-12-28 West Virginia University Systems and methods for supporting and positioning body tissue samples in a microscope
WO2019017995A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aztherapies, Inc. FORMULATIONS OF CROMOLYNE SODIUM POWDER AND IBUPROFEN
US11453701B2 (en) 2017-08-18 2022-09-27 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
RS64289B1 (sr) 2017-08-22 2023-07-31 Biogen Ma Inc Farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-amiloid beta antitela
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
US11524954B2 (en) 2018-03-23 2022-12-13 Pfizer Inc. Piperazine azaspiro derivatives
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
EP3817739A4 (en) 2018-07-02 2022-04-13 The General Hospital Corporation SODIUM CROMOGLYCATE AND ?-LACTOSE POWDER FORMULATIONS
US20230183304A1 (en) 2020-05-19 2023-06-15 Robinoo BARBOUR Multi-Epitope Vaccine for the Treatment of Alzheimer's Disease

Family Cites Families (433)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589566A (en) * 1897-09-07 meevten
US6096318A (en) 1973-05-07 2000-08-01 The Ohio State University Antigenically modified HCG polypeptides
JPS57212347A (en) * 1981-06-25 1982-12-27 Nissan Motor Co Ltd Air-fuel ratio control system
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5158769A (en) 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5417986A (en) 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
IT1190383B (it) * 1985-08-01 1988-02-16 Eniricerche Spa Sostanze peptidominetiche ad azione ipotensiva
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4713366A (en) * 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) * 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5278049A (en) * 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) * 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5220013A (en) * 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US4879213A (en) 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US4818397A (en) * 1986-12-22 1989-04-04 Sundstrand Corporation Shut-off valve seal
DE3702789A1 (de) 1987-01-30 1988-08-18 Bayer Ag Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins
US4912206A (en) * 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・2・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5583112A (en) * 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5641474A (en) * 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5869054A (en) * 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5849298A (en) * 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5571500A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5645820A (en) * 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
DE3854741T3 (de) 1987-06-24 2002-08-14 Autoimmune, Inc. Behandlung von autoimmun-erkrankungen durch orale verabreichung von autoantigenen.
US5571499A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US4912208A (en) * 1987-06-29 1990-03-27 Abbott Laboratories Fluorophores for encapsulation into liposomes
US5004697A (en) * 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US4966753A (en) 1987-08-18 1990-10-30 Molecular Rx, Inc. Immunotherapeutic methods and compositions employing antigens characteristic of malignant neoplasms
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
CA1339014C (en) 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
JP2518911B2 (ja) 1987-10-23 1996-07-31 森永乳業株式会社 c―fms癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
WO1989006689A1 (en) 1988-01-13 1989-07-27 The Mclean Hospital Corporation Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene
WO1994029459A1 (en) 1993-06-04 1994-12-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Stress proteins and uses therefor
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5098706A (en) * 1988-11-01 1992-03-24 The Regents Of The University Of California Juvenile hormone esterase for insect control
WO1990005142A1 (en) 1988-11-10 1990-05-17 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Polypeptides
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5227159A (en) 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
WO1990012871A1 (en) 1989-04-14 1990-11-01 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10
WO1990012870A1 (en) 1989-04-14 1990-11-01 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
CA2070281C (en) 1989-12-20 2005-08-23 David Allen Hafler Improved treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of auto antigens
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
EP0594607B1 (en) 1990-03-02 1997-08-27 Autoimmune, Inc. Enhancement of the down-regulation of autoimmune diseases by oral or enteral administration of autoantigens
GB9005705D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Health Lab Service Board Particle manipulation
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
EP0451700A1 (en) 1990-04-10 1991-10-16 Miles Inc. Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JPH05506990A (ja) * 1990-04-24 1993-10-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア プロテアーゼ ネキシン―2の精製、検出、及び使用方法
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
CA2081482C (en) * 1990-04-27 2000-11-21 Ellis L. Kline Method and composition for treatment of central nervous system disease states associated with abnormal amyloid beta protein molecular organization
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0600866T3 (da) 1990-06-01 1998-03-09 Chiron Corp Præparater og fremgangsmåder til identifikation af biologisk aktive molekyler
ATE260974T1 (de) 1990-06-15 2004-03-15 Scios Inc Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt
US5914109A (en) * 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
CA2085897A1 (en) 1990-06-19 1991-12-20 George Pieczenik Nonpathogenic variant virus
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
KR970005049B1 (ko) * 1990-07-16 1997-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니벌시티 오브 캘리포니아 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
WO1992006187A1 (en) 1990-09-28 1992-04-16 The Upjohn Company Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene
ATE175118T1 (de) * 1990-10-05 1999-01-15 Medarex Inc Gezielte immunostimulierung mit bispezifischen stoffen
JP2635444B2 (ja) 1990-10-15 1997-07-30 オートイミューン インク 自己抗体の経口投与による自己免疫性疾患の治療
GB9023352D0 (en) * 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
ES2236682T5 (es) 1991-01-21 2011-03-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer.
KR100257214B1 (ko) 1991-03-01 2000-05-15 데스꼴롱그 티에리 거세되지 않은 수컷가축의 고기의 관능적 품질을 개선하기 위한 방법
DE4107857A1 (de) * 1991-03-12 1992-09-17 Thomae Gmbh Dr K Cyclische harnstoffderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und verfahren zu ihrer herstellung
US5192753A (en) * 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
DE69229703T2 (de) 1991-05-08 2000-04-27 Schweiz Serum & Impfinst Wiederhergestellte Influenza-Virosomen mit immunostimulierenden und immunoverstärkenden Eigenschaften und diese enthaltende Impfstoffe
EP0940468A1 (en) * 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5672805A (en) 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
EP0773227A1 (en) 1991-09-18 1997-05-14 Affymax Technologies N.V. Diverse collections of oligomers in use to prepare drugs, diagnostic reagents, pesticides or herbicides
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
DE69233109T2 (de) 1992-01-07 2004-05-19 Elan Pharmaceuticals, Inc., San Francisco Transgene tiermodelle fur alzheimer-krankheit
US5679348A (en) * 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
ATE245446T1 (de) 1992-02-11 2003-08-15 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
HU220357B (hu) 1992-02-28 2001-12-28 Autoimmune Inc. Eljárás és készítmények autoimmun betegségek kezelésére bystander antigén alkalmazásával
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0561087B1 (en) 1992-03-20 1999-08-04 N.V. Innogenetics S.A. Mutated form of the beta-amyloid precursor protein gene
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
GB9209118D0 (en) 1992-04-28 1992-06-10 Sb 120 Amsterdam Bv Vaccine compositions
CA2138137C (en) 1992-06-18 2004-11-09 R. John Collier Diphtheria toxin vaccines
PT761231E (pt) * 1992-06-25 2000-06-30 Smithkline Beecham Biolog Composicao de vacina contendo adjuvantes
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
WO1994001772A1 (en) 1992-07-13 1994-01-20 The Children's Medical Center Corporation SCREEN FOR ALZHEIMER'S DISEASE THERAPEUTICS BASED ON β-AMYLOID PRODUCTION
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
CA2141427C (en) 1992-07-31 2008-07-22 Mohammed Anjam Khan Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
NZ255256A (en) * 1992-08-27 1997-02-24 Deakin Res Ltd Synthetic peptide antigen analogues with retro, inverso or retro-inverso modification, their use and antibodies against them
FI96267C (sv) 1992-09-16 1996-06-10 Formit Foodprocessing Ab Oy Vals och maskin för skalning eller formning av potatis och liknande produkter
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
CA2107181C (en) * 1992-09-29 1998-12-29 Yoshiaki Tachikawa Arrayed-wave guide grating multi/demultiplexer with loop-back optical paths
EP0665897B1 (en) 1992-10-01 2003-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
AU5358494A (en) 1992-10-13 1994-05-09 Duke University Method of inhibiting binding of amyloid precursor protein to beta-amyloid protein
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
EP0667959B1 (en) 1992-10-26 2003-08-13 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying inhibitors of the production of beta-amyloid peptide
US5972336A (en) 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
US5733647A (en) * 1992-11-05 1998-03-31 Polymer Innovations, Inc. Insole
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
AU6014094A (en) 1992-12-02 1994-06-22 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
US7014856B1 (en) * 1993-01-22 2006-03-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Ganglioside-KLH conjugate vaccines plus OS-21
EP0683234B2 (en) * 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5955317A (en) * 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
US5750106A (en) * 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
US5358708A (en) 1993-01-29 1994-10-25 Schering Corporation Stabilization of protein formulations
US5989565A (en) * 1993-01-29 1999-11-23 University Of Pittsburgh Elution and identification of T cell epitopes from viable cells
US5472693A (en) * 1993-02-16 1995-12-05 The Dow Chemical Company Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies
CA2115811A1 (en) * 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
CA2158455C (en) 1993-03-17 2003-05-27 Nicholas P. Restifo Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide and their uses in vaccines and disease treatments
EP0690722B1 (en) * 1993-03-18 2004-06-30 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for reducing toxicity of biologically-active factors
SG48309A1 (en) * 1993-03-23 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
CA2119090A1 (en) * 1993-03-26 1994-09-27 Wayne R. Gombotz Compositions for controlled release of biologically active tgf-.beta.
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
JP3734263B2 (ja) 1993-05-25 2006-01-11 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 呼吸器シンシチウムウイルスに対するワクチンのためのアジュバント
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
US5464823A (en) * 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
JPH09500540A (ja) 1993-07-30 1997-01-21 メデヴァ ホールディングス ビー.ヴイ. ワクチン組成物
WO1995005393A2 (en) 1993-08-18 1995-02-23 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Lipopolysaccharide-binding and neutralizing peptides
EP0714308A4 (en) 1993-08-26 1998-07-29 Univ California METHOD, COMPOSITIONS AND DEVICES FOR THE DELIVERY OF NAKED POLYNUCLEOTIDES THAT ENCODE BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES
AU707083B2 (en) 1993-08-26 1999-07-01 Bavarian Nordic Inc. Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign T-cell epitopes
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
FR2709247B1 (fr) * 1993-08-27 1995-09-29 Martin Jean Raymond Dispositif d'ancrage d'une instrumentation rachidienne sur une vertèbre.
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
KR100362340B1 (ko) 1993-09-07 2003-02-26 스미스클라인비이참피이엘시이 인터로이킨-4(il4)매개된질환의치료에유용한재조합il4항체
US5652334A (en) * 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
AU698962B2 (en) 1993-09-14 1998-11-12 Epimmune, Inc. Alteration of immune response using pan DR-binding peptides
US5415584A (en) 1993-09-21 1995-05-16 Tomco2 Equipment Company Particle blast cleaning apparatus
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) * 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
ES2173130T3 (es) 1993-10-20 2002-10-16 Univ Duke Metodo de fijacion de material al peptido beta-amiloide.
CA2172507C (en) 1993-10-22 2008-12-02 Jeffrey L. Cleland Methods and compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines
JPH09508353A (ja) 1993-11-02 1997-08-26 アフィマックス テクノロジーズ ナムローゼ フェンノートシャップ 分子多様性の合成及びスクリーニング
US5744368A (en) * 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5434170A (en) * 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
US5877399A (en) * 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
ATE278023T1 (de) * 1994-01-27 2004-10-15 Univ Minnesota Nicht humane, transgenische säugetiere mit sich entwickelnder neurologischer krankheit
EP0802797A1 (en) * 1994-02-03 1997-10-29 The Picower Institute For Medical Research Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
AUPM411994A0 (en) 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
EP0705880B1 (en) 1994-02-28 1999-01-27 Sumitomo Chemical Company, Limited Polyolefin resin composition and resin film
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6270757B1 (en) 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US6372716B1 (en) * 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
JPH10500112A (ja) 1994-05-06 1998-01-06 ファーマコピーア,インコーポレイテッド 組合せ ジヒドロベンゾピラン ライブラリー
ATE202940T1 (de) * 1994-05-25 2001-07-15 John Mcmichael Mittel und methoden zur behandlung von plaque- krankheiten
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5798100A (en) * 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
WO1996003144A1 (en) 1994-07-27 1996-02-08 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Polyepitope vaccines
WO1996008565A2 (en) 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
DE69508521T2 (de) * 1994-10-14 1999-10-07 Able Corp., Tokio/Tokyo Elektrolytische Vorrichtung zur Herstellung von Kohlenstoff-Dioxyd
NL9401735A (nl) * 1994-10-19 1996-06-03 Crown Gear Bv Tandwieloverbrenging van een cilindrisch rondsel met een kroonwiel, het kroonwiel dat toegepast wordt in deze tandwieloverbrenging, een werkwijze volgens welke het kroonwiel gemaakt kan worden alsmede een gereedschap waarmee het kroonwiel gemaakt kan worden.
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
JPH08137927A (ja) * 1994-11-07 1996-05-31 Hitachi Ltd 部品配置配線表示方法
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) * 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
EP0820299B1 (en) * 1995-02-06 2002-04-24 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
WO1996028471A1 (en) 1995-03-14 1996-09-19 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5854215A (en) 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
AU711702B2 (en) * 1995-03-23 1999-10-21 Cambridge University Technical Services Limited Vectors for gene delivery
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
ATE274064T1 (de) 1995-05-23 2004-09-15 Morphosys Ag Multimere proteine
AU6113896A (en) 1995-06-05 1996-12-24 Brigham And Women's Hospital Use of oral tolerance to suppress both th1 and th2 immune re sponses and to suppress antibody production
US5948763A (en) 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
AU6264996A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Athena Neurosciences, Inc. Method for identifying alzheimer's disease therapeutics usin g transgenic animal models
IT1276680B1 (it) * 1995-06-08 1997-11-03 Oris Spa Processo di sintesi dell'1-piridiniopropan-3-solfonato
US5910427A (en) 1995-06-22 1999-06-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigen non-specific glycosylation inhibiting factor derivatives
US5780361A (en) * 1995-06-23 1998-07-14 Nec Corporation Salicide process for selectively forming a monocobalt disilicide film on a silicon region
ATE214603T1 (de) * 1995-06-30 2002-04-15 American Cyanamid Co Stabile makrolide und makrolide imptstoff- zusammensetzungen
WO1997003192A2 (en) * 1995-07-07 1997-01-30 Darwin Molecular Corporation Chromosome 1 gene and gene products related to alzheimer's disease
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AUPN443995A0 (en) 1995-07-27 1995-08-17 Csl Limited Papillomavirus polyprotein
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
AU6898996A (en) * 1995-08-21 1997-03-12 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
EP1416280A3 (en) * 1995-09-14 2005-08-10 The Regents of the University of California Antibodies specific for native PrPsc
US5664823A (en) * 1995-09-18 1997-09-09 Ford Global Technologies, Inc. Instrument panel brace
US5731284A (en) 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
WO1997013855A1 (en) 1995-10-10 1997-04-17 Novartis Ag Melanoma-associated protein
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
EP0876615A1 (en) 1995-11-10 1998-11-11 Elan Corporation Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
WO1997018855A1 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Eduard Naumovich Lerner Device for enhanced delivery of biologically active substances and compounds in an organism
EP0866805A1 (en) 1995-12-12 1998-09-30 Karolinska Innovations AB PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性appの定量法
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
US5770700A (en) * 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
ZA97452B (en) 1996-01-25 1997-08-15 Trinity College Dublin Streptococcus equi vaccine.
WO1997026913A1 (en) 1996-01-26 1997-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A POLYPEPTIDE FROM LUNG EXTRACT WHICH BINDS AMYLOID-β PEPTIDE
GB9602294D0 (en) * 1996-02-05 1996-04-03 Zeneca Ltd Heterocyclic compounds
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
EP0883686A1 (en) 1996-02-26 1998-12-16 Morphosys Gesellschaft für Proteinoptimierung mbH Novel method for the identification of nucleic acid sequences encoding two or more interacting (poly)peptides
US6150091A (en) * 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
US5870587A (en) * 1996-03-20 1999-02-09 International Business Machines Corporation Information-handling system, method, and article of manufacture including a mechanism for providing an improved application binary interface
JP4229341B2 (ja) 1996-03-23 2009-02-25 財団法人阪大微生物病研究会 破傷風毒素の機能的フラグメント抗原及び破傷風ワクチン
CA2250041A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 University Of Otago Parapoxvirus vectors
EP0954324A4 (en) * 1996-04-03 2000-11-02 Anergen Inc CYCLIC PEPTID VACCINES FOR DIABETES TREATMENT AND PREVENTION
EP0904365A1 (en) * 1996-04-19 1999-03-31 The Government of the United States Of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Antigenically reactive regions of the hepatitis-a virus polyprotein
US6284533B1 (en) * 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
EP0938506B1 (en) 1996-07-16 2003-11-05 Plückthun, Andreas, Prof. Dr. Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
WO1998004720A1 (en) 1996-07-26 1998-02-05 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and reagents for genetic immunization
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
CA2183901A1 (en) 1996-08-22 1998-02-23 Johanna E. Bergmann Targets for therapy and diagnosis of alzheimer's disease and down syndrome in humans
DE69733655T2 (de) 1996-08-27 2006-04-27 Praecis Pharmaceuticals, Inc., Cambridge beta-AMYLOID PEPTIDAGGREGATION REGULIERENDE PEPTIDE MIT D-AMINOSÄUREN
US6057367A (en) * 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) * 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
US6022859A (en) * 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US6218506B1 (en) * 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0966447B1 (en) 1997-03-03 2003-03-05 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Small molecules useful in the treatment of inflammatory disease
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US6611610B1 (en) * 1997-04-02 2003-08-26 Gentex Corporation Vehicle lamp control
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
EP2305709A1 (en) 1997-04-09 2011-04-06 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods for use thereof
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
ATE326481T1 (de) 1997-04-15 2006-06-15 Pharmexa As Veränderte tnfalpha-moleküle, dns, welche für derartige veränderte tnfalpha-moleküle kodiert und impfstoffe, die derartige veränderte tnfalpha-moleküle und dns enthalten
US6787319B2 (en) * 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US5858205A (en) * 1997-05-13 1999-01-12 Uop Llc Multizone catalytic reforming process
DE69838294T2 (de) 1997-05-20 2009-08-13 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
IT1293511B1 (it) 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US7078191B1 (en) 1997-08-01 2006-07-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
ES2327693T3 (es) 1997-08-29 2009-11-02 Antigenics Inc. Composiciones que comprenden el adyvante qs-21 y polisorbato o ciclodextrina excipiente.
US6175057B1 (en) * 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6905686B1 (en) * 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
JP2002511385A (ja) 1997-12-03 2002-04-16 ニューララブ リミテッド アルツハイマー病におけるβ−アミロイド関連変化を抑制する方法
KR20010032303A (ko) 1997-12-03 2001-04-16 후지야마 아키라 연질 펠렛상 약제 및 그 제조방법
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
WO1999055369A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
NO314086B1 (no) 1998-05-08 2003-01-27 Gemvax As Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til
EP1080110A2 (en) 1998-05-19 2001-03-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of activated t cells, nervous system-specific antigens for treating disorders of the nevrous system
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
WO1999060024A1 (en) 1998-05-21 1999-11-25 The University Of Tennessee Research Corporation Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6710228B1 (en) * 1998-05-29 2004-03-23 Mycogen Corporation Cotton cells, plants, and seeds genetically engineered to express insecticidal and fungicidal chitin binding proteins (lectins)
US6727349B1 (en) 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
PT1117421E (pt) 1998-10-05 2004-11-30 Pharmexa A S Novos metodos para vacinacao terapeutica
WO2000023082A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US7112661B1 (en) 1998-10-30 2006-09-26 The Research Foundation Of State University Of New York Variable heavy chain and variable light chain regions of antibodies to human platelet glycoprotein Ib alpha
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
SI1148891T1 (en) 1999-01-19 2004-08-31 Pharmacia & Upjohn Company Method of packaging an oxidation sensitive medicinal substance
AU775525B2 (en) 1999-01-22 2004-08-05 Auckland Technology Enabling Corporation Limited Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
US7282570B2 (en) 1999-04-20 2007-10-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP2003503312A (ja) 1999-05-05 2003-01-28 ニューロシェム インコーポレイテッド 立体選択的抗原線維形成ペプチドおよびそのペプチド模倣体
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AU780474B2 (en) * 1999-06-16 2005-03-24 Boston Biomedical Research Institute Incorporated Immunological control of beta-amyloid levels in vivo
CA2377382A1 (en) 1999-07-01 2001-01-11 Scios, Inc. Prevention and treatment of amyloid-associated disorders
NZ516664A (en) 1999-07-15 2003-06-30 Inst Genetics Llc Formulations and compositions for interleukin-11
DE60016227T2 (de) 1999-08-04 2005-12-15 Northwestern University, Evanston Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
US6919075B1 (en) 1999-09-03 2005-07-19 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Bacteriophage displaying aβ epitopes and method of use
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
CN1433321A (zh) 1999-11-29 2003-07-30 尼奥切姆公司 预防和治疗Alzheimer症和其他与淀粉样蛋白有关的疾病的疫苗
WO2001042306A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Mindset Biopharmaceuticals (Usa), Inc. Chimeric peptides (short b-cell epitope joined to a t-cell epitope) and their use for immunization
US6399314B1 (en) * 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
MXPA02007796A (es) * 2000-02-21 2003-12-08 Pharmexa As Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides.
ATE306933T1 (de) 2000-02-21 2005-11-15 Pharmexa As Verfahren zur herabregulierung von amyloid
MXPA02008145A (es) 2000-02-24 2004-04-05 Univ Washington Anticuerpos humanizados que secuestran al peptido beta amiloide.
US6294221B1 (en) * 2000-03-08 2001-09-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for spray-coating with frequent changes between aqueous and non-aqueous coating agents inside a spray-coating chamber
US6548840B1 (en) * 2000-04-03 2003-04-15 Hrl Laboratories, Llc Monolithic temperature compensation scheme for field effect transistor integrated circuits
CA2404237C (en) 2000-04-05 2010-01-26 University Of Tennessee Research Corporation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
AU5162201A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Corixa Corporation Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21
DE60108111T2 (de) * 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
EP1309341A2 (en) * 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
US7199102B2 (en) * 2000-08-24 2007-04-03 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides synergize statin activity
DE60139788D1 (de) 2000-09-06 2009-10-15 Aventis Pharma Sa Verfahren und zusammensetzungen für amyloidosis-verbundene krankheiten
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
CA2427014A1 (en) 2000-11-02 2002-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostic detection and imaging of a neurodegenerative disease
JP2004534511A (ja) * 2000-11-27 2004-11-18 プラエシス ファーマシューティカルズ インク. アミロイド形成性疾患を治療するための治療薬及びその使用法
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US6900036B2 (en) * 2000-12-27 2005-05-31 University Of Texas Health Science Center Houston Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
US20020160394A1 (en) * 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
EP1251138B1 (en) * 2001-04-19 2006-07-26 Hermann Dr. Schätzl Prion protein dimers useful for vaccination
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
US6524624B1 (en) * 2001-05-16 2003-02-25 Alcide Corporation Two-part disinfecting systems and compositions and methods related thereto
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
US6888849B2 (en) * 2001-06-15 2005-05-03 Lucent Technologies Inc. Method for evaluating capacity utilization of a terminus in a communication system
AU2002345843A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
EP1409018B1 (en) 2001-07-25 2010-01-06 Facet Biotech Corporation Stable lyophilized pharmaceutical formulation the igg antibody daclizumab
US20030135035A1 (en) 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
WO2003016467A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
WO2003015691A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
US20040192898A1 (en) 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
US7625550B2 (en) * 2001-09-10 2009-12-01 Anticancer, Inc. Enhanced resolution of tumor metastasis using a skin flap model
US6736142B2 (en) * 2001-09-13 2004-05-18 Gines Sanchez Gomez Protective tube and harness
US6907297B2 (en) 2001-09-28 2005-06-14 Ethicon, Inc. Expandable intracardiac return electrode and method of use
US6597198B2 (en) * 2001-10-05 2003-07-22 Intel Corporation Current mode bidirectional port with data channel used for synchronization
GB0124446D0 (en) * 2001-10-11 2001-12-05 Short Brothers Ltd Aircraft propulsive power unit
US7781413B2 (en) 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
DK1441589T3 (da) 2001-11-08 2012-08-06 Abbott Biotherapeutics Corp Stabil, flydende, farmaceutisk sammensætning af IgG-antistoffer
AU2002357007A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-10 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID Beta, PRION PROTEIN, AMYLIN, Alpha-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
WO2003051374A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 New York State Office Of Mental Health SEQUESTRATION OF Aβ IN THE PERIPHERY IN THE ABSENCE OF IMMUNOMODULATING AGENT AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF BETA-AMYLOID RELATED DISEASES
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
JP2005526501A (ja) 2002-02-21 2005-09-08 デューク・ユニヴァーシティ 自己免疫疾患用の試薬および治療方法
US6688651B2 (en) * 2002-02-21 2004-02-10 Dmt Co., Ltd. Device for locking cap nut for coupling
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2390700C (en) * 2002-06-11 2004-09-07 Henry Tsang Illuminated soap bar with sound
GB0213437D0 (en) 2002-06-12 2002-07-24 Univ Cranfield Temporary tattoos: A novel vehicle for skin testing
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
US6892535B2 (en) * 2002-06-14 2005-05-17 Volvo Construction Equipment Holding Sweden Ab Hydraulic circuit for boom cylinder combination having float function
WO2004016282A1 (en) 2002-07-19 2004-02-26 Cytos Biotechnology Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
AU2003250102B2 (en) 2002-07-24 2009-09-17 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
AU2003279728B2 (en) 2002-10-01 2007-09-27 Northwestern University Amyloid beta-derived diffusible ligands (addls), addl-surrogates, addl-binding molecules, and uses thereof
US20040080762A1 (en) * 2002-10-25 2004-04-29 Xerox Corporation Half-tone based enhancement of black
US20060019850A1 (en) * 2002-10-31 2006-01-26 Korzenski Michael B Removal of particle contamination on a patterned silicon/silicon dioxide using dense fluid/chemical formulations
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
US20040191243A1 (en) 2002-12-13 2004-09-30 Bei Chen System and method for stabilizing antibodies with histidine
US6787129B1 (en) 2003-01-13 2004-09-07 Zenitech Llc Castor polyester as gloss agents in anionic systems
CA2513722A1 (en) 2003-02-01 2004-08-19 Neuralab Limited Active immunization to generate antibodies to soluble a-beta
US7575747B2 (en) 2003-02-10 2009-08-18 Applied Molecular Evolution Aβ binding molecules
DK2335725T3 (en) 2003-04-04 2017-01-23 Genentech Inc Highly concentrated antibody and protein formulations
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20060182321A1 (en) 2003-07-07 2006-08-17 Agency For Science, Technology And Research Method and apparatus for extracting third ventricle information
WO2005014041A2 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US20060233788A1 (en) 2003-09-05 2006-10-19 Heiman Mark L Anti-ghrelin antibodies
CA2445743A1 (en) 2003-10-08 2005-04-08 The University Of British Columbia Methods for modulating neuronal responses
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
SG149039A1 (en) * 2003-12-17 2009-01-29 Elan Pharm Inc Ass IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
MY146566A (en) 2003-12-17 2012-08-30 Wyeth Llc Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
US20050214222A1 (en) 2004-02-13 2005-09-29 Mckinnon Stuart J In vivo imaging of amyloid plaques in glaucoma using intravenous injectable dyes
KR101166342B1 (ko) 2004-03-15 2012-07-18 얀센 파마슈티카 엔.브이. 아편계 약물 수용체 조절자로서의 신규의 화합물
CN101137397A (zh) 2004-07-02 2008-03-05 匹兹堡大学高等教育联邦体系 淀粉样蛋白成像作为抗淀粉样蛋白疗法的功效的替代标记物
WO2006036291A2 (en) 2004-07-30 2006-04-06 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US7328838B2 (en) * 2004-09-09 2008-02-12 Igt Counterfeit cashless instrument detection methods and systems
TW200616662A (en) 2004-09-10 2006-06-01 Wyeth Corp Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody/calicheamicin conjugates
CA2582157A1 (en) 2004-10-05 2006-04-20 Wyeth Methods and compositions for improving recombinant protein production
US20060160161A1 (en) 2004-10-26 2006-07-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
US20060026911A1 (en) * 2004-11-18 2006-02-09 Sutton Adam F Footer track with moisture vent
EP1838348B1 (en) 2004-12-15 2013-06-26 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
TW200636066A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20060257396A1 (en) 2004-12-15 2006-11-16 Jacobsen Jack S Abeta antibodies for use in improving cognition
WO2006066233A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited An immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
WO2006066118A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Contextual fear test for predicting efficacy of alzheimer immunotherapeutic treatment
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
EP1841456A2 (en) 2005-01-28 2007-10-10 Wyeth Stabilized liquid polypeptide formulations
ATE535252T1 (de) 2005-05-05 2011-12-15 Merck Sharp & Dohme Peptid-konjugat-zusammensetzungen und -verfahren zur prävention und behandlung von alzheimer- krankheit
CA2611816C (en) 2005-06-17 2014-05-27 Wyeth Methods of purifying fc region containing proteins
ATE550338T1 (de) 2005-07-18 2012-04-15 Merck Sharp & Dohme Spiropiperidininhibitoren von beta-secretase zur behandlung von alzheimer-krankheit
CN101558080A (zh) 2005-11-10 2009-10-14 罗斯坎普研究有限责任公司 Aβ肽片段对血管生成的调节
SI1996621T1 (sl) 2006-03-30 2010-04-30 Glaxo Group Ltd Protitelesa proti amiloidnemu peptidu beta
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2010044803A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
AU2007275467B2 (en) 2006-07-14 2013-12-05 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
EP2120717A1 (en) 2007-03-12 2009-11-25 National Institute of Radiological Sciences Pet visualization of amyloid-associated neuroinflammation in the brain
US20080292625A1 (en) 2007-04-18 2008-11-27 Sally Schroeter Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
US8613920B2 (en) 2007-07-27 2013-12-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2011133919A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Janssen Alzheimer Immunotherapy Use of tau to monitor immunotherapy
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
JP5730020B2 (ja) 2007-12-28 2015-06-03 ネオトープ バイオサイエンシーズ リミテッド アミロイドーシスの処置および予防
WO2010033861A1 (en) 2008-09-18 2010-03-25 Cedars-Sinai Medical Center Optical method for the detection of alzheimer's disease
JP2013521233A (ja) 2010-02-25 2013-06-10 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー Aβを標的とする免疫療法のPETモニタリング

Also Published As

Publication number Publication date
ATE433760T1 (de) 2009-07-15
SI1679080T1 (sl) 2009-12-31
DK1033996T3 (da) 2008-09-22
ES2263408T1 (es) 2006-12-16
CA2312920C (en) 2016-07-12
CZ20001706A3 (cs) 2000-11-15
PT2305282E (pt) 2013-09-27
JP2002502802A (ja) 2002-01-29
EP2305282A2 (en) 2011-04-06
HU228061B1 (en) 2012-09-28
US20050048049A1 (en) 2005-03-03
US8034339B2 (en) 2011-10-11
EP1994937A3 (en) 2008-12-24
WO1999027944A1 (en) 1999-06-10
IL136252A0 (en) 2001-05-20
US8535673B2 (en) 2013-09-17
US8642044B2 (en) 2014-02-04
US6982084B2 (en) 2006-01-03
US20080227718A1 (en) 2008-09-18
US20040171816A1 (en) 2004-09-02
HRP20090568A2 (hr) 2010-06-30
NO331425B1 (no) 2011-12-27
IL205298A0 (en) 2011-07-31
AR020050A1 (es) 2002-04-10
CO4980846A1 (es) 2000-11-27
ES2262460T1 (es) 2006-12-01
DE06075479T1 (de) 2006-11-16
NO20100061L (no) 2000-07-31
US20050191314A1 (en) 2005-09-01
JP4677334B2 (ja) 2011-04-27
NZ504569A (en) 2005-01-28
SI1994937T1 (sl) 2011-04-29
MY134906A (en) 2007-12-31
US7014855B2 (en) 2006-03-21
IL191904A0 (en) 2008-12-29
IL193245A0 (en) 2009-09-22
US6808712B2 (en) 2004-10-26
KR100936419B1 (ko) 2010-01-12
US20080096818A1 (en) 2008-04-24
IS5500A (is) 2000-05-17
ES2428740T3 (es) 2013-11-11
EP1679080B1 (en) 2009-06-17
NO20092874L (no) 2000-07-31
DK1994937T3 (da) 2011-02-07
EP1994937A2 (en) 2008-11-26
NO328865B1 (no) 2010-06-07
US20050019343A1 (en) 2005-01-27
EP1679080A2 (en) 2006-07-12
US20050031629A1 (en) 2005-02-10
PE20001383A1 (es) 2000-11-25
DE69842082D1 (de) 2011-02-10
US6972127B2 (en) 2005-12-06
US20050249725A1 (en) 2005-11-10
PT1033996E (pt) 2008-10-02
EP2305282B1 (en) 2013-07-10
US20060029611A1 (en) 2006-02-09
HK1094535A1 (en) 2007-04-04
DE69839647D1 (de) 2008-08-07
US20050037026A1 (en) 2005-02-17
ATE399016T1 (de) 2008-07-15
US20050163788A1 (en) 2005-07-28
US20140227274A1 (en) 2014-08-14
EA200401473A1 (ru) 2005-04-28
CY1108331T1 (el) 2014-02-12
CN1281366A (zh) 2001-01-24
US20060034858A1 (en) 2006-02-16
KR20010032635A (ko) 2001-04-25
EP1994937B1 (en) 2010-12-29
NO332813B1 (no) 2013-01-21
US20050019330A1 (en) 2005-01-27
DE69840969D1 (de) 2009-08-20
JP2006131639A (ja) 2006-05-25
US20040170641A1 (en) 2004-09-02
DE69840922D1 (de) 2009-07-30
US20050142132A1 (en) 2005-06-30
WO1999027944A9 (en) 1999-09-23
HRP20000443B1 (en) 2009-11-30
DE06075704T1 (de) 2006-12-28
US6946135B2 (en) 2005-09-20
EA200000608A1 (ru) 2000-12-25
JP4677333B2 (ja) 2011-04-27
US20050196399A1 (en) 2005-09-08
US20040171815A1 (en) 2004-09-02
DK1679080T3 (da) 2009-09-28
HU228493B1 (en) 2013-03-28
BR9815357A (pt) 2000-10-24
DK2305282T3 (da) 2013-10-07
HK1095265A1 (en) 2007-05-04
SI2305282T1 (sl) 2013-10-30
CY1109368T1 (el) 2014-07-02
US20080227719A1 (en) 2008-09-18
JP4677094B2 (ja) 2011-04-27
PT1679080E (pt) 2009-09-10
SA99191269B1 (ar) 2006-03-15
PT1994937E (pt) 2011-02-22
JP2010215651A (ja) 2010-09-30
JP2006077030A (ja) 2006-03-23
PL342649A1 (en) 2001-06-18
PL202706B1 (pl) 2009-07-31
HUP0100627A1 (hu) 2001-06-28
IL191904A (en) 2014-05-28
EP1679080A3 (en) 2006-07-19
EP1690547A1 (en) 2006-08-16
US20040228865A1 (en) 2004-11-18
ES2263408T3 (es) 2009-11-16
TR200001608T2 (tr) 2001-07-23
CZ303137B6 (cs) 2012-04-25
CY1111370T1 (el) 2015-08-05
EP2305282A3 (en) 2011-05-18
BG104562A (en) 2001-01-31
AU1706199A (en) 1999-06-16
EA009283B1 (ru) 2007-12-28
HUP0100627A3 (en) 2006-03-28
SI1033996T1 (sl) 2009-02-28
EA200601132A1 (ru) 2007-02-27
KR101248711B1 (ko) 2013-03-28
NO20002784L (no) 2000-07-31
SG111083A1 (en) 2005-05-30
EE200000379A (et) 2001-04-16
TWI239847B (en) 2005-09-21
US20050191292A1 (en) 2005-09-01
EP1033996B1 (en) 2008-06-25
ATE435659T1 (de) 2009-07-15
ATE493149T1 (de) 2011-01-15
US20120276116A1 (en) 2012-11-01
CN100374151C (zh) 2008-03-12
KR20090078366A (ko) 2009-07-17
EP1690547B1 (en) 2009-07-08
EP1033996A1 (en) 2000-09-13
US20050013815A1 (en) 2005-01-20
DE1033996T1 (de) 2001-06-07
US8034348B2 (en) 2011-10-11
ES2310017T3 (es) 2008-12-16
ID25504A (id) 2000-10-05
US20090191231A1 (en) 2009-07-30
IL136252A (en) 2010-11-30
NO20002784D0 (no) 2000-05-31
KR20120135915A (ko) 2012-12-17
US20130058869A1 (en) 2013-03-07
EA007218B1 (ru) 2006-08-25
CA2312920A1 (en) 1999-06-10
HRP20000443A2 (en) 2000-10-31
GEP20043319B (en) 2004-05-10
EP1033996A4 (en) 2004-05-26
EE05377B1 (et) 2011-02-15
GEP20053715B (en) 2005-12-26
US20050249727A1 (en) 2005-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6787523B1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
CA2312920C (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2006202899B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2016256668A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
PL203431B1 (pl) Kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie srodka immunogennego
AU2013206069A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification