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KR20200141470A - 체세포 재프로그래밍 및 각인의 조정을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

체세포 재프로그래밍 및 각인의 조정을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20200141470A
KR20200141470A KR1020207031724A KR20207031724A KR20200141470A KR 20200141470 A KR20200141470 A KR 20200141470A KR 1020207031724 A KR1020207031724 A KR 1020207031724A KR 20207031724 A KR20207031724 A KR 20207031724A KR 20200141470 A KR20200141470 A KR 20200141470A
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KR
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KR1020207031724A
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이 장
쇼고 마토바
Original Assignee
칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본 발명은 클로닝 효율을 개선시키고, 각인 제어 영역을 조정하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 각인 제어 영역 내에서 억제된 대립유전자를 활성화시킴으로써 각인 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 Kdm4d 과발현이 Xist 넉아웃 공여자 세포인 것을 포함하는 체세포 핵 전달 효율을 개선시키는 방법을 제공한다.

Description

체세포 재프로그래밍 및 각인의 조정을 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2018년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/654,199호의 우선권을 주장한다.
연방정부 지원된 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 HD092465 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
포유동물 난모세포는 체세포 핵 전달 (SCNT)을 통해 체세포를 전능한 상태로 재프로그래밍할 수 있다. SCNT는 의도되는 숙주와 유전적으로 동일하거나 유사한 공여자 유기체로부터의 조직의 생성을 포함하는 치료적 클로닝에 사용된다. SCNT는 또한 동물의 클로닝을 가능하게 한다. 이 기법은 농생명공학에서 뿐만 아니라 멸종위기 종의 보존에서 큰 잠재성을 갖는다. 그러나, 극도로 낮은 클로닝의 성공률은 이 기법의 실제 사용을 곤란하게 만든다. 예를 들어, 마우스의 경우, SCNT 배아의 단지 약 30％만이 배반포로 발달하고, 대리모에 전달된 배아의 단지 1 내지 2％만이 만기에 도달할 수 있다. 더욱이, 생존한 배아에서, 거의 모든 클로닝된 포유동물 종에서, 배외 조직, 예컨대 태반 및 탯줄에서 이상이 빈번히 관찰된다. 이들 관찰은 SCNT 재프로그래밍이 배아 발생 프로세스를 방해하는 일부 결함을 가짐을 시사한다. DNA 메틸화, 히스톤 변형, 및 게놈 각인에 있어서의 다양한 후생적 이상은 SCNT의 낮은 성공률에 연루되었다. 클로닝의 효율을 개선시키기 위한 상당한 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 클로닝 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 클로닝 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 Kdm4d 과발현이 Xist 넉아웃 공여자 세포인 것을 포함하는 체세포 핵 전달 효율을 개선시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 Xist 활성이 결여된 체세포로부터 얻어진 공여자 핵을 제핵된 난모세포 내로 전달하고, 난모세포에서 Kdm4d를 발현시킴으로써 클로닝된 배반포를 얻는 것을 포함하는, 클로닝된 배반포를 얻는 방법을 제공한다. 방법의 일부 실시양태에서, 난모세포는 Kdm4d mRNA로 주사된다. 일부 실시양태에서, 공여자 세포 핵은 Xist에서의 결실을 포함하거나 Xist의 불활성 형태를 포함하는 배아 섬유모세포로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 공여자 핵은 인간, 고양이, 소, 개, 돼지, 또는 말로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 방법은 또한 배반포를 임신을 위해 숙주 자궁 내로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 출생률을 통상적인 체세포 핵 전달에 비해 적어도 약 10 내지 20％ 증가시킨다. 본 발명의 일부 측면은 상기 기재된 방법에 의해 제조된 배반포를 포함한다. 본 발명의 일부 측면은 상기 기재된 방법에 의해 제조된 배반포를 착상시킴으로써 제조된 클로닝된 유기체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 얻어진 배양된 세포에서 Xist를 불활성화시키거나 Xist 활성 또는 발현을 감소시키는 단계; 배양된 세포로부터의 핵을 제핵된 난모세포 내로 전달함으로써 난모세포를 활성화시키는 단계; 및 활성화된 난모세포를 Kdm4d mRNA로 주사하고, 생성된 세포를 배양함으로써 대상체 내로의 이식에 적합한 세포 또는 조직을 얻는 단계를 포함하는, 대상체 내로의 이식을 위한 세포 또는 조직을 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 측면에서, 이 방법에 의해 제조된 세포 또는 조직이 제공된다. 일부 실시양태에서, Xist는 게놈 편집에 의해 불활성화된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CRISPR 시스템은 결실 또는 불활성화 돌연변이를 게놈 Xist 폴리뉴클레오티드에 도입하기 위해 사용된다. 방법의 다른 실시양태에서, Xist 폴리뉴클레오티드 발현 또는 활성은 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 감소된다.
본 발명의 다른 측면에서, Xist에서의 결실 또는 감소된 수준의 Xist 발현을 갖고, Kdm4d를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 갖는 세포가 제공된다.
추가의 측면은 Xist 활성이 결여된 체세포로부터 얻어진 공여자 핵을 포함하고, 통상적인 난모세포에 비해 증가된 수준의 Kdm4d를 발현하는 난모세포를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 달리 명시되지 않는다면 하기에 그들에게 할당된 의미를 갖는다.
"KDM4D 폴리펩티드"란 NCBI 참조 번호 Q6B0I6과 적어도 약 85％ 아미노산 서열 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 의미한다. 예시적인 KDM4D 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
>sp|Q6B0I6|KDM4D_인간 리신-특이적 데메틸라제 4D OS=호모 사피엔스 (Homo sapiens) OX=9606 GN=KDM4D PE=1 SV=3
Figure pct00001
"KDM4D 폴리뉴클레오티드"란 KDM4D 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM4D 핵산은 하기에 제공된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
"EZH1 폴리펩티드" (히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제 EZH1)란 NCBI 참조 서열: NP_001982에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 H3K27 메틸트랜스퍼라제 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00004
"EZH1 폴리뉴클레오티드"란 EZH1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 EZH1 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001991.4에 제공되고, 하기에 재현된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
"EZH2 폴리펩티드" (히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제 EZH2)란 유니프롯 (UniProt)KB/스위스-프롯 (Swiss-Prot): Q15910.2에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 H3K27 메틸트랜스퍼라제 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00008
"EZH2 폴리뉴클레오티드"란 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 EZH2 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001203248.1에 제공되고, 하기에 제공된다:
Figure pct00009
Figure pct00010
"KDM6A 폴리펩티드" (리신-특이적 데메틸라제 6A, 또한 히스톤 데메틸라제 UTX로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O15550.2에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6A 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00011
Figure pct00012
"KDM6A 폴리뉴클레오티드"란 KDM6A 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6A 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001291415.1에 제공된다.
"KDM6B 폴리펩티드" (리신-특이적 데메틸라제 6, 또한 JmjC 도메인-함유 단백질 3으로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O15054.4에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6B 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00013
Figure pct00014
"KDM6B 폴리뉴클레오티드"란 KDM6B 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6B 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001080424.2에 제공되고, 하기에 재현된다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
"KDM6C 폴리펩티드" (히스톤 데메틸라제 UTY, 또한 Y 염색체 상의 편재적으로-전사된 TPR 단백질로 지칭됨)란 NCBI 참조 서열: O14607.2에 제공된 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖고, 데메틸라제 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 예시적인 KDM6C 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00019
"KDM6C 폴리뉴클레오티드란 KDM6C 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 KDM6A 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001258249.1에 제공되고, 이 서열은 하기에 재현된다:
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
"Gab1 폴리펩티드" (GRB2-연관된-결합 단백질 1)란 NCBI 참조 서열: NP_997006.1에 제공된 서열과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖는 단백질, 또는 그의 단편을 의미한다. 예시적인 Gab1 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
"Gab1 폴리뉴클레오티드"란 Gab1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 Gab1 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_002039.3에 제공되고, 이는 하기에 재현된다:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
"Sfmbt2 폴리펩티드" (4개의 MBT 도메인을 갖는 scm-유사 단백질 2)란 NCBI 참조 서열: NP_001018049.1에 제공된 서열과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖는 단백질, 또는 그의 단편을 의미한다. 예시적인 Sfmbt2 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00029
"Sfmbt2 폴리뉴클레오티드"란 Sfmbt2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리펩티드를 의미한다. 예시적인 Sfmbt2 폴리뉴클레오티드 서열은 NM_001018039.1에 제공되고, 이는 하기에 재현된다:
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
"Smoc1 폴리펩티드" (SPARC 관련된 모듈 칼슘 결합 1)란 NCBI 참조 서열: NP_001030024에 제공된 서열과 적어도 약 85％ 아미노산 동일성을 갖는 단백질, 또는 그의 단편을 의미한다. 예시적인 Smoc1 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00034
"Smoc1 폴리뉴클레오티드"란 Smoc1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 Smoc1 폴리뉴클레오티드 서열은 XM_005267995.1에 제공되고, 이는 하기에 재현된다:
Figure pct00035
Figure pct00036
"리신 27에서의 트리-메틸화 히스톤 H3 (H3K27me3)"이란 히스톤 H3 단백질 서브유닛 상의 리신 27의 트리메틸화를 의미한다. H3K27me3 변형은 일반적으로 유전자 억제와 연관된다.
"작용제"란 펩티드, 핵산 분자, 또는 작은 화합물을 의미한다.
"대립유전자"란 염색체 상의 동일한 장소에서 발견되는 유전자의 2개 이상의 대안적 형태 중 하나를 의미한다.
"변경"이란 본원에 기재된 것들과 같은 표준 기술 공지된 방법에 의해 검출된 바로, 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화 (증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 변경은 발현 수준의 10％ 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25％ 변화, 보다 바람직하게는 40％ 변화, 및 가장 바람직하게는 50％ 이상의 변화를 포함한다.
"개선시키다"란 질환의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 줄이거나, 정지시키거나, 안정화하는 것을 의미한다.
이 개시내용에서, "포함하다 (comprise)", "포함하는 (comprising)", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 할당된 의미를 가질 수 있고, "포함하다 (include)", "포함하는 (including)" 등을 의미할 수 있으며; "로 본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 할당된 의미를 갖고, 상기 용어는 인용된 것의 기본적 또는 신규한 특징이 인용된 것 초과의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용된 것 초과의 존재를 허용하는 개방-말단이지만, 선행 기술 실시양태는 배제한다.
"검출하다"는 검출되는 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다.
"질환"이란 세포, 조직, 또는 기관의 정상적인 기능을 손상시키거나, 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다. 장애의 예로는 H3K27me3-의존성 각인에 의한 대립유전자의 비바람직한 억제와 연관된 것들을 들 수 있다. 소안구증은 각인 장애와 관련된 H3K27me3-의존성 각인과 연관된 예시적인 장애이다.
"DNA"란 데옥시리보핵산을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 용어 DNA는 게놈 DNA, 재조합 DNA, 또는 cDNA를 지칭한다. 특정 실시양태에서, DNA는 "표적 영역"을 포함한다. 본원에서 고려되는 DNA 라이브러리는 게놈 DNA 라이브러리, 및 RNA로부터 구축된 cDNA 라이브러리, 예를 들어, RNA 발현 라이브러리를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DNA 라이브러리는 1개 이상의 추가의 DNA 서열 및/또는 태그를 포함한다.
"유효량"이란 비치료된 환자에 비해 질환의 증상을 개선시키는 데 요구되는 양을 의미한다. 질환의 치료적 치료를 위한 본 발명을 실시하는 데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여의 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 일반적 건강에 따라 다양하다. 궁극적으로, 담당 의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여량 처방을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다.
"단편"이란 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이 부분은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 바람직하게는, 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 또는 90％를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 통상적으로 이를 수반하는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 지칭한다. "단리하다"는 원래 공급원 또는 환경으로부터의 분리의 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 더 높은 분리의 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치지 않거나, 다른 유해 결과를 유발하지 않도록 다른 물질이 충분히 없는 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 그것이 재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 경우 세포성 물질, 바이러스성 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 한 밴드를 발생시키는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화될 수 있는 단백질에 대해, 상이한 변형은 별개로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 발생시킬 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"란 본 발명의 핵산 분자가 유래되는 유기체의 천연-발생 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 없는 핵산 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터 내로; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입된; 또는 다른 서열과 독립적인 별개의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자, 뿐만 아니라 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"란 자연적으로 그것을 수반하는 성분으로부터 분리된 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그것이, 그것이 자연적으로 회합되는 단백질 및 천연-발생 유기 분자로부터 적어도 60 중량％ 유리되는 경우 단리된다. 바람직하게는, 제제는 적어도 75 중량％, 보다 바람직하게는 적어도 90 중량％, 및 가장 바람직하게는 적어도 99 중량％ 본 발명의 폴리펩티드이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 얻어질 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
"감소시키다"란 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 또는 100％의 음성 변경을 의미한다.
"참조물"이란 표준 또는 대조군 상태를 의미한다.
"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 한정된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 하위세트 또는 그의 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드에 대해, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 20개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 25개 아미노산, 및 보다 더 바람직하게는 약 35개 아미노산, 약 50개 아미노산, 또는 약 100개 아미노산일 것이다. 핵산에 대해, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 60개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 및 보다 더 바람직하게는 약 100개 뉴클레오티드 또는 약 300개 뉴클레오티드 또는 그 부근의 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100％ 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 혼성화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100％ 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화하다"란 다양한 엄격성의 조건 하에서 상보성 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 유전자), 또는 그의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다. (예를 들어, 문헌 [Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).
예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에서 얻어질 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35％ 포름아미드, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50％ 포름아미드의 존재 하에서 얻어질 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃의, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가의 파라미터, 예컨대 혼성화 시간, 세정제, 예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 농도, 및 운반체 DNA의 포함 또는 배제를 다양화하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이들 다양한 조건을 조합함으로써 달성된다. 바람직한: 실시양태에서, 혼성화는 30℃에서 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 37℃에서 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1％ SDS, 35％ 포름아미드, 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA (ssDNA)에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 42℃에서 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1％ SDS, 50％ 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 유용한 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
대부분의 적용을 위해, 혼성화에 이어지는 세척 단계는 또한 엄격성에 있어서 다양할 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도에 의해 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시킴으로써 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 25℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃의, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 25℃에서 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 42℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 세척 단계는 68℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1％ SDS에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 추가의 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 혼성화 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Benton and Davis (Science 196:180, 1977)]; [Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)]; [Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; [Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50％ 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교에 사용되는 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60％, 보다 바람직하게는 80％ 또는 85％, 및 보다 바람직하게는 90％, 95％ 또는 심지어 99％ 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애브뉴 1710에 소재하는 유니버시티 오브 위스콘슨 바이오테크놀로지 센터 (University of Wisconsin Biotechnology Center), 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지 (Sequence 분석 Software Package), BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 상동성의 정도를 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 측정하는 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, e-3 내지 e-100의 확률 점수는 가깝게 관련된 서열을 지시한다.
"체세포 핵 전달" 또는 "SCNT"란 제핵된 난모세포 내로의 체세포로부터의 공여자 핵의 전달을 의미한다. 상기 프로세스는 생식적 또는 치료적 클로닝 중 어느 하나에 사용될 수 있으며, 체세포와 제핵된 난모세포의 융합, 제핵된 난모세포 내로의 핵의 주사에 의해, 또는 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
체세포의 핵은 유전 정보를 제공하는 반면, 난모세포는 배아의 발생에 필요한 영양분 및 다른 에너지-생성 물질을 제공한다. 융합이 일어나면, 세포는 전능성이고, 결국 배반포로 발달하며, 이 시점에서 내부 세포 덩이가 단리된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 전달"은 제핵된 난모세포를 체세포의 세포 핵 유전 물질 또는 핵과 인공적으로 조합함으로써 획득된 동일한 특징 및 품질을 허용하는 유전자 조작 기법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵 전달 절차는 공여자 체세포로부터의 핵 또는 핵 유전 물질이 제핵된 난 또는 난모세포 (핵/전핵이 제거된 난 또는 난모세포) 내로 전달되는 경우이다. 공여자 핵은 체세포로부터 올 수 있다.
용어 "핵 유전 물질"은 개체에 관한 정보를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)를 포함하는 핵에서 발견되는 구조 및/또는 분자를 지칭한다. 핵 유전 물질은 염색체 및 염색질을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 분열, 예컨대 모 세포의 딸 세포로의 분열에 의해 생산된 핵 유전 물질 (예를 들어, 염색체)을 지칭한다. 핵 유전 물질은 미토콘드리아 DNA를 포함하지 않는다.
용어 "SCNT 배아"는 체세포의 핵 또는 핵 유전 물질과 융합된 제핵된 난모세포의 세포, 또는 그의 전능성 자손을 지칭한다. SCNT 배아는 배반포로 발달하고, 착상후에 살아 있는 후손으로 발달할 수 있다. SCNT 배아는 1-세포 배아, 2-세포 배아, 4-세포 배아, 또는 배반포가 되기 전의 임의의 단계의 배아일 수 있다.
용어 "공여자 인간 세포" 또는 "공여자 인간 체세포"는 핵 수용체 또는 수용자로서 수용자 난모세포 내로 전달된 인간 세포의 체세포 또는 핵을 지칭한다.
용어 "체세포"는 생식 세포 또는 생식 세포 전구체가 아닌 식물 또는 동물 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 분화된 세포는 배 세포가 아니다. 체세포는 다능성 또는 전능성 세포와 관련되지 않는다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "비-배아 체세포"이며, 이는 배아에 존재하거나 그로부터 얻어지지 않으며, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되지 않는 체세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 "성체 체세포"이며, 이는 배아 또는 태아 이외의 유기체에 존재하거나 그로부터 얻어지거나, 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 발생되는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "난모세포"는 감수분열의 중기 II에 도달한 성숙한 난모세포를 지칭한다. 난모세포는 또한 생식에 관여하는 자성 배우자 또는 배 세포를 기재하는 데 사용되며, 통상적으로 또한 난으로 지칭된다. 성숙한 난은 모계 염색체의 단일 세트 (23개, 인간 영장류에서 X)를 가지며, 중기 II에서 중단된다.
"하이브리드 난모세포"는 제1 인간 난모세포 ("수용자"로 용어화됨)로부터의 세포질을 갖지만, 수용자 난모세포의 핵 유전 물질을 갖지 않는 제핵된 난모세포를 지칭하며; 이는 "공여자"로 용어화되는 또다른 인간 세포로부터의 핵 유전 물질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하이브리드 난모세포는 또한 수용자 난모세포로부터의 것이 아니지만, 공여자 세포로부터의 것인 (이는 핵 유전 물질과 동일한 공여자 세포, 또는 상이한 공여자로부터의, 예를 들어 공여자 난모세포로부터의 것일 수 있음) 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵된 난모세포"는 그의 핵이 제거된 인간 난모세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵"은 세포의 핵 물질이 제거되어, 세포질만 남기는 프로세스를 지칭한다. 난에 적용되는 경우, 제핵은 핵막에 의해 둘러싸이지 않은 모계 염색체의 제거를 지칭한다. 용어 "제핵된 난모세포"는 핵 물질 또는 핵이 제거된 난모세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "수용자 인간 난모세포"는 그의 원래 핵을 제거한 후에 인간 핵 공여자 세포로부터 핵을 받는 인간 난모세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합"은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포의 지질 막의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 지질 막은 세포의 형질막 또는 핵막일 수 있다. 융합은 핵 공여자 세포 및 수용자 난모세포 사이의 전기적 자극의 인가 시 일어날 수 있는데, 이 때 이들은 서로 인접하게 위치하거나, 핵 공여자 세포는 수용자 난모세포의 난황주위 공간에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "살아 있는 후손"은 자궁 외에서 생존할 수 있는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 이는 1초, 1분, 1일, 1주, 1개월, 6개월 또는 1년 초과 동안 생존할 수 있는 동물이다. 동물은 생존을 위해 자궁내 환경을 요구하지 않을 수 있다.
용어 "출생전"은 출생 전에 존재하거나 일어나는 것을 지칭한다. 유사하게, 용어 "출생후"는 출생 후에 존재하거나 일어나는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "배반포"는 약 30 내지 150개의 세포의 태반 포유동물에서의 착상전 배아 (마우스에서 수정 후 약 3일, 인간에서 수정 후 약 5일)를 지칭한다. 배반포 단계는 상실배 단계에 이어지며, 그의 고유한 형태에 의해 구별될 수 있다. 배반포는 세포의 층 (영양외배엽), 유체-충전된 강 (포배공간 또는 배반포강), 및 내부 상의 세포의 클러스터 (내부 세포 덩이, 또는 ICM)로 구성된 구체로 이루어진다. 비분화된 세포로 이루어진 ICM은 배반포가 자궁에 착상되는 경우 태아가 될 것을 발생시킨다. 이들 동일한 ICM 세포는, 배양에서 성장되는 경우, 배아 줄기 세포주를 발생시킬 수 있다. 착상 시, 마우스 배반포는 약 70개의 영양막 세포 및 30개의 ICM 세포로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포배"는 포배공간으로 지칭되는 유체-충전된 강을 둘러싸는 세포의 중공 구체로 이루어진 배아의 발생에서의 초기 단계를 지칭한다. 용어 포배는 때때로 배반포와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "할구"는 전반에 걸쳐 착상전 배아로부터 얻어진 적어도 1개의 할구 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 등)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "2개 이상의 할구의 클러스터"는 할구의 시험관내 배양 동안 생성되는 세포를 지칭하기 위해 "할구-유래된 증식물"과 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 할구가 SCNT 배아로부터 얻어지고, 초기에 배양된 후, 이는 일반적으로 적어도 1회 분열하여 2개 이상의 할구의 클러스터 (또한 할구-유래된 증식물로 공지됨)를 생성한다. 클러스터는 배아 또는 태아 세포와 함께 더 배양될 수 있다. 궁극적으로, 할구-유래된 증식물은 분열하기를 계속할 것이다. 이들 구조로부터, ES 세포, 전능성 줄기 (TS) 세포, 및 부분적으로 분화된 세포 유형이 배양 방법의 과정에 걸쳐 발달할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로닝된 (또는 클로닝)"은 또다른 개체 단위와 동일한 유전자 세트를 갖는 새로운 개체 단위를 제조하기 위한 유전자 조작 기법을 지칭한다. 본 발명에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로닝된"은 또다른 세포, 배아 세포, 태아 세포, 분화된 세포, 및/또는 동물 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 유사하거나 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 세포, 배아 세포, 태아 세포, 및/또는 동물 세포를 지칭한다. 용어 "실질적으로 유사한" 및 "동일한"은 본원에서 기재된다. 클로닝된 SCNT 배아는 하나의 핵 전달로부터 발생할 수 있거나, 대안적으로, 클로닝된 SCNT 배아는 적어도 1회의 재-클로닝 단계를 포함하는 클로닝 프로세스로부터 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스제닉 유기체"는 또다른 유기체로부터의 유전 물질이 실험적으로 전달되어, 숙주가 그의 염색체 조성에서 전달된 유전자의 유전적 소질을 획득하는 유기체를 지칭한다.
본원에 개시된 바와 같은 SCNT 배아와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "착상"은 본원에 기재된 SCNT 배아를 갖는 대리 암컷 동물을 수태시키는 것을 지칭한다. 이 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairyman]을 참조한다. 배아는 자궁내에서 발달하도록 허용될 수 있거나, 대안적으로, 태아는 분만 전에 자궁 환경으로부터 제거될 수 있다.
"대상체"란 인간 또는 비-인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물, 예컨대 농업적으로 중요한 포유동물 (예를 들어, 소, 말, 양, 돼지), 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이), 또는 희귀하거나 멸종위기 포유동물 (예를 들어, 팬더)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 그와 연관된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 불가능하지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 장애, 상태 또는 그와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지는 않음이 인정될 것이다.
구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 포함적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태 용어는 단수 또는 복수 (즉, 적어도 하나)인 것으로 이해된다. 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 명백하지 않다면, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술분야에서 정상적인 내성의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로서 이해된다. 약은 언급된 값의 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 0.1％, 0.05％, 또는 0.01％ 내로서 이해될 수 있다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, 본원에서 제공된 모든 수치 값은 용어 약에 의해 변형된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학기의 목록의 나열은 열거된 기의 임의의 단일 기 또는 조합으로서의 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 변수 또는 측면에 대한 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과의 조합으로의 그 실시양태를 포함한다.
본원에서 제공된 임의의 조성물 및 방법은 본원에서 제공된 다른 조성물 및 방법 중 임의의 것 중 1종 이상과 조합될 수 있다.
도 1a 내지 1f는 Xist KO 공여자 세포 및 Kdm4d mRNA 주사의 조합된 사용이 SCNT 배아의 발생 잠재성을 완전히 복원하지 않음을 나타낸다.
도 1a는 항-H3K27me3, 항-Cdx2, 항-Oct4 항체 및 DAPI로 염색된 IVF 및 SCNT 배반포의 대표적인 화상을 포함한다. 화살표는 이소적으로 불활성화된 X 염색체를 나타내는 점상 H3K27me3 신호를 지시한다. 이소적 XCI는 Kdm4d mRNA 주사와 무관하게 관찰될 수 있음을 주목한다. 스케일 바, 50 μm.
도 1b는 IVF 및 SCNT 배반포에서 점상 H3K27me3 신호 (불활성화된 X 염색체를 나타냄)를 갖는 또는 갖지 않는 세포의 비를 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 각각의 열은 단일 배반포를 나타낸다.
도 1c는 E19.5에서의 제왕 절개에 의한 조사된 SCNT 배아의 새끼 비율을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. Xist KO 공여자 세포와 Kdm4d mRNA 주사를 사용하는 것의 조합은 공여자로서 난구 세포, 세르톨리 세포 및 MEF 세포로의 SCNT 배아의 만기 비율을 상가적으로 개선시킴을 주목한다.
도 1d는 Kdm4d mRNA 주사와 조합된 Xist KO 세르톨리 세포를 사용하여 SCNT에 의해 유래된 성체 수컷 마우스, 및 야생형 암컷과의 자연 교배를 통해 생성된 그의 새끼의 화상을 나타낸다.
도 1e는 E19.5에서의 제왕 절개에 의한 조사된 태반의 중량을 나타내는 박스 플롯을 제공한다. 수염모양은 최대값 및 최소값을 나타낸다. ***p < 0.001. ns, 유의하지 않음.
도 1f는 과요오드산-쉬프 (Periodic acid-Schiff) (PAS: 우측)로 염색된 만기 태반의 조직학적 섹션의 대표적인 화상을 제공한다. PAS-양성 해면영양막 층은 공여자 세포에서의 Xist 대립유전자의 유전자형과 무관하게 SCNT 태반에서 미로 층 내로 침습되었음을 주목한다. 스케일 바, 1 mm.
도 2a 내지 2c는 SCNT 배아의 착상후 발생 정지를 나타낸다.
도 2a는 지시된 시점에서 Kdm4d mRNA 주사와 조합된 Xist KO MEF 세포를 사용하여 생성된 SCNT 배아의 발생률을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 2b는 E4.5에서 수집된 SCNT 배아의 화상이다.
도 2c는 E10.5에서 수집된 SCNT 배아의 화상이다. SCNT 배아는 각각의 단계에서 배아/신체 크기의 큰 변이를 나타냄을 주목한다. 스케일 바, (도 2b)에서 100 μm 및 (도 2c)에서 1 mm.
도 3a 내지 d는 SCNT 배반포에서의 DNA 메틸화의 광범위한 재프로그래밍을 나타낸다.
도 3a는 실험적 접근법의 개략적 예시이다. IVF 또는 SCNT (Xist KO 공여자 및 Kdm4d 주사의 조합)에 의해 생성된 배반포를 전체-게놈 비술파이트 시퀀싱 (WGBS) 및 RNA-seq에 사용하였다.
도 3b는 SCNT 및 IVF 배반포, 뿐만 아니라 MEF, 접합자, 정자 및 난모세포의 게놈에 걸쳐 모두 커버된 CpG의 DNA 메틸화 수준을 비교하는 박스 플롯을 포함한다. 박스에서 두꺼운 선은 중위값을 지시하고, 십자표는 평균을 나타낸다. 수염모양은 제2.5 및 제97.5 백분위수를 나타낸다. Sp+Oo는 정자 및 난모세포의 평균 값을 나타낸다. MEF, 정자 및 난모세포의 WGBS 데이터세트는 GSE56151 및 GSE56697로부터 얻었다.
도 3c는 각각의 샘플 사이의 DNA 메틸화 수준을 비교하는 플롯이다. 심하게 메틸화된 공여자 MEF 세포 게놈은 SCNT에 의해 전반적으로 재프로그래밍되어 IVF 배반포의 그것과 유사한 DNA 메틸화 프로파일을 발생시킴을 주목한다.
도 3d는 IVF 및 SCNT 배반포의 유전자 발현 프로파일을 비교하는 산포도이다. SCNT 배아에서의 상향-조절된 유전자 (n=37 (어두운 색 클러스터); 배수 변화 (FC) > 3.0) 및 하향-조절된 유전자 (n=55, 더 밝은 색 클러스터; FC > 3.0).
도 4a 및 4b는 SCNT 및 IVF 배반포가 유사한 DNA 메틸롬 및 전사체를 가짐을 나타낸다.
도 4a는 IVF 및 SCNT 배반포에서의 반복부를 비롯한 다양한 게놈 특색에서의 평균 메틸화 수준을 비교하는 막대 그래프를 제공한다.
도 4b는 IVF 및 SCNT 배반포의 생물학적 반복실험의 전사체를 비교하는 산포도를 포함한다.
도 5a 내지 5h는 SCNT 배반포에서의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 확인 및 특징규명을 나타낸다.
도 5a는 과다- 및 과소-DMR에서의 SCNT 및 IVF 배반포의 DNA 메틸화 수준을 나타내는 박스 플롯을 나타낸다. 박스에서 두꺼운 선은 중위값을 지시하고, 십자표는 평균을 나타낸다. DMR의 수가 또한 지시된다.
도 5b는 과다- 및 과소-DMR의 길이를 비교하는 박스 플롯을 포함한다.
도 5c는 게놈에서의 과다- 및 과소-DMR의 파이 차트 분포이다.
도 5d는 그들의 플랭킹 영역에 비해 과소DMR에서의 지시된 샘플의 평균 DNA 메틸화 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5e는 그들의 플랭킹 영역에 비해 과소DMR에서의 IVF 및 SCNT 배반포의 부계 (Pat) 및 모계 (Mat) 대립유전자-특이적 DNA 메틸화 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5f는 그들의 플랭킹 영역에 비해 과소DMR에서의 지시된 발생 단계에서의 IVF 및 SCNT 배아의 부계 및 모계 대립유전자-특이적 DNA 메틸화 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5g는 그들의 플랭킹 영역에 비해 과다DMR에서의 지시된 샘플의 평균 DNA 메틸화 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5h는 그들의 플랭킹 영역에 비해 과다DMR에서의 지시된 샘플의 평균 DNA 메틸화 수준을 나타내는 그래프이다. 사용된 데이터세트는 GSE11034로부터의 것이었다.
도 6a 내지 6d는 SCNT 배반포에서의 과소- 및 과다-DMR의 특색을 제공한다.
도 6a는 과다- 및 과소-DMR의 대표적인 게놈 브라우저 보기이다.
도 6b는 난모세포에서의 메틸화 피크가 IVF 배반포에서의 그것들과 중첩함을 나타내는 대표적인 게놈 브라우저 보기이다.
도 6c는 과다DMR-연관된 유전자의 유전자 존재론 분석이다.
도 6d는 PGC 발생 동안 과다DMR에서의 평균 메틸화 (5mC) 및 히드록시메틸화 (5hmC) 수준을 나타내는 피크 플롯을 포함한다.
도 7a 내지 d는 SCNT 배반포에서의 H3K27me3-의존성 각인의 소실을 나타낸다.
도 7a는 SCNT 배반포에서의 H3K27me3-각인된 유전자의 상대 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 신뢰성 있게 검출가능한 수준 (백만개 맵핑된 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편 (FPKM) > 1)으로 IVF 배반포에서 발현된 26개의 유전자가 나타내어진다. IVF 배반포의 발현 수준은 1로 설정되었다. 유전자를 IVF 배반포에서의 그것에 비해 SCNT에서의 발현 변화에 의해 상향, 하향 및 비변화됨으로 분류하였다 (FC >1.5).
도 7b는 IVF 및 SCNT 배반포에서의 H3K27me3-각인된 유전자의 대립유전자 발현의 비 (Pat/Mat)를 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 26개의 발현된 유전자 중에서 (FPKM >1), 어느 샘플에서든 10개 초과의 SNP 판독물을 갖는 17개의 유전자가 나타내어진다. 별표는 부계 대립유전자로 100％ 편향됨을 나타낸다. 모든 17개의 유전자는 SCNT 배반포에서 그들의 부계 대립유전자 편향을 소실하였음을 주목한다.
도 7c는 2개의 대표적인 H3K27me3-각인된 유전자에서의 H3K27me3 ChIP-seq 신호의 게놈 브라우저 보기를 나타낸다.
도 7d는 3 Mb 플랭킹 영역에 비해 76개의 H3K27me3-각인된 유전자에서의 다양한 세포 유형 (난모세포, 정자, MEF, ESC) 및 조직의 평균 H3K27me3 ChIP-seq 강도를 나타낸다.
도 8a 내지 8f는 공지된 126개의 각인된 유전자 및 그들의 공지된 ICR의 각인 상태를 예시한다.
도 8a는 SCNT 배반포에서의 23개의 공지된 각인 제어 영역 (ICR)의 상대 DNA 메틸화 수준을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. IVF 배반포의 메틸화 수준은 1로 설정되었다. 파선은 IVF 배반포 메틸화 수준의 50％를 지시한다. 23개의 ICR 중 21개는 SCNT 배반포에서 IVF 메틸화 수준의 그것의 적어도 50％를 유지하였지만, Slc38a4 및 Snrpn ICR (적색으로 표시됨)은 IVF 수준의 그것의 50％ 미만을 나타내었음을 주목한다.
도 8b는 충분한 대립유전자-특이적 메틸화 정보 (IVF 및 SCNT 배반포 둘 다의 둘 다의 대립유전자에서 5 초과의 검출된 CpG)를 갖는 20개의 ICR에서의 DNA 메틸화의 대립유전자 편향을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 모든 20개의 ICR은 SCNT 배반포에서 대립유전자 편향된 DNA 메틸화를 유지하였음을 주목한다.
도 8c는 SCNT 배반포에서의 공지된 각인된 유전자의 상대 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. IVF 배반포에서 신뢰성 있게 검출가능한 45개의 각인된 유전자가 나타내어진다 (FPKM > 1). IVF 배반포의 발현 수준은 1로 설정되었다. 유전자를 IVF 배아에 비해 SCNT 배아에서의 그들의 발현 수준에 기초하여 상향, 하향, 및 비변화됨으로 분류하였다 (FC >1.5).
도 8d는 IVF 및 SCNT 배반포에서의 공지된 각인된 유전자의 대립유전자 발현의 비 (Mat/Pat)를 나타내는 막대 그래프를 제공한다. IVF 배반포에서 충분한 SNP 추적된 판독물 (어느 샘플에서든 FPKM>1, 평균 SNP 판독물 > 10)을 갖는 신뢰성 있게 검출가능한 수준으로 발현된 6개의 모계적으로 발현된 유전자 (MEG; Mat/Pat > 2.0)가 나타내어진다. 별표는 모계 대립유전자에 대한 100％ 편향을 나타낸다. 모든 6개의 MEG는 SCNT 배반포에서 모계 대립유전자 편향을 유지하였음을 주목한다.
도 8e는 IVF 및 SCNT 배반포에서의 공지된 각인된 유전자의 대립유전자 발현의 비 (Pat/Mat)를 나타내는 막대 그래프를 제공한다. IVF 배반포에서 충분한 SNP 추적된 판독물 (어느 샘플에서든 FPKM>1, 평균 SNP 판독물 > 10)을 갖는 신뢰성 있게 검출가능한 수준으로 발현된 13개의 부계적으로 발현된 유전자 (PEG; Pat/Mat > 2.0)가 나타내어진다. 별표는 부계 대립유전자에 대한 100％ 편향을 나타낸다. 화살표는 SCNT 배반포에서 부계 편향된 발현을 소실한 유전자를 지시한다. Slc38a4, Sfmbt2, Phf17, 및 Gab1은 H3K27me3-의존성 각인된 유전자이다.
도 8f는 비-정규 각인된 유전자에서의 H3K27me3 ChIP-seq 신호의 대표적인 게놈 브라우저 보기를 제시한다.
상세한 설명
본 발명은 클로닝 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 Kdm4d 과발현이 Xist 넉아웃 공여자 세포인 것을 포함하는 체세포 핵 전달 효율을 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 적어도 부분적으로, Kdm4d mRNA 주사와 결합된 Xist 넉아웃 공여자 세포가 체세포 핵 전달 효율을 개선시킬 수 있다는 발견에 기초한다. 이 조합된 접근법은 분화된 체세포 공여자 세포를 사용한 마우스 클로닝에서 지금껏 보고된 가장 높은 효율을 발생시켰다. 그러나, SCNT 배아 중 많은 것은 여전히 착상후 발생 정지를 나타내고, 생존한 배아는 비정상적으로 큰 태반을 가지며, 이는 일부 재프로그래밍 결함이 여전히 존속함을 시사한다. 비교적 메틸롬 및 전사체 분석은 SCNT 배반포 배아에서의 비정상적인 DNA 메틸화 및 H3K27me3-의존성 각인의 소실을 밝혀내었으며, 이는 관찰된 발생적 결함의 원인일 가능성이 있다.
H3K27me3은 DNA 메틸화-독립성 각인 메커니즘이다
포유동물 정자 및 난모세포는 상이한 후생적 경관을 가지며, 상이한 방식으로 조직화된다. 수정 후, 초기에 별개의 모 에피게놈은 각인 제어 영역 (ICR)을 비롯한 특정 좌위를 제외하고는 매우 동등화된다. 어떻게 모 염색질이 동등화되고 어떻게 ICR이 이 재프로그래밍으로부터 탈출하는 지는 거의 잘 알려져 있지 않다. 여기서 모 대립유전자-특이적 DN아제 I 과민성 부위 (DHS)를 마우스 접합자 및 상실배 배아에서 특징규명하였으며, 대립유전자 DHS 기저에 있는 후생적 메커니즘을 조사하였다. DNA 메틸롬 및 H3K27me3 ChIP-seq 데이터 세트의 통합된 분석은 DNA 메틸화가 없지만, 모계 대립유전자-특이적 H3K27me3을 가진 부계 대립유전자-특이적 DHS를 갖는 76개의 유전자 (표 1)를 밝혀내었다.
<표 1> H3K27me3-의존성 각인된 유전자
Figure pct00037
Figure pct00038
흥미롭게도, 이들 유전자는 착상전 배아에서 부계적으로 발현되며, H3K27me3의 이소적 제거는 모계 대립유전자 발현을 유도하였다. H3K27me3-의존성 각인은 배아 세포 계통에서 크게 소실되었지만, 적어도 5개의 유전자는 배외 세포 계통에서 그들의 각인을 유지하였다. 5개의 유전자는 모두 이전에 확인된 DNA 메틸화-독립성 각인된 상염색체 유전자를 포함한다. 모계 H3K27me3은 DNA 메틸화-독립성 각인 메커니즘이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 H3K27me3 선택적 메틸라제의 사용을 포함한다.
H3K27me3은 X 염색체 불활성화에 중요하다
설치류를 비롯한 특정 진수류 포유동물의 암컷에서, 2개의 X 염색체 중 1개는 유전자 용량 보상을 달성하기 위해 불활성화된다. X 염색체 불활성화 (XCI)로 지칭되는 이 현상은 후생적 침묵화의 메커니즘을 이해하기 위한 우수한 모델을 제공한다. 발생 동안, XCI는 각인된 또는 무작위 방식 중 어느 하나로 일어날 수 있다. 각인된 XCI에 대해, 부계 X 염색체 (Xp)는 착상전 발생 동안 선택적으로 불활성화된다. 각인된 XCI는 배외 세포 계통에서 유지되지만, 이는 후기 배반포의 내부 세포 덩이 (ICM)에서 소실된다. 착상주위 단계에서, 위판 세포는 무작위 XCI를 겪어 Xp 또는 모계 X 염색체 (Xm) 중 어느 하나의 침묵화를 발생시킨다. 이전의 연구는 각인된 및 무작위 XCI 둘 다에서 X-연관 긴 비-코딩 RNA인 Xist의 중요한 역할을 입증하였다. Xist RNA는 시스로 X 염색체를 코팅하고 불활성화시킴으로써 XCI에 참여한다.
게놈 각인은 기원의 모체 특이적 유전자 조절을 허용한다. 각인된 XCI 동안 Xp를 선택적으로 침묵시키기 위해, Xist 유전자는 긴 탐구 후에, 그러나 아직 확인되지 않은 메커니즘을 갖는 Xm에서의 침묵화를 위해 각인된다. 핵 전달 접근법을 사용한 이전의 연구는 Xist의 게놈 각인이 상염색체 각인된 유전자의 그것과 같이, 난자형성 동안 확립됨을 시사하였다. 마우스 착상전 배아 및 배외 세포에서, 단지 부계 X 염색체 (Xp)만이 불활성화된다. 각인된 부계 X 염색체 불활성화 (XCI)에 대한 중심은 긴 비-코딩 RNA, Xist이며, 이는 Xp로부터 발현되고, 시스로 작용하여 전체 Xp를 코팅하고 침묵시킨다. Xp-특이적 불활성화를 달성하기 위해, 모계 Xist 유전자는 침묵화되어야 하지만, 침묵화 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 본원에서 보고된 바와 같이, Xist 좌위는 마우스 난모세포에서 폭넓은 H3K27me3 도메인으로 코팅되며, 이는 착상전 발생을 통해 지속된다. H3K27me3의 이소적 제거는 모계 Xist 발현 및 모계 XCI를 유도한다. 따라서, 모계 H3K27me3은 Xist의 각인 마크로서 기능한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 선택적 H3K27me3 데메틸라제 억제제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
H3K9me3 및 SCNT
공여자 체세포에서의 히스톤 H3 리신 9 트리메틸화 (H3K9me3)는 SCNT 재프로그래밍에 대한 후생적 장벽이다. 공여자 세포에서의 H3K9me3은 접합자 게놈 활성화에서의 연관된 영역의 전사 활성화를 방지하며, 마우스 및 인간 둘 다에서 착상전 단계에서 SCNT 배아의 발생 정지를 발생시킨다. 중요하게는, H3K9me3-특이적 데메틸라제, Kdm4d의 과발현에 의한 H3K9me3 장벽의 제거는 SCNT 배아가 IVF의 그것과 유사한 속도로 배반포 단계로 발달하는 것을 허용한다. 결과적으로, 만기 비율을 위한 전체 클로닝 효율은 8 내지 9배 증가된다. SCNT에서 Kdm4d의 사용은 IVF의 그것과 필적하는 착상률을 발생시키지만, 착상된 SCNT 배아의 15％ 미만이 만기까지 발생한다. 더욱이, 비정상적으로 큰 태반은 Kdm4d-주사된 SCNT 배아에서 여전히 관찰된다. 이들 결과는 H3K9me3 재프로그래밍 장벽이 주로 착상전 발생을 방해하며, 다른 장벽은 착상후 발생에 영향을 미침을 시사한다.
Xist는 마우스 SCNT 배아의 착상후 발생에 중요하다. 모계 X 염색체로부터의 Xist의 비정상적 발현은 이소적 X 염색체 불활성화 (XCI) 및 착상전 배아의 전반적 전사 변경을 발생시키며, 이는 SCNT 배아의 착상후 발생 실패를 발생시킨다. 중요하게는, 이소적 Xist 발현에 의해 유발된 이 발생 실패는 공여자 세포로서 Xist 넉아웃 (KO) 체세포를 사용함으로써 또는 Xist에 대한 작은 간섭 RNA를 1-세포 수컷 SCNT 배아 내로 주사하여 만기 비율의 8 내지 10배 증가를 발생시킴으로써 극복될 수 있다.
억제성 핵산
억제성 핵산 분자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, Xist 폴리뉴클레오티드)의 발현 또는 활성을 억제하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 Xist 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 안티센스 분자, siRNA, shRNA)에 결합하는 단일 및 이중 가닥 핵산 분자 (예를 들어, DNA, RNA, 및 그의 유사체)를 포함한다.
siRNA
짧은 21 내지 25개의 뉴클레오티드 이중-가닥 RNA는 유전자 발현을 하향-조절하는 데 유효하다 (Zamore et al., Cell 101: 25-33; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001, 본원에 참조로 포함됨). 포유동물에서 siRNA 접근법의 유효성은 맥카페리 (McCaffrey) 등 (Nature 418: 38-39.2002)에 의해 생체내에서 입증되었다.
표적 유전자의 서열을 고려하여, siRNA는 그 유전자를 불활성화시키도록 디자인될 수 있다. 이러한 siRNA는 예를 들어, 질환에 걸린 조직에 직접적으로 투여되거나, 전신적으로 투여될 수 있다. 유전자의 핵산 서열은 작은 간섭 RNA (siRNA)를 디자인하는 데 사용될 수 있다. 21 내지 25개의 뉴클레오티드 siRNA는 예를 들어, Xist 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 억제성 핵산 분자는 발현의 RNA 간섭 (RNAi)-매개된 넉-다운을 위한 이중-가닥 RNA로서 채용될 수 있다. 한 실시양태에서, Xist 유전자의 발현은 체세포에서 감소된다. RNAi는 관심의 특이적 단백질의 세포 발현을 감소시키는 방법이다 (문헌 [Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001]; [Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000]; [Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002]; 및 [Hannon, Nature 418:244-251, 2002]에서 검토됨). dsRNA의 형질감염에 의한 또는 플라스미드-기재 발현 시스템을 사용한 siRNA의 발현을 통한 세포 내로의 siRNA의 도입은 포유동물 세포에서 기능의 소실 표현형을 생성하기 위해 점점 더 사용되고 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 핵염기 올리고머의 8 내지 19개의 연속적 핵염기를 포함하는 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자가 제조된다. dsRNA는 듀플렉스화된 RNA의 2개의 별개의 가닥, 또는 자기-듀플렉스화된 단일 RNA 가닥 (작은 헤어핀 (sh)RNA)일 수 있다. 전형적으로, dsRNA는 약 21개 또는 22개 염기 쌍이지만, 바람직할 경우 더 짧거나 더 길 수 있다 (약 29개 이하의 핵염기). dsRNA는 표준 기법 (예를 들어, 화학적 합성 또는 시험관내 전사)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 앰비온 (Ambion) (미국 텍사스주 오스틴) 및 에피센터 (Epicentre) (미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 키트가 이용가능하다. 포유동물 세포에서 dsRNA를 발현시키는 방법은 문헌 [Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002]; [Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002]. [Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002]; [Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002]; [Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002]; [Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002]; 및 [Lee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505 2002]에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
작은 헤어핀 RNA (shRNA)는 줄기-루프 구조를 갖는 RNA 서열을 포함한다. "줄기-루프 구조"는 우세하게 단일-가닥 뉴클레오티드의 영역 (루프 부분)에 의해 한 측에 연결된 이중 가닥 또는 듀플렉스를 형성하는 것으로 공지되거나 예측된 뉴클레오티드의 영역 (줄기 부분)을 포함하는 2차 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. 용어 "헤어핀"은 또한 본원에서 줄기-루프 구조를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 상기 용어는 관련 기술분야에서의 그의 공지된 의미와 일치하게 사용된다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 2차 구조는 정확한 염기-쌍형성을 요구하지 않는다. 따라서, 줄기는 1개 이상의 염기 미스매치 또는 벌지 (bulge)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기-쌍형성은 정확할 수 있으며, 즉, 임의의 미스매치를 포함하지 않는다. 다수의 줄기-루프 구조는 링커, 예컨대, 예를 들어, 핵산 링커, miRNA 플랭킹 서열, 다른 분자, 또는 이들의 일부 조합을 통해 서로에 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작은 헤어핀 RNA"는 전구체 miRNA (프리-miRNA)를 형성하는 통상적인 줄기-루프 shRNA를 포함한다. 범위에 있어서 일부 변이가 있을 수 있지만, 통상적인 줄기-루프 shRNA는 19 내지 29 bp 범위의 줄기, 및 4 내지 30 bp 범위의 루프를 포함할 수 있다. "shRNA"는 또한 마이크로-RNA 포매된 shRNA (miRNA-기재 shRNA)를 포함하며, 여기서, miRNA 듀플렉스의 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 기존의 (또는 천연) miRNA 내로 또는 변형된 또는 합성 (디자인된) miRNA 내로 혼입된다. 일부 예에서, 전구체 miRNA 분자는 1개 초과의 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 마이크로RNA는 약 22-뉴클레오티드 길이이며, 일반적으로 고도로 조직- 또는 발생-단계-특이적 방식으로 발현되고, 표적 유전자를 전사후로 조절하는 내인적으로 코딩된 RNA 분자이다. 200개 초과의 별개의 miRNA가 식물 및 동물에서 확인되었다. 이들 작은 조절성 RNA는 2가지 우세한 작용의 방식에 의해 중요한 생물학적 기능을 하는 것으로 믿어진다: (1) 표적 mRNA의 번역을 억제함으로써, 및 (2) RNA 간섭 (RNAi), 즉, mRNA의 절단 및 분해를 통해. 후자의 경우, miRNA는 작은 간섭 RNA (siRNA)와 유사하게 기능한다. 따라서, 기존의 miRNA 유전자의 특색에 기초하여 인공 miRNA를 디자인하고 발현시킬 수 있다.
shRNA는 지속된 침묵화 및 거의 임의의 세포 유형 내로의 고수율 전달을 제공하도록 DNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적인 바이러스 벡터로는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 바쿨로바이러스 및 조류 바이러스 벡터를 비롯한, 및 안정한, 단일-카피 게놈 통합을 허용하는 이러한 벡터를 비롯한 레트로바이러스를 들 수 있다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성하는 데 채용될 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990)]에 기재된 바와 같은 PE50l, PA3l7, R-2, R-AM, PA12, T19-14x, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 패키징 세포를 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 통해 형질도입할 수 있다. 생산자 세포주는 DNA 복제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 그 후, 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 시험관내에서 또는 생체내에서 진핵생물 세포를 형질도입하는 데 채용될 수 있다. 형질도입된 진핵생물 세포는 DNA 복제 단백질을 발현할 것이다.
본 발명의 안티센스 서열을 포함하는 촉매 RNA 분자 또는 리보자임은 생체내에서 핵산 분자 (예를 들어, Xist)의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 내의 리보자임 서열의 포함은 그들에게 RNA-절단 활성을 부여함으로써, 구축물의 활성을 증가시킨다. 표적 RNA-특이적 리보자임의 디자인 및 용도는 문헌 [Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988], 및 미국 특허 출원 공개 제2003/0003469 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 참조로 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 결합 아암에 8 내지 19개의 연속적 핵염기를 갖는 안티센스 RNA를 포함하는 촉매 RNA 분자를 특색으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 촉매 핵산 분자는 해머헤드 또는 헤어핀 모티프에서 형성된다. 이러한 해머헤드 모티프의 예는 문헌 [Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992]에 의해 기재되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 1988년 9월 20일에 출원된 미국 일련 번호 07/247,100의 일부계속출원인 1989년 9월 20일에 출원된 햄펠 (Hampel) 등, "특이적 RNA 서열을 절단하기 위한 RNA 촉매"; 문헌 [Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989]; 및 [Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990]에 의해 기재되어 있다. 이들 특이적 모티프는 본 발명에서 제한적이지 않으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 효소적 핵산 분자에서 중요한 모든 것이, 그것이 표적 유전자 RNA 영역 중 1개 이상에 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 갖고, 그것이 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 그 기질 결합 부위 내의 또는 주위의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것임을 인식할 것이다.
세포 내로 핵산 구축물을 도입하는 본질적으로 임의의 방법이 채용될 수 있다. 핵산을 도입하는 물리적 방법은 구축물을 함유하는 용액의 주사, 구축물에 의해 덮인 입자에 의한 포격, 핵산의 용액에서의 세포, 조직 샘플 또는 유기체의 흡인, 또는 구축물의 존재 하에서의 세포 막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자 내로 패키징된 바이러스 구축물은 세포 내로의 발현 구축물의 효율적인 도입 및 코딩된 shRNA의 전사 둘 다를 달성하는 데 사용될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 지질-매개된 운반체 수송, 화학물질 매개된 수송, 예컨대 인산칼슘 등이 사용될 수 있다. 따라서, shRNA-코딩 핵산 구축물은 하기 활성 중 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 RNA 흡수를 향상시키거나, 듀플렉스 가닥의 어닐링을 촉진시키거나, 어닐링된 가닥을 안정화시키거나, 다르게는 표적 유전자의 억제를 증가시킴.
세포 내에서의 발현을 위해, DNA 벡터, 예를 들어 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 벡터가 채용될 수 있다. 내인성 miRNA의 발현은 RNA 폴리머라제 II (Pol II) 프로모터에 의해 제어되며, 일부의 경우, shRNA는 RNA 폴리머라제 III 프로모터에 비해 Pol II 프로모터에 의해 가장 효율적으로 유도된다 (Dickins et al., 2005, Nat. Genet. 39: 914-921). 일부 실시양태에서, shRNA의 발현은 제한 없이, RNA 폴리머라제 유형 II 프로모터를 비롯한 유도성 프로모터 또는 조건적 발현 시스템에 의해 제어될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 프로모터의 예는 테트라시클린-유도성 프로모터 (TRE-타이트를 포함함), IPTG-유도성 프로모터, 테트라시클린 전사활성화제 시스템, 및 리버스 테트라시클린 전사활성화제 (rtTA) 시스템이다. 구성적 프로모터는 또한 사용될 수 있으며, 세포- 또는 조직-특이적 프로모터도 사용될 수 있다. 많은 프로모터는 이들이 모든 세포 및 조직 유형에서 발현되도록 편재적일 것이다. 특정 실시양태는 시험관내 및 생체내 연구에서 가장 효과적인 조건적 유전자 발현 시스템 중 하나인 테트라시클린-반응성 프로모터를 사용한다. 유도성 shRNA의 설명에 대해서는, 국제 특허 출원 PCT/US2003/030901 (공개 제WO 2004-029219 A2호) 및 문헌 [Fewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982]을 참조한다.
폴리뉴클레오티드의 전달
네이키드 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 유사체는 포유동물 세포에 진입하고, 관심의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포에의 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵염기 올리고머의 전달을 보조하는 제형을 이용하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,656,611호; 제5,753,613호; 제5,785,992호; 제6,120,798호; 제6,221,959호; 제6,346,613호; 및 제6,353,055호 참조; 이들의 각각은 본원에 참조로 포함됨).
올리고뉴클레오티드 및 다른 핵염기 올리고머
적어도 2가지 유형의 올리고뉴클레오티드는 RN아제 H에 의한 RNA의 절단을 유도한다: 포스포디에스테르 (PO) 또는 포스포로티오에이트 (PS) 연결을 갖는 폴리데옥시뉴클레오티드. 2'-OMe-RNA 서열은 RNA 표적에 대한 높은 친화도를 나타내지만, 이들 서열은 RN아제 H에 대한 기질이 아니다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 저항성을 위해 포스포로티오에이트에 대해 변형된 일부 또는 전부의 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드 갭을 함유하는 2'-변형된 올리고뉴클레오티드에 기초한 것이다. 메틸포스포네이트 변형의 존재는 그의 표적 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키고, 따라서 IC50을 감소시킨다. 이 변형은 또한 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 저항성을 증가시킨다. 본 발명의 방법 및 시약은 공유-폐쇄된 다중 안티센스 (CMAS) 올리고뉴클레오티드 (Moon et al., Biochem J. 346:295-303, 2000; PCT 공개 제WO 00/61595호), 리본-유형 안티센스 (RiAS) 올리고뉴클레오티드 (Moon et al., J. Biol. Chem. 275:4647-4653, 2000; PCT 공개 제WO 00/61595호), 및 큰 원형 안티센스 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 출원 공개 제US 2002/0168631 A1호)를 비롯한 개발될 수 있는 임의의 기술과 함께 사용될 수 있음이 이해된다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 뉴클레오시드는 핵염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 통상적으로 헤테로시클릭 염기이다. 이러한 헤테로시클릭 염기의 2가지 가장 통상적인 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 연결된 포스페이트 기를 더 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 그러한 뉴클레오시드에 대해, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 형성하는 데 있어서, 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오시드를 서로에게 공유 연결하여 선형 중합체성 화합물을 형성한다. 다시, 이 선형 중합체성 구조의 각각의 말단은 더 결합되어 원형 구조를 형성할 수 있으며; 개방된 선형 구조는 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 기는 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 백본을 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 통상적인 연결 또는 백본은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 연결이다.
본 발명에서 유용한 바람직한 핵염기 올리고머의 구체적인 예로는 변형된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 이 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 백본을 갖는 핵염기 올리고머는 백본에 인 원자를 보유하는 것들 및 백본에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 이 명세서의 목적상, 그들의 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 올리고머인 것으로 간주된다.
변형된 올리고뉴클레오티드 백본을 갖는 핵염기 올리고머는 예를 들어, 통상적인 3'-5' 연결을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 반전된 극성을 갖는 것들을 포함하며, 여기서, 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태는 또한 포함된다. 상기 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 백본을 갖는 핵염기 올리고머는 짧은 쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 1개 이상의 짧은 쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결 (부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨); 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본을 갖는 것들; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타의 것들을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
다른 핵염기 올리고머에서, 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉, 백본 둘 다는 신규한 기로 대체된다. 핵염기 단위는 열거된 Xist 유전자와의 혼성화를 위해 유지된다. 한 이러한 핵염기 올리고머는 펩티드 핵산 (Peptide Nucleic Acid) (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 보유되고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 이들 핵염기 올리고머를 제조하고 사용하는 방법은 예를 들어, 문헌 ["Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications" Ed. P. E. Nielsen, Horizon Press, Norfolk, United Kingdom, 1999]에 기재되어 있다. PNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다. PNA 화합물의 추가의 교시는 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 발견될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 핵염기 올리고머는 포스포로티오에이트 백본 및 헤테로원자를 갖는 뉴클레오시드 백본, 및 특히 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-를 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,034,506호에 기재된 모르폴리노 백본 구조를 갖는다.
핵염기 올리고머는 또한 1개 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 핵염기 올리고머는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐, 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 특히 바람직한 것은 O[(CH2)nO] nCH3, O(CH2) nOCH3, O(CH2) nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2) nONH2, 및 O(CH2) nON[(CH2) nCH3)]2이며, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 바람직한 핵염기 올리고머는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴, 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 삽입제, 핵염기 올리고머의 약동학적 특성을 개선시키는 기, 또는 핵염기 올리고머의 약역학적 특성을 개선시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 바람직한 변형은 2'-O-메틸 및 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨)이다. 또다른 바람직한 변형은 또한 2'-DMAOE로 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시 (즉, O(CH2) 2ON(CH3) 2)이다. 다른 변형은 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵염기 올리고머의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 또는 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 핵염기 올리고머는 또한 펜토푸라노실 당 대신 당 모방체, 예컨대 시클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵염기 올리고머는 또한 핵염기 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체; 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체; 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신; 5-할로우라실 및 시토신; 5-프로피닐 우라실 및 시토신; 6-아조 우라실, 시토신 및 티민; 5-우라실 (슈도우라실); 4-티오우라실; 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌; 5-할로 (예를 들어, 5-브로모), 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신; 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌; 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌; 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌; 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 의해 개시된 것들, 및 문헌 [Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 의해 개시된 것들을 포함한다. 특정의 이들 핵염기는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 증가시키는 것으로 나타났으며 (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 심지어 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 또는 2'-O-메틸 당 변형과 조합되는 경우에도 바람직한 염기 치환이다. 특정의 상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 및 제5,750,692호를 포함하며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 핵염기 올리고머의 또다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 향상시키는 1개 이상의 모이어티 또는 접합체를 핵염기 올리고머에 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 4:1053-1060, 1994), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309, 1992; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770, 1993), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20:533-538: 1992), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10:1111-1118, 1991; Kabanov et al., FEBS Lett., 259:327-330, 1990; Svinarchuk et al., Biochimie, 75:49-54, 1993), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995; Shea et al., Nucl. Acids Res., 18:3777-3783, 1990), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973, 1995), 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237, 1995), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937, 1996)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 핵염기 올리고머 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,828,979호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,948,882호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,109,124호; 제5,112,963호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,214,136호; 제5,218,105호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,414,077호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,486,603호; 제5,510,475호; 제5,512,439호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,578,717호; 제5,578,718호; 제5,580,731호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,591,584호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호; 제5,608,046호; 및 제5,688,941호를 포함하며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 또한 키메라 화합물인 핵염기 올리고머를 포함한다. "키메라" 핵염기 올리고머는 각각 적어도 1개의 단량체 단위, 즉, 올리고뉴클레오티드의 경우 뉴클레오티드로 구성된 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 핵염기 올리고머, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 이들 핵염기 올리고머는 전형적으로 핵염기 올리고머가 핵염기 올리고머 상에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 부여하도록 변형된 적어도 1개의 영역을 함유한다. 핵염기 올리고머의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 기능할 수 있다. 예로서, RN아제 H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RN아제 H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 발생시킴으로써, 유전자 발현의 핵염기 올리고머 억제의 효율을 크게 향상시킨다. 결과적으로, 키메라 핵염기 올리고머가 사용되는 경우, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드에 비해, 필적하는 결과는 종종 보다 짧은 핵염기 올리고머로 얻어질 수 있다.
본 발명의 키메라 핵염기 올리고머는 상기 기재된 바와 같은 2개 이상의 핵염기 올리고머의 복합 구조로서 형성될 수 있다. 이러한 핵염기 올리고머는, 올리고뉴클레오티드의 경우, 또한 관련 기술분야에서 하이브리드 또는 갭머로 지칭되었다. 이러한 하이브리드 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호를 포함하며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에 따라 사용되는 핵염기 올리고머는 편리하게는 및 통상적으로 고체 상 합성의 널리 공지된 기법을 통해 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) (미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 비롯한 몇몇 판매자에 의해 판매된다. 관련 기술분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단은 추가적으로 또는 대안적으로 채용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하는 유사한 기법을 사용하는 것은 널리 공지되어 있다.
본 발명의 핵염기 올리고머는 또한 흡수 (uptake), 분포 및/또는 흡수 (absorption)를 보조하기 위해, 예를 들어, 리포솜, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형으로서 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 접합되거나, 다르게는 회합될 수 있다. 이러한 흡수, 분포 및/또는 흡수 보조 제형의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,158호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호를 포함하며, 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
Xist를 넉아웃시키기 위한 게놈 편집
유전자 편집은 기본 및 임상 과학 사이의 계면을 포괄하는 생물의학적 연구의 주요한 초점이다. 신규한 "유전자 편집" 도구의 발달은 게놈의 다른 부위에 돌연변이를 도입하지 않고, 특이적 염색체 좌위에서 세포의 DNA 서열을 조작하는 능력을 제공한다. 이 기술은 연구자들이 대상체의 세포의 게놈을 시험관내에서 또는 생체내에서 조작하는 것을 효과적으로 가능하게 한다. SCNT의 맥락에서, Xist에 KO를 포함하는 세포는 CRISPR을 사용하여 생성된다.
한 실시양태에서, 유전자 편집은 엔도뉴클레아제 (DNA 분자 내에서 내부적으로 DNA 파단을 유발하는 효소)를 게놈의 특이적 부위에 표적화하고, 그에 의해 선택된 부위에서 염색체 이중 가닥 파단 (DSB)의 형성을 촉발시키는 것을 포함한다. 염색체 파단의 도입과 수반하여, 공여자 DNA 분자가 (예를 들어, 플라스미드 또는 올리고뉴클레오티드 도입에 의해) 도입되는 경우, 파단된 염색체 및 도입된 DNA 사이의 상호작용은 특히 2개의 서열이 상동성을 공유하는 경우 일어날 수 있다. 이 예에서, "유전자 표적화"로 용어화된 프로세스가 일어날 수 있으며, 여기서 염색체의 DNA 말단은 상동성 재조합 (HR)에 의해 공여자 DNA의 상동성 서열을 침입한다. 공여자 플라스미드 서열을 HR을 위한 주형으로서 사용함으로써, 관심의 유전자의 이음매 없는 넉아웃이 달성될 수 있다. 중요하게는, 공여자 DNA 분자가 표적 유전자 (예를 들어, Xist) 내에 결실을 포함하는 경우, HR-매개된 DSB 복구는 공여자 서열을 염색체 내로 도입하여, 결실이 염색체 좌위 내에 도입되는 것을 발생시킬 것이다. 뉴클레아제를 표적 유전자를 함유하는 게놈 부위에 표적화함으로써, 개념은 HR을 자극하고, 그에 의해 기능적 표적 유전자를 유전자의 결실된 형태로 대체하는 DSB 형성을 사용하는 것이다. HR 경로의 이점은 그것이 이전의 야생형 대립유전자 대신 유전자의 넉아웃을 이음매 없이 생성하는 잠재성을 갖는다는 것이다.
현재의 게놈 편집 도구는 세포의 유전자 조작을 향상시키는 이중 가닥 파단 (DSB)의 도입을 사용한다. 이러한 방법으로는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN; 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,746,838호; 제6,794,136호; 제6,824,978호; 제6,866,997호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 제7,030,215호; 제7,220,719호; 제7,241,573호; 제7,241,574호; 제7,585,849호; 제7,595,376호; 제6,903,185호; 및 제6,479,626호; 및 미국 특허 공개 제20030232410호 및 제US2009020314호에 기재됨), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) (TALEN; 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,440,431호, 제8,440,432호, 제8,450,471호, 제8,586,363호, 및 제8,697,853호, 및 미국 특허 공개 제20110145940호, 제20120178131호, 제20120178169호, 제20120214228호, 제20130122581호, 제20140335592호, 및 제20140335618호에 기재됨), 및 CRISPR (군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부)/Cas9 시스템 (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호, 제8,771,945호, 제8,795,965호, 제8,871,445호, 제8,889,356호, 제8,906,616호, 제8,932,814호, 제8,945,839호, 제8,993,233호, 및 제8,999,641호, 및 미국 특허 공개 제20140170753호, 제20140227787호, 제20140179006호, 제20140189896호, 제20140273231호, 제20140242664호, 제20140273232호, 제20150184139호, 제20150203872호, 제20150031134호, 제20150079681호, 제20150232882호, 및 제20150247150호에 기재됨)을 들 수 있다. 예를 들어, ZFN DNA 서열 인식 능력 및 특이성은 예측불가능할 수 있다. 유사하게, TALEN 및 CRISPR/Cas9는 바람직한 부위에서 뿐만 아니라 다른 "오프-타겟" 부위에서도 또한 절단한다. 이들 방법은 오프-타겟 이중-가닥 파단 유도, 및 이들 오프-타겟 효과와 연관된 indel, 게놈 재배열, 및 염색체 재배열을 비롯한 유해한 돌연변이에 대한 잠재성과 관련된 상당한 문제를 갖는다. ZFN 및 TALEN은 게놈에서 약 18 bp 서열에 대한 특이성을 생성하는 모듈식 서열-특이적 DNA 결합 단백질의 사용을 수반한다.
유형 2 CRISPR (군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부)/Cas (CRISPR 연관된) 시스템에 기초한 RNA-가이드된 뉴클레아제-매개된 게놈 편집은 게놈을 변경시키기 위한 가치있는 접근법을 제공한다. 간략하게, 단일-가이드 RNA (sgRNA)에 의해 가이드된 뉴클레아제인 Cas9는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 다음의 표적화된 게놈 좌위에 결합하며, 이중-가닥 파단 (DSB)을 생성한다. 그 후, DSB는 삽입/결실 (indel) 돌연변이를 초래하는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해, 또는 외인성 주형을 요구하고, 표적 좌위에서 정확한 변형을 생성할 수 있는 상동성-지정 복구 (HDR)에 의해 복구된다 (Mali et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6). 기능적, 또는 부분적으로 기능적 유전자의 카피를 환자의 세포에 첨가하지만, 유전자의 원래 기능이상적 카피를 보유하는 다른 유전자 요법 방법과는 달리, 이 시스템은 결함을 제거할 수 있다. 조작된 뉴클레아제를 사용한 유전적 교정은 조직 배양 세포 및 희귀 질환의 설치류 모델에서 입증되었다.
CRISPR은 빵 효모 (에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)), 제브라 피쉬, 선충 (씨. 엘레간스 (C. elegans)), 식물, 마우스, 및 몇몇 다른 유기체를 비롯한 폭넓은 범위의 유기체에서 사용되었다. 추가적으로, CRISPR은 과학자들이 특이적 유전자를 표적화하고 활성화시키거나 침묵시키는 것을 허용하는 프로그래밍가능한 전사 인자를 제조하기 위해 변형되었다. 수 만 개의 가이드 RNA의 라이브러리가 현재 이용가능하다.
2012년 이래로, CRISPR/Cas 시스템은 심지어 마우스 및 영장류와 같은 진핵생물에서도 작동하는 유전자 편집 (특이적 유전자를 침묵시키거나, 증진시키거나, 변화시킴)에 사용되었다. cas 유전자 및 특이적으로 설계된 CRISPR을 함유하는 플라스미드를 삽입함으로써, 유기체의 게놈은 임의의 바람직한 위치에서 커팅될 수 있다.
CRISPR 반복부는 크기로 24 내지 48 염기 쌍의 범위이다. 이들은 통상적으로 일부 이원 대칭을 나타내며, 이는 2차 구조, 예컨대 헤어핀의 형성을 암시하지만, 진정하게 회문구조는 아니다. 반복부는 유사한 길이의 스페이서에 의해 분리된다. 일부 CRISPR 스페이서 서열은 플라스미드 및 파지로부터의 서열과 정확하게 매칭하지만, 일부 스페이서는 원핵생물의 게놈과 매칭한다 (자기-표적화 스페이서). 새로운 스페이서는 파지 감염에 반응하여 급속하게 첨가될 수 있다.
CRISPR-연관된 (cas) 유전자는 종종 CRISPR 반복부-스페이서 어레이와 연관된다. 2013년 현재, 40개 초과의 상이한 Cas 단백질 족이 기재되었다. 이들 단백질 족 중에서, Cas1은 상이한 CRISPR/Cas 시스템 중에서 편재하는 것으로 보인다. cas 유전자 및 반복부 구조의 특정 조합은 8가지 CRISPR 하위유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 M튜브)을 정의하는 데 사용되었으며, 이들 중 일부는 반복부-연관된 신비한 단백질 (RAMP)을 코딩하는 추가의 유전자 모듈과 연관된다. 1개 초과의 CRISPR 하위유형은 단일 게놈에서 발생할 수 있다. CRISPR/Cas 하위유형의 산발적 분포는 시스템이 미생물 진화 동안 수평적 유전자 전달에 처함을 시사한다.
외인성 DNA는 일견하여 Cas 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 의해 작은 요소 (길이로 약 30 염기 쌍)로 프로세싱되며, 이는 그 후 왜 그런지 리더 서열 부근의 CRISPR 좌위 내로 삽입된다. CRISPR 좌위로부터의 RNA는 구성적으로 발현되며, Cas 단백질에 의해 플랭킹 반복 서열을 갖는 개별적, 외인적으로-유래된 서열 요소로 구성된 작은 RNA로 프로세싱된다. RNA는 다른 Cas 단백질을 가이드하여 외인성 유전적 요소를 RNA 또는 DNA 수준에서 침묵시킨다. 증거는 CRISPR 하위유형 중에서의 기능적 다양성을 시사한다. Cse (Cas 하위유형 이콜라이 (Ecoli)) 단백질 (이. 콜라이 (E. coli)에서 CasA-E로 지칭됨)은 CRISPR RNA 전사체를 캐스케이드 (Cascade)가 보유하는 스페이서-반복 단위로 프로세싱하는 기능적 복합체, 캐스케이드를 형성한다. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 흥미롭게도, 이. 콜라이에서의 CRISPR-기재 파지 불활성화는 캐스케이드 및 Cas3을 요구하지만, Cas1 및 Cas2는 요구하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 및 다른 원핵생물에서 발견되는 Cmr (Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA를 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능적 복합체를 형성한다. RNA-가이드된 CRISPR 효소는 유형 V 제한 효소로서 분류된다.
또한, 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 공개 2014/0068797을 참조한다.
Cas9
Cas9는 DNA를 커팅하기 위해 특수화된 효소인 뉴클레아제이며, 하나가 이중 나선의 각각의 가닥에 대한 것인 2개의 활성 커팅 부위를 갖는다. 팀은 이들이 위치된 그의 표적 DNA로 귀소하는 Cas9의 능력을 보존하면서, 하나 또는 둘 다의 부위를 망가뜨릴 수 있음을 입증하였다. 지넥 (Jinek) 등 (2012)은 tracrRNA 및 스페이서 RNA를 Cas9와 혼합되어 정확한 DNA 표적을 발견하고 커팅할 수 있는 "단일-가이드 RNA" 분자로 조합하였다. 이러한 합성 가이드 RNA는 유전자 편집에 사용될 수 있음이 제안되었다 (Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21).
Cas9 단백질은 병원성 및 공생 박테리아에 매우 풍부하다. CRISPR/Cas-매개된 유전자 조절은 특히 진핵생물 숙주와의 박테리아 상호작용 동안 내인성 박테리아 유전자의 조절에 기여할 수 있다. 예를 들어, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)의 Cas 단백질 Cas9는 에프. 논비시다가 숙주 반응을 약화시키고 병독성을 촉진시키는 데 중요한 박테리아 지질단백질을 코딩하는 내인성 전사체를 억제하는 독특한 작은 CRISPR/Cas-연관된 RNA (scaRNA)를 사용한다. 배선 (접합자) 내로의 Cas9 mRNA 및 sgRNA의 공동주사는 돌연변이를 갖는 마우스를 생성하였다. Cas9 DNA 서열의 전달은 또한 고려된다.
gRNA
RNA 가이드된 단백질로서, Cas9는 DNA 표적의 인식을 지정하는 짧은 RNA를 요구한다. Cas9는 PAM 서열 NGG를 함유하는 DNA 서열을 우선적으로 추궁하지만, 이는 여기서 프로토스페이서 표적 없이 결합할 수 있다. 그러나, Cas9-gRNA 복합체는 이중 가닥 파단을 생성하기 위해 gRNA에 가까운 매칭을 요구한다. 박테리아에서 CRISPR 서열은 다중 RNA에서 발현되고, 그 후 프로세싱되어 RNA에 대한 가이드 가닥을 생성한다. 진핵생물 시스템은 CRISPR RNA를 프로세싱하는 데 요구되는 단백질의 일부가 결여되기 때문에, 발현된 단일 RNA 내로의 Cas9 표적화를 위한 RNA의 필수 조각을 RNA 폴리머라제 유형 2I 프로모터 U6)과 조합하는 합성 구축물 gRNA를 생성하였다. 합성 gRNA는 최소 길이에서 100 bp 약간 초과이며, PAM 서열 NGG 바로 앞의 20 프로토스페이서 뉴클레오티드를 표적화하는 부분을 함유한다; gRNA는 PAM 서열을 함유하지 않는다.
한 접근법에서, 대상체의 1개 이상의 세포는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 Xist를 결실시키거나 불활성화시키도록 변경된다. Cas9는 Xist 유전자를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 표적 인식 시, Cas9는 Xist 표적 유전자에서 이중 가닥 파단을 유도한다. 이중-가닥 파단 부위에서 상동성-지정 복구 (HDR)는 Xist 서열의 불활성 또는 결실된 형태의 삽입을 허용할 수 있다.
하기 US 특허 및 특허 공개는 본원에 참조로 포함된다: 특허 번호 8,697,359, 20140170753, 20140179006, 20140179770, 20140186843, 20140186958, 20140189896, 20140227787, 20140242664, 20140248702, 20140256046, 20140273230, 20140273233, 20140273234, 20140295556, 20140295557, 20140310830, 20140356956, 20140356959, 20140357530, 20150020223, 20150031132, 20150031133, 20150031134, 20150044191, 20150044192, 20150045546, 20150050699, 20150056705, 20150071898, 20150071899, 20150071903, 20150079681, 20150159172, 20150165054, 20150166980, 및 20150184139.
치료 방법
각인 제어 영역에 존재하는 H3K27me3 각인을 조정하는 작용제는 SCNT를 사용하여 클로닝된 완전한 만기 유기체를 생성하는 데 유용하다. H3K27me3 각인을 첨가하는 작용제는 Kdm4d 폴리뉴클레오티드로 주사된 Xist KO 세포와 조합으로 사용될 수 있다.
한 접근법에서, H3K27me3 데메틸라제를 억제하는 작용제는 SCNT와 조합으로 사용된다. 투여되는 작용제의 투여량은 개별적 환자의 크기 및 건강을 비롯한 다수의 인자에 의존한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 구체적인 투여량 처방은 개별적 필요 및 조성물의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 한다.
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 검정, 스크리닝, 및 치료 방법을 수행하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
체세포 핵 전달
체세포 핵 전달 (SCNT)은 예를 들어, 가축 (예를 들어, 소, 말, 양, 염소, 돼지)의 생식적 클로닝에, 또는 바람직한 조직이 세포 대체 요법을 위해 생성되는 치료적 클로닝에 사용될 수 있는 기법이다. 불행하게도, 클로닝된 동물은 부적절한 각인으로부터 발생하는 특정 결함, 예컨대 히스톤 H3 단백질 서브유닛 상의 리신 27의 트리메틸화의 결핍을 겪는다. 이 결핍은 SCNT 절차 동안 트리메틸화 사건을 수행하는 효소를 코딩하는 mRNA를 제공함으로써 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 트리메틸화 사건을 수행할 수 있는 효소 (예를 들어, EZH1, EZH2, PRC2)를 코딩하는 mRNA는 SCNT 절차 전에 또는 동안 수용자 세포 또는 핵 공여자 세포 내로 주사된다.
체세포 핵 전달은 핵 공여자 세포를 얻고, 그 후 이 핵 공여자 세포를 제핵된 수용자 세포, 가장 바람직하게는 제핵된 난모세포 내로 융합시켜 핵 전달 배아를 형성하고, 이 배아를 활성화시키고, 마지막으로 배아를 배양하거나, 이 배아를 모계 숙주 내로 전달하는 것을 포함한다. 핵 전달 동안, 한 세포로부터의 핵 DNA의 완전한 상보체는 제핵된 세포에 도입된다. 핵 전달 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 1991년 2월 19일에 허여된 발명의 명칭이 "소 배아의 증식"인 프라더 (Prather) 등의 미국 특허 제4,994,384호; 1991년 10월 15일에 허여된 발명의 명칭이 "소 핵 이식"인 매시 (Massey)의 미국 특허 제5,057,420호; 1999년 11월 30일에 스티스 (Stice) 등에게 허여된 발명의 명칭이 "배양된 내부 세포 덩이 세포를 사용한 키메라 소 또는 돼지 동물의 제조"인 미국 특허 제5,994,619호; 2000년 1월 19일에 캠벨 (Campbell) 등 및 윌무트 (Wilmut) 등에게 각각 허여된 발명의 명칭이 "핵 전달을 위한 정지 세포 집단"인 영국 특허 제GB 2,318,578호, 제GB 2,331,751호; 2000년 1월 4일에 허여된 발명의 명칭이 "재프로그래밍된 비-배아 소 세포를 사용하여 소를 클로닝하는 방법"인 스트렐켄코 (Strelchenko) 등의 미국 특허 제6,011,197호; 및 발명의 명칭이 "돼지 동물을 클로닝하는 방법"인 미국 특허 출원 일련 번호 09/753,323 (대리인 정리 번호 030653.0026.CIP1, 2000년 12월 28일에 출원됨)을 참조하며, 이들의 각각은 모든 도면, 표 및 도면을 비롯하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 핵 전달은 투명대에 의해 둘러싸이지 않은 난모세포를 사용함으로써 달성될 수 있다.
핵 전달 절차에서, 핵 공여자 세포, 또는 그의 핵은 수용자 세포 내로 도입된다. 수용자 세포는 바람직하게는 난모세포이고, 바람직하게는 제핵된다. 그러나, 본 발명은 부분적으로 난모세포의 핵이 난모세포로부터 물리적으로 추출되지 않는 핵 전달에 관한 것이다. 공여자 세포로부터의 핵 DNA가 세포 분열 동안 복제되는 핵 전달 배아를 확립하는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Wagoner et al., 1996, "Functional enucleation of bovine oocytes: effects of centrifugation and ultraviolet light," Theriogenology 46: 279-284]을 참조한다. 또한, 핵 전달은 1개의 핵 공여자 및 1개 초과의 제핵된 난모세포를 조합함으로써 달성될 수 있다. 또한, 핵 전달은 1개의 핵 공여자, 1개 이상의 제핵된 난모세포, 및 1개 이상의 제핵된 난모세포의 세포질을 조합함으로써 달성될 수 있다. 핵 공여자 세포 및 수용자 세포의 생성된 조합은 "하이브리드 세포"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 공여자"는 난모세포 내로 전위될 수 있는 핵 DNA를 갖는 임의의 세포, 또는 그의 핵을 지칭한다. 핵 공여자는 세포로부터 단리된 핵일 수 있다. 세포로부터 핵을 단리한 후, 핵을 핵 공여자로서 이용하기 위한 다수의 기법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제4,664,097호, 제6,011,197호, 및 제6,107,543호를 참조하며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 임의의 유형의 세포는 핵 공여자로서 기능할 수 있다. 핵 공여자 세포의 예로는 시험관내에서 또는 생체내에서 2개의 배우자의 결합으로부터 발생한 배아로부터 단리된 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 배아 세포 (예를 들어, 사전-배반포 세포 및 내부 세포 덩이 세포)로부터 발생한 배아 줄기 세포 (ES 세포); 배아로부터 단리된 내부 세포 덩이 세포로부터 발생한 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 및 비-배양된 사전-배반포 세포; 배양된 및 비-배양된 태아 세포; 배양된 및 비-배양된 성체 세포; 배양된 및 비-배양된 원시 배 세포; 배양된 및 비-배양된 배 세포 (예를 들어, 배아 배 세포); 동물로부터 단리된 배양된 및 비-배양된 체세포; 배양된 및 비-배양된 난구 세포; 배양된 및 비-배양된 양막 세포; 배양된 및 비-배양된 태아 섬유모세포 세포; 배양된 및 비-배양된 생식 융기 세포; 배양된 및 비-배양된 분화된 세포; 동기 집단에서의 배양된 및 비-배양된 세포; 비동기 집단에서의 배양된 및 비-배양된 세포; 배양된 및 비-배양된 혈청-기아 세포; 배양된 및 비-배양된 영구 세포; 및 배양된 및 비-배양된 전능성 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321-1329]; [Shim et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 1089-1095]; [Tsung et al., 1995, Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28: 173-189]; 및 [Wheeler, 1994, Reprod. Fertil. Dev. 6: 563-568]을 참조하며, 이들의 각각은 모든 도면, 도면, 및 표를 비롯한 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 핵 공여자는 이전에 동결되거나 동결보존된 세포일 수 있다.
핵 전달의 프로세스에 의해 제조된 하이브리드 세포는 예를 들어, 생식적 클로닝에 또는 재생적 클로닝에 사용될 수 있다.
SCNT 실험은 성체 분화된 체세포로부터의 핵이 전능한 상태로 재프로그래밍될 수 있음을 나타내었다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 생성된 SCNT 배아는 전능성 또는 배아 줄기 세포 또는 줄기-유사 세포 및 세포 콜로니의 생성을 위해 적합한 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배아의 배양 및 성숙에 적합한 배양 배지는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 소 배아 배양 및 유지에 사용될 수 있는 공지된 배지의 예로는 햄 (Ham) F-10+10％ 소 태아 혈청 (FCS), 조직 배양 배지 (Tissue Culture Medium)-199 (TCM-199)+10％ 소 태아 혈청, 티로드-알부민-락테이트-피루베이트 (Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate) (TALP), 둘베코 포스페이트 완충 염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) (PBS), 이글 (Eagle) 및 위튼 (Whitten) 배지를 들 수 있다. 난모세포의 수집 및 성숙에 사용되는 가장 통상적인 배지 중 하나는 TCM-199, 및 소 태아 혈청, 신생아 혈청, 발정기 소 혈청, 양 혈청 또는 거세수소 혈청을 비롯한 1 내지 20％ 혈청 보충물이다. 바람직한 유지 배지는 얼 (Earl) 염, 10％ 소 태아 혈청, 0.2 Ma 피루베이트 및 50 ug/ml 겐타미신 술페이트를 갖는 TCM-199를 포함한다. 상기 중 임의의 것은 또한 다양한 세포 유형, 예컨대 과립막 세포, 난관 세포, BRL 세포 및 자궁 세포 및 STO 세포와의 공동-배양을 포함할 수 있다.
특히, 자궁내막의 상피 세포는 착상전 및 착상 기간 동안 백혈병 억제성 인자 (LIF)를 분비한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 배양 배지에의 LIF의 첨가는 SCNT-유래된 배아의 시험관내 발생을 향상시키기 위해 포함된다. 배아 또는 줄기-유사 세포 배양을 위한 LIF의 사용은 미국 특허 제5,712,156호에 기재되었으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
또다른 유지 배지는 본원에 참조로 포함되는 로센크란스, 주니어 (Rosenkrans, Jr.) 등의 미국 특허 제5,096,822호에 기재되어 있다. CR1로 명명된 이 배아 배지는 배아를 지지하는 데 필요한 영양 물질을 함유한다. CR1은 1.0 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 5.0 mM 범위의 양으로 헤미칼슘 L-락테이트를 함유한다. 헤미칼슘 L-락테이트는 그 상에 혼입된 헤미칼슘 염을 갖는 L-락테이트이다. 또한, 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)] 및 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848 (1995)]에 논의된 바와 같은 인간 배아 줄기 세포를 유지하기 위한 적합한 배양 배지.
일부 실시양태에서, 공급자 세포는 마우스 배아 섬유모세포를 포함할 것이다. 적합한 섬유모세포 공급자 층의 제조를 위한 수단은 이어지는 실시예에 기재되어 있으며, 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
배반포-단계 SCNT 배아 (또는 그의 등가물)로부터 ES 세포 (예를 들어, NT-ESC 또는 hNT-ESC)를 유도하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 기법은 SCNT 배아로부터 ES 세포 (예를 들어, hNT-ESC)를 유도하는 데 사용될 수 있으며, 여기서, hNT-ESC를 생성하는 데 사용되는 SCNT 배아는 KDM4 데메틸라제 족의 구성원 및/또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 SUV39h1/SUV39h2의 억제제로 처리되지 않은 SCNT에 비해, 체세포 공여자 세포로부터 공여된 핵 유전 물질에서 감소된 수준의 H3K9me3을 갖는다. 추가적으로 또는 대안적으로, hNT-ESC는 발생의 보다 초기 단계 동안 클로닝된 SCNT 배아로부터 유도될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 생성된 SCNT 배아로부터 생성된 할구는 유리 피펫을 사용하여 분리되어 전능성 세포를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리는 0.25％ 트립신의 존재 하에서 일어날 수 있다 (Collas and Robl, 43 BIOL. REPROD. 877-84, 1992; Stice and Robl, 39 BIOL. REPROD. 657-664, 1988; Kanka et al., 43 MOL. REPROD. DEV. 135-44, 1996).
특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터의 생성된 배반포, 또는 배반포-유사 클러스터는 배아 줄기 세포주, 예를 들어, 핵 전달 ESC (ntESC) 세포주를 얻는 데 사용될 수 있다. 이러한 주는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)] 및 [Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7544-7848 (1995)]에 의해 보고된 배양 방법에 따라 얻어질 수 있다.
다능성 배아 줄기 세포는 또한 배아의 정상적인 발생에서 출생까지를 방해하지 않고 SCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다. 2004년 11월 4일에 출원된 미국 출원 제60/624,827호; 2005년 3월 14일에 출원된 제60/662,489호; 2005년 6월 3일에 출원된 제60/687,158호; 2005년 10월 3일에 출원된 제60/723,066호; 2005년 10월 14일에 출원된 제60/726,775호; 2005년 11월 4일에 출원된 제11/267,555호; 2005년 11월 4일에 출원된 PCT 출원 제PCT/US05/39776호를 참조하며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다; 또한 문헌 [Chung et al., Nature, Oct. 16, 2005 (인쇄물에 앞서 전자적으로 공개됨) 및 [Chung et al., Nature V. 439, pp. 216-219 (2006)]을 참조하며, 이들의 각각의 전체 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다). 이러한 경우, SCNT 배아는 다능성 줄기 세포의 생성을 위해 파괴되지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 방법은 연구에서의 및 요법에서의 SCNT 배아로부터 유래된 세포의 이용을 포함한다. 이러한 다능성 줄기 세포 (PSC) 또는 전능성 줄기 세포 (TSC)는 제한 없이, 피부, 연골, 골, 골격근, 심장근, 신장, 간, 혈액 및 혈액 형성, 혈관 전구체 및 혈관 내피, 췌장 베타, 뉴런, 교질, 망막, 내이 모낭, 장, 또는 폐 세포를 비롯한 신체 내의 임의의 세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, SCNT 배아, 또는 배반포, 또는 SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, NT-ESC)는 1종 이상의 분화의 유도제에 노출되어 다른 치료적으로 유용한 세포, 예컨대 망막 색소 상피, 조혈 전구체 및 혈관모세포 전구체 뿐만 아니라 외배엽, 중배엽, 및 내배엽의 많은 다른 유용한 세포 유형을 수득할 수 있다. 이러한 유도제는 시토카인, 예컨대 인터류킨-알파 A, 인터페론-알파 A/D, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터페론-감마-유도성 단백질-10, 인터류킨-1 내지 17, 각질세포 성장 인자, 렙틴, 백혈병 억제성 인자, 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증성 단백질-1 알파, 1-베타, 2, 3 알파, 3 베타, 및 단핵구 화학주성 단백질 1 내지 3, 6카인, 액티빈 A, 암피레귤린, 안지오게닌, B-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린, 뇌-유래된 신경영양 인자, C10, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 시토카인-유도된 호중구 화학유인물질-1, 에오탁신, 표피 성장 인자, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트로겐 수용체-알파, 에스트로겐 수용체-베타, 섬유모세포 성장 인자 (산성 및 염기성), 헤파린, FLT-3/FLK-2 리간드, 아교 세포주-유래된 신경영양 인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구대식세포 콜로니 자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-베타, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 헤레귤린-알파, 인슐린, 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 신경 성장 인자, 뉴로토핀-3,4, 온코스타틴 M, 태반 성장 인자, 플레이오트로핀, 란테스, 줄기 세포 인자, 기질 세포-유래된 인자 1B, 트로모포이에틴, 전환 성장 인자--(알파, 베타 1,2,3,4,5), 종양 괴사 인자 (알파 및 베타), 혈관 내피 성장 인자, 및 골 형태형성 단백질, 호르몬 및 호르몬 길항제, 예컨대 17B-에스트라디올, 부신피질자극 호르몬, 아드레노메둘린, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 융모막성 고나도트로핀, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올, 난포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 고나도트로핀, L-3,3',5'-트리아이오도티로닌, 황체형성 호르몬, L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 프로게스테론, 프로락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합 글로불린, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀 방출 인자, 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신의 발현을 변경시키는 효소, 세포외 매트릭스 성분, 예컨대 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질분해적 단편, 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘, 및 프로테오글리칸, 예컨대 아그레칸, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 콘트로이틴 술페이트 프로테오글리칸, 및 신데칸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유도제는 본 발명의 재프로그래밍된 세포로부터 유래된 분화 세포에 대한 유도성 신호를 제공하는 데 사용되는 한정된 조직으로부터의 세포로부터 유래된 세포 또는 성분을 포함한다. 이러한 유도제 세포는 인간, 비-인간 포유동물, 또는 조류, 예컨대 특이적 병원체-무함유 (SPF) 배아 또는 성체 세포로부터 유래될 수 있다.
할구 배양. 한 실시양태에서, SCNT 배아는 할구를 생성하고, SCNT 배아를 파괴하거나, 다르게는 그들의 생존성을 유의하게 변경시키지 않고, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성된 SCNT 배아로부터 단일 할구를 단리하기 위해 착상전 유전적 진단 (PGD)에 현재 사용되는 것들과 관련된 시험관내 기법을 이용하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, 다능성 배아 줄기 (hES) 세포 및 세포주는 배아의 정상적인 발생에서 출생까지를 방해하지 않고 본원에 개시된 바와 같은 SCNT 배아로부터 제거된 단일 할구로부터 생성될 수 있다.
hESC를 유도하는 데 있어서 톰슨 (Thomson) 등 (Thomson et al., Science 282, 1145 (1998))과 함께 "돌리 (Dolly)"의 양 클로닝에서 윌무트 (Wilmut) 등 (Wilmut, et al., Nature 385, 810 (1997)의 발견은 SCNT-배아 또는 환자 자신의 핵으로부터 생성된 SCNT-조작된 세포 덩이로부터 유래된 환자-특이적 hESC의 확립에 기초한 재생적 세포 이식을 위한 상당한 열광을 발생시켰다. 자가 이식을 통해 면역 거부를 회피하는 데 목표를 둔 이 전략은 아마 SCNT에 대한 가장 강한 임상적 근거이다. 마찬가지로, 복잡한 질환-특이적 SCNT-hESC의 유도는 질환 메커니즘의 발견을 가속화할 수 있다. 세포 이식을 위해, 개별적 마우스 자신의 SCNT-유래된 mESC로의 뮤린 SCID 및 PD 모델의 혁신적인 치료는 고무적이다 (Rideout et al., Cell 109, 17 (2002); Barberi, Nat. Biotechnol. 21, 1200 (2003)). 궁극적으로, 폭넓은 조직 적합성을 갖는 SCNT-유래된 줄기 세포의 뱅크를 생성하는 능력은 새로운 난모세포의 계속되는 공급에 대한 필요를 감소시킬 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, hNT-ESC)는 치료적 유용성을 나타내기 위해 임의로 분화되고, 이들이 정상적으로 거주하는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 조직 내로 도입될 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 전신적으로 또는 치료적 유용성이 바람직한 부위로부터 거리를 두고 도입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포는 거리를 두고 작용할 수 있거나, 바람직한 부위로 향할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, SCNT 배아로부터 얻어진 클로닝된 세포, 다능성 또는 전능성 세포는 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 이용될 수 있다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 번식할 수 있는 세포의 단일 세포-유래된 집단의 생성은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 데 유용하다. 세포-세포 유도는 초기 배아에서의 분화를 지정하는 통상적인 수단이다. 많은 잠재적으로 의학적으로 유용한 세포 유형은 척수 뉴런, 심장 세포, 췌장 베타 세포, 및 최종적인 조혈 세포를 비롯한 정상적인 배아 발생 동안 유도적 신호에 의해 영향을 받는다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 번식될 수 있는 세포의 단일 세포-유래된 집단은 다른 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 다양한 시험관내, 난자내, 또는 생체내 배양 조건에서 배양되어 바람직한 세포 또는 조직 유형이 될 수 있다.
SCNT 배아로부터 얻어진 다능성 또는 전능성 세포 (예를 들어, ntESC)는 임의의 바람직한 분화된 세포 유형을 얻는 데 사용될 수 있다. 이러한 분화된 세포의 치료적 용법은 독보적이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 공여자 세포, 또는 수용자 난모세포, 하이브리드 난모세포 또는 SCNT 배아는 본원에서 논의된 바와 같은 방법에 따라 KDM4 히스톤 디메틸라제 활성화제 및/또는 H3K9 메틸트랜스퍼라제 억제제로 처리될 수 있다.
대안적으로, 공여자 세포는 장애를 갖는 대상체로부터의 성체 체세포일 수 있으며, 생성된 SCNT 배아는 질환의 동물 모델 또는 질환의 세포 모델을 생성하는 분화 조건 하에서 배양될 수 있는 질환-특이적 다능성 또는 전능성 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 큰 이점은 SCNT의 효율을 증가시킴으로써, 그것이 특히 유도된 다능성 줄기 세포가 아닌 (예를 들어, iPSC가 아닌) 다능성인 동종 또는 동계 ES 세포의 본질적으로 제한없는 공급을 제공한다는 것이다. 이러한 NT-ESC는, 이들이 부분적으로 다능성이 아니며, 그들의 재프로그래밍을 지정하기 위해 바이러스 트랜스진 또는 재프로그래밍 인자의 강제된 발현을 갖지 않기 때문에, iPSC에 비해 이점을 가지며, 이식에 적합하다.
일부 실시양태에서, SCNT로부터 생성된 NT-ESC는 SCNT 배아로부터 얻어진 환자-특이적 전능성이며, 여기서, 공여자 세포는 다능성 줄기 세포 또는 그의 분화된 자손으로 처리되는 대상체로부터 얻어졌다. 따라서, 이는 현재의 이식 방법과 연관된 상당한 문제, 즉, 숙주-대-이식편 또는 이식편-대-숙주 거부 때문에 일어날 수 있는 이식된 조직의 거부를 제거할 것이다. 통상적으로, 거부는 항-거부 약물, 예컨대 시클로스포린의 투여에 의해 방지되거나 감소된다. 그러나, 이러한 약물은 상당한 유해한 부작용, 예를 들어, 면역억제, 발암 특성을 가질 뿐만 아니라 매우 고비용이다. 본 발명은 항-거부 약물, 예컨대 시클로스포린, 이뮬란, FK-506, 글루코코르티코이드, 및 라파마이신, 및 그의 유도체에 대한 필요를 제거하거나, 적어도 크게 감소시킬 것이다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기법을 채용하며, 이는 널리 통상의 기술자의 범위 내에 있다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; ["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용하능하며, 따라서, 본 발명을 수행하고 실시하는 데 있어서 고려될 수 있다. 특정 실시양태에 특히 유용한 기법은 이어지는 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 검정, 스크리닝, 및 치료 방법을 수행하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: Kdm4d 주사는 SCNT-연관된 비정상적 Xist 활성화를 완화시키지 않는다
불활성 X 염색체는 항-H3K27me3 항체로의 그의 점상 염색에 의해 표시된다. 일관되게, 이러한 점상 염색은 시험관내에서 수정된 (IVF) 배아에서 단지 자성 (XX) 세포에서만 검출가능하지만, 웅성 (XY) 세포에서는 그렇지 않다. 대조적으로, 이러한 점상 염색은 웅성 세르톨리 세포가 공여자 세포로서 사용된 경우 SCNT 배아에서 관찰되었으며 (도 1a), 이는 SCNT 배아에서의 비정상적 Xist 활성화를 시사한다. 중요하게는, Kdm4d 주사는 주사 없는 대조군 SCNT 배아에 비해 점상 염색 패턴 또는 그의 빈도를 변경시키지 않는다 (도 1a, 1b). 이들 결과는 공여자 세포에서의 H3K9me3 및 SCNT 배아에서의 Xist의 이소적 활성화가 SCNT 재프로그래밍에 있어서 2가지 독립적인 장벽임을 입증하였다.
실시예 2: Xist 돌연변이체 공여자 세포 및 Kdm4d mRNA 주사의 조합적 사용은 클로닝 효율을 크게 개선시킨다
2가지 재프로그래밍 장벽이 서로에 독립적이라는 사실은 Xist KO 공여자 세포를 사용하고 Kdm4d를 주사하는 것의 조합된 접근법이 증가된 클로닝 효율을 달성하는 상승적 또는 상가적 효과를 가질 것인지 여부의 질문을 촉발시켰다. 공여자로서 난구 세포를 사용한 SCNT가 시도되었다. B6D2F1 배경을 갖는 야생형 대조군에서, 대리모에 전달된 배아 중 단지 1.2％만이 만기에 도달하였다 (도 1c; 표 2).
<표 2> SCNT 배아의 착상후 발생, 도 1과 관련됨
Figure pct00039
주사된 Kdm4d mRNA의 농도는 1500 ng/ul이었다. N/A, 적용가능하지 않음. ET, 배아 전달
Kdm4d mRNA 주사는 이전의 관찰 (Matoba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 20621-20626, 2014)과 일치하게, 새끼 비율을 8.4％로 증가시켰다. Xist 이형접합성 마우스로부터 유래된 난구 세포가 공여자 세포로서 사용되고, Kdm4d mRNA 주사와 조합되는 경우, 새끼 비율은 18.7％로 증가하였다 (도 1c; 표 S1). 유사하게, 세르톨리 세포-유래된 SCNT 배아의 새끼 비율은 Kdm4d mRNA 주사에 의해 1.8％에서 9.1％로 개선되었고, Xist KO를 Kdm4d mRNA 주사와 조합함으로써 23.5％로 더 증가하였으며 (도 1c; 표 2), 이는 지금껏 보고된 가장 높은 마우스 클로닝률이다 (Ogura et al., Phil. Trans. R. Soc. B 368, 20110329, 2013). 중요하게는, 이 상가적 효과는 또한 하이브리드 (129S1/Svj x CAST/EiJ) 유전적 배경에서 상이한 Xist 돌연변이체 주의 MEF 세포를 사용하여 관찰되었다 (도 1c; 표 2). 조합된 접근법을 사용하여 생성된 새끼는 성체기까지 성장하였으며, 정상적인 생식력을 나타내었다 (도 1d).
상기 결과는 본 발명이 조합된 접근법을 사용함으로써 가장 높은 마우스 클로닝 효율을 제공함을 지시한다. 그러나, 심지어 23.5％의 가장 높은 클로닝 효율은 여전히 IVF 새끼 비율의 절반 미만이며, 이는 전달된 배아의 50％ 초과이다. 사실, 착상된 배아 중 65％ (57개 중 37개)는 조합된 세르톨리 세포 SCNT 군에서 착상후 발생 동안 정지하였다 (표 2). 상이한 배아 단계에서의 주의깊은 형태학적 조사는 배아 정지가 착상 직후 시작하며, 발생이 진행됨에 따라 점차적으로 증가함을 밝혀내었다 (도 2a). 더욱이, 형태학적 및 조직학적 분석은 미로 층 내로의 PAS-양성 해면영양막 세포의 침습과 연관된 큰 태반 표현형 (도 1e)이 Kdm4d mRNA 주사 또는 조합된 접근법에 의해 구제되지 않았음을 밝혀내었다 (도 1e 및 1f; 표 2). 따라서, SCNT 배아 발생을 개선시키는 데 있어서 Xist KO 및 Kdm4d mRNA 주사의 조합된 양성 효과에도 불구하고, 다른 재프로그래밍 장벽은 이들 SCNT 배아의 발생 실패에 기여할 수 있다.
실시예 3: 광범위한 DNA 메틸화 재프로그래밍은 조합적 재프로그래밍된 SCNT 배반포에서 달성된다
조합적 재프로그래밍된 SCNT 배아는 착상 직후 발생적 결함을 나타내기 때문에 (도 2a, 2b, 2c), 재프로그래밍 관련된 후생적 결함은 SCNT 배반포에서 이미 존재하였을 것이지만, 이들은 형태적으로 정상인 것으로 보인다고 상정되었다. 이러한 후생적 결함을 확인하기 위해, Kdm4d mRNA 주사와 조합된 Xist KO MEF 세포 (129S1/Svj x CAST/EiJ 배경)로부터 유래된 둘 다의 SCNT 배반포의 전체 게놈 비술파이트 시퀀싱 (WGBS) 데이터를 생성하고, 유전적으로 매칭된 IVF 배반포의 그것과 비교하였다 (도 3a).
각각 IVF 및 SCNT 배반포로부터의 2060만개 및 2090만개 CpG 부위의 DNA 메틸화 정보 (표 3).
<표 3> WGBS 라이브러리의 요약, 도 2와 관련됨
Figure pct00040
비교를 위해, WGBS 데이터세트를 또한 공개적 데이터베이스로부터 MEF (Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5890-5895, 2014), 정자 및 난모세포 (Wang et al., Cell 157, 979-991, 2014)에 대해 얻었다. 먼저, 모든 커버된 CpG의 평균 DNA 메틸화 수준을 계산하였다. 정자 및 난모세포에서의 평균 메틸화 수준은 각각 82.2％ 및 58.8％인 것으로 밝혀졌다. IVF 접합자의 출발 메틸화 수준으로서 기능하는 정자 및 난모세포의 평균 메틸화 수준은 70.5％이다 (도 3b). 그러나, 고도로 메틸화된 배우자는 가능성 있게는 착상전 발생 동안 일어난 능동 및 수동 탈메틸화 프로세스로 인해 배반포 단계에 의해 낮은 메틸화 수준으로 전반적으로 재프로그래밍되었다 (19.1％).
다음으로, 통상적으로 커버된 CpG의 MEF 세포 및 SCNT 배반포의 DNA 메틸화 수준을 계산하였으며, 공여자 MEF 세포는 고도로 메틸화되지만 (78.0％), SCNT 배반포는 IVF 배반포의 그것 (19.1％)과 유사한 메틸화 수준 (15.6％)으로 낮게 메틸화된 것으로 밝혀졌으며, 이는 DNA 메틸화 상태의 성공적인 전반적 재프로그래밍을 지시한다 (도 3b). 사실, DNA 메틸화의 쌍별 비교는 IVF 및 SCNT 배반포 둘 다가 배우자 또는 MEF 세포에서의 그것에 비해 극도로 낮은 DNA 메틸화를 가짐을 밝혀내었다 (도 3c). 전반적 메틸화 수준 뿐만 아니라 메틸화된 CpG의 분포는 유사하다 (도 5a). 유사한 전반적 DNA 메틸화 패턴과 일치하게, RNA-seq는 IVF 및 SCNT 배반포 사이에 매우 유사한 전사체를 밝혀내었다 (R = 0.988) (도 3d, 4a, 4b, 및 5b). 사실, 검출된 8,921개의 유전자 중에서 (적어도 1개의 샘플에서 FPKM>3), 단지 92개의 유전자만이 SCNT 배반포에서 차등적으로 발현되었다 (FC>3) (도 5d, 표 4).
<표 4> SCNT 배반포에서 차등적으로 조절된 유전자
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
이들 결과는 DNA 메틸화 및 전사체가 배반포 단계에서 SCNT에 의해 크게 재프로그래밍됨을 지시한다.
실시예 4: SCNT 배반포에서의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 확인 및 특징규명
DNA 메틸롬의 성공적인 전반적 재프로그래밍에도 불구하고, SCNT 배반포의 평균 메틸화 수준 (15.6％)은 IVF 배반포의 그것 (19.1％)보다 약간 그러나 유의하게 더 낮았다 (p 값 < 2.2e-16) (도 5b). 게놈-범위 스캐닝 분석 (최소 창 크기로서 10 CpG)을 수행하여 SCNT 및 IVF 배반포 사이의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 확인하였으며, 이는 10％ 초과의 절대 메틸화 차이를 갖는 56,240개의 DMR을 밝혀내었다 (도 5a). 이들 DMR의 대다수 (48,315개: 85.9％)는 IVF의 그것에 비해 SCNT에서 더 낮은 DNA 메틸화를 나타내었으며, 과소DMR로 용어화되었다. IVF의 그것에 비해 SCNT에서 더 높은 DNA 메틸화를 갖는 7,925개의 영역을 확인하고, 과다DMR로 용어화하였다. 흥미롭게도, 과다DMR의 평균 길이 (741 bp)는 과소DMR의 그것 (5,743 bp)보다 훨씬 더 짧다 (도 5b). 사실, 대표적인 과다DMR은 프로모터/인핸서 영역에 샤프한 피크로서 존재하는 반면, 대표적인 과소DMR은 전체 유전자-코딩 영역을 커버한다 (도 6a, 6b). 일관되게, 과다DMR 및 과소DMR은 유전자간 영역에 풍부화된 과다DMR, 반면 유전자 체에 풍부화된 과소DMR을 갖는 별개의 게놈 분포를 나타낸다 (도 5c).
어떻게 이들 DMR이 형성되는지 및 이들이 SCNT 배아의 착상후 발생 실패에 기여할 수 있는지 여부를 이해하기 위해, 분석은 과소DMR에 초점을 맞추었다. 정자에서, 과소DMR에서의 메틸화 수준은 플랭킹 영역보다 유의하게 더 높았다 (약 90％ 대 약 80％) (도 5d). 난모세포에서, 과소DMR 및 플랭킹 영역 사이의 메틸화 차이는 훨씬 더 크다 (약 75％ 대 약 60％) (도 3d). 대조적으로, 과소DMR 및 플랭킹 영역 사이의 메틸화 차이는 MEF에서 훨씬 더 작다 (도 5d). 따라서, SCNT 배반포의 과소DMR은, SCNT 및 IVF 배아 둘 다가 동일한 수의 복제-의존성 희석을 거치는 경우, IVF 배반포에서의 보다 높은 수준에서인 것으로 잔류하는 배우자에서의 그들의 상대적으로 더 높은 DNA 메틸화 수준과 잘 상관된다. 이 개념과 일치하게, 게놈 브라우저 보기에서의 대표적인 과소DMR의 가시적 검사는 난모세포에서의 메틸화 피크가 IVF 배반포에서의 그것들과 명백하게 중첩됨을 밝혀내었다 (도 6b). 대립유전자 DNA 메틸화 분석은 또한 IVF 배반포에서의 메틸화 패턴이 모계 대립유전자로 강하게 편향되기 때문에 이 개념을 뒷받침한다 (도 5e). 사실, 착상전 배아의 공개된 WGBS 데이터세트의 분석 (Wang et al., Cell 157, 979-991, 2014)은 모계 대립유전자가 4 세포-단계까지 과소DMR에서 그의 높은 DNA 메틸화 수준을 유지하는 반면, 부계 대립유전자는 이들 영역에서 그의 메틸화를 빠르게 소실함을 밝혀내었다 (도 5f).
다음으로, 과다DMR을 분석하였다. 과다DMR 및 플랭킹 영역에서의 메틸화 수준은 난모세포에서 유사한 반면 (약 50％), 이는 정자에서 플랭킹 영역보다 유의하게 더 낮다 (약 55％ 대 약 80％) (도 5g). 그들의 메틸화 수준의 차이에도 불구하고, 과다DMR 및 플랭킹 영역 둘 다는 IVF 배반포에서 매우 낮은 수준 (약 20％)으로 탈메틸화되었다 (도 5g). 대조적으로, 과다DMR은 MEF에서 플랭킹 영역의 그것보다 훨씬 더 높은 메틸화 수준으로 심하게 메틸화되었다 (약 80％) (도 5g). 과다DMR이 MEF에서 심하게 메틸화되지만, 배우자에서는 그렇지 않다는 사실은 이들 영역에서의 낮은 메틸화가 배선의 고유한 특색일 수 있음을 시사한다. 사실, 상이한 세포 유형의 공개적인 DNA 메틸롬 데이터세트의 분석은 과다DMR이 사실 분석된 모든 체세포 유형에서 심하게 메틸화되지만, 단지 정모세포, 정세포 및 난모세포에서만 덜 메틸화됨을 밝혀내었다 (도 5h). 일관되게, 과다DMR과 연관된 유전자의 GO 분석은 배선 관련된 기능, 예컨대 정자형성 및 배우자형성의 유의한 풍부화를 밝혀내었다 (도 6c). 과다DMR은 Tet1에 의한 원시 배 세포 (PGC) 발생 동안 탈메틸화되는 것으로 보이는데 (Yamaguchi et al., Nature 504, 460-464, 2013), 이는 히드록시메틸시토신 (5hmC)이 PGC에서 과다DMR에서 유의하게 풍부화되기 때문이다 (도 6d). 이는 과다DMR이 대부분 배선 발생과 관련되지만, 배아 발생과는 그렇지 않음을 시사한다.
실시예 5: SCNT 배반포에서의 H3K27me3-의존성 각인의 소실
결함성 태반 발달은 SCNT 배아에서 중심적 특색이다. 이전의 연구는 게놈 각인이 태반 발달에서 중요한 역할을 함을 확립하였다. 따라서, SCNT 배아의 착상후 결함에 잠재적으로 기여할 수 있는 확인된 DRM 외에도, 게놈 각인에 대한 조합적 접근법의 영향을 평가하는 것은 중요하다. 이 목적으로, 23개의 공지된 각인 제어 영역 (ICR)의 DNA 메틸화 수준을 분석하였는데, 이는 각인된 유전자의 대립유전자 발현이 대립유전자 ICR 메틸화에 의해 크게 제어되기 때문이다. 비교적 DNA 메틸화 분석은 DNA 메틸화 수준이 대부분의 ICR에서 약간 감소되지만, 23개의 ICR 중 21개는 IVF 배반포 수준의 그것의 적어도 반을 유지하였음을 밝혀내었으며 (도 8a), 이는 DNA 메틸화-매개된 게놈 각인이 크게 유지되었음을 지시한다. 사실, 충분한 대립유전자 특이적 메틸화 정보 (IVF 및 SCNT 배반포 둘 다의 둘 다의 대립유전자에서 5 초과의 검출된 CpG)를 갖는 모든 20개의 ICR은 IVF 및 SCNT 배반포 사이의 일관된 대립유전자 특이적 DNA 메틸화를 나타내었다 (도 8b).
SCNT 결함에서의 DNA 메틸화-매개된 게놈 각인의 잠재적 역할을 추가로 평가하기 위해, RNAseq 데이터세트를 126개의 공지된 각인된 유전자에 초점을 맞추어 분석하였다. IVF 배반포에서 신뢰성 있게 검출가능한 (FPKM > 1) 45개의 각인된 유전자 중에서, 단지 6개만이 IVF 배반포에서의 그것에 비해 SCNT 배반포에서 유의하게 상향조절되었다 (FC > 1.5) (도 8c). 대립유전자 발현 분석 (FPKM>1, 어느 샘플에서든 평균 SNP 판독물 > 10)은 충분한 수의 SNP 판독물을 갖는 36개의 각인된 유전자 중에서, IVF 배반포에서 6개는 모계-대립유전자 편향된 (Mat/Pat > 2.0) 발현을 나타내었고, 13개는 부계-대립유전자 편향된 (Pat/Mat >2.0) 발현을 나타내었음을 밝혀내었다 (도 8d 및 8e, 보다 밝은 막대). 모든 6개의 모계적으로 발현된 유전자 (MEG)는 SCNT 배반포에서 그들의 모계 편향된 발현을 유지하였다 (도 8d). 13개의 부계적으로 발현된 유전자 (PEG) 중에서, 7개는 대립유전자 편향을 소실하였고, SCNT 배반포에서 이중대립유전자적으로 발현되게 되었다 (도 8e에서 화살표). 흥미롭게도, SCNT 배반포에서 각인된 발현을 소실한 7개의 PEG는 Slc38a4, Sfmbt2, Phf17 및 Gab1을 포함하였으며 (도 8e에서 보다 어두운 막대), 그의 각인된 발현은 DNA 메틸화에 독립적이지만, 모계적으로 침착된 H3K27me3에 의존하는 것으로 공지되어 있다 (Inoue et al., Nature 547, 419-424, 2017).
분석은 최근 확인되었지만 상기 분석에 포함되지 않은 H3K27me3-의존성 각인된 유전자에 초점을 맞추었다. 상실배 배아에서 H3K27me3-의존성 각인된 발현을 나타내는 76개의 유전자 중에서 (Inoue et al., Nature 547, 419-424, 2017), 26개는 IVF 배반포에서 신뢰성 있게 검출가능한 수준 (FPKM >1)으로 발현된다. 흥미롭게도, 이들 중 대다수 (15개/26개)는 SCNT 배반포에서 유의하게 상향조절된다 (FC>1.5) (도 7a). 대립유전자 발현 분석은 충분한 SNP 판독물을 갖는 23개의 유전자 중에서 (FPKM>1, 어느 샘플에서든 평균 SNP 판독물 > 10), 17개가 분석된 유전적 배경 (129S1/Svj x CAST/EiJ) 하에서 IVF 배반포에서 부계적으로 편향된 발현 (Pat/Mat > 2.0)을 나타내었음을 밝혀내었다. 현저하게, 모든 17개의 PEG는 부계 대립유전자-편향된 발현을 소실하였고, 이중대립유전자 발현을 나타내었다 (도 7b). 이들 결과는 H3K27me3-의존성 각인된 유전자가 SCNT 배반포에서 그들의 각인을 완전히 소실함을 명백하게 입증하였다.
왜 이들 H3K27me3-의존성 각인된 유전자는 SCNT 배반포에서 각인을 소실하는가? 이들 유전자의 각인 상태는 난자형성 동안 침착된 모계 대립유전자-특이적 H3K27me3 도메인에 의해 조절되기 때문에, 공여자 MEF에서의 H3K27me3 패턴은 난모세포에서의 그것과 상이할 수 있음이 가능하다. 충분히 성장된 난모세포 및 MEF 세포의 이용가능한 H3K27me3 ChIP-seq 데이터세트의 분석은 난모세포에서 이들 각인된 유전자에서의 H3K27me3 도메인이 MEF 세포에 완전히 부재하였음을 밝혀내었다 (도 7c 및 8f). 분석은 다른 체세포 유형을 포함하도록 확장되었다. 이 분석은 이들 각인된 유전자에서의 H3K27me3 도메인이 일반적으로 분석된 체세포 유형으로부터 부재하였으며, 따라서 난모세포 게놈에 고유하였음을 밝혀내었다 (도 8d). 이들 결과는 공여자 체세포에서의 이들 각인된 유전자의 모계 대립유전자에서의 H3K27me3 메틸화의 결여가 SCNT 후의 각인의 소실 (LOI)의 원인일 가능성이 있음을 지시한다.
SCNT에 의한 20개 초과의 포유동물 종의 성공적인 클로닝에도 불구하고, 클로닝 효율은 한결같이 낮으며, 태반 과다성장을 비롯한 발생적 이상이 본질적으로 모든 클로닝된 포유동물 종에서 관찰된다. 후생적 이상은 클로닝된 동물의 발생 실패의 원인이 되는 것으로 추측되었다. 이 연구에서, 2가지 접근법을 조합하여 마우스 SCNT 배아의 발생을 방해하는 2가지 이전에 확인된 재프로그래밍 장벽을 극복하였다. Xist KO 공여자 체세포 및 Kdm4d mRNA 주사의 조합적 사용은 사실 전체 클로닝 효율 (만기 비율)을 20배 증가시켜 체세포 공여자 세포를 사용한 마우스 생식적 클로닝에서 지금껏 보고된 가장 높은 새끼 비율 (예를 들어, 세르톨리 세포를 사용하여 23％)을 생성하였다. 이 효율은 그것이 유사한 핵 주사가 포함된 세포질내 정자- 또는 정세포 주위-주사 (ICSI/ROSI)의 그것과 가깝기 때문에 주목할 만하다 (Ogonuki et al., PLoS One 5, 2010; Ogura et al., International Review of Cytology, pp. 189-2292005). 이 달성은 공여자 세포에서의 H3K9me3 및 Xist의 비정상적 활성화가 성공적인 클로닝을 위한 2가지 주요한 장벽을 나타내며, 따라서 SCNT-매개된 재프로그래밍의 분자적 메커니즘을 이해하기 위한 토대를 확립함을 명백하게 입증한다.
주목할 만한 개선에도 불구하고, 조합적 접근법을 사용하여 생성된 SCNT 배아 중 많은 것은 착상 후에 발생하는 데 실패하였다. 더욱이, 태반 과다성장은 공여자 세포 유형과 무관하게 여전히 관찰되었으며, 이는 고효율 동물 클로닝을 위해 추가의 장벽이 존재함을 지시한다. 이들 추가의 재프로그래밍 장벽을 확인하기 위해, 발생 실패가 시작되는 시간을 확인하고, 제1 WGBS 데이터세트를 발생적 표현형이 나타나기 직전에 SCNT 배반포로부터 생성하였다. 비교적 DNA 메틸롬 분석은 SCNT에 의한 성공적인 전반적 DNA 메틸롬 재프로그래밍을 밝혀내었으며, 이는 난모세포질 및 절단 배아에서의 DNA 탈메틸화 기구가 IVF 배아에서의 그것에 비해 SCNT 배아에서 유사하게 기능적임을 지시한다. 그럼에도 불구하고, DNA 메틸롬의 상세한 비교적 분석은 IVF 및 SCNT 배반포 사이의 게놈에 걸쳐 많은 DMR을 밝혀내었다. 흥미롭게도, 과다DMR은 배선에서 탈메틸화된 게놈 영역에 풍부하며, 이는 배 세포-특이적 유전자가 배 세포 발생 동안, 특히 원시 배 세포 (PGC) 단계에서 Tet1에 의해 탈메틸화된다는 사실과 일치한다. 그러나, SCNT는 이 탈메틸화 프로세스를 우회한다. 과다DMR-연관된 유전자의 목록은 1세포 SCNT 배아에서 빠르게 탈메틸화되는 것으로 보고된 소수의 배선 유전자를 포함하지 않으며, 이는 대다수는 아니지만 일부 배선 유전자가 SCNT 후에 탈메틸화됨을 지시한다. 한편, 과소DMR은 주로 난모세포에서 메틸화된 영역과 중첩한다. 이들 영역에서의 모계 DNA 메틸화는 IVF 배아에서 특히 8-세포 단계 전에 탈메틸화 프로세스를 벗어나는 것으로 보인다. 8-세포 단계 전의 DNA 메틸화의 모계 대립유전자-특이적 유지에 대한 기저의 메커니즘은 추가의 연구를 위해 흥미롭다. 집합적으로, SCNT 특이적 DMR은, 높거나 낮거나, 정상적인 수정을 통해 배반포에 유전되는 배우자형성의 고유한 특색으로 인해 형성되는 것으로 보인다. 수정을 통해 난모세포로부터 배아로 전해진 모계 DNA 메틸화는 초기 단계 영양막 발달에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (Branco et al., Dev. Cell 36, 152-163, 2016). 따라서, SCNT 배반포에서의 난모세포-유사 DNA 메틸화 패턴의 소실은 SCNT 배아의 발생적 표현형에 기여할 수 있다.
본원에서 보고된 바와 같이, DNA 메틸화-각인된 유전자의 DNA 메틸화 및 전사체 분석은 대부분의 ICR이 그들의 정상적인 각인 상태를 크게 유지하며, 대부분의 정규 각인된 유전자가 사실 SCNT 배반포에서 대립유전자 발현 패턴을 유지함을 밝혀내었다. 대조적으로, 최근 발견된 H3K27me3-매개된 비-정규 각인된 유전자 (Inoue et al., 2017)는 전체적으로 조절이상되며, SCNT 배반포에서 이중대립유전자 발현을 나타낸다. SCNT 배반포에서의 조절이상된 비-정규 각인된 유전자의 목록은 Slc38a4, Sfmbt2 및 Gab1을 포함하였으며, 이는 E13.5 SCNT 배아의 태반에서의 이들 3가지 유전자의 각인의 소실 (LOI)의 이전의 보고와 일치한다 (Okae et al., Hum. Mol. Genet. 23, 992-1001, 2014). 3가지 유전자 모두가 태반 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났음을 고려하여, 이들 유전자의 LOI는 SCNT 배아의 태반 과다성장 표현형에 기여할 가능성이 있다. 더욱이, Runx1, Otx2 및 Etv6은 마우스 초기 배아 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, 따라서 배반포 단계에서 이들 유전자의 LOI는 착상후 SCNT 배아의 배아 치사 표현형에 기여할 수 있다. SCNT에서의 비-정규 각인된 유전자의 LOI의 원인은 공여자 체세포에서 이들 좌위에서의 H3K27me3의 부재에 기인할 가능성이 크다. H3K27me3-각인된 유전자의 조절 메커니즘에 대한 추가의 상세한 분석은 SCNT 배아 발생을 개선시키기 위한 단서를 제공할 것이다.
요약하면, Kdm4d mRNA 주사를 Xist KO 공여자 세포의 사용과 조합함으로써 가장 효율적인 마우스 클로닝 방법을 확립하는 것 외에도, H3K27me3 각인은 효율적인 동물 클로닝을 방지하는 잠재적인 장벽으로서 밝혀졌다. 이론에 의해 구애되기를 의도하지는 않지만, 마우스 SCNT 배반포에서의 H3K27me3-의존성 각인된 유전자에서의 LOI의 명백한 연관 및 배아 발생에서의 그들의 중요한 기능에 기초하여, H3K27me3-각인된 유전자에서의 LOI는 SCNT 배아의 착상후 표현형을 해명할 가능성이 크지만, 이 연구에서 확인된 비정상적 DNA 메틸화의 잠재적 기여의 가능성은 배제될 수 없다. SCNT 배아에서 결함성 착상후 발생 및 비정상적 태반 표현형이 포유동물 종에서 통상적으로 관찰됨을 고려하여, 다른 종의 클로닝된 배아에서의 H3K27me3-의존성 각인 상태의 조사는 추가의 조사를 보증할 수 있다.
기재된 결과는 하기 방법 및 물질을 사용하여 얻어졌다.
PN5 단계 접합자로부터의 모계 및 부계 전핵의 단리
모든 동물 연구는 하바드 메디칼 스쿨 (Harvard Medical School)에서의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었다. MII-단계 난모세포를 7.5 I.U.의 PMSG (밀리포어 (Millipore)) 및 hCG (밀리포어)를 주사함으로써 과배란된 8주령 B6D2F1/J (BDF1) 암컷으로부터 수집하였다. 시험관내 수정 (IVF)을 위해, MII 난모세포를 10 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))으로 보충된 HTF 배지에서 성체 BDF1 수컷 마우스의 꼬리 부고환으로부터 얻어진 활성화된 정자로 수정시켰다. 정자 수정능은 HTF 배지에서 1시간 인큐베이션에 의해 획득되었다. 접합자를 37.8℃에서 5％ CO2/95％ 공기를 갖는 습윤 분위기에서 배양하였다. 수정후 10시간 (hpf)에서, 접합자를 10 μg/ml 시토칼라신 B (시그마-알드리치)를 함유하는 M2 배지 내로 옮겼다. 투명대를 피에조 (Piezo) 충격-유도된 미세조작장치 (프라임 테크 리미티드 (Prime Tech Ltd.), 일본 이바라키켕)에 의해 커팅하고, 전핵을 접합자로부터 단리하였다. 12 hpf (PN5-단계)에서, 단리된 전핵을 0.2％ BSA/PBS로 세척하고, 에펜도르프 로바인드 (Eppendorf LoBind) 1.5 ml 튜브 내로 옮기고, DN아제 I 처리까지 얼음 상에 정치하였다. 각각의 실험에 대해, 150 내지 200개의 전핵을 수집하고, liDN아제-seq를 위해 준비하였다. 모 전핵을 (1) 제2 극체로부터의 거리 및 (2) 전핵의 크기에 의해 구별하였다.
웅성발생성 (AG) 및 자성발생성 (GG) 배아의 제조
MII 난모세포를 8주령 과배란된 BDF1 암컷으로부터 수집하고, BDF1 정자와 수정시켰다. 7 hpf에서, 접합자를 5 μg/ml 시토칼라신 B를 함유하는 M2 배지 내로 옮기고, 모 전핵을 피에조 충격-유도된 미세조작장치를 사용함으로써 교환하였다. 센다이 바이러스 (HVJ, 코스모-바이오 (Cosmo-bio))를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 핵질체를 세포질과 융합시켰다. 재구축 후, 배아를 KSOM에서 배양하였다.
RNA-seq 또는/및 liDN아제-seq를 위한 배아를 수집할 경우, 투명대 (ZP)를 산 티로이드 용액 (시그마-알드리치)에의 간단한 노출에 의해 제거한 후, 배아를 M2 배지, 및 그 후 0.2％ BSA/PBS로 세척하였다. liDN아제-seq를 위해, 10개의 상실배 배아를 에펜도르프 로바인드 1.5 ml 튜브 내로 옮기고, DN아제 I 처리까지 얼음 상에 정치하였다. RNA-seq를 위해, 7 내지 10개의 배아를 얇은 벽 RN아제-무함유 PCR 튜브 (앰비온) 내로 옮겼다. 2-세포 및 상실배 배아를 각각 30 및 78 hpf에서 수집하였다. α-아마니틴 처리된 2-세포 배아를 제조하기 위해, 5 hpf 접합자를 25 μg/ml α-아마니틴 (시그마-알드리치)을 함유하는 KSOM 내로 옮기고, 수집까지 (30 hpf) α-아마니틴의 존재 하에서 배양하였다. ICM 및 TE를 단리하였다. 간략하게, 120 hpi에서의 AG 및 GG 배아를 산 티로이드 용액으로 처리하여 ZP를 제거하였다. M2 배지에서 세척한 후, 배아를 토끼 항-마우스 림프구 혈청 (씨더레인 (Cedarlane), 1:8 희석)을 함유하는 KSOM에서 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. M2 배지에서 세척한 후, 이들을 기니아 피그 보체 (엠피 바이오메디칼스 (MP Biomedicals), 1:3.3 희석)를 함유하는 KSOM 내로 옮겼다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 후, 용해된 TE 세포를 유리 모세관으로 피펫팅함으로써 제거하였다. 잔류의 ICM 클럼프를 0.25％ 트립신/EDTA (써모 피셔 (Thermo Fisher), 25200)에서 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 용해된 TE 세포의 오염을 회피하기 위해 단일 세포로 분리하였다. 100 내지 200개의 세포를 RNA-seq를 위해 수집하였다.
완전히 성장된 난모세포로부터의 GV 핵의 단리
완전히 성장된 GV-단계 난모세포를 5 I.U. PMSG로의 주사 후 44 내지 48시간에 3주령 BDF1 마우스로부터 얻었다. 난소를 M2 배지 내로 옮겼다. 난소 여포를 30-게이지 바늘로 천공하고, 난구 세포를 좁은 구멍 유리 피펫을 사용하여 난구-난모세포 복합체로부터 부드럽게 제거하였다. 그 후, 난모세포를 5％ 소 태아 혈청 (FBS) (시그마-알드리치, F0926), 10 ng/ml 표피 성장 인자 (시그마-알드리치, E4127), 및 0.2 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX; 시그마-알드리치)으로 보충된 α-MEM (라이프 테크놀로지스 (Life technologies), 12571-063) 내로 옮겼다. 수집 후 1시간에, 핵소체 주위 (SN)-유형 염색질을 갖는 가시적 난황주위 공간을 나타내는 GV 난모세포를 도태시켰다. 그 후, 이들을 10 μg/ml 시토칼라신 B, 0.1 μg/ml 콜세미드 (시그마-알드리치), 및 0.2 mM IBMX를 함유하는 M2 배지에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, GV 핵을 피에조-유도된 미세조작장치를 사용함으로써 단리하였다. 0.2％ BSA/PBS로 세척한 후, GV 핵을 에펜도르프 로바인드 1.5 ml 튜브 내로 옮겼다. 각각의 실험에 대해, 115 내지 150개의 GV 핵을 liDN아제-seq를 위해 수집하였다.
E6.5 배아의 절개 및 GFP-양성 E9.5 태반 세포의 FACS 분류
C57BL6(B6)/PWK 하이브리드 배아를 얻기 위해, 자연 교배 방식을 사용하였다. PWK/B6 하이브리드 배아를 얻기 위해, PWK 난모세포와 B6 정자의 시험관내 수정을 사용하고, 2-세포 배아를 ICR 주 대리모 내로 전달하였다. E6.5 배아의 EPI, EXE, 및 VE로의 절개를 수행하였다. E9.5 태반 세포를 수집하기 위해, 잭슨 래버러토리 (Jackson laboratory)로부터 B6GFP 마우스를 구입하였다 [C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)131Osb/LeySopJ, 스톡 번호 006567]. MII 난모세포 및 정자를 과배란된 8주령 B6GFP 또는 PWK 마우스로부터 수집하였다. 시험관내 수정 후, 2-세포 배아를 ICR 주 대리모 내로 전달하였다. E9.5에서, 태반을 수확하고, 약 0.5 mm 조각으로 커팅하고, 50 ml 튜브 내로 옮기고, 2 ml의 0.25％ 트립신-EDTA (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific), 25200)로 30℃에서 15분 동안 200 rpm의 진탕기에서 처리하여 태반 세포를 분리하였다. 트립신 처리를 10％ FBS를 함유하는 2 ml DMEM의 첨가에 의해 중지시켰다. 피펫팅 후, 튜브를 원심분리하고, 펠릿화된 세포를 0.2％BSA/PBS로 3회 세척하였다. DAPI를 최종 세포 현탁액 중 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. GFP-양성 세포를 BD FACS아리아 기계 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences))를 사용하여 분류하고, DAPI 양성 세포는 죽은 세포로서 제외하였다. 대략 10,000 내지 20,000개의 GFP-양성 세포를 각각의 태반으로부터 수집하였으며, 이는 총 태반 세포의 40 내지 60％에 상응하였다.
플라스미드 구축 및 mRNA 제조
Kdm6b WT 구축물을 생성하기 위해, 촉매 도메인을 함유하는 카르복실-말단 부분 (아미노산 1025-말단)을 코딩하는 cDNA를 증폭시켰다. PCR 앰플리콘을 pcDNA3.1-플래그 (Flag)-폴리(A)83 플라스미드의 플래그 태그 및 폴리(A) 사이에서 클로닝하였다. H1390A Kdm6b MUT 구축물을 프라임스타 (PrimeSTAR) 돌연변이유발 (타카라 (TAKARA))을 사용함으로써 생성하였다. 돌연변이유발에 사용된 프라이머는 5'- CCAGGCgctCAAGAGAATAACAATTTCTGCTCAGTCAACATCAAC-3' 및 5'- CTCTTGagcGCCTGGCGTTCGGCTGCCAGGGACCTTCATG-3'이다. 모든 구축물을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 야생형 및 H189A 돌연변이체 Kdm4d에 대한 플라스미드는 이전에 기재되었다.
제한 효소에 의한 선형화 후, 구축물을 페놀-클로로포름 추출로 정제하였다. mRNA를 mMESSAGE mMACHINE T7 울트라 키트 (Ultra Kit) (라이프 테크놀로지스)를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 합성된 mRNA를 염화리튬 침전에 의해 정제하고, 뉴클레아제-무함유수로 희석하였다. mRNA 분취물을 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
mRNA 주사
MII 난모세포를 과배란된 8주령 BDF1 암컷으로부터 수집하고, BDF1 정자와 수정시켰다. 2.5 hpf에서, 수정된 난모세포를 M2 배지 내로 옮기고, mRNA를 피에조 충격-유도된 미세조작장치를 사용하여 주사하였다. mRNA 주사를 4 hpf까지 완결하였다. Kdm6b WT 및 Kdm6b MUT 의 mRNA 농도는 1.8 μg/μl이고, Kdm4d WT 및 Kdm4d MUT 의 그것은 1.5 μg/μl이었다. Kdm6b-주사된 PG 배아를 제조하는 경우, MII 난모세포를 5 μg/ml 시토칼라신 B를 함유하는 Ca2+-무함유 KSOM에서 3 mM SrCl2로 처리함으로써 화학적으로 활성화시켰다. 활성화후 4시간 (hpa)에서, 배아를 KSOM으로 세척하였다. 5 hpa에서, 이들을 mRNA로 주사하였다.
전조직 표본 면역염색
접합자를 0.2％ 트리톤 (Triton)을 함유하는 PBS 중 3.7％ 파라포름알데히드 (PFA)에서 20분 동안 고정시켰다. 10 mg/ml BSA를 함유하는 PBS (PBS/BSA)로 4회 세척 후, 접합자를 1차 항체로 4℃에서 밤새 처리하였다. 이 연구에 사용된 1차 항체는 마우스-항-H3K27me3 (1/500, 액티브 모티프 (Active Motif), 61017), 토끼 항-H3K9me3 (1/500, 밀리포어, 07-442), 및 토끼 항-FLAG (1/2000, 시그마-알드리치, F7524)이었다. PBS/BSA로 3회 세척 후, 샘플을 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노-리서치 (Jackson Immuno-Research)) 또는 알렉사 플루오르 568 당나귀 항-토끼 IgG (라이프 테크놀로지스)의 1:250 희석물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 접합자를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 갖는 벡타쉴드 (Vectashield) 항-표백 용액 (벡터 래버러토리스 (Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 벌링게임)에서 유리 슬라이드 상에 마운팅하였다. 형광을 회전 디스크 (CSU-10, 요코가와 (Yokogawa)) 및 EM-CCD 카메라 (ImagEM, 하마마츠 (Hamamatsu)) 또는 자이스 (Zeiss) LSM800을 갖는 레이저-스캐닝 공초점 현미경 하에서 검출하였다.
모든 화상을 액시오비젼 (Axiovision) 소프트웨어 (칼 자이스 (Carl Zeiss))를 사용하여 획득하고, 분석하였다. 형광 신호 강도를 액시오비젼 소프트웨어로 정량화하였다. 간략하게, 모계 전핵 내의 신호 강도를 측정하고, 세포질성 신호를 배경으로서 차감하였다. 그 후, 주사 없는 대조군 접합자의 평균된 신호 강도를 1.0으로 설정하였다.
저-투입 DN아제-seq
저-투입 DN아제-seq 라이브러리를 약간의 변형으로 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. 1.5 ml 튜브에서 수집된 배아 또는 핵을 36 μl 용해 완충제 (10 mM 트리스 (Tris)-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.1％ 트리톤 X-100)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. DN아제 I (10 U/μl, 로슈 (Roche))을 80 U/ml (GV 핵 샘플에 대해) 또는 40 U/ml (모든 다른 샘플에 대해)의 최종 농도로 첨가하고, 37 ℃에서 정확히 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 2 μl 프로테이나제 (Proteinase) K (20 mg/ml, 라이프 테크놀로지스)를 함유하는 80 μl 정지 완충제 (Stop Buffer) (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.15％ SDS, 10 mM EDTA)를 첨가함으로써 정지시켰다. 그 후, 20 ng의 원형 운반체 DNA [작은 DNA 단편을 제거하기 위해 0.5x 베크만 SPRI셀렉트 (Beckman SPRIselect) 비드 (베크만 쿨터 (Beckman Coulter))로 정제된 임의의 포유동물 유전자가 없는 순수한 플라스미드 DNA]를 첨가하였다. 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, DNA를 페놀-클로로포름으로의 추출에 의해 정제하고, 선형 아크릴아미드 (라이프 테크놀로지스)의 존재 하에서 에탄올에 의해 -20 ℃에서 밤새 침전시켰다. 침전된 DNA를 50 μl TE (2.5 mM 트리스, pH 7.6, 0.05 mM EDTA)에 재현탁시키고, 전체 부피를 시퀀싱 라이브러리 구축에 사용하였다.
어댑터 라이게이션을 20 ℃에서 30분 동안 라이게이션 반응에서 0.03 μM 어댑터로 수행하고, PCR 증폭을 카파 하이파이 (Kapa Hifi) 핫스타트 레디믹스 (카파 바이오시스템스 (Kapa Biosystems))를 사용하여 8-사이클 동안 수행한 것을 제외하고는, 일루미나를 위한 NEB넥스트 울트라 II DNA 라이브러리 프렙 키트 (NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina) (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. PCR 생성물을 x1.3 부피의 SPRI셀렉트 비드 (베크만 쿨터)로 정제한 후, x0.65 부피, 이어서 x0.7 부피의 SPRI셀렉트 비드로 크기 선택하였다. 샘플을 24 μl TE에 용리하였다. 제2 PCR 증폭에 필요한 사이클의 수를 1 μl의 1:1,000 희석된 샘플을 사용하여 qPCR에 의해 결정하였다. 그 후, 잔류의 23 μl의 샘플을 카파 하이파이 핫스타트 레디믹스로 증폭시켰다 (본 발명자들은 이 연구에서 모든 샘플에 대해 7 사이클을 사용하였다). PCR 생성물을 x1.3 부피의 SPRI셀렉트 비드로 정제한 후, x0.65 부피, 이어서 x0.7 부피의 SPRI셀렉트 비드로 크기 선택하였다. DNA를 30 μl의 TE에 용리하고, 큐비트 (Qubit) dsDNA HS 검정 키트 (써모 피셔 사이언티픽, Q32854) 및 애질런트 (Agilent) 고민감도 검정 키트 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies))에 의해 정량화하였다. 라이브러리를 단일-말단 100 bp 판독물을 갖는 하이섹 (Hiseq)2500 (일루미나 (Illumina)) 상에서 시퀀싱하였다.
RNA-시퀀싱
RNA-seq 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, 역전사 및 cDNA 증폭을 스마터 울트라 저 투입 (SMARTer Ultra Low Input) RNA cDNA 제조 키트 (클론테크 (Clontech), 634890)로 전체 배아 용해물을 사용하여 수행하였다. 2-세포 AG, GG 및 α-아마니틴-처리된 IVF 배아 샘플을 프로세싱하는 경우, 1 μl의 1:40,000 희석된 ERCC (외부 RNA 제어 컨소시엄 (External RNA Controls Consortium)) 표준 RNA (라이프 테크놀로지스)를 세포 용해의 단계에서 각각의 튜브에 첨가하였다. 그 후, cDNA를 마이크로튜브 (microTUBE)-50 (코바리스 (Covaris))을 갖는 코바리스 M220 초음파발생기 (코바리스)를 사용하여 평균 150 내지 160 bp 단편으로 단편화하였다. 단편화된 cDNA를 말단-복구시키고, 어댑터 라이게이션하고, 일루미나를 위한 NEB넥스트 울트라 DNA 라이브러리 프렙 키트를 제조업자의 지시서 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 따라 사용하여 증폭시켰다. 단일 말단 100 bp 시퀀싱을 하이섹2500 시퀀서 (일루미나) 상에서 수행하였다.
liDN아제-seq 데이터 분석
liDN아제-seq 데이터의 판독물을 먼저 trim_galore를 갖는 저 품질 및 어댑터로 트리밍한 후, 고유한 맵핑 히트를 유지하기 위해 보타이 (Bowtie) v0.12.9. '-m 1' 파라미터를 사용하여 마우스 게놈 (mm9)에 대해 맵핑하였다. 10 이하의 맵핑 품질 (MAPQ)을 갖는 판독물 또는 동일한 배향을 갖는 동일한 위치에 대해 맵핑된 중복 판독물을 SAM툴스 (SAMtools)로 제거하였다. liDN아제-seq 데이터에서의 DHS 피크를 FDR <= 0.01을 갖는 핫스팟 (Hotspot) 프로그램에 의해 확인하였다. 모든 33개의 라이브러리로부터의 DHS 피크를 베드툴스로부터의 '베드툴스 머지 (bedtools merge)'를 사용하여 병합하였다. 각각의 라이브러리에 대한 각각의 DHS에서의 판독물의 수를 딥툴스 (deepTools)로부터의 '멀티밤서머리 (multiBamSummary)'를 사용하여 계산하고, 맵핑된 판독물의 총 수에 대해 및 DHS의 길이에 대해 정규화하였다 (백만개 맵핑된 판독물 당 1 kb 당 위치 상에 위치한 태그의 가능성). 성 염색체의 수는 모 전핵 사이에 및 웅성발생성 및 자성발생성 배아 사이에 상이하기 때문에, 성 염색체의 판독물을 제거하였다. 게놈-범위 DHS에서의 태그 밀도의 피어슨 상관 계수 (r)를 계산하여 반복실험 사이의 상관을 측정하였다. 접합자 및 상실배 배아에서의 모 대립유전자-특이적 DHS의 확인을 위해, 엄격한 컷오프를 사용하였다 (편향된 대립유전자에서 모든 반복실험에서 RPKM 평균>2, RPKM>1, 및 2개의 대립유전자 사이에 4 초과의 평균 값 배수 변화). 431개의 가장 신뢰성 있는 Ps-DHS를 미세주사된 접합자의 부계 PN의 모든 반복실험에서 추가의 기준 'RPKM>1을 Ps-DHS에 적용함으로써 확인하였다. UCSC 게놈 브라우저 데이터베이스로부터의 RefSeq 유전자 어셈블리 (mm9) 및 이전에 정의된 CGI를 도 2d 및 2e에서 게놈 특색 분포 분석으로서 사용하였다.
RNA-seq 데이터 분석
마우스 게놈 (mm9)을 ERCC 대조군과 조합한 주문제작 참조 서열을 구축하였다. RNA-seq의 판독물을 톱핫 (TopHat) v2.0.6 또는 STAR (github.com/alexdobin/STAR)로 참조 게놈에 대해 맵핑하였다. 모든 프로그램을 달리 명시되지 않는다면 디폴트 파라미터로 실행하였다. 고유하게 맵핑된 판독물을 이어서 하위판독물-v1.5.1로부터의 피처카운트 (featureCounts)로 참조 주석 (UCSC 유전자 모델)에 의해 가이드된 전사체 내로 어셈블리하였다. 모든 2-세포 RNA-seq 라이브러리에 대해, 라이브러리 크기 인자를 단지 ERCC 판독물 카운트를 사용하여 R 패키지 DESeq로부터의 'estimateSizeFactors' 기능으로 추정하였다. 라이브러리 크기를 정규화한 후, 각각의 유전자의 발현 수준을 정규화된 FPKM (백만개 맵핑된 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편)으로 정량화하였다. 이중실험 사이의 상관을 지시하는 유전자 발현 수준의 피어슨 상관 계수 (r)를 계산하였다. 2-세포 단계에서 새롭게 합성된 전사체의 확인을 위해, 통계적으로 비-유의한 유전자를 AG 또는 GG 및 α-아마니틴 처리된 2-세포 배아 사이에서 필터링하였다. 이 목적으로, 조정된 P 값을 음성 이항식 모델을 사용하여 R 패키지 DESeq로부터의 'nbinomTest' 기능으로 계산하고, 단지 FDR<0.05를 갖는 유전자를 선택하였다. 그 후, 추가의 컷오프 [평균 FPKM (AG 또는 GG)>2 및 배수-변화 (FC) (AG/Ama 또는 GG/Ama)>2]를 적용하였다. 그 결과, 4,381개 및 3,916개의 유전자가 AG 및 GG 2-세포 배아에서 각각 새롭게 합성된 유전자로서 확인되었다. 2-세포 배아에서 AG- 및 GG-특이적 DEG를 확인하기 위해, α-아마니틴 2-세포 배아에서 각각의 유전자의 유전자 발현 수준 (FPKM)을 AG 및 GG 배아의 그것으로부터 차감하였다. FC (AG/GG 또는 GG/AG)>10을 나타내는 유전자를 DEG로서 확인하였다.
WGBS 및 H3K27me3 ChIP-seq 데이터 분석
DHS에서의 DNA 메틸화 수준을 메트파이프 v3.4.2를 사용하여 계산하였다. 각각의 DHS에서의 DNA 메틸화 수준을 계산하는 경우, WGBS 판독물의 충분한 커버리지를 얻기 위해, 각각의 DHS를 2 kb 위 및 아래 둘 다로 연장하여 보다 가까운 CpG 부위를 포함시켰다. 난모세포-메틸화된 gDMR은 난모세포에서 >80％ 메틸화 및 정자에서 <20％에 의해 정의되었다. 도 5a에 대해, "베드툴스 메이크윈도우스 (bedtools makewindows)"를 사용하여 Ps-DHS의 ±100 kb 플랭킹 영역에 대해 비-중첩된 1 kb 빈의 세트를 생성하였다. H3K27me3 ChIP-seq 분석을 위해, 베드 파일을 문헌 [Zheng et al., 2016]으로부터 다운로드하고, UCSC 게놈 브라우저 데이터베이스로부터의 '베드클립 (bedClip)' 및 '베드그래프투빅윅 (bedGraphToBigWig)'을 사용하여 빅윅 (bigWig) 포맷으로 전환시켰다. 딥툴스로부터의 '멀티빅윅서머리 (multiBigwigSummary)'를 사용하여 DHS 및 주위의 영역에 비한 H3K27me3 신호를 산출하였다.
통계적 분석 및 데이터 가시화
통계적 분석을 R (www.r-project.org/)로 실행하였다. 피어슨 r 계수를 디폴트 파라미터를 갖는 'cor' 기능을 사용하여 계산하였다. 도 6b 및 10d는 R 기능 'heatmap.2'로 생성되었다. 도 7d, 10c, 및 12a 내지 12d는 R 기능 'pheatmap'로 생성되었다. 도 1b 및 7b는 딥툴스에서 '컴퓨트매트릭스 (computeMatrix)' 및 '플롯히트맵 (plotHeatmap)' 기능을 사용하여 생성되었다. 시퀀싱 판독물에 의한 게놈의 위치-범위 커버리지를, macs2 v2.1.0을 사용하여 라이브러리에서의 총 고유한 맵핑된 판독물에 대해 정규화함으로써 결정하고, IGV 게놈 브라우저에서 커스텀 트랙으로서 가시화하였다.
공지된 각인 유전자 정보
공지된 각인 정보를 www.geneimprint.com/site/genes-by-species.Mus+musculus로부터 다운로드하였다.
코드 가용성
주문제작된 파이프라인을 사용하여 하이브리드 RNA-seq 데이터를 SNP 정보에 기초하여 그들의 모 기원으로 분할하였다. 코드는 github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplit에서 발견될 수 있다.
데이터 가용성 진술
이 연구에서 생성된 모든 liDN아제-seq 및 RNA-seq 데이터세트를 GEO 데이터베이스에 수탁 번호 GSE92605 하에 기탁하였다. 정자 liDN아제-seq 데이터세트는 이전의 공개 (GSE76642)로부터의 것이었다. 정자 및 GV 난모세포에 대한 WGBS 데이터세트를 www.nodai-genome.org/mouse.html?lang=en으로부터 다운로드하였다. 정자, MII 난모세포, 및 1-세포 배아의 SNP-추적된 모계 및 부계 대립유전자의 H3K27me3 ChIP-seq 데이터세트를 이전의 공개 (GSE76687)로부터 다운로드하였다.
마우스 착상전 배아의 수집
모든 동물 연구는 하바드 메디칼 스쿨에서의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었다. MII-단계 난모세포를 7.5 I.U.의 PMSG (밀리포어) 및 hCG (밀리포어)를 주사함으로써 과배란된 8주령 B6D2F1/J (BDF1) 암컷으로부터 수집하였다. 시험관내 수정 (IVF)을 위해, MII 난모세포를 10 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA; 시그마-알드리치)으로 보충된 HTF 배지에서 성체 BDF1 또는 PWK (잭슨 래버러토리, 003715) 수컷의 꼬리 부고환으로부터 얻어진 활성화된 정자로 수정시켰다. 정자 수정능은 HTF 배지에서 1시간 인큐베이션에 의해 획득되었다. 접합자를 KSOM에 옮기고, 37.8℃에서 5％ CO2/95％ 공기를 갖는 습윤 분위기에서 배양하였다.
mRNA 주사
수정후 4시간 (hpf)에서, 접합자를 M2 배지 내로 옮기고, mRNA를 피에조 충격-유도된 미세조작장치 (프라임 테크 리미티드, 일본 이바라키켕)를 사용하여 주사하였다. mRNA의 구축 및 제조는 상기 기재되었다. Kdm6b WT 및 Kdm6b MUT 의 주사된 mRNA의 농도는 1.8 μg/μl이고, Kdm4d WT 및 Kdm4d MUT 의 그것은 1.5 μg/μl이었다.
형광 계내 혼성화를 위한 프로브
Xist RNA를 위한 프로브를 Cy3-dCTP (지이 헬스케어 (GE healthcare), PA53021)를 갖는 닉 (Nick) 번역 시약 키트 (애보트 몰리큘라 (Abbott Molecular), 07J00-001)를 제조업자의 지시서에 따라 사용함으로써 제조하였다. 프로브 제조에 사용된 주형 DNA는 루돌프 재니쉬 (Rudolf Jaenisch)로부터의 기증품인 전장 마우스 Xist 유전자를 코딩하는 플라스미드였다 (pCMV-Xist-PA, 26760) (Wutz and Jaenisch, 2000). DNA FISH를 위한 프로브를 그린 (Green)-dUTP를 갖는 동일한 키트 (애보트 몰리큘라, 02N32-050)를 사용하여 제조하였다. 주형 DNA는 Rnf12 좌위를 함유하는 BAC 클론 (RP23-36C20)이었다. 형광 프로브를 5 μg Cot-1 DNA (라이프 테크놀로지스), 5 μg 청어 정자 DNA (써모 피셔 사이언티픽), 및 2.5 μg 효모 tRNA (써모 피셔 사이언티픽, AM7119)로 에탄올 침전시킨 후, 20 μl 포름아미드 (써모 피셔 사이언티픽, 17899)로 용해시켰다. 프로브를 4℃에서 저장하였다. 사용하기 전에, 프로브 (각각 0.75 μl)를 0.75 μl Cot-1 DNA와 혼합하고, 이를 에탄올 침전시키고, 포름아미드, 및 2.25 μl의 4xSSC/20％ 덱스트란 (Dextran) (밀리포어 S4030)에 용해시켰다. 프로브 혼합물을 80℃에서 30분 동안 가열한 후, 37℃ 인큐베이터에 옮겼다 ('사전-어닐링된 프로브').
전조직 표본 RNA/DNA 형광 계내 혼성화
상실배 배아를 78 hpf에서 0.5％ 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 2％ 파라포름알데히드 (PFA)에서 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 1 mg/ml BSA를 함유하는 PBS (PBS/BSA)로 3회 세척 후, 배아를 0.02％ 트리톤 X-100을 함유하는 0.1 N HCl로 4℃에서 15분 동안 처리하였다. 0.1％ BSA를 함유하는 2xSSC로 3회 세척 후, 배아를 유리 디쉬 (일렉트론 마이크로스코피 사이언스 (Electron Microscopy Science), 705430-30)에서 15 μl의 10％ 포름아미드/2xSSC에서 인큐베이션하였다. 모든 배아를 가라앉히고, 부드러운 피펫팅에 의해 유리 디쉬의 바닥에 부착시켰다. 5분 후, 15 μl의 30％ 포름아미드/2xSSC를 첨가하였다. 5분 후, 90 μl의 60％ 포름아미드/2xSSC를 첨가하여 최종 포름아미드 농도 50％를 만들고, 배아를 실온에서 추가의 30분 동안 인큐베이션하였다. 배아를 함유하는 포름아미드 용액을 광물유로 덮었다. 샘플을 80℃에서 30분 동안 가열한 후, 37℃ 인큐베이터에 적어도 30분 동안 옮겼다. 배아를 유리 피펫에서 집어내고, 또다른 유리 디쉬 상의 광물유로 덮힌 4.5 μl의 '사전-어닐링된 프로브' 내로 옮기고, 37℃에서 적어도 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배아를 0.1％BSA를 함유하는 사전-가온된 (42℃) 2xSSC로 세척하고, 마지막 액적에서 30분 동안 방치하였다. 1％BSA/PBS로 3회 세척 후, 이들을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 갖는 벡타쉴드 항-표백 용액 (벡터 래버러토리스, 미국 캘리포니아주 벌링게임) 중 유리 슬라이드 상에 마운팅하였다. 형광을 레이저-스캐닝 공초점 현미경 자이스 LSM800 하에서 검출하였다.
전조직 표본 면역염색
면역염색 및 정량화의 절차는 상기 기재되었다.
모계 대립유전자-편향된 H3K27me3의 컴퓨터 확인
내부 세포 덩이 (ICM)에서 H3K27me3 ChIP-seq를 위한 100 bp 빈으로의 RPKM 값을 포함하는 베드 파일을 GEO로부터 번호 GSE76687 하에 다운로드하였다. 2개의 모 대립유전자 및 대립유전자 판독물에 대한 RPKM 값을 함유하는 모계 또는 부계로 표지된 베드 파일을 총 판독물 수에 대해 정규화하였다. '베드툴스 메이크윈도우스'를 사용하여 mm9 게놈에 대한 1000 bp 빈을 생성한 후, 각각의 빈에 대한 RPKM 값을 '베드툴스 맵 (bedtools map)'에 의해 계산하였다. 모든 빈을 1의 신호 컷오프 및 4의 배수 변화 컷오프를 사용하여 신호 없음, 이중대립유전자, 모계 편향의 3개의 범주로 분류하였다. 슬라이딩 창 접근법을 사용하여 20 kb의 창 크기, 3의 최소 빈 수 및 50％ 초과의 모계 편향된 H3K27me3 빈의 백분율의 기준을 갖는 모계 편향된 H3K27me3 빈을 함유하는 창을 확인하였다. 중첩된 창을 "베드툴스 머지"로 병합하였다. 총 5986개의 창을 게놈에서 확인하였다.
RNA-시퀀싱
RNA-seq 라이브러리를 약간의 변형으로 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, 역전사 및 cDNA 증폭을 스마터 울트라 저 투입 RNA cDNA 제조 키트 (클론테크, 634890)로 전체 배아 용해물을 사용하여 수행하였다. 그 후, cDNA를 넥스테라 (Nextera) XT DNA 라이브러리 프렙 키트 (일루미나)로의 태그단편화를 사용하여 단편화하였다. 단편화된 cDNA를 넥스테라 PCR 마스터 믹스를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 증폭시켰다. 단일 말단 100 bp 시퀀싱을 하이섹2500 시퀀서 (일루미나) 상에서 수행하였다.
RNA-seq 데이터 분석
RNA-seq의 판독물을 STAR (github.com/alexdobin/STAR)로 참조 게놈에 대해 맵핑하였다. 모든 프로그램은 달리 명시되지 않는다면 디폴트 파라미터로 실행되었다. 고유하게 맵핑된 판독물을 이어서 하위판독물-v1.5.1로부터의 피처카운트로 참조 주석 (UCSC 유전자 모델)에 의해 가이드된 전사체 내로 어셈블리하였다. 라이브러리 크기를 정규화한 후, 각각의 유전자의 발현 수준을 정규화된 FPKM (백만개 맵핑된 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편)으로 정량화하였다. 이중실험 사이의 상관을 지시하는 유전자 발현 수준의 피어슨 상관 계수 (r)를 계산하였다.
통계적 분석을 R (www.r-project.org/)로 실행하였다. 피어슨 r 계수를 디폴트 파라미터를 갖는 'cor' 기능을 사용하여 계산하였다.
코드 가용성
주문제작된 파이프라인을 사용하여 하이브리드 RNA-seq 데이터를 SNP 정보에 기초하여 그들의 모 기원으로 분할하였다. 코드는 github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplit에서 발견될 수 있다.
데이터 가용성
이 연구에서 생성된 RNA-seq 데이터세트를 GEO 데이터베이스에 수탁 번호 GSEXXXXX 하에 기탁하였다. GV 난모세포에 대한 WGBS 데이터세트를 www.nodai-genome.org/mouse.html?lang=en으로부터 다운로드하였다. 동일한 100 bp 빈으로부터의 WGBS 판독물을 함께 풀링하여 평균 메틸화 수준을 계산하였으며, 10 판독물의 최소 커버리지가 요구되었다. 정자, MII 난모세포, 및 1-세포, 2-세포, 및 배반포 배아의 내부 세포 덩이의 SNP-추적된 모계 및 부계 대립유전자의 H3K27me3 ChIP-seq 데이터세트를 이전의 연구 (GSE76687)로부터 다운로드하였다. 난모세포 DN아제I-seq 데이터세트는 상기 (GSE92605)로부터의 것이었다.
마우스
B6D2F1/J (BDF1) 마우스를 SCNT를 위한 수용자 난모세포의 수집에 사용하였다. 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 세포 제조를 위해, 129S1/SvImj 배경 (Marahrens et al., 1997)에서 유지된 Xist KO 암컷 마우스를 CAST/EiJ 수컷과 교배시켜 129/CAST F1 배경에서 Xist 이형접합성 KO 배아를 생성하였다. 난구 및 세르톨리 세포 제조를 위해, C57BL/6N 배경 (Sado et al., 2005)에서의 Xist KO 암컷 마우스를 DBA/2N 수컷과 교배시켜 BDF1 배경에서 Xist 이형접합성 KO 배아를 생성하였다. 모든 동물 실험은 하바드 메디칼 스쿨 및 리켄 츠쿠바 인스티튜트 (RIKEN Tsukuba Institute)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
공여자 세포 제조
1차 MEF 세포는 13.5 dpc에서 Xist KO 수컷 마우스 배아로부터 유래되었다. 머리 및 모든 기관의 제거 후, 나머지 몸통으로부터의 갈려진 조직을 1 mM EDTA (써모 피셔 사이언티픽 # 25200056)를 갖는 500 μl의 0.25％ 트립신에서 37℃에서 10분 동안 분리하였다. 세포 현탁액을 10％ FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 (써모 피셔 사이언티픽 # 15140-022)을 함유하는 동등한 양의 DMEM (써모 피셔 사이언티픽 # 11995-073)으로 희석하고, 상하로 20회 피펫팅하였다. 세포 현탁액을 새로운 배지로 희석하고, 100 mm 디쉬 상으로 플레이팅하고, 37℃에서 배양하였다. 2일 후, MEF 세포를 수확하고, 동결시켰다. MEF 세포의 동결된 스톡을 해동시키고, 한 계대 후에 실험에 사용하였다.
난구 세포를 7.5 IU의 임신 말 혈청 고나도트로핀 (PMSG; 밀리포어 # 367222) 및 7.5 IU의 인간 융모막성 고나도트로핀 (hCG; 밀리포어 # 230734)을 주사함으로써 과배란을 통해 야생형 (WT) 및 Xist 이형접합성 KO 성체 암컷 (리켄 바이오리소스 센터 (RIKEN BioResource Center), RBRC01260)으로부터 수집하였다. hCG 주사 후 15 내지 17시간에, 난구-난모세포 복합체 (COC)를 난관으로부터 수집하고, 300 U/ml 소 고환 히알루로니다제 (칼바이오켐 (Calbiochem) # 385931)를 함유하는 헤페스 (Hepes)-완충 칼륨 단순-최적화 배지 (KSOM)로 간단히 처리하여 분리된 난구 세포를 얻었다.
세르톨리 세포를 기재된 바와 같이 (Matoba et al., 2011) 3 내지 5일령 WT 또는 Xist KO 수컷 마우스의 고환으로부터 수집하였다. 고환 덩이를 0.1 mg/ml 콜라게나제 (써모 피셔 사이언티픽 # 17104-019)를 함유하는 PBS에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 mM EDTA를 갖는 0.25％ 트립신으로 실온에서 5분 처리하였다. 3 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS로 4회 세척한 후, 분리된 세포를 헤페스-KSOM 배지에 현탁시켰다.
Kdm4d mRNA 합성
Kdm4d mRNA를 이전에 기재된 바와 같이 (Matoba et al., 2014) 시험관내 전사 (IVT)에 의해 합성하였다. 간략하게, 전장 마우스 Kdm4d, 이어서 폴리(A)83을 함유하는 pcDNA3.1 플라스미드 (애드진 (Addgene) # 61553)를 XbaI에 의해 선형화하였다. 정제 후, 선형화된 플라스미드 DNA를 mMESSAGE mMACHINE T7 울트라 키트 (써모 피셔 사이언티픽 # AM1345)를 사용하여 IVT를 위한 주형으로서 사용하였다. 합성된 mRNA를 뉴클레아제-무함유수에 용해시키고, 나노드롭 (NanoDrop) ND-1000 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지스 (NanoDrop Technologies))에 의해 정량화하였다. mRNA를 1500 ng/μl로 희석한 후, 분취물을 -80℃에서 저장하였다.
SCNT
마우스 체세포 핵 전달을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Matoba et al., 2014; Ogura et al., 2000). 간략하게, 수용자 MII 난모세포를 7.5 IU의 PMSG 및 7.5 IU의 hCG를 주사함으로써 과배란을 통해 성체 BDF1 암컷 마우스로부터 수집하였다. hCG 주사 후 15 내지 17시간에, 난구-난모세포 복합체 (COC)를 난관으로부터 수집하고, 300 U/ml 소 고환 히알루로니다제를 함유하는 헤페스-KSOM으로 간단히 처리하여 MII 난모세포를 얻었다. 단리된 MII 난모세포를 피에조-유도된 미세조작장치 (프라임테크 # PMM-150FU)를 사용함으로써 7.5 μg/ml의 시토칼라신 B (칼바이오켐 # 250233)를 함유하는 헤페스-완충 KSOM 배지에서 제핵시켰다. 난구 또는 세르톨리 세포의 핵을 제핵된 난모세포 내로 주사하였다. MEF 세포를 불활성화된 센다이 바이러스 외피 (게놈원 (GenomOne) CF); 이시하라 산교 (Ishihara Sangyo) #CF001)에 의해 제핵된 난모세포와 융합시켰다. KSOM에서 1시간 인큐베이션 후, 재구축물된 SCNT 난모세포를 3 mM 염화스트론튬 (SrCl2) 및 5 μg/ml 시토칼라신 B를 함유하는 Ca-무함유 KSOM에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 활성화시키고, 5 μg/ml 시토칼라신 B를 갖는 KSOM에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 활성화된 SCNT 배아를 SrCl2 처리의 개시 후 5시간 (활성화후 시간, hpa)에 세척하고, 37.8℃에서 5％ CO2를 갖는 습윤 분위기에서 KSOM에서 배양하였다. 일부 SCNT 배아를 피에조-유도된 미세조작장치를 사용함으로써 5 내지 6 hpa에서 약 10 pl의 1500 ng/μl 마우스 Kdm4d mRNA로 주사하였다.
배아 전달
2-세포 단계 SCNT 배아를 가임신된 (E0.5) ICR 암컷의 난관으로 전달하였다. 새끼를 분만일 (E19.5)에 제왕 절개에 의해 회수하고, 수유 ICR 암컷에 의해 길렀다. 일부 암컷을 E4.5 및 E10.5에서 배아 발생을 조사하기 위해 희생시켰다.
태반의 조직학적 분석
E19.5에서의 태반을 4％ 파라포름알데히드 (PFA)에서 4℃에서 밤새 고정시키고, 파라핀에 통상적으로 포매시켰다. 일련의 섹션 (두께로 4 μm)을 과요오드산 쉬프 (PAS) 염색으로 처리하였다.
배반포에서의 H3K27me3에 대한 면역염색
배반포를 4％ 파라포름알데히드 (PFA)로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 10 mg/ml BSA를 함유하는 PBS (PBS/BSA)로 세척한 후, 고정된 배아를 0.5％ 트리톤-X 100으로 15분 인큐베이션에 의해 투과화하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS/BSA에서 차단시킨 후, 이들을 토끼 항-H3K27me3 항체 (1/500, 밀리포어, 07-449), 염소 항-Oct4 항체 (1/500, 산타크루즈 (SantaCruz), sc-8628) 및 마우스 항-Cdx2 항체 (1/100, 바이오제넥스 (BioGenex), AM392-5M)를 포함하는 1차 항체의 혼합물에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS/BSA로 3회 세척 후, 배아를 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 항-마우스 IgG (1/400, 잭슨 이뮤노-리서치), 알렉사 플루오르 546 당나귀 항-토끼 IgG (1/400, 써모 피셔 사이언티픽) 및 알렉사 플루오르 647 당나귀 항-염소 IgG (1/400, 써모 피셔 사이언티픽)를 포함하는 2차 항체의 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 이들을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 갖는 벡타쉴드 (벡터 래버러토리스 # H-1200)로 마운팅하였다. 형광 신호를 레이저-스캐닝 공초점 현미경 (자이스 LSM510) 및 EM-CCD 카메라 (하마마츠 ImagEM)를 사용하여 관찰하였다.
WGBS
초기 배반포 단계 (수정 또는 활성화 후 96시간)의 IVF 및 SCNT 배아를 EZ DNA 메틸화-다이렉트 키트 (EZ DNA Methylation-Direct Kit) (자이모 리서치 (Zymo Research), D5020)를 사용하여 비술파이트 전환으로 직접적으로 처리하였다. 39개 및 36개의 배아를 각각 IVF 및 SCNT 샘플을 제조하는 데 사용하였다. 소량 (0.01 ng)의 비메틸화된 람다 (Lambda) DNA (프로메가 (Promega), D152A)를 비술파이트 전환 전에 각각의 샘플에 첨가하여 비술파이트 전환 효율을 평가하기 위한 스파이크-인 컨트롤로 기능하게 하였다. 시퀀싱 라이브러리를 에피게놈 메틸-Seq (EpiGnome Methyl-Seq) 키트 (에피센터 (Epicenter), EGMK81312)를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 제조하였다. 라이브러리를 단지 12 사이클 동안 증폭시킨 후, 아젠코트 AM퓨어 (Agencourt AMPure) XP 비드 (베크만 쿨터, A63880)를 사용하여 정제하였다. 최종 라이브러리를 PhiX 스파이크-인 컨트롤로 하이섹 2500 시퀀서 (일루미나) 상에서 단일-판독물 (100 bp) 시퀀싱으로 처리하였다.
RNA-seq
초기 배반포 단계 (수정 또는 활성화 후 96시간)의 6개의 IVF 또는 SCNT 배아를 직접적으로 용해시키고, 스마터 울트라 저 투입 RNA cDNA 제조 키트 (클론테크, 634936)를 사용한 cDNA 합성에 사용하였다. 증폭 후, cDNA 샘플을 코바리스 M220 초음파발생기 (코바리스)를 사용하여 단편화하였다. 시퀀싱 라이브러리를 일루미나를 위한 NEB넥스트 울트라 DNA 라이브러리 프렙 키트를 제조업자의 지시서 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, E7370)에 따라 사용하여 단편화된 cDNA로 제조하였다. 단일-판독물 50 bp 시퀀싱을 하이섹 2500 시퀀서 (일루미나) 상에서 수행하였다.
정량화 및 통계적 분석
WGBS 및 RRBS 데이터 분석
WGBS 및 감소된 제시 비술파이트 시퀀싱 (RRBS) 판독물을 먼저 trim_galore를 사용하여 트리밍하여 저-품질 서열 및 어댑터 서열을 제거하였다. 비스마크 (버전 0.15.0)를 사용하여 판독물을 비술파이트 전환된 참조 게놈 (mm9)으로 정렬하였다. 각각의 시토신의 커버리지 깊이 및 메틸화 수준을 비스마크_메틸화_추출기 (bismark_methylation_extractor)로 정렬된 판독물로부터 추출하였다. CpG 부위에 대한 메틸화 수준을 계산하는 경우, 둘 다의 가닥으로부터의 정보가 조합되고, 적어도 5개의 판독물의 커버리지가 요구되었다. DMR을 메트파이프 (버전 3.4.3)를 사용하여 확인하고, 적어도 10개의 CpG 부위 및 적어도 10％ 메틸화 차이를 요구하여 추가로 필터링하였다. DMR 연관된 유전자 (즉, TSS±3kb 영역에 위치한 DMR을 갖는 유전자)의 기능적 주석을 R에서 클러스터프로파일러 (버전 2.4.3)로 수행하였다. 공지된 ICR의 대립유전자 특이적 메틸화 분석을 위해, 1개의 ICR 내의 모든 검출된 CpG를 함께 풀링하였으며, 둘 다의 대립유전자에서 적어도 5개의 검출된 CpG의 커버리지는 추가의 메틸화 비교에 요구되었다.
RNA-seq 데이터 분석
RNA-seq 데이터를 파라미터 "--no-coverage-search --no-novel-juncs --library-type=fr-unstranded"를 갖는 톱핫 (버전 2.0.14)으로 마우스 게놈 (mm9)에 대해 맵핑하였다. 고유하게 맵핑된 판독물을 이어서 커프링크스 (Cufflinks) (버전 2.2.1)로 참조 주석 (UCSC 유전자 모델)에 의해 가이드된 전사체 내로 어셈블리하였다. 각각의 유전자의 발현 수준을 정규화된 FPKM (백만개 맵핑된 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편)으로 정량화하였다. 이중실험 사이의 상관을 지시하는 유전자 발현 수준의 피어슨 상관 계수를 계산하였다.
대립유전자 특이적 분석
하이브리드 WGBS 및 RNA-seq 데이터 (129S1/Svj x CAST/EiJ)를 마우스 게놈 (mm9)에 대해 맵핑한 후, 커스텀 Perl 스크립트를 사용하여 맵핑된 판독물을 마우스 게놈 프로젝트 (Mouse Genomes Project) (ftp://ftp-mouse.sanger.ac.uk/REL-1211-SNPs_Indels/)로부터 다운로드된 SNP 정보에 기초하여 그들의 모 기원으로 분할하였다. 그 후, 대립유전자 판독물을 개별적으로 프로세싱하였다.
ChIP-seq 및 DIP-seq 데이터 분석
다운로드된 ChIP-seq 및 DIP-seq 판독물을 파라미터 "-D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50"을 갖는 보타이 (버전 2.1.0)를 사용하여 마우스 게놈 (mm9)에 대해 맵핑하여 단지 많아야 3개의 미스매치를 갖는 고유하게 맵핑된 판독물을 얻었다. 게놈 브라우저에서 신호를 가시화하기 위해, 본 발명자들은 고유하게 맵핑된 판독물을 (동일한 게놈 위치에서 많아야 2개의 판독물을 유지하면서) 3' 말단을 향해 200 bp로 연장하고, 판독물 카운트를 50 bp 간격으로 비닝함으로써 MACS2 (버전 2.1.1)로 각각의 데이터 세트에 대한 위그 트랙 파일을 생성하였다. 태그 카운트를 각각의 빈에서 고유하게 맵핑된 판독물의 총 수에 대해 정규화하였다 (백만개 판독물 당 판독물, RPM). 딥툴스로부터의 '컴퓨트매트릭스 (computeMatrix)' 프로그램을 사용하여 DMR 또는 ICR 및 그들의 플랭킹 영역에 비한 ChIP-seq 및 DIP-seq 신호를 산출하였다.
통계적 분석 및 데이터 가시화
통계적 분석 및 플롯을 R (버전 3.4.1, http://www.r-project.org)로 실행하였다. 피어슨 상관 계수를 디폴트 파라미터를 갖는 'cor' 기능을 사용하여 계산하였다. 스튜던트 (Student) t-검정 (양측, 동등 분산)을 디폴트 파라미터를 갖는 't.검정' 기능을 사용하여 수행하였다. ChIP-seq 신호 및 DNA 메틸화 수준을 통합 게노믹스 뷰어 (Integrative Genomics Viewer) 게놈 브라우저에서 커스텀 트랙으로서 가시화하였다.
데이터 및 소프트웨어 가용성
이 연구에서 생성된 WGBS 및 RNA-seq 데이터세트는 유전자 발현 옴니버스 (Gene Expression Omnibus) (GEO)에 수탁 번호 GSE109214 하에 기탁되었다.
이 연구에 사용된 공개된 데이터세트
착상전 배아 (2-세포, 4-세포, 및 ICM)의 모계 및 부계 DNA 메틸화는 GSE56697 (Wang et al., 2014)로부터 얻었다. 상이한 세포 및 체세포 조직의 RRBS 데이터는 GSE11034 및 GSE43719 (Soumillon et al., 2013)로부터 얻었다. H3K27me3 ChIP-seq 데이터는 GSE49847 (Yue et al., 2014) 및 GSE76687 (Zheng et al., 2016)로부터 얻었다. PGC 발생 동안 5mC 및 5hmC의 DIP-seq 데이터는 SRP016940 (Hackett et al., 2013)으로부터 다운로드하였다.
다른 실시양태
상기 설명으로부터, 변화 및 변형이 이를 다양한 용법 및 조건에 채택하기 위해 본원에 기재된 본 발명에 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소의 목록의 나열은 열거된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합 (또는 하위조합)으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합으로 그 실시양태를 포함한다.
이 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SOMATIC CELL REPROGRAMMING AND MODULATING IMPRINTING <130> 167705.015801/PCT <140> PCT/US2019/026074 <141> 2019-04-05 <150> 62/654,199 <151> 2018-04-06 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 523 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Thr Met Lys Ser Lys Ala Asn Cys Ala Gln Asn Pro Asn Cys 1 5 10 15 Asn Ile Met Ile Phe His Pro Thr Lys Glu Glu Phe Asn Asp Phe Asp 20 25 30 Lys Tyr Ile Ala Tyr Met Glu Ser Gln Gly Ala His Arg Ala Gly Leu 35 40 45 Ala Lys Ile Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Ala Arg Glu Thr Tyr Asp 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Ile Leu Ile Ala Thr Pro Leu Gln Gln Val Ala Ser 65 70 75 80 Gly Arg Ala Gly Val Phe Thr Gln Tyr His Lys Lys Lys Lys Ala Met 85 90 95 Thr Val Gly Glu Tyr Arg His Leu Ala Asn Ser Lys Lys Tyr Gln Thr 100 105 110 Pro Pro His Gln Asn Phe Glu Asp Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn 115 120 125 Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Gly Ser Leu 130 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Glu Asp Thr Lys Gln Glu Glu Glu Glu Arg Leu Val 805 810 815 Leu Glu Ser Asn Pro Leu Glu Trp Thr Val Thr Asp Val Val Arg Phe 820 825 830 Ile Lys Leu Thr Asp Cys Ala Pro Leu Ala Lys Ile Phe Gln Glu Gln 835 840 845 Asp Ile Asp Gly Gln Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Pro Thr Val Gln 850 855 860 Glu Cys Met Glu Leu Lys Leu Gly Pro Ala Ile Lys Leu Cys His Gln 865 870 875 880 Ile Glu Arg Val Lys Val Ala Phe Tyr Ala Gln Tyr Ala Asn 885 890 <210> 15 <211> 7922 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cgccttgtgt gtgctggatc ctgcgcgggt agatccccga gtaatttttt ctgcaggatg 60 aattaagaga agagacactt gctcatcagg catggagagc actttgtcag cttccaatat 120 gcaagaccct tcatcttcac ccttggaaaa gtgtctcggc tcagctaatg gaaatggaga 180 ccttgattct gaagaaggct caagcttgga ggaaactggc tttaactggg gagaatattt 240 ggaagagaca ggagcaagtg ctgctcccca cacatcattc aaacacgttg aaatcagcat 300 tcagagcaac ttccagccag gaatgaaatt ggaagtggct aataagaaca acccggacac 360 gtactgggtg gccacgatca ttaccacgtg cgggcagctg ctgcttctgc gctactgcgg 420 ttacggggag gaccgcaggg ccgacttctg gtgtgacgta gtcatcgcgg atttgcaccc 480 cgtggggtgg tgcacacaga acaacaaggt gttgatgccg ccggacgcaa tcaaagagaa 540 gtacacagac tggacagaat ttctcatacg tgacttgact ggttcgagga cagcacccgc 600 caacctcctg gaaggtcctc tgcgagggaa aggccctata gacctcatta cagttggttc 660 cttaatagaa cttcaggatt cccagaaccc ttttcagtac tggatagtta gtgtgattga 720 aaatgttgga ggaagattac gccttcgcta tgtgggattg gaggacactg aatcctatga 780 ccagtggttg ttttacttgg attacagact tcgaccagtt ggttggtgtc aagagaataa 840 atacagaatg gacccacctt cagaaatcta tcctttgaag atggcctctg aatggaaatg 900 tactctggaa aaatccctta ttgatgctgc caaatttcct cttccaatgg aagtgtttaa 960 ggatcacgca gatttgcgaa gccatttctt cacagttggg atgaagcttg agacagtgaa 1020 tatgtgcgag cccttttaca tctctcctgc gtcggtgact aaggttttta acaatcactt 1080 ttttcaagtg actattgatg acctaagacc tgaaccaagt aaactgtcaa tgctgtgcca 1140 tgcagattct ttggggattt tgccagtaca gtggtgcctt aaaaatggag tcagcctcac 1200 tcctcccaaa ggttactctg gccaggactt cgactgggca gattatcaca agcagcatgg 1260 ggcgcaggaa gcccctccct tctgcttccg aaatacatca ttcagtcgag gtttcacaaa 1320 gaacatgaaa cttgaagctg tgaaccccag gaatccagga gaactgtgtg tggcctccgt 1380 tgtgagtgtg aaggggcggc taatgtggct tcacctggaa gggctgcaga ctcctgttcc 1440 agaggtcatt gttgatgtgg aatccatgga catcttccca gtgggctggt gtgaagccaa 1500 ttcttatcct ttgactgcac cacacaaaac agtctcacaa aagaagagaa agattgcagt 1560 cgtgcaacca gagaaacaat tgccgcccac agtgcctgtt aagaaaatac ctcatgacct 1620 ttgtttattc cctcacctgg acaccacagg aaccgtcaac gggaaatact gctgtcctca 1680 gctcttcatc aaccacaggt gtttctcagg cccttacctg aacaaaggaa ggattgcaga 1740 gctacctcag tcggtgggac cgggcaaatg cgtgctggtt cttaaagagg ttcttagcat 1800 gataatcaac gcagcctaca agcctggaag ggtattaaga gaattacagc tggtagaaga 1860 tccccactgg aatttccagg aagagacgct gaaggccaaa tacagaggca aaacatacag 1920 ggctgtggtc aaaatcgtac ggacatctga ccaagtcgca aatttctgcc gccgagtctg 1980 tgccaagcta gagtgctgtc caaatttgtt tagtcctgtg ctgatatctg aaaactgccc 2040 agagaactgc tccattcata ccaaaaccaa atacacctat tactatggaa agagaaagaa 2100 gatctccaag ccccccatcg gggaaagcaa ccccgacagc ggacacccca aacccgccag 2160 gcggaggaag cgacggaaat ccattttcgt gcagaagaaa cggaggtctt ctgccgtgga 2220 cttcaccgcg ggctcggggg aggaaagtga agaggaggac gctgacgcca tggacgatga 2280 caccgccagt gaggagaccg gctccgagct ccgggatgac cagacggaca cctcgtcggc 2340 ggaggtgccc tcggcccggc cccggagggc cgtcaccctg cggagcggct cagagcccgt 2400 gcgccggcca cccccagaga ggacacgaag gggccgcggg gcgccggctg cctcctcagc 2460 agaggaaggg gagaagtgcc cgccgaccaa gcccgagggg acagaggaca cgaaacagga 2520 ggaggaggag agactggttc tggagagcaa cccgttggag tggacggtca ccgacgtggt 2580 gaggttcatt aagctgacag actgtgcccc cttggccaag atatttcagg agcaggatat 2640 tgacggccaa gcactcctgc ttctgaccct tccgacggtg caggagtgca tggagctgaa 2700 gctggggcct gccatcaagt tatgccacca gatcgagaga gtcaaagtgg ctttctacgc 2760 ccagtacgcc aactgagtct gccctcggga ggtggcccat tattgctggg atgcggtgtt 2820 ggtaaaggtt tccaggactg aaactttgat tttccgggat atgttaaatg gtacagccac 2880 taagtatcac cagaaaacca gaagcccagg atcttctgcc tccgccagcc tgtgagctgt 2940 ttccatgttt tcaaagcaca gcagcagtcg cttctgggga gtgccagtta aagtcatgca 3000 tcagaccctg ccagacgtgg gcctgcttct tggctcaccc acgttttgcc tttctcctgc 3060 cccaaatcag gcagctccct tggagcaggg tttcctcaga tgaggactgc attctttgaa 3120 aacaaagaat gtcgccaagg aagaaacctc acgccatgct gtagtgtttc ctgtaatcac 3180 acgagcacat ttatatatgc agtttcccat ggataggcgt gtgaccctgg ttgagtggca 3240 cttgcggttt catcttggtg gcaactcctt tgcaatgcag ctggcagcga catccttata 3300 aaaacatgtg ctaaagctct gtcctctgtt agaggtgcct tttaggaata cggggagtga 3360 aggaaggccg gcaggcatct ccatgcaact agatggtttg tttgtttgtt tgtttgtttg 3420 ttgttcattt tgttgtgttt tttgagacag ggtcttgctc tgtcgcccag gttgtaatgc 3480 agtggcgcaa tctcagctca ctgcaacctc tctctcccgg gttcaagtga ttctcctgcc 3540 tcagcctccc aagtagctgg gattacaggc acccaccacc atgcctggct aatttttgta 3600 tttttggtag agacagggtt tcaccatgtt ggtcaggcta gtcttgaact cccaacctca 3660 agtgatctgc ccgcctcggc ctcccaacgt gctgggatta caggtgtgag ccactacgcc 3720 ccggcccaac tggatggttt ttgattgaag cctagaacat ctgtagagac aaactctacc 3780 cagtcttttc tagaccctca actatctcca gtgttgttgt ttaatcgtag ccggatcagg 3840 gagtgagtct tttaggcaaa tgttggatta tatatcaaag gaaaagctta gtttcagaga 3900 ggaggaaggg aaagagatgt gagggaagca tttcatcaac cagctacgtc ccccttagaa 3960 ggatcactgc agcaggtcac cgagcaggag tccctctgag cgtcccttct gtctcgttct 4020 gccctagctg gcagcatatg aaccaggcat gatgcagcag gagcagtgaa tctggagtca 4080 gccacttggc accctggttt cgctgagaac aaactctgag atcttgggtg acttctcatc 4140 actctggacc tccattcctg tgaagtgaca ggtgtggacc ctgagggtgc ggtggtgagc 4200 acactgtctc ctgctggcat tcaccccact catgctggaa aggaagatcc agatcgtaca 4260 aaaattagaa aaagaaagaa taagaagggt ctggtcccag ttctgactcg gccattctta 4320 cagctctttc tggctttgag tttgcttgtg gaatttcctg ggcagttgtg ttaaatccgc 4380 caggtcacgt gcagacaaag ctgtggctgc gagagttggc tggcctcttg gaccagaagc 4440 catctccata tcctcatgag cgattccata tctccactca gaccctgtgg actacagtgt 4500 tccgctgtgg tggctgccaa gatgccttct taaacttatg caaggaaacc aaaccctccc 4560 acagttccca agcagacact ggaagcagag gcttctcacc cttcctgctt tttcaccaca 4620 atcaccttga gctcgtccct tggactagag tctccacagt tccagtaaaa ttctgcggtg 4680 ggctgatgag ctgcttgcat ttctgtgaca tttccagata tgattctcag tgggattttg 4740 gaaactttga ttgctcaagc tcacccttct taacattctg taatggttac agatgagaat 4800 ggaaaacaca tattttatgg atgaggcgtt ttggtctccc ctgcagtcga tttctagaat 4860 caagttttag agttcggctg atgcatctgc ctggggacct cagatgggag gagtgtgtca 4920 gttgtacccc gacagaaatg tctctgggat ctgtggctgg cttgccccgg gcatctctcc 4980 tttaagctca agttttgaac tctctgcggt tttccacccc tgccttctca gccacatgct 5040 tttggcctta aacgctcagt cttgtggagt tcaactctgt caaacgattg gaaagggcat 5100 ccatttccag atctttggca ttttccccgc gctgactctt tgatgatcct tcactgtggc 5160 cttttcaagc tcagctgttc ctgttgtatt tgagacgagg gtgagggaat gtggtggcca 5220 caaaagaaca gggacttgca gcacaaatgt cacttctgtc tcccttttca gtggtagcac 5280 ggaggaggag gtgctgcgtt ggagggaggg gatcctccag gagctctctg gagcccatct 5340 aggaagctag agtgtgtggc ccgccaggag ctcaggaagg atacagccac tgtcgcaggg 5400 gaaagtgttt gcttcccgtg gagccaagcg cccaagactc tccgtatcct tcaccctgac 5460 agtttaactt cagcgtttct ctgtgcagtt gcggtcacca tgggtgagca ctgtctgtgc 5520 acgtgccagg gaggagatgg ctgggaccac tgcacaggag ggcgcagcct ggcgtcgcca 5580 tgaaagttgt ctctgtgcca tctctccggt ccttgaggag agcccagaaa gattttagga 5640 cccaggaggt gcttttcctc cagctgttgc cagtgtcctt ctgagcctgg attctccggg 5700 gatttccgtc gtggtggatg gacttcacat cagcagcagt tctggtacag aattgtaatg 5760 tgttttcatt tctctgtagg attcacctct caccagcgtc tgtcttaaag gtagggccaa 5820 tttcatggag catttttctg tgtgtgtcct tgttgctttt gccagaaaaa gtggatttga 5880 catgcgtgcc ccgatgccac catagcccct aggccaacaa tgtcatggtc taaacaccaa 5940 aaagtgatgc cccgcattcc ttccctggat ggtaccgttt cttctccgtc tctctttgat 6000 gattctttgg gaccaaagtc ctctccttag tgcgcctact tcctgtgggc atcatgccac 6060 ttggaactta ttggaactgg cccgggagac tctgcagtct gcgccgtttg aaaaccctga 6120 gaaagagatg ccacctcaac ttgaatcatg acagcccatc gctcagtctc accctaaact 6180 catggagctt gtttcagctc ctcacttctt gactgtattt gtactatgtt gaaaaaatat 6240 cctgtccaca aagacataag cctaacaacc tagaaaaaca acagggtact actggcatta 6300 cagaacttct ttgcctttca aaacaaaagc aaaacacagt gaacttcacc acggagctgc 6360 acagcgtggg gaactcatcc atcactttca aaattagagt catttgatcc aagttggagt 6420 cagacacagt atttgagctg cacggcttct gggttctccc accttatttg atcatattcg 6480 aaagattatt tcctgtgttt gctttgattt gttcctcagt acattaaaat gatccacacc 6540 ttgaacactg ccctctctag aaggttgatt ttgatcagcc ttttgaagat gggtgtcgtt 6600 tccctaactt atctcacaga attttgagtg ttgtatttgg caagttctga gatttgcctt 6660 ctgtcttatg ccaaacaccc ctttctaaga gctgtccccg cttagtttta gaagtactag 6720 gggttttcat acttatttta tagaacaccc atttatattt atttctgtat atagaactaa 6780 aaaaaacagt agtgttaaaa atctttgttg tggtttgagc atctttgctg cttttggatt 6840 gagatggcga atcaaggctt cacttcctct ctcttctgtc tttagaaagc tgtgatcgtg 6900 cgtgcaatta tttgaaaggc aacatagtca attaagaaac ctgtagttgt taaggaagaa 6960 attgttggca agatatccat actgcccata tctcgttggt gcaataatta aatagcaaag 7020 gaaatctgta ttggcaacta ttataattca ataattcttt tgtttactgc ccttttctgt 7080 tcaagaattt tctggaaatt actccctttc acatggttga actcttaagt tgaccagttc 7140 tcatagctct atcactagaa tggtttgcag ataccccaaa catactatga taaaatcaaa 7200 ttgtgctact tttgacccat gtaatttacc taaaagttgt aattgctgac agagtactgc 7260 cttgaatttt ggtttaaaac ctctctagtt tcaatgacaa gtaacaactc aaataattcc 7320 atattgtttg aggaagaggc cataatcctt ctgaattgtt ggcactaagt aatgggattt 7380 ggcccagtaa gtatgacggt cgtgtcgcct aaccaacgca gagcagtgct ttttgtgtgg 7440 ctgaagcgat gtgctgacga aaaaaggaaa attctaggac aatcgttggc taaaaatcac 7500 cttaggatga aaaatttgag gcaaattttt ttaaatgaca gaaaaagata atcatctcac 7560 ttgcttgaaa caggagccag catgatctct ggaagcatca actatccctc gtcgtgattg 7620 ttgaaagctc tttcactgtt ttgcattcta gtttgaatag tttgtattga aattggattc 7680 ctatcttgtg tatgtttttg gtgcgtaaaa gggaaaaatt ggtgtcatta cttttgaaat 7740 ttgcaggacg aagggcatgc ttttggtttg ctgtaagatt gtattctgta tatatgtttt 7800 catgtaaata aatgaaaatc tatatcagag ttatatttta atttttattc taaatgaaaa 7860 aaaccctttt tacttcaaaa aaattgtaag ccacattgtt aataaagtaa aaataaattc 7920 ta 7922 <210> 16 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Leu Pro Ala Arg Cys Ala Arg Leu Leu Thr Pro His Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Val Gln Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Arg Thr Thr Gly Pro 20 25 30 Arg Phe Leu Ile Ser Asp Arg Asp Pro Gln Cys Asn Leu His Cys Ser 35 40 45 Arg Thr Gln Pro Lys Pro Ile Cys Ala Ser Asp Gly Arg Ser Tyr Glu 50 55 60 Ser Met Cys Glu Tyr Gln Arg Ala Lys Cys Arg Asp Pro Thr Leu Gly 65 70 75 80 Val Val His Arg Gly Arg Cys Lys Asp Ala Gly Gln Ser Lys Cys Arg 85 90 95 Leu Glu Arg Ala Gln Ala Leu Glu Gln Ala Lys Lys Pro Gln Glu Ala 100 105 110 Val Phe Val Pro Glu Cys Gly Glu Asp Gly Ser Phe Thr Gln Val Gln 115 120 125 Cys His Thr Tyr Thr Gly Tyr Cys Trp Cys Val Thr Pro Asp Gly Lys 130 135 140 Pro Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Asn Lys Thr Pro Val Cys Ser Gly 145 150 155 160 Ser Val Thr Asp Lys Pro Leu Ser Gln Gly Asn Ser Gly Arg Lys Asp 165 170 175 Asp Gly Ser Lys Pro Thr Pro Thr Met Glu Thr Gln Pro Val Phe Asp 180 185 190 Gly Asp Glu Ile Thr Ala Pro Thr Leu Trp Ile Lys His Leu Val Ile 195 200 205 Lys Asp Ser Lys Leu Asn Asn Thr Asn Ile Arg Asn Ser Glu Lys Val 210 215 220 Tyr Ser Cys Asp Gln Glu Arg Gln Ser Ala Leu Glu Glu Ala Gln Gln 225 230 235 240 Asn Pro Arg Glu Gly Ile Val Ile Pro Glu Cys Ala Pro Gly Gly Leu 245 250 255 Tyr Lys Pro Val Gln Cys His Gln Ser Thr Gly Tyr Cys Trp Cys Val 260 265 270 Leu Val Asp Thr Gly Arg Pro Leu Pro Gly Thr Ser Thr Arg Tyr Val 275 280 285 Met Pro Ser Cys Glu Ser Asp Ala Arg Ala Lys Thr Thr Glu Ala Asp 290 295 300 Asp Pro Phe Lys Asp Arg Glu Leu Pro Gly Cys Pro Glu Gly Lys Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Thr Ser Leu Leu Asp Ala Leu Thr Thr Asp Met Val 325 330 335 Gln Ala Ile Asn Ser Ala Ala Pro Thr Gly Gly Gly Arg Phe Ser Glu 340 345 350 Pro Asp Pro Ser His Thr Leu Glu Glu Arg Val Val His Trp Tyr Phe 355 360 365 Ser Gln Leu Asp Ser Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asn Lys Arg Glu Met 370 375 380 Lys Pro Phe Lys Arg Tyr Val Lys Lys Lys Ala Lys Pro Lys Lys Cys 385 390 395 400 Ala Arg Arg Phe Thr Asp Tyr Cys Asp Leu Asn Lys Asp Lys Val Ile 405 410 415 Ser Leu Pro Glu Leu Lys Gly Cys Leu Gly Val Ser Lys Glu Val Gly 420 425 430 Arg Leu Val 435 <210> 17 <211> 3740 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ataacgggaa ttcccatggc ccgggctcag gcgtccaacc tgctgccgcc tgggccccgc 60 cgagcggagc tagcgccgcg cgcagagcac acgctcgcgc tccagctccc ctcctgcgcg 120 gttcatgact gtgtcccctg accgcagcct ctgcgagccc ccgccgcagg accacggccc 180 gctccccgcc gccgcgaggg ccccgagcga aggaaggaag ggaggcgcgc tgtgcgcccc 240 gcggagcccg cgaaccccgc tcgctgccgg ctgcccagcc tggctggcac catgctgccc 300 gcgcgctgcg cccgcctgct cacgccccac ttgctgctgg tgttggtgca gctgtcccct 360 gctcgcggcc accgcaccac aggccccagg tttctaataa gtgaccgtga cccacagtgc 420 aacctccact gctccaggac tcaacccaaa cccatctgtg cctctgatgg caggtcctac 480 gagtccatgt gtgagtacca gcgagccaag tgccgagacc cgaccctggg cgtggtgcat 540 cgaggtagat gcaaagatgc tggccagagc aagtgtcgcc tggagcgggc tcaagccctg 600 gagcaagcca agaagcctca ggaagctgtg tttgtcccag agtgtggcga ggatggctcc 660 tttacccagg tgcagtgcca tacttacact gggtactgct ggtgtgtcac cccggatggg 720 aagcccatca gtggctcttc tgtgcagaat aaaactcctg tatgttcagg ttcagtcacc 780 gacaagccct tgagccaggg taactcagga aggaaagtct cctttcgatt ctttttaacc 840 ctcaattcag atgacgggtc taagccgaca cccacgatgg agacccagcc ggtgttcgat 900 ggagatgaaa tcacagcccc aactctatgg attaaacact tggtgatcaa ggactccaaa 960 ctgaacaaca ccaacataag aaattcagag aaagtctatt cgtgtgacca ggagaggcag 1020 agtgccctgg aagaggccca gcagaatccc cgtgagggta ttgtcatccc tgaatgtgcc 1080 cctgggggac tctataagcc agtgcaatgc caccagtcca ctggctactg ctggtgtgtg 1140 ctggtggaca cagggcgccc gctgcctggg acctccacac gctacgtgat gcccagttgt 1200 gagagcgacg ccagggccaa gactacagag gcggatgacc ccttcaagga cagggagcta 1260 ccaggctgtc cagaagggaa gaaaatggag tttatcacca gcctactgga tgctctcacc 1320 actgacatgg ttcaggccat taactcagca gcgcccactg gaggtgggag gttctcagag 1380 ccagacccca gccacaccct ggaggagcgg gtagtgcact ggtatttcag ccagctggac 1440 agcaatagca gcaacgacat taacaagcgg gagatgaagc ccttcaagcg ctacgtgaag 1500 aagaaagcca agcccaagaa atgtgcccgg cgtttcaccg actactgtga cctgaacaaa 1560 gacaaggtca tttcactgcc tgagctgaag ggctgcctgg gtgttagcaa agaagtagga 1620 cgcctcgtct aaggagcaga aaacccaagg gcaggtggag agtccaggga ggcaggatgg 1680 atcaccagac acctaacctt cagcgttgcc catggccctg ccacatcccg tgtaacataa 1740 gtggtgccca ccatgtttgc acttttaata actcttactt gcgtgttttg tttttggttt 1800 cattttaaaa caccaatatc taataccaca gtgggaaaag gaaagggaag aaagacttta 1860 ttctctctct tattgtaagt ttttggatct gctactgaca acttttagag ggttttgggg 1920 gggtggggga gggtgttgtt ggggctgaga agaaagagat ttatatgctg tatataaata 1980 tatatgtaaa ttgtatagtt cttttgtaca ggcattggca ttgctgtttg tttatttctc 2040 tccctctgcc tgctgtgggt ggtgggcact ctggacacat agtccagctt tctaaaatcc 2100 aggactctat cctgggccta ctaaacttct gtttggagac tgacccttgt gtataaagac 2160 gggagtcctg caattgtact gcggactcca cgagttcttt tctggtggga ggactatatt 2220 gccccatgcc attagttgtc aaaattgata agtcacttgg ctctcggcct tgtccaggga 2280 ggttgggcta aggagagatg gaaactgccc tgggagagga agggagtcca gatcccatga 2340 atagcccaca caggtaccgg ctctcagagg gtccgtgcat tcctgctctc cggaccccca 2400 aagggcccag cattggtggg tgcaccagta tcttagtgac cctcggagca aattatccac 2460 aaaggatttg cattacgtca ctcgaaacgt tttcatccat gcttagcatc tactctgtat 2520 aacgcatgag aggggaggca aagaagaaaa agacacacag aagggccttt aaaaaagtag 2580 atatttaata tctaagcagg ggaggggaca ggacagaaag cctgcactga ggggtgcggt 2640 gccaacaggg aaactcttca cctccctgca aacctaccag tgaggctccc agagacgcag 2700 ctgtctcagt gccaggggca gattgggtgt gacctctcca ctcctccatc tcctgctgtt 2760 gtcctagtgg ctatcacagg cctgggtggg tgggttgggg gaggtgtcag tcaccttgtt 2820 ggtaacacta aagttgtttt gttggttttt taaaaaccca atactgaggt tcttcctgtt 2880 ccctcaagtt ttcttatggg cttccaggct ttaagctaat tccagaagta aaactgatct 2940 tgggtttcct attctgcctc ccctagaagg gcaggggtga taacccagct acagggaaat 3000 cccggcccag ctttccacag gcatcacagg catcttccgc ggattctagg gtgggctgcc 3060 cagccttctg gtctgaggcg cagctccctc tgcccaggtg ctgtgcctat tcaagtggcc 3120 ttcaggcaga gcagcaagtg gcccttagcg ccccttccca taagcagctg tggtggcagt 3180 gagggaggtt gggtagccct ggactggtcc cctcctcaga tcacccttgc aaatctggcc 3240 tcatcttgta ttccaacccg acatccctaa aagtacctcc acccgttccg ggtctggaag 3300 gcgttggcac cacaagcact gtccctgtgg gaggagcaca accttctcgg gacaggatct 3360 gatggggtct tgggctaaag gaggtccctg ctgtcctgga gaaagtccta gaggttatct 3420 caggaatgac tggtggccct gccccaacgt ggaaaggtgg gaaggaagcc ttctcccatt 3480 agccccaatg agagaactca acgtgccgga gctgagtggg ccttgcacga gacactggcc 3540 ccactttcag gcctggagga agcatgcaca catggagacg gcgcctgcct gtagatgttt 3600 ggatcttcga gatctcccca ggcatcttgt ctcccacagg atcgtgtgtg taggtggtgt 3660 tgtgtggttt tcctttgtga aggagagagg gaaactattt gtagcttgtt ttataaaaaa 3720 taaaaaatgg gtaaatcttg 3740 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 ccaggcgctc aagagaataa caatttctgc tcagtcaaca tcaac 45 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 ctcttgagcg cctggcgttc ggctgccagg gaccttcatg 40

Claims (15)

  1. Xist 활성이 결여된 체세포로부터 얻어진 공여자 핵을 제핵된 난모세포 내로 전달하고, 난모세포에서 Kdm4d를 발현시킴으로써 클로닝된 배반포를 얻는 것을 포함하는, 클로닝된 배반포를 얻는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 난모세포가 Kdm4d mRNA로 주사되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공여자 세포 핵이 Xist에서의 결실을 포함하거나 Xist의 불활성 형태를 포함하는 배아 섬유모세포로부터 얻어지는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 공여자 핵이 인간, 고양이, 소, 개, 돼지, 또는 말로부터 얻어지는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 배반포를 임신을 위해 숙주 자궁 내로 전달하는 것을 더 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 방법이 출생률을 통상적인 체세포 핵 전달에 비해 적어도 약 10 내지 20％ 증가시키는 것인 방법.
  7. (a) 대상체로부터 얻어진 배양된 세포에서 Xist를 불활성화시키거나 Xist 활성 또는 발현을 감소시키는 단계;
    (b) 배양된 세포로부터의 핵을 제핵된 난모세포 내로 전달함으로써 난모세포를 활성화시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 얻어진 활성화된 난모세포를 Kdm4d mRNA로 주사하고, 생성된 세포를 배양함으로써 대상체 내로의 이식에 적합한 세포 또는 조직을 얻는 단계
    를 포함하는, 대상체 내로의 이식을 위한 세포 또는 조직을 얻는 방법.
  8. 제7항에 있어서, Xist가 게놈 편집에 의해 불활성화되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, CRISPR 시스템이 결실 또는 불활성화 돌연변이를 게놈 Xist 폴리뉴클레오티드에 도입하기 위해 사용되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, Xist 폴리뉴클레오티드 발현 또는 활성이 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 감소되는 것인 방법.
  11. 제1항의 방법에 따라 제조된 배반포.
  12. Xist에서의 결실을 포함하거나 감소된 수준의 Xist 발현을 갖고, Kdm4d를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  13. 제7항의 방법에 따라 제조된 세포 또는 조직.
  14. 제1항의 배반포를 숙주 자궁 내로 착상시킴으로써 제조된 클로닝된 유기체.
  15. Xist 활성이 결여된 체세포로부터 얻어진 공여자 핵을 포함하고, 통상적인 난모세포에 비해 증가된 수준의 Kdm4d를 발현하는 난모세포.
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