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KR20200106052A - 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 치료에서 이의 용도 - Google Patents

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 치료에서 이의 용도 Download PDF

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KR20200106052A
KR20200106052A KR1020207021966A KR20207021966A KR20200106052A KR 20200106052 A KR20200106052 A KR 20200106052A KR 1020207021966 A KR1020207021966 A KR 1020207021966A KR 20207021966 A KR20207021966 A KR 20207021966A KR 20200106052 A KR20200106052 A KR 20200106052A
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난징 유엠에이비-바이오파마 컴퍼티 리미티드
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Abstract

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해서 사용될 수 있다.

Description

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 치료에서 이의 용도
본 출원은 2017년 12월 29일자로 출원된 발명의 명칭이 "단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 치료에서 이의 용도(Isolated Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof and Use of Same in Tumor Treatment)"인 중국 발명 특허 출원 제2017114761603호의 우선권을 주장한다.
본 개시내용은 항체에 관한 것이며, 구체적으로, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 이의 종양 치료에서의 용도에 관한 것이다.
인간 OX40은, N146 위치 및 N160 위치에서의 글리코실화 반응 때문에 대략 50kD의 표현 분자량을 갖는 277개의 아미노산으로 이루어지는 단백질이다([1,2]). OX40은 I형 막투과성 단백질이며, 천연 리간드 OX40L (CD252)에 결합(bind)될 수 있는 세포외 세그먼트 및 T 세포에 의해서 활성화되는 다수의 신호전달 경로에 커플(couple)되는 세포내 세그먼트를 구비한다.
인간 OX40은 주로 활성화된 T 세포 상에서 발현되며, CD4 세포, CD8 세포, Th 세포, Treg 세포 등을 포함한다([3]에서 검토됨). OX40의 발현은 나이브 T 세포 상에서 매우 낮으나, 항원-유도된 자극 후에, 이의 발현 레벨은 상향 조절(up-regulated)되고 12시간 내지 5-6일 내에 피크에 도달한다. 유사하게, OX40L의 발현은 또한 세포 활성화의 상태에 의해서 영향을 받는다([3]). OX40L 발현은 항원 자극 후 1-3일 APC 세포에서 검출되는 것이 가능하다. 흥미롭게도, 면역 세포에 부가하여, 근육 세포도 염증성 인자의 자극 하에서 OX40L을 발현할 수 있으며([4, 5]), OX40L-OX40 신호전달 경로가 유기체의 염증성 반응에 따라 널리 작용할 수 있음을 암시한다.
OX40/OX40L이 항원-활성화된 T 세포에서 주로 발현되는 특성에 기반하여, OX40 작용제(agonist)가 개발되고 있고, 강한 특이도 및 낮은 부작용을 갖는 면역 치료법이 될 것으로 기대된다.
항원-의존성 OX40L/OX40 공자극 분자의 활성화는 T 세포에 있는 다수의 신호전달 경로에 커플된다. 결정 구조 연구는, OX40L과 OX40의 결합이 OX40-OX40L 복합체의 삼량체화를 유도할 수 있고([6]), 따라서 수용체-연관 인자(TRAF)의 세포내 결합 부위를 형성한다. 후자(TRAF2, 5)는 결과적으로 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시키고 T 세포 아포토시스를 억제할 수 있다([5, 7, 8]). 연구에 의하면, OX40의 활성화로 인해 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현이 높아질 수 있다는 점이 발견되었고([9]), OX40이 T 세포 아포토시스를 억제하는 기능을 달성하기 위해서 NF-κB 신호전달 경로를 통해서 항-아포토시스 단백질의 발현을 유발할 수 있다는 점이 암시된다.
PKB/PI3K는 OX40으로부터 하류에 있는 다른 중요한 신호전달 경로이다. 연구에 따르면, 한편으로, T 세포 상의 OX40의 공자극 신호가 PKB 활성화 유지에 필수적이라는 점과, 다른 한편으로, 항시적으로 활성화된 PCB가 OX40 결핍에 의해서 유발된 T 세포 내 항-아포토시스 단백질의 하향-조절을 길항할 수 있다는 점이 발견되었다([10]). OX40 공자극 신호는 PKB/PI3K 신호전달 경로를 통해서 서비빈(Survivin)의 발현을 유지할 수 있다([11]).
마지막으로, T 세포 상의 OX40 및 TCR의 활성화는 NFAT 신호전달 경로의 활성화 및 칼슘 유동을 또한 상승적으로 유도할 수 있으며, IL-2, IL-4, IL-5 및 IFN-γ를 포함하는 사이토카인의 발현을 조절한다([12]).
요컨대, 위 연구에 따르면, OX40의 활성화가 NF-κB 신호전달 경로, PKB/PI3K 신호전달 경로 및 NFAT 신호전달 경로를 통해서 T 세포의 증식, 아포토시스 및 사이토카인 분비능을 조절할 수 있고, 이로써 면역 체계의 활력을 향상시키는 효과를 달성한다.
그러나, OX40의 더 깊은 연구에 따르면, CD4+ 세포의 하위 집단인 Treg 세포가 또한 OX40을 발현시킬 수 있다는 점이 발견되었다. OX40은 쥐 Treg 세포 상에서 계속 발현되나, 인간 Treg 상에서 이의 발현은 활성화 후 상향 조절된다([13, 14]). Treg는 이펙터 T 세포(Teff) 억제 효능을 갖는 일 유형의 세포이고, 따라서 Treg 세포 상의 OX40의 기능을 연구하는 것은 매우 흥미롭다. 기존의 증거는 OX40 신호전달 경로가 자연 Treg (nTreg)의 분화에 거의 영향을 미치지 않는 점을 보이나, 대부분의 연구는 유도된 Treg (iTreg)의 분화에 상대적으로 명확한 억제 조절 효능을 갖는 점을 보인다([3, 15]에서 검토됨).
Treg 세포의 분화에서 OX40 신호전달 경로에 대한 명확한 결론과 상이한, Treg 세포의 기능에 대한 OX40 신호전달 경로의 조절 효과에 대한 연구는 일관성이 없다. 일부 연구는 OX40 신호전달 경로가 Treg 세포의 면역 억제성 기능을 억제할 수 있다는 점을 나타내나([14, 16-20]), 다른 연구는 Treg 세포가 면역 억제성 기능을 충분히 발휘하기 위해서 OX40이 필수적이라는 점을 발견하였다([21-23]). 이러한 비일관성은 상이한 실험실에 의해서 채택된 상이한 실험 모델 및 실험 조건에 관련될 수 있고, 또한, 유기체 내의 Treg 세포 상의 OX40의 기능이 상이한 생리학적 조건 및 병리학적 조건에 의해서 영향을 받을 수 있다는 점을 시사할 수 있다.
유사하게, Treg 세포의 증식 및 아포토시스에 대한 OX40 활성의 영향은 또한 세포 주위의 미세환경 중에서 변한다. 예를 들어, IFN-γ 및 IL-4의 부존재([24]) 중에 또는 FoxP3 발현의 존재([17]) 중에, OX40의 활성화는 Treg 세포의 증폭을 상당히 촉진시킬 수 있다. 그러나, 다른 경우에는, 이 OX40-의존성 Treg 증폭이 관찰되지 않는다([14]).
요컨대, 면역 체계에 대한 OX40의 조절은 복잡한 프로세스이다. 한편으로, OX40 공자극 신호는 어떤 경우에 이펙터 T 세포의 활성을 향상시키고 Treg 기능을 억제하는 듀얼 메커니즘을 통해서 면역의 활성화의 효과를 달성할 수 있고; 다른 한편으로, OX40 신호전달 경로는 또한 Treg 세포의 증식을 촉진하고, 이펙터 T 세포의 기능을 길항할 수 있다. 또한, ADCC의 작동 메커니즘은 Teff 세포 및 음성적으로 조절된 Treg 세포를 클리어할 수 있다.
종양 침투 림프구(TIL)는 말초 림프계로부터 이동하고 종양 조직 내부에 억류되는 림프구이며, 이들의 수와 종류는 환자의 예후와 종종 관련된다([25, 26]). 많은 연구는, OX40은 종양 침투 림프구, 특히 Treg 상에서 높게 발현되며([27-32]), 이는 아마도 종양 특이 항원에 의한 T 세포의 활성화 징후가 될 수 있다는 점을 보인다. 립프종에 있어서, Treg 상에 있는 OX40의 상당한 상향 조절 때문에, OX40은 또한 항원-특이적 Treg에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다([30]). 흥미롭게도, OX40의 발현은 종양을 갖는 환자의 임상적 예후와 관련된다. 결장암에서, TIL, 장간막 림프절, 또는 종양의 엣지에 있는 림프 절 상에 있는 OX40의 높은 발현은 더 긴 생존 기간과 연관된다([31]). 유사하게, 흑색 종을 갖는 환자에게서, TIL 및 종양 말초 림프구 내의 OX40-양성 세포의 수는 종양의 전이 및 환자의 생존 기간과 관련된다([32]).
T 세포 활성화에 있어서 OX40의 중요한 역할 및 상술된 발견에 기반하여, OX40은 종양 치료를 위한 중요한 목표가 되었다. OX40 신호전달 경로의 활성화는 활성화된 OX40 항체를 사용하거나 또는 OX40L 융합 단백질에 결합함으로써 달성될 수 있다. OX40 작용제를 사용하는 종양 치료의 최초 시도는 2000년으로 거슬러 올라갈 수 있고, Weinber 연구소는 OX40L: Ig 융합 단백질의 복강내 투여가 피하 이종이식의 종양 형성을 방지할 수 있다는 점을 보고하였다([33]). 흥미롭게도, 치료 그룹에서 쥐는 동일한 종양의 재접종에 대해 여전히 양호한 면역을 가지나, 상이한 종양 세포의 접종에 대해 유사한 면역을 갖지 않는다([33]). 이러한 결과는 OX40 작용제가 종양 치료 중에 종양 특이적 기억 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다는 점을 암시한다. 동시에, 연구는 CD4+ 및 CD8+ 세포가 OX40 작용제의 항종양 활성에 필요하다는 점을 더 나타낸다([33, 34]). 이때 부터, 많은 증상발현전 연구는, 동물 모델에서 단독으로 또는 다른 종양 치료와 결합하여 OX40 작용제를 사용하면 종양 성장이 효과적으로 억제되고 종양 재발도 방지될 수 있다는 점을 증명하였다([15, 35]에서 검토됨).
Mallett S, Fossum S, Barclay AN이 저술한 "Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4 positive T lymphocytes -- a molecule related to nerve growth factor receptor."의 타이틀을 가지는 자료로서, EMBO J. 1990; 9: 1063-8. doi:를 통해 발간된 자료. Byun M, Ma CS, Akcay A, Pedergnana V, Palendira U, Myoung J, Avery DT, Liu Y, Abhyankar A, Lorenzo L, Schmidt M, Lim HK, Cassar O, et al.이 저술한 "Inherited human OX40 deficiency underlying classic Kaposi sarcoma of childhood."의 타이틀을 가지는 자료로서, J Exp Med. 2013; 210: 1743-59. doi: 10.1084/jem.20130592를 통해 발간된 자료 Willoughby J, Griffiths J, Tews I, Cragg MS가 저술한 "OX40: Structure and function-What questions remain?"의 타이틀을 가지는 자료로서, Mol Immunol. 2017; 83: 13-22. doi: 10.1016/j.molimm.2017.01.006.을 통해 발간된 자료. 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종래기술의 문제를 극복하기 위해서, 본 개시내용은 새로운 항-인간 OX40 모노클로날 항체 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 종양 치료에서 이의 용도를 제공한다.
본 개시내용은, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementary determining region) 및 경쇄 상보성 결정 영역(light chain complementary determining region)을 포함하되, 중쇄 상보성 결정 영역은 다음 서열: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11 중 하나 이상으로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
여기서, 중쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11이다.
여기서, 경쇄 상보성 결정 영역은 다음 서열: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14 중 하나 이상으로부터 선택된다.
여기서, 경쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8; 또는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14이다.
여기서, 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나; 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나; 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나; 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나; 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14를 포함한다.
여기서, 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)은 다음 서열: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 29로 대체될 수 있다.
여기서, 경쇄 가변 영역(light chain variable region)은 다음 서열: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 30으로 대체될 수 있다.
여기서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16을 포함하거나; 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16을 포함하거나; 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18을 포함하거나; 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18을 포함하거나; 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 19를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함하거나; 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 30을 포함한다.
여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 모노클로날 항체(humanized monoclonal antibody) 또는 완전 인간 모노클로날 항체(fully human monoclonal antibody)이다.
여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 캐멀화(camelized) 단일 도메인 항체, 이작용성 항체, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, dsFv2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F (ab')2, ds 이작용성 항체, 나노바디, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체이다.
여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 단백질의 불변 영역을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합체를 더 포함한다.
본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다.
본 개시내용은 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 단리된 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 인간 OX40 또는 원숭이 OX40의 존재 또는 레벨의 검출에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 OX40 작용제에 반응하는, 장애 또는 상태를 앓고 있는 개체의 검출 및 확인에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 OX40 작용제 치료 동안의, 치료 반응 또는 질병 진행의 모니터링에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 상향 조절된(up-regulated) 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태의 치료를 위한 약물의 제조에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 여기서, 상태는 암 또는 만성 바이러스 감염이다.
본 개시내용은 인간 OX40 또는 원숭이 OX40의 존재 또는 레벨을 검출하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 OX40 작용제에 반응하는 장애 또는 상태를 앓고 있는 개체를 검출하고 식별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 OX40 작용제 치료 동안의, 치료 반응 또는 질병 진행을 모니터링하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 상향 조절된 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 단계를 포함한다. 여기서, 상태는 암 또는 만성 바이러스 감염이다.
본 개시내용은 인간 OX40 또는 원숭이 OX40의 존재 또는 레벨을 검출하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 OX40 작용제에 반응하는, 장애 또는 상태를 앓고 있는 개체를 검출하고 식별하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 OX40 작용제 치료 동안의, 치료 반응 또는 질병 진행을 모니터링하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 상향 조절된 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태를 치료하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 여기서, 상태는 암 또는 만성 바이러스 감염이다.
종래기술과 비교하여, 본 개시내용은 다음의 유리한 효과를 갖는다: 본 발명자는 독립적으로 개발된 쥐-유래 항-OX40 항체를 변경시킴으로써 인간-쥐 키메라 항-OX40 모노클로날 항체를 개발하였고, 본 개시내용의 항체는 세포 표면 상에 있는 OX40단백질에 결합될 수 있고, 이의 하류 신호전달 경로를 활성화시키고 T 세포의 기능을 활성화시켜, 종양 또는 만성 바이러스 감염의 치료 가능성을 제공한다.
도 1은 ELISA 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 2는 FACS 검출에 의한 CHO-hsOX40과 항체의 결합 분석 결과를 도시한다.
도 3은 FACS 검출에 의한 CHO-mOX40과 항체의 결합 분석 결과를 도시한다.
도 4는 OX40 항체가 Jurkat 세포에서 NF-κB 신호전달 경로 활성을 활성화시켰음을도시한다.
도 5는 OX40 항체가 Jurkat 세포에서 NF-κB 신호전달 경로의 OX40L-유도 활성화를 경쟁적으로 억제하였음을 도시한다.
도 6은 CHO-OX40 세포에 대한 PBMC의 OX40 항체-매개 ADCC 효과를 도시한다.
도 7은 OX40 항체가 Th 세포의 증식을 촉진한다는 점을 도시한다. 상이한 농도의 OX40 항체 및 OKT3은 CD4+ Th 세포의 증식을 촉진시키도록 상승적으로 기능하였다.
도 8의 (a)는 종양 부피의 억제와 OX40 항체 드러그(drug) 사이의 관계를 나타내는 그래프이고(** P <0.01), 도 8의 (b)는 OX40 항체 드러그가 쥐의 체중에 상당한 영향을 미치지 않음을 도시한다.
도 9의 (a)는 인간 OX40에 결합하는 인간화 항체의 ELISA 데이터를 도시하고, 도 9의 (b)는 Jurkat 세포에서 NF-κB 신호전달 경로 상의 인간화 항체의 활성화 활성을 도시하고; 도 9의 (c)는 OX40-인간화 유전자이식 쥐에 대한 인간화 항체의 항-종양 효과를 도시한다.
도 10의 (a)는 쥐에서 OX40 항체 드러그의 약물동태적 성능을 도시하고, 도 10의 (b)는 시노몰구스 원숭이에서 OX40 항체 드러그의 약물동태적 성능을 도시한다.
본 개시내용의 다음 설명은 본 개시내용의 다양한 실시형태를 단지 설명하기 위한 것이다. 이와 같이, 본원에서 논의되는 특정 변형물이 본 개시내용의 범위에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다양한 균등물, 수정물 및 변형물이 본 개시내용의 범위로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 점이 본 기술분야에서 숙련된 자에게 명백할 것이고, 이러한 균등 실시형태가 본 개시내용의 범위에 포함된다는 점이 이해된다. 공개공보, 특허 및 특허 출원을 포함하는, 본원에서 인용되는 모든 참조문헌은 전체적으로 참조에 의해서 본원에 포함된다.
용어
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는, 특이적 항원에 결합될 수 있는 모든 면역 글로불린 항체, 모노클로날항체, 다클론항체, 다중 특이적 항체, 또는 이중 특이적(이가) 항체를 포함한다. 천연의 무손상 항체는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1 불변 영역, 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역으로 구성되는 한편, 각각의 경쇄는 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류될 수 있고, 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로 분류될 수 있다. 항체는 "Y" 형상을 가지며, Y 형상 구조체의 스템은 이황화 결합을 통해서 서로 결합된 두 개의 중쇄의 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역으로 구성된다. Y 형상 구조체의 각각의 아암은 하나의 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 이 중쇄는 하나의 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역에 결합된다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원의 결합을 결정한다. 각 쇄의 가변 영역은 상보적 결정 영역(CDR)으로 불리는 세 개의 초가변 영역을 포함한다. 경쇄(L)의 CDR는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3를 포함하고, 중쇄(H)의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함한다. 본 개시내용에서 항체 또는 항원 결합 단편의 CDR 경계는 Kabat, IMGT, Chothia, 또는 Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 273(4), 927(1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. 186(3): 651-63(1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901(1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28; 342(6252): 877-83(1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))의 명명법에 의해서 명명되거나 식별될 수 있다. 세 개의 CDR은 프레임워크 영역(FR)으로 알려진 플랭킹 신장물(flanking stretch)들 사이에 개재되며, 이 프레임워크 영역은 CDR보다 더욱 고도로 보존적이며 초가변 루프를 지지하도록 스캐폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여되지 않으나, 다양한 효과기 기능을 갖는다. 항체는 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기반하여 몇 개의 클래스로 분류될 수 있다. 항체의 다섯 개의 주요한 클래스 또는 아이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이들은 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재에 의해서 특징지워진다. 주요 항체 클래스 중 몇 개는 서브클래스, 예를 들어, IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄), or IgA2 (α2 중쇄) 등으로 더 나뉜다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성되는 항체 단편, 또는 항원에 결합되나 무손상 항체 구조를 갖지 않는 임의의 다른 항체 단편을 가리킨다. 항원 결합 단편의 예는, 한정 없이, 디아바디, Fab, Fab ', F(ab') 2, Fv 단편, 이황화 안정화 Fv 단편(dsFv), (dsFv) 2, 이중 특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화 디아바디 (ds 디아 바디), 단일-쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 디아 바디), 2가 단일쇄 항체(BsFv), 다중 특이적 항체, 캐멀화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 항원 결합 단편은, 모항체(parent antibody)가 결합되는 동일한 항원에 결합될 수 있다. 어떤 실시형태에서, 항원 결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 프레임워크 영역에 이식된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
항체의 "Fab" 단편은 가변 영역에 결합된 경쇄(가변 영역 및 불변 영역을 포함) 및 이황화 결합을 통한 중쇄의 불변 영역의 일부분으로 이루어진 항체 분자의 일부분을 가리킨다.
용어 "Fab'" 단편은 힌지 영역의 일부분을 포함하는 Fab 단편을 가리킨다.
용어 "F(ab')2"는 Fab의 이량체를 가리킨다.
항체의 FC 부분은, ADCC 및 CDC와 같은 다양한 효과기 기능에 책임이 있으나, 항원에 대한 결합에는 관여하지 않는다.
항체의 "Fv" 단편은 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 가장 작은 단편을 가리킨다. Fv 단편은 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역으로 이루어진다.
용어 "단쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 펩타이드 사슬을 통해서 또는 직접적으로 서로 연결되는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)과 경쇄 가변 영역(light chain variable region)에 의해서 형성되는 조작된 항체를 가리킨다(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879(1988)).
용어 "단쇄 항체 Fv-Fc" 또는 "scFv-Fc"는 어떤 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 이루어진 조작된 항체를 가리킨다.
용어 "캐멀화 단일 도메인 항체", "중쇄 항체" 또는 "중쇄 단독 항체(HCAb)"는 두 개의 VH 도메인을 포함하나 경쇄를 포함하지 않는 항체를 가리킨다(Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. 231(1-2): 25-38(1999); Muyldermans S., J Biotechnol. 74(4): 277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호). 중쇄 항체는 원래 낙타과(Camelidae)(낙타, 단봉낙타 및 라마(llama))로부터 유래되었다. 경쇄의 결여에도 불구하고, 캐멀화 항체는 진정한 항원 결합 레퍼토리를 갖는다(Hamers-Casterman C. et al., Nature 363(6428): 446-8 (1993); Nguyen VK. et al., Heavy-chain antibodies in Camelidae: a case of evolutionary innovation, Immunogenetics. 54 (1): 39-47(2002); Nguyen VK. et al., Immunology. 109(1): 93101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 도메인(VH 도메인)은 후천적 면역을 생성하기 위해 알려진 가장 작은 항원 결합 유닛이다(Koch-Nolte et al., FASEB J. 21(13): 3490-8. Epub (2007)).
용어 "나노바디(nanobody)"는 중쇄 항체로부터의 두 개의 불면 도메인 CH2 및 CH3, 및 하나의 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 가리킨다.
용어 "디아바디(diabody)"는 두 개의 항원 결합 부위를 구비하는 작은 항체 단편을 포함하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬 상의 VL 도메인에 연결되는 VH 도메인을 포함한다(예를 들어, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90(14): 6444-8(1993); EP404097; WO93/11161 참조). 두 개의 도메인 사이의 링커는 너무 짧아 동일한 체인 상의 두 개의 도메인 사이의 페어링을 허용하지 못하고, 따라서, 두 개의 도메인이 다른 사슬의 상보적인 도메인과 페어링되도록 하여 두 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 두 개의 항원 결합 부위는 동일한 또는 상이한 항원(또는 항원 에피토프)을 표적으로 하여 결합할 수 있다.
용어 "도메인 항체"는 단지 하나의 중쇄 가변 영역 또는 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 단편을 가리킨다. 어떤 예에서, 두 개 이상의 VH 도메인은 폴리펩타이드 링커로 공유적으로 결합되어 2가 도메인을 형성한다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 도메인은 동일한 또는 상이한 항원을 표적으로 하여 동작된다.
어떤 실시형태에서, "(dsFv)2"는 세 개의 펩타이드 사슬을 포함한다: 두 개의 VH 모이어티는 폴리펩타이드 링커에 의해서 링크되고 이황화물 브리지에 의해서 두 개의 VL 모이어티에 연결된다.
어떤 실시형태에서, "이중 특이적 ds 디아바디"는 VH1-VL2 (폴리펩타이드 링커에 의해서 링크됨) 및 VL1-VH2 (또한 폴리펩타이드 링커에 의해서 링크됨)를 포함하며, 이 양자는 VH1과 VL1 사이의 이황화 결합을 통해서 연결된다.
"이중특이적 dsFv" 또는 "dsFv-dsFv"는 세 개의 폴리펩타이드 사슬(중쇄가 폴리펩타이드 링커(예를 들어, 긴 가요성 링커)에 의해서 링크되고 이황화 결합에 의해서 VL1 및 VL2 모이어티에 연결되는 VH1-VH2 모이어티)을 포함하며, 여기서 이황화 결합으로 페어링된 중쇄 및 경쇄의 페어 각각은 상이한 항원 특이도를 갖는다.
어떤 실시형태에서, "scFv 이량체"는, 이량화된 두 개의 VH-VL 모이어티(폴리펩타이드 링커에 의해서 링크됨)를 포함하는 2가 디아바디 또는 2가 단쇄 항체(BsFv)이며, 여기서 두 개의 모이어티로부터의 VH는 다른 모이어티로부터의 VL과 조정하여 두 개의 결합 부위를 형성하며, 이 부위는 동일한 항원(또는 에피토프) 또는 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적으로 하고 결합될 수 있다. 다른 실시형태에서, "scFv 이량체"는, 서로 연결된 VL1-VH2 (폴리펩타이드 링커에 의해서 링크됨) 및 VH1-VL2(펩타이드 링커에 의해서 링크됨)을 포함하는 이중 특이적 디아바디이며, 여기서 VH1은 VL1과 조정하고, VH2는 VL2와 조정하고, 각 조정된 페어는 상이한 항원 특이도를 갖는다.
항체 또는 항원 결합 단편에 관하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "완전 인간"은, 항체 또는 항원 결합 단편이, 인간 또는 인간 면역 세포에 의해서 생성되는 항체 또는 인간 항체 라이브러리를 사용하는 유전자이식 비인간 동물과 같은 비인간 소오스로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 대응하는, 또는 인간 항체를 코딩하는 다른 서열에 대응하는 어떤 아미노산 서열을 갖거나 또는 이로써 이루어지는 점을 의미한다. 어떤 실시형태에서, 완전 인간 항체는 비인간 항체로부터 유도된 아미노산 잔기(특히 항원 결합 잔기)를 포함하지 않는다.
항체 또는 항원 결합 단편에 관하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화"는 비인간 동물로부터 유도된 CDR, 인간으로부터 유도된 FR 영역, 및, 적용 가능하다면, 인간으로부터 유도된 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 가리킨다. 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 감소된 면역원성을 갖기 때문에, 어떤 실시형태에서 인간을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 어떤 실시형태에서, 비인간 동물은, 쥐, 래트(rat), 토끼, 염소, 양, 기니피그 또는 햄스터와 같은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은, CDR 서열이 비인간이라는 점을 제외하고 인간 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인간 유래의 FR 영역은, 이들이 유래된 인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 일부 아미노산 변형물, 예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하의 아미노산 변형물(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변형물(들)은 중쇄 FR 영역에서만, 경쇄 FR 영역에서만, 또는 양 사슬에서 존재할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 인간화 항체는 인간 FR1-3, 및 인간 JH 및 JK를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라(chimeric)"는 하나의 종으로부터 유도된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분, 및 상이한 종으로부터 유도된 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 의미한다. 도해적인 실시예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유도된 불면 영역 및 쥐와 같은 비인간 동물로부터의 가변 영역을 포함할 수 있다.
용어 "OX40"은 OX40L에 결합되는 수용체를 가리킨다. 이것은 TNF 수용체 패밀리에 속하는 I형 막 단백질이다. 다른 이름은 ACT-4, OX40L 수용체, CD134 항원, ACT35 항원, 및 TNFRSF4이다. 이것은 50 kDa의 분자량을 갖고, 등록 번호 P43489 하에 SwissProt에 저장된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항-OX40 항체"는 진단 및/또는 치료 용도를 제공하기에 충분한 친화력을 갖는 OX40(예를 들어, 인간 OX40 또는 원숭이 OX40)에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 가리킨다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합되는"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체와 항원 사이의 반응과 같은, 두 개의 분자 사이의 비-무작위 바인딩 반응을 가리킨다. 어떤 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ≤10-6 M의 바인딩 친화력(KD)을 갖는 인간 OX40 및/또는 원숭이 OX40에 특이적으로 결합된다. 본 개시내용에서 사용되는 KD는 결합율에 대한 해리율의 비율(koff/kon)을 가리키며, 이 비율은 표면 플라즈몬 공명 방법에 의해서, 예를 들어, Biacore 로부터의 장비를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M1)"은 SEQ ID NO: 17에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M2)"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 18에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M1/M2)"은 SEQ ID NO: 17에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 18에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(G2)"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L2"은 SEQ ID NO: 19에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/λ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L2(G2)"은 SEQ ID NO: 19에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/λ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-C1"은 SEQ ID NO: 29에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 30에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간화 모노클로날 항체(humanized monoclonal antibody)를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-C1(G2)"은 SEQ ID NO: 29에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 30에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간화 모노클로날 항체를 가리킨다.
아미노산 서열에 관하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리적 성질 및 화학적 성질을 구비하는 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산 잔기 가운데에서 소수성 측쇄(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu, 및 Ile), 중성 친수성 측쇄(예를 들어, Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln), 산성 측쇄(예를 들어, Asp, Glu), 염기성 측쇄(예를 들어, His, Lys, 및 Arg), 또는 방향족 측쇄(예를 들어, Trp, Tyr, 및 Phe)를 이용하여 될 수 있다. 본 기술분야에서 알려진 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질의 입체형태 구조에 의미있는 변화를 유발하지 않고, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 관하여, 용어 "서열 동일성의 백분율"은, 서열을 정렬하고, 필요하면, 최대로 많은 수의 동일한 아미노산(또는 핵산)을 달성하기 위해서 갭을 도입한 후, 기준 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 잔기의 보존적 치환물은 동일한 잔기로 간주될 수도 또는 간주되지 않을 수도 있다. 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성의 백분율을 결정하기 위한 정렬은 본 기술분야에서 공개적으로 이용 가능한 툴을 이용하여 달성될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 자는 툴에 의해서 제공되는 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 정렬을 위한 필요에 따라서 적절하게, 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택함으로써, 파라미터를 조절할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포"는 CD4 + T 세포, CD8 + T 세포, T 헬퍼 타입 1 T 세포, T 헬퍼 타입 2 T 세포, T 헬퍼 타입 17 T 세포, 및 서프레서 T 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과기 기능"은, C1 복합체 및 Fc 수용체와 같은 효과기에 항체의 Fc 영역을 결합하는 데 원인이 되는 생물학적 활성을 가리킨다. 예시적인 효과기 기능은 C1 복합체 상의 C1q와 항체의 상호작용에 의해서 유도되는 보체의존 세포독성(CDC); 작용기 세포 상의 Fc 수용체에 항체의 Fc 영역을 결합함으로써 유도되는 항체의존 세포매개 세포독성(ADCC); 및 식세포작용을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 또는 "암성 상태(cancerous condition)"은 종양성 또는 악성 세포의 성장, 증식, 또는 전이에 의해 매개되고, 고형암 및, 백혈병과 같은 비고형암 둘 다를 유발하는 모든 의학적 상태를 가리킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 종양성 및/또는 악성 세포의 고체 덩어리를 가리킨다.
특정 상태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 특정 상태의 예방 또는 완화시키는 것, 특정 상태의 상승 또는 발생 속도를 늦추는 것, 특정 상태의 발생 위험을 감소시키는 것, 특정 상태와 관련된 증상의 발생을 예방하거나 지연시키는 것, 특정 상태와 관련된 증상을 감소시키거나 종료시키는 것, 특정 상태의 완전 또는 부분 반전을 발생시키는 것, 특정 상태를 치료하는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다. 암에 관하여 "치료하는 것" 또는 "치료"는 종양성 또는 악성 세포의 성장, 증식 또는 전이를 억제 또는 둔화시키는 것, 또는 이들의 어떤 조합을 가리킬 수 있다. 암에 관하여 "치료하는 것" 또는 "치료"는 종양의 전부 또는 일부를 제거하는 것, 종양의 성장 및 전이를 억제하거나 늦추는 것, 종양의 발생을 예방하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 특정 조합을 포함한다.
"단리된" 물질은 자연 상태로부터 인공적으로 변경되었다. "단리된" 물질 또는 성분이 본질적으로 발생되면, 이것은 원래의 상태로부터 변경되거나 제거되거나, 또는 두가지 모두이다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는 "분리되"지 않았으나, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드가 충분히 순수한 상태에서 존재하도록 자연 상태에서 공존하는 물질로부터 충분하게 단리된다면 "단리된" 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 전기영동 방법(SDS-PAGE, 등전 포커싱, 모세관 전기영동 등) 또는 크로마토그래픽 방법(이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC 등)에 의해 결정되는 바와 같이, 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 순수성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터(vector)"는 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이 단백질의 발현을 초래하도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 비이클(vehicle)을 가리킨다. 벡터는 숙주 세포 내에서 벡터가 나르는 유전 인자의 발현을 초래하도록 숙주 세포를 변형, 변환 또는 감염시키기 위해서 사용될 수 있다. 예로서, 벡터는 플라스미드(plasmid), 파지미드 (phagemid), 코스미드(cosmid), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, λ 파지(phage) 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리는 레트로바이러스(렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 헤르페스 심플렉스바이러스), 포크스바이러스, 바쿨로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함)를 포함한다. 벡터는 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 포함할 수 있으며, 프로모터 염기서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 가능한 요소, 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 세포 안으로 진입을 돕는 성분을 포함하며, 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 외피를 포함하고 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주세포"는, 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "OX40에 관련된 또는 연관된 질병"은 OX40 발현 또는 활성의 증가 또는 감소로 인해 유발, 악화되거나 또는 달리 관련된 모든 증상을 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효한 투여량"은 OX40과 연관된 질병 또는 증상을 치료하는 데 효과적인 특정 약물의 투여량 또는 농도를 가리킨다. 예를 들어, 본원에서 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 사용과 관련하여, 치료학적 유효량은, 항체나 항원 결합 단편이 종양의 전부 또는 일부를 제거할 수 있거나, 종양 성장을 억제 또는 둔화시킬 수 있거나, 암 상태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있거나, 종양 세포 전이를 억제할 수 있거나, 종양 또는 암 증상과 관련된 증상이나 표지를 개선할 수 있거나, 종양이나 암 증상의 발생을 방지 또는 지연시킬 수 있거나, 또는 이들의 어떤 조합을 할 수 있는 용량 또는 농도를 가리킨다.
용어 "약학적으로 허용가능"은, 지정된 담체(carrier), 비이클, 희석제, 부형제 및/또는 염이 일반적으로 화학적으로 그리고/또는 물리적으로 제제의 다른 성분과 양립될 수 있고, 생리학적으로 수령자와 양립될 수 있다는 점을 가리킨다.
항-OX40 항체에 관하여
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 예시적인 모노클로날 항체 MT01-L1, MT01-L1(M1), MT01-L1(M2), MT01-L1(M1/M2), MT01-L1(G2), MT01-L2 및 MT01-L2(G2), MT01-C1 및 MT01-C1(G2)을 제공한다. 이들의 CDR 서열은 표1에 도시되고, 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역 서열은 또한 다음과 같이 열거된다:
표 1 모노클로날 항체의 서열 정보
Figure pct00001
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 9, 10, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementary determining region) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 12, 13, 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 서열(light chain complementary determining region)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; c) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; d) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 e) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역, 및 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M1)"은 SEQ ID NO: 17에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M2)"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 18에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(M1/M2)"은 SEQ ID NO: 17에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 18에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L1(G2)"은 SEQ ID NO: 15에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L2"은 SEQ ID NO: 19에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-L2(G2)"은 SEQ ID NO: 19에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/λ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간-쥐 키메라 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-C1"은 SEQ ID NO: 29에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 30에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG1/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간화 모노클로날 항체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MT01-C1(G2)"은 SEQ ID NO: 29에서 보여지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 30에서 보여지는 경쇄 가변 영역, 및 인간-유래 IgG2/κ 아이소타입 불변 영역을 갖는 인간화 모노클로날 항체를 가리킨다.
본 기술분야에서 숙련된 자는, 본원에서 제공된 CDR 서열이 아미노산의 하나 이상의 치환물을 포함하도록 변경될 수 있고, 따라서, 인간 OX40에 대한 증가된 결합 친화력과 같은 향상된 생물학적 활성으로 귀결될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체 변이체(예를 들어, Fab 또는 scFv 변이체)의 라이브러리가 파지 디스플레이 기술로 생성되고 표현될 수 있고, 다음으로 인간 OX40에 대한 결합 친화력을 갖는 항체에 대해서 스크린될 수 있다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 소프트웨어가, 인간 OX40에 대한 항체의 결합력을 시뮬레이션하고, 결합 인터페이스를 형성하는 항체 상의 아미노산 잔기를 식별하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 잔기의 치환은 결합 친화력의 감소를 방지하기 위해서 회피될 수 있거나, 이러한 잔기는 치환이 더 강한 결합을 형성하게끔 표적될 수 있다. 특정 실시형태에서, CDR 서열의 치환물 중 적어도 하나(또는 모두)는 보존적 치환물(들)이다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 표1에 제공되는 서열에 대해 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 CDR 서열을 포함하고, 동시에, 대응하는 CDR 서열이 표1에 제공되는 서열에 대해 100% 의 서열 동일성을 갖는 점을 제외하고, 실질적으로 동일한 서열을 갖는 모(parental) 항체와 유사한 또는 이보다 더 높은 레벨로 인간 OX40에 대한 결합 친화력을 유지한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 표면 플라즈몬 공명에 의해서 ≤10-7 M의 결합 친화력(Kd)으로 인간 OX40에 대해 특이적으로 결합될 수 있다. 결합 친화력은 KD 값으로 나타내질 수 있으며, 이는 항원과 항원 결합 분자 사이의 결합이 평형에 도달되었을 때 결합율에 대한 해리율의 비(koff/kon)로서 계산된다. 항원 결합 친화력(예를 들어, KD)은, 예를 들어, Biacore로부터의 장비를 사용하는 플라즈몬 공명 결합 분석을 포함하는, 본 기술분야에 알려진 적합한 방법을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10 ng/mL-10 μg/mL의 EC50(즉, 절반의 바인딩 농도)으로 인간 OX40에 결합된다. 인간 OX40에 대한 항체의 결합은, ELISA, Western blot, FACS, 또는 다른 결합 분석과 같은, 샌드위치 방법과 같은 본 기술분야에 알려진 방법에 의해서 측정될 수 있다. 도해적인 실시예에서, 테스트될 항체(즉, 제1차의 항체)는 고정된 인간 OX40 또는 인간 OX40를 발현하는 세포에 바인드되도록 허용되고, 그러면, 결합되지 않은 항체는 씻겨 나가고, 라벨링된 제2차의 항체가 도입되며, 이는 제1차의 항체에 결합될 수 있고, 따라서 결합된 제2차의 항체의 검출을 허용한다. 검출은, 고정된 OX40이 이용되는 경우, 마이크로플레이트 리더와 마이크로플레이트를 이용하여 실시될 수 있거나, 인간 OX40을 발현하는 세포가 사용되는 경우, FACS에 의해서 실시될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은0.1 μg/mL 내지 10 μg/mL(FACS 분석에 의해서 측정됨)의 EC50(즉, 50% 유효 농도)으로 인간 OX40에 결합된다.
특정 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 OX40 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고, 따라서, 예를 들어, 사이토카인을 생성하기 위한 활성화된 T세포(예를 들어, CD4+T세포 및 CD8+T세포)의 유도, 활성화된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및 CD8+ T세포)의 증식 유도, 조절 Treg의 억제 기능의 역전을 포함하는 생물학적 활성을 제공한다.
항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX40에 대해서 특이적이다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥐 OX40에 결합되지 않으나, 인간 OX40과 유사한 결합 친화력으로 원숭이 OX40에 결합된다. 예를 들어, 쥐 OX40에 대한 예시적인 항체 MT01-L1 및 MT01-L2의 바인딩은 FACS 분석과 같은 일반적인 결합 분석에 의해서 검출될 수 없었으나, FACS는 이러한 항체가 인간 OX40과 유사한 EC50 값 또는 친화력으로 원숭이 OX40에 결합됨을 검출하였다.
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG2 아이소타입의 불변 영역을 갖고, 효과기 기능을 감소시키거나 제거하였다. ADCC 및 CDC와 같은 효과기 기능은 OX40 발현 세포에 대한 세포독성으로 이어질 수 있다. 일부 정상 세포가 OX40을 발현할 수 있다. 이러한 정상 세포에 대한 잠재적인 바람직하지 않은 독성을 회피하기 위해서, 본원에서 설명되는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 특정 실시형태는 효과기 기능을 감소시키거나 심지어 제거하였다. 알려진 바와 같이, 본 기술분야에서 숙련된 자에 의해서 용이하게 선택될 수 있는, Fc 수용체 결합 분석, 보완 Clq 결합 분석 및 세포 융해 방법과 같은 많은 검사가 ADCC 또는 CDC 활성을 추정하기 위해 사용된다. 이론에 의하여 제한되는 것을 바라지 않으나, 감소된 또는 제거된, ADCC 및 CDC와 같은 효과기 기능을 갖는 항체가 OX40 발현 세포에 대해서 세포독성을 갖지 않거나 최소의 세포독성을 가질 것이고, 따라서 바람직하지 않은 부작용을 회피할 것이라고 생각된다.
일부 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감소된 부작용을 갖는다. 예를 들어, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 완전 인간 IgG 서열을 가질 수 있고, 따라서 이의 면역원성은 인간화된 항체의 것보다 더 낮다. 다른 실시예에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ADCC 및 CDC를 제거하기 위해서 IgG2 또는 IgG4의 형태를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항-OX40 항체 및 이의 항원 결합 단편의 장점은 이들이 종양 세포, 정제된 종양 항원, 면역 자극 인자를 코딩하는 유전자로 전염된 세포, 종양 백신과 같은 면역원성 제제와 함께 사용될 수 있다는 것이다. 또한, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 표준 화학요법 및 방사선요법, 표적 기반 소분자 요법, 기타 새롭게 등장하는 면역 체크포인트 조절 요법을 포함하는, 조합 요법에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 약물 접합체, 이중 특이적 항체 또는 다가 항체를 위한 베이스 분자로서 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 다클론 항체, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 재조합체 항체, 이중 특이적 항체, 표지 항체, 2가 항체, 또는 항유전자형 항체일 수 있다. 재조합체 항체는 동물에서보다 재조합체 방법을 사용하여 체외에서 마련되는 항체이다. 이중 특이적 또는 2가 항체는, 두 개의 상이한 항원에 결합될 수 있는 두 개의 상이한 모노클로날 항체의 단편을 갖는 인공 항체이다. "2가"인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 두 개의 항원 결합 부위를 포함한다. 두 개의 항원 결합 부위는 동일한 항원에 결합되거나, 상이한 항원에 각각 결합될 수 있으며, 이 경우에 항체 또는 항원 결합 단편은 이중 특이적인 것으로 특징지워진다.
일부 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 완전 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 완전 인간 항체는 재조합체 방법을 사용하여 마련된다. 예를 들어, 쥐와 같은 유전자이식 동물은 인간 면역 글로불린 항체의 이식유전자 또는 트랜스유전자를 운반하도록 마련될 수 있고, 따라서 인간 OX40과 같은 적절한 항원으로 면역조치를 한 후 완전 인간 항체를 생성할 수 있다. 완전 인간 항체는 이러한 유전자이식 동물로부터 분리될 수 있거나, 또는, 혼성세포 기술에 의해서 마련될 수 있으며, 이 기술로, 유전자이식 동물의 비장 세포가 불멸 세포 라인(immortalized cell line)과 융합(fuse)되어 완전 인간 항체를 분비하는 하이브리도머 세포를 생성한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 설명되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 캐멀화 단일 도메인, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 글로불린 항체 불변 영역을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 글로불린 항체 불변 영역은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH1-CH2, 또는 CH1-CH3 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 글로불린 항체 불변 영역은 바람직한 특성을 부여하기 위해서 하나 이상의 변형물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은, 하나 이상의 효과기 기능을 감소시키거나 제거하여 FcRn 수용체에 대한 결합을 향상시키도록, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키도록 변경될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합체를 더 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편이 다양한 접합체와 링크될 수 있는 점이 고려된다(예를 들어, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989) 참조). 이러한 접찹체는 다른 방법 중에서, 공유 결합, 친화력 바인딩, 인터칼레이션, 좌표 결합, 복합체화, 결합(association), 혼합(blending) 또는 추가에 의해서 항체 또는 항원 결합 단편에 링크될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은, 하나 이상의 접합체에 대한 결합을 위해서 활용될 수 있는 에피토프 바인딩 모이어티 이외의 특이적 부위를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는, 시스테인 잔기 또는 히스티딘 잔기와 같은 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 접합체에 간접적으로 또는 다른 접합체를 통해서 링크될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 바이오틴에 접합되고, 다음으로 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 접합체는 검출가능한 라벨, 약동학적 수정 모이어티, 정제 모이어티, 또는 세포독성 모이어티일 수 있다. 검출가능한 라벨의 예는 형광 라벨(예: 플루오레신, 로다민, 단실, 파이코에스트린 또는 텍사스 레드), 효소-기질 라벨(예: 호스래디시 페록시다제, 알칼라인 포스파타제, 루세리페라아제(luceriferase), 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제 또는 β-D-갈락토시다제), 안정 동위원소 또는 방사성동위원소, 발색단 모이어티, 디옥시게닌, 바이오틴/아비딘, DNA 분자 또는 검출용 금을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 접합체는, 항체의 반감기를 연장하는 데 도움이 되는 PEG와 같은 약물동태(pharmacokinetic) 변형 모이어티일 수 있다. 다른 적합한 중합체는, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 고중합체 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 접합체는 자성 비드와 같은 정제 모이어티일 수 있다. "세포독성" 모이어티는 세포에 해롭거나 세포를 손상시키거나 죽일 수 있는 모든 물질일 수 있다. 세포독성 모이어티의 예는, 한정됨 없이, 탁솔, 시토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신 및 이의 유사체, 항대사물질(예: 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 다카바진), 알킬화제(예: 질소 머스타드, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로 포스 파 미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민백금(II)(DDP), 시스플라틴, 안트라 사이클린(예: 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예: 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예: 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 재조합 방법
본 기술분야에 알려진 유전자 조작 기술을 사용하여, 표1의 아미노산 서열을 대응하는 DNA 코딩 서열로 변환할 수 있다. 코딩된 단백질 서열은 변경되지 않으나, 유전자 코돈의 퇴화로 인해 변환된 DNA 서열은 완전히 동일하지 않을 수 있다.
항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는(예: 표1에 도시된 서열을 포함하는) 벡터는, 본 기술분야에 알려진 재조합 기술을 사용하여, 유전자 발현을 위해서 또는 클론(DNA 증폭)을 위해서 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체는 본 기술분야에 알려진 상동 재조합에 의해서 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여(예: 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여) 단리되고 서열화될 수 있다. 다양한 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음의 둘 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강자 서열, 프로모터(예: SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결자 서열.
일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 포유류 시스템, 박테리아 시스템 또는 효모 시스템 등을 포함하고, 플라스미드, 예를 들어, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pELpGEMEX, pGEX, pCLpCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2 등, 및 실험실로부터 또는 상업적으로 이용 가능한 다른 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노연관바이러스)를 포함할 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해서 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 본 개시내용에서 벡터 내의 DNA의 발현 또는 클로닝을 위해 적합한 숙주 세표는 상술된 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 본 개시내용에서 사용을 위한 적합한 원핵 세포는, 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아와 같은 진정세균, 예를 들어, 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클레비엘라, 프로테우스, 살모넬라(예: 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)), 세라티아(예: 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans)) 및 시겔라와 같은 장내세균, 뿐만 아니라, 고초균 및 해초 기생 균과 같은 바킬리, 녹농균과 같은 슈도모나스, 및 스트렙토마이세스를 포함한다.
원핵 세포뿐만 아니라, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 또한 항-OX40 항체를 코딩하는 벡터를 클론하거나 발현시키기 위해서 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 베이커 효모는 가장 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 그러나, 예를 들어, 분열효모(Schizosaccharomyces pombe); K. 라티스(lactis), K. 프라길리스(fragilis)(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(bulgaricus)(ATCC 16,045), K. 위커하미이(wickerhamii)(ATCC 24,178), K. 왈티티(waltii)(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(drosophilarum)(ATCC 36,906), K. 써모톨러란스(thermotolerans) 및 K. 마르크시아누스(marxianus)와 같은 클루이버로마이스(Kluyveromyces) 숙주; 야로이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코데르마 리이시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 쉬완니오마이스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 쉬완니오마이스(Schwanniomyces); 및 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 토리포클라디움(Tolypocladium), A. 니둘란스(nidulans) 및 A. 니걸(niger)와 같은 아스페르기루스(Aspergillus) 등 많은 다른 속, 종 및 균주가 본 개시 내용에서 이용 가능하고 적용 가능하다.
본원에서 제공되는 당화 항체 또는 항원-단편의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로 바이러스 균주 및 그의 변이체 및 대응하는 허용성 곤충 숙주 세포는, 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 애데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(과일 파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터 발견되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 특히 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 본 개시내용 중에서 사용될 수 있는, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 변이체는 공개적으로 이용가능하다. 면, 옥수수, 감자, 콩, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양액이 또한 숙주로서 활용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포는 가장 큰 관심을 끌었고, 척추동물 세포의 배양(조직 배양)은 루틴한 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포의 예로는 SV40 변형 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(293 or 293 cell subclones cultured in suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980)); 쥐 고환강하 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색원숭이 신장세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포(MDK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 쥐 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포 암종 라인(HepG2)이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 숙주는 293F 세포이다.
숙주 세포는, 항-OX40 항체를 생성할 수 있는 상술된 발현 또는 클로닝 벡터에 의해서 변형되고, 프로모터를 유발하거나, 변형된 세포를 선택하거나, 목표 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해서 적절하게 변경된 종래의 영양 배지 내에서 배양된다.
본 개시내용에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기 위해서 사용되는 숙주 세포는 본 기술분야에 알려진 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다. 배지는 또한 본 기술분야에서 알려진 적절한 농도로 임의의 다른 필요한 첨가물을 포함할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위한 숙주 세포의 선택을 위해서 이전에 사용되는 것들이고, 통상의 숙련된 기술자에게 명백하다.
재조합 기술이 사용되는 경우, 항체는 주변세포질 공간에서 세포 내적으로 생성되거나, 또는 배지 내에 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포 내적으로 생성되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미립자 잔해가 먼저, 예를 들어, 원심분리 또는 초음파 분해에 의해서 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167(1992)는 대장균(E. coli)의 주변세포질 공간 안으로 분비되는 항체를 분리하기 위한 절차를 설명한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐서 우라닐 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)의 존재 중에서 해동된다. 세포 잔해는 원심분리에 의해서 제거될 수 있다. 항체가 배지 안으로 분비되는 경우, 상업적으로 이용가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초미세여과 유닛을 사용하여, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액이 일반적으로 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 단백질분해를 억제하기 위해서 상술된 어느 단계에서 추가될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해서 추가될 수 있다.
세포로부터 마련된 항체는, 하이드록시라파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전, 염석 및 친화성 크로마토그래피와 같은 정제 방법을 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적절한지 여부는 항체의 유형 및 항체에 존재하는 임의의 면역 글로불린 항체 FC 도메인에 의존된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반하는 항체를 정제하기 위해서 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13(1983)). 단백질 G는 모든 쥐 아이소타입 및 인간 γ3에 대해서 적합하다(Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575(1986)). 아가로스는 가장 통상적으로 사용되는 친화성 리간드 부착 매트릭스이나, 다른 매트릭스가 또한 사용될 수 있다. 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌)벤젠과 같은 기계적으로 안정된 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동율 및 더 짧은 처리 시간을 달성할 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 레진(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이 정제를 위해서 사용될 수 있다. 얻어질 항체에 의존하여 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어, 이온 교환 컬럼에서 부분분리, 에탄올 침전, 역위상 HPLC, 실리카 겔 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지에 기초한 헤파린 세파로스 크로마토 그래피(예: 폴리아스파르트 산 컬럼), 크로마토 초점 맞춤, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 결정된다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 불순물을 포함하는 혼합물은 약 pH 2.5-4.5의 용출 완충액을 사용하여 저pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 받을 수 있으며, 이는 바람직하게는 저염분 농도에서 수행된다(예: 약 0-0.25M의 염분 농도).
키트
본 개시내용은 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 생물학적 샘플에서 OX40의 레벨 또는 존재를 검출하기 위해서 유용하다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 검출 가능한 라벨과 접합된 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 라벨되지 않은 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 라벨되지 않은 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있는 라벨된 제2 차의 항체를 더 포함한다. 키트는 사용에 관한 지시, 및 키트 내의 각 구성요소를 분리하는 패키지를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, ELISA 또는 면역 크로마토그래피 분석법과 같은 샌드위치 분석법을 위한 서브스트레이트 또는 장비와 연관된다. 적절한 서브스트레이트 또는 장비는, 예를 들어, 마이크로웰 플레이트 및 테스트 스트립일 수 있다.
약학적 조성물 및 치료 방법
본 개시내용은, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.
본원에서 개시되는 약학적 조성물에서 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장화제, 완충제, 산화방지제, 마취제, 현탁제/분산제, 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 무독성 보조 물질, 본 기술분야에 알려진 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
적합한 성분은, 예를 들어, 산화방지제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 방부제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는, 설탕과 시클로덱스트린과 같은 안정화제를 포함할 수있다. 적합한 산화방지제는, 예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 소듐 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸 메틸 메틸아니솔(methylxanisole), 부틸 하이드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수있다. 본원에 개시된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에서 메티오닌과 같은 하나 이상의 산화방지제를 포함하면 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 산화를 감소시킬 것이다. 산화의 감소는 결합 친화도의 감소를 방지하거나 감소시켜서 항체 안정성을 개선시키고 저장수명을 연장시킬 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 조성물은 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 산화방지제, 예컨대 메티오닌을 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 메티오닌과 같은 하나 이상의 산화방지제와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 산화를 방지하고, 보관 수명을 연장시키고, 그리고/또는 활성을 향상시키기 위한 다양한 방법이 더 제공된다.
또한, 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 염화나트륨 주사제, 링거액 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제, 또는 글루코스 및 링거젖산액 주사제와 같은 수성 비이클, 식물 유래 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유와 같은 비수성 비이클, 정균성 또는 정진균성 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 포도당과 같은 등장화제, 인산 또는 시트레이트 완충액과 같은 완충액, 황산수소나트륨과 같은 산화방지제, 프로카인 히드로클로라이드와 같은 국소마취제, 현탁제 및 분산제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈, 폴리소르베이트 80(TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸 에테르)-테트라 아세트산)와 같은 킬레이트제, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함할 수 있다. 담체로서 항균제는 다회 투여 용기 내의 약학적 조성물에 첨가될 수 있으며, 페놀 또는 크레졸, 수은 제제, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 파라벤, 티이메로살, 염화 벤잘코늄 및 염화 벤제토늄을 포함한다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 염류용액, 포도당, 글리세롤 또는 에탄올을 포함 할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은, 예를 들어, 유화제, pH 완충제, 안정화제, 가용화제 또는 아세트산 나트륨, 소르비탄 라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 또는 시클로덱스트린을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유제, 환제, 캡슐, 정제, 서방성 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 폴리 비닐 피롤리돈, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 주사용 조성물로 제제된다. 주사가능한 약학적 조성물은 임의의 통상적 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 유화제 또는 액체 용액, 현탁액 또는 유화제를 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사 제제는 사용 준비가 된 멸균 및/또는 발열원이 없는 용액, 사용 전에 용매와 결합될 준비가 된 멸균 건조 가용성 물질, 예를 들어, 피하 정제를 포함한 동결 건조된(lyophilized) 분말, 주사 준비가 된 멸균 현탁액, 사용 전 비이클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/또는 발열원이없는 에멀젼을 포함할 수 있다. 용매는 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 실시형태에서, 단위 투여량 주사 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 달린 주사기에 포장된다. 주사 투여를 위한 모든 제제가 멸균되고 발열원이 없어야한다는 점은 본 기술분야에 알려져 있다.
특정 실시형태에서, 멸균, 동결 건조된 분말은 본원에서 개시된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 용매에서 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 용매는 분말의 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성을 개선하거나 분말 또는 재구성된 용액을 개선시킬 수 있는 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 적절한 부형제는 물, 포도당, 소르비톨(sorbital), 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 포도당, 수크로스 또는 다른 적합한 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용매는 완충액, 예컨대 시트레이트 완충액, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨 완충액, 또는 당업자에게 알려진 다른 이러한 완충액을 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 완충액의 pH는 중성이다. 본 기술분야에서 숙련된 자에게 알려진 표준 조건 하에서의 동결 건조가 뒤따르는 용액의 후속 멸균 여과는 바람직한 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 결과적인 용액은 동결 건조를 위해서 바이알 안으로 분배된다. 각각의 바이알은 단일 투여량 또는 다수 투여량의 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 각 바이알의 충전량은 정확한 샘플링 및 정확한 투여를 보장하기 위해 각 투여량 또는 다수 투여량에 필요한 것보다 약간 더 높을(예를 들어, 10% 과다투여) 수 있다. 동결 건조된 분말은 약 4℃내지 실온의 범위와 같은 적절한 조건하에 저장될 수 있다.
동결 건조된 분말을 주사를 위해 물로 재구성함으로써 주사용 제제가 제공된다. 일 실시형태에서, 동결 건조된 분말은 멸균 및 무발열원 물 또는 재구성을 위한 다른 적합한 액체 담체에 첨가 될 수있다. 정확한 양은 선택된 치료에 의해 결정될 수 있고, 경험적으로 결정될 수 있다.
치료학적 유효량의 본원에 설명된 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써, OX40과 관련된 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 치료 방법이 또한 제공된다. 다른 양태에서, 또한, 상향 조절된(up-regulated) 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료학적 유효량의 본원에 설명된 항-OX40 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 제공되는 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료학적 유효량은, 투여 경로 및 종양 발생 정도뿐만 아니라, 대상체의 체중, 연령, 과거 병력, 현재 치료, 건강 상태 및 교차 감염 가능성, 알레르기, 과민성 및 부작용과 같은, 본 기술분야에 알려진 다양한 요인에 의존할 것이다. 본 기술분야에소 숙련된 자(예를 들어, 의사 또는 수의사)는 이 조건 또는 다른 조건 또는 요건에 따라 비례적으로 투여량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 치료 유효 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 특정 실시형태에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 용량은 다수의 간격으로, 예를 들어, 하루에 한 번, 하루에 두 번 이상, 한 달에 두 번 이상, 일주일에 한 번, 2 주에 한 번, 3 주에 한 번, 한 달에 한 번, 두 달에 한 번 또는 세 달 이상에 한 번 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 투여량은 치료 과정에 걸쳐서 변경될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 처음 투여량은 후속 투여량보다 많을 수 있다. 특정 실시형태에서, 투여량은 대상자의 반응에 의존하여 치료 과정에 걸쳐서 조정될 수 있다.
투약 처방은 최적 반응(예: 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 투여는 단일 용량으로 또는 두 기간에 걸쳐 다수 분할 용량으로 수행된다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은, 주사(예를 들어, 피하 주사, 복강 내 주사, 정맥 내 주입(infusion)을 포함한 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 또는 피내 주사)에 의해 투여되거나, 또는 비주사 루트(예를 들어, 경구 투여, 코 투여, 설하 투여, 직장 투여 또는 국소 투여)에 의해 투여되는 것과 같이, 본 기술분야에 알려진 임의의 투여 루트에 의해 투여될 수 있다.
OX40와 연관된 상태 및 장애는 면역 관련 질병 또는 장애일 수 있다. 특정 실시형태에서, OX40과 연관된 상태 및 장애는 종양 및 암, 예를 들어, 비소 세포 폐암, 소세포 폐암, 신장암, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁 경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 진균증 곰팡이, 메르켈 세포암 및 다른 혈액학적 악성 종양, 예를 들어 고전적 호지킨 림프종(CHL), 원발 가슴세로칸 큰 B-세포 림프종, T- 세포/조직구-풍부한 B-세포 림프종, EBV-양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 연관 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질 모세포 림프종, 림프절외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 연관 원발 삼출 림프종, 호지킨 림프종, 중추 신경계(CNS) 신생물, 예컨대 원발 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌줄기 신경아교증을 포함한다. 특정 실시형태에서, 종양 및 암은 전이성, 특히 OX40을 발현하는 전이성 종양이다. 특정 실시형태에서, OX40과 관련된 상태 및 장애는 만성 바이러스 감염, 예를 들어, B 형 간염(HBV), C 형 간염(HCV), 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, HIV, 거대 세포 바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 I 및 단순 포진 바이러스 유형 2, 인체 유두종 바이러스, 아데노 바이러스, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 유행, 얇은 고리 바이러스(Torquetenovirus), JC 바이러스 또는 BK 바이러스의 바이러스 감염을 포함한다.
사용 방법
본 개시내용은 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 방법을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상자에서 OX40과 관련된 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 설명된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 OX40 작용제에 반응할 것으로 보이는 장애 또는 상태를 갖고 있는 것으로 식별된다.
표적 생물학적 조직에서 OX40의 존재 및 레벨은 생물학적 샘플이 유래된 개체가 OX40 작용제에 반응할 수 있을지 여부를 나타낼 수 있다. 개체로부터의 시험될 생물학적 샘플에서 OX40의 존재 또는 레벨을 결정하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 생물학적 샘플은, 발현된 OX40 단백질에 결합되고 발현된 OX40 단백질을 검출하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험될 샘플은 암 세포 또는 조직, 또는 종양에 들어가는 면역 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 시험될 생물학적 샘플에서의 OX40의 존재 또는 상향 조절 레벨은 반응 가능성을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상향 조절"은, 본원에 설명된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 검출될 샘플에서의 OX40 단백질 레벨이, 동일한 항체를 사용하여 측정된 기준 샘플에서의 OX40 단백질 레벨과 비교하여, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 이상만큼이나 전체적으로 증가한 것을 가리킨다. 기준 샘플은 건강한 또는 질병이 없는 개체로부터 얻어진 대조군 샘플, 또는 시험 될 샘플이 얻어진 동일한 개체로부터 얻어진 건강한 또는 질병이 없는 샘플일 수 있다. 예를 들어, 기준 샘플은 검사될 샘플(예: 종양)에 인접하거나 근처에 있는 질병이 없는 샘플일 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료법 또는 물질과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 화학 요법, 방사선 요법, 암 치료 수술(예: 종양절제술), 하나 이상의 항구토제 또는 화학 요법으로부터 발생되는 합병증에 대한 다른 치료, 또는 임의의 다른 암 치료 물질 또는 OX40에 의해 매개되는 장애의 치료제와 합동하여 투여될 수 있다. 특정의 이러한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은, 하나 이상의 치료 물질과 합동하여 사용되는 경우, 하나 이상의 치료 물질과 동시에 투여 될 수 있고, 특정의 이러한 실시형태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 동일한 약학적 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 그러나, 다른 치료 물질과 "합동하여" 투여되는 항체 및 항원 결합 단편은 치료 물질과 동시에 또는 치료 물질과 동일한 조성물로 투여될 필요는 없다. 본 개시내용에서 사용되는 바와 같이, 용어 "합동하여"의 의미는, 다른 치료 물질 전 또는 후에 투여된 항체 또는 항원 결합 단편이, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 제2 물질이 상이한 루트를 통해서 투여된다고 하더라도, 이 치료 물질과 "합동하여" 투여된 것으로 간주된다는 것을 또한 의미한다. 가능한 경우, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 합동하여 투여되는 추가적인 치료 물질은 추가적인 치료 물질에 대한 지시에 열거된 스케쥴에 따라서, 또는 미국 의사 처방집(Physicians' Desk Reference) 2003(Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002))에 따라서, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 프로토콜(protocol)을 따라서 투여된다.
특정 실시형태에서, 치료 물질은 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시킬 수있다. 예를 들어, 종양 백신은 특정 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도하기 위해서 사용될 수 있다. 사이토카인 치료는 면역계에 대한 종양 항원의 제공을 향상시키기 위해 사용될 수있다. 사이토카인 치료법의 예는 인터페론 -α, -β 및 γ와 같은 인터페론, 대식세포 CSF, 과립구 대식세포 CSF 및 과립구 CSF와 같은 콜로니 자극 인자, 및 IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, 및 IL-12 와 같은 인터류킨, TNF-α 및 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. PD-L1/PD-1 항체, TGF-β 억제제, IL-10 억제제 및 Fas 리간드 억제제와 같은 면역억제 표적을 불활성화하는 물질이 또한 사용될 수 있다. 다른 그룹의 물질은 종양 또는 암 세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 것, 예를 들어, T 세포 활성화를 증가시키는 것(예를 들어, ICOS, CTLA-4와 같은 T 세포 공자극 분자의 작용제) 및 수지상 세포 기능 및 항원 제시를 증가시키는 것을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 OX40 작용제로 치료되는 대상체에서 치료 반응 또는 질병 진행을 모니터링하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원에 설명된 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 대상체로부터의 시험될 생물학적 샘플에서 OX40의 존재 또는 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 시험될 생물학적 샘플에서의 OX40 레벨을 동일한 대상체로부터 이전에 얻어진 비교 가능한 샘플에서의 OX40 레벨과 비교하는 단계를 더 포함하며, 여기서 시험될 생물학적 샘플에서의 OX40 레벨 증가가 감소하거나 또는 느려지거나 멈추는 것은 긍정적인 치료 반응 또는 통제된 질병 진행을 나타낸다. 비교 가능한 샘플은 시험될 샘플과 동일한 유형의 샘플일 수 있지만, 처리 전 또는 처리의 초기 단계에서 동일한 개체로부터 얻어진다.
이하의 실시예는 본 발명을 더 잘 도해하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 아래에 설명되는 모든 특정 조성물, 물질 및 방법은, 전체적으로 또는 부분적으로, 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 특정 조성물, 물질 및 방법은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라, 특정 실시형태가 본 발명의 범주 내에 있음을 단지 예시하기 위한 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 자는 창의적 단계를 추가하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 균등한 조성물, 물질 및 방법을 개발할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 대한 다양한 변경이 여전히 본 발명의 범위에 포함될 수 있음이 이해될 것이다. 발명자는 이러한 변경을 본 개시내용의 범위 내에 포함시키고자 한다.
실시예 1: 항-인간 OX40 활성화 모노클로날 항체의 획득
본 개시내용의 발명자는 OX40을 과발현하는 CHO 세포 라인을 구성하였고, 이를 쥐를 면역화시키고 하이브리도머 세포 융합을 수행하기 위해서 사용하였다. 항원-항체 결합 분석 및 세포 기능 스크리닝을 통해, 더 강한 ELISA 결합 활성 및 OX40 활성화 기능을 갖는 일련의 쥐-유래 항체가 얻어졌다. 각 항체의 가변 영역 VH 및 VL의 서열이 시퀀싱에 의해 얻어졌고, 인간-쥐 키메라 항체가 설계되고 그에 따라 발현되었으며, 여기서 중쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11 중 하나 이상으로부터 선택되고, 경쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 및 SEQ ID NO: 14 중 하나 이상으로부터 선택된다.
좀 더 바람직하게는, 중쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11이다. 경쇄 상보성 결정 영역은, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8; 또는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역은 각각 표 1에 제시된다.
a. 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나;
b. 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나;
c. 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나;
d. 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나;
e. 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11을 포함하고, 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14를 포함한다.
구체적으로, 실시예 1에서, 본 발명자는 OX40을 과발현하는 CHO 세포 라인을 구성하였고, 이를 쥐를 면역화하고 SP2/0-AG14 세포 라인과 하이브리도머 세포 융합을 수행하기 위해서 사용하였다. 항원-항체 결합 분석 및 세포 기능 스크리닝을 통해, 더 강한 ELISA 결합 활성 및 OX40 활성화 기능을 갖는 일련의 쥐 항체가 얻어졌다. 각 항체의 가변 영역 VH 및 VL의 서열은 시퀀싱에 의해 얻어졌고, MT01-L1 및 MT01-L2를 포함하는 인간-마우스 키메라 항체가 설계되고 이에 따라 발현되었다.
항체 안정성을 향상시키고 항체의 순도 및 활성에 대한 가능한 산화 및 이성질체 화의 영향을 감소시키기 위해, 항체의 중쇄 및 경쇄 V 영역에서 잠재적 불안정성을 갖는 특이적 부위에 돌연변이가 만들어졌다. 예를 들어, MT01-L1의 중쇄에서 아미노산 57은 글리신으로부터 알라닌으로 돌연변이되었고, MT01-L1의 경쇄에서 아미노산 96은 트립토판으로부터 페닐알라닌으로 돌연변이되었다. 결과적인 돌연변이 항체는 MT01-L1(M1), MT01-L1(M2) 및 MT01-L1(M1/M2)이다.
항체의 ADCC 및 CDC 활성을 제거하기 위해, 항체 중쇄의 인간 IgG1 서브타입이 인간 IgG2로 교체하였고, 키메라 항체 MT01-L1(G2)로 귀결되었다.
MT01-L1 및 MT01-L1(G2)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인간화한 후, 인간화된 항체 MT01-C1 및 MT01-C1(G2)가 얻어졌다.
실시예 2: 항체의 제조
융합 단백질의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA 서열이 포유동물 세포 발현 벡터pcDNA3.4에 각각 클로닝되었다. 2 : 1 몰비의 중쇄 발현 플라스미드 및 경쇄 발현 플라스미드가 리포펙타민 2000 형질감염 시약(Invitrogen)으로 HEK293 세포에 형질감염되었고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 7 일동안 배양되었다. 배양 상청액이 수집되었고, 상청액 중의 항체가 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제되었다. 정제된 항체는 PBS 용액에서 투석되고 동결 건조에 의해서 농축된 후 -20℃에서 저장되었다.
실시예 3: ELISA 결합 분석
1 ㎍/mL 농도를 갖는 단백질 용액으로 100 ㎕/웰로 96-웰 고친화도 플레이트가 코팅되었고, 4℃에서 하룻 밤 동안 진탕되었다. 다음날, 300 μL PBST(Tween 20 : 0.5 ‰)로 3 회 세척되었고, 다음으로 2시간 동안 5% BSA/PBS에 의해서 100 μL/웰로 블록킹되고, 실온에서 진탕되었다. 300 μL PBST로 3 회 세척 후, PBS로 샘플의 그래디언트 희석물을 준비하였으며, 이는 96-웰 플레이트에 100 μL/웰로 첨가되었고, 실온에서 1 시간 동안 진탕되었고, 300 μL PBST로 3 회 세척되었다. 제2 차의 항체 염소 항-인간 IgG HRP 용액이 준비되었으며, 이는 96-웰 플레이트에 100 μL/웰로 첨가되었고, 실온에서 1 시간 동안 진탕되었다. 300 μL PBST로 4 번 세척한 후, 100μL/웰로 TMB이 추가되었고, 20분 동안 색상이 현상되었다. 0.6N H2SO4이 100μL/웰로 추가되어 현상을 중단하고, OD450nm가 측정되었다.
측정 결과는 도 1에 도시된다. 인간-쥐 키메라 항체 MT01-L1 및 MT01-L2에 대한 ELISA 결합의 EC50 값은 각각 290.7 ng/mL 및 208.5 ng/mL였다.
실시예 4: CHO-hOX40과의 결합
OX40 항체 그래디언트는 PBS로 생성되었고, 10X 최종 농도의 저장 용액이 준비되었다. CHO-hOX40 세포가 수집되고, PBS로 1회 세척되고, 카운팅되고, 2 Х 106 cells/ml의 세포 현탁액으로 희석되었다. 10 μl의 OX40 항체 저장 용액이 100 μl의 세포 현탁액 안에 첨가되었고, 30분 동안 4℃의 어두운 곳에서 배양되었다. PBS로 2회 세척된 후, 제2 차의 항체가 첨가되었고, 30분 동안 4℃의 어두운 곳에서 배양되었다. PBS로 1차 세척된 후, 세포는 400 μl FACS 완충액에 현탁시키고 장비에서 측정되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 결과는 MT01-L1 및 MT01-L2가 인간 OX40에 결합되었고, 이들의 EC50 값이 각각 1.22 μg/mL 및 2.42 μg/mL이었다는 점을 보인다.
유사하게, 본 개시내용의 발명자는 쥐 OX40을 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 결합을 측정하였다. 도 3에 있는 결합 분석의 결과를 참조하면, MT01-L1 및 MT01-L2가 모두 쥐 OX40에 결합되지 않았음이 발견되었다.
실시예 5: OX40 신호전달 경로의 활성화 분석
본 개시내용의 발명자는 OX40 활성화 항체의 기능을 식별하기 위한 세포 분석 시스템을 구성하였다. 구체적으로, 본 개시내용의 발명자는 Jurkat-OX40-NFκB-루시퍼라제 리포터에 의해 안정적으로 형질감염된 세포 라인을 구성하였다. OX40 활성화 항체가 안정한 형질감염된 세포 라인 및 FcR을 과발현하는 HEK293 세포와 혼합될 때, OX40 항체는 NFκB-루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다.
OX40 항체 그래디언트는 PBS로 생성되었고, 2X 최종 농도의 저장 용액이 얼음 위에 준비되었다. FcR을 과발현하는 Jurkat-NFkB-luc-OX40 세포 및 HEK293 세포가 수집되고, 원심 분리되고 배지에서 재현탁되었다. OX40 Abs 및 적절한 양의 세포 현탁액이 384-웰 플레이트에 첨가되었다. 5시간 배양 후, One-Glo (Promega) 검출 시약이 첨가되었다. 철저히 혼합한 후, Pherastar가 형광 신호를 검출하기 위해서 사용되었다.
도 4의 (a)에 도시된 바와 같이, NF
Figure pct00002
B-루시퍼라제 리포터 유전자의 활성화에 대한 상술된 분석 시스템에서 MT01-L1, MT01-L1 (G2), MT01-L2 및 MT01-L2 (G2)의 측정된 EC50 값은 각각 39.1, 14.9, 84.1 및 117.9 ng/mL이었다.
도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, NF
Figure pct00003
B-루시퍼라제 리포터 유전자의 활성화에 대한 상술된 분석 시스템에서 MT01-L1, MT01-L1(M1), MT01-L1(M2) 및 MT01-L1(M1/M2)의 측정된 EC50 값은 각각 57.35, 64.52, 59.95 및 127.9 ng/mL이었다.
실시예 6: OX-40L과의 경합분석
OX40L은 10X 최종 농도의 저장 용액을 준비하기 위해서 PBS로 희석되었고, OX40 정제 항체 그래디언트는 PBS로 생성되었고, 2X 최종 농도의 저장 용액이 얼음 위에서 준비되었다. Jurkat-NFkB-luc-OX40 세포는 수집되었고, 세포 현탁액을 제조하기 위해서 배지에서 재현탁되었다. OX40 Abs, 세포 현탁액 및 OX40L이 384-웰 플레이트 안에 첨가되었다. 5시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터 내에서 배양 후, One-Glo (Promega) 시약이 첨가되었다. 철저히 혼합한 후, Pherastar가 형광 신호를 측정하기 위해서 사용되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 결과는 MT01-L1 및 MT01-L2가 각각 0.686 μg/mL 및 1.59 μg/mL의 IC50로 Jurkat 세포에서 NFkB 신호 전달 경로의 OX40L-유도 활성화를 억제하였음을 보여준다.
실시예 7: ADCC 분석
CHO-OX40-luc는 96-웰 편평한 바닥 플레이트 상에 확산되었고, 하룻 밤 동안 배양되었다; 다음날, 1640 배지를 사용하여 OX40 Ab 그래디언트 희석액이 제조되고, 96- 웰 편평한 바닥 플레이트에 첨가되었다. 인간 PBMC를 첨가하고 48 시간 동안 함께 배양한 후, 상청액이 원심분리에 의해서 수집되고 Cyto-Tox Glo 키트로 분석되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 결과는 키메라 항체 MT01-L1 및 MT01-L2가 1 μg/mL 초과의 농도에서 유의한 ADCC 효과를 갖는 점을 보여준다.
실시예 8: OX40 항체에 의한 제1 차의 Th 세포 증식 촉진
CD4+ 세포는 건강한 지원자의 혈액으로부터 단리되었고, 2일 동안 PHA/IL-2를 함유하는 1640 완전 배지에서 배양되었다. 고친화력 96-웰 원형 바닥 판은 OKT3 (0.1 μg/웰) 및 연속적으로 희석된 OX40 항체 또는 대조 IgG로 코팅되었다. 둘째 날, 웰 플레이트는 PBS로 2 회 세척되었고, 전-처리된 CD4+ 세포는, 웰당 50,000개의 세포로 항체에 의해서 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가되었다. 7일 동안의 후속 배양 후, 세포 증식이 CCK8 키트로 검출되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 분석 결과는 OKT3 항체의 존재 하에서, OX40 항체가 CD4 Th 세포의 증식을 용량 의존적 방식으로 촉진할 수 있음을 보여준다. 실험에서, 1500 ng/mL의 최고 농도의 OX40 항체만이 추가되는 CD4+ 세포에 관하여, 생존력이 분석법으로 측정되었고 이를 기초로 데이터가 표준화되었다.
실시예 9: 동물에서 키메라 항체의 약역학 연구
쥐 결장암 세포는 취당 106개 세포의 양으로 OX40 인간화된 쥐(OX40 세포외 세그먼트는 인간 OX40 세포외 세그먼트 서열로 교체되었다) 안으로 피하에 접종되었다. 종양이 약 100 mm3으로 성장한 후, OX40 항체 또는 IgG1 대조군 (10 mg/kg)을 3 일마다 1 회 정맥내 투여하여 총 4 회 투여하였다. 투여 시작으로부터 13 일 후, 도 8의 (a) 및 도 8의 (b)에 도시 된 바와 같이, MT01-L1은 대조군과 비교하여 매우 유의한 효험을 가졌다. 동일한 투여량 요법 하에서, MT01-L2의 효험이 통계적으로 유의미한 차이에 도달하지는 않았지만, 또한 효험에서 명확한 경향을 보여주었다.
실시예 10: 인간화 항체의 활성
인간화 항체 MT01-C1 및 MT01-C1(G2)은 키메라 항체의 CDR 그래프팅 및 아미노산 역 돌연변이를 통해서 얻어졌다.
인간화 항체 및 인간 OX 항원 단백질의 체외 결합 분석이 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행도었다. 결과는 인간화 항체 및 인간 OX40 단백질에 대한 ELISA 결합의 EC50 값이 각각 0.345 μg/mL 및 0.390 μg/mL임을 보여준다.
인간화 항체의 체회 활성 분석이 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 Jurkat-OX40-NFκB-루시퍼라제 리포터에 의해서 안정되게 형질감염된 세포주에서 MT01-C1 및 MT01-C1(G2)에 대한 활성화의 EC50 값이 각각 0.028 및 0.0434 μg/mL임을 보여준다(도 9의 (b)).
동물에서 인간화 항체의 약역학적 연구는 실시예 8에서와 같이 수행되었지만, 항체 투여 모드는 15 mg/kg의 단일 투여로 변경되었다. 결과는 투여 17 일 후, 종양 부피에 대한 MT01-C1 및 MT01-C1 (G2)의 억제율이 각각 79% 및 66%에 도달함을 보여준다(도 9의 (c)).
실시예 11: 쥐 및 시노몰구스 원숭이에서 인간화 항체의 PK 특성
쥐의 PK 실험에서, 각 항체는 5 mg/kg의 복용량으로 C56BL6 암컷 쥐(각 그룹에 6 마리의 쥐)에 정맥내 주사되었다. 투여 후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 192 시간 및 312 시간 후, 100 μL의 혈액 샘플이 각 시점에서 각 그룹의 3 마리 쥐로부터 수집되었다. 4°C에서 2-3 시간 동안 방치된 후, 혈액 샘플은 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 혈청이 수집되고 -80°C에서 ELISA 분석을 위해서 저장되었다.
혈청에서 항체 농도를 측정하기 위해, 고친화력 마이크로플레이트가 인간 OX40 항원으로 코팅되었다. 쥐 혈청 샘플이 희석 완충액에서 1 : 100으로 희석되었고, 다음으로 웰에 첨가되었다. C57BL6 쥐 혈청 중의 MT01-C1 및 MT01-C1 (G2)가 마이크로 플레이트에 코팅된 인간 OX40-6his에 결합되었고, 결합되지 않은 드러그는 세척 단계 동안 세척되었다. 호스래디시 페록시다제(HRP)로 라벨링된 당나귀 항-인간 IgG를 첨가되었고, 항원-항체 복합체에 결합되었다. 세척 후, HRP 효소 서브스트레이트(TMB)가 첨가되어 색반응을 일으켰고, 색의 깊이는 테스트될 항체의 농도에 비례한다. 반응이 1M H2SO4에 의해 종료 된 후, OD 값이 마이크로 플레이트 판독기에 의해서 판독되었고, 검출 파장은 450nm이고, 기준 파장은 620nm였다. 샘플 표준 곡선과 OD450nm 판독값을 비교하여 생물학적 샘플에서 테스트될 항체의 농도가 계산되었다.
측정 결과는 MT01-C1 및 MT01-C1 (G2)의 Cmax가 각각 125.7 μg/mL 및 107.2 μg/mL이고, t1/2가 각각 265 hrs 및 321 hrs인 것을 보인다(도 10의 (a)).
시노몰구스 원숭이의 PK 실험에서, 각 항체는 수컷 시노몰구스 원숭이(각 그룹에 3 마리의 원숭이)에게 1.5 mg/kg의 복용량으로 정맥내 주사되었다. 투여 48시간 전, 투여 후 15분, 30분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 168 시간, 240 시간, 336 시간 및 504 시간 후, 각 시점에서 100 μL의 혈액 샘플이 수집되었다. 4°C에서 2-3 시간 동안 방치된 후, 혈액 샘플은 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 혈청이 수집되고 -80°C에서 ELISA 분석을 위해서 저장되었다.
혈청에서 항체 농도를 측정하기 위해, 고친화력 마이크로플레이트가 인간 OX40 항원으로 코팅되었다. 시노몰구스 원숭이 혈청 샘플이 희석 완충액에서 1 : 100으로 희석되었고, 웰에 첨가되었다. 시노몰구스 원숭이 혈청 중의 MT01-C1 및 MT01-C1 (G2)가 마이크로 플레이트에 코팅된 인간 OX40-6his에 결합되었고, 결합되지 않은 드러그는 세척 단계 동안 세척되었다. 호스래디시 페록시다제(HRP)로 라벨링된 당나귀 항-인간 IgG를 첨가되었고, 항원-항체 복합체에 결합되었다. 세척 후, HRP 효소 서브스트레이트(TMB)가 첨가되어 색반응을 일으켰고, 색의 깊이는 테스트될 항체의 농도에 비례한다. 반응이 1M H2SO4에 의해 종료 된 후, OD 값이 마이크로 플레이트 판독기에 의해서 판독되었고, 검출 파장은 450nm이고, 기준 파장은 620nm였다. 샘플 표준 곡선과 OD450nm 판독값을 비교하여 생물학적 샘플에서 테스트될 항체의 농도가 계산되었다.
측정 결과는 시노몰구스 원숭이에 1.5 mg/kg의 정맥내 주사 후, 종말 단계 제거 t1/2는 121.307 ± 66.853 hr이고, Cmax는 42.619 ± 3.464 μg/mL이었다는 점을 보인다(도 10의 (b)).
위 설명은 단지 본 개시내용의 바람직한 실시예이고, 본 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 역할을 하지 않는다. 본 개시내용과 관련된 기술 분야에서 숙련된 사람은, 본 개시내용의 기술적 해결책의 범위를 벗어나지 않으면서, 본원에서 개시되는 기술적 해결책 및 기술적 내용의 균등한 치환 또는 변경을 행할 수 있으며, 이는 본 개시내용의 기술적 해결책으로부터 벗어나지 않는 내용에 속하고, 본 개시내용의 범위 내에 여전히 해당된다.
<110> NANJING UMAB-BIOPHARMA CO., LTD. <120> ISOLATED ANTIBODY OR ANTIGEN BINDING FRAGMENT THEREOF AND USE OF SAME IN TUMOR TREATMENT <130> EIC18310018P-KR <150> CN 201711476160.3 <151> 2017-12-29 <160> 33 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 2 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly Lys Ala <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 3 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 5 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 6 Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 7 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 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Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 449 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 32 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 33 <211> 445 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (23)

  1. 단리된 항체(isolated antibody) 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementary determining region) 및 경쇄 상보성 결정 영역(light chain complementary determining region)을 포함하되,
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 다음 서열: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11 중 하나 이상으로부터 선택되는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은:
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3;
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 3; 또는
    SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및/또는 SEQ ID NO: 11인,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 경쇄 상보성 결정 영역은 다음 서열: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14 중 하나 이상으로부터 선택되는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 경쇄 상보성 결정 영역은:
    SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 6;
    SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및/또는 SEQ ID NO: 8; 또는
    SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14인,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나;
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하거나;
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나;
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 8을 포함하거나;
    상기 중쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14를 포함하는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)은 다음 서열: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 29로 대체되는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역(light chain variable region)은 다음 서열: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 30으로 대체되는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제6항또는 제7항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16을 포함하거나;
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16을 포함하거나;
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18을 포함하거나;
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18을 포함하거나;
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 19를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함하는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 모노클로날 항체(humanized monoclonal antibody)또는 완전 인간 모노클로날 항체(fully human monoclonal antibody)인,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    캐멀화(camelized) 단일 도메인 항체, 이작용성 항체, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, dsFv2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F (ab')2, ds 이작용성 항체, 나노바디, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체인,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에있어서,
    인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 단백질의 불변 영역(constant region)을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역을 더 포함하는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체(conjugate)를 더 포함하는,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 단리된 폴리뉴클레오티드에 있어서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는,
    단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 벡터(vector)에 있어서,
    제13항에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
    벡터.
  15. 숙주세포에 있어서,
    제14항에 따른 상기 벡터를 포함하는,
    숙주세포.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위한 방법에 있어서,
    제13항에 따른 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 조건 하에서 제15항에 따른 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    방법.
  17. 키트에 있어서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는,
    키트.
  18. 약학적 조성물에 있어서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는,
    약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 있어서,
    인간 또는 원숭이 OX40의 존재 또는 레벨의 검출에서의,
    용도.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 있어서,
    OX40 작용제(agonist)에 반응하는, 장애 또는 상태를 앓고 있는 개체의 검출 및 식별에서의,
    용도.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 있어서,
    OX40 작용제 치료 동안의, 치료 반응 또는 장애 진행의 모니터링에서의,
    용도.
  22. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 있어서,
    상향 조절된(up-regulated) 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태의 치료를 위한 약물의 제조에서의,
    용도.
  23. 제22항에있어서,
    상기 상태가 암 또는 만성 바이러스 감염인,
    용도.
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