Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20230161245A - 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 - Google Patents

글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230161245A
KR20230161245A KR1020220061012A KR20220061012A KR20230161245A KR 20230161245 A KR20230161245 A KR 20230161245A KR 1020220061012 A KR1020220061012 A KR 1020220061012A KR 20220061012 A KR20220061012 A KR 20220061012A KR 20230161245 A KR20230161245 A KR 20230161245A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
leu
glu
amino acid
arg
Prior art date
Application number
KR1020220061012A
Other languages
English (en)
Inventor
김효경
최선형
이지원
심지현
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to KR1020220061012A priority Critical patent/KR20230161245A/ko
Priority to PCT/KR2023/004003 priority patent/WO2023224248A1/ko
Publication of KR20230161245A publication Critical patent/KR20230161245A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 출원은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물; 본 출원의 미생물을 이용한 L-아르기닌의 생산방법; 본 출원의 미생물을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물; 및 본 출원의 미생물의 L-아르기닌 생산 용도에 관한 것이다.

Description

글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 L-아르기닌 생산 방법{A microorganism having gluconate repressor protein activity weakened and a method for producing L-arginine using the same}
본 출원은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물; 본 출원의 미생물을 이용한 L-아르기닌의 생산방법; 본 출원의 미생물을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물; 및 본 출원의 미생물의 L-아르기닌 생산 용도에 관한 것이다.
L-아르기닌(L-arginine)은 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 종합 아미노산 제제 등의 의약용으로 사용되고 있으며, 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용 등의 식품용으로도 최근 각광받고 있는 물질이다. 산업적으로 이용 가능한 고농도의 아르기닌을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아르기닌의 생산을 위해 코리네박테리움 속 균주에서 주로 L-아르기닌 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 L-아르기닌의 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-1102263호).
그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 출원의 하나의 목적은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된, 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-아르기닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물의 L-아르기닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 L-아르기닌 생산능을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화되지 않은 코리네박테리움 속 미생물에 비해 L-아르기닌 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 출원에서, 용어 　"글루코네이트 리프레서(Gluconate repressor, GntR) 단백질"은 글루코네이트 대사 또는 당 유입 등에 관여하는 조절 단백질을 의미한다.
구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 당업계에 공지되어 있으며, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질은 상기 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "L-아르기닌"(L-Arginine)"은 모든 생물체에 존재하는 조건부 필수 아미노산으로서, C6H14N4O2의 화학식을 갖는 L-아미노산을 의미한다.　L-아르기닌은 미생물 중에서도 주로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에 의해 생산되는 것으로 알려져 있으나, 이들은 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의　L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물"은　L-아르기닌을 생물체 내에서 생산할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물 균주로서,　L-아르기닌　생산능이 없는 모균주에　L-아르기닌의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로　L-아르기닌　생산능을 갖는 미생물을 포함한다.　L-아르기닌　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 내재적 활성에 비해 약화되지 않거나 약화되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다.
상기 비변형 미생물은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물은 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화되어, L-아르기닌 생산능이 증가된, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 L-아르기닌 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 글루코네이트 리프레서 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물에 비하여 L-아르기닌 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 L-아르기닌을 생산능을 가지는 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
예를 들어, 상기 L-아르기닌을 생산능을 가지는 미생물은 상기 글루코네이트 리프레서 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
일 예로, 상기 L-아르기닌 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모균주 또는 글루코네이트 리프레서 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물의 L-아르기닌 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상, 또는 약 19% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하 또는 약 25% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-아르기닌 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 약 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상, 또는 약 1.19배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.3배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물이 L-아르기닌을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 모두 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 천연의 야생형 미생물 자체, L-아르기닌 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 L-아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 L-아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함한다.
본 출원에서 용어, 글루코네이트 리프레서 단백질 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 글루코네이트 리프레서 단백질 활성은 폴리펩티드 활성, 단백질 활성 등의 용어와 혼용될 수 있다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약화는 글루코네이트 단백질 활성이 내재적 활성의 100% 미만, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하이거나 또는 0%인 것을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 불활성화는 글루코네이트 리프레서 단백질의 발현이 비변형 미생물에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미할 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다.
상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 글루코네이트 리프레서 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 변형된 글루코네이트 리프레서　변이체, 상기 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서　변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 "다른 아미노산"은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
아미노산은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 분류할 수 있다.
이러한 분류의 예로, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산; 비극성 곁사슬(nonpolar side chain)을 갖는 아미노산(비극성 아미노산)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린; 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 곁사슬을 갖는 아미노산(극성 아미노산)은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 속하는 것으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인(electrically charged amino acid) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산과, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산(uncharged amino acid; neutral amino acid로도 지칭)인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산(aromatic amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 발린, 류신, 이소류신은 분지쇄 아미노산(branched amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 20종 아미노산을 크기에 따라 분류하여 상대적으로 부피(volume)가 작은 아미노산 그룹부터 글리신, 알라닌, 세린; 시스테인, 프롤린, 쓰레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴; 발린, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민; 이소류신, 류신, 메치오닌, 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신의 5군으로 분류할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, "서열번호 1에서 36번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었다"고 기재하는 경우, 서열번호 1에서 36번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신 (isoleucine)을 제외한 아스파라긴 (asparagine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 알라닌 (alanine), 아르기닌 (arginine), 아스파테이트 (aspartate), 시스테인 (cysteine), 글루탐산 (glutamate), 류신(leucine), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 타이로신 (tyrosine), 리신 (lysine), 트립토판 (tryptophan), 발린 (valine), 메티오닌 (methionine) 또는 트레오닌 (threonine)으로 치환되는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원의 "N번 위치"는 N번 위치 및 N번 위치와 상응(Correspoding)하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 구체적으로 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)에서 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 상기 특정 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트를 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메치오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신. 메치오닌, 페닐알라닌. 트립토판, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산의 아스파라긴으로의 치환, 59번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 60번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환, 63번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 79번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산은 극성 아미노산인 세린, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민 중 선택되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산이 류신(L)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산이 류신(L)으로 치환된 변이체일 수 있다.
한편, 당업자라면 당업계에 알려진 서열 얼라인먼트를 통해 임의의 아미노산 서열에서 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산을 파악할 수 있으며, 본 출원에서 별도로 기재하지 않더라도 "특정 서열번호에서 특이적 위치의 아미노산"를 기재하는 경우, 임의의 아미노산 서열에서 그와 "상응하는 위치의 아미노산"까지 포함하는 의미임은 자명하다.
또한 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치, 59번 위치, 60번 위치, 63번 위치, 79번 위치, 92번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 본 출원의 변이체는 서열번호 25 내지 서열번호 31로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 또는, 상기 서열번호 25 내지 서열번호 31로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또는 구체적으로, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질 활성을 불활성화시키기 위해 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 예로, 상기 유전자의 일부 또는 전체를　결손시키는 방법은 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가　결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있다.
상기 유전자　결손　방법에는 유전자 재조합 기술(Genetic recombination technique)에 의한 방법이 포함된다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
구체적으로, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 글루코네이트 리프레서 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 변형된 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 일 예로, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 32 내지 서열번호 38로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 32 내지 서열번호 38로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 본 출원의 변이체의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
또는 구체적으로, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 서열번호 2의 핵산 염기서열이 결손된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 상기 글루코네이트 리프레서 변이체를 숙주에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 포함함으로써, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질을 숙주 세포에서 불활성화시키기 위한 발현 벡터를 포함함으로써, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-아르기닌의 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 방법에 있어서, 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메치오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메치오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서는 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배양물의 온도는 25℃내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-아르기닌은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산 방법은, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 준비하는 단계, 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-아르기닌을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아르기닌을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-아르기닌 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-아르기닌 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 L-아르기닌 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물의 L-아르기닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 코리네박테리움 속 미생물은 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화되지 않은 코리네박테리움 속 미생물에 비하여 L-아르기닌을 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 글루코네이트 리프레서 활성 약화를 위한 벡터 제작
글루코네이트 리프레서 활성 약화를 위하여 각각 서열번호 25 내지 서열번호 31로 표시되는 gntR1(I36N), gntR1(R59A), gntR1(T60L), gntR1(R63A), gntR1(R79A), gntR1(A92L) 변이형을 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주에 삽입하고자 하였다. 이에, 글루코네이트 리프레서 활성 약화를 위한 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 1의 프라이머 쌍 (서열번호 3 및 5, 서열번호 4 및 6, 서열번호 3 및 7, 서열번호 4 및 8, 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 3 및 11, 서열번호 4 및 12, 서열번호 3 및 13, 서열번호 4 및 14, 서열번호 3 및 15, 서열번호 4 및 16) 들을 이용한 PCR 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 각각의 gntR1-I36N, R59A, T60L, R63A, R79A, A92L 변이 서열을 가지는 상동재조합 단편(이하, 각각 "변이 도입 단편 1" 내지 "변이 도입 단편 6")을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
이어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호) 벡터 와 PCR로 증폭된 상기 단편을 염색체 도입용 제한효소 BamHI과 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결하여 각 변이 도입 단편이 삽입된 플라스미드를 제조한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB 고체배지에서 상기 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 각각 상기 변이 도입 단편 1 내지 변이 도입 단편 6을 포함하는 벡터(재조합 플라스미드) pDCM2-gntR1(I36N), pDCM2-gntR1(R59A), pDCM2-gntR1(T60L), pDCM2-gntR1(R63A), pDCM2-gntR1(R79A), pDCM2-gntR1(A92L)를 제조하였다.
No. 명칭 DNA 서열 (5'-3')
서열번호 3 gntR1-AF tcggtacccggggatccAAGCAACCGTCGGCGAG
서열번호 4 gntR1-BR tgcaggtcgactctagaTTTCGGGACGCAGTTTC
서열번호 5 gntR1(I36N)-AR AGCAACCTTGCCACTGtTGATATCTTGACCGAGC
서열번호 6 gntR1(I36N)-BF aCAGTGGCAAGGTTGCTGTCGGAGATACCTTCAAG
서열번호 7 gntR1(R59A)-AR TCGCGTGCCACTGTGgcGGAAATACCAAAACGC
서열번호 8 gntR1(R59A)-BF gcCACAGTGGCACGCGAAGCAATGCGCGCTTTG
서열번호 9 gntR1(T60L)-AR GCTTCGCGTGCCACTagGCGGGAAATACCAAAACG
서열번호 10 gntR1(T60L)-BF ctAGTGGCACGCGAAGCAATGCGCGCTTTGGAGCA
서열번호 11 gntR1(R63A)-AR GCGCGCATTGCTTCGgcTGCCACTGTGCGGG
서열번호 12 gntR1(R63A)-BF gcCGAAGCAATGCGCGCTTTGGAGCAGCTCGGTC
서열번호 13 gntR1(R79A)-AR GTAATGCCAATGCGAgcTGAAGAAGCGACAAGACC
서열번호 14 gntR1(R79A)-BF gcTCGCATTGGCATTACTGTTTTGCCACAGGAAG
서열번호 15 gntR1(A92L)-AR GACTTATCAAAAACAagCCACTCTTCCTGTGGC
서열번호 16 gntR1(A92L)-BF ctTGTTTTTGATAAGTCCATCATTCGCTGGCGTC
실시예 2. KCCM10741P 균주 기반 글루코네이트 리프레서 활성 약화 균주 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가
실시예 2-1. 균주 제작
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P (US 8034602 B2)의 글루코네이트 리프레서 단백질 활성을 약화 시키기 위해 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 플라스미드(pDCM2-gntR1(I36N), pDCM2-gntR1(R59A), pDCM2-gntR1(T60L), pDCM2-gntR1(R63A), pDCM2-gntR1(R79A), pDCM2-gntR1(A92L))를 이용하여 각각 형질 전환시켰다 (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 이어서, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하고, 2차 재조합이 완료된 형질 전환주를 대상으로 프라이머 쌍 (서열번호 3 및 4)을 이용해 PCR을 수행하여 염색체상 gntR1 유전자에 각각의 변이가 도입되었음을 확인하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
상기 형질 전환주를 각각 KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L) 라 명명하였다.
실시예 2-2. L-아르기닌 생산능 평가
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, 상기 실시예 2-1에서 제작된 형질 전환주(각 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화 균주, KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L))들의 L-아르기닌 생산능을 비교하기 위하여 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-아르기닌의 농도를 분석하였다.
하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P와 상기 실시예 1-2에서 제작된 형질 전환주(각 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화 균주)들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종배지와 생산배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.2)>
포도당 20g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.2)>
포도당 60g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg , 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 사용하여 L-아르기닌의 생산능(농도)을 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 2에 나타내었다.
균주명 L-아르기닌 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
대조군 KCCM10741P 2.9 3.0 3.1 3.0
실험군 KCCM10741P-gntR1(I36N) 3.4 3.6 3.5 3.5
KCCM10741P-gntR1(R59A) 3.6 3.3 3.5 3.5
KCCM10741P-gntR1(T60L) 3.4 3.5 3.5 3.5
KCCM10741P-gntR1(R63A) 3.6 3.5 3.0 3.4
KCCM10741P-gntR1(R79A) 3.4 3.7 3.5 3.5
KCCM10741P-gntR1(A92L) 3.6 3.5 3.3 3.5
그 결과, 상기 형질 전환주(각 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화 균주, KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L))들 모두에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 약 17% 증가함을 확인하였다.
실시예 3. CJ1R 균주 기반 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화 균주 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가
실시예 3-1. CJ1R 균주 제작
L-아르기닌 생산능을 가지는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서도 L-아르기닌 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주(ATCC13869)에 1종의 변이(△argR)를 도입하여 L-아르기닌을 생산능을 가진 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 CJ1R을 추가 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 3의 프라이머 쌍 (서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20) 들을 이용한 PCR 및 서열번호 17 및 20의 프라이머 쌍을 이용한 오버랩핑 (overlapping) PCR을 수행하여 argR 결손 변이 서열을 가지는 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
제작된 벡터(재조합 플라스미드)는 pDCM2-△argR 이라 명명하였다.
No. 명칭 DNA 서열 (5’-3’)
서열번호 17 argR-AF tcggtacccggggatccAGCAGGCCTTAAGGGTAAG
서열번호 18 argR-AR AGGGGCGCTGTCTTACCTCGGCTGGTGGGCCAGC
서열번호 19 argR-BF GGTAAGACAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATC
서열번호 20 argR-BR tgcaggtcgactctagaACCGTTGAACTGCTTGCCAG
이어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13869)에 상기 제작된 pDCM2-△argR을 형질 전환시켰으며(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), 이어, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하고, 2차 재조합이 완료된 형질 전환주를 대상으로 프라이머 쌍(서열번호 19 및 22)을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 argR이 결손된 균주를 확인하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다. 상기 형질 전환주를 CJ1R라 명명하였다.
실시예 3-2. CJ1R 균주 기반 글루코네이트 리프레서 활성 약화 균주 제작
CJ1R 균주의 글루코네이트 리프레서 단백질 활성을 약화시키기 위하여 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 실시예 1에서 제작한 벡터가 각각 도입된 변이주를 제작하고, 상기 변이주를 각각 CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L) 라 명명하였다.
실시예 3-3. L-아르기닌 생산능 평가
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R, 상기 실시예 3-2에서 제작된 변이주(각 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화 균주, CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L))들의 L-아르기닌 생산능을 비교하기 위하여 실시예 2-2와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-아르기닌의 농도를 분석하였다.
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 사용하여 L-아르기닌의 생산능(농도)을 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 4에 나타내었다.
균주명 L-아르기닌 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
대조군 CJ1R 2.0 2.2 2.1 2.1
실험군 CJ1R-gntR1(I36N) 2.5 2.7 2.5 2.6
CJ1R-gntR1(R59A) 2.3 2.6 2.8 2.6
CJ1R-gntR1(T60L) 2.6 2.5 2.4 2.5
CJ1R-gntR1(R63A) 2.4 2.4 2.6 2.5
CJ1R-gntR1(R79A) 2.5 2.6 2.7 2.6
CJ1R-gntR1(A92L) 2.5 2.5 2.3 2.4
그 결과, 상기 변이주(각 글루코네이트 리프레서 단백질 활성 약화된 균주, CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L))들 모두에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 약 19% 증가함을 확인하였다.
실시예 4. 글루코네이트 리프레서 활성 약화 균주 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가
실시예 4-1. 균주 제작
글루코네이트 리프레서 활성 약화가 L-아르기닌 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 KCCM10741P 및 CJ1R에 gntR1유전자를 결손시킨 균주를 제작하였다.
구체적으로, 상기 유전자 gntR1의 결손을 위한 재조합 벡터를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 제작하였으며, 벡터 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 5와 같다. 구체적으로, 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 5의 프라이머 쌍 (서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24) 들을 이용한 PCR 및 서열번호 21 및 24의 프라이머 쌍을 이용한 오버랩핑 (overlapping) PCR을 수행하여 argR 결손 변이 서열을 가지는 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
제작된 벡터(재조합 플라스미드)는 pDCM2-△gntR1 이라 명명하였다.
No. 명칭 DNA 서열 (5’-3’)
서열번호 21 gntR1 del-AF tcggtacccggggatccTTGACCGTGACTACACC
서열번호 22 gntR1 del-AR GTATCACGGGTGCCTCTTTAATGGGCCGGTGTAC
서열번호 23 gntR1 del-BF AGAGGCACCCGTGATACGCGCACTGCGTTTGCCA
서열번호 24 gntR1 del-BR tgcaggtcgactctagaGGCTTCGTCAATTACCG
이어서, L-아르기닌을 생산능을 가진 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 KCCM10741P 및 CJ1R 균주에 상기 제작된 pDCM2-△gntR1을 형질 전환시켰으며(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), 이어, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하고, 2차 재조합이 완료된 형질 전환주를 대상으로 프라이머 쌍 (서열번호 21 및 24)을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 gntR1이 결손된 균주를 확인하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다. 상기 형질 전환주를 각각 KCCM10741P-△gntR1, CJ1R-△gntR1라 명명하였다.
실시예 4-2. L-아르기닌 생산능 평가
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, CJ1R 및 상기 실시예 4-1에서 제작된 gntR1 결손 균주(KCCM10741P-△gntR1, CJ1R-△gntR1)들의 L-아르기닌 생산능을 비교하기 위하여 실시예 2-2와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-아르기닌의 농도를 분석하였다.
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 사용하여 L-아르기닌의 생산능(농도)을 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 L-아르기닌 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
대조군 KCCM10741P 3.0 3.0 3.1 3.0
실험군 KCCM10741P-△gntR1 3.3 3.4 3.5 3.4
대조군 CJ1R 2.2 2.2 2.0 2.1
실험군 CJ1R-△gntR1 2.6 2.4 2.5 2.5
그 결과, 상기 gntR1 결손 균주(KCCM10741P-△gntR1, CJ1R-△gntR1)들 모두에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 13% 내지 19% 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism having gluconate repressor protein activity weakened and a method for producing L-arginine using the same <130> KPA211924-KR <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor <400> 1 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 2 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor <400> 2 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcggtacccg gggatccaag caaccgtcgg cgag 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcaggtcga ctctagattt cgggacgcag tttc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agcaaccttg ccactgttga tatcttgacc gagc 34 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acagtggcaa ggttgctgtc ggagatacct tcaag 35 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcgcgtgcca ctgtggcgga aataccaaaa cgc 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccacagtgg cacgcgaagc aatgcgcgct ttg 33 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcttcgcgtg ccactaggcg ggaaatacca aaacg 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctagtggcac gcgaagcaat gcgcgctttg gagca 35 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcgcgcattg cttcggctgc cactgtgcgg g 31 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gccgaagcaa tgcgcgcttt ggagcagctc ggtc 34 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtaatgccaa tgcgagctga agaagcgaca agacc 35 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctcgcattg gcattactgt tttgccacag gaag 34 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gacttatcaa aaacaagcca ctcttcctgt ggc 33 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cttgtttttg ataagtccat cattcgctgg cgtc 34 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tcggtacccg gggatccagc aggccttaag ggtaag 36 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aggggcgctg tcttacctcg gctggtgggc cagc 34 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggtaagacag cgcccctagt tcaaggcttg ttaatc 36 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgcaggtcga ctctagaacc gttgaactgc ttgccag 37 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tcggtacccg gggatccttg accgtgacta cacc 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtatcacggg tgcctcttta atgggccggt gtac 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agaggcaccc gtgatacgcg cactgcgttt gcca 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgcaggtcga ctctagaggc ttcgtcaatt accg 34 <210> 25 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 25 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Asn Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 26 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 26 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Ala Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 27 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 27 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Leu Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 28 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 28 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 29 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 29 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Lys Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 30 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 30 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Ala Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 31 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 31 Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Leu Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 32 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 32 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcaacag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 33 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 33 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttccgccaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 34 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 34 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgccta 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 35 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 35 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcagccg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 36 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 36 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttgaag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 37 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 37 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcagctcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 38 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> gluconate repressor variant <400> 38 atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tggcttgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753

Claims (6)

  1. 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된, 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 L-아르기닌 생산능을 가지는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 L-아르기닌 생산능이 증가된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌의 생산 방법.
KR1020220061012A 2022-05-18 2022-05-18 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 KR20230161245A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220061012A KR20230161245A (ko) 2022-05-18 2022-05-18 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법
PCT/KR2023/004003 WO2023224248A1 (ko) 2022-05-18 2023-03-27 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220061012A KR20230161245A (ko) 2022-05-18 2022-05-18 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230161245A true KR20230161245A (ko) 2023-11-27

Family

ID=88835382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220061012A KR20230161245A (ko) 2022-05-18 2022-05-18 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230161245A (ko)
WO (1) WO2023224248A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014001662B8 (pt) * 2011-07-29 2021-10-05 Mitsui Chemicals Inc Microrganismo produtor de acetil-coa, métodos para produzir acetil-coa, acetona, álcool isopropílicoe e glutamato
JP2016165225A (ja) * 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
KR101640711B1 (ko) * 2015-04-20 2016-07-19 씨제이제일제당 (주) 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023224248A1 (ko) 2023-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102277408B1 (ko) 신규한 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
KR102284730B1 (ko) 신규한 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102277407B1 (ko) 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102274484B1 (ko) 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 알파 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102273639B1 (ko) 신규한 이중기능성 메틸렌테트라히드로폴레이트 탈수소효소/메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102273640B1 (ko) 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 감마 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102277410B1 (ko) 신규한 이중기능성 pyr 오페론 전사조절자/우라실 포스포리보실 전달 효소 변이체 및 이를 이용한 IMP 생산 방법
KR102273638B1 (ko) 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102279696B1 (ko) 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102277409B1 (ko) 신규한 2중기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포밀트랜스퍼라아제/imp 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
KR102267931B1 (ko) 신규한 5-(카르복시아미노)이미다졸리보뉴클레오티드합성효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
KR102284731B1 (ko) 신규한 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102525073B1 (ko) 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR20220069864A (ko) L-글루타민 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
JP2024514138A (ja) Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたｌ－アルギニン生産方法
KR20230161245A (ko) 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법
KR102673796B1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
KR102635860B1 (ko) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법
CN114269909B (zh) 新型可溶性吡啶核苷酸转氢酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法
KR102279137B1 (ko) 신규한 아데닌 포스포리보실기 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
RU2792640C1 (ru) Новый вариант глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и способ получения l-валина с его применением
RU2793368C1 (ru) Новый вариант регулятора транскрипции и способ получения L-валина с его применением
KR102665227B1 (ko) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
KR102619598B1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
EP4056698B1 (en) Novel urease accessory protein variant and method for producing l-valine using same

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal