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KR20230142470A - 동종이계 세포 산물의 T 세포 인식을 완화하기 위한TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 녹다운 또는 녹아웃 - Google Patents

동종이계 세포 산물의 T 세포 인식을 완화하기 위한TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 녹다운 또는 녹아웃 Download PDF

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KR20230142470A
KR20230142470A KR1020237024740A KR20237024740A KR20230142470A KR 20230142470 A KR20230142470 A KR 20230142470A KR 1020237024740 A KR1020237024740 A KR 1020237024740A KR 20237024740 A KR20237024740 A KR 20237024740A KR 20230142470 A KR20230142470 A KR 20230142470A
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KR
South Korea
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cells
cell
nlrc5
engineered immune
tap2
Prior art date
Application number
KR1020237024740A
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English (en)
Inventor
마이클 토마스 베튠
에릭 한스 그쉬웽
블라콤 토마스 존 반
케사 아돌포 소머
마이클 씨 이
Original Assignee
알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

암(예를 들어, 고형 종양 또는 액체 종양) 및 다른 병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하기 위한 조작된 면역 세포 및 이의 집단이 본원에 제공된다. 세포는 RFX5, NLRC5, TAP2, β2m, TRAC, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 기능적으로 발현되도록 조작된다. 세포는, 환자의 종양 세포 또는 다른 손상된 세포를 표적화하기 위해 항원 결합 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체)와 같은 하나의 또는 둘 이상의 추가 단백질을 발현하고/하거나 다른 유전자를 감소된 수준으로 발현하도록 임의로 추가로 조작된다. 또한, 조작된 세포를 제조하고 사용하는 방법, 조작된 세포를 포함하는 조성물 및 키트, 및 상기 세포 및 조성물을 투여함으로써 치료하는 방법이 제공된다.

Description

동종이계 세포 산물의 T 세포 인식을 완화하기 위한 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 녹다운 또는 녹아웃
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/143,748호; 2021년 4월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/176,818호; 및 2022년 1월 21일 출원된 미국 특허 가출원 제63/267,041호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 2022년 1월 27일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 AT-041_04WO_SL.txt이며, 그 크기는 17,262바이트이다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 치료적 응용에 사용하기 위한 조작된 면역 세포(예를 들어 T 세포)의 용도에 관한 것이다.
암 관련 항원을 인식하도록 유전적으로 변형된 면역 세포의 입양 전달은 암 치료에 대한 새로운 접근법으로서의 가능성을 나타낸다(예를 들어, Brenner 등의 문헌[Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010)]; Rosenberg 등의 문헌[Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)] 참조). 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR), 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다(예를 들어, Eshhar 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)] 참조). CAR-T 세포(CAR-T)와 같은 CAR을 함유하는 면역 세포는 표적 세포를 인식하고 죽이는 능력을 유지시키거나 향상시키면서 항원 특이성을 가지도록 조작된다.
그러나, CAR-변형 자가 세포 요법의 생성은 비용이 많이 들고, 몇 주의 프로세스 및 품질 시험이 필요하며, 사용된 환자-특이적 T 세포의 초기 품질 및 양에 따라 가변 효능의 산물을 산출한다. 건강한 공여자 유래의 세포가 CAR로 변형된 다음 다수의 환자에게 투여되는, 동종이계 CAR-변형 세포 요법은 필요 시 즉시 전달될 수 있는 자가 요법보다 더 저렴하고 더 강력한 생성물을 제공할 수 있다(예를 들어, Graham 등의 문헌[Cells 2018, 7, 155; doi:10.3390/cells7100155] 참조). 또한, 동종이계 요법은 바람직한 생성물 특성(예: 유전자 편집 효율, 통합 부위, 유해한 오프 타겟 유전자 편집의 결여, 일배체형 등)에 대한 선택을 가능하게 하고, 보다 정교한 세포 조작(예: 효능, 지속성, 귀환 등을 개선하는 다중 유전자 편집)을 용이하게 한다. 동종이계 CAR-변형 세포 요법을 구현하는 데 있어서 가장 큰 어려움은 환자의 면역 체계(숙주)에 의한 생성물(공여자)의 거부 가능성이다.
CD8+ T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 살해 림프구는 자기로부터 벗어나는 암성 세포, 바이러스 감염된 세포, 및 외래 세포(동종이계 세포 포함)를 식별하고 살해한다. 자가 대 비자기 구별의 중심 결정인자는 모든 유핵 세포의 표면에서 발현되는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자이다. 각각의 MHC 클래스 I 분자는 고도로 다중-대립형질인 MHC 클래스 I 중쇄(이 중 가장 흔한 것은 HLA-A2임), 불변 β2 마이크로글로불린(β2m), 및 내부에서 발현된 단백질 유래의 단백질 분해에 의해 제시된 펩티드로 이루어진 비공유 삼량체 복합체이다. 종합적으로, MHC 클래스 I 분자에는 세포 내에서 발현된 전체 단백질의 다양성을 나타내는 펩티드가 로딩되어 있어서, 암성 세포 및 감염된 세포가 자신들의 위험(distress)을 면역 체계에 ‘알려줄(announce)’ 수 있다. CD8+ T 세포는 각각의 초기 T 세포에 고유한 T 세포 수용체(TCR)로 이들 비-자기 펩티드를 인식하고, 비-자기 펩티드-MHC의 인식에 따라 살해를 개시한다(예를 들어 Dembic, Z. 등의 문헌[Nature 320, 232-238 (1986)] 참조). T 세포에 의한 비-자기 인식은 NK 세포에 의한 ‘결측 자기(missing self)’의 인식에 의해 보완된다: NK 세포 표면 상의 억제 수용체는 MHC의 부재 시 NK 세포 매개 살해를 가능하게 한다(예를 들어,K. Karre 등의 문헌[Nature 319, 675-678 (1986)] 참조)(도 1 및 도 3 참조). MHC 클래스 I 제시의 실험적 용발(MHC 클래스 I의 범용 β2m 성분을 암호화하는 b2m 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 게놈 녹아웃(KO)을 통해 달성됨)은 자가반응 및 동종반응 모두의 맥락에서 강력한 NK 활성화 및 MHC가 결여된 T 세포의 선택적 살해를 유도한다(도 2 참조).
동종이계 세포 요법은 자가 세포 요법에 비해 많은 이점을 나타내지만, 동종이계 세포는 숙주와 구별되는 동종이계 세포 산물의 표면에서 T 및 NK 에피토프 결정 인자와 반응하는 숙주 또는 수용자 면역 체계 세포에 의한 거부 반응을 또한 직면한다. 본 개시는 수용자의 자연 방어에도 불구하고 투여된 세포의 증가된 지속성을 제공하는 개선된 동종이계 요법의 이점을 제공한다.
세포가 도입된 숙주 또는 수용자에 의한 거부반응을 완화시키도록 조작된, 예를 들어 유전적으로 조작된 면역 세포, 숙주 또는 수용자의 면역 체계(예: T 세포 및/또는 NK 세포)에 의한 거부반응 및/또는 인식을 완화시키는 방법, 조작된 세포를 포함하는 조성물 및 집단, 및 이를 사용하여 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시의 면역 세포는 세포에 의한 항원 제시에 참여하는 산물을 가진 2개의 유전자인 NLRC5 및 TAP2 중 하나 또는 둘 다, 또는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상을, 조작되지 않은 상응하는 세포에 비해 감소된 수준으로 기능적으로 발현하도록 조작된다. 조작된 세포는 거부반응에 대한 저항성을 증대시키고/시키거나 치료 효과를 제공하도록 추가로 조작될 수 있고, 예를 들어 세포는 추가 단백질(예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체와 같은 항원 결합 단백질)을 포함하거나 발현하도록 조작될 수 있으며, 여기서 항원 결합 단백질 또는 T 세포 수용체는 조작된 면역 세포를 동족 항원을 발현하는 종양 세포 및/또는 다른 바람직하지 않은 질환 상태 세포로 표적화한다. 따라서, 본 개시는 수용자에서 동종이계 세포의 지속성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NLRC5 및 TAP2 중 하나 또는 둘 다, RFX5 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다, 또는 RFX5 및 TAP2 중 하나 또는 둘 다, 또는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상을 조작되지 않은 세포에 비해 감소된 수준으로 기능적으로 발현하도록 세포를 조작하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상을 감소된 수준으로 기능적으로 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 조작되지 않은 상응하는 면역 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적으로 언급된 감소된 발현 수준은, 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 모두가 녹아웃된 경우 0%이거나; 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 중 하나가 녹아웃되고, 해당 유전자의 다른 하나의 염색체 사본의 발현이 보상적으로 증가하지 않는 경우 50%(조작되지 않은 대조군 면역 세포에서의 수준의 50%)이다. 일부 구현예에서, 세포는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상을 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 90% 이하, 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하의 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 발현 수준은, 상응하는 유전자와 관련하여 상응하게 조작되지 않은 대조군 세포에서의 발현 수준의 0% 내지 90%의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에서의 발현 수준은, 예를 들어 대조군 세포에서의 발현 수준의 10% 내지 90%, 25% 내지 90%, 25% 내지 75%, 10% 내지 50%, 25% 내지 50%, 50% 내지 90%, 또는 50% 내지 75%이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 유전자의 단 하나의 염색체 사본만이 녹아웃되고, 보상 메커니즘이 남은 염색체 사본의 발현 수준을 증가시키거나, 발현의 감소가 유전자 녹아웃 이외의 방법, 예컨대 알려진 녹다운 방법, 예를 들어 다양한 RNA-기반 기술(예: 안티센스 RNA, miRNA, siRNA; 예를 들어 Lam 등의 문헌[Mol. Ther.-Nucleic Acids 4:e252 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.23]; Sridharan 및 Gogtay, Brit.의 문헌[J. Clin. Pharmacol. 82: 659-72 (2016)] 참조) 중 어느 하나를 사용하는 것들에 의해 달성될 때, 0% 또는 50% 이외의 감소된 발현 수준이 수득된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 세포 표면에서, 적절한 대조군에 비해 감소된 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 발현 수준을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 세포는 T 세포, 예를 들어 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 유전자좌 또는 유전자 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이를 포함하고/하거나 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 유전자좌 또는 유전자에서 파괴를 포함하는데, 이는 파괴된 유전자좌 또는 유전자의 기능적 발현을 감소시킨다. 일 구현예에서, 돌연변이 또는 파괴는 유전자 돌연변이 또는 유전자 편집 기술 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 도입되는데, 여기에는 알려진 상동성 재조합 기술; 및 메가뉴클레아제, TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, Cas9, Cas12, 및 MAD7) 중 하나 이상을 사용하는 기술들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 세포, 예를 들어 영장류 세포 또는 비-영장류 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 파괴는 핵산, 예를 들어 세포에서 발현될 하나 이상의 단백질 또는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 녹인함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 핵산은 막 당단백질 UL18(예를 들어 UniProtKB - P08560(UL18_HCMVA) 참조; 접속 주소: https://www.uniprot.org/uniprot/P08560) 및 ADR 중 어느 하나 또는 둘 다를 암호화한다. 다양한 구현예에서, ADR(동종면역 방어 수용체)은 다음 문헌에 개시된 ADR과 같은 성분 또는 도메인을 포함한다: Feiyan Mo 등의 문헌[Nature Biotechnol. (2021) 39(1): 56-63. doi:10.1038/s41587-020-0601-5 (“Mo 등의 2021 문헌”)] 및/또는 미국 특허 공개 제2021/0077530호(2021년 3월 18일) (“‘530 공개”)(이들 모두의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, ADR은 ‘530 공개에 개시된 것과 같은 4-1BB ADR, OX40 ADR, 또는 CD40L ADR이다.
다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포는 항원 결합 단백질을 추가로 발현하며, 예를 들어 조작된 면역 세포는 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되거나, 유전자좌 내에 삽입되어 이를 파괴한다. 다양한 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)이다. 일 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되거나, 유전자좌 내에 삽입되어 이를 파괴한다. 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 게놈 변형, 예를 들어 내인성 CD70 유전자, 내인성 TCRa 유전자, 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 내인성 유전자좌의 변형을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 게놈 변형은 변형을 함유하는 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 부재를 야기한다.
조작된 면역 세포는 임의의 다양한 공급원 유래의 세포로부터 유래될 수 있다. 조작된 면역 세포는 세포로부터, 예를 들어 조작된 면역 세포가 투여될 사람 이외의 사람, 예를 들어 수용자 이외의 공여자(예를 들어 건강한 자원자) 유래의 줄기 세포 또는 면역 세포로부터 제조되거나 유래될 수 있거나; 세포로부터, 예를 들어 조작된 면역 세포가 투여될 사람(수용자) 유래의 줄기 세포 또는 면역 세포로부터 제조되거너 유래될 수 있거나; 하나 이상의 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 면역 세포는 건강한 자원자로부터 수득된 면역 세포이거나, 환자로부터 수득되거나, iPSC로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템과 같은 임의의 유전자 편집 기술을 사용하고/하거나, 임의의 공지된 유전자 녹다운 방법, 예를 들어 다양한 RNA 기반 기술(예를 들어, shRNA, 안티센스 RNA, miRNA, siRNA; 예를 들어, Lam 등의 문헌[Mol. Ther.-Nucleic Acids 4:e252 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.23]; Stridharan 및 Gogtay, Brit.의 문헌[J. Clin. Pharmacol. 82: 659-72 (2016)] 참조) 중 어느 하나를 사용하는 방법 중 어느 하나를 사용해 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항원 결합 단백질(예를 들어 CAR 또는 TCR)을 암호화하는 핵산을 조작된 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하거나 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 조작된 면역 세포의 게놈 내에 도입하는 단계를 포함하거나 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 게놈 변형은 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 기능적 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 파괴하고/하거나 방지한다.
본 개시의 다양한 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 조작된 면역 세포의 표면에서 하나 이상의 HLA 단백질, 예컨대 HLA-A 또는 HLA-B 단백질, 또는 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 하나 이상의 HLA 단백질 및 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되거나, 유세포 계측법에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 발현은, 작동자 세포(예: T 세포)가 존재하는 가운데 조작된 면역 세포 생존의 정도를, 동일한 조건 하에 상응하게 조작되지는 않았지만, 그 외에는 비슷한, 예를 들어 동일한 면역 세포 생존의 정도와 비교하여 측정함으로써 검정된다.
일부 구현예에서, 조작되지 않은 상응하는 세포에 비해 상대적으로 감소된 수준으로 NLRC5 및 TAP2 중 하나 또는 둘 다를 기능적으로 발현하도록 조작된 면역 세포는, HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G, HLA-G 단쇄 삼량체, UL18, UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, HLA-A2 단쇄 삼량체, 인간 거대세포바이러스(HCMV) US11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하고/하거나; β2m, TRAC, CIITA, RFXANK, RFXAP, 및 RFX5를 본원에 기술된 것과 같은 녹아웃 또는 녹다운에 의해 달성된 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 조작된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 제공된 조작된 면역 세포를 포함하는 조작된 면역 세포 집단을 제공한다. 일 구현예에서, 조작된 면역 세포 집단은 104 내지 1010개의 본원에 제공된 조작된 면역 세포를 포함한다. 다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포 집단은 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010개의 본원에 제공된 조작된 면역 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 조작된 면역 세포 집단을 제공하며, 상기 세포의, 예를 들어 75% 이하가 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상을 기능적으로 발현한다. 일 구현예에서, 상기 집단의 세포의 75% 이하가 TAP2를 기능적으로 발현한다. 일 구현예에서, 상기 집단의 세포의 75% 이하가 NLRC5를 기능적으로 발현한다. 일 구현예에서, 상기 집단의 세포의 75% 이하가 RFX5를 기능적으로 발현한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 조작된 면역 세포 집단을 제공하며, 여기서 조작된 면역 세포의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 100%가 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 기능적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 적절한 대조군에 대해, 예를 들어 상응하게 조작되지 않은 상응하는 면역 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적으로 언급된 감소된 발현 수준은, 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 모두가 (예를 들어 TALEN, 징크 핑커, Cas-CLOVER, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 방법에 의해) 녹아웃된 경우 0%이거나; 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 중 하나가 녹아웃되고, 해당 유전자의 다른 하나의 염색체 사본의 발현이 보상적으로 증가하지 않는 경우 50%이다. 일부 구현예에서, 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적으로 언급된 감소된 발현 수준은 0% 내지 90% 또는 0% 내지 90%의 중간에 있는 임의의 2개 값의 범위, 예를 들어 10% 내지 90%, 25% 내지 90%, 25% 내지 75%, 10% 내지 50%, 25% 내지 50%, 50% 내지 90%, 및 50% 내지 75%이다. 이러한 중간 범위 중 하나 이상 내의 값은, 예를 들어, 유전자의 하나의 염색체 사본만이 녹아웃되고, 보상 메커니즘이 남아 있는 염색체 사본의 발현 수준을 증가시키거나, 발현의 감소가 유전자 녹아웃 이외의 방법(예컨대 알려진 녹다운 방법), 예를 들어, 다양한 RNA 기반 기술(예: shRNA, 안티센스 RNA, miRNA, siRNA; 예를 들어 Lam 등의 문헌[Mol. Ther.-Nucleic Acids 4:e252 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.23]; Sridharan 및 Gogtay, Brit.의 문헌[J. Clin. Pharmacol. 82: 659-72 (2016)] 참조) 중 어느 하나를 사용하는 방법들에 달성될 때, 수득된다. 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단의 일부 구현예에서, 조작된 세포의 일부 또는 전부, 예를 들어, 5~10%, 10~25%, 25~50%, 50~90%, 또는 90~100%는 세포 표면에서, 적절한 대조군에 비해 감소된 MHC 클래스 I 단백질 및/또는 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체 발현 수준을 나타낸다.
다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포 집단 또는 면역 세포 집단은 적어도 10% 조작된 T 세포, 적어도 20% 조작된 T 세포, 적어도 30% 조작된 T 세포, 적어도 40% 조작된 T 세포, 적어도 50% 조작된 T 세포, 적어도 75% 조작된 T 세포, 또는 적어도 90% 조작된 T 세포, 또는 100% 조작된 T 세포를 포함한다. 또한, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 또는 100%가 본원에 개시된 것과 같은 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포인 세포 집단이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 항원 결합 단백질을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되고/되거나, 이러한 삽입은 유전자좌를 파괴한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)이다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되고/되거나, 이러한 삽입은 유전자좌를 파괴한다.
소정의 구현예에서, 조작된 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조작된 면역 세포 집단은 사람(예를 들어, 조작된 면역 세포 집단이 투여될 사람 이외의 사람)으로부터 수득된, 예를 들어 수용자 이외의 공여자 또는 건강한 자원자로부터 수득된 하나 이상의 면역 세포로부터 유래되거나; 환자(예를 들어 조작된 면역 세포 집단이 투여될 환자)로부터 수득된 하나 이상의 면역 세포로부터 유래되거나; 하나 이상의 iPSC로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단을 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유전자 편집 기술, 예를 들어 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단의 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및/또는 RFXANK의 기능적 발현 수준 결정하거나 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 기능적 발현 수준은 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA 단백질, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA 단백질과 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되고/되거나, 유세포 계측법에 의해 측정된다.
본원에 기술된 조작된 면역 세포 및 본원에 개시된 조작된 면역 세포의 집단의 다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포 또는 상기 집단의 조작된 면역 세포 중 하나 이상, 예를 들어 집단의 조작된 면역 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, 또는 100%는 HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G, HLA-G 단쇄 삼량체, UL18, UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, HLA-A2 단쇄 삼량체, 및 인간 거대세포바이러스(HCMV) US11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하도록 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 (예를 들어 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해) 추가로 조작된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 것과 같은 조작된 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 것과 같은 조작된 면역 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 조성물의 다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포 또는 집단의 조작된 면역 세포 중 하나 이상, 예를 들어 집단의 조작된 면역 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, 또는 100%는 HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G, HLA-G 단쇄 삼량체, UL18, UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, HLA-A2 단쇄 삼량체, 및 인간 거대세포바이러스(HCMV) US11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하고/하거나; CIITA, RFXANK, RFXAP, 및 RFX5 중 임의의 하나 이상을 발현하지 않거나, 본원에 기술된 것과 같은 녹아웃 또는 녹다운에 의해 달성된 감소된 수준으로 발현한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 환자에서 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 것과 같은 조작된 면역 세포, 본원에 개시된 것과 같은 조작된 면역 세포 집단, 또는 본원에 개시된 것과 같은 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 병태는 고형 종양 및 액체 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 조작된 면역 세포에서 내인성 MHC 클래스 I 단백질의 표면 발현 수준을, 일부 구현예에서, 조작되지 않은 면역 세포에서 내인성 MHC 클래스 I 단백질의 발현 수준의 약 75% 이하로 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현 수준을, 예를 들어 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 약 75% 이하로 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하의 수준으로 TAP2를 기능적으로 발현한다. 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하의 수준으로 NLRC5를 기능적으로 발현한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 세포 표면에서, 적절한 대조군에 비해 감소된 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 발현 수준을 나타낸다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 조작된 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포, 예를 들어 본원에 개시된 조작된 T 세포는 추가 단백질, 예를 들어 외인성 DNA에 의해 암호화된 단백질, 또는 세포의 추가적인 조작에 의해 발현되는 단백질을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 추가 단백질은 항원 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 추가 단백질, 예를 들어 CAR과 같은 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산은 본원에 기술된 방법에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내로 도입되거나, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌는 추가 단백질, 예를 들어 CAR과 같은 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된다.
본원에 개시된 방법의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR) 성분, 예를 들어 TCR α(TCR 알파), TCR β(TCR 베타), TCR γ(TCR 감마), 또는 TCR δ(TCR 델타)이다. 일 구현예에서, TCR 성분을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내로 삽입되거나, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌는 TCR 성분을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된다.
본원에 개시된 방법의 추가 구현예에서, 조작된 면역 세포는 내인성 TCR 알파 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형(예: 녹아웃, 결실, 녹다운, 삽입)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 변형은 변형된 유전자의 기능적 발현을 부분적으로 또는 전체적으로 제거한다. 본원에 개시된 방법의 추가 구현예에서, 면역 세포는 인간으로부터, 예를 들어 세포가 투여될 사람 이외의 공여자로부터, 예를 들어 건강한 자원자로부터 수득된 면역 세포이거나; 환자, 예를 들어 세포가 투여될 환자로부터 수득되거나; iPSC로부터 수득된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단을 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유전자 편집 기술, 예를 들어 TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 세포에서, 예를 들어 면역 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 편집 기술은 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 유전자좌 중 하나 또는 둘 이상에 돌연변이를 도입한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 삽입(예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 삽입, 예를 들어 단백질을 암호화하는 서열의 삽입), 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 결실, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 치환 중 임의의 하나 이상이다.
본원에 개시된 방법의 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA 단백질, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA 단백질과 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되거나, 유세포 계측법에 의해 측정된다. 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 표면 발현 수준의 감소 정도는 유전자 편집되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 상응하는 발현 수준에 대해 상대적으로 결정된다.
본원에 개시된 방법의 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 추가 단백질을 발현하는데, 추가 단백질은 항원 결합 단백질을 포함하는 임의의 원하는 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 CAR을 포함한다. 일 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되거나, 이러한 삽입은 유전자좌를 파괴한다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR) 성분이다. 일 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 또는 RFXANK 유전자좌 내에 삽입되거나, 이러한 삽입은 유전자좌를 파괴한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 파괴된 유전자좌의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 RFX5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 CIITA의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 TCR 성분을 암호화하는 유전자, 예를 들어 TCRa 유전자 및 CD52 유전자 중 하나 이상의 게놈 변형을 조작된 면역 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 예를 들어 MHC 클래스 I에 의해 세포 표면에 제시된 펩티드 다양성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하고, 일부 구현예에서는, 이 수준을 상응하게 변경되지 않은 유사한 세포의 약 90% 이하로 감소시키거나(즉, 100의 대조군 수준과 비교해 적어도 약 10% 내지 약 90 이하로 감소시키거나) 약 75% 이하로 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계는 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLover, 및 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, Cas9, Cas12, 및 MAD7 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 RFX5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 CIITA의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 발현 수준의 감소 정도는 유전자 편집되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 상응하는 발현 수준에 대해 상대적으로 결정된다. 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 동종이계 세포의 T 세포 매개 살해를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조작된 면역 세포(예컨대 조작된 T 세포)에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적으로 언급된 발현 수준을 감소시키며, 감소된 발현 수준은, 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 모두가 녹아웃된 경우 0%이거나; 예를 들어 유전자의 2개의 염색체 사본 중 하나가 녹아웃되고, 해당 유전자의 다른 하나의 염색체 사본의 발현이 보상적으로 증가하지 않는 경우 50%이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적으로 언급된 발현 수준을 0% 내지 90%으로 감소시키거나, 0% 내지 90%의 중간에 있는 임의의 2개 값의 범위로, 예를 들어 10% 내지 90%, 25% 내지 90%, 25% 내지 75%, 10% 내지 50%, 25% 내지 50%, 50% 내지 90%, 및 50% 내지 75%로 감소시킨다. 일부 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계는 유전자 편집 기술, 예를 들어 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 중 임의의 하나 이상 및/또는 하나 이상의 알려진 녹다운 방법, 예를 들어 다양한 RNA 기반 기술(예: shRNA, 안티-센스 RNA, miRNA, siRNA) 중 어느 하나를 사용하는 방법들을 사용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 RFX5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 CIITA의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 발현 수준의 감소 정도는 그렇게 변경 및/또는 조작되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 상응하는 발현 수준에 대해 상대적으로 결정된다.
본원에 개시된 동종이계 세포의 T 세포 매개 살해를 감소시키는 방법의 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정된다. 일 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 표면 발현 수준은 유세포 계측법에 의해 측정된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TCR 성분을 암호화하는 유전자, 예를 들어 TCRa 유전자 및 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 도입하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 동종이계 세포의 T 세포 매개 살해를 감소시키는 방법의 일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 작동자 세포(예: T 세포)가 존재하는 가운데 조작된 면역 세포 생존의 정도를, 동일한 조건 하에 조작되지는 않았지만, 그 외에는 비슷한, 예를 들어 동일한 면역 세포 생존의 정도와 비교하여 측정함으로써 검정된다.
일 양태에서, 본 개시는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 기능적으로 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 다양한 구현예에서, TRAC 및 RFX5는 감소된 수준으로 기능적으로 발현된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내거나; 세포 표면에서 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내거나; 세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내고 세포 표면에서 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
다양한 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 추가 단백질을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 추가 단백질은 항원 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)이다. 소정의 구현예에서, 조작된 면역 세포는 추가 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 단백질을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2, NLRC5, CIITA, RFX5, RFXANK, β2m, 또는 RFXAP 유전자좌 내에 위치하고/하거나 이러한 유전자좌에서 파괴를 야기하거나 생성한다.
다양한 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 내인성 TCRa(TCRα 또는 TCR 알파) 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 포함하거나 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 건강한 자원자 또는 환자로부터 수득된 면역 세포이거나 이로부터 유래되거나, iPSC로부터 유래된다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함한다.
도 1은 동종이계 CAR-T 세포 상의 펩티드-MHC 복합체(가운데) 및 숙주 T 상의 수용체(상단) 및 NK 세포(좌측, 우측, 하단) 간의 상호작용에 대한 비포괄적 예시를 제시한다. TCR을 통해, T 세포는 MHC에 의해 제시된 비-자기 펩티드(도 1에서 “HLA”로 표지됨)를 인식함으로써 외래 세포를 살해한다. 무수히 많은 억제 수용체(KIR2DL 및 KIR3DL, NKG2A, LILRB1)를 통해, NK 세포는 ‘결측 자기(missing self)’를 MHC 상호작용의 부재로서 인식한다. 도 1에서, T 세포 살해가 활성화되는 것은, 동종이계 세포의 HLA 복합체가 외래 항원(좁은 사각형)을 제시하고 T 세포의 TCR/CD3 복합체가 항원을 이물(foreign)로서 인식하기 때문이다. NK 세포 살해가 활성화되지 않는 것은, “결측 자기”가 없기 때문인데, 이는 도시된 바와 같이, 동종이계 세포가 HLA 복합체를 고전적인 HLA, HLA-E, 및 HLA-G(이들 각각은 펩티드를 나타냄)로 제시하기 때문이다.
도 2a~2b. 표면 MHC가 결여된 T 세포는 NK 세포 탈과립화를 유도하고 선택적으로 살해된다. 도 2a: 모넨신(GolgiStop) 및 항-CD107a 항체의 존재 하에 NK 세포를 단독으로 또는 자가 또는 동종이계 T 세포 ± b2m KO와 함께 3시간 동안 인큐베이션한 후, NK 세포의 탈과립화를 측정한 유세포 계측 데이터의 정량화. 도 2b. 시간 경과에 따른, NK 세포와 함께 인큐베이션한 표면 MHC+(b2m WT) 및 표면 MHCneg(b2m KO)의 표적 조성물. 인큐베이션을 시작할 때, b2m WT:b2m KO의 조성은 1:1(50%:50%)이었다. 평균 + SD가 3개의 실험에 대해 도시되어 있다. WT, 야생형. KO, 녹아웃.
도 3은 유핵 포유류 세포에서 MHC 클래스 I 생물생성 경로 및 펩티드 로딩 경로를 도시한다. 다수의 MHC 관련 유전자(MHC 클래스 I, b2m, TAP, 프로테아좀 성분)는 IFN-γ(IFN 감마) 유도성 NLRC5에 의해 전사가 조절된다. MHC 클래스 I 분자에 프로테아좀에 의해 생성된 다양한 펩티드가 로딩되는 지배적인 경로는 TAP-의존적이다. 대안적으로, 신호 펩티드 펩티다아제(SPP)에 의해 유리된, 비교적 적은 수의 다양성이 낮은 신호 펩티드를 프로테아좀 및 TAP와 독립적으로 MHC 클래스 I 분자에 로딩할 수 있다.
도 4a~4b. (HLA-A2+ 공여자 유래 세포의)TAP2 또는 b2m 유전자(도 4a) 및 (HLA-A2- 공여자 유래 세포의) NLRC5 유전자(도 4b)를 CRISPR/Cas9-매개 녹아웃시킨 후, T 세포 표면에서 β2m 수준을 측정하는 가상 채색된 유세포 계측 플롯. KO, 녹아웃.
도 5. IFN-γ에 노출된 유전자 편집된(β2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO) T 세포는 표면 MHC 클래스 I 발현에 있어서 최소 변화를 경험한다. CRISPR/Cas9를 통해 TRAC sgRNA, 및 β2m, TAP2, 또는 NLRC5 sgRNA 중 하나로 일차 T 세포를 편집하고, TCR αβ 고갈에 의해 정제하였다. 그런 다음, 세포를 재조합 IFN-γ로 72시간 동안 치료한 다음, 항-HLA-A, B, C 항체(클론 W6/32)를 사용하여 MHC 클래스 I 발현에 대해 유세포 계측법으로 분석하였다. 3개의 기술적 복제물에 대한 MFI의 평균 + SD가 도시되어 있다. KO, 녹아웃; TRAC, T 세포 수용체 α 상수.
도 6a~6c. β2m, TAP2, 또는 NLRC5가 결여된 T 세포는 T 세포-매개 항원-특이적 살해로부터 보호된다. 도 6a. HLA-A2+ 공여자 유래의 일차 T 세포(각 쌍의 좌측 막대) 또는 HLA-A2- 공여자 유래의 일차 T 세포(각 쌍의 우측 막대)를 CRISPR을 통해 모의, TAP2, 또는 b2m sgRNA로 편집한 다음, BFP-P2A- MART1 항원을 형질도입하였다. 그런 다음, 정제되지 않은 편집된 세포를 72시간 동안 단독으로(작동자 미포함) 또는 MART1-특이적 F5 TCR(작동자)을 형질도입된 자가 작동자 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 데이터를 편집되지 않은(표면 β2m+), 항원 발현(BFP+) 세포에 대해 게이팅하고, 작동자 세포의 존재 시/부재 시 생존한 편집되지 않은 BFP+ 세포 백분율에 대해 도표화하였다(3개의 기술적 복제물에 대한 평균 + SD). 도 6b. 데이터를 편집된(표면 β2mneg), 항원 발현(BFP+) 세포에 대해 게이팅하고, 작동자 세포의 존재 시/부재 시 생존한 편집된 BFP+ 세포 백분율에 대해 도표화한 것 외에는 도 6a에서와 동일한 실험(3개의 기술적 복제물에 대한 평균 + SD). NA, “KO 없음” 대조군에는 편집된 세포가 없기 때문에 해당 없음. 도 6c. 도 6a 및 도 6b에서와 유사하지만, NLRC5 KO를 추가하여 독립적으로 수행한 실험. 데이터를 편집된(표면 β2mneg), 항원 발현(BFP+) 세포에 대해 게이팅하고, 작동자 세포의 존재 시/부재 시 생존한 편집된 BFP+ 세포 백분율에 대해 도표화하였다(2개의 기술적 복제물에 대한 평균 + SD). NA, “KO 없음” 대조군에는 편집된 세포가 없기 때문에 해당 없음; KO, 녹아웃.
도 7: b2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO는 T 세포 동종반응성을 완화시킨다. 범 T 세포를 단리하고, TRAC KO 및 b2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO에 대해 유전자 편집하고, 조사된 표적 PBMC에 대해 프라이밍된 작동자 범 T 세포와 함께 1주일 동안 공동 인큐베이션하였다. 48시간 동안 1:1 E:T 비율로 공동 인큐베이션한 후, 유세포 계측법을 통해 생존한 표적을 계수하였다. 생존율(%)을 부피/시간 획득이 고정된 상태에서 지속 표적의 절대 수로서 계산하고, 작동자가 없는 조건에 대해 정규화한다. 각 작동자 공여자에 대한 2~3개의 기술적 복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다. 3명의 동종이계 공여자를 시험하였다.
도 8a~8c. TAP2 KO 및 NLRC5 KO T 세포는 b2m KO T 세포보다 NK-매개 살해에 덜 취약하다 TRAC KO 및 b2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO가 되도록 편집한 범 T 세포를, 1000 U/mL IL-2의 존재 하에 동종이계 NK 세포와 함께 0:1, 1:1, 또는 5:1 NK:T 세포의 비율로 72시간 동안 공동 인큐베이션하였다. 유세포 계측법에 의해 생존 표적을 계수하였다. 도 8a. 표시된 조건 하에 생존한 표적 T 세포를 나타내는 가상 채색한 유세포 계측 플롯. 데이터는 단일 동종이계 공여자 유래의 NK 세포와 인큐베이션한 후의 데이터이다. 도 8b. 표면 b2m 음성인(즉, b2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO) 생존 세포 백분율 측정치를 NK 작동자 세포가 결여된 조건에 대해 정규화함. 4개의 데이터포인트의 평균 ± SD가 도시되어 있다(2개의 동종이계 NK 공여자 각각에 대한 2개의 기술적 복제물). 도 8c. 도 8b의 실험에서 T 세포에 대한 표면 β2m 염색의 대표적인 히스토그램. NK1054 및 NK1241은 2개의 동종이계 NK 공여자이다. 수직 점선은 TRAC KO T 세포(MHC 관련 변형 없음)에 대한 표면 β2m의 평균 형광 강도에 근접하며, 히스토그램 플롯에 걸쳐 시각적 기준으로서 포함된다. Coinc, 공동 인큐베이션; KO, 녹아웃;
도 9a~9b. 개시된 유전자 편집 전략의 예비 제조 가능성 평가. 도 9a. β2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO와 조합하여 TRAC KO에 대해 편집된 일차 T 세포 유전자에 10G1K DLL3 CAR을 편집되지 않은 세포와 유사한 속도로 형질도입할 수 있다. 범 T 세포를 CRISPR/Cas9를 통해 유전자 편집하고 렌티바이러스를 형질도입하여 DLL3 CAR 발현을 가능하게 하였다. 형질도입 효율은 CAR 렌티바이러스 벡터 상에서 공동 발현된 BFP 리포터 유전자를 발현하는 세포의 백분율에 대한 플로우에 의해 결정하였다. 도 9b. 조작된 CAR T 세포의 증식을 ViCell 세포 계수기를 이용해 생존 세포를 계수하고, 이를 0일차의 초기 시딩 밀도에 대해 정규화하여 결정하였다.
도 10a~10c. NLRC5 KO는 DLL3 CAR 매개 세포독성을 손상시키지 않는다 도 10a. DLL3high-발현 WM266.4 종양 세포 및 DLL3low-발현 DMS273 종양 세포(도 10b)의 단기 살해. 항-DLL3 CAR+ T 세포의 E:T 비율을 달리하여 라이브 셀 이미징(live cell imaging)을 통해 생성한 종양 세포 성장 곡선. 도 10c. DLL3high-발현 WM266.4 종양 세포의 연속 살해. 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 11a~11b. RFX 복합체 KO에 대한 sgRNA의 스크리닝. 이중 MHC-I/II 하향조절에 대한 RFX5 KO의 확인. 유전자 편집 후 7일차에 유세포 계측법에 의해 평가한 MHC-I(도 11a) 및 MHC-II(도 11b)의 평균 형광 강도(MFI).
도 12a~12b. MHC-I/II 발현의 하향조절. 3개의 독립적인 T 세포 공여자에 대해 유전자 편집 후 5일차에, 유세포 계측법에 의해 평가한 유전자 편집된 T 세포에서의 MHC-I(도 12a) 및 MHC-II(도 12b)의 평균 형광 강도. 생물학적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 13a~13b. 면역 회피 T 세포의 성장. 도 13a. 3명의 독립적인 공여자에서 TRAC KO +/- 면역 회피 KO 변형을 갖는 T 세포의 증식. 2일차에 유전자 편집된 세포 수 대비 배수 증식. 2개의 기술적 복제물에 대한 평균 ± SD가 도시되어 있다. 도 13b. IL-2의 부재 시 이식편 T 세포의 성장. 20K 세포를 20 IU/mL IL-2와 함께 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 4일차에, IL-2 없이 배지를 교환하였다. 그 후 2~3일마다 배지를 재공급하였다. 6개의 기술적 복제물에 대한 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 14a~14c. MHC-I/II 발현의 하향조절은 T 세포 동종반응성을 완화시킨다. 2명의 동종이계 공여자 유래의 T 세포를 이식편 공여자 유래의 조사된 세포에 대해 1주 동안 프라이밍하였다. 그 이후, CD4+ 세포(도 14a), CD8+ 세포(도 14b), 또는 범 T 세포(도 14c)를 정제하고 이식편 T 세포와 함께 48시간 동안 1:1 E:T 비율로 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 단방향 살해를 유세포 계측법으로 평가하였다. 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다. 생존(%) = 세포 수 /(작동자가 없는 세포 수) x 100. 이식편 세포를 편집하여 KO 세포(TRAC, β2m, NLRC5, 또는 RFX5)를 만들고, KO 이식편 세포를 프라이밍된 CD4+, CD8+, 및 범 T 세포와 함께 공동 배양하였다. 프라이밍된 T 세포와의 공동 배양에서 생존한 이식편 KO 세포의 수를 결정하였다. TRAC KO 세포보다 유의하게 높은 비율의 RFX5 KO 세포가 프라이밍된 세포와의 공동 배양에서 생존하였다.
도 15a~15b. NLRC5 KO 및 RFX5 KO T 세포는 동종이계 NK 세포에 의해 최소로 살해된다. 도 15a. NK 세포를 동종이계 PBMC로부터 단리하고, 1000 IU/mL IL-2의 존재 하에 이식편 T 세포와 함께 1:1 E:T 비율로 48시간 동안 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 단방향 살해를 유세포 계측법으로 평가하였다. 유래의 이식편 세포를 편집하여 KO(TRAC) 또는 이중 KO(TRAC + β2m, NLRC5, 또는 RFX5 중 하나)를 만들고, KO 이식편 세포를 NK 세포와 공동 배양하였다. NK 세포와의 공동 배양에서 생존한 이식편 KO 세포의 수를 결정하였다. TRAC+NLRC5 KO 세포의 약 절반 이상 및 TRAC+RFX5 KO 세포의 약 절반 이상이 NK 세포와의 공동 배양에서 생존하였다. 생물학적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다. NK 세포는 3개의 상이한 공여자 유래의 PBMC로부터 수득하였다. 각각의 데이터포인트는 이들 공여자 중 하나 유래의 세포에 의한 살해를 나타낸다. 생존(%) = 세포 수 /(작동자가 없는 세포 수) x 100. 도 15b. allo-PBMC를 이식편 T 세포와 함께 10:1 E:T 비율로 7일 동안 공동 배양한 후 동종이계 NK 세포의 증식. 6개의 생물학적 복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다. 데이터는 TRAC KO +/- RFX5 KO 또는 NLRC5 KO가 유의한 NK 세포 증식을 유도하지 않음을 나타낸다. 유전자 편집된 이식편 세포와 공동 배양한 후 동종이계 NK 세포 수를 측정하고, 이식편 세포가 없는 상태에서의 세포 수와 비교하였다. 1배 변화란 NK 세포가 본질적으로 활성화/증식되지 않았음을 의미한다. 이 검정에서, PBMC를 이식편 T 세포와 함께 배양하고, NK 세포를 NK-특이적 마커에 기초하여 계수하였다. *:p<0.05; ****:p<0.001, 일원 ANOVA Holm-Sidak.
도 16. 2명의 공여자 중 어느 하나로부터 유래된 동종이계 PBMC와 공동 배양한 후, 다양한 유전자 녹아웃(KO)을 보유한 이식편 T 세포의 생존. 동종이계 PBMC를 다양한 유전자 편집 변형(TRAC KO 단독 또는 β2m ,NLRC5, 및 RFX5 중 하나의 KO)을 함유하는 TRAC KO 이식편 T 세포와 함께 10:1의 E:T 비율로 9일 동안 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존을 유세포 계측법에 의해 결정하고 아무런 작동자 없이 배양한 이식편 T 세포에 대해 정규화하였다. 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 17a~17d. US11 과발현은 동종반응성 T 세포 회피를 향상시킨다. 도 17a. US11 과발현은 MHC-I 발현을 감소시키며, NLRC5 KO와 조합되어 MHC-I 수준을 상당히 감소시킬 수 있다. 도 17b. US11 과발현은 프라이밍된 동종반응성 T 세포에 의한 살해를 완화시킨다. US11은 NLRC5 KO와 조합되어 살해를 추가로 감소시킬 수 있다. 이식편 세포를 프라이밍된 T 세포와 함께 1:1 E:T 비율로 48시간 동안 배양하고, 유세포 계측법에 의해 생존을 결정하였다. 시험한 3명의 공여자에 대한 평균 ± SD가 도시되어 있다. 도 17c. US11 과발현은 NK 정밀 조사를 최소한으로 증가시킨다. NLRC5 KO와 조합될 때, NK 반응성이 증가하지만 b2m KO와 같은 정도로 증가하지는 않는다. 이식편 세포를 동종이계 NK 세포 및 1000 IU/mL IL-2와 함께 1:1 E:T 비율로 48시간 동안 배양하고, 유세포 계측법에 의해 생존을 결정하였다. 시험한 3명의 공여자에 대한 평균 ± SD가 도시되어 있다. 도 17d. US11 및 US11 + NLRC5 KO T 세포는 TRAC KO 단독보다 더 잘 유지된다. 이식편 세포를 동종이계 PBMC 세포 및 20 IU/mL IL-2와 함께 10:1 E:T 비율로 9일 동안 배양하고, 유세포 계측법에 의해 생존을 결정하였다. 시험한 3명의 공여자에 대한 평균 ± SD가 도시되어 있다. 생존(%) = 세포 수 /(작동자가 없는 세포 수) x 100.
도 18은 HCMV US11을 암호화하는 렌티바이러스 벡터(LVV)를 도시한 개략도이다.
도 19a~19b. 유전자 편집된 T 세포를 다양한 농도의 재조합 IFN-γ와 함께 72시간 동안 배양하였다. MHC-1(도 19a) 및 MHC-II(도 19b)의 표면 발현을 유세포 계측법으로 평가하였다. MHC-I 및 MHC-II 발현의 변화를 비히클(0 U/mL IFN-γ)에 대해 상대적으로 결정하였다. 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 20a~20d. 스텔스-변형 CD19 CAR T 세포의 생성 및 분석. TRAC KO ± 추가 스텔스 변형을 갖는 CD19 CAR+ 세포의 백분율은 도 20a에 도시되어 있다. 대조군: TRAC KO CD19 CAR T 세포; NTD: TRAC KO 형질도입되지 않은 T 세포. 제조하는 동안 세포 증식의 동역학은 도 20b에 도시되어 있다. n = 4명의 공여자의 평균 ± SD. 대조군: TRAC KO CD19 CAR T 세포; NTD: TRAC KO 형질도입되지 않은 T 세포. 하나의 대표적인 공여자의 CD4/CD8 비율은 도 20c에 도시되어 있다 하나의 대표적인 공여자의 T 세포 메모리 표현형은 도 20d에 도시되어 있다.
도 21a~21b. 동종이계 PBMC와의 공동 배양 후, 숙주 CD8 T 세포의 증식 및 다양한 KO를 가진 이식편 CD19 CAR T 세포의 생존. 5개의 고유 이식편/PBMC 쌍이 도시되어 있다. 동종이계 PBMC를 다양한 유전자 편집 변형(TRAC KO 단독 또는 β2m ,NLRC5, RFX5, 또는 CIITA 중 하나의 KO)을 함유하는 TRAC KO CD19 CAR T 세포와 함께 10:1의 E:T 비율로 9일 동안 공동 배양하였다. 숙주 CD8 T 세포의 증식(도 21a)를 항-CD8 항체(BioLegend, Cat # 344709) 및 항-HLA-A2 항체(BioLegend Cat #343326)를 사용하여 유세포 계측법에 의해 결정하고, 이식편 세포 없이 배양된 PBMC에 대해 정규화하였다. 이식편 CAR T 세포의 생존(도 21b)을 유세포 계측법에 의해 결정하고, 작동자 세포 없이 배양한 이식편 CD19 CAR T 세포에 대해 정규화하였다. 5쌍에 대한 각각의 고유한 PBMC/이식편 쌍을 나타내는 개별 점과 평균 ± SEM이 도시되어 있다.
도 22a~22c. 다양한 유전자 녹아웃(KO)을 갖는 CD19 CAR T 세포의 지속성 및 항종양 효능을 생체 내에서 동종이계 T 세포 거부반응 모델에서 평가하였다. 다양한 유전자 편집 변형(TRAC KO 단독 또는 β2m ,NLRC5, 또는 RFX5 중 하나의 KO)을 갖는 CD19 CAR T 세포를, 동종이계 공여자 유래의 인간 T 세포 및 Raji 종양 세포를 이전에 이식한 NSG 마우스에게 주입하였다(도 22a). 말초 혈액에서 CAR T 세포의 지속성(도 22b) 및 항종양 효능(도 22c)을 유세포 계측법 및 총 신체 생물발광에 의해 각각 결정하였다. NT: TRAC KO가 형질도입되지 않은 T 세포. 평균 ± SEM이 도시되어 있다.
도 23a~23c. 다양한 유전자 녹아웃(KO)을 갖는 이식편 T 세포의 NK 세포 거부반응을 동계 마우스 모델에서 평가하였다(도 23a). 시험관 내에서 증식시킨 대조군(편집되지 않음) 마우스 T 세포 또는 유전자-편집된(β2m 또는 NLRC5 KO) 마우스 T 세포를 숙주 NK 세포가 고갈되었거나 고갈되지 않은 동계 숙주 마우스에게 주입하였다. 말초 혈액 내 이식편 T 세포를 유세포 계측법에 의해 CD45.1-CD45.2+ T 세포로서 식별하였다. MHC-1의 표면 발현(도 23a) 및 이식편 세포의 생존(도 23c)에서 평가하였다.
본 개시는, 수용자의 면역 체계에 의한 거부 반응을 유발하지 않거나, 감소된 정도로 유발하는 치료 동종이계 세포 산물을 제공하기 위한 유전자 편집 전략을 제공한다. 이는 세포 산물이 수용자에서 더 오래 지속되도록 하여 치료 효과를 촉진 및/또는 개선한다. 본 전략은 세포 표면에서 MHC 수준을 최소로 교란함과 동시에 동종이계 세포 산물에 의해 제시된 펩티드의 다양성을 최소화한다. 이는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC , CIITA , RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 게놈 녹아웃을 통해 달성되며, 이의 생성물은 세포에 의해 펩티드 제시로 기능한다.
본 개시의 일 양태에서, 유전자 편집 표적은 항원 처리와 연관된 수송체(TAP)의 TAP2 성분이다. MHC 클래스 I 분자에 펩티드가 로딩되는 지배적인 경로는 TAP-의존적이다: 프로테아좀(또는 IFN-γ-유도성 면역프로테아좀)에 의해 생성된 펩티드는 TAP를 통해 소포체(ER)로 유입된 다음 MHC 클래스 I에 로딩된다. 신호 펩티드로부터 실질적으로 유래된 소수의 펩티드는 대안적인 TAP- 및; ER-상주 신호 펩티드 펩티다아제에 의한 신호 서열 절단에 따른 프로테아좀-독립 경로를 통해 로딩된다. β2m KO 세포의 표면 β2m이 상당히(10~100배) 감소한 것에 비해, TAP2를 녹아웃하면 표면 β2m이 적당히 감소한다(KO 세포의 경우, 선택 후 2배 감소)(도 4a 참조).
본 개시의 제2 양태에서, 유전자 편집 표적은 NLR 카스파제 동원 도메인 함유 5(NLRC5)로 불리는 뉴클레오티드-결합 도메인 및 류신-풍부 반복 함유 수용체(NLR) 계열의 구성원이다. NLRC5의 CRISPR/Cas9-매개 녹아웃은 표면 β2m의 수준을 2.5배 감소시킨다(도 4b 참조).
본원에 개시된 유전자 편집 전략은 놀랍게도, 수용자의 T 세포 반응으로 인한 세포 사멸을 충분히 감소시킬 정도로 펩티드 디스플레이를 감소시킴과 동시에, 수용자의 NK 세포에 의한 살해가 유발될 정도로 많이 펩티드 디스플레이를 감소시키지는 않는다. 따라서, 본원에 제공된 전략은 동종이계 CAR-T 요법 및 다른 동종이계 세포 요법에서의 상당한 진전을 나타낸다. 본원에 제공된 유전자 편집 전략은 MHC 클래스 I 제시를 억제하는 NLRC5 녹아웃 효과가 IFN-γ의 존재 여부와 상관없이 발생하게 된다는 추가의 이점을 부여한다. 이러한 결론은 IFN-γ-유도성 MHC 클래스 I 상향조절이 NLRC5에 따라 달라진다는 소견에 의해 뒷받침된다.
일반 기술
본 개시의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당 기술분야의 기술 범위 내에 있는, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller 및 M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, TALEN, CRISPR/Cas9, 및 megaTAL 뉴클레아제를 사용하는 유전자 편집 기술은 당업자의 기술 범위 내에 있으며, T. Gaj 등의 문헌[Genome-Editing Technologies: Principles and Applications, Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8:a023754] 및 그 안에 인용된 문헌 등에 충분히 설명되어 있다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, “자가(autologous)”는 대상체를 치료하는 데 사용되는 세포, 세포주, 또는 세포 집단이 상기 대상체로부터 수득됨을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “동종이계(allogenic)”는 대상체를 치료하는 데 사용되는 세포 또는 세포 집단이 상기 대상체로부터 수득되는 것이 아니라 대신에 공여자로부터 수득됨을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “내인성”은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 유래하거나 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “외인성”은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입되거나 그 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “면역 세포”는 선천적 및/또는 적응적 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 관여하는 조혈 유래 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 조절 T(Treg) 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수 유래 식세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “발현”은 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “발현 벡터”는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포좀에 함유된 것) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 당업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
본 개시의 조작된 면역 세포는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상을 본원에 기술된 것과 같이 감소된 수준으로 (예를 들어 기능적으로) 발현하고, 임의로 추가 특징을 추가로 포함한다. 예를 들어, 이들은 본원에 기술된 기술에 의해 세포 내로 도입된 항원 결합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산으로부터 항원 결합 단백질을 기능적으로 발현할 수 있고/있거나, 이들은 예를 들어 외인성 유전자에서 게놈 변형, 예를 들어 유전자의 기능적 발현을 감소시키거나 제거하는 TCRa 및/또는 CD52와 돌연변이를 포함할 수 있고/있거나, 이들은 본원에 기술된 기술에 의해 세포 내로 도입된 항원 결합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산으로부터 하나 이상의 추가 단백질을 발현할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 개시의 조작된 면역 세포는 다양한 공급원으로부터 수득된 세포(예: 면역 세포)로부터 유래될 수 (예를 들어 제조될 수) 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자를 “기능적으로 발현하는 것”은 것은 유전자가 발현되고 그 발현이 작용성 유전자 최종 산물을 생성함을 의미한다. 예를 들어, 유전자가 단백질을 암호화하는 경우, 유전자의 발현이 궁극적으로 적절하게 기능하는 단백질을 생성하는 경우, 세포는 유전자를 기능적으로 발현하는 것이다. 따라서, 유전자가 전사되지 않거나, 유전자의 발현이 궁극적으로 번역되지 않은 RNA를 생성하거나, 번역으로 인해 비기능적인 단백질이 생산되거나, 예를 들어 단백질이 정확하게 접히지 않거나, 예를 들어 작용 부위에(예를 들어, 막-결합 단백질의 경우 막에) 수송되지 않는 경우, 유전자는 기능적으로 발현되지 않는다. 기능적 발현은 (예를 들어, 유전자 산물 자체에 대한 검정에 의해) 직접적으로 측정되거나 (예를 들어, 유전자 산물의 효과에 대한 검정에 의해) 간접적으로 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “작동가능하게 연결된”은, 하나의 기능이 다른 하나의 핵산 단편에 의해 영향을 받도록 하는, 하나의 핵산 단편 상의 핵산 서열의 연관성을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있는 경우) 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “발현 조절 서열”은 핵산의 전사를 유도하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터, 예컨대 구성 프로모터 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
“프로모터” 및 “프로모터 서열”은 상호교환적으로 사용되며 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 대체적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3’에 위치한다. 당업자는, 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시의 벡터 중 어느 하나에서, 벡터는 본원에 개시된 프로모터를 선택적으로 포함한다.
“숙주 세포”는 폴리뉴클레오티드 삽입체의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 (형태학적 또는 게놈 DNA 보체에서) 반드시 원래 부모 세포와 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 개시의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “세포외 리간드 결합 도메인”은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 식별하도록 선택될 수 있다. 용어 “줄기 도메인”은 막관통 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 줄기 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 더 높은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다.
용어 “세포내 신호 전달 도메인”은 효과기 신호 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “공자극 분자”는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 이에 한정되지는 않으나 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA, 및 Toll 리간드 수용체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 공자극 분자의 예는 CD27, CD28, CD8, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
“공동 자극 리간드”는 T 세포 상의 동족 공동 자극 신호 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 제공되는 일차 신호에 더하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상의 분자를 지칭한다. 공동 자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1 BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1 CB, HVEM, 림프독소 β 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특히, T 세포에 존재하는 보조 자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체는 CD27, CD28, 4-1 BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
“항체”는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 온전한 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라 그의 항원-결합 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv), 및 예를 들어 제한 없이 단일 사슬(scFv) 및 도메인 항체(예를 들어, 상어 및 낙타 항체를 포함함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체는 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 임의의 클래스의 항체를 포함하며, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 배정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 같이 하위클래스(이소형)으로 더 세분화될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 “항원 결합 단편” 또는 “항원 결합 부분”은 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 온전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 “항원 결합 단편”이라는 용어 내에 포함된 결합 단편의 예는 Fab; Fab’; F(ab’)2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체(dAb) 단편(예를 들어 Ward 등의 문헌[Nature 341:544-546, 1989] 참조), 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
항체, 항체 접합체, 또는 표적에 “특이적으로 결합하는” 폴리펩티드는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 분자는, 대체 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더 큰 친화도로 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 경우 “특이적 결합”을 나타내는 것으로 지칭된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 용이한, 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우, 항체는 표적에 “특이적으로 결합한다”. 또한, 본 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, “특이적 결합”은 (포함할 수 있지만) 배타적 결합을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
항체의 “가변 영역”은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역이라고도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 골격 영역(FR)으로 구성된다. 각 사슬의 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 다음과 같은 여러 기술이 있다: 종간 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani 등의 문헌[1997, J. Molec. Biol. 273:927-948]), Chothia 시스템(즉, Chothia and Lesk의 문헌[J. Mol. Biol. (1987) 196(4):901-917]. 본원에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법 중 하나 또는 두 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
가변 도메인의 “CDR”은 가변 영역 내의 아미노산 잔기로서, Kabat, Chothia의 정의, Kabat 및 Chothia 모두의 축적, AbM, 접촉, 및/또는 형태적 정의, 또는 당업계에 잘 알려진 임의의 CDR 결정 방법에 따라 식별된다. 항체 CDR은 Kabat 등에 의해 본래 정의된 초가변 영역으로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Kabat 등의 문헌[1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 Chothia 등에 의해 본래 기술된 구조적 루프 구조로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Chothia 등의 문헌[Nature 342:877-883, 1989]을 참조한다. CDR 식별에 대한 다른 접근법은, Kabat과 Chothia 간의 절충이며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(현재 Accelrys®)를 사용하여 유도되는 “AbM 정의”, 또는 MacCallum 등의 문헌[J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 기술된 관찰된 항원 접촉에 기반한 CDR의 “접촉 정의”를 포함한다. CDR의 “형태적 정의”로서 본원에서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피적으로 기여하는 잔기로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Makabe 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, 283:1 156-1 166, 2008]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 전술한 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들은 특정 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견을 고려하여 단축되거나 길어질 수 있지만, 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법의 조합을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 임의의 이러한 접근법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나를 초과하는 CDR을 함유하는 임의의 주어진 구현예에 대해, CDR은 Kabat, Chothia, 연장된, AbM, 접촉, AHo, 및/또는 형태적 정의 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다.
본 개시의 항원은 당업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술 또는 당업계에 쉽게 알려진 다른 기술의 조합(예를 들어, Jayasena, S.D.등의 문헌[ClinChem., 45: 1628-50, 1999 및 Fellouse, F.A. 등의 J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007]을 참조)을 사용하여 생산될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 바와 같은, “폴리뉴클레오티드” 또는 “핵산”은 임의의 길이의 뉴클레오티드 사슬을 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 사슬에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 사슬의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어, “캡”, 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 예를 들어, 전하가 없는 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트, 등) 및 하전된 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)과 같은 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신, 등)등과 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들, 삽입제(예: 아크리딘, 소랄렌, 등)를 가지는 것들, 킬레이트제(예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속, 등)을 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 연결(예를 들어, 알파 아노머 핵산, 등)을 가지는 것들뿐 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태도 포함된다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스폰산염기, 인산염기로 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 추가 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합을 준비하기 위해 활성화되거나, 고형 지지체에 접합될 수 있다. 5’ 및 3’ 말단 OH는 인산화되거나, 1 내지 20개의 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실도 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, 2’-O-메틸-, 2’-O-알릴, 2’-플루오로- 또는 2’-아지도-리보오스, 카르보환 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피메화 당류, 에컨대, 아라비노오스, 자일로오스 또는 릭소오스, 피라노오스 당류, 퓨라노오스 당류, 세도헵툴로오스, 비순환 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 무염기 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 당업계에 일반적으로 알려진 리보오스 또는 데옥시리보오스 당류의 유사체 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 인산디에스테르 결합은 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는, 이에 제한되지는 않으나, 인산염이 P(O)S(“티오에이트”), P(S)S(“디티오에이트”), (O)NR2(“아미데이트”), P(O)R, P(O)OR’, CO 또는 CH2(“포마세탈”)로 치환되는 구현예를 포함하고, 여기서 각각의 R 또는 R’는 독립적으로 H 또는 치환되거나 미치환된 알킬(1-20C)(선택적으로, 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 또는 아랄딜을 함유함)이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “형질감염”은 세포에 의한 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA의 흡수를 지칭한다. 세포는 이러한 RNA 또는 DNA가 세포 내부에 도입되었을 때, 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의해 “형질감염”된다. 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화에 영향을 미칠 때, 세포는 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의해 “형질전환”된다. 형질전환 RNA 또는 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합(공유 결합)될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “형질전환”은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 내로 전달되어 유전적으로 안정적인 유전을 초래하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 “유전자이식” 또는 “재조합” 또는 “형질전환된” 유기체로서 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “실질적으로 순수한” 물질은 적어도 50% 순수(즉, 오염물이 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다. 항체와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “경쟁”은 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 부분)이 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합함으로써, 제2 항체의 부재 시 제1 항체의 결합에 비해 동족 에피토프에 대한 제1 항체의 결합의 결과가 제2 항체의 존재 시에 검출 가능하게 감소된다는 것을 의미한다. 제2 항체의 에피토프에 대한 결합이 제1 항체의 존재 시에 또한 검출 가능하게 감소될 수도 있는 대안이 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는 제2 항체가 그의 각각의 에피토프에 대한 제1 항체의 결합을 억제하지 않고서 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 그의 동족 에피토프 또는 리간드와 다른 항체의 결합을 검출 가능하게 억제하는 경우, 동일하거나, 더 크거나, 더 적은 정도이든 간에, 항체는 그들 각각의 에피토프(들)에 결합하기 위해 서로 “교차 경쟁”하는 것으로 언급된다. 경쟁 항체와 교차 경쟁 항체 모두는 본 개시에 포함된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 발생하는 메커니즘(예를 들어, 입체 장애, 구조 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부에 대한 결합)에 상관없이, 당업자는 본원에 제공된 교시에 기초하여 이러한 경쟁 및/또는 교차 경쟁 항체가 본원에 개시된 방법에 포함되고 유용할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “치료”는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 개시의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 이에 제한되지는 않으나, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 신생물 또는 암세포의 증식을 감소(또는 파괴), 신생물 세포의 전이를 억제, 종양의 크기를 축소하거나 감소, 질환(예를 들어, 암)의 관해, 질환(예를 들어, 암)으로 인한 증상의 감소, 질환(예를 들어, 암)을 앓고 있는 이들의 삶의 질 증가, 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 데 필요한 다른 약물의 투여량을 감소, 질환(예를 들어, 암)의 진행의 지연, 질환(예를 들어, 암)의 치유, 및/또는 질환(예를 들어, 암)을 갖는 대상의 생존 연장.
“개선(ameliorating)”은 치료를 투여하지 않는 것과 비교했을 때 하나 이상의 증상이 완화 또는 개선되는 것을 의미한다. “개선”은 또한 증상의 지속시간을 단축시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 “유효 투여량” 또는 “유효량”은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 예방적 사용을 위해, 유익하거나 바람직한 결과는, 질환의 발생 동안 나타나는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는, 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 중증도를 완화시키는 것, 또는 질환의 시작을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 사용을 위해, 유익하거나 원하는 결과는 다양한 질환 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상의 발생을 감소 또는 다양한 질환 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상의 개선, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 약물의 투여량의 감소, 다른 약물의 효과의 향상 및/또는, 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 유효 투여량은 직접적 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 유효 투여량은 다른 약물, 화합물 또는 약학적 조성물과 함께 달성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, “유효 투여량”은 하나 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우, 단일 제제는 유효량으로 투여되는 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “대상체”는 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 원숭이이다. 포유류는, 농장 동물, 스포츠 동물, 반려동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 예시적인 일 구현예에서, 대상체는 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “벡터”는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는, 발현할 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 바이러스 벡터, 내이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 응결제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “약학적으로 허용 가능한 담체” 또는 “약학적으로 허용 가능한 부형제”는 활성 성분과 조합될 때, 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 하고 대상체의 면역 체계와 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는, 이에 제한되지는 않으나, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제와 같은 임의의 표준 약학적 담체를 포함한다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 생리식염수(0.9%)이다. 이러한 담체를 포함하는 본 개시의 조성물은 공지된 종래의 방법(예를 들어, A. Gennaro(편집)의 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 Remington의 문헌[The Science 및 Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참조)에 의해 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “동종반응성”은 흉선 발달 동안 접하지 않은 MHC 복합체를 식별하는 T 세포의 능력을 지칭한다. 동종반응성은 숙주 대 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환으로 임상적으로 나타난다.
본원에서 값 또는 파라미터을 “약”으로 언급하는 것은, 해당 값 또는 파라미터 자체의 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%에 관한 구현예를 포함하고 기술한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 설명은 “X”의 설명을 포함한다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
본원에서 “포함하는”이라는 언어로 구현예가 기술되는 경우마다, “구성되는” 및/또는 “본질적으로 구성되는”이라는 용어로 기술된 유사한 구현예가 또한 제공된다는 것으로 이해된다.
본 개시의 양태 또는 구현예가 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 대안적인 것들의 관점에서 설명되는 경우, 본 개시는 전체로서 열거된 전체 그룹뿐만 아니라, 그룹의 각각의 구성원을 개별적으로 그리고 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹뿐만 아니라, 하나 이상의 그룹 구성원이 없는 주요 그룹을 포함한다. 본 개시는 개시된 및/또는 청구된 구현예에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 또한 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조절할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 “포함하다” 또는 “포함한다” 또는 “포함하는”과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함하고 복수 용어는 단수형을 포함한다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기술되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
“항원 결합 단백질”은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 “항원 결합 도메인”은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 증식성 질환에 관여하는 세포 상의 항원 또는 바이러스 항원 또는 박테리아 항원에 결합한다.
항원 결합 도메인은 면역학적으로 기능적 단편인 항체 결합 영역을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 항원 결합 도메인의 “면역학적 기능적 단편”(또는 “단편”)은 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부가 결여되어 있지만 표적 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 (그 부분이 어떻게 수득되거나 합성되는지에 관계없이) 포함하는 항원 결합 도메인의 종이다. 이러한 단편은 표적 항원에 결합한다는 점에서 생물학적으로 활성이고, 주어진 에피토프에 결합하기 위해 온전한 항체를 포함하는 다른 항원 결합 도메인과 경쟁할 수 있다.
면역학적 기능성 면역글로불린 단편은, scFv 단편, Fab 단편(Fab′, F(ab′)2, 등), 하나 이상의 상보성 결정 영역(“CDR”), 디아바디(동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은, 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), 도메인 항체, 2가 항원 결합 도메인(2개의 항원 결합 부위를 포함함), 다중특이적 항원 결합 도메인, 및 단쇄 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 단편은 인간, 마우스, 랫트, 낙타류 또는 토끼를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원 결합 도메인은 비-단백질 성분을 포함할 수 있다.
가변 영역은 일반적으로 3개의 초가변 영역(CDR)에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 일반적으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 모두는 통상적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 관례상, 중쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 HC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 경쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 LC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 하나 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 포함하고, 일부 구현예에서는 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 포함한다. 이들 단편은 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있거나, 온전한 항체를 포함하는 항원 결합 도메인의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 다음 경쇄 CDR: CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 다음 중쇄 CDR: CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
각각의 프레임워크에 대한 아미노산의 할당, CDR, 및 가변 도메인은 통상적으로 Kabat 넘버링(예를 들어 Kabat 등의 문헌[in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. 1991] 참조), Chothia 넘버링(예를 들어 Chothia 및 Lesk의 문헌[(1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani 등의 문헌[(1997) J Mol Biol 273: 927-948]; Chothia 등의 문헌[(1992) J Mol Biol 227: 799-817]; Tramontano 등의 문헌[(1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조), 접촉 넘버링, AbM 방식(항체 모델링 프로그램(Antibody Modeling program), Oxford Molecular), 또는 AHo 시스템(Honneger 및 Pluckthun의 문헌[J Mol Biol (2001) 309(3):657-70])의 넘버링 체계를 따른다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 재조합 항원 수용체이다. 본원에서 사용되는 용어 “재조합 항원 수용체”는 세포외 항원 결합 도메인 또는 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 비자연 발생 표면 수용체를 광범위하게 지칭한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 당업계에 공지되어 있다. CAR은 항원 식별 모이어티, 막관통 도메인, 및 T 세포 활성화 도메인을 포함하는 융합 단백질이다(예를 들어 Eshhar 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)] 참조).
일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체의 세포내 도메인은 공동-자극 도메인 및 ITAM-함유 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체의 세포내 도메인은 세포내 단백질 또는 이의 기능적 변이체(예를 들어, 절단(들), 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들))를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “세포외 리간드 결합 도메인” 또는 “세포외 항원 결합 도메인”은 리간드 또는 항원에 결합할 수 있거나 리간드 또는 표면 항원과 같은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 세포외 리간드 결합 또는 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드, 예를 들어 종양 특이적 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fv 또는 scFv, Fab 또는 scFab, F(ab’)2 또는 scF(ab’)2, Fd, 모노바디, 아피바디, 카멜화 항체, VHH 항체, 단일 도메인 항체, 또는 다핀을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드-결합 도메인은 표면 수용체에 결합하는 리간드, 또는 리간드에 결합하는 표면 수용체의 엑토도메인과 같은 결합 쌍의 파트너를 포함한다.
용어 “줄기 도메인” 또는 “힌지 도메인”은 막관통 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 폴리펩티드를 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 특히, 줄기 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 더 높은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 종종 사용된다.
용어 “세포내 신호 전달 도메인”은 효과기 신호 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다.
벡터
폴리뉴클레오티드 조성물을 투여하기 위한 발현 벡터 및 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에서 추가로 기술된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또한 본 개시에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 대응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가 코딩 서열 또는 비-코딩 서열은 본 개시의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 존재할 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만, 연결될 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유하여, 천연 면역 반응성 분자에 비해 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성이 감소되지 않게 한다. 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%의 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 이하에서 기술된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬될 때 동일한 경우, “동일”한 것으로 언급된다. 2개의 서열 간의 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교하기 위해 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “비교 윈도우”는 적어도 약 20개의 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 또는 40 내지 약 50의 세그먼트를 지칭하며, 여기서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 동일한 수의 연속 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 기본 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene Suite에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 다음 참고 문헌에 설명된 여러 가지 정렬 체계를 구현한다: Dayhoff, M.O.의 문헌[1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; Hein J.의 문헌[1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; Higgins, D.G. 및 Sharp, P.M.의 문헌[1989, CABIOS 5:151 -153]; Myers, E.W. 및 Muller W.의 문헌[1988, CABIOS 4:1 1-17]; Robinson, E.D.의 문헌[1971, Comb. Theor. 1 1:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; Sneath, P.H.A. 및 Sokal, R.R.의 문헌[1973, Numeric Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; Wilbur, W.J. 및 Lipman, D.J.의 문헌[1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:726-730].
일부 구현예에서, “서열 동일성의 백분율”은 적어도 20개의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은, 일반적으로, 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 대개 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치하는 위치의 수를 참조 서열에서의 총 위치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는, 또한, 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 이의 일부 또는 상보체와 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 다소 엄격한 조건 하에서 천연 항체(또는 상보적 서열)를 암호화하는 자연적으로 발생하는 DNA 서열에 혼성화될 수 있다.
적절한 “적당한 엄격한 조건”은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1 .0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하는 단계; 50°C-65°C, 5 X SSC에서 밤새 혼성화하는 단계; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각을 사용해 65°C에서 20분 동안 2회 세척하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “매우 엄격한 조건” 또는 “높은(고) 가혹한 조건”은 다음과 같다: (1) 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50°C에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 구연산나트륨/0.1% 도데실황산나트륨을 사용하여 세척; (2) 혼성화 중에 변성제, 예를 들어, 포름아미드, 예를 들어, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/pH 6.5에서 750 mM 염화나트륨을 갖는 50 mM 인산나트륨 완충액을 갖는 50% (v/v) 포름아미드, 42°C에서 75 mM 구연산 나트륨을 사용; 또는 (3) 42°C에서 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x Denhardt의 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 황산염을 사용, 42°C에서 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)에서 그리고 55°C에서 50% 포름아미드에서 세척, 이어서 55°C에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 매우 엄격한 세척. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요에 따라 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재함을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오티드는 본 개시에 의해 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 개시의 범위 내에 있다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 결실, 첨가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은, 반드시 그럴 필요는 없지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기술(예를 들어, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 식별될 수 있다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에서 상세히 기술될 필요는 없다. 당업자는 본원에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우, 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있고, 이어서 벡터가 복제 및 증폭을 위한 적절한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포는 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-결합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에 유지되거나 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호, 및 제4,683,202호뿐만 아니라 Mullis 등(eds.)의 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기술되어 있다.
RNA는 적절한 벡터에서 단리된 DNA를 사용하여 적절한 숙주 세포에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되는 경우, 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[1989, 전술한 바와 같음]에 제시된 바와 같이, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적절한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 작제될 수 있거나, 당업계에서 이용 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제할 수 있고/있거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 가질 수 있다. 적절한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, Bluescript(예: pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28과 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상업적 벤더로부터 입수할 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로 본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오티드 구조체이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 일체형 부분으로서 숙주 세포에서 복제되어야 한다는 것이 내재되어 있다. 적절한 발현 벡터는 이에 한정되지 않지만, 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드를 포함하는 바이러스 벡터, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함한다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 이에 제한되지는 않으나, 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; (프로모터, 인핸서 및 터미네이터와 같은) 적절한 전사 조절 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 발현(즉, 번역)을 위해, 일반적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 또한 요구된다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 형질감염; 미세투과성 충돌; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 어느 하나에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라질 것이다.
항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 숙주 세포 내로 도입하기 위한 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질감염을 위한 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 포유류 숙주 세포의 형질감염을 위한 렌티바이러스와 같은 플라스미드 또는 바이러스 벡터)에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는, 예를 들어, 제한 없이 2A 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 리보솜 스키핑 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 피코나비르류의 아프토바이러스 하위군에서 식별된 2A 펩티드는 코돈에 의해 암호화된 2개의 아미노산 사이에 펩티드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 다음 코돈으로 리보솜 “스키핑”을 야기한다(예를 들어 Donnelly 및 Elliott의 2001 문헌; Atkins, Wills 등의 2007 문헌; Doronina, Wu 등의 2008 문헌 참조). “코돈”은 리보솜에 의해 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA 상의 (또는 DNA 분자의 센스 가닥 상의) 3개의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 2개의 폴리펩티드는, 틀 내에 있는 2A 올리고펩티드 서열에 의해 폴리펩티드가 분리될 때, mRNA 내의 단일의 연속된 열린 해독 틀로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스키핑 메커니즘은 당업계에 잘 알려져 있고, 단일 메신저 RNA에 의해 암호화된 여러 단백질의 발현을 위해 여러 벡터에 의해 사용되는 것으로 알려져 있다.
막관통 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해, 일부 구현예에서, 분비 신호 서열(리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로도 알려짐)이 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터 서열에 제공된다. 분비 신호 서열은 막관통 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는데, 즉, 2개의 서열은 정확한 해독 틀에서 연결되고, 새롭게 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하도록 위치한다. 특정 분비 신호 서열이 관심 핵산 서열의 다른 곳에 위치할 수 있지만, 분비 신호 서열은 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대해 일반적으로 5’에 위치한다(예를 들어, Welch 등의 미국 특허 제5,037,743호; Holland 등의 미국 특허 제5,143,830호 참조). 당업자는, 유전자 코드의 축퇴성의 관점에서, 이들 폴리뉴클레오티드 분자 사이에서 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현, 바람직하게는, 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 코돈-최적화는, 일반적으로 이러한 종의 고도로 발현되는 유전자에서 빈번하게 발생하는 코돈에 대해 주어진 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 희귀한 코돈의 관심 서열로의 교환을 지칭하며, 이러한 코돈은 교환되는 코돈으로서 동일한 아미노산을 암호화하는 것이다.
면역요법에 사용하기 위한 면역 세포를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 하나 이상의 면역 세포 내로 도입하는 단계, 또는 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계, 및 세포를 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 면역 세포를 제공하는 단계; 및 세포의 표면에서 적어도 하나의 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항원 결합 단백질(예: CAR)로 세포를 형질감염시키는 단계; 및 세포에서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서의 안정적인 발현을 위해 하나 이상의 발현 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포에서의 안정적인 발현을 위해 바이러스 벡터 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 전기천공에 의해 세포 내로 직접 도입되는 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 내로 물질을 전달하기 위해 살아있는 세포를 일시적으로 투과화시키는 데 사이토펄스(CytoPulse) 기술이 사용될 수 있다. 파라미터는 최소 사망률을 갖는 높은 형질감염 효율을 위한 조건을 결정하기 위해 변형될 수 있다.
또한, 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 형질감염시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일반적으로, 전기천공에 의해 RNA, DNA, 또는 단백질 중 어느 하나를 세포 내로 도입하는 것과 같이, 당업자에게 알려진 임의의 종래 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 Luft 및 Ketteler, J.의 문헌[Biomolec Screening 20(8): 932 (2015) (DOI: 10.1177/1087057115579638)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 다음을 포함한다: T 세포를 RNA와 접촉시키고, T 세포에 (a) 센티미터당 약 2250 내지 3000 V의 전압 범위를 갖는 전기 펄스; (b) 0.1 ms의 펄스 폭; (c) 단계 (a)와 (b)의 전기 펄스 사이에서 약 0.2 내지 10 ms의 펄스 간격; (d) 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에 약 100 ms의 펄스 폭 및 약 100 ms의 펄스 간격을 갖는 센티미터 당 약 2250 내지 3000 V의 전압 범위를 갖는 전기 펄스; 및 (e) 각각의 4개의 전기 펄스 사이에 2 ms의 펄스 간격 및 약 0.2 ms의 펄스 폭을 갖는 약 325 V의 전압을 갖는 4개의 전기 펄스로 이루어진 애자일 펄스 연쇄를 인가하는 단계. 일부 구현예에서, T 세포를 형질감염시키는 방법은, 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계; 및 다음을 포함하는 애자일 펄스 시퀀스를 T 세포에게 인가하는 단계를 포함한다: (a) 센티미터 당 전압이 1600, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 또는 3000V인 전기 펄스; (b) 0.1 ms의 펄스 폭; (c) 단계 (a)와 (b)의 전기 펄스 사이의 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ms의 펄스 간격; (d) 전압 범위가 센티미터 당 약 2250 내지 3000 V(예: 센티미터 상 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 또는 3000 V)인 하나의 전기 펄스로서, 펄스 폭이 100 ms이고, 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 간의 펄스 간격이 100 ms인, 전기 펄스; 및 (e) 전압이 약 325 V인 4개의 전기 펄스로서, 펄스 폭이 약 0.2 ms이고, 4개의 전기 펄스 사이에 펄스 간격이 각각 약 2 ms인, 전기 펄스. 전술한 값 범위에 포함된 임의의 값이 본 출원에 개시된다. 전기천공 매질은 당업계에 공지된 임의의 적절한 매질일 수 있다. 일부 구현예에서, 전기천공 매질은 약 0.01 내지 약 1.0 밀리지멘스에 걸쳐진 범위에서 전도성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어 TAP2, NLRC5, β2m, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK (이에 한정되지 않음)를 발현하는 적어도 하나의 유전자, TCR의 성분, 면역억제제에 대한 표적, HLA 유전자, 및/또는 예를 들어 PDCD1 또는 CTLA-4와 같은 면역 관문 단백질의 발현 수준을 불활성화시키거나 감소시킴으로써 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유전자를 불활성화시킨다는 것은, 관심 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않도록 하는 것이다. 일부 구현예에서, 불활성화시킬 유전자는, 예를 들어 NLRC5, TAP2, TCRα, TCRβ, β2-마이크로글로불린(“β2m” 또는 b2m), CD52, CIITA, RFX5, RFXAP, RFXANK, GR, 데옥시시티딘 키나아제(DCK), PD-1, 및 CTLA-4로 이루어진(이들로 한정되지는 않음) 군으로부터 선택된 유전자 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 선택적 DNA 절단에 의해 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀 절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 세포 내에 도입함으로써 하나 이상의 유전자를 불활성화시키거나 이의 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀 절단 엔도뉴클레아제는, 예를 들어 전사 활성화제-유사 작동자 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제 또는 TALEN®), metaTAL 뉴클레아제, 또는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다.
또 다른 양태에서, 면역 세포(예: T 세포)를 유전적으로 변형시키거나 조작하는 단계는 다음 단계를 포함한다: 면역억제제에 대한 표적을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 면역 세포(예: T 세포)를 변형시키는 단계; 및 임의로 면역억제제가 존재하는 가운데, 세포를 증식시키는 단계. 면역억제제는 여러 작용기전 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 제제이다. 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 강도(voracity)를 감소시킬 수 있다. 면역억제제의 비제한적인 예는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 표적, 인터루킨-2 α-사슬 차단제, 이노신 일인산 탈수소효소의 억제제, 디하이드로엽산 환원효소의 억제제, 코르티코스테로이드, 및 면역억제성 항대사물을 포함한다. 일부 세포독성 면역억제제는 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 억제제들은 T 세포의 활성화를 통해 작용하거나 헬퍼 세포의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 개시에 따른 방법은 T 세포에서 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 면역 요법을 위한 T 세포에 대한 면역 억제 저항성을 부여할 수 있게 한다. 비제한적인 예로서, 면역억제제에 대한 표적은, 예를 들어, 제한 없이, CD52, 글루코코르티코이드 수용체(GR), FKBP 패밀리 유전자 구성원, 및 시클로필린 패밀리 유전자 구성원과 같은 면역억제제에 대한 수용체일 수 있다.
TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현의 하향 조절하면서 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현시키기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 또한, 면역 세포, 예를 들어, CAR-T 세포와 같은 T 세포의 기능적 활성을 개선하기 위한 이러한 조성물 및 방법의 용도가 제공된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물은 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포(예: CAR-T 세포)의 생체 내 지속성 및 치료 효능을 개선하는 데 유용하다.
본원에 제공된 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포는 항원 결합 단백질(예: 키메라 항원 수용체(CAR))를 발현하고, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상을, 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하의 수준으로 발현한다. 유리하게는, 본원에 제공된 조작된 면역 세포는, 조작되지 않은 세포에 비해, 개선된 생체 내 지속성 및/또는 수용자의 면역계에 의한 거부에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 면역 세포(예: T 세포)는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상을, 그렇게 변형되지 않은 비슷한 세포에 비해 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 (예를 들어 유전적으로) 변형된다. 예를 들어, 면역 세포는, 예를 들어 유전자좌의 전체 코딩 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 게놈 DNA 및/또는 유전자좌의 전사 조절 요소 및/또는 프로모터 요소 및/또는 활성화 요소를 포함하는 게놈 DNA를 결실시키거나, 기능적 단백질의 생산을 막는 삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이를 도입함으로써 상응하는 기능적 단백질이 세포 표면에서 발현되지 않도록, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 유전자좌 중 하나 이상의 전체 또는 일부를 녹아웃하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포(예: T 세포)에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 상응하는 발현 수준을 감소시키도록 조작되지 않은 비슷한 세포에서의 기능적 발현 수준에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소할 수 있다.
하나 이상의 항원 결합 단백질(예를 들어 하나 이상의 CAR)은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포 내로 도입한 후 세포 내에서 인시츄로 합성될 수 있다. 대안적으로, 항원 결합 단백질(예: CAR)은 세포 외부에서 생산된 다음 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 구조체를 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 구조체는 세포의 게놈 내에 통합되지 않는다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 재조합 바이러스 벡터(예: 렌티바이러스 및 아데노바이러스를 포함하는 레트로바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 변환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포(예: T 세포)는 적어도 하나의 항원 결합 단백질(예: CAR)을 포함할 수 있다. 조작된 면역 세포(예: T 세포)는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 변형된다(예를 들어 유전적으로 조작된다). 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예: 조작된 T 세포)는 적어도 2개의 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어 2개 이상의 상이한 CAR을 포함할 수 있으며, 각각의 CAR은 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
본원에 제공된 조작된 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 일부 구현예에서, T 세포를 발현하는 CAR은 세포외 리간드-결합 도메인(예를 들어, 단쇄 가변 단편(scFv)), 막관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 도메인은 하나의 폴리펩티드 내에, 즉 단일 사슬 내에 있다. 다중 사슬 CAR 및 폴리펩티드 또한 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은: 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서, 폴리펩티드는 함께 조립되어 다중 사슬 CAR을 형성한다.
세포외 리간드 결합 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 관심 표적은 임의의 관심 분자일 수 있으며, 여기에는 예를 들어 BCMA, EGFRvIII, Flt-3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD70, CD33, CD133, WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKG2D, CS1, CD44v6, ROR1, CD19, Claudin-18.2 (Claudin-18A2, 또는 Claudin18 이소형 2), DLL3 (델타 유사 단백질 3, 초파리 델타 상동체 3, 델타3), Muc17, Muc3, Muc3, Muc16, FAP 알파(섬유아세포 활성화 단백질 알파), Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체 유전자좌 단백질 G6d, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25), RNF43 (E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 RNF43, RING 핑거 단백질 43)이 포함되고, 열거된 예시적인 표적 중 어느 하나의 인간 형태가 구체적으로 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 BCMA, MUC16(CA125로도 알려짐), EGFR, EGFRvIII, MUC1, Flt-3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD70, CD33, CD133, MHC-WT1 , TSPAN10, MHC-PRAME, MHC-NY-ESO1, HER2(ERBB2), CAIX(탄산 탈수효소 IX), LIV1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKG2D, CS1, CD44v6, ROR1, CD19, Claudin-18.2(Claudin-18A2, 또는 Claudin18 이소형 2), PSCA, DLL3(델타-유사 단백질 3, 초파리 델타 상동체 3, 델타3), Mud 7(뮤신17, Muc3, Muc3), FAP 알파(섬유아세포 활성화 단백질 알파), Ly6G6D(림프구 항원 6 복합체 유전자좌 단백질 G6d, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25), PSMA, MSLN, 또는 RNF43(E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 RNF43, RING 핑거 단백질 43)에 특이적으로 결합한다. 항원을 표적으로 하는 CAR 및/또는 항체는, 예를 들어, 다음에 개시되어 있다: BCMA- WO201616630, WO2020150339, WO2019196713, WO2016014565, WO2017025038; MUC16: US9,169,328, WO2016149368, WO2020023888; EGFRvIII: WO2017125830, WO2016016341; Flt3: WO2018222935, WO2020010284, WO2017173410; CD20: WO2018145649, WO2020010235, WO2020123691; CD38: WO2017025323; CD70: WO2019152742, WO2018152181; CD33: WO2016014576; CD133: WO2018072025; CS1: WO2019030240; ROR1: WO2016115559; CD19: WO2002077029, US11,077,144; Claudin: WO2018006882, WO2021008463; DLL3: WO2020180591; WT1: US20160152725A1, US7622119B2; CD23: US6011138A, CN1568198A; CD30: US10815301B2, US10808035B2; PRAME: US20180148503A1, WO2020186204A1; LIV1: US20200231699A1; NKG2D: WO2021179353A1, US20210269501A1; FAP 알파: US20200246383A1, US20210115102A1; PSMA: US20210277141A1, WO2020108646A1; MSLN: CN109680002A, CN109628492A.
일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론 항체의 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하는 scFv를 포함한다. 단쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 제조된다(Bird 등의 문헌[Science 242:423-426, 1988]). 연결 펩티드의 예는 아미노산 서열(GGGGS)3(서열번호 22)을 갖는 GS 링커이며, 이는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이에서 약 3.5 nm를 가교한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되고 있다(Bird 등, 1988, 전술한 문헌 참조). 대체로, 링커는 짧고, 가요성 폴리펩티드일 수 있고, 바람직하게는, 약 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성된다. 약물 부착 또는 고형 지지체에 대한 부착과 같은 추가 기능을 위해 링커를 차례로 수정할 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 생성을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생성을 위해, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드 또는 다른 벡터는 적절한 숙주 세포, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포, 또는 대장균과 같은 원핵 세포 내에 도입될 수 있다. 관심 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 연결과 같은 일상적인 조작에 의해 만들어질 수 있다. 생성된 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
본 개시에 따른 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 초래하는 표적에 대한 세포외 리간드-결합 도메인의 결합 후 세포내 신호 전달을 담당한다. 세포내 신호 전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나를 활성화시키는 능력을 갖는다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR에 사용하기 위한 세포내 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 공수용체의 세포질 서열일 수 있고, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포내 신호 전달 도메인은 세포질 신호 전달 서열의 2가지의 구분되는 부류를 포함한다: 항원 의존성 일차 활성화를 개시하는 것, 및 이차 또는 공동 자극 신호를 제공하도록 항원 독립적 방식으로 작용하는 것. 일차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 클래스 티로신 키나아제에 대한 결합 부위로서 작용하는 다양한 수용체의 세포질 내 테일에서 발견되는 잘 정의된 신호 전달 모티프이다. 본 개시에 사용된 ITAM의 예는, 비제한적인 예로서, TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 분자의 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 4-1BB(GenBank: AAA53133)의 단편 및 CD28(NP_006130 및 이의 이소형)로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자의 일부를 포함한다.
CAR은 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 따라서, CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 CAR에 대한 적절한 막관통 도메인은 (a) 세포의 표면, 예를 들어, 제한 없이, 림프구 세포 또는 자연 살해(NK) 세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되고, (b) 사전 정의된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 리간드 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, 막관통 폴리펩티드는 α, β, γ 또는 δ와 같은 T 세포 수용체, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체, 예를 들어 p55(a 사슬), p75(β 사슬 또는 γ 사슬), Fc 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질의 도메인일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있고, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인과 전술한 막관통 도메인 사이에 줄기(stalk) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 줄기 도메인은 최대 300개의 아미노산, 예를 들어, 10 내지 100개의 아미노산,또는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 자연 발생 분자의 전부 또는 일부로부터, 예컨대 CD8, CD4, 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부로부터, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 줄기 도메인은 자연적으로 발생하는 줄기 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 완전히 합성된 줄기 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 줄기 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345 및 이의 이소형)의 일부이다. 또 다른 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR은 BCMA에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인, CD8α 인간 줄기 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인, 및 4-1BB 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 벡터 (예: 플라스미드 벡터)를 통해 이식유전자로서 면역 세포 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터는, 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수도 있다.
CAR 폴리펩티드는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 후, 세포에서 실시간으로 합성될 수 있다. 대안적으로, CAR 폴리펩티드는 세포 외부에서 생산된 후, 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 구조체를 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 구조체는 세포의 게놈 내에 통합되지 않는다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바리러스), 아데노바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 변환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
또한, 면역 세포, 예를 들어 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따라 수득된 단리된 T 세포와 같은 T 세포가 본원에 제공된다. 이종 DNA를 발현할 수 있는 임의의 면역 세포가 항원 결합 단백질, 예를 들어 관심 CAR을 발현할 목적으로 사용될 수 있고, 추가로 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 발현하도록 조작할 목적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는, 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적인 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 단리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK 세포, B 세포 또는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어 단리된 T 세포와 같은 T 세포는 본원에 기술된 방법(예를 들어 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 유전자의 유전자좌 중 하나 이상을 부분적으로 또는 전체적으로 결실시키거나 파괴하기 위해 TALEN, CRISPR/Cas9, 또는 MegaTAL 뉴클레아제를 사용하는 알려진 유전자 편집 기술)에 의해 추가로 변형(예를 들어 유전적으로 조작)됨으로써, 이들은 상응하는 단백질을 감소된 수준 또는 변경된 수준으로 발현하도록 조작되지 않은 유사한 세포에 비해 상응하는 단백질을 감소된 수준으로 발현한다.
본원에 제공된 조작된 면역 세포는, 본원에 기술된 것과 같은 조작된 세포(예를 들어 항원 결합 단백질을 발현하는 세포)의 집단을 풍부하게 하기 위해 세포 분류를 가능하게 하는, 및/또는 세포가 환자 또는 수용자에게 투여된 후, 예를 들어 부작용(adverse effect)을 제한하기 위해, 면역 세포를 불활성화시키는 안전성 스위치 메커니즘을 제공하는, 하나 이상의 미모토프 서열을 포함할 수 있다. 이러한 미모토프 서열 및 세포 분류에 안전성 스위치로서 이를 적용하는 것은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 US2018/0002435에 기술되어 있다.
증식 및 유전자 변형 전에, 세포의 공급원은 다양한 비제한적인 방법을 통해 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자에게 이용 가능하고 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 대상체 또는 감염으로 진단된 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따라 변형된, 예를 들어 형질전환되었거나 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포로부터 수득된 세포주가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포는 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준에서 발현하도록, 예를 들어 기능적으로 발현하도록 추가로 변형되거나 (예를 들어 유전적으로) 조작된다.
본 개시의 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 변형 이전에 또는 후에, 예를 들어 제한 없이, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 일반적으로 기술된 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다. 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 확장될 수 있다. 대체로, 본 개시의 면역 세포는, 예를 들어, 세포에 대한 활성화 신호를 생성하도록 면역 세포의 표면 상에서 CD3 TCR 복합체 및 공자극 분자를 자극하는 제제와 세포를 접촉시킴으로써 증식될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 아이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 유사분열성 렉틴과 같은 화학물질이 면역 세포, 예를 들어 T 세포에 대한 활성화 신호하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은, 예를 들어, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 시험관 내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공동자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFβ, 및 TNF를 포함하여 증식 및 생존에 필요한 인자, 또는 세포의 성장을 위한 당업자에게 공지된 임의의 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지, RPMI 배지 1640, 또는 X-vivo™ 5(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 계면활성제, Plasmanate®, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 배지에는 RPMI 1640(본원에서 언급된), AIM V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, 및 X-VIVO™ 20, OpTmizer™이 포함될 수 있으며, 이들 배지에는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 포함되고, 무혈청이거나 적당량의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트로 보충되고/되거나, T 세포가 성장하고 증식하는 데 충분한 양의 사이토카인(들)이 포함된다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에게 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37°C) 및 대기(예를 들어, 5% CO2가 더해진 공기)에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 조직 또는 세포와 공동 배양함으로써 증식될 수 있다. 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액 내에서 확장될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 세포 중 어느 하나를 포함하는 조성물(예를 들어 약학적 조성물)을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 T 세포를 포함한다. 세포는 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 발현되도록 추가로 조작된다. 조성물은, 예를 들어 본 개시의 조작된 면역 세포(예: T 세포), 예를 들어 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현하고, 상응하는 단백질을 감소된 수준 또는 변경된 수준으로 기능적으로 발현하기 위해 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 조작되지 않은 유사한 세포에 비해 감소된 수준으로 기능적으로 발현하는 면역 세포를 포함하거나, 본 개시의 조작된 면역 세포(예: T 세포)를 포함하는 세포 집단, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 단리된 일차 세포는 본원에 기술된 것과 같이 조작되어, 생성된 세포의 (예를 들어 100% 미만, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 미만의 비율의) 하위집단이 원하는 변형을 모두 포함하는 세포 집단을 제공한다. 모든 변형을 포함하는 세포와 그렇지 않은 세포의 혼합물을 포함하는, 이렇게 생성된 집단은 본 개시의 치료 방법 및 본 개시의 조성물을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포 집단(“시작 집단”)은 공지된 방법(예를 들어 원하는 변형을 갖는 세포를 분류하고/하거나 증식시키는 방법)에 의해 조작되어 원하는 변형 중 하나 이상을 포함하는 세포들이 풍부한 세포 집단(예를 들어 원하는 항원 결합 단백질을 발현하는 세포가 풍부한 세포 집단 및/또는 상응하는 단백질의 발현 수준과 관련하여, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 조작되지 않은 유사한 세포에 비해 상대적으로 감소된 수준으로 발현하는 세포가 풍부한 세포 집단), 즉 변형된 또는 조작된 세포를 시작 집단이 포함한 것 보다 더 높은 백분율로 포함하는 세포 집단을 제공한다. 그런 다음, 변형된 세포가 풍부한 집단은 본 개시의 치료 방법에 사용될 수 있고, 예를 들어 본 개시의 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 풍부한 세포 집단은 변형 중 하나 이상을 갖는 세포를 함유하거나, 이러한 세포를 적어도 예를 들어 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 함유한다. 다른 구현예에서, 풍부한 세포 집단 중 변형 중 하나 이상을 포함하는 세포의 비율은 원하는 변형을 포함하는 세포 시작 집단의 세포 비율보다 적어도 30% 더 높다.
치료 방법
전술한 방법에 의해 수득된 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 이러한 면역 세포 또는 T 세포로부터 유래된 세포주는 의약으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 의약은, 예를 들어, 바이러스 질환, 박테리아 질환, 암, 염증성 질환, 면역 질환, 또는 노화 관련 질환과 같은 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 위암, 육종, 림프종(비호지킨 림프종 포함), 백혈병, 두경부암, 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 위장암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 백혈병, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 대장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평 세포 두경부암(SCHNC), 난소암, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 고전 호지킨 림프종(cHL)을 앓고 있는 이전에 치료된 성인 대상체이다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 면역 세포 예를 들어 T 세포로부터 유래된 세포주는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는, 예를 들어 암, 자가면역 장애, 또는 감염일 수 있다.
또한, 대상체를 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 개시의 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 개시의 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포는 강력한 생체 내 세포 증식을 거칠 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 본 개시의 치료 방법은 개선적,, 치유적, 또는 예방적일 수 있다. 본 개시의 방법은 자가 면역 요법의 일부 또는 동종이계 면역 요법 치료의 일부일 수 있다. 본 개시는 동종이계 면역 요법에 특히 적합하다. 공여자에 의해 제공된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 비-동종반응성 세포로 형질전환될 수 있고, 필요에 따라 재생산되어, 하나 또는 여러 대상체에게 투여될 수 있는, 예를 들어 CAR-T 세포를 생산할 수 있다. 이러한 CAR-T 세포 요법은 동종이계 ALLO CAR T™ 치료제로서 이용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 종양을 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암 세포의 전이를 억제 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 종양을 갖는 대상체에서 종양의 퇴행을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 면역 세포, 예를 들어 조작된 T 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 대상체에게 비경구로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는, 예를 들어, 크리조티닙, 팔보시클립, 항-CTLA4 항체, 항-4-1 BB 항체, PD-1 항체, 또는 PD-L1 항체이다.
또한, 암의 치료 또는 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체를 위한 의약의 제조에 있어서, 본원에서 제공된 면역 세포, 예를 들어 T 세포 중 어느 하나의 용도가 제공된다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은, 또는 본 개시에 따라 녹다운 되었거나 녹아웃된 임의의 다른 유전자의 기능적 발현 수준은, 유사하지만 이렇게 유전적으로 변형되지 않은 면역 세포에서의 상응하는 발현 수준에 비해 약 또는 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소된다. 발현 수준은 FACS 또는 MAC와 같은 임의의 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는, 조작되지 않은 것 외에는 조작된 면역 세포와 동일한(동일한 성분을 포함하는) 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 10% 이하, 또는 0%의 발현 수준으로 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 임의의 하나 이상, 또는 본 개시에 따라 녹다운되거나 녹아웃된 임의의 다른 유전자를 기능적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 하나의 유전자의 두 대립유전자 모두가 녹아웃되어, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서의 유전자의 발현 수준은 상응하는 조작되지 않은 세포의 발현 수준의 0%이다. 일부 구현예에서, 유전자의 두 대립유전자 중 하나가 녹아웃되어, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서의 유전자의 발현 수준이 상응하는 조작되지 않은 세포의 발현 수준의 50% 또는 약 50%(예: 보상 메커니즘이 나머지 대립유전자의 정상 발현보다 더 큰 발현을 유발하는 경우)이다. 예를 들어, 발현이 녹아웃 이외에 본원에 기술된 것과 같은 일부 수단에 의해 감소되는 경우, 중간 수준의 발현이 관찰될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 발현 수준, 또는 발현 수준이 본 개시에 따라 조작된 임의의 다른 유전자의 발현 수준은 당업자에게 공지된 표준 기술(예: RT-qPCR, 핵산 시퀀싱, 항체 염색, 또는 일부 기술의 조합)을 사용해, 세포를 유전자 산물 및 이들의 특성에 대해 검정함으로써 직접적으로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은 당업계에 알려진 표준 기술(예: 유세포 계측법)에 의해, 조작된 면역 세포의 표면에서 하나 이상의 HLA 단백질, 예컨대 HLA-A 또는 HLA-B 단백질, 또는 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 B2M 및 하나 이상의 HLA 단백질 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정된다. 이들 측정값은, 상응하는 기능적 발현 수준을 감소시키도록 조작되지 않은 유사한 세포에서 이루어진 상응하는 측정값과 비교될 수 있다. 본 발명의 조작된 세포(예를 들어 조작된 면역 세포)를 포함하는 세포 집단에서, 측정되는 물질의 풀링된 샘플(예를 들어 RNA 또는 단백질 또는 세포)은 다음 사실을 반영하게 된다: 세포 중 일부는 대립유전자 모두가 녹아웃된 관심 유전자를 발현하지 않고; 예를 들어 세포 중 일부는 대립유전자 중 하나만이 녹아웃된 관심 유전자를 50% 또는 약 50% 수준으로 발현하고; 집단이 조작되지 않은 세포를 포함하는 경우, 세포 중 일부는 관심 유전자를 정상 수준으로 발현함.
본 개시의 조작된 면역 세포에서 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 RFXANK 중 하나 이상의 발현의 기능적 발현 수준은, 예를 들어, 조작되지 않은 것 외에는 비슷한, 예를 들어 동일한 조작되지 않은 면역 세포가 동일한 조건 하에 생존하는 정도와 비교하여, 조작된 면역 세포가 작동자 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)가 존재할 때 생존하는 정도를 측정함으로써 검정할 수도 있다. 예를 들어, 도 6a~6c 및 실시예 1 참조.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포(예를 들어 조작된 T 세포)를 투여하거나, 이러한 조작된 면역 세포(예를 들어 조작된 T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하면, 유사하지만 조작되지 않은 세포 또는 이러한 조작된 세포를 포함하지 않는 유사한 집단에 비해 투여된 세포 또는 세포 집단의 숙주 거부반응이 상대적으로 감소한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 포함하고, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 발현 수준(예: 기능적 발현 수준)이 감소된 본 개시의 조작된 면역 세포(예: 조작된 T 세포)를 투여하거나, 이러한 조작된 면역 세포(예: 조작된 T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하면, 유사하지만 조작되지 않은 세포 또는 이러한 조작된 세포를 포함하지 않는 집단에 비해 투여된 세포 또는 세포 집단의 숙주 거부반응이 상대적으로 감소한다. 예를 들어, 이러한 투여는, 동일하지만 상응하는 단백질을 감소된 수준으로 발현하도록 조작되지 않은 세포의 숙주 거부반응과 비교했을 때, 숙주 거부반응을 1% 내지 99%, 예를 들어, 5% 내지 95%, 10% 내지 90%, 50% 내지 90%, 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 숙주 거부반응은 90% 넘게 감소된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어 CAR)을 포함하고, TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현 수준이 감소된 본 개시의 면역 세포(예: T 세포)를 투여하거나, 이러한 면역 세포(예를 들어 T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하면, 동일하지만 상응하는 단백질을 감소된 수준으로 발현하도록 조작되지 않은 세포의 지속성과 비교했을 때, 세포의 지속성이 강화 또는 개선되고/되거나 지속성이 증가한다. 일부 구현예에서, 지속성은, 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위 내에 속하는 특정 기간만큼 증가한다. 일부 구현예에서, 지속성의 차이는 집단 또는 조성물 중 투여된 세포의 반감기를 비교함으로써 측정되며, 여기서 반감기는 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위 내에 속하는 특정 기간만큼 늘어난다. 일부 구현예에서, 지속성에서의 차이는 투여된 세포가 투여 후 검출될 수 있는 시간의 길이를 비교함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 지속성의 개선은, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포의 존재 하에 조작된 세포와 조작되지 않은 세포의 생존을 비교하되, 이들 세포를 면역 세포와 혼합한 후 약 72시간, 5일, 7일, 또는 13일차에 이들 세포의 생존을 비교함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 구현예에서, 이러한 시험관 내 분석에서, 측정 시점에 조작된 세포의 생존율은 조작되지 않은 세포가 생존율의 약 1.5배 내지 많게는 10배이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 투여된 세포의 숙주 거부반응 감소 및/또는 지속성의 증가는 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 다음 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이 사용된다: 유세포 계측법, PCT(예: 정량적 PCR), 및 환자 종양 물질과의 생체 외 공동 인큐베이션 또는 CAR-T 세포에 의해 표적화된 항원을 발현하는 모델 종양 세포주와의 생체 외 공동 인큐베이션. 일부 구현예에서, 녹아웃이 생존의 이점을 제공하는 정도를 결정하기 위해, qPCR을 사용해 관심 녹아웃을 갖는 CAR T 세포 및 갖지 않는 CAR T 세포의 수를 평가한다.
일부 구현예에서, 치료는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 하나 이상의 요법과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 면역억제제 치료를 받는 대상체에게 투여될 수 있다. 실제로, 본 개시는 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 암호화하는 유전자의 불활성화로 인해 적어도 하나의 면역억제제에 내성을 갖게 된 세포 또는 세포 집단에 의존할 수 있다. 이러한 양태에서, 면역억제 치료는 대상체 내에서 본 개시에 따른 T 세포의 선택 및 확장에 도움을 줄 수 있다.
본 개시에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 정맥내 또는 림프내 주사에 의해, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 또는 복강내 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 세포 또는 세포 집단을 투여하는 것은, 예를 들어, 약 103 또는 104 내지 약 109개의 세포/kg(체중)(이들 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값 포함)을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단을 투여하는 것은 약 105 내지 약 106개의 세포/kg(체중)(이들 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값 포함)을 투여하는 것, 또는 0.1x106 내지 5x106개의 본 개시의 조작된 면역 세포/kg(체중), 또는 총 0.1x108 내지 5x108개의 조작된 면역 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 유효량은 단일 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 유효량은 일정 기간에 걸쳐 1회를 초과하는 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 시기는 담당 의사의 판단에 따르며 이는 대상체의 임상적 병태에 따라 달라진다. 세포 또는 세포 집단은 혈액 은행 또는 공여자와 같은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 개별적인 요구는 다양하지만, 특정 질환 또는 병태에 대한 주어진 세포 유형의 유효량의 최적 범위의 결정은 당 기술분야의 범위 내에 있다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 병용 치료의 종류(해당되는 경우), 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 유효량의 세포 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 비경구 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 종양 내 주사에 의해 직접 수행될 수 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 세포는, 이에 제한되지는 않으나, 제제를 사용한 치료, 예를 들어, 단클론 항체 요법, CCR2 길항제(예를 들어, INC-8761), 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터루킨-2, MS 대상체를 위한 시타라빈(ARA-C로도 알려짐) 또는 나탈리지맙 치료, 또는 건선 대상체를 위한 에팔리즈티맙 치료 또는 PML 대상체를 위한 다른 치료를 포함하는 임의의 수의 관련 치료 기법과 함께 (예를 들어, 이전, 동시에 또는 이후에) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, BCMA 특이적 CAR-T 세포가 다음 중 하나 이상과 함께 대상체에게 투여된다: 항-PD-1 항체(예를 들어 니볼루맙, 펨브롤리주맙), 항-PD-L1 항체(예를 들어 아벨루맙, 아테졸리주맙, 또는 더발루맙), 항-OX40 항체, 항-4-1 BB 항체(예를 들어 우톨리무맙), 항-MCSF 항체, 항-GITR 항체, 및/또는 항-TIGIT 항체. 추가의 구현예에서, 본 개시의 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제(예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506), 항체, 또는 다른 면역제거제(예컨대 CAMPATH(알렘투주맙), 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법), 시톡산, 플루다리빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및/또는 방사선 조사와 병용으로 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타아제 칼시뉴린(시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도 신호 전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다(Henderson, Naya 등의 문헌[Immunology. 1991 Jul; 73(3): 316-321]; Liu, Albers 등의 문헌[Biochemistry 1992 Apr 28;31(16):3896-901]; Bierer, Hollander 등의 문헌[Curr Opin Immunol. 1993 Oct;5(5):763-73]).
추가 구현예에서, 본 개시의 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법제(플루다라빈, 외부 빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드) 중 어느 하나를 사용하는 T 세포 제거 요법, 또는 CAMPATH와 같은 항체와 함께(예를 들어 그 이전에, 동시에, 또는 이후에) 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 제제(예: 리툭산) 후에 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 대상체는 고 투여량 화학요법을 이용한 표준 치료를 거친 후, 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 소정의 구현예에서, 이식 후, 대상체는 본 개시의 증식된 면역 세포의 주입을 받는다. 일부 구현예에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
키트
본 개시는 또한 본 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 개시의 키트는 하나 이상의 용기를 포함하며, 상기 용기에는 본 개시의 조성물 또는 면역 세포(예: T 세포) 또는 본 개시의 면역 세포(예: 조작된 T 세포)를 포함하는 세포 집단이 포함된다. 다양한 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 본원에 기술된 것과 같은 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하며, 본원에 기술된 것과 같이 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 조작된다. 키트는 본원에 기술된 본 개시의 방법 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일반적으로, 이들 지침은 전술한 치료 치료제를 위한 조성물, 예를 들어 T 세포 또는 세포 집단의 투여에 대한 설명을 포함한다.
키트 구성 요소의 사용에 관한 지침은 일반적으로 의도된 치료제에 대한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 투여량 패키지) 또는 서브-유닛 투여량일 수 있다. 본 개시의 키트에 제공된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입부(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 대한 서면 지침이지만, 기계 판독 가능 지침(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 포함된 지침)도 허용 가능하다.
본 개시의 키트는 적절히 포장된다. 적절한 포장은 바이알, 병, 항아리, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기도 또한 멸균 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 면역 세포, 예를 들어, 본 개시에 따른 T 세포이다. 용기는 제2 약학적 활성제를 더 포함할 수 있다.
키트는 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 구성요소를 선택적으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
분류 및 고갈 방법
일부 구현예에서, 면역 세포 집단을 시험관 내에서 분류하는 방법이 제공되며, 여기서 면역 세포 집단의 하위 집합은 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상을 감소된 수준으로 발현하고/하거나 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 발현하도록 본원에 기술된 바와 같이 조작된 면역 세포를 포함한다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은: 조작된 세포에 고유한 에피토프(예를 들어 US2018/0002435에 제공된 것들과 같은 미모토프), 예를 들어 항원 결합 단백질의 에피토프 또는 항원 결합 단백질에 통합된 미모토프에 특이적인 단클론 항체와 면역 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 단클론 항체에 결합하는 면역 세포를 선택하여 항원 결합 단백질을 발현하는 조작된 면역 세포가 풍부한 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 에피토프에 특이적인 단클론 항체는 형광단에 임의로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 전술한 에피토프에 특이적인 전술한 단클론 항체는 자기 입자에 선택적으로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 자기 활성화 세포 분류(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현하는 면역 세포를 분류하는 방법에 사용된 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 뮤로모납-CD3, 토시투모맙, 압시시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 겜투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전술한 mAb는 리툭시맙이다. 또 다른 구현예에서, 전술한 mAb는 QBEND-10이다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포의 시험관 내 분류 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 85%를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 초기(분류되지 않은) 세포 집단과 비교하여 시험관 내에서 증가된 세포독성 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 전술한 시험관 내에서의 세포독성 활성은 10%, 20%, 30% 또는 50%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다.
수용자에게 투여될 CAR-발현 면역 세포는 시험관 내에서 공급원 모집단으로부터 농축될 수 있다. 공급원 모집단을 농축하는 방법은 밀도 원심분리, 면역-자성 비드 정제, 친화도 크로마토그래피, 및 형광 활성화 세포 분류의 조합을 사용하여, CD34 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
유세포 계측법은 사용하여 세포 집단 내에서 특정 세포 유형을 정량화하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 유세포 계측법은 주로 광학 수단으로 세포의 구성 요소 또는 구조적 특징을 정량화하는 방법이다. 상이한 세포 유형은 구조적 특징을 정량화함으로써 구별될 수 있기 때문에, 유세포 계측법 및 세포 분류를 사용해 혼합물 내에서 상이한 표현형의 세포를 계수하고 분류할 수 있다.
유세포 계측법 분석은 두 가지 주요 단계를 포함한다: 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 표지된 마커로 표지하는 단계, 및 2) 집단에서의 총 세포 수에 대한 표지된 세포의 수를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 유형을 표지하는 방법은 특정 세포 유형에 의해 발현된 마커에 표지된 항체를 결합하는 단계를 포함한다. 항체는 형광 화합물로 직접 표지되거나, 예를 들어 제1 항체를 인식하는 형광 표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 T 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS)이다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)는 초 상자성 나노입자 및 컬럼을 사용하여 표면 항원(CD 분자)에 따라 다양한 세포 집단을 분리하는 방법이다. MACS는 순수 세포 집단을 수득하는 데 사용될 수 있다. 단일 세포 현탁액 중의 세포는 마이크로비드로 자기적으로 표지될 수 있다. 샘플을 세포 친화적인 코팅으로 덮여 있는 강자성 구체로 구성된 컬럼에 도포하여, 세포를 신속하고 안전하게 분리할 수 있다. 표지되지 않은 세포는 통과하는 반면, 자기 표지된 세포는 컬럼 내에 유지된다. 관류는 표지되지 않은 세포 분획으로서 수집될 수 있다. 세척 단계 후, 컬럼을 분리기로부터 제거하고, 자기 표지된 세포를 컬럼으로부터 용리시킨다.
T 세포와 같은 특정 세포 집단의 정제를 위한 상세한 프로토콜은 Basu S 등의 (2010) 문헌에서 확인할 수 있다. (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A.의 문헌[Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546]).
실시예
일반적인 방법
KO T 세포의 생성
자기-활성화 세포 분류(MACS) 음성 선택(Miltenyi, 인간 범 T 세포 단리 키트, Cat # 130-096-535)을 사용하여 동결된 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 일차 인간 T 세포를 단리하고, R10(RPMI-1640 + 10% FBS + 25 mM HEPES + 피루브산 나트륨 + 비필수 아미노산)에서 1:100(v:v) T 세포 TransAct(Miltenyi, Cat # 130-111-160) + 100 IU/mL IL-2(Miltenyi, Cat # 130-097-746)으로 활성화시켰다. 2일 후, Neon 형질감염 시스템(Invitrogen)을 사용하여 T 세포를 유전자 편집하였다. 간략하게, cas9 효소(IDT, Cat # 1081059)와 sgRNA를 1:1 몰비로 실온에서 10분 동안 혼합하여 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 2개의 sgRNA를 사용한 경우, 0.5:0.5:1 비율(sgRNA1:sgRNA2:cas9)로 cas9를 사용해 인큐베이션을 수행하였다. 세포를 1600 V에서 10 ms 간격으로 총 3회 펄스를 인가하고, 100 IU/mL IL-2 + 10 ng/mL IL-7(Miltenyi, Cat # 130-095-363)이 보충된 R10 배지에 즉시 회수하였다. 편집된 T 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음 날, 100 IU/mL의 IL-2가 포함된 신선한 R10을 세포에 첨가하였다. 유전자 편집 후 5~7일 후에, 유세포 계측법을 통해 KO 효율을 평가하였다. KO 효율은 약 50% 내지 높게는 약 100%의 범위였다. KO 효율을 다양한 방식으로 평가하였다: TRAC의 경우, CD3/TCRab 발현을 평가하였고; b2m, NLRC5, 및 RFX5의 경우, 항-b2m 또는 항-HLA 항체를 사용하였다. 후술하는 바와 같이 편집된 세포를 정제하기 때문에 편집 효율이 더 낮아도 된다. KO를 약 22일차에 확인하였는데, 비교적 안정한 것으로 밝혀졌다.
제조사의 권장 지침에 따라 MACS 음성 선택(Stem Cell Technologies, EasySep 인간 TCR 알파/베타 고갈 키트, Cat # 17847)을 사용하여 TRAC KO 세포를 정제하였다. 정제된 T 세포를 즉시 사용하거나, 90% FBS + 10% DMSO에 5e6 세포 분취물로 냉동시켰다.
시험관내 동종이계 거부반응 분석
프라이밍된 T 혼합 림프구 반응(MLR) (도 7, 14a~14c, 17b)
위에서 이식편 T 세포를 만드는 데 사용한 공여자 유래의 조사된 PBMC에 대해 인간 PBMC(숙주)를 프라이밍하여 동종반응성 T 세포 클론의 증식을 촉진하였다. 간략하게, 이식편 PBMC를 30 Gy로 조사하고, R10 + 20 IU/mL IL-2 + 10 ng/mL IL-7 + 10 ng/mL IL-15(Miltenyi, Cat # 130-095-765)에서 숙주 PBMC와 1:1 비율로 4일 동안 공동 배양하였다. 배지를 사이토카인이 없는 R10으로 교환하고, 세포를 3일 동안 추가로 배양하였다. 그 후, MACS 음성 선택(Miltenyi, 인간 범 T 세포 단리 키트, Cat #130-096-535)을 제조사의 권장 지침에 따라 사용하여 범 T 세포를 단리하였다. 96-웰 플레이트에서, 20,000개의 이식편 T 세포를 20,000개의 프라이밍된 숙주 T 세포와 함께 시딩하고, 37℃, 5% CO2 하에 R10 + 20 IU/mL IL-2에서 2일 동안 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존은 살아있는 TCRαβ- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅함으로써 절대 계수를 사용해 유세포 계측법으로 의해 결정하였다.
NK MLR (도 8a~8b, 15a, 17c)
MACS 정제(Miltenyi, 인간 범 NK 세포 단리 키트, Cat # 130-092-657)를 통해 인간 NK 세포를 신선하게 단리된 인간 PBMC로부터 단리하였다. 96-웰 플레이트에서, 20,000개의 이식편 T 세포를 숙주 NK 세포와 함께 시딩하고, 37℃, 5% CO2 하에 R10 + 1000 IU/mL IL-2에서 2일 동안 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존은 살아있는 TCRαβ- CD56- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅함으로써 절대 계수를 사용해 유세포 계측법으로 의해 결정하였다.
PBMC MLR (도 16)
96-웰 플레이트에서, 20,000개의 이식편 T 세포를 200,000개의 숙주 PBMC 세포와 함께(10:1 E:T 비율) 시딩하고, 37℃, 5% CO2 하에 R10 + 20 IU/mL IL-2에서 4~13일 동안 배양하였다. 2~3일마다 신선한 R10 + IL-2를 세포에게 공급하였다. 이식편 T 세포의 생존은 살아있는 TCRαβ- CD56- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅함으로써 절대 계수를 사용해 유세포 계측법으로 의해 결정하였다. 작동자 NK 세포의 증식은 TCRαβ- CD56+ 상에서 게이팅한 살아있는 세포의 절대 계수에 의해 결정하였다. 작동자 T 세포의 증식은 TCRαβ+ CD56- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅한 살아있는 세포의 절대 계수에 의해 결정하였다.
실시예 1. 자가 항원 특이적 살해 검정에서 TAP2 KO 또는 NLRC5 KO는 T 세포를 보호한다
A. MHC 클래스 I 제시의 의존성
NLRC5는 인터페론-γ(IFN-γ)에 의해 유도될 수 있으며, IFN-γ 유도성 면역프로테아좀(즉, LMP2 및 LMP7)의 성분의 발현을 조절한다. IFN-γ-유도 MHC 클래스 I의 상향 조절은 NLRC5에 의존적인데, 이는 IFN-γ의 존재 또는 부재 시 NLRC5 KO가 MHC 클래스 I 제시를 안정적으로 억제하게 됨을 시사한다. 실제로, NLRC5 KO 일차 T 세포를 다양한 양의 재조합 IFN-γ와 함께 인큐베이션했을 때, TRAC KO 단독에 비해 MHC 클래스 I 발현이 최소로 증가하였다(도 5).
B. TAP2 KO 및 NLRC5 KO 각각은 작동자 세포 살해에 대해 보호한다
TAP2 KO 또는 NLRC5 KO에 의해 달성된 MHC의 적당한 하향조절이(도 4a, 4b 참조) 자가 항원-특이적 살해 검정에서 T 세포를 보호하는지 여부를 결정하였다. 일차 T 세포(모의 산물 세포)를 Cas9-복합체화 sgRNA와 함께 TAP2 또는 β2m으로 전기천공하고, 멜라닌세포 유래 조직 분화 항원 MART1/MelanA(BFP-P2A-MART1)로 형질도입하였다. 동시에, 동일한 공여자 유래의 모의 작동자 T 세포를 HLA-A2-제한, MART1-특이적 T 세포 수용체, F5 TCR로 형질도입하였다. 모의 산물 세포 및 작동자 세포를 72시간 동안 공동-배양한 다음, 유세포 계측을 통해 남아 있는 BFP+ (MART1-발현) T 세포를 정량화하여 항원-특이적 살해 정도를 분석하였다(도 6a~6c 참조). 표면 β2m(베타2m)을 유지한 (즉, 편집되지 않은) 항원-발현 세포가 HLA-A2-(HLA-A2-마이너스)인 경우, 이들은 작동자 세포에 의해 살해되지 않았지만(도 6a, 각 쌍의 우측 막대), 이들이 HLA-A2+인 경우 작동자에 의해 제거되었다(도 6a, 각 쌍의 좌측 막대). 이는, HLA-A2가 펩티드를 제시한다는 제한에 따라 달라지긴 하지만, F5 TCR-보유 작동자 세포가 MART1 항원-발현 세포를 살해하는 데 유능함을 확인시켜 준다.
편집되지 않은 세포와 대조적으로, TAP2 또는 β2m에 대해 편집된 (따라서, 각각 표면 β2mlow 또는 β2m-인) 항원-발현 HLA-A2+ 세포는 작동자 세포에 의한 살해로부터 완전히 보호되었다(도 6b). 유사하게, 독립적인 실험에서, NLRC5 또는 β2m에 대해 편집된 HLA-A2+ 세포도 작동자 세포에 의한 살해로부터 보호되었다(도 6c). 따라서, β2m, TAP2, 또는 NLRC5의 녹아웃은 편집된 T 세포를 T 세포-매개 항원-특이적 살해로부터 보호하지만, TAP2 KO 및 NLRC5 KO는 표면 MHC에서 β2m KO보다 더 적은 감소로 이를 달성한다.
실시예 2. 다형성 에피토프의 맥락에서 NLRC5 KO의 보호 효과
다형성 에피토프의 맥락에서 NLRC5 KO의 보호 효과를 평가하기 위해, 동종이계 공여자로부터 신선하게 단리한 범 T 세포를 사용해 단방향 T 세포 혼합 림프구 반응(MLR)에서 이들 표적을 시험하였다. 먼저, CRISPR/Cas9를 통해 β2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO가 있거나 없는 TRAC KO에 대해 범 T 세포를 유전자 편집하였다. 그런 다음, 표적을 정제하여 임의의 TCR α/β 발현 세포를 제거하였다. 작동자 PBMC를 동일한 표적 공여자로부터 단리한 조사된 PBMC와 함께 1주일 동안 공동 배양하여 동종반응성 T 세포의 성장과 증식을 촉진하였다. 작동자 범 T 세포를 정제하고 표적과 함께(1:1 비율) 2일 동안 공동 배양하였다. 살해의 정도는 살아있는 표적의 절대 수를 분석하여 결정하였다(도 7). 자가 환경에서, 변형 전략 중 어느 하나에서도 살해는 관찰되지 않았다. 동종이계 환경에서는, TRAC KO 변형된 표적 세포에 대해 유의한 동계반응성이 관찰되었는데, 이는 β2m, TAP2, 또는 NLRC5 KO에 의해 유의하게 약독화되었다. 따라서, 다클론 동종이계 환경에서, 이들 MHC 클래스 I 하향조절 변형은 동종반응성 T 세포 인식을 완화시킨다.
실시예 3. TAP2 KO 및 NLRC5 KO T 세포는 β2m KO T 세포보다 NK-매개 살해에 덜 취약하다
β2m KO를 통한 표면 MHC의 용발은 NK-매개 살해를 야기한다(도 2a~2b). TAP2 KO 또는 NLRC5 KO에 기인하는 표면 MHC의 적당한 하향조절(도 4a~4b)이 NK-매개 살해를 유사하게 야기하는지 여부를 결정하기 위해, CRISPR/Cas9를 통해 범 T 표적 세포를 TRAC KO 및 β2m , TAP2, 또는 NLRC5 KO에 대해 편집하였다. TCR-음성 표적 T 세포를 동종이계 공여자 유래의 신선하게 단리된 NK 세포와 함께 0:1, 1:1, 또는 5:1의 NK 작동자:T 표적의 비율로 72시간 동안 공동 인큐베이션하였다. NK-매개 살해를 유세포 계측법으로 평가하였다(도 8a~8c 참조). 이전에 관찰된 바와 같이, b2m KO T 세포는 동종이계 NK 세포에 의해 1:1 또는 5:1로 효율적으로 살해되었다. 대조적으로, 대다수의 TAP2 KO T 세포는 1:1 NK:T로 인큐베이션했을 때 생존하였으며, NLRC5 KO T 세포는 5:1 NK:T에서도 거의 대부분 유지되었다(도 8a). 2개의 추가 동종이계 공여자 유래의 NK 세포와 함께 동일하게 인큐베이션한 결과 유사한 결과를 얻었는데, 이는 TAP2 KO 및, 특히 NLRC5 KO T 세포가 b2m KO T 세포가 유발한 것보다 더 적게 NK-매개 살해를 유발함을 나타낸다(도 8b). 편집 효율이 100%가 아니기 때문에, 본 실험에서 사용된 T 세포에는 편집되지 않은 세포뿐만 아니라 β2m, TAP2, 또는 NLRC5 유전자좌에서 편집된 세포들도 포함되어 있다. NK-매개 살해가 편집된 세포를 선택하는 경우, NK 세포를 첨가하면 MHC null/low(편집된) 세포가 MHC 재생(편집되지 않은) 세포로 이동하게 될 것이다. 실제로, β2m KO 세포의 경우, 1:1 NK 세포를 첨가했을 때 거의 모든 미편집 세포가 선택된 반면, TAP2 KO 세포의 경우, 미편집 세포가 비슷하게 선택되기 위해서는 5:1 NK 세포를 첨가해야 했다(도 8c). NLRC5 유전자좌에서 편집된 T 세포는 5:1 NK 세포에서도 이러한 선택을 나타내지 않았는데, 이는 이들 세포가 결측 자기(missing self)에 따라 NK-매개 살해로보터 명백하게 제외되었음을 추가로 입증한다.
실시예 4. NLRC5 KO는 DLL3 CAR 매개 세포독성을 손상시키지 않는다
NLRC5 KO는 예시적인 DLL3 CAR-매개 세포독성을 손상시키지 않는 것으로도 나타났다(도 10a~10b 참조). 예시적인 DLL3 CAR 서열은 표 3에 나타나 있다. TRAC KO(검은색 삼각형) 또는 TRAC KO + NLRC5 KO(역삼각형)를 포함하는 항-DLL3 CAR+ T 세포는, DLL3high-발현 WM266.4 종양 세포(도 10a, 3개의 상이한 작동자:표적 비율이 도시되어 있음) 및 DLL3low -발현 DMS273 종양 세포(도 10b)와 공동으로 인큐베이션했을 때 유사한 단기 세포독성을 나타냈다. 표적 세포를 단독으로 성장시키거나(점) 형질도입되지 않은 T 세포가 존재하는 가운데 성장시켰을 때(사각형), 표적 세포 수는 기하급수적으로 성장하였고 서로 유사한 비율로 감소하였다. 본 실험에는 다음의 방법을 사용하였다.
단기 살해: 방법
Incucyte 플랫폼(Sartorius)을 사용하여 시간 경과에 따른 종양 표적 세포의 수를 측정하여 세포독성을 결정하였다. 간략하게, WM266.4 종양 세포를, 핵-제한 GFP인 NucLight Green(Sartorius Cat # 4475)을 안정적으로 발현하도록 렌티바이러스로 조작하고, 표적 세포로서 사용하였다. 표적 세포를 웰당 5,000개의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 도말하였다. DLL3 CAR T 세포를 해동하고, 도말된 표적 세포에 다양한 효과기:표적(E:T) 비율로 첨가하였다. 표적 세포(GFP+)의 수를 총 132시간 동안 6시간마다 계수하였다.
TRAC KO(검은색 삼각형) 또는 TRAC KO + NLRC5 KO(역삼각형)를 포함하는 항-DLL3 CAR+ T 세포를 표적 세포와 함께 더 긴 시간 동안 인큐베이션했을 때에도 서로 유사한 세포독성을 나타냈다(도 10c). 이들 실험에는 다음의 방법을 사용하였다.
연속 살해: 방법
살아있는 표적 세포로부터의 발광 신호의 감소를 측정함으로써 세포독성을 결정하였다. WM266.4 종양 세포가 루시페라아제를 안정적으로 발현하도록 렌티바이러스로 조작하고, 표적 세포로서 사용하였다. 표적 세포를 웰당 5,000개의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 도말하였다. DLL3 CAR T 세포를 해동하고, 도말된 표적 세포에 3:1 E:T 비율로 첨가하였다. 2~4일마다, 세포의 절반을 백색 벽의 96-웰 플레이트로 옮기고, OneGlo 기질(Promega, Cat # E6110)과 함께 1:1 비율(v:v)로 실온에서 2분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. SpectraMax M3 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 상대 발광 단위를 측정하고, 아무런 세포가 없는 웰에 대해 배경을 차감하였다. 세포독성(%) = 100 x [1 - (RLUtest/RLUcontrol)]. 미치료 표적 세포를 사용하여 RLUcontrol을 결정하였다.
실시예 5. 제조 가능성
이들 조작 전략의 제조 가능성을 시험하기 위해, 증식 및 현질도입 효율을 DLL3-특이적 CAR과 조합하여 평가하였다. 범 T 세포를 유전자 편집하고 동시에 CAR 발현을 위해 형질도입하고, TCR αβ 발현에 대해 음성선택하였다. 유전자 편집된 세포를 오로지 CAR 형질도입 단독과 비교해 유사한 효율로 형질도입하였다(도 9a). 또한, DLL3 CAR을 발현하는 세포를 TRAC KO 및 NLRC5 KO와 함께 증식시켰을 때 DLL3 CAR 및 TRAC KO 단독과 비교하여 유사한 성장 속도가 나타냈다(도 9b).
실시예 6. 면역 회피 유전자 KO의 활성
RFX 및 기타 KO가 MHC 발현에 미치는 효과
서열번호 1~11의 상응하는 sgRNA를 사용해 녹아웃 T 세포주를 제조하였는데, 이들 각각은 전술한 것과 같이 β2m, NLRC5, RFX5, CIITA, RFXANK, 및 RFXAP 중 하나에 대한 녹아웃을 포함하였다. 각각의 녹아웃이 HLA-ABC(MHC-I) 및 HLA-DR, DP, DQ(MHC-II)의 세포 표면 발현 수준에 미치는 효과를 유전자 편지 후 7일차에 유세포 계측법에 의해 평가하고 모의 유전자 편집의 효과와 비교하였다(도 11a~11b 참조). 데이터는, 특히, RFX5 및 RFXANK 중 어느 하나의 녹아웃이 HLA-ABC(MHC-I) 및 HLA-DR, DP, DQ(MHC-II) 둘 다의 세포 표면 발현 수준의 상당한 감소를 야기함을 나타낸다.
유사한 실험을 수행하여, 3명의 독립적인 T 세포 공여자로부터 제조한 TRAC+β2m 이중 KO, TRAC+NLRC5 이중 KO, 및 TRAC+RFX5 이중 KO를 비교하였다(도 12a~12b 참조). TRAC 단일 KO를 대조군으로서 사용하였다. 3명의 공여자 모두의 세포에 대해, MHC-II 및 놀랍게도 MHC-I 발현 수준도 모두 TRAC KO에서보다 RFX5 KO에서 상당히 더 낮았음이 관찰되었다(도 12a~12b 참조).
면역 회피 T 세포의 성장
3명의 독립적인 T 세포 공여자로부터 각각 제조된 β2m + TRAC, NLRC5 + TRAC, 및 RFX5 + TRAC 이중 녹아웃의 성장 능력을 평가하였다(도 13a~13b 참조). 유전자 편집 후 약 11일의 기간에 걸쳐, 세포 증식은 30배, 70배, 또는 40배 넘게 도달하였고, RFX5 이중 녹아웃, NLRC5 이중 녹아웃, 및 TRAC 단일 녹아웃 간에 유의한 차이가 없었다(도 13a 참조).
IL-2가 결여된 배지에서 녹아웃 세포를 유지함으로써 세포의 지속성을 또한 평가하였다. 세포 수는 IL-2의 제거 후 3일 동안 본질적으로 동일하게 유지되었고, IL-2의 제거 후 5일차에 약 50%만큼 감소하였다. NLRC5 + TRAC 이중 KO, RFX5 + TRAC 이중 KO 및 대조군 TRAC KO 간에 차이는 관찰되지 않았다. 20K 세포를 20 IU/mL IL-2와 함께 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 4일차에, IL-2 없이 배지를 교환하였다. 그 후 2~3일마다 배지를 재공급하였다(도 13b 참조).
MHC-I/II 발현의 하향조절은 동종반응성을 완화시킨다.
a. 시험관내 동종이계 거부반응 검정: 프라이밍된 T 혼합 림프구 반응(MLR)
이중 KO T 세포를 프라이밍된 T 세포와 공동 배양하여 KO T 세포가 대조군 TRAC KO 세포의 생존율과 상이한 생존율을 갖는지 여부를 결정하였다. 구체적으로, 2명의 동종이계 공여자 유래의 T 세포를 이식편 공여자 유래의 조사된 세포에 대해 1주 동안 프라이밍하였다. 이식편 공여자 유래의 T 세포를 편집하여 KO 세포(TRAC(대조군)에 대한 KO, TRAC + β2m, TRAC + NLRC5, 또는 TRAC + RFX5에 대한 이중 KO)를 만들고, KO 이식편 세포를 프라이밍된 CD4+, CD8+, 및 범 T 세포와 함께 공동 배양하였다. 프라이밍된 T 세포와의 공동 배양에서 생존한 이식편 KO 세포의 수를 결정하였다. 두 공여자 모두에 대해 및 3개의 T 세포 집단(CD4+, CD8+, 및 범 T 세포)에 대해 프라이밍한 세포와 공동 배양한 후, TRAC KO 세포보다 유의하게 더 높은 비율의 TRAC + RFX5 KO 세포가 생존하였다(도 14a: CD4+ 세포, 도 14b: CD8+ 세포, 및 도 14c: 범 T 세포 참조).
방법: 2명의 동종이계 공여자 유래의 T 세포를 이식편 공여자 유래의 조사된 세포에 대해 1주 동안 프라이밍하였다. 그 이후, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 또는 범 T 세포를 정제하고 이식편 T 세포와 함께 48시간 동안 1:1 E:T 비율로 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 단방향 살해를 유세포 계측법으로 평가하였다. 도 14a~14c에는 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다. 생존(%) = 세포 수 / (작동자가 없는 세포 수) x 100. 전술한 바와 같이 녹아웃을 제조하였다.
b. TRAC + NLRC5 및 TRAC + RFX5 이중 KO T 세포는 동종이계 NK 세포에 의해 최소로 살해된다
3명의 상이한 공여자 유래의 이식편 세포를 편집하여 KO(TRAC) 또는 이중 KO(TRAC + β2m, NLRC5, 또는 RFX5 중 하나)를 만들고, KO 이식편 세포를 NK 세포와 공동 배양하였다. NK 세포와의 공동 배양에서 생존한 이식편 KO 세포의 수를 결정하였다. NK 세포와 공동 배양에서 NLRC5 KO 세포의 절반이 생존하였고 RFX5 KO 세포는 절반 넘게 생존하였다(도 15a 참조).
방법 요약: NK 세포를 동종이계 PBMC로부터 단리하고, 1000 IU/mL IL-2의 존재 하에 이식편 T 세포와 함께 1:1 E:T 비율로 48시간 동안 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 단방향 살해를 유세포 계측법으로 평가하였다. 추가적인 또는 대안적인 방법, NK 혼합 림프구 반응(MLR)에 대한 설명에 대해서는 하기를 또한 참조한다.
도 15b에 대한 방법: 동종이계 PBMC를 다양한 유전자 편집 변형이 포함된 TRAC KO 이식편 T 세포와 함께 10:1 E:T 비율로 7일 동안 공동 배양하였다. TCRαβ- CD56+ 세포에 대해 게이팅된 절대 세포 수를 사용하여 유세포 계측법으로 동종이계 NK 세포의 증식을 결정하고, 이식편 세포가 없는 상태에서 배양한 동종이계 NK 세포에 대해 정규화하였다. 6개의 생물학적 복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
도 16에 대한 방법. 동종이계 PBMC를 다양한 면역 회피 변형이 포함된 TRAC KO 이식편 T 세포와 함께 10:1 E:T 비율로 9일 동안 공동 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존을 유세포 계측법에 의해 결정하고 아무런 작동자 없이 배양한 이식편 T 세포에 대해 정규화하였다. 기술적 3복제물의 평균 ± SD가 도시되어 있다.
실시예 7. US11의 과발현
US11 과발현은 동종반응성 T 세포 회피를 향상시키는 것으로 또한 나타났는데, 이를 NLRC5 녹아웃과 조합하면 단독으로 제공하는 것보다 더 큰 효과를 얻을 수 있다(도 17a~17d 참조). 다음 방법들을 도 17b에 도시된 실험에 사용하고, 도 7 및 14a~c에 도시된 실험에도 사용하였다.
US11 과발현 T 세포의 생성: 방법
US11을 암호화하는 렌티바이러스를 만들기 위해, 폴리-L-리신(R 및 D 시스템)으로 미리 코팅된 10 cm 접시에서 10% FBS (HyClone), 비필수 아미노산(Gibco), 및 피루브산 나트륨(Gibco)으로 보충된 DMEM(Gibco) 1 mL 당 75만개의 HEK-293T 세포를 플레이팅하였다. 다음 날, pLVX 골격(서열번호 8~12; 도 18) 상에서 US11을 암호화하는 플라스미드를 렌티바이러스 포장 벡터 psPAX2 및 pMD2G와 3:4:1의 질량비로 혼합하였다. 제조사의 권장 지침에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후 지질-DNA 복합체를 형성하였다. 혼합물을 HEK-293T 단층에 적가하고(약 70~90% 콘플루언스), 세포를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 16~20시간 후, 배지를 R10으로 교체하였다. 48시간 후, 상청액을 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다. 바이러스를 Lenti-X(Takara Bio)로 20X 농축시키고, 2일 전에 TransAct(1:100)로 활성화시킨 1백만개의 T 세포에 1:10 희석물로 첨가하였다. 형질도입 효율은 청색 형광 단백질(BFP+)의 발현에 의해 유세포 계측법으로 평가하였다.
프라이밍된 T 혼합 림프구 반응(MLR)
위에서 이식편 T 세포를 만드는 데 사용한 공여자 유래의 조사된 PBMC에 대해 인간 PBMC(숙주)를 프라이밍하여 동종반응성 T 세포 클론의 증식을 촉진하였다. 간략하게, 이식편 PBMC를 30 Gy로 조사하고, R10 + 20 IU/mL IL-2 + 10 ng/mL IL-7 + 10 ng/mL IL-15(Miltenyi, Cat # 130-095-765)에서 숙주 PBMC와 1:1 비율로 4일 동안 공동 배양하였다. 배지를 사이토카인이 없는 R10으로 교환하고, 세포를 3일 동안 추가로 배양하였다. 그 후, MACS 음성 선택(Miltenyi, 인간 범 T 세포 단리 키트, Cat #130-096-535)을 제조사의 권장 지침에 따라 사용하여 범 T 세포를 단리하였다. 96-웰 플레이트에서, 20,000개의 이식편 T 세포를 20,000개의 프라이밍된 숙주 T 세포와 함께 시딩하고, 37℃, 5% CO2 하에 R10 + 20 IU/mL IL-2에서 2일 동안 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존은 살아있는 TCRαβ- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅함으로써 절대 계수를 사용해 유세포 계측법으로 의해 결정하였다.
다음 방법들을 도 17c에 도시된 실험에 사용하고, 도 8a~8b 및 15a에 도시된 실험에도 사용하였다.
NK 혼합 림프구 반응(MLR)
MACS 정제(Miltenyi, 인간 범 NK 세포 단리 키트, Cat # 130-092-657)를 통해 인간 NK 세포를 신선하게 단리된 인간 PBMC로부터 단리하였다. 96-웰 플레이트에서, 20,000개의 이식편 T 세포를 숙주 NK 세포와 함께 시딩하고, 37℃, 5% CO2 하에 R10 + 1000 IU/mL IL-2에서 2일 동안 배양하였다. 이식편 T 세포의 생존은 살아있는 TCRαβ- CD56- CD4+ CD8+ 상에서 게이팅함으로써 절대 계수를 사용해 유세포 계측법으로 의해 결정하였다.
실시예 8: 스텔스 넉아웃 T 세포는 IFNη에 민감하지 않았다
다양한 유전자 녹아웃으로 변형된 T 세포에서 MHC 표면 발현 수준에 IFNη이 미치는 효과를 시험하였다. 다양한 유전자 KO(TRAC KO 단독(대조군) 또는 TRAC KO + B2M KO, NLRC5 KO, RFX5 KO, 또는 CIITA KO)를 갖는 T 세포를 다양한 농도의 재조합 인간 IFN-γ(R&D Systems)과 함께 96-웰 플레이트에 3x104 세포/웰로 72시간 동안 시딩하였다. MHC-I 및 MHC-II의 발현은 항-HLA-ABC 및 항-HLA-DR, DP, DQ 항체(예: BioLegend, Cat # 311404, 361708)로 염색하여 결정하고, 유세포 계측법으로 분석하였다.
도 19a~b는 대조군 T 세포의 MHC-I 및 MHC-II의 발현(TRAC KO 단독)이 IFN-γ의 농도 증가와 함께 상승하였지만, B2M KO, NLRC5 KO, 또는 RFX5 KO T 세포에서 MHC-I 발현이 증가하였고, RFX5 KO 또는 CIITA KO T 세포에서 MHC-II의 발현은 IFN-γ 첨가와 상관없이 상대적으로 낮게 유지되었음을 보여준다.
실시예 9: 스텔스 CD19 CAR T 세포의 제조
CD19 CAR의 발현을 위해 T 세포에 렌티바이러스를 형질도입한 것을 제외하고, 다양한 유전자 KO를 갖는 예시적인 CD19 CAR T 세포을 생산하기 위해 예를 들어 실시예 4 및 5에서 전술한 것과 동일한 방법을 사용하였다. 예시적인 CD19 CAR 서열은 표 3에 나타낸 것과 같다. T 세포를 해동하고 활성화한 후, 네온 형질감염 시스템(Neon Transfection System(Invitrogen)) 또는 Nucleotfector 4D(Lonza)를 사용하여 2일차(데이터는 도 20~21에 도시됨) 또는 5일차(데이터는 도 23에 도시됨)에 유전자 편집을 수행하였다. TCR 고갈(Stem Cell Technologies, EasySep 인간 TCR 알파/베타 고갈 키트, Cat # 17847)은 일반적으로 14~16일차에 수행하였다. TCR-고갈된 T 세포를 동결 보존하고, 나중에 추가적인 분석을 위해 해동하였다. Vi-CELL 계수기(Beckman Coulter)로 생존 세포를 계수하여 생산 중 세포 증식을 추적하였다. 배수 증식은 다양한 시점의 생존 세포 수를 2일차(유전자 편집 시점)와 비교하여 계산하였다. CAR+ T 세포, CD4/CD8 비율, 및 T 세포 하위 집합의 백분율은 유세포 계측법에 의해 결정하였다. CD19 CAR T 세포는 항-개별특이형 항체(Acro Biosystems, Cat # FM3HPY53)에 의해 식별하였다. CAR+CD4+ 세포 또는 CAR+CD8+ 세포의 표현형을 CD62L 및 CD45RO 발현에 의해 결정하고, 줄기 세포 메모리(CD62L+/CD45RO-), 중심 메모리(CD62L+/CD45RO+), 작동자 메모리(CD62L-/CD45RO+), 또는 작동자(CD62L-/CD45RO-) 세포 집단으로서 정의하였다.
다양한 유전자 KO를 갖는 CD19 CAR T 세포의 제조 가능성을 DLL3 CAR T 세포와 유사한 방식으로 평가하였다. 유전자-편집된 세포를 유사한 효율로 형질도입하고, 생산 전반에 걸쳐 대조군 CAR T 세포와 비교하여 유사한 동역학을 나타냈다(도 20a). 또한, CD19 CAR을 발현하는 CAR T 세포로서, TRAC KO 및 다양한 추가 KO를 함께 가진 CAR T 세포의 세포 증식(도 20b), CD4/CD8 비율(도 20c), 및 메모리 표현형(도 20d)은 TRAC KO만을 가진 CD19 CAR T 세포와 비슷하였다.
예시적인 CAR 서열
CAR 서열 서열번호
DLL3 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVFYCAIDPEYYDILTGGDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCLQHDSFPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR		 18
CD19 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssGGGGSGGGGSGGGGSdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR		 19
실시예 10: 이식편으로서 CD19 CAR T 세포를 이용한 PBMC MLR 검정
다음으로, 상이한 공여자 유래의 동종이계 PBMC와 공동 배양한 후, 다양한 유전자 녹아웃(KO)을 보유한 이식편 CD19 CAR T 세포의 생존을 조사하였다. CAR T 세포의 다양한 유전자 편집 변형이 동종이계 면역 세포 인식을 완화시키는 데 미치는 효과를 상기 실시예 6에 기술된 것과 같은 PBMC MLR 검정에서 평가하였다. 도 21a는 CD19 CAR T 세포에서 β2m ,NLRC5, 또는 RFX5를 녹아웃하는 것이 숙주 CD8 T 세포 증식을 감소하였음을 보여주는데, 이는 CD19 CAR T 세포 상에서 MHC-I 발현을 감소시킴으로써 동종이계 CD8 T 세포 인식이 효과적으로 완화되었음을 시사한다. CD19 CAR T 세포의 생존율도 정량화하였다. NLRC5, RFX5, 및 CIITA를 녹아웃한 결과 생존률은 대조군 CD19 CAR T 세포와 비슷하였지만, β2m을 녹아웃한 결과 CD19 CAR T 세포의 생존률은 대조군 CD19 CAR T 세포와 비교해 나빴다(도 21b 참조).
실시예 11: NSG 마우스 모델에서의 T 세포 거부반응
동종이계 T 세포 거부반응 모델을 대상으로 다양한 유전자 녹아웃(KO)을 갖는 CD19 CAR T 세포의 지속성 및 항종양 효능을 생체내에서 평가하였다. 8~12주령의 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. -6일차에 NSG 마우스에게 1 Gy를 조사하였고, 시험관에서 증식시킨 7 × 106개의 HLA-A2+ 수용자 유래의 동종이계 인간 T 세포를 투여하였다. 요약하자면, 동종이계 T 세포를 동결보존에서 복구한 직후, 5% 인간 AB 혈청(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) 및 100 IU/mL IL-2(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 보충된 X-Vivo 15 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 T 세포 TransAct™(Miltenyi Biotec, Auburn, CA; 1:100 희석물)를 사용하여 활성화시켰다. 도 3a 참조. 활성화 2일 후, T 세포를 원심분리하여 TransAct를 제거한 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 100 IU/ml IL-2가 보충된 신선한 XVivo-15 배지에 6~8일 동안 재현탁한 후, 정맥내 주사를 통해 동물에게 투여하였다. -4일차에, 마우스에게 1x105 루시페라아제-표지된 B2M KO Raji 종양 세포를 정맥내 주사를 통해 투여하였다. -1일차에, 총 신체 생물발광에 기초하여 마우스를 무작위 배정하였다. 0일차에, 다양한 유전자 편집 변형(TRAC KO 단독 또는 β2m, NLRC5, 또는 RFX5 중 하나의 KO 포함)을 갖는, HLA-A2- 공여자로부터 생산된 CD19 CAR T 세포를 3 × 106 CAR+ 세포로 정맥내 주사하였다. 비-형질전환 T 세포로 정규화함으로써 총 T 세포 수는 모든 군에 걸쳐 일정하게 유지되었다. Raji 종양의 성장을 표시된 시점에 전신 생물발광에 의해 추적하였다. 생체 내에서 CAR T 세포 지속성을 추적하기 위해, CAR T 투여 후 2, 9, 및 16일차에 뺨 채혈에 의해 40 μL의 말초 혈액을 수득하였다. 적혈구 용해 후, 샘플을 항-인간 CD45, HLA-A2, 및 항-개별특이적 항체로 염색하여 CD19 CAR T 세포를 식별하였다. 계수 비드(123count eBeads, Thermo Fisher)를 사용해 CAR T 세포 수를 정규화하였다. 군 당 N=8마리 마우스.
MHC-I 발현을 감소시키기 위한 유전자 변형(B2m, NLRC5, 또는 RFX5 KO)을 갖는 CD19 CAR T 세포는 대조군 CD19 CAR T 세포(TRAC KO 단독)와 비교하여, 더 높은 CAR T 세포 수를 나타냈고 말초 혈액에서 더 오래 지속되었는데, 이는 MHC-I 발현이 감소된 CAR T 세포가 동종이계 T 세포 거부반응을 완화시키는 데 있어서 우월하였음을 시사한다(도 22b). 우월한 CAR T 세포 지속성과 일관되게, B2M KO, NLRC5 KO, 및 RFX5 KO CD19 CAR T 세포 또한 대조군 CD19 CAR T 세포와 비교하여 더 양호한 항종양 효능을 나타냈다(도 22c).
실시예 12: 동계 마우스 모델에서의 NK 거부반응
유전자-편집된 마우스 T 세포의 생산: CD45.2 대립유전자를 갖는 C57BL/6 마우스의 비장을 수확하고, 단일 세포 현탁액을 gentleMAC 해리기(Miltenyi)에 의해 수득하였다. 그런 다음, 마우스 T 세포를 마우스 T 세포 단리 키트 II로 정제한 다음, 제조사의 프로토콜(Miltenyi)에 따라 마우스 T 세포 활성화/증식 키트에 의해 활성화하였다. 활성화 후 1일차에, 인간 T 세포와 유사하게 마우스 T 세포를 전기천공(Nucleofector 4D, Lonza)을 통해 CRISPR/Cas9로 유전자 편집하였다. 사용된 sgRNA 서열은 5’에서 3’ 방향으로 다음과 같다: ugaguauacuugaauuugag (B2m, 서열번호 20) 및 gccucacaagccaggcccac (Nlrc5, 서열번호 21). 유전자-편집된 마우스 T 세포를 IL-2(40 ng/ml) 및 IL-7(40 ng/ml)의 존재 하에 6일 동안 시험관 내에서 증식시킨 후 동물에게 투여하였다.
이식편 T 세포의 입양 전달(adoptive transfer): CD45.1 또는 CD45.2 대립유전자를 갖는 8~12주령 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. -3일차에, CD45.1 대립유전자를 가진 C59BL/6 마우스에게 2.5 Gy를 조사하고, 0일차에 1 × 107개의 대조군(유전자 편집하지 않음) 또는 CD45.2 대립유전자를 가진 C57BL/6 마우스 유래의 시험관에서 증식시킨 유전자 편집한(B2m 또는 Nlrc5 KO) T 세포를 정맥내 주사를 통해 투여하였다. 도 23a 참조. 또한, -3일차 및 0일차에, CD45.1 대립유전자를 가진 일부 C57BL/6 마우스에게는 복강내 주사를 통해 NK 고갈 항체(항-NK1.1 항체, BioXcell)를 매 주입 시마다 200 ug/마우스로 투여하고, “+NK 고갈” 코호트로서 표시하였다. 말초 혈액 내 숙주 면역 세포 및 이식편 T 세포의 세포 수를 유세포 계측법에 의해 추적하였다. 이식편 T 세포 투여 후 표시된 시점에 40 μL의 말초 혈액을 뺨 채혈에 의해 수득하였다. 적혈구 용해 후, 샘플을 CD45.1, CD45.2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD335, CD11b, 및 H2-Kb에 대한 항-마우스 항체로 염색하여 이식편 T 세포 및 숙주 면역 세포 하위 집합을 식별하였다. 계수 비드(123count eBeads, Thermo Fisher)를 사용해 세포 수를 정규화하였다. 군 당 N=5마리 마우스. 평균 ± SEM이 도시되어 있다.
이식편 투여 전에 준치사 선량을 조사하여 C57BL/6 마우스의 숙주 면역 세포를 일시적으로 감소시켰다. 일부 마우스에게는 NK 고갈 항체를 또한 투여하여 잔류 NK 세포를 심층적으로 고갈시켰다. 그런 다음, 동계 마우스 유래의 유전자 편집된(B2m 또는 NLRC5 KO) 또는 편집되지 않은 대조군 이식편 T 세포를 숙주에게 입양 전달하였다. 입양 전달 T 세포의 생착을 유세포 계측법에 의해 다양한 시점에 추적하였다. B2m 또는 Nlrc5 KO 중 어느 하나를 가진 이식 T 세포는 항-마우스 H2-Kb(BioLegend, cat. # 116508)를 사용해 결정했을 때, 낮은 MHC-1 발현을 나타냈다(도 23b). NLRC5 KO를 가진 이식편 T 세포의 생존은 NK 고갈 여부와 상관없이 대조군 이식편과 유사하였는데, 이는 Nlrc5를 녹아웃하는 것이 마우스에서 NK 세포 거부반응을 일으키지 않았음을 시사한다(도 23c). 반대로, B2m KO 이식편 세포는 숙주 NK 세포가 고갈되지 않는 한 생존하지 못하였는데, 이는 B2m의 녹아웃이 이식편 T 세포를 NK 거부반응에 민감하게 하였음을 시사한다(도 23c).
특허, 특허 출원, 문서, 교과서 등을 포함하여, 본원에 인용된 모든 참조 문헌 및 그 안에 인용된 참조 문헌은, 이들이 아직 인용되지 않은 정도로, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
개시된 교시는 다양한 응용, 방법, 키트, 및 조성물을 참조하여 설명되었지만, 본원의 교시 및 아래의 청구된 발명을 벗어나지 않고서 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 전술한 실시예는 개시된 교시를 더 잘 설명하기 위해 제공되며, 본원에서 제시된 교시의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 교시는 이들 예시적인 구현예의 관점에서 설명되었지만, 당업자는 과도한 실험 없이 이들 예시적인 구현예의 수많은 변형 및 변경이 가능하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 모든 변형 및 변경은 본 교시의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC. <120> KNOCKDOWN OR KNOCKOUT OF ONE OR MORE OF TAP2, NLRC5, BETA2M, TRAC, RFX5, RFXAP AND RFXANK TO MITIGATE T CELL RECOGNITION OF ALLOGENEIC CELL PRODUCTS <130> AT-041/04WO <140> <141> <150> 63/267,041 <151> 2022-01-21 <150> 63/176,818 <151> 2021-04-19 <150> 63/143,748 <151> 2021-01-29 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 gcugguacac ggcaggguca 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 ucacgucauc cagcagagaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 cagcucugca aggcucuggg 20 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Claims (86)

  1. 조작된 면역 세포로서, 상기 세포는 RFX5, NLRC5, TAP2, β2m, TRAC, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상이 감소된 수준으로 기능적으로 발현되도록 조작되는, 조작된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, TRAC 및 RFX5 또는 TRAC 및 NLRC5는 감소된 수준으로 기능적으로 발현되는, 조작된 면역 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 다음을 나타내는, 조작된 면역 세포:
    세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준;
    세포 표면에서 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준; 또는
    세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준 및 세포 표면에서 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 조작된 면역 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 항원 결합 단백질을 추가로 발현하는, 조작된 면역 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)인, 조작된 면역 세포.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 상기 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 위치하거나, CIITA, RFX5, RFXANK, 및 RFXAP로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌 내에 위치하는, 조작된 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 건강한 자원자로부터 수득된 면역 세포이거나 이로부터 유래되거나, 환자로부터 수득되거나, iPSC로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 만드는 방법으로서, TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP, CIITA, 및 RFXANK 중 하나 이상의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  13. TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다를 감소된 수준으로 기능적으로 발현하는 조작된 면역 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 다음을 포함하는, 조작된 면역 세포:
    (a) TAP2의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서의 녹아웃,
    (b) NLRC5의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서의 녹아웃, 또는
    (c) TAP2의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서의 녹아웃 및 NLRC5의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서의 녹아웃.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 90% 이하, 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하의 수준으로 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다를 발현하는, 조작된 면역 세포.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 90% 이하, 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하의 수준으로 TAP2를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 90% 이하, 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하의 수준으로 NLRC5를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내거나, 세포 표면에서 MHC 클래스 II 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내는, 조작된 면역 세포.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 조작된 면역 세포.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 항원 결합 단백질을 추가로 발현하는, 조작된 면역 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)인, 조작된 면역 세포.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 상기 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 위치하거나, CIITA, RFX5, RFXANK, 및 RFXAP로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌 내에 위치하는, 조작된 면역 세포.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 건강한 자원자로부터 수득된 면역 세포이거나 이로부터 유래되거나, 환자로부터 수득되거나, iPSC로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  27. 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 만드는 방법으로서, TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 면역 세포에서 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 또는 제27항의 방법에 따라 만들어진 조작된 면역 세포로서, TAP2 및/또는 NLRC5의 기능적 발현 수준은 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(β2M), 또는 HLA와 β2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되거나, 유세포 계측법에 의해 측정되는, 조작된 면역 세포.
  29. 제1항 내지 제11항, 제13항 내지 제26항, 또는 제28항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 또는 제12항 또는 제27항의 방법에 의해 만들어진 조작된 면역 세포로서,
    (a) 상기 조작된 면역 세포는 HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G, HLA-G 단쇄 삼량체, UL18, UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, HLA-A2 단쇄 삼량체, 및 인간 거대세포바이러스(HCMV) US11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하도록 추가로 조작되고/되거나;
    (b) 상기 조작된 면역 세포는 CIITA, RFXANK, RFXAP, 및 RFX5 중 하나 이상을 발현하지 않거나 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 조작되는, 조작된 면역 세포.
  30. 조작된 면역 세포 집단으로서, 상기 조작된 면역 세포의 75% 이하가 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  31. 조작된 면역 세포 집단으로서, 상기 조작된 면역 세포의 적어도 1%는, 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하의 수준으로 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  32. 제30항에 있어서, 상기 세포의 75% 이하가 TAP2를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  33. 제30항에 있어서, 상기 세포의 75% 이하가 NLRC5를 기능적으로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 적어도 50%는 세포 표면에서 MHC 클래스 I 단백질 또는 복합체의 감소된 발현 수준을 나타내는, 조작된 면역 세포 집단.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 집단은 적어도 10%의 조작된 T 세포, 적어도 20%의 조작된 T 세포, 적어도 30%의 조작된 T 세포, 적어도 40%의 조작된 T 세포, 적어도 50%의 조작된 T 세포, 적어도 75%의 조작된 T 세포, 또는 적어도 90%의 조작된 T 세포를 포함하는, 조작된 면역 세포 집단.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 항원 결합 단백질을 추가로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포 집단.
  38. 제37항에 있어서, 상기 CAR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되거나, CIITA, RFX5, RFXANK, 및 RFXAP로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌 내에 삽입되는, 조작된 면역 세포 집단.
  39. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)인, 조작된 면역 세포 집단.
  40. 제39항에 있어서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되거나, CIITA, RFX5, RFXANK, 및 RFXAP로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌 내에 삽입되는, 조작된 면역 세포 집단.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포 집단.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포 집단은 건강한 자원자로부터 수득된 하나 이상의 면역 세포로부터 유래되거나, 환자로부터 수득된 하나 이상의 면역 세포로부터 유래되거나, 하나 이상의 iPSC로부터 유래되는, 조작된 면역 세포 집단.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 집단을 만드는 방법으로서, TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및/또는 NLRC5의 기능적 발현 수준은 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되거나, 유세포 계측법에 의해 측정되는, 조작된 면역 세포 집단.
  45. 제30항 내지 제42항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 또는 90%는 HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G 또는 HLA-G 단쇄 삼량체, UL18 또는 UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, 및 HLA-A2 단쇄 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 추가로 발현하는, 조작된 면역 세포 집단.
  46. 약학적 조성물로서, 제1항 내지 제11항, 제13항 내지 제26항, 및 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 또는 제12항 또는 제27항의 방법에 의해 만들어진 조작된 면역 세포, 또는 제30항 내지 제42항 및 제44항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 집단을 포함하고, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포 집단의 하나 이상의 세포는 HLA-E, HLA-E 단쇄 삼량체, HLA-G, HLA-G 단쇄 삼량체, UL18, UL18 단쇄 삼량체, HLA-A2, HLA-A2 단쇄 삼량체, 및 인간 거대세포바이러스(HCMV) US11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 추가로 발현하고/하거나, CIITA, RFXANK, RFXAP, 및 RFX5 중 하나 이상을 발현하지 않거나 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 조작되는, 약학적 조성물.
  48. 환자에서 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 다음을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    제1항 내지 제11항, 제13항 내지 제26항, 및 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 또는 제12항 또는 제27항의 방법에 의해 만들어진 조작된 면역 세포; 또는
    제30항 내지 제42항 및 제44항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 집단; 또는
    제46항 또는 제47항의 약학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 병태는 고형 종양 또는 액체 종양인, 방법.
  50. 조작된 면역 세포에서 내인성 MHC 클래스 I 단백질의 표면 발현 수준을 조작되지 않은 면역 세포에서의 내인성 MHC 클래스 I 또는 MCH 클래스 II 단백질의 발현 수준의 약 75% 이하로 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현 수준을 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 약 75% 이하로 감소시키는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하의 수준으로 TAP2를 기능적으로 발현하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 세포는 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하의 수준으로 NLRC5를 기능적으로 발현하는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 MHC 클래스 I 단백질을 발현하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 T 세포인, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 항원 결합 단백질을 추가로 발현하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 CAR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되거나, 상기 CAR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌가 파괴되는, 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되거나, 상기 TCR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌가 파괴되는, 방법.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 내인성 TCRa 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함하는, 방법.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 건강한 자원자로부터 수득된 면역 세포이거나, 환자로부터 수득되거나, iPSC로부터 유래되는, 방법.
  62. 제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및/또는 NLRC5의 기능적 발현 수준은 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(β2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되거나, 유세포 계측법에 의해 측정되는, 방법.
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 표면 발현 수준의 감소 정도는 유전자 편집되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 발현 수준 각각에 대해 상대적으로 결정되는, 방법.
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 항원 결합 단백질을 발현하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 CAR을 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 CAR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR)인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 파괴된 TAP2 또는 NLRC5 유전자좌 내에 삽입되는, 방법.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 TCRa 유전자 및 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 상기 조작된 면역 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 면역 세포에서 MHC 클래스 I에 의해 제시된 펩티드 다양성을 감소시키는 방법으로서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현 수준을 면역 세포에서의 야생형의 수준의 약 75% 이하로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계는 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하여 TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제73항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제73항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 발현 수준의 감소 정도는 유전자 편집되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 발현 수준 각각에 대해 상대적으로 결정되는, 방법.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및 NLRC5의 기능적 발현 수준은 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되는, 방법.
  79. 동종이계 세포의 T 세포 매개 살해를 감소시키는 방법으로서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 또는 둘 다의 기능적 발현 수준을, 조작되지 않은 세포에서의 상응하는 수준의 약 50% 이하로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계는 TALEN, 징크 핑거, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 편집 기술을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  81. 제79항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 TAP2의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  82. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 NLRC5의 기능적 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 발현 수준의 감소 정도는 유전자 편집되지 않은 동일한 유형의 세포에서의 TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 발현 수준 각각에 대해 상대적으로 결정되는, 방법.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, TAP2 및 NLRC5 중 하나 이상의 기능적 발현 수준은 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 HLA, 베타2 마이크로글로불린(B2M), 또는 HLA와 B2M 둘 다의 표면 발현 수준을 결정함으로써 측정되는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, TAP2 및/또는 NLRC5 중 하나 이상의 표면 발현 수준은 유세포 계측법에 의해 측정되는, 방법.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 TCRa 유전자 및 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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