KR20240145064A

KR20240145064A - 연쇄상구균 백신

Info

Publication number: KR20240145064A
Application number: KR1020247031708A
Authority: KR
Inventors: 레이첼 밥; 모하메드 알샤리피; 오스틴 야니스 첸; 샤논 크리스타 다비드; 티모시 레이몬드 허스트; 아비오둔 다비드 오군니이; 제임스 클릴랜드 페이턴
Original assignee: 지피앤 백신즈 피티와이 엘티디
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2024-10-04
Also published as: CN107427569A; EP3273989A4; US20180117136A1; CN107427569B; KR20170129786A; ES2970824T3; JP7269281B2; KR102710711B1; SG11201707926WA; US20210170011A1; AU2016236770B2; WO2016149771A1; EP3273989C0; BR112017020178A2; CN116603058A; CA2980616A1; AU2016236770A1; JP6903046B2; JP2018513877A; US10821168B2

Abstract

본 발명은 광자-조사된 연쇄상구균 백신 제제 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

연쇄상구균 백신 {STREPTOCOCCAL VACCINE}

상호-참조에 의한 편입

본 출원은 2015년 3월 26일자로 출원된 "Streptococcal Vaccine"이라는 제목의 호주 가특허출원 제2015901098호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 상호 참조로 본원에 포함된다.

본 발명은 일반적으로 백신 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연쇄상구균 백신 제제 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

연쇄상구균(streptococci)은 스트렙토코카세아과(Streptococcaceae)에 속하는 회전 타원체 박테리아(spheroidal bacteria) 속에 속한다. 연쇄상구균은 여러 다른 종류가 있는데, 그 중 일부는 사람과 동물에게 질병을 유발한다. 다른 것들은 다양한 발효 제품의 제조에 중요하다.

개별 연쇄상구균 종은 그들의 용혈성 특성(알파- 및 베타-용혈성)에 기초하여 2개의 중요한 그룹으로 분류된다. 알파-용혈성 연쇄상구균은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 및 비리단스 연쇄상구균(Viridans streptococci)를 포함한다. 베타-용혈성 그룹은 A군 및 B군 연쇄상구균으로 구성된다. B군 연쇄상구균은 일반적으로 부작용없이 여성의 소화 기관과 질에 서식한다. 대부분의 사람들은 신생아에서 더 심각한 유형의 감염을 일으킬 수 있지만 B군 연쇄상구균에 대한 자연 면역력이 빠르게 생긴다. A군 연쇄상구균은 일반적으로 인후와 피부 표면에 서식하며, 성인과 어린이의 감염의 흔한 원인이 된다. 대부분의 A군 감염이 보통 건강에 심각한 위협을 가하지 않지만(예를 들면, 인후염, 봉와직염, 농가진, 부비동염, 중이염), A군 연쇄상구균은 신체의 조직과 기관에 더 깊숙이 침투하여, 더 심각한 침습성 감염을 일으킬 수 있고(예를 들면, 폐렴, 패혈증, 수막염, 괴사성 근막염), 급성 연쇄상구균-감염후 사구체신염(post-sterptococcal glomerulonephritis)과 급성 류마티스 열을 포함한 심각한 후유증을 유발할 수 있다.

또한, 장내구균(Enterococcal)(배설물) 연쇄상구균 종은 대장에서 상당수 발생하고 심내막염 및 요로 감염을 일으킬 수 있다.

폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae, 폐렴구균이라고도 함)은 인간 및 동물 대상체군의 심각한 이환율 및 사망률의 원인이 되는 중요한 인간 병원균이다. 폐렴, 수막염, 부비동염, 중이염을 비롯한 심각한 질환들을 유발한다. 세계적으로 매년 160만명의 사람들이 침습성 폐렴구균 질병으로 사망하고, 그중 약 백만명이 어린이이다. 피막화학구조와 면역원성을 토대로 구별가능한 여러 종류의 폐렴연쇄상구균(>90) 혈청형이 있다. 피막 다당류는 비-침습성 폐렴구균 질병의 원인이 되는 폐렴연쇄상구균에서 비-피막 균주가 사실상 없기 때문에 폐렴연쇄상구균의 필수 독성 인자로 간주된다. 따라서, 피막 다당류는 현재의 폐렴구균 백신에서 백신 항원으로 사용된다.

현재의 폐렴구균 접합 백신은 선택된 혈청형 세트(예를 들어, PCV7(7가지 혈청형), PCV10(10가지 혈청형) 및 PCV13(13가지 혈청형))만을 커버한다. 많은 대상체군에서, 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 대상으로 하는 PCV7 백신의 도입은 폐렴구균 질병의 부담을 상당히 감소시켰다. 그러나, 목표한 백신 혈청형에 기인한 질병에 대한 그들의 효과에도 불구하고, 혈청형 보충은 백신접종의 순 효과를 종종 감소시킨다. 예를 들어, 미국, 영국, 독일, 웨일즈, 네덜란드를 비롯한 여러 지역에서, 혈청형 19A가 PCV7 도입 이후 일반적인 신종 비-백신 혈청형으로 보고되었다. 따라서, 폐렴구균 접합 백신의 이행시 비-백신 혈청형의 출현은 문제를 야기한다.

폐렴구균 접합 백신과 관련된 비-백신 혈청형의 출현을 고려할 때, 보다 넓은 범위의 혈청형에 대한 면역을 유도할 수 있는 새로운 연쇄상구균 백신에 대한 필요성이 존재한다.

상기도의 군집화(colonisation)은 폐렴구균 질병의 발병 기전 중 필수적인 첫번째 단계이므로, 침습성 폐렴구균 질병의 가장 중요한 위험 인자로 간주된다. 또한 지역 사회에서 폐렴구균이 수평적으로 퍼져 나가는 것에 근거하여, 예방책의 중요한 목표로 삼고 있다.

따라서, 넓은 범위의 폐렴구균 혈청형에 대한 면역력을 유도할 수 있고, 상기도 투여에 적합한 백신에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 기존의 연쇄상구균 백신의 적어도 하나의 결핍을 감소시키거나 완화시키는, 개선된 연쇄상구균 백신에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 적어도 이하의 구현예에 관한 것이다:

구현예 1. 대상체에서 연쇄상구균 박테리아에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아를 대상체에게 투여하여 감염을 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는 방법.

구현예 2. 구현예 1에 따른 방법으로서, 상기 방법은 복수의 상이한 연쇄상구균 종 및/또는 혈청형에 의한 감염을 예방 또는 치료하는, 방법.

구현예 3. 구현예 2에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 상이한: 연쇄상구균(Streptococcus) 종, 연쇄상구균 혈청형 및/또는 연쇄상구균 유도체를 포함하는, 방법.

구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 연쇄상구균 감염이 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 하나 이상의 혈청형에 의한 감염을 포함하는, 방법.

구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 연쇄상구균 박테리아에 의한 감염이 기도 감염, 폐렴, 귀 감염, 귀병, 중이염, 분비성중이염, 부비동염, 수막염, 결막염, 균혈증, 패혈증(septicaemia), 관절 감염, 뼈 감염, 화농성 관절염, 패혈증(sepsis), 골수염, 연조직 감염, 봉와직염, 근염, 안와 주위염, 농양, 괴사성 근막염, 농가진, 복막염, 심장 감염, 심내막염 및/또는 심낭염 중 하나 이상인, 방법.

구현예 6. 대상체에 연쇄상구균 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 치료적 유효량의 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아를 대상체에 투여하여 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 7. 구현예 6에 따른 방법으로서, 상기 면역 반응이 대상체에게 투여된 것과 상이한 연쇄상구균 종 및/또는 혈청형에 대한 이종 면역 반응을 포함하는, 방법.

구현예 8. 구현예 6 또는 구현예 7에 따른 방법으로서, 치료적 유효량의 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 상이한: 연쇄상구균 종, 연쇄상구균 혈청형 및/또는 연쇄상구균 유도체를 포함하는, 방법.

구현예 9. 구현예 7 또는 구현예 8에 따른 방법으로서, 상기 상이한 연쇄상구균 종 및/또는 혈청형이 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 혈청형인, 방법.

구현예 10. 구현예 6 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 면역 반응이 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:

(i) B-림프구 반응;

(ii) 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아로부터의 이중-가닥 RNA와 Toll-유사 수용체의 상호 작용에 의해 적어도 부분적으로 유도되는 선천적 면역 반응;

(iii) T-림프구 반응.

구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 적어도 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형, 또는 적어도 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형의 비피막 유도체를 포함하는, 방법.

구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 하기를 포함하는 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 방법:

(i) 하나 이상의 결함있는 DNA 복구 단백질; 및/또는

(ii) 결함있는 DNA 복구 능력을 유발하는 유전자 변형.

구현예 13. 구현예 12에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균이 DNA 복구 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자에 결함을 포함하는, 방법.

구현예 14. 구현예 13에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아가 DNA 알킬화 복구 단백질을 코딩하는 유전자, DNA 폴리머라제 4를 코딩하는 유전자, hexA, hexB, mutS, radC, recA, recF, recN, recO, uvrA, uvrB, uvrC 또는 uvrD로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결함을 포함하는 폐렴연쇄상구균 돌연변이체인, 방법.

구현예 15. 구현예 12 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 결함있는 DNA 복구 단백질이 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아에서 돌연변이, 절단 또는 결실된, 방법.

구현예 16. 구현예 12 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아가 하기의 연쇄상구균 Rx1 균주 유도체를 포함하는, 방법:

(i) 자가분해효소, 용혈소, 폐렴구균용혈소 및/또는 PsaA 단백질 중 임의의 하나 이상이 결함있고; 및/또는

(ii) 자가분해효소, 용혈소 및/또는 PsaA 단백질 중 임의의 하나 이상이 결실되어 있다.

구현예 17. 구현예 16에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 Rx1 균주 유도체는:

(i) 결함있는 자가분해효소 단백질을 코딩하는 유전자, 결함있는 용혈소를 코딩하는 유전자, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자 및/또는 결함있는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자 중 임의의 하나 이상을 포함하고; 또는

(ii) 자가분해효소를 코딩하는 유전자, 용혈소를 코딩하는 유전자 및/또는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자 중 임의의 하나 이상이 결실된 유도체인, 방법.

구현예 18. 구현예 16 또는 구현예 17에 따른 방법으로서, 상기 자가분해효소가 LytA 인 방법.

구현예 19. 구현예 16 내지 18 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 Rx1 균주 유도체가:

(i) 결함있는 LytA 단백질을 코딩하는 유전자 및 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하고; 또는

(ii) lytA 유전자를 함유하지 않으며, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하는, 방법.

구현예 20. 구현예 12 내지 19 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아가 상응하는 비-돌연변이 연쇄상구균 박테리아에 의해 요구되는 것과 비교하여 불활성화를 위한 광자-조사선량을 감소시킬 것을 요구하는, 방법.

구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아의 일부 또는 전부가 RNA 전사체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변형된 연쇄상구균 박테리아를 포함하고, 상기 RNA 전사체가 전사 후 이중-가닥 부분을 형성할 수 있는 자가-상보성 영역을 포함하는, 방법.

구현예 22. 구현예 21에 따른 방법으로서, 상기 이중-가닥 RNA 전사체의 일부가 적어도: 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 염기 쌍의 길이인, 방법.

구현예 23. 구현예 21 또는 구현예 22에 따른 방법으로서, 상기 이중-가닥 RNA 전사체가 Toll-유사 수용체 활성화를 포함하는 대상체에서 선천적인 면역 반응을 개시하는, 방법.

구현예 24. 구현예 23에 따른 방법으로서, 상기 Toll-유사 수용체가 Toll-유사 수용체-3(TLR-3)인, 방법.

구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 영양요구성 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 방법.

구현예 26. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가:

(i) 박테리아를 불활성화시키거나 약독화시키고; 및/또는

(ii) 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 개선시키는

항원 또는 그의 성분을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA 부분을 포함하는, 방법.

구현예 27. 구현예 26에 따른 방법으로서, 상기 재조합 DNA 부분이 병원성, 감염, 증식, 생체내 성장 또는 이들의 임의의 조합에 필요한 내인성 유전자를 대체 또는 파괴하는, 방법.

구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 전체 사멸된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 방법.

구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 대상체에게 점막으로 또는 비강내로 투여되는, 방법.

구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 보조제와 함께 대상체에게 투여되는, 방법.

구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아의 1, 2 또는 3의 개별적인 투여량이 대상체에게 투여되는, 방법.

구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 대상체가 인간인, 방법.

구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 적어도: 8킬로그레이(kGy), 9kGy, 10kGy, 11kGy, 12kGy, 15kGy, 20kGy, 25kGy, 30kGy, 40kGy, 또는 50kGy의 광자-조사의 총 투여량 투여되는, 방법.

구현예 34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 감마선-조사된 연쇄상구균 박테리아, X선-조사된 연쇄상구균 박테리아 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.

구현예 35. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 X선-조사된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 방법.

구현예 36. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 감마선-조사된 연쇄상구균 박테리아와 X선-조사된 연쇄상구균 박테리아의 조합을 포함하는, 방법.

구현예 37. 구현예 20 또는 구현예 33에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사가 감마선-조사인, 방법.

구현예 38. 구현예 20 또는 구현예 33에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사가 X선-조사인, 방법.

구현예 39. 구현예 20 또는 구현예 33에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사가 감마선-조사 및 X선-조사의 조합인, 방법.

구현예 40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가:

(i) 결함있는 LytA 단백질을 코딩하는 유전자, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자 및 결함있는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고;

(ii) 결합있는 LytA 단백질을 코딩하는 유전자, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하고, PsaA 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않고;

(iii) 결함있는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 및 LytA 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않고; 또는

(iv) 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하고, LytA 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않고, PsaA 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않는,

연쇄상구균 Rx1 균주 유도체를 포함하는, 방법.

구현예 41. 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체를 포함하는 백신 조성물로서:

(i) 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가, 하나 이상의 결함있는 DNA 복구 단백질을 포함하는 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아 및/또는 DNA 복구 단백질의 적어도 한 유형이 존재하지 않는 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아를 포함하고; 및/또는

(ii) 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가, RNA 전사체를 코딩하는 DNA의 서열을 포함하는 변형된 연쇄상구균 박테리아를 포함하며, 상기 RNA 전사체는 전사 후 이중-가닥 부분을 형성할 수 있는 자기-상보성의 영역을 포함하는, 백신 조성물.

구현예 42. 구현예 41에 따른 백신 조성물로서, 상기 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아가 DNA 알킬화 복구 단백질을 코딩하는 유전자, DNA 폴리머라제 4를 코딩하는 유전자, hexA, hexB, mutS, radC, recA, recF, recN, recO, uvrA, uvrB, uvrC 또는 uvrD로부터 선택된 하나 이상의 유전자들에 결함을 포함하는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 돌연변이체인, 백신 조성물.

구현예 43. 구현예 41 또는 구현예 42에 따른 백신 조성물로서, 상기 변형된 연쇄상구균 박테리아가 변형된 폐렴연쇄상구균 박테리아이고, 이중-가닥 RNA 전사체의 부분이 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 염기 쌍의 길이를 갖는, 백신 조성물.

구현예 44. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가:

(i) 박테리아를 불활성화하거나 약독화시키거나; 또는

(ii) 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 개선시키는,

항원 또는 그의 성분을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA 부분을 포함하는, 백신 조성물.

구현예 45. 구현예 44에 따른 백신 조성물로서, 상기 재조합 DNA 부분이 병원성, 감염, 생식 또는 이들의 임의의 조합에 필요한 내인성 유전자를 대체 또는 파괴하는, 백신 조성물.

구현예 46. 구현예 41 내지 45 중 어느 하나에 따른 백신으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가:

(i) 자가분해효소, 용혈소, 폐렴구균용혈소 및/또는 PsaA 단백질 중 임의의 하나 이상이 결함이 있으며; 및/또는

(ii) 자가분해효소, 용혈소 및/또는 PsaA 단백질 중 임의의 하나 이상이 존재하지 않는,

연쇄상구균 Rx1 균주 유도체 균주를 포함하는, 백신.

구현예 47. 구현예 46에 따른 백신으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 Rx1 균주 유도체는:

(ii) 자가분해효소를 코딩하는 유전자, 용혈소를 코딩하는 유전자 및/또는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자 중 임의의 하나 이상이 존재하지 않는 유도체인, 백신.

구현예 48. 구현예 41 내지 47 중 어느 하나에 따른 백신으로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 Rx1 균주 유도체가:

(ii) lytA 유전자를 함유하지 않으며, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하는, 백신.

구현예 49. 구현예 41 내지 48 중 어느 하나에 따른 백신으로서, 상기 광자-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아가:

(ii) 결함있는 LytA 단백질을 코딩하는 유전자, 결함있는 폐렴구균용혈소를 코딩하는 유전자를 포함하고, PsaA 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않고;

연쇄상구균 Rx1 균주 유도체를 포함하는, 백신.

구현예 50. 구현예 41 내지 49 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 전체-감쇠된 또는 전체-사멸된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.

구현예 51. 구현예 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 보조제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.

구현예 52. 구현예 41 내지 51 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 백신 조성물이 점막 또는 비강내 투여용으로 배합되거나 근육내, 피하 또는 피내 주사를 위해 배합되는, 백신 조성물.

구현예 53. 구현예 41 내지 52 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 감마선-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아 및/또는 감마선-조사 변형된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.

구현예 54. 구현예 41 내지 52 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가 X선-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아 및/또는 X선-조사된 변형된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.

구현예 55. 구현예 41 내지 52 중 어느 하나에 따른 백신 조성물로서, 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아가:

(i) 감마선-조사된 및 X선-조사된 돌연변이체 연쇄상구균 박테리아의 조합; 및/또는

(ii) 감마선-조사된 및 X선-조사된 변형된 연쇄상구균 박테리아의 조합

을 포함하는, 백신 조성물.

구현예 56. 구현예 41 내지 55 중 어느 하나에 따른 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,

(i) 연쇄상구균 박테리아 제제를 광자-조사하여 박테리아를 약독화시키거나 사멸하는 단계; 및

(ii) 상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아를 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 배합하는 단계

를 포함하는, 방법.

구현예 57. 구현예 56에 따른 방법으로서, 연쇄상구균 박테리아의 제제를 상기 광자-조사하는 단계는 박테리아를 감마-선에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 58. 구현예 56에 따른 방법으로서, 연쇄상구균 박테리아의 제제를 상기 광자-조사하는 단계는 박테리아를 X-선에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 59. 구현예 56에 따른 방법으로서, 연쇄상구균 박테리아의 제제를 상기 광자-조사하는 단계는 박테리아를 감마-선 및 X-선에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 60. 구현예 56 내지 59 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 백신 조성물.

구현예 61. 연쇄상구균 박테리아에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 구현예 41 내지 55 또는 60 중 어느 하나에 따른 백신 조성물.

구현예 62. 연쇄상구균 박테리아에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용되는 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아의 용도로서, 약제가 구현예 41 내지 55 또는 60 중 어느 하나에 따른 백신 조성물인, 용도.

구현예 63. 구현예 61에 따른 백신 조성물 또는 구현예 62에 따른 용도로서, 연쇄상구균 박테리아에 의한 상기 감염이 기도 감염, 폐렴, 귀 감염, 귀병, 중이염, 분비성중이염, 부비동염, 수막염, 결막염, 균혈증, 패혈증, 관절 감염, 뼈 감염, 화농성 관절염, 골수염, 연조직 감염, 봉와직염, 근염, 안와 주위염, 농양, 복막염, 심장 감염, 심내막염 및 심낭염 중 임의의 하나 이상인, 백신 또는 용도.

본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 도면을 참조하여 비-제한적인 예로서만 설명될 것이다.
도 1은 항-LytA 및 항-PdT 항혈청을 사용하여 폐렴연쇄상구균 D39 및 다양한 유도체에서 PdT 및 LytA를 검출하는 웨스턴 블럿 분석 결과를 보여준다. 이는 LytA 유전자의 성공적인 결실 및 PdT를 코딩하는 돌연변이 유전자에 의한 ply의 치환을 확인하여, 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 명명된 lytA 삭제(null) 돌연변이체(자가분해효소-결핍), 폐렴구균용혈소 돌연변이 유도체(PdT) Rx1 균주를 발생시켰다. 레인: 1. 대조군으로서 정제된 ply 및 LytA(각각 5ng); 2. 폐렴연쇄상구균 D39; 3, 폐렴연쇄상구균 Rx1; 4, Rx1(ΔLytA, PdT) 백신 균주(사전-조사). 재조합 정제된 Ply 및 LytA 단백질은 His6-태그의 존재로 인해 크기가 더 크다.
도 2는 폐렴구균용혈소의 PdT 돌연변이 형태를 갖는 유도체 Rx1 균주 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에서 용혈 활성의 결핍을 확인하기 위해 수행된 용혈 분석의 결과를 나타낸다.
도 3은 ΔlytA 유전자에 의해 코딩된 mRNA 전사체의 예측된 2차 구조를 도시한다.
도 4는 얼음(도 4a) 또는 드라이 아이스(도 4b)상의 감마선-조사의 다양한 투여량에 노출된 후의 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 생존력을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 5는 감마선-조사가 물리적 형태에 미치는 영향을 나타내는 그람-염색된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 이미지를 제공한다. DI: 드라이 아이스; KGY: 킬로그레이;
도 6은 감마선-조사가 물리적 형태에 미치는 영향을 나타내는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 주사 전자 현미경 이미지를 제공한다.
도 7은 살아있는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 균주 D39(혈청형 2)에 의한 비강내 투여에 대한 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 백신접종된 마우스의 (A)중간 생존 기간 및 (B) 생존율을 나타낸 그래프이다. * P = <0.05; γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 8은 EF3030(혈청형 19F)(도 8a 및 도 8b) 또는 P9(혈청형 6A)(도 8c)에 의한 이종유형 투여에 대해 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 백신접종된 마우스에서 면역력을 나타내는 일련의 그래프를 제공한다. 폐(도 8a) 및 비인두(도 8b)에서 투여 후 96시간 후에 EF3030 박테리아 수를 측정하였다. 도 8c는 P9를 투여한 지 21일후 마우스의 생존 기간을 나타낸다. γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 9는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 비강내로 백신접종된 마우스에서 폐렴연쇄상구균-특이 항체 반응을 측정한 ELISA 결과를 보여주는 일련의 그래프이다. 각 그래프는 항원 Ply, CbpA, GlpO 및 NanA에 대한 혈청내 특정 IgG 반응을 나타내며; 및 IgG 및 IgA 항체는 PspA 및 조사되지않은 전체 Rx1(ΔLytA, PdT) 박테리아 세포에 반응한다. 마우스는 γ-PN(감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT))으로 백신접종을 받았거나, 백신접종받지 않았다(PBS 대조군);
도 10은 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 복강내 백신접종된 마우스에서 폐렴연쇄상구균-특이 항체 반응을 측정한 ELISA 결과를 보여주는 일련의 그래프이다. 각 그래프는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 세포(WC)(도 10a) 및 정제된 항원 Ply(도 10b) 및 CbpA(도 10c)의 전체 세포 용해물에 대한 혈청내 특정 IgG 적정을 보여준다. γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 11은 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 비강내 백신접종되고, 치사량의 폐렴연쇄상구균 균주 D39가 접종된 야생형 C57/BL6 및 B-세포 결핍 C57/BL6(μMT) 마우스의 생존율(%)을 나타내는 그래프이다. ** P = <0.01; γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 12는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 비강내 백신접종된 마우스로부터 유래된 배양된 비장세포로부터의 상청액에 수행된 사이토킨 분석의 결과를 나타낸다. 폐렴연쇄상구균 항원 MalX, ConA, 또는 전체 감마선-조사된 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신으로 자극한 후의 비장세포로부터의 상청액에서 인터루킨-17A(IL-17A)(도 12a) 및 인터페론-γ(IFN-γ) 수준(도 12b)이 표시된다. 도 12c 및 12d는 72시간 자극후 유도된 Th1 세포(IFN-γ+를 사용함), Th2 세포(IL-4+), Th17 세포(IL-17+) 및 T-reg 세포(Foxp3+)의 비율을 측정하기 위해 MalX 또는 백신 존재하에서 배양된 비장세포에서 수행된 세포내 사이토카인 염색의 결과를 나타낸다. γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 13은 A/PR8 도전 3주전에, (i) 대조군으로서 PBS가 주어진 마우스(도 13a) 및 (ⅱ) 비강내로 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신접종된 마우스(도 13b)의 인플루엔자 바이러스 균주 A/PR8로 접종한 후의 체중 변화율을 나타낸다. γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 14는 콜레라 독소(CT) 단독(대조군) 또는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) + 콜레라 독소로 비강내 백신접종된 마우스의 폐렴연쇄상구균 균주 EF3030(혈청형 19F)에 의한 접종 후 폐(도 14a) 및 비인두(도 14b)내 박테리아 수를 나타낸다. 도 14c 및 도 14d는 CT 단독(대조군) 또는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) + CT에 의해 비강내 백신접종된 폐렴연쇄상구균 균주 D39(혈청형 2) 또는 폐렴연쇄상구균 균주 P9(혈청형 6A) 각각으로 접종한 마우스의 생존 기간을 나타낸다. * p = <0.05; ** p = <0.01; γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 15는 콜레라 독소(CT) 단독(대조군) 또는 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) + CT에 의해 비강내 백신접종된 마우스에서 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신 또는 MalX 항원으로 비장세포를 72시간 자극한 후 유도된, Th1 세포(IFN-γ+ 사용), Th2 세포(IL-4+), Th17 세포(IL-17+) 및 T-reg 세포(Foxp3+)의 비율을 측정하기 위해 수행된 세포내 사이토카인 염색 결과를 나타낸다(도 15a 및 도 15b). 사이토카인 분석은 또한 배양된 비장세포로부터의 상청액에 대해 수행하였다. MalX 또는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신으로 자극한 후 비장세포로부터의 상청액에서 인터루킨-17A(IL-17A)와 인터페론-감마(IFN-γ) 수준이 표시되어 있다(도 15c). γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 16은 콜레라 독소 보조제의 존재 또는 부재하에, 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 비강내에서 백신접종한 마우스의 혈청에서 조사되지않은 전체 Rx1(ΔLytA, PdT) 박테리아 세포에 대한 폐렴연쇄상구균-특이 항체 반응을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다. γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 17은 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 비강내 백신접종되고, 치사량의 폐렴연쇄상구균 균주 D39를 접종한 야생형 C57/BL6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프를 제공한다. 마우스에게 접종 24시간 전, 접종 6시간 후 및 접종 48시간 후에 IFN-γ 또는 IL-17에 대한 중화 항체 또는 관련 아이소타입 제어 항체를 주사했다. * P = <0.05, ** P = <0.01; γ-PN = 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT);
도 18은 백신접종을 하지 않은 마우스와 비교하여, 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 백신접종된 마우스에서 폐렴연쇄상구균 D39로 생 접종한 후 24시간 및 48시간후에 유도된 폐에서의 T 이펙터 세포(Th1 및 Th17), γδT 세포(γδT1 및 γδT17) 및 포식세포(대식세포 및 호중구)의 총 수를 나타낸다;
도 19는 균주 D39, Rx1, Rx1(ΔLytA, PdT) 및 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 PCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 또한 Rx1, Rx1(ΔLytA, PdT) 및 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 성장을 보여준다. PCR의 경우, ply, lytA 및 psaA 유전자에 대한 유전자좌가 증폭되었다(도 19a). 웨스턴 블랏의 경우, Ply, LytA 및 PsaA에 대한 항혈청을 사용하였다(도 19b). 성장을 위해 SILAC RPMI 1640 Flex Media(포도당이 보충됨)에 0.05의 A ₆₀₀으로 박테리아를 접종하고, 5% CO₂에서 37℃에서 정적으로 배양했다(도 19c). 이것은 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)을 생성하기 위한 Rx1(ΔLytA, PdT)로부터 psaA 유전자의 성공적인 결실을 확인하고, Mn²⁺가 보충되지 않은 배지에서 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA) 균주의 성장 결함을 입증한다;
도 20은 ΔpsaA 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 전사체의 예측된 2차 구조를 도시한다; 및
도 21은 드라이 아이스상에서 다양한 감마선-조사량에 노출된 후의 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA) 생존력을 나타내는 그래프를 제공한다(도 21a). 방사선 조사되지 않았거나(도 21b) 또는 25kGy에서 조사된(도 21c) 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 물리적 형태에 대한 주사 전자 현미경 이미지가 도시되어 있다.
정의들
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 인용을 포함한다. 예를 들어, 문구 "단백질"은 또한 복수의 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"을 의미한다. "포함한다"와 같은 단어 "포함하는"의 변형은 상응하게 다양한 의미들을 가진다. 따라서, 예를 들어, 감마선-조사된 연쇄상구균 균주 A를 "포함하는" 백신은 감마선-조사된 연쇄상구균 균주 A만으로 구성될 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가 성분(예를 들어 감마선-조사된 연쇄상구균 균주 B)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "복수"라는 용어는 둘 이상을 의미한다. 특정 특정 양태 또는 구현예에서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 그 이상 및 그로부터 유도될 수 있는 임의의 정수 및 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목적하는 치료 효과를 제공하기 위해 본 발명에서 사용하기 위한 약제 또는 조성물의 비-독성이지만 충분한 양을 의미한다. 필요한 정확한 양은 치료되는 종류, 대상체의 나이 및 일반적인 상태, 치료되는 질환의 중증도, 투여되는 특정 약제, 투여 방식 등과 같은 요소에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 모든 구현예에 적용가능한 정확한 "유효량"을 지정할 수는 없다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해, 적절한 "유효량"은 통상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "광자-방사선"이라는 용어는 감마-방사선(즉, 감마-선)과 X-방사선(즉, X-선)을 모두 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "광자-조사된" 재료는 감마-선에 노출되어, 결과적으로 "감마선-조사된" 재료, X-방사선에 노출되어 결과적으로 "X선-조사된" 재료, 또는 둘다일 수 있다. 광자-조사되는 비-제한적인 예로서, 재료는 0.01MeV 이상, 0.1MeV 이상, 0.5MeV 이상, 0.01MeV 내지 0.5MeV, 0.01MeV 내지 1MeV, 0.01MeV 내지 10MeV, 0.5MeV 내지 20MeV, 0.5MeV 내지 15MeV, 0.5MeV 내지 10MeV, 0.5MeV 내지 5MeV, 0.5MeV 내지 2MeV, 또는 1MeV 내지 2MeV(예를 들어, 1.25MeV)의 에너지로 광자-조사될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 박테리아와 관련하여 "약독화된(attenuated)"이라는 용어는 박테리아가 숙주에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 기간동안 투여된 숙주에서 비병원성 감염만을 확립할 수 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 박테리아는 약독화된 박테리아가 투여되는 비-면역 결핍된 숙주에게 장기간 감염을 일으키거나, 유해한 병원성 감염을 일으킬 수는 없다.
본원에서 사용된 바와 같이, 면역 또는 면역 반응의 문맥에서 "유도", "유도하는", "개선" 및 "개선하는"이라는 용어들은 부재하거나 측정가능한 존재 수준 이상의 면역력 또는 면역 반응의 증가를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상체"란 용어는 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하여 경제적, 사회적 또는 연구적으로 중요한 임의의 동물을 포함한다. 따라서, "대상체"는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물(예를 들어, 돼지, 고양이, 개, 소, 말 또는 양)과 같은 포유동물일 수 있다. 실험실 동물(예를 들어, 설치류 동물, 토끼 등), 조류(예를 들어, 가금류), 어류 및 갑각류도 이 용어의 범주에 포함된다.
본원에서 사용된, 주어진 감염 및/또는 감염으로부터 발생하는 질병 또는 질환과 관련하여 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"이라는 용어는 대상체가 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 병원성 유기체에 노출시 감염 및/또는 질병 또는 질환을 일으키는 성향이 감소한 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 감염 및/또는 질병 또는 질환을 일으키는 감소된 성향은 감소된 성향 및 결여된 성향 모두를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된, 주어진 감염 및/또는 감염으로부터 비롯되는 질병 또는 질환과 관련하여 "치료" 및 "치료하는"이라는 용어는 대상체를 감염시키는 병원성 유기체의 수를 감소시키고, 및/또는 감염의 임의의 증상들 및/또는 감염으로 인한 질병 또는 질환의 증상을 감소시키는 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
인용된 수치를 참조하여 본 명세서에서 용어 "약"을 사용하는 것은 열거된 수치 및 인용된 값의 ±10% 이내의 수치를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
수치 값들의 범위를 언급할 때 본 명세서에서 "내지"라는 용어의 사용은 수치범위가 범위의 각 종점에서의 수치를 포함한다는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 10 잔기 내지 20 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드는 10 잔기 길이의 폴리펩티드 및 20 잔기 길이의 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서의 선행 문헌 또는 본 문헌에서 파생된 진술 또는 본 문헌을 토대로 한 진술은 상기 문헌 또는 파생된 진술이 관련 기술의 통상적인 일반 지식의 일부임을 인정하지 않는다.
설명을 위해, 본원에 언급된 모든 문헌은 달리 언급되지 않는 한, 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

이하의 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 본 발명의 예시적인 예시 구현예를 전달한다. 기술된 다양한 구현예의 특징 또는 제한은 본 발명의 다른 구현예 또는 본 발명 전체를 반드시 제한하지 않는다. 따라서, 이하의 상세한 설명은 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 특허청구범위에 의해서만 정의된다.

연쇄상구균 감염에 대해 현재 사용되는 백신은 일반적으로 다중 혈청형(가장 최근에 23가지 혈청형의 다당류를 함유하는 PCV23 백신) 정제된 피막 다당류를 함유하는 다당류 백신, 또는 디프테리아 톡소이드 또는 비-연쇄상구균 기원의 다른 단백질 항원에 접합된 피막 다당류를 함유하는 접합 백신이다. 혈청형 대체는 다당류 백신과 관련된 중요한 문제이며, 접합 백신은 다당류 백신에 의해 커버되는 혈청형의 부분 집합에 대해서만 면역력을 유도한다. 예를 들어, 90개 이상의 폐렴구균의 인지된 혈청형이 있으며, 대부분이 질병을 일으키는 것으로 나타났다. 따라서 현재 이용가능한 연쇄상구균 백신에 의해 유도된 면역력은 특정 병원성 종 내의 연쇄상구균 종 및/또는 혈청형의 대부분에 대해 광범위한 면역력을 확립하기에 부적합하다. 바이러스와 달리 안전한 생-약독화된 박테리아 백신의 생성은 어렵다. 비교적, 박테리아는 훨씬 더 많은 유전자를 가지고 있으므로, 백신 수용체에게 투여한 후 돌연변이체/약독화된 박테리아가 다시 병원성 형태로 복귀되는 것을 방지하기가 더 어렵다. 살아있는 박테리아 백신은 악성 종양, HIV 환자 및 젊은 또는 노인 대상체를 대상으로 화학 요법을 받는 사람들과 같은 면역저하 개체에게 투여하기에도 부적합하다. 이 대상체들은 다양한 형태의 연쇄상구균 감염에 더 민감함에도 불구하고 임의의 형태의 살아있는 약독화된 연쇄상구균 백신을 효과적으로 방지한다.

본 발명은 상이한 연쇄상구균 종 및/또는 상이한 연쇄상구균 혈청형(본원에서 "본 발명의 백신들" 또는 "본 발명의 백신"이라고도 함)에 대한 이종 면역을 유도할 수 있는 백신을 제공한다. 백신에는 사멸된 연쇄상구균 박테리아가 함유되어 있으므로 약독화 생백신으로 인한 잠재적 문제를 경감시킨다. 백신은 또한 광범위한 연쇄상구균 종 및/또는 혈청형에 대한 면역력을 유도할 수 있으므로 혈청형 대체의 잠재적 영향을 감소시킨다.

또한, 본 발명의 백신의 제조 방법, 및 상기 백신을 포함하는 약제 및 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명은 또한 대상체내 연쇄상구균 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 백신은 예방 또는 치료 목적으로 투여될 수 있다. 상기 방법은 다수의 상이한 연쇄상구균 종 및/또는 아형에 대한 대상체내 이종 면역력을 유도할 수 있다.

요구되는 제한은 아니지만, 본 발명의 백신은 바람직하게는 점막 표면에 대해 제제화되고, 점막 표면을 통해 투여된다. 예를 들어, 백신은 비강내 투여되어, 특정 구현예에서 특정 표적 질병 또는 질환에 따라 보다 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있다.

연쇄상구균 백신 제조

- 연쇄상구균 균주

본 발명의 백신은 감마선-조사에 노출됨으로써 약독화 또는 사멸된 연쇄상구균 박테리아 및, 약독화 또는 전체 사멸된 그의 유도체에 기초한다. 연쇄상구균 박테리아는 숙주 생물에서 해로운 감염을 일으킬 수 있는 병원성 박테리아일 수 있다. 본 발명의 백신은 예를 들어 상이한 연쇄상구균 종의 조합 및/또는 동일한 연쇄상구균 종 내의 상이한 연쇄상구균 혈청형의 조합을 포함하는, 광자-방사선(예를 들어 감마-선 및/또는 X-선)에의 노출에 의해 약독화되거나 사멸된 상이한 연쇄상구균 박테리아의 조합을 포함할 수 있다.

연쇄상구균 박테리아는 감마-용혈성 연쇄상구균 박테리아의 경우 잘 특징지어진 용혈성 특성 또는 그의 부족에 따라 분류되는 바와 같이, 예를 들어 알파-, 베타- 또는 감마-용혈성 연쇄상구균일 수 있다.

적합한 알파-용혈성 연쇄상구균 박테리아의 비-제한적인 예는 페렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 및 비리단스(viridans) 연쇄상구균(예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 스트렙토코커스 산구이니스(S. sanguinis), 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis), 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus), 스트렙토코커스 밀러리(S. milleri))을 포함한다. 또한 이들 연쇄상구균 종의 각 혈청형들도 본 발명의 범위 내에 있다.

적합한 베타-용혈성 연쇄상구균 박테리아의 비-제한적인 예는 세포벽 박테리아 항원(다당류)의 탄수화물 조성을 기초로 랜스필드(Lancefield) 그룹(그룹 A-H, L, N 및 R/S)으로 분류되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 베타-용혈성 박테리아는 스트렙토코커스 파이오게네스(S. pyogenes)(그룹 A), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)(그룹 B), 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(S. equisimilis)(그룹 C), 스트렙토코커스 에퀴(S. equi)(그룹 C), 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(S. zooepidemicus)(그룹 C), 스트렙토코커스 다이스갈락티애(S. dysgalactiae)(그룹 C), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)(그룹 D), 스트렙토코커스 보비스(S. bovis)(그룹 D), 스트렙토코커스 밀레리(S. milleri)(그룹 E), 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)(그룹 E), 스트렙토코커스 안지노수스(S. anginosus)(그룹 F), 스트렙토코커스 카니스(S. canis)(그룹 G), 스트렙토코커스 다이스갈락티애(S. dysgalactiae)(그룹 G), 스트렙토코커스 산구이스(S. sanguis)(그룹 H), 스트렙토코커스 다이스갈락티애(S. dysgalactiae)(그룹 L), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)(그룹 N) 및 스트렙토코커스 수이스(S. suis)(그룹 R/S) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한 상기 연쇄상구균 종의 각 혈청형도 본 발명의 범위 내에 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 백신은 폐렴연쇄상구균의 하나 이상의 혈청형을 포함한다. 따라서, 백신은 폐렴연쇄상구균 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7A, 7B, 7C, 7F, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F 및/또는 48 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 백신은 폐렴연쇄상구균 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F 중 임의의 하나 이상을 포함한다.

- 연쇄상구균 유도체

본 발명의 백신은 광자-조사된(예를 들어 감마선-조사된 및/또는 X선-조사된) 연쇄상구균 유도체를 포함할 수 있다. 연쇄상구균 유도체는 연쇄상구균 박테리아의 인공 유전자 조작으로부터 발생하는 연쇄상구균 박테리아의 재조합 형태 또는 자연발생 돌연변이 형태일 수 있다. 특별한 제한없이, 연쇄상구균 유도체는 병원성을 감소시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다.

비-제한적인 예로서, 연쇄상구균 유도체는 피막 궤적(cps)을 분열시키거나 제거하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 재조합 등에 의해) 피막 생산을 방지, 파괴 또는 변형시키기 위해 폐렴연쇄상구균 cpsA, cpsB, cpsC, cpsD 및/또는 cpsE 유전자 중 임의의 하나 이상 또는 다른 연쇄상구균 종의 상동성 유전자가 변형될 수 있다. 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 상기 유전자들 또는 다른 유전자에서 자발적 돌연변이를 가질 수 있어, 자연-발생 비-피막 연쇄상구균 박테리아가 된다. 연쇄상구균 유도체는 피막 궤적의 전부 또는 적어도 일부를 결여할 수 있다. 일부 구현예에서, 피막이 결여된 연쇄상구균 유도체는 폐렴연쇄상구균 균주 Rx1 또는 Rx1 유도체이다.

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 다른 표적 단백질의 생산 또는 활성을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 유전자 변형은 콜린-결합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자; 자가분해효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어 폐렴연쇄상구균 lytA, lytB, lytC 또는 다른 연쇄상구균 박테리아에서 상동성 유전자); 성장을 위한 영양/보조인(예를 들어, 금속 이온) 필요 조건을 부여하는 하나 이상의 유전자(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 psaA 또는 다른 연쇄상구균 박테리아의 상동성 유전자); 방어 항원을 코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 pspA 또는 다른 연쇄상구균 박테리아의 상동성 유전자); 및/또는 독성 결정인자 또는 조절인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자들(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 codY, comC, comD, cps2A, csp4A, glpO, mgrA, nanA, nanB, pavA, pcpA, phtA, phtB, phtD, phtE, piuA, piaA, ply, prtA, psaA, psrP, rrgA, rrgB, spxB 및 다른 연쇄상구균 박테리아내 상기 유전자의 동족체)에 존재할 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 유전자 변형을 포함하여, 생체내에서 감소된 병원성 및/또는 성장을 갖는 영양요구체를 생성할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 티미딜레이트 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 유전자 변형이 존재할 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는: 동일 종이지만 상이한 혈청형인 연쇄상구균 박테리아; 다른 종의 연쇄상구균 박테리아; 비-연쇄상구균 박테리아; 또는 인간 또는 비-인간 포유동물(예를 들어, 돼지, 고양이, 개, 소, 말 또는 양); 실험실 동물(예를 들어, 설치류 또는 토끼); 새; 및/또는 재조합 연쇄상구균 박테리아가 투여될 대상체로부터의 하나 이상의 (외부) 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 외부 유전자(들)은 하나 이상의 내인성 유전자(들)(예를 들어, 바로 위에 기재된 바와 같은 임의의 하나 이상의 유전자)를 분열시키거나 그렇지 않으면 불활성화시킨다. 다른 구현예에서, 외부 유전자(들)은 임의의 내인성 유전자를 파괴시키지 않거나 또는 불활성화시키지 않는다. 비-제한적인 예로서, 외부 유전자(들)은 연쇄상구균 유도체가 투여되는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 개선시키는 단백질을 코딩한다. 면역 반응은 선천적, 적응적 또는 둘 모두일 수 있다. 일부 구현예에서, 외부 유전자(들)은 면역 조절제(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 항체, 융합 단백질, 펩타이드, 단백질 및/또는 호르몬)를 코딩한다. 다른 구현예에서, 외부 유전자(들)은 다른 박테리아 계열의 항원(예를 들어, 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae) 항원, 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 항원, 클라미도필라 뉴모니애(Chlamydophila pneumoniae) 항원, 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 항원, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원), 바이러스 항원(예를 들어, 아데노바이러스 항원, 코로나바이러스 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, 파라인플루엔자 바이러스 항원, 메타뉴모바이러스 항원, 라이노바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, HIV 항원, 간염 바이러스 항원 또는 헤르페스 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 볼거리 바이러스 항원, 유두종바이러스 바이러스 항원, 풍진 바이러스 항원, 수두 대상포진 바이러스 항원), 진균/효모 항원, 기생 항원 및/또는 원충 항원을 포함할 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 박테리아가 하나 이상의 표적 유전자를 과발현하게 하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 "과발현"은 동일한 생물학적 조건 하에서 해당 연쇄상구균 박테리아에서 유전자 변형없이 동일한 유전자의 발현에 비해 증가된 발현 수준을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 주어진 표적 유전자의 과발현은 예를 들어, 투여된 연쇄상구균 유도체의 부모인 연쇄상구균 균주 및/또는 연쇄상구균 유도체 자체에 대한 대상체내 면역 반응을 유도하거나 개선시킬 수 있다. 비-제한적 예로서, 유전자 변형은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 연쇄상구균 유도체에서 하나 이상의 유전자의 생성을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 cbpA, pspA, ply 또는 다른 연쇄상구균 박테리아에서 이들 유전자의 동족체).

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 결함있는 DNA 복구능력을 야기하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. 광자-조사로 인한 DNA 병변을 치료하는 능력이 감소된 광자-조사된(예를 들어, 감마선-조사된 및/또는 X선-조사된) 연쇄상구균 유도체를 포함하는 백신을 사용하는 것은 약독화 또는 불활성화에 필요한 광자-선량이 감소될 수 있으면서, 백신 유효성과 안전성을 반대로 높일 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 연쇄상구균 유도체는 미스매치(mismatch) 복구 시스템(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 hex 유전자좌 또는 다른 연쇄상구균 박테리아내 이 유전자좌의 동족체)에서 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 혼란시키거나 불활성화시키는 유전자 변형을 포함한다. 다른 구현예에서, 연쇄상구균 유도체는 DNA 알킬화 복구 단백질(예를 들어, 폐렴연쇄상구균 DNA 폴리머라제 4, hexA, hexB, mutS, radC, recA, recF, recN, recO, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 또는 다른 연쇄상구균 박테리아내 이들 유전자의 동족체)을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 혼란시키거나 불활성화시키는 유전자 변형을 포함한다.

부가적으로 또는 대안으로, 연쇄상구균 유도체는 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 생성을 촉진하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. dsRNA는 mRNA 또는 tRNA일 수 있다. 제한없이, dsRNA의 길이는 10 초과, 15 초과, 20 초과, 25 초과, 30 초과, 35 초과, 40 초과, 45 초과, 50 초과, 55 초과, 초과, 65 초과 또는 70 초과의 염기쌍 길이일 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, dsRNA의 길이는: 약 10 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 10 내지 약 50 염기쌍(bp); 약 10 내지 약 30 염기쌍(bp); 약 20 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 20 내지 약 60 염기쌍(bp); 약 20 내지 약 50 염기쌍(bp); 약 20 내지 약 40 염기쌍(bp); 약 20 내지 약 30 염기쌍(bp); 약 30 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 40 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 50 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 60 내지 약 70 염기쌍(bp); 약 30 내지 약 60 염기쌍(bp); 약 30 내지 약 50 염기쌍(bp); 또는 약 30 내지 약 40 염기쌍(bp); 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNA는 그렇지 않으면 단일 가닥인 더 큰 RNA 분자의 성분이다. 더 큰 RNA 분자는 다수의 dsRNA 성분을 포함할 수 있다. dsRNA는 더 큰 RNA 분자의 내부 구성요소 또는 최종 구성요소일 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNA는 종결 스템-루프(stem-loop) 서열을 포함할 수 있다. dsRNA는 더 큰 RNA 분자 내에서 자가-상보성의 영역으로부터 발생할 수 있다. 연쇄상구균 유도체의 주어진 유전자 내의 코딩 영역(들)/엑손(exon)(들)은 자가-상보성의 하나 이상의 영역(들)을 포함하도록 조작되어, 전사될 때 dsRNA 부분을 생성할 수 있다.

dsRNA는 연쇄상구균 유도체가 투여되는 대상체에서 세포에 의해 발현된 Toll-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 단백질에 의해 인식될 수 있다. TLR 단백질은 세포의 소포체 및/또는 엔도솜 구획에 위치할 수 있다. TLR 단백질은 Toll-유사 수용체 3(TLR3) 단백질일 수 있다. 제한없이, 세포는 B 림프구, T 림프구, 자연 사멸 세포 및/또는 수지상 세포 중 임의의 하나 이상일 수 있다. TLR3 단백질에 의한 dsRNA의 인식은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 반응은 선천적인 면역 반응일 수 있다. 면역 반응은 인터페론 타입-1 반응일 수 있고, 및/또는 염증성 사이토카인의 방출을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 백신에 사용되는 연쇄상구균 유도체는 이들이 유래하는 모 균주와 상당한 정도의 유전적 유사성을 가질 것이다. 비-제한적인 예로서, 본원에서 언급된 "연쇄상구균 유도체"는 그것이 유래된 모 연쇄상구균 균주에 대하여 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 92% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과의 서열 상동성을 가질 수 있다. 추가의 비-제한적인 예로서, 본원에서 언급된 "연쇄상구균 유도체"는 그의 모 균주에 대응하여 비교될 때, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 5개 초과의 유전자 또는 이들 유전자의 발현에 필요한 조절 서열의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 유전자 변형은 해당 유전자(들)의 발현을 증가, 감소 또는 예방할 수 있다.

비-제한적인 일 구현예에서, 연쇄상구균 박테리아 유도체는 Rx1 균주일 수 있다. 자가분해효소 유전자(lytA) 유전자는 Rx1 유도체 균주에서 결실되거나 비기능적으로 될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 폐렴구균용혈소 유전자(ply)는 Rx1 유도체 균주에서 결실되거나 비기능적으로 될 수 있다. 예를 들어, ply 유전자는 ply의 톡소이드 버전과 같은 또 다른 유전자로 대체될 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 폐렴구균 표면 항원 A 유전자(psaA) 유전자는 결실되거나 그렇지 않으면 비기능적으로 될 수 있다. 폐렴연쇄상구균의 psaA 유전자는 Mn²⁺ 수송과 산화적 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 폐렴구균 표면 항원 A(PsaA)를 코딩한다. 본원에 기술된 바와 같은 psaA-결실 돌연변이는 낮은 Mn²⁺ 환경에서의 성장이 불량하고 및/또는 폐렴구균 능력이 결핍될 수 있다. 비-제한적인 구현예에서, Rx1(ΔLytA, PdT)의 psaA-결실 돌연변이체는 낮은 Mn²⁺ 환경에서 낮은 병독성, 감소된 역량 및/또는 감소된 성장을 갖는 백신 후보 균주 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)을 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 특징은 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)에 추가적인 생물보안 및 생물안전성을 부여하여 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 백신을 제조하기에 적합한 백신 후보 물질이 될 수 있다. 또한, 낮은 Mn²⁺ 스트레스 조건하에서 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 발효기 성장은 방어 항원의 생산 수준을 증가시키는 유전자 발현의 변화를 유도할 수 있다. 따라서, 방어 항원의 발현 수준이 높은 백신 제품을 사용함으로써 개선된 방어 수준을 얻을 수 있다.

박테리아의 유전자 조작 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Vennison "Laboratory Manual for Genetic Engineering", PHI Learning Pvt. Ltd., 2010; Zyskind and Bernstein, "Recombinant DNA Laboratory Manual", Elsevier, 2014; Bose, "Genetic Manipulation of Staphylococci" in "Methods in Molecular Biology", Springer Protocols, volume 1106, pages 101-111, 2014; Hakenbeck and Chhatwal, "Molecular Biology of Streptococci", Horizon Scientific Press, 2007; Morona 등, "The effect that mutations in the conserved capsular polysaccharide biosynthesis genes cpsA, cpsB and cpsD have on virulence of Streptococcus pneumoniae", J. Infect. Dis. 189: 1905-1913, 2004; Morona 등, "Mutational analysis of the carboxy-terminal [YGX] ₄ repeat domain of CpsD, an autophosphorylating tyrosine kinase required for capsule biosynthesis in Streptococcus pneumonia", J. Bacteriol. 185: 3009-3019, 2003; McAllister 등, "Molecular analysis of the psa permease complex of Streptococcus pneumoniae", Mol. Microbiol. 53:889-901, 2004; Mahdi 등, "Identification of a novel pneumococcal vaccine antigen preferentially expressed during meningitis in mice", J. Clin. Invest. 122:2208-2220, 2012. 참조).

광자-조사

본 발명의 백신에서 연쇄상구균 박테리아 및 이의 유도체는 광자-방사선에 노출될 수 있다. 상술한 바와 같이, "광자-방사선"이라는 용어는 감마방사선(즉, 감마-선)과 X-방사선(즉, X-선)을 모두 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "광자-조사된" 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체는 감마-방사선(즉, 감마-선)에 노출됨으로써 "감마선-조사되고", X-방사선(즉, X-선)에 노출됨으로써 "X선-조사"될 수 있거나, 둘다 될 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, X-선은 방사성 붕괴시 핵 자체보다는 핵의 전기장을 통해 전자가 통과함으로써 방출되는 것을 제외하고는 감마-선과 동일하다. 비-제한적인 예로서, 광자-조사되기 위해, 재료는 0.01MeV 이상, 0.1MeV 이상, 0.5MeV 이상, 0.01MeV 내지 0.5MeV, 0.01MeV 내지 1MeV, 0.01MeV 내지 10MeV, 0.5MeV 내지 20MeV, 0.5MeV 내지 15MeV, 0.5MeV 내지 10MeV, 0.5MeV 내지 5MeV, 0.5MeV 내지 2MeV, 또는 1MeV 내지 2MeV(예를 들어, 1.25MeV)의 에너지로 광자-방사선에 노출될 수 있다.

본 발명의 백신에서 연쇄상구균 박테리아 및 이의 유도체는 감마선-조사될 수 있다. 임의의 적절한 감마-방사선원이 사용될 수 있다. 적합한 감마 방출제는 Ba¹³⁷, Co⁶⁰, Cs¹³⁷, Ir¹⁹², U²³⁵, Se⁷⁵ 및 Yb¹⁶⁹를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체의 감마선-조사는 상업적으로 입수 가능한 장치, 예를 들어, 캐나다의 Atomic Energy of Canada Ltd.에 의해 제조된 Gammacell 조사기(예를 들어, Gammacell 40 조사기, Gammacell 220 조사기, Gammacell 1000 조사기, Gammacell 3000 조사기), J.L. Shepherd and Associates(San Fernando, California, USA)에 의해 제조된 감마선-조사기 또는 Nordion Inc.(Kanata, Ontario, Canada)에 의해 제조된 Nordion Gamma Cell-1000 조사기를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 적합한 장치는 예를 들어 미국 특허 제3,557,370호 및 미국 특허 제3,567,938호에 기술되어 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 본 발명의 백신에서 연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체는 X선-조사될 수 있다. 임의의 적합한 X-선원이 사용될 수 있다. 적합한 X-선원은 IBA Industrial(Louvain-la-Neuve, Belgium)에서 제조한 eXelis® 멸균 X-선 기계를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 다른 적합한 장치는 예를 들어, Rad Source Technologies Inc.(Suwanee, Georgia, USA)에 의해 제조된 RS2400® 및 RS3400®을 포함한다.

일반적으로, 연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체는 박테리아/유도체를 약독화 또는 불활성화시키기에 충분한 광자-방사선(예를 들어 감마-방사선 및/또는 X-선)에 노출된다. 바람직하게는, 광자-방사선량은 항원(예를 들어, 표면 항원)의 구조를 실질적으로 파괴시키지 않으면서 박테리아 및 그의 유도체를 약독화하거나 불활성화시키기에 충분하다. 그러므로 항원 결정기의 면역원성은 광자-조사된 박테리아 및 그의 유도체에 의해 유지될 수 있다. 바람직하게는, 광자-방사선량은 항원 결정기의 구조적 완전성에 악영향을 미치지 않으면서 처리중인 모든 박테리아/유도체가 노출되도록 하기에 충분한 기간에 걸쳐 및 충분한 수준으로 박테리아 또는 그의 유도체에 투여된다.

당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 방사선의 흡수 선량에 대한 척도는 그레이(Gy)이며, 이는 1 킬로그램의 질량으로 퇴적된 1 Joule의 에너지로 정의된다. 이것에 대한 이전 측정 단위는 "방사선 흡수 선량"을 나타내는 rad인데, 여기서 1 Gy = 100 rad이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 연쇄상구균 박테리아 및 이의 유도체는 약 1×10³ rad 내지 약 2×10⁹ rad(또는 약 10 Gy 내지 약 2×10⁴ kGy)의 범위의 광자-방사선(예를 들어, 감마-선 및/또는 X-선)의 총 선량에 노출될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 연쇄상구균 박테리아 또는 유도체는 약 1×10³ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁹ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁸ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁷ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁶ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁵ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 1×10⁴ rad, 약 1×10³ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10⁴ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10⁵ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10⁶ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10⁷ rad 내지 약 2×10⁹ rad, 약 1×10⁸ rad 내지 약 2×10⁹ rad 또는 약 1×10⁹ rad 내지 약 2×10⁹ rad의 X-선 및/또는 감마-선의 총 선량에 노출된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 연쇄상구균 박테리아 또는 유도체는 약 6.5×10⁴ rad 내지 약 2×10⁷ rad(약 0.65KGy 내지 약 200kGy)의 광자-방사선(예를 들어, X-선 및/또는 감마-선)의 총선량에 노출된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체는 약 10kGy 내지 약 12kGy, 약 12kGy 내지 약 14kGy, 약 14kGy 내지 약 16kGy, 약 10kGy 내지 약 20kGy, 약 14kGy 내지 약 20kGy, 10 초과, 약 12kGy 내지 약 14kGy, 1 2kGy 초과, 14kGy 초과, 16kGy 초과, 18kGy 초과, 20kGy 초과, 1.26×10⁶ rad(12.6kGy)의 총 광자 선량, 약 1×10⁶ rad(약 10 kGy)의 광자-선의 총 광자-방사선량 또는 약 1×10⁵ rad(1KGy)의 총 광자-방사선량에 노출된다.

광자-방사선(예를 들어, 감마-선 및/또는 X-선)의 최적 용량은 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체가 존재하는 배지, 처리될 박테리아/유도체의 양 및/또는 치료중인 아형이나 균주와 같은 요소들에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 노출 기간 동안 인가된 광자-방사선의 총 선량, 노출 시간 및/또는 광자-방사선의 수준은 처리의 유효성을 개선시키도록 최적화될 수 있다.

광자-방사선(예를 들어, X-선 및/또는 감마-선)의 총 선량은 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체에 일정 기간에 걸쳐 누적되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 광자-방사선은 필요한 총 광자-방사선량을 달성하기에 충분한 기간에 걸쳐 총 선량보다 낮은 수준으로 박테리아/유도체에 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체의 제제는 광자-방사선(예를 들어 감마-선 및/또는 X-선)에 노출되는 동안 동결 및/또는 동결 건조된 상태로 유지된다. 이는 생물학적 무결성의 보존을 용이하게하고, 항원의 불필요한 손상을 피함으로써 광자-조사된 박테리아 제제의 면역원성을 개선시키고, 특히 예를 들어, 이종 아형(subtypes)에 대한 교차-반응/교차-방어 면역을 유도하는 능력을 개선시킬 수 있다. 일반적으로 냉동 및/또는 동결건조된 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체의 제제를 처리하기 위해 10-20kGy(예를 들어, 10 초과, 12 초과, 14 초과, 16 초과 또는 18kGy 초과)의 광자-방사선량이 효과적일 수 있다.

상기한 바와 같이, 광자-방사선으로 처리하는 것이 박테리아 항원의 구조를 실질적으로 파괴하지 않으면서 박테리아/유도체를 불활성화시키는데 충분하므로 바람직하다. 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체의 약독화 및/또는 불활성화는 당 업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

예를 들어, 박테리아 약독화 및/또는 불활성화는 광자-방사선(예를 들어, 감마-선 및/또는 X-선)으로 처리한 후 한천 배지에 콜로니(즉, 콜로니 형성 단위)를 형성하는 생 박테리아의 수를 측정하여 평가할 수 있다.

항원 결정기의 무결성은 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, FACs 분석 또는 표면 성분의 효소적 분석을 사용하여, 정제된 천연 항원 성분에 대해 생성된 단일특이적 항혈청의 패널과의 반응성에 의해 평가될 수 있다.

예방적 및 치료적 방법

본 발명은 대상체에서 연쇄상구균 감염을 예방하기 위한 예방 방법을 제공한다. 또한 대상체에서 연쇄상구균 감염을 치료하기 위한 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 광자-조사된 유도체를 대상체에게, 예를 들어 본 발명의 백신의 형태로 투여하는 단계를 포함한다. 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 유도체는 감마선-조사되거나, X선-조사되거나, 또는 둘 다일 수 있다.

상기 방법은 대상체의 연쇄상구균 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하거나 개선시킨다. 면역 반응은 연쇄상구균 박테리아의 여러 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하거나 개선시킬 수 있는 한 교차-방어적/이형적일 수 있다. 상기 방법은 또한 다수의 상이한 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사, X선-조사, 또는 둘 모두)된 연쇄상구균 종 또는 이의 유도체를 투여하여, 여러 종류의 연쇄상구균 박테리아 및 이의 다양한 혈청형에 대한 면역력을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 하기 연쇄상구균 박테리아 종: 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 카니스(Streptococcus canis), 스트렙토코커스 다이스갈락티애(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 에퀴누스(Streptococcus equinus), 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 밀레리(Streptococcus milleri), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 및 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis) 중 임의의 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도 또는 개선할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 동일한 연쇄상구균 종의 광자-조사(예를 들어 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 제제를 대상체에 투여함으로써 주어진 연쇄상구균 종에 의해 유발된 연쇄상구균 감염을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 감염의 원인인 연쇄상구균 종 혈청형은 투여된, 광자-조사된 연쇄상구균 종 혈청형과 다를 수 있다.

비-제한적인 예로서, 상기 방법은 하기를 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다:

(i) 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 아갈락티애의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 아갈락티애 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(ii) 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 보비스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 보비스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(iii) 스트렙토코커스 카니스(Streptococcus canis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 카니스의 하나 이상의 혈청형에 의해 야기된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 카니스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(iv) 스트렙토코커스 다이스갈락티애(Streptococcus dysgalactiae)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 다이스갈락티애의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 다이스갈락티애 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(v) 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 에퀴의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 에퀴 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(vi) 스트렙토코커스 에퀴누스(Streptococcus equinus)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 에퀴누스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 에퀴누스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(vii) 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 아갈락티애의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 아갈락티애 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(viii) 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 에퀴시밀리스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 에퀴시밀리스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(ix) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 엔테로코커스 패칼리스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 엔테로코커스 패칼리스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(x) 엔테로코커스 파에슘(Enterococcus faecium)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 엔테로코커스 파에슘의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 엔테로코커스 파에슘 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xi) 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 이니애의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 이니애 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xii) 스트렙토코커스 밀레리(Streptococcus milleri)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 밀레리의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 밀레리 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xiii) 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 뮤탄스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xiv) 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 뉴모니애의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xv) 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 파이오게네스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 파이오게네스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xvi) 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 살리바리우스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 살리바리우스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xvii) 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 산구이니스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 산구이니스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

(xviii) 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 수이스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 수이스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다. 및/또는

(xix) 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)의 하나 이상의 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형(들)을 투여함으로써 스트렙토코커스 우베리스의 임의의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환. 투여된 광자-조사된 스트렙토코커스 우베리스 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 상기 방법은 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 폐렴연쇄상구균의 하나 이상의 혈청형을 대상체에게 투여함으로써 복수의 상이한 폐렴연쇄상구균 혈청형에 대한 대상체내 면역 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균의 단일 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 혈청형을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균의 하나 이상의 혈청형에 의해 유발된 감염, 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 폐렴연쇄상구균의 적어도 하나의 혈청형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 폐렴연쇄상구균 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7A, 7B, 7C, 7F, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F, 및/또는 48 중 임의의 하나 이상에 대해 상기 대상체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 중 임의의 하나 이상에 대해 상기 대상체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 투여된 광자-조사된 폐렴연쇄상구균 혈청형(들)은 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 혈청형(들)과 다를 수 있다.

질병 또는 질환은 연쇄상구균 박테리아의 특정 종 또는 혈청형의 감염에 의해 유발되는 임의의 질병 또는 질환일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 질병 또는 질환은 폐렴, 귀 감염, 귀병, 중이염, 분비성중이염, 부비동염, 수막염, 결막염, 균혈증, 패혈증, 관절 감염, 뼈 감염, 화농성 관절염, 골수염, 연조직 감염, 봉와직염, 근염, 안와 주위염, 농양, 복막염, 심장 감염, 심내막염 및 심낭염 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

대상체는 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하여 경제적, 사회적 또는 연구적으로 중요한 임의의 동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 예를 들어 인간 또는 비인간 포유류(예를 들어, 돼지, 고양이, 개, 소, 말 또는 양)와 같은 포유동물일 수 있다. 대상체는 실험용 동물(예를 들어, 마우스, 래트 또는 기니아 피그와 같은 설치류, 토끼 등), 조류(예를 들어, 가금류), 어류 또는 갑각류일 수 있다.

광자-조사(예를 들어, 감마선-조사 및/또는 X선-조사)된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 광자-조사된 유도체는 예를 들어, 비경구(예를 들어, 피내, 정맥내, 척수내, 복강내, 피하 또는 근육내), 경구, 국소 또는 점막 경로(예를 들어, 비강)를 포함하는 임의의 적당한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 점막 경로에 의한다. 예를 들어, 투여는 비강내로 될 수 있다.

특정 작용 기전(들)에 제한되지 않으면서, 상기 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하는 대상체내 면역 반응을 유도할 수 있다:

(i) 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 연쇄상구균 박테리아의 항원(들)에 특이적으로 결합하는 항체 생산;

(ii) 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 연쇄상구균 박테리아의 항원(들)에 특이적인 CD4⁺ T 림프구 반응;

(iii) 감염, 질병 또는 질환의 원인이 되는 연쇄상구균 박테리아의 항원(들)에 특이적인 CD8⁺ T 림프구 반응.

일부 구현예에서, 상기 방법은 인터루킨-17A(IL-17A) 의존성, IL-17A 비의존성이고, 및/또는 사이토카인(예를 들어, IFN-γ) 생성 및/또는 Toll-유사 수용체(예를 들어, TLR-3)의 활성화를 포함하는 선천성 면역계의 활성화를 포함하는 대상체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 이것은 B 세포의 활성화 임계치를 감소시키고 및/또는 관심 항원에 대한 항체 반응의 질 또는 양을 개선시키는데 도움을 줄 수 있다.

비-제한적인 예로서, 본 방법에 의해 대상체에서 유도되거나 개선된 면역 반응은 적당한 대조군과 비교했을때 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상, 약 90% 이상, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상 또는 약 100배 이상 증가될 수 있다. 적합한 대조군은 예를 들어, 다른 유사한, 실질적으로 동일하거나 동일한 조건 하에서 방법을 수행하기 전에 동일한 면역 반응의 측정일 수 있다.

면역 반응을 검출하고 정량화하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 고체상 이종 분석(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석), 용액상 분석(예를 들어, 전기화학발광 분석), 증폭된 발광 근접 균질 분석, 유동 세포 계측법, 세포내 사이토카인 염색법, 기능성 T-세포 분석법, 기능성 B-세포 분석법, 기능성 단핵구 대식세포 분석법, 수상돌기 및 망막 내피 세포 분석법, NK 세포반응 측정법, 산화성 버스트 분석법, 세포독성 특이적 세포 용해 분석법, 오량체 결합 분석 및 식균작용 및 세포 자멸사 평가를 포함한다.

백신 제형

본원에 기술된 연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체는 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 상기 조성물은 질병 또는 질환에서 최고점에 도달할 수 있는 숙주에서 감염을 일으킬 수 있는 병원성 유기체에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 조성물은 예방 백신(즉, 감염 및/또는 질병/질환을 예방하기 위한 목적으로 투여된 백신) 및 치료 백신(즉, 감염 및/또는 질병/질환을 치료하기 위한 목적으로 투여된 백신)을 포함하는 백신일 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 예방, 개선, 완화 또는 치료 목적으로 수혜자에게 투여될 수 있다. 상기 모든 백신은 본원에서 "본 발명의 백신들" 또는 "본 발명의 백신"으로 총괄하여 포함되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 백신으로의 혼입에 적합한 적합한 연쇄상구균 박테리아 및 이들의 유도체의 비-제한적인 예는 "연쇄상구균 균주" 및 "연쇄상구균 유도체"라는 제목의 서브섹션에 기술되어 있다. 백신의 연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체는 광자-방사선(예를 들어, 감마-선 및/또는 X-선)에 의해 약독화되거나 불활성화된다. 광자-방사선은 다른 시약(들)과 결합하기 전, 도중 또는 후에 박테리아/유도체에 적용되어, 백신 제형을 제공할 수 있다.

- 제형

본 발명의 백신은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 방법의 비-제한적인 예는 Gennaro 등 (Eds), (1990), "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA에 기술되어 있으며, 백신 제조 방법은 일반적으로 Voller 등, (1978), "New Trends and Developments in Vaccines", University Park Press, Baltimore, Maryland, USA에 기술되어 있다.

백신은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 "약학적으로 허용가능한" 담체, 부형제, 희석제 및/또는 보조제는 인간 또는 비인간 동물과 같은 특정 수용체에게 투여될 때 부작용(들)을 일으키지 않는 물질이다. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 및 보조제는 일반적으로 백신의 다른 성분과도 양립 가능하다. 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 비-제한적인 예는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients" 제4판, (2003) Rowe 등 (Eds), The Pharmaceutical Press, London, American Pharmaceutical Association, Washington에서 찾아볼 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 비-제한적인 예는 탈염수 또는 증류수; 생리 식염수; 피넛 오일, 홍화 오일, 올리브 오일, 면실유, 옥수수 오일, 참기름, 낙화생유 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일; 폴리실록산, 예를 들어 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알렌과 같은 미네랄 오일; 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체; 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올 또는 이소프로판올; 저급 아랄칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예컨대 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레이트; 폴리비닐피리돈; 한천; 카라기난; 트라가칸트 고무 또는 아라비아 고무, 및 바셀린(petroleum jelly)을 포함한다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10 중량% 내지 99.9 중량%를 형성할 것이다.

본 발명의 백신은 주사에 의한 투여에 적합한 형태, 경구 섭취에 적합한 제형의 형태(예를 들어, 캡슐, 정제, 당의정, 엘릭서 등), 국소 투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션의 형태, 점안액으로 전달하기에 적합한 형태, 흡입, 예컨대 비강내 흡입 또는 경구 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태, 또는 비경구 투여, 즉 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 형태로 될 수 있다.

경구 투여용 백신의 고체 형태는 인간 및 동물 제약실무에서 허용가능한 결합제, 감미제, 붕해제, 희석제, 풍미제, 코팅제, 방부제, 윤활제 및/또는 시간지연제를 함유할 수 있다. 적합한 결합제는 아카시아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트 고무, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 감미제는 수크로스, 락토스, 글루코스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제로는 옥수수 전분, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 크산탄 검, 벤토나이트, 알긴산 또는 한천이 있다. 적합한 희석제는 락토스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로즈, 탄산칼슘, 규산칼슘 또는 인산2칼슘을 포함한다. 적합한 풍미제는 페퍼민트 오일, 윈터그린유, 체리, 오렌지 또는 라즈베리 풍미제를 포함한다. 적합한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산의 중합체 또는 공중합체 및/또는 이들의 에스테르, 왁스, 지방 알콜, 제인, 쉘락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 방부제는 벤조산나트륨, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 소듐 비설파이트를 포함한다. 적합한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 소듐 올레이트, 염화나트륨 또는 탈크를 포함한다. 적합한 시간지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.

경구 투여용 백신의 액체 형태는 상기 제제 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 적합한 액체 담체는 물, 올리브 오일, 피넛 오일, 참기름, 해바라기 오일, 홍화유, 낙화생유, 코코넛 오일, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알콜, 트리글리세라이드 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

경구 투여용 백신을 포함하는 현탁액은 분산제 및/또는 현탁제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 현탁제는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 폴리-비닐-피롤리돈, 알긴산 나트륨 또는 아세틸 알콜을 포함한다. 적합한 분산제는 레시틴, 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예컨대 스테아린산, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 등을 포함한다.

주사액 또는 현탁액으로서 백신을 제조하기 위해, 링거액, 등장성 식염수, 인산 완충 식염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜과 같은 비-독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 담체가 사용될 수 있다.

경구 투여용 백신 에멀젼은 하나 이상의 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유화제는 상기 예시된 바와 같은 분산제 또는 천연 고무, 예컨대 구아 검, 아라비아 고무 또는 트라가칸트 고무를 포함한다.

백신의 국소 제형은 하나 이상의 허용가능한 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 유효 성분들(예를 들어, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 유도체)을 포함한다. 국소 투여에 적합한 제형은 치료가 요구되는 부위로의 피부를 통한 침투에 적합한 액체 또는 반-액체 제제, 예컨대 도포제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다.

점적제로서 제형화될 때, 백신은 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이들은 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 다른 적절한 방부제의 수용액에 유효 성분을 용해시키고, 임의로 표면 활성제를 함유시킴으로써 제조될 수 있다. 그후, 생성된 용액을 여과에 의해 정화하고, 적합한 용기로 옮기고, 멸균시킬 수 있다. 예를 들어, 멸균은 여과에 이어, 무균 기술에 의해 용기로 옮겨 이루어질 수 있다. 점적제에 포함시키기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예로는 페닐질산수은 또는 아세트산페닐수은(0.002%), 염화 벤잘코늄(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)가 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알콜 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

로션으로 제형화될 때, 백신은 피부 또는 눈에 도포하기에 적합한 것을 포함한다. 점안액은 임의로 살균제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조와 관련하여 상기 기술된 것과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 피부에 도포하기 위한 로션 또는 도포제는 또한 건조를 촉진시키고 피부를 차갑게 하는 제제, 예컨대 알콜 또는 아세톤, 및/또는 모이스처라이저, 예컨대 글리세롤, 또는 오일, 예컨대 피마자유 또는 땅콩 오일을 포함할 수 있다.

크림, 연고 또는 페이스트로 제형화될 때, 백신은 외부 적용을 위한 유효 성분의 반-고형 배합물일 수 있다. 이들은 유효 성분을 미분 또는 분말 형태로, 단독으로 또는 수성 또는 비-수성 유체 중 용액 또는 현탁액 중에, 미끈거리거나 기름기없는 주성분과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 주성분은 탄화수소, 예컨대 경질, 연질 또는 유동 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누; 점액; 아몬드, 옥수수, 땅콩, 피마자 또는 올리브 오일과 같은 천연 기원의 오일; 양모 지방 또는 그의 유도체, 또는, 프로필렌 글리콜 또는 매크로골과 같은 알콜과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 함유할 수 있다.

백신은 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제와 같은 임의의 적합한 계면활성제, 예컨대 그의 소르비탄 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 유도체를 포함할 수 있다. 현탁제, 예컨대 천연 검, 셀룰로스 유도체 또는 무기 재료, 예컨대 규질 실리카, 및 다른 성분들, 예컨대 라놀린도 또한 포함될 수 있다.

백신은 리포솜 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유도되며, 수성 매질에 분산된 단일층 또는 다중층 수화 액정에 의해 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 임의의 비-독성, 생리적으로 허용가능한 및 대사가능한 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 형태의 백신은 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이며, 둘다 천연 및 합성이다. 리포솜을 형성하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이와 관련하여, 특히 Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq를 참조한다.

- 보조제

본원에서 제공된 실험 데이터는 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및 그의 유도체가 보조제 없이도 면역을 유도할 수 있음을 입증하지만 보조제(들)이 본 발명의 백신에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 보조제를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다.

일반적으로, 백신 조성물의 문맥에서 보조제 활성은 백신내 면역원성 성분(예를 들면, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 유도체)에 의해 유도되는 면역 반응을 (양적 또는 질적으로) 개선시킬 수 있는 능력을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이는 면역 반응을 일으키는데 필요한 면역원성 성분의 투여량 또는 수준을 감소시키고, 및/또는 원하는 면역 반응을 일으키는데 필요한 면역화 횟수 또는 빈도를 감소시킬 수 있다.

바람직하게는, 보조제는 백신의 성분(들)에 의해 유도 및/또는 개선된 면역 반응을 증진시켜서 방어 효능을 개선시킬 것이다. 바람직하게는, 보조제는 다른 유효 성분(들)(예를 들어, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 유도체)의 저용량을 이용하여 방어 면역의 유도를 가능하게 할 것이다.

본 발명의 백신에 포함시키기에 적합한 보조제 및 이의 제조 방법의 비-제한적인 예는 "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine)", (2000), Ohagan (Ed), Humana Press Inc에 기술되어 있다. 임의의 적합한 보조제가 본 발명의 백신에 포함될 수 있다.

상기 보조제의 특정 예는 수산화 알루미늄; 인터페론, 인터루킨 및 다른 사이토카인을 포함하는 폴리펩티드 보조제; AMPHIGEN, 수중유형 및 유중수형 에멀젼; 및 QuilA와 같은 사포닌을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

예를 들어, 알루미늄계 보조제가 사용될 수 있다. 적합한 알루미늄계 보조제는 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 알루미늄계 보조제의 다른 구체적인 예는 유럽 특허 제1216053호 및 미국 특허 제6,372,223호에 기술되어있다.

수중유형 에멀젼은 본 발명의 백신에서 보조제로서 사용될 수 있다. 수중유형 에멀젼은 당 업계에 잘 알려져있다. 일반적으로, 수중유형 에멀젼은 대사 오일, 예를 들어, 어유, 식물성 오일 또는 합성 오일을 포함할 것이다. 적합한 수중유형 에멀젼의 예는 유럽 특허 제0399843호, 미국 특허 제7,029,678호 및 PCT 공개 WO 2007/006939에 기술된 것들을 포함한다. 수중유형 에멀젼은 다른 보조제 및/또는 면역자극제와 조합하여 사용될 수 있다.

다른 적당한 보조제의 비-제한적인 예는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 모노포스포릴 지질 A(MPL), 콜레라 독소(CT) 또는 그의 구성 소단위, 열 불안정한 장 독소(LT) 또는 그의 구성 소단위, Toll-유사 수용체 리간드 보조제, 예컨대 리포폴리사카라이드(LPS) 및 그의 유도체(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 및 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A), 무라밀 디펩티드(MDP), Toll-유사 수용체(TLR) 작용제(예를 들어, TLR-2, TLR-3 작용제) 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F 단백질을 포함한다.

본 발명의 백신내 보조제는 전형적으로 연화제, 유화제, 증점제, 방부제, 살균제 및 완충제를 포함할 수 있다. 또 다른 유형의 "자가 면역 보조제"는 수용성 리포펩타이드 Pam3Cys 또는 그의 디팔미토일 유도체 Pam2Cys와 같은 지질에 대한 면역원성 펩티드의 접합에 의해 제공된다. 상기 보조제는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포) 내로 면역원성 성분을 동반하여, 이에 따라 개선된 항원 제시 및 동시에 세포의 활성화를 생성하는 잇점을 가진다(예를 들어, Brown and Jackson, (2005), "Lipid based self adjuvanting vaccines", Current Drug Delivery, 23:83 참조).

적합한 보조제는 예를 들어, 프로인트의 불완전 보조제 및 완전한 보조제(Difco Laboratories, Detroit, Michigan); Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화 알루미늄 겔(명반) 또는 인산 알루미늄과 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온성 또는 음이온성 유도체화 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A이다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토킨도 또한 보조제로서 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 백신에 포함된 보조제는 주로 TH1 유형의 면역 반응을 유도할 수 있다. 우세한 TH1-타입 반응을 유도하는데 사용하기에 적합한 보조제는 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 알루미늄 염의 배합물을 포함한다. 예를 들어, 상기 조성물 또는 백신은 Thoelen 등 (2001), "A prophylactic hepatitis B vaccine with a novel adjuvant system", Vaccine, 19:2400-2403에 기술된 바와 같이 수산화 알루미늄(명반) 및 3-O-탈아실화 모노포스포릴화 지질 A(MPL)를 함유하는 보조제 AS04와 함께 제형화될 수 있다. TH1 유형 면역 반응을 우선적으로 유도하는 다른 공지된 보조제는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 CpG 디 뉴클레오티드가 메틸화되지 않은 것을 특징으로 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 1996/02555에 기술되어있다. 면역자극 DNA 서열은 또한 예를 들어, Sato 등, (1996), "Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization", Science, 273:352-354에 기술되어있다.

보조제의 또 다른 예는 사포닌, 바람직하게는 단독으로 또는 다른 보조제와 조합하여 사용될 수 있는 QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.)이다. 예를 들어, PCT 공개 공보 제 WO 1994/00153에 기술되어 있는 QS21 및 3D-MPL의 조합물과 같은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 또는 QS21은 PCT 공개 번호 WO 1996/33739에 기술된 바와 같이 콜레스테롤로 급냉된 덜 반응성(reactogenic) 조성물을 포함하는 개선된 보조제 시스템이 사용될 수 있다. 다른 대체 제형은 수중유형 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 수중유형 에멀젼 중의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 보조제는 PCT 공개 공보 제 WO 1995/17210에 기술되어있다. 본 발명의 조성물에 포함된 보조제는 PCT 공개 번호 WO 1995/17210에 기술된 바와 같은 수중유형 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 제형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 천연 대사가능한 오일을 주성분으로 하는 보조제인 몬타나이드(Montanide) ISA720(M-ISA-720, Seppic, Fairfield, NJ)을 포함한다.

바람직하게는, 보조제는 점막 경로를 통해 투여된 면역원성 성분에 대한 점막 면역 및/또는 전신 면역을 증진시키는데 효과적인 점막 보조제이다. 점막 보조제는 백신의 다른 면역원성 성분에 의해 유도된 방어 면역의 유도를 개선시키기 위해 백신 전달을 용이하게하는 것들(예를 들어, 리포솜, 코클리에이트(cochleate), 생-약독화된 벡터, 폴리 D,L-락티드-코-글리코시드 또는 PLGA, 키탄(chitan), DNA 백신, 점막부착제), 및 면역자극 역할을 하는 것들(예를 들어, 선천성 면역과 관련된 독소-기반, 사이토카인-기반 등)로 넓게 분류될 수 있다. 특정 메카니즘을 제한하지 않으면서, 점막 보조제의 유리한 효과는 점막 장벽을 가로 질러 백신내 면역원성 성분의 통과를 돕는 능력으로부터 부분적으로 유도된다고 가정된다. 점막 장벽을 가로지를때, 점막 보조제는 예를 들어, 보체 활성화, 사이토카인 유도, 항체 생성 또는 항체 유형 전환의 자극, 항원 제시 세포의 자극 및/또는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 발현에 대한 영향에 의해, 면역력을 강화시킬 수 있다.

투여 경로

본 발명의 백신은 비경구(예를 들어, 피내, 정맥내, 척수내, 복강내, 피하 또는 근육내), 경구, 국소 또는 점막 경로(예를 들어, 비강)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 표준 경로에 의해 수혜자에게 투여될 수 있다.

예를 들어, 백신은 점막 경로에 의해 투여될 수 있다. 점막 백신 투여의 허용가능한 경로의 비-제한적인 예는 비강, 안구, 구강, 생식기(질), 직장, 기관내, 피부 및 위장관을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 백신은 비강 경로에 의해 투여된다. 이론 또는 특정 작용 방식에 제한없이, 백신의 비강내 투여는 박테리아가 상부 및/또는 하부 기도의 점막 표면을 통해 숙주를 감염시키는 특정 연쇄상구균 감염에 대한 면역력을 증진시키는데 유리할 수 있다. 또한, 점막 백신접종(예를 들어, 비강내 백신접종)은 기도뿐만 아니라 생식기 점막을 포함하는 멀리 떨어져있는 점막 부위에서도 점막 면역을 유도할 수 있다.

본 발명의 비강내 백신은 예를 들어, 코 점적, 스프레이 또는 흡입에 적합한 액체 형태, 분말 형태, 크림 형태 또는 에멀젼 형태로 배합될 수 있다. 분무되거나 에어로졸화된 비강내 백신도 사용할 수 있다. 미스트, 분말 또는 스프레이의 흡입, 또는 코 점적, 면봉, 분말, 스프레이, 미스트, 에어로졸 등의 비강내 투여에 의한 상부 및/또는 하부 기도 점막에 백신을 투여하는 것도 고려된다.

일 구현예에서, 비강내 투여용 백신은 사용 직전에 재구성될 수 있는 동결-건조 분말 형태로 제공된다. 본 발명의 백신 및 조성물의 분말 백신 제형은 액체-기반 백신 안정성 및 전달과 관련된 냉장 저장 및 분배 요건을 극복하기 위한 수단을 제공한다. 건조 분말 제형은 보다 안정한 장점을 제공하며, 미생물 성장을 지원하지 않는다.

동결-건조된 백신은 비 동결-건조 백신과 유사한 이종항원성 면역 수준을 유도할 수 있다. 백신은 당 업계에 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여 동결-건조될 수 있다. 예를 들어, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 그의 유도체의 액체 제제는 드라이 아이스-이소프로판올 슬러리에서 동결될 수 있고, 동결 건조기(예를 들어, Virtis Model 10-324 Bench, Gardiner, NY)에서 적절한 시간(예를 들어, 24시간) 동안 동결건조될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 건조 분말 비강 백신은 분무-동결-건조(SFD) 입자를 생성함으로써 제조된다(예를 들어, Costantino 등, (2002),　"Protein spray freeze drying. 2. Effect of formulation variables on particle size and stability",　J Pharm Sci., 91:388-395; Costantino, 등,　(2000), "Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability", Pharm Res.,17:1374-1383; Maa　등, (1999),　"Protein inhalation powders: spray drying vs spray freeze drying",　Pharm Res, 16:249-254; Carrasquillo 등, (2001); "Non-aqueous encapsulation of excipient-stabilized spray-freeze dried BSA into poly(lactide-co-glycolide) microspheres results in release of native protein", J Control Release,76:199-208; Carrasquillo 등, (2001), "Reduction of structural perturbations in bovine serum albumin by non-aqueous microencapsulation",　J Pharm Pharmacol., 53:115-120; 및 미국특허 제6,569,458호 참조).

백신의 비강내 투여에 바람직한 장치는 비강 스프레이 장치(예를 들어, Pfeiffer GmBH, Valois 및 Becton Dickinson으로부터 상업적으로 이용가능한 장치)이다. 적합한 장치의 비-제한적 예는 예를 들어, Bommer, (1999), "Advances in Nasal drug delivery Technology", Pharmaceutical Technology Europe, p26-33에 기술되어 있다. 비강내 장치는 1 내지 500㎛ 범위의 점적제를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 작은 비율의 점적제(예를 들어, <5%)만이 흡입력을 최소화하기 위해 10μm 미만이다. 비강내 장치는 이중-투여량 전달, 즉 단일 백신접종 투여량의 2 서브투여량(subdose), 각 콧구멍 당 1 서브투여량을 제공할 수 있다.

본 발명의 백신은 단독으로 또는 다른 추가의 치료제(들)와 조합하여 수혜자에게 투여될 수 있다. 백신이 치료제(들)와 함께 투여되는 구현예에서, 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다(즉, 백신 투여 후에 약제(들)의 투여 또는 그 역으로 될 수 있다). 따라서, 본 발명의 백신이 다른 약제와 함께 대상체에 투여되는 경우, 이들은 동시에 단일 조성물로, 개별 조성물로 동시에 또는 상이한 시간에 따로 투여될 수 있다.

투여량

일반적으로, 본 발명의 백신은 투여 경로 및 수혜자의 물리적 특성(건강 상태 포함)과 양립할 수 있는 방법 및 원하는 효과(들)(즉, 치료 효과, 면역원성 및/또는 방어)를 이끌어내는 방법으로 투여된다.

예를 들어, 주어진 백신의 적절한 투여량은 대상체의 물리적 특성(예를 들어, 연령, 체중, 성별), 화합물이 단일 약제 또는 보조제 요법으로 사용되는지 여부, 주어진 연쇄상구균 감염의 진행(즉, 병리학적 상태) 및 당업자에 의해 인식될 수 있는 다른 요소들을 포함하는 다양한 요소들에 따라 다르며, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 주어진 백신의 적절한 투여량을 결정할 때 고려될 수 있는 다양한 일반적 고려사항은 예를 들어, Gennaro 등 (Eds), (1990), "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA; and Gilman 등, (Eds), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press에 기술되어 있다.

일반적으로, 본 발명의 백신은 약 50㎍ 내지 약 5mg의 유효 성분(들)(즉, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및/또는 이의 유도체)의 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 약 50㎍ 내지 약 500㎍의 양의 투여량이 특히 바람직하다.

당업자는 일상적인 실험에 의해, 원하는 치료 결과를 위한 본 발명의 백신에 포함시키기 위한 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 또는 이의 유도체의 유효한 무독성 양을 결정할 수 있을 것이다.

일반적으로, 유효 투여량은 24시간마다 체중 kg 당 약 0.0001mg 내지 약 1000mg; 전형적으로, 24시간마다 체중 kg 당 약 0.001mg 내지 약 750mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 500mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 0.1mg 내지 약 500mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 0.1mg 내지 약 250mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 1.0mg 내지 약 250mg 유효 성분(즉, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 또는 그의 유도체)의 범위에 있을 것으로 예상된다. 보다 통상적으로, 유효 투여량 범위는 24시간마다 체중 kg 당 약 1.0mg 내지 약 200mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 1.0mg 내지 약 100mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 1.0mg 내지 약 50mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 1.0mg 내지 약 25mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 5.0mg 내지 약 50mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 5.0mg 내지 약 20mg; 24시간마다 체중 kg 당 약 5.0mg 내지 약 15mg의 범위에 있을 것으로 예상된다.

대안적으로, 유효 투여량은 약 500mg/㎡ 이하의 유효 성분(들)(즉, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 또는 이의 유도체)일 수 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 약 25 내지 약 500mg/㎡, 바람직하게는 약 25 내지 약 350mg/㎡, 보다 바람직하게는 약 25 내지 약 300mg/㎡, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 250mg/㎡ , 훨씬 더 바람직하게는 약 50 내지 약 250mg/㎡, 및 더욱 더 바람직하게는 약 75 내지 약 150mg/㎡의 범위에 있을 것으로 예상된다.

전형적으로, 치료적 용도에서, 치료는 감염, 질병 상태 또는 질환 내내 진행될 것이다. 또한, 개별 투여량의 최적 양 및 간격은 감염의 성질 및 정도, 치료되는 질병 상태 또는 질환, 투여의 형태, 경로 및 부위, 치료되는 특정 개인의 성격에 의해 결정될 것이라는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 이러한 최적 조건은 종래 기술에 의해 결정될 수 있다.

많은 경우, 본 발명의 백신을 수회 또는 다수 투여가 바람직할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여될 수 있다. 투여는 약 1 내지 약 12주 간격일 수 있고, 특정 구현예에서는 약 1 내지 약 4주 간격일 수 있다. 주기적인 재-투여는 본 발명의 백신에 의해 표적화된 특정 병원체에 반복적으로 노출되는 경우 바람직할 수 있다.

또한, 당해 기술 분야의 통상의 기술자라면, 최적의 치료 과정이 통상적인 치료 과정 결정 테스트를 사용하여 확정될 수 있음이 명백할 것이다.

본원에 기술된 방법은 본 발명의 백신접종량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 접종량은 부스터 용량으로 이어질 수 있다. 부스터는 재-백신접종을 목적으로할 수 있다. 다양한 구현예에서, 백신은 적어도 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 투여된다. 본 발명의 백신은 연쇄상구균 박테리아의 특정 표적 균주(들)에 대해 혈청반응음성인 대상체인 경구 수혜자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 백신은 연쇄상구균 박테리아의 특정 표적 균주(들)에 대해 혈청반응양성인 감작된 수혜자에 투여될 수 있다.

광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 특정 구현예들에 개시된 바와 같이, 본 발명에 많은 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 본 구현예들은 모든 면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야한다.

실시예

본 발명은 특정 실시예(들)을 참조하여 이제 설명될 것이나, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1 : 일반적인 백신으로서 시험하기에 적합한 폐렴구균 균주의 생성.

폐렴연쇄상구균 균주 Rx1은 박테리아의 외부 피막이 없는 혈청형 2(D39)의 유도체이다. 이 균주는 하기 흐름도에 나타낸 바와 같이, 자가분해효소 유전자(lytA)를 제거하기 위해 유전자 변형되었다. 생성된 Rx1(ΔLytA) 균주는 하기 흐름도에 나타낸 바와 같이, 폐렴구균용혈소 유전자(ply)를 PdT로 표시된 Ply의 톡소이드 버전으로 치환함으로써 추가로 변형되었다.

성공적인 형질전환을 확인하기 위해 각 형질전환 단계 후에 PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였고, 시퀀싱(sequencing)을 통해 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 명명된, lytA 결핍 폐렴구균용혈소 돌연변이체(PdT) Rx1 균주의 성공적인 생성이 확인되었다(도 1).

PdT 돌연변이 형태의 폐렴구균용혈소를 보유하는 유도체 균주에서 용혈 활성의 결핍을 확인하기 위해 각 유도체에서 용혈성 분석을 수행하였다(도 2).

흐름도: 자가분해효소를 코딩하는 lytA 유전자를 제거하고, 폐렴구균용혈소를 코딩하는 ply 유전자를 폐렴구균용혈소 발현 PdT의 돌연변이 유도체로 치환하기 위해 Rx1 균주를 변형시키는 절차.

웨스턴 블롯, PCR 및 시퀀싱은 폐렴연쇄상구균 균주 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)이 성공적으로 생성되었음을 확인했다.

실시예 2: ΔlytA 유전자로부터의 mRNA 전사체의 2차 구조 분석.

ΔlytA 유전자 mRNA 전사체의 2차 구조를 예측하기 위해 분석을 수행하였다.

플랭킹 영역을 포함하는, 결실 전의 균주 Rx1의 lytA 유전자의 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1(하기 참조)에 나타낸다. ATG(개시 코돈)부터 TAA(정지 코돈)까지의 lytA 유전자의 전체 코딩 영역이 스플라이스-오버랩 연장 PCR에 의해 프레임 내에서 결실되었다. 생성된 ΔlytA 유전자 서열은 SEQ ID NO: 2(하기 참조)에 나타내었다. ΔlytA 유전자 서열에 의해 코딩된 mRNA 전사체는 SEQ ID NO: 3(하기 참조)에 나타내었다.

mRNA 전사체의 2차 구조는 RNA폴드(RNA폴드 웹서버([http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi])를 사용하여 예측했으며, 도 3에 도시되어 있다. 도 3에 도시된 mRNA 전사체의 예측된 2차 구조는 -52.80kcal/mol의 최소 자유 에너지를 가지는 것으로 예상된다. SEQ ID NO: 3에서 굵은 검정색으로 표시된 예측된 이중-가닥 종결 스템-루프 서열은 -18.10kcal/mol의 최소 자유 에너지를 가지는 것으로 예상된다.

서열식별번호: 1

LytA 유전자 서열, 폐렴 연쇄상구균의 플랭킹 영역 포함

자가분해효소(LytA)에 대한 lytA 코딩 서열은 ATG 개시 코돈 및 TAA 정지 코돈이 굵게/기울임체로 강조표시된 기울임체/밑줄로 표시된다. -35 및 -10 및 sigma70 프로모터 인식 서열은 밝은 회색 및 어두운 회색으로 각각 음영 처리된다. 사각형/굵지않은 뉴클레오티드는 RpoD에 대한 잠재적 전사 결합 부위(들)(TFB)을 나타낸다. TFB의 중앙에 있는 굵은 A는 lytA mRNA에 대한 예측된 전사 개시 부위(TSS) 위치를 나타낸다. ATG 개시 코돈 및 TAA 정지 코돈의 바로 옆에있는 상류 및 하류 뉴클레오티드는 사각형/굵은 글씨이다.

lytA 유전자의 SEQ ID NO: 1 상류 및 하류의 사각형/굵은 뉴클레오티드 서열이 함께 융합되도록, lytA 유전자의 전체 코딩 영역을 슬라이스-오버랩 연장 PCR에 의해 프레임 내에서 결실시켰다.

서열식별번호: 2

lytA 유전자의 결실 후, 폐렴연쇄상구균 균주 Rx1ΔLytA (및 유도체)내 유전자 서열

ΔlytA 유전자에 의해 코딩된 메신저 RNA(mRNA) 전사체를 SEQ ID NO: 3에 나타낸다. 굵은 흑색 및 밑줄로 표시된 리보뉴클레오티드는 Rho-의존성 종결을 허용하는 전형적인 이중-가닥(ds) 스템-루프 구조를 형성하는 것으로 예측된다.

서열식별번호: 3

ΔLytA 유전자에 의한 코딩된 메신저 RNA (mRNA) 전사체

실시예 3: 감마선 조사선량 및 조건이 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 생존력 및 형태에 미치는 영향.

상이한 조사 선량 및 조건에서 농축 백신 샘플의 생존력 및 형태에 대한 감마선 조사의 영향을 시험하였다.

폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 THY 브로쓰에서 배양하여, 10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의 세포 밀도를 얻었다. 박테리아를 원심분리를 통해 농축하고, PBS로 세척하고, 다시 원심분리하고, PBS-10% 글리세롤에 1×10¹⁰ CFU/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 얼음 또는 드라이 아이스(DI) 상에서 방사선 조사(0.5-25 kGy)의 다양한 선량 및 온도 조건으로 스톡 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(1×10¹⁰ CFU/ml)을 감마선-조사했다. 백신 샘플을 감마선-조사 후 혈액 한천 플레이트 상에 플레이팅하여, 생존력을 평가하고, 불활성화를 확인하였다(도 4a 및 도 4b). 그람 염색법과 주사 전자 현미경검사를 수행하여, 감마선-조사가 박테리아의 물리적 형태에 미치는 영향을 측정했다(각각, 도 5 및 도 6).

감마선-조사는 박테리아의 형태에 영향을 미치지 않았다. 왼손 이미지는 조사되지 않은 대조군 박테리아를 나타내는 반면, 오른손 이미지는 드라이 아이스 상에 조사된 샘플의 완전한 불활성화에 필요한 최소 선량인 12kGy에서 조사한 후 박테리아의 형태를 나타낸다.

실시예 4: 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 백신접종된 후, 살아있는 폐렴연쇄상구균 균주 D39에 의한 접종 후에 마우스의 생존 기간.

DI에서 12KGY의 감마선-조사를 사용하여 제조된 감마선-조사된 Rx1(ΔLytA, PdT)이 살아있는 폐렴연쇄상구균 균주 D39(혈청형 2)에 의한 치사 감염으로부터 방어할 수 있는지를 측정하기 위한 실험을 수행했다.

마우스에게 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)을 2주 간격으로 비강내 백신접종을 하였다. 두 번째 백신접종 투여후 2주째, 마우스에게 1×10⁶CFU의 폐렴연쇄상구균 D39를 접종하고, 21일동안 생존 기간과 생존율을 모니터링했다(도 7a 및 도 7b).

이 백신은 폐렴연쇄상구균 D39에 의한 치사 접종에 대해 상당한 방어를 제공할 수 있었다. 따라서, 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)은 생 폐렴연쇄상구균 D39 균주의 비강내 접종에 대한 방어 효과가 관찰되었다.

실시예 5: 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)로 백신접종된 후, 폐렴연쇄상구균 균주 EF3030(혈청형 19F) 또는 P9(혈청형 6A)로 이형 접종된, 마우스에서의 면역력.

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)이 EF3030(혈청형 19F) 또는 P9(혈청형 6A)에 의한 이형 접종에 대한 방어를 제공할 수 있는지를 결정하기 위해, 마우스에게 2선량의 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내 백신접종하였다. 두 번째 백신접종 2주 후, 마우스를 1×10⁷ CFU의 EF3030 또는 5×10⁶ CFU의 P9로 감염시켰다. EF3030 접종 후, 감염 96시간 후, 폐와 비인두를 채취하여 박테리아 수를 측정하였다(각각 도 8a 및 도 8b 참조). P9 접종 후, 마우스를 21일 동안 생존을 모니터링하였다(도 8c).

이 백신은 폐에서 폐렴연쇄상구균 EF3030 수의 유의한 감소와 폐렴연쇄상구균 P9 접종후 중앙생존기간의 유의한 차이에 의해 나타나는 이형 접종에 대한 방어를 제공할 수 있었다.

실시예 6: 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 비강내로 접종한 마우스에서의 폐렴연쇄상구균-특이적인 혈청 항체 반응의 유도.

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)이 비강내 백신접종 후 폐렴연쇄상구균-특이적 항체 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 분석을 수행했다.

마우스에게 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내 백신접종하고, 2차 백신접종 투여 후 2주후 혈액을 채취하였다. 다음의 항원, 즉 Ply, NanA, CbpA 및 GlpO에 대한 혈청내 항원 특이적 IgG 반응을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한, ELISA를 사용하여 PspA 및 조사되지않은 전체 Rx1(ΔLytA, PdT) 박테리아 세포에 대한 IgG 및 IgA 항체 반응을 측정하였다.

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의한 비강내 백신접종 후 CbpA, GlpO, PspA 및 전체 폐렴구균에 대한 항체 반응이 검출되었다(도 9).

실시예 7: 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 복강내 백신접종한 마우스에서 폐렴연쇄상구균 특이적 항체 반응의 유도.

복강내 백신접종이 높은 수준의 폐렴연쇄상구균-특이적 항체 반응을 유도할 수 있는지를 측정하기 위해 추가 실험을 수행하였다.

마우스에게 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1x10⁸ CFU/용량)을 복강내 백신접종하고, 2차 백신접종 투여 후 2주후 혈액을 채취하였다. ELISA를 사용하여 하기 항원: 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 세포(WC)(도 10a), Ply(도 10b) 및 CbpA(도 10c)의 전체 세포 용해물에 대한 혈청내 항원 특이적 IgG 역가를 측정하였다.

이 백신은 복강내 주사될때 유의한 높은 수준의 항체 역가를 유도했다.

실시예 8: 비강내 투여된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 유도된 방어 면역에서 B 림프구의 역할.

폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 유도된 면역 반응에서의 B 세포의 관련성을 평가하였다.

야생형 C57BL/6 마우스(WT)와 B-세포 결핍 C57BL/6(μMT) 마우스(B 세포 결핍)에 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내 백신접종하였다. 두 번째 백신접종 투여 후 2주후, 마우스에게 치사량의 폐렴연쇄상구균 D39를 비강내로 접종하고, 21일 동안 생존을 모니터링하였다. 생존율은 도 11에 도시되어 있다.

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 사용한 WT 마우스의 백신접종은 상대적 WT 대조군 마우스(백신보다 PBS를 투여받음)와 비교하여, D39에 의한 치사량 접종에 대해 유의한 방어 효과를 나타냈다. 대조적으로 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 갖는 μMT 마우스의 백신접종은 각각의 μMT 대조군 마우스(백신보다 PBS를 투여 받음)에 비해 증가된 방어의 증거를 보여주지 못했다. 이 결과는 B-세포가 비강내 투여된 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신이 폐렴연쇄상구균에 대한 방어 면역을 유도하는데 필수적임을 나타낸다.

실시예 9: 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 비강내 투여에 의해 유도된 방어 면역에서 T-림프구 반응의 분석.

T-림프구 반응은 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의한 백신접종 후에 평가되었다.

마우스에게 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내로 백신접종하고 2회째 백신접종 투여 후 2주후 비장을 채취했다. 그런 다음 비장세포를 백신 항원, MalX 단백질 또는 Media 단독(-대조군)으로 72시간동안 자극하였다. 72시간 후, ELISA(IL-17A 및 IFN-γ)에 의해 사이토카인 수준을 측정하기 위해 세포 배양물의 상청액을 수집하였다(도 12a 및 도 12b).

항원 자극 후 Th1 세포(IFN-γ+ 사용), Th2세포(IL-4+), Th17 세포(IL-17+) 및 T-reg 세포(Foxp3+)의 비율을 조사하기 위해 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다(도 12c 및 도 12d).

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 백신접종은 ELISA로 확인된 백신 항원 또는 MalX로 비장세포를 자극한 후, 상청액내 IL-17A 또는 IFN-γ 수준을 증가시키지 않는 것으로 보인다. 이와 유사하게, 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정된 바와 같이, Th1, Th2, Th17 또는 Tregs의 비율에는 변화가 없었다.

실시예 10: 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 비강내 투여 후 인플루엔자 바이러스에 의한 도전

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 사전 백신접종을 실시한 결과 인플루엔자에 의한 도전에 어떠한 악영향을 미쳤는지 여부를 측정하기 위해 분석을 진행했다.

마우스에게 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/용량)의 비강내 백신접종하였다. 두 번째 백신접종 투여 후 2주 후, 마우스에게 인플루엔자 바이러스 A/PR8(~100 TCID50)을 접종하고, 체중 감소와 생존을 모니터링했다(도 13b). 대조군 마우스는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 백신접종을 받는 대신에, PBS를 투여받은 후 인플루엔자 바이러스 A/PR8(~100 TCID50)을 투여하고, 체중 감소와 생존을 모니터링하였다(도 13a).

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 사전 백신접종을 한 결과, 마우스가 생 인플루엔자 바이러스로 도전되었을 때 부작용을 나타내지 않았다. 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 사전 백신접종을 하면 인플루엔자 균주 A/PR8에 의한 도전에서 생존한 모든 백신접종 마우스에 의해 보여지는 바와 같이, 인플루엔자 도전에 대한 일부 방어 효과가 있다는 증거가 있다. 이것은 유익한 방관자 효과를 제시한다.

실시예 11: 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 효능에 대한 콜레라 독소 보조제의 효과

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)을 원형(prototype) 보조제 콜레라 독소(Cholera Toxin, CT)와 혼합하여, 보조제가 백신의 효능을 증가시킬 수 있는지 평가했다.

마우스에게 2선량의 1μg CT(대조군) 또는 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/회분) + 1μg CT로 마우스에게 비강내 백신접종을 실시했다.

두번째 백신접종 투여후 2주 후에, 1×10⁷ CFU의 폐렴연쇄상구균 EF3030, 1×10⁶ CFU의 폐렴연쇄상구균 D39 또는 5×10⁶ CFU의 폐렴연쇄상구균 P9로 마우스를 도전시켰다. EF3030 감염 후 7일 후, 폐와 비인두를 채취하여 세균 수를 측정하였다(도 14a 및 도 14b).

D39 또는 P9 도전 후에, 마우스를 21일동안 생존을 모니터링하였다(도 14c 및 도 14d).

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)과 CT 보조제에 의한 백신접종은 생 EF3030에 의한 감염 후 백신접종을 하지 않은 대조군과 비교하여 폐내 박테리아 수를 현저히 감소시켰다. CT를 갖는 백신은 생 D39 및 P9에 의한 치사량 감염에 대하여 유의하게 방어한다.

보조제로서 콜레라 독소를 갖는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신에 의해 유도된 면역 반응의 유형을 측정하기 위해, 1μg CT 첨가 여부에 관계 없이, 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(12KGY DI)(1×10⁸ CFU/dose)로 비강내 백신접종된 마우스로부터 두번째 접종후 2주 후 비장 및 혈청을 채취하였다. 비장세포를 백신 항원, MalX 또는 Media 단독(-대조군)으로 72시간 동안 자극하였다. 72시간 후에, 72시간 자극후 유도된 Th1 세포(IFN-γ+ 사용), Th2 세포(IL-4+), Th17 세포(IL-17+) 및 T-reg 세포(Foxp3+)의 비율을 찾기 위해 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다(도 15a 및 도 15b). 세포 배양물의 상청액을 수확하여 사이토카인(IL-17A 및 IFN-γ)을 검출하였다(도 15c 및 도 15d).

CT를 갖는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)의 비강내 백신접종은 Th17 반응을 양극화하였는데, 세포내 사이토카인 염색에 의해 입증된 Th17 세포의 수 증가 및 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 또는 MalX에 의한 자극 후 상청액에서 IL-17A 증가로 나타났다.

전체 Rx1(ΔLytA, PdT) 세포에 대한 혈청 IgA 및 IgG 역가를 ELISA로 측정하였다(도 16). CT 보조제의 존재하에 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)으로 면역화된 마우스는 백신 균주만으로 면역화된 마우스와 비교하여 높아진 항체 반응을 나타났다.

실시예 12: 비강내 투여된 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 유도된 방어 면역에서 사이토카인의 역할.

감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 유도된 면역 반응에서 백신 유효성에 IFN-γ 및 IL-7의 관련성을 평가하였다.

야생형 C57BL/6 마우스(WT)에 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내로 백신접종하였다. 두 번째 백신접종후 2주 후, 마우스에게 접종 24시간 전, 접종 6시간 후 및 접종 48시간 후 IFN-γ 또는 IL-17, 또는 관련 아이소타입 대조군 항체에 중화 항체 200㎍을 주사하였다(도 17a 및 17b). 마우스를 치사량의 폐렴연쇄상구균 D39로 비강내 도전하고, 21일 동안 생존을 모니터링하였다. 생존율이 표시되어 있다.

어느 아이소타입 대조군 항체를 투여해도 D39 도전에 대한 백신의 방어 효과는 변하지 않았다. 중요하게도, 백신접종은 상대적인 대조군과 비교했을때 IFN-γ 중화에도 불구하고 면역된 마우스에서 유의적인 방어를 유도했다(도 17a). 대조적으로, 이 보호는 IL-17A 중화에 의해 폐지되었다(도 17b). 이러한 데이터는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 유도된 방어 기전이 IL-17A-의존적이며, IFN-γ-독립적이라는 것을 입증한다.

실시예 13: 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)은 선천성 IL-17 반응을 유도한다.

IL-17 의존적 방어의 근원(source)이 이용(access)되었다. 야생형 C57BL/6 마우스(WT)에 2선량의 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)(1×10⁸ CFU/용량)을 비강내로 백신접종하였다. 두 번째 백신접종 투여 후 2주 후에 마우스에게 폐렴연쇄상구균 D39를 접종하였다. 접종후 24시간 및 48시간 후, 폐를 채취하고, T 이펙터 세포(Th1 및 Th17), γδT 세포(γδT1 및 γδT17) 및 식세포(대식세포 및 호중구)의 비율을 분석하였다. 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신접종은 D39 접종 24시간 후에 폐의 Th1 세포 또는 Th17 세포의 상대적 군집 또는 T 이펙터 세포의 총 수를 변경시키지 않았다(도 18a). 토탈(Total) T 이펙터 세포와 Th17 세포에서 48시간 째 비슷한 결과가 관찰되었다. 접종 후 48시간에서 PBS-처리된 대조군에 비해 면역화된 마우스내 Th1 세포 수가 유의하게 감소하였다. T 이펙터 세포와 달리, 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의한 비강내 백신접종은 D39 감염 후 폐에서 γδT 세포군집의 중요한 변화를 유도했다(도 18a). 백신접종된 마우스의 폐에서 γδT 세포의 총 수는 비-면역화된 마우스에 비해 유의하게 다르지 않았지만, 데이터는 면역화된 마우스가 접종후 24시간후에 폐에서 γδT17 세포 수가 특이적으로 증가되었으며, 접종 후 48시간후 더욱 증가되었음을 나타낸다. 24시간에 백신접종된 마우스의 γδT1 세포 수가 감소하여, 대조군 동물에 비해 48시간에 유의한 차이가 검출되었다. 전반적으로, 이 데이터는 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT) 백신이 Th1 및 γδT1 세포의 유의한 감소 및 Th17 군집의 차이 없음과 관련된 γδT17 세포 반응의 유의한 증가를 촉진한다는 것을 입증한다. 따라서, 이 데이터는 γδT17 세포가 백신접종된 마우스에서 방어 면역을 매개하는데 관여하는 IL-17A의 잠재적인 원천이 될 수 있음을 제시한다.

폐렴연쇄상구균 D39 접종 후 24시간 및 48시간 후, 마우스의 폐에서 대식세포와 호중구의 상대적 수를 감마선-조사된 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT)에 의해 백신접종되었거나 백신접종되지 않은 마우스(PBS 대조군)(도 18b)와 비교하였다. 백신접종된 동물에서 접종후 24시간 및 48시간후에 각 세포 유형의 수가 유사하게 유지되는 반면, PBS 대조군 마우스에서는 접종 후 24시간 내지 48시간에 폐에서 대식세포가 유의하게 증가하였다. 이것은 호중구에서도 분명했다.

실시예 14: 독성 결정기를 코딩하는 유전자에서 유전자 변형을 갖는 폐렴구균 유도체의 생성.

이하의 흐름도에 도시된 바와 같이, 폐렴연쇄상구균 균주 Rx1(ΔLytA, PdT)은 폐렴구균 표면 항원 A(PsaA)를 코딩하는 유전자를 제거함으로써 추가로 유전적으로 변형되었다.

성공적인 형질전환이 일어났는지 확인하고 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA) 균주의 생성을 확인하기 위해, PCR, 시퀀싱 및 웨스턴 블롯을 각 형질전환 단계 후에 수행하였다(도 19a 및 도 19b). 도 19c는 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)를 생성하기 위해 Rx1(ΔLytA, PdT)로부터 psaA 유전자의 성공적인 결실을 확인하고, Mn²⁺가 보충되지 않은 배지에서 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA) 균주의 성장 결함을 입증한다.

흐름도 : 폐렴구균 표면 항원 A를 코딩하는 psaA 유전자를 제거하기 위해 Rx1 균주(ΔLytA, PdT)를 변형시키기 위해 채택된 과정.

웨스턴 블롯, PCR 및 시퀀싱은 폐렴연쇄상구균 균주 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 성공적인 생성을 확인했다.

실시예 15 : ΔpsaA 유전자로부터의 mRNA 전사체의 2차 구조 분석.

ΔpsaA 유전자 mRNA 전사체의 2차 구조를 예측하기 위해 분석을 수행하였다.

플랭킹 부위를 포함하는 결실 전 Rx1(ΔLytA, PdT) 균주의 psaA 유전자의 DNA 서열을 SEQ ID NO: 4에 나타내었다(하기 참조). 전체 865개의 뉴클레오티드는 스플라이스-오버랩 연장 PCR 돌연변이유발에 의해 결실되어, 전사 개시 부위에서부터 GTAAA로 시작하는 서열까지의 영역, 정지 코돈의 56개 뉴클레오티드 상류의 영역이 결실되었다. 생성된 ΔpsaA 유전자 서열을 SEQ ID NO: 5에 나타내었다(하기 참조). ΔpsaA 유전자 서열에 의해 코딩된 mRNA 전사체는 SEQ ID NO: 6에 기재되어있다(하기 참조).

mRNA 전사체의 2차 구조는 RNA폴드(RNA폴드 웹서버([http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi])를 사용하여 예측했으며, 도 20에 표시되어 있다. 도 20에 도시된 ΔpsaA 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 전사체의 예측된 2차 구조는 -20.20 kcal/mol의 최소 자유 에너지를 가질 것으로 예상된다.

서열식별번호: 4

PsaA 유전자 서열, 폐렴연쇄상구균의 플랭킹 영역 포함

폐렴구균 표면 항원 A(PsaA)에 대한 psaA 코딩 서열은 ATG 개시 코돈 및 TAA 정지 코돈을 굵은/이탤릭체로 강조하여 이탤릭/밑줄로 표시하였다. -35 및 -10 및 sigma70 프로모터 인식 서열은 밝은 회색 및 어두운 회색으로 각각 음영 처리된다. ATG 개시 코돈의 굵은 G 9 뉴클레오티드 상류는 PsaA mRNA에 대한 예상 전사 개시 부위(TSS)이다. ATG 개시 코돈의 바로 상류의 뉴클레오티드 및 TAA 정지 코돈의 56 뉴클레오티드 상류는 사각형/굵은 글씨이며, PCR 프라이머 어닐링을 위한 부위를 구성한다.

프라이머 어닐링 부위들 사이의 psaA 유전자의 코딩 영역은 스플라이스-오버랩 연장 PCR에 의해 결실되어, psaA의 SEQ ID NO: 4의 사각형/굵은 뉴클레오티드 서열이 함께 융합된다.

서열식별번호: 5

ΔpsaA 유전자에 의해 코딩된 메신저 RNA(mRNA) 전사체를 SEQ ID NO: 6에 나타낸다. 굵은 검은 색 및 밑줄 표시된 리보뉴클레오티드는 Rho-의존성 종결을 허용하는 전형적인 이중-가닥(ds) 스템-루프 구조를 형성하는 것으로 예측된다.

서열식별번호: 6

실시예 16: 감마선-조사 선량 및 조건이 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 생존력 및 형태에 미치는 영향.

다양한 조사 선량에서 감마선-조사가 농축 백신 샘플의 생존력과 형태에 미치는 영향.

폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)을 THY 브로쓰에서 배양하여, 10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의 세포 밀도를 얻었다. 박테리아를 원심분리를 통해 농축시키고, PBS로 세척하고, 다시 원심분리하고, 최종 농도 1×10¹⁰ CFU/ml로 PBS-10% 글리세롤에 재현탁시켰다. 드라이 아이스(DI) 상에서 다양한 농도의 조사(0.5-25 kGy)에서 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)(1×10¹⁰ CFU/ml)을 감마선-조사하였다. 감마-조사한 후, 백신 균주의 샘플을 혈액 한천 평판에 플레이팅하여, 생존력을 평가하고, 불활성화를 확인하였다(도 21a). 조사되지 않았거나(도 21b) 또는 25kGy에서 조사된(도 21c) 폐렴연쇄상구균 Rx1(ΔLytA, PdT, ΔPsaA)의 물리적 형태에 대한 주사 전자 현미경사진이 도시된다. 감마선-조사는 박테리아의 총 형태에 영향을 미치지 않았다.

<110> Gamma Vaccines Pty Limited <120> Streptococcal Vaccine <130> P140271C <150> AU 2015901098 <151> 2015-03-26 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1324 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 tgaaaatagt ttaacagact tttgacttct tttatatgat ataataaagt atagtattta 60 tgaaaaggac atatagagac tgtaaaaata tacttttgaa aatcttttta gtctggggtg 120 ttattgtaga tagaatgcag accttgtcag tcctatttac agtgtcaaaa tagtgcgttt 180 tgaagttcta tctacaagcc taatcgtgac taagattgtc ttctttgtaa ggtagaaata 240 aaggagtttc tggttctgga ttgtaaaaaa tgagttgttt taattgataa ggagtagaat 300 atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagtcggcgt gcaaccatat 360 aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat 420 tatcactggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggttgc 480 atcatgcagg taggacctgt tgataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 540 gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ccaaagaaga gttcatgacg 600 gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 660 acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 720 ccaaacaacc actcagacca cgttgaccct tatccatatc ttgctaaatg gggcattagc 780 cgtgagcagt ttaagcatga tattgagaac ggcttgacga ttgaaacagg ctggcagaag 840 aatgacactg gctactggta cgtacattca gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 900 aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 960 aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 1020 tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 1080 tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc catggtatca 1140 aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca ggctggtact acctcaaacc agacggaaca 1200 ctggcagaca agccagaatt cacagtagag ccagatggct tgattacagt aaaataataa 1260 tggaatgtct ttcaaatcag aacagcgcat attattaggt cttgaaaaag cttaatagta 1320 tgcg 1324 <210> 2 <211> 367 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 tgaaaatagt ttaacagact tttgacttct tttatatgat ataataaagt atagtattta 60 tgaaaaggac atatagagac tgtaaaaata tacttttgaa aatcttttta gtctggggtg 120 ttattgtaga tagaatgcag accttgtcag tcctatttac agtgtcaaaa tagtgcgttt 180 tgaagttcta tctacaagcc taatcgtgac taagattgtc ttctttgtaa ggtagaaata 240 aaggagtttc tggttctgga ttgtaaaaaa tgagttgttt taattgataa ggagtagaat 300 taatggaatg tctttcaaat cagaacagcg catattatta ggtcttgaaa aagcttaata 360 gtatgcg 367 <210> 3 <211> 234 <212> RNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 aaugcagacc uugucagucc uauuuacagu gucaaaauag ugcguuuuga aguucuaucu 60 acaagccuaa ucgugacuaa gauugucuuc uuuguaaggu agaaauaaag gaguuucugg 120 uucuggauug uaaaaaauga guuguuuuaa uugauaagga guagaauuaa uggaaugucu 180 uucaaaucag aacagcgcau auuauuaggu cuugaaaaag cuuaauagua ugcg 234 <210> 4 <211> 1140 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 cagttttggg actctttatt ggctatagtt ttaatgttgc ggcaggttct agtatcgtgc 60 ttacagctgc tagtttcttt ctcattagct tctttatcgc tcccaaacaa cgatatttga 120 aactgaaaaa taaacatttg ttaaaataag gggcaaagcc ctaataaatt ggaggatcta 180 atgaaaaaat taggtacatt actcgttctc tttctttctg caatcattct tgtagcatgt 240 gctagcggaa aaaaagatac aacttctggt caaaaactaa aagttgttgc tacaaactca 300 atcatcgctg atattactaa aaatattgct ggtgacaaaa ttgaccttca tagtatcgtt 360 ccgattgggc aagacccaca cgaatacgaa ccacttcctg aagacgttaa gaaaacttct 420 gaggctgatt tgattttcta taacggtatc aaccttgaaa caggtggcaa tgcttggttt 480 acaaaattgg tagaaaatgc caagaaaact gaaaacaaag actacttcgc agtcagcgac 540 ggcgttgatg ttatctacct tgaaggtcaa aatgaaaaag gaaaagaaga cccacacgct 600 tggcttaacc ttgaaaacgg tattattttt gctaaaaata tcgccaaaca attgagcgcc 660 aaagacccta acaataaaga attctatgaa aaaaatctca aagaatatac tgataagtta 720 gacaaacttg ataaagaaag taaggataaa tttaataaga tccctgctga aaagaaactc 780 attgtaacca gcgaaggagc attcaaatac ttctctaaag cctatggtgt tccaagtgcc 840 tacatctggg aaatcaatac tgaagaagaa ggaactcctg aacaaatcaa gaccttggtt 900 gaaaaacttc gccaaacaaa agttccatca ctctttgtag aatcaagtgt ggatgaccgt 960 ccaatgaaaa ctgtttctca agacacaaac atcccaatct acgcacaaat ctttactgac 1020 tctatcgcag aacaaggtaa agaaggcgac agctactaca gcatgatgaa atacaacctt 1080 gacaagattg ctgaaggatt ggcaaaataa gcctctgaaa aacgtcattc tcatgtgagc 1140 1140 <210> 5 <211> 281 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5 cagttttggg actctttatt ggctatagtt ttaatgttgc ggcaggttct agtatcgtgc 60 ttacagctgc tagtttcttt ctcattagct tctttatcgc tcccaaacaa cgatatttga 120 aactgaaaaa taaacatttg ttaaaataag gggcaaagcc ctaataaatt gggtaaagaa 180 ggcgacagct actacagcat gatgaaatac aaccttgaca agattgctga aggattggca 240 aaataagcct ctgaaaaacg tcattctcat gtgagctggc g 281 <210> 6 <211> 110 <212> RNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 6 gguaaagaag gcgacagcua cuacagcaug augaaauaca accuugacaa gauugcugaa 60 ggauuggcaa aauaagccuc ugaaaaacgu cauucucaug ugagcuggcg 110

Claims

광자-조사된 연쇄상구균 박테리아 및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 담체를 포함하는 백신 조성물로서,
여기서 연쇄상구균 박테리아는 Mn²⁺ 이온 수송에 결함이 있고,
상기 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아는 적어도 0.01MeV의 에너지에서 광자 조사에 노출됨으로써 사멸되고,
(i) 연쇄상구균 박테리아가 결함이 있는 PsaA 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하거나; 또는
(ii) PsaA 단백질을 코딩하는 유전자/유전자들이 연쇄상구균 박테리아에 존재하지 않는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 부형제, 희석제 및/또는 담체가 액체인, 백신 조성물.
제2항에 있어서, 액체는 물, 오일, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알코올, 트리글리세리드 또는 이들의 혼합물 중 어느 하나 이상인 것인, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 부형제, 희석제 및/또는 담체가 탈염수 또는 증류수, 식염수, 식물성 오일, 실리콘 오일, 미네랄 오일, 소프트 파라핀 또는 스쿠알렌, 셀룰로스 유도체, 저급 알카놀, 저급 아랄카놀, 저급 폴리알킬렌 글리콜, 저급 알킬렌 글리콜, 지방산 에스테르, 폴리비닐피롤리돈; 한천; 카라기난, 트라가칸트 검, 아카시아 검, 바셀린, 링거액, 등장 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜 중 어느 하나 이상을 포함하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분산제 또는 현탁제를 더 포함하는 백신 조성물.
제5항에 있어서, 현탁제는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 폴리-비닐-피롤리돈, 알긴산나트륨 및 아세틸 알코올 중 어느 하나 이상인 것인, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 분산제는 레시틴, 스테아르산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 중 어느 하나 이상인 것인, 백신 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 연쇄상구균 박테리아는 적어도 하나의 비캡슐화(unencapsulated) 연쇄상구균 혈청형 또는 적어도 하나의 비캡슐화 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 혈청형을 포함하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제8항 중 한 항에 있어서, 연쇄상구균 박테리아가 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)인, 백신 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 연쇄상구균 박테리아는 결함이 있는 오토리신 단백질, 결함이 있는 헤모리신 단백질 및 결함이 있는 뉴모리신 단백질 중 하나 이상을 포함하고/하거나;
(ii) 연쇄구균 박테리아에 오토리신 단백질, 헤몰리신 단백질 또는 뉴모리신 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 유전자/유전자들이 존재하지 않는 것인, 백신 조성물.
제10항에 있어서, 오토리신은 LytA인 것인, 백신 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
연쇄상구균 박테리아가
(i) 박테리아를 불활성화 또는 약화시키거나; 또는
(ii) 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 향상시키는;
항원 또는 그의 성분을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA 부분을 더 포함하는, 백신 조성물.
제12항에 있어서, 재조합 DNA 부분이 병원성, 감염, 생식 또는 이들의 조합에 필요한 내인성 유전자를 대체하거나 방해하는 것인, 백신 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 광자-조사된 연쇄상구균 박테리아는 전체-약화 또는 전체-사멸된 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트를 더 포함하는 백신 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 애쥬번트를 포함하지 않는 백신 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 점막 또는 비강 내 투여를 위해 제형화되거나 근육 내, 피하 또는 피내 주사를 위해 제형화되는, 백신 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 연쇄상구균 박테리아는 감마 조사 돌연변이 연쇄상구균 박테리아 및/또는 감마 조사 변형 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 연쇄상구균 박테리아는 X-조사 돌연변이 연쇄상구균 박테리아 및/또는 X-조사 변형 연쇄상구균 박테리아를 포함하는, 백신 조성물.