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KR20200037781A - 면역자극 융합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

면역자극 융합 분자 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200037781A
KR20200037781A KR1020207003059A KR20207003059A KR20200037781A KR 20200037781 A KR20200037781 A KR 20200037781A KR 1020207003059 A KR1020207003059 A KR 1020207003059A KR 20207003059 A KR20207003059 A KR 20207003059A KR 20200037781 A KR20200037781 A KR 20200037781A
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KR
South Korea
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cells
seq
amino acid
molecule
antibody
Prior art date
Application number
KR1020207003059A
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토마스 엘 앤드리슨
대관 장
더글라스 에스 존스
제시 라이온스
조나단 디 나도지
울리크 비 닐슨
Original Assignee
토크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

면역 세포 표적화 모이어티 및 시토카인 분자를 포함하는 면역자극 융합 분자, 이의 약제 및 제형, 및 이를 사용 및 제조하는 방법이 개시되어 있다.

Description

면역자극 융합 분자 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/528,411, 2017년 12월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/598,433, 2018년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/620,418, 2018년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/620,107 및 2018년 4월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/657,455에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
EFS-Web을 통해 제출된, 2018년 7월 3일에 생성되고 크기가 231,504 바이트인 "174285_010800_sequence.txt"라는 제목의 ASCII 텍스트 파일은 이에 의해 전부 참조로 포함된다.
분야
본 개시는 일반적으로 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하도록 조작된 면역자극 융합 분자에 관한 것이다. 이를 제조 및 사용하는 방법도 제공된다.
시토카인은 면역계의 조절에 참여한다. 암 요법에 사용되는 경우, 시토카인은 항종양 효과를 갖고 일부 유형의 종양에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 면역조정제로서 작용할 수 있다. 그러나, 신속한 혈액 제거 및 종양 특이성 결여는 종양 부위 및 다른 관련 조직(예컨대, 림프절 및 비장)에서 면역 반응을 활성화시키거나 항종양 효과를 갖기에 충분한 시토카인 농도를 달성하기 위해 높은 용량의 시토카인의 전신 투여를 필요로 한다. 이러한 높은 수준의 전신 시토카인은 심각한 독성 및 유해 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 개선된 특성을 갖는, 예컨대 더 큰 치료 효과 및 이들 제품의 부작용(예컨대, 독성, 비종양 세포의 파괴 등)의 수 및 중증도의 감소를 갖는 시토카인 조성물에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시는 특히 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하는 면역자극 융합 분자(IFM; "테더링된 융합물(tethered fusion)"과 상호교환적으로 사용됨)를 제공한다.
일 측면에서,
(a) 면역자극 시토카인 분자; 및
(b) 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 친화성을 갖는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하고,
면역자극 시토카인 분자가 항원 결합 단편에 작동적으로 연결되는 것인, 면역자극 융합 분자가 제공된다.
다른 측면에서,
(a) 면역자극 시토카인 분자; 및
(b) 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 항체를 포함하는 면역 세포 표적화 모이어티로서, 항체가 C-말단 및 N-말단을 갖는 경쇄, 및 C-말단 및 N-말단을 갖는 중쇄를 포함하고, 경쇄가 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 것인, 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하고,
면역자극 시토카인 분자가 경쇄의 C-말단, 경쇄의 N-말단, 또는 중쇄 부분의 N-말단에서 항체에 작동적으로 연결되는 것인, 면역자극 융합 분자가 제공된다.
다른 측면에서,
(a) IL-12 분자; 및
(b) CD45 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 Fab 단편을 포함하는 T 세포 표적화 모이어티
를 포함하고,
Fab 단편 및 IL-12 분자가 융합 분자로서 함께 작동적으로 연결되는 것인, 면역자극 융합 분자가 제공된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 이펙터 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CTL로부터 선택되는 T 세포를 표적한다. 일부 실시양태에서, 항원은 T 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 CD45 수용체이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 항-CD45 항체 BC8, 4B2, GAP8.3 또는 9.4의 Fab 단편, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 인간화된 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역자극 시토카인 분자는 IL-12, 단일쇄 IL-12, IL-12의 서브유닛, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체 형태를 포함한다. 면역자극 융합 분자는 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 친화성을 갖는 단일쇄 Fv를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로 단일쇄 Fv는 항원 결합 단편과 동일한 항원에 대해 친화성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 Fv는 항원 결합 단편과 상이한 항원에 대해 친화성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은, 임의적으로 디술파이드 결합에 의해 임의적으로 연결되는 경쇄 및 중쇄 단편을 포함하는, Fab 단편이며, 면역자극 시토카인 분자는 경쇄의 C-말단, 경쇄의 N-말단, 중쇄 단편의 C-말단, 또는 중쇄 단편의 N-말단에서 Fab 단편에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 면역자극 시토카인 분자는 링커에 의해 항원 결합 단편에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 및 비나선형 링커, 예컨대 Gly 및 Ser을 포함하는 펩티드 링커로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGS)N(서열 번호 124) 또는 (GGGGS)N(서열 번호 125) 링커이고, N은 모티프 반복 횟수를 나타내고 1-10으로부터 선택되는 정수이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 CD45 수용체에 대해 친화성을 갖고 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호 82에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분의 가변 도메인에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열, 또는 서열 번호 82의 가변 도메인과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열; 및/또는
(b) 서열 번호 79에 나타낸 아미노산 서열의 가변 도메인에 상응하는 중쇄 가변 아미노산 서열, 또는 서열 번호 79의 가변 도메인과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 서열 번호 50에 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 50의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 IL-12 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 서열 번호 70에 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 70의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 IL-12B 서브유닛에 연결된 IL-12A 서브유닛을 갖는 단일쇄 IL-12 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호 36의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일쇄 Fv는 서열 번호 80의 Fv 부분에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 80의 Fv 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, Fab 단편은 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 갖는 경쇄 및 가변 도메인(VH) 및 불변 도메인(CH1)을 갖는 중쇄 단편을 포함하고, 경쇄 및 중쇄 단편은 임의적으로 디술파이드 결합에 의해 연결되고, 경쇄 및 중쇄 단편은 각각 C-말단 및 N-말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-12 분자는 경쇄 또는 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 IL-12 분자에 융합된 제1 말단을 갖는 펩티드 링커를 추가로 포함하고, 제2 말단은 Fab 단편에 융합됨으로써 IL-12 분자 및 Fab 단편을 작동적으로 연결한다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 면역자극 융합 분자 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공된다.
또한, 본원에는 서열 번호 36, 50, 70, 79, 80, 또는 82의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36, 50, 70, 79, 80, 또는 82와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
추가의 측면은
(a) 하기를 포함하는 면역자극 융합 분자:
(i) 면역자극 시토카인 분자; 및
(ii) 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티; 및
(b) 세포 표면 항원을 발현하거나 달리 나타내는 표적 면역 세포
를 포함하고,
면역자극 융합 분자가 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 면역 세포의 표면에 결합되는 것인, 변형된 면역 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면은 건강한 및/또는 비악성 면역 세포 및 이에 결합된 본원에 개시된 면역자극 융합 분자를 포함하는 변형된 면역 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면은
(a) 면역 세포 집단을 제공하는 단계; 및
(b) 면역 세포 집단에 본원에 개시된 면역자극 융합 분자의 표적된 결합을 허용하도록 면역자극 융합 분자를 면역 세포 집단과 인큐베이션함으로써 세포 표면에 결합된 면역자극 융합 분자를 갖는 면역 세포 집단을 생성하는 단계
를 포함하는 변형된 면역 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면은
(a) 복수의 면역자극 융합 분자로서, 각각의 융합 분자가
(i) 면역자극 시토카인 분자; 및
(ii) T 세포의 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하는 것인, 복수의 면역자극 융합 분자;
(b) 세포 표면 항원을 발현하거나 달리 나타내는 T 세포 집단으로서, 복수의 면역자극 융합 분자가 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 T 세포의 표면에 결합되는 것인, T 세포 집단; 및
(c) 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제
를 포함하는, 면역 세포 요법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면은 본원에 개시된 면역자극 융합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본원에는 인간 대상체에게 세포 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 조성물은
(a) 복수의 면역자극 융합 분자로서, 각각의 융합 분자가
(i) 면역자극 시토카인 분자; 및
(ii) T 세포의 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하는 것인, 복수의 면역자극 융합 분자; 및
(b) 암 세포 또는 암 세포가 존재하는 조직이 있는 T 세포 집단으로서, T 세포가 세포 표면 항원을 발현하는 것인, T 세포 집단
을 포함하고,
복수의 면역자극 융합 분자는 T 세포의 표면에 결합되고, 시토카인 분자는 생체내에서 인간 대상체의 T 세포 및/또는 다른 면역 세포 집단과 작용하여 암에 대한 면역 반응을 자극한다.
일부 실시양태에서, T 세포 집단은 일차 T 세포, 확장된 일차 T 세포, PBMC 세포로부터 유래된 T 세포, 제대혈 세포로부터 유래된 T 세포, 인간 대상체에 대해 자기유래의 T 세포, 인간 대상체에 대해 동종이형의 T 세포, 유전자 조작된 T 세포, CAR-T 세포, 이펙터 T 세포, 활성화된 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CTL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 치료 조성물은 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택되는 세포 요법 경로로 인간 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 면역자극 융합 분자는 나노입자, 리포솜 및/또는 생분해성 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 단백질 나노겔, 뉴클레오티드 나노겔, 중합체 나노입자, 또는 고체 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 단백질 나노겔을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 나노입자 표면 상에 적어도 하나의 중합체, 양이온성 중합체, 또는 양이온성 블럭 공중합체를 임의적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 산화환원(디술파이드) 또는 pH(가수분해성 기) 또는 효소(프로테아제)에 민감한 가역성 링커에 의해 가교된 나노겔을 포함한다.
한 측면에서,
(a) 하기를 포함하는 면역자극 융합 분자:
(i) 면역자극 시토카인 분자; 및
(ii) 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티;
(b) 세포 표면 항원을 발현하거나 달리 나타내는 표적 면역 세포로서, 면역자극 융합 분자가 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 면역 세포의 표면에 결합되는 것인, 표적 면역 세포; 및
(c) 나노입자, 나노겔, 또는 리포솜
을 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 측면에서,
(i) IL-15, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, 또는 IL-27 중 하나 이상으로부터 선택되는 시토카인 분자; 및
(ii) 면역 세포 상의 면역 세포 표면 수용체와 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티로서, 면역 세포 표적화 모이어티가 면역 세포 표면 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 비항체 스캐폴드, 또는 리간드로부터 선택되고, 면역 세포 표면 수용체가 CD45, CD4, CD8, CD3, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD25, CD127, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD197, CD38, CD27, CD196, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CD84, CD229, CCR1, CCR5, CCR4, CCR6, CCR8, CCR10, CD16, CD56, CD137, OX40, 또는 GITR 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하고;
시토카인 분자 및 면역 세포 표적화 모이어티가 융합 분자로서 함께 작동적으로 연결되는 것인, 면역자극 융합 분자(IFM)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-15 및/또는 IL-12를 포함할 수 있다. 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45에 결합하는 항체 또는 리간드를 포함할 수 있다.
다른 측면에서,
(i) IL-12 및/또는 IL-15, 또는 이의 변이체 형태로부터 선택되는 시토카인 분자; 및
(ii) 면역 세포 상의 면역 세포 표면 수용체와 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티로서, 면역 세포 표적화 모이어티가 면역 세포 표면 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 비항체 스캐폴드, 또는 리간드로부터 선택되고, 면역 세포 수용체가 CD45인, 면역 세포 표적화 모이어티
를 포함하고;
시토카인 분자 및 면역 세포 표적화 모이어티가 융합 분자로서 함께 작동적으로 연결되는 것인, 면역자극 융합 분자(IFM)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-12 및/또는 IL-15이다. 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 건강한 및/또는 비악성 면역 세포이다. 다양한 실시양태에서, IFM은 표적화 모이어티 및 시토카인 분자를 작동적으로 연결하기 위한 링커를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 링커는 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 또는 비나선형 링커, 바람직하게는 Gly 및 Ser을 임의적으로 포함하는 펩티드 링커로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 펩티드 링커는 (GGGS)N 또는 (GGGGS)N 링커이고, N은 모티프 반복 횟수를 나타내고 1-10으로부터 선택되는 정수이다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 IFM 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 측면은 건강한 및/또는 비악성 면역 세포 및 이에 결합되거나 표적되는 본원에 개시된 IFM을 포함하는 변형된 면역 세포에 관한 것이다.
추가의 측면은
복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포를 제공하는 단계; 및
복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포에 본원에 개시된 IFM의 표적된 결합을 허용하도록 IFM을 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포과 인큐베이션함으로써 복수의 변형된 면역 세포를 생성하는 단계
를 포함하는, 변형된 면역 세포를 시험관내에서 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면은
복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포를 제공하는 단계;
복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포에 본원에 개시된 IFM의 표적된 결합을 허용하도록 IFM을 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포와 인큐베이션함으로써 복수의 변형된 면역 세포를 생성하는 단계; 및
복수의 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하고,
바람직하게는 세포 요법이 대상체의 사전-조건화(pre-conditioning)의 부재 하에 투여되고, 상기 사전-조건화가 CPX(시클로포스파미드) 또는 다른 림프고갈 조건화 화학요법을 포함하는 것인, 세포 요법을 제공하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 세포 요법은 암, 바람직하게는 고형 종양 암 또는 혈액 암을 치료하는 데 이용될 수 있다. 고형 종양 암은 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 영역의 암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 카포시 육종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 표피모양 암, 경부 편평 세포암의 암종, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 질의 암종, 연조직의 육종, 요도의 암, 음부의 암종, 음경의 암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 골반의 암종, 척수축 종양, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 상기 암의 전이성 병변, 또는 이의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 혈액 암은 백혈병(예컨대, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 털 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병(AMoL), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병(JMML), 또는 큰 과립 림프구성 백혈병), 림프종(예컨대, AIDS-관련된 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종(예컨대, 전형적 호지킨 림프종 또는 결절 림프구-우세 호지킨 림프종), 균상식육종, 비호지킨 림프종(예컨대, B-세포 비호지킨 림프종(예컨대, 버킷 림프종, 작은 림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 큰 B-세포 림프종, 소포 림프종, 면역모세포성 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 또는 맨틀 세포 림프종) 또는 T-세포 비호지킨 림프종(균상식육종, 역형성 큰 세포 림프종, 또는 전구체 T-림프모구성 림프종), 원발성 중추신경계 림프종, 세자리 증후군, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 만성 골수증식성 신생물, 랑게르한스 세포 조직구증, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 또는 골수형성이상/골수증식성 신생물 중 하나 이상일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 세포 요법은 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 농축된 항원 특이적 T 세포 요법 또는 NK 세포 요법으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포는 피험체에 대해 자기유래이다.
다른 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 IFM을 포함하는 입자, 예컨대 나노입자, 예컨대 단백질을 포함하는 나노입자(예컨대, 단백질 나노겔)를 제공한다. 일 실시양태에서, 입자는 동일한 IFM을 포함한다. 다른 실시양태에서, 입자는 하나 이상의 상이한 유형의 IFM을 포함한다. 나노입자 및 제조 방법은 2017년 6월 13일에 출원된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2017/037249, 예컨대 57-79면에 개시되어 있으며, 이는 전부 참조로 본원에 포함된다. 특정 실시양태에서, 이러한 나노입자는, 예컨대 미국 공개 번호 2017/0080104, 미국 특허 번호 9,603,944, 미국 공개 번호 2014/0081012, 및 PCT 출원 번호 PCT/US2017/037249에 개시된 백팩 기술과 관련하여 사용될 수 있으며, 이들 각각은 전부 참조로 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 시토카인 분자, 공동자극 분자의 효능제, 또는 음성 면역 조절제의 억제제, 예컨대 체크포인트 억제제의 억제제로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 시토카인 분자이다. 특정 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-2, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 또는 IL-27 중 하나 이상으로부터 선택되는 시토카인, 및 이의 변이체 형태(예컨대, 시토카인 유도체, 폴리펩티드와 함께 시토카인 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 시토카인 수용체 복합체, 및 이의 다른 효능제 형태)를 포함한다. 일 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-15 분자이다.
다른 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 공동자극 분자의 효능제, 예컨대 CD137, OX40, CD28, GITR, VISTA, 항-CD40, 또는 CD3로부터 선택되는 공동자극 분자의 효능제이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극 분자의 효능제는 CD137, OX40, GITR, CD3, 또는 CD28에 대한 효능제 항체 분자, 또는 이의 효능제 리간드이다.
다른 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 음성 면역 조절제의 억제제, 예컨대 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4로부터 선택되는 체크포인트 억제제의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 음성 면역 조절제의 억제제는 항체 분자 또는 리간드이다. 예컨대, 체크포인트 억제제의 억제제, 예컨대 항체 분자는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4에 결합하고/하거나 이를 억제한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물에 결합할 수 있고, 이에 의해 면역 자극 모이어티를 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포(예컨대, 림프구)에 표적화한다. 이론에 구애됨이 없이, 면역 세포 표적화 모이어티의 면역 세포 표면 표적물에 대한 결합은, 예컨대 유리 시토카인 분자의 이의 시토카인 수용체와의 연합과 비교하여, 면역 세포의 표면 상에 면역 자극 모이어티의 상응하는 수용체, 예컨대 시토카인 수용체와 함께 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자의 농도, 예컨대 시간에 따른 농도를 증가시키는 것으로 믿어진다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물은 면역 세포의 표면에 풍부하게 존재한다(예컨대, 면역 세포 표면에 존재하는 시토카인 분자에 대한 수용체의 수보다 많다). 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물, 예컨대 CD4, CD8, CD11a, CD19, CD20 또는 CD45로부터 선택되는 표적물에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자로부터 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4에 결합한다. 면역 체크포인트 억제제가 표적되는 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 체크포인트 억제제에 결합할 수 있거나, 이에 결합 및 억제할 수 있다. 실시양태에서, 표적화 모이어티는 면역 세포의 표면에 시토카인 분자의 농도를 특이적으로 전달하고/하거나 증가시킴으로써 시토카인 분자의 증가된 국소화, 분포 및/또는 시토카인 분자의 세포 표면 이용가능성의 증진 중 하나 이상을 초래하는 것으로 믿어진다. 실시양태에서, IFM은 시토카인 분자의 신호전달 기능을 실질적으로 방해하지 않는다. 이러한 표적화 효과로 면역 세포의 증식 및 활성화의 국소적이고 연장된 자극이 초래됨으로써 면역 반응의 제어된 확장 및 활성화를 유도한다.
따라서, 본원에는 특히 상술된 모이어티를 포함하는 IFM, 이의 약제학적 조성물 및 제형, 예컨대 IFM을 포함하는 나노입자(예컨대, 본원에 기재된 단백질 나노겔), 이를 코딩하는 핵산, 상술된 분자를 제조하는 방법, 및 상술된 IFM 및 이의 조성물을 사용하여 장애, 예컨대 암, 감염성 장애 또는 자가면역 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 일 측면에서, 본 개시는 면역 자극 모이어티(예컨대, 시토카인 분자, 공동자극 분자의 효능제, 또는 음성 면역 조절제의 억제제), 및 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하는 면역자극 융합 분자(IFM)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자는 면역 세포 표적화 모이어티에 (예컨대, 직접적으로 또는 간접적으로, 예컨대 펩티드 링커를 통해) 연결, 예컨대 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포 상의 표면 표적물, 예컨대 표면 수용체에 결합한다. 실시양태에서, IFM은 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자, 및 면역 세포 표적화 모이어티를 면역 세포, 예컨대 이펙터 면역 세포에 연합, 예컨대 함께 연결시킨다. 일부 실시양태에서, IFM은 면역 세포의 표면 상의 IFM의 시토카인 분자의 농도(예컨대, 시간, 예컨대 특정한 기간에 따른 IFM의 시토카인 분자의 농도)를 증가시킨다. 실시양태에서, 면역 세포의 표면 상의 IFM의 시토카인 분자의 증가된 농도는 (i) 예컨대, 유리 시토카인 분자와 비교하여, 면역 세포 표면에 대한 IFM의 시토카인 분자의 증가된 국소화(예컨대, 수준); (ii) 예컨대, 유리 시토카인 분자와 비교하여, IFM의 시토카인 분자의 증진된 세포 표면 이용가능성(예컨대, 농도(예컨대, 수준 또는 양) 및/또는 노출 지속기간); (iii) 예컨대, 유리 시토카인 분자와 비교하여, 면역 세포의 표적된 집단, 예컨대 미리선택된 표면 표적물, 예컨대 본원에 기재된 표면 표적물을 발현하는 세포 집단에서 증가된 시토카인 신호전달; (iv) 예컨대, 유리 시토카인 분자와 비교하여, 표적된 세포 집단에서 시토카인 신호전달의 연장(예컨대, 시토카인 신호전달의 지속기간을 적어도 8시간, 예컨대 24시간 증가시킴); (v) 면역자극 유발; (vi) 예컨대, 면역 세포의 표적된 집단의 증가된 면역 세포 활성화 및/또는 확장; 또는 (vii) 유리 시토카인 분자와 비교하여, 감소된 부작용, 예컨대 더 낮은 전신 독성 중 하나 이상을 초래한다. 일부 실시양태에서, IFM은 (i)-(vii) 중 임의의 것을 유리 시토카인 분자보다 더 큰 정도로, 예컨대 적어도 8시간, 예컨대 24시간 변화, 예컨대 증가시킨다. 일 실시양태에서, 시토카인 분자는 본원에 기재된 IL-15 분자이고, 면역 세포 표적화 모이어티는 항-CD45 항체 분자, 예컨대 본원에 기재된 CD45에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
관련된 측면에서, 본 개시는, 예컨대 면역 세포 표적화 모이어티에 커플링된, 예컨대 융합된 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 분자를 포함하는 조성물, 예컨대 IFM을 제공한다. 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 상의 표적물 또는 수용체에 결합한다. 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 세포, 예컨대 면역 세포(예컨대, 면역 이펙터 세포, 예컨대 림프구) 상의 CD45 수용체에 결합하는 항체 분자, 예컨대 항체 또는 항체 단편, 예컨대 항-CD45 항체 분자(예컨대, IgG, Fab, scFv)이거나 이를 포함한다. 실시양태에서, 조성물, 예컨대 IFM은 시토카인 분자 및 면역 세포 표적화 모이어티를 면역 세포, 예컨대 이펙터 면역 세포에 연합, 예컨대 함께 연결시킨다. 실시양태에서, 세포에 대한 항-CD45 항체 결합은, 예컨대 유리 IL-15 분자(조성물에서 발견되지 않는 IL-15 분자)와 비교하여, IL-15 분자와 세포와의 연합을 증가시키고 시간 경과에 따라 IL-15 신호전달, 면역자극 중 하나 이상을 개선한다. 실시양태에서, 신호전달 및/또는 면역자극은 일정 시간, 예컨대 수분, 수시간, 수일에 걸쳐, 예컨대 적어도 8시간, 예컨대 24시간 일어난다.
다른 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 IFM을 포함하는 입자, 예컨대 나노입자, 예컨대 단백질을 포함하는 나노입자(예컨대, 본원에 개시된 단백질 나노겔)를 제공한다. 일 실시양태에서, 입자는 동일한 IFM을 포함한다. 다른 실시양태에서, 입자는 하나 이상의 상이한 유형의 IFM을 포함한다.
본원에 개시된 IFM 및/또는 입자를 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물이 또한 개시된다. 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 IFM을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 서열을 포함하거나 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95% 동일한) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 및 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예컨대 발현 벡터, 및 숙주 세포를 제공한다.
본원에 개시된 IFM을 제조, 예컨대 생성하는 방법이 또한 개시된다. 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 적합한 성장 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 피험체, 예컨대 인간에서 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료를 필요로 하는 피험체에게 조성물, 예컨대 본원에 기재된 IFM 또는 입자를 장애 또는 병태를 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애는 암, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 암이다. 다른 실시양태에서, 장애는 감염, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 효모 감염이다. 다른 실시양태에서, 장애는 자가면역 장애이다. 본원에 개시된 조성물은 단독으로, 또는, 이로 제한 없이, 세포 요법과 조합하여, 및 화학요법 또는 방사선요법과의 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택된다.
관련된 측면에서, 본 개시는, 예컨대 피험체, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간)에서 장애 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위해 약제에 사용하기 위한 조성물, 예컨대 본원에 개시된 IFM 및/또는 입자를 제공한다. 대안적으로, 피험체, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간)에서 장애 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에서 조성물, 예컨대 IFM의 용도가 개시된다. 일부 실시양태에서, 장애는 암, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 암이다. 다른 실시양태에서, 장애는 감염, 예컨대 바이러스(예컨대, HIV), 박테리아 또는 효모 감염이다. 다른 실시양태에서, 장애는 자가면역 장애이다. 본원에 개시된 조성물은 단독으로, 또는, 이로 제한 없이, 세포 요법과 조합하여, 및 화학요법 또는 방사선요법과의 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 개시는 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 분자를 피험체, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간)의 면역 세포에 선별적으로 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 IFM을 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 시토카인 분자는 면역 세포에 선별적으로 전달된다.
본원에 개시된 치료 및 전달 방법의 실시양태에서, 본원에서의 피험체는 세포-기반 요법, 예컨대 면역 세포 요법이 필요하다. 예컨대, 피험체는 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택되는 세포 요법이 필요하다. 일부 실시양태에서, 피험체는 환자, 예컨대 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 암, 당뇨병, 자가면역 질환, 알러지 또는 알러지 병태, 천식 또는 심혈관 질환으로부터 선택되는 질환을 갖는다. 한 실시양태에서, 피험체는 이식이 필요하다.
본원에 기재되는 IFM은 치료될 장애(예컨대, 암)를 앓는 피험체에, 예컨대 정맥내 또는 피하 투여를 통해 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 시토카인 분자를 면역 세포의 표면에 전달함으로써 면역 세포의 표면에서 시토카인 분자의 농도를 증가시킨다. 실시양태에서, IFM은 시토카인 분자의 분포의 국소화 및/또는 시토카인 분자의 세포 표면 이용가능성의 증진 중 하나 이상을 초래함으로써 면역 세포를 활성화 및/또는 자극시킨다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 IFM은 생체내 또는 시험관내에서 면역 세포 요법을 활성화 및/또는 자극하기 위해 면역 세포 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 IFM은 치료될 장애(예컨대, 암)을 앓는 피험체에게, 예컨대 정맥내 또는 피하 투여를 통해 세포 기반 요법으로 공동-투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 요법은 투여 전에 본원에 기재된 IFM으로 시험관내에서 펄싱된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택된다.
본원에 개시된 IFM, 조성물, 나노입자, 방법, 용도, 핵산, 벡터, 및 숙주 세포 중 임의의 것의 추가의 특징 및 실시양태는 하기 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, IFM은 이기능성 또는 이특이적 분자이며, 예컨대 이는, 예컨대 상이한 기능 및/또는 결합 특이성을 갖는, 적어도 2개의 상이한 종류의 구성원을 갖는다. 예컨대, IFM은 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자, 및 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하거나 이로 이루어지고, 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적 모이어티는 동일하거나 상이한 세포, 예컨대 하나 이상의 면역 세포의 2개의 상이한 세포 표면 표적물 또는 수용체에 결합한다. 실시양태에서, 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적 모이어티는 동일한 면역 세포, 예컨대 동일한 면역 이펙터 세포 상의 2개의 상이한 표적물에 결합한다. 이기능성 또는 이특이적 분자는 추가의 모이어티, 예컨대 추가의 결합 및/또는 기능성 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, IFM은 다기능성 또는 다특이적 분자일 수 있으며, 예컨대 이는 삼기능성 또는 삼특이적, 또는 사기능성 또는 사특이적 융합 분자이다.
특정 실시양태에서, IFM은 N에서 C 말단 배향으로 하기 식으로 표시될 수 있다: R1-(임의적으로 L1)-R2 또는 R2-(임의적으로 L1)-R1; 여기서 R1은 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하고, L1은 링커(예컨대, 본원에 기재된 펩티드 링커)를 포함하고, R2는 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자는 면역 세포 표적화 모이어티에 (예컨대, 화학적 커플링, 유전자 또는 단백질 융합, 비공유적 연합 등에 의해) 기능적으로 연결, 예컨대 공유적으로 연결된다. 예컨대, 면역 자극 모이어티는, 예컨대 링커를 통해 면역 세포 표적화 모이어티에 공유적으로 간접적으로 커플링될 수 있다. 실시양태에서, 링커는 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 또는 비나선형 링커로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커는 5-20, 8-18, 10-15, 또는 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15-20, 20-25, 또는 25-30개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 30개 이상의 아미노산; 예컨대, 30-35, 35-40, 40-50 50-60개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly 및 Ser, 예컨대 아미노산 서열(Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n을 포함하는 링커(여기서, n은 모티프 반복 횟수를 나타내고, 예컨대 n=1, 2, 3, 4 또는 5)(예컨대, (Gly3-Ser)2 또는 (Gly4Ser)2, 또는 (Gly3-Ser)3 또는 (Gly4Ser)3 링커)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호 36, 37, 38, 또는 39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는) 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGSGGGS(서열 번호 37)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 항체 힌지 영역으로부터 유래되는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgGM, 또는 IgGA 항체의 힌지 영역으로부터 유래되는 아미노산을 포함한다. 실시양태에서, 링커는 IgG 힌지 영역, 예컨대 IgG1, IgG2 또는 IgG4 힌지 영역으로 유래되는 아미노산을 포함한다. 예컨대, 링커는 IgG 힌지로부터의 변이체 아미노산 서열, 예컨대 하나 이상의 시스테인이, 예컨대 세린으로 대체된 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 또는 두 시스테인이 또 다른 아미노산, 예컨대 세린으로 대체된 DKTHTCPPSCAPE(서열 번호 126)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 DKTHTSPPSPAP(서열 번호 38), EPKSSDKTHTSPPSPAPE(서열 번호 127), 또는 이의 유도체를 포함한다. 실시양태에서, 링커는 IgG2 힌지 영역으로부터 유래되는 아미노산, 예컨대 아미노산 SVESPPSP(서열 번호 128), ERKSSVESPPSP(서열 번호 129), 또는 이의 유도체를 포함한다. 실시양태에서, 링커는 IgG2 힌지 영역으로부터 유래되는 아미노산, 예컨대 아미노산 SVESPPSP(서열 번호 128), ERKSSVESPPSP(서열 번호 129), 또는 이의 유도체를 포함한다. 실시양태에서, 링커는 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 아미노산, 예컨대 아미노산 PPSPSSP(서열 번호 130), ESKYGPPSPSSP(서열 번호 131), 또는 이의 유도체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 링커는 비펩티드의 화학적 링커이다. 예컨대, 면역 자극 모이어티는 가교에 의해 면역 세포 표적화 모이어티에 공유적으로 커플링된다. 적합한 가교링커는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 뚜렷한 반응성 기를 갖는 이종이기능성(예컨대, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종이기능성(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트)인 것들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 링커 없이 면역 세포 표적화 모이어티에 직접적으로 공유적으로 커플링된다. 다른 실시양태에서, IFM의 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적화 모이어티는 공유적으로 연결되지 않으며, 예컨대 비공유적으로 연합된다.
다른 실시양태에서, 링커는 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체, 예컨대 인간 알부민 또는 Fc 도메인, 또는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 N-말단에 연결되고, 면역 자극 모이어티는 C-말단에 연결된다.
다른 실시양태에서, 링커는 면역 세포 표적화 모이어티를 면역 자극 모이어티에 비공유적으로 연합시킨다. 예컨대, 링커는 이량체화 도메인, 예컨대 코일형 코일 또는 루이신 지퍼를 포함한다.
예컨대, 2개의 다른 단백질을 연결하기 위해 IL-15/sushi 상호작용의 고친화성을 이용하는, 다른 비공유적 상호작용에 기반한 융합이 또한 이용될 수 있다.
면역 세포
실시양태에서, 면역 세포는 유핵 세포, 예컨대 하기에서 본원에 기재된 유핵 세포이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 면역 이펙터 세포 집단, 예컨대 T 세포, 예컨대 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 알파 T 세포, 베타 T 세포, 감마 T 세포, 및 델타 T 세포; B 세포; 천연 킬러(NK) 세포; 천연 킬러 T(NKT) 세포; 또는 수지상 세포 중 하나 이상으로부터 선택되는 면역 이펙터 세포 집단이다. 실시양태에서, 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포는 면역 세포 표적화 모이어티에 결합하는 세포 표면 수용체를 나타낸다.
보다 특정한 실시양태에서, 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, (예컨대, 림프구, T 세포, B 세포, 또는 천연 킬러 세포로부터 선택되는 면역 세포), 또는 조혈 줄기 세포). 실시양태에서, 면역 세포는 림프구를 포함한다. 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. 실시양태에서, 면역 세포는 B 세포를 포함한다. 실시양태에서, 면역 세포는 천연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 실시양태에서, 면역 세포는 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR), 예컨대 암 항원에 결합하는 CAR를 포함, 예컨대 발현하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 외인성의 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 조작된 T-세포 수용체를 포함, 예컨대 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포(예컨대, CD8 T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 조절성 T-세포("Treg")이다.
실시양태에서, 면역 세포는 환자, 예컨대 환자의 혈액으로부터 수득되는 면역 세포, 예컨대 NK 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 건강한 공여자로부터 수득되는 면역 세포, 예컨대 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, NK 세포 집단은 환자에게 주입하기 전에 T 세포, 예컨대 동종이형의 T 세포가 정제, 예컨대 고갈된다. 실시양태에서, 면역 세포는 배아 줄기 세포 및/또는 iPSC 세포로부터의 면역 세포, 예컨대 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 세포주, 예컨대 안정한 또는 불멸화된 세포주(예컨대, NK 세포 불멸화된 세포주)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 환자, 예컨대 혈액 암, 예컨대 백혈병 또는 림프종을 갖는 환자로부터 수득된다. 실시양태에서, 면역 세포는 NK 세포주, 예컨대 문헌(Klingemann, H. et al. (2016) Frontiers in Immunology Vol. 7(Art. 91): 1-7, 본원에 참조로 포함됨)에 기재되는 바와 같이, 예컨대 NK-92(예컨대, ATCC 카달로그 번호 CRL-2407), NK-YS, KHYG-1, NKL, NKG, SNK-6, IMC-1로부터 선택되는 NK 세포주이다. 일 실시양태에서, 면역 세포는 NK92 세포주, 예컨대 고친화성 Fc 수용체를 발현하는 변이체 NK92 세포, 예컨대 Fc 감마 RIIIa-발현 세포(예컨대, 158V)이다. 다른 실시양태에서, NK92 세포주는, 예컨대 문헌(Klingemann et al. 상기 참조)에 기재되는 바와 같이, 암 항원에 결합하는 CAR을 포함한다.
사이토킨 분자
일부 실시양태에서, IFM의 시토카인 분자는 면역조절성 시토카인, 예컨대 프로-염증성 시토카인 또는 항-염증성 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 시토카인의 공통 γ-쇄(γc) 계열의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-1, 예컨대 인터루킨-1 알파(IL-1α) 또는 인터루킨-1 beta(IL-1β), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-23(IL-23), 인터루킨-27(IL-27), 인터루킨-35(IL-35), IFNγ, TNFα, IFNα, IFNβ, GM-CSF, 또는 GCSF 중 하나 이상으로부터 선택되는 시토카인, 및 이의 변이체 형태(예컨대, 시토카인 유도체, 폴리펩티드와 함께 시토카인 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 시토카인 수용체 복합체, 및 이의 다른 효능제 형태)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 또는 IL-27 시토카인 분자로부터 선택되는 프로-염증성 시토카인 분자이다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35 시토카인 분자로부터 선택되는 항-염증성 시토카인 분자이다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 또는 IL-27, 및 이의 변이체 형태(예컨대, 시토카인 유도체, 폴리펩티드와 함께 시토카인 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 시토카인 수용체 복합체, 및 이의 다른 효능제 형태, 예컨대 비-중화 항-시토카인 항체 분자)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는, 예컨대 본원에 기재되는 바와 같이, 초효능제(superagonist: SA)이다. 예컨대, 초효능제는, 자연 발생 시토카인과 비교하여, 예컨대 적어도 10%, 20%, 또는 30%의 증가된 시토카인 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 단량체 또는 이량체이다. 실시양태에서, 시토카인 분자는 수용체 또는 이의 단편, 예컨대 시토카인 수용체 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 시토카인 분자는 야생형 시토카인, 예컨대 야생형의, 예컨대 인간 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 시토카인 분자는 야생형 시토카인 서열, 예컨대 인간 시토카인 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는, 야생형 시토카인 서열, 예컨대 인간 시토카인 서열과 비교하여, 적어도 95% 내지 100% 동일하거나 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시양태에서, 시토카인 분자는, 야생형 시토카인 서열, 예컨대 인간 시토카인 서열과 비교하여, 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
예시적 시토카인 아미노산 서열이 본원에 개시되며, 예컨대 IL-15의 아미노산은, 예컨대 서열 번호 10 및 서열 번호 40으로 제공되고; IL-7 아미노산은, 예컨대 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 제공되고; IL-21 아미노산은, 예컨대 서열 번호 44 및 서열 번호 45로 제공되고; IL-12A의 아미노산은, 예컨대 서열 번호 46 및 서열 번호 47로 제공되고; IL-12B의 아미노산은, 예컨대 서열 번호 48 및 서열 번호 49로 제공되고; IL-12A와 IL-12B의 예시적 융합은, 예컨대 서열 번호 50 및 서열 번호 51로 개시된다. 본원에 개시된 시토카인 서열 및 실질적으로 동일한 서열(예컨대, 적어도 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성) 중 임의의 것이 본원에 개시된 IFM에 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-15 분자이다. 일 실시양태에서, IL-15 분자(예컨대, IL-15 폴리펩티드 분자)는 야생형 IL-15 아미노산 서열, 예컨대 인간 IL-15 아미노산 서열을 포함하고, 예컨대 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-15 분자, 예컨대 전체 길이, IL-15의 단편 또는 변이체, 예컨대 IL-15 활성을 보유하는 인간 IL-15이다. 다른 실시양태에서, IL-15 분자는, 예컨대 인간 IL-15 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 변경, 예컨대 치환을 갖는, 인간 IL-5의 변이체이다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는, 예컨대 US 2016/0184399에 기재되는 바와 같이, 위치 45, 51, 52, 또는 72에서 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 N, S 또는 L의 D, E, A Y 또는 P 중 하나로의 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 (인간 IL-15의 서열인 서열 번호 11과 관련하여) L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y, 또는 N72P로부터 선택된다.
실시양태에서, IL-15 분자는 IL-15 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 인간 IL-15 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 분자는 위치 72에서 치환, 예컨대 N의 D로의 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, IL-15 분자는, IL-15Rα 결합 활성을 갖는, 서열 번호 11의 IL-15N72D 폴리펩티드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, IL-15 분자는 IL-15(예컨대, IL-15 야생형 또는 변이체 서열) 및 IL-15 수용체, 예컨대 IL-15 수용체 알파의 IL-15 결합 단편 또는 이의 IL-15 결합 단편의 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 분자는 IL-15 및 IL-15 수용체 단편, 예컨대 IL-15 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 분자 및 IL-15 수용체의 IL-15 결합 단편은 공유적으로 연결되지 않으며, 예컨대 비공유적으로 연합된다.
일 실시양태에서, IL-15 수용체 단편은 서열 번호 9 또는 서열 번호 52의 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95% 동일하거나, 서열 번호 9 또는 서열 번호 52의 아미노산 서열, 또는 이의 단편에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5개, 그러나 10, 15, 20개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖고, IL-15 결합 활성을 갖는) 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, IL-15 분자는 IL-15 및 IL-15 수용체 단편, 예컨대 스시(sushi) 도메인(예컨대, 본원에 기재된 것)의 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 인간 또는 비인간 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 비인간 영장류로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 인간 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95% 동일한) 것을 포함한다. 실시양태에서, IL-15 수용체 알파의 세포외 도메인은 IL-15에 결합하는 본원에서 "스시 도메인"으로 지칭되는 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 스시 도메인은 본원에서 "최소 도메인"으로 지칭되는 62-아미노산(예컨대, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 가짐), 또는 65-아미노산 확장된 도메인(예컨대, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가짐)으로서 제공되거나, 서열 번호 63의 아미노산 31-107을 포함하는, 예컨대 이로 이루어진 77-아미노산 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-15 수용체 단편은 야생형 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, IL-15 수용체 단편은 돌연변이된 서열, 예컨대 위치 77에서 치환, 예컨대 L77I 치환을 갖는다(서열 번호 4의 야생형 IL-15Rα에 준거하여 번호매김). 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 9, 서열 번호 52, 서열 번호 65, 또는 서열 번호 66의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95% 동일하거나, 서열 번호 9, 서열 번호 52, 서열 번호 65, 또는 서열 번호 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5개, 그러나 10 또는 15개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖고, IL-15 결합 활성을 갖는) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-15 수용체 알파 세포외 도메인은 서열 번호 63의 62-171개 아미노산 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는) 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 수용체 알파 세포외 도메인은 서열 번호 63의 65-171개 아미노산 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는) 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 수용체 알파 세포외 도메인은 서열 번호 63의 171개 이하의 아미노산 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는) 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 수용체 알파 세포외 도메인은 서열 번호 63의 62-171, 62-160, 62-150, 62-140, 62-130, 62-120, 62-110, 62-100, 62-90, 62-80, 62-70, 65-171, 65-160, 65-150, 65-140, 65-130, 65-120, 65-110, 65-100, 65-90, 65-80, 65-70, 또는 65-77개 아미노산 또는 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖거나 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 수용체 알파 세포외 도메인은 서열 번호 63의 62-171, 62-160, 62-150, 62-140, 62-130, 62-120, 62-110, 62-100, 62-90, 62-80, 62-70, 65-171, 65-160, 65-150, 65-140, 65-130, 65-120, 65-110, 65-100, 65-90, 65-80, 65-70, 또는 65-77개 아미노산으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, IL-15 분자를 함유하는 IFM은 폴리펩티드, 예컨대 시토카인 수용체, 예컨대 시토카인 수용체 도메인, 및 제2의 이종 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 이종 도메인은 면역글로불린 Fc 영역이다. 다른 실시양태에서, 이종 도메인은 항체 분자, 예컨대 Fab 단편, FAB2 단편, scFv 단편, 또는 아피바디 단편 또는 유도체, 예컨대 sdAb(나노바디) 단편, 중쇄 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 또한 제3의 이종 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체 도메인은 제2 도메인의 N-말단이고, 다른 실시양태에서, 시토카인 수용체 도메인은 제2 도메인의 C-말단이다.
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 시토카인 및 항-시토카인 항체 분자의 복합체를 포함한다. 예컨대, 시토카인은 IL-2일 수 있고, 항-시토카인 항체는 비중화 항-IL-2 항체 분자일 수 있다(예컨대, 문헌(Spangler, J.B., et al. (2015) www.dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2015.04.015; Letourneau, S. et al. (2010) PNAS Vol 107(5): 2171-2176; Boyman, O. et al. (2006) Science 311, 1924); Spangler, J.B. (2015) Annu Rev Immunol 33:139-167) 참조, 이의 내용이 전부 참조로 포함됨).
면역 세포 표적화 모이어티
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물, 예컨대 면역 세포 표면 수용체에 선별적으로 결합하는 항체 분자 또는 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물 또는 수용체는 하기 특성 중 1, 2, 3개 이상을 가질 수 있다: (i) 면역 세포의 표면 상에 풍부하게 존재함(예컨대, 면역 세포 표면에 존재하는 시토카인 분자에 대한 수용체의 수보다 많음); (ii) 예컨대, IFM의 시토카인에 의해 활성화되는 수용체와 비교하여, 느린 하향조절, 내재화, 및/또는 세포 표면 회전을 나타냄; (iii) 예컨대, IFM의 시토카인에 의해 활성화되는 수용체와 비교하여, 연장된 기간 동안 면역 세포의 표면 상에 존재함; 또는 (iv) 일단 내재화되면 실질적으로 세포 표면으로 재순환되고, 예컨대 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 면역 세포 표면 표적물이 세포 표면으로 재순환됨.
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 재순환 세포 표면 수용체에 결합한다. 이론에 구애됨이 없이, 재순환 세포 표면 수용체에 대한 결합은 수용체 및 IFM의 내재화를 매개하는 것으로 믿어진다. 예컨대, 수용체와 함께 내재화된 IFM은 초기 엔도솜으로 격리된 후 (예컨대, 클라트린-매개된 및 클라트린-독립적인 세포내이입을 통해) 후속 분해로 진행하는 대신 세포 표면으로 재순환될 수 있다. IFM/수용체의 세포 표면으로의 반송은 IFM의 시토카인 분자를 세포 표면으로 복원시켜 시토카인 신호전달을 개선함으로써 시토카인 분자가 그 자신의 세포-표면 수용체에 결합하는 시간 및 이용가능성을 증가시킬 수 있다. 추가적으로, 본 개시의 융합 단백질의 결합에 의해 표면 막에서 개시되는 신호전달 이벤트는 엔도솜 구획으로부터 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물 또는 수용체는 면역 세포의 표면 상에는 존재하나, 암 또는 종양 세포, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 암 세포 상에는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물 또는 수용체는 암 또는 종양 세포 상에서의 이의 존재와 비교하여 면역 세포의 표면 상에 대부분 존재하며, 예컨대 암 또는 종양 세포에 비해 면역 세포 상에 적어도 적어도 5:1, 10:1, 15:1, 20:1 이상의 비율로 존재한다.
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 세포(예컨대, 면역 세포), 예컨대 세포의 표면 막 상에서 발현되는 수용체에 결합하고, 추가로 세포는 또한 시토카인 수용체(예컨대, IFM의 시토카인 분자에 대한 수용체)를 발현한다.
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물, 예컨대 CD16, CD45, CD4, CD8, CD3, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD25, CD127, CD56, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD197, CD38, CD27, CD137, OX40, GITR, CD56, CD196, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CD84, CD229, CCR1, CCR5, CCR4, CCR6, CCR8, 또는 CCR10으로부터 선택되는 표적물에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD4, CD8, CD11a, CD18, CD20, CD56, 또는 CD45에 결합한다. 다른 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물은 CD19, CD20, 또는 CD22로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자(또한 본원에서 "CD45 수용체" 또는 "CD45R"로 상호교환적으로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적물은 CD45(예컨대, CD45RA, CD45RB, CD45RC 또는 CD45RO로부터 선택되는 CD45 이소형)이다. 실시양태에서, CD45는 주로 T 세포 상에서 발현된다. 예컨대, CD45RA는 주로 나이브 T 세포 상에서 발현되고; CD45RO는 주로 활성화된 메모리 T 세포 상에서 발현된다.
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티(예컨대, 항체 분자)는 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4에 결합한다. 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포 상에 존재한다.
다른 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는, 면역 세포 표적물 또는 수용체에 결합하는, 항체 분자(예컨대, 항원 결합 도메인), 수용체 분자(예컨대, 수용체, 수용체 단편 또는 이의 기능성 변이체), 또는 리간드 분자(예컨대, 리간드, 리간드 단편 또는 이의 기능성 변이체), 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티의 항체 분자는 전체 항체(예컨대, 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄, 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 항체), 또는 면역 세포 표적물 또는 수용체에 결합하는 항원 결합 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv, 단일 도메인 항체, 디아바디(dAb), 이가 항체, 또는 이의 이특이적 항체 또는 단편, 이의 단일 도메인 변이체, 또는 카멜리드 항체)을 포함한다.
항체 분자의 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 또는 이의 단편, 및 보다 전형적으로, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합, 신생아-Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 보체 기능 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키거나, 항체 형성을 안정화(예컨대, IgG4를 안정화)시키기 위한 하나 이상의 변경, 예컨대 치환을 포함할 수 있다. 예컨대, IgG4, 예컨대 인간 IgG4에 대한 중쇄 불변 영역은 위치 228에서의 치환(예컨대, Ser의 Pro로의 치환)을 포함할 수 있다(예컨대, 문헌(Angal, S, King, DJ, et al. (1993) Mol Immunol 30:105-108(초기에 상이한 번호매김 시스템을 사용하여 S241P로 기재됨); Owens, R, Ball, E, et al. (1997) Immunotechnology 3:107-116) 참조).
항체 분자의 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다의 경쇄 불변 영역, 또는 이의 단편으로부터 선택될 수 있다.
IFM의 면역 세포 표적화 모이어티의 항체 분자는 표적 항원에 약 100 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM 미만, 예컨대 1 nM 미만(예컨대, 약 10 - 100 pM)의 해리 상수로 결합할 수 있다. 실시양태에서, 항체 분자는 항원 상의 입체형태 또는 선형 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티의 항체 분자에 의해 결합되는 항원은 면역 세포의 표면 상에서 안정하게 발현된다. 실시양태에서, 항원은 세포 표면 상의 IFM의 시토카인 분자에 대한 수용체와 비교하여 세포 표면 상에 더 풍부한 세포 표면 수용체이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 항체 분자(예컨대, 전체 항체(예컨대, 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄, 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 항체), 또는 항원 결합 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv, 단일 도메인 항체, 디아바디(dAb), 이가 항체, 또는 이특이적 또는 다특이적 항체 또는 이의 단편, 이의 단일 도메인 변이체, 또는 카멜리드 항체), 또는 비항체 스캐폴드, 또는 면역 세포 표면 표적물 또는 리간드에 결합하는 리간드로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45, CD2, CD4, CD8, CD11(예컨대, CD11a(인테그린 알파-L), CD11b, 또는 CD11c), CD18(인테그린 베타-2), CD19, CD20, 또는 CD25에 결합하는 항체 분자 또는 리간드, 또는 이의 조합, 예컨대 2개 이상의 상술된 표적물에 결합하는 이특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체 분자(예컨대, 일특이적 또는 이특이적 항체)는 CD45, CD8, CD18 또는 CD11a 중 하나 이상에 결합하며, 예컨대 이는 IgG, 예컨대 인간 IgG4, 또는 CD45, CD8, CD18 또는 CD11a에 결합하는 항원 결합 도메인, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv이다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 인간, 인간화된 또는 키메라 항체이다. 실시양태에서, 항체 분자는 재조합 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-CD45 항체는 인간 항-CD45 항체, 인간화된 항-CD45 항체, 또는 키메라 항-CD45 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD45 항체는 항-CD45 단일클론 항체이다. 예시적 항-CD45 항체는 항체 BC8, 4B2, GAP8.3 또는 9.4를 포함한다. 다른 면역 세포 표면 표적물에 대한 항체, 예컨대 항-CD8 항체, 예컨대 OKT8 단일클론 항체, 항-CD18 항체, 예컨대 1B4 단일클론 항체, 및 항-CD11a 항체, 예컨대 MHM24 항체가 또한 개시되어 있다.
또한, 본 개시에 의해 본원에 개시된 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 분자, 이를 코딩하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포 및 벡터가 포함된다.
일 실시양태에서, CD45에 결합하는 항체 분자는 하나의 CD45 이소형에 대해 특이적이거나 CD45 이소형보다 더 많은 것에 결합하며, 예컨대 pan-CD45 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD45 항체 분자는 CD45RA 및 CD45RO에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CD45 항체 분자는 BC8 항체이다. 일부 실시양태에서, BC8 항체는 CD45RA 및 CD45RO에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-CD45 항체 분자는 CD45RO-특이적이거나 pan-CD45 항체 분자이고, 예컨대 이는 활성화된 메모리 T 세포에 결합한다. 항-CD45 항체 분자의 추가의 예는 GAP8.3, 4B2, 및 9.4를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 항-CD45 항체 분자는 BC8 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 BC8 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 21, 또는 22에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 7, 21, 또는 22의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 각각 서열 번호 5, 6, 또는 8에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열 또는 S228P 치환을 갖는 인간 IgG4 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 5, 6, 또는 8과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트(Kabat) 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 1-4, 7, 21, 또는 22, 또는 5-6, 또는 8의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
다른 실시양태에서, 서열 번호 1-4의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 1-4와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함)은, 임의적으로 링커를 통해, IL-15 시토카인 또는 수용체, 예컨대 본원에 기재된 스시 도메인(예컨대, 서열 번호 9 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 9와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열))을 포함한다. 일 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 1-4의 BC8 항체의 경쇄의 N-말단에 커플링된다. 다른 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 1-4의 BC8 항체의 경쇄의 C-말단에 커플링된다. 일 실시양태에서, 링커는 서열 번호 37 또는 38을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 실시양태에서, 서열 번호 21 또는 22의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 21 또는 22와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함)은, 임의적으로 링커를 통해, IL-15 시토카인 또는 수용체, 예컨대 본원에 기재된 스시 도메인(예컨대, 서열 번호 9 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 9와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열))을 포함한다. 일 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 37 또는 38의 링커를 통해 서열 번호 21 또는 22의 BC8 항체의 경쇄의 N-말단에 커플링된다. 다른 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 37 또는 38의 링커를 통해 서열 번호 21 또는 22의 BC8 항체의 경쇄의 C-말단에 커플링된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 6 또는 8의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 6 또는 8과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 6 또는 8의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 6 또는 8과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 또는 수용체, 예컨대 본원에 기재된 스시 도메인(예컨대, 서열 번호 9 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 9와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 일 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 6 또는 8의 BC8 항체의 경쇄의 N-말단에 커플링된다. 다른 실시양태에서, IL-15 시토카인 또는 수용체는 서열 번호 6 또는 8의 BC8 항체의 경쇄의 C-말단에 커플링된다.
다른 실시양태에서, 인간화된 BC8 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 19에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 19의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 서열 번호 18에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 18과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 18 또는 19의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 19의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 19와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 19의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 18의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 18과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 18의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
다른 실시양태에서, CD45에 결합하는 항체 분자는 9.4 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 9.4 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 9.4 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 15에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 15의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 각각 서열 번호 14에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 14와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 9.4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 정의에 따라, 9.4 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 14 또는 15의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 15의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 15와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 15의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 14의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 14와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 14의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
다른 실시양태에서, CD45에 결합하는 항체 분자는 4B2 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 4B2 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 4B2 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 17의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 각각 서열 번호 16에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 16과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 4B2 항체는, 예컨대 카바트 정의에 정의에 따라, 4B2 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 16 또는 17의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 17의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 17과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 17의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 16의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 16과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 16의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
다른 실시양태에서, CD8에 결합하는 항체 분자는 OKT8 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 OKT8 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 OKT8 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 31에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 31의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 서열 번호 30에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 30과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, OKT8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 정의에 따라, OKT8 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 30 또는 31의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 31의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 31과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 31의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 30의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 30과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 30의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, CD18에 결합하는 항체 분자는 1B4 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 1B4 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 1B4 항체는
(i) 서열 번호 29에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 31의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 28과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 1B4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 1B4 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 28 또는 29의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 29의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 29와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 29의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 28의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 28과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 28의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
다른 실시양태에서, CD11a에 결합하는 항체 분자는 MHM24 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 MHM24 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 MHM24 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 27의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열); 및/또는
(ii) 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 26과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, MHM24 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, MHM24 항체의 경쇄 가변 영역, 및/또는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 26 또는 27의 CDR 서열로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 27의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 27과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 27의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
대안적으로 또는 조합하여, 서열 번호 26의 아미노산, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산(예컨대, 서열 번호 26과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)은 IL-15 시토카인 분자, 예컨대, 임의적으로 링커(예컨대, 서열 번호 36-39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 36-39와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함하는 링커)를 통해, 서열 번호 26의 N- 또는 C-말단에 커플링된 IL-15 시토카인을 포함한다.
예시적 IFM 포맷
IFM의 예시적 포맷은 면역 세포 표면 표적물에 결합하는 항체 분자(예컨대, 면역글로불린 모이어티(Ig), 예컨대 항체(예컨대, 전체 항체, IgG) 또는 항체 단편(Fab, scFv, 하프 항체(half antibody), 또는 단일 도메인 항체 등))에 커플링된 시토카인 분자(예컨대, 하나 이상의 시토카인 분자)를 포함한다. 실시양태에서, IFM은 항체 분자의 아미노-말단(N-말단) 또는 카복시-말단(C-말단), 전형적으로 C-말단에 대한 융합을 포함한다. 시토카인 분자는, 임의적으로 링커를 통해, 항체 분자에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인 또는 시토카인 수용체, 예컨대 수용체 단편(예컨대, 스시 도메인)은 항체 분자의 N-말단 또는 C-말단에 커플링된다. 실시양태에서, 시토카인 또는 시토카인 수용체, 예컨대 수용체 단편(예컨대, 스시 도메인)은 항체 분자(예컨대, 전체 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab, scFv, 또는 하프 항체)의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 커플링된다. 대안적으로 또는 조합하여, 시토카인 또는 시토카인 수용체, 예컨대 수용체 단편(예컨대, 스시 도메인)은 항체 분자(예컨대, 전체 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab, scFv, 하프 항체, 또는 단일 도메인 항체(VH))의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 커플링된다. 포맷의 예가, 예컨대 도 1, 2a, 3a-3d, 6a, 11a 및 12a에 제공된다.
일부 실시양태에서, IFM은, (예컨대, 도 1, 2a, 3a-3d, 6a, 11a 및 12a에 도시되는 바와 같이) 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-21, IL-27, 또는 시토카인 수용체, 예컨대 IL-15R알파 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄를 포함한다. 경쇄- 또는 중쇄-시토카인 분자의 임의의 배향 조합이 IFM에 존재할 수 있다.
예컨대, IFM은, (예컨대, 도 3a 및 3c에 도시되는 바와 같이) 경쇄의 N-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 전체 항체 또는 2개의 동일한 하프-항체, 예컨대 제1 및 제2 항체(각각은 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄를 가짐)의 사량체를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, IFM은, (예컨대, 도 2a, 3a, 3c 및 6a에 도시되는 바와 같이) 경쇄의 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 전체 항체 또는 2개의 동일한 하프-항체, 예컨대 제1 및 제2 항체(각각은 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄를 가짐)의 사량체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 상술된 포맷과 조합하여, IFM은, (예컨대, 도 6a에 도시되는 바와 같이) 중쇄의 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 전체 항체 또는 2개의 동일한 하프-항체, 예컨대 제1 및 제2 항체(각각은 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄를 가짐)의 사량체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 상술된 포맷과 조합하여, IFM은, 중쇄의 N-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 전체 항체 또는 2개의 동일한 하프-항체, 예컨대 제1 및 제2 항체(각각은 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄를 가짐)의 사량체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 상술된 포맷과 조합하여, IFM은, (예컨대, 도 2a, 3b, 3d, 11a, 및 12a에 도시되는 바와 같이) 중쇄 가변 도메인의 N- 또는 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 갖는 항체 단편(예컨대, scFv, Fab)을 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 상술된 포맷과 조합하여, IFM은, 경쇄 가변 도메인의 N- 또는 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 갖는 항체 단편(예컨대, scFv, Fab)을 포함할 수 있다.
대안적으로, IFM은 2개의 상이한 하프-항체, 예컨대 제1 및 제2 항체의 사량체를 포함하며, 여기서 제1 항체는 경쇄의 N-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄 (또는 이의 단편, 예컨대 scFv 또는 Fab)를 갖고; 제2 항체는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체), 항-CD8, 항-CD18, 또는 항-CD11a의 경쇄 및 중쇄 (또는 이의 단편, 예컨대 scFv 또는 Fab)를 갖는다. 동일하거나 상이한 표적물에 대한 항체의 임의의 짝지음, 예컨대 CD45:CD8, CD45:CD18, CD45:CD11a, CD8:CD18, CD8:CD11a, 또는 CD18:CD11a가 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, IFM은, (예컨대, 도 6a에서 도시되는 바와 같이) 중쇄 및 상응하는 경쇄의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에서 시토카인 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 스시 도메인에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체) 또는 항-CD8의 중쇄를 포함한다. 실시양태에서, 시토카인 분자는 중쇄의 C-말단에 공유적으로 연결된다.
다른 실시양태에서, IFM은, 비시토카인 면역자극 분자, 예컨대 면역자극 분자의 효능제에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체) 또는 항-CD8의 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 자극 분자는 CD137, OX40, GITR, CD3, 또는 CD28의 효능제이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극 분자의 효능제는 항체 분자 또는 리간드이다. 예컨대, 면역 자극 분자의 효능제는 CD137, OX40, GITR, CD3, 또는 CD28에 대한 효능제 항체 분자이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극 분자는 중쇄 및 상응하는 경쇄의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 연결된다. 실시양태에서, 면역자극 분자는 중쇄의 C-말단에 공유적으로 연결된다.
다른 실시양태에서, IFM은, 음성 면역 조절제의 억제제, 예컨대 체크포인트 억제제의 억제제에 커플링된, 예컨대 공유적으로 연결된, 항-면역 세포 표적화 항체 분자, 예컨대 항-CD45(예컨대, BC8 항체) 또는 항-CD8의 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 음성 면역 조절제의 억제제는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4로부터 선택되는 체크포인트 억제제의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극 분자의 효능제는 항체 분자 또는 리간드이다. 예컨대, 체크포인트 억제제의 억제제, 예컨대 항체 분자는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4에 결합하고/하거나 이를 억제한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(LC-chBC8-sushi, sushi-LC-chBC8, LC-chBC8-L1-IL15, IL15-LC-chBC8 및 HC-chBC8-Fab, HC-chBC8-IgG4S228P)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4로부터 선택되는 경쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)(실시양태에서, IFM은 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함); 및
(ii) 서열 번호 5 또는 6으로부터 선택되는 중쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 5 또는 6과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 5 또는 6과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 5 또는 6과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chBC8-IgG4S228P-IL15 및 LC-chBC8)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 7에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 카파로부터의 불변 도메인 서열을 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 7과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 8과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열번호 8과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 7 또는 8과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-ch9.4-Fab 및 LC-ch9.4-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 15에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 15의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 15와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 14에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 14와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 15와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 14 또는 15와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-ch4B2-Fab 및 LC-ch4B2-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 16에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 16의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 16과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 17에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 17과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 17과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 16 또는 17과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-hBC8(23)-Fab 및 LC-hBC8(23)-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 18의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 18과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 19에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 19와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 19와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 18 또는 19와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chBC8-Fab 및 LC-chBC8-L2-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 5의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 5와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 21에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 21과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 21과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 21 또는 5와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chBC8-Fab 및 LC-chBC8-L3-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 5의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 5와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 22에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 22와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 22와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 22 또는 5와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chMHM24-Fab 및 LC-chMHM24-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 26의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 26과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 27과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 27과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 26 또는 27과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chMHM24-Fab 및 LC- chMHM24-scIL12p70)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 26의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 26과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 50 또는 51에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 50 또는 51과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 50 또는 51과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 50 또는 51 또는 26과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chMHM24-Fab 및 LC- chMHM24-IL7)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 26의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 26과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 42 또는 43에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 42 또는 43과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열번호 42 또는 43과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 42 또는 43 또는 26과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chMHM24-Fab 및 LC-MHM24-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 26의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 26과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 27과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 27과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 27 또는 26과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-ch1B4-Fab 및 LC-ch1B4-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 28의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 28과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 29에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 29와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 29와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 28 또는 29와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, HC-chOKT8-Fab 및 LC-chOKT8-IL15)은 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 30에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 30의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 30과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열); 및
(ii) 각각 서열 번호 31에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 31과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 31과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열). 실시양태에서, IFM은 서열 번호 30 또는 31과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, BC8scFv-IL15)은 서열 번호 32에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 각각 서열 번호 32의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일하거나, 서열 번호 32와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, 사가 CD137 효능제)는 항-CD137 효능제 단일쇄 가변 단편 항체의 C-말단에 공유적으로 융합된 항-CD45 인간화된 IgG4(예컨대, 인간화된 BC8)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IFM은 IgG4의 C-말단 상에 추가의 항-CD137 scFv를 추가로 포함함으로써, 예컨대 CD45에 대해 이가이고 CD137에 대해 사가인 분자를 생성한다. 다른 실시양태에서, IFM은 또한 상기 규정된 항-CD45 IgG4를 IgG의 C-말단에 독점적으로 융합된 scFv 항-CD137 효능제를 함께 포함함으로써 CD45에 대해 이가이고 CD137에 대해 이가인 분자를 생성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM(예컨대, 이가 CD137 효능제)은 Fab의 중쇄 및 경쇄의 C-말단을 통해 항-CD137 효능제 단일쇄 가변 단편 항체의 N-말단에 공유적으로 융합된 항-CD45 인간화된 IgG1 Fab(예컨대, 인간화된 BC8)를 포함함으로써 CD45에 대해 일가이고 CD137에 대해 이가인 분자를 생성할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 IFM을 포함하는 중합체성 스캐폴드, 예컨대 중합체성 히드로겔, 예컨대 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 예컨대 IFM을 포함하는 히드로겔을 제공한다. 중합체는 또한 폴리펩티드, 키토산, PVA(폴리비닐 알콜), PLA(폴리락트산), PEG(폴리에틸렌 글리콜), 또는 블럭 공중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 다수의 상이한 폴리펩티드 또는 중합체를 포함한다. 일 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 하나의 IFM을 포함한다. 다른 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 하나 이상의 상이한 IFM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 생분해성이다. 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 시간에 따라 수동 확산을 통해 및/또는 중합체성 스캐폴드의 분해를 통해 IFM을 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 적어도 부분적으로, 예컨대, 제한 없이, 본원에 개시된 링커를 사용하여 화학적 가교에 의해 형성된다. 중합체는 중합체 쇄들 사이의 공유적 가교링커 또는 비공유적 상호작용(예컨대, H-결합, 정전기적 상호작용, 또는 반 데르 발스 상호작용)을 이용하여 가교된 중합체 네트워크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교링커는, 예컨대 디술파이드 결합 또는 산-불안정 에스테르기를 포함함으로써, 예컨대, 제한 없이, 환경의 변경된 산화환원 상태 또는 변경된 pH에 의해 가역성이다. 다른 산-불안정 링커는, 예컨대 시스-아코니트산 링커, 아세탈, 케탈, 활성화된 아미드, 예컨대 2,3 디메틸말레암산의 아미드, 비닐 에테르, 다른 활성화된 에테르 및 에스테르, 예컨대 에놀 또는 실릴 에테르 또는 에스테르, 이민, 이미늄, 에나민, 카바메이트, 히드라존, 및 당해 분야에 공지된 다른 연결일 수 있다.
실시양태에서, 하나 이상의 IFM을 포함하는 중합체성 스캐폴드는 이를 필요로 하는 피험체에게 투여된다. 실시양태에서, 하나 이상의 IFM을 포함하는 중합체성 스캐폴드는 국소적으로(예컨대, 종양내) 투여된다. 실시양태에서, 중합체성 스캐폴드는 체내 주사 또는 이식 시, 예컨대 1000 cP 이상의 점도 증가로 고형화되는 액체이다.
다른 측면에서, 본 개시는, 본원에 개시된 IFM을 포함하는, 입자, 예컨대 나노입자, 예컨대 단백질(예컨대, 본원에 기재된 단백질 나노겔)을 포함하는 나노입자를 제공한다. 일 실시양태에서, 입자는 동일한 IFM을 포함한다. 다른 실시양태에서, 입자는 하나 이상의 상이한 유형의 IFM을 포함한다.
실시양태에서, 본원에서의 조성물은 입자, 예컨대 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 나노입자 및 마이크로입자 둘 다를 포함한다. 실시양태에서, 입자, 예컨대 나노입자는 30 nm 내지 1200 nm, 40 nm 내지 1,100 nm, 50 nm 내지 1,000 nm, 예컨대 50-500 nm, 보다 전형적으로, 70 내지 400 nm의 평균 유체역학 직경(예컨대, 동적 광산란에 의해 측정됨)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 리포솜, 단백질 나노겔, 뉴클레오티드 나노겔, 중합체 나노입자, 또는 고체 나노입자를 포함한다. 실시양태에서, 입자는 임의적으로 입자 표면 상에 적어도 하나의 중합체, 양이온성 중합체, 또는 양이온성 블럭 공중합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 나노입자는 산화환원(디술파이드) 또는 pH(가수분해성 기) 또는 효소(프로테아제)에 민감한 가역성 링커에 의해 가교되는 나노겔을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 IFM은 본원에서 제공되는 바와 같이 서로 가교될 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 IFM은, 제한 없이, 단백질-친수성 중합체 컨주게이트(예컨대, PEG로 가역적으로 변형됨), 단백질-소수성 중합체 컨주게이트(예컨대, 가역적으로 변형된 PLA 또는 PLGA), 벌크 가교된 단백질 히드로겔, 가교된 단백질 나노겔 입자, 상이한 쉘 물질(예컨대, 지질, 중합체 또는 실리카)을 갖는 단백질 나노캡슐, 단백질-컨쥬게이션된 나노입자(예컨대, 미셀, 중합체성 나노입자, 무기 나노입자) 및 리포솜을 포함하는 다양한 나노구조물로 형성 또는 자가 조립될 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 서로 가교된 단백질은 단백질 나노구조물로 형성될 수 있거나 자가 조립될 수 있다.
실시양태에서, 임의적으로, IFM은, 예컨대 임의적으로 분해성 링커(예컨대, 디술파이드 링커)를 통해, 나노입자의 단백질-친수성 중합체에 공유적으로 커플링, 예컨대 가교되며, 생물학적으로 활성인 상태로 남아, 예컨대 이의 기능을 유지한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 세포 요법, 예컨대 면역요법에 대해 상당한 이익을 제공한다.
실시양태에서, IFM을 포함하는 입자는 유핵 세포, 예컨대 면역 세포를 추가로 포함한다(본원에서 "유핵 세포-나노입자 복합체"로도 지칭됨).
따라서, 본 개시는 IFM 및 입자, 예컨대 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 유핵 세포 및 적어도 하나의 IFM 및/또는 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
실시양태에서, 입자는 유핵 세포에 정전기적 당김에 의해 세포 표면과 연합된다. 실시양태에서, 나노입자는 적어도 하나의 리간드를 포함하고, 리간드는 유핵 세포의 표면 상의 단백질, 탄수화물 또는 지질에 대해 친화성을 갖는다.
실시양태에서, 입자는, 예컨대 유핵 세포, 예컨대 면역 세포의 표면에 공유적으로 컨주게이션된다. 실시양태에서, 나노입자는 유핵 세포에 공유적으로 컨주게이션되지 않는다.
실시양태에서, 입자는 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4, 5개 이상의) 치료 단백질, 예컨대 시토카인 분자(예컨대, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-4, IL-1알파, IL-1beta, IL-5,　IFN감마, TNF알파(TNFa), IFN알파, IFNbeta, GM-CSF, 또는 GCSF, 및 이의 변이체 형태, 예컨대 돌연변이체; 폴리펩티드와 함께 시토카인 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 시토카인 수용체 복합체; 이의 융합 또는 효능제 형태); 성장 인자; 및 다른 분자, 예컨대 공동자극 분자에 대한 항체 분자 또는 효능제 리간드(예컨대, 공동자극 분자는 CD137, OX40, CD28, GITR, VISTA, 항-CD40, 또는 CD3으로부터 선택됨)로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 치료 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 상술된 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에서 언급되는 모든 공개문, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조문은 전부 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이지 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 세포-표면 표적화 및 자극을 위해 시토카인 및 면역글로불린 모이어티를 조합하는 본 개시의 예시적인 융합 단백질을 도시한다.
도 2a-2c는 다양한 항체 포맷을 포함하는 IFM을 도시한다. 도 2a는 다양한 항체 포맷을 포함하는 IL-15 IFM의 개략도를 도시한다. 도 2b 및 2c는 셀타이터 블루(CellTiter Blue)(도 2b) 또는 유동 세포측정 카운팅 비드(도 2c)를 사용하는 펄스 검정에서 CD8 T 세포 확장에 대한 IFM의 평가를 도시한다.
도 3a-3d는 IL-15/sushi 복합체와 항-CD45 항체 사이의 다양한 융합 전략에 대한 개략도를 도시한다. 도 3a 및 3b는 chBC8 IgG(도 3a) 또는 chBC8 Fab(도 3b) 경쇄의 N- 또는 C-말단에 대한 IL-15의 융합을 위한 개략도를 도시한다. 항체 융합물은 IL-15와의 고친화성 상호작용을 통한 IL-15Rα-sushi와의 복합체를 포함한다. 도 3c 및 3d는 chBC8 IgG(도 3c) 또는 chBC8Fab(도 3d) 경쇄의 N- 또는 C-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합을 위한 개략도를 도시한다. 항체 융합은 IL-15R-sushi와의 고친화성 상호작용을 통한 IL-15N72D와의 복합체를 포함한다.
도 4a-4b는 CD8 T 세포 확장에 대한 다양한 융합 전략을 포함하는 IFM의 효과를 도시한다(도 4a 및 4b). IL-15N72D 및 chBC8 Fab(도 4a) 또는 chBC8 IgG(도 4b)를 포함하는 IFM은 펄스 생물검정에서 T 세포 확장에 대해 평가되었다. CD8 T 세포 증식은 셀타이터 블루를 사용하여 분석되었고; IL15N72D/sushiN77I-Fc 및 비자극된 T-세포(음성 대조군)는 비교를 위해 포함되었다.
도 5a-5d는 야생형 또는 돌연변이된 IL-15를 포함하는 IFM의 생물학적 활성 및 항-CD45 항체에 대한 IL-15/sushi 복합체의 다양한 융합 전략을 도시한다. 도 5a 및 5b는 IFM과의 펄스 인큐베이션 후 3일에 셀타이터 블루를 사용하는 펄스 검정에서 CD8 T 세포 확장에 대해 평가된, 야생형 IL-15 또는 IL-15N72D 및 chBC8 Fab(도 5a) 또는 chBC8 IgG(도 5b)를 포함하는 IFM을 도시한다. 도 5c 및 5d는 3일 동안 IFM과의 인큐베이션 후 셀타이터 블루를 사용하는 일정한 노출, 예컨대 정적 검정 포맷에서 CD8 T 세포 확장에 대한 chBC8 Fab(도 5c) 또는 chBC8 IgG(도 5d)를 포함하는 IFM의 평가를 도시한다.
도 6a-6b는 chBC8 IgG 경쇄 또는 중쇄에 대한 C-말단 융합을 포함하는 IFM을 도시한다. 도 6a는 chBC8 IgG 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 IL-15 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 복합체를 포함하는 IFM의 개략도를 도시한다. 도 6b는 펄스 생물검정에서 CD8 T 세포 확장에 대한 IFM의 효과를 도시한다.
도 7a-7c는 IFM은 개선된 활성을 위해 항체 단편의 기능성 결합을 필요로 한다는 것을 도시한다. 도 7a 및 7b는 셀타이터 블루를 사용하는 펄스 검정에서 CD8 T 세포의 확장에 대해 평가된 가용성 BC8 IgG 경쟁자의 존재 또는 부재 하에 chBC8 Fab(도 7a) 또는 chBC8 IgG(도 7b)를 포함하는 IL-15 IFM을 도시한다. 도 7c는 펄스 생물검정에서 CD8 T 세포 확장에 대한 인간화된 BC8 Fab 단편 또는 CD45에 대한 결합을 제거하는 돌연변이된 CDR-H3을 함유하는 인간화된 BC8 Fab 단편을 포함하는 IL-15 IFM의 평가를 도시한다.
도 8a-8c는 IFM의 세포 표면 로딩 및 지속성을 도시한다. 도 8a는 형광 표지된 항-IL15 또는 항-IgG 항체로의 염색에 의해 검출되는 IFM의 펄싱 후 MFI를 나타내는 유동 세포측정 히스토그램을 도시한다. 도 8b는 시간에 따른 IL-15의 세포 표면 염색의 지속성을 도시한다. 도 8c는 유동 세포측정 카운팅 비드를 사용하여 측정된 시간에 따른 세포 밀도를 도시한다.
도 9a-9b는 IL-15와 chBC8 사이에 다양한 링커 조성을 포함하는 IFM의 평가를 도시한다. 도 9a는 chBC8 Fab 경쇄의 C-말단에 대한 IL-15의 융합을 위한 3개의 상이한 링커의 아미노산 서열을 도시한다. 도 9b는 셀타이터 블루를 사용하는 펄스 생물검정에서 CD8 T 세포 확장을 위한 상이한 링커 조성을 포함하는 IFM의 평가를 도시한다.
도 10a-10b는 대안적 CD45 항체 클론을 포함하는 IFM의 평가를 도시한다. 도 10a는 T 세포 상에 발현된 CD45에 대한 다양한 CD45 항체 클론의 결합 친화성을 도시한다. 도 10b는 셀타이터 블루를 사용하는 펄스 생물검정에서 상이한 항-CD45 항체 클론을 포함하는 IL-15 IFM의 평가를 도시한다.
도 11a-11b는 CD8, CDlla, 또는 CD18를 표적하는 항체를 포함하는 IFM을 도시한다. 도 11a는 대안적 세포 표면 수용체를 표적하는 Fab 항체 단편의 경쇄 C-말단에 대한 IL-15의 융합을 포함하는 IL-15 IFM의 개략도를 도시하며; IFM은 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이에 비공유적 연합을 포함한다. 도 11b는 셀타이터 블루를 사용하는 펄스 생물검정에서 CD8 T 세포 확장에 대한 IL-15 IFM의 평가를 도시한다.
도 12a-12b는 CD4 또는 CD8 T 세포에 대한 항-CD8을 포함하는 IFM의 효능 평가를 도시한다. 도 12a는 항-CD8 Fab 경쇄의 C-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함하는 IL-15 IFM의 개략도를 도시한다. 도 12b는 셀타이터 블루를 사용하여 펄스 생물검정에서 정제된 CD4 또는 CD8 T 세포에 대한 항-CD8 IFM의 효능 평가를 도시한다. CD4 또는 CD8 T 세포는 자기 비드 분류를 사용하여 (자연적으로 CD4와 CD8 T 세포의 혼합물을 포함하는) 총 T 세포로부터 정제된다.
도 13a-13c는 IL-15 IFM을 포함하는 나노입자가 T 세포 확장을 지지한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 13a 및 13b는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석된 단백질 나노겔로의 IFM의 가교를 도시하고(도 13a); IL15N72D/sushiL77I-Fc를 포함하는 단백질 나노겔은 비교를 위해 제시된다(도 13b). IL-15 IFM 또는 IL15N72D/sushiL77I-Fc를 포함하는 백팩은 펄스 생물검정으로 CD8 T 세포 확장에 대해 평가되었다(도 13c). 세포 밀도는 유동 세포측정 카운팅 비드를 사용하여 분석되고; 데이터는 확장 배수로 표시된다.
도 14a-14b는 프라이밍이 ACT 효능을 개선할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 15는 플랫폼의 다양성을 설명하는 면역표적된 표면 수용체 및 시토카인의 예를 나타낸다.
도 16a-16e는 IL-15 테더링된 융합물이 고형 종양 모델에서 종양-특이적 T 세포 요법을 개선한다는 것을 나타낸다.
도 17a-17g는 테더링된 융합 플랫폼이 CD8-표적된 IFM과의 펄스 인큐베이션에 의해 활성화된 총 CD3 인간 T 세포의 배양물에서 CD8 T 세포의 선별적인 세포 표적화 및 개선된 확장을 가능하게 할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 18a-18e는 IL-15의 다양한 돌연변이된 형태의 세포 활성 및 IL-15 돌연변이체를 포함하는 IFM의 표면 지속성을 나타낸다.
도 19a-19c는 야생형 또는 돌연변이된 IL-15를 포함하는 CD8-표적된 IFM에 의한 세포 표적화 및 CD8 T 세포 확장을 나타낸다.
도 20은 야생형 또는 돌연변이된 IL-15를 포함하는 CD45-표적된 IFM의 표면 지속성을 나타낸다.
도 21은 IL-15 테더링된 융합물이 IL-15 수용체 하류의 지속적 신호전달을 지지한다는 것을 나타낸다.
도 22a-22d는 항-CD45 항체 및 IL-12를 포함하는 4개의 예시적인 구축물("항-CD45-IL12-TF" 또는 "αCD45-IL12-TF"또는 "IL12-TF"로도 지칭됨)을 도시한다.
도 23은 항-CD45-IL12-TF가 IL-12의 강한 세포 로딩 및 강한 표면 지속성을 지지한다는 것을 나타낸다.
도 24는 IL-12 테더링된 융합물이 지속적 STAT4 인산화를 유도하고, STAT4 인산화가 IL-12 및 IL-15 테더링된 융합물로의 조합 처리에 의해 증대된다는 것을 나타낸다.
도 25는 IL-15 및 IL-21 IFM의 조합의 표면 로딩 및 지속성을 나타낸다.
도 26은 CD45-표적된 IL-15 및 CD8-표적된 IL-21 IFM의 조합의 표면 로딩을 나타낸다.
도 27a-27b는 IL-15 및 IL-21 IFM의 조합으로부터의 STAT5 인산화를 나타낸다.
도 28은 IL-12 및 IL-15 IFM의 조합으로부터의 표면 로딩을 나타낸다.
도 29는 IL-12 및 IL-15 IFM의 조합으로부터의 STAT4 인산화를 나타낸다.
도 30은 CD45-테더링된 IL-15-D61H IFM 및 CD18-테더링된 야생형 IL-15 IFM의 조합에 의한 T 세포 확장을 나타낸다.
도 31은 CD45, CD11a, 또는 CD18을 표적하는 다양한 인간화된 항체를 사용한 IL-12 또는 IL-15의 표면 로딩을 나타낸다.
도 32는 마우스 T 세포 테더링된 IL-12의 표면 지속성을 나타낸다.
도 33은 마우스 T 세포 테더링된 IL-12의 정량화를 나타낸다.
도 34a-34b는 테더링된 융합물이 시스, 트랜스로 및 표적 세포로의 전달에 의해 신호를 보낼 수 있음을 도시하는 개략도를 나타내고, IL-12 테더링된 융합물에 의한 로딩된("시스"), 비로딩된 표적 세포("트랜스" 및 "전달된")에서 STAT4 인산화의 활성화를 나타낸다.
도 35a는 종양 성장, 마우스 중량 변화, 생존(ACT 후 100일까지)을 나타낸다.
도 35b는 대용물 IL12-TF 리드 후보물을 운반하는 Pmel 세포가 전달 및 내인성 면역 세포의 일시적 림프구감소증을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 35c-35d는 순환 내인성 CD8 T 세포의 증식(Ki67 양성을 통함)을 나타낸다.
도 35e는 내인성 NK 세포 증식(Ki67 양성을 통함) 및 활성화(CD69 양성을 통함)를 나타낸다.
도 36은 IL12-TF가 입양 전달되는 T 세포 상으로 사전-로딩되거나 가용성 상태로 공동투여 시 종양-특이적 T 세포 요법을 증대시킨다는 것을 나타낸다.
도 37a는 IL12-TF를 운반하는 단일 또는 다수 용량의 종양-특이적 T 세포에 따른 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 37b는 IL12-TF를 운반하는 단일 또는 다수 용량의 종양-특이적 T 세포로부터의 생존을 나타낸다.
도 37c는 IL12-TF가 생체내에서 종양-특이적 T 세포 확장 및 생착을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
도 37d는 IL12-TF를 운반하는 1회 또는 2회 용량의 종양-특이적 T 세포로의 처리에 따른 체중 변화를 나타낸다.
도 38은 2개의 IL12-TF 중 하나를 운반하는 Pmel로의 ACT 후 IFN-γ 혈장 수준을 나타낸다.
도 39는 2개의 IL12-TF 중 하나를 운반하는 Pmel로 ACT 후 CXCL10 혈장 수준을 나타낸다.
도 40a-40d는 야생형 또는 돌연변이된 IL-15를 포함하는 CD8-표적된 IFM의 생체내에서의 CD8 T 세포에 대한 특이적 결합 및 순환 CD4 T, CD8 T, 및 NK 세포에 대한 CD8-표적된 IFM의 활성을 나타낸다.
도 41a-41c는, 야생형 또는 돌연변이된 IL-15 변이체를 포함하는 CD8-표적된 IFM의 안전성과 비교하여, 증가하는 용량 또는 투여 스케쥴에 따른 IL-15의 독성을 나타낸다. *는 2차 투여를 나타낸다.
도 42a-42b는 IL-12, CD8-표적된 IL-12 IFM, 또는 2개의 상이한 CD45-표적된 IL-12 IFM에 의한 용량 점증으로부터의 항종양 효능 및 체중 변화를 나타낸다.
본 개시는 특히 면역자극 융합 분자 또는 IFM의 조성물 및 관련된 이용 방법을 제공한다. 본원에 기재된 "IFM"은 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자(예컨대, 생물학적으로 활성인 시토카인), 및 면역 세포 표적화 모이어티, 예컨대 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포에 결합할 수 있는 항체 분자(예컨대, 항체 또는 항체 단편)를 포함한다. 실시양태에서, 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적화 모이어티는(예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 등에 의해) 기능적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물에 결합함으로써 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자를 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포(예컨대, 림프구)에 표적할 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, 면역 세포 표면 표적물에 면역 세포 표적화 모이어티의 결합은, 예컨대 유리 시토카인 분자의 이의 시토카인 수용체와의 연합과 비교하여, 면역 세포 상에 면역 자극 모이어티의 수용체, 예컨대 시토카인 수용체를 갖는 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자의 표면 상의 농도, 예컨대 시간 경과에 따른 농도를 증가시키는 것으로 믿어진다. 이는 IFM에 의해 결합된 면역 세포 자체(자가분비 신호전달), 및/또는 또 다른 (예컨대, 인접하는) 면역 세포(주변분비 신호전달) 상에 면역 효과를 초래할 수 있다. 유리하게는, 다른 치료, 예컨대 가용성 시토카인, (시토카인으로) 무장된(armored) CAR-T 및 (면역 세포 상의) 나노겔 백팩과 비교하여, 본 개시의 테더링된 융합물은 균형 잡힌 이중 자가분비 및 주변분비 활성을 제공하여 충분히 높은 활성 및 낮은 독성 둘 다의 이익을 조합할 수 있다. 대조적으로, 전신 활성을 제공하는 가용성 시토카인의 전달은 이의 높은 독성이 알려져 있다. 무장된 CAR-T는 주변분비 및 전신 활성 뿐만 아니라 전신 독성을 제공하는 시토카인을 국소적으로 분비할 수 있다. 나노겔 백팩, 예컨대 미국 공개 번호 2017/0080104, 미국 특허 번호 9,603,944, 미국 공개 번호 2014/0081012, 및 PCT 출원 번호 PCT/US2017/037249(각각 전부 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 것은 매우 국소화된 자가분비 활성을 제공할 수 있어 특정 시토카인(예컨대, IL-15)에 대해서는 바람직할 수 있다. 그러나, 주변분비가 필요한 시토카인(예컨대, IL-12)에 대해서는, 본원에 개시된 테더링된 융합물이 균형 잡힌 자가분비 및 주변분비 활성을 위한 적합한 스폿일 수 있다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 테더링된 융합물은 면역 세포 상에 테더링되면 (또는 로딩되면) 시스로 신호를 보내고, 인접하는 표적 면역 세포로는 트랜스로 신호를 보내고, 원래의 백팩-로딩된 세포에 근접하지 않은 표적 면역 세포로는 전달에 의해 신호를 보낼 수 있다.
실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는, 예컨대 지정된 시간에 걸쳐, 면역 세포 상의 면역 자극 모이어티의 결합, 이용가능성, 활성화 및/또는 신호전달 중 하나 이상의 증가를 초래한다. 실시양태에서, IFM은 시토카인 분자의 신호전달 기능을 실질적으로 방해하지 않는다. 이러한 표적화 효과는 면역 세포의 증식 및 활성화의 국소적이고 연장된 자극을 초래함으로써 면역 반응의 제어된 확장 및 활성화를 유도한다. 본원에 기재된 IFM은, 시토카인 분자의 면역자극 생물활성(예컨대, 신호전달 활성 및/또는 효능)을 보유하면서, 공지된 시토카인에 비해 감소된 부작용, 예컨대 보다 낮은 전신 독성을 포함하는 몇몇 이점을 제공한다.
면역시토카인-항체-시토카인 융합 단백질의 선행 개시는 전형적으로 그들의 시토카인 성분을 통해 이펙터 기능을 강화시키기 위해 그들의 항체 성분을 통해 질환 항원(예컨대, 종양 연관된 항원, 예컨대 세포막 항원 및 세포외 기질 성분)을 표적하도록 설계된다(Clin. Pharmacol. 2013; 5(Suppl 1): 29-45. Thomas List and Dario Neri. Published online 2013 Aug 20. doi: 10.2147/CPAA.S49231 PMCID: PMC3753206). 시토카인의 치료적 이용에 대한 예시적 장애는 그들의 짧은 혈청 반감기 및 제한된 생체이용성과 관련된다. 높은 용량의 시토카인이 이들 장애를 극복할 수 있지만, 용량-제한 독성이 초래된다. 결과적으로, 대부분의 시토카인은 독성을 감소시키고 반감기를 증가시키기 위한 단백질 조작 접근을 필요로 한다. 구체적인 전략은 페길화, 항체 복합체 및 융합 단백질 포맷, 및 돌연변이유발을 포함한다(Antibodies 2013, 2, 426-451; doi:10.3390/antib2030426 Rodrigo Vazquez-Lombardi Brendan Roome and Daniel Christ).
본 개시는 특히 시토카인 및 융합 단백질을 특정 조성의 수용체를 갖는 면역 세포(예컨대, 건강한 및/또는 비악성)로 표적하는 기능을 하는 표적화 모이어티의 공유적 컨주게이트로서 융합 단백질을 제공한다. 프로-염증성 시토카인을 표적화 모이어티, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편(예컨대, 단일쇄 Fv, Fab, IgG)에 융합시키면 융합 단백질을 관심 세포로 유도하고 시토카인의 세포 표면 이용가능성을 증진시킨다. 관심 세포는 특히 면역 세포, 특별히 림프구 및 바람직하게는 T-세포(예컨대, 총 CD3 T 세포, CD4 T 세포, 또는 CD8 T 세포)를 포함하고, 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 CD8 T 세포의 서브세트를 활성화시킬 수 있다. 면역 세포를 포함하는 관심 세포는 생체내(예컨대, 피험체내), 시험관내 또는 생체외(예컨대, 세포 기반 요법)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표면 표적물은 면역 세포의 표면에 풍부하게 존재한다(예컨대, 면역 세포 표면 상에 존재하는 시토카인 분자에 대한 수용체의 수보다 많다). 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물, 예컨대 CD4, CD8, CD18, CD11a, CD11b, CD11c, CD19, CD20 또는 CD45로부터 선택되는 표적물에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자로부터 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자를 포함한다.
CD45는 풍부한 수용체의 예이다. CD45는 또한 백혈구 공통 항원으로 공지되어 있고, 세포 활성화를 돕는 적혈구를 제외한 조혈 세포 상에 존재하는 I형 막횡단 단백질이다(예컨대, 문헌(Altin, JG, Immunol Cell Biol. 1997 Oct;75(5):430-45)을 참조). IFM의 표적화 모이어티의 다른 수용체는 이상적으로 세포 표면 상에 유지되고 세포(예컨대, 지속적인 수용체)에 의한 내재화에 저항성이 있다. 풍부하고 지속적인 수용체의 예가 CD45이다. 대안적으로, 표적화 모이어티의 수용체는 세포에 의해 구성적으로 회전되고, 예컨대 내재화되고, 표면으로 재순환됨으로써 그들의 동적 내재화(재순환 수용체)에도 불구하고 융합 단백질에 대한 상당한 결합 기회를 허용한다. CD22는 재순환 수용체의 예이다.
시토카인 수용체의 발현 수준은 (i) 세포 유형, 및 (ii) 세포의 활성화 상태를 포함하는 다양한 인자에 기반하여 달라질 수 있다. 실시양태에서, 발현 수준은 시토카인 신호 전달, 신호 세기 및 지속기간 중 하나 이상에 영향을 끼칠 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 세포 표면 상에서 발현되는 수용체는 효과적인 비율로 존재하여 표적화 모이어티에 대한 수용체의 수는 세포 표면 상의 시토카인 성분에 대한 수용체의 수를 초과한다. 이러한 효과적인 비율은 표적화 모이어티 수용체가 지속적일 때; 또는 대안적으로; 그들의 세포 표면 밀도가 수용체를 세포의 표면으로 복원하는 재순환 메카니즘에 의해 효과적으로 유지되어 결과적으로 시토카인 성분을 초과하는 표적화 성분에 대한 결합 기회를 허용할 때 실현된다. 재순환되는(예컨대, 내재화되고 세포 표면으로 반송되는) 수용체의 경우, 항체 수용체는 단백질의 시토카인 성분에 대한 결합 기회에 초과하여 표적화 모이어티에 대한 결합 기회를 허용하는 효과적인 비율로 존재할 것이다. 이러한 효과적인 비율은 세포 표면에 대한 시토카인 국소화를 허용하고 결과적으로 (동적 존재, 내재화 및 표적화 수용체의 표면으로 반송에도 불구하고) 시토카인이 그 자신의 세포-표면 수용체에 결합하는 시간 및 이용가능성을 증가시킨다.
일부 경우에, 형질막 수용체에 의해 개시되는 신호전달의 조절은 세포내이입과 커플링된다. 활성화된 수용체의 내재화는 신호 감쇠를 위한 수단일 뿐만 아니라 수용체 신호전달의 지속기간 및 신호전달 출력 특이성을 조절한다(Barbieri, P.P. Di Fiore, S. Sigismund. Endocytic control of signaling at the plasma membrane Curr. Opin. Cell Biol., 39 (2016), pp. 21-27). 엔도솜은 다중단백질 신호전달 어셈블리의 형성을 촉진하고 결과적으로 공간 및 시간에서 효과적인 신호 익스팬더(Expander)를 가능하게 하는 모바일 신호전달 플랫폼으로 작용할 수 있다. 형질막에서 개시되는 일부 신호전달 이벤트, 예컨대 시토카인-신호전달 이벤트가 엔도솜 구획으로부터 계속될 수 있다.
본 개시의 IFM은 일반적으로 일반적으로 효능적 시토카인, 특히 IL-15, IL-7, IL-21, 및 IL-12p70의 개선된 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 다른 효능적 시토카인은 IL-2, IL-6, 및 IL-27을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 프로-염증성 시토카인, 예컨대 IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 또는 IL-27, 및 이의 변이체 형태(예컨대, 시토카인 유도체, 폴리펩티드와 함께 시토카인 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 시토카인 수용체 복합체, 및 이의 다른 효능제 형태) 중 하나 이상으로부터 선택되는 시토카인을 포함한다. 일 실시양태에서, 시토카인 분자는 (1개의 IFM 또는 2개의 IFM에서) IL-15 및/또는 IL-12를 포함한다.
일 예시적 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 항-CD45 항체 분자로부터 유래되고, 시토카인 분자는 임의적으로 IL-15 수용체 알파 서브유닛의 스시 도메인에 복합체화된 인터루킨-15이다(αCD45-IL15 및 αCD45-IL15/sushi). 또 다른 예시적 실시양태에서, IFM의 면역 세포 표적화 모이어티는 항-CD45 항체 분자로부터 유래되고, 시토카인 분자는 인터루킨-12이다(αCD45-IL12). αCD45-IL15/sushi IFM 및 αCD45-IL12 IFM은, 예컨대 조합 요법으로 함께 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, IFM은 상이한 세포 표면 분자, 예컨대 면역 세포 표적화 모이어티가 CD45 이외의 풍부 또는 지속적인 세포 표면 수용체, 예컨대 CD4, CD8, CD18, CD11a, CD11b, CD11c, CD19, 또는 CD20으로부터 선택되는 표적물을 표적하는 항체로부터 유래되는 IFM에 테더링될 수 있다. IFM은 시토카인, 예컨대 임의적으로 IL-15 수용체 알파 서브유닛의 스시 도메인에 복합체화된 인터루킨-15 및/또는 인터루킨-12를 함유할 수 있다. IFM은, 예컨대 αCD45-IL15, αCD45-IL15/sushi, 또는 αCD45-IL12와의 조합 요법으로 함께 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 동일한 또는 상이한 세포 표면 수용체에 테어링된 추가의 시토카인을 포함하는 IFM은, 예컨대 조합 요법으로 함께 사용된다. 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표면 표적물, 예컨대 CD4, CD8, CD18, CD11a, CD11b, CD11c, CD19, CD20 또는 CD45로부터 선택되는 표적물에 결합하는 항체 분자 또는 리간드 분자로부터 선택될 수 있고, 프로-염증성 시토카인은, 예컨대 IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 또는 IL-27, 및 이의 변이체 형태 중 하나 이상으로부터 선택되는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 상이한 IFM의 조합이 사용된다. 다른 실시양태에서, 3개의 상이한 IFM의 조합이 사용된다. 다른 실시양태에서, 3개 초과의 IFM의 조합이 사용된다.
본 개시의 융합 단백질의 치료적 이용은, 특히 (1) 특정 세포(예컨대, CD4 또는 CD8)에 고유한 수용체의 수용체 매개된 결합을 통해 치료 단백질의 특이적 전달을 위한 작용제로서; (2) 예컨대, ACT(입양 세포 전달)를 포함하는 T 세포 요법에서 및 또한, 예컨대 B 세포, 종양 침윤 림프구, NK 세포, 항원 특이적 CD8 T 세포, 일반적으로 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포 또는 CAR-T 세포, 일반적으로 종양 항원에 특이적인 T-세포 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 및/또는 항원-훈련된 T 세포(예컨대, 관심 항원, 예컨대 종양 연관된 항원(TAA)을 나타내는 항원 제시 세포(APC)에 의해 "훈련된" T 세포)를 포함하는 다른 중요한 면역 세포 유형과 함께, 환자에 재도입하기 전에 단리된 자기유래 및 동종이형 세포의 활성화 및 확장을 유도하기 위한 생체외 작용제로서; 및, (3) ACT를 포함하는 세포 요법에 사용되는 세포의 확장을 지지하는 데 사용되는 시토카인을 전달하기 위한 투여를 위한 생체내 작용제로서의 이용을 포함한다.
이와 같이, 본 개시의 IFM 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함하는 약제학적 조성물은 치료 단백질을 이를 필요로 하는 피험체에 전달하는 데 사용될 수 있다. 건강한 및/또는 비악성 면역 세포 및 이에 결합되거나 표적된 본 개시의 IFM을 포함하는 변형된 면역 세포가 또한 제공된다. 이러한 변형된 면역 세포는 시험관내 또는 생체내에서 제조될 수 있다.
본 개시는 또한 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포를 제공하는 단계; 및 건강한 및/또는 비악성 면역 세포에 본 개시의 IFM의 표적된 결합을 허용하도록 본 개시의 IFM을 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포와 인큐베이션함으로써 복수의 변형된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 변형된 면역 세포의 시험관내 제조 방법을 제공한다.
또한, 본원에는 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포를 제공하는 단계; 건강한 및/또는 비악성 면역 세포에 본 개시의 IFM의 표적된 결합을 허용하도록 본 개시의 IFM을 복수의 건강한 및/또는 비악성 면역 세포와 인큐베이션함으로써 복수의 변형된 면역 세포를 생성하는 단계; 및 복수의 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 요법을 제공하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 피험체의 사전-조건화의 부재 하에 투여되며, 상기 사전-조건화는 CPX(시클로포스파미드) 또는 다른 림프고갈 조건화 화학요법을 포함한다. 화학요법제로의 사전-조건화는 건강한 세포를 포함하는 모든 세포에게 전신의 높은 독성을 야기하고 면역계를 약화시키고 많은 바람직하지 않은 부작용을 유도하는 것으로 널리 공지되어 있으므로, 사전-조건화의 제거가 유리하다.
정의
특정 용어가 하기에서 정의된다. 추가의 정의는 출원 전반에 걸쳐 제공된다.
본원에 사용된 단수 형태는 하나 또는 하나 초과, 예컨대 적어도 하나의 대상을 지칭한다. 단수 형태의 사용은 본원에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 "하나"를 의미할 수 있으나, 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 초과"의 의미와 일치한다.
본원에 사용된 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성 또는 정밀도를 고려하여 측정된 양에 대해 허용가능한 오차 정도를 의미한다. 예시적 오차 정도는 주어진 값 범위의 20 퍼센트(%), 전형적으로 10%, 및 보다 전형적으로 5% 이내이다. 용어 "실질적으로"는 50% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 및 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 초과를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 주어진 실시양태에는 존재하지만 아직 특정되지 않은 요소를 포함하도록 개방된 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다.
본원에 사용된 용어 "필수적으로 이루어진"은 주어진 실시양태에 대해 요구되는 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 본 개시의 실시양태의 기본적 및 신규 또는 기능적 특성(들)에 크게 영향을 끼치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어지는"은 실시양태의 설명에서 언급되지 않는 임의의 요소를 배제하는 본원에 기재된 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분을 지칭한다.
용어 "자기유래"는 나중에 개체에 재도입될 동일한 개체로부터 유래되는 임의의 물질을 지칭한다. 용어 "동종이형"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 "항체" 또는 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예컨대 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 항체 분자는 항체(예컨대, 전장 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 전장 항체 또는 전장 면역글로불린 쇄의 항원 결합 또는 기능성 단편을 포함한다. 예컨대, 전장 항체는 자연 발생이거나 정상적 면역글로불린 유전자단편 재조합 과정에 의해 형성된 면역글로불린(Ig) 분자(예컨대, IgG)이다. 실시양태에서, 항체 분자는 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 항원 결합 부분, 예컨대 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편, 예컨대 기능성 단편은 항체의 부분, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)2, 가변 단편(Fv), 도메인 항체(dAb), 또는 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 기능성 항체 단편은 온전한(예컨대, 전장) 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합한다. 용어 "항체 단편" 또는 "기능성 단편"은 또한 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 예컨대 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편 또는 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 활성이 없는 항체의 부분, 예컨대 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기는 포함하지 않는다. 예시적 항체 분자는 전장 항체 및 항체 단편, 예컨대 dAb(도메인 항체), 단일쇄, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편, 및 단일쇄 가변 단편(scFvs)을 포함한다. 용어 "Fab" 및 "Fab 단편"은 상호교환적으로 사용되며, 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인을 포함하는 영역, 즉 VL, CL, VH, 및 CH1을 지칭한다.
본원에 사용된 "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 예컨대, 서열은 자연 발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예컨대, 서열은 1, 2개 이상의 N- 또는 C-말단 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있거나, 단백질 구조의 형성과 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 항체 분자는 일특이적이며, 예컨대 단일 에피토프에 대한 결합 특이성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 다특이적이며, 예컨대 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 이특이적 항체 분자이다. 본원에 사용된 "이특이적 항체 분자"는 1개 초과의(예컨대, 2, 3, 4개 이상의) 에피토프 및/또는 항원에 대해 특이성을 갖는 항체 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 "항원"(Ag)은 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 마크로분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은, 예컨대 특정 면역 세포의 활성화 및/또는 항체 생성을 수반하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 분자이다. 항원은 항원 생성에만 관련되는 것은 아니다. T 세포 수용체는 또한 (펩티드 또는 펩티드 단편이 MHC 분자와 복합체화된 항원이더라도) 항원을 인식하였다. 거의 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 마크로부타가 항원일 수 있다. 항원은 또한 게놈 재조합체 또는 DNA로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 DNA가 "항원"을 코딩한다. 실시양태에서, 항원은 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없으며, 항원은 전혀 유전자에 의해 코딩될 필요가 없다. 실시양태에서, 항원은 생물학적 샘플, 예컨대 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체로부터 합성될 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 "종양 항원" 또는 상호교환적으로 "암 항원"은 암, 예컨대 암 세포 또는 면역 반응을 일으킬 수 있는 종양 미세환경 상에 존재하거나 이와 연관된 임의의 분자를 포함한다. 본원에 사용된 "면역 세포 항원"은 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역 세포 상에 존재하거나 이와 연관된 임의의 분자를 포함한다.
항체 분자의 (본원에서 상호교환적으로 사용되는) "항원-결합 부위" 또는 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 항체 분자, 예컨대 면역글로불린(Ig) 분자, 예컨대 IgG의 일부를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 부위는 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변(V) 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 초가변 영역으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내의 3개의 고도로 다른 스트레치가 "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는 보다 보존된 플랭킹 스트레치 사이에 배치된다. FR은 면역글로불린의 초가변 영역 사이에서 및 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열이다. 실시양태에서, 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보적인 항원-결합 표면을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 프레임워크 영역 및 CDR은, 예컨대 문헌(Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)에서 정의되고 기재되었다. 각각의 가변 쇄(예컨대, 가변 중쇄 및 가변 경쇄)는 전형적으로 아미노-말단부터 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 아미노산 순서로 배치된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 가변 경쇄(VL) CDR은 일반적으로 위치 27-32(CDR1), 50-56(CDR2), 및 91-97(CDR3)에 잔기를 포함하도록 정의된다. 가변 중쇄(VH) CDR은 위치 27-33(CDR1), 52-56(CDR2), 및 95-102(CDR3)에 잔기를 포함하도록 정의된다. 당업자는 프레임워크가 항체에 걸쳐 일정한 번호매김을 갖도록 루프가 항체 및 번호매김 시스템, 예컨대 카바트 또는 초티아 제어에 걸쳐 상이한 길이일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 항체의 항원-결합 단편은 (예컨대, 본 개시의 융합 분자의 일부로서 포함되는 경우) 전체 Fc 도메인이 결여되거나 없을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체-결합 단편은 전체 IgG 또는 전체 Fc를 포함하지는 않으나, 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 불변 영역 (또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 어떠한 Fc 도메인도 완전히 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 전체 Fc 도메인이 실질적으로 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 전체 Fc 도메인의 일부(예컨대, CH2 또는 CH3 도메인 또는 이의 일부)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 전체 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG 도메인, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 "시토카인 분자"는 자연 발생의 야생형 시토카인의 전장, 단편 또는 변이체(자연 발생 시토카인 분자의 활성을 적어도 10% 갖는 이의 단편 및 기능성 변이체를 포함)를 지칭한다. 실시양태에서, 시토카인 분자는 자연 발생 분자의 활성, 예컨대 면역조절성 활성을 적어도 30, 50, 또는 80% 갖는다. 실시양태에서, 시토카인 분자는, 임의적으로 면역글로불린 Fc 영역에 커플링된, 수용체 도메인, 예컨대 시토카인 수용체 도메인을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 시토카인 분자는 면역글로불린 Fc 영역에 커플링된다. 다른 실시양태에서, 시토카인 분자는 항체 분자(예컨대, 면역글로불린 Fab 또는 scFv 단편, Fab 단편, FAB2 단편, 또는 아피바디 단편 또는 유도체, 예컨대 sdAb(나노바디) 단편, 중쇄 항체 단편, 단일-도메인 항체, 이특이적 또는 다특이적 항체), 또는 비항체 스캐폴드 및 항체 모방체(예컨대, 리포칼린(예컨대, 안티칼린), 아피바디, 피브로넥틴(예컨대, 모노바디 또는 아드넥틴), 노틴(knottin), 안키린 반복체(예컨대, DARPin), 및 A 도메인(예컨대, 아비머))에 커플링된다.
본원에 사용된 "암"은 모든 유형의 발암 과정 및 암성 성장을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 암은 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 조직 또는 악성 전환 세포, 조직, 또는 기관을 포함한다. 실시양태에서, 암은 암의 모든 조직병리학 및 단계, 예컨대 침습/중증 단계를 포함한다. 실시양태에서, 암은재발 및/또는 내성 암을 포함한다. 용어 "암" 및 "종양"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예컨대, 두 용어는 고형 및 액상 종양을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "암" 및 "종양"은 악성 암 및 종양 뿐만 아니라 전암성을 포함한다.
본원에 사용된 "면역 세포"는, 예컨대 감염제 및 이물질로부터 보호하기 위해 면역계에서 기능하는 임의의 다양한 세포를 지칭한다. 실시양태에서, 이 용어는 백혈구, 예컨대 호중구, 호산구, 호염구, 림프구, 및 단핵구를 포함한다. 용어 "면역 세포"는 본원에 기재된 면역 이펙터 세포를 포함한다. "면역 세포"는 또한 면역 반응에 관련되는 세포의 변형된 버전, 예컨대 문헌(Klingemann et al., 상기 참조)에 기재된 바와 같이 NK 세포주 NK-92(ATCC 카달로그 번호 CRL-2407), haNK(고친화성 Fc 수용체 FcγRIIIa를 발현하는 NK-92 변이체(158V)) 및 taNK(주어진 종양 항원에 대한 CAR을 발현하는 유전자로 형질감염된 표적된 NK-92 세포)를 포함하는 변형된 NK 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예컨대 면역 이펙터 반응의 촉진에 관련되는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는, T 세포, 예컨대 CD4T 세포, CD8 T 세포, 알파 T 세포, 베타 T 세포, 감마 T 세포, 및 델타 T 세포; B 세포; 천연 킬러(NK) 세포; 천연 킬러 T(NKT) 세포; 수지상 세포; 및 비만 세포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR), 예컨대 암 항원에 결합하는 CAR를 포함하는, 예컨대 발현하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 외인성의 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 조작된 T-세포 수용체를 포함, 예컨대 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 면역 세포 집단을 포함하고, 종양 연관된 항원(TAA)에 대한 특이성이 강화된, 예컨대 관심 종양 연관된 항원(TAA), 예컨대 MART-1을 나타내는 MHC에 대해 특이성을 갖는 T 세포를 분류함으로써 강화된 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 면역 세포 집단을 포함하고, 관심 TAA 펩티드를 나타내는 항원 제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포에 의해 TAA에 대한 특이성을 갖도록 "훈련된" T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 MART-1, MAGE-A4, NY-ESO-1, SSX2, 서비빈(Survivin) 등 중 하나 이상으로부터 선택된 TAA에 대해 훈련된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 다수의 관심 TAA 펩티드를 나타내는 APC, 예컨대 수지상 세포에 의해 다수의 TAA에 대한 특이성을 갖도록 훈련된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포(예컨대, CD8 T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 헬퍼 T 세포, 예컨대 CD4 T 세포이다.
용어 "이펙터 기능" 또는 "이펙터 반응"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예컨대 시토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
본원에 사용된 "세포독성 T 림프구"(CTL)는 표적 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 T 세포를 지칭한다. CTL 활성화는 2 단계: 1) 표적 세포 상의 항원-결합된 MHC 분자와 CTL 상의 T 세포 수용체 사이의 상호작용이 이루어지고, 2) 공동자극 신호가 T 세포 및 표적 세포 상의 공동자극 분자의 연대에 의해 만들어질 때 일어날 수 있다. 이어서, CTL은 표적 세포 상의 특정 항원을 인식하고, 이들 표적 세포를, 예컨대 세포용해에 의해 파괴를 유도한다. 일부 실시양태에서, CTL은 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, CTL은 조작된 T-세포 수용체를 발현한다.
용어 "피험체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예컨대, 포유동물, 인간)를 포함한다. 일 실시양태에서, 피험체는 환자, 예컨대 면역 세포 요법을 필요로 하는 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 피험체는 공여자, 예컨대 면역 세포의 동종이형 공여자, 예컨대 동종이형 이식이 의도되는 면역 세포의 동종이형 공여자이다.
본 개시의 조성물 및 방법은 특정된 서열 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예컨대 특정된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열과 관련하여, 본원에서 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통된 구조 도메인 및/또는 공통된 기능적 활성을 가질 수 있도록 i) 제2 아미노산 서열과 동일하거나 ii) 제2 아미노산 서열에서 정렬된 아미노산 잔기의 보존적 치환인 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산을 지칭하는 데 사용된다. 예컨대, 참조 서열과 적어도 약 85%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 공통된 구조 도메인을 함유하는 아미노산 서열이 본원에 제공된다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통된 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 공통된 구조 폴리펩티드 도메인 또는 공통된 기능적 폴리펩티드활성을 코딩하도록 제2 핵산 서열에서 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 또는 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산을 지칭한다. 예컨대, 참조 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공된다.
서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성(본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(예컨대, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적 상 무시될 수 있다). 바람직한 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 및 더욱더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다(본원에 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다).
2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열 비교 및 2개의 서열들 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트 패키지의 GAP 프로그램(www.gcg.com에서 이용가능)에 통합된 문헌(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)의 알고리즘을 사용하고, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 이용가능)을 사용하고, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정된다. 파라미터의 특히 바람직한 세트 (및 달리 특정되지 않는 한 사용되어야 하는 것)은 12의 갭 패널티, 4의 갭 확장 패널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 패널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스이다.
2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌(E. Meyers and W. Miller (1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 사용하고, PAM120 웨이트 레지듀 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예컨대 다른 계열 구성원 또는 관련된 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "조회 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 개시의 핵산(예컨대, 서열 번호 1) 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 개시의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해 갭 BLAST가 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 활용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 활용하는 경우, 각각의 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 본 개시의 분자는 그들의 기능에 실질적인 영향을 갖지 않는 추가의 보존적 또는 비본질적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 모두를 포함하고 자연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는, 천연 또는 합성의 모든 분자를 포함하도록 의도된다. 예시적 아미노산은 자연 발생 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동류물; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 전술한 것 중 임의의 것의 모든 입체이성체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 D- 또는 L- 광학 이성체 및 펩티드모방체 둘 다를 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에서 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), beta-분지된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
폴리펩티드와 관련하여 용어 "기능성 변이체" 또는 "변이체" 또는 "변이체 형태"는 자연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 적어도 10% 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 이것이 자연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 갖도록 자연 발생 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 실질적으로 동일한 뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본원에 사용된 용어 "분자"는 문맥에 의해 지시되는 바와 같이 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 지칭할 수 있다. 이 용어는 자연 발생의 야생형 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 핵산의 전장, 단편 또는 변이체, 예컨대 이의 기능성 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 야생형 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 핵산의 유도체, 예컨대 돌연변이체이다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 이의 원래 또는 천연 환경(예컨대, 자연적으로 발생하는 경우 천연적인 환경)으로부터 떼어낸 물질을 지칭한다. 예컨대, 살아 있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 천연 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 모두로부터 인간의 개입에 의해 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"는 (단일쇄인 경우) 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지될 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된: 예컨대, 디술파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과의 컨주게이션된 아미노산 중합체를 포함한다. 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 진핵생물 또는 원핵생물 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성될 수 있거나, 합성 절차의 산물일 수 있다.
용어 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열", 또는 "폴리뉴클레오티드 서열", 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 단일-가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중화화 후에, 예컨대 표지화 성분과의 컨주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 핵산은 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 게놈의 폴리뉴클레오티드, cDNA, 반합성 또는 합성 기원(이는 자연에서는 일어나지 않거나 비천연 배열로 또 다른 폴리뉴클레오티드에 연결됨)일 수 있다.
용어 "모 폴리펩티드"는 야생형 폴리펩티드를 지칭하며, 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 공개적으로 접근가능한 단백질 데이터베이스(예컨대, EMBL Nucleotide Sequence Database, NCBI Entrez, ExPasy, Protein Data Bank 등)의 일부이다.
용어 "돌연변이체 폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 변이체" 또는 "뮤테인"은 이의 아미노산 서열이 이의 상응하는 야생형(모) 형태, 자연적으로 존재하는 형태 또는 임의의 다른 모 형태의 아미노산 서열과 상이한 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 돌연변이체 폴리펩티드는 돌연변이체 폴리펩티드를 초래하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 대체, 삽입, 결실 등을 함유할 수 있다.
용어 "모 폴리펩티드에 상응하는" (또는 이 용어의 문법적 변형)은, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 상응하는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 단지 적어도 아미노산 변이의 존재에 의해서만 상이한, 본 개시의 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된다. 전형적으로, 변이체 폴리펩티드 및 모 폴리펩티드의 아미노산 서열은 높은 퍼센트의 동일성을 나타낸다. 일례에서, "모 폴리펩티드에 상응하는"은 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열이 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 것을 의미한다. 또 다른 예에서, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 모 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는다.
용어 "모 폴리펩티드로 변이를 도입하는" (또는 추가하는 등) (또는 이의 문법적 변형), 또는 변이를 포함하도록 "모 폴리펩티드를 변형하는" (또는 이의 문법적 변형)은 반드시 모 폴리펩티드가 이러한 전환을 위한 물리적 출발 물질이라는 것을 의미하는 것이 아니라, 오히려 모 폴리펩티드가 변이체 폴리펩티드를 제조하기 위한 가이드 아미노산 서열을 제공한다는 것을 의미한다. 일례에서, "모 폴리펩티드로 변이체를 도입하는"은 모 폴리펩티드에 대한 유전자가 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성하도록 적합한 돌연변이를 통해 변형된다는 것을 의미한다. 또다른 에에서, "모 폴리펩티드로 변이체를 도입하는"은 생성된 폴리펩티드가 가이드로서 모 폴리펩티드를 사용하여 이론적으로 설계된다는 것을 의미한다. 이어서, 설계된 폴리펩티드는 화학적 또는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다.
본 개시의 다양한 측면이 하기에 더욱 자세히 설명된다. 추가의 정의가 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
시토카인 분자
시토카인은 면역 반응의 매개자인 단백질성 신호전달 화합물이다. 그들은 증식, 분화 및 세포 생존/아폽토시스를 포함하는 많은 상이한 세포 기능을 제어하며; 시토카인은 또한 바이러스 감염 및 자가면역 질환을 포함하는 몇몇 병리생리학적 과정에 관련된다. 시토카인은 선척 면역계(단핵구, 대식구, 수지상 세포) 및 입양 면역계(T- 및 B-세포) 둘 다의 것을 포함하여 다양한 세포에 의해 다양한 자극 하에 합성된다. 시토카인은 2개의 군: 프로- 및 항-염증성으로 분류될 수 있다. IFN-γ, IL-1, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 프로-염증성 시토카인은 대부분 선천 면역 세포 및 Th1 세포로부터 유래된다. IL-10, IL-4, IL-13 및 IL-5를 포함하는 항-염증성 시토카인은 Th2 면역 세포로부터 합성된다.
본 개시는 특히 하나 이상의 시토카인 분자, 예컨대 면역조절성(예컨대, 프로-염증성) 시토카인 및 이의 변이체, 예컨대 기능성 변이체를 포함하는, 예컨대 함유하도록 조작된 IFM(예컨대, IFM 폴리펩티드)을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 인터루킨 또는 이의 변이체, 예컨대 기능성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 인터루킨은 프로-염증성 인터루킨이다.
실시양태에서, 시토카인 분자는 시토카인의 전장, 단편 또는 변이체, 예컨대 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-1 알파(IL-1 알파), 인터루킨-1 beta(IL-1 베타), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-23(IL-23), 인터페론(IFN) , IFN-β, IFN-γ, 종양 괴사 인자 알파, GM-CSF, GCSF, 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상술된 시토카인 중 임의의 것의 조합으로부터 선택되는 시토카인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 시토카인 분자는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 또는 인터페론 감마, 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상술된 시토카인 중 임의의 것의 조합으로부터 선택된다. 시토카인 분자는 단량체 또는 이량체일 수 있다. 실시양태에서, 시토카인 분자는 수용체 도메인, 예컨대 시토카인 수용체 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 시토카인 또는 성장 인자 분자는 Ifn-γ, IL-lα, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-27 또는 TNF-α 중 하나 이상으로부터 선택되는 Treg 억제성 분자일 수 있다. Ifn-γ는 Treg 취약성을 촉진하고, 종양 미세환경에서의 억압을 감소시킬 수 있다. IL-1 및 IL-6, IL-21 및 IL-23은 Treg를 유도하여 프로-염증성 IL-17을 생성하고/하거나 Treg를 Thl7 T 세포 서브세트로 전환시킬 수 있다. IL-12는 Treg에서 Ifh-γ 생성을 촉진하여 Treg 취양성 및 일반적인 프로-면역원성 환경을 이끌 수 있다. TNF-α는 Treg 발달을 손상시키고 기존 Treg의 기능을 감소시킨다. 따라서, 이들 시토카인은 Treg 발달은 손상시키거나, Treg 기능을 감소시키거나, 면역 활성화 세포로 Treg 트랜스-분화를 유도할 수 있다.
암과 관련하여, Treg 활성을 감소시키는 것이 바람직한 경우, 하나 이상의 Treg 억제제성 시토카인은 Treg 억압을 전체적으로 감소시키기 위해 Treg-특이적 IFM을 통해 전신적으로 전달될 수 있다. 이특이적 표적화(예컨대, CD4:CD25, CD4:NRP1, CD4:CD39)는 생체내에서 전신적으로 주사된 IFM을 Treg 세포로 유도하는 데 사용될 수 있다. 특정 세포 집단을 표적하는 이러한 개념이 실시예에 기재된다. 이어서, 이들 IFM은 Treg 수 및/또는 기능을 감소시키고 이들을 프로-염증성 또는 면역원성 상태로 유도한다.
추가적으로, Treg-특이적 IFM은 생체외에서 항종양 면역 세포로 로딩될 수 있고, 트랜스 또는 주변분비 신호전달을 통해 Treg로 전달될 수 있다. 이 경우, 항종양 세포는 Treg 억제성 시토카인의 국소 농도를 증가시킴으로써 국소적 항-억압 환경을 생성한다. 이는 글로벌 Treg 기능이상과는 반대로 국소적인 것을 촉진할 수 있다.
IL-15 분자
일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 IL-15 분자, 예컨대 IL-15, 예컨대 인간 IL-15의 전장, 단편 또는 변이체이다. 실시양태에서, IL-15 분자는, 예컨대 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 야생형 인간 IL-5이다. 다른 실시양태에서, IL-15 분자는, 예컨대 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간 IL-5의 변이체이다.
일부 실시양태에서, IL-15 변이체는, 예컨대 US 2016/0184399에 기재되는 바와 같이, 위치 45, 51, 52, 또는 72에서 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 N, S 또는 L의 D, E, A Y 또는 P 중 하나로의 치환을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 (인간 IL-15의 서열, 서열 번호 11을 참조하여) L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y, 또는 N72P로부터 선택된다. 당업자는 알 수 있듯이, 위치의 임의의 조합이 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 2개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 3개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 4, 5, 또는 6개 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-15 분자는 돌연변이, 예컨대 본원에서 서열 번호 11에 나타낸 바와 같은 N72D 포인트 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 분자는 야생형 인간 IL-15에 비해 N72D 돌연변이를 포함하는 서열 번호 11과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고 IL-15Rα 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 (인간 IL-15의 서열, 서열 번호 11을 참조하여) 아미노산 위치 8, 10, 61, 64, 65, 72, 101, 또는 108에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 야생형 IL-15와 비교하여 증가된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 야생형 IL-15와 비교하여 감소된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 야생형 IL-15와 비교하여 대략 2배, 4배, 10배, 20배, 40배, 60배, 100배, 또는 100배 초과로 감소된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 (인간 IL-15의 서열, 서열 번호 11을 참조하여) D8N, K10Q, D61N, D61H, E64H, N65H, N72A, N72H, Q101N, Q108N, 또는 Q108H로부터 선택된다. 당업자는 위치의 임의의 조합이 돌연변이될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 2개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 3개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 4, 5, 또는 6개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 위치 61 및 64에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 61 및 64에서의 돌연변이는 D61N 또는 D61H 및 E64Q 또는 E64H이다. 일부 실시양태에서, IL-15 변이체는 위치 61 및 108에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 61 및 108에서의 돌연변이는 D61N 또는 D61H 및 Q108N 또는 Q108H이다.
실시양태에서, 시토카인 분자는 수용체 도메인, 예컨대 시토카인 수용체 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 시토카인 분자는 본원에 기재되는 바와 같은 IL-15 수용체, 또는 이의 단편(예컨대, IL-15 수용체 알파의 IL-15 결합 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는 본원에서 기재되는 바와 같은 IL-15 분자, 예컨대 IL-15 또는 IL-15 초효능제이다. 본원에 사용된 시토카인 분자의 "초효능제" 형태는, 자연 발생 시토카인과 비교하여, 예컨대 적어도 10%, 20%, 30% 증가된 활성을 나타낸다. 예시적 초효능제는 IL-15 SA이다. 일부 실시양태에서, IL-15 SA는, 예컨대 본원에서 기재되는 바와 같은, IL-15 및 IL-15 수용체, 예컨대 IL-15 수용체 알파 또는 이의 IL-15 결합 단편의 복합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 시토카인 분자는, 임의적으로 면역글로불린 Fc 또는 항체 분자에 커플링된, 수용체 도메인, 예컨대 IL-15R 알파의 세포외 도메인을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 시토카인 분자는 WO 2010/059253에 기재되는 바와 같은 IL-15 초효능제(IL-15SA)이다. 일부 실시양태에서, 시토카인 분자는, 예컨대 문헌(Rubinstein et al PNAS 103:24 p. 9166-9171 (2006)에 기재되는 바와 같은, IL-15 및 Fc에 융합된 가용성 IL-15 수용체 알파 도메인(예컨대, sIL-15Rα-Fc 융합 단백질)을 포함한다.
IL-15 분자는 폴리펩티드, 예컨대 시토카인 수용체, 예컨대 시토카인 수용체 도메인, 및 제2의 이종 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 이종 도메인은 면역글로불린 Fc 영역이다. 다른 실시양태에서, 이종 도메인은 항체 분자, 예컨대 Fab 단편, FAB2 단편, scFv 단편, 또는 아피바디 단편 또는 유도체, 예컨대 sdAb(나노바디) 단편, 중쇄 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 또한 제3의 이종 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체 도메인은 제2 도메인의 N-말단이고, 다른 실시양태에서, 시토카인 수용체 도메인은 제2 도메인의 C-말단이다.
야생형 IL-15 수용체 알파 서열 및 이 서열의 단편 및 변이체가 하기에 제시된다.
야생형 IL-15 수용체 알파 서열(진뱅크 수탁 번호 AAI21141.1): 서열 번호 41.
야생형 IL-15 수용체 알파 세포외 도메인(수탁 번호 Q13261의 일부): 서열 번호 63.
이소형 CRA_d IL-15 수용체 알파 세포외 도메인(수탁 번호 EAW86418의 일부): 서열 번호 64.
야생형 IL-15 수용체 알파 서열은 서열 번호 41로 제공된다. IL-15 수용체 알파는 세포외 도메인, 23개 아미노산의 막횡단 분절, 및 39개 아미노산의 세포질 테일을 함유한다. IL-15 수용체 알파의 세포외 도메인은 서열 번호 63으로 제공된다.
다른 실시양태에서, IL-15 효능제가 사용될 수 있다. 예컨대, IL-15 수용체의 효능제, 예컨대 IL-15 수용체에 대한 항체 분자(예컨대, 효능적 항체)가 자연 발생 시토카인의 적어도 하나의 활성을 유도한다. 실시양태에서, IL-15 수용체 또는 이의 단편은 인간 또는 비인간 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 비인간 영장류로부터의 것이다.
IL-15 수용체 알파 스시 도메인
야생형 IL-15 수용체 알파 서열은 서열 번호 64로 제공된다. IL-15 수용체 알파는 세포외 도메인, 23개 아미노산의 막횡단 분절, 및 39개 아미노산의 세포질 테일을 함유한다. 스시 도메인은, 예컨대 문헌(Bergamaschi et al. (2008), JBC VOL. 283, NO. 7, pp. 4189-4199; Wei et al. (2001), Journal of Immunology 167:277-282; Schluns et al. (2004) PNAS Vol 110 (15) 5616-5621; US 2016/0184399, 각각의 내용이 본원에 참조로 포함됨)을 포함하여 문헌에 기재되어 있다.
IL-15 수용체 알파의 세포외 도메인은 서열 번호 63으로 제공된다. IL-15 수용체 알파의 세포외 도메인은 IL-15에 결합하는 스시 도메인으로 지칭되는 도메인을 포함한다. 보체 제어 단백질(CCP) 모듈 또는 짧은 컨센서스 반복체(SCR)로도 지칭되는 일반적인 스시 도메인은 보체 시스템의 다수의 구성원을 포함하는 몇몇 단백질에서 발견되는 단백질 도메인이다. 스시 도메인은, 대략 60개 아미노산의 서열 스트레치를 포함하는, 4개의 고도로 보존된 시스테인 잔기의 제1 및 제4 시스테인에 의해 결합된 베타-샌드위치 접힘을 채택한다(Norman, Barlow, et al. J Mol Biol. 1991 Jun 20;219(4):717-25). IL-15R알파의 스시 도메인의 제1 및 제4 시스테인에 의해 결합된 아미노산 잔기는 최소 도메인(서열 번호 52)으로 지칭하는 62개 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다. 최소 스시 도메인의 N- 및 C-말단에 IL-15R알파의 추가의 아미노산을 포함시키면, 예컨대 N-말단 Ile 및 Thr 및 C-말단 Ile 및 Arg 잔기를 포함시키면 65개 스시 아미노산 도메인(서열 번호 9)을 초래한다.
본원에 기재된 스시 도메인은 야생형 스시 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예컨대, IL-15Rα의 잔기 77은 야생형 유전자에서 루이신이지만(서열 번호 41에 밑줄침), 이소루이신(L77I)으로 돌연변이될 수 있다. 따라서, (서열 번호 41의 야생형 IL-15Rα에 따른 번호매김으로) L77I를 포함하는 최소 스시 도메인은 서열 번호 65로 제공된다. (서열 번호 41의 야생형 IL-15Rα에 따른 번호매김으로) L77I를 포함하는 확장된 스시 도메인은 서열 번호 66으로 제공된다.
최소 스시 도메인, 야생형:
Figure pct00001
확장된 스시 도메인, 야생형:
Figure pct00002
최소 스시 도메인, L77I:
Figure pct00003
확장된 스시 도메인, L77I:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 62-171개 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 65-171개 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 171개 이하의 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 62-171, 62-160, 62-150, 62-140, 62-130, 62-120, 62-110, 62-100, 62-90, 62-80, 62-70, 65-171, 65-160, 65-150, 65-140, 65-130, 65-120, 65-110, 65-100, 65-90, 65-80, 또는 65-70개 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 62-171, 62-160, 62-150, 62-140, 62-130, 62-120, 62-110, 62-100, 62-90, 62-80, 62-70, 65-171, 65-160, 65-150, 65-140, 65-130, 65-120, 65-110, 65-100, 65-90, 65-80, 또는 65-70개 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 9 또는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 62-171개 아미노산 또는 이와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 5의 171개 이하의 아미노산 또는 이와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 62-171, 62-160, 62-150, 62-140, 62-130, 62-120, 62-110, 62-100, 62-90, 62-80, 62-70, 65-171, 65-160, 65-150, 65-140, 65-130, 65-120, 65-110, 65-100, 65-90, 65-80, 또는 65-70개 아미노산 또는 이와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖고 IL-15 결합 활성을 갖는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 적어도 62개 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고(여기서, 서열은 야생형 IL-15Rα와 비교하여 L77I 돌연변이를 포함함) IL-15 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 적어도 65개 아미노산 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고(여기서, 서열은 야생형 IL-15Rα와 비교하여 L77I 돌연변이를 포함함) IL-15 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 일부 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고(여기서, 서열은 야생형 IL-15Rα와 비교하여 L77I 돌연변이를 포함함) IL-15 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 9 또는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 적어도 62개 아미노산 또는 이와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖고(여기서, 서열은 야생형 IL-15Rα와 비교하여 L77I 돌연변이를 포함함) IL-15 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 66의 일부 또는 이와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖고(여기서, 서열은 야생형 IL-15Rα와 비교하여 L77I 돌연변이를 포함함) IL-15 결합 활성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 62, 65, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 또는 160개의 연속적인 아미노산 또는 이와 비교하여 L77I 돌연변이를 갖는 서열을 포함한다. 실시양태에서, 스시 도메인은 서열 번호 63의 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 또는 160-170개의 연속적인 아미노산 또는 이와 비교하여 L77I 돌연변이를 갖는 서열로 이루어진다.
실시양태에서, 스시 도메인은 인간 또는 비인간 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 비인간 영장류로부터의 스시 도메인이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제2의 이종 도메인, 예컨대 Fc 도메인 또는 Fab 도메인을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-15 수용체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함한다. 실시양태에서, Fc 도메인은 이펙터-감쇠된 Fc 도메인, 예컨대 인간 IgG2 Fc 도메인, 예컨대 서열 번호 54 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 인간 IgG2 Fc 도메인이다.
실시양태에서, 이펙터-감쇠된 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 예컨대 서열 번호 67의 야생형 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 감소된 이펙터 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이펙터 활성은 항체-의존적 세포 독성(ADCC)을 포함한다. 실시양태에서, 이펙터 활성은 ADCC 검정에서, 예컨대 서열 번호 67의 야생형 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 활성은 보체 의존적 세포독성(CDC)를 포함한다. 실시양태에서, 이펙터 활성은 CDC 검정, 문헌(Armour et al., "Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities." Eur J Immunol (1999) 29:2613-24)에 기재되는 CDC 검정에서, 예컨대 서열 번호 67의 야생형 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소된다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열 번호 67 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 IgG1 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열 번호 68 또는 이의 단편, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 IgG2 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열 번호 55 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 IgG2Da Fc 도메인을 포함한다. 실시양태에서, Fc 도메인은 카바트 번호매김 시스템을 사용하여 A330S 및 P331S 돌연변이 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 실시양태에서, Fc 도메인은 문헌(Armour et al. "Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities." Eur J Immunol (1999) 29:2613-24)에 기재된 것이다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 이량체화 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG 도메인, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 서열 번호 56의 서열(sushi-IgG2Da-Fc) 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, IFM은 본원에(예컨대, 서열 번호 9에) 기재된 스시 도메인 및 본원에 기재된 Fc 도메인, 예컨대 IgG2 Fc 도메인(예컨대, 서열 번호 54 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 9의 스시 도메인 및 본원에 기재된 Fc 도메인, 예컨대 IgG1 Fc 도메인, 예컨대 서열 번호 67 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 9의 스시 도메인 및 IgG2 Fc 도메인, 예컨대 서열 번호 54 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 9의 스시 도메인 및 IgG1 Fc 도메인, 예컨대 서열 번호 67 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 9의 스시 도메인 및 서열 번호 56 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 IgG2Da Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 9의 스시 도메인 및 서열 번호 56 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 IgG2Da Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFM은 서열 번호 56 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 sushi-IgG2Da-Fc 단백질을 포함한다.
실시양태에서, IL-15 분자는 PCT 국제 출원 공개 번호 WO2017/027843(전부 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 분자이다.
IL-12 분자
인터루킨-12(IL-12)는 각각 IL-12A 및 IL-12B의 2개의 개별적인 유전자에 의해 코딩되는 p35 및 p40 서브유닛으로 구성되는 이종이량체 시토카인이다. IL-12는 나이브 T 세포의 Th1 세포로의 분화에 관련된다. 이는 T 세포의 성장 및 기능을 자극할 수 있는 T 세포-자극 인자로 공지되어 있다. 이는 T 세포 및 천연 킬러(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 생성을 자극하며, IFN-γ의 IL-4 매개된 억압을 감소시킨다. IL-12를 생성하는 T 세포는 IL-12 활성과 연관된 보조수용체(coreceptor), CD30을 갖는다.
IL-12는 NK 세포 및 T 림프구의 활성에 중요한 역할을 한다. IL-12는 NK 세포 및 CD8 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성의 증진을 매개한다. 또한, NK 세포에서 IL-2와 IL-12의 신호 전달 사이에 연관이 있는 것으로 보인다. IL-2는 2개의 IL-12 수용체, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2의 발현을 자극하여 NK 세포에서 IL-12 신호전달에 관련되는 중요한 단백질의 발현을 유지한다. 증진된 기능적 반응은 IFN-γ 생성 및 표적 세포 사멸에 의해 입증된다.
IL-12는 또한 항-혈관형성 활성을 가지며, 이는 새로운 혈관의 형성을 차단할 수 있다는 것을 의미한다. 이는 인터페론 감마의 생성을 증가시킴으로써 이를 수행하며, 결과적으로 유도성 단백질-10(IP-10 또는 CXCL10)으로 불리는 케모카인의 생성을 증가시킨다. 이어서, IP-10은 이러한 항-혈관형성 효과를 매개한다. 면역 반응 및 이의 항-혈관형성 활성을 유도하는 이의 능력 때문에, 가능한 항암 약물로서 IL-12를 시험하는 데 관심이 있었다. IL-12와 건선 & 염증성 장 질환 사이의 치료에 유용할 수 있는 연관성이 있다.
IL-12는 IL-12R-β1 및 IL-12R-β2에 의해 형성된 이종이량체 수용체인 IL-12 수용체에 결합한다. IL-12R-β2는 활성화된 T 세포 상에 발견되고 Th1 세포 발달을 촉진하는 시토카인에 의해 자극되며 Th2 세포 발달을 촉진하는 것에 의해 억제되므로 IL-12 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 결합 시, IL-12R-β2는 티로신 인산화되고, 키나제, Tyk2 및 Jak2에 대한 결합 부위를 제공한다. 이들은 중요한 전사 인자 단백질, 예컨대 T 세포 및 NK 세포에서 IL-12 신호전달에 관련된 STAT4를 활성화시키는 데 중요하다.
IL-12는 고형 종양에서 항-염증성 환경을 재구성하는 잠재력을 갖는 강력한 시토카인이다. 그러나, 이의 임상적 활용은 가용성 투여로부터 또는 IL-12를 분비하도록 조작된 입양 전달된 T 세포로부터 모두 심각한 독성에 의해 제한되었다. 본원에 개시된 테더링된 융합물(TF)은 시토카인 용량 및 생체분포의 개선된 제어를 가능하게 한다. 시험관내 모델 시스템에서, IL12-TF 시토카인은 T 세포의 표면 상에서 IL-12의 지속적인 로딩 및 지속적인 T 세포 활성화 및 IL-12 수용체의 하류로 신호전달을 제공한다. 이어, 이는 선천 및 입양 면역을 활성화시킬 수 있다.
테더링된 융합물에서의 IL-12는 IL-12A 및 IL-12B 서브유닛 둘 다를 함유하는 단일쇄 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-12는 비단일쇄로서(즉, IL-12의 천연 형태인 IL-12A 및 IL-12B의 이종이량체로서) 존재할 수 있다. 예컨대, TF는 3개의 단백질 서브유닛(Fab 중쇄, Fab 경쇄 w/IL-12A (또는 IL-12B), 및 IL-12B (또는 IL-12A))의 공동 발현에 의해 제조될 수 있다.
면역 세포 표적화 모이어티
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 면역자극 융합 분자는 면역 세포 표적화 모이어티를 포함한다. 면역 세포 표적화 모이어티는 항체 분자(예컨대, 본원에 기재된 항원 결합 도메인), 수용체 또는 수용체 단편, 또는 리간드 또는 리간드 단편, 또는 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포(예컨대, 면역 세포의 표면에 존재하는 분자, 예컨대 항원)와 연합, 예컨대 이에 결합한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 본원에 개시된 면역자극 융합 분자를 면역 세포(예컨대, 림프구, 예컨대 T 세포)에 표적화, 예컨대 이로 향하게 한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 항체 분자(예컨대, 전체 항체(예컨대, 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄, 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 항체), 또는 항원 결합 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv, 단일 도메인 항체, 디아바디(dAb), 이가 항체, 또는 이특이적 항체 또는 이의 단편, 이의 단일 도메인 변이체, 또는 카멜리드 항체), 비항체 스캐폴드, 또는 CD45 수용체에 결합하는 리간드로부터 선택된다..
일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 IFM을 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 지속적이고, 풍부하고, 및/또는 재순환하는 세포 표면 수용체 및 분자에 표적화한다. 이들 수용체/분자는, 예컨대 CD45(예컨대, BC8(ACCT: HB-10507), 9.4(ATTC: HB-10508), GAP8.3(ATTC: HB-12), 단일클론 항체를 통해), CD8(OKT8 단일클론 항체를 통해), 막횡단 인테그린 분자 CD11a(MHM24 단일클론 항체를 통해) 또는 CD18(키메라 1B4 단일클론 항체를 통해)을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 CD4, CD8, CD11a, CD18, CD19, CD20, 및 CD22로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 표적화 모이어티는 CD45, CD4, CD8, CD3, CD11a, CD11b, CD11c, CD25, CD127, CD137, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD197, CD38, CD27, CD196, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CD84, CD229, CCR1, CCR5, CCR4, CCR6, CCR8, 또는 CCR10에 결합하는 항체 분자, 예컨대 항원 결합 도메인, 비항체 스캐폴드, 또는 리간드로부터 선택된다.
백혈구 공통 항원으로도 공지된 "CD45"는 인간 CD45 단백질 및 종, 이소형, 및 이의 다른 서열 변이체를 지칭한다. 따라서, CD45는 고유의 전장 단백질일 수 있거나, 고유 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 절두된 단편 또는 서열 변이체(예컨대, 자연 발생 이소형, 또는 재조합 변이체)일 수 있다. CD45는 백혈구 상에서 발현되고 이들 세포의 기능에 중요한 역할을 하는 수용체-연결된 단백질 티로신 포스파타제이다(Altin, JG (1997) Immunol Cell Biol. 75(5):430-45, 본원에 참조로 포함됨). 예컨대, CD45의 세포외 도메인은 T 세포 상의 몇몇 상이한 이소형으로 발현되며, 발현되는 특정 이소형(들)은 특정 세포 서브집단, 그들의 성숙 상태, 및 항원 노출에 의존한다. CD45의 발현은 TCR을 통한 T 세포의 활성화에 중요하며, 상이한 CD45 이소형은 T 세포 활성화를 지지하는 상이한 능력을 나타낸다.
"CD4"는 MHC 부류 II(TCR, T-세포 수용체를 가짐)에 대한 보조수용체이고; 면역 세포, 예컨대 T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식구, 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견된다. CD4 T 세포는 병원체에 대해 조절된 효과적인 면역 반응을 달성하는 데 중요하다. 나이브 CD4 T 세포는 항원-MHC 복합체와의 상호작용 후 활성화되며, 주로 미세환경의 시토카인 환경에 따라 특정한 서브유형으로 분화된다. 전형적 T-헬퍼 1 및 T-헬퍼 2 이외에, 각각 특징적인 시토카인 프로필을 갖는 T-헬퍼 17, 조절성 T 세포(Treg), 소포 헬퍼 T 세포, 및 T-헬퍼 9를 포함하는 다른 서브세트가 확인되었다. CD4 T 세포는 선천 면역계의 세포, B-림프구, 세포독성 T 세포 뿐만 아니라 비면역 세포의 활성화에 걸친 다수의 기능을 수행하며, 또한 면역 반응의 억압에 중요한 역할을 한다. 예컨대, 문헌(Rishi Vishal et al. "CD4+ T Cells: Differentiation and Functions," Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, Article ID 925135, 12 pages, 2012. doi:10.1155/2012/925135)을 참조한다.
"CD8"은 T 세포 수용체(TCR)에 대한 보조수용체로서 기능하는 막횡단 당단백질이다. TCR와 같이, CD8은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하나, 부류 I MHC 단백질에 대해 특이적이다. 각각 상이한 유전자에 의해 코딩되는 2개의 이소형의 단백질, 알파 및 베타가 있다. 인간에서, 두 유전자는 위치 2p12에서 염색체 2에 위치된다. CD8 보조수용체는 대부분 세포독성 T 세포의 표면 상에서 발현되나, 또한 천연 킬러 세포, 피질 흉선세포, 및 수지상 세포 상에서도 발견될 수 있다. 이는 T 세포 림프모구성 림프종 및 저색소 균상식육종에서 발현된다. 기능하기 위해, CD8은 한쌍의 CD8 쇄로 이루어진 이량체를 형성한다. CD8의 가장 일반적인 형태는 CD8-α 및 CD8-β 쇄, 얇은 줄기에 의해 막에 연결된 면역글로불린 가변(IgV)-유사 세포외 도메인을 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 두 구성원, 및 세포내 테일로 구성된다. CD8-α 쇄의 덜 일반적인 동종이량체가 또한 일부 세포 상에서 발현된다. CD8-α의 세포외 IgV-유사 도메인은 부류 I MHC 분자의 α3 부분과 상호작용한다. 이러한 친화성은 항원 특이적 활성화 동안 세포독성 T 세포의 T 세포 수용체 및 표적 세포를 서로 밀접하게 결합되게 한다. CD8 표면 단백질을 갖는 세포독성 T 세포는 CD8 T 세포로 불린다. 예컨대, 문헌(Leahy DJ et al. (March 1992). "Crystal structure of a soluble form of the human T cell coreceptor CD8 at 2.6 A resolution". Cell. 68 (6): 1145-62; Gao G et al. (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-cell receptor". Immunol Today. 21 (12): 630-6; 및 Devine L et al. (1999). "Orientation of the Ig domains of CD8 alpha beta relative to MHC class I". J Immunol. 162 (2): 846-51)을 참조한다.
"인테그린 알파 L(ITGAL)" 및 "LFA-1의 알파 서브유닛"으로도 공지된 "CD11a"는 ICAM-1과의 상호작용에 의해 세포-세포 부착을 제공하는 막 당단백질이다. 유전자 ITGAL은 인테그린 알파 L 쇄를 코딩한다. 인테그린은 알파 쇄 및 베타 쇄로 구성된 이종이량체 통합 막 단백질이다. 알파 인테그린을 함유하는 이 I-도메인은 베타 2 쇄(ITGB2)와 조합되어 모든 백혈구 상에서 발현되는 인테그린 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1)을 형성한다. LFA-1은 이의 리간드, ICAM 1-3(세포간 부착 분자 1 내지 3)과의 상호작용을 통해 백혈구 세포간 부착에서 중요한 역할을 하며, 또한 림프구 공동자극 신호전달에서 기능을 한다. 상이한 이소형을 코딩하는 2개의 전사 변이체가 이 유전자에 대해 발견되었다. 예컨대, 문헌(Cornwell RD et al. Description of the leukocyte function-associated antigen 1 (LFA-1 또는 CD11a) promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993;90(9):4221-4225; 및 Bose TO et al. CD11a Regulates Effector CD8 T Cell Differentiation and Central Memory Development in Response to Infection with Listeria monocytogenes. Flynn JL, ed. Infection and Immunity. 2013;81(4):1140-1151. doi:10.1128/IAI.00749-12)을 참조한다.
인테그린 베타 2 쇄(ITGB2)로도 공지된 "CD18"은 4개의 상이한 구조: LFA-1(CD11a와 짝지음); 대식구-1 항원(CD11b와 짝지음); 인테그린 alphaXbeta2(CD11c와 짝지음); 및 인테그린 alphaDbeta2(CD11d와 짝지음)의 베타 서브유닛이다. CD18이 결여된 인간은 혈액으로부터 조직으로 백혈구 유출의 결여로 정의되는 질환인 백혈구 부착 결핍을 유발한다. 베타 2 인테그린은 또한 가용성 형태로도 발견되었다. 가용성 베타 2 인테그린은 리간드 결합이고, 혈장 수준은 자가면역 질환인 척추관절염에서 질환 활성과 역으로 연관된다. 예컨대, 문헌(Mazzone A1 et al. Leukocyte CD11/CD18 integrins: biological and clinical relevance. Haematologica. 1995 Mar-Apr;80(2):161-75; 및 Gjelstrup et al (8 September 2010). "Shedding of Large Functionally Active CD11/CD18 Integrin Complexes from Leukocyte Membranes during Synovial Inflammation Distinguishes Three Types of Arthritis through Differential Epitope Exposure". The Journal of Immunology. 185 (7): 4154-4168)을 참조한다.
"CD20"은 세포 활성화에 필요한 칼슘의 유입을 허용하는 세포막에서 칼슘 채널을 형성하는 B 세포 상에서 발견되는 유형 III 막횡단 단백질이고; B-세포 림프종, 털 세포 백혈병, 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병에서 발현된다. 이들 질환의 요법에 중요한 CD20에 대한 항체가 존재한다: 예컨대, 개발 중인 몇몇과 함께 리툭시맙 및 오파투무맙. 마찬가지로, 항-CD20 단일클론 항체 오크렐리주맙은 다발성 경화증에 대한 시험 중이다. 예컨대, 문헌(Cragg MS et al (2005). "The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy". Current Directions in Autoimmunity. Current Directions in Autoimmunity. 8: 140-74; 및 Kuijpers TW et al (January 2010). "CD20 deficiency in humans results in impaired T cell-independent antibody responses". The Journal of Clinical Investigation. 120 (1): 214-22)을 참조한다.
체크포인트 억제제를 표적하는 모이어티
일부 실시양태에서, 면역자극 모이어티 또는 표적화 모이어티(예컨대, 항체 분자)는, 예컨대 본원에 참조로 포함된 US 2016/0184399에 기재되는 바와 같은, 면역억제제의 억제제, 예컨대 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, 억제성 KIR, CD276, VTCN1, BTLA/HVEM, HAVCR2 및 ADORA2A의 억제제에 결합한다. 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포 상에 존재한다.
일부 실시양태에서, 면역자극 또는 표적화 모이어티는 PD-1에 결합한다. 예컨대, 피딜리주맙 및 다른 항-PD-1 항체가 문헌(Rosenblatt, J. et al. (2011) J Immunotherapy 34(5): 409-18, US 7,695,715, US 7,332,582, 및 US 8,686,119, 전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. MEDI0680 및 다른 항-PD-1 항체가 US 9,205,148 및 WO 2012/145493(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 추가의 항-PD-1 항체는, 예컨대 WO 2010/027827 WO 2011/066342, WO 2015/112800, WO 2016/092419, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/209804, WO 2015/200119, US 8,735,553, US 7,488,802, US 8,927,697, US 8,993,731, 및 US 9,102,727(전부 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역자극 또는 표적화 모이어티는 PD-L1에 결합한다. 예컨대, 아테졸리주맙 및 다른 항-PD-L1 항체가 US 8,217,149(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 아벨루맙 및 다른 항-PD-L1 항체가 WO 2013/079174(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 두르발루맙 및 다른 항-PD-L1 항체가 US 8,779,108(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. BMS-936559 및 다른 항-PD-L1 항체가 US 7,943,743 및 WO 2015/081158(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 또한, 항-PD-L1 항체는, 예컨대 WO 2015/181342, WO 2014/100079, WO 2016/000619, WO 2014/022758, WO 2014/055897, WO 2015/061668, WO 2013/079174, WO 2012/145493, WO 2015/112805, WO 2015/109124, WO 2015/195163, US 8,168,179, US 8,552,154, US 8,460,927, 및 US 9,175,082(전부 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역자극 또는 표적화 모이어티는 LAG-3에 결합한다. LAG-3 항체, 예컨대 BMS-986016(Bristol-Myers Squibb), TSR-033(Tesaro), MK-4280(Merck & Co), 또는 REGN3767(Regeneron)이 당해 분야에 보고되어 있다. IMP731 및 다른 항-LAG-3 항체가 WO 2008/132601 및 US 9,244,059(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 또한, 항-LAG-3 항체는, 예컨대 WO 2008/132601, WO 2010/019570, WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2015/200119, WO 2016/028672, US 9,244,059, US 9,505,839(전부 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역자극 또는 표적화 모이어티는 TIM-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIM-3 표적화 모이어티는 TSR-022(Tesaro), 또는 LY3321367(Eli Lilly)로부터 선택된다. APE5137, APE5121, 및 다른 항-TIM-3 항체가 WO 2016/161270(전부 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 또한, 항-TIM-3 항체는, 예컨대 WO 2016/111947, WO 2016/071448, WO 2016/144803, US 8,552,156, US 8,841,418, 및 US 9,163,087(전부 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역자극 또는 표적화 모이어티는 CTLA-4에 결합한다. 항체 이필리무맙 및 다른 항-CTLA-4 항체가 US 6,984,720(본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 항체 트레멜리무맙 및 다른 항-CTLA-4 항체가 US 7,411,057(본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
항체 분자
본원에 기재된 면역자극 융합 분자는 하나 이상의 항체 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 면역 세포 인게이저(engager)는 항체 분자를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 암 항원, 예컨대 종양 항원 또는 기질 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 암 항원은, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간 암 항원이다. 다른 실시양태에서, 항체 분자는 면역 세포 항원, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간의 면역 세포 항원에 결합한다. 예컨대, 항체 분자는 암 항원 또는 면역 세포 항원 상의 에피토프, 예컨대 선형 또는 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, 항체 분자는 일특이적 항체 분자이고, 단일 에피토프에 결합한다. 예컨대, 각각 동일한 에피토프에 결합하는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 갖는 일특이적 항체 분자.
또 다른 실시양태에서, 항체 분자는 다특이적 항체 분자이며, 예컨대 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 복수의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예컨대 동일한 단백질 (또는 다량체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 일치한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 일치하지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예컨대 상이한 단백질 (또는 다량체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 다특이적 항체 분자는 제3, 제4 또는 제5 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 다특이적 항체 분자는 이특이적 항체 분자, 삼특이적 항체 분자, 또는 사특이적 항체 분자이다.
한 실시양태에서, 다특이적 항체 분자는 이특이적 항체 분자이다. 이특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 특징지어진다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예컨대 동일한 단백질 (또는 다량체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 일치한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 일치하지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예컨대 상이한 단백질 (또는 다량체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 이특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 하프 항체 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 하프 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 하프 항체, 또는 이의 단편 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 하프 항체, 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 Fab, 또는 이의 단편 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 Fab, 또는 이의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자는 디아바디, 및 단일쇄 분자 뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함한다. 예컨대, 항체 분자는 중쇄(H) 가변 도메인 서열(본원에서 VH로 단축됨), 및 경쇄(L) 가변 도메인 서열(본원에서 VL로 단축됨)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 중쇄 및 경쇄(본원에서 하프 항체로 지칭됨)를 포함하거나 이로 이로 이루어진다. 또 다른 에에서, 항체 분자는 2개의 중쇄(H) 가변 도메인 서열 및 2개의 경쇄(L) 가변 도메인 서열을 포함함으로써 2개의 항원 결합 부위, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv, 단일쇄 항체(예컨대, scFv), 단일 가변 도메인 항체, 디아바디(Dab)(이가 및 일 또는 이특이적), 트리아바디(삼가 및 일 또는 다특이적), 및 키메라 또는 인간화된 항체를 형성하며, 이는 전체 항체 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 드 노보(de novo) 합성된 것들의 변형에 의해 생성될 수 있다. 이들 기능성 항체 단편은 그들 각각의 항원 또는 수용체와 선별적으로 결합하는 능력을 보유한다. 항체 및 항체 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함하나 이로 제한되지 않는 임의의 부류의 항체 및 임의의 서브부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)의 항체로부터의 것일 수 있다. 항체 분자의 제조는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 항체 분자는 또한 인간, 인간화된, CDR-그래프팅된, 또는 시험관내 생성된 항체일 수 있다. 항체는, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 항체는 또한, 예컨대 카파 또는 람다로부터 선택되는 경쇄를 가질 수 있다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 용어 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
항체 분자의 항원 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VL 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 디아바디 (dAb) 단편; (vi) 카멜리드 또는 카멜화된 가변 도메인; (vii) 단일쇄 Fv(scFv)(예컨대, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 참조); (viii) 단일 도메인 항체를 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항체 분자는 온전한 분자 뿐만 아니라 이의 기능성 단편을 포함한다. 항체 분자의 불변 영역은 (예컨대, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키기 위해) 항체의 특성을 변형시키도록 변경, 예컨대 돌연변이될 수 있다.
항체 분자는 또한 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체를 포함할 수 있다. 예는 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 결핍된 항체, 통상의 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래되는 것과 다른 단일 도메인 스캐폴드를 포함할 수 있다. 단일 도메인 항체는 당해 분야의 임의의 것, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하나 이로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 개시의 또 다른 측면에 따라, 단일 도메인 항체는 경쇄가 결핍된 중쇄 항체로 공지된 자연 발생 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체는, 예컨대 WO 9404678에 개시된다. 명확성을 이유로, 자연적으로 경쇄가 결핍된 중쇄 항체로부터 유래되는 이 가변 도메인은 이를 4개 쇄 면역글로불린의 통상의 VH로부터 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로 공지되어 있다. 이러한 VHH 분자는, 예컨대 카멜리대(Camelidae) 종, 예컨대 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 생성되는 항체로부터 유래될 수 있다. 카멜리대 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 결핍된 중쇄 항체를 생성할 수 있으며; 이러한 VHH는 본 개시의 범위 내에 있다.
항체 분자는 비항체 스캐폴드 및 항체 모방체를 포함할 수 있다. 예시적 비항체 스캐폴드는 리포칼린(예컨대, 안티칼린), 아피바디, 피브로넥틴(예컨대, 모노바디 또는 아드넥틴), 크노틴, 안키린 반복체(예컨대, DARPins), 및 A 도메인 (예컨대, 아비머)을 포함한다.
VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"(FR 또는 FW)으로 불리는 보다 보존된 영역으로 점재된 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불리는 과가변 영역으로 세분될 수 있다.
프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 다수의 방법(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917) 및 옥스포드 몰리큘라 AbM(Oxford Molecular's AbM) 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의에 의해 정확히 정의되었다. 일반적으로, 예컨대 문헌(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌(Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest,"5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)("카바트" 번호매김 체계), (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)("초티아" 번호매김 체계)에 의해 기재된 것을 포함하여 다수의 공지된 체계 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 본원에 사용된 "초티아" 번호 체계에 따라 정의된 CDR은 또한 때때로 "과가변 루프"로 지칭된다.
예컨대, 카바트 하에서, 중쇄 가변 도메인(VH)의 CDR 아미노산 잔기는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2), 및 95-102(HCDR3)로 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL)의 CDR 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2), 및 89-97(LCDR3)로 번호가 매겨진다. 초티아 하에서, VH의 CDR 아미노산은 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2), 및 95-102(HCDR3)로 번호가 매겨지고; VL의 아미노산 잔기는 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2), 및 91-96(LCDR3)으로 번호가 매겨진다.
각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단부터 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다.
항체 분자는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 단일클론 항체는 하이브리도마 기술 또는 하이브리도마 기술을 이용하지 않는 방법(예컨대, 재조합 방법)에 의해 제조될 수 있다.
항체는 재조합적으로, 예컨대 파지 디스플레이에 의해 또는 조합 방법에 의해 생성될 수 있다.
항체를 생성하기 위한 파지 디스플레이 및 조합 방법은 (예컨대, 문헌(Ladner et al. 미국 특허 번호 5,223,409; Kang et al. 국제 공개 번호 WO 92/18619; Dower et al. 국제 공개 번호 WO 91/17271; Winter et al. 국제 공개 WO 92/20791; Markland et al. 국제 공개 번호 WO 92/15679; Breitling et al. 국제 공개 WO 93/01288; McCafferty et al. 국제 공개 번호 WO 92/01047; Garrard et al. 국제 공개 번호 WO 92/09690; Ladner et al. 국제 공개 번호 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, 모두의 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되는 바와 같이) 당해 분야에 공지되어 있다.
일 실시양태에서, 항체는 완전 인간 항체(예컨대, 인간 면역글로불린 서열로부터 항체를 생성하도록 유전자 조작된 마우스에서 제조된 항체), 또는 비인간 항체, 예컨대 설치류(마우스 또는 래트), 염소, 영장류(예컨대, 원숭이), 낙타 항체이다. 바람직하게는, 비인간 항체는 설치류(마우스 또는 래트 항체)이다. 설치류 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
인간 단일클론 항체는 마우스 시스템보다 인간 면역글로불린을 보유하는 트렌스제닉 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 관심 항원으로 면역된 이들 트렌스제닉 마우스로부터의 비장세포는 인간 단백질로부터의 에피토프에 대해 특이적 친화성을 갖는 인간 mAB를 분비하는 하이브리도마를 생성하는 데 사용된다(예컨대, 문헌(Wood et al. 국제 출원 WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT 공개 WO 91/10741; Lonberg et al. 국제 출원 WO 92/03918; Kay et al. 국제 출원 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326)을 참조한다.
항체 분자는 가변 영역, 또는 이의 일부, 예컨대 CDR이 비인간 유기체, 예컨대 래트 또는 마우스에서 생성되는 것일 수 있다. 키메라, CDR-그래프팅된, 및 인간화된 항체가 본 개시 내에 있다. 비인간 유기체, 예컨대 래트 또는 마우스에서 생성되고 이어 인간에서의 항원성을 감소시키기 위해, 예컨대 가변 프레임워크 또는 불변 영역에서 변형된 항체 분자가 본 개시 내에 있다. 예컨대, 항-인간 CD45 항체, 예컨대 9.4, 4B2 및 BC8은 본원에 개시된 테더링된 융합물을 제조하기 위해 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
"효과적인 인간" 단백질은 중화 항체 반응, 예컨대 인간 항-뮤린 항체(HAMA) 반응을 실질적으로 일으키지 않는 단백질이다. HAMA는, 예컨대 항체 분자가, 예컨대 만성 또는 재발성 질환 병태의 치료에 반복적으로 투여되는 경우, 다수의 환경에서 문제가 될 수 있다. HAMA 반응은 혈청으로부터의 증가된 항체 제거 때문에(예컨대, 문헌(Saleh et al. , Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)) 및 또한 잠재적인 알러지 반응(예컨대, 문헌(LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)) 참조) 때문에 반복적인 항체 투여를 잠재적으로 비효과적으로 할 수 있다.
키메라 항체(예컨대, 마우스 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 함유하는 항체)는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(Robinson et al., 국제 특허 공개 PCT/US86/02269; Akira, et al., 유럽 특허 출원 184,187; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 171,496; Morrison et al., 유럽 특허 출원 173,494; Neuberger et al., 국제 출원 WO 86/01533; Cabilly et al. 미국 특허 번호 4,816,567; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 및 Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559).
인간화된 또는 CDR-그래프팅된 항체는 공여자의 CDR로 대체된 (중쇄 및 또는 경쇄 면역글로불린 쇄의) 적어도 1개 또는 2개, 그러나 일반적으로 모든 3개의 수용자 CDR을 가질 것이다. 항체는 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나 CDR의 단지 일부가 비인간 CDR로 대체될 수 있다. 항원에 결합하는 데 필요한 CDR의 수만 대체하는 것이 필요하다. 바람직하게는, 공여자는 설치류 항체, 예컨대 래트 또는 마우스 항체일 것이며, 수용자는 인간 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크일 것이다. 전형적으로, CDR을 제공하는 면역글로불린은 "공여자"로 불리고, 프레임워크를 제공하는 면역글로불린은 "어셉터"로 불린다. 일 실시양태에서, 공여자 면역글로불린은 비인간(예컨대, 설치류)이다. 어셉터 프레임워크는 자연 발생(예컨대, 인간) 프레임워크 또는 컨센서스 프레임워크, 또는 이와 약 85% 이상, 바람직하게는 90%, 95%, 99% 이상 동일한 서열이다.
본원에 사용된 용어 "컨센서스 서열"은 관련 서열의 계열에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산 (또는 뉴클레오티드)으로부터 형성되는 서열을 지칭한다(예컨대, 문헌(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987) 참조). 일 계열의 단백질에서, 컨센서스 서열의 각각의 위치는 계열의 그 위치에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산에 의해 차지된다. 2개의 아미노산이 동등하게 빈번히 발생하는 경우, 둘 중 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다. "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역을 지칭한다.
항체 분자는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 인간화될 수 있다(예컨대, 문헌(Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, 및 Queen et al. US 5,585,089, US 5,693,761 및 US 5,693,762) 참조, 모두의 내용이 참조로 포함됨).
인간화된 또는 CDR-그래프팅된 항체 분자는 면역글로불린 쇄의 1개, 2개, 또는 모든 CDR이 대체될 수 있는 CDR-그래프팅 또는 CDR 치환에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 문헌(U.S. 특허 5,225,539; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060; Winter US 5,225,539, 모두의 내용이 명백히 참조로 포함됨)을 참조한다. 윈터(Winter)는 본 개시의 인간화된 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 CDR-그래프팅 방법을 기재한다(UK 특허 출원 GB 2188638A, 1987년 3월 26일 출원; Winter US 5,225,539, 이의 내용이 명백히 참조로 포함됨).
또한, 본 개시의 범위에는 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 첨가된 인간화된 항체 분자가 있다. 공여자로부터 아미노산을 선택하기 위한 기준은 US 5,585,089, 예컨대 US 5,585,089의 12-16 컬럼, 예컨대 US 5,585,089의 12-16 컬럼(이의 내용이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 인간화 항체에 대한 다른 기술은 문헌(Padlan et al. EP 519596 A1, 1992년 12월 23일에 공개)에 기재되어 있다.
항체 분자는 단일쇄 항체일 수 있다. 단일쇄 항체(scFv)는 조작될 수 있다(예컨대, 문헌(Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; 및 Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52) 참조). 단일쇄 항체는 동일한 표적 단백질의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 다가 항체를 생성하도록 이량체화되거나 다량체화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체 분자는, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는; 특히, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 (예컨대, 인간) 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항체 분자는, 예컨대 카파 또는 람다의 (예컨대, 인간) 경쇄 불변 영역으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 갖는다. 불변 영역은 항체의 특성을 변형시키도록 (예컨대, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 및/또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키도록) 변경, 예컨대 돌연변이될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체는 이펙터 기능을 갖고; 보체를 고정시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체는 이펙터 세포를 동원하지 않고; 보체를 고정시키지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체를 결합하는 능력이 감소되거나 이를 갖지 않는다. 예컨대, 이는 Fc 수용체에 대한 결합을 지지하지 않는 이소형 또는 서브형, 단편 또는 다른 돌연변이체이며, 예컨대 이는 돌연변이되거나 결실된 Fc 수용체 결합 영역을 갖는다.
항체 불변 영역을 변경하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 변경된 기능, 예컨대 이펙터 리간드, 예컨대 세포 상의 FcR, 또는 보체의 C1 성분에 대해 변경된 친화성을 갖는 항체는 항체의 불변 부분의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체함으로써 생성될 수 있다(예컨대, EP 388,151 A1, U.S. 특허 번호 5,624,821 및 U.S. 특허 번호 5,648,260, 모두의 내용이 참조로 포함됨). 뮤린 또는 다른 종 면역글로불린에 적용되는 경우 이들 기능을 감소시키거나 제거시키는 유사한 유형의 변경이 기재될 수 있다.
항체 분자는 또 다른 기능성 분자(예컨대, 본원에 기재된 시토카인 분자 또는 다른 화학적 또는 단백질성 기)로 유도체화되거나 이에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 "유도체화된" 항체 분자는 변형된 것이다. 유도체화 방법은 형광 모이어티, 방사성뉴클레오티드, 독소, 효소, 친화성 리간드, 예컨대 비오틴의 첨가를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본 개시의 항체 분자는 면역부착 분자를 포함하는 본원에 기재된 항체의 유도체화된 및 달리 변형된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 예컨대, 항체 분자는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 시토카인 분자, 또 다른 항체(예컨대, 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 부분의 또 다른 분자와의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예컨대, 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 (예컨대, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유적 연합 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다.
일 유형의 유도체화된 항체 분자는 항체 분자를 (예컨대, 이특이적 항체를 생성하기 위해 동일한 유형 또는 상이한 유형의) 하나 이상의 단백질, 예컨대 시토카인 분자, 또 다른 항체 분자에 가교시킴으로써 생성된다. 적합한 가교링커는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 뚜렷한 반응성 기를 갖는 이종이기능성(예컨대, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종이기능성(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company, 일리노이주 로크포드)로부터 입수가능하다.
예시적 면역자극 융합 분자 및 링커
특정 실시양태에서, IFM은 N에서 C 말단 배향으로 하기 화학식으로 나타낼 수 있다: R1-(임의적으로 L1)-R2 또는 R2-(임의적으로 L1)-R1; 여기서, R1은 면역 세포 표적화 모이어티를 포함하고, L1은 링커(예컨대, 본원에 기재된 펩티드 링커)를 포함하고, R2는 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자는 면역 세포 표적화 모이어티에 연결, 예컨대 공유적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자는 면역 세포 표적화 모이어티는 면역 세포 표적화 모이어티에 (예컨대, 화학적 커플링, 융합, 비공유적 연합 등에 의해) 기능적으로 연결, 예컨대 공유적으로 연결된다. 예컨대, 면역 자극 모이어티는 간접적으로, 예컨대 링커를 통해 면역 세포 표적화 모이어티에 공유적으로 커플링될 수 있다.
실시양태에서, 링커는 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 또는 비나선형 링커로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커는 5-20, 8-18, 10-15, 또는 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly 및 Ser, 예컨대 아미노산 서열(Gly3-Ser)n을 포함하는 링커(여기서, n은 모티프 반복 횟수를 나타내고, 예컨대 n=1, 2, 3, 4 또는 5)(예컨대, (Gly4Ser)2 또는 (Gly4Ser)3 링커)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호 36, 37, 38, 또는 39의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는) 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGSGGGS(서열 번호 37)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 IgG4 힌지 영역으로부터의 아미노산, 예컨대 아미노산 DKTHTSPPSPAP(서열 번호 38)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 링커는 비펩티드성 화학적 링커이다. 예컨대, 면역 자극 모이어티는 가교에 의해 면역 세포 표적화 모이어티에 공유적으로 커플링된다. 적합한 가교링커는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 뚜렷하게 반응성인 기를 갖는 이종이기능성인 것(예컨대, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종이기능성인 것(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 생분해성 또는 절단성 링커일 수 있다. 절단성 링커는 면역 자극 모이어티, 예컨대 시토카인 분자가 면역 표적화 모이어티로부터 방출될 수 있도록 IFM의 절단을 허용한다. 링커의 절단은 관련 조직 내에서의 생물학적 활성화 또는 대안적으로 외부 자극, 예컨대 전자기 방사선 예컨대, UV-방사선에 의해 야기될 수 있다.
일 실시양태에서, 절단성 링커는, 예컨대 세포 또는 조직 손상 또는 질환과 연관된 병태에서 절단되도록 세포에 대한 절단성 외부에 대해 구성된다. 이러한 병태는, 예컨대 산증; 괴사 병태(예컨대, 칼파인 또는 괴사 세포로부터 유출되는 다른 프로테아제에 의해 절단됨)를 포함하는 (일반적으로 세포 내에 한정된) 세포내 효소의 존재; 저산소 병태, 예컨대 환원 환경; 혈전증(예컨대, 링커는 트롬빈에 의해 또는 혈액 응고 케스케이드와 연관된 또 다른 효소에 의해 전단될 수 있음); 면역계 활성화(예컨대, 링커는 활성화된 보체 단백질의 작용에 의해 절단될 수 있음); 또는 질환 또는 손상과 연관된 다른 병태를 포함한다.
일 실시양태에서, 절단성 링커는 S-S 연결(디술파이드 결합)을 포함하거나, 금속이 환원되는 경우 떨어져 나가는 전이 금속 착물을 포함할 수 있다. S-S 링커의 일 실시양태는 (미국 특허 번호 9,603,944(본원에 전부 참조로 포함됨)에 개시되는 바와 같이) 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00005
pH 변화에 따라, 예컨대 낮은 pH에서 절단되는 또 다른 예시적인 pH 민감성 링커는 산 (또는 염기) 불안정 모이어티, 예컨대 산 불안정 에스테르 기 등의 가수분해를 촉진할 것이다. 이러한 조건은 세포외 환경, 예컨대 암성 세포 및 조직 근처에서 발견될 수 있는 산성 조건 또는 저산소성 또는 허혈성 세포 및 조직 근처에서 발견될 수 있는 환원 환경에서; 세포의 표면 상에서 발견되거나 치료될 병태를 갖는 세포, 예컨대 병에 걸린 아폽토시스 또는 괴사 세포 및 조직 근처에서 방출되는 프로테아제 또는 다른 효소에 의해; 또는 다른 조건 또는 요인에 의해 발견될 수 있다. 산-불안정 링커는, 예컨대 시스-아코니트산 링커일 수 있다. pH 민감성 연결의 다른 예는 아세탈, 케탈, 활성화된 아미드, 예컨대 아미드 of 2,3 디메틸말레암산, 비닐 에테르, 다른 활성화된 에테르 및 에스테르, 예컨대 에놀 또는 실릴 에테르 또는 에스테르, 이민, 이미늄, 오르토에스테르, 에나민, 카바메이트, 히드라존, 및 당해 분야에 공지된 다른 연결을 포함한다(예컨대, 문헌(PCT 공개 No. WO 2012/155920 및 Franco et al. AIMS Materials Science, 3(1): 289-323, 본원에 참조로 포함됨) 참조). 2017년 9월 5일에 출원된 U.S. 가출원 번호 62/554,067 및 2018년 1월 11일에 출원된 U.S. 가출원 번호 62/616,221에 개시된 링커도 사용될 수 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 표현 "pH 민감성"은 문제의 절단성 링커가 산성 pH(예컨대, 6.0 이하, 예컨대 4.0-6.0 범위의 pH)에서 실질적으로 절단된다.
또 다른 실시양태에서, 절단성 링커는 효소, 예컨대 프로테아제(예컨대, 펩신, 트립신, 써모리신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 디스인테그린 및 메탈로프로테아제(ADAM; 예컨대 ADAM-10 또는 ADAM-17), 글리코시다제(예컨대, α-, β-, γ-아밀라제, α-, β-글루코시다제 또는 락타제) 또는 에스테라제(예컨대, 아세틸 콜린에스테라제, 슈도 콜린에스테라제 또는 아세틸 에스테라제)에 의한 절단에 대해 구성된다. 절단성 링커를 절달할 수 있는 다른 효소는 우로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA), 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 그란짐 A, 그란짐 B, 리소솜 효소, 카텝신, 전립선-특이적 항원, 단순 포진 바이러스 프로테아제, 시토메갈로바이러스 프로테아제, 트롬빈, 카스파제, 및 인터루킨 1 베타 전환 효소를 포함한다.
또 다른 예는 관심 조직에서 효소, 예컨대 프로테아제(예컨대, 펩신, 트립신)의 과발현이며, 이로써 특이적으로 설계된 펩티드 링커는 관심 조직에 도착 시 절단될 것이다. 이러한 측면에서 적합한 링커의 실증적인 예는 Gly-Phe-Ser-Gly(서열 번호 105), Gly-Lys-Val-Ser(서열 번호 106), Gly-Trp-Ile-Gly(서열 번호 107), Gly-Lys-Lys-Trp(서열 번호 108), Gly-Ala-Tyr-Met(서열 번호 109)이다.
또 다른 예에서, 관심 조직에서 효소, 예컨대 글리코시다제(예컨대, α-아밀라제)의 과발현은 관심 조직에 도착 시 특이적으로 설계된 탄수화물 링커가 절단되게 한다. 이러한 측면에서 적합한 링커의 실증적인 예는 -(α-1-4-D-Glucose)n-(여기서, n≥4)이다.
또 다른 예에서, 절단성 링커는 전자기 방사선, 예컨대 UV-방사선에 의한 절단에 대해 구성된다. 링커 B의 절단을 초래하는 관심 조직의 UV 노출은 약물 방출을 촉진시키거나 원하는 조직에서 나노입자의 흡수를 촉진시킬 수 있다.
절단성 링커는 총 2 내지 60개의 원자, 예컨대 2 내지 20개의 원자를 포함할 수 있다. 절단성 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 예컨대 1 내지 30 또는 2 내지 10개 아미노산 잔기의 펩티드 연결일 수 있다. 한 변형에서, 절단성 링커 B는 1 내지 30, 예컨대 2 내지 10, 또는 2 내지 8, 또는 3 내지 9, 또는 4-10개의 아미노산으로 이루어진다. pH 민감성 링커에 대해, 원자의 수는 전형적으로 2 내지 50, 예컨대 2-30이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 링커는 아미노카프로산(또한 아미노헥산산으로 명명) 연결 또는 1 내지 30개, 또는 2 내지 10개 탄수화물 잔기로 구성된 연결을 포함한다.
일 실시양태에서, 링커는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 기질로서 작용할 수 있는 펩티드를 포함한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제로서, 예컨대 MMP-1(간질 콜라게나제), MMP-2(겔라티나제 A), MMP-3, MMP-7, MMP-9(겔라티나제 B) 등이 공지되어 있고, 상기 언급된 것 중 하나 이상의 종류의 매트릭스 메탈로프로테이나제로서 작용할 수 있는 기질 펩티드가 사용될 수 있다. 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대해, 예컨대 문헌("Molecular mechanism of cancer metastasis", Ed. by Tsuruo T., pp. 92-107, Medical View Co., Ltd., published in 1993)을 참조한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 기질로서 작용할 수 있는 기질 펩티드로서, 예컨대 특정 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 이에 의해 특이적으로 인식되는 기질 펩티드가 문헌(Nature Biotechnology, 19, pp. 661-667, 2001)에 설명되어 있다. 따라서, 이 공개문을 참조하여, 특정 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 특이적으로 절단되는 기질 펩티드가 선택될 수 있다. 예컨대, Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Tyr-Ser-Gly(서열 번호 110)가 MMP-9에 대한 특정 기질로서 공지되어 있고, MMP-9의 기질로서 작용할 수 있는 기질 펩티드로서 상술된 옥타펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 기질로서 작용할 수 있는 기질의 실증적인 예는 Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln(서열 번호 111), Val-Pro-Met-Ser-Met-Arg-Gly-Gly(서열 번호 112), Ile-Pro-Val-Ser-Leu-Arg-Ser-Gly(서열 번호 113), Arg-Pro-Phe-Ser-Met-Ile-Met-Gly(서열 번호 114), Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly(서열 번호 115), Ile-Pro-Glu-Ser-Leu-Arg-Ala-Gly(서열 번호 116), Arg-His-Asp, Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(서열 번호 117), Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-Lys(서열 번호 118), Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg(서열 번호 119), Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Arg(서열 번호 120), Gly-Pro-Leu-Gly-Pro(서열 번호 121), Gly-Pro-Ile-Gly-Pro(서열 번호 122) 등을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 디스인테그라제 및 메탈로프로테아제(ADAM), MMP, 또는 그란짐의 기질로서 작용할 수 있는 펩티드를 포함한다. 예컨대, 링커는, 제한 없이, ADAM-8, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-17, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-13, 그란짐 A, 또는 그란짐 B의 펩티드 기질을 포함할 수 있다. ADAM, MMP, 및 그란짐의 기질은 널리 기재되어 있으며(예컨대, Miller, MA, et al. Integrative Biology (2011) 3:422-438, Van Damme et al. Biol Chem (2010) 391:983-997, 및 Casciola-Rosen, L, et al. J Biol Chem (2007) 282:4545-4552), 당업자는 이러한 펩티드, 또는 이의 변이체를 관심 링커로 쉽게 포함시킬 수 있다.
링커는, 기질 펩티드 이외에, 결합 또는 치료 단백질과의 결합에 관련되는 커넥터를 함유한다. 이러한 커넥터 각각은 1개의 아미노산 잔기 또는 2 내지 10, 예컨대 3 내지 9, 또는 4 내지 8, 또는 2 내지 8개의 아미노산 잔기를 함유하는 올리고펩티드로 이루어질 수 있다. 커넥터로서 아미노산 잔기 또는 올리고펩티드는, 존재하는 경우, 기질 펩티드의 양 말단에 결합할 수 있거나, 하나의 구조를 나타내도록 기질 펩티드의 한 말단에만 결합될 수 있다. 커넥터(들)로서 사용가능한 하나의 아미노산의 유형 및 커넥터(들)로서 사용가능한 올리고펩티드를 구성하는 아미노산 잔기는 특별히 제한되지 않으며, 임의의 유형의 하나의 아미노산 잔기, 또는, 예컨대 임의의 유형의 동일하거나 상이한 아미노산 잔기 중 2 내지 8개를 함유하는 임의의 올리고펩티드가 사용될 수 있다. 커넥터(들)로서 사용가능한 올리고펩티드의 예는, 예컨대 Gly 아미노산이 풍부한 커넥터를 포함한다. 다른 유기 모이어티도 커넥터로서 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 면역 자극 모이어티는 링커 없이 면역 세포 표적화 모이어티에 직접적으로 공유결합적으로 커플링된다.
다른 실시양태에서, IFM의 면역 자극 모이어티 및 면역 세포 표적화 모이어티는 공유적으로 연결되지 않고, 예컨대 비공유적으로 연합된다.
시토카인 분자의 항체 분자, 예컨대 면역글로불린 모이어티(Ig), 예컨대 항체(IgG) 또는 항체 단편(Fab, scFv 등)에 대한 융합의 예시적 포맷은 항체 분자의 아미노-말단(N-말단) 또는 카복시-말단(C-말단), 전형적으로 항체 분자의 C-말단에의 융합을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 시토카인 폴리펩티드, 시토카인-수용체 복합체, 또는 Ig 폴리펩티드에 연결된 시토카인-수용체 Fc 복합체, 시토카인 폴리펩티드 쇄와 Ig 폴리펩티드 쇄 사이의 적합한 접합을 포함하는 시토카인-Ig 모이어티 융합 분자는 직접적 폴리펩티드 결합, 2개의 쇄 사이에 폴리펩티드 링커를 갖는 접합; 및 쇄 사이의 화학적 연결을 포함한다. 전형적 접합은 Gly4Ser 링커(GGGGS)N(여기서, N은 모티프 반복 횟수를 나타냄)로 구성된 유연성 링커이다. (GGGGS)2 및 (GGGGS)3이 본 개시의 융합 구축물에 사용하기 위한 바람직한 양태의 링커이다.
본원에 기재된 예시적 면역자극 융합 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 상술된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에는 본 개시의 예시적 면역자극 융합 분자 (또는 이의 부분)가 기재된다. 특정 scFv에서 배열은 VH-링커-VL임이 주목되어야 한다. 그러나, VL-링커-VH 배열은 또한 기능성에 영향을 끼치지 않으면서 사용될 수 있다. 또한, 특정 링커(링커-1, 링커-2 등)가 다양한 구축물에 사용되었지만, 본원에 개시된 다른 링커도 상호교환적으로 사용될 수 있다.
서열 번호 1
명칭: LC-chBC8-sushi
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15Rα-스시 도메인을 함유한다.
Figure pct00006
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15-결합 스시 도메인에 융합된 키메라 BC8 Fab의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 스시 도메인은 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 1에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1과 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 영역의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 1의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 1로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 1과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 1과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 2
명칭: sushi-LC-chBC8
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 N-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15Rα-스시 도메인을 함유한다.
Figure pct00007
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 키메라 BC8 Fab의 경쇄 부분에 융합된 IL-15-결합 야생형 스시 도메인을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 스시 도메인은 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 2에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 2와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 영역의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 2의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 2와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 2와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 2와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 3
명칭: LC-chBC8-IL15(LC-chBC8-Ll-IL15로도 지칭됨)
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00008
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 BC8 Fab의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 3에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 3과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, BC8 항체 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 3의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 3으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 3과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 3과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 3과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 4
명칭: IL15-LC-chBC8
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 N-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00009
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 키메라 BC8 Fab의 경쇄에 융합된 IL-15 시토카인을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 4에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 4와 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 4의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 4로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 4와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 4와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 4와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
키메라 BC8 항체 분자, 예컨대 Fab 또는 IgG의 예시적인 상응하는 중쇄는 하기에 각각 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 제시된다.
서열 번호 5
명칭: HC-chBC8-Fab
키메라 BC8 항-CD45 항체의 Fab 중쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 5에 나타낸 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 5와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 5의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 6
명칭: HC-chBC8-IgG4S228P
키메라 BC8 항-CD45 항체의 중쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 S228P 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4로부터의 불변 영역(IgG4-S228P)을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 6에 나타낸 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, S228P 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4로부터의 불변 도메인 서열(IgG4-S228P)을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 6과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 6의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 7
명칭: LC-chBC8
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 BC8 항체는 서열 번호 7에 나타낸 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 카파로부터의 불변 도메인 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 7과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 7의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 8
명칭: HC-chBC8-IgG4S228P-IL15
키메라 BC8 항-CD45 항체의 중쇄; 모 BC8 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 S228P 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4로부터의 불변 영역(IgG4-S228P)을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 중쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00010
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 BC8 IgG4의 중쇄 부분을 나타낸다. 중쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다.
일부 실시양태에서, BC8 항체는 서열 번호 8에 나타낸 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG4 불변 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 8과 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 8의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 8과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 8과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 8과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 14
명칭: HC-ch9.4-Fab
키메라 9.4 항-CD45 항체의 Fab 중쇄; 모 9.4 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 9.4 항체는 서열 번호 14에 나타낸 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgGl 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 14와 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 9.4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 9.4 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 14의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 15
명칭: LC-ch9.4-IL15
키메라 9.4 항-CD45 항체의 경쇄; 모 9.4 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00011
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 9.4 IgGl의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 15에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 9.4 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 15의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 9.4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 15의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 15의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 15와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 15와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 15와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 16
명칭: HC-ch4B2-Fab
키메라 4B2 항-CD45 항체의 Fab 중쇄; 모 4B2 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 4B2 항체는 서열 번호 16에 나타낸 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1 중쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 16과 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 4B2 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 4B2 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 16의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 17
명칭: LC-ch4B2-IL15
키메라 4B2 항-CD45 항체의 경쇄; 모 4B2 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00012
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 4B2 IgGl의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 17에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 4B2 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 17의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 4B2 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 4B2 항체의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 17의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 17의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 17과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 17과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 17과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 18
명칭: HC-hBC8(23)-Fab
인간화된 BC8 항-CD45 항체의 Fab 중쇄; 인간화된 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 인간화된 BC8 항체의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인 서열을 추가로 포함)은 서열 번호 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 18의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 갖는다. 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 18의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 19
명칭: LC-hBC8(23)-IL15
인간화된 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 인간화된 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00013
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 인간화된 BC8 IgGl의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 19에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 인간화된 BC8 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 19의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 19의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 19의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 19와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 19와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 19와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 20
명칭: HC-hBC8(23)-null-Fab
인간화된 BC8 항-CD45 항체의 Fab 중쇄; 인간화된 가변 도메인, CDR-H3에 SGGGS(서열 번호 123) 치환, 및 인간 IgGl으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
서열 번호 21
명칭: LC-chBC8-L2-IL15
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 서열 GGGSGGGS(서열 번호 37)를 갖는 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00014
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커(L2)를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 BC8 IgG1의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 21에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 BC8 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 21의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 21의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 21의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 21과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 21과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 21과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 22
명칭: LC-chBC8-L3-IL15
키메라 BC8 항-CD45 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 인간 IgG1 힌지와 관련된 링커(서열 번호 38)를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00015
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커(L3)를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 BC8 IgG1의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 22에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 BC8 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 22의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, BC8 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 22의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 22의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 22와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 22와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 22와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 25
명칭: hBC8(23)-null 중쇄 가변 도메인
인간화된 BC8 항-CD45 항체의 중쇄 가변 도메인; CDR-H3에 SGGGS 치환을 함유한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 25의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 25와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 25와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 25와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 26
명칭: HC-chMHM24-Fab
키메라 MHM24 항-CD11a 항체의 Fab 중쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 MHM24 항체의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인 서열을 추가로 포함)은 서열 번호 26에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 26의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 갖는다. 실시양태에서, MHM24 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, MHM24 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 26의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 69
명칭: HC-hMHM24-Fab
인간화된 MHM24 항-CD11a 항체의 Fab 중쇄; 인간화된 MHM24 중쇄 가변 도메인으로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 인간화된 MHM24 항체의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인 서열을 추가로 포함)은 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 27의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 갖는다. 실시양태에서, MHM24 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, MHM24 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 27의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 27
명칭: LC-chMHM24-IL15
키메라 MHM24 항-CD11a 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00016
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 MHM24 IgG1의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 MHM24 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 27의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 키메라 MHM24 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 27의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 27의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 27과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 27과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 27과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 28
명칭: HC-ch1B4-Fab
키메라 1B4 항-CD18 항체의 Fab 중쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 1B4 항체의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 인간 IgG1의 CH1 도메인 서열을 추가로 포함)은 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 28의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 키메라 1B4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 1B4 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 28의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 29
명칭: LC-ch1B4-IL15
키메라 1B4 항-CD18 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00017
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 1B4 IgG1의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 29에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 1B4 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 29의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 키메라 1B4 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 29의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 29의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 29와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 29와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 29와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 30
명칭: HC-chOKT8-Fab
키메라 OKT8 항-CD8 항체의 Fab 중쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 OKT8 항-CD8 항체의 중쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로 인간 IgG1으로부터의 CH1 도메인 서열을 추가로 포함)은 서열 번호 30에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 30의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열)을 갖는다. 실시양태에서, 키메라 OKT8 항-CD8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, OKT8 항-CD8 항체의 중쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 30의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
서열 번호 31
명칭: LC-chOKT8-IL15
키메라 OKT8 항-CD8 항체의 경쇄; 모 마우스 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 및 인간 불변 카파 도메인을 함유하고; 유연성 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 유전자조작으로 융합된 야생형 IL-15를 함유한다.
Figure pct00018
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 키메라 OKT8 IgG1의 경쇄 부분을 나타낸다. 경쇄의 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다. 카파 불변 영역은 서열 번호 74로 제시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 31에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 키메라 OKT8 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열(임의적으로, 카파 경쇄 서열을 추가로 포함), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 31의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, 키메라 OKT8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 31의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 31의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 31과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 31과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 31과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
서열 번호 32
명칭: BC8scFv-IL15
짧은 유연성 링커 및 헥사히스티딘 태그를 사용하여 BC8-scFv의 C-말단에 융합된 IL-15.
Figure pct00019
N-말단에서 C-말단으로, 펩티드 링커를 통해 IL-15 시토카인에 융합된 BC8 scFv의 경쇄 부분을 나타낸다. scFv 서열은 표준 글씨체로 표시되고, 펩티드 링커의 위치는 이탤릭체 및 단일 밑줄로 표시되고, 시토카인 분자는 이중 밑줄로 표시된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 31에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분에 상응하는 BC8 scFv 항체의 경쇄 가변 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 32의 항체 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열). 실시양태에서, BC8 항체는, 예컨대 카바트 정의에 따라, 항체의 경쇄 가변 도메인의 1, 2, 또는 모든 3개의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예컨대 서열 번호 32의 CDR 서열 중 임의의 것으로부터 적어도 1개, 그러나 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 32의 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 32와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 32와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 32와 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
본 개시의 IFM에 포함될 수 있는 추가의 서열이 하기 표 1에 제시된다. 일부 실시양태에서, IFM은 불변 람다 또는 람다 영역을 포함한다. 예시적인 불변 람다 또는 람다 영역은 서열 번호 74-78을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 IFM은 서열 번호 1-104의 아미노산 서열 중 하나 이상, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1-104 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하거나, 서열 번호 1-104 중 임의의 것과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 실시양태에서, IFM은 서열 번호 1-104 중 임의의 것과 비교하여 5, 10, 또는 15개 이하의 변경(예컨대, 치환, 결실, 또는 삽입, 예컨대 보존적 치환)을 포함한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
단백질 변이체
전장 폴리펩티드 및 이의 변이체가 하기에 기재된다. 전장 IL-15 서열(서열 번호 40)은 진뱅크 수탁 번호 CAA62616.1로부터 취해지고; 성숙 IL-15는 신호 서열이 결핍되고 서열 번호 10에 정의된다. 전장 IL-15Rα(서열 번호 41)는 진뱅크 수탁 번호 AAI21141.1로부터 취해진다. IL-15R의 스시 도메인(IL-15Rα-sushi)은 서열 번호 9에 의해 주어진다. 제1 및 제4 시스테인 및 개재하는 아미노산을 포함하는 최소 스시 도메인(서열 번호 52)는 또한 다른 곳에서도 기재되며, 타당한 대체물이다. 마찬가지로, 천연 Thr 또는 Ile-Thr을 포함하는 최소 스시 도메인에 대한 임의의 N-말단 첨가 및/또는 Ile 또는 Ile-Arg 잔기를 포함하는 최소 스시 도메인에 대한 임의의 C-말단 첨가도 타당하다.
하기에 기재된 단백질 변이체는 성숙 단백질에 상응하는 단백질 서브유닛 명칭 및 서열 번호를 명시한다. 각각의 단백질 서브유닛은 발현 세포로부터 분비를 촉진하기 위해 N-말단 신호 펩티드와 함께 재조합적으로 발현되었다. 천연 IL-15Rα 신호 펩티드(서열 번호 35)가 스시, sushi-L77I-Fc, 및 sushi-Fc에 대해 사용되었다. 서열 번호 33의 리더 서열이 항체 경쇄, IL15-WT, N-말단 IL-15 융합물, IL15-N72D, 및 Fab-경쇄에 대한 스시의 N-말단 융합물의 분비를 지지하기 위해 사용되었다. 서열 번호 34의 리더 서열이 항체 중쇄의 분비를 지지하기 위해 사용되었다.
"중쇄" 및 "경쇄" 명명에 대해, 우리는 항체에 대한 표준 명명 시스템을 사용한다. 예컨대, 항체 Fab 단편에서, 두 쇄는 대략 동일한 분자 질량을 갖지만, 우리는 중쇄를 (예컨대, 가변 중쇄 및 CH1 도메인을 함유하는) 전장 항체에서의 중쇄에 상응하는 Fab 단편의 쇄로서 지칭한다. 또한, Fab 단편의 경쇄에 대한 시토카인 융합물의 경우, 경쇄는 실제로 시토카인 융합에 기인하여 중쇄보다 큰 분자 질량을 갖는다; 그러나, 일관성을 위해, 우리는 가변 경쇄 도메인 및 불변 카파 도메인 및 시토카인 융합물은 "경쇄"를 포함하고 가변 중쇄 도메인 및 CH1 도메인은 "중쇄"를 포함하는 표준 명명 규칙을 유지한다.
단백질명: chBC8-IL15/sushi Fab(chBC8-Ll-IL15/sushi Fab로도 지칭됨)
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), LC-chBC8-IL15(서열 번호 3), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 BC8 Fab는 모 마우스 단일클론 항체(mAb)로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-인간 CD45R 항체 Fab 단편이다.
단백질명: IL15-chBC8/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), IL15-LC-chBC8(서열 번호 4), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 N-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-sushi/IL15-N72D Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), LC-chBC8-sushi(서열 번호 1), 및 IL15-N72D(서열 번호 11)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 IL15-N72D와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: sushi-chBC8/IL15-N72D Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), sushi-LC-chBC8(서열 번호 2), 및 IL15-N72D(서열 번호 11)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 N-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 IL15-N72D와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-IL15/sushi IgG
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-IgG4S228P(서열 번호 6), LC-chBC8-IL15(서열 번호 3), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 IgG-S228P 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 BC8 IgG4-S228P는 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 IgG4의 Fab-아암-교환의 감수성을 감소시키는 S228P 포인트 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4)을 포함하는 항-인간 CD45R 항체이다.
단백질명: IL15-chBC8/sushi IgG
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-IgG4S228P(서열 번호 6), IL15-LC-chBC8(서열 번호 4), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 IgG4-S228P 경쇄의 N-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sush 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-sushi/IL15-N72D IgG
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-IgG4S228P(서열 번호 6), LC-chBC8-sushi(서열 번호 1), 및 IL15-N72D(서열 번호 11)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 IgG4-S228P 경쇄의 C-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 IL-15Rα-sushi와 IL-15 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: sushi-chBC8/IL15-N72D IgG
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-IgG4S228P(서열 번호 6), sushi-LC-chBC8(서열 번호 2), 및 IL15-N72D(서열 번호 11)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 IgG4-S228P 경쇄의 N-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 IL-15Rα-sushi와 IL-15 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-(HC)-IL15/sushi IgG
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-IgG4S228P-IL15(서열 번호 8), LC-chBC8(서열 번호 7), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 BC8 IgG4-S228P 중쇄의 C-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-IL15/sushi scFv
이 단백질은 2개의 서브유닛: BC8scFv-IL15(서열 번호 32) 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 BC8-scFv의 C-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다. BC8-scFv는 유연성 링커에 의해 연결된 모 마우스 mAb로부터의 가변 도메인을 포함한다.
단백질명: IL15-N72D/sushiL771-Fc
이 단백질은 2개의 서브유닛: IL15-N72D(서열 번호 11) 및 sushi-L77I-Fc(서열 번호 12)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 인간 IgGl-Fc 영역의 N-말단에 융합된 L77I 돌연변이를 함유하는 IL-15Rα-sushi, 및 IL15-N72D와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: IL15-WT/sushi-Fc
이 단백질은 2개의 서브유닛: IL15-WT(서열 번호 10) 및 sushi-Fc(서열 번호 13)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 인간 IgGl-Fc 영역의 N-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 IL15-WT와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: IL15-WT/sushi-IgG2Da-Fc
이 단백질은 2개의 서브유닛: IL15-WT(서열 번호 10) 및 sushi-IgG2Da-Fc(서열 번호 56)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 인간 IgG2Da-Fc 영역의 N-말단에 대한 IL-15Rα-sushi의 융합, 및 (IL-15Rα-sushi와의 상호작용을 통한) IL15-WT와의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: ch9.4-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-ch9.4-Fab(서열 번호 14), LC-ch9.4-IL15(서열 번호 15), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 9.4 Fab는 (ATCC 하이브리도마 HB-10508에 상응하는) 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-CD45R 항체 Fab 단편이다.
단백질명: ch4B2-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-ch4B2-IL15(서열 번호 16), LC-ch4B2-IL15(서열 번호 17), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 4B2 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 4B2 Fab는 (ATCC 하이브리도마 HB-11186에 상응하는) 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-CD45R 항체 Fab 단편이다.
단백질명: hBC8(23)-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-hBC8(23)-Fab(서열 번호 18), LC-hBC8(23)-IL15(서열 번호 19), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 인간화된 BC8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다. 인간화된 BC8(23) Fab는 모 마우스 mAb로부터 인간화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-CD45R 항체 Fab 단편이다.
단백질명: hBC8-null-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8(23)-null-Fab(서열 번호 20), LC-hBC8(23)-IL15(서열 번호 19), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 인간화된 BC8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다. 이 단백질은 이의 중쇄가 CDR-H3 루프 내에 GGGS 치환을 함유하여 CD45R에 대한 결합 친화성이 제거된다는 점에서 hBC8(23)-IL15/sushi Fab와 상이하다(따라서, "널(null)" 결합 변이체로 지정). 따라서, 이 IL15 융합 단백질은 CD45R 인게이지먼트(engagement)의 효과에 대한 음성 대조군으로 작용한다.
단백질명: chBC8-L2-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), LC-chBC8-L2-IL15(서열 번호 21), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-L2(서열 번호 37)를 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 N-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chBC8-L3-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chBC8-Fab(서열 번호 5), LC-chBC8-L3-IL15(서열 번호 22), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-L3(서열 번호 38)을 사용하는 키메라 BC8 Fab 단편 경쇄의 N-말단에 대한 IL-15의 융합, 및 IL-15와 IL-15Rα-sushi 사이의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chMHM24-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chMHM24-Fab(서열 번호 26), LC-MHM24-IL15(서열 번호 27), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 MHM24 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 MHM24 Fab는 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-인간 CD11a 항체 Fab 단편이다.
단백질명: chlB4-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chlB4-Fab(서열 번호 28), LC-chlB4-IL15(서열 번호 29), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 1B4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 1B4 Fab는 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-인간 CD18 항체 Fab 단편이다.
단백질명: chOKT8-IL15/sushi Fab
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chOKT8-Fab(서열 번호 30), LC-chOKT8-IL15(서열 번호 31), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 OKT8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다. 키메라 OKT8 Fab 는 모 마우스 mAb로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-인간 CD8 항체 Fab 단편이다.
단백질명: h9.4Fab-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab(서열 번호 79) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70(서열 번호 82)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70의 융합을 포함한다. h9.4 Fab는 h9.4로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(VH 및 VL) 및 인간으로부터의 불변 도메인(인간 불변 카파 도메인 및 인간 IgGl-CHl 도메인)을 포함하는 항-인간 CD45R 항체 Fab 단편이다.
단백질명: h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-h9.4scFv(서열 번호 80) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70(서열 번호 82)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70의 융합, 및 링커-l을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 h9.4 scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: h9.4Fab-hBC8scFv-scIL-12-p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-hBC8scFv(서열 번호 81) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70(서열 번호 82)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70의 융합, 및 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 hBC8 scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: h9.4Fab-scIL-12p70AB
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab(서열 번호 79) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(서열 번호 102)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70의 융합을 포함한다.
단백질명: h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70AB
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-h9.4scFv(서열 번호 80) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(서열 번호 102)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70의 융합, 및 링커-l을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 h9.4 scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: h9.4Fab-hBC8scFv-scIL-12-p70AB
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-hBC8scFv(서열 번호 81) 및 LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(서열 번호 102)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 인간 IL-12p70 융합, 및 링커-1(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 hBC8 scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: h9.4Fab-IL-12p70AB
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab(서열 번호 79), LC-h9.4Fab-IL-12A(서열 번호 103), 및 IL-12B(서열 번호 49)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)를 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12A의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12A와 IL-12B 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: h9.4Fab-h9.4scFv-IL-12p70AB
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-h9.4scFv(서열 번호 80), LC-h9.4Fab-IL-12A(서열 번호 103), 및 IL-12B(서열 번호 49)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-Ll(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12A의 융합, 및 링커-l을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 h9.4 scFv의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12A와 IL-12B 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: h9.4Fab-hBC8scFv-IL-12-p70AB
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-hBC8scFv(서열 번호 81), LC-h9.4Fab-IL-12A(서열 번호 103), 및 IL-12B(서열 번호 49)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12A의 융합, 및 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 hBC8 scFv의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12A와 IL-12B 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: h9.4Fab-IL-12p70BA
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab(서열 번호 79), LC-h9.4Fab-IL-12B(서열 번호 104), 및 IL-12A(서열 번호 47)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12B의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12B와 IL-12A 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: h9.4Fab-h9.4scFv-IL-12p70BA
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-h9.4scFv(서열 번호 80), LC-h9.4Fab-IL-12B(서열 번호 104), 및 IL-12A(서열 번호 47)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12B의 융합, 및 링커-l을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 h9.4 scFv의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12B와 IL-12A 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: h9.4Fab-hBC8scFv-IL-12-p70BA
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-h9.4Fab-hBC8scFv(서열 번호 81), LC-h9.4Fab-IL-12B(서열 번호 104), 및 IL-12A(서열 번호 47)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 인간 IL-12B의 융합, 및 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 h9.4 Fab 단편 중쇄에 대한 hBC8 scFv의 융합을 포함한다. 전체 IL-12p70은 IL-12B와 IL-12A 사이의 연합에 의해 형성된다.
단백질명: chMlFab-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-chMlFab(서열 번호 83) 및 LC-chMlFab-scIL-12p70(서열 번호 84)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-1(서열 번호 36)를 사용하는 chMl Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 마우스 IL-12p70의 융합을 포함한다.
단백질명: chMlFab-MlscFv-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-chMlFab-MlscFv(서열 번호 86) 및 LC-chMlFab-scIL-12p70(서열 번호 84)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 chMl Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 마우스 IL-12p70의 융합, 및 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 chMl Fab 단편 중쇄에 대한 Ml scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: chMlFab-IL-15/sushi
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chMlFab(서열 번호 83), LC-chMlFab-IL-15(서열 번호 85), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 chMl Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 인간 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chMlFab-MlscFv-IL-15/sushi
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chMlFab-MlscFv(서열 번호 86) 및 LC-chMlFab-IL-15(서열 번호 85), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 chMl Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 인간 IL-15의 융합, 링커-1(서열 번호 36)을 사용하는 chMl Fab 단편 중쇄에 대한 Ml scFv의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chY169Fab-IL-15/sushi
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chY169Fab(서열 번호 87), LC-chY169Fab-IL-15(서열 번호 88), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36)을 사용하는 키메라 Y169 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chY169Fab-MlscFv-IL-15/sushi
이 단백질은 3개의 서브유닛: HC-chY169Fab-MlscFv(서열 번호 89), LC-chY169Fab-IL-15(서열 번호 88), 및 IL-15Rα-sushi(서열 번호 9)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36) 사용하는 키메라 Y169 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 야생형 IL-15의 융합, 링커-l을 사용하는 chY169 Fab 단편 중쇄에 대한 Ml scFv의 융합, 및 (IL-15와의 상호작용을 통한) IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함한다.
단백질명: chY169Fab-MlscFv-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-chY169Fab-MlscFv(서열 번호 89) 및 LC-chY169Fab-scIL-12p70(서열 번호 90)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36) 사용하는 키메라 Y169 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 마우스 IL-12p70의 융합, 및 링커-l(서열 번호 36) 사용하는 chY169 Fab 단편 중쇄에 대한 Ml scFv의 융합을 포함한다.
단백질명: chY169Fab-scIL-12p70
이 단백질은 2개의 서브유닛: HC-chY169Fab-(서열 번호 87) 및 LC-chY169Fab-scIL-12p70(서열 번호 90)의 공동발현에 의해 제조되었다. 생성된 단백질은 링커-l(서열 번호 36) 사용하는 키메라 Y169 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 대한 단일쇄 마우스 IL-12p70의 융합을 포함한다.
핵산/벡터/세포
본 개시는 또한 본원에 기재된 면역자극 융합 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다. 또한, 본원에는 본원에 기재된 IFM 및 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 IFM 및 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 벡터는 바이러스, 플라스미드, 코스미드, 람다 파아지 또는 효모 인공 염색체(YAC)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 다수의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예컨대, 일 부류의 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(로우스 육종 바이러스, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 활용한다. 또 다른 부류의 벡터는 RNA 바이러스, 예컨대 셈리키 포레스트 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스 및 플라비바이러스로부터 유래되는 RNA 요소를 활용한다.
추가적으로, DNA를 그들의 염색체로 안정하게 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는, 예컨대 영양요구성 숙주에 프로토트로피, 살생물제 내성(예컨대, 항생제), 또는 중금속, 예컨대 구리 등에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 연결되거나 공동형질전환에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다. 추가의 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 요소는 스플라이스 신호 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
구축물을 함유하는 발현 벡터 또는 DNA 서열이 발현을 위해 제조되면, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 형질감염되거나 도입될 수 있다. 이를 달성하기 위한 다양한 기술, 예컨대 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 전기천공, 레트로바이러스 형질도입, 바이러스 형질감염, 유전자 건, 지질 기반 형질감염 또는 다른 통상의 기술이 이용될 수 있다. 원형질체 융합의 경우, 세포는 배지에서 성장되고 적합한 활성에 대해 스크리닝된다.
생성된 형질감염된 세포를 배양하고 생성된 항체 분자를 회수하기 위한 방법 및 조건이 당업자에게 공지되어 있으며, 본 설명에 기초하여 사용되는 특정 발현 벡터 및 포유동물 숙주 세포에 따라 변화되거나 최적화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 본원에 기재된 핵산을 함유하는 숙주 세포 및 벡터를 특징으로 한다. 핵산은 동일한 숙주 세포 또는 별개의 숙주 세포에 존재하는 단일 벡터 또는 별개의 벡터에 존재할 수 있다. 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 원핵생물 세포, 예컨대 이. 콜리(E. coli)일 수 있다. 예컨대, 포유동물 세포는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 예시적 포유동물 세포는 림프구 세포주(예컨대, NSO)를 포함한다. 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), COS 세포, 난모 세포, 및 트랜스제닉 동물로부터의 세포, 예컨대 포유동물 상피 세포를 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 항체 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 항체 분자를 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작된다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 사용하여 유전자 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 이러한 서열과 맞는 유전자의 발현에 영향을 끼칠 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 카세트는 프로모터, 인트론이 있거나 없는 개방 판독 프레임, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 발현을 달성하는 데 필요하거나 도움이 되는 추가의 요소, 예컨대 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 본 개시는 또한 본원에 개시된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 진핵생물 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 인간 세포일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 적합한 진핵생물 세포는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
조성물
면역자극 융합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 양으로 약제학적으로 허용되는 조성물로 제형화될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 활성 성분(예컨대, 나노입자의 생물학적 활성 단백질)의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 염, 완충제, 보존제, 및 임의적으로 다른 치료제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 또한 적합한 보존제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 단위 용량 형태로 존재할 수 있고, 약학 분야에서 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은, 일부 실시양태에서, 수용자 피험체의 혈액과 등장성인 나노입자의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 포함한다. 이 제제는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 적합한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액일 수 있다.
추가의 조성물은 변형된 세포, 예컨대 그들의 세포 표면 상에 하나 이상의 테더링된 융합 단백질을 추가로 포함하는 변형된 세포를 포함한다. 이는 세포 요법, 예컨대 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 농축된 항원 특이적 T 세포 요법, 또는 NK 세포 요법의 생체외 제제에 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 IFM은 이를 필요로 하는 환자에게, 예컨대 나노겔 또는 히드로겔 또는 바이오겔의 형태로, 특정 세포에 고유한 수용체(예컨대, CD4 또는 CD8)의 수용체 매개된 결합을 통해 치료 단백질을 특이적으로 전달하기 위한 제제로서 직접적으로 투여될 수 있다. 이러한 직접적 투여는 전신(예컨대, 비경구, 예컨대 정맥내 주사 또는 주입) 또는 국소적(예컨대, 종양내, 예컨대 종양 미세환경으로 주사)일 수 있다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 통상적으로 주사 또는 주입에 의한 장관 투여(즉, 소화관을 통한 투여) 이외의 투여 및 국소 투여의 모드를 지칭하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피막하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 IFM은 전신 또는 국소 투여를 통해 환자에게 투여 또는 재도입하기 전에 단리된 자기유래의 동종이형 세포의 활성화 및 확장을 유도하기 위한 생체외 제제로서 사용될 수 있다. 예컨대, 확장된 세포는 ACT(입양 세포 전달)을 포함하는 T 세포 요법에 또한, 예컨대 B 세포, 종양 침윤 림프구, NK 세포, 항원 특이적 CD8 T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포 또는 CAR-T 세포, 종양 항원에 특이적인 T-세포 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 및/또는 항원-훈련된 T 세포(예컨대, 관심 항원, 예컨대 종양 연관된 항원(TAA)을 나타내는 항원 제시 세포(APC)에 의해 "훈련된" T 세포)를 포함하는 다른 중요한 면역 세포 유형과 함께 사용될 수 있다.
치료적 이용 및 방법
면역자극 융합 분자 및 이를 함유하는 조성물은, 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료를 포함하는 다수의 치료적 유용성을 갖는다. 본 개시는 특히 암을 갖는 피험체를 치료하기 위해 암을 갖는 피험체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 예시적 방법은 피험체에게 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 면역자극 융합 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 IFM은 시토카인의 세포 표면 이용가능성을 증가시키고 결과적으로 이의 신호전달을 강화시키도록 선택되고 설계된다.
본원에 기재된 방법은 IFM, 예컨대 IFM 또는 본원에 기재된 IFM 또는 이를 포함하는 나노입자를, 예컨대 본원에 기재된 약제학적 조성물을 사용함으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함한다. 또한, 대상체에서 암의 증상을 감소 또는 개선시키는 방법, 및 암의 성장을 억제시키/시키거나 하나 이상의 암 세포를 사멸시키는 방법이 제공된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 것 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물로 투여된 대상체에서 종양의 크기를 감소시키고/시키거나 암 세포의 수를 감소시킨다.
실시양태에서, 암은 혈액 암이다. 실시양태에서, 혈액 암은 백혈병 또는 림프종이다. 본원에 사용된 "혈액 암"은 조혈 또는 림프 조직의 종양, 예컨대 혈액, 골수, 또는 림프절에 영향을 끼치는 종양을 지칭한다. 예시적인 혈액 악성은 백혈병(예컨대, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 털 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병(AMoL), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병(JMML), 또는 큰 과립 림프구성 백혈병), 림프종(예컨대, AIDS-관련된 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종(예컨대, 전형적 호지킨 림프종 또는 결절 림프구-우세 호지킨 림프종), 균상식육종, 비호지킨 림프종(예컨대, B-세포 비호지킨 림프종(예컨대, 버킷 림프종, 작은 림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 큰 B-세포 림프종, 소포 림프종, 면역모세포성 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 또는 맨틀 세포 림프종) 또는 T-세포 비호지킨 림프종(균상식육종, 역형성 큰 세포 림프종, 또는 전구체 T-림프모구성 림프종), 원발성 중추신경계 림프종, 세자리 증후군, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 만성 골수증식성 신생물, 랑게르한스 세포 조직구증, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 골수형성이상 증후군, 또는 골수형성이상/골수증식성 신생물을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
실시양태에서, 암은 고형 암이다. 예시적인 고형 암은 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 영역의 암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 카포시 육종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 표피모양 암, 경부 편평 세포암의 암종, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 질의 암종, 연조직의 육종, 요도의 암, 음부의 암종, 음경의 암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 골반의 암종, 척수축 종양, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 상기 암의 전이성 병변, 또는 이의 조합을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
실시양태에서, 면역자극 융합 분자 (또는 약제학적 조성물)은 치료되거나 예방될 질환에 적합한 방식으로 투여된다. 투여 양 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이다. 적합한 용량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, "유효량" 또는 "치료량"이 지시되는 경우, 투여될 약제학적 조성물 (또는 면역자극 융합 분자)의 정확한 양은 피험체의 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 나이, 체중, 및 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 104 내지 109개 세포/kg 체중, 예컨대 105 내지 106개 세포/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있으며, 이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 이들 용량에서 다수회 투여될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 면역요법에 기재된 주입 기술을 이용하여 투여될 수 있다(예컨대, 문헌(Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988) 참조).
실시양태에서, 면역자극 융합 분자 또는 약제학적 조성물은 피험체에게 비경구로 투여된다. 실시양태에서, 세포는 피험체에게 정맥내, 피하, 종양내, 결절내, 근육내, 피내, 또는 복강내 투여된다. 실시양태에서, 세포는 종양 또는 림프절로 직접적으로 투여, 예컨대 주사된다. 실시양태에서, 세포는 (예컨대, 문헌(Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)에 기재되어 있는 바와 같이) 주입으로 또는 정맥내 푸시로 투여된다. 실시양태에서, 세포는 주사가능한 데포 제형으로 투여된다.
실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 실시양태에서, 피험체는 인간, 원숭이, 돼지, 개, 고양이, 소, 양, 염소, 토끼, 래트, 또는 마우스이다. 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 실시양태에서, 피험체는 소아 피험체, 예컨대 18세 미만, 예컨대 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1세 미만이다. 실시양태에서, 피험체는 성인, 예컨대 적어도 18세, 예컨대 적어도 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 또는 80-90세이다.
조합 요법
본원에 개시된 면역자극 융합 분자는 제2 치료제 또는 처치와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 방사선요법과 조합하여 투여된다.
일부 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 세포 요법, 예컨대 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택되는 세포 요법과 함께 투여된다.
실시양태에서, 면역자극 융합 분자 및 제2 치료제 또는 처치는 피험체가 암으로 진단된 후, 예컨대 암이 피험체로부터 제거되기 전에 투여/수행된다. 실시양태에서, 면역자극 융합 분자 및 제2 치료제 또는 처치는 동시에 또는 공동으로 투여/수행된다. 예컨대, 하나의 치료제의 전달이 제2 치료제의 전달이 시작될 때에도 여전히 발생하여, 예컨대 치료제 투여에 있어 중복이 있다. 다른 실시양태에서, 면역자극 융합 분자 및 제2 치료제 또는 처치는 순차적으로 투여/수행되어, 예컨대 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 끝난다.
실시양태에서, 조합 요법은 단독 제제로의 단독요법보다 효과적인 치료를 이끌 수 있다. 실시양태에서, 제1 및 제2 치료제의 조합은 제1 또는 제2 치료제 단독보다 효과적이다(예컨대, 증상 및/또는 암 세포의 더 큰 감소를 이끈다). 실시양태에서, 조합 요법은 단독요법으로 투여될 때 유사한 효과를 달성하기 위해 일반적으로 필요한 제1 또는 제2 치료제의 용량과 비교하여 더 낮은 용량의 제1 또는 제2 치료제의 사용을 허용한다. 실시양태에서, 조합 요법은 부분적으로 부가적인 효과, 완전히 부가적인 효과, 또는 부가적인 효과보다 더 큰 효과를 갖는다.
일 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 요법, 예컨대 암 요법(예컨대, 하나 이상의 항암제, 면역요법, 광역학 요법(PDT), 수술 및/또는 방사선)과 조합하여 투여된다. 면역자극 융합 분자 및 요법, 예컨대 암 요법의 투여는 (중복이 있거나 없이) 순차적 또는 동시적일 수 있다. 면역자극 융합 분자의 투여는 요법(예컨대, 암 요법)의 과정 동안 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 본원에 기재된 특정 요법은 암 및 비암성 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다. 예컨대, PDT 효능은 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 암 및 비암성 병태(예컨대, 결핵)에서 증진될 수 있다(예컨대, 문헌(Agostinis, P. et al. (2011) CA 암 J. Clin. 61:250-281) 검토).
항암 요법
다른 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 저분자량 또는 소분자량 화학치료제와 조합하여 투여된다. 예시적인 저분자량 또는 소분자량 화학치료제는 13-시스-레티노산(이소트레티노인, ACCUTANE®), 2-CdA(2-클로로데옥시아데노신, 클라드리빈, LEUSTATINTM), 5-아자시티딘(아자시티딘, VIDAZA®), 5-플루오로우라실(5-FU, 플루오로우라실, ADRUCIL®), 6-머캅토퓨린(6-MP, 머캅토퓨린, PURINETHOL®), 6-TG(6-티오구아닌, 티오구아닌, THIOGUANINE TABLOID®), 아브락산(파클리탁셀 단백질-결합됨), 악티노마이신-D(닥티노마이신, COSMEGEN®), 알리트레티노인(PANRETIN®), 모두-트랜스레티노산(ATRA, 트레티노인, VESANOID®), 알트레타민(헥사메틸멜라민, HMM, HEXALEN®), 아메토프테린(메토트렉세이트, 메토트렉세이트 나트륨, MTX, TREXALLTM, RHEUMATREX®), 아미포스틴(ETHYOL®), 아라비노실시토신(Ara-C, 시타라빈, CYTOSAR-U®), 아르세닉 트리옥사이드(TRISENOX®), 아스파라기나제(어위니아 L-아스파라기나제, L-아스파라기나제, ELSPAR®, KIDROLASE®), BCNU(카르무스틴, BiCNU®), 벤다무스틴(TREANDA®), 벡사로텐(TARGRETIN®), 블레오마이신(BLENOXANE®), 부술판(BUSULFEX®, MYLERAN®), 칼슘 류코보린(시트로보룸 인자, 폴린산, 류코보린), 캄프토테신-11(CPT-11, 이리노테칸, CAMPTOSAR®), 카페시타빈(XELODA®), 카르보플라틴(PARAPLATIN®), 카르무스틴 웨이퍼(카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20, GLIADEL® 웨이퍼), CCI-779(템시롤리무스, TORISEL®), CCNU(로무스틴, CeeNU), CDDP(시스플라틴, PLATINOL®, PLATINOL-AQ®), 클로람부실(류케란), 시클로포스파미드(CYTOXAN®, NEOSAR®), 다카르바진(DIC, DTIC, 이미다졸 카르복사미드, DTIC-DOME®), 다우노마이신(다우노루비신, 다우노루비신 히드로클로라이드, 루비도마이신 히드로클로라이드, CERUBIDINE®), 데시타빈(DACOGEN®), 덱스라족산(ZINECARD®), DHAD(미톡산트론, NOVANTRONE®), 도세탁셀(TAXOTERE®), 독소루비신(ADRIAMYCIN®, RUBEX®), 에피루비신(ELLENCETM), 에스트라무스틴(EMCYT®), 에토포시드(VP-16, 에토포시드 포스페이트, TOPOSAR®, VEPESID®, ETOPOPHOS®), 플록수리딘(FUDR®), 플루다라빈(FLUDARA®), 플루오로우라실(크림)(CARACTM, EFUDEX®, FLUOROPLEX®), 겜시타빈(GEMZAR®), 히드록시우레아(HYDREA®, DROXIATM, MYLOCELTM), 이다루비신(IDAMYCIN®), 이포스파미드(IFEX®), 익사베필론(IXEMPRATM), LCR(류로크리스틴, 빈크리스틴, VCR, ONCOVIN®, VINCASAR PFS®), L-PAM(L-사르콜리신, 멜팔란, 페닐알라닌 머스타드, ALKERAN®), 메클로르에타민(메클로르에타민 히드로클로라이드, 무스틴, 질소 머스타드, MUSTARGEN®), 메스나(MESNEXTM), 미토마이신(미토마이신-C, MTC, MUTAMYCIN®), 넬라라빈(ARRANON®), 옥살리플라틴(ELOXATINTM), 파클리탁셀(TAXOL®, ONXALTM), 페가스파르가제(PEG-L-아스파라기나제, ONCOSPAR®), PEMETREXED(ALIMTA®), 펜토스타틴(NIPENT®), 프로카르바진(MATULANE®), 스트렙토조신(ZANOSAR®), 테모졸로미드(TEMODAR®), 테니포시드(VM-26, VUMON®), TESPA(티오포스포아미드, 티오테파, TSPA, THIOPLEX®), 토포테칸(HYCAMTIN®), 빈블라스틴(빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴, VLB, ALKABAN-AQ®, VELBAN®), 비노렐빈(비노렐빈 타르트레이트, NAVELBINE®), 및 보리노스타트(ZOLINZA®)을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 면역자극 융합 분자는 생물제제와 함께 투여된다. 예시적 생물제제는, 예컨대 HERCEPTIN®(트라스투주맙); FASLODEX®(풀베스트란트); ARIMIDEX®(아나스트로졸); Aromasin®(엑세메스탄); FEMARA®(레트로졸); NOLVADEX®(타목시펜), AVASTIN®(베바시주맙); 및 ZEVALIN®(이브리투모맙 티욱세탄)을 포함한다.
실시예
실시예 1. 증가된 생물학적 지속성을 갖는 항체/IL-15 융합 분자의 구축
개선된 특성을 갖는 IFM을 생성하는 능력을 입증하기 위해, 우리는 다수의 포맷: (i) IgG, Fab 단편, 또는 scFv 단편을 포함하는 IFM, (ii) 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 대한 융합; (iii) 항체 또는 항체 단편에 대한 IL-15 또는 IL-15Rα 스시 도메인의 융합(예컨대, 도 1 및 도 2a-2c); 및 (iv) 항체와 시토카인 사이에 다양한 링커 조성을 포함하는 IFM을 포함하는 IFM 시리즈를 구축하였다.
A. 다수의 상이한 항체 포맷을 포함하는 IL-15 IFM
IL-15 생물학적 활성을 개선하기 위한 IL-15와 면역-표적된 항체의 융합 분자의 잠재력을 조사하기 위해, 우리는 IL-15 및 면역 세포 표면 상의 풍부한 수용체인 인간 CD45를 표적하는 mAb 클론 BC8을 포함하는 IFM을 구축하였다(Cyster et al., EMBO Journal, Vol 10, no4, 893-902, 1991). IFM은 3개의 상이한 항체 포맷: scFv, Fab, 및 전장 IgG으로 구성되었다. 간략히, 야생형 IL-15를 (GGGGS)3(서열 번호 36)으로 이루어진 아미노산 링커를 사용하여 Fab 또는 IgG 경쇄의 C-말단에 또는 아미노산 링커 RSGSGGGGSLQ(서열 번호 39)를 사용하여 scFv의 C-말단에 유전자조작으로 융합하였다. Fab 및 IgG 항체 포맷은 마우스 단일클론 항체 BC8(예컨대, chBC8 Fab 또는 chBC8 IgG)의 인간 불변 영역 및 가변 도메인을 포함하였다. scFv는 (GGGGS)3 링커로 유전자조작으로 융합된 BC8 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하였다. IL-15/항체 융합물은 IL-15Rα-sushi와 공동발현되었으며; IL-15와 스시 사이의 고친화성 상호작용은 IL-15Rα-sushi와의 비공유적 연합을 포함하는 IL-15 항체 복합체를 초래하였다. 또한, 이는 3개의 IFM 변이체: chBC8-IL15/sushi scFv, chBC8-IL15/sushi Fab, 및 chBC8-IL15/sushi IgG를 초래하였다(도 2a; 보다 자세한 사항은 단백질 변이체 섹션 참조).
CD8 T 세포 확장에 대한 IFM의 효과는 시토카인이 고정된 시간 동안 세포와 인큐베이션된 후 세척에 의해 결합되지 않은 시토카인이 제거되는 펄스 생물검정을 이용하여 평가되었다. 시토카인이 세척되지 않는 "정적" 자극 검정과 비교하여, 펄스 생물검정은 생물학적 효과의 지속성에 대한 더 나은 특징규명을 제공한다. 이는 또한 리간드-고갈과 연관된 혼란 요소를 수용하며, 이는 고친화성 수용체/리간드 상호작용의 정량 분석을 위한 잘 알려진 도전 과제이다(Hulme, Tevethick, Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation Br J Pharm 2010, 161:1219-1237). 동일한 원리가 세포 수용체에 대한 결합에 의해 시토카인 및 성장인자의 효과를 매개하는 시토카인 및 성장인자의 정량적 세포-기반 검정에 적용된다. 우리는 IMF 효과를 인간 IgGl-Fc 도메인에 융합된 보존적 L77I 돌연변이를 함유하는 스시 도메인을 포함하고, N72D 돌연변이를 함유하는 IL-15 변이체와 (스시 도메인과의 상호작용을 통해) 비공유적으로 연합된 IL15/sushi-Fc 단백질: IL15N72D/sushiL77I-Fc와 비교하였다. N72D 돌연변이는 IL-15의 효능적 특성을 개선하기 위한 것으로 알려져 있다(Zhu, Marcus, Xu, Lee, et al. Novel Human Interleukin-15 Agonists. Journal of Immunology 2009). 음성 대조군으로서, 우리는 또한 (IL-15에 대한 융합이 없는) chBC8 단독을 평가하였다. IFM 및 대조군을 37℃에서 1 hr 동안 CD8 T 세포와 인큐베이션한 후, 3회 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 이어서, 세포를 전체 배지에 플레이팅하고, 3일 동안 성장시킨 후, 셀타이터 블루(도 2b) 및 유동 세포측정 카운팅 비드(도 2c) 둘 다를 사용하여 증식을 평가하였다. 이들 방법 둘 다는 일관된 결과를 산출하였으며, 3개의 항체 포맷 모두가 IL-15N72D/sushiL77I-Fc 단백질보다 큰 지속성을 생성할 수 있다는 입증하였다. scFv, Fab, 또는 IgG를 함유하는 IFM의 효능이 증가하는 경향이 있었다(즉, 효능: IgG IFM > Fab IFM > scFv IFM). chBC8 항체 단독의 음성 대조군은 T 세포 확장을 유도하지 않았으며, 이는 IL-15의 존재가 IFM의 증식 효과에 필요하다는 것을 나타낸다. 전술한 것은 IL-15의 생물학적 지속성을 개선하는 항-CD45 항체 또는 항체 단편에 대한 IL-15의 융합의 비제한적 예를 제공한다. 예컨대, 본원에 기재된 다수의 항체 포맷은 개선된 효능을 갖는 이러한 IFM을 생성할 수 있다.
B. 항-CD45에 대한 IL-15의 다양한 융합 전략을 포함하는 IFM
IFM의 시토카인과 항체 사이의 대안적 융합 전략을 조사하기 위해, 우리는 키메라 BC8 Fab 또는 IgG 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 IL-15의 융합물을 포함하는 6개의 추가의 IFM을 구축하였다. 첫 번째의 2개의 IFM은 chBC8 Fab 또는 chBC8 IgG 경쇄의 N-말단에 IL-15을 유전자조작으로 융합시켜 구축하였으며; 항체 융합물을 IL-15Rα와 공동발현시켜 IFM: IL15-chBC8/sushi Fab 및 IL15-chBC8/sushi IgG을 생성하였다(도 3a-3b; 보다 자세한 사항은 "단백질 변이체" 섹션을 참조). 우리는 각각 항체 C- 또는 N-말단에 대한 IL-15의 융합을 지칭하기 위해 실시예 1A에서의 chBC8-IL15 및 여기 IL-15-chBC8의 명명 규칙을 사용한다. chBC8 Fab 또는 IgG 경쇄의 N- 또는 C-말단에 야생형 IL-15Rα-sushi를 융합시키고 이들 항체 융합물을 IL-15N72D와 공동발현시킴으로써 4개의 추가적인 IFM을 구축하였다(도 3c-3d: chBC8-sushi/IL15N72D Fab, sushi-chBC8 /IL15N72D Fab, chBC8-sushi/IL15N72D IgG, sushi-chBC8 /IL15N72D IgG)(보다 자세한 사항은 단백질 변이체 섹션을 참조). 실시예 1A에서의 2개의 Fab 및 IgG IFM과 함께(chBC8-IL15/sushi Fab 및 chBC8-IL15/sushi IgG), 이들 8개의 IFM은 우리가 다양한 항체 융합 전략, IL-15의 유전자융합 대 면역-표적화 모이어티에 대한 스시의 유전자 융합, 및 야생형 또는 돌연변이된 IL-15 변이체를 포함하는 IFM을 시험할 수 있게 하였다.
제1 실험에서, 우리는 IL-15N72D를 포함하는 IFM을 펄스 생물검정 포맷으로 평가하고, Fab 및 IgG 융합 뿐만 아니라 N- 및 C-말단 융합 모두에 대해 IFM이 IL-15N72D와 sushi-Fc 변이체 사이에 복합체를 포함하는 IL-15 포맷과 비교하여 개선된 활성을 나타내었다는 것을 발견하였다(도 4a-4b). 모든 8개의 IFM 변이체를 비교하는 추가의 실험에서, 우리는 항체에 대한 IL-15 또는 스시 융합에 대해 유사한 효능을 관찰하였으며, 또한 야생형 IL-15 및 IL15-N72D를 함유하는 단백질 변이체에 대해서도 유사한 효능을 관찰하였다(도 5a-5b). 우리는 chBC8 IgG 또는 Fab의 C-말단에 대한 IL-15 또는 스시의 융합으로 항체 N-말단에 대한 융합보다 큰 CD8 T 세포 확장이 초래되는 경향을 관찰하였다(도 4a-4b 및 도 5a-5b). 그러나, (IgG 또는 Fab에 대한 N-말단 융합을 포함하는) IFM 변이체 각각은 CD45 수용체 결합 기능성을 함유하지 않는 대조군 단백질인 IL15-N72D/sushiL77I-Fc보다 큰 효능을 나타내었다(도 3c-3d 및 도 4a-4b). 대조군으로서, 키메라 BC8 또는 모 BC8 마우스 mAb 항체 단독은 상기한 우리의 관찰과 일치하게 T 세포 확장을 유도하지 않았다(도 4a-4b 및 도 5a-5b). 우리는 또한 CD8 T 세포 증식에 대해 "정적" 검정 포맷으로 8개의 IFM을 평가하였다. (세척 없이) 3일의 인큐베이션 후, 각각의 IFM은, 이 검정 포맷에서 약간 약한 효능을 초래한 Fab 단편에 대한 IL-15의 N-말단 융합을 포함하는 IFM(IL15-chBC8/sushi Fab)을 제외하고는, IL15N72D/sushiL77I-Fc와 유사한 활성을 초래하였다(도 5c-5d). IgG 융합은 IL-15 Fab 융합과 유사한 효능을 나타내었다(도 3b). 우리는 CD45 수용체를 표적하는 항체에 대한 IL-15/sushi 복합체의 다수의 융합 전략이 증가된 생물학적 지속성을 갖는 IFM을 초래하고, IFM 융합 전략이 IL-15의 야생형 및 돌연변이 형태 둘 다의 활성을 개선시킨다고 추단한다.
C. 항체 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 IL-15를 포함하는 IFM
우리는 항체 중쇄 또는 경쇄 C-말단에 시토카인을 융합시키는 능력을 평가하기 위해 추가의 chBC8-시토카인 융합물을 구축하였다. 야생형 IL-15를 chBC8 중쇄(HC)의 C-말단에 유전자조작으로 융합시키고, 이 구축물을 IL15Rα-sushi와 공동발현시켜 IFM 변이체 chBC8(HC)-IL15/sushi IgG를 수득하였다(도 6a). 우리는 chBC8(HC)-IL15/sushi IgG를 경쇄 C-말단에 융합된 IL-15을 포함하는 이전 실시예에서 기재된 chBC8-IL15/sushi IgG와 비교하였으며; 명확성을 위해, 우리는 이 후자 단백질을 중쇄 C-말단에 대한 융합을 포함하는 IFM과 구별하기 위해 chBC8(LC)-IL15/sushi IgG로 지칭한다. 활성화된 인간 CD8 T 세포를 37℃에서 1 hr 동안 400 nM 내지 25.6 pM의 chBC8(HC)-IL15/sushi IgG 또는 chBC8-IL15(LC)/sushi IgG에 걸쳐 7개의 연속 5배 희석물로 펄싱한 후, 전체 배지로 3회 세척하고, 500,000개 세포/mL로 플레이팅하였다. 배지만의 연속 희석물, (IL-15와의 융합을 함유하지 않는) 모 BC8 항체, 또는 (면역-표적화 기능이 결핍된) IL-15WT/sushi-Fc를 대조군으로 사용하였다. 배양 5일 후, 우리는 셀타이터 블루를 사용하여 CD8 T 세포 확장을 측정하였다. chBC8(HC)-IL15/sushi IgG 및 chBC8-IL15(LC)/sushi IgG IFM은 각각 T 세포 확장을 유도하고 유사한 용량-반응 특징을 나타내었으나, IL15WT/sushi-Fc 또는 모 BC8 항체는 그렇지 않았다(도 6b). 우리는 항체 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 대한 IL-15의 융합이 각각 증가된 지속성을 갖는 IFM을 생성할 수 있다고 추단한다.
D. 기능적 항체 결합이 IFM의 개선된 효능에 필요함
우리는 상기에서 (예컨대, IL-15와의 융합을 포함하지 않는 BC8 항체를 사용하는) CD45에 대한 결합 단독은 IFM의 증가된 활성을 설명하지 못한다는 것을 입증하였다(도 3c-3d, 도 4a-4b, 및 도 5a-5d). 이는 IFM의 효능에 대한 시토카인의 요건을 지지한다. 우리는 이의 동족 세포 표면 수용체에 대한 항체 결합의 기능적 요건을 입증하기 2개의 추가적 제어를 수행하였다. 제1 실험에서, 우리는 CD45 세포 표면 수용체에 대한 가용성 경쟁자로서 1 μM BC8의 존재 또는 부재 하에서 실시예 1A에 기재된 8개의 IFM 각각에 대해 활성화된 일차 인간 CD8 T 세포에 대한 펄스 검정을 수행하였다. 37℃에서 1 hr 펄스 인큐베이션 후, 세포를 3회 세척한 후, 300,000개 세포/mL의 밀도로 전체 RPMI 배지에 플레이팅하였다. 37℃에서 5일 후, 세포 확장을 셀타이터 블루를 사용하여 측정하였으며; BC8 경쟁자의 존재는 펄스 생물검정에서 8개의 IFM 모두의 활성을 제거하였다(도 7a-7b).
제2 실험에서, 우리는 기능적 또는 비기능적 BC8 결합 영역을 포함하는 2개의 IFM을 생성하였다. 기능적 BC8 영역을 갖는 IFM은 모 BC8 항체로부터의 CDR이 인간 가변 도메인으로 이식된 인간화된 BC8 가변 도메인을 갖는 Fab 항체 단편 및 인간화된 BC8 Fab 경쇄에 대한 IL-15WT의 융합을 포함하였다. 이 복합체는 IL-15Rα-sushi와 공동발현되어 IFM 변이체 hBC8(23)-IL15/sushi Fab를 초래하였다(보다 자세한 사항은 "단백질 변이체" 섹션 참조). 인간화된 BC8 항체(hBC8(23))는 키메라 BC8 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다(도 10a). 비기능적 BC8 영역을 갖는 IFM(hBC8-null-IL15/sushi Fab)은 잔기 SGGGS로 대체된 항체 중쇄의 CDR3의 5개의 아미노산을 제외하고는 동일한 Fab 단편을 포함하였다. 이들 아미노산 치환은 시험된 농도에 대해 세포 CD45에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 인간화된 BC8 항체를 초래하였다(도 10a). 이들 단백질 각각을 활성화된 인간 CD8 T 세포(400 nM 내지 25.6 pM의 농도 범위에 걸친 7개의 연속 5배 희석물)로 펄싱한 후, 세포를 세척하고, 96-웰 플레이트에 500,000개 세포/mL로 플레이팅하였다. 37℃에서 3일 후, hBC8(23)-IL15/sushi Fab는 CD8 T 세포 확장을 지지하였으나, hBC8-null-IL15/sushi Fab는 그렇지 않았다(도 7c). 종합하면, 이들 데이터는 기능적 세포 표면 수용체 결합이 IFM의 개선된 효능에 필요하다는 것을 입증한다.
E. 항-CD45에 대한 융합은 IL-15의 로딩 및 세포 표면 지속성을 증가시킴
IFM의 개선된 생물학적 지속성이 IL-15의 세포 상의로의 증가된 로딩 및 지속성과 서로 관련이 있는지의 여부를 조사하기 위해, 우리는 시간에 따른 세포 표면 IFM을 분석하였다. 5 x 107개 포/mL 밀도의 CD8 T 세포를 PBS와 HBSS의 1:1 혼합물 중에서 1 hr 동안 0.75 mg/mL hBC8(23)-IL15/sushi Fab, IL-15/sushi-Fc2Da, 또는 IL-15N72D/sushiL77I-Fc로 펄싱한 후, 전체 배지로 3회 세척하였다. Sushi-Fc2Da는 인간 IgG2-Fc 도메인의 변이체에 대한 야생형 IL-15Rα-sushi의 융합물이다. 세포를 PBS와 HBSS의 1:1 혼합물 중에서 인큐베이션한 모의 펄스 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 세포를 형광 표지된 항-IL-15 항체를 사용하여 IL-15에 대해 또는 인간 IgG 경쇄 및 중쇄를 인식하는 형광 표지된 다중클론 항체를 사용하여 IgG 도메인(Fab 또는 Fc 단편)에 대해 염색하였다. 이들 항체는 T 세포 표면 상의 IL-15 또는 연관된 Fab 또는 Fc 단편 둘 다의 검출을 제공하였다. hBC8(23)-IL15/sushi Fab 단백질은 IL15/sushi-Fc2Da 또는 IL15-N72D/sushiL77I-Fc 단백질보다 실질적으로 더 높은 수준의 IL-15 염색을 산출하였으며, 이는 세포 표면 상에서 더 많이 풍부한 IL-15를 나타낸다(도 8a). 우리는 IFM이 IL15/sushi-Fc 구축물보다 높은 수준의 염샘을 초래하는 IgG 염색에 대한 일관된 결과를 관찰하였다(도 8a). IL-15의 증식 효과에 대한 양성 대조군으로서, 우리는 약 10 nM의 IL15/sushi-Fc2Da를 모의 펄스 대조군에 첨가하였으며("모의 및 포화(mock then saturating)" 조건); 이는 IL-15/sushi-함유 변이체(도 3a-3d 참조)에 대한 EC90을 초과하는 농도에 해당하며, 따라서 IL-15에 의한 최대 증식 효과에 대한 양성 대조군으로 작용한다. 세포를 배양물에서 증식시키고, 펄스 인큐베이션 후 3일 동안 IL-15 표면 수준에 대해 모니터링하였다. IL-15 검출은 hBC8(23)-IL15/sushi Fab에 대해서는 배경을 초과하는 반면, L15/sushi-Fc 변이체 둘 다는 펄스 인큐베이션 후 1일에 배경과 구별될 수 없었다(도 8b). 또한, hBC8(23)-IL15/sushi Fab의 펄스는 IL15/sushi-Fc 변이체의 포화량과 유사한 세포 확장을 초래하였다(도 8c).
우리는 우리가 사용한 IL-15 항체(클론 번호 34559, R&D Systems)가 IL-15Rβ와 적어도 부분적으로 겹치는 IL-15 상의 에피토프에 결합할 가능성이 있으므로 IL-15 신호전달 수용체와 이미 생산적으로 관여되지 않은 IL-15를 검출할 수 있다고 생각한다. 이 항체는 몇몇 그룹에 의해 차단/중화 항체로 기재되었다(예컨대, 문헌(Neely, GG, Robbins, Amankwah, et al. (2001) J Imm 167:5011-5017; Krutzik, Hewison, Liu, Robles, et al (2008) J Imm 181:7115-7120; Schlaepfer, Speck (2008) PLoS ONE 3:e1999; Correia, Cardoso, Pereira, Neves, et al.,J Imm (2009) 182: 6149-6159) 참조). 그러나, IL-15Rα와의 경쟁적 IL-15 결합을 통해 이의 중화 효과를 매개하는 것으로 보이지는 않는다; IL-15는 IL-15Rα와의 상호작용을 통해 수지상 세포 표면 상에 제시되며, 이 항체는 이전에 수지상 세포 상의 IL-15의 이러한 제시를 검출하는 데 사용되었다(Ferlazzo, Pack, Thomas, Paludan, et al PNAS 2004). 이들 관찰과 일치하게, 우리는 이 항체를 사용하여 T 세포 표면 상의 hBC8(23)-IL15/sushi Fab 및 IL15/sushi-Fc 변이체를 검출할 수 있다(도 8a-8b; 각각의 단백질 변이체는 IL-15Rα-sushi와 IL-15 사이의 연합을 포함한다). 따라서, 항체의 중화 활성은 IL-15의 다른 2개의 세포 표면 수용체 중 하나, IL-2/IL-15Rβ 또는 공통 γ 쇄와의 경쟁적 결합으로부터 유래할 수 있다. 이와 같이, 이 항체를 사용한 IL-15의 검출은 이의 세포 표면 수용체, 예컨대 IL-2/IL-15Rβ 또는 공통 γ 쇄를 포화시키는 수준을 초과하여 T 세포 표면으로의 IL-15의 과다한 로딩을 반영할 수 있다. 이는 또한 sushi-Fc 융합물과의 연합으로부터 생기는 이량체 IL-15가 약간 풍부한 시토카인을 초래할 수는 있지만, IL-15 수용체를 통해서만 T 세포와 상호작용하는 IL-15/sushi-Fc 구축물에 대해 검출된 세포 표면 IL-15의 낮은 수준을 설명할 수 있다(도 8a-8b). 전반적으로, 우리는 IFM 둘 다가 T 세포 표면 상의 IL-15의 보다 큰 초기 로딩을 촉진하고 시간에 따라 세포 표면 상의 생물학적으로 이용가능한 IL-15의 증가된 수준을 지지한다고 추단한다.
F. 다수의 링커 조성은 증진된 IFM 효능을 지지함
IFM의 IL-15와 항체 사이의 연결에 대한 유연성을 평가하기 위해, 우리는 다수의 상이한 폴리펩티드 링커 조성을 조사하였다. 실시예 1에서 조사된 IFM은 각각 IL-15 또는 스시와 항체 사이에 (GGGGS)3의 3개의 직열 반복물(링커-1, 서열번호 36)로 이루어진 유연한 15개 아미노산 링커를 포함하였다. 여기서, 우리는 유연한 8개 아미노산 링커((GGGS)2; 링커-2, 서열 번호 37) 및 인간 IgG1 힌지 영역으로부터 유래되는 적당히 유연한 12개 아미노산 링커(DKTHTSPPSPAP; 링커-3, 서열 번호 38, 밑줄친 위치는 이 링커를 위해 시스테인으로부터 세린으로 돌연변이된 IgG1 힌지 영역의 잔기를 나타냄)를 포함하는 2개의 추가의 링커 조성을 조사하였다. IL-15WT를 링커-2 또는 링커-3을 사용하여 chBC8 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 융합시키고, IL-15Rα-sushi와 공동발현시켜 각각 chBC8-L2-IL15/sushi Fab 및 chBC8-L3-IL15/sushi Fab를 생성하였다(도 9a). 우리는 이전에 실시예 1에서 chBC8-IL15/sushi Fab를 기재하였으며; 이 IFM 변이체는 IL-15와 chBC8 경쇄 사이에 (GGGGS)3 링커(링커-1, 서열 번호 36)를 포함하고; 일관성을 위해, 우리는 이 구축물을 여기서 chBC8-L1-IL15/sushi Fab로 지칭한다(도 9a). 이들 단백질 구축물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD8 T 세포를 사용하여 펄스 생물검정으로 평가하였다. 배지만 또는 CD45에 대한 친화성을 제거하기 위해 돌연변이된 BC8 결합 도메인을 포함하는 hBC8-null-IL15/sushi Fab를 포함하는 모의 연속 희석물과의 인큐베이션을 음성 대조군으로 사용하였다(도 10a). 펄스 인큐베이션 후 3일에 우리는 셀타이터 블루를 사용하여 세포 증식을 분석하고, 3개의 링커 조성 모두가 T 세포 확장을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다(도 9b). 우리는 시토카인과 항체 사이의 다수의 링커 조성이 개선된 효능을 갖는 IFM을 생성할 수 있다고 추단한다.
방법
단백질 발현. 단백질을 무혈청 배지에서 현탁액 적응된 HEK 293 세포로부터 생성하였다. 아메리칸 타입 셀 컬쳐(ATCC, 카달로그 번호 HB-10507)로부터 수득된 BC8 하이브리도마 배양물로부터 정제된 모 마우스 단일클론 항체 BC8는 예외였다. 이어서, 단백질을 적절히 단백질 A 수지(Fc 융합물 및 전장(IgG) 항체에 대해), KappaSelect 수지(GE Healthcare; 항체 Fab 단편에 대한 융합물에 대해), 또는 히스티딘 친화성 수지(예컨대, 니켈-니트릴로트리아세트산, Ni-NTA; 6-His-태깅된 scFv 융합물에 대해)에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 인산염 완충된 식염수(PBS)로 버퍼 교환하였다. 대략적 분자량을 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 확인하고, 응집 및 다량체 상태를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하였다. 응집 또는 다량체 상태에 기초하여, 단백질을 임의적으로 AKTA 퓨어 크로마토그래피 시스템(GE Life Sciences) 상의 하이로드 슈퍼덱스 200 프렙-그레이드(HiLoad Superdex 200 prep-grade) 컬럼(GE Life Sciences)을 사용하여 SEC에 의해 정제하였다.
정적 생물검정. 인간 혈액으로부터 단리된 CD8 T-세포(Biospecialty Corp.)를 제조자의 지침에 따라 10 ng/mL 인간 IL-2(카달로그 번호 202-IL-050/CF, R&D Systems)의 존재 하에서 제조자의 지침에 따라 CD3/CD28 비드(Dynabead 카달로그 번호 11132D, ThermoFisher Scientific, Inc.)로 활성화시키고, 10% 열 불활성화된 소태아혈청(FBS-HI, ThermoFisher Scientific, Inc.), 페니실린/스트렙토마이신, 및 1% 글루타막스(Glutamax)(카달로그 번호 35050-061, ThermoFisher Scientific, Inc.)로 보충된 RPMI 1640(카달로그 번호 30-2001, American Type Cell Culture)을 함유하는 전체 RPMI 배지에서 6 웰 9.5 cm2 플레이트에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% O2에서 배양하였다. 자극 3일 후, CD3/CD28 비드를 제거하고, 세포를 24시간 동안 전체 RPMI 배지에 두었다. 이어서, T-세포를 달리 지시되지 않는 한 20 nM 내지 4.9 pM의 농도 범위에 걸친 IFM 또는 대조군 단백질의 6개의 연속 4배 희석물의 존재 하에 또는 음성 대조군으로 단지 배지와 함께 0.5x106개 세포/mL로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3일 후, 세포 확장을 셀타이터-블루(카달로그 번호 G8081, Promega)를 통해 분석하였다.
펄스 생물검정. 인간 CD8 T-세포(Biospecialty Corp.)를 정적 생물검정에 대해 기재된 바와 같이 10 ng/mL IL-2의 존재 하에 CD3/CD28 비드(Dynabead, ThermoFisher Scientific, Inc.)로 자극하였다. 자극 3일 후, CD3/CD28 비드를 제거하고, 세포를 24시간 동안 전체 RPMI 배지에 두었다. 달리 지시되지 않는 한, 활성화된 T-세포를 500,000개 세포/mL의 세포 밀도로 80 nM 내지 5 nM 농도 범위의 IFM 또는 대조군 단백질(3개의 연속 4배 희석물)과 함께 또는 음성 대조군으로 단지 배지(0 nM)과 함께 인큐베이션하였다. 37℃ 및 5% O2에서 1시간 후, 세포를 전체 RPMI 배지로 3회 세척하여 결합되지 않은 시토카인을 제거한 후, 달리 지시되지 않는 한 96-웰 플레이트에서 0.5x106개 세포/mL로 (추가의 시토카인 없이) 전체 RPMI 배지에 플레이팅하였다. 추가의 대조군은 임의적으로 모 BC8 항체 또는 chBC8 IgG 항체를 포함하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3일 후, T 세포 확장을 셀타이터-블루 또는 유동 세포측정을 통해 분석하였다. 유동 세포측정을 위해, 제조자의 지침에 따라 7-AAD(카달로그 번호 A9400-5MG, Sigma)를 사용하여 분석 동안 죽은 세포를 염색하고 (이후 배제시키고), 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비드(CountBright Absolute Counting Bead)(카달로그 번호 C36950, Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 살아있는 세포 밀도를 정량하였다.
세포 표면 상의 IFM의 측정. 펄스 인큐베이션 및 세척 후 배양물에서 0, 1, 및 3일 후 세포 표면 IFM을 검출하기 위해 면역형광 염색에 의해 세포를 분석하였다. 간략히, 세포를 1 mg/mL 소혈청 알부민을 함유하는 1x 인산염 완충된 식염수(PBS)(PBS/BSA)로 세척한 후, PBS/BSA 중의 PE-컨주게이션된 항-IL15 항체(클론 번호 34559; R&D Systems 카달로그 번호 IC2471P)의 1:100 희석물 및 DyLight650-컨주게이션된 항-인간 IgG H+L 다중클론 항체(ThermoFisher 카달로그 번호 Sa5-10129)의 1:100 희석물로 염색하였다. 4℃에서 20-30분 인큐베이션 후, 세포를 PBS/BSA로 1회 세척한 후, 디바(Diva) 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 FACSCelesta 상에서 분석하기 위해 PBS/BSA에 재현탁시켰다. 데이터를 시토뱅크(Cytobank)(Cytobank, Inc) 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(GraphPad Software, Inc)을 사용하여 분석하였다.
실시예 2. 대안적인 항-CD45 항체에 대한 IL15의 융합
BC8과 다른 항-CD45 항체가 개선된 효능을 갖는 IFM을 생성할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 우리는 2개의 추가의 항-CD45 단일클론 항체(mAb 클론 9.4 및 4B2)를 평가하였다. 우리는 먼저 활성화된 CD8 T 세포의 표면 상에서 발현되는 CD45에 대한 이들 항체의 키메라 IgG 형태의 결합 친화성을 평가하였다. 키메라 항체 각각은 마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역(인간 불편 카파 도메인 및 IgG4 힌지 영역을 안정화시키기 위한 S228P 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4)을 포함한다. 이전 결과와의 비교를 위해, 우리는 chBC8, hBC8(23), 및 비결합 변이체 hBC8-null과 함께 이들 항체를 평가하였다. 인간화된 BC8 항체는 BC8로부터 이식된 CDR 영역을 함유하는 가변 도메인으로 이루어지며, hBC8-null 변이체는 중쇄 CDR3에 CD45에 대한 결합을 제거하는 SGGGS 치환을 함유한다(도 10a). ch4B2 및 ch9.4 항체는 각각 0.44 및 0.84 nM의 겉보기 해리 상수(KD,app)로 세포 CD45에 대해 가장 높은 친화성을 나타내었다(도 10a). hBC8-null 항체는 조사된 최고 농도에서 유의한 결합을 나타내지 않았다(500 nM; 도 10a). 우리는 실제 평형 해리 상수와 구별하기 위해 용어 겉보기 해리 상수(KD,app)를 사용하며; IgG 항체의 이가 특성은 이들 유형의 검정에 대한 실제 평형 해리 상수의 계산을 복잡하게 하는 아비디티(avidity) 효과를 도입한다. 그럼에도 불구하고, KD,app는 이의 고유한 맥락에서 세포 수용체에 대한 항체의 상대적 친화도를 스코어링하는 데 유용한 측정기준이다
다음으로, 우리는 이들 항체 각각을 포함하는 IFM의 효능을 평가하였다. 간략히, IL-15를 ch9.4 또는 ch4B2 Fab 단편 경쇄의 C-말단에 융합시키고, IL-15Rα-sushi와 공동발현시켜 각각 ch9.4-IL15/sushi Fab 및 ch4B2-IL15/sushi Fab를 생성하였다. hBC8-IL15/sushi Fab, hBC8(23)-IL15/sushi Fab, 및 hBC8-null-IL15/sushi Fab의 구축은 실시예 1에 기재되어 있다. 우리는 이들 IFM의 효능을 펄스 생물검정으로 비교하였으며, 일련의 음성 대조군: hBC8-null-IL15/sushi Fab(제거된 CD45 결합을 갖는 IFM), IL-15WT/sushi-Fc, BC8 항체, 및 단지 배지를 포함하였다. 각각의 IFM은 펄스 인큐베이션 후 3일에 측정 시 음성 대조군보다 큰 T 세포 확장을 유도하였다(도 10b). 4B2 또는 9.4를 포함하는 IFM은 chBC8 또는 hBC8(23)을 포함하는 IFM과 비교하여 증가된 효능을 가졌다. 이는 chBC8 및 hBC8(23)와 비교하여 4B2 및 9.4의 증가된 친화성과 일치하며, 세포 표면 수용체에 대한 항체의 증가된 친화성이 IFM의 증가된 효능을 초래한다는 생각과 일치한다. 종합적으로, 우리는 개선된 생물학적 지속성을 갖는 IFM의 생성은 BC8 항체에 제한되지 않으며 세포 표면 수용체에 대한 증가된 친화성은 IFM의 효능을 개선할 수 있다고 추단한다.
방법
세포 결합 검정. 일차 인간 CD8 T-세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD3/CD28 비드 및 10 ng/mL IL-2로 활성화시켰다. 활성화 및 전체 RPMI 배지에서 밤새 둔 후(실시예 1 방법 참조), T-세포를 1시간 동안 4℃에서 500 nM 내지 6.4 pM에 걸친 항체의 7개의 연속 5배 희석물 또는 단지 배지의 대조군과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 MACS 버퍼(PBS, 2% FBS, lmM EDTA)로 3회 세척하고, 항체 결합을 20분 동안 4℃에서 PE-컨주게이션된 항-인간 IgG-Fc 항체(BioLegend, 카달로그 번호 HP6017)를 사용하여 검출하였다. 세포를 MACS 버퍼로 2회 세척하고, 생사 염색(7-AAD)을 갖는 MACS 버퍼에 재현탁하였다. 항체 결합을 PE 신호 내에서 (7-ADD 배제를 통해) 살아있는 세포 집단의 중간 형광 강도(MFI)를 사용하여 정량화하였다. 항체 농도에 대해 평균 형광 단위를 플로팅함으로써 곡선을 생성하였으며, 겉보기 해리 상수(KD,app)를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 방정식을 이용하여 비선형 회귀에 의해 결정하였다.
펄스 생물검정. 펄스 생물검정은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.
단백질 발현. 단백질은 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성되었다.
실시예 3. 추가의 세포 표면 수용체를 표적하는 IFM은 개선된 효능 및 특이성을 촉진함
A. CD45 이외의 추가의 세포 표면 수용체는 개선된 시토카인 효능을 촉진함
CD45 이외의 세포 표면 수용체를 표적하는 IFM이 증가된 생물학적 효능을 초래할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 우리는 추가의 세포 표면 수용체를 표적하는 항체를 포함하는 IFM을 구축하였다. 대안적 수용체는 세포 표면 상에 풍부한 수용체이거나 단백질 수준에서 지속성을 나타낼 수 있다(예컨대, 느린 수용체 내재화 또는 수용체 내재화 시 세포 표면으로의 강력한 재순환을 나타낼 수 있다). 이상적으로, 수용체는 풍부하고 지속적이다. 이들 고려 사항에 따라, 우리는 평가를 위해 CD8, CD11a, 또는 CD18를 표적하는 IFM을 선택하였다. CD8은 세포독성 T 세포 상에서 발현되는 T 세포 수용체에 대한 보조수용체이다. CD8은 또한 피질 흉선세포, 수지상 세포, 및 천연 킬러 세포에서 발현될 수 있다. 세포독성 T 세포에서, CD8은 세포 표면 상에 활성화된 T 세포 수용체/MHC 복합체를 유지하는 것을 도우며(Wooldridge, van den berg, Glick, et al. JBC 2005), T 세포 수용체가 내재화되면, CD8 보조수용체는 T 세포 수용체와 비교하여 세포 표면 상에 우선적으로 유지된다(1989 J Imm Boyer, Auphan, Gabert, Schmitt-Verhulst et al Comparison of phosphorylation and internalization of the antigen receptor/CD3 complex, CD8, and Class I MHC-encoded proteins on T cells). 림프구 기능-연관된 항원 1(LFA-1)은 인테그린 알파-L(CD11a) 및 인테그린 베타-2(CD18)로 구성된 이종이량체 세포 표면 수용체이며, 세포간 부착 및 림프구 공동자극에 관련된다. 인테그린은 일반적으로 단백질 수준에서 지속성을 나타내며; 이들은 전형적으로 세포 표면으로부터 느린 내재화를 나타내거나 내재화 시 세포 표면으로 재순환된다(2012 J Cell Sci Integrins at a Glance and 1989 EMBO J Endocytosis and recycling of the Fn receptor in CHO). LFA-1은 몇몇 상이한 유형의 백혈구에 높은 수준으로 존재하며, 단핵구 U937 세포, 전골수성 백혈병 세포주 HL-60, 및 림프모구 세포주 JY를 포함하는 다수의 상이한 세포 유형에서 느린 내재화를 나타내는 것으로 밝혀졌다(1992 EMBO J Circulating Integrins Bretscher). 또한, CD11a 항체 에팔리주맙의 전임상 연구는 CD11a가 혈액으로부터 단리된 인간 및 마우스 T 세포에서 단백질 수준으로 지속성을 나타낸다는 것을 입증하였으나; 에팔리주맙은 이차 가교 항체의 존재 하에서 수용체 내재화 및 분해를 유도할 수 있음을 입증하였다(2004 Coffey, Pippig et al J Pharm Exp Ther).
우리는 각각의 항체 단편 경쇄의 C-말단에 IL-15를 유전자조작으로 융합시킴으로써 CD8(항체 클론 OKT8), CD1la(항체 클론 MHM24), 또는 CD18(항체 클론 1B4)을 표적하는 IFM을 구축하였다. IL-15-항체 융합물을 IL-15Rα-sushi와 공동발현시켜 3개의 IFM: chMHM24-IL15/sushi Fab, chlB4-IL15/sushi Fab, 및 chOKT8-IL15/sushi Fab를 생성하였다(도 11a). 각각의 Fab 단편은 마우스 가변 영역 및 인간 불변 도메인(카파 및 CHI)을 갖는 키메라 인간 및 마우스 영역으로 구성된다. CD8 T 세포 상의 IFM의 효능은 실시예 1에 기재된 바와 같이 펄스 생물검정으로 분석하였으며; 펄스 인큐베이션 후 배양 3일 후, 세포를 셀타이터 블루를 사용하여 증식에 대해 분석하였다. 3개의 IFM 각각은 chBC8-IL 15/sushi Fab에 대한 것과 유사한 수준으로 T 세포 증식을 지지하였다(도 11b). 우리는 상기에서 면역-표적화 기능성을 함유하지 않는 IL-15의 형태는 펄스 생물검정에서 최소의 효과를 나타낸다는 것을 입증하였다(도 2a-2c, 4a-4b, 5a-5d, 6a-6b, 및 8a-8c). 종합하면, 이는 추가의 세포 표면 수용체가 개선된 생물학적 지속성을 갖는 IFM을 생성할 수 있다는 것을 입증한다.
B. CD8 T 세포에 대해 개선된 효능을 촉진시키는 IFM
세포 표면 수용체 표적화가 개별 세포 유형에 대해 개선된 효능을 촉진시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 우리는 CD4 및 CD8 T 세포 상에서의 CD8-표적된 IFM의 효능을 비교하였다. CD4 또는 CD8 세포를 펄스 생물검정 포맷으로 chOKT8-IL15/sushi Fab로 처리하고, 세포 증식을 펄스 인큐베이션 후 3일에 측정하였다. CD8-표적된 IFM은 CD4 T 세포와 비교하여 CD8 T 세포를 강력하게 자극하였으며(도 12a-12b), 이는 IFM의 항체에 기초하여 특정 세포 유형을 표적하는 능력을 지지한다.
방법
CD4 또는 CD8 T 세포 상에서의 펄스 생물검정. CD4, CD8, 또는 CD4 및 CD8 보조수용체를 발현하는 세포의 혼합물을 함유하는 일차 인간 CD3 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 ng/mL IL-2의 존재 하에서 CD3/CD28 활성화 비드를 사용하여 활성화시켰다. 활성화 3일 후, 비드를 제거하고, 세포를 전체 RPMI 배지에 밤새 두었다. 이어서, 우리는 제조자의 프로토콜에 따라 자기 활성화된 세포 분류(MACS)(카달로그 번호 130-045-101, 및 번호 130-045-201, Miltenyi Biotec, Inc.)를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포의 개별 집단을 정제하였다. 이어서, CD4 또는 CD8 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 펄스 생물검정으로 분석하였다.
실시예 4. IL-15 IFM을 포함하는 단백질 나노겔은 장기간 세포 확장을 지지함
약물-로딩된 나노입자(본원에서 "백팩(backpack)"으로도 지칭됨)는 세포 생존력 및 기능을 지지하기 위한 잠재력을 보유한다. 따라서, 우리는 IFM를 포함하는 나노입자를 형성하는 능력 및 T 세포 생존력 및 확장의 효과를 조사하였다. 우리는 가역성, 아민 반응성, 동종이기능성 가교제를 사용하여 단백질 나노겔로 hBC8(23)-IL15/sushi Fab를 가교시켰다. IL15N72D/sushiL77I-Fc를 포함하는 단백질 나노겔을 비교제로서 사용하였다. 이들 단백질 둘 다는 단백질 나노겔로 효과적으로 가교결합되었으며; SEC 분석에 의해 단백질 나노겔은 더 큰 종과 일치하게 유리 단백질보다 빠른 용출 시간으로 이동하였다(도 13a 및 13b). 단백질 나노겔의 유리(비결합된) 단백질과의 HPLC 트레이스의 비교(도 13a-13b)는 가교된 나노겔에 남아 있는 최소량의 유리 단백질을 나타내었으며, 이는 단백질의 나노겔로의 높은 전환을 제시한다. 단백질 나노겔을 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리리신의 공동-블럭 중합체로 코팅하고, CD8 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 두 단백질 나노겔 모두 비-가교된 단백질 및 비자극된 대조군과 비교하여 장기 세포 확장을 지지하였다(도 13c).
방법
단백질 나노겔 합성. 가교된 단백질 나노입자를 포함하는 단백질 나노겔을 하기와 같이 형성하였다. 400 달톤의 평균 분자량을 갖는 최종 농도 2.5%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG-400, Spectrum Chemical Mfg. Corp.) 및 10% 글리세롤(Sigma)의 존재 하에서 17 mg/mL 농도의 chBC8-IL15/sushi Fab 융합 단백질을 27배 몰 과량의 분해성 가교링커(화학식 I)와 함께 인큐베이션함으로써 상기 단백질을 단백질 나노겔로 가교시켰다. 17 mg/mL 농도의 IL15N72D/sushiL77I-Fc 단백질을 27배 몰 과량의 분해성 가교링커(화학식 I)와 함께 인큐베이션함으로써 상기 단백질을 단백질 나노겔로 가교시켰다. 이 연구에 사용된 가교링커, 비스[2-(N-숙신이미딜-옥시카르보닐옥시)에틸] 디술파이드는 화학식 I에 나타난 바와 같이 유연한 디술파이드-함유 링커로 함께 연결된 2개의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 기를 함유한다.
화학식 I:
Figure pct00024
실온에서 30분 인큐베이션한 후, 반응물을 듈베코(Dulbecco)의 인산염 완충된 식염수(DPBS)로 1.5 mg/mL의 최종 시토카인 농도로 희석하였다. 이어서, 단백질 나노겔을 조바(Zeba) 컬럼(40,000 MW 컷-오프, Thermo-Fisher)을 사용하여 DPBS로의 버퍼 교환에 의해 (가교결합 반응의 일부로서 제거되는 링커의 분자 단편을 포함하는) 링커 이탈기 및 비반응된 링커로부터 정제하였다. 조바 컬럼은 버퍼 교환을 촉진하기 위해 DPBS로 3회 연속 세척하여 DPBS에서 컬럼을 평형화시킨 후 반응 생성물을 적용하는 것을 포함하여, 제조자의 지침에 따라 사용되었다. 버퍼-교환된 단백질 나노겔을 포토다이오드 어레이가 장착된 프로미넌스(Prominence) HPLC 시스템(Shimadzu Corp.) 상에서 용출제(유속 0.5 mL/min)로서 PBS(pH 7.2)를 사용하여 BioSepTM SEC-s4000 컬럼(Phenomenex Inc.)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다.
대략 1 - 1.5 mg/mL의 시토카인 농도의 단백질 나노겔을 평균 분자량 5 킬로달톤(kD)의 폴리에틸렌 글리콜 중합체 및 30 아미노산 폴리리신 중합체(폴리리신30 또는 polyK30)을 포함하는 블럭 공중합체인 폴리에틸렌 글리콜-폴리리신(PEG-polyK) 블럭 공중합체: PEG5k-polyK30(Alamanda Polymers 카달로그 번호 050-KC030)와 컨주게이션하였다. PEG5k-polyK30을 DPBS 중에 1 mg/mL로 재구성하고, 50 ug/mL의 최종 블럭 공중합체 농도로 1-1.5 mg/mL의 단백질 나노겔에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
T 세포 확장 분석. 1-1.5 mg/mL의 단백질 농도로 PEG5k-polyK30을 포함하는 단백질 나노겔을 100x106개 세포/mL의 세포 농도로 HBSS 중의 1x106개 CD8 T-세포와 동일한 부피로 혼합하고, 1 hr 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, T-세포를 10% FBS, 페니실린/ 스트렙토마이신, 및 글루타막스(모두, ThermoFisher Scientific, Inc.)를 함유하는 RPMI 배지로 3회 세척하고, 대략 1 x 106개 세포/mL의 세포 밀도로 시딩하고, 24-웰 조직 배양 플레이트에서 9일 동안 배양하였다. 세포를 백팩의 세포 부착 후 3일에 1:5의 비율로 신선한 배지로 분할하였다. 세포 증식을 생사 세포 염색(7-AAD) 및 카운팅 비드(CountBright Absolute Counting Beads, Thermo Fisher Scientific, Inc.)에 의해 0, 1, 2, 3, 6, 및 9일에 유동 세포측정으로 측정하였다.
실시예 5: 면역 조절제에 대한 융합을 포함하는 예시적인 IFM
시토카인에 대한 융합 이외에, 면역-세포 표적된 항체를 비시토카인 면역 조절제, 예컨대 공동자극 분자 또는 체크포인트 억제제에 대한 항체에 커플링시킬 수 있다.
일 실시양태에서, chBC8 항-CD45 Fab 또는 IgG를 포함하는 구축물을 공동-자극 수용체, 예컨대 4-1BB(CD137)를 표적하는 항체 분자, 예컨대 Fab 또는 scFv에 커플링시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CD137에 대한 항체 분자는 효능제 항체이다. 일부 실시양태에서, CD137에 대한 항체 분자는 scFv, Fab, 또는 IgG로부터 선택된다. 실시양태에서, 융합물은 융합물의 항-CD45 (또는 CD11, CD8, CD4 등) 부분의 N-말단 또는 C-말단 도메인에 융합된 공동-자극 수용체에 대한 항체 분자를 포함한다. 요컨대, 상기 및 도면에 기재된 모든 융합물은 시토카인이 4-1BB에 대한 Fab 또는 scFv 효능제 (또는 임의의 다른 세포 표면 수용체의 효능제)에 의해 대체되도록 변형될 수 있었다.
다른 실시양태에서, chBC8 항-CD45 Fab 또는 IgG를 포함하는 구축물은 음성 면역 조절제, 예컨대 체크포인트 억제제의 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA-4로부터 선택되는 체크포인트 억제제의 억제제를 표적하는 항체 분자, 예컨대 Fab 또는 scFv에 커플링될 수 있다. 예컨대, CTLA-4 또는 PD-1에 대한 길항제, 예컨대 IgG, Fab, 또는 scFv 항체는 시토카인을 대체하여 CD45, CD11 등과의 융합물의 상호작용을 통해 세포 표면 수용체의 지속적 길항작용을 초래할 수 있다.
실시예 6: 프라이밍은 ACT 효능을 개선할 수 있음
일부 실시양태에서, 세포 치료제, 종양 미세환경, 및/또는 숙주를 프라이밍 (또는 사전-조건화)하는 것은 입양 세포 요법(ACT)에 확장된 이익을 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특정 실시양태에서, 심지어 짧은(예컨대, 약 1-3일, 약 1일, 또는 1일 미만) 프라이밍 이벤트도 놀랍게도 세포 요법의 효능에 극적인 효과를 가질 수 있다.
도 14a에 나타난 바와 같이, 예컨대 CPX(시클로포스파미드) 또는 다른 림프고갈 조건화 화학요법으로 숙주 및 종양 미세환경을 프라이밍하는 것은 종양 성장을 상당히 억제하므로 ACT 효능을 개선한다. Pmel 트랜스제닉 마우스 스트레인은 문헌(Finkelstein et al., J Leukoc Biol. 2004 Aug; 76(2): 333-337)으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 세포 치료(예컨대, T 세포 ACT)도 T 세포 활성화를 개선하거나 최적화하기 위해 프라이밍될 수 있다. 도 14b에 나타난 바와 같이, IL-21로의 전처리로 ACT 효능이 가장 개선되었으며, 다음으로 IL-2/IL-7 및 IL-7였다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 면역자극 융합 분자는 생체내 환경에서 이러한 프라이밍을 확장시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 7: 면역표적된 표면 수용체의 다양성
도 15는 면역표적화 모이어티(예컨대, 다양한 세포 표면 수용체에 대한 항체) 및 시토카인 분자의 다양한 조합을 도시한다. 다수의 수용체가 시토카인 면역표적화를 촉진시킬 수 있다. 예컨대, 테더링된 융합물은 "풍부한" 세포 표면 수용체, 예컨대 다수의 세포 유형에 존재할 수 있는 CD11a, CD18, CD45 및/또는 CD2에 대한 항체에 테더링된 다양한 시토카인으로 제조될 수 있다. 시토카인은 또한 세포 유형-특이적 표면 수용체, 예컨대 CD4, CD8 또는 CD56을 통해 특정 세포에 면역표적될 수 있다.
실시예 8: IL-15 테더링된 융합물은 고형 종양에서 T 세포 요법을 개선함
우리는 2개의 상이한 종양-특이적 세포 요법 모델을 사용하여 항암 요법의 효능을 증대시키는 IL-15 IFM의 능력을 평가하였다. 종합적으로, 이들 연구는 인간 또는 마우스 T 세포, CAR-T 세포 또는 종양-특이적 TCR을 포함하는 종양 모델, 및 면역결핍 또는 면역적격 동물 모델에 걸쳐 종양 특이적 세포 요법을 증대시키는 IL-15 IFM의 능력을 입증한다. 종양-특이적 T 세포에 면역표적된 IL-15를 사전로딩하는 것은 도 16a-16c(면역 면역적격, B16-F10 종양을 갖는 C57BL/6J 마우스) 및 도 16d-16e(이종발생 종양 모델, H1299 종양을 갖는 NSG 마우스)에 나타난 바와 같이 생체내에서 항종양 활성을 지지하며, IL-15 테더링된 융합물은 시간에 따라 종양-특이적 세포 요법의 효능을 증대시킨다.
IL-15 IFM을 먼저 Pmel/B16-F10 모델에서 조사하였다. 이 모델에 대해, 흑색종 항원(gp100)에 특이적인 CD8 T 세포를 생체외에서 확장시킨 후, gp100-발현 B16-F10 종양 세포주를 운반하는 동계 마우스에 주사하였다. ACT 전 9일에, 200,000개의 B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내 주사하였다. 흑색종 항원 gp100-특이적 마우스 CD8 T 세포를 Pmel 마우스로부터 단리시키고, 마우스 CD3 및 CD28 수용체에 대한 플레이트-코팅된 항체를 사용하여 2일 동안 활성화시킨 후, 2일 동안 IL-21의 존재 하에 확장시켰다. 생체외 확장 후, 세포에 0.75 mg/mL의 농도로 chM1Fab-IL15/sushi를 로딩하였다. 세포를 HBSS에서 3회 세척하여 과량의 시토카인을 제거한 후, 6.0x106개 세포/마우스의 단일 용량으로 주사하였다. 추가의 그룹은 비히클 단독(세포 없음), 및 IL-15 IFM 부재 하에 HBSS로 모의-로딩된 단일 용량의 6.0x106개 세포(Pmel 단독)을 포함하였다. 모든 동물에게 또한 ACT 1일 전에 시클로포스파미드 림프고갈(4 mg/마우스)을 제공하였다.
도 16a-16c는 상기 기재된 연구로부터의 종양 성장 곡선, 마우스 생존 곡선, 및 Pmel 확장 곡선을 나타낸다. Pmel 세포 단독은 연구 과정에 걸쳐 종양 부피를 감소시켰으며, 이 효과는 세포를 chM1Fab-IL15/sushi로 사전-로딩함으로써 증진되었다(도 16a). 이 감소된 종양 부피는 400 mm3의 종양 부피에 대한 시간에 의해 측정되는 바와 같이 개선된 생존 결과로 해석되었다(도 16b). 비히클 대조군 마우스는 13일의 중간 생존을 가진 반면, Pmel 세포 단독으로의 처리는 이 중간 생존을 34일로 증가시켰다. 사전-로딩된 chM1Fab-IL15/sushi를 갖는 Pmel은 중간 생존 시간을 43일로 확장시켰으며, 2번의 완전한 완화를 이끌었다(28.6%). 비히클 대조군 및 Pmel 단독 그룹은 모두 39일 이후에 어떠한 마우스도 생존하지 못했다. 이 증가된 종양 제어 및 생존은 증가된 수의 순환 Pmel 세포와 서로 관련이 있다(도 16c). 피크 확장에서, chM1Fab-IL15/sushi-로딩된 Pmel은 Pmel 단독보다 2.6배 높은 혈액 농도를 가졌으며, 이 증가된 농도는 피크 확장 후 오랫 동안 유지되었으며; chM1Fab-IL15/sushi-로딩된 그룹에 대해, ACT 후 42일까지 200개 초과의 Pmel 세포/μl 혈액이었으며, 이는 모의-로딩된 Pmel 그룹보다 실질적으로 많았다(도 16c). 우리는 IL-15 테더링된 융합 분자로 사전-로딩된 종양-표적화 T 세포가 동계 숙주에서 세포 확장을 증진시키고 더 우수한 종양 제어 및 전반적인 생존을 이끈다고 추단한다.
인간 이종이식 종양을 포함하는 추가의 마우스 모델 및 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 요법을 이용하여 종양-특이적 세포 요법을 증진시키는 IL-15 IFM의 능력을 시험하였다. 간략히, CAR-T 세포를 임상 CAR-T 세포의 생체외 확장에 사용된 것과 유사한 프로토콜에 따라 생성하였다. CD3 인간 T 세포를 (종양 세포 상에서 발현되는 EGFR을 인식할) EGFR-표적된 CAR 구축물로 형질도입 및 확장 후, 세포에 인간 CD45-표적된 IL-15 IFM(h9.4Fab-IL15/sushi)을 로딩하고, 종양 이종이식편-보유 마우스에 주사하고, 생체내 확장 및 치료 효능을 평가하였다. 이 연구에서, H1299 인간 폐 암 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, VA)으로부터 입수하고, 1.0x107개의 종양 세포를 NOD.Cg-Prkdc scid 　Il2rg tm1Wjl /SzJ 마우스(NSG, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)의 면도된 우측 옆구리에 피하(SC) 주사하였다. 인간 CD3 T 세포를 1:1의 비드:세포의 비율 및 1x106개 세포/mL의 세포 밀도로 디나비드(Dynabead), T 세포 익스팬더 비드로 활성화시켰다. T 세포 배지(ECM, 10% 소태아혈청, 25 mM HEPES 버퍼, 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640)를 IL-7(10 ng/mL) 및 IL-21(100 ng/mL)로 보충하고, 세포를 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 배양 2일 후, 비드를 자석에 의해 배양물로부터 제거시키고, 세포를 배지로 세척하였다. T 세포를 2.0x107개 세포/mL로 신선한 배지에 재현탁시키고, 30분 동안 500 g 원심분리 하에서 CAR-T 발현 레트로바이러스 벡터로 5의 감염 다중도로 10 ng/mL 프로타민 술페이트와 함께 형질도입시켰다. 원심분리 30분 후, 세포를 각각 10 ng/mL 및 100 ng/mL의 농도의 IL-7 및 IL-21로 추가로 보충된 신선한 TCM으로 5.0x106개 세포/mL로 희석하였다. 세포를 추가의 12 hr 동안 37℃에서 5% CO2로 형질도입시켰다. 12 hr 형질도입 후, 세포를 펠렛화하여 바이러스-함유 배지를 제거시키고, IL-15(50 ng/mL) 및 IL-21(100 ng/mL)로 보충된 신선한 T 세포 배지에 1.0x106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 5% CO2로 추가의 3일 동안 배양한 후, 0.75 mg/mL 농도의 IL-15 IFM을 로딩하였다. 세포를 HBSS에서 3회 세척하여 과량의 시토카인을 제거시킨 후, 5.0x106개 CAR-T 세포/마우스로 H1299 종양-보유 마우스에 단일 용량으로 주사하였다. 다른 그룹은 비히클 단독(세포 없음), 및 HBSS로 모의-로딩된 5.0x106개 세포의 단일 용량(CAR-T 단독)을 포함하였다. CAR-T 생성을 (동일한 인간 공여자를 사용하여) 반복하고, 37일에 동물에게 제2 용량의 5x106개 CAR-T 세포(IL-15 IFM의 존재 또는 부재)를 주사하였다.
도 16d는 상기 기재된 연구로부터의 종양 성장 곡선을 나타낸다. CAR-T 세포 단독은 연구 과정에 걸쳐 대조군 그룹(HBSS: T 세포 없음; WT: 활성화되고 확장되나 비-CAR-형질도입된 T 세포)에 비해 종양 부피를 감소시켰으며, 이 효과는 세포를 h9.4Fab-IL15/sushi로 사전-로딩함으로써 증진되었다. IL-15 IFM-로딩된 CAR-T 세포로 처리된 마우스만이 연속적인 종양 퇴행을 나타내었으며, h9.4Fab-IL15/sushi 테더링된 융합 분자는 CAR-T 항종양 활성을 증진시킨다. ACT 후 8주 후, 종양을 수거하고 무게를 쟀으며; 도 16e는 IL-15 IFM이 CAR-T 세포 단독과 비교하여 종양 중량을 감소시켰으며, 또한 7마리의 마우스 중 3마리가 완전한 반응(종양 없음)을 보였음을 나타낸다.
실시예 9: 테더링된 융합 플랫폼은 선별적인 세포 표적화를 가능하게 함
CD8-표적된 IL-7은 CD8 T 세포의 선별적인 로딩 및 확장을 제공한다. 도 17a-17b는 CD8-표적된-IL-7이 CD8 T 세포를 선별적으로 표적하는 세포-특이적 표적화를 나타낸다. 도 17c는 CD8-표적된 IL-7과의 펄스 인큐베이션에 의해 활성화된 총 CD3 인간 T 세포의 배양물에서 CD4 T 세포가 아닌 CD8 T 세포의 선별적인 확장을 나타낸다. 간략히, 총 CD3 인간 T 세포(CD4 및 CD8 T 세포 둘 다를 포함)를 3일 동안 제조자의 지침에 따라 CD3/CD28 디나비드 활성제 비드(Thermo)를 사용하여 20 ng/mL IL-7 및 100 ng/mL IL-21의 존재 하에서 자극함으로써 활성화된 인간 T 세포를 제조하였다. 이어서, CD3/CD28 비드를 제거하고, 세포를 밤새 20 ng/mL IL-7 and 100 ng/mL IL-21의 존재 하에 37℃ 및 5% CO2에서 전체 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI 1640)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 500 nM의 CD8-표적된 IL-7 구축물(chOKT8Fab-IL7)과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 1 hr 후 세포를 전체 배지로 2회 세척하고, 200,000개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 별도로, T 세포를 DyLight 650-컨주게이션된 항-인간 IgG 다중클론 항체(Thermo 카달로그 번호 SA5-10129; DyLight 650 형광단은 유동 세포측정을 위한 APC 채널 상에서 판독될 수 있음, 도 17b 참조), FITC-컨주게이션된 항-CD4 항체(BioLegend 카달로그 번호 344604), 및 APC/Cy7-컨주게이션된 항-CD8 항체(BioLegend 카달로그 번호 344715)로 염색함으로써 세포를 CD8 및 CD4 T 세포 상으로의 로딩에 대해 분석하였다. 항-인간 IgG 다중클론 항체는 CD8-표적된 IFM의 Fab 영역을 검출한다. 항-CD4 및 항-CD8 항체는 CD4 및 CD8 T 세포 집단을 구별할 수 있다(도 17a). 도 17b는 CD8-표적된 IL-7 구축물이 CD4와 CD8 T 세포의 혼합 집단과 인큐베이션될 때 CD8 T 세포 상에 더 높은 수준으로 선별적으로 로딩됨을 나타낸다. 도 17c는 CD8-표적된 IL-7 구축물에 의한 CD8 T 세포의 선별적 확장을 나타낸다.
상이한 항체 클론 및 항체 구성(configuration)에 의한 선별적 세포 로딩을 더욱 조사하기 위해서, 우리는 2개의 상이한 항-CD3 단일클론 항체에 의한 CD4 및 CD8 T 세포 상으로의 로딩을 비교하였다. 간략히, 우리는 항-인간 CD8 항체 클론 OKT8 및 51.1을 Fab 단편(chOKT8Fab 및 ch51.1Fab)으로서 재조합적으로 생성하였다. 우리는 추가적으로 2개의 IL-15 IFM: chOKT8Fab를 포함하는 것(chOKT8Fab-IL15/sushi) 및 chOKT8Fab 및 항-CD45 scFv를 포함하는 제2의 것(chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi)을 구축하였다. 이 후자의 구축물은 2개의 상이한 세포 표면 수용체, CD8 및 CD45에 대한 항체 단편을 함유하며, 우리는 이것이 아비디티 효과를 통해 CD8 T 세포의 더 강력한 세포 로딩을 제공할 수 있다고 생각하였다. 우리는 총 CD3 T 세포(CD4와 CD8 T 세포의 혼합물을 포함)를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포 상으로 로딩하는 이들 4개의 항체 및 IFM 구축물의 능력을 평가하였다. 도 17d는 각각의 구축물에 대한 CD8 T 세포 상으로의 강한 선별적 로딩을 나타낸다. 도 17e에서, 우리는 항-IL15 염색을 이용하여 IL-15의 CD8 T 세포 상으로의 선별적 로딩을 유사하게 나타낸다(IL-15를 함유하지 않는 Fab 구축물, chOKT8Fab 및 ch51.1Fab은 물론 이 검정에서 음성이다).
CD8 T 세포에 대한 상대적 친화성을 비교하기 위해, 우리는 도 17d로부터의 CD8 T 세포에 대한 결합 적정을 도 17f의 단일 플롯으로 편집하였다. chOKT8Fab-BC8scFv 항체 구성은 CD8 T 세포에 가장 밀접한 결합을 제공하였다. 이 IFM은 또한 보다 높은 농도로 사용 시 CD4 T 세포 상으로 로딩되었다(도 17d 및 도 17e). 우리는 이것이 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다에 존재하는 CD45 수용체에 결합하는 BC8scFv에 기인한다고 생각한다. 도 17d에서 관찰되는 CD4 T 세포에 대한 chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi의 상대적 친화도는 T 세포에 대한 단량체 BC8scFv의 친화도와 유사하며(도 17g, BC8scFv는 여기서 유동 세포측정에 의한 검출을 위한 핸들로서 사용되는 헥사히스티딘 태그를 사용하여 구축되었음); CD4 T 세포에 대한 chOKT8Fab 및 chOKT8Fab-Il15/sushi의 최소 결합과 함께, 우리는 CD4 T 세포에 대한 chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi의 결합이 BC8scFv에 의해 이끌린다고 추단한다. BC8scFv의 이량체 형태는 아마도 이가 결합으로부터의 아비디티 효과에 기인하여 T 세포에 대해 보다 높은 친화성을 초래한다. 우리는 또한 - 일가 chOKT8Fab-IL15/sushi와 비교하여 CD8 T 세포에 대한 더 높은 결합 뿐만 아니라 - CD4 T 세포 대비 CD8 T 세포에 대한 chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi의 보다 높은 결합 친화성도 유사하게 CD8 T 세포에 대한 이가 결합으로부터 발생하는 아비디티 효과에 기인한다고 생각한다. 따라서, 우리는 IFM이 세포 친화성 및 로딩을 개선하기 위해 상이한 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체 클론을 사용하여 구축할 수 있다고 추단한다. 또한, 선택된 항체 중 하나 이상은 여전히 세포-선별적 로딩을 보유하면서 개선된 친화성을 가능하게 하기 위해 특정 세포 유형에 대해 특이적일 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 우리는 상이한 세포 유형에 대해 다양한 로딩 효율을 갖는 이종특이적 항체를 구축하는 것이 또한 실행가능하다는 것을 보여준다(예컨대, 이 경우, CD8 T 세포 상으로의 더 강한 로딩 및 CD4 T 세포 상으로의 더 약한 - 그러나 0은 아닌 - 로딩).
실시예 10: 시토카인 조작은 테더링된 융합 효능을 개선함
우리는 조절된 생물학적 활성을 갖는 시토카인 돌연변이체를 조작함으로써 IFM 효능을 더욱 증대시키는 능력을 평가하였다. IL-15와 이의 세포 신호전달 수용체 사이의 상호작용에 대한 구조-기능 이해에 기초하여(Chirifu et al. Nat Immunol. 2007 Sep;8(9):1001-7; Ring et al. Nat Immunol. 2012 Dec;13(12):1187-95), 우리는 IL-15/IL-2 수용체 베타와 상호작용하는 것으로 믿어지는 아미노산 측쇄에 대한 돌연변이를 포함하는 3개의 IL-15 돌연변이체(구체적으로, IL-15-D8N, IL-15-D61N, 및 IL-15N72A), 및 감마 쇄와 상호작용하는 것으로 믿어지는 아미노산 측쇄에 대한 돌연변이를 포함하는 3개의 추가의 IL-15 변이체(IL-15-K10Q, IL-15-Q101N, 및 IL-15-Q108N)를 구축하였다. 우리는 chBC8Fab 항체 단편에 대한 융합물로서 IL-15 돌연변이체를 구축하고, 인간 T 세포에 대한 그들의 결합 및 활성을 평가하였다. 간략히, 일차 인간 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화시킨 후, IL-15 변이체를 포함하는 IFM의 5배 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다(IFM 인큐베이션 후 세척 없이, 예컨대 '일정한(constant)' 인큐베이션 검정 포맷). 야생형 IL-15 및 IL-15/sushi-Fc 구축물을 포함하는 IFM을 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. 3일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 IL-15 구축물과 함께 인큐베이션한 후, 세포 밀도를 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비드(Thermo)를 사용하여 유도 세포측정에 의해 제조자의 지침에 따라 분석하였다. 야생형 IL-15를 함유하는 IFM(chBC8Fab-IL15/sushi)은 IL-15/sushi-Fc 구축물과 유사한 세포 효능을 나타내었다(도 18a 및 도 18b). 또한, 도 18a 및 도 18b는 3개의 상이한 IL-15 변이체(IL-15-K10Q, IL-15-Q101N, 및 IL-15-N72A)는 야생형 IL-15보다 강력한 세포 효능을 초래하고, 2개의 IL-15 변이체(IL-15-D61N 및 IL-15-Q108N)는 감소된 세포 효능을 초래하며, 단일 IL-15 변이체(IL-15-D8N)는 평가되는 농도 범위 하에서 세포 활성을 나타내지 않았다는 것을 나타낸다. 별도의 실험에서, 우리는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펄스 검정 포맷으로 2개의 감쇠된 IL-15 변이체(IL-15-D61N 및 IL-15-Q108N)의 표면 지속성을 평가하였다. 우리는 감쇠된 변이체가 세포 표면에 대해 더 강한 지속성을 나타낸다는 것을 발견하였다(도 18c). 성장 인자 및 시토카인 신호전달 수용체의 활성화는 세포 내에서 음성 조절 피드백 메커니즘을 유도한다. 하나의 이러한 메커니즘은 활성화된 시토카인 및 성장 인자 수용체의 내재화 및 분해를 포함한다(Jones et al. Trends Biotechnol. 2008 Sep;26(9):498-505). 이론에 구애됨이 없이, 우리는 감쇠된 활성을 갖는 시토카인 변이체로부터의 상승된 표면 지속성은 세포 내에서 이러한 음성 조절 피드백 메커니즘의 보다 약한 유도에 기인할 수 있다고 생각한다.
시토카인 활성과 IFM 표면 지속성 및 효능 사이의 관계를 더욱 조사하기 위해, 우리는 IL-15 및 이의 IL-15/IL-2 수용체 베타와의 경계면에 돌연변이를 포함하는 4개의 추가의 IL-15 변이체를 설계하였다. 특히, 우리는 IL-15 변이체 IL-15-D61H, IL-15E64H, IL-15-D65H, 또는 IL-15-N72H를 포함하는 CD8-표적된 IFM을 구축하였다. CD3 인간 T 세포를 3일 동안 CD3/CD28 디나비드 활성제 비드(Thermo)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 자극함으로써 활성화된 인간 T 세포를 제조한 후, 비드를 제거하고, 세포를 밤새 20 ng/mL IL-7 및 100 ng/mL IL-21의 존재 하에서 37℃ 및 5% CO2에서 전체 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI 1640)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 활성화된 T 세포를 10 - 0.0032 nM의 농도 범위에 걸쳐 IFM의 연속 5배 희석물과 함께 인큐베이션하고, (IFM 인큐베이션 후 세척 없이, 예컨대 '일정한' 인큐베이션 검정 포맷) 96-웰 플레이트로 200,000개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3일 후, 세포를 수거하고, 세포 확장 및 IFM 표면 수준에 대해 평가하였다. IFM 표면 수준의 분석을 위해, 세포를 BV421-컨주게이션된 항-CD4 항체(BioLegend 카달로그 번호 344632), BV786-컨주게이션된 항-CD8 항체(BioLegend 카달로그 번호 344740), 및 Alexa-Fluor-647-컨주게이션된 항-인간 카파(경쇄) 항체로 염색하였다. 도 18d는 CD8-표적된 IL-15 구축물의 CD8 T 세포 상으로의 높은 로딩 및 CD4 T 세포 상으로의 최소 로딩를 입증한다. CD8-표적된 IFM의 CD4 T 세포 상으로의 제한된 로딩은 세포 반응에 대한 IL-15 돌연변이의 효과에 대한 제어된 평가를 가능하게 하였다. D61H, E64H, N65H, 또는 N72H 포인트 돌연변이를 포함하는 CD8-표적된 IL-15 구축물과의 인큐베이션에 반응한 CD4 T 세포의 확장은 D61H, E64H, 및 N65H 돌연변이의 약화 활성을 입증하였다(도 18e).
우리는 또한 펄스 검정 포맷으로 CD8 및 CD4 T 세포에 대한 이들 구축물의 활성을 평가하였다. 간략히, 활성화된 총 CD3 인간 T 세포를 1 hr 동안 37℃에서 CD8-표적된 IL-15 변이체와 함께 인큐베이션하고, 세척하여 비결합된 IFM을 제거하고, 200,000개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 유도된 시토카인 분비 또는 테더링된 융합물 비결합 및 재결합의 효과를 제어하기 위해(각각은 추가의 T 세포 생존 또는 확장을 지지할 수 있음), 우리는 펄스 인큐베이션 후 1일 및 3일에 세포 배양 배지를 새롭게 하고; 펄스 인큐베이션 후 3일에 추가의 세포 확장을 허용하도록 세포를 5배 희석비를 사용하여 신선한 배지로 추가로 분할하였다. 각각의 CD8-표적된 구축물은 CD4 T 세포와 비교하여 CD8 T 세포 상으로 보다 높은 정도로 선별적으로 로딩되었다(도 19a). 또한, 감쇠된 세포 활성을 포함하는 각각의 히스티딘 돌연변이체(D61H, E64H, 및 N65H)는 혼합된 CD4와 CD8 T 세포 상으로 펄스 인큐베이션한 후 1일에 더 높은 표면 지속성을 나타내었다(도 19a). CD4 T 세포 대비 CD8 T 세포를 선별적으로 확장시키는 CD8-표적된 구축물의 능력을 평가하기 위해, 우리는 그들의 활성을 CD8-표적된 IL-15 IFM와 동일한 항체 구성으로 구축된 비선별적으로-로딩된 CD45-표적된 IL-15 IFM(CD8-표적된 구축물에 대한 항체 포맷과 일치하는 Fab-scFv 포맷을 함유하는 h9.4Fab-BC8scFv-IL15/sushi)과 비교하였다. 각각의 CD8-표적된 IL-15 구축물은 CD8 T 세포의 선별적 확장을 제공하였으며, D61H 및 E64H 돌연변이를 포함하는 CD8-표적된 IL-15 구축물은 야생형 IL-15를 포함하는 CD8-표적된 구축물보다 큰 CD8 T 세포 확장을 지지하였다(도 19b). 특히, 이 펄스 검정 포맷에서, CD8-표적된 IL-15 구축물 각각은 CD8-특이성에 대한 그들의 설계와 일치하고 CD8 T 세포 상으로의 로딩을 위한 그들의 특이성과 일치하게 CD4 T 세포를 단지 약하게 확장시켰다(도 19b). 비교를 위해, 전체 확장 시간 과정이 야생형 IL-15, IL-15-D61H, 또는 IL-15-E64H를 포함하는 CD8-표적된 구축물에 대해 제시된다(도 19c).
우리는 추가적으로 CD45-표적된 IFM(h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H)과 관련하여 감쇠된 IL-15 변이체 IL-15-D61H를 평가하였다. CD8-표적된 IL-15-D61H IFM에 대해 관찰된 데이터와 일치하게, CD45-테어링된 구축물은 일가 및 이가 CD45-테더링된 IL-15 IFM 둘 다와 비교하여 더 강한 세포 표면 지속성을 제공하였다(도 20). 총체적으로, 우리는 감쇠된 IL-15 변이체를 포함하는 IFM이 시간에 따라 더 높은 세포 표면 지속성을 초래하고 더 강한 세포 증식을 유도할 수 있다고 추단한다.
실시예 11: IL-15 테더링된 융합물은 IL-15 수용체의 하류에 지속적인 신호전달을 지지함
우리는 테더링된 융합물과의 펄스 인큐베이션 후 1일에 세포내 신호전달의 활성화를 지지하는 IL-15 테더링된 융합물의 능력을 평가하였다. 간략히, 인간 T 세포를 제조자의 지침에 기재된 바와 같이 3일 동안 CD3/CD28 디나비드로 활성화시켰다. 비드를 제거하고, 세포를 IL-15 구축물과 펄스 또는 일정한 인큐베이션 전 1일 동안 IL-2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 1 hr 동안 37℃에서 PBS(모의 조건), 및 IL-15/sushi-Fc 구축물, 또는 hBC8Fab-IL15/sushi와 함께 생물학적 복제로 인큐베이션한 후, 전체 배지(10% FBS를 갖는 RPMI 1640)로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 대략 400,000개 세포/mL의 세포 밀도로 전체 배지에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. "일정한" 인큐베이션 조건에 대해, 세포는 대략 1 μg/mL의 농도로 지시된 IL-15 구축물로 보충되었다. 다음날, 세포를 회수하고, 10분 동안 실온에서 대략 1.5% 파라포름알데히드로 고정시키고, 10분 동안 4℃에서 100% 메탄올로 투과시켰다. 이어서, 세포를 인산화된 STAT5(IL-15 수용체로부터 하류로 신호전달 분자에 의해 활성화되는 전사 인자)에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색하고, 디바 소프트웨어를 사용하여 FACSCelesta 상에서 분석하고; 데이터를 시토뱅크(Cytobank)를 사용하여 분석하였다. 두 IL-15 구축물 모두 "일전한" 포맷으로 T 세포와 함께 인큐베이션 시 STAT5의 인산화를 유도하였지만, 테더링된 융합물만이 펄스 인큐베이션 후 1일에 STAT5 인산화를 유지하였다(도 21).
실시예 12a: IL-12를 포함하는 예시적 면역자극 융합 단백질
IL-12를 포함하는 테더링된 융합물(IFM으로도 지칭됨)은 IL-15에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 구축될 수 있다. 예시적인 IL-12 테더링된 융합물(IL12-TF)이 도 22a-22d에 도시된다. 인간 또는 마우스 세포 둘 다에 사용하기 위한 IL12-TF는 인간 또는 마우스 IL-12 및 인간 또는 마우스 CD45에 특이적인 항체 단편을 사용하여 구축되었다. IL12-TF chM1Fab-sc-IL12p70은 마우스 단일쇄 IL-12p70에 융합된 항-마우스 CD45 Fab 단편을 포함한다(도 22a). 마우스 단일쇄 IL-12p70은 마우스 IL-12A와 IL-12B 사이에 유전자 융합을 포함한다. 마우스 세포에서 사용하기 위한 또 다른 IL12-TF인 chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70은 항-마우스 CD45 Fab와 scFv 항체 단편의 Fab-scFv 융합물 및 마우스 단일쇄 IL-12p70을 포함한다(도 22b). 인간 세포와 함께 사용하기 위한 상응하는 IL12-TF도 구축되었다: h9.4Fab-scIL-12p70(도 22c) 및 h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70(도 22d)은 인간 CD45에 특이적인 Fab 또는 Fab-scFv 융합물 및 단일쇄 인간 IL-12p70을 포함한다. 4개의 구축물 모두에 대한 각각의 IL-12p70 서브유닛 IL-12A 및 IL-12B는, 정반대의 발현 배향도 가능하지만(예컨대, IL-12A-IL-12B), IL-12B-IL-12A 배향을 갖는 단일쇄 분자로 발현된다. IL-12A 및 IL-12B 서브유닛을 연결하는 다수의 상이한 유연성 링커가 가능하다. IL-12p70은 또한 단백질의 천연 형태인 IL-12A 및 IL-12B의 이종이량체로서 발현될 수 있다. 사이에 공간을 추가하도록 작용하는, 본원에 개시된 다양한 링커가 항-CD45 항체 및 IL-12를 작동적으로 연결하는 데 사용될 수 있다.
실시예 12b: IL-12의 항체-매개된 테더링은 IL-12의 세포 로딩 및 연장된 표면 지속성을 지지함
우리는 T 세포 상으로 IL-12의 로딩을 지지하는 IL12-TF의 능력을 평가하였다. 간략히, 인간 총 CD3 T 세포를 3일 동안 CD3/CD28 디나비드로 활성화시켰다. 비드를 제거하고, 세포를 전체 배지(10% FBS를 갖는 RPMI 1640)에 희석된 h9.4Fab-scIL-12p70과 함께 펄스 인큐베이션하기 전 1일 동안 IL-2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 1 hr 동안 37℃에서 전체 배지(모의 조건) 또는 h9.4Fab-scIL-12p70와 함께 생물학적 복제로 인큐베이션한 후, 전체 배지(10% FBS를 갖는 RPMI 1640)로 3회 세척하여 비결합된 IL12-TF를 제거하였다. 이어서, 세포를 대략 200,000개 세포/mL의 세포 밀도로 전체 배지에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 표면 테더링된 IL-12는 유동 세포측정을 이용하여 다중클론 항-인간 IgG 항체로의 면역염색에 의해 검출되었다. 세포를 카운트브라이트 앱솔루트 유동 세포측정 카운팅 비드를 사용하여 계수하였다. 각각의 경우에, 세포를 디바 소프트웨어를 사용하여 FACSCelesta 상에서 분석하고; 데이터를 시토뱅크를 사용하여 분석하였다.
도 23에 나타난 바와 같이, 항-CD45 항체에 융합된 IL-12의 펄스 인큐베이션은 T 세포 표면 상에서 IL-12의 상당한 로딩 및 연장된 지속성 뿐만 아니라 상당한 T 세포 확장을 지지한다.
실시예 13: IL-12 테더링된 융합물은 지속적 STAT4 인산화를 유도함
인간 총 CD3 T 세포를 3일 동안 CD3/CD28 디나비드로 활성화시켰다. 비드를 제거하고, 세포를 전체 배지(10% FBS를 갖는 RPMI 1640)에 희석된 IL-12 및 IL-15 테더링된 융합 구축물과 함께 펄스 인큐베이션하기 전 1일 동안 IL-2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 1 hr 동안 37℃에서 전체 배지(모의 조건), IL-15/sushi-Fc, h9.4Fab-scIL-12p70, h9.4Fab-IL-15/sushi, 또는 h9.4Fab-scIL-12p70 및 h9.4Fab-IL-15/sushi 구축물(각각 500 nM)의 조합과 함께 생물학적 복제로 인큐베이션한 후, 전체 배지로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 대략 200,000개 세포/mL의 세포 밀도로 전체 배지에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 일정한 IL-15 인큐베이션의 제어 조건에 대해, 세포는 대략 25 nM 농도로 IL-15/sushi-Fc 구축물로 보충되었다. 다음날, 세포를 회수하고, 10분 동안 실온에서 대략 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, 10분 동안 4℃에서 100% 메탄올로 투과시켰다. 이어서, 세포를 인산화된 STAT4 또는 인산화된 STAT5에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색하고, 디바 소프트웨어를 사용하여 FACSCelesta 상에서 분석하고; 데이터를 시토뱅크를 사용하여 분석하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, IL-15 테더링된 융합물의 펄스 인큐베이션은 25 nM IL-15/sushi-Fc와의 일정한 인큐베이션과 유사한 수준으로 STAT5 인산화를 유도하지만, IL-15/sushi-Fc와의 펄스 인큐베이션은 배경 수준을 초과하여 STAT5 인산화를 유도하지 못한다. IL-12 테더링된 융합물은 STAT4의 인산화를 유도하고; 이 활성은 IL-15 테더링된 융합물과의 조합된 펄스 인큐베이션에 의해 증대된다. 우리는 테더링된 융합물이 개별적으로 및 조합하여 사용 시 지속된 세포내 신호전달 활성을 유도할 수 있고 IFM의 상이한 시토카인과의 조합이 단일 IFM에 의해 관찰되는 것 보다 증가된 활성을 제공할 수 있다고 추단하다.
실시예 14: 면역 세포 표면에 대한 다수의 시토카인의 테더링
면역 세포는 종종 다수의 상이한 입력으로부터의 신호를 감지하고 통합한다. 실제로, 당해 분야의 많은 예는 다수의 시토카인이 개별 시토카인 단독 보다 광범위하거나 강력한 면역 반응을 유도하는 능력을 입증한다. 따라서, 우리는 IFM 플랫폼을 사용하여 면역 세포 표면에 다수의 시토카인을 동시에 테더링하는 능력을 평가하였다. 우리는 시토카인의 다수의 상이한 조합을 사용하고 또한 다수의 상이한 세포 표면 수용체로부터의 자극을 테더링함으로써 이 가능성을 조사하였다.
우리는 먼저 단일 세포 표면 수용체로부터 IL-15 및 IL-21을 테더링함으로써 면역 세포 표면 상으로 2개의 시토카인을 동시에 테더링하는 능력을 입증하였다. 간략히, 총 CD3 인간 T 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 CD3/CD28 자극을 이용하여 활성화시켰다. 이어서, 세포 표면 시토카인 로딩에 대한 상대적 농도의 효과를 조사하기 위해 세포를 몰비의 범위에서 CD45-테더링된 IL-15 및 IL-21(h9.4Fab-IL15/sushi 및 h9.4Fab-IL21)과 함께 인큐베이션하였다. IL-15 및 IL-21 TF를 각각 500 nM:0 nM, 1500 nM:500 nM, 500 nM:1500 nM, 및 500 nM:1500 nM의 농도로 혼합함으로써 1:0, 3:1, 1:1, 및 1:3의 IL-15:IL-21 테더링된 융합물(TF) 비율을 평가하였다. 37℃에서 1 hr 인큐베이션 후, 세포를 전체 배지에서 2회 세척한 후, PE-컨주게이션된 항-IL-15 및 Alexa-Fluor-647-컨주게이션된 항-IL-21 항체(R&D Systems 카달로그 번호 IC2471P 및 BioLegend 카달로그 번호 513006)로 염색하였다. 세포를 디바 소프트웨어를 사용하여 FACSCelesta 유동 세포측정기 상에서 분석하고, 데이터를 시토뱅크를 사용하여 분석하였다. 도 25는 두 IL-15 및 IL-21이 모두 CD45 수용체에 대한 테더링을 통해 T 세포 표면 상으로 동시에 로딩될 수 있음을 입증한다. 그러나, 우리는 추가적으로 IL-21:IL-15 TF의 몰비가 증가하면 IL-15의 양이 감소함에 따라 세포 표면 상의 IL-21의 양이 증가한다는 것을 관찰하였으며; 도 25는 이 효과가 로딩 당일(0일) 및 펄스 인큐베이선 후 1일(1일) 모두에서 관찰되었음을 나타내며, 이는 로딩의 초기 차이가 시간에 따라 관찰되는 표면 수준에 영향을 끼친다는 것을 나타낸다.
다음으로, 우리는 다수의 시토카인을 상이한 세포 표면 수용체에 테더링함으로서 세포 표면 상에 다수의 시토카인을 '부가적으로' 로딩하는 능력을 평가하였다. 우리는 추가적으로 CD8-표적된 IL-21 구축물을 사용함으로써 세포 선별적 시토카인 로딩을 TF 조합과 커플링하는 잠재력을 평가하였다. IL-21은 CD8 T 세포에 바람직한 줄기-세포 메모리 표현형을 부여하는 것으로 보고되었으나, CD4 T 세포의 Th2 헬퍼 표현형으로의 분화를 촉진시키면서 CD4 T 세포의 IFNg-생성 Thl 표현형으로의 분화를 바람직하지 않게 억제할 수 있다(Tian et al. Trends Immunol. 2016 Aug; 37(8): 557-568). 따라서, CD8 T 세포에 특이적인 IL-21 테더링된 융합물은 항암 요법에 바람직할 것이다. 간략히, 총 인간 CD3 T 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 이어서, 세포를 각각 500 nM 농도의 CD45-테더링된 IL-15(h9.4Fab-IL15/sushi) 또는 CD8-테더링된 IL-21(chOKT8Fab-BC8scFv-IL21)의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 1 hr 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척한 후, PE-컨주게이션된 항-IL-15 및 Alexa-fluor-647 컨주게이션된 항-IL-21 항체로 염색하였다. CD4 또는 CD8 T 세포 상으로의 시토카인 로딩의 독립적인 정량화를 가능하게 하기 위해, 세포를 추가적으로 PE/Cy7-컨주게이션된 항-CD4 및 BV785-컨주게이션된 항-CD8 항체(BioLegend cat. nos. 344612 및 344740)로 염색하였다. 세포를 FACSCelesta 유동 세포측정기 상에서 디바 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 데이터를 시토뱅크를 사용하여 분석하였다. 도 26은 CD45-테더링된 IL-15가 두 CD4 및 CD8 T 세포 상에 유사하게 높은 수준으로 로딩되었음을 입증한다. 그에 비해, CD8-표적된 IL-21은 CD8 T 세포 상에 높은 수준으로 선별적으로 로딩되었다. 비판적으로, CD8-표적된 IL-21이 부가는 CD45-표적된 IL-15의 수준을 감소시키지 않았으며(도 26), 이는 상이한 표면 수용체로부터의 테더링을 통한 부가적인 시토카인 로딩을 입증한다.
생물학적 활성을 증대시키는 IFM 조합의 능력을 조사하기 위해, 우리는 IL-15 및 IL-21 TF와의 인큐베이션 후 두 IL-15 및 IL-21 신호전달 수용체 하류의 전사 인자인 STAT5의 (인산화를 통한) 활성화를 평가하였다. 간략히, 상기 기재된 펄스 인큐베이션 및 세척 후, 세포를 대략 200,000개 세포/mL의 밀도로 전체 배지로 플레이팅하고, 37℃ 및 5% C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포내 신호전달은 역동적인 과정으로, 신호는 세포 내에서 음성 조절 피드백 메커니즘에 의해 시간에 따라 감소되며; 따라서, 우리는 STAT5 신호전달 활성에 대한 상한을 반영하기 위해 포화량(25 nM)의 IL15/sushi-Fc 구축물과의 일정한 인큐베이션을 포함하는 제어 조건을 포함하였다. 우리는 추가적으로 CD45-테더링된 IL-15 및 IL-21 또는 CD45-테더링된 IL-15 및 CD8-테더링된 IL-21(각각의 TF는 500 nM에서 인큐베이션됨)의 조합을 평가하였다. 37℃ 및 5% C02에서 1일 또는 3일 후, 실시예 11에 기재된 바와 같이 웰을 고정시키고, 투과시키고, 면역염색하였다. 특히, 펄스 인큐베이션 후 1일에, CD45-표적된 IL-15는 IL15/sushi-Fc과의 일정한 인큐베이션에 근접하는 수준으로 STAT5 인산화를 유도하였다(도 27a). IL-15 및 IL-21 테더링된 융합물 - 각각의 시토카인을 동일한 수용체에 테더링하거나 시토카인을 별개의 수용체에 테더링함 - 의 조합으로 IL-15 TF 단독과 비교하여 더욱 증가된 STAT5 인산화를 초래하였으며, 일정한 IL15/sushi-Fc 제어 조건과 유사한 수준에 도달한다(도 27a). 부가적으로 로딩된 테더링된 융합물 - 즉 CD45-표적된 IL-15과 CD8-표적된 IL-21의 조합 -은 3일째 시점에서 포화 IL15/sushi-Fc 조건과 유사한 수준으로 STAT5 인산화를 추가로 유지하였다(도 27b). 우리는 다수의 시토카인을 동일한 수용체에 대한 또는 상이한 수용체에 대한 테더링에 의해 세포 표면에 테더링함으로써 세포 반응을 증대시킬 수 있다고 추단한다. 상이한 세포 표면 수용체로부터의 테더링은 추가적으로 부가적인 시토카인 로딩을 가능하게 할 수 있고 더욱 개선된 세포 활성을 제공할 수 있다.
시토카인 및 세포 표면 수용체의 IFM 조합에 대한 모듈성을 추가로 조사하기 위해, 우리는 IL-15 및 IL-12를 포함하는 IFM의 조합으로부터 세포 표면 로딩 및 세포 반응을 조사하였다. IL-15 및 IL-12 조합으로부터의 개선된 항종양 활성은 당해 분야에 잘 기재되어 있다(Di Carlo et al. J Immunol. 2000 Sep 15;165(6):3111-8; Lasek et al. Eur Cytokine Netw. 1999 Sep;10(3):345-56). 이는 아마도 적어도 부분적으로 IL-15에 의해 유도되는 IL-12 수용체 수준의 상승된 발현에 기인한다(Wu et al. Eur J Immunol. 1997 Jan;27(l): 147-54). 따라서, IL-15 및 IL-12를 포함하는 IFM의 조합은 더욱 개선된 치료 활성을 제공할 수 있다. 우리는 IL-15 및 IL-12가 모두 CD45 수용체로부터 테더링된 IFM 조합 뿐만 아니라 IL-12는 CD45로부터 테더링되고 IL-15는 CD18로부터 테더링된 조합을 평가하였다. 간략히, 총 CD3 인간 T 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 이어서, 세포를 CD45 -테더링된 IL-15 또는 IL-12(h9.4Fab-IL15/sushi 및 h9.4Fab-scIL12p70)의 조합 또는 CD45-테더링된 IL-12의 CD18-테더링된 IL-15(chlB4Fab-IL15/sushi)와의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 두 조합을 각각의 IFM에 대해 25, 100, 및 400 nM의 농도에서 평가하였다. 37℃에서 1 hr 인큐베이션 후, 세포를 세척한 후, 200,000개 세포/mL의 밀도로 전체 배지에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% C02에서 밤새 인큐베이션하였다. IL-12의 세포 표면 수준(Alexa-fiuor-647-컨주게이션된 항-IL-12 항체를 사용, BioLegend 카달로그 번호 501818)을 0일 및 1일에 평가하고, IL-12 수용체 하류의 전사 인자인 STAT4의 활성화(PE-컨주게이션된 항-p-STAT4 항체를 사용, BD Biosciences 카달로그 번호 558249)를 1일에 분석하였다. 세포 표면 시토카인 및 세포내 신호전달에 대한 염색을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 조합된 IL-15 및 IL-21 로딩에 대해 상기 관찰된 데이터와 일치하게, 우리는 CD45-표적된 IL-15와 조합 시 CD45-표적된-IL-12의 전체 로딩이 더 낮다는 것을 관찰하였다(h9.4Fab-scIL12p70 및 h9.4Fab-IL15/sushi 조합; 도 28). 그러나, CD45-표적된 IL-12의 CD18-표적된 IL-15와의 조합은 세포 표면 상의 IL-12의 수준을 감소시키지는 않았다(h9.4Fab-scIL12p70 및 chlB4Fab-IL15/sushi 조합, 도 28). IL-12 테더링된 융합은 STAT4 인산화를 유도하였다 - 그러나, IL-15 테더링된 융합물 및 20 nM IL15/sushi-Fc와의 일정한 인큐베이션은 유도하지 않음(도 29). 이는 IL-15 및 IL-12에 의한 세포내 신호전달의 이해와 일치하며, IFM으로부터의 펄스 인큐베이션이 전형적으로 천연 시토카인의 일정한 인큐베이션에 의해서만 관찰되는 시토카인 활성을 제공할 수 있음을 제시한다. 특히, IL-15 TF는 그 자체로는 STAT4 활성을 유도하지 않았지만, STAT4 인산화는 IL-12 TF와 IL-15 TF와의 조합에 의해 증대되었다(도 29). 우리는 IL-15 및 IL-12를 포함하는 IFM이 IL-12 단독에 의해 유도되는 것을 초과하여 신호전달을 더욱 증대시킬 수 있다고 추단한다. 이는 IL-15에 의한 IL-12 수용체의 유도로부터 비롯될 수 있다. IL-2 및 IL-7는 IL-12 수용체 발현을 상승시키는 것으로 추가적으로 기재되어 있으며(Wu et al, Eur J Immunol. 1997 Jan;27(l): 147-54), IL-2 또는 IL-7을 포함하는 IFM의 IL-12 IFM과의 조합은 또한 아마도 IL-12 또는 IL-12 IFM 활성을 증대시킬 것이다.
우리는 추가로 다수의 상이한 세포 표면 수용체로부터의 단일 수용체를 테더링함으로써 IFM 조합에 대한 잠재력을 조사하였다. 특히, 우리는 개선된 세포 표면 지속성을 제공하는 CD45-표적된 IL-15 포인트 돌연변이체를 CD18-표적된 야생형 IL-15와 조합하는 것의 T 세포 확장 및 생존력에 대한 효과를 평가하였다. 간략히, 총 CD3 인간 T 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 이어서, 세포를 D61H 돌연변이를 함유하는 25 또는 100 nM CD45-테더링된 IL-15(h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H/sushi), 100 nM CD18-테더링된 야생형 IL-15(chlB4Fab-IL15/sushi), 또는 두 IFM의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 1 hr 후 세포를 전체 배지에서 2회 세척하고, 200,000개 세포/mL의 세포 밀도로 플레이팅하고, 37℃ 및 5% C02에서 인큐베이션하였다. 살아있는 세포 밀도를 카운트브라이트 앱솔루트 유동 세포측정 카운팅 비드(ThermoFisher)를 사용하여 FACSCelesta 유동 세포측정기 상에서 디바 소프트웨어를 사용하여 시간에 따라 모니터링하였다. h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H/sushi 및 chlB4Fab-IL15/sushi의 조합으로 단일 테더링된 시토카인보다 큰 T 세포 증식을 초래하였다(도 30). 우리는 개별 시토카인 또는 시토카인 변이체가 생물학적 효능을 개선하기 위해 다수의 세포 표면 수용체로부터 테더링될 수 있다고 추단한다.
우리는 여기서 시토카인이 단일 수용체로부터(예컨대, CD45 수용체로부터 테더링된 시토카인 둘 다) 또는 상이한 수용체의 조합으로부터 세포 표면에 테더링될 수 있다는 것을 보였다. 이들 연구는 CD8, CD18, 또는 CD45 수용체를 표적하는 항체를 사용하여 조합 시토카인 로딩을 조사하였지만, 세포 표면 수용체의 다른 조합도 가능하다(임의적으로, 예컨대 D4, CD11a, 및/또는 CD2 포함). 단일 세포 상으로 3개 이상의 시토카인의 테더링도 가능하며, 추가의 이점을 부가할 것이다(예컨대, IL-12, IL-15, 및 IL-21의 단일 면역 세포 상으로의 조합된 로딩은 여기서 우리의 관찰에 기초 시 STAT4 및 STAT5 신호전달 둘 다를 증대시킬 수 있었다). 우리는 추가적으로 상이한 수용체로부터의 시토카인의 테더링이 '부가적인' 시토카인 로딩을 가능하게 하였음을 입증하였으며, 여기서 제2 시토카인은 제1 시토카인의 수준을 감소시키지 않으면서 T 세포 표면으로 로딩된다. 이론에 구애됨이 없이, 우리는 상이한 수용체로부터의 로딩 시 관찰된 부가성이 단일 세포 표면 수용체 상으로의 로딩에 대해 경쟁할 필요가 없는 IFM의 항체 성분의 결과인 것으로 생각한다. 우리는 추가로 부가적 로딩이 세포-특이적 표적화와 조합될 수 있다는 것을 입증하였다. 우리는, 예컨대 IL-21은 CD8 T 세포 상으로 선별적으로 로딩되고 IL-15는 두 CD4 및 CD8 T 세포 상으로 로딩되는, IL-15 및 IL-21을 조합하는 능력을 보였다. 이는 IL-21은 CD4 T 세포를 Th2 표현형으로의 분화를 촉진하고 IFNg-생성 Thl 표현형으로의 CD4 T 세포 분화는 억제하는 것으로 나타났기 때문에 유리하다(Tian et al, Trends Immunol. 2016 Aug; 37(8): 557-568). 따라서, Thl CD4 T 세포는 보다 생산적인 항암 CD4 T 세포 서브세트로 간주되므로, CD4 T 세포로부터 IL-21을 방향 전환시키는 것이 바람직할 것이다. 마지막으로, 우리는 개별 시토카인 및/또는 시토카인 변이체가 보다 개선된 생물학적 활성을 촉진시키기 위해 다수의 상이한 수용체 상으로 로딩될 수 있다는 것을 입증하였다. 구체적으로, 우리는 IL-15를 포함하는 CD18- 및 CD45-표적된 테더링된 융합물 및 IL-15 돌연변이체를 포함하는 증진된-활성 테더링된 융합물을 조합함으로서 개선된 세포 확장을 보였다. 종합적으로, 이들 데이터는 면역 세포 표면의 비-유전자 조작을 통해 면역 자극 활성을 제공하기 위한 테더링된 융합 플랫폼의 광범위한 다양성을 지지한다.
실시예 15: CDlla 또는 CD18 수용체로부터 IL-15 또는 IL-12의 테더링
실시예 3에서, 우리는 다수의 상이한 풍부한 또는 지속적인 세포 표면 수용체가 개선된 생물학적 활성 및 지속성을 갖는 IFM(테더링된 융합물로도 지칭됨)을 생성할 수 있다는 것을 입증하였다. 여기서, 우리는 IL-15 및 IL-12의 높은 세포 표면 로딩을 지지하는 선별된 수용체-표적된 항체의 인간화된 형태의 능력을 평가하였다. 간략히, CD3 인간 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 활성화된 CD3 T 세포를 인간화된 MHM24 가변 도메인을 포함하는 500 nM의 CD11a-표적된 IL-12 IFM(hMHM24Fab-scIL-12p70)과 함께 인큐베이션하고; CD45-표적된 IL-12 IFM(h9.4Fab-scIL-12p70 및 h9.4Fab-BC8scFv-scIL-12p70; 각각 500 nM)을 비교를 위해 포함하였다. 37℃에서 1 hr 후 세포를 전체 배지에서 2회 세척한 후, 유동 세포측정 분석을 위해 Alexa-Fluor-647-컨주게이션된 항-인간 IL-12 항체로 염색하였다. 도 31a는 세포 표면 상으로의 IL-12의 로딩을 지지하는 인간화된 항체를 포함하는 테더링된 융합물과의 펄스 인큐베이션을 나타낸다.
별개의 실험에서, 우리는 CD45, CD11a, 또는 CD 18 수용체를 표적하는 인간화된 항체에 대한 IL-15 테더링된 융합물의 세포 표면 로딩을 평가하였다. 간략히, CD3 인간 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화시킨 후, 다양한 인간화된 항체: 항-CD45 Fab 단편(h9.4Fab-IL15/sushi), 항-CD11a Fab 단편(hHMH24Fab-IL15/sushi), 또는 항-CD18 Fab 단편(hlB4Fab-IL15/sushi)의 경쇄 C-말단에 융합된 IL-15을 포함하는 IFM의 5배 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 1 hr 후 세포를 전체 배지에서 2회 세척한 후, 유동 세포측정 분석을 위해 PE-컨주게이션된 항-인간 IL-15 항체로 염색하여 표면 IFM 수준을 검출하였다. 도 31b는 세포 표면 상으로 IL-15의 용량-의존적 로딩을 지지하는 다양한 인간화된 항체를 포함하는 테더링된 융합물과의 펄스 인큐베이션을 나타낸다.
실시예 16: 마우스 T-세포 테더링된 IL-12의 표면 지속성 및 정량화
우리는 마우스 T 세포의 표면 상에 IL-12의 로딩 및 지속성을 촉진하는 마우스 CD45에 특이적인 항체 및 마우스 scIL-12p70 시토카인을 포함하는 테더링된 융합물의 능력을 평가하였다. 마우스 IL12-TF와의 인큐베이션 전에, 마우스 CD8 T 세포를 Pmel 마우스로부터 단리하고, 2일 동안 마우스 CD3 및 CD28 수용체에 대한 항체를 사용하여 활성화시킨 후, 2일 동안 IL-21의 존재 하에서 확장시켰다. 간략히, 단리된 CD8 T 세포를 마우스 CD3 및 CD28 수용체에 대한 항체로 이전에 코팅된 눈크 하이바인드(Nunc HighBind) 플레이트에서 완전 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 페니실린/스트렙토마이신, 및 50 uM 베타-머캅토에탄올 함유)에서 인큐베이션하였으며; CD3 및 CD28 항체를 각각 0.5 ug/mL 및 5 ug/mL의 농도로 코팅하였다. 항체-코팅된 플레이트 상에서 대략 24 hr 인큐베이션 후, IL-2 및 IL-7을 각각 20 ng/mL 및 0.5 ng/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 인큐베이션 2일 후, 세포를 항체-코팅된 플레이트로부터 회수하고, IL-21을 20 ng/mL의 최종 농도로 함유하는 배지로 대략 200,000개 세포/mL의 밀도로 희석하였다. IL-21에서 확장 1일 후, 세포를 IL-21을 20 ng/mL의 최종 농도로 함유하는 배지로 대략 200,00개 세포/mL의 밀도로 다시 희석하였다. 이어서, 세포를 회수하고, 세척하고, 37℃에서 1 hr 동안 125 nM의 농도로 IL-12 테더링된 융합물(chMlFab-scIL-12p70 또는 chMlFab-MlscFv-scIL-12p70)과 함께 인큐베이션한 후, 전체 배지에서 3회 세척하였다. 세포를 24-웰 디쉬에서 500,000개 세포/mL의 밀도로 전체 배지에 플레이팅하였다. 펄스 인큐베이션 후 0, 1, 3, 및 5일에, 세포를 마우스 IL-12에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색하고, FACSCelesta 에서 디바 소프트웨어를 사용하여 분석하고; 데이터를 플로우조(FlowJo)를 사용하여 분석하였다. 도 32에 나타난 바와 같이, IL-12 테더링된 융합물은 IL-12의 마우스 T 세포 상으로의 높은 수준의 로딩을 지지한다. IL-12는 5일 실험의 지속기간 동안 모의 조건의 배경보다 높게 검출가능하다.
별개의 실험에서, 우리는 펄스 인큐베이션 후 마우스 T 세포에 테더링된 IL-12의 양을 정량화하였다. 간략히, 마우스 CD8 T 세포를 1 hr 동안 37℃에서 연속 희석된 chM1Fab-scIL-12p70과 함께 펄스 인큐베이션하고, 비결합된 테더링된 융합물을 세척하여 제거하였다. 세포 표면 결합된 IL-12 수준을 유동 세포측정 분석에 의해 PE-컨주게이션된 단일클론 항-IL-12 항체 및 QUANTBriteTM PE 정량화 키트(BD Biosciences)로 정량화하였다. 도 33에 나타난 바와 같이, 펄싱된 IL-12 테더링된 융합물의 포화 농도에서, 대략 3600개의 IL-12 테더링된 융합 분자가 마우스 T 세포의 표면에 결합되었다. 이는 1E6 세포당 대략 650 pg chM1Fab-scIL-12p70, 및 백만개 세포당 대략 430 pg IL-12 p70에 상응한다.
실시예 17: IL-12 테더링된 융합물에 의한 비로딩된 표적 세포에서의 STAT4 인산화의 활성화
테더링된 융합물은 로딩된 세포 및 비로딩된 표적 세포 둘 다를 활성화시킬 수 있다(도 34a). 따라서, 우리는 시스/자가분비, 트랜스, 및 주변분비 방식으로 인간 T 세포에서 활성을 지지하는 이의 능력 대해 IL-12 테더링된 융합물을 평가하였다. 간략히, STAT4 인산화는 시스, 트랜스, 및 주변분비 활성을 조사하기 위해 IL-12 테더링된 융합물(h9.4Fab-scIL-12p70)로 펄스 인큐베이션 후 1일에 3개의 별개의 검정으로 측정되었다. 총 CD3 T 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 활성화된 인간 T 세포를 1 hr 동안 37℃에서 IL12-TF(h9.4Fab-scIL-12p70)와 함께 인큐베이션하고, 비결합된 테더링된 융합물을 세척하여 제거시키고, 세포를 4E5 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 비로딩된 세포를 시토카인의 부재 하에 추가의 일 동안 전체 배지에서 증식시키고, 다음날에 트랜스 및 주변분비 검정을 위한 "표적" 세포로 사용하였다. 시스-제시/자가분비 활성의 경우, 세포를 상기 기재된 바와 같이 STAT4 인산화를 위해 고정시키고, 투과시키고, 면역염색하였다. 트랜스-제시 평가의 경우, 유동 세포측정을 이용하여 IL12-TF-로딩된 세포로부터 분화를 가능하게 하기 위해 비-IL12-TF-로딩된 표적 세포를 셀트레이스 파 레드 염료(CellTrace Far Red dye)(ThermoFisher)로 표지하였다. IL12-TF-로딩된 세포를 형광 표지된 비로딩된 세포와 혼합하고, 펠렛화하고, 30분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이어서, STAT4 인산화를 위해 세포를 고정시키고, 투과시키고, 면역염색하였다. 전달/주변분비의 경우, IL12-TF-로딩된 세포로부터의 조건화된 배지를 펄스 인큐베이션 후 1일에 회수하고, 비로딩된 세포로 전달하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, STAT4 인산화를 위해 고정시키고, 투과시키고, 면역염색하였다. 모든 검정에서, 세포를 FACSCelesta 유동 세포측정기 상에서 디바 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 데이터를 시토뱅크를 사용하여 분석하였다. 모든 검정에 대해, IL12-TF는 테더링된 융합물을 함유하지 않는 배지로 펄싱된 "모의" 펄싱된 세포의 배경을 초과하여 STAT4 인산화를 유도한다(도 34b). IL-15는 IL-12의 활성을 증대시키는 것으로 보고되었으며, 우리는 상기에서 IL-15 및 IL-12 테더링된 융합물의 조합이 STAT4 인산화를 증대시킬 수 있다는 것을 보이며; 따라서, 우리는 또한 여기 기재된 3가지의 검정으로 IL-12(h9.4Fab-scIL-12p70) 및 IL-15(h9.4Fab-IL-15/sushi) 테더링된 융합물과의 조합된 펄스 인큐베이션에 대한 STAT4 인산화를 평가하였다. 도 34b에 나타난 바와 같이, IL-15 테더링된 융합물은 그 자체로는 강한 STAT4 인산화를 유도하지 않았으나, STAT4 인산화는 시스 및 전달 검정에서 IL-12 및 IL-15 테더링된 융합물의 조합에 의해 증대되었다.
실시예 18: 종양-특이적 T 세포 요법에서 IL12-TF의 효과
표면 테더링된 IL-12를 입양 세포 요법(ACT) 이전에 세포에 사전-로딩 시 암에 대한 종양-특이적 세포 요법을 증대시키는 능력에 대해 평가하였다. 간략히, C57BL/6J 마우스에 400,000개의 B16-F10 흑색종 세포를 피내로 접종하였다. 별도로, CD8 T 세포를 B16-F10 흑색종 세포에서 마우스 gp100 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 Pmel-1 마우스로부터 단리하였다. 세포를 실시예 16에 기재된 바와 같이 활성화시키고 확장시켰다. 마우스 IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70)를 50 nM의 농도로 세포와 인큐베이션함으로써 활성화된 CD8 Pmel T 세포 상으로 로딩하였으며; 비결합된 시토카인을 세척하여 제거시키고, 세포를 HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)에 재현탁시켰다. 우리는 또한 IL15-TF(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)를 단독으로(250 nM 농도) 또는 IL-12 테더링된 융합물과 조합하여(50 nM 농도) 평가하였다. 37℃에서 테더링된 융합물과 1 hr 인큐베이션 후, 세포를 완전 배지로 2회 세척하고, HBSS에 재현탁시키고, 꼬리 정맥 주사에 의해 B16-F10 종양-보유 마우스로 입양 전달하였다(5x106개 세포/마우스). 대조군으로서, 마우스를 또한 HBSS 또는 Pmel T 세포 단독으로 처리하였다. 골수절제 림프고갈은 항종양 T 세포 요법에 일반적으로 사용되지만, 본 연구에서 모든 처리 조건은 골수절제 림프고갈의 부재 하에서 수행되었다.
도 35a는 종양 성장, 마우스 중량 변화, 및 생존을 나타낸다(ACT 후 100일까지). IL-12 함유 요법(IL12-TF 및 IL12/15 TF)은 항종양 성장 및 장기간 생존 측면 둘 다에서 가장 높은 항종양 활성을 나타내었다. (단독으로 또는 IL15-TF와 조합하여) IL12-TF를 운반하는 Pmel로 처리된 그룹으로부터의 7마리의 마우스 중 4마리(57%)는 완전한 반응을 나타내었다. 특히, IL15-TF-함유 그룹에 하나의 장기간 생존자가 있다. 모든 처리 그룹은 5% 미만의 피크 체중 손실을 나타내었으며, 이는 HBSS-처리된 그룹에서 관찰된 체중 손실과 일치하였으며, 이는 여기서 시험된 치료 전략에 대한 명백한 독성의 부재를 나타낸다.
마우스 IL12-TF를 운반하는 Pmel 세포는 내인성 면역계에 대한 활성의 징후를 나타낸다. 그들은 CD8 T 세포 및 NK 세포를 포함하는 전달된 내인성 면역 세포의 일시적 림프구감소증을 유도한다(도 35b). 이어, 내인성 CD8 T 세포의 증식(Ki67 양성에 의해 정의됨) 및 분화가 이어진다(도 35c). 내인성 CD8 T 세포의 추가 세분화는 증식 세포가 거의 독점적으로 항원-경험된 내인성 CD8 T 세포 집단 내에 포함됨을 보여주며(유동 세포측정에 의함, 집단은 둘 다 유사유전자형 Pmel T 세포 마커 CD90.1에 대해 음성이고 CD8 및 CD44에 대해 이중-양성임), 이는 IL12-TF의 존재가 내인성 면역계의 특정 구획을 활성화시키고 있음을 제시한다(도 35d). 도 35b에 나타난 내인성 NK 세포의 일시적 림프구감소증은 도 35e에 나타난 바와 같이 그들의 (Ki67 양성에 통한) 증가된 증식 및 (CD69 양성을 통한) 활성화로 이어진다. 우리는 IL12-TF를 운반하는 종양-특이적 T 세포가 암에 대한 ACT를 증대시키고 내인성 면역계를 프라이밍하는 잠재력을 보유한다고 추단한다.
실시예 19: IL12-TF는 입양 전달된 T 세포에 사전-로딩되거나 가용성 상태로 공동투여될 때 종양-특이적 T 세포 요법을 증대시킴
표면 테더링된 IL-12를 암에 대한 입양 세포 요법(ACT)을 증대시키는 능력에 대해 평가하였다. 간략히, C57BL/6J 마우스에 400,000개의 B16-F10 흑색종 세포를 피내 접종하였다. 종양-특이적 T 세포로의 입양 세포 요법 1일 전에(B16-F10 세포 접종 후 9일), 종양-보유 마우스를 4 mg 시클로포스파미드로 처리하였다. 별도로, CD8 T 세포를 B16-F10 흑색종 세포에서 gp100 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 Pmel-1 마우스로부터 단리하고, 실시예 16에서 T 세포에 대해 기재된 바와 같이 활성화시키고 확장시켰다. 이어서, 세포를 ACT를 위해 수거하고, 125 nM의 농도로 IL-12 테더링된 융합물(chM1Fab-scIL-12p70)과 함께 인큐베이션하였다. 비결합된 테더링된 융합물을 세척하여 제거하고, 세포를 HBSS 중에 재현탁시킨 후, CD8 Pmel T 세포를 B16-F10 종양-보유 마우스로 정맥내(i.v.) 주사에 의해 입양 전달하였다(3E6 세포/마우스). 대조군으로서, 마우스를 HBSS, CD8 Pmel T 세포 단독, 또는 CD8 Pmel T 세포에 이어 단일 용량의 가용성 IL-12p70(0.143, 0.715, 및 3.575 pmole의 IL-12p70에 상응하는 10, 50, 또는 250 ng의 용량 수준)으로 또는 가용성 IL-12 테더링된 융합물(0.143, 0.715, 또는 3.575 pmole의 테더링된 융합물)로 처리하였으며, 이는 모든 조건에 대해 정맥내 투여되었다. 이론에 구속되지 않고, 실시예 16에서의 예비 계산에 기초하여, 지금껏 시험된 가장 높은 용량은 표면-태더링된 IL-12 용량의 100배 초과량에 상응한다.
도 36에 나타난 바와 같이, 사전-로딩되거나 가용성 상태로 공동투여된 IL-12 테더링된 융합물은 둘 다 종양 성장을 상당히 억제하고 연장된 생존을 지지하였다. 각각의 경우에서, 테더링된 융합물은 유리 IL-12의 공동투여보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하고 생존을 연장시켰다. 체중 손실 형태의 최소한의 명백한 독성이 관찰되었다. 데이터는 명확성을 위해 2개의 분리된 도면에 플로팅되며; 제2 세트의 도면에서, HBSS, 단지 Pmel, 및 IL12-TF 그룹을 운반하는 Pmel을 비교를 위해 재플로팅하였다. 종양 성장 동역학은 ACT 후 처음 35일 동안 또는 주어진 그룹에서 2마리의 마누스가 죽을 때까지 나타난다.
실시예 20: IL12-TF는 다수의 세포 용량으로 더욱 개선된 종양 제어를 가능하게 함
대부분의 세포 요법은 강력한 항종양 반응을 위해 ACT 전에 골수절제 화학요법을 포함하는 사전조건화 요법을 필요로 한다. 그러나, 이 접근법은 연속적인 사전조건화 화학요법에 의해 이전에 투여된 세포의 활성을 고갈시키는 위험으로 인해 다수의 세포 용량을 투여할 수 없는 것을 포함하는 한계를 갖는다. 실시예 18에서, 우리는 고형 종양 모델에서 사전조건화의 부재 하에 종양-특이적 T 세포 요법을 증대시키는 IL12-TF의 잠재력을 입증하였다. 이들 효과를 고려하여, 우리는 다수의 세포 용량의 이용을 통해 항종양 제어를 더욱 증대시키는 IL12-TF의 능력을 평가하였다. 간략히, C57BL/6J 마우스에 400,000개의 B16-F10 흑색종 세포를 피내 접종하였다. 별도로, Pmel 마우스로부터의 CD8 T 세포를 실시예 18에 기재된 바와 같이 단리하고, 활성화시키고, 확장시키고, IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70)로 로딩하였다. 종양 접종 후 9일에, 마우스를 i.v. 주사에 의해 CD8 Pmel T 세포로 처리하였다. 제1 세포 용량 투여 1일 전에 시클로포스파미드로의 림프고갈을 이용하고; 제2 세포 용량을 추가의 림프고갈의 부재 하에서 제1 용량 투여 후 14일에 제공하였다. 우리는 추가적으로 단일 용량의 종양-특이적 세포 요법의 효능을 증대시키는 IL12-TF(chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)의 대안적 구성의 능력을 평가하였다. IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70 및 chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70) 둘 다는 테더링된 융합물로 생체외에서 로딩된 단일 세포 용량으로 종양 성장 억제 및 생존을 개선시켰다(도 37a). chM1Fab-scIL-12p70으로 생체외에서 로딩된 다수 용량의 종양-특이적 T 세포는 항종양 생존을 더욱 증대시켰다 - 그러나, 다수 용량의 종양-특이적 T 세포 단독은 그렇지 않았다(도 37b).
IL12-TF는 순환 Pmel T 세포의 피크 확장 및 그들의 장기간 지속성 둘 다를 증가시켰다(도 37c). 우리는 체중 손실 형태의 명백한 독성의 징후를 관찰하지 못했다(도 37d). 임의의 관찰된 체중 손실은 대부분 시클로포스파미드로의 림프고갈에 의해 유도되는 것으로 보였다: 마우스는 각 처리 그룹에서 대략 10%의 체중을 손실하였으며(도 37d), 림프고갈의 부재 하에서 수행된 실시예 18에서, 우리는 모든 처리 그룹에 걸쳐 5% 미만의 체중 손실을 관찰하였다(도 35a). 우리는 추가적으로 IL12-TF를 운반하는 Pmel로의 ACT 후 1일에 혈장에서 전신적 IFN-γ(도 38) 및 CXCL10(도 39)의 적당한 수준을 관찰하였으며; 순환 수준은 입양 세포 전달 4일 내에 기선으로 복귀하였다(도 38-39).
요약하면, 우리는 전임상 연구에서 항체-매개된 시토카인 테더링의 다수의 구성이 T 세포 표면 상에 IL-12의 강한 로딩 및 지속성을 가능하게 한다는 것을 입증하였다. 표면-테더링된 IL-12은, 전신 투여되는 IL-12의 >100배 몰 과량보다 우수한 종양 제어 및 생존을 포함하여, 공격적인 고형 종양 모델에서 입양 전달된 종양-특이적 T 세포의 효능을 실질적으로 개선시킨다. 림프고갈의 부재 하에서 IL12-TF로 로딩된 종양-특이적 T 세포의 효능은 다수의 세포 용량의 투여를 통해 더욱 개선된 효능을 가능하게 하였다.
표면-테더링된 IL-12는 또한 체중 손실 및 지속적인 전신 시토카인 방출의 명백한 독성 없이 - 항원-경험된 CD8 T 세포의 증가된 증식을 포함하여 - 내인성 면역계의 활성화를 지지한다.
우리는 세포 표면 테더링된 면역자극 시토카인이 고형 종양에 대한 것을 포함하여 암에 대한 세포 요법의 효능을 증대시키는 강력한 접근법임을 추단한다. 이 접근법은 유전자 조작을 필요로 하지 않으며, 현재 임상 조사 중인 세포 요법, 예컨대 CAR-T, TCR-T, 종양 연관된 항원 특이적 T 세포, 및 NK 세포에 쉽게 통합될 수 있다.
실시예 21: 테더링된 융합 플랫폼은 생체내에서 특이적 세포 표적화를 가능하게 함
CD8-표적된 IL-7 또는 IL-15 테더링된 융합물을 사용하여 시험관내에서 선별적인 CD8 T 세포 로딩을 위한 능력을 확립한 후(실시예 9 참조), 우리는 CD8-표적된 IL-15 IFM을 사용하여 생체내에서 CD8 T 세포의 선별적인 표적화를 시험하였다. 이가 Fab-scFv 구축물을 사용하여 개선된 CD8 친화성을 입증하는 인간 T 세포에서의 우리의 이전 관찰을 고려하여(도 17d-도 17f), 우리는 유사한 Fab-scFv 항체 구성을 포함하는 마우스 CD8-표적된 IL-15 변이체(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)를 생성하였다. CD8-표적화 Fab는 특이성을 제공하도록 설계되고, CD45-표적화 scFv는 표적 세포 상에서 지속성을 개선시킨다.
이 실시예에 기재된 제1 실험에서, 우리는 정맥내 투여된 태더링된 융합물이 생체내에서 마우스 CD8 T 세포 상에 특이적으로 표적될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 그룹당 2마리의 C57BL/6J 마우스에 chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi(2 μg/마우스), chMlFab-IL15/sushi(CD45-표적된 IFM, 2 μg/마우스), 또는 PBS 비히클 대조군을 주사하였다. 주사 후 1시간에, 채혈하고, 테더링된 융합 세포 표면 결합을 유동 세포측정으로 평가하였다. 적혈구를 용해시키고, 나머지 세포를 테더링된 융합물의 검출을 위해 카파 및 IL-15에 대한 형광 컨주게이션된 항체로 염색하였다. 면역 세포 서브세트 분석이 가능하게 하기 위해 마우스 CD4, CD8, NK1.1, 및 CD45에 특이적인 항체를 추가적으로 포함하였다. 테더링된 융합 표면 결합은 카파 및 IL-15 둘 다에 대해 양성으로 정의되었다. 비히클 대조군 및 chMlFab-IL15/sushi-처리된 동물 둘 다는 최소한의 양성 염색 세포를 갖는 반면(3.5-3.9/μ1), chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi-처리된 동물은 10배 초과의 높은 농도의 순환하는 테더링된-융합물 양성 세포를 가졌다(도 40a). 도 40a의 히스토그램 플롯은 chMlFab-IL15/sushi-처리된 동물에 대해 형광의 대량 이동을 나타내며; 그러나, 뚜렷한 TF-양성 집단은 없었다. CD45는 모든 면역 세포에서 발견되기 때문에, 특이적 결합이 있었을 가능성이 있지만, 테더링된 융합물 신호는 훨씬 많은 수의 세포에 걸쳐 퍼져 있었다. CD8-표적된 IL-15(chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi)로 처리된 마우스에 대해, 단지 적은 퍼센트의 총 세포가 테더링된 융합물에 대해 양성었던 반면(1.73%), CD8 T 세포의 대부분이 양성이었다(도 40b). 또한, 다른 분석된 서브세트(CD4 T 세포, NK 세포) 중 어떠한 것도 TF-염색을 나타내지 않았다. 이들 데이터는 함께 chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi 테더링된 융합물에 의한 CD8 세포의 특이적이고 높은 수준의 표적화 및 CD45-특이적 chMlFab-IL15/sushi 테더링된 융합물에 의한 비특이적이고 낮은 수준의 표적화를 나타낸다.
제2 실험에서, 우리는 순환 면역 세포에 대한 단일 용량(2 또는 10 ug)의 CD45- 또는 CD8-표적된 IL-15 IFM의 효과를 평가하였다. 우리는 추가적으로 비표적된 IL-15/sushi-Fc 구축물 및 D61H 및 E64H 돌연변이를 포함하는 CD8-표적된 IL-15 변이체(chY169Fab-MlscFv-IL15-DHEH/sushi;이들 돌연변이의 추가의 설명에 대해 실시예 9 참조)를 포함하였다. 주사 후 3일에 채혈하고, 적혈구를 용해시키고, 나머지 세포를 CD45, CD4, CD8 및 NK1.1에 대해 지시된 형광 컨주게이션된 항체로 염색하였다. 주사 후 3일까지 테더링된 융합 포맷 또는 농도의 임의의 것에 대해 CD4 T 세포수에 최소한의 변화가 있었다(도 40c). 대조적으로, CD8 수는 모든 테더링된 융합 포맷 및 농도에 의해 3.4-13.6배의 범위로 증가되었다. CD45- 및 CD8-표적 테더링된 융합물의 효과는 CD8 세포에 대해 유사하였으며, 비표적된 IL15/sushi-Fc에 비해 증가하였다. 이의 감소된 생물학적 활성과 일치하게, DHEH 돌연변이체는 야생형 IL-15 IFM보다 CD8 확장을 덜 이끌었다. CD45에 비해 CD8-표적 테더링된 융합물에 대한 CD8 T 세포 확장의 증진은 없었지만, (순환에서 NK1.1+ 세포의 정량화에 의해 측정 시) NK 세포에 대한 감소된 표적외 효과가 있었다. NK 세포는 또한 IL-15에 고도로 민감하고, 그들의 수는 IL-15/sushi-Fc 및 pan-CD45 표적화 chMlFab-IL15/sushi 테더링된 융합물에 의해 극적으로 증가되었다(HBSS 처리 그룹 대비 6-13배 확장). 대조적으로, CD8-표적화 chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi는 NK 세포수의 단지 적당한 증가(3-5배)를 이끌었다. NK 세포에 대한 DHEH 돌연변이체 표적외 효과는 비히클 대조군에 비해 단지 1.5-3배 확장으로 훨씬 더 감쇠되었다. 이들 효과는 CD8 T 세포 대 NK 세포의 비율을 비교함으로써 가장 명확하게 볼 수 있다(도 40d). 비표적된 IL15/sushi는 CD8 T 세포 대 NK 세포의 비율을 실제로 감소시키며, 이는 표적화 없이는 NK 특이적 활성에 대한 선호가 있음을 제시한다. pan-CD45-표적화 테더링된 융합물은 CD8 T 세포수를 상당히 증가시켰지만, 이는 NK 세포수에 대한 비교할만한 효과를 가졌으며 CD8:NK 비율은 비히클 처리된 마우스로부터 변하지 않았다. 야생형 CD8-표적화 테더링된 융합물은 2 μg 및 10 μg 용량에 대해 각각 9.2배 및 4.4배의 증가로 CD8:NK 비율에서 실질적인 증가를 이끌었다. DHEH 돌연변이체는 CD8 T 세포에 대해 극적인 효과를 가졌지만, 또한 NK 세포에 대해 감소된 표적외 효과를 가졌으며, 이 구축물로 처리된 마우스는 야생형 CD8-표적화 테더링된 융합물과 유사한 CD8:NK 비율을 가졌다. 우리는 IFM 표적화가 IL-15의 CD8 및 NK 세포 효과의 크기 및 선별성을 조절할 수 있다고 추단하며; 특히, IL-15 활성은 표적화(CD8 대 CD45 대 비표적), 용량 및 IL-15의 활성(감쇠된 IL-15 돌연변이를 통함)을 제어함으로써 CD8 세포를 향해 편향될 수 있다.
이들 실험은 함께 CD8-표적된 IL-15 변이체의 전신 투여가 생체내에서 CD8 T 세포 상으로 IL-15를 로딩할 수 있고, 이들 세포를 향해 IL-15 활성을 편향시킬 수 있으며, 당해 분야에 기재된 IL-15 구축물, 예컨대 IL15/sushi-Fc로의 처리에 의해 얻을 수 있는 것을 초과하여 CD8 T 세포의 순환 수준을 더욱 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 22: CD8-표적된 IL-15의 전신 투여는 감소됨 독성을 나타냄
우리는 IL-15를 CD8 T 세포로 재표적하는 것의 전신 독성에 대한 효과를 평가하였다. 간략히, C57BL/6J 마우스에게 IL-15의 연장된 반감기 형태인 IL15/sushi-Fc 구축물, 또는 D61H(DH) 또는 D61H 및 E64H(DHEH) 돌연변이를 함유하는 2개의 상이한 CD8-표적된 IL-15 변이체(chY169Fab-MlscFv-IL15-DH/sushi 및 chY169Fab-MlscFv-IL15-DHEH/sushi)로 10, 30 또는 90 μg의 정맥내 주사에 의해 주당 1회 투여되는 2회 용량을 투여하였다; n=5 마우스/그룹. 우리는 추가적으로 90 μg 용량 수준으로 야생형 IL-15를 함유하는 CD8-표적된 IFM, chY169Fab-MlscFv-IL15/sushi를 평가하였다. 상기 실시예 21에서, 우리는 CD8-표적된 구축물이 IL15/sushi-Fc 또는 CD45 -표적된 구축물과 비교하여 CD8 T 세포를 향한 IL-15의 로딩 및 활성을 편향시키고, 10 μg 용량에서 CD8-표적된 구축물이 순환 CD8 T 세포의 확장을 유도하고 10 μg IL15/sushi-Fc보다 우수하며, 순환 NK 세포의 확장은 덜 유도한다는 것을 입증하였다. 우리는 또한 고정된 용량-수준으로 주당 용량 횟수 증가를 평가하였으며, 특히 우리는 2주 동안 10 μg IL15/sushi-Fc 또는 CD8-표적된 IL-15 IFM의 주당 2 또는 3회 용량을 조사하였다(n=3 마우스/그룹). 도 41a는 CD8-표적된 IL-15 변이체의 용량 증가에 대해 시간에 따라 체중 손실 형태의 명백한 독성을 나타내지 않는다. 그러나, IL15/sushi-Fc 구축물은 IL15/sushi-Fc에 대해 주당 10 μg의 최대 허용 용량을 가졌으며: 30 및 90 μg 용량은 상당한 독성을 유도하였고 주사 후 4일에 사망을 초래하였다(도 41a, 도면 범례에서 괄호 안의 숫자는 실험 말기에 생존 마우스의 분율을 나타낸다). 우리는 추가로 죽은 마우스로부터 비장을 수거하고 30 및 90 μg IL15/sushi-Fc로 처리된 마우스에서 비장비대를 발견하였다(도 41b). 비교해서, CD8-표적된 IL-15 변이체 각각은 전체 2주 연구를 완료할 수 있었으며, 여기서 시험된 전체 2주 요법 후 최소한의 체중 손실(도 41a), 사망 없음, 및 10 μg IL15/sushi-Fc와 비교하여 더 적은 비장 증대를 초래하였다(도 41b). 또한, IL15/sushi-Fc는 주당 10 μg의 1회 용량은 허용되지만, 이 투여를 주당 2회 또는 3회 용량으로 증가시키면 2차 주사 후 심각한 독성 및 사망을 초래하였다(도 41c, 도면 범례에서 괄호 안의 숫자는 실험 말기에 생존 마우스의 분율을 나타낸다). 사망한 마우스는 또한 비장비대를 나타내었다(도 41b). 비교해서, CD8-표적된 IL-15 변이체의 10 μg의 용량으로 주당 2회 또는 3회의 투여는 전체 2주 투여 요법 과정에 걸쳐 유의한 체중 손실, 사망한 동물(도 41c) 또는 실질적인 비장 증대(도 41b)를 초래하지 않았다. 우리는 CD8 T 세포에 대해 IL-15를 재표적하는 것이 생체내에서 더 낮은 독성 및 더 높은 IL-15 투여를 가능하게 한다고 추단한다. IL-15에 의한 NK 세포의 확장은 생체내에서 IL-15 독성에 강하게 기여하는 것으로 나타났다(Guo et al, J Immunol. 2015 Sep l;195(5):2353-64). 이론에 구애됨이 없이, 생체내에서 NK 세포로부터 멀어지는 IL-15의 편향 활성은 독성을 감소시킬 수 있고 CD8 T 세포에 대한 보다 강한 투여를 가능하게 한다고 생각한다. 이는 IL-15의 항종양 효능이 CD8 T 세포에 의해 매개될 수 있다는 것을 고려할 때 치료적으로 유리하고 중요하다(Xu et al., Cancer Res. 2013 May 15;73(10):3075-86; Cheng et al., J Hepatol. 2014 Dec;61(6):1297-303).
실시예 23: IL-12의 전신적인 CD8 표적된 투여로부터의 항암 효능
IL-12는 뮤린 종양 모델에서 강한 항종양 활성을 유도하는 강력한 시토카인이나, 인간 임상 시험에서 높은 독성을 겪었다. IL-12는 CD4 T 세포의 Th1 표현형으로의 분화를 지지하고, CD8 T 세포의 세포독성을 증가시키고, NK 세포를 활성화시킨다. 그러나, 암 요법을 위한 IL-12의 임상 시험은 인간 환자에서 IL-12의 효과가 NK 세포에 대해 가장 두드러지는 것으로 밝혀졌다(Robertson et al., Clin Cancer Res. 1999 Jan;5(1):9-16; Bekaii-Saab et al., Mol Cancer Ther. 2009 Nov; 8(11): 2983-2991). NK 세포에 대한 IL-12의 우세한 활성 - NK 세포를 활성화시키는 것과 연관된 독성과 커플링됨 - 은 IL-12의 생물학적 효과를 CD4 및 CD8 T 세포에 효과적으로 제공하는 능력을 제한할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 우리는 마우스 CD8 T 세포에 표적되는 마우스 IL-12 IFM(chY169Fab-M1scFv-scIL-12p70)을 구축하고, 뮤린 흑색종 종양 모델에서 이의 안전성 및 항종양 효능을 평가하였다.
간략히, B6D2F1/J 마우스에 피하 주사로 400,000개의 B16-F10 흑색종 세포를 접종하였다. 10일 후, 종양-보유 마우스를 무작위화하고, 0.05, 0.25, 1, 또는 5 μg의 재조합 IL-12(R&D Systems), CD45-표적된 IL-12(chM1Fab-M1scFv-scIL12p70 및 chM1Fab-scIL12p70), 또는 CD8-표적된 IL-12의 2회 용량(매주 1회 투여)으로 정맥내 주사로 처리하였다(n=5 마우스/그룹). 도 42a는 CD45-표적된 IL-12 IFM 또는 CD8-표적된 IL-12 IFM의 주별 주사 각각이 IL-12의 주별 주사보다 강한 항종양 효능을 제공한다는 것을 입증한다. CD8-표적된 IL-12는 추가적으로 CD45-표적된 IL-12와 유사한 종양 성장 억제를 제공하였다(도 42a). 특히, Fab-scFv CD45-표적된 IL-12 구축물로 처리된 마우스는 1 및 5 ug 수준에서 체중 손실 형태의 독성을 겪었지만, Fab-scFv CD8-표적된 IL-12로 처리된 마우스는 유사한 독성을 나타내지 않았다(도 42b). 우리는 IL-12를 포함하는 IFM이 IL-12 단독과 비교하여 개선된 항종양 효능을 제공할 수 있고, 세포 특이적으로 표적된 IL-12가 전신 독성을 감소시킬 수 있다고 추단한다.
본 개시의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 본 개시의 기술된 방법 및 조성물의 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시는 특정 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 바와 같은 개시는 이러한 특정 실시양태에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 개시를 수행하기 위한 기술된 모드의 다양한 변형은 관련 분야의 숙련가에 의해 의도되고 이해되며, 이 개시는 하기의 청구범위에 의해 제시되는 바와 같이 본 개시의 범위 내에 있다.
참조에 의한 삽입
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개문은 각각의 독립적인 특허 및 공개문이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 2018년 7월 3일에 출원된 "면역자극 융합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도"라는 제목의 변호사 일람 번호 174285-010900/PCT를 갖는 PCT 국제 출원 및 2018년 7월 3일에 출원된 "면역 조절성 세포를 표적하는 융합 분자 및 이의 용도"라는 제목의 변호사 일람 번호 174285-011000/PCT를 갖는 PCT 국제 출원 둘 다가 전부 참조로 본원에 포함된다.
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Trp Glu Leu Lys Lys 225 230 235 240 Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu 245 250 255 Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp 260 265 270 Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr 275 280 285 Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys 290 295 300 Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu 305 310 315 320 Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys 325 330 335 Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe 340 345 350 Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val 355 360 365 Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala 370 375 380 Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu 385 390 395 400 Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu 405 410 415 Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr 420 425 430 Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp 435 440 445 Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val 450 455 460 Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr 465 470 475 480 Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu 485 490 495 Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys 500 505 510 Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser 515 520 525 Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 530 535 540 <210> 105 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 105 Gly Phe Ser Gly 1 <210> 106 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 106 Gly Lys Val Ser 1 <210> 107 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 107 Gly Trp Ile Gly 1 <210> 108 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 108 Gly Lys Lys Trp 1 <210> 109 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 109 Gly Ala Tyr Met 1 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 110 Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly 1 5 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 111 Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 112 Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 113 Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 114 Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly 1 5 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 115 Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 116 Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly 1 5 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 117 Arg Pro Lys Pro Val Glu Nva Trp Arg Lys 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 118 Arg Pro Lys Pro Tyr Ala Nva Trp Met Lys 1 5 10 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 119 Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg 1 5 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 120 Pro Leu Gly Ile Ala Gly Arg 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 121 Gly Pro Leu Gly Pro 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 122 Gly Pro Ile Gly Pro 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 123 Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 124 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 124 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 125 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 126 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Cys Ala Pro Glu 1 5 10 <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 127 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 128 Ser Val Glu Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 129 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 129 Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 130 Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro 1 5 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic <400> 131 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro 1 5 10

Claims (49)

  1. 면역자극 융합 분자로서,
    (a) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (b) 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 친화성을 갖는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 세포 표적화 모이어티
    를 포함하고,
    여기서, 면역자극 시토카인 분자는 항원 결합 단편에 작동적으로 연결되는 면역자극 융합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 면역 세포 표적화 모이어티가 이펙터 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CTL로부터 선택되는 T 세포를 표적하는 것인 면역자극 융합 분자.
  3. 제2항에 있어서, 항원이 T 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 CD45 수용체인 면역자극 융합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 면역 세포 표적화 모이어티가 항-CD45 항체 BC8, 4B2, GAP8.3 또는 9.4의 Fab 단편, F(ab')2, Fv, 단일쇄 Fv, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 인간화된 버전을 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  5. 제1항에 있어서, 면역자극 시토카인 분자가 IL-12, 단일쇄 IL-12, IL-12의 서브유닛, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체 형태를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  6. 제1항에 있어서, 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 친화성을 갖는 단일쇄 Fv를 추가로 포함하는 면역자극 융합 분자.
  7. 제6항에 있어서, 단일쇄 Fv가 항원 결합 단편과 동일한 항원에 대해 친화성을 갖는 것인 면역자극 융합 분자.
  8. 제6항에 있어서, 단일쇄 Fv가 항원 결합 단편과 상이한 항원에 대해 친화성을 갖는 것인 면역자극 융합 분자.
  9. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편인 면역자극 융합 분자.
  10. 제9항에 있어서, Fab 단편이 경쇄 및 중쇄 단편을 포함하고, 면역자극 시토카인 분자가 경쇄의 C-말단, 경쇄의 N-말단, 중쇄 단편의 C-말단, 또는 중쇄 단편의 N-말단에서 Fab 단편에 작동적으로 연결되는 것인 면역자극 융합 분자.
  11. 제1항에 있어서, 면역자극 시토카인 분자가 링커에 의해 항원 결합 단편에 작동적으로 연결되는 것인 면역자극 융합 분자.
  12. 제11항에 있어서, 링커가 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 및 비나선형 링커로부터 선택되는 것인 면역자극 융합 분자.
  13. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 CD45 수용체에 대해 친화성을 갖고,
    (a) 서열 번호 82에 나타낸 아미노산 서열의 항체 부분의 가변 도메인에 상응하는 경쇄 가변 아미노산 서열, 또는 서열 번호 82의 가변 도메인과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열; 및/또는
    (b) 서열 번호 79에 나타낸 아미노산 서열의 가변 도메인에 상응하는 중쇄 가변 아미노산 서열, 또는 서열 번호 79의 가변 도메인과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  14. 제1항에 있어서, 시토카인 분자가 서열 번호 50에 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 50의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 IL-12 분자를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  15. 제14항에 있어서, 시토카인 분자가 서열 번호 70에 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 70의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 IL-12B 서브유닛에 연결된 IL-12A 서브유닛을 갖는 단일쇄 IL-12 분자를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  16. 제15항에 있어서, 링커가 서열 번호 36의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36의 시토카인 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  17. 제6항에 있어서, 단일쇄 Fv가 서열 번호 80의 Fv 부분에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 80의 Fv 부분과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 면역자극 융합 분자.
  18. 면역자극 융합 분자로서,
    (a) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (b) 표적 면역 세포의 표면 상의 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 항체를 포함하는 면역 세포 표적화 모이어티로서, 항체는 C-말단 및 N-말단을 갖는 경쇄, 및 C-말단 및 N-말단을 갖는 중쇄를 포함하며, 경쇄는 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 것인 면역 세포 표적화 모이어티
    를 포함하고,
    여기서, 면역자극 시토카인 분자는 경쇄의 C-말단, 경쇄의 N-말단, 또는 중쇄 부분의 N-말단에서 항체에 작동적으로 연결되는 면역자극 융합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 면역 세포 표적화 모이어티가 이펙터 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CTL로부터 선택되는 T 세포를 표적하는 것인 면역자극 융합 분자.
  20. 제19항에 있어서, 항원이 T 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 CD45 수용체인 면역자극 융합 분자.
  21. 제18항에 있어서, 면역자극 시토카인 분자가 IL-12, 단일쇄 IL-12, IL-12의 서브유닛, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체 형태를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  22. 제18항에 있어서, 면역자극 시토카인 분자가 링커에 의해 항체에 작동적으로 연결되는 것인 면역자극 융합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 링커가 절단성 링커, 비절단성 링커, 펩티드 링커, 유연성 링커, 경직성 링커, 나선형 링커, 및 비나선형 링커로부터 선택되는 것인 면역자극 융합 분자.
  24. 제23항에 있어서, 링커가 Gly 및 Ser을 포함하는 펩티드 링커인 면역자극 융합 분자.
  25. 제24항에 있어서, 펩티드 링커가 (GGGS)N(서열 번호 124) 또는 (GGGGS)N(서열 번호 125) 링커이고, N은 모티프 반복 횟수를 나타내고 1-10으로부터 선택되는 정수인 면역자극 융합 분자.
  26. 면역자극 융합 분자로서,
    (a) IL-12 분자; 및
    (b) CD45 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 Fab 단편을 포함하는 T 세포 표적화 모이어티
    를 포함하고,
    여기서, Fab 단편 및 IL-12 분자는 융합 분자로서 함께 작동적으로 연결되는 면역자극 융합 분자.
  27. 제26항에 있어서, T 세포 표적화 모이어티가 이펙터 T 세포, 알파/베타 T 세포, 감마/델타 T 세포, 활성화된 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 CTL 중 적어도 하나를 표적하는 것인 면역자극 융합 분자.
  28. 제26항에 있어서, IL-12 분자가 야생형 IL-12, 변이체 IL-12, 단일쇄 IL-12, 또는 IL-12 서브유닛인 면역자극 융합 분자.
  29. 제26항에 있어서, Fab 단편이 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 갖는 경쇄 및 가변 도메인(VH) 및 불변 도메인(CH1)을 갖는 중쇄 단편을 포함하고, 경쇄 및 중쇄 단편은 각각 C-말단 및 N-말단을 포함하고,
    IL-12 분자가 경쇄 또는 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에 작동적으로 연결되는 것인 면역자극 융합 분자.
  30. 제26항에 있어서, IL-12 분자에 융합된 제1 말단을 갖는 펩티드 링커를 추가로 포함하고, 제2 말단이 Fab 단편에 융합됨으로써 IL-12 분자와 Fab 단편을 작동적으로 연결하는 것인 면역자극 융합 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 면역자극 융합 분자를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  32. 서열 번호 36, 50, 70, 79, 80, 또는 82에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36, 50, 70, 79, 80, 또는 82와 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터.
  33. 제31항의 핵산 분자 또는 제32항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 변형된 면역 세포로서,
    (a) 하기를 포함하는 면역자극 융합 분자:
    (i) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (ii) 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티; 및
    (b) 세포 표면 항원을 발현하거나 그렇지 않은 경우 이를 나타내는 표적 면역 세포
    를 포함하고,
    여기서, 면역자극 융합 분자는 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 면역 세포의 표면에 결합되는 변형된 면역 세포.
  35. 건강한 및/또는 비악성 면역 세포 및 이에 결합된 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 면역자극 융합 분자를 포함하는 변형된 면역 세포.
  36. (a) 면역 세포 집단을 제공하는 단계; 및
    (b) 면역 세포 집단에 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 면역자극 융합 분자의 표적된 결합을 허용하도록 상기 면역자극 융합 분자를 면역 세포 집단과 인큐베이션함으로써 세포 표면에 결합된 면역자극 융합 분자를 갖는 면역 세포 집단을 생성하는 단계
    를 포함하는, 변형된 면역 세포를 제조하는 방법.
  37. 면역 세포 요법에 사용하기 위한 조성물로서,
    (a) 복수의 면역자극 융합 분자로서, 각각의 융합 분자는
    (i) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (ii) T 세포의 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티
    를 포함하는 복수의 면역자극 융합 분자;
    (b) 세포 표면 항원을 발현하거나 그렇지 않은 경우 이를 나타내는 T 세포 집단으로서, 복수의 면역자극 융합 분자는 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 T 세포의 표면에 결합되는 T 세포 집단; 및
    (c) 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제
    를 포함하는 조성물.
  38. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 면역자극 융합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 인간 대상체에게 세포 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조성물은
    (a) 복수의 면역자극 융합 분자로서, 각각의 융합 분자는
    (i) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (ii) T 세포의 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티
    를 포함하는 복수의 면역자극 융합 분자; 및
    (b) 암 세포 또는 암 세포가 존재하는 조직이 있는 T 세포 집단으로서, T 세포는 세포 표면 항원을 발현하는 T 세포 집단
    을 포함하고,
    여기서, 복수의 면역자극 융합 분자는 T 세포의 표면에 결합되고, 시토카인 분자는 생체내에서 인간 대상체의 T 세포 및/또는 다른 면역 세포 집단과 작용하여 암에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, T 세포 집단이 일차 T 세포, 확장된 일차 T 세포, PBMC 세포로부터 유래된 T 세포, 제대혈 세포로부터 유래된 T 세포, 인간 대상체에 대해 자기유래의 T 세포, 인간 대상체에 대해 동종이형의 T 세포, 유전자 조작된 T 세포, CAR-T 세포, 이펙터 T 세포, 활성화된 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CTL을 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 세포 치료 조성물이 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 항원-훈련된 T 세포 요법, 또는 농축된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택되는 세포 요법 과정으로 인간 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자를 추가로 포함하는 면역자극 융합 분자.
  43. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜을 추가로 포함하는 면역자극 융합 분자.
  44. 제42항에 있어서, 나노입자가 단백질 나노겔, 뉴클레오티드 나노겔, 중합체 나노입자, 또는 고체 나노입자를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  45. 제44항에 있어서, 나노입자가 단백질 나노겔을 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  46. 제45항에 있어서, 나노입자가 나노입자 표면에 적어도 하나의 중합체, 양이온성 중합체, 또는 양이온성 블럭 공중합체를 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  47. 제46항에 있어서, 나노입자가 산화환원(디술파이드) 또는 pH(가수분해성 기) 또는 효소(프로테아제)에 민감한 가역성 링커에 의해 가교된 나노겔을 포함하는 것인 면역자극 융합 분자.
  48. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 중합체를 추가로 포함하는 면역자극 융합 분자.
  49. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 하기를 포함하는 면역자극 융합 분자:
    (i) 면역자극 시토카인 분자; 및
    (ii) 세포 표면 항원에 대해 친화성을 갖는 면역 세포 표적화 모이어티;
    (b) 세포 표면 항원을 발현하거나 그렇지 않은 경우 이를 나타내는 표적 면역 세포로서, 면역자극 융합 분자는 세포 표면 항원과의 상호작용을 통해 면역 세포의 표면에 결합되는 표적 면역 세포; 및
    (c) 나노입자, 나노겔, 또는 리포솜.
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