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KR20240155275A - 항 글루코코르티코이드 유도 tnfr 관련(gitr) 단백질 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항 글루코코르티코이드 유도 tnfr 관련(gitr) 단백질 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240155275A
KR20240155275A KR1020247031511A KR20247031511A KR20240155275A KR 20240155275 A KR20240155275 A KR 20240155275A KR 1020247031511 A KR1020247031511 A KR 1020247031511A KR 20247031511 A KR20247031511 A KR 20247031511A KR 20240155275 A KR20240155275 A KR 20240155275A
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KR
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antibody
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seq
igg1
gitr
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로니 다한
야헬 아브라함
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예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
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Abstract

본 발명은 변형된 인간 불변 영역(Fc)과 임의로 감소된 푸코실화 함량을 포함하는 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 작용적 및 비작용적 항체를 제공한다. 또한, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 약제학적 조성물 및 암 치료 방법도 제공된다.

Description

항 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질 항체 및 이의 용도
본 발명은 면역요법 분야에 속하며, 조작된 항체, 이들을 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 약제학적 조성물 및 치료적 용도에 관한 것이다.
암 치료법은 숙주의 항종양 방어를 강화하는 면역조절 요법에 의해 구동되어 지난 10년 동안 크게 발전했다. 특히, 종양을 직접 인식하기보다는 면역계를 표적으로 하는 모노클로날 항체(mAb)와 같은 면역 체크포인트 억제제는 여러 종양 유형에 걸쳐 치료받은 환자의 하위 집합에서 지속적인 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Ribas, A. & Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science 80-, 359, 1350-1355, 2018). 이러한 항체는 항종양 면역 반응을 유도하는 수단에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있다: (i) 면역 시냅스의 활성화 공동 조절 수용체를 자극하는 작용성 mAb(Mayes et al., A. The promise and challenges of immune agonist antibody development in cancer. Nature Reviews Drug Discovery, 17, 509-527, 2018) 및 (ii) 면역 시냅스의 억제성 신호전달 경로를 차단하여 조절(억제) 메커니즘을 약화시키는 길항적 mAb(Sharma et al., The future of immune checkpoint therapy. Science 348, 56-61, 2015).
항체는 항원 결합을 매개하는 가변 단편(Fab)과 (선천성) 면역 세포의 Fc 수용체 또는 보체 시스템 단백질과의 상호작용을 통해 다운스트림 이펙터 기능을 매개하는 불변 단편(Fc)의 두 가지 구조 영역으로 구성된다.
Fcγ 수용체(FcγR)는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며, 많은 구조적 및 기능적 특성을 공유한다. FcγR은 세포내 활성화(면역수용체 티로신 활성화 모티프, ITAM) 또는 억제성(면역수용체 티로신 억제 모티프, ITIM)) 신호전달 모티프의 존재에 따라 활성화 또는 억제성으로 분류될 수 있다. 세 개의 활성화 FcγR은 마우스(FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV) 및 인간(FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA)에서 발현되며, 단일 억제성 FcγRIIB는 두 종 모두에서 발현된다. 각 FcγR은 뚜렷한 세포 발현 패턴을 갖는다. 활성화 FcγR의 관여는 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 식균 작용(phagocytosis) 및 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산과 같은 이펙터 메커니즘을 유도한다. 억제성 수용체인 FcγRIIB를 통한 신호전달은 염증성 면역 반응의 억제와 같은 부정적인 기능을 초래한다. 항체의 Fc 도메인에 의한 활성화 또는 억제성 FcγR의 관여는 IgG 서브클래스 및 Fc 글리칸 조성에 의해 결정된다(Pincetic, A. et al., Type I and type II Fc receptors regulate innate and adaptive immunity. Nat. Immunol. 15, 707-716, 2014).
수지상 세포는 종양에 침투하는 항원 제시 세포의 이질적인 집단이다. 수지상 세포는 국소 면역의 프라이밍과 유지에 중요한 역할을 하지만, 이들의 기능은 종양 미세환경에서 발생하는 요인에 의해 저하되거나 억제되는 경우가 종종 있다. 또한, 면역억제 활성을 갖는 수지상 세포 집단도 종양에 모집되어 T 세포 침윤을 제한하고 종양 성장(tumor growth)을 촉진한다. 수지상 세포의 활성화는 항종양 T 세포 면역을 프라이밍하는 데 중요한 역할을 하며, 이에 따라 암 면역요법의 주요 치료 표적을 나타낸다(Whily et al., Dendritic Cells and Cancer: From Biology to Therapeutic Intervention. Cancer 11, 4, 521. 2019).
지금까지 항체의 이론적 설계와 개발을 이끄는 주요 원칙은 면역 세포의 특정 수용체 표적에 대한 효과를 향상시키기 위해 Fab 도메인을 조작해야 할 필요성이었다. 그러나, 최근의 생체내 발견은 활성화 및/또는 억제성 FcγR을 발현하는 추가 유형의 면역 세포를 모집하여 체크포인트 항체 억제제의 효능을 향상시키기 위한 Fc 도메인의 중요성을 강조한다(Dahan, R. et al., Therapeutic Activity of Agonistic, Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcγR Engagement. Cancer Cell 29, 820-831, 2016; Vargas, F. A. et al., Fc Effector Function Contributes to the Activity of Human Anti-CTLA-4 Antibodies. Cancer Cell 33, 649-663.e4, 2018).　
활성화 FcγR의 Fc 관여는 항-CTLA4(세포독성 T-림프구 관련 단백질 4/CD125), 항-OX-40(CD134) 또는 항-4-1BB에 의한 종양내 조절 T 세포(Treg) 제거와 같은 항체 이펙터 기능을 유도하는 데 필요하다(Bulliard, Y. et al., OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcγRs, leading to anti-tumor efficacy. Immunol . Cell Biol . 92, 475-480, 2014; Buchan, S. L. et al., Antibodies to Costimulatory Receptor 4-1BB Enhance Anti-tumor Immunity via T Regulatory Cell Depletion and Promotion of CD8 T Cell Effector Function. Immunity 49, 958-970.e7, 2018). 또 다른 Fc 관여는, 예를 들어, 항 PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1) 및 항-CD73 mAb에 의해 종양 미세환경(TME)에서 FcγR+ 골수성 및 자연 살해 세포(NK)의 재프로그래밍을 유도할 수 있다(Bulliard, Y. et al., Activating Fc γ receptors contribute to the anti-tumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J. Exp . Med . 210, 1685-1693, 2013; Dahan, R. et al., FcγRs Modulate the Anti-tumor Activity of Antibodies Targeting the PD-1/PD-L1 Axis. Cancer Cell 28, 285-295, 2015; and Dahan, R. & Ravetch, J. V. Co-targeting of Adenosine Signaling Pathways for Immunotherapy: Potentiation by Fc Receptor Engagement. Cancer Cell 30, 2016).
반대로, 억제성 FcγRIIB의 관여는 항-CD40 mAb와 같은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)를 주로 표적으로 하는 작용성 mAb 활성을 향상시키기 위한 항체 가교결합을 위한 불활성 스캐폴드를 제공한다(Li, F. & Ravetch, J. V. Anti-tumor activities of agonistic anti-TNFR antibodies require differential FcRγIIB co-engagement in vivo. Proc . Natl . Acad . Sci ., 110(48), 19501-6, 2013). 따라서, 작용성 mAb는 생체내에서 여러 메커니즘(예: TNFR 활성화 및 Treg 고갈)을 통해 작동할 수 있으며, 이는 최적의 치료 효능을 위해 이들의 활성을 상승작용시킬 수 있다. 따라서, 각 항체에 적합한 스캐폴드(특정 FcγR 경로에 선택적으로 관여하거나 회피하는 IgG 이소형 또는 Fc 영역 변이체로 구성됨)의 선택은 최적의 항종양 활성을 달성하는 데 매우 중요하다.
상기 언급된 면역 체크포인트 분자 중 하나는 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(Glucocorticoid-induced TNFR related)(GITR, TNFRSF18 및 CD357이라고도 함) 단백질이다. GITR은 조절 T 세포(Treg)에서는 높은 수준으로, 나이브 및 기억 T 세포에서는 낮은 수준으로 구성적으로 발현되는 세포 표면 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다(G. Nocentini, C. Riccardi GITR: a modulator of immune response and inflammation. Adv Exp Med Biol, 647 156-173, 2009).
GITR 유발은 이펙터 T 림프구를 공동 활성화하고 조절 T 세포(Treg) 활성을 조절한다. GITR은 주로 항원 제시 세포(APC)에서 발현되는 GITR 리간드(GITRL)에 의해 활성화된다. GITR 활성화는 종양 및 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시키고, 자가면역/염증 과정에 관여하며 백혈구의 혈관외유출을 조절한다. 따라서, GITR은 이펙터 T 세포 기능을 촉진하고 조절 T 세포 억제를 방해하는 능력으로 인해 면역요법의 매력적인 표적이다.
다수의 상이한 자극에 의한 T 세포의 활성화는 조절 T 세포(Treg)와 이펙터 T 세포(Teff) 모두에서 24시간 이내에 GITR 발현을 빠르게 증가시킨다(L.T. Krausz, et al., GITR-GITRL system, a novel player in shock and inflammation. Scientific World Journal, 7 533-566, 2007). Treg 발달 및 기능의 핵심 조절 단백질인 FoxP3은 성숙한 T 세포에서 높은 수준의 GITR 발현을 촉진하는 반면, 활성화 T 세포에서는 표준 NFκB 신호전달이 GITR 발현을 유도하고, 이는 발현의 세포 유형 고유 조절을 시사한다(Y. Zhan, et al., Glucocorticoid-induced TNF receptor expression by T cells is reciprocally regulated by NF-kappaB and NFAT. J Immunol, 181 5405-5413, 2008).
낮은 수준 내지 중간 수준의 GITR은 또한 활성화 후 선천성 면역 세포에서 검출된다(S. Hanabuchi, et al., Human plasmacytoid predendritic cells activate NK cells through glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-ligand (GITRL). Blood, 107 3617-3623, 2006). 선천성 세포 유형 내에서, 가장 높은 유도는 활성화 T 이펙터(Teff) 세포에서 GITR 발현과 비슷한 수준으로 활성화 자연 살해 세포(NK)에서 관찰된다. 활성화 대식세포와 수지상 세포(DC)에서는 중간 수준만 나타난다(D.L. Clouthier, T.H. Watts Cell-specific and context-dependent effects of GITR in cancer, autoimmunity, and infection. Cytokine Growth Factor Rev, 25 91-106, 2014).
활성화 Treg에서 높은 수준의 GITR 발현은 GITR 조절의 생체내 평가 동안 더욱 분명해지는 중요한 차이점이다. 수많은 연구는 GITR 세포를 발현하는 종양 침윤성 Treg가 비소세포 폐 암종(Non-Small Cell Lung Carcinoma; NSCLC), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 흑색종(melanoma), 교모세포종(glioblastoma), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer) 및 난소 암종(ovarian carcinoma)과 같은 종양에 존재한다고 보고한다(Curiel, T., et al., Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med 10, 942-949, 2004., Zhu et al., Evaluation of glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR) expression in breast cancer and across multiple tumor types. Mod Pathol 33, 1753-1763, 2020; Vence L, et al. Characterization and Comparison of GITR Expression in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 2019, 25(21), 6501-6510).
항 마우스 GITR 항체는 항종양 활성을 위해 FcγR 매개 Treg 고갈 및 CD8 T 세포 증식에 의존하는 것으로 밝혀졌다(D. Coe, et al., Depletion of regulatory T cells by anti-GITR mAb as a novel mechanism for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunotherapy, 59, 1367-1377, 2010).
항-GITR 작용제 항체는 단독요법으로 또는 추가 면역요법과 병용하여 전임상 모델에서 입증된 바와 같이 이펙터 T 세포를 강화하고 종양 미세환경(TME)에서 Treg 반응을 억제함으로써 상당한 치료 가능성을 입증한다(A. D. Cohen et al., Agonist anti-GITR monoclonal antibody induces melanoma tumor immunity in mice by altering regulatory T cell stability and intra-tumor accumulation. PLoS One. 5, 2010; D. A. Schaer, J. et al., Modulation of GITR for cancer immunotherapy. Curr . Opin . Immunol. 24 217-224 2012; L. Lu, et al. Combined PD-1 blockade and GITR triggering induce a potent anti-tumor immunity in murine cancer models and synergizes with chemotherapeutic drugs. J Transl Med, 12, 36-47, 2014; Zappasodi R, et al. Rational design of anti-GITR-based combination immunotherapy. Nat Med. 2019, 25(5), 759-766). 그러나, 임상적 번역에는 상당한 장벽이 있었다: 유망한 전임상 활성은 아직 임상 시험에서 재현되지 않았다(Tran B., et al., Dose escalation results from a first-in-human, phase 1 study of glucocorticoid-induced TNF receptor-related protein agonist AMG 228 in patients with advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 2018, 6(1), 93; and Siu LL, et al., Preliminary results of a phase I/II a study of BMS-986156, glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related gene (GITR) agonist), alone and in combination with nivolumab in patients with advanced solid tumors. J Clin Oncol. 2017, 35(15_suppl),104).
DTA-1이라고 하는 항 마우스GITR(mGITR) 작용제 항체는 연구에 가장 널리 사용되는 IgG2b 래트 항체이다(J. Shimizu, et al., Stimulation of CD25+ CD4+ regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3, 135-142, 2002). 현재, 머크 앤드 코 인크(Merck & Co Inc.)의 MK-4166(US8709424), 인사이트 코프(Incyte Corp.)의 라기필리맙(US10155818), 리제네론 파마슈티컬스 인크(Regeneron Pharmaceuticals Inc.)의 REGN-6569(US10738126), 포텐자 테라퓨틱스 인크(Potenza Therapeutics Inc.)의 PTZ-522(US2018208665), 노바티스 아게(Novartis AG)의 GWN-323(US10662247), 및 브리스톨-마이어스 스퀴브 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co.)의 BMS-986156(US9228016)과 같은 전임상 또는 임상(1상/2상) 시험 중인 항체는 거의 없다. WO2015187835는 FcγRIIB에 대한 증가된 결합 및 증가된 ADCC 활성을 갖도록 조작된 Fc 영역을 갖는 항 인간 GITR(hGITR) 항체를 개시한다.
미국 특허 번호 7812135, 미국 특허 번호 1121358 및 US2019010241은 인간 GITR에 대한 특정 mAb를 개시한다.
미국 특허 번호 9040041은 조작된 인간 Fc를 포함하는 항체에 의해 항체 의존성 세포 식균 작용(ADCP)의 활성화를 향상시키는 방법을 개시한다. 조작된 항체의 단백질 표적은 Ep-CAM, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD40L, CD52, Her2/neu, EGFR, IGF-1 R, EpCAM, MUC1, GD3, CEA, CA 125, HLA-DR, MUC18 및 전립선 특이적 막 항원(PMSA)이다.
WO2019/125846은 개선된 이펙터 기능과 함께 hFcγRIIA, hFcγRIIIA 및 hFcγRIIB에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 종양 항원 sLeA에 특이적인 인간 IgG Fc 영역 변이체를 개시한다. 항체 중 하나인 hIgG1-G236A/A330L/I332E(GAALIE)는 활성 hFcRIIA 및 hFcRIIIA에 대한 향상된 결합 친화도 및 억제성 FcγRIIB에 대한 더 낮은 결합을 갖고, 또한 향상된 ADCC 활성을 나타낸다.
문헌(Weitzenfeld P., et al.)은 억제성 수용체인 hFcγRIIB에 대한 결합을 감소시키면서 활성화 hFcγR, hFcγRIIA 및 hFcγRIIIA 모두에 대한 친화도를 향상시키는 Fc 도메인의 특정 돌연변이의 조합을 포함하는 탄수화물 표적화 항체를 개시한다(Antibodies targeting sialyl Lewis A mediate tumor clearance through distinct effector pathways. J. Clin. Invest, 129, 3952-3962, 2019).　
미국 특허 번호 10479838은 FcγRIIB에 대한 결합의 특이성을 향상시키도록 변형된(modified) Fc 영역을 포함하는 CD40에 결합하는 특정 항체를 개시한다.
WO2003035835는 N297 연결 탄수화물에 푸코스(fucose)를 부착시키는 능력이 감소되어 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 세포주를 개시하고, 여기서 당단백질의 약 80-100%는 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조(mature core carbohydrate structure)를 포함한다. 생산된 항체는 인간 FcγRIIIA와 결합하고 푸코실화 항체에 비해 향상된 ADCC 활성을 갖는다. 개시된 항체 변이체 중 하나는 FcγRIIA 및 FcγRIIIB에 대한 증가된 결합을 갖는다.
항-인간 GITR 항체와 인간 FcγR 상호작용의 결과는 포괄적으로 다루어지지 않았으며, TME에서 Fcγ 수용체에 대한 선택적 결합을 통해 치료적 항 GITR 항체의 항종양 활성을 개선하기 위한 적절한 IgG 스캐폴드에 대한 미충족 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 일부 구현예에 따르면, 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR)에 결합하고, 이 단백질에 대해 이전에 공지된 항체와 비교하여 향상된 치료적 항종양 활성을 갖는 항체를 제공한다. 본 발명은 활성화 수용체 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 중 적어도 하나에 대한 결합을 증가시키고, 임의로 억제성 FcγRIIB 수용체에 대한 결합을 감소시키는 Fc 변형을 포함하는 항 GITR 항체를 제공한다. 본 발명의 Fc-변형 항체는, FcγRIIB에 비해 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 높은 결합 비율을 갖고, 따라서 FcγRIIB 매개 항체 가교결합에 관여할 수 없지만, 향상된 생체내 항종양 효과 및 장기 항종양 면역을 유도한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 동일한 Fab 영역을 갖고 FcγRIIB에 비해 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 결합 비율이 더 낮은 항체는 항종양 효과 및 장기 항종양 면역을 유도하지 못했다.
본 발명은 Fab 영역을 통해 GITR에, Fc 영역을 통해 활성화 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 수용체에 높은 친화도 및 특이성으로 결합하고, 억제성 수용체 FcγRIIB에 대해 필적할 만한 더 낮은 결합 친화도를 갖는 치료용 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 가짐을 특징으로 하며, 여기서 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 위치 236의 글리신 잔기의 알라닌 잔기로의 치환(G236A), 및 글리코실화 함량의 감소(예: 아푸코실화), 위치 330의 알라닌의 류신으로의 치환(A330L) 및 위치 332의 이소류신의 글루탐산으로의 치환(I332E)으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다. Fc 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 색인에 따른다.
따라서, 본 발명은 하나의 양태에 따라 GITR에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 항체는 가변 영역(Fab) 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)을 포함하고, 상기 항체는 동일한 Fab 및 모 비변형 인간 IgG1 Fc를 갖는 항체와 비교하여 (RIIA 및/또는 RIIIA)/RIIB에 대한 증가된 결합 비율을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 인간 IgG1 Fc 영역 변형은 RIIA/RIIB; RIIIA/RIIB; 및 (RIIA+RIIIA)/RIIB에 대한 항체의 결합 비율의 증가를 초래한다.
본 양태의 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 가변 영역(Fab)과 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하고, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음으로부터 선택된다:
i. 위치 297의 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A 및 전체 글리칸 구조 중 최대 약 40%의 푸코실화 함량을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(본원에서 afuco-G236A); 및　
ii. 위치 236의 글리신 잔기의 알라닌 잔기로의 아미노산 치환(G236A), 위치 330의 알라닌 잔기의 류신 잔기로의 치환(A330L), 및 위치 332의 이소류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(본원에서 GAALIE).
따라서, 본 발명은 일부 구현예에 따르면, 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 아푸코실화 항체(isolated afucosylated antibody)를 제공하며, 여기서 항체는 가변 영역(Fab), 및 위치 297에 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A를 포함하는 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)(본원에서 afuco-G236A)을 포함한다.　
본 발명은 또한 다른 구현예에 따르면, 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 가변 영역(Fab) 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)을 포함하고, 여기서 변형된 인간 IgG는 위치 236의 글리신 잔기의 알라닌 잔기로의 아미노산 치환(G236A), 위치 330의 알라닌 잔기의 류신 잔기로의 치환(A330L) 및 위치 332의 이소류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)(본원에서 GAALIE)을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, GITR은 인간 GITR(hGITR)이다.
일부 구현예에 따르면, 항체는 인간화 항체(humanized antibody)이다.
일부 구현예에 따르면, 항체는 키메라 항체(chimeric antibody)이다.
GITR, 특히 hGITR을 특이적으로 인식하는 항체의 임의의 결합 부위, 초가변 영역(HVR) 또는 Fab를 사용하여 본 발명의 IgG1-Fc 영역 변형 항체를 생성할 수 있다. 이는 작용제, 비작용제 및 혼합 작용제/비작용제 항체뿐만 아니라, hGITR에 대한 결합 후 반응을 유도하지 않거나 hGITR에 대한 결합과 관련된 임의의 활성을 매개하지 않는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포에서 hGITR에 대한 결합은 본 발명의 항체를 면역학적 시냅스의 필요한 위치에 표적화하기 위해서만 사용되는 반면, 변형된 Fc 영역은 FcγR 발현 세포에 대한 이들의 활성을 매개한다.
일부 구현예에 따르면, 항 hGITR 항체의 Fab는 MAPK 신호전달에 의해 매개되는 GITR 활성화를 유도하는 작용제 항체로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 항 hGITR 항체의 Fab는 비작용제 항체로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 항-hGITR 항체의 Fab는 인간 GITR에 특이적인 항체의 6개의 CDR 서열 세트를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 항체는 6개의 CDR 서열 세트를 포함하며, 여기서 세트는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
i. 서열 GFSLSTSGMG(서열번호 1)를 포함하는 중쇄(HC) CDR1, 서열 IWWDDDK(서열번호 2)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARTRRYFPFAY(서열번호 3)를 포함하는 HC CDR3, 서열 QNVGTN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄(LC) CDR1, 서열 SAS 또는 서열 SAST(서열번호 5)를 포함하는 LC CDR2, 서열 QQYNTDPLT(서열번호 6)를 포함하는 LC CDR3;　
ii. 서열 SYGMH(서열번호 7)를 포함하는 HC CDR1, 서열 VIWYEGSNKYYADSVKG(서열번호 8)를 포함하는 HC CDR2, 서열 GGSMVRGDYYYGMDV(서열번호 9)를 포함하는 HC CDR3, 서열 RASQGISSALA(서열번호 10)를 포함하는 LC CDR1, 서열 DASSLES(서열번호 11)를 포함하는 LC CDR2, 및 서열 QQFNSYPYT(서열번호 12)를 포함하는 LC CDR3; 및
iii. 서열 GYTFTRYW(서열번호 25)를 포함하는 HC CDR1, 서열 IYPGDGDT(서열번호 26)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARNPLTTATAWFVY(서열번호 27)를 포함하는 HC CDR3, 서열 ENIYSN(서열번호 28)을 포함하는 LC CDR1, 서열 AAT를 포함하는 LC CDR2 및 서열 QHFWGPPWT(서열번호 29)를 포함하는 LC CDR3.
각 옵션은 본 발명의 개별적인 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, afuco-G236A 항체는 다음 서열을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다:
일부 구현예에 따르면, 아푸코실화-G236A 항체는 다음 서열을 포함하는 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다:
일부 구현예에 따르면, afuco-G236A 항체는 서열번호 13에 제시된 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 14에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, GAALIE 항체(Fc 영역 치환 G236A, A330L 및 I332E)는 다음 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다:
일부 구현예에 따르면, GAALIE 항체는 서열번호 15에 제시된 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 14에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, Fc 영역 변형은 수지상 세포(DC)의 향상된 활성화, 염증성 사이토카인의 생산 또는 둘 다를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, Fc 영역 변형은 ADCC 활성의 향상을 초래하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, Fc 영역 변형은 수지상 세포의 활성화를 초래하여 ADCC의 향상 없이 DC 활성화 마커의 상향조절로 이어진다.
상기 기재된 항-hGITR 항체를 포함하는 접합체(conjugate)도 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 접합체는 검출 가능한 프로브 또는 본 발명의 항 GITR 항체에 부착된 독소와 같은 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 모이어티는 hGITR에 대한 결합 및 인간 FcγRIIA 및 FcγRIIIA에 대한 결합을 방해하지 않는 한 항체의 임의의 부분에 부착될 수 있다.
본 발명은 또한 또 다른 양태에 따르면, hGITR에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 항체의 적어도 하나의 쇄(chain)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 항체는 hGITR을 인식하는 가변 영역(Fab) 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)을 포함하며, 여기서 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음으로부터 선택된다:
i. 위치 279에 N과 치환 G236A를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; 및
ii. 아미노산 치환: G236A, A330L 및 I332E를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(본원에서 GAALIE).
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 hGITR에 대한 높은 친화도 및 특이성을 갖는 항체의 적어도 하나의 쇄를 인코딩하며, 여기서 항체는 위치 236의 아미노산 잔기 글리신의 알라닌 잔기로의 치환(G236A), 위치 330의 아미노산 잔기 알라닌의 류신 잔기로의 치환(A330L) 및 위치 332의 아미노산 잔기 이소류신의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)을 포함하는 변형된 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 기재된 항체의 아미노산 중쇄 또는 경쇄를 인코딩한다.
일부 구현예에 따르면, 인코딩된 중쇄는 인간 IgG1이다.
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 인간화 항체 및 키메라 항체에서 선택된 항체의 적어도 하나의 아미노산 쇄를 인코딩한다.
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13, 14 또는 15 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 항체 쇄를 인코딩한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13 및 서열번호 15로부터 선택된 서열 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 아미노산 서열을 인코딩한다.
일부 구현예에 따르면, 항체 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (서열번호 22); 및 (서열번호 23)으로부터 선택된 서열; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체에 제시되어 있다.
일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 제시된 서열 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다.
일부 구현예에 따르면, 항체 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 24에 제시된 서열 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
상기 개시된 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 벡터(vector), 플라스미드(plasmid) 및 작제물(construct)은 본 발명의 또 다른 양태에 따라 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 벡터, 플라스미드 또는 작제물은 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13 및 서열번호 15 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 벡터, 플라스미드 또는 작제물은 서열번호 13 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 서열번호 14의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 서열, 벡터 또는 작제물 중 적어도 하나를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단 또는 배양물을 제공하며, 여기서 이러한 세포는 상기 기재된 항체의 적어도 하나의 쇄를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 또 다른 양태에 따르면, 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 복수의 항체 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 각 항체 분자는 가변 영역(Fab) 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc 영역)을 포함하고, Fc 영역은 위치 297에 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A를 포함하고, 조성물 내 항체 분자의 약 65-100%는 Fc 영역의 위치 297의 아스파라긴 잔기(N)에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 조성물 내 항체 분자의 약 80-100%는 Fc 영역의 위치 297의 아스파라긴 잔기(N)에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조를 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 조성물 내 항체 분자의 약 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 80%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 Fc 영역의 위치 297의 아스파라긴 잔기(N)에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조를 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 항체 분자의 IgG Fc 영역의 적어도 70%, 75% 또는 80%는 비후코실화된다. 일부 특정 구현예에 따르면, 항체 분자의 약 60-80%는 아푸코실화된다. 각 옵션은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 인간 IgG1 Fc 영역의 20% 미만, 25% 미만 또는 30% 미만의 푸코실화를 포함하는 복수의 afuco-G236A 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 각 옵션은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 조성물은 비아푸코실화 항체와 비교하여 afuco-G236A 항체 분자의 인간 IgG1 Fc 영역의 N-297에 부착된 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 푸코스 모이어티를 함유한다. 각 옵션은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, GITR은 인간 GITR(hGITR)이다.
일부 구현예에 따르면, 항체 분자 각각의 Fab는 6개의 CDR 서열 세트를 포함하며, 여기서 세트는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
i. 서열 GFSLSTSGMG(서열번호 1)를 포함하는 중쇄(HC) CDR1, 서열 IWWDDDK(서열번호 2)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARTRRYFPFAY(서열번호 3)를 포함하는 HC CDR3, 서열 QNVGTN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄(LC) CDR1, 서열 SAS 또는 서열 SAST(서열번호 5)를 포함하는 LC CDR2, 서열 QQYNTDPLT(서열번호 6)를 포함하는 LC CDR3;　
ii. 서열 SYGMH(서열번호 7)를 포함하는 HC CDR1, 서열 VIWYEGSNKYYADSVKG(서열번호 8)를 포함하는 HC CDR2, 서열 GGSMVRGDYYYGMDV(서열번호 9)를 포함하는 HC CDR3, 서열 RASQGISSALA(서열번호 10)를 포함하는 LC CDR1, 서열 DASSLES(서열번호 11)를 포함하는 LC CDR2, 및 서열 QQFNSYPYT(서열번호 12)를 포함하는 LC CDR3; 및
iii. 서열 GYTFTRYW(서열번호 25)를 포함하는 HC CDR1, 서열 IYPGDGDT(서열번호 26)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARNPLTTATAWFVY(서열번호 27)를 포함하는 HC CDR3, 서열 ENIYSN(서열번호 28)을 포함하는 LC CDR1, 서열 AAT를 포함하는 LC CDR2 및 서열 QHFWGPPWT(서열번호 29)를 포함하는 LC CDR3.
일부 구현예에 따르면, 각각의 항체 분자는 서열번호 13에 제시된 중쇄 서열, 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 항체 분자는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에 따르면, 조성물은 적어도 하나의 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태이다.
GITR에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 적어도 하나의 항체 또는 항체 접합체 및 적어도 하나의 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 발명의 또 다른 양태에 따라 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 활성 성분으로서, GITR에 결합하는 가변 영역(Fab) 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음으로부터 선택된다:
i. 치환 G236A와 모든 글리칸 구조 중 20-40%의 푸코실화 함량을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(본원에서 afuco-G236A); 및
ii. 아미노산 치환: G236A, A330L 및 I332E를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(본원에서 GAALIE).
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 활성 성분으로서, 다음으로부터 선택된 항체 또는 복수의 항체를 포함한다: 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 아푸코실화 항체로서, 상기 항체가 가변 영역(Fab), 및 위치 297에 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A를 포함하는 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)(본원에서 afuco-G236A)을 포함하는, 단리된 아푸코실화 항체; 및 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체가 가변 영역(Fab), 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)을 포함하며, 상기 변형된 인간 IgG가 위치 236의 글리신 잔기의 알라닌 잔기로의 아미노산 치환(G236A), 위치 330의 알라닌 잔기의 류신 잔기로의 치환(A330L) 및 위치 332의 이소류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)을 포함하는(본원에서 GAALIE), 항체.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 활성 성분으로서, GITR에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 이의 접합체를 포함하며, 상기 항체는 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌(A)으로의 치환 및 모든 글리칸 구조 중 최대 40%의 푸코실화 함량을 포함하는 변형된 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 활성 성분으로서, GITR에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 이의 접합체를 포함하며, 상기 항체는 위치 236의 아미노산 잔기 글리신의 알라닌 잔기로의 치환(G236A), 위치 330의 아미노산 잔기 알라닌의 류신 잔기로의 치환(A330L) 및 위치 332의 아미노산 잔기 이소류신의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)을 포함하는 변형된 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 6개의 CDR 세트를 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1은 서열번호 1을 포함하고, 중쇄 CDR2는 서열번호 2를 포함하고, 중쇄 CDR3은 서열번호 3을 포함하고, 경쇄 CDR1은 서열번호 4를 포함하고, 경쇄 CDR2는 서열번호 5를 포함하고, 경쇄 CDR3은 서열번호 6을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 6개의 CDR 세트를 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1은 서열번호 7을 포함하고, 중쇄 CDR2는 서열번호 8을 포함하고, 중쇄 CDR3은 서열번호 9를 포함하고, 경쇄 CDR1은 서열번호 10을 포함하고, 경쇄 CDR2는 서열번호 11을 포함하고, 경쇄 CDR3은 서열번호 12를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 서열번호 13 및 15로부터 선택된 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 14의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물은 항체의 투여에 적합한 임의의 수단에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 정맥내(i.v.) 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 투여용으로 제형화된다.
hGITR의 면역 공동자극 활성(immune co-stimulatory activity)을 향상시키는 데 사용하기 위한, 상기 기재된 적어도 하나의 항체 또는 항체 접합체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 수지상 세포를 활성화하고, 식균 작용을 활성화하고, 전염증성 사이토카인의 생산을 향상시키는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 종양은 고형 종양(solid tumor)이다. 다른 구현예에 따르면, 암은 혈액암(hematological cancer)이다.
일부 구현예에 따르면, 암은 전이성 암(metastatic cancer)이다.
일부 특정 구현예에 따르면, 고형암은 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinoma; NSCLC), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 흑색종(melanoma), 교모세포종(glioblastoma), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer) 및 난소 암종(ovarian carcinoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 적어도 하나의 추가 항암 요법을 투여 또는 수행하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 추가 항암 요법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 및 호르몬 요법으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 항 hGITR 항체 또는 이의 접합체 및 추가 항암제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 추가 항암제는 면역 조절제, 종양 항원 또는 종양 세포에서 과발현된 수용체에 결합하는 제제 및 화학요법제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 종양 성장 또는 재발을 지연, 둔화 또는 예방하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 대상체(subject)에서 전이의 형성, 성장 또는 확산을 방지하거나 감소시키는 결과를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 항종양 효과를 향상시키는 결과를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 장기 항종양 면역의 유도를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양의 치료는 hGITR을 표적으로 하고 이펙터 세포의 Fc 영역 매개 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA 활성화에 의해 종양 미세환경을 조절하는 결과를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 hGITR을 통해 및 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA를 통해 이펙터 세포를 활성화함으로써 항종양 효과를 향상시키는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 장기 항종양 면역을 유도하는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키거나 억제하는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 수지상 세포를 활성화하는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 GITR을 표적으로 하고, 이펙터 세포의 Fc 영역 매개 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA 활성화에 의해 종양 미세환경을 조절하는 데 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 종양 성장 및 전이 형성 또는 확산을 지연, 둔화 또는 방지하는 데 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태 및 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이, 항 GITR 항체 또는 이의 접합체 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 hGITR의 활성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서 항 GITR 항체는 작용적 활성을 갖는다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 Fc 영역 변형 항-hGITR 항체 또는 이의 접합체의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법은 적어도 하나의 추가 항암 요법을 투여하거나 수행하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 추가 항암 요법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 및 호르몬 요법으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양을 치료하는 방법은 항 hGITR 항체 또는 이의 접합체 및 추가 항암제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 추가 항암제는 면역 조절제, 종양 항원 또는 종양 세포에서 과발현된 수용체에 결합하는 제제 및 화학요법제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 면역 조절제는 체크포인트 억제제이다.
일부 구현예에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법은 대상체에서 형성, 성장 또는 재발을 예방하거나 감소시키는 결과를 초래한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양을 치료하는 방법은 전이 형성 또는 확산을 지연, 둔화 또는 방지하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양을 치료하는 방법은 항종양 효과를 향상시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양을 치료하는 방법은 장기 항종양 면역을 유도하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암 또는 종양을 치료하는 방법은 hGITR을 표적으로 하고 이펙터 세포의 Fc 영역 매개 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA 활성화에 의해 종양 미세환경을 조절하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명은 수지상 세포를 활성화하고, 식균 작용을 활성화하고, 전염증성 사이토카인의 생산을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체의 투여를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 hGITR에 대한 적어도 하나의 Fc-변형 항체를 투여하는 단계를 포함하는, Treg를 예방, 지연, 고갈 또는 억제시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 포장 재료로 포장되고, 상기 포장 재료의 내부 또는 표면에서 인쇄로 식별되는, 상기 기재된 항체, 항체 접합체 또는 조성물을 포함하는 키트(kit)가 제공된다.
본 발명의 항 GITR 항체 또는 항체 접합체를 생산하고 정제하기 위한 방법도 그 범위 내에 포함된다. 재조합 항체를 생산, 단리 및 정제하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 항체는 중쇄 및 경쇄 쌍을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 세포로 일시적으로 형질감염시킴으로써 생산된다.
일부 구현예에 따르면, GITR에 대한 Fc-변형 항체를 생산하는 방법은 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 및 경쇄 쌍을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 플라스미드 또는 작제물을 세포로 형질감염시키는 단계;
(ii) 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(iii) 세포로부터 상기 쇄를 회수하는 단계.
다른 구현예에 따르면, 항체는 세포 내에서 조립되고, 세포 배양 상청액으로 분비된 다음, 회수, 분리 및 정제된다.
일부 구현예에 따르면, 분리 및 정제는 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다: 배양 배지를 수집하는 단계, 원심분리하여 세포 및 임의의 미립자 물질을 펠렛화하는 단계, 여과, 크로마토그래피를 사용한 정제 및 완충액 교환.
일부 구현예에 따르면, 크로마토그래피는 단백질 G 크로마토그래피이다.
특정 구현예에 따르면, 항체 단편의 인간화 항체는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 높은 수준의 순도(5% 미만의 숙주 세포 오염물 w/w 또는 w/v)로 정제된다.
아푸코실화 항체를 생산하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 Fc-아푸코실화 항체를 생산할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 항체의 아푸코실화는 아미노산 글리코실화 부위를 변형시키지 않고, 예를 들어, Fc의 위치 297에서 아스파라긴(N) 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키지 않고 수행된다.
일부 구현예에 따르면, 항체의 아푸코실화는 번역 후 형질감염 단계에서 수행된다.
일부 구현예에 따르면, 아푸코실화된 Fc 변형 항체를 생산하는 방법은 형질감염 배지에 50-500μM의 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스를 첨가하는 단계를 포함한다.
도 1a 및 1b는 작용성 항-GITR 항체에 대한 FcγR 경로의 개략도로서, FcγR 경로의 활성화(도 1a)와 항체 가교결합을 위한 스캐폴드로서의 FcγR의 관여(도 1b)를 모두 나타낸다.
도 2는 본 발명의 항체 중 일부를 생산하는 데 사용되는 예시적인 클로닝 전략의 개략도이다. 인간 IgG1을 클로닝하여 포유류 발현 벡터에 도입했다. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 불변 영역의 표지 밴드, hIgG1을 1% 아가로스 겔로부터 추출하여 항-마우스 GITR(mGITR)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)과 결찰시키고, Fc 영역 변이체 항체의 발현 및 생산에 사용했다.
도 3a-3b 래트 항 mGITR 항체 DTA-1을 기반으로 한 키메라 래트 항 mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체의 비환원(도 3a) 및 환원(도 3b) SDS-PAGE. 비환원 SDS-PAGE에서, 중쇄와 경쇄 사이의 이황화 결합은 온전하고, 따라서 온전한 항체의 크기에서 하나의 밴드만이 명백한 반면(도 3a), 환원 SDS-PAGE(도 3b)에서는 중쇄 약 50kDa를 나타내는 하나와 경쇄 약 25kDa를 나타내는 다른 하나인 두 개의 뚜렷한 밴드가 나타났다. 레인 1- 분자량 마커, 레인 2- 항-mGITR V11, 레인 3- 아푸코실화 항-mGITR, 레인 4- N279A, 레인 5- GAALIE, 레인 6- GASDALIE, 레인 7- G236A, 레인 8- 항-mGITR IgG1.
도 4는 플레이트 결합 마우스 GITR에 대한 여러 키메라 항 mGITR hIgG1 Fc 변형 변이체(항 mGITR DTA-1의 Fab를 포함함)의 유사한 결합 친화도를 보여주는 그래픽 표현이다. ELISA OD450 값은 테스트된 항체의 농도 증가에 대해 플롯팅했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 5a-5d는 표시된 hFcγR: hFcγRIa(도 5a), hFcγRIIA(도 5b), hFcγRIIB(도 5c) 및 hFcγRIIIA(도 5d)에 대한 키메라 항 mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체(DTA-1의 Fab를 포함함)의 차등 결합 친화도를 입증하는 그래프이다 . 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 6은 항체의 생체내 반감기로 측정된 여러 키메라 항 mGITR IgG1 Fc 영역 변이체(DTA-1의 Fab를 포함함)에 대한 약동학적 검정 결과를 묘사한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. n=3.
도 7a-7h는 키메라 항 mGITR hIgG Fc 영역 변이체의 차등 항종양 활성을 나타낸다. FcγR 인간화(hFcγR) 마우스에 MC38 세포를 접종하고, DTA-1 항체의 키메라 인간 Fc 영역 변이체로 처리했다. 마우스는 종양 진행과 전체 생존율에 대해 추적 관찰했다. 미처리 마우스(n=10)(도 7a), IgG1 치료(n=8)(도 7b), IgG1-N297A 치료(n=10)(도 7c), IgG1-V11 치료(n=10)(도 7d), IgG1-G236A 치료(n=9)(도 7e), Afuco-IgG1 치료(n=10)(도 7f). Fc 영역 변이체와 IgG1-N297A 그룹을 비교하기 위해 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하였고(도 7g), Fc 영역 변이체 사이의 생존 확률을 비교하였다(도 7h). 별표는 IgG1-N297A와의 통계적 비교를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 8a-8b는 장기 면역의 표시로서 종양 재도전 모델에서 항 GITR 치료에 의해 제공된 보호의 그래픽 표현이다. 이전 치료에 완전히 반응하여 종양 부재(tumor free)가 된 항 mGITR Fc 영역 변이체로 처리된 나이브 마우스 및 MC38 보유 hFcγR 마우스; IgG1(n=4), IgG1-N297A(n=1), IgG1-G236A(n=6), Afuco-IgG1(n=7)을 재도전시키고 종양 성장(도 8a) 및 생존 확률(도 8b)에 대해 추적 관찰했다. 별표는 나이브 마우스와의 통계적 비교를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 9a-9f는 항 mGITR mAb에 의한 종양의 재출현 및 기억 반응에 대한 장기 보호를 묘사한다. 이전 치료에 완전히 반응하여 종양 부재가 된 항-GITR Fc 영역 변이체로 처리된 MC38 보유 hFcγR 마우스를 CD4 및 CD8 세포를 고갈시키는 항체를 주사한 동일한 유형의 종양 부재 마우스와 비교했다. 각 Fc 영역 변이체 치료에 대한 T 세포 고갈 마우스와 비 T 세포 고갈 마우스의 종양 성장 비교: 미처리됨(n=6, 도 9a), IgG1-G236A(T 세포 고갈 n=4, 비 T 세포 고갈 n=2, 도 9b), Afuco-IgG1(T 세포 고갈 n=3, 비 T 세포 고갈 n=2, 도 9c) 및 Afuco-IgG1-G236A(T 세포 고갈 n=2, 비 T 세포 고갈 n=4, 도 9d). 시간 경과에 따른 종양 성장(도 9e)과 생존 확률(도 9f)을 비교했다. 별표는 동일한 Fc 영역 변이체로 처리된 T 세포 고갈 마우스와 비 T 세포 고갈 마우스 사이의 통계적 비교를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 10a-10c는 ELISA로 측정된 hFcγRIIA(도 10a), hFcγRIIIA(도 10b) 및 hFcγRIIB(도 10c)에 대한 키메라 Fc 영역 변형 항 mGITR(DTA-1 Fab) 변이체의 결합의 그래픽 표현이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 11a-11f는 Fc 영역 변형 키메라 항 마우스GITR 항체에 의해 매개되는 향상된 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 활성의 그래픽 표현이다. 인간화 FcγR 마우스에 MC38 세포를 접종하고, 종양이 평균 용적 115mm3에 도달하면 이들을 표시된 인간 Fc 영역 변이체로 처리하고 종양 진행에 대해 모니터링하였고: 미처리 마우스(도 11a), IgG1-G236A(도 11b), Afuco-IgG1(도 11c), Afuco-IgG1-G236A(도 11d), 모든 Fc 영역 변이체의 평균 종양 성장의 비교, 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 Afuco-IgG1-G236A와 Afuco-IgG1 그룹(도 11e) 및 생존 확률(도 11f)을 비교 했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 12a-12f는 키메라 항 mGITR hIgG Fc 영역 변이체의 향상된 항종양 활성의 그래픽 표현이다. 인간화 FcγR 마우스에 MC38 세포를 접종하고, 종양이 평균 용적 115mm3에 도달하면 이들을 표시된 키메라 항체 변이체(DTA-1 기반)로 처리했다. 마우스를 종양 진행을 위해 추적 관찰했다: 미처리 마우스(도 12a), IgG1(도 12b), IgG1-N297A(도 12c), Afuco-IgG1-G236A(도 12d), 모든 Fc 영역 변이체의 평균 종양 성장 비교, 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 Afuco-IgG1-G236A와 IgG1 그룹 사이(도 12e) 및 생존 확률(도 12f)을 비교했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 13a-13f는 항-GITR Fc 영역 변이체 치료 개시 후 1일, 4일 및 8일째 TME에서 T 세포 빈도를 나타낸다. 불응성 MC38 종양을 가진 인간화 FcγR 마우스를 키메라 항 mGITR Fc 영역 변이체 IgG1-N297A(NA), Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc) 및 IgG1로 처리했다. 마우스를 희생시키고, 치료 후 1일, 4일(총 2mAb 투여) 및 8일째(총 3mAb 투여)의 세 시점에 종양을 수거하고, 미처리 마우스를 대조군으로 사용했다. 도 13a-13c, CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 대해 검출된 Treg 빈도의 유세포 분석법 분석: 치료 개시 1일 후(도 13a), 치료 개시 4일 후(도 13b) 및 치료 개시 8일 후(도 13c). 도 13d-13f, CD45+CD3+CD11b-CD8+CD4-에 대해 검출된 CD8+빈도에 대한 유세포 분석법 분석: 치료 개시 1일 후(도 13d), 치료 개시 4일 후(도 13e) 및 치료 개시 8일 후(도 13f). 도 13g-13i, 마우스의 TME에서 CD8/Treg 비율: 치료 개시 1일 후(도 13g), 치료 개시 4일 후(도 13h) 및 치료 개시 8일 후(도 13i).
도 14a-14g는 Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc), IgG1 Fc-침묵 N297A(NA) 및 IgG1로 처리된 불응성 MC38 종양을 가진 인간화 FcγR 마우스의 TME 및 dLN 내 DC 활성화 상태의 유세포 분석법 분석을 묘사한다. TME와 dLN을 치료 개시 4일 및 8일 후 수거하고, 미처리 마우스는 대조군(미처리됨)으로 작용했다. DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 대해 검출되었고, 활성화 CD80 DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+ CD80+ CD86-에 대해 검출되었고, 활성화 CD86 DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+ CD80- CD86+에 대해 검출되었다. 도 14a는 치료 개시 4일 후 TME에서 DC의 백분율을 나타낸다. 도 14b는 치료 개시 4일 후 TME에서 활성화 CD80 DC의 기하학적 평균 형광 강도(gMFI)를 나타낸다. 도 14c는 치료 개시 4일 후 TME에서 활성화 CD86 DC의 gMFI를 나타낸다. 도 14d는 치료 개시 4일 후 dLN에서 DC의 백분율을 나타낸다. 도 14e는 치료 개시 4일 후 dLN에서 활성화 CD80 DC의 기하학적 평균 형광 강도(gMFI)를 나타낸다. 도 14f는 치료 개시 4일 후 dLN에서 활성화 CD86 DC의 gMFI를 나타낸다. 도 14g는 치료 개시 8일 후 TME에서 DC의 백분율을 나타낸다.
도 15a-15c는 hGITR 및 표시된 hFcγR에 대한 인간화 항 hGITR(TRX518) IgG1 Fc 영역 변이체의 차등 결합 친화도의 그래픽 표현이다. hGITR(도 15a) 및 인간 FcγRIIA(도 15b) 및 FcγRIIIA(도 15c)에 대한 항-인간 IgG1 Fc 영역 변이체의 결합 친화도는 비교 ELISA를 사용하여 평가했다. OD450 값은 플레이트 결합 단백질에 대한 결합을 평가하기 위해 테스트 항체의 농도 증가에 대해 플롯팅했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 16은 항 hGITR 항체로 치료 후 혈액 내 T 세포 빈도의 효과의 그래픽 표현이다. MC38 종양이 접종된 인간화 FcγR 및 hGITR 마우스는 모두 TRX518의 Fab를 포함하는 항 hGITR 항체 IgG1-N297A 및 Afuco-IgG1-G236A의 인간화 Fc 영역 변형 변이체로 처리했다. mAb의 한 번 투여 후, 다음 시점에 혈액을 수집했다: 치료 2일 전, 치료 2시간, 22시간 및 96시간 후. 데이터는 투키(Tukey)의 다중 비교 통계 테스트를 사용하여 평균 ± SEM 및 일반적 일원 ANOVA로 표시된다. 모든 그룹의 경우, n=5.
도 17a-17c는 항 hGITR 치료 후 TME에서 T 세포 주파수를 나타낸다. 불응성 MC38 종양을 가진 인간화 FcγR/GITR 마우스는 항 hGITR Fc 영역 변이체 IgG1-N297A(TRX518) 및 Afuco-IgG1-G236A로 처리했다. 종양은 치료 개시 후 4일째(총 2mAb 투여)에 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하고 CD4 FoxP3-(도 17a), CD8(도 17b) 및 Treg(도 17c)의 TME의 면역 구획의 조절에 대해 유세포 분석법으로 분석했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 통계 테스트가 수행되었다.
도 18a αNK1.1에 의한 NK 고갈 일정을 포함하여 혈액을 채혈하고 종양을 수거할 때 불응성 MC38 종양 세포의 접종으로부터 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시부터 4일째까지 생체내 NK 고갈 검정의 타임라인. Afuco-IgG1-G236A에 의한 Treg의 고갈을 위해서는 NK 세포 평가가 필요하다.
도 18b-18c afuco-IgG1-G236A 또는 IgG1 Fc-침묵 N297A(NA) 치료 개시 후 및 NK 세포 고갈 후 0일째(도 18b) 및 4일째(도 18c)에 마우스의 혈액 샘플에서 NK 세포의 유세포 분석법. NK 세포는 CD45+CD3-NKp46+에 대해 검출되었으며, PBS로 처리된 마우스의 혈액은 음성 대조군으로만 작용했다. 도 18d-18f는 종양 ㎎당 다음의 세포 계수를 묘사한다: NK 세포(도 18d), Treg 세포(CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 대해 검출됨, 도 18e) 및 CD8+ 세포(CD45+CD3+CD11b-CD8+CD4-에 대해 검출됨, 도 18f).
도 19a-19c는 대조군으로 작용한 단일특이적 Afuco-IgG1-G236A(DTA1 GA-aFuc, 원)와 비교하여 상이한 hFcγR에 대한 새로운 항-mGITR 이중특이적 변이체의 결합을 측정하는 ELISA 분석을 묘사한다. 비작용성 이중특이적 항체는 (i) Afuco-IgG1-G236A와 Synagsis 항체(GITR/Afuco-IgG1-G236A Syn, DTA1/Syn GA-aFuc, 삼각형) 및 (ii) IgG1-N297A 및 Synagsis(GITR/NA Syn DTA1/NA Syn, 거꾸로 된 삼각형)의 Fc 스캐폴드를 기반으로 하여 생성되었다. Ab는 FcγRIIA(도 19a), FcγRIIB(도 19b) 및 FcγRIIIA(도 19c)에 대한 결합에 대해 ELISA로 평가되었다. 도 19d, 트립신으로 분해된 이중특이적 항-GITR GITR/Afuco-IgG1-G236A Synagis 비작용적 항체의 HPLC 특성화.　
도 20a는 단일특이적 mIgG1-N297A(완전한 원)와 비교하여 "mGITR/NA Synagis"(DTA-1/Synagsis NA, 사각형)로 표시된 Fc에 N297A 치환이 있는 새로운 비작용제 이중특이적 항-mGITR mAb의 결합 용량을 묘사한다. 동형 대조군으로서 Fc 영역에 N297A 치환이 있는 비-GITR 결합 항체(동형 대조군 NA, 삼각형) 결합 용량은 ELISA로 검정하고, OD450 값은 표시된 항체의 농도 증가에 대해 플롯팅했다.
도 20b는 증가하는 농도의 항-mGITR/NA Synagis(DTA-1/Synagsis NA, 사각형), 단일특이적 mIgG1-N297A(DTA-1 NA 완전한 원) 또는 동형 대조군(삼각형)으로서 Fc 영역에 N297A 치환이 있는 비-GITR 결합 항체(동형 대조군 NA)로 배양 후 야생형(WT) 마우스(항-CD3 항체로 활성화됨)로부터 단리된 T 세포에 의한 IL-2 분비를 묘사한다. ELISA는 Ab로 배양된 활성화 T 세포의 상청액에 대해 수행하였다.
도 21 상이한 치료 후 MC38 종양을 가진 hFcγR 마우스의 TME에서 Treg의 퍼센트의 유세포 분석법 분석. 마우스는 100μg, 200μg, 또는 400μg의 비작용적 이중특이적 Ab의 인간화 GA-aFuc Fc 영역 변이체(GITR/syn GA-aFuc) 또는 100μg의 마우스 항-DTA-1(항-GITR) GA-aFuc Ab로 처리했다(IP). 미처리 마우스의 종양과 음성 대조군을 분석했다.
도 22a-22c는 100μg의 GA-aFuc Ab(완전한 삼각형) 또는 200μg의 비작용적 GITR/syn GA-aFuc Ab(빈 삼각형)로 치료 후 MC38 종양을 가진 hFcγR 마우스에서 종양 용적(mm3) 진행을 묘사한다. 미처리 마우스는 대조군(전체 원)으로 작용했다. 도 22a는 20일 종양 용적 측정을 묘사한다. 도 22b는 치료 개시로부터 13일째에 모든 그룹의 마우스의 종양 용적을 묘사한다. 도 22c는 치료 개시로부터 15일째에 GA-aFuc Ab 및 GITR/syn GA-aFuc Ab 테스트 그룹의 마우스의 종양 용적을 묘사한다.
도 23a-23b MC38 종양을 가진 hFcγR 마우스의 TME에서 각각 200μg의 GITR/syn GA-aFuc(삼각형) 및 100μg의 GA-aFuc(사각형)로 처리 후 Treg 및 수지상 세포(DC)의 퍼센트의 유세포 분석법 분석. 미처리 마우스의 종양뿐만 아니라 음성 대조군(원)을 분석했다. Treg는 CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 의해 검출되었고, DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 의해 검출되었다.
도 23c-23d 각각 CD80+ 또는 CD86+ 발현 DC의 퍼센트를 검출하여 DC의 활성화의 유세포 분석법 분석. 미처리 마우스의 종양 뿐만 아니라 음성 대조군을 분석했다. DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 의해 검출되었고, CD80+ DC는 항-CD80의 첨가로 검출되었으며, CD86+ DC는 항-CD86의 첨가로 검출되었다.
도 24a는 MC38 종양을 가진 야생형 WT C57BL/6J 마우스에서 100μg의 DTA-1 mIgG2a(사각형) 또는 100μg의 항-GITR-mIgG2a N279A Ab(DTA-1 mIgG2a NA, 빈 삼각형)로 치료 후 17일간 종양 용적 진행 감시를 묘사한다. 미처리 마우스는 대조군(완전한 원)으로 작용했다. 도 24b-24e, 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab(사각형) 및 100μg의 DTA-1 mIgG2a NA(삼각형)으로 처리된 MC38 종양을 가진 WT 마우스 또는 대조군으로 사용된 미처리 마우스(원)의 TME에서 면역 구획의 조절을 위한 유세포 분석법 분석. 종양은 치료 후 4일째에 수거하여 분석했다. 도 24b, 모든 테스트 그룹에서 항-FoxP3을 사용하여 검출된 Treg 계수/종양 ㎎. 도 24c, 모든 테스트 그룹에서 전체 림프구 중 DC 백분율(항-CD11c/항-CD45를 사용하여 검출됨). 도 24d, 모든 테스트 그룹에서 CD80+ 활성화 DC의 델타 gMFI. 도 24e, 모든 테스트 그룹에서 CD86+ 활성화 DC의 델타 gMFI.
도 25, 100μg의 DTA-1 mIgG2a(사각형) Ab 및 100μg의 DTA-1 mIgG2a-NA Ab(삼각형)로 처리된 MC38 종양을 가진 BATF3-/- 마우스 또는 대조군으로 사용된 미처리 마우스(원)에서 13일 동안 종양 용적(mm3) 측정의 그래픽 표현.
도 26a-26b, 각각 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab, 20ng/gr 체중 디프테리아 독소(DT), 또는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab와 20ng/gr 체중 DT의 조합으로 처리된 XCR1-iDTR 및 ZBTB46-iDTR NC38 종양 보유 마우스에서 종양 용적(mm3) 진행의 그래픽 표현. 미처리 마우스는 대조군으로 사용되었다. DT는 격일로 20ng/g씩 주사하여 DC를 고갈시켰다. 도 26a DT 매개 유도성 cDC1 세포 고갈 모델인 XCR1-iDTR XCR1-iDTR 마우스에서 13일 종양 용적(mm3) 진행. 도 26b DT 매개 유도성 cDC1 및 cDC2 세포 고갈 모델인 ZBTB46-iDTR 마우스에서 20일 종양 용적(mm3) 진행.
도 27a-27b, 100μg의 마우스 항-GITR Ab, 100μg의 항-CD25 Ab로 처리된 MC38 종양 보유 마우스 또는 미처리 마우스로부터 각각 TME 내 Treg의 백분율 및 dLN 내 DC의 백분율. 장기는 치료 후 4일째에 수거했다.
도 27c-27d는 100μg의 마우스 항-GITR Ab, 100μg의 항-CD25 Ab로 처리된 마우스 또는 미처리 마우스의 dLN에서 각각 CD80+ 및 CD86+ 활성화 DC의 델타 gMFI를 묘사한다. dLN은 치료 후 4일째에 수거했다. 도 27c는 CD80+ 활성화 DC의 델타 gMFI를 묘사한다. 도 27d는 CD86+ 활성화 DC의 델타 gMFI를 묘사한다.
도 28a-28c는 100μg/마우스의 IgG1-N297A(N297A) 또는 IgG1-GAALIE(GAALIE)로 3회 처리된 MC38 종양 보유 마우스의 종양 용적 진행을 묘사한다. 미처리 마우스는 대조군으로 사용되었다. 각 선은 한 마리의 동물을 나타낸다.
도 28d, 각 치료 그룹 IgG1-N297A(N297A, n=8), IgG1-GAALIE(GAALIE, n=9), 대조군, 미처리 마우스(미처리 n=8)에 대한 평균 종양 용적 진행의 그래픽 표현. 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 IgG1-N297A 그룹과 IgG1-GAALIE 그룹을 비교했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
상기 본원에 개시된 임의의 구현예는 임의로 본원에 개시된 또 다른 구현예의 하나 또는 임의의 조합의 주제와 결합될 수 있다. 본 발명의 추가 구현예 및 적용 가능성의 전체 범위는 이하에 제공되는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 단지 예시로서 제공되는 것임이 이해되어야 한다.
본 발명의 상세한 설명　
본 발명은 변형된 인간 IgG1 Fc를 포함하고, FcγRIIB에 대한 결합에 비해 활성화 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 향상된 결합 비율을 나타내 종양 성장 및 전반적인 생존의 조절을 강화하는 인간 단백질 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(hGITR, CD357 또는 TNFRSF18이라고도 함)에 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명의 Fc-변형 항 hGITR 항체는 2개의 전략- 당 조작, 즉 당 모이어티의 함량을 변경하고(예: 아푸코실화), 하나 이상의 아미노산의 치환(예: G236A)에 의한 단백질 조작을 결합하여 설계되었다. 본 발명의 항 GITR 항체를 개발하는 과정에서, 인간 FcγR 마우스에서 초기 실험을 수행하여 인간 IgG1 Fc 영역 및 이의 변이체를 포함하는 키메라 항 마우스 GITR 항체를 테스트했다. 유망한 항종양 활성에 따라, 변형된 hIgG1 Fc 영역을 포함하는 항 hGITR 항체를 생성하고, 인간 FcγR-인간 GITR 마우스 모델에서 테스트했다.
본 발명의 항체에 의한 FcγRIIB에 대한 감소되거나 변하지 않은 결합 친화도에 비해 FcγRIIA 및/또는 FcγRIIIA에 대한 향상된 친화도는 활성화/억제 비율의 상당한 증가를 초래한다. 이 비율은 차례로 항종양 효과 및 장기 항종양 면역을 유도하는 수지상 세포의 활성화, 식균 작용 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해 면역계를 자극하는 항체의 능력과 직접 관련되어 있다. 놀랍게도, 본 발명의 Fc 변형 항체는 GITR 수용체를 활성화할 필요 없이 항종양 면역 활성을 향상시킨다.
작용 메커니즘의 임의의 이론에 결부시키지 않고, 활성화 수용체에 대한 결합에 비해 FcγRIIB에 대한 본 발명의 항 hGITR 항체의 Fc-변형 IgG1의 결합의 감소는 항체의 가교결합 활성을 손상시키는 것으로 제안된다. FcγRIIB에 대한 결합을 통해 항체 가교결합 메커니즘은 TNFR 계열 구성원에 대해 작용적 활성을 향상시키는 데 있어 역할로 공지되어 있다. 놀랍게도, 본 발명의 Fc-변형 항 hGITR 항체는 이러한 가교결합 없이도 항종양 활성의 상당한 향상을 입증한다.
실질적으로 동일한 항원 결합 부위를 포함하는 항체(예: 본원에서 "IgG1", "IgG1-N297A" 또는 "V11"로 지칭되는 항체)와 비교하여, 본 발명의 항체(예: "아푸코실화IgG1-G236A" 또는 "afuco-G236A" 및 "GAALIE"로 지칭되는 항체)는 억제성 수용체 FcγRIIB에 대한 결합에 비해 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 활성화 수용체 모두에 대한 향상된 결합을 나타냈다. FcγRIIB에 대해 높은 친화도를 나타내는 "V11" Fc 변이체는 항종양 효과 및 장기 항종양 면역을 유도하지 못했다.
본 발명의 항 hGITR 항체는 Fc-매개 고갈 메커니즘에 의해 TME에서 Treg 주파수를 감소시킨다. CD4 Treg 감소는 Fc-변형 Afuco-G236A 항체에 의해 초기 시점에 발생한다. 항 hGITR-매개 Treg 고갈은 FcγR 의존적이다. 본 발명의 Afuco-G236A 항 hGITR 항체는 FcγR 매개 Treg 고갈을 입증한 반면, Fc 영역 침묵 항체인 현재 임상 시험 중인 항체 TRX518은 Treg 고갈을 매개하지 않는다. 또한, 본 발명의 Afuco-G236A Fc 변형 변이체는 테스트된 모든 Fc 영역 변이체 중에서 종양 및 배액 림프절(dLN) 내 두 DC 활성화 마커인 CD80 및 CD86의 밀도에서 가장 높은 증가를 입증했다. IgG1 Fc-침묵 N297A는 CD80 또는 CD86 마커의 증가를 나타내지 않았다.
다시 한 번, 예기치 않게, 본 발명의 Fc 변형 항체는 주로 활성화 수용체와 결합하지만 가교결합을 향상시키지 않고, 상이한 Fc 스캐폴드를 갖는 유사한 항체와 비교하여 증가된 항암 활성을 입증한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, TNF 수용체 슈퍼패밀리 18(TNFRSF18), AITR, CD357, ENERGEN 또는 GITR-D로도 공지된 용어 "글루코코르티코이드 유도 TNFR 계열 관련 수용체(본원에서 "GITR"로 약칭됨)는 종양 괴사 인자/신경 성장 인자 수용체 계열의 구성원을 지칭한다. 인간 구성원은 세포외 도메인에서 3개의 시스테인 의사반복체를 특징으로 하는 유형 I 막관통 단백질이다(Nocentini, G. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94:6216-622). 본 발명의 Fc-변형 항체는 인간 암세포 및/또는 인간 면역 세포에서 발현되는 임의의 인간 GITR 단백질 변이체에 대해 지시될 수 있다. 인간 단백질 변이체에 대한 비제한적인 예로는 수탁 번호 NM_004195.3, 수탁 번호 NP_004186.1 및 GI: 4759246의 241개 아미노산 단백질, 수탁 번호 NP_683699.1 및 GI: 23238194의 255개 아미노산 단백질, 수탁 번호 NP_683700.1 및 GI: 23238197의 234개 아미노산 단백질이 포함된다. 비제한적인 예시적인 마우스 GITR 단백질 변이체 수탁 번호는 NM_021985.3, 수탁 번호 NP_068820.1 및 NM_009400.3의 132개 아미노산 단백질, 수탁 번호 NP_033426.1의 228개 아미노산 단백질이다.
항체 또는 면역글로불린은 이황화 결합에 의해 함께 연결된 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 포함하며, 각 경쇄는 "Y"자형 배열로 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 연결된다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VH)에 이어, 다수의 불변 도메인(CH)을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고, 다른 쪽 말단에 불변 도메인(CL)을 가지며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되고 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 경쇄와 중쇄 각 쌍의 가변 도메인은 항원 결합 부위(Fab)를 형성한다. 경쇄와 중쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)으로 공지된 3개의 초가변 도메인에 의해 연결된, 서열이 상대적으로 보존된 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 이러한 도메인은 항원 결합 부위의 특이성과 친화성에 기여한다.
"프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고, 각 전장 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다. 제공된 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol . Biol. 262, 732-745." ("Contact" numbering scheme); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan, 27(1):55-77 ("IMGT" numbering scheme); Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" numbering scheme); and Whitelegg NR and Rees AR, "WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB," Protein Eng. 2000 Dec;13(12):819-24 ("AbM" numbering scheme)]에 기재된 것들을 포함하여 임의의 다수의 익히 공지된 방식을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.　
주어진 항체 분자의 CDR 서열을 결정하기 위한 당업계에 공지된 여러 가지 방법이 있지만, 표준적인 명확한 방법은 없다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 CDR 서열의 결정은 카바트(Kabat), 초티아(Chothia) 및 IMGT 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 선택된 CDR 세트는 하나 이상의 방법에 의해 식별되는 서열을 포함할 수 있고, 즉 일부 CDR 서열은, 예를 들어, 카바트를 사용하여 결정될 수 있고, 일부는 IMGT를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 항체 가변 영역의 CDR 서열은 카바트 및/또는 초티아 방법을 사용하여 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 카바트, 초티아, IMGT, Aho, AbM 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, CDR은 카바트를 사용하여 정의된다.
변경(예: 치환)은, 예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 체세포 성숙 동안 높은 돌연변이율을 갖는 코돈을 인코딩하는 CDR에서 이루어질 수 있고(예: Chowdhury, Methods Mol. 207:179-196 (2008)), 생성된 변이체는 결합 친화도에 대해 테스트될 수 있다. 친화도 성숙(예: 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 쇄 셔플링, CDR의 무작위화 또는 부위/올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발을 사용)을 사용하여 항체 친화도를 개선할 수 있다(예: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)). 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다(예: Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)). 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
본 발명의 범위 내에 키메라 항체, 인간 및 인간화 항체, 재조합 및 조작된 항체 및 이들의 접합체가 추가로 포함된다. 또한, 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 다른 항체를 인코딩하는 DNA에 삽입하여 키메라 항체를 생성할 수 있다.
본원의 항체는 특이적으로 "키메라" 항체를 포함한다. 키메라 항체는 분자이며, 이의 상이한 부분은 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들과 같은 상이한 동물 종으로부터 유래된다. 실질적으로 인간 항체로부터 유래된 가변 영역 프레임워크 잔기와 실질적으로 마우스 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역을 갖는 항체는 또한 인간화 항체로서 지칭된다. 키메라 항체는, 예를 들어, 뮤린 mAb가 하이브리드마에서 더 높은 수율을 갖지만 인간에서 더 높은 면역원성을 갖는 경우, 인간/뮤린 키메라 mAb가 사용되도록 주로 적용에서 면역원성을 감소시키고 생산 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 키메라 항체 및 이들의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다(예: PCT 특허 출원 WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 및 미국 특허 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, 5,530,101 및 5,225,539).
비인간(예: 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정교하게 하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 루프에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 전형적으로 변형된 인간 면역글로불린 불변 영역(Fc)을 포함한다.
비인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 한 가지 방법에서, 비인간 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 항체 또는 컨센서스 항체 프레임워크 서열에 삽입(그래프팅)된다. 그런 다음, 친화도 또는 면역원성을 조절하기 위해 항체 프레임워크에 추가 변화를 도입할 수 있다.
예를 들어, 퀸 등(Queen et al.)의 미국 특허 5,585,089는 인간화 면역글로불린 및 이의 제조 방법을 개시하고, 여기서 인간화 면역글로불린은 공여자 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함하고, 상기 인간화 면역글로불린은 카바트 및 초티아 CDR 외부의 공여자 면역글로불린 프레임워크의 아미노산을 포함하며, 여기서 공여자 아미노산은 수용체 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프레임워크에서 상응하는 아미노산을 대체한다. 윈터(Winter)의 미국 특허 5,225,539호는 또한 변경된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 제조 방법을 개시하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편의 가변 도메인은 제1 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역과 제2 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역을 갖고, 상기 제2 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인은 항원 결합 특이성, 항원 결합 친화도, 종, 부류 또는 하위부류에서 상기 제1 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 상이하다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 해당 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다(Vaughan et al. Nature Biotechnology 1996 14,309-314; Sheets et al. PNAS (USA), 1998, 95, 6157-6162); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 1991, 227, 381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222, 581). 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자좌를 유전자도입 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 도전시, 인간 항체 생산이 관찰되고, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 측면에서 인간에게서 나타나는 것과 매우 유사하다. 이 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 및 다음 과학 간행물에 기재되어 있다: Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화되었을 수 있다). 예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "부위 지정 돌연변이유발"은 맞춤 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 이중 가닥 DNA 플라스미드에 목적하는 돌연변이를 부여하는 시험관내 절차를 지칭한다. 가장 널리 사용되는 방법은 표준 프라이머를 사용한 역 PCR에 의해 플라스미드에 돌연변이를 통합한다. 예를 들어, 이러한 방법 중 하나는 목적하는 특정 치환을 도입하도록 설계된 중복 프라이머 특수 친화도를 활용한다.
친화도는 단일 분자가 이의 리간드에 결합하는 강도이다. 이는 전형적으로 측정되어 평형 해리 상수(KD)로 보고되며, 이는 이중 분자 상호작용의 순서 강도를 평가하고 순위를 매기는 데 사용된다. 항체와 이의 항원의 결합은 가역적 과정이며, 결합 반응의 속도는 반응물의 농도에 비례한다.
KD는 항체와 이의 항원 사이의 koff/kon의 비율인 평형 해리 상수이다. KD와 친화도는 반비례적으로 관련된다. KD 값은 항체의 농도(특정 실험에 필요한 항체의 양)와 관련되며, 따라서 KD 값이 낮을수록(농도가 낮을수록) 항체의 친화도는 더 높아진다.
Ki는 분자와 이의 리간드(예: 항체와 항원, 효소와 리간드)의 결합 친화도를 기재하는 데 사용되는 억제 상수를 지칭한다. Ki는 또한 해리 상수를 KD로 나타내지만, 결합이 결합 분자의 활성을 감소시키는 리간드의 결합에 대해서는 더 좁은 의미로 나타낸다. Ki 값으로 기재되는 결합 평형은 억제의 운동 메커니즘에 따라 달라진다.
Ki는 비제한적인 예에 대해 경쟁 ELISA에 의한 억제 동역학을 통해 측정되는 반면, 결합이, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 보다 직접적으로 측정되는 경우 'KD'가 바람직하다(Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors. Biosens Bioelectron. 2010, 25: 957-66). 더 낮은 KD 및 Ki 값은 더 높은 친화도와 억제를 반영한다.
모노클로날 항체의 Fc 영역은 적응 면역 반응과 선천성 면역 반응 사이의 중요한 가교 역할을 한다. 암세포, 바이러스 감염 세포 또는 침입하는 병원체의 표면에서 발현된 항원이 특정 항체에 의해 인식되면, 세포 또는 병원체는 항체로 코팅된다. 이러한 표면에 결합된 항체의 Fc 영역은 상이한 메커니즘을 통해 표적의 제거를 돕는다. 첫째, 이는 보체 시스템의 C1 분자와 상호작용하고, 보체 시스템의 고전적인 경로의 활성화를 유발할 수 있다. 이는 또한 Fc 수용체를 통해 식세포를 모집하고 식균작용(ADCP) 경로 및, NK 세포 대식세포 및 추가 이펙터 세포에 의해 매개되는 ADCC를 활성화할 수 있다. 이러한 메커니즘 중, 리툭시맙(항 CD20)과 트라스투주맙(항 HER2/neu, 헤르셉틴으로도 공지됨)에 대한 연구는 ADCC/ADCP가 암세포를 제거하는 주요 작용 메커니즘임을 시사했다.
이하에서 사용되는 용어 "수지상 세포(DC)의 활성화"는 병원체, 염증성 자극 또는 T 헬퍼 림프구에 의해 유발되는 과정을 지칭한다. DC의 활성화는 여러 가지 변화를 설정하여 활성화 DC가 가장 효율적인 항원 제시 세포로 형질전환되도록 한다. 이러한 변화 중 하나는 활성화 DC의 마커 역할을 하는 CD80 및 CD86과 같은 T 세포에 대한 공동자극 분자의 표면 발현의 현저한 증가이다.
본 발명의 Fc 영역 변형은 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 첨가 또는 결실을 초래하는 부위/올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발에 의해 이루어지거나, Fc 영역의 글리코실화 수준에서, 예를 들어, 적어도 하나의 올리고당(N-글리칸) 모이어티의 제거 또는 첨가에 의해 또는 보다 구체적으로 푸코스 단위의 감소(아푸코실화)에 의해 실행될 수 있다.
본원에서 용어 다음에 사용된 바와 같이, "아푸코실화 항체"는 변형되지 않은 IgG1을 포함하는 모 항체에 비해 그의 Fc 영역이 상당히 감소된, 즉 50% 이상 감소되거나, 글리칸 구조에 푸코스가 없는 항체를 지칭한다.
본 발명의 일부 구현예에 따른 현저하게 감소된 푸코실화는 모든 글리칸 구조 중 최대 약 40%의 푸코스 함량 또는 수준을 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 항체는 모든 글리칸 구조 중 20 내지 40%의 푸코스를 Fc 영역에 포함한다.
아푸코실화, 즉 항체 Fc 내 푸코스 함량의 감소는 푸코실화 메커니즘이 유전적으로 녹아웃, 차단 또는 변경된 세포주(예: CHO 세포)를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 아푸코실화는 번역 후 수행된다.
아푸코실화는 또한 다음 비제한적인 접근법 중 어느 하나에 따라 수행될 수 있다:
(i) GDP-푸코스의 정상적인 합성을 방해하고 코어 푸코실화를 억제하는 푸코실트랜스퍼라제(FUT) 억제제, 예를 들어, L-푸코스 유사체, 2-플루오로 퍼아세틸화 푸코스(2FF)(Mishra N et al., "Comparison of two glycoengineering strategies to control the fucosylation of a monoclonal antibody". J Biotechnol. 2020; Zhou, Y., et al., "Inhibition of fucosylation by 2-fluorofucose suppresses human liver cancer HepG2 cell proliferation and migration as well as tumor formation". Sci Rep 7, 11563 (2017)).　
(ii) 아푸코실화 항체 생산을 위한 숙주 세포주로서의 Lec13 세포(Shields R.L., et al., Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. J Biol Chem. 2002, 277:26733-40).
(iii) 완전히 아푸코실화된 N-글리칸을 가진 항체를 생산하기 위한 GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제/4 리덕타제(FX)-녹아웃 CHO 세포주(Louie S., et al., FX knockout CHO hosts can express desired ratios of fucosylated or afucosylated antibodies with high titers and comparable product quality. Biotechnol Bioeng. 2017, 114:632-44).
(iv) 모 세포주에서 생성된 동일한 항체와 비교하여 완전 아푸코실화 항체를 발현하는 것으로 나타난 FUT8(푸코실트랜스퍼라제 8) -/- 세포주(Yamane-Ohnuki, N. et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: An ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnology and bioengineering, 87, 614-622).
(v) CHO 세포보다 더 낮은 수준의 Fut8(푸코실트랜스퍼라제 8) mRNA를 갖는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포(Shinkawa T. et al., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem. 2003 Jan 31, 278(5):3466-73).
(vi) FUT8 siRNA CHO 세포(Mori K. et al., Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using. Biotechnol Bioeng, 2004, 88:901-8).
(vii) EPO-Fc 융합 단백질에 부착된 N-글리칸과 CHO-gmt3 세포에서 생성된 IgG1 항체에 코어 푸코스의 완전한 결여를 나타낸 CHO-gmt3(CHO-글리코실화 돌연변이체3) 세포(Chan K. F. et al., Inactivation of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnol J. 2016, 11:399-414).
(viii) IgG 항체에서 최고 수준의 이분화 및 아푸코실화 글리칸을 생성하는 GnT-III 및 αManII를 모두 과발현하는 CHO 세포(Ferrara C. et al., Modulation of therapeutic antibody effector functions by glycosylation engineering: influence of Golgi enzyme localization domain and co-expression of heterologous beta1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase III and Golgi alpha-mannosidase II. Biotechnol Bioeng, 2006, 93:851-61).
(ix) 아푸코실화 항체 생산을 위한 세포주의 유전 공학을 포함하는 기존 플랫폼을 보완하기 위해 항체 푸코실화를 억제하는 소분자(Okeley et al., Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110:5404-9).
(x) 식물과 같은 대체 발현 플랫폼(Loos A. IgG-Fc glycoengineering in non-mammalian expression hosts. Arch Biochem Biophys, 2012, 526:167-73).
일부 구현예에 따르면, 아푸코실화는 형질감염 배지에 20-600μM의 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스를 첨가함으로써 수행된다.
항체 푸코스 함량 및 아푸코실화 속도는 질량 분석법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
서열 동일성은 두 개의 상이한 서열 사이에서 정확히 일치하는 아미노산 또는 뉴클레오티드의 백분율이다. 서열 유사성은 아미노산의 보존적 치환이 동일한 아미노산으로 결정될 수 있도록 허용한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 항체 쇄의 인코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않지만, 예를 들어, 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
항체 서열의 변이체, 유사체 및 유도체도 본 출원의 범위 내에 있다. 이들은 서열 내 아미노산의 보존적 및 비보존적 치환, 삽입 및 결실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형 및 생성되는 항체 유사체 또는 변이체는 이들이 hGITR 및 인간 FcγR에 대한 결합 프로파일을 부여하거나 심지어 개선하는 한 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "항체 변이체"는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 및/또는 이의 Fc 영역의 글리코실화 함량의 변화에 의해 또 다른 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다. 인코딩된 단백질의 전체 분자 구조를 보존하는 본 발명에 따른 변이체가 만들어질 수 있다. 개시된 단백질 생성물을 포함하는 개별 아미노산의 특성을 감안할 때, 일부 합리적인 치환은 숙련된 작업자에 의해 인식될 것이다.
당업자에게 공지된 아미노산의 보존적 치환은 본 발명의 범위 내에 있다. 보존적 아미노산 치환은 한 아미노산을 동일한 유형의 작용성 그룹 또는 측쇄를 갖는, 예를 들어, 지방족, 방향족, 양전하, 음전하를 띤 또 다른 아미노산으로의 대체를 포함한다. 이러한 치환은 경구 생체이용률, 침투, 특정 세포 집단에 대한 표적화, 면역원성 등을 향상시킬 수 있다. 숙련가는 단일 아미노산 또는 인코딩된 서열에서 작은 백분율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서 변경은 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 초래한다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 한 표에 따르면, 다음 6개 그룹은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:　
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);　
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);　
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);　
4) 아르기닌(R), 리신(K);　
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
본원에 사용된 용어 "항체 접합체"는 본 발명의 항체를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체가 항암제 또는 식별 가능한 모이어티와 같은 또 다른 개체에 연결된 융합 단백질은 항체 접합체로 간주된다.
용어 "핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일 가닥 또는 이중 가닥 서열(중합체)을 지칭한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 특별히 언급되지 않는 한, 천연 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 구현예에 따르면, 핵산은 "데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드 핵산(PNA), 로킹 핵산(LNA) 및 이들의 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 DNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 이들의 화학적 변형을 포함한다.　
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 150개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 긴 핵산을 지칭한다.
용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 기재된 항체는 핵산에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 폴리펩티드를 세포로 전달하는 데 사용될 수 있는 벡터의 구성 요소이다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 게놈 통합 벡터 또는 "통합 벡터"이며, 이는 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 "에피솜" 벡터, 예를 들어, 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 발현 벡터에서, 프로모터, 인핸서, 전사 조절에 사용하기 위한 폴리아데닐화 신호와 같은 조절 요소는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유도될 수 있다. 일반적으로 복제의 기원에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력과 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선택 유전자가 추가로 통합될 수 있다. 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등과 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터는 염색체 위치에 통합하기 위해 선형화될 수 있다. 벡터는 게놈의 정의된 위치 또는 제한된 부위 세트(예: AttP-AttB 재조합)에 부위 특이적 통합을 지시하는 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 벡터는 전치 가능한 요소로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산은 핵산에 적합한 세포를 감염, 형질감염, 형질전환 또는 달리 유전자도입되도록 하는 데 사용되어 상업적 또는 치료적 용도를 위한 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대규모 세포 배양으로부터 항체를 생산하기 위한 표준 세포주 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 특정 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 포유류 세포는 항체 생산에 유용한 세포주로서, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포 또는 PER.C6®세포이다. 특정 구현예에서, 항체를 인코딩하는 핵산은 항체 생산에 유용한 세포의 게놈 유전자좌에 통합된다. 특정 구현예에서, 상기 항체의 생산 및 분비를 허용하기에 충분한 시험관내 조건 하에서 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
재조합 항체의 생산에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 한 방법에 따르면, 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 세포는 효과적인 조건 하에서 배양되며, 이는 많은 양의 재조합 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 발현을 허용한다. 효과적인 배양 조건에는 단백질 생산을 허용하는 효과적인 배지, 생물 반응기, 온도, pH 및 산소 조건이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 효과적인 배지는 세포가 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 전형적으로 동화 가능한 탄소, 질소 및 인산염 공급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소, 예를 들어, 비타민을 갖는 수용액을 포함한다. 본 발명의 세포는 종래의 발효 생물 반응기, 쉐이크 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 접시 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 범위 내에 있다.
생산에 사용되는 벡터 및 숙주 시스템에 따라, 본 발명의 생성되는 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 잔류하거나, 발효 배지로 분비되거나, 두 세포막 사이의 공간으로 분비되거나, 세포 또는 바이러스 막의 외부 표면에 잔류될 수 있다.
배양에서 미리 결정된 시간 후, 재조합 항체의 회수는, 예를 들어, 추가 분리 또는 정제 단계를 포함하거나 포함하지 않고 항체 폴리펩티드/폴리펩티드들을 함유하는 전체 발효 배지를 수집함으로써 영향을 받는다.
항체 폴리펩티드가 세포에서 발현되는 경우, 세포막은 바람직하게는 균질화를 포함하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드를 방출하도록 파괴된다.
문헌[Vazquez-Lombardi et al., 2018, nature Protocols, 13,1, 99-117]에 기재된 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 항체를 발현하고 정제하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
동일한 단백질 또는 뉴클레오티드 서열에 사용되는 상이한 서열분석 방법이 특히 서열 말단에서 기술적 문제와 상이한 프라이머로 인해 약간 상이한 서열을 초래할 수 있음이 강조되어야 한다.
상기에도 불구하고, 본 발명의 일부 구현예의 항체는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 단백질 A/G/L 분리, 혼합 모드 크로마토그래피, 금속 친화도 크로마토그래피, 렉틴 친화도 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 차등 가용화와 같지만, 이에 제한되지 않는 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
약리학 및 치료 방법
약제 및 의약 제형에서, 활성제는 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(들) 및 임의로 임의의 다른 치료 성분과 함께 이용된다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있고 이의 수용자에게 과도하게 해롭지 않다는 의미에서 약제학적으로 허용 가능해야 한다. 활성제는 상기 기재된 바와 같이 목적하는 약리학적 효과를 달성하기에 효과적인 양으로, 그리고 목적하는 노출을 달성하기에 적절한 양으로 제공된다.
활성 성분으로서 본 발명의 항체는 익히 공지된 바와 같이 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 양립 가능한 부형제에 용해, 분산 또는 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합이다. 다른 적합한 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 또한, 목적하는 경우, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 1-50mg/ml의 항-hGITR 항체를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 당을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 염기성 아미노산, 당 및 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 (i) 1-10mg/ml의 염기성 아미노산; (ii) 10-200mg/ml의 당; (iii) 0.01-1mg/ml의 계면활성제; (iv) 1-50mg/ml의 항-hGITR 항체를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 염기성 아미노산은 히스티딘, 아르기닌, 리신 및 오르니틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
용어 "당"은 단당류, 이당류 및 다당류를 지칭하며, 당의 예는 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 당은 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 덱스트로스 및 말토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 조성물은 10-200, 10-100, 50-150 또는 70-100mg/ml의 당을 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에 따르면, 조성물은 만니톨 및 소르비톨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 폴리올을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 계면활성제는 비음이온성이다. 일부 구현예에 따르면, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르 및 폴록사머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 조성물은 0.01-10, 0.01-1, 0.05-5 또는 0.1-1mg/ml의 계면활성제를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
전형적으로, 본 발명의 항체 및 이의 접합체는 치료적 용도를 위해 멸균 식염수 용액에 현탁될 것이다. 약제학적 조성물은 활성 성분의 방출을 제어하거나 환자의 시스템에서 이의 존재를 연장하기 위해 대안적으로 제형화될 수 있다. 수많은 적합한 약물 전달 시스템이 공지되어 있으며, 예를 들어, 이식 가능한 약물 방출 시스템, 하이드로겔, 하이드록시메틸셀룰로스, 마이크로캡슐, 리포좀, 마이크로에멀젼, 마이크로스피어 등을 포함한다. 제어 방출 제제는 본 발명에 따른 분자를 복합체화하거나 흡착하기 위해 중합체의 사용을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 중합체는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 이량체와 세바산의 폴리언하이드라이드 공중합체의 매트릭스를 포함한다. 이러한 매트릭스로부터 본 발명에 따른 분자, 즉 항체의 방출 속도는 분자의 분자량, 매트릭스 내의 분자의 양 및 분산된 입자의 크기에 따라 달라진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 국소, 비강내, 동맥내, 관절내, 병변내, 종양내 또는 비경구와 같은 임의의 적절한 수단에 의한 투여용으로 제형화된다. 일반적으로, 정맥내(i.v.) 투여는 항체를 전달하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 접합체는 주입에 의해 투여된다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항체 접합체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 기재된 조성물 및 방법이 치료에 유용한 적어도 하나의 질환을 진단받았거나, 질환에 걸린 것으로 의심되거나, 발병 위험이 있는 개체를 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 개체는 포유동물이다. 일부 구현예에 따르면, 개체는 인간이다.
본 발명에 따른 분자의 치료적 유효량은 특히 투여 일정, 투여되는 분자의 단위 용량, 분자가 다른 치료제와 병용 투여되는지 여부, 환자의 면역 상태 및 건강, 투여된 분자의 치료 활성, 혈액 순환에서의 이의 지속성 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것임이 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암세포의 수를 감소시키고, 종양의 크기를 줄이고, 말초 기관으로의 암세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단)하고, 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단)하고, 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나 장애와 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화할 수 있다. 약물이 성장을 방해하고/하거나 기존의 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 이는 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은, 예를 들어, 생존 기간, 질환 진행까지의 시간(TTP), 반응률(RR), 반응 지속 기간 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정될 수 있다.
용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. 본 발명에 의한 치료를 위해 보정 가능한 암은 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma) 및 백혈병(leukemia) 또는 림프성 악성 종양(lymphoid malignancy)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예는 편평세포암(squamous cell cancer), 폐암(lung cancer)(소세포 폐암(small-cell lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐의 선암(adenocarcinoma of the lung), 및 폐의 편평 암종(squamous carcinoma of the lung) 포함), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포암(hepatocellular cancer), 위암 또는 위암(gastric or stomach cancer)(위장암(gastrointestinal cancer) 포함), 췌장암(pancreatic cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간종(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁 암종(endometrial or uterine carcinoma), 타액선 암종(salivary gland carcinoma), 신장암 또는 신장암(kidney or renal cancer), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음부암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간 암종(hepatic carcinoma) 및 다양한 유형의 두경부암(head and neck cancer), 뿐만 아니라 B-세포 림프종(저급/여포성 비호지킨 림프종(low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma; NHL); 소림프구성(SL) NHL, 중급/여포성 NHL, 중급 미만성 NHL, 고급 면역모세포성 NHL, 고급 림프모구성 NHL, 고급 소형 비절단 세포 NHL, 벌키 질환 NHL, 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma), AIDS 관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL); 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL); 모발 세포 백혈병(Hairy cell leukemia); 만성 골수모구성 백혈병(chronic myeloblastic leukemia); 및 이식 후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder; PTLD), 뿐만 아니라 모종증(phakomatosis)과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종(edema)(예: 뇌종양(brain tumor)과 관련된 것) 및 마이그스 증후군(Meigs' syndrome)을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 암은 비소세포 폐 암종(NSCLC), 신장 세포 암종, 흑색종, 교모세포종, 결장직장암, 유방암 및 난소 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 치료를 위해 보정 가능한 암성 상태는 전이성 암을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 항암 조성물과 함께 또는 항암 조성물과 병용하여 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조합" 또는 "조합 치료"는 결합될 물품의 동시 투여 또는 결합될 물품의 순차적 투여를 지칭할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 조합이 물품의 순차적 투여를 지칭할 때, 물품은 임의의 시간적 순서로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 치료적 치료와 예방적 또는 예방적 조치 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 장애를 앓고 있는 사람들뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암을 치료하는 방법은 적어도 하나의 추가 항암제 또는 치료제의 투여를 포함하는 치료 섭생의 일부로서 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 항암제는 항대사산물, 유사분열 억제제, 탁산, 토포아이소머라제 억제제, 토포아이소머라제 II 억제제, 아스파라기나제, 알킬화제, 항종양 항생제, 면역 조절제, 체크포인트 억제제, 종양 항원을 표적으로 하는 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 항대사산물은 시타라빈, 플루다라빈, 플루오로우라실, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 티오구아닌, 젬시타빈 및 하이드록시우레아로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 유사분열 억제제는 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 토포아이소머라제 억제제는 토포테칸 및 이리노테칸으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 알킬화제는 부설판, 카르무스틴, 로무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 티오테파, 다카르바진 및 프로카르바진으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 항종양 항생제는 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미톡산트론 및 플리카마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 토포아이소머라제 II는 에토포사이드 및 테니포사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
일부 특정 구현예에 따르면, 추가 항암제는 베바시주맙, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 독소루비신 하이드로클로라이드, 젬시타빈 하이드로클로라이드, 토포테칸 하이드로클로라이드, 티오테파 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
본 발명에 따른 항체는 적어도 면역 조절제, 활성화된 림프구 세포, 키나제 억제제 또는 화학요법제와의 병용 요법의 일부로 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 항암제는 면역 체크포인트 억제제에 대한 항체와 같은 작용제든 길항제든 관계없는 면역 조절제이다.
체크포인트 면역요법 차단은 암 치료의 흥미로운 새로운 장임이 입증되었다. 면역 체크포인트 경로는 생리적 조건 하에서 자가 내성을 유지하고 면역계에 의한 손상으로부터 조직을 보호하기 위해 함께 작용하는 다양한 공동 자극 및 억제 분자로 구성된다. 종양은 면역계를 회피하기 위해 특정 체크포인트 경로를 이용한다. 따라서, 이러한 경로의 억제는 유망한 항암 치료 전략으로 부상하고 있다.
항세포독성 T 림프구 4(CTLA-4) 항체 이필리무맙(2011년 승인)은 암 환자 치료에 효과를 보인 최초의 면역치료제이다. 항체는 T 세포에 항원 제시 동안 억제 신호를 방해한다. 항-프로그램된 세포 사멸 1(PD-1) 항체 펨브롤리주맙(2014년 승인)은 T 세포에 의해 발현되는 PD-1 수용체의 부정적인 면역 조절 신호전달을 차단한다. 추가의 항-PD-1 제제는 비소세포 폐암(NSCLC) 치료를 위해 2014년에 규제 승인을 위해 제출되었다. 활발한 연구는 현재 다음과 같은 많은 다른 면역 체크포인트를 탐구하고 있다: CEACAM1, NKG2A, B7-H3, B7-H4, VISTA, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), CD137, OX40(CD134라고도 함) 및 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR).
다른 구현예에 따르면, 추가 항암제는 화학요법제이다. 본 발명에 따른 항체와 함께 또는 별도로 투여될 수 있는 화학요법제는 미톡산트론, 토포아이소머라제 억제제, 빈카의 스핀들 독: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈(탁솔), 파클리탁셀, 도세탁셀; 알킬화제: 메클로레타민, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드; 메토트렉세이트; 6-머캅토퓨린; 5-플루오로우라실, 시타라빈, 젬시타빈; 포도필로톡신: 에토포사이드, 이리노테칸, 토포테칸, 다카바진; 항생제: 독소루비신(아드리아마이신), 블레오마이신, 미토마이신; 니트로소우레아: 카르무스틴(BCNU), 로무스틴, 에피루비신, 이다루비신, 다우노루비신; 무기 이온: 시스플라틴, 카보플라틴; 인터페론, 아스파라기나제; 호르몬: 타목시펜, 류프롤리드, 플루타미드 및 메게스트롤 아세테이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항암 활성을 나타내는 당업계에 공지된 임의의 이러한 제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 화학요법제는 알킬화제, 항대사산물, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 관련 억제제, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, L-아스파라기나제, 토포아이소머라제 억제제, 인터페론, 백금 배위 복합체, 안트라세네디온 치환 우레아, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 아드레노코르티코스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐, 항안드로겐 및 성선자극호르몬 방출 호르몬 유사체로부터 선택된다. 또 다른 구현예에 따르면, 화학요법제는 5-플루오로우라실(5-FU), 류코보린(LV), 이리노테칸, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나 이상의 화학요법제가 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 접합체의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해, 예를 들어, 대상 화합물에 대한 IC50(50% 억제를 제공하는 농도) 및 최대 허용 용량을 결정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 투여량은 다른 관련 요인 중에서 특히 사용된 투여 형태, 선택된 투여 섭생, 치료에 사용된 제제의 조성 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 고려하여 개별 의사가 선택할 수 있다. 치료될 상태의 중증도와 반응성에 따라, 투여는 또한 서방형 조성물을 단일 투여일 수 있으며, 치료 과정은 며칠에서 몇 주까지 지속되거나 치료가 영향을 받거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속된다. 물론 투여될 조성물의 양은 치료받는 대상체, 질환의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 및 기타 모든 관련 요인에 따라 달라질 것이다.
용어, 물질, 화합물 또는 제제를 대상체에게 "투여하는" 또는 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 제제는 장내 또는 비경구 투여될 수 있다. 장내는 경구(per os), 설하 또는 직장을 포함한 위장관을 통한 투여를 지칭한다. 비경구 투여는 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 피하, 안구, 설하, 비강내, 흡입, 척수내, 뇌내 및 경피(흡수에 의해, 예를 들어, 피부 관을 통해) 투여를 포함한다. 화합물 또는 제제는 또한 적합하게는 재충전 가능하거나 생분해성 중합체 장치 또는 다른 장치, 예를 들어, 패치 및 펌프, 또는 제형에 의해 도입될 수 있고, 이는 화합물 또는 제제의 연장된, 느린 또는 제어 방출을 제공한다. 투여는 또한, 예를 들어, 한 번, 수회 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 자가 투여를 포함하는 직접 투여 및 약물을 처방하는 행위를 포함하는 간접 투여를 모두 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, 환자에게 약물을 자가 투여하거나 다른 사람이 약물을 투여하도록 지시하고/하거나 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사가 환자에게 약물을 투여하고 있다.
항체는 일반적으로 환자 체중의 약 0.1 내지 약 50mg/kg, 일반적으로 약 0.5 내지 약 20mg/kg, 종종 약 1 내지 약 10mg/kg의 범위로 투여된다. 이와 관련하여, 순환 반감기가 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 4일, 더 바람직하게는 최대 21일인 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 경우에, 큰 부하 용량을 투여한 후 치료 기간에 걸쳐 주기적(예: 매주) 유지 용량을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 항체는 또한 서방형 전달 시스템, 펌프 및 연속 주입을 위한 기타 공지된 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다.
용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위, 예를 들어, 최대 5% 또는 10%를 가정해야 함을 의미한다.
용어 "a", "an" 및 "the"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 하나 이상을 의미한다.
용어 "및/또는"은 언급된 경우 중 하나 또는 모두가 발생할 수 있음을 나타내는 데 사용되며, 예를 들어, A 및/또는 B는 (A 및 B)와 (A 또는 B)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "또는"은, 적절한 경우, 결합될 수 있는 대안을 나타내며, 즉 용어 "또는"은 나열된 각 대안을 개별적으로 포함할 뿐만 아니라 조합이 상호 배타적이지 않은 경우 이들의 조합도 포함한다.
용어 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprise(s))", "포함한다(include(s))", "갖는(having)", "갖는다(has)" 및 "함유한다(contain(s))"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, "적어도 일부로 구성되는"의 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"을 포함하는 본 명세서에서 각 진술을 해석할 때, 그 용어가 앞에 붙는 것 또는 것들 이외의 특징이 또한 존재할 수 있다. "포함하다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"와 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다. 용어 "갖는다(have)", "갖는다(has), "갖는(having)" 및 "포함하는(comprising)"은 또한 "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는"의 의미를 또한 포함할 수 있으며, 이러한 용어로 치환될 수 있다. 용어 "이루어지는"은 구체적으로 설명되거나 나열되지 않은 임의의 구성 요소, 단계 또는 절차를 제외한다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 추가 성분이 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 새로운 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 조성물 또는 구성 요소가 추가 성분을 포함할 수 있음을 의미한다.
다음의 방법과 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 이들은 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험실 절차는 분자, 생화학적, 미생물학적, 면역학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다. 독자의 편의를 위해 본 문서 전반에 걸쳐 익히 공지된 절차를 언급하는 기타 일반적인 참고 문헌이 제공된다.
재료 및 방법　
ELISA 검정
항체 변이체의 결합 특이성 및 친화도는 재조합 마우스 또는 인간 GITR(SinoBiological)을 사용하여 ELISA에 의해 결정되었다. ELISA 플레이트(Nunc)를 4℃에서 표시된 재조합 GITR(1μg/mL/웰)로 밤새 코팅했다. 모든 순차적 단계는 2% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 인산염 완충 식염수(PBS)에서 실온에서 수행되었다. 세척 후, 플레이트를 1시간 동안 차단한 다음, 연속적으로 희석된 항체 샘플로 1시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 HRP-접합 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch)와 함께 1시간 동안 배양했다. 검출은 TMB 가용성 시약(, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, ScyTek Laboratories)으로 수행하였고, 0.18M 황산을 첨가하여 반응을 중단했다. SpectraMax Plus 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 즉시 기록하고, 음성 대조군 샘플의 배경 흡광도를 뺐다.
FcγR 결합 ELISA를 위해 상기 기재된 프로토콜의 다음과 같은 변형을 수행했다. 인간 FcγR 가용성 엑토도메인(2μg/ml/웰)을 플레이트에 고정시켰다. 세척 후, 플레이트는 10% BSA가 포함된 PBS로 40분 동안 차단한 후, 연속적으로 희석된 항체와 함께 2시간 동안 배양했다.
마우스의 생체내 연구
C57BL/6J 마우스는 Harlan Laboratories에서 구입했다. FcγR 인간화 마우스(mFcγRα-/-, Fcgr1-/-, hFcγRI+, hFcγRIIAR131 +, hFcγRIIB+, hFcγRIIIAF158 + 및 hFcγRIIIB+)는 문헌[Rankin CT, et al., (CD32B, the human inhibitory Fc-gamma receptor IIB, as a target for monoclonal antibody therapy of B-cell lymphoma. Blood, 2006, 108, 2384-91)]에 기재된 바와 같이 C57Bl/6J 배경에서 생성되었다.
항 hGITR Fc 영역 변이체 투여 후 면역 세포의 조절을 평가하기 위해, FcγR 및 hGITR에 대해 인간화된 마우스(huFcγR/hGITR)를 생성했다.
항체의 생체내 반감기에 대한 Fc 영역 변형의 효과를 평가하는 약동학 검정을 위해, MC38(마우스 결장 선암종) 종양 보유 인간 FcγR 마우스에 DTA-1 항 마우스 GITR(200μg/마우스)의 hIgG1 Fc 영역 변이체를 주사하고, 표시된 시점에 출혈시켰다.
항종양 활성을 평가하기 위해(1회 도전 또는 첫 번째 도전으로), MC38 세포를 접종한 FcγR 인간화 마우스를 항 mGITR 항체 DTA-1의 Fab를 기반으로 한 키메라 인간 Fc 영역 변이체로 처리했다. 8 내지 10주령의 마우스를 마취시킨 후, 우측 옆구리에 MC38 세포(2x106)를 피하(s.c.) 이식했다. 종양 용적은 전자 캘리퍼로 2 내지 3일마다 측정하고, 화학식 (L22 x L1)/2를 사용하여 용적으로 보고되었으며, 여기서 L1은 가장 긴 직경이고 L2는 가장 짧은 직경이다. 종양 접종 후, 마우스는 종양 크기(0일째), 평균 55mm3 또는 115mm3(달리 명시되지 않는 한)에 의해 무작위화하고, Ab 또는 PBS의 복강내(i.p) 주사를 투여받았다. 마우스는 표시된 바와 같이 3일째 및 6일째에 hIgG1을 포함하는 항체 변이체 100μg/마우스와 추가 항체 치료로 처리했다.
장기 면역 및 기억 반응을 평가하는 재도전 실험을 위해, 원발성 종양에 대한 완전한 반응 및 거부 반응을 갖는 마우스(종양 부재 마우스)를 치료 개시 후 62일 동안 추적 관찰한 후, 반대쪽 옆구리에 MC38 종양 세포(2x106)를 재접종했다.
CD4/CD8 고갈 실험의 경우, 여러 종양 부재 마우스는 재도전 전에 CD4 및/또는 CD8에 대한 항체를 주사했다.
조직 처리 및 유세포 분석법
기능적 실험을 위해, 마우스를 상기 기재된 바와 같이 도전시키고 처리하고, 달리 표시되지 않는 한 8일째에 죽였다. 비장을 70μm 나일론 세포 스트레이터를 통해 절개하고, 적혈구 용해 완충액(Sigma)으로 배양하고 세척했다. 종양을 기계적으로 작은 조각으로 절개하여 0.33mg/ml DNase(Sigma-Aldrich) 및 0.27mg/ml 리베라제 TL(로슈)과 함께 GentleMACSTM C 튜브(Milteny)로 옮겼다. GentleMACSTM 옥토 분리기 프로그램 "m_impTumor_02_01"(Milteny)을 두 번 수행한 후 25rpm에서 연속 회전으로 37℃에서 40분 동안 배양했다. 70μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 분산시키고 세척하기 전에, 프로그램 "m_impTumor_03_01"(Milteny)을 두 번 수행했다. 림프절을 70μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 절개하고 세척했다.
살아 있는/죽은 고정 가능한 청색 사멸 세포 새틴 키트(Invitrogen)를 사용하여 죽은 세포를 배제한 후 상이한 세포 집단을 식별했다. 세포내 염색을 위해, 세포를 고정시키고 Foxp3 Fix/Perm 완충액 키트(BioLeagend)로 투과화했다. CountBrightTM 앱솔루트 계수 비드(Life Technologies)를 획득 전에 첨가했다. 세포 집단은 다음 마커(BioLegened 수지상 세포(CD11b+ CD11c+ MHCII+ F4/80-), NK 세포(NKp46+ CD3-),　CD8 T 세포(CD3+ CD8+ CD4-), CD4 T 세포(CD3+ CD4+ CD8-), CD4 이펙터 T 세포(CD3+ CD4+ CD8- Foxp3- CD44+) 및 CD4 조절 T 세포(CD3+ CD4+ CD8- Foxp3+)에 의해 정의되었다.
질량 분석법
샘플을 S-트랩 방법을 사용하여 트립신으로 분해한 다음, 글리코펩티드의 HILIC 농축을 진행했다. 생성된 펩티드는 고분해능, 고질량 정확도 질량 분석법(Fusion Lumos)과 결합된 나노플로우 액체 크로마토그래피(nanoAcquity)를 사용하여 분석했다. 생성되는 데이터는 Byonic을 사용하여 인간 IgG1 글리코실화 펩티드 및 인간 Fc 글리칸 데이터베이스에 대해 검색했다. ID는 수동으로 확인되었으며, Skyline(v19.1.0.193)을 사용하여 정량화했다. 실험은 와이즈만 과학연구소의 INCPM 유닛에 의해 수행되고 분석되었다.
표면 플라즈몬 공명( SPR )에 의한 해리 상수(KD)의 결정
SPR 실험은 BiacoreTM T200(Cytiva) 기기를 사용하여 수행했다. 항체는 단백질 G 칩에 포획되었다. 모든 측정은 PBS-Tween 0.05%를 사용하여 수행했다. 5μg/mL 농도의 항체를 10μL/분의 유속으로 20초 동안 고정시켰다. FcγR은 상이한 농도 범위로 제조되었다: 0.78nM - 200nM FcγRIIA, 2.34 - 600nM FcγRIIIA 및 2 - 500nM FcγRIIB. 각 농도를 30μL/분의 유속으로 180초 동안 주사하고, 340초 동안 해리되도록 방치했다. 각 사이클 후, 표면을 글리신 완충액 pH 1.5로 재생시켰다. 블랭크 고정 경로에 대한 배경 결합을 각 결합 이벤트로부터 뺐다. 데이터를 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 두 상태 1:1 결합 모델에 적합화하고, KD 값을 계산했다. 모든 변이체의 활성화 대 억제 친화도 비율의 계산은 다음과 같이 수행되었다: KD 활성화/KD 억제.
통계 분석
쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트가 두 그룹을 비교할 때와 세포 유형의 백분율을 평가하는 실험에서 그룹을 비교하는 데 사용되었다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)로 분석되었으며, <0.05의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 도면에 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001로 표시되었다. 별표는 그래프에 표시된 바와 같은 통계적 비교를 나타낸다.
실시예 　
이제, 상기 설명과 함께 본 발명을 비제한적인 방식으로 예시하는 다음의 실시예를 참조한다.
실시예 1. 항 GITR hIgG1 Fc 영역 변이체의 생성 및 특성화
래트 항마우스 DTA-1 클론으로부터 인간 IgG1을 갖는 키메라 항마우스 GITR 항체를 생성하기 위해, DTA-1 하이브리도마 클론으로부터 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 서열분석하고 합성했다(BioBasic에 의해). 인간화 항-인간 GITR 항체를 생성하기 위해, 항 hGITR 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 서열을 사용하고 합성했다(BioBasic에 의해). 서열을 PCR 증폭시키고, 인간 IgG1 불변 영역을 가진 포유류 발현 벡터에 클로닝했다. 도 2는 항-GITR VH 및 VL의 삽입 후 HC 및 LC 발현 벡터의 겔 전기영동 결과를 제공한다. 도 2는 TRX518로부터 항-GITR VH 및 VL의 삽입 후 HC 및 LC 발현 벡터의 겔 전기영동 결과를 제공한다(이 겔은 DTA-1이다). 레인 1- 1Kb 분자량 마커(Mw), 레인 2- 100bp Mw, 레인 3- 절단되지 않은 발현 벡터, 레인 4 및 5- 항-GITR VH 삽입을 갖는 벡터, 레인 6- 항-GITR VL 및 LC 불변 영역(Fc)을 갖는 벡터, 레인 7- 불변 영역(Fc)을 갖는 HC IgG1 발현 벡터, 레인 8- 불변 중쇄 영역에 V11 돌연변이가 있는 불변 영역(Fc)을 갖는 HC IgG1 발현 벡터. 레인 9- LC IgG1 발현 벡터. 인간 IgG1의 Fc 변형 변이체의 생성을 위해, 제조업체의 지침에 따라 표 1(Agilent Technologies)에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 사전 정의된 점 돌연변이를 생성하기 위해 부위 지정 돌연변이유발 기술을 적용했다.
[표 1]
돌연변이된 플라스미드 서열은 직접 서열분석에 의해 검증되었다(Life science core facility, Weizmann Institute of Science). 항체를 생산하기 위해, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)로 일시적으로 형질감염시켰다. 상청액에 분비된 항체를 단백질 G 세파로스 4 패스트 플로우(GE Healthcare)로 정제했다. 정제된 항체를 PBS로 투석하고 멸균 여과하고(0.22μm), 순도는 SDS-PAGE에 이어 ImperialTM 블루 염색(ThermoFisher)에 의해 평가하고, 이는 모든 항체가 예상된 형태로 발현되었음을 입증했다. 아푸코실화 Fc 영역 변이체의 생성을 위해, 푸코실트랜스퍼라제의 억제제로서 200μM의 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스(Carbosynth)를 상청액에 형질감염 1일 후 형질감염 배지에 첨가했다. 도 3a-3b는 발현된 항-GITR 변이체의 ImperialTM 블루로 염색된 SDS 페이지를 제공한다: 레인 1- 분자량 마커, 레인 2- 항-mGITR V11, 레인 3- 아푸코실화 항-mGITR, 레인 4- N279A, 레인 5- GAALIE, 레인 6-GASDALIE, 레인 7- G236A, 레인 8- 항-mGITR IgG1. 도 3a는 비환원된 SDS-PAGE의 결과를 제공한다. 도 3b는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 제공한다.
인간 IgG1을 포함하는 항 마우스 GITR(mGITR) 키메라 항체의 활성이 hFcγR과의 상호작용을 필요로 하는지 여부를 테스트하고 이러한 상호작용을 추가로 조작하여 모 항체의 활성을 최적화할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항 마우스 GITR(DTA-1) 항체의 가변 영역을 인간 IgG1에 클로닝했다. 상이한 돌연변이를 부위 지정 돌연변이유발에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인에 도입하여 일련의 돌연변이된 hIgG1 항-mGITR 항체를 생성했다. 결합 친화도는 고정화된 FcγR과 가용성 항체와 함께 SPR 분석을 사용하여 측정하였으며, 결과는 표 2에 표시되어 있다.
[표 2]
생산 후, 마우스 GITR에 대한 Fc 영역 변이체의 결합 친화도를 측정하고 비교 ELISA로 검증했다. 도 4는 마우스 GITR에 대한 Fc 영역 변이체의 ELISA 검정 결과를 제공한다; IgG1(완전한 원), IgG1-V11(완전한 사각형), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형), IgG1-G236A(마름모), Afuco-IgG1(삼각형), IgG-GAALIE(별표), IgG1-GASDALIE(빈 사각형) 및 Afuco-IgG1-G236A이다. 도 4에 제시된 바와 같이, 키메라 항 mGITR(DTA-1의 Fab를 포함함) hIgG1 Fc 영역 변이체는 모 항체와 유사한 결합 친화도를 나타내며, 이는 Fc 영역 변형이 마우스 GITR에 대한 결합을 손상시키지 않음을 나타낸다.
또한, 각 FcγR에 대한 변형된 인간 IgG1을 갖는 항 mGITR 항체의 결합 친화도는 비교 ELISA를 사용하여 비교하고 평가했다. 도 5a-5d는 항-mGITR Fc 영역 변이체의 결합에 대한 비교 EISA 결과를 제공한다: IgG1(완전한 원), IgG1-V11(완전한 사각형), Afuco-IgG1(삼각형), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형), IgG-GAALIE(빈 원), IgG1-GASDALIE(빈 사각형) 및 IgG1-G236A(빈 마름모). DTA-1 결합 부위와 변형된 인간 IgG1을 갖는 항 마우스 GITR 항체는 표시된 hFcγR에 대한 차등 결합 친화도를 입증한다. 다중 Fc 영역 돌연변이 G236A/S239D/A330L/I332E("GASDALIE"라고 함)를 갖는 인간 IgG1 변이체는 주로 hFcRγIIIA 결합을 향상시키지만, hFcγRIIA 및 hFcγRIIB와도 결합한다. S239D 돌연변이(G236A/A330L/I332E, "GAALIE"라고 함)가 없는 유사한 변이체는 hFcγRIIB에 대한 결합을 잃은 반면, hFcRγIIIA 및 hFcRγIIA에 대한 향상된 결합은 보존한다. 변이체 "IgG1-G236A"는 hFcγRIIA 결합의 선택적 향상을 나타내고, "IgG1-V11" 변이체(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R, GDPDHDPGAR)는 hFcγRIIB를 선택적으로 향상시키고, 인간 FcγRIIA에 대한 결합은 나타내지 않는다. 아글리코실화 FcγR-null 변이체 "IgG1-N297A"는 글리코실화 부위의 변형으로 인해 hFcγR 경로에 관여하는 능력이 결여된다. 변형되지 않은 Fc-N297을 포함하는 번역 후 당 조작된 IgG1 변이체 "Afuco-IgG1"은 hFcγRIIIA에 대한 결합을 향상시킨다.
항 GITR 변이체의 2개의 비푸코실화 형태, 즉 IgG1 및 IgG1-G236A는 IgG1 및 IgG1-G236A 생산 세포의 형질감염 배지에 형질감염 1일 후에 첨가된 푸코실트랜스퍼라제 억제제(2FF)를 사용하여 생성했다. 푸코실화는 질량 분석법으로 결정되었으며, 비푸코실화 형태의 백분율은 표 3에 제시되어 있다. 항체 농도는 NanoDrop 기기를 사용하여 측정했다.
[표 3]
실시예 2. 항 mGITR IgG1 Fc 영역 변이체의 약동학　
항체의 생체내 반감기에 대한 Fc 영역 변형의 효과를 테스트했다. MC38 종양 보유 인간 FcγR 마우스에 DTA-1의 Fab(200μg/마우스)을 포함하는 항 mGITR의 hIgG1 Fc 영역 변이체를 주사하고, 표시된 시점에 출혈시켰다. 혈청은 모든 시점이 수집될 때까지 -80℃에서 저장했다. 혈청 내 항체 농도는 표준 비색 ELISA 검정을 사용하여 결정했다. 간단히 말해서, 검정 플레이트를 재조합 마우스 GITR(1μg/mL, Sino Biological, #13643-H08H)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양했다. 그런 다음, 10% FCS를 함유하는 PBS로 2시간 동안 플레이트를 차단했다. 혈청의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 배양했다. 세척 후, 플레이트를 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항인간 IgG(#109-035-088, Jackson IummunoResearch)와 함께 1시간 동안 배양했다. 450nm에서 흡광도는 SpectraMax Plus 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 즉시 기록하고, 음성 대조군 샘플의 배경 흡광도를 뺐다. 도 6은 Fc 변형 변이체, IgG1(완전한 원), IgG1-V11(완전한 사각형), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형), IgG1-G236A(빈 마름모), Afuco-IgG1(삼각형) 및, Afuco-IgG1-G236A(빈 원)의 생체내 반감기(PK 검정)의 ELISA 결과를 제공한다.
도 6에 표시된 바와 같이, Fc 변형 변이체의 생체내 반감기는 주사 4일 후 혈액 내 감소된 수준을 입증하는 "IgG1-V11"을 제외하고는 모 IgG1을 갖는 항체와 유사하다.
실시예 3.　항- GITR hIgG1 Fc 영역 변이체의 생체내 항종양 활성
항 mGITR hIgG Fc 영역 변이체의 항종양 활성은 MC38(마우스 결장 선암종) 세포를 접종하고 DTA-1의 인간 Fc 영역 변이체로 처리된 FcγR 인간화 마우스에서 생체내 평가되었다. FcγR 인간화 C57BL/6J 마우스(mFcγα-/-, Fcgr1-/-, hFcγRI+, hFcγRIIAR131+, hFcγRIIB+, hFcγRIIIAF158 +, 및 hFcγRIIIB+)는 문헌[Rankin CT, et al., Blood, 2006 ibid.]에 기재된 바와 같이 C57Bl/6J 배경에서 생성되었다. 8 내지 10주령 마우스를 마취하고, 우측 옆구리에 MC38 세포(2x106)를 피하(s.c.) 이식했다. 종양 용적을 전자 캘리퍼로 2 내지 3일마다 측정하고 화학식 (L22 x L1)/2를 사용하여 용적으로 보고했으며, 여기서 L1은 가장 긴 직경이고, L2는 가장 짧은 직경이다. 종양 접종 후, 마우스는 종양 크기(0일째), 평균 55mm3(달리 표시되지 않는 한)에 의해 무작위화하고, Ab 또는 PBS의 복강내(i.p) 주사를 투여받았다. 항종양 활성을 위해, 마우스를 hIgG를 포함하는 100μg/마우스의 항 mGITR(DTA-1 기반)로 처리하고 3일째와 6일째에 추가 항체 치료를 투여받았다. 재도전 실험을 위해, 모든 처리군의 종양 부재 마우스는 항 GITR 치료 개시 62일 후 반대쪽 옆구리에 MC38 종양 세포(2x106)로 재도전했다. 마우스는 종양 진행을 위해 추적 관찰했으며, 전체 생존 및 결과는 도 7a-7h에 묘사되어 있다.
종양 용적과 생존은 각 인간 Fc 영역 변이체 항체의 각 테스트 동물에 대해 평가하고, 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 Fc 변이체와 IgG1-N297A 그룹 사이를 비교했다. 각 선은 한 마리의 동물을 나타낸다. 결과는 다음과 같다: 미처리 마우스(n=10), 예상대로 종양 부재 마우스(도 7a), IgG1 치료(n=8), 4/8 종양 부재 마우스(도 7b), IgG1-N297A 치료(n=10), 1/10 종양 부재 마우스(도 7c), IgG1-V11 치료(n=10), 0/10 종양 부재 마우스(도 7d), IgG1-G236A 치료(n=9), 6/9 종양 부재 마우스(도 7e), Afuco-IgG1 치료(n=10), 8/10 종양 부재 마우스(도 7f). 각 Fc 영역 변이체에 따라 테스트된 모든 동물의 평균 종양 용적은 도 7g, 나이브(미처리됨, 완전한 마름모), IgG1(완전한 원), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형), IgG1-G236A(빈 마름모) 및 Afuco-IgG1(삼각형)에 제시되어 있다. 시간 경과에 따른 생존 확률(치료 개시 후 최대 60일까지)도 추적 관찰하였으며, 결과는 도 7h, 미처리 마우스(미처리됨, 검은색 선), IgG1(파선), IgG1-N297A(점선), IgG1-V11(대시와 점), IgG1-G236A(대시와 두 점), Afuco-IgG1(수직 세그먼트로 종결되는 선)에 제시되어 있다. 도 7h에 표시된 바와 같이, 여러 치료법은 Afuco-IgG1의 경우 80%, IgG1-G236A의 경우 66.6%, IgG1의 경우 50%로 향상된 생존 확률을 나타냈다. Fc-조작된 또는 당 조작된 변이체 IgG1-G236A 및 Afuco-IgG1에 의한 치료는 다른 Fc 영역 변이체와 비교하여 감소된 종양 성장과 증가된 전체 생존을 초래한다.
장기 면역과 기억 반응을 매개하는 항-GITR 치료의 능력을 평가하기 위해, 모든 처리 그룹으로부터 종양 부재 마우스를 재도전시켰다. 원발성 종양의 완전한 반응 및 거부 반응을 갖는 마우스를 치료 개시 후 62일 동안 추적 관찰한 후, 반대편 옆구리에 2x106 MC38 종양 세포를 임의의 추가 치료 없이 재접종했다. 마우스의 종양 진행을 위해 추적 관찰했으며, 전체 생존 및 결과는 시간 경과에 따른 종양 용적(도 8a)(재도전 후 일수) 및 생존 확률(도 8b)로 묘사되어 있고, 이는 각 이전 Fc 영역 변이체 치료(종양 부재 동물)에 대해 계산되었다. 도 8a 나이브(미처리됨, 완전한 마름모, n=9), IgG1(완전한 원, n=4), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형, n=1), IgG1-G236A(빈 마름모, n=6) 및 Afuco-IgG1(삼각형, n=7). 도 8b 나이브(미처리됨, 검은색 선), IgG1(파선), IgG1-N297A(점선), IgG1-G236A(대시와 점) 및 Afuco-IgG1(대시와 두 개의 점). 종양은 나이브 대조군 마우스에서 빠르게 발달된반면, 이전에 항-GITR Ab로 처리된 모든 동물은 장기 면역을 입증하였고, 즉 종양을 거부하고 재도전에서 완전히 생존했다. GITR 항체는 종양의 재발에 대한 장기 항종양 T 세포 기억 보호를 매개하는 데 잠재력을 나타낸다.
GITR 항체에 의한 장기 보호 및 기억 반응의 메커니즘을 추가로 평가하기 위해, 실험은 상기와 유사한 환경에서 수행했지만, 추가로 여려 종양 부재 마우스에 CD4 또는 CD8에 대한 항체를 주사했다. 이전 치료에 완전히 반응하여 종양 부재가 된 항-GITR Fc 영역 변이체로 처리된 MC38 보유 hFcγR 마우스, 및 대조군 나이브 마우스에 MC38 세포를 접종하고, CD4 및 CD8에 대한 항체를 주사한 후, 종양 성장에 대해 추적 관찰했다. PBS는 대조군 치료로 사용되었다. 테스트된 각 동물에 대해 종양 용적을 시간 경과에 따라 추적 관찰했다. 도 9a-9d는 항-GITR Fc 영역 변이체에 의한 치료 이외에, aCD4 및 aCD8(점선)과 대조군으로서 PBS(선)를 주사한 마우스에서의 종양 성장 진행에 대한 결과를 제공한다. 도 9a, 대조군, 미처리 마우스. 도 9b, IgG1-G236A. 도 9c, Afuco-IgG1. 도 9d, Afuco-IgG1-G236A. 도 9e는 각 이전 Fc 영역 변이체 치료에 대한 평균 종양 용적을 제공한다. 나이브(n=6, 완전한 마름모), PBS를 갖는 IgG1-G236A(G236A PBS, n=2, 빈 마름모와 검은색 선), aCD4 및 aCD8을 갖는 IgG1-G236A(G236A αCD4+ αCD8, n=4, 빈 마름모와 파선), PBS를 갖는 Afuco-IgG1(아푸코실화 PBS, n=2, 삼각형과 검은색 선), aCD4 및 aCD8을 갖는 Afuco-IgG1(아푸코실화 αCD4+ αCD8, n=3, 삼각형 및 파선), PBS를 갖는 Afuco-IgG1-G236A(n=3, 빈 사각형 및 검은색 선), aCD4 및 aCD8을 갖는 Afuco-IgG1-G236A(n=4, 빈 사각형 및 파선). 생존 확률은 도 9f에 제시된 각 이전 Fc 영역 변이체 치료에 대해 계산되었다. 나이브(대시 및 두 개의 점), IgG1-G236A(선), IgG1-G236A αCD4+ αCD8(파선), Afuco-IgG1(선), aCD4 및 aCD8을 갖는 Afuco-IgG1(점선), Afuco-IgG1-G236A(선) 및 aCD4 및 aCD8을 갖는 Afuco-IgG1-G236A(대시 및 점). 말초혈액 내 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 풍부도는 항체 투여 후 다양한 시점에서 유세포 분석법으로 결정했다. 유세포 분석법 분석을 위해, 마우스 CD8의 β 서브유닛을 표적으로 하는 형광 접합된 모노클로날 항체(클론 YTS156.7.7; Biolegend) 또는 항 CD4 GK1.5 에피토프와 비중첩되는 에피토프(클론 RM4-4; Thermofisher)를 사용하여 고갈되는 항체와의 경쟁을 회피했다.
종합하면, 종양 성장과 전반적인 생존 결과는 GITR 항체에 의해 매개되는 장기 종양 면역에 대한 T 세포 의존적 메커니즘을 주장한다. 종양 부재 마우스는 종양 세포의 두 번째 주사로 재도전한 다음, 이들의 T 세포를 고갈시켜 종양 재발에 대한 T 세포 의존성에 대해 테스트했다. T 세포가 장기 면역에 중요하다는 것이 밝혀졌는데, 이는 이들의 부재시 종양이 확장되고 거부되지 않았기 때문이다.
실시예 4. 아푸코실화 G236A 변이체는 항체의 활성화/억제 친화도 비율을 개선한다.
활성화 수용체 FcγRIIA는 억제성 수용체 FcγRIIB와 90% 상동성이며(Rankin C.T. et al., Blood, 2006, ibid), 따라서 FcγRIIB가 아닌 FcγRIIA에 대한 결합은 도전적인 작업이다. 현재까지, 일부 변형이 도입되었지만, 이들 중 대부분은 FcγRIIB에 대한 결합의 향상을 초래한다[문헌(Smith P, et al., Mouse model recapitulating human Fcγ receptor structural and functional diversity. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109, 6181-6)에 개시된 DAE, 변이체18 및 GASDALIE]. 본 발명에서, 새로운 Fc 영역 변이체는 Fc 스캐폴드에 당 조작(아푸코실화) 및 아미노산 치환(G236A)에 의한 단백질 조작이라는 두 가지 전략을 결합하여 아푸코실화 IgG1-G236A 변이체를 생성함으로써 생성되었다. 이 이중 조작된 항체는 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 활성화 수용체에 대한 결합을 향상시키고, 억제성 FcγRIIB에 대한 관여를 최소화하면서 항체 매개 이펙터 기능, 예를 들어, 수지상 세포의 활성화 및 식균작용을 유도하는 후속 능력을 향상시켰다. 도 10a-10c는 FcγRIIA (도 10a), FcγRIIIA(도 10b) 및 FcγRIIB(도 10c)에 대한 aGITR IgG1(원), Afuco-IgG1(마름모) Afuco-IgG1-G236A(삼각형) 및 IgG1-G236A(사각형)의 결합에 대한 ELISA 검정 결과를 제공한다.
GITR을 표적으로 하는 새로운 Afuco-IgG1-G236A 변이체는 테스트된 다른 Ab에 비해 활성화 Fc 수용체 모두에 대한 친화도는 향상되었지만, hIgG1과 비교할 때 억제성 FcγRIIB에 대해 겉보기에 더 낮은 친화도를 갖는다(도 10a-10c).
실시예 5. 최적의 항 mGITR 항체 매개 항종양 면역을 위한 FcγRIIA 및 Fc γRIIIA 요건
아푸코실화 IgG1과 IgG1-G236A 모두 항종양 활성의 유사한 향상을 초래하기 때문에, 이러한 Fc 변이체 중 하나가 다른 것보다 우수한 지 여부와 이들이 별개의 메커니즘(FcγRIIA 대 FcγRIIIA 경로)에 관여하는지 여부를 확립하기 위해 추가 평가를 수행했다. 항종양 활성은 생체내에서 비교했다. 인간화 FcγR 마우스에 MC38 세포를 접종하고, 종양이 평균 용적 115mm3에 도달하면, 마우스를 표시된 키메라 인간 Fc 영역 변이체(DTA-1 항체의 항 mGITR 결합 도메인을 포함함), IgG1-G236A, Afuco-IgG1 및 Afuco-IgG1-G236A로 처리했다. 종양 진행은 각 동물에 대해(도 11a-11d) 각 치료 그룹의 경우 평균 종양 용적(도 11e)으로 및 생존 확률(도 11F)로서 모니터링했다. 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 Afuco-IgG1-G236A와 IgG1 그룹(모든 그룹에서 n=8)을 비교했다. 치료군은 미처리 마우스, 종양 부재 마우스 없음(도 11a), IgG1-G236A 치료, 1/8 종양 부재 마우스(도 11b), Afuco-IgG1 치료, 0/8 종양 부재 마우스(도 11c) 및 Afuco-IgG1-G236A 치료, 2/8 종양 부재 마우스(도 11d)였다. 도 11e는 각 치료군, 대조군, 미처리 마우스(미처리됨, 완전한 마름모), IgG-G236A(빈 마름모), Afuco-IgG1(삼각형), Afuco-IgG1-G236A(사각형)에 대한 평균 종양 용적을 제공한다. 도 11f는 테스트된 각 그룹, 미처리 마우스(미처리됨, 선), IgG-G236A(파선), Afuco-IgG1(점선), Afuco-IgG1-G236A(대시 및 점)에서 마우스의 생존 확률을 제공한다.
결과에 제시된 바와 같이, 세 가지 Fc 영역 변이체는 모두 여전히 상당한 항종양 활성을 초래한다. Fc 영역 변이체 Afuco-IgG1-G236A로 처리된 마우스는 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 향상을 보였으며, IgG1-G236A 변이체가 아니라 Afuco-IgG1과 비교했을 때 종양 성장 및 완전한 반응에서 통계적으로 유의한 감소를 초래했다.
현재 임상 시험 중인 항체의 일부인 Fc 스캐폴드 IgG1 또는 IgG1-N297A와 비교할 때, 새로운 Afuco-IgG1-G236A는 진행성 불응성 종양 모델에서 우수한 항종양 활성과 전체 생존자를 입증한다. 인간화 FcγR 마우스에 MC38 세포를 접종하고, 종양이 평균 용적 115mm3에 도달하면, 이들은 표시된 인간 Fc 영역 변이체인 IgG1, IgG1-N297A 또는 Afuco-IgG1-G236A로 처리했다. 마우스는 종양 진행(도 12a-12d), 각 치료군의 평균 종양 용적 및 전체 생존 확률(도 12e-12f)에 대해 추적 관찰했다. 도 12e는 각 치료군, 대조군, 미처리 마우스(미처리됨, 완전한 마름모), IgG1(원), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형), Afuco-IgG1-G236A(사각형)에 대한 평균 종양 용적을 제공한다. 도 12f는 테스트된 각 그룹, 미처리 마우스(미처리됨, 선), IgG1(파선), IgG1-N297A(점선), Afuco-IgG1-G236A(대시 및 점)에서 마우스의 생존 확률을 제공한다.
도 12e 및 12f에서 입증된 바와 같이, 이중 변형된 Fc 영역 변이체 Afuco-IgG1-G236A는 다른 Fc 영역 변이체와 비교하여 종양 성장과 생존을 감소시킨다. 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 Afuco-IgG1-G236A와 IgG1 그룹을 비교했다. Fc 영역 변이체 치료군은 미처리 마우스, 종양 부재 마우스 없음(도 12a), IgG1 치료, 1/9 종양 부재 마우스(도 12b), IgG1-N297A 치료, 0/9 종양 부재 마우스(도 12c), Afuco-IgG1-G236A 치료, 5/9 종양 부재 마우스(도 12d)이다.
실시예 6. 종양 미세환경( TME ) 및 배액 림프절( dLN ) 면역 환경에 대한 항 mGITR hIgG의 영향
Fc 조작된 항체 변이체의 특성화 후, Afuco-IgG1-G236A는 GITR mAb의 매우 효율적이고 적합한 인간 IgG 스캐폴드로서 향상된 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌고, TME에 대한 항-GITR Fc 영역 변이체의 효과를 평가했다. 불응성 MC38 종양을 가진 인간화 FcγR 마우스는 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체, Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc), IgG1 Fc-침묵 N297A(NA), IgG1의 100μg/마우스/복강내(IP) 주사로 처리하고, 미처리 마우스는 대조군으로 사용했다. 마우스를 희생시키고, 종양은 치료 후 1일, 4일(총 2mAb 투여) 및 8일(총 3mAb 투여)의 세 시점에 수거했다. TME 조성의 평가를 위해, 단일 세포 현탁액을 생성하고 유세포 분석법으로 림프구의 백분율에 대해 분석했다. 항-GITR Fc 영역 변이체 치료 개시 1일, 4일 및 8일 후 마우스의 TME에서 Treg의 빈도에 대한 유세포 분석 결과는 각각 도 13a-13c에 제시되어 있으며, Treg는 CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 대해 검출되었다. 항-GITR Fc 영역 변이체 치료 개시 1일, 4일 및 8일 후 마우스의 TME에서 CD8+ 세포의 빈도에 대한 유세포 분석 결과는 각각 도 13d-13f에 제시되어 있으며, CD8+ 세포는 CD45+CD3+CD11b-CD8+CD4-에 대해 검출되었다. 항-GITR Fc 영역 변이체 치료 개시 1일, 4일 및 8일 후 마우스의 TME에서 CD8/Treg 비율은 각각 도 13g-13i에 제시되어 있다. 도 13a-13i, 미처리 마우스(미처리됨, 마름모), IgG1(원), IgG1-N297A(거꾸로 된 삼각형) 및 Afuco-IgG1-G236A(사각형). 쌍을 이루지 않은 양측 t-테스트가 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 13a-13i로부터 알 수 있는 바와 같이, IgG1 Fc-침묵 N297A(NA)를 제외한 모든 Fc 영역 변이체를 사용한 치료 후 Treg 빈도의 감소가 명백했으며, 이는 종양 내 Treg의 Fc 매개 고갈을 나타낸다. Treg 빈도 감소는 초기 시점(1일)에 Fc 강화 변이체 Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc)로 발생하는 반면, CD8+ T 세포 빈도는 이 초기 시점에서 동일하게 유지된다. 그럼에도 불구하고, 후기 시점(8일)에 CD8+ T 세포 빈도의 증가가 Fc 강화 변이체로 관찰되었지만, IgG1에 의해서는 관찰되지 않았다. GA-aFuc는 초기 시점(4일)에 가장 높은 CD8/Treg 비율을 입증한 반면, 다른 변이체는 이후 시점에서 입증되었다. CD8/Treg 비율은 초기 시점에서는 IgG1-N297A와 비교하여 GA-aFuc 치료에 대해서만 유의한 증가를 보였고, 이후 시점에서는 IgG1-N297A와 비교하여 IgG1 Fc 영역 변이체 사이에서도 증가가 관찰되었다.
TME 및 dLN 내의 DC 활성화 상태는 MC38 세포를 접종하고 인간 항 GITR Fc 영역 변이체인 Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc), IgG1 Fc-침묵 N297A(NA) 및 IgG1로 처리된 인간화 FcγR의 TME 및 dLN에서 DC와 DC의 활성화 마커를 측정하여 평가했다. 미처리 마우스의 종양과 dLN은 대조군으로 작용하였다. 종양 및 dLN은 mAb 치료 개시 4일 및 8일 후에 수거한 다음, 단일 세포 현탁액을 수거된 장기로부터 생성하여 유세포 분석법으로 분석했다. 도 14a-14f Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc, 거꾸로 된 삼각형), IgG1 Fc-침묵 N297A(IgG1-N297A, 삼각형) 및 IgG1(사각형)로 치료 개시 4일 후 TME(14a-14c) 및 dLN(14d-14f)에서 DC 및 활성화 DC의 검출에 대한 유세포 분석법. 미처리 마우스는 대조군으로 작용했다(미처리됨, 원). 도 14a는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 대해 검출된 TME 내 DC의 백분율을 제시한다. 도 14b는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 대해 검출된 TME 내 활성화 CD80 DC의 기하학적 평균 형광 강도(gMFI)를 제시한다. 도 14c는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 대해 검출된 TME에서 활성화 CD86 DC의 gMFI를 제시한다. 도 14d는 도 14a에 대해 기재된 바와 같이 검출된 dLN에서 DC의 백분율을 제시한다. 도 14e는 도 14b에 대해 기재된 바와 같이 검출된 dLN DC에서 활성화 CD80의 기하학적 평균 형광 강도(gMFI)를 제시한다. 도 14f는 도 14c에 기재된 바와 같이 검출된 dLN에서 활성화 CD86 DC의 gMFI를 제시한다. 도 14g는 치료 개시 8일 후, 도 14에 대해 기재된 바와 같이 처리된 마우스의 TME에서 DC의 백분율을 제시한다. 기하학적 평균 형광 강도(gMFI)는 FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 투키의 다중 비교 통계 테스트를 사용한 일반적 일원 ANOVA가 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 14a-14g로부터 알 수 있는 바와 같이, TME에서의 DC 백분율은 치료 개시 후 4일째와 8일째 사이에 감소되었다(도 14a 및 14g). 증가된 DC 백분율은 IgG1 변이체로 관찰된 것과 비교하여 치료 개시 4일 후 dLN에서 관찰되었다(도 14d). IgG1 Fc-침묵 N297A(NA) 이외의 모든 Fc 영역 변이체는 TME 및 dLN(14b-14c 및 14e-14f) 내에서 CD80 또는 CD86 활성화 마커의 밀도 증가를 나타냈지만, Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc) 변이체는 두 마커 모두에 대해 가장 높은 증가를 입증했다.
실시예 7. 종양 미세환경( TME ) 및 배액 림프절( dLN ) 면역 환경에 대한 항-인간 GITR hIgG의 영향
최적화된 Fc 영역 변이체(Afuco-IgG1-G236A)가 hGITR을 표적으로 하면서 향상된 항종양 활성을 유지하는지 여부를 테스트하기 위해, 항 hGITR 인간화 항체 TRX518)의 중쇄와 경쇄를 합성하고 포유류 발현 벡터로 클로닝하여 항 hGITR 인간화 항체를 형성했다. G236A 및 N297A 돌연변이는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 CH2 도메인에 도입되어 활성화 hFcγR에 대한 결합을 향상시킨 동일한 GITR mAb 클론의 TRX518(N297A) 및 Afuco-IgG1-G236A Fc 영역 변이체를 생성했다. 위치 236의 알라닌이 글리신으로 치환된 Afuco-IgG1-G236A 변이체의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13에 제시되어 있다. 이 변이체의 경쇄 불변 영역과 TRX518의 경쇄 불변 영역은 서열번호 14에 따른다.
생산 후, 항 hGITR(항 hGITR) Fc 영역 변이체의 결합 친화도는 플레이트 결합 단백질에 대한 결합을 평가하기 위해 OD450 값이 테스트된 항체의 농도 증가에 대해 플롯팅된 비교 ELISA에 의해 측정하고 검증했다. 도 15a는 hGITR에 대한 인간화된 테스트 항체인 IgG1(원), hGITR TRX518(TRX518 (IgG1-N297A), 거꾸로 된 삼각형), Afuco-IgG1-G236A(사각형)의 결합에 대한 ELISA 결과를 제시한다. hFcγR 구성원, RIIA 및 RIIIA에 대한 Fc 영역 변이체의 결합 친화도도 ELISA로 측정되었다. 도 15b-15c는 각각 FcγRIIA 및 FcγRIIIA에 대한 테스트된 항체 IgG1(원), hGITR TRX518(TRX518(IgG1-N297A), 거꾸로 된 삼각형), Afuco-IgG1-G236A(사각형)의 결합에 대한 ELISA 결과를 제시한다.
도 15a에 묘사된 결과는 항 hGITR TRX518의 상이한 Fc 스캐폴드가 필적할 만한 결합 친화도로 hGITR에 대한 결합 친화도를 보존했음을 나타낸다. TRX518(IgG1-N297A, (삼각형))에 의한 두 개의 인간 FcγR에 대한 결합의 결여가 명백한 반면, "Afuco-IgG1-G236A"(사각형)는 인간 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 모두에 대한 결합 증가를 입증했다.
실시예 8. 항 GITR 치료 후 FcγR 의존성 종양 침윤성 림프구( TIL ) 조절
혈액 내 및 TME 내 면역 세포의 조절에 대한 인간화 항 hGITR Fc 영역 변이체의 영향을 평가하기 위해, FcγR 및 GITR(hFcγR/hGITR)에 대해 인간화된 마우스를 생성했다.
불응성 MC38 종양을 가진 인간화 FcγR/hGITR 마우스는 항 hGITR 항체 TRX518(IgG1-N297A)과 이의 Fc 영역 변이체 Afuco-IgG1-G236A로 처리했다. 혈액 내 Treg 수준은 항 hGITR Fc 영역 변이체를 1회 투여 후 시간 경과에 따라 평가했다. 도 16은 항 hGITR 항체 TRX518(IgG1-N297A, 거꾸로 된 삼각형), Afuco-IgG1-G236A(사각형), 대조군으로서 미처리 마우스(미처리됨, 마름모)로 치료 후 혈액 Treg 빈도에 대한 결과를 제시한다. 혈액 Treg 빈도 감소는 Fc-침묵 IgG1-N297A(삼각형) 및 Afuco-IgG1-G236A (사각형) 변이체 모두에 의한 치료 22시간 후 유사하게 발생했지만, Treg 빈도 감소는 IgG1 Fc-침묵 N297A에 의한 치료 후보다 Afuco-IgG1-G236A에 의한 치료 후 더 빠른 시점(2시간)에 발생했다. 치료 개시 4일 후 혈액에서 Treg 수준이 회복되었다.
다음으로, TME 조성을 평가하고, 종양을 치료 개시 4일 후(2회 항체 투여 후) 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하고 TME 내 면역 구획의 조절에 대해 유세포 분석법으로 분석했다. 도 17a-17c는 TME에서 각각 CD4+ FoxP3, CD8+ 및 Treg의 퍼센트에 대한 상이한 Ab 변이체의 효과의 유세포 분석법을 제시한다. TRX518-IgG1-N297A(TRX518(IgG1-N297A, 거꾸로 된 삼각형) 또는 Afuco-IgG1-G236A(사각형), 대조군으로서 미처리 마우스(미처리됨, 마름모). TRX518-IgG1-N297A에 대해 상기 기재된 혈액 및 huFcγR/GITR 생체내 모델에서의 Treg 고갈과 달리, TME 내 Treg 고갈은 Afuco-IgG1-G236A 처리군에서만 나타났으며(도 17c), 다른 TIL에서는 변화가 관찰되지 않았다(도 17a-b). 항 hGITR 매개 Treg 고갈은 현재 임상 시험 중인 Fc 침묵 항체 TRX518과 달리 FcγR 의존적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 9. 항 GITR Afuco - IgG1 - G236A 변이체에 의한 Treg 고갈은 NK 독립적이다
　생체내 NK 고갈 검정을 위해, 인간화 FcγR 마우스는 불응성 MC38 종양으로 도전하였고, NK 세포를 고갈시키면서 100μg/마우스/주사 IP, 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체, Afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc) 및 IgG1 Fc-침묵 N297A(NA)로 두 번(0일째 및 3일째) 처리했다. 인간화 FcγR 마우스는 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체에 의한 제1 치료(0일째) 14일 전(-14일째)에 불응성 MC38 종양 세포로 도전했다.　 αNK1.1(250ug, #BE0036, BioXCell)을 사용한 NK 세포의 고갈은 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체에 의한 제1 치료 전후 1일째 및 2일째(-2일째, -1일째, 1일째 및 2일째)에 수행했다. NK 세포 부재는 0일째와 4일째에 검증했다. PBS 또는 PBS와 αNK1.1로 처리된 마우스는 대조군으로 사용되었다. 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시 후 0일째와 4일째에 테스트된 동물로부터 혈액을 채취하고, 유세포 분석법으로 NK 세포 존재에 대해 분석했다. 추가로, 치료 개시 후 4일째에 수거된 종양으로부터 생성된 단일 세포 현탁액을 유세포 분석법에 의해 TME 내 면역 구획의 조절에 대해 분석했다.
도 18a는 마우스에 불응성 MC38 종양 세포의 접종으로부터 혈액을 채취하고 종양을 수거할 때 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시 후 4일째까지의 타임라인을 제시한다. 도 18b-18c는 각각 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시 후 0일째 및 4일째와 NK 세포 고갈 후 마우스의 혈액 샘플에서 NK 세포의 유세포 분석법을 제시한다. NK 세포는 CD45+CD3-NKp46+에 대해 검출되었으며, PBS로만 처리된 마우스의 혈액은 음성 대조군으로 작용하였다. 도 18d-18f는 각각 NK 세포(CD45+CD3-NKp46+에 대해 검출됨), Treg 세포(CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 대해 검출됨) 및 CD8+ 세포(CD45+CD3+CD11b-CD8+CD4-에 대해 검출됨)의 mg 종량당 세포 계수를 제시한다. PBS로 처리된 마우스(PBS, 전체 원), PBS와 αNK1.1로 처리된 마우스(PBS+αNK1.1, 빈 원), IgG1-N297A(완전한 사각형), IgG1-N297A 및 αNK1.1(IgG1-N297A+ αNK1.1, 빈 사각형), Afuco-IgG1-G236A(완전한 삼각형), Afuco-IgG1-G236A 및 αNK1.1(Afuco-IgG1-G236A+ αNK1.1 빈 삼각형). 쌍을 이루지 않은 양측 t-테스트가 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 18b-18c로부터 알 수 있는 바와 같이, NK 세포의 유의한 고갈은 PBS만 주사한 음성 대조군 마우스와 비교하여 αNK1.1 주사된 마우스에서는 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시 0일째에 달성되었다. 항-mGITR hIgG1 Fc 영역 변이체 치료 개시 후 0일째와 4일째 사이에, NK 세포의 고갈은 αNK1.1 주사된 마우스에서 훨씬 더 광범위하게 나타났다. 도 18d-18f로부터 알 수 있는 바와 같이, 종양내 NK 세포의 절대 수는 PBS 주사된 대조군 마우스와 비교하여 αNK1.1 주사된 그룹 모두에서 고갈을 보여준다. afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc) 처리군에서, Treg 세포가 NK 세포와 독립적인 방식으로 고갈되었으며, IgG1 Fc-침묵 N297A(NA) 처리군에서는 Treg의 훨씬 완화된 고갈이 관찰되었다. afuco-IgG1-G236A(GA-aFuc) 또는 IgG1 Fc-침묵 N297A(NA)로 처리된 마우스 그룹에서 치료 개시 후 4일째에 CD8+ 세포 수준이 보존되었다. 생체내 NK 고갈 검정은 Treg 고갈이 NK 존재와 무관하다는 것을 입증했다.
실시예 10. 비작용성 이중특이적 Afuco - IgG1 - G236A 항 GITR 항체의 생성 및 특성화　
향상된 FcγR 표적화와 함께 2가 GITR 작용제의 필요성을 평가하기 위해, Afuco-IgG1-G236A 및 IgG1-N297A의 Fc 스캐폴드와 인간화 항-RSV(호흡기 세포융합 바이러스)인 Synagis(팔리비주맙)의 Fab를 기반으로 통상적인 방법을 사용하여 비작용성 이중특이적 항체를 생성했다. Afuco-IgG1-G236A Fc 스캐폴드와 Synagis Fab를 사용하여 GITR/Synagsis Afuco-IgG1-G236A 이중특이적 항체를 생성하고, IgG1-N297A와 Synagis Fab를 사용하여 GITR/NA Synagis 이중특이적 항체를 생성했다. 새로운 이중특이적 항체를 정제하고 ELISA, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분석법으로 특성화했다. HPLC의 경우, 두 개의 이중특이적 비작용적 Ab의 샘플을 S-트랩 방법을 사용하여 트립신으로 분해했다. 생성되는 펩티드는 고분해능, 고질량 정확도 질량 분석법(Exploris)과 결합된 나노플로우 액체 크로마토그래피(nanoAcquity)를 사용하여 분석했다. 각 샘플은 발견 모드에서 무작위 순서로 기기에서 개별적으로 분석했다. 데이터는 IgG1 펩티드와 Fc 글리칸 라이브러리에 대해 Byonic 검색 엔진을 사용하여 처리되었다. 데이터는 Skyline을 사용하여 정량화되고 수동으로 검증되었다. FcγR, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 대한 이중특이적 항체의 결합을 측정했다. ELISA 테스트에서 수득된 OD450 값을 플레이트 결합 단백질에 대한 결합을 평가하기 위해 표시된 항체의 농도 증가에 대해 플롯팅했다. 단일특이적 afuco-IgG1-G236A를 대조군으로 사용했다. 도 19a-19c는 각각 상이한 hFcγR, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 대한 이중특이적 비작용제 변이체인 Afuco-IgG1-G236A(원), GITR/Afuco-IgG1-G236A Syn(DTA1/Syn GA-aFuc, 삼각형) 및 GITR/NA Syn(DTA1/Syn, 거꾸로 된 삼각형)의 결합에 대한 ELISA 결과를 제시한다. 단일특이적 Afuco-IgG1-G236A(DTA1 GA-aFuc)를 대조군(원)으로 사용했다. 도 19d는 트립신 분해된 GITR/Afuco-IgG1-G236A Synagis 비작용적 항체의 HPLC 분석을 제시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 19a-19d로부터 알 수 있는 바와 같이, GITR/Afuco-IgG1-G236A Synagis 인간화 2가(이중특이적) 및 1가 Afuco-IgG1-G236A(단일특이적) 항체는 상이한 hFcR에 대한 유사한 결합 능력을 보유한다. 그럼에도 불구하고, GITR/Afuco-IgG1-G236A Synagis는 활성화 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 우선적인 결합을 보여주었다. HPLC 분석은 80%의 단백질 순도를 나타냈다. 또한, 질량 분석법 분석은 약 73.13%의 비푸코실화 형태의 GITR/Afuco-IgG1-G236A Synagis의 수율을 나타냈다. 이중특이적 항 마우스 GITR/Synagis는 Fab 및 Fc 도메인 모두에 의해 고순도와 목적하는 결합 특성으로 생성되었다.
실시예 11. 항-마우스- GITR / Synagis 이중특이적 mAb의 시험관내 활성 검정
mGITR/NA Synagis로 표시된, Fc에 N297A 치환이 있는 항-마우스 GITR(mGITR) 비작용제 이중특이적 mAb를 생성했다. mGITR에 결합하는 새로운 mGITR/NA Synagis 용량은 단일특이적 mIgG1-N297A와 비교하여 ELISA로 평가했다. 플레이트 결합 단백질에 대한 결합을 평가하기 위해 mGITR/NA Synagis 및 mIgG1-N297A의 농도 증가에 대한 광학 밀도 450(OD450) 값을 플롯팅했다. 다음으로, WT) 마우스로부터 단리된 T 세포를 항-CD3 및 증가하는 농도의 항 mGITR/NA Synagis 또는 단일특이적 mIgG1-N297A와 함께 배양했다. Fc 영역에 N297A 치환이 있는 비-GITR 결합 항체는 동형 대조군으로 작용했다. ELISA는 배양 24시간 후 상청액에 대해 수행하여 T 세포에 의해 분비된 마우스 IL-2를 검출했다. IL-2 ELISA는 제조업체의 지침에 따라 Biolegened ELISA MAX™ 디럭스 세트 마우스 IL-2(BLG-431004)를 사용하여 수행했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 20a는 단일특이적 mIgG1-N297A(전체 원)와 비교하여 mGITR의 새로운 mGITR/NA Synagis(사각형) 결합 용량을 제시한다. 도 20b는 증가하는 농도의 항 mGITR/NA Synagis(사각형), 단일특이적 mIgG1-N297A(완전한 원) 또는 동형 대조군(동형 대조군 NA, 삼각형)으로서 Fc 영역에 N297A 치환이 있는 비-GITR 결합 항체(동형 대조군 NA)와 함께 배양 후 T 세포(항-CD3 항체로 활성화됨)에 의한 뮤린 IL-2(mIL-2) 분비(pg/ml)를 제시한다. 점선은 임의의 Ab 치료 없이 항-CD3으로 활성화 후 IL-2 농도에 대한 천연 역치를 나타낸다.
도 20a-20b에서 알 수 있는 바와 같이, 이중특이적 mGITR/NA Synagis는 단일특이적 mIgG1-N297A와 비교하여 mGITR에 대한 더 낮은 결합 용량을 보유한다. 이미 약 10- 3μg/ml의 항체 농도에서, mGITR/NA Synagis의 OD450은 mIgG1-N297A(0.6)와 비교하여 현저히 낮다(0.18). 포화점은 OD450 값이 약 0.9인 플라토로 약 10-1.5μg/ml에서 mIgG1-N297A에 의해 도달되는 반면, mGITR/NA Synagis는 약 100μg/ml의 항체 농도에서 동일한 OD 값과 플라토에 도달했다. 이 차이는 항체의 원자가와 일치하고, 각 이중특이적 mGITR/NA Synagis 항체는 단지 하나의 mGITR 분자와 결합할 수 있는 반면, 각 단일특이적 mIgG1-N297A 항체는 2개의 mGITR 분자와 결합할 수 있다.
mGITR/NA Synagis는 증가하는 농도에서 항-CD3 활성화 뮤린 T 세포에 의한 mIL-2 분비를 유도하지 않았다. mGITR/NA Synagis와 T 세포의 배양 후 분비된 mIL-2 수준은 비-GITR 결합, 동형 대조군 항체보다 훨씬 낮았다. T 세포에 의한 IL-2 분비를 유도하는 mGITR/NA Synagis의 능력의 결여는 작용적 활성의 결여를 나타낸다. 그러나, mIgG1-N297A에 의한 배양은 mIgG1-N297A의 농도가 증가하더라도 분비 수준이 동일하게 유지될 때 약 10-3 내지 약 10- 1.5μg/ml 사이의 항체 농도에서 용량 의존적 방식으로 항-CD3 활성화 뮤린 T 세포에 의한 mIL-2 분비를 유도했다. 약 10-3 내지 약 101. 5μg/ml의 농도 범위에서, mIgG1-N297A는 용량 의존적 방식으로 활성화 T 세포에 의한 mGITR과 IL-2 분비를 결합함으로써 작용제 활성을 보였다. 이중특이적 기술은 비작용제 항 GITR의 생성을 가능하게 했다.
실시예 12. 항- GITR 변이체 , GA- aFuc 및 이중특이적 비작용적 인간화 afuco -IgG1은 생체내 항종양 활성을 나타낸다.
인간화 FcγR 마우스는 불응성 MC38 종양에 도전했다. 도전 14일 후, 마우스는 100μg의 마우스 항-DTA-1(항-GITR) GA-aFuc Ab 또는 100μg, 200μg 또는 400μg의 비작용성 이중특이적 항체(GITR/syn GA-aFuc) Ab의 인간화 GA-aFuc Fc 영역 변이체로 처리했다. 미처리 마우스는 음성 대조군으로 작용했다. 치료 24시간 후 종양을 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하고, 유세포 분석법으로 TME에서 Treg 조절에 대해 분석했다. 도 21은 100μg(사각형), 200μg(삼각형) 또는 400μg(마름모)의 GITR/syn GA-aFuc와 100μg의 GA-aFuc(거꾸로 된 삼각형)로 치료 후 TME 내 Treg의 퍼센트의 유세포 분석법 분석을 제시한다. 미처리 마우스는 대조군(미처리됨, 원)으로 작용했다. 미처리 마우스의 종양뿐만 아니라 음성 대조군을 분석했다. Treg는 CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 의해 검출되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. (n=5 마우스/그룹, 일원 ANOVA).
도 21로부터 알 수 있는 바와 같이, 비작용적 및 작용적 aGITR 항체는 모두 생체내 Treg 고갈에 의해 TME를 면역조절하는 유의한 능력을 보여주었다. TME에서 Treg 백분율의 감소는 새로운 비작용적 GITR/syn GA-aFuc의 농도와 상관관계가 있었다.
실시예 13. 작용적 및 비작용적 인간화 afuco - IgG1 GA 변이체는 생체내 항종양 활성을 나타낸다
GITR/syn GA-aFuc 및 GA-aFuc의 생체내 항암 면역을 추가로 평가하기 위해, 불응성 MC38 종양을 가진 hFcγR 마우스를 종양 세포 접종 14일 후 GA-aFuc Ab 또는 비작용적 GITR/syn GA-aFuc Ab로 처리하고, 20일 동안 종양 진행(종양 용적)에 대해 모니터링했다. 미처리 마우스는 대조군으로 작용했으며, 동물에 의한 추가 고통을 방지하기 위해 13일째에 희생시켰다. 도 22a-22c는 100μg의 GA-aFuc Ab(완전한 삼각형) 또는 200μg의 비작용적 GITR/syn GA-aFuc Ab(빈 삼각형)로 치료 후 MC38 종양을 가진 hFcγ마우스에서 종양 용적(mm3) 진행 결과를 제시한다. 미처리 마우스는 대조군(완전한 원)으로 작용했으며, 각 테스트된 그룹당 n=9였다. 도 22a는 20일 종양 용적 측정치를 제시한다. 도 22b는 치료 개시 후 13일째 모든 그룹의 마우스의 종양 용적을 제시한다. 도 22c는 치료 개시 후 15일째에 GA-aFuc Ab 및 GITR/syn GA-aFuc Ab 테스트된 그룹의 마우스의 종양 용적을 제시한다. 미처리 마우스는 13일째에 희생시켰으며, 이 도면에는 나타나지 않는다.
도 22a-22c로부터, 비작용적 aGITR Ab, GITR/syn GA-aFuc 및 GA-aFuc 모두 생체내에서 성공적인 항종양 효능을 입증하였음이 명백하다. 그러나, 비작용제인 GITR/syn GA-aFuc는 작용적 aGITR 항체 GA-aFuc와 비교하여 유의하게 더 높은 암 면역을 나타냈다. 따라서, 비작용제 aGITR 변이체는 일치된 Fc 작용적 aGITR mAb와 비교하여 생체내에서 종양 성장을 억제하는 증가된 능력을 나타냈다.
실시예 14. 작용적 및 비작용적 인간화 afuco - IgG1 GA 변이체에 의한 생체내 수지상 세포 활성화　
인간화 FcγR 마우스에 불응성 MC38 종양을 접종했다. 마우스는 치료 개시 후 0일째 및 3일째에 100μg의 GA-aFuc Ab 또는 200μg의 GITR/syn GA-aFuc Ab로 2회 처리했다. 미처리 마우스는 음성 대조군으로 작용했다. 두 번째 치료 24시간 후 종양을 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하고, 유세포 분석법에 의해 TME, 즉 Treg 고갈 및 수지상 세포(DC) 활성화에 대해 분석했다. 도 23a-23b는 각각 200μg의 GITR/syn GA-aFuc(GITR/syn Afuco-IgG1-G236A 거꾸로 된 빈 삼각형)와 100μg의 GA-aFuc(Afuco-IgG1-G236A 거꾸로 된 완전한 삼각형)으로 치료한 후 TME에서 Treg 및 DC의 퍼센트의 유세포 분석법 분석을 제시한다. 미처리 마우스의 종양과 음성 대조군(원)을 분석했다. Treg는 CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 의해 검출되었고, DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 의해 검출되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. (n=5 마우스/그룹, 일원 ANOVA). 도 23c-23d는 각각 DC를 발현하는 CD80+ 또는 CD86+] 퍼센트를 검출하여 DC의 활성화의 유세포 분석법 분석을 제시한다. GITR/syn Afuco-IgG1-G236A(거꾸로 된 빈 삼각형), Afuco-IgG1-G236A 거꾸로 된 완전한 삼각형, 미처리 마우스의 종양과 음성 대조군(원)을 분석했다. 형광 강도의 기하학적 평균(gMFI)은 FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 계산했다. DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 의해 검출되었고, CD80+ DC는 항-CD80의 첨가로 검출되었으며, CD86+ DC는 항-CD86의 첨가로 검출되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 각 점은 개별 마우스를 나타낸다(n=5 마우스/그룹, 일원 ANOVA).
도 23a-23b는 대조군 마우스와 비교하여 aGITR Ab, GITR/syn GA-aFuc 및 GA-aFuc 중 하나로 치료 후 Treg가 상당한 고갈을 겪었지만, DC 수준은 안정적이었음을 보여준다. 이는 aGITR Ab의 작용적 및/또는 비작용적 활성이 DC의 수준에 영향을 미치거나 조절하지 않음을 나타낸다.
도 23c-23d는 GITR/syn GA-aFuc 또는 GA-aFuc Ab에 의한 치료가 CD80+ DC를 유의하게 증가시켰음을 보여준다. GITR/syn GA-aFuc Ab에 의한 치료가 CD86+ DC의 수준을 현저하게 증가시켰으며, CD86+ DC의 더 적은 증가는 GA-aFuc Ab에 의한 치료에 이어졌다. Fc 영역 매개 DC 활성화는 GITR/syn GA-aFuc 또는 GA-aFuc Ab 모두에 의해 나타났다.
실시예 15. 야생형 마우스에서 마우스 aGITR - mIgG2a 변이체의 생체내 항암 활성.
활성화 뮤린 수용체 FcγRI 및 FcγRIV에 대한 우선적 결합을 갖는 항-GITR-mIgG2a Ab는 이들의 항암 활성에 대해 평가했다. MC38 종양을 가진 야생형(WT) C57BL/6J 마우스는 종양 세포 접종 8일 후 100μg의 마우스 항-GITR(DTA-1) Ab(DTA-1 mIgG2a) 또는 100μg의 mIgG2a-N297A Ab(DTA-1 mIgG2a NA)로 처리하였고, mIgG2a의 Fc영역 중 침묵 돌연변이 N297A는 활성화 Fc 수용체에 대한 강화를 갖는 평행 마우스 Fc이다. 종양의 진행은 17일 동안 종양 용적을 측정하여 모니터링했다. 미처리 마우스는 대조군으로 사용되었다.
도 24a는 100μg의 DTA-1 mIgG2a(사각형) 또는 100μg의 DTA-1 mIgG2a NA Ab(삼각형)에 의한 치료 후 MC38 종양을 가진 WT 마우스에서 17일 종양 용적 진행 감시 결과를 제시한다. 미처리 마우스는 대조군(완전한 원)으로 작용했다. 데이터는 평균 ± SEM, n=9 마우스/그룹으로 표시된다.
도 24a로부터 알 수 있는 바와 같이, 100μg의 Fc 관여 DTA-1 mIgG2a Ab로 처리된 마우스는 mIgG2a-N297A와 비교할 때 종양 성장 및 완전한 반응에서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다.
다음으로, MC38 종양을 가진 WT 마우스는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab와 100μg의 DTA-1 mIgG2a NA로 처리하고, 미처리 마우스는 음성 대조군으로 작용했다. 치료 4일 후 종양을 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하고 유세포 분석법에 의해 TME 내 면역 구획에서 조절에 대해 분석했다. 검정된 면역조절 매개변수는 Treg 계수/mg 종양(항-FoxP3을 사용하여 검출됨) 및 총 림프구 중 DC 백분율(항-CD11c/항-CD45를 사용하여 검출됨), DC 활성화 상태(항-CD80 또는 항-CD86을 사용하여 검출됨)였다. 도 24b-24e는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab(mIgG2a, 사각형) 및 100μg의 DTA-1 mIgG2a NA(mIgG2a-N297A, 삼각형)로 처리된 WT 마우스 또는 대조군으로 사용된 미처리 마우스(PBS, 원)의 수거된 종양에서 상기 상세화된 매개변수의 유세포 분석법 분석을 제시한다. 각 점은 개별 마우스 n=6 마우스/그룹을 나타내며, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 일원 ANOVA를 사용하여 분석된다. 델타 gMFI는 FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 쌍을 이루지 않은 t-테스트가 사용되었다. 도 24b는 모든 테스트 그룹에서 항-FoxP3을 사용하여 검출된 Treg 계수/종양 ㎎을 제시한다. 도 24c는 모든 테스트 그룹에서 총 림프구 중 DC 백분율(항-CD11c/항-CD45를 사용하여 검출됨)을 제시한다. 도 24d는 모든 테스트 그룹에서 CD80+ 활성화 DC의 델타 gMFI를 제시한다. 도 24e는 모든 테스트 그룹에서 CD86+ 활성화 DC의 델타 gMFI를 제시한다.
도 24b-24e로부터 알 수 있는 바와 같이, DTA-1 mIgG2a 및 DTA-1 mIgG2a NA는 미처리 마우스와 비교하여 생체내에서 현저하고 유의한 Treg 고갈을 유도했다. 또한, DTA-1 mIgG2a Ab는 Fc-null 항체인 mIgG2a NA와 비교하여 유의하게 더 큰 Treg 고갈을 유도했으며, 이는 Ab의 특이성과 Fc 상호작용이 Ab의 면역조절 능력에 기여한다는 것을 나타낸다. DTA-1 mIgG2a Ab의 생체내 치료는 TME 면역 세포 집단을 조절하여 DTA-1 mIgG2a NA와 비교하여 DC 백분율을 크게 증가시켰으며, 이는 Fc 상호작용이 TME에서 DC의 증가에 결정적임을 시사한다. 또한, DTA-1 mIgG2a Ab에 의한 생체내 치료는 미처리 마우스와 DTA-1 mIgG2a NA 둘 다와 비교하여 TME에서 CD80+ 및 CD86+ 활성화 DC의 수에 반영된 바와 같이 DC 활성화를 유의하게 증가시켰다. 주목할 만하게도, CD80+ 활성화 DC의 경우, DTA-1 mIgG2a와 비교하여 DTA-1 mIgG2a Ab에 의한 이 DC 집단의 증가는 미처리 마우스의 증가보다 훨씬 더 컸다. 요약하면, DTA-1 mIgG2a는 Fc-null 항체와 비교하여 항종양 반응을 향상시키고, Treg 감소를 향상시키고, TME에서 DC 백분율을 증가시키고, DC 활성화 마커인 CD86 및 CD80을 상승시키는 것으로 나타났다.
이 Fc 결합 항체인 DTA-1mIgG2a는 다양한 DC 녹아웃(KO) 마우스 모델에서 추가로 평가하여 DC의 존재에 대한 항-GITR 항종양 효능의 의존성을 결정했다.
실시예 16. BATF3 -/- 마우스 모델에서 마우스 aGITR - mIgG2a 변이체의 생체 내 항암 활성
cDC1 세포는 부류 I MHC 분자(MHC-I)와 관련하여 세포 관련 항원의 제시에서 매우 효과적인 DC의 하위 집합이다. cDC1 세포의 이러한 특성은 특히 감염된 세포 또는 종양 세포에 대한 CD8+ T 세포 프라이밍에서 중요한 역할에 기여한다. MC38 종양이 있는 cDC1 세포의 DC 하위 집합만 결여된 BATF3-/- 마우스는 접종 9일 후 DTA-1 mIgG2a Ab 또는 DTA-1 mIgG2a-NA Ab로 처리했다. 종양 용적(mm3) 진행을 13일 동안 모니터링했다. 미처리 마우스는 음성 대조군으로 작용했으며, 동물의 불필요한 고통을 피하기 위해 치료 후 10일째에 희생시켰다. 도 25는 100μg의 DTA-1 mIgG2a(mIgG2a, 사각형) Ab 및 100μg의 DTA-1 mIgG2a-NA Ab(mIgG2a NA 삼각형)로 처리된 MC38 종양이 있는 BATF3-/- 마우스 또는 대조군으로 사용된 미처리 마우스(PBS, 원)에서 13일 동안 종양 용적(mm3) 진행 결과를 제시한다. 데이터는 평균 ± SEM, n=8, 쌍을 이루지 않은 t-테스트로 표시된다.
도 25는 치료 후 첫 6일 동안 모든 그룹에서 종양 진행이 실질적으로 동일하다는 것을 보여준다. 치료 후 6일째부터 9일째까지, Fc 관여 Ab인 DTA-1 mIgG2a로 처리된 마우스의 종양 성장률이 감소하기 시작하는 반면, 다른 그룹의 종양 성장률은 실질적으로 동일하게 유지된다. 치료 후 10일째부터,　 DTA-1 mIgG2a Ab로 처리된 마우스는 mIgG2a-N297A 및 미처리 마우스와 비교하여 종양 성장의 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다. 임의의 이론이나 작용 메커니즘에 의해 결부시키지 않고, 결과는 cDC1 세포의 결여가 Fc-null aGITR Ab, DTA-1 mIgG2a-NA Ab의 효능을 방해하여 T 세포 프라이밍의 결핍과 후속적 작용제 효과의 결여로 인해 비효율적일 가능성이 있음을 나타낸다. DTA-1 mIgG2a Ab의 지연 효과(치료 후 10일째부터만 검출됨)는 Treg 고갈 활성은 보존되지만 이펙터 세포에 대한 작용의 결여에 기인할 수 있다.
실시예 17. XCR1 - iDTR 및 ZBTB46 - iDTR 마우스 모델에서 마우스 aGITR - mIgG2a 변이체의 생체내 항암 활성
XCR1-iDTR 및 ZBTB46-iDTR 마우스 모델은 DT 수용체(DTR)를 통해 디프테리아 독소(DT) 주사시 DC가 일시적으로 고갈될 수 있는 모델이다. XCR1-iDTR은 유도성 cDC1 세포 고갈 모델이고, ZBTB46-iDTR은 유도성 cDC1 및 cDC2 세포 고갈 모델이다. cDC2 세포는 이전에 언급된 바와 같이 CD4+ T 세포와 cDC1 세포의 프라이밍에 특히 효율적이며, CD8+ T 세포 프라이밍을 촉진한다. MC38 종양을 가진 XCR1-iDTR 및 ZBTB46-iDTR 마우스는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab, 20ng/gr 체중의 DT, 또는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab와 DT 20ng/gr 체중의 조합으로 처리했다. DT는 20ng/g으로 격일로 주사하여 DC를 고갈시켰다. 종양 용적 진행은 13일(XCR1-iDTR 마우스) 또는 20일(ZBTB46-iDTR 마우스) 동안 모니터링했다. 도 26a-26b는 각각 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab(mIgG2a, 완전한 사각형), 20ng/gr 체중 DT(DTx, 원), 또는 100μg의 DTA-1 mIgG2a Ab와 20ng/gr 체중의 DT의 조합(mIgG2a+DTx, 빈 사각형)의 조합으로 처리된 XCR1-iDTR 및 ZBTB46-iDTR 마우스에서 종양 용적(mm3) 진행 결과를 제시한다. 미처리 마우스는 XCR1-iDTR 검정의 경우 n=5-10 마우스/그룹, ZBTB46-iDTR 검정의 경우 n=8 마우스/그룹으로 대조군(미처리됨, 원)으로 사용했다. 데이터는 평균 ± SEM, 쌍을 이루지 않은 t-테스트로 표시된다.
도 26a에서 알 수 있는 바와 같이, BATF3-/- 마우스 모델 검정과 유사한 경향이 XCR1-iDTR 마우스 모델에서 관찰되며, DTA-1 mIgG2a Ab 및 DT의 조합으로 처리된 마우스와 비교하여 DTA-1 mIgG2a Ab로 처리된 마우스의 종양 성장 감소에 대한 DTA-1 mIgG2a Ab의 지연 효과이다. XCR1-iDTR 검정에서, mIgG2a 항체의 효과는 DT 투여시 폐지되었으며, 이는 DC, 구체적으로 cDC1이 Fc 관여 DTA-1 항체의 성공적인 항종양 활성의 매개에 필요하다는 것을 추가로 시사한다.
도 26b에서 알 수 있는 바와 같이, cDC1 및 cDC2 세포 집단이 모두 고갈된 ZBTB46-iDTR 모델에서, DT에 의한 cDC 고갈시 Fc 관여 DTA-1 mIgG2a Ab의 효능이 폐지되었다. 그러나, DTA-1 mIgG2a Ab 단독으로의 치료는 DTA-1 mIgG2a Ab와 DT의 조합에 의한 치료와 비교하여 현저하고 유의하게 더 낮은 종양 용적 진행을 나타냈다. 심지어 DTA-1 mIgG2a Ab 단독에 의한 치료는 치료 후 3일째 초기 단계부터 종양 성장을 멈추게 했다.
임의의 이론이나 작용 메커니즘에 의해 결부시키지 않고, Fc 관여 DTA-1 항체는 관찰된 향상된 항종양 효과를 매개하기 위해 DC와의 관여를 필요로 한다. 시스템에서 이러한 세포의 부재하에, 이는 효능을 잃고, 심지어는 환경의 다른 이펙터 세포에 대한 해로운 결합으로 인해 미처리 그룹의 효과로 중화된 효과를 갖는다.
실시예 18. Treg 고갈 매개 DC 활성화에 대한 생체내 aGITR 효과
Treg 고갈 매개 DC 활성화에 대한 항-GITR Ab의 생체내 효과를 당업계에 공지된 Treg 고갈 항체인 항-CD25의 효과와 비교했다. 이를 위해, 100μg의 항-마우스 GITR mIgG2a 또는 100μg의 항-CD25로 처리된 불응성 MC38을 가진 마우스 C57BL/6J의 종양과 dLN을 치료 4일 후 수거했다. 단일 세포 현탁액을 수거된 장기로부터 생성하고, 유세포 분석법에 의해 TME 및 dLN 내 면역 구획에서 Treg 조절 또는 dLN에서 DC 활성화에 대해 분석했다. 미처리 마우스는 대조군으로 작용했다. 도 27a-27b는 각각 100μg의 마우스 항-GITR Ab(aGITR (DTA-1), 사각형), 100μg의 항-CD25 Ab(aCD25, 삼각형)로 처리된 마우스 또는 미처리 마우스(미처리됨, 원)의 TME 내 Treg 백분율과 dLN 내 DC 백분율을 제시한다. Treg는 CD45+CD3+CD11b-CD8-CD4+FoxP3+에 의해 검출되었고, DC는 CD45+CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+에 의해 검출되었다. 각 점은 개별 마우스, n=5/6 마우스/그룹을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되며, 일원 ANOVA를 사용하여 분석했다. 도 27c-27d는 각각 100μg의 마우스 항-GITR Ab(aGITR (DTA-1), 사각형), 100μg의 마우스 항-CD25 Ab(aCD25, 삼각형)로 처리된 마우스 또는 미처리 마우스(미처리, 원)의 dLN에서 CD80+ 및 CD86+ 활성화 DC를 제시한다. 활성화 CD80+ DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+ CD80+에 대해 검출되었고, 활성화 CD86 DC는 CD45+ CD11b- NK1.1- F4/80- CD11c+ MHCII+ CD86+에 대해 검출되었다. 각 점은 개별 마우스, n=5/6 마우스/그룹을 나타낸다. 델타 gMFI는 FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며, 일원 ANOVA를 사용하여 분석했다.
도 27a-27b는 미처리 마우스와 비교하여 항-GITR AB 및 항-CD25 처리 마우스 모두의 TME에서 Treg의 유의하고 거의 완전한 고갈을 보여준다. 항-GITR AB는 항-CD25 및 미처리 마우스와 비교하여 dLN에서 DC의 백분율의 유의한 증가를 나타냈다. 미처리 마우스와 항-CD25 치료 마우스의 DC 백분율은 유사했다.
도 27c-27d는 항-GITR Ab가 미처리 마우스와 비교하여 CD80+의 유의한 활성화를 유도하고 항-CD25와 비교하여 현저한 증가를 유도했음을 보여준다. 또한, 항-GITR Ab는 항-CD25와 비교하여 CD86+ DC의 유의한 활성화를 유도했으며, 미처리 마우스와 비교하여 훨씬 더 높은 증가를 유도했다.
항 GITR 및 항 CD25 치료는 Treg의 거의 완전한 고갈을 매개했지만 항 GITR만이 DC의 증가를 나타냈고 이들의 활성화를 유도했기 때문에, 생체내 Treg 고갈 매개된 DC 활성화는 GITR 의존적인 것으로 나타났다.
실시예 19. 최적의 항 mGITR 항체 매개 항종양 면역을 위한 FcγRIIA 및 Fc γRIIIA 요건
인간화 FcγR 마우스에 MC38 세포를 접종하고 종양이 평균 용적 55mm3에 도달하면, 마우스는 키메라 인간 Fc 영역 변이체로 처리했다. 종양 보유 마우스는 3일마다 총 3회 치료 동안(각 치료 100μg/마우스) IgG1-N297A 또는 IgG1-GAALIE로 처리했다. 종양 진행은 각 치료군의 평균 종양 용적으로 각 동물에 대해 모니터링했다. 도 28a-28c는 IgG1-N297A(N297A) 또는 IgG1-GAALIE(GAALIE)로 처리된 마우스의 종양 용적 진행을 제시하고, 미처리 마우스는 대조군(미처리)으로 사용했다. 각 라인은 한 마리의 동물을 나타낸다. 도 28d는 각 치료군 IgG1-N297A(N297A, n=8), IgG1-GAALIE(GAALIE, n=9), 대조군, 미처리 마우스(미처리 n=8)의 평균 종양 용적에 대한 결과를 제시한다. 쌍을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용하여 IgG1-N297A 그룹과 IgG1-GAALIE 그룹을 비교했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 28a-28d로부터 알 수 있는 바와 같이, 치료 후 8일째까지 IgG1-GAALIE로 처리된 마우스에서는 명백한 종양 용적 감소가 있었지만, IgG1-N297A로 처리된 마우스는 종양 용적의 증가를 나타냈다. 실시예 5에서 입증된 바와 같이, GAALIE는 본원에서 IgG1-N297A에 비해 종양 성장의 통계적으로 유의한 감소를 반영하는 FcγRIIa 및 FcγRIIIa 향상을 나타냈다. IgG1-GAALIE는 우수한 항종양 활성을 입증한다.
실시예 20. MC38 및 B16F10 암에 걸린 마우스에서 aGITR 변이체의 항종양 면역의 생체내 비교
hFcγ마우스는　MC38 또는 B16F10 세포를 접종하고, DTA-1(항마우스 GITR)의 인간 Fc 영역 변이체: IgG1-N297A, GAALIE, IgG1 및 GA-aFuc로 처리했다. 마우스의 종양 용적 진행 및 전반적인 생존을 모니터링한다. 다음으로, 치료 후 종양 면역 프로파일을 단일 세포 다중 오믹스(multi-omics)를 사용하여 매핑하고, 이는 병렬 단일 세포 유전체 및 전사체 동시 증폭과 단일 세포 데이터를 기반으로 한 다단계 분석을 가능하게 한다.
실시예 21. 항- hGITR의 결합 및 활성 평가를 위한 동물 모델의 생성
인간화 GITR/FcγR, GITR-Tg 마우스는 유전 공학적 접근법과 보다 전통적인 육종 접근법의 두 가지 상이한 접근법을 사용하여 생성된다. 유전 공학 접근법의 경우, GITR 유전자와 이의 관련 유전자 발현 게놈 조절 요소를 함유하는 인간 박테리아 인공 염색체 클론(BAC)이 평가되고 있다. 육종 접근법의 경우, 상기 언급된 인간화 FcγR 마우스는 마우스 GITR이 인간 서열로 대체된 hGITR 녹인(knock-In) 마우스와 함께 사육된다. 항-hGITR 결합 및 활성은, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 두 가지 인간화 GITR 마우스인 Biocytogen과 GenOway를 사용하여 생체내에서 평가된다.
실시예 22. 시험관내 항- hGITR 매개 말초 혈액 단핵 세포( PBMC ) 활성화　
항-인간 GITR mAb의 잠재적 활성화를 테스트하기 위해, 공여자의 신선한 또는 냉동 인간 PBMC를 튜브에 고르게 분배하고, 항-hGITR Ab 및 항-인간-CD3와 함께 배양한다. PBMC 활성화 상태는 T 세포 증식(CellTraceViolet 염료)과 유세포 분석법에 의한 CD25, CD44 발현에 의해 평가된다. IL-2의 존재는 ELISA를 사용하여 검출된다.
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Claims (42)

  1. 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(Glucocorticoid-induced TNFR-related; GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 아푸코실화 항체(isolated afucosylated antibody)로서, 상기 항체가 가변 영역(Fab), 및 위치 297의 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A를 포함하는 변형된(modified) 인간 IgG1 불변 영역(Fc)(본원에서 afuco-G236A)을 포함하는, 단리된 아푸코실화 항체.
  2. 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체가 가변 영역(Fab), 및 변형된 인간 IgG1 불변 영역(Fc)(본원에서 GAALIE)을 포함하며, 상기 변형된 인간 IgG가 위치 236의 글리신 잔기의 알라닌 잔기로의 아미노산 치환(G236A), 위치 330의 알라닌 잔기의 류신 잔기로의 치환(A330L), 및 위치 332의 이소류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 치환(I332E)을 포함하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GITR이 인간 GITR(hGITR)인, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체의 Fab가 6개의 CDR 서열의 세트를 포함하며, 상기 세트가 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 항체:
    i. 서열 GFSLSTSGMG(서열번호 1)를 포함하는 중쇄(HC) CDR1, 서열 IWWDDDK(서열번호 2)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARTRRYFPFAY(서열번호 3)를 포함하는 HC CDR3, 서열 QNVGTN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄(LC) CDR1, 서열 SAS 또는 서열 SAST(서열번호 5)를 포함하는 LC CDR2, 서열 QQYNTDPLT(서열번호 6)를 포함하는 LC CDR3;　
    ii. 서열 SYGMH(서열번호 7)를 포함하는 HC CDR1, 서열 VIWYEGSNKYYADSVKG(서열번호 8)를 포함하는 HC CDR2, 서열 GGSMVRGDYYYGMDV(서열번호 9)를 포함하는 HC CDR3, 서열 RASQGISSALA(서열번호 10)를 포함하는 LC CDR1, 서열 DASSLES(서열번호 11)를 포함하는 LC CDR2, 및 서열 QQFNSYPYT(서열번호 12)를 포함하는 LC CDR3; 및
    iii. 서열 GYTFTRYW(서열번호 25)를 포함하는 HC CDR1, 서열 IYPGDGDT(서열번호 26)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARNPLTTATAWFVY(서열번호 27)를 포함하는 HC CDR3, 서열 ENIYSN(서열번호 28)을 포함하는 LC CDR1, 서열 AAT를 포함하는 LC CDR2 및 서열 QHFWGPPWT(서열번호 29)를 포함하는 LC CDR3.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 13에 제시된 중쇄 서열, 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열 또는 이들 둘 다를 포함하는, afuco-G236A 항체.
  6. 제2항에 있어서, 서열번호 15에 제시된 중쇄 서열, 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열 또는 둘 다를 포함하는, GAALIE 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 인간화 항체(humanized antibody)인, 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 접합체(conjugate).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 접합체의 적어도 하나의 쇄(chain)를 인코딩(encoding)하는　폴리뉴클레오티드 서열.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 13에 제시된 afuco-G236A 항체 중쇄 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 이의 변이체를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
  11. 제9항에 있어서, 항체 중쇄를 인코딩하는, 서열번호 22 및 서열번호 23으로부터 선택되는 서열; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터(vector), 플라스미드(plasmid) 또는 작제물(construct).
  13. 제12항에 있어서, 항체 중쇄를 인코딩하는, 서열번호 22 및 서열번호 23으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 서열번호 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 벡터, 플라스미드 또는 작제물.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 벡터, 플라스미드 또는 작제물을 포함하는 숙주 세포.
  15. 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련(GITR) 단백질에 특이적으로 결합하는 복수의 항체 분자를 포함하는 조성물로서, 각 항체 분자가 가변 영역(Fab), 및 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역이 위치 297에 아스파라긴 잔기(N), 위치 236의 아미노산 잔기 글리신(G)의 알라닌 잔기(A)로의 치환 G236A를 포함하고, 상기 조성물 내의 항체 분자의 약 65-100%가 Fc 영역의 위치 297의 아스파라긴 잔기(N)에 부착된, 푸코스(fucose)가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조(mature core carbohydrate structure)를 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물 내의 항체 분자의 약 80-100%가 Fc 영역의 위치 297의 아스파라긴 잔기(N)에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조를 포함하는, 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 GITR이 인간 GITR(hGITR)인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체 분자 각각의 Fab가 6개의 CDR 서열의 세트를 포함하며, 상기 세트가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    i. 서열 GFSLSTSGMG(서열번호 1)를 포함하는 중쇄(HC) CDR1, 서열 IWWDDDK(서열번호 2)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARTRRYFPFAY(서열번호 3)를 포함하는 HC CDR3, 서열 QNVGTN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄(LC) CDR1, 서열 SAS 또는 서열 SAST(서열번호 5)를 포함하는 LC CDR2, 서열 QQYNTDPLT(서열번호 6)를 포함하는 LC CDR3;　
    ii. 서열 SYGMH(서열번호 7)를 포함하는 HC CDR1, 서열 VIWYEGSNKYYADSVKG(서열번호 8)를 포함하는 HC CDR2, 서열 GGSMVRGDYYYGMDV(서열번호 9)를 포함하는 HC CDR3, 서열 RASQGISSALA(서열번호 10)를 포함하는 LC CDR1, 서열 DASSLES(서열번호 11)를 포함하는 LC CDR2, 및 서열 QQFNSYPYT(서열번호 12)를 포함하는 LC CDR3; 및
    iii. 서열 GYTFTRYW(서열번호 25)를 포함하는 HC CDR1, 서열 IYPGDGDT(서열번호 26)를 포함하는 HC CDR2, 서열 ARNPLTTATAWFVY(서열번호 27)를 포함하는 HC CDR3, 서열 ENIYSN(서열번호 28)을 포함하는 LC CDR1, 서열 AAT를 포함하는 LC CDR2, 및 서열 QHFWGPPWT(서열번호 29)를 포함하는 LC CDR3.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체 분자 각각이 서열번호 13에 제시된 중쇄 서열, 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열, 또는 둘 다를 포함하는, 조성물.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 조성물.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태인, 조성물.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 제8항에 따른 항체 접합체, 및 적어도 하나의 담체, 부형제 또는 희석제를 활성 성분으로 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산을 향상시키고, 조절 T 세포(Treg)를 고갈 또는 억제시키거나 수지상 세포를 활성화하는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, hGITR의 면역 공동자극 활성(immune co-stimulatory activity)을 향상시키는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 암(cancer) 또는 종양(tumor)의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암이 전이성 암(metastatic cancer)인, 약제학적 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 치료가 적어도 하나의 추가 항암 요법을 투여하거나 수행하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 추가 항암 요법이 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 및 호르몬 요법으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 종양 성장(tumor growth) 또는 재발을 지연, 둔화 또는 예방하거나, 전이의 형성, 성장 또는 확산을 방지 또는 감소시키는, 약제학적 조성물.
  30. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 항종양 효과를 향상시키거나, 종양 미세환경을 조절하거나, 장기 항종양 면역을 유도하는, 약제학적 조성물.
  31. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 접합체, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하고, 포장 재료로 포장되고, 상기 포장 재료의 내부 또는 표면에서 인쇄로 식별되는 키트(kit).
  32. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항 hGITR 항체를 생성하기 위한 방법으로서,
    (i) 중쇄 및 경쇄 쌍을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 플라스미드 또는 작제물을 세포로 형질감염시키는 단계;
    (ii) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    (iii) 세포로부터 상기 쇄를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 항체가 afuco-G236A 항체이고, 아푸코실화가 번역 후 형질감염 단계에서 수행되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제8항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암 또는 종양을 치료하기 위한 방법.
  35. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제11항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 항종양 면역을 향상시키기 위한 방법.
  36. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제8항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 하나에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장 또는 재발을 지연, 둔화 또는 예방하기 위한 방법.
  37. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체, 제8항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 전이의 형성, 성장 또는 확산을 감소시키기 위한 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 종양의 치료가 적어도 하나의 추가 항암 요법을 투여하거나 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 추가 항암 요법이 수술, 화학 요법, 방사선 요법 및 면역 요법으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체, 제8항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 전염증성 사이토카인의 생산을 향상시키고, 조절 T 세포(Treg)를 고갈 또는 억제시키거나 수지상 세포를 활성화하는 방법.
  42. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제8항에 따른 항체 접합체 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, hGITR의 면역 공동자극 활성을 향상시키기 위한 방법.
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